本發(fā)明屬于與糖尿病有關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況的藥物治療領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及人胰島素類似物的新型?；苌铩１景l(fā)明還提供了包含這樣的衍生的胰島素類似物的藥物組合物，并且涉及這樣的衍生物在治療或預(yù)防與糖尿病有關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況中的用途。

背景技術(shù)：

用于治療糖尿病的胰島素療法已經(jīng)使用了數(shù)十年。胰島素療法通常包括每天施用若干次胰島素注射。這樣的療法通常包括每天施用一次或兩次長(zhǎng)效基礎(chǔ)注射，以及在就餐時(shí)注射速效胰島素(即餐時(shí)使用)。胰島素療法的一個(gè)關(guān)鍵改善是速效胰島素類似物的引入。然而，即使采用速效胰島素類似物，峰值胰島素水平通常也不會(huì)在注射后50至70分鐘之前出現(xiàn)。

因此，胰島素注射沒有復(fù)制胰島素的天然時(shí)間-作用譜(profile)。特別是，在沒有糖尿病的人中，第一階段胰島素釋放的天然陡增(spike)導(dǎo)致血液胰島素水平在葡萄糖從飲食進(jìn)入血液的數(shù)分鐘內(nèi)上升。相反，注射的胰島素僅緩慢地進(jìn)入血液，其峰值胰島素水平在常規(guī)人胰島素注射后80至100分鐘內(nèi)出現(xiàn)。

因?yàn)樗傩б葝u素類似物沒有充分模擬第一階段胰島素釋放，所以采用胰島素療法的糖尿病患者在進(jìn)食開始時(shí)存在的胰島素水平仍然不足，并且在兩餐之間存在過(guò)多的胰島素。胰島素遞送的這種滯后可能導(dǎo)致餐后早期高血糖的發(fā)作。

胰島素具有自締合性質(zhì)，并且其濃度代表自締合的主要因素。在高濃度時(shí)，特別是在藥物制劑中時(shí)，胰島素將自締合成二聚體、六聚體、十二聚體和晶體。然而，胰島素的生理學(xué)活性形式為單體，該單體與胰島素受體結(jié)合并觸發(fā)生物反應(yīng)。

胰島素作用的速度(rapidity)取決于胰島素從皮下組織被吸收得有多快。當(dāng)皮下注射常規(guī)人胰島素時(shí)，該制劑主要由含有兩個(gè)鋅離子的六聚體組成。由于其大小，該六聚體胰島素具有較低的擴(kuò)增速率，因此其吸收速率比較小的物質(zhì)慢。

兩個(gè)鋅原子位于六聚體內(nèi)，其使分子對(duì)化學(xué)和物理降解穩(wěn)定。注射后，在皮下組織中發(fā)生濃度驅(qū)使的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致該六聚體解離成二聚體，并隨后成為單體。過(guò)去，這些常規(guī)人胰島素制劑達(dá)到最大血漿濃度水平需要約120分鐘。比常規(guī)人胰島素更快吸收的鋅-胰島素制劑已經(jīng)商品化，例如門冬胰島素和賴脯胰島素。

無(wú)鋅胰島素制劑將能夠?qū)崿F(xiàn)更快的皮下吸收，但一般對(duì)于胰島素而言，無(wú)鋅制劑的化學(xué)和物理穩(wěn)定性是個(gè)挑戰(zhàn)。

各種胰島素衍生物已被建議用于不同的用途。

WO 1998 042749描述了用于肺部給藥的無(wú)鋅胰島素晶體。

US 6960561描述了具有改善的穩(wěn)定性的無(wú)鋅和低鋅胰島素制劑。

WO 2007/096431描述了某些人胰島素衍生物，包括在A22位置具有?；馁嚢彼釟埢⒃贐29位置具有精氨酸殘基并且為desB30的類似物，這些衍生物在生理pH值下可溶并且具有延長(zhǎng)的作用譜，并且旨在用作長(zhǎng)效胰島素。

WO 2009/022013描述了某些酰化的胰島素類似物，包括在A22位置具有?；馁嚢彼釟埢?、在B29位置具有精氨酸殘基并且為desB30的類似物，其具有較高的胰島素受體結(jié)合親和力，并且旨在用作長(zhǎng)效胰島素。

WO 2009/112583描述了某些胰島素類似物，包括在A22位置具有賴氨酸殘基、在B29位置具有精氨酸殘基并且為desB30的類似物，其表現(xiàn)出改善的蛋白酶穩(wěn)定性。

WO 2011/161124描述了含有額外的二硫鍵以改善穩(wěn)定性的某些?；囊葝u素類似物，包括在A22位置具有賴氨酸殘基、在B29位置具有精氨酸殘基并且為desB30的類似物。

WO 2012/171994描述了包含兩個(gè)或更多個(gè)置換的某些胰島素衍生物，包括在A22位置具有酰化的賴氨酸殘基、在B29位置具有精氨酸殘基并且為desB30的類似物，其具有延長(zhǎng)的體內(nèi)活性。

