本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)或生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種針對于fap多肽分子抗原表位分子的納米抗體(nb57)、其編碼序列及用途。

背景技術(shù)：

成纖維細胞激活蛋白(fibroblastactivationprotein，fap)是腫瘤相關(guān)成纖維細胞特異性表達的一種表面抗原，具有二肽基肽酶和膠原酶活性，它基因組穩(wěn)定，具有促進腫瘤細胞生長，侵襲及免疫抑制的作用。fap由761個氨基酸組成，在不同哺乳動物細胞中的糖基化水平不同，單體相對分子質(zhì)量有8.8×10⁴、9.5×10⁴、9.7×10⁴等多種報道，二聚體相對分子質(zhì)量為1.7×10⁵。fap的結(jié)構(gòu)分為胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)三部分，其中胞漿區(qū)是由開頭6個氨基酸組成的短肽鏈，跨膜區(qū)是由19個氨基酸組成，起到固定作用的疏水跨膜片段，然而fap分子中氨基酸序列20～761的絕大部分都暴露在細胞外的微環(huán)境中，這一部分就是胞外區(qū)，是關(guān)鍵的酶催化區(qū)。fap同時具有二肽基肽酶活性和膠原酶活性，能夠降解基質(zhì)中的二肽和ⅰ型膠原。fap與屬于二肽基肽酶家族的dppiv(dipeptidylpeptidaseiv/cd26)具有50％的同源性，均具有肽鏈外切酶活性，常形成復(fù)合物。因此，推測fap可通過調(diào)節(jié)腫瘤基質(zhì)中某些肽類生長因子，修飾活性肽并改變其功能，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

在惡性腫瘤中，fap陽性的成纖維細胞僅占腫瘤細胞總數(shù)的2％，但當(dāng)其被去除后，癌細胞及基質(zhì)細胞都會發(fā)生迅速的壞死。由此可以看出，fap對惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有非常重要的作用，而在腫瘤治療方面則具有廣闊的應(yīng)用前景。靶向腫瘤微環(huán)境，尤其是靶向fap的治療策略在腫瘤治療中扮演著非常重要的角色。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤細胞不僅被動地逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，同時也主動地抑制其生長環(huán)境中的免疫細胞的正常功能，它與其所 處的微環(huán)境相互作用，形成抑制性腫瘤微環(huán)境并促進腫瘤的惡性進展，這些因素的存在為探討腫瘤發(fā)生機制及開辟新的腫瘤免疫治療方案提供了思路。

目前已經(jīng)發(fā)展了幾種fap特異性單克隆抗體，并開始在臨床診斷和治療中得到應(yīng)用，其對腫瘤組織的親和力得到了提高。但是這種傳統(tǒng)方法存在抗體穩(wěn)定性差、靈敏度低、生產(chǎn)成本高等缺點。

納米抗體技術(shù)，是生物醫(yī)學(xué)科學(xué)家在傳統(tǒng)抗體的基礎(chǔ)上，運用分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合納米粒子科學(xué)的概念進行的抗體工程革命，從而研發(fā)出的最新和最小的抗體分子，最初由比利時科學(xué)家萊曼德.哈馬斯在駱駝血液中發(fā)現(xiàn)。普通的抗體蛋白由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，而從駱駝血液中發(fā)現(xiàn)的新型抗體只有兩條重鏈，沒有輕鏈，這些“重鏈抗體”能像正?？贵w一樣與抗原等靶標(biāo)緊緊結(jié)合，但不像單鏈抗體那樣相互黏連聚集成塊。以該“重鏈抗體”為基礎(chǔ)的納米抗體不僅分子量只是普通抗體的1/10，而且化學(xué)性質(zhì)也更加靈活，穩(wěn)定性好，可溶性高，表達容易且容易獲得，并容易偶聯(lián)其他分子。但是，現(xiàn)有技術(shù)中并沒有針對fap研發(fā)出適用的納米抗體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，針對現(xiàn)有技術(shù)中缺乏針對fap表位的納米抗體的缺陷，提供一種fap納米抗體，同時提供編碼該fap納米抗體的dna分子以及該納米抗體的用途等。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：本發(fā)明的第一方面，提供了一種fap納米抗體，該fap納米抗體為針對fap表位的納米抗體，包括兩條如seqidno：9所示氨基酸序列的vhh鏈。本發(fā)明中該fap納米抗體可以簡稱為nb57。

