本發(fā)明涉及男性不育癥檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測與特發(fā)性無精子癥相關(guān)的遺傳標(biāo)記的試劑盒。

背景技術(shù)：

全球約有10％～15％的育齡夫婦面臨不能生育的問題，其中一半是由于男性不育。原發(fā)性無精子癥是造成男性不育的一個非常重要的原因，約影響1％的成年男性。男性不育發(fā)病因素具有復(fù)雜性和多樣性的特點，包括疾病、營養(yǎng)不良、內(nèi)分泌紊亂、基因缺陷和環(huán)境因素等，其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，但從家族病例報道和小鼠模型的研究成果中可以推斷遺傳因素起了很大作用。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們已發(fā)現(xiàn)近200個基因與男性不育癥的發(fā)生密切相關(guān)；采用基因敲除技術(shù)，發(fā)現(xiàn)近400個基因與小鼠精子發(fā)生密切相關(guān)，這些基因的突變、缺失或表達(dá)異常，可能是男性不育癥發(fā)生的重要原因。對這些突變基因的研究將有助于男性不育癥的診斷，也有助于將來在體外受精過程中防止將遺傳缺陷帶給下一代。

雄激素受體(AR，NCBI Gene ID:367)是一種重要的類固醇激素受體，在男性性分化和維持正常精子發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。AR屬于核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的類固醇激素作用的家族。AR有4個蛋白結(jié)構(gòu)，包括N末端反式激活結(jié)構(gòu)域(NTD)，DNA結(jié)合域(DBD)，鉸鏈區(qū)(HR)和羧基配體結(jié)合域(LBD)。它能結(jié)合雄激素，包括睪酮(T)和5α-二氫睪酮(DHT)的配體結(jié)合域，從而介導(dǎo)核易位和AR的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。

在過去的幾年中，確定了一些AR突變或多態(tài)性，可以導(dǎo)致或與遺傳疾病相關(guān)，如完全或部分雄激素不敏感綜合征(CAIS和PAIS)。然而，還需要深入地研究以揭示AR突變與特發(fā)性無精子癥(IA)的關(guān)系，為特發(fā)性無精子癥的診斷提供依據(jù)和指導(dǎo)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了確定IA患者AR基因突變的情況，我們將776例IA患者和709例正常生育男性的AR基因外顯子測序，首次新發(fā)現(xiàn)5個錯義突變和1個同義突變與IA的發(fā)生相關(guān)。

基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供一種與特發(fā)性無精子癥相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其位于AR基因的編碼區(qū)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中，上述序列的突變位點選自c.868T>C、c.1484G>A、c.1888C>T、c.569C>T、c.616A>G和c.1149C>T中的一個或多個。

前5個突變位點是錯義突變，第6個突變位點是同義突變。

上述突變分別是在如SEQ ID NO:1所示的AR基因序列的編碼區(qū)的第868位、1484位、1888位、569位、616位、1279位和1149位。

前5個突變位點依次分別對應(yīng)的氨基酸變化情況是p.C290R、p.S495N、p.R630W、p.T190I和p.S206G，即第290位氨基酸由C變?yōu)镽、第495位氨基酸由S變?yōu)镹、第630位氨基酸由R變?yōu)閃、第190位氨基酸由T變?yōu)镮、第206位氨基酸由S變?yōu)镚。第6個突變位點沒有對應(yīng)的氨基酸變化。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述序列的突變位點選自c.868T>C、c.1484G>A和c.1888C>T中的一個或多個。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述序列的突變位點選自c.1888C>T。

本發(fā)明還提供一種檢測與特發(fā)性無精子癥相關(guān)的遺傳標(biāo)記的試劑盒，其中，該試劑盒包括引物對，上述遺傳標(biāo)記位于AR基因的編碼區(qū)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中，上述序列的突變位點選自c.868T>C、c.1484G>A、c.1888C>T、c.569C>T、c.616A>G和c.1149C>T中的一個或多個；上述引物對的上游引物和下游引物分別位于上述突變位點的上游和下游。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述引物對選自primer 1、primer 2或primer 3引物對，其中，