WO 2013 063572描述了任選地缺乏鋅的超濃縮速效胰島素類似物制劑。

而且，具有白蛋白結(jié)合部分的肽和蛋白質(zhì)的酰化已用于延長(zhǎng)該肽和蛋白質(zhì)的作用持續(xù)時(shí)間。

然而，根據(jù)本發(fā)明的胰島素衍生物尚未有報(bào)道，并且從未提出其作為速效胰島素衍生物用于餐時(shí)使用的用途。

發(fā)明目的

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供在皮下施用后具有餐時(shí)分布(prandial profile)的胰島素類似物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供在制劑中化學(xué)穩(wěn)定的胰島素類似物。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供在未添加鋅的制劑中化學(xué)穩(wěn)定的胰島素類似物。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供在制劑中物理穩(wěn)定的胰島素類似物。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供在未添加鋅的制劑中物理穩(wěn)定的胰島素類似物。

本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供在制劑中化學(xué)和物理穩(wěn)定的胰島素類似物。

本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供在未添加鋅的制劑中化學(xué)和物理穩(wěn)定的胰島素類似物。

本發(fā)明的第八個(gè)目的是提供在皮下施用后，相對(duì)于當(dāng)前市售的餐時(shí)胰島素具有肝偏好性(hepatopreferential)的胰島素類似物。

本發(fā)明的第九個(gè)目的是提供在皮下施用后，相對(duì)于當(dāng)前市售的餐時(shí)胰島素具有肝選擇性的胰島素類似物。

本發(fā)明的第十個(gè)目的是提供在餐時(shí)皮下施用后，相對(duì)于當(dāng)前市售的餐時(shí)胰島素不容易引起低血糖的胰島素類似物。

本發(fā)明的第十一個(gè)目的是提供在餐時(shí)皮下施用后，相對(duì)于當(dāng)前市售的餐時(shí)胰島素不容易引起體重增加的胰島素類似物。

本發(fā)明的第十二個(gè)目的是提供在餐時(shí)皮下施用后，相對(duì)于當(dāng)前市售的餐時(shí)胰島素不容易引起低血糖和體重增加的胰島素類似物。

本發(fā)明的進(jìn)一步的目的在于以上提到的一個(gè)或多個(gè)目的的組合，具體為提供在皮下施用后顯示出餐時(shí)分布，同時(shí)在制劑中，特別是在未添加鋅的制劑中化學(xué)穩(wěn)定的胰島素類似物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

我們已發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的相似胰島素衍生物，本發(fā)明的A22K?；囊葝u素衍生物具有顯著改善的性質(zhì)。我們特別發(fā)現(xiàn)，與現(xiàn)有技術(shù)的相似衍生物相比，在未添加鋅離子的制劑中的本發(fā)明胰島素衍生物與分子聚集體的較小大小相關(guān)。已知較小的物質(zhì)比較大的物質(zhì)擴(kuò)散更快，因此預(yù)期將被更快地吸收。例如，可以如本文所述通過(guò)小角度X射線散射(SAXS)以及通過(guò)用實(shí)施例部分描述的SEC-HPLC(大小排阻HPLC)進(jìn)行系列稀釋來(lái)測(cè)量這些分子聚集體的大小。

我們還發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的相似衍生物，在未添加鋅離子的制劑中的本發(fā)明胰島素衍生物在皮下施用至豬后被更快地吸收，由此證明了胰島素用于餐時(shí)使用的潛在臨床實(shí)用性。我們已發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的相似衍生物，在皮下施用至豬后，在未添加鋅離子的制劑中的本發(fā)明胰島素衍生物與較少的“拖尾(tailing)”相關(guān)。所謂較少的拖尾是指，所注射的胰島素的皮下儲(chǔ)留物(depot)比現(xiàn)有技術(shù)的相似類似物更快地被吸收，使得與現(xiàn)有技術(shù)的相似?；苌锵啾?，本發(fā)明胰島素衍生物的皮下施用后平均停留時(shí)間(MRT)更短。

無(wú)鋅制劑能夠?qū)崿F(xiàn)更快的皮下吸收，但一般對(duì)于胰島素而言，無(wú)鋅制劑的化學(xué)和物理穩(wěn)定性是個(gè)挑戰(zhàn)，并且迄今為止只有賴谷胰島素(B3K，B29E人胰島素)被證明是可行的，而且只有在表面活性劑的存在下分散于小瓶中時(shí)才是可行的。

現(xiàn)在我們發(fā)現(xiàn)，在B3位置處具有置換的本發(fā)明A22K?；葝u素衍生物的亞組非常意外地且前所未有地在未添加鋅離子和表面活性劑的制劑中同時(shí)化學(xué)和物理穩(wěn)定。