本發(fā)明第二方面，提供了一種針對fap納米抗體的vhh鏈，包括框架區(qū)fr和互補決定區(qū)cdr，所述框架區(qū)fr包括下組的fr的氨基酸序列：seqidno：1所示的fr1，seqidno：2所示的fr2，seqidno：3所示的fr3，seqidno：4所示的fr4；所述互補決定區(qū)cdr包括下組的cdr的氨基酸序列：seqidno：5所示的cdr1，seqidno：6所示的cdr2，seqidno： 7所示的cdr3?？蚣軈^(qū)結(jié)構(gòu)相對保守，主要起著維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用；互補決定區(qū)結(jié)構(gòu)相對多樣化，主要負責(zé)抗體的識別。

優(yōu)選地，所述針對fap納米抗體的vhh鏈，它具有seqidno：9所示的氨基酸序列。

本發(fā)明第三方面，提供了一種dna分子，它用于編碼選自下組的蛋白質(zhì)：本發(fā)明所述的fap納米抗體nb57，或者本發(fā)明所述的針對fap納米抗體的vhh鏈。

優(yōu)選地，所述的dna分子，它具有seqidno：8所示的核苷酸序列。

本發(fā)明提供的fap納米抗體可通過噬菌體擴增或基因工程重組表達的方式進行大量制備。噬菌體擴增是指將展示有fap納米抗體nb57的噬菌體，通過生物擴增的方式，大量繁殖生產(chǎn)展示有fap納米抗體nb57的噬菌體粒子。基因工程重組表達的方式是指將編碼fap納米抗體nb57的基因，通過克隆至表達載體，以蛋白表達的形式進行納米抗體的大量制備。

本發(fā)明的第四方面，提供了一種表達載體，它含seqidno：8所示的核苷酸序列。

本發(fā)明的第五方面，提供了一種宿主細胞，它可以表達本發(fā)明的fap納米抗體nb57。

本發(fā)明的第六方面，提供了本發(fā)明所述的fap納米抗體nb57在制備fap檢測試劑方面的用途。本發(fā)明的fap納米抗體nb57可以替代傳統(tǒng)的fap抗體，制備fap檢測試劑，用于檢測fap多肽分子。本發(fā)明還提供了fap納米抗體nb57在制備抗腫瘤藥物方面的用途。本發(fā)明也相應(yīng)提供了一種fap檢測試劑或抗腫瘤藥物，包括如前所述的fap納米抗體nb57。

本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明所述的fap納米抗體nb57在非治療目的免疫學(xué)檢測中的用途。該免疫學(xué)檢測的類型包括酶聯(lián)免疫吸附檢測、膠體金免疫層析、免疫斑點雜交等基于抗原抗體特異性反應(yīng)的免疫學(xué)分析檢測類型。本發(fā)明fap納米抗體nb57在應(yīng)用時，可以通過噬菌體擴增獲得的展示有fap納米抗體nb57的噬菌體粒子直接用于分析檢測以及將fap納米抗體nb57經(jīng)過原核生物或真核生物表達后以蛋白的形式進行免疫學(xué)檢測分析。

本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明所述的fap納米抗體nb57在制備結(jié)合吸附fap試劑中的應(yīng)用。例如，可以將本發(fā)明fap納米抗體制成免疫親和柱，吸附抓取fap，在富集后供進一步的研究等。