上述primer 1引物對的上游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO:3所示；

上述primer 2引物對的上游引物的序列如SEQ ID NO:4所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO:5所示；

上述primer 3引物對的上游引物的序列如SEQ ID NO:6所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO:7所示。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述序列的突變位點選自c.868T>C、c.1484G>A和c.1888C>T中的一個或多個。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述序列的突變位點選自c.1888C>T。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，上述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反應(yīng)緩沖液中的一種或多種。

通過大規(guī)模測序在特發(fā)性無精子癥病人中篩選出了AR基因的6個新的突變位點，構(gòu)建AR基因野生型及突變體表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行研究，通過實驗發(fā)現(xiàn)其功能有明顯差異，表明AR基因的上述突變可能導(dǎo)致特發(fā)性無精子癥的發(fā)生，從而能夠通過上述突變來實現(xiàn)對男性不育癥(尤其是特發(fā)性無精子癥)的診斷檢測。本發(fā)明在突變位點的上游和下游分別設(shè)計上游引物和下游引物用于檢測上述突變位點，實現(xiàn)特發(fā)性無精子癥的診斷檢測。

附圖說明

圖1為無精子癥患者AR基因的3個錯義突變位點測序圖譜；

圖2為無精子癥患者AR基因的3個錯義突變位點影響的進(jìn)化保守性的氨基酸；

圖3為在AR基因上發(fā)現(xiàn)的3個IA病人特異的錯義突變的位置；

圖4為3個AR突變體對下游靶基因MMTV表達(dá)的影響，NC表示陰性對照，WT表示野生型。

具體實施方式

下面通過具體實施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

1實驗內(nèi)容

1.1標(biāo)本的收集

本申請人從2007年6月到2011年10月共收集1880例無精子癥病人，其中特發(fā)性無精子癥病人為776例，我們的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：1)隨機(jī)檢查三次精液中無精子；2)生殖系統(tǒng)或盆腔無阻塞、炎癥和損傷；3)無核型異常和Y染色體微缺失，另將709例正?？捎行?至少育有一個孩子且未行IVF、ICSI、IMSI等人類輔助生殖技術(shù))作為對照進(jìn)行研究。每例受試者均認(rèn)真簽署知情同意書，本次研究通過醫(yī)院倫理委員會的審查批準(zhǔn)。

1.2外顯子測序

抽取外周血提取基因組DNA，用枸櫞酸鈉抗凝管收集研究對象的外周血，迅速置于-80℃冰箱中備用，用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取外周血DNA。

取出5微克基因組DNA送華大基因研究中心(深圳)進(jìn)行外顯子捕獲、測序，在特發(fā)性無精子癥患者中篩選出AR基因中的9個突變位點中，其中7個錯義突變和2個同義突變，與dbSNP135數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫和ExAC數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)相比對，有5種錯義突變和1個同義突變是我們首次發(fā)現(xiàn)的新突變。

1.3驗證錯義突變

以提取的外周血基因組DNA為模板，使用設(shè)計合成的3對引物對僅在特發(fā)性無精子癥患者(W320，W691，W530)AR基因存在的3個錯義突變位點(c.868T>C、c.1484G>A和c.1888C>T)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，AR序列從NCBI數(shù)據(jù)庫中查得(NCBI Gene ID:367)。引物由Invitrogen公司合成，所合成的3對引物對見表1。

表1 AR突變位點驗證引物

PCR擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性2min，然后以98℃10s、60℃30s、72℃45s進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸5min。

DNA電泳：取3μl的PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠孔中，140V電泳，15min，紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察電泳圖，確保單一條帶，其余PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基公司測序，引物對Primer1、Primer2和Primer3擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物片段序列分別如序列表中SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