使用?；囊葝u素衍生物作為餐時(shí)胰島素療法的優(yōu)勢(shì)是，獲得了比通過(guò)用未?；牟蜁r(shí)胰島素如門冬胰島素、賴脯胰島素或賴谷胰島素治療所達(dá)到的血漿胰島素濃度更高的血漿胰島素濃度。

根據(jù)本發(fā)明的A22K酰化胰島素衍生物在皮下施用后具有與餐時(shí)類似的時(shí)間-作用譜。

根據(jù)本發(fā)明具有基于十四烷二酸、十五烷二酸或十六烷二酸的白蛋白結(jié)合體的A22K?；葝u素衍生物已顯示賦予極高的胰島素受體結(jié)合親和力，該親和力在1.5％人血清白蛋白(HSA)的存在下降低。

根據(jù)本發(fā)明的A22K酰化胰島素衍生物在生理鹽濃度下溶解度不會(huì)降低。

因此，在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了新型胰島素衍生物，該胰島素衍生物是人胰島素類似物的?；苌?，該類似物是相對(duì)于人胰島素的[A22K，desB27，B29R，desB30]；并且該胰島素類似物是通過(guò)用以下式II的基團(tuán)對(duì)A22位置處的賴氨酸殘基的ε氨基進(jìn)行酰化而衍生的：

[?；鵠-[連接體]-

其中該連接體基團(tuán)是由1到10個(gè)選自-gGlu-和-OEG-的氨基酸殘基組成的氨基酸鏈；其中g(shù)Glu代表γ谷氨酸殘基；OEG代表8-氨基-3，6-二氧雜辛酸殘基(即，式-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-的基團(tuán))；該氨基酸殘基可以以任意順序存在；并且該氨基酸鏈包含至少一個(gè)gGlu殘基；并且

其中該酰基是選自1，14-十四烷二酸、1，15-十五烷二酸和1，16-十六烷二酸的α，ω-二羧酸殘基；

該酰化的類似物可以另外包含A14E，和/或B3E或B3Q置換。

在另一個(gè)第一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的胰島素衍生物和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的胰島素衍生物作為藥物的用途。

在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了用于治療、預(yù)防或減輕與糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、葡萄糖耐量減低、高血糖、血脂異常、肥胖癥、代謝綜合征(代謝綜合征X、胰島素抵抗綜合征)、高血壓、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、中風(fēng)、心血管疾病、冠心病、炎性腸綜合征、消化不良或胃潰瘍有關(guān)的疾病、病癥或狀況的方法，該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的本發(fā)明的胰島素衍生物。

基于以下詳述和實(shí)施例，本發(fā)明的其他目的對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)變得顯而易見。

具體實(shí)施方式

胰島素衍生物

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了新型胰島素衍生物，該胰島素衍生物是?；娜艘葝u素類似物。

本發(fā)明的胰島素衍生物可具體被表征為一種酰化的人胰島素類似物，該類似物是相對(duì)于人胰島素的[A22K，desB27，B29R，desB30]；

并且該胰島素類似物是通過(guò)用以下式II的基團(tuán)對(duì)A22位置處的賴氨酸殘基的ε氨基進(jìn)行?；苌模?/p>

[?；鵠-[連接體]-

其中該連接體基團(tuán)是由1到10個(gè)選自-gGlu-和-OEG-的氨基酸殘基組成的氨基酸鏈；其中g(shù)Glu代表γ谷氨酸殘基；OEG代表8-氨基-3，6-二氧雜辛酸殘基(即，式-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-的基團(tuán))；該氨基酸殘基可以以任意順序存在；并且該氨基酸鏈包含至少一個(gè)gGlu殘基；并且

其中該?；沁x自1，14-十四烷二酸、1，15-十五烷二酸和1，16-十六烷二酸的α，ω-二羧酸殘基。

本發(fā)明的胰島素衍生物可以另外包含A14E，和/或B3E或B3Q置換。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人胰島素類似物是相對(duì)于人胰島素的[A14E，A22K，B3E，desB27，B29R，desB30]、[A14E，A22K，desB27，B29R，desB30]；[A22K，B3E，desB27，B29R，desB30]、[A22K，B3Q，desB27，B29R，desB30]或[A22K，desB27，B29R，desB30]；并且該胰島素類似物在A22位置的賴氨酸殘基的ε氨基處被?；?/p>

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述人胰島素類似物是相對(duì)于人胰島素的[A22K，desB27，B29R，desB30]；并且該胰島素類似物在A22位置的賴氨酸殘基的ε氨基處被?；?。

在第三個(gè)實(shí)施方案中，所述人胰島素類似物是相對(duì)于人胰島素的[A22K，B3E，desB27，B29R，desB30]；并且該胰島素類似物在A22位置的賴氨酸殘基的ε氨基處被?；?/p>

在第四個(gè)實(shí)施方案中，所述人胰島素類似物是相對(duì)于人胰島素的[A22K，B3Q，desB27，B29R，desB30]；并且該胰島素類似物在A22位置的賴氨酸殘基的ε氨基處被?；?。