實施本發(fā)明，具有以下有益效果：本發(fā)明首先合成fap多肽，并使其具有免疫原性，然后將fap分子偶聯(lián)在酶標(biāo)板上，展示該蛋白的正確空間結(jié)構(gòu)，以此形式的抗原利用噬菌體展示技術(shù)篩選免疫納米抗體基因庫(駱駝重鏈抗體噬菌體展示基因庫)，從而獲得了fap特異性的納米抗體基因，將此基因轉(zhuǎn)至大腸桿菌中，從而建立了能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體株；本發(fā)明方法篩選得到的fap納米抗體具有與fap免疫反應(yīng)特性，且特異性好、親和力高，可應(yīng)用于制備fap檢測試劑或抗腫瘤藥物等。

附圖說明

下面將結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明，附圖中：

圖1為fap納米抗體的氨基酸編號和結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是fap納米抗體的dna電泳圖；

圖3是fap納米抗體經(jīng)鎳柱樹脂凝膠親和層析純化后的sds-page的電泳圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。

本發(fā)明利用噬菌體展示技術(shù)，從駝源免疫的單域重鏈抗體庫中篩選能與靶分子fap抗原特異性結(jié)合的單域重鏈抗體(vhh)噬菌體克隆，而獲得了能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體株，即fap納米抗體nb57。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。

實施例1：針對于fap的納米抗體文庫的構(gòu)建：

(1)首先合成fap多肽，將1mgfap與弗氏佐劑等體積混合，免疫一只新疆單峰駝，每周一次，共免疫7次，刺激b細胞表達抗原特異性的納米 抗體；

(2)7次免疫結(jié)束后，提取100ml駱駝外周血淋巴細胞并提取總rna；

(3)合成cdna并利用套式pcr擴增vhh；

(4)利用限制性內(nèi)切酶psti及noti酶切20ugpcomb3噬菌體展示載體(biovector中國質(zhì)粒載體菌株細胞基因保藏中心供應(yīng))及10ugvhh并連接兩個片段；(5)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞tg1中，構(gòu)建fap納米抗體文庫并測定庫容，庫容大小為1.85×10⁸。

實施例2：針對fap的納米抗體篩選過程：

(1)將溶解在100mmnahco3、ph8.2中的20ugfap偶聯(lián)在nunc酶標(biāo)板上，4℃放置過夜；

(2)第二天加入100ul0.1％酪蛋白，室溫封閉1-3h；

(3)1-3h后，加入100ul噬菌體(5×10¹¹tfu免疫駱駝納米抗體噬菌展示基因庫)，室溫作用1-2h；

(4)用0.05％pbs+tween-20洗4-6遍，以洗掉不結(jié)合的噬菌體；

(5)用100mmtea(三乙胺)將與fap特異性結(jié)合的噬菌體解離下，并感染處于對數(shù)期生長的大腸桿菌tg1，37℃培養(yǎng)1h，產(chǎn)生并純化噬菌體用于下一輪的篩選，相同篩選過程重復(fù)3-5輪，逐步得到富集。

實施例3：用噬菌體的酶聯(lián)免疫方法(elisa)篩選特異性單個陽性克?。?/p>

(1)從上述3-5輪篩選后含有噬菌體的細胞培養(yǎng)皿中，挑選96個單個菌落并接種于含有100微克每毫升的氨芐青霉素的tb培養(yǎng)基(1升tb培養(yǎng)基中含有2.3克磷酸二氫鉀，12.52克磷酸氫二鉀，12克蛋白胨，24克酵母提取物，4毫升甘油)中，生長至對數(shù)期后，加終濃度1毫摩爾的異丙基硫代半乳糖苷(iptg)，30-35℃培養(yǎng)過夜。

(2)利用滲透法獲得粗提抗體，并將抗體轉(zhuǎn)移到經(jīng)抗原包被的elisa板中，在室溫下放置1-1.5小時。

(3)用pbst洗去未結(jié)合的抗體，加入一抗鼠抗ha抗體(mouseanti-hatagantibody，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，在室溫下放置1-1.5小時。