1.4 AR突變體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以pcDNA3.1-AR(Mou L等人,Identification of Ube2b as a novel tARget of androgen receptor in mouse sertoli cells.BiolReprod.2013Aug 15；89(2):32.)為模板，使用設(shè)計合成的3對點突變引物，構(gòu)建AR的3種突變體表達(dá)質(zhì)粒。引物由Invitrogen公司合成，所合成的3對點突變引物見表2。

表2 AR 3對定點突變引物

1.5雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/p>

1.5.1質(zhì)粒準(zhǔn)備

野生型AR表達(dá)載體：pcDNA3.1-AR WT(WT組)

突變型AR表達(dá)載體：pcDNA3.1-AR C290R(C290R組)

pcDNA3.1-AR S495N(S495N組)

pcDNA3.1-AR R630W(R630W組)

1.5.2 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)

將HeLa細(xì)胞用含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％CO₂和95％濕度條件下培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞在長滿瓶底時，用0.25％胰蛋白酶消化后按比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.5.3 HeLa細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染

將HeLa細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，方法參考轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine^TM2000說明書。轉(zhuǎn)染6h后，用移液槍吸棄每孔培養(yǎng)液，每孔再加入新的1640培養(yǎng)基500μl，減少Lipofectamine^TM2000對細(xì)胞的毒性。

1.5.4雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)錄因子活性

1)轉(zhuǎn)染24h后收集細(xì)胞，用移液槍吸棄每孔培養(yǎng)液，每孔加入PBS 1ml洗滌2次；

2)將5×Passive Lysis Buffer稀釋成1×Passive Lysis Buffer，用移液槍向每孔加入100μl Passive Lysis Buffer；

3)室溫下在搖床上裂解細(xì)胞15min，用微量移液槍分別吸取每孔細(xì)胞裂解液5μl至一個干凈的1.5mL透明EP中；

4)在避光環(huán)境中依次向每個EP管中加入19μl Luciferase AssayⅡBuffer后用單管光度計檢測螢火蟲熒光照度；

5)在避光環(huán)境中依次再向每個EP管中加入19μl STOP Buffer后用單管光度計檢測海腎熒光照度，以螢火蟲熒光來校正海腎熒光減少實驗誤差。測定報告基因的相對活性。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

所用統(tǒng)計學(xué)方法來自于SPSS17.0軟件，每組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間均值的比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2實驗結(jié)果

2.1特發(fā)性無精子癥患者AR基因點突變的鑒定

對776例特發(fā)性無精子癥患者和709例正?？捎行缘腁R基因的外顯子測序結(jié)果分析，如表3所示：AR基因的9個突變均為純合突變，前7個為錯義突變，最后2個為同義突變。與dbSNP135數(shù)據(jù)庫、千人基因組數(shù)據(jù)庫和ExAC數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)相比對，有5個錯義突變(c.868T>C，c.1484G>A，c.1888C>T，c.569C>T，c.616A>G)和1個同義突變(c.1149C>T)是我們首次發(fā)現(xiàn)的新突變。在709例正?？捎行灾杏?個錯義突變(c.868T>C，c.1484G>A，c.1888C>T)和1個同義突變(c.1149C>T)是不存在的。我們進(jìn)一步用PCR測序驗證這3個錯義突變，結(jié)果如圖1所示。

在不同物種中AR氨基酸序列的同源性比較顯示R630W的突變影響了一個高度保守的氨基酸(圖2)，圖2是采用MegAlign(Demonstration System DNASTAR,Inc.)軟件對不同蛋白進(jìn)行比對得到的，其中AR蛋白的編號如下：人(human)(NP_000035.2)，黑猩猩(chimpanzee)(XP_009437511.1)，恒河猴(rhesus)(NP_001028083.1)，牛(cow)(NP_001231056.1)，大鼠(rat)(NP_036634.1)，小鼠(mouse)(NP_038504.1)和雞(chicken)(NP_001035179.1)。圖2中方框表示突變的位置，*表示保守序列。