在第五個(gè)實(shí)施方案中，所述人胰島素類似物是相對(duì)于人胰島素的[A14E，A22K，desB27，B29R，desB30]；并且該胰島素類似物在A22位置的賴氨酸殘基的ε氨基處被酰化。

在第六個(gè)實(shí)施方案中，所述人胰島素類似物是相對(duì)于人胰島素的[A14E，A22K，B3E，desB27，B29R，desB30]；并且該胰島素類似物在A22位置的賴氨酸殘基的ε氨基處被?；?。

如上所述，所述胰島素類似物是通過(guò)用如上所述的式II的基團(tuán)(即，具有與連接基團(tuán)結(jié)合的酰基的取代基)對(duì)A22位置處的賴氨酸殘基的ε氨基進(jìn)行?；苌?。

在本發(fā)明的上下文中，根據(jù)式II的連接基團(tuán)是由1到10個(gè)選自-gGlu-和-OEG-的氨基酸殘基組成的氨基酸鏈。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)式II的連接基團(tuán)是由1到7個(gè)選自-gGlu-和-OEG-的氨基酸殘基組成的氨基酸鏈，包含1到4個(gè)gGlu殘基和0到3個(gè)OEG殘基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)式II的連接基團(tuán)選自-gGlu-、-2xgGlu-、-3xgGlu-、-4xgGlu-、-gGlu-2xOEG-、-gGlu-3x(OEG-gGlu)-、-4xgGlu-2xOEG-、-2xOEG-和-2xOEG-gGlu-。

在第三個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)式II的連接基團(tuán)是-gGlu-。

在第四個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)式II的連接基團(tuán)是-2xgGlu-。

在第五個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)式II的連接基團(tuán)是-3xgGlu-。

在第六個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)式II的連接基團(tuán)是-4xgGlu-。

在第七個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)式II的連接基團(tuán)是-gGlu-2xOEG-。

在第八個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)式II的連接基團(tuán)是-gGlu-3x(OEG-gGlu)-。

在第九個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)式II的連接基團(tuán)是-4xgGlu-2xOEG-。

在第十個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)式II的連接基團(tuán)是-2xOEG-。

在第十一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)式II的連接基團(tuán)是-2xOEG-gGlu-。

在本發(fā)明的上下文中，根據(jù)式II的?；苌?，14-十四烷二酸、1，15-十五烷二酸或1，16-十六烷二酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)式II的酰基衍生自1，14-十四烷二酸(即，1，14-十四烷二?；?。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)式II的?；苌?，15-十五烷二酸(即，1，15-十五烷二?；?。

在第三個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)式II的?；苌?，16-十六烷二酸(即，1，16-十六烷二?；?。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，如上所述的式II的基團(tuán)是十四烷二酰基-gGlu-、十四烷二酰基-2xgGlu-、十四烷二?；?3xgGlu-、十四烷二?；?4xgGlu-、十四烷二酰基-gGlu-2xOEG-、十四烷二酰基-4xgGlu-2xOEG-、十四烷二酰基-2xOEG-、十五烷二?；?4xgGlu-、十六烷二?；?4xgGlu-、十六烷二?；?gGlu-2xOEG-或十六烷二酰基-3x(gGlu-OEG)-gGlu-。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，式II的基團(tuán)是十四烷二?；?gGlu-。

在第三個(gè)實(shí)施方案中，式II的基團(tuán)是十四烷二酰基-2xgGlu-。

在第四個(gè)實(shí)施方案中，式II的基團(tuán)是十四烷二?；?3xgGlu-。

在第五個(gè)實(shí)施方案中，式II的基團(tuán)是十四烷二?；?4xgGlu-。

在第六個(gè)實(shí)施方案中，式II的基團(tuán)是十四烷二?；?gGlu-2xOEG-。

在第七個(gè)實(shí)施方案中，式II的基團(tuán)是十四烷二?；?2xOEG-。

在第八個(gè)實(shí)施方案中，式II的基團(tuán)是十四烷二?；?4xgGlu-2xOEG-。

在第九個(gè)實(shí)施方案中，式II的基團(tuán)是十五烷二酰基-4xgGlu-。

在第十個(gè)實(shí)施方案中，式II的基團(tuán)是十六烷二?；?4xgGlu-。

在第十一個(gè)實(shí)施方案中，式II的基團(tuán)是十六烷二?；?gGlu-2xOEG-。

在第十二個(gè)實(shí)施方案中，式II的基團(tuán)是十六烷二酰基-3x(gGlu-OEG)-gGlu-。

本發(fā)明的胰島素衍生物可具體為選自下組中的一個(gè)：

A22K(N(eps)-十四烷二酰基-4xgGlu)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A14E，A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二酰基-4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二?；?3x(gGlu-OEG)-gGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二?；?3x(gGlu-OEG)-gGlu)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二酰基-2xgGlu)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二?；?4xgGlu)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二?；?gGlu-2xOEG)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二酰基-3x(gGlu-OEG)-gGlu)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?2xOEG)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二酰基-4xgGlu)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十五烷二?；?4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu-2xOEG)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu-2xOEG)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A14E，A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A14E，A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?2xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；以及