(4)用pbst洗去未結(jié)合的抗體，加入anti-mousealkalinephosphatase conjugate(山羊抗小鼠堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，購自艾美捷科技有限公司)，在室溫下放置1-1.5小時。

(5)用pbst洗去未結(jié)合的抗體，加入堿性磷酸酶顯色液，于elisa儀上，在405nm波長，讀取吸收值。

(6)當(dāng)樣品孔od值大于對照孔od值3倍以上時，判為陽性克隆孔。

(7)將陽性克隆孔的菌轉(zhuǎn)搖在含有100微克每毫升的lb液體中以便提取質(zhì)粒并進行測序。

通過上述實驗，本發(fā)明得到了6個陽性克隆孔與抗原表現(xiàn)出3倍以上的結(jié)合力，視為初篩陽性克隆株。根據(jù)序列比對軟件vectornti分析各個初篩陽性克隆株的基因序列，把cdr1，cdr2，cdr3序列相同的株視為同一克隆株，而其序列不同的株視為不同克隆株，可以得到一組抗體的vhh鏈的氨基酸序列如seqidno：9所示。該fap納米抗體被編號為nb57，其氨基酸編號和結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

請參閱圖2，為fap納米抗體的dna電泳圖。圖中標(biāo)號為m的第一個凝膠孔的dna條帶是：1000bp的dna分子標(biāo)記，后面從左至右標(biāo)號為1-24的凝膠孔的dna條帶均為fap納米抗體dna電泳條帶。這些1-24凝膠孔的dna均為前述陽性克隆株中fap納米抗體dna的pcr產(chǎn)物，該pcr產(chǎn)物帶約為500bp。

實施例4：納米抗體在宿主菌大腸桿菌中表達、純化：

(1)將前面測序分析獲得的氨基酸序列如seqidno：9所示的克隆株的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌wk6中，并將其涂布在la+glucose即含有氨芐青霉素和葡萄糖的培養(yǎng)平板上，37℃培養(yǎng)過夜；

(2)挑選單個菌落接種在5ml含有氨芐青霉素的lb培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)過夜；

(3)接種1ml的過夜菌種至330mltb培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)到od值達到0.6～1時，加入iptg，30-35℃搖床培養(yǎng)過夜；

(4)離心，收菌；

(5)利用滲透法，獲得抗體粗提液；

(6)經(jīng)鎳柱離子親和層析可制備純度達90％以上的蛋白。

請參閱圖3，為fap納米抗體經(jīng)鎳柱樹脂凝膠親和層析純化后的sds-page的電泳圖。標(biāo)號m代表蛋白分子標(biāo)記，標(biāo)號nb57代表本發(fā)明實施例4得到的fap納米抗體nb57的sds-page條帶，圖中單位為kda。結(jié)果顯示，fap納米抗體nb57的大小約為15kda，該fap納米抗體nb57經(jīng)過上述純化過程，其純度可達到95％以上。

本發(fā)明還對上述實施例4純化后的fap納米抗體nb57進行了動力學(xué)親和力分析。實驗測得結(jié)合速率常數(shù)為3.01×10⁴(單位m^-1s^-1)，解離速率常數(shù)為1.23×10^-3(單位s^-1)，由此計算得到平衡解離常數(shù)為4.09×10^-8(單位m)。與從噬菌體文庫中選出的其它克隆株的親和力數(shù)據(jù)相比，該fap納米抗體nb57的平衡解離常數(shù)較低，代表抗體抗原間難以解離，其親和力較強。

本發(fā)明是根據(jù)特定實施例進行描述的，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)明白在不脫離本發(fā)明范圍時，可進行各種變化和等同替換。此外，為適應(yīng)本發(fā)明技術(shù)的特定場合或材料，可對本發(fā)明進行諸多修改而不脫離其保護范圍。因此，本發(fā)明并不限于在此公開的特定實施例，而包括所有落入到權(quán)利要求保護范圍的實施例。