基于保守型分析，SIFT和Polyphen 2.0軟件分析的結(jié)果顯示，R630W的突變可能影響蛋白的功能(表4)。這3個錯義突變的位置如圖3所示。

表3 AR點突變在特發(fā)性無精子癥組和正常組中的情況

注：病人編號以W開頭，編號1-7為錯義突變，編號8、9為同義突變。

表4 SIFT和PolyPhen 2.0軟件預(yù)測錯義突變對蛋白功能的影響

注：SIFT得分≤0.05：破壞，≥0.05：容忍；

PolyPhen-2:很可能破壞(概率得分>0.85)，可能破壞(概率得分>0.15)，良性(保持)。

2.2 AR突變體功能的變化

為了評估我們發(fā)現(xiàn)的病人特有的AR錯義突變是否影響了其調(diào)節(jié)功能，我們采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒瑢MTV-LUC(Mou L等人,Identification of Ube2b as a novel tARget of androgen receptor in mouse sertoli cells.BiolReprod.2013Aug 15；89(2):32)與AR野生型及3種突變體質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中，由于AR屬于配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，因此我們轉(zhuǎn)染后用雄激素進(jìn)行處理，將檢測到的螢火蟲熒光值/海參熒光值來表示啟動子的活性。與野生型AR一致，AR C290R和S495N突變體也可以激活MMTV啟動子的活性，僅AR R630W突變體與野生型有顯著差異，不能激活MMTV啟動子的活性(見圖4)。這些結(jié)果表明，R630W變體抑制AR轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。

2.3臨床信息及激素水平檢測

帶有3個錯義突變(c.868T>C，c.1484G>A，c.1888C>T)的患者進(jìn)一步進(jìn)行了陰囊超聲檢查，結(jié)果顯示陰囊睪丸小，具有均勻的回聲特性和廣泛的低回聲；沒有觀察到固體或囊性病變。表5總結(jié)了這三例患者的臨床和激素水平數(shù)據(jù)。這些患者都沒有男性不育癥的家族史。所有AR突變患者均不存在CAIS或PAIS的個人或家族史。

表5.帶有3個錯義突變的患者的臨床信息及激素水平檢測

3討論

越來越多的證據(jù)表明，AR是調(diào)節(jié)雄激素應(yīng)答基因表達(dá)的配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子。雄激素和AR對男性生精功能和生育能力至關(guān)重要。

雖然已經(jīng)報道AR基因有超過700個突變和多態(tài)性，只有5突變位于外顯子1，并在無精子癥患者有不同程度生精障礙或MAIS。所有這些患者的外生殖器正常，復(fù)雜的臨床表現(xiàn)和我們的報告都證實了這個方面。與此同時，雄性AR基因敲除小鼠表現(xiàn)出雌性個體的典型外觀，這類似于一個人雄激素不敏感綜合征或睪丸女性化變異小鼠。

在本發(fā)明的研究中，我們測序了776個IA患者AR的編碼序列。R630W突變定位于AR的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在776例患者中的發(fā)現(xiàn)了一個患者有這個突變，但是不存在于709個生育男性以及報告在公共數(shù)據(jù)庫中的其他個體。使用PolyPhen-2和Sift軟件分析R630W突變，預(yù)測有對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生影響。此外，AR的氨基酸序列的局部比對分析表明，受影響的精氨酸殘基在多個物種高度保守，包括雞。這個突變附件的氨基酸都很保守，提示突變可能對AR的功能有較大的影響。

當(dāng)我們試圖評估AR對不育患者的致病作用時，一個關(guān)鍵的問題要解決的是突變的AR是否影響其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。正如預(yù)期，我們發(fā)現(xiàn)R630W突變影響了AR對MMTV啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。

總之，我們通過大規(guī)模并行測序技術(shù)確定了AR基因的七個錯義突變和兩個同義突變。通過功能試驗表明，R630W突變抑制AR的正常轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。