A22K(N(eps)-十四烷二?；?3xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素。

本發(fā)明化合物的優(yōu)選特征

可以參考以下特征中的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步表征本發(fā)明：

1.一種酰化的人胰島素類似物，該類似物為[A22K，desB27，B29R，desB30]；并且該胰島素類似物任選地具有A14E，和/或B3E或B3Q置換；并且該胰島素類似物在A22位置的賴氨酸殘基的ε氨基處被酰化。

2.根據(jù)第1項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，該類似物為相對(duì)于人胰島素的[A22K，desB27，B29R，desB30]；并且該胰島素類似物具有B3E或B3Q置換；并且該胰島素類似物在A22位置的賴氨酸殘基的ε氨基處被?；?/p>

3.根據(jù)第1項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，該類似物為相對(duì)于人胰島素的[A22K，B3E，desB27，B29R，desB30]；并且該胰島素類似物在A22位置的賴氨酸殘基的ε氨基處被酰化。

4.根據(jù)第1項(xiàng)所述的酰化的人胰島素類似物，該類似物為相對(duì)于人胰島素的[A22K，B3Q，desB27，B29R，desB30]；并且該胰島素類似物在A22位置的賴氨酸殘基的ε氨基處被酰化。

5.根據(jù)第1項(xiàng)所述的酰化的人胰島素類似物，該類似物為相對(duì)于人胰島素的[A14E，A22K，desB27，B29R，desB30]；并且該胰島素類似物在A22位置的賴氨酸殘基的ε氨基處被?；?。

6.根據(jù)第1項(xiàng)所述的酰化的人胰島素類似物，該類似物為相對(duì)于人胰島素的[A14E，A22K，desB27，B29R，desB30]；并且該胰島素類似物具有B3E或B3Q置換；并且該胰島素類似物在A22位置的賴氨酸殘基的ε氨基處被酰化。

7.根據(jù)第1項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，該類似物為相對(duì)于人胰島素的[A14E，A22K，B3E，desB27，B29R，desB30]；并且該胰島素類似物在A22位置的賴氨酸殘基的ε氨基處被?；?/p>

8.根據(jù)第1項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，該類似物為相對(duì)于人胰島素的[A22K，desB27，B29R，desB30]；并且該胰島素類似物是通過(guò)用以下式II的基團(tuán)對(duì)A22位置處的賴氨酸殘基的ε氨基進(jìn)行?；苌模?/p>

[酰基]-[連接體]-

其中該連接體基團(tuán)是由1到10個(gè)選自-gGlu-和-OEG-的氨基酸殘基組成的氨基酸鏈；其中

gGlu代表γ谷氨酸殘基；并且

OEG代表8-氨基-3，6-二氧雜辛酸殘基(即，式-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-的基團(tuán))；

該氨基酸殘基可以以任意順序存在；并且

該氨基酸鏈包含至少一個(gè)gGlu殘基；并且

其中該?；沁x自以下的α，ω-二羧酸殘基：

1，14-十四烷二酸；

1，15-十五烷二酸；和

1，16-十六烷二酸；

該?；念愃莆锟梢粤硗獍珹14E，和/或B3E或B3Q置換。

9.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述?；茄苌?，14-十四烷二酸、1，15-十五烷二酸或1，16-十六烷二酸的二酸基團(tuán)。

10.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述酰基是衍生自1，14-十四烷二酸或1，16-十六烷二酸的二酸基團(tuán)。

11.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述?；茄苌?，14-十四烷二酸的二酸基團(tuán)。

12.根據(jù)第7項(xiàng)所述的酰化的人胰島素類似物，其中所述酰基是衍生自1，16-十六烷二酸的二酸基團(tuán)。

13.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述?；茄苌?，15-十五烷二酸的二酸基團(tuán)。

14.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述連接基團(tuán)包含1-10個(gè)gGlu殘基。

15.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述連接基團(tuán)包含1-8個(gè)gGlu殘基。

16.根據(jù)第7項(xiàng)所述的酰化的人胰島素類似物，其中所述連接基團(tuán)包含1-6個(gè)gGlu殘基。

17.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述連接基團(tuán)包含1-4個(gè)gGlu殘基。

18.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述連接基團(tuán)包含1-3個(gè)gGlu殘基。

19.根據(jù)第7項(xiàng)所述的酰化的人胰島素類似物，其中所述連接基團(tuán)包含1-2個(gè)gGlu殘基。

20.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述連接基團(tuán)包含1個(gè)gGlu殘基。

21.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述連接基團(tuán)包含2個(gè)gGlu殘基。

22.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述連接基團(tuán)包含3個(gè)gGlu殘基。

23.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述連接基團(tuán)包含4個(gè)gGlu殘基。

24.根據(jù)第7項(xiàng)所述的酰化的人胰島素類似物，其中所述連接基團(tuán)包含1-6個(gè)OEG殘基。

25.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述連接基團(tuán)包含1-4個(gè)OEG殘基。

26.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述連接基團(tuán)包含1-3個(gè)OEG殘基。

27.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述連接基團(tuán)包含1個(gè)OEG殘基。

28.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述連接基團(tuán)包含2個(gè)OEG殘基。

29.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述連接基團(tuán)包含3個(gè)OEG殘基。

30.根據(jù)第7項(xiàng)所述的酰化的人胰島素類似物，其中所述連接基團(tuán)不包含OEG殘基。

31.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述連接基團(tuán)選自-gGlu-、-2xgGlu-、-3xgGlu-、-gGlu-3x(OEG-Glu)-、-4xgGlu-、-2xOEG-、-4xgGlu-2xOEG-、-2xOEG-gGlu-和-gGlu-2xOEG-。

32.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述連接基團(tuán)選自-gGlu、-gGlu-3x(OEG-gGlu)-和-gGlu-2xOEG-。

33.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中所述連接基團(tuán)選自-gGlu-、-2xgGlu-和-4xgGlu-。

34.根據(jù)第7項(xiàng)所述的?；娜艘葝u素類似物，其中式II[酰基]-[連接體]-的基團(tuán)是十四烷二?；?gGlu-、十四烷二?；?2xgGlu-、十四烷二?；?3xgGlu-、十四烷二?；?4xgGlu-、十四烷二?；?gGlu-2xOEG-、十四烷二?；?2xOEG-、十四烷二?；?4xgGlu-2xOEG-、十六烷二?；?4xgGlu-、十六烷二酰基-gGlu-2xOEG-或十六烷二?；?3x(gGlu-OEG)-gGlu-。

35.根據(jù)第7項(xiàng)所述的酰化的人胰島素類似物，其中式II[酰基]-[連接體]-的基團(tuán)是十四烷二?；?gGlu-、十四烷二?；?2xgGlu-、十四烷二?；?4xgGlu-、十四烷二?；?gGlu-2xOEG-，或十四烷二?；?2xOEG-、十六烷二?；?4xgGlu-、十六烷二?；?gGlu-2xOEG-或十六烷二?；?3x(gGlu-OEG)-gGlu-。

定義

命名法

本文中，胰島素的命名根據(jù)以下原則進(jìn)行：

術(shù)語(yǔ)“類似物”頻繁地用于在經(jīng)歷進(jìn)一步的化學(xué)修飾(衍生)、特別是?；暗乃懻摰囊葝u素蛋白質(zhì)或肽。由這樣的化學(xué)修飾(衍生)所產(chǎn)生的產(chǎn)物通常被稱為“衍生物”或“?；念愃莆铩?。然而，在本申請(qǐng)的上下文中，術(shù)語(yǔ)“類似物”表示人胰島素的類似物以及這類人胰島素類似物的(酰化的)衍生物。

名稱作為相對(duì)于人胰島素的類似物、衍生物和修飾(?；?而給出。對(duì)于?；糠?即，式II的[?；鵠-[連接體]-基團(tuán))的命名，在一些情況下根據(jù)IUPAC命名法進(jìn)行命名，而在其他情況下按照肽命名法進(jìn)行命名。

作為一個(gè)示例，以下結(jié)構(gòu)(化學(xué)式1)的?；糠郑?/p>

可以被命名為“十四烷二?；?4xgGlu”、“十四烷二?；?4xγGlu”或“1，14-十四烷二酰基-4xgGlu”等，其中γGlu(和gGlu)是L構(gòu)型的氨基酸γ谷氨酸的簡(jiǎn)寫符號(hào)，并且“4x”是指后接的殘基重復(fù)4次。

類似地，以下結(jié)構(gòu)(化學(xué)式2)的酰基部分：

可以被命名為例如“十六烷二酰基-(gGlu-OEG)₃-gGlu)”、“十六烷二酰基-(gGlu-OEG)₃-gGlu)”、“十六烷二酰基-3x(gGlu-OEG)-gGlu)”、“1，16-十六烷二?；?(gGlu-OEG)₃-gGlu)”、“1，16-十六烷二?；?(gGlu-OEG)₃-gGlu)”、“1，16-十六烷二酰基-3x(gGlu-OEG)-gGlu)”、“十六烷二酰基-(γGlu-OEG)₃-γGlu)”、“十六烷二?；?(γGlu-OEG)₃-γGlu)”或“十六烷二?；?3x(γGlu-OEG)-γGlu)”；

其中以下結(jié)構(gòu)(化學(xué)式3)的部分：

可以被命名為例如十四烷二?；?，14-十四烷二?；?簡(jiǎn)寫符號(hào))C14二酸。類似的符號(hào)適用于具有15和16個(gè)碳原子的類似殘基，十五烷二酰基和十六烷二?；謩e對(duì)應(yīng)C15二酸和C16二酸。

γGlu(和gGlu)是L構(gòu)型的氨基酸γ谷氨酸的簡(jiǎn)寫符號(hào)。

OEG是氨基酸殘基8-氨基-3，6-二氧雜辛酸，即NH₂(CH₂)₂O(CH₂)₂OCH₂CO₂H的簡(jiǎn)寫符號(hào)。

“2x”和“3x”分別指后接的殘基重復(fù)2次、3次。

例如，實(shí)施例1的胰島素衍生物被命名為“A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，desB27，B29R，desB30人胰島素”，以表示含有人胰島素中的21個(gè)氨基酸殘基的A鏈已被延伸了1個(gè)氨基酸(A22位置)——賴氨酸(K)，該A鏈進(jìn)一步通過(guò)用十四烷二?；?4xgGlu部分對(duì)A22的賴氨酸殘基中的ε氮(表示為N^ε(或N(eps)))進(jìn)行?；恍揎棧辉贐27 位置的氨基酸-人胰島素中的T已被刪除；在B29位置的氨基酸-人胰島素中的K已被精氨酸R置換；在B30位置的氨基酸-人胰島素中的蘇氨酸T已被刪除。下式中的星號(hào)表示，與人胰島素相比，所討論的殘基是不同的(即，被置換)。

在整個(gè)申請(qǐng)中，同時(shí)給出了本發(fā)明的優(yōu)選胰島素的通式和名稱。

此外，還根據(jù)IUPAC命名法(OpenEye，IUPAC樣式)命名了本發(fā)明的胰島素。根據(jù)該命名法，實(shí)施例1的胰島素衍生物被指定以下的名稱：N{α}([ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳?；被?丁酰基]氨基]丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]丁?；鵠Lys，(B)-肽。

應(yīng)注意，通式可以這樣書寫，其中賴氨酸殘基(通過(guò)?；揎?以展開的賴氨酸殘基的方式繪出(如例如實(shí)施例23中所示)或以收縮的賴氨酸殘基的方式繪出(如例如實(shí)施例1中所示)。在所有情況下，?；c賴氨酸殘基的ε氮連接。

為了完整起見，可以提到，在B27位置的殘基的缺失(desB27)導(dǎo)致(在形式上)剩余的氨基酸殘基向N末端移動(dòng)一個(gè)殘基。因此，由于在B28位置的殘基是脯氨酸而在B29位置的殘基是精氨酸(參見，例如，實(shí)施例1的化合物)，因此這樣的類似物還可以被命名為B27P，B28R，desB29-30。這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)刪除B27，序列中的下一個(gè)氨基酸隨后移動(dòng)位置，因此在B28位置的氨基酸(脯氨酸)移至B27位置。

物理穩(wěn)定性

如本文所用的術(shù)語(yǔ)胰島素制劑的“物理穩(wěn)定性”是指由于蛋白質(zhì)暴露于熱機(jī)械應(yīng)力和/或與去穩(wěn)定化的界面及表面(如疏水性表面和界面)相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)形成無(wú)生物活性和/或不可溶的蛋白質(zhì)聚集體的傾向。在將裝在合適容器(例如，筒匣或小瓶)中的制劑在不同溫度下暴露于機(jī)械/物理應(yīng)力(例如，攪拌)不同的時(shí)間段后，通過(guò)目測(cè)和/或濁度測(cè)量來(lái)評(píng)估水性蛋白質(zhì)制劑的物理穩(wěn)定性。在暗背景下采用銳聚焦的光進(jìn)行制劑的目測(cè)。當(dāng)制劑在日光下顯示出目視可見的混濁時(shí)，將該制劑分類為就蛋白質(zhì)聚集而言物理不穩(wěn)定的?；蛘?，可以通過(guò)技術(shù)人員公知的簡(jiǎn)單濁度測(cè)量來(lái)評(píng)估制劑的濁度。還可以通過(guò)采用蛋白質(zhì)構(gòu)象狀態(tài)的光譜分析劑或探針來(lái)評(píng)估水性蛋白質(zhì)制劑的物理穩(wěn)定性。該探針優(yōu)選為優(yōu)先與蛋白質(zhì)的非天然構(gòu)象異構(gòu)體結(jié)合的小分子。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的小分子光譜探針的一個(gè)實(shí)例是硫代黃素T。硫代黃素T是已廣泛用于檢測(cè)淀粉樣原纖維的熒光染料。在原纖維以及可能的其他蛋白質(zhì)構(gòu)型的存在下，當(dāng)硫代黃素T與原纖維蛋白質(zhì)形式結(jié)合時(shí)，硫代黃素T產(chǎn)生了在約450nm處的新的最大激發(fā)以及在約482nm處的增強(qiáng)發(fā)射。未結(jié)合的硫代黃素T在這些波長(zhǎng)下基本沒有熒光。

化學(xué)穩(wěn)定性

如本文所用的術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)制劑的“化學(xué)穩(wěn)定性”是指共價(jià)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，其導(dǎo)致與天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相比具有可能更小的生物效力和/或可能增加的免疫原性性質(zhì)的化學(xué)降解產(chǎn)物的形成。根據(jù)天然蛋白質(zhì)的類型和性質(zhì)以及該蛋白質(zhì)所暴露的環(huán)境，可以形成各種化學(xué)降解產(chǎn)物。在蛋白質(zhì)制劑的儲(chǔ)存和使用過(guò)程中，常常觀察到逐漸增大的化學(xué)降解產(chǎn)物量。大多數(shù)蛋白質(zhì)容易脫酰胺，在脫酰胺過(guò)程中，谷氨酰胺?；蛱於０孵；鶜埢械膫?cè)鏈酰胺基團(tuán)水解形成游離的羧酸或天冬酰胺酰基殘基，以形成異Asp衍生物。其他降解途徑包括高分子量產(chǎn)物的形成，其中兩個(gè)或更多個(gè)蛋白質(zhì)分子通過(guò)轉(zhuǎn)酰胺基作用和/或二硫鍵相互作用彼此共價(jià)結(jié)合，從而導(dǎo)致共價(jià)結(jié)合的二聚體、寡聚物和聚合物降解產(chǎn)物的形成(Stability of Protein Pharmaceuticals，Ahern TJ&Manning MG，Plenum Press，New York 1992)。(例如，甲硫氨酸殘基的)氧化可以作為化學(xué)降解的另一種變型而被提及?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)量暴露于不同環(huán)境條件后不同時(shí)間點(diǎn)的化學(xué)降解產(chǎn)物的量來(lái)評(píng)估蛋白質(zhì)制劑的化學(xué)穩(wěn)定性(通常可以通過(guò)例如提高溫度來(lái)加速降解產(chǎn)物的形成)。通常通過(guò)采用各種色譜分析技術(shù)(例如，SEC-HPLC和/或RP-HPLC)根據(jù)分子大小、疏水性和/或電荷分離降解產(chǎn)物來(lái)確定每種單獨(dú)的降解產(chǎn)物的量。由于HMWP產(chǎn)物可能是免疫原性的且無(wú)生物活性的，因此低水平的HMWP是有利的。

合成方法

本發(fā)明的胰島素衍生物可以通過(guò)用于制備胰島素、胰島素類似物和胰島素衍生物的常規(guī)方法，特別是工作實(shí)施例中描述的方法而獲得。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素衍生物通過(guò)用式II的基團(tuán)對(duì)A22位置處的賴氨酸殘基的ε氨基進(jìn)行?；@得，該式II的基團(tuán)是十四烷二酰基-4xgGlu。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素衍生物通過(guò)在高pH下，特別是在9.5至13范圍內(nèi)的pH下，用式II的基團(tuán)對(duì)A22位置處的賴氨酸殘基的ε氨基進(jìn)行?；@得，該式II的基團(tuán)是十四烷二?；?4xgGlu。

更具體地，本發(fā)明的胰島素衍生物通過(guò)用化合物(S)-2-((S)-4-羧基-4-{(S)-4-羧基-4-[(S)-4-羧基-4-(13-羧基-十三碳?；被?-丁?；被鵠-丁酰基氨基}-丁?；被?-戊二酸5-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(或可替代地，指定的十四烷二?；?4xgGlu-OSu)(化學(xué)式4)對(duì)A22位置處的賴氨酸殘基的ε氨基進(jìn)行酰化而獲得。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素衍生物通過(guò)用化合物14-[[(1S)-1-羧基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基-2-氧代乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代丁基]氨基]-14-氧代十四烷酸(或可替代地，指定的十四烷二酰基-gGlu-2xOEG-OSu)(化學(xué)式5)對(duì)A22位置處的賴氨酸殘基的ε氨基進(jìn)行?；@得。

本發(fā)明化合物的合成的優(yōu)選特征

可以參考以下特征中的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步表征本發(fā)明：

1.化合物(S)-2-((S)-4-羧基-4-{(S)-4-羧基-4-[(S)-4-羧基-4-(13-羧基-十三碳?；被?-丁酰基氨基]-丁?；被鶀-丁酰基氨基)-戊二酸5-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(或可替代地，指定的十四烷二?；?4xgGlu-OSu) (化學(xué)式4)，其在?；^(guò)程中用作本發(fā)明胰島素衍生物的合成中的中間體。

2.化合物14-[[(1S)-1-羧基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基-2-氧代乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代丁基]氨基]-14-氧代十四烷酸(或可替代地，指定的十四烷二?；?gGlu-2xOEG-OSu)(化學(xué)式5)，其在?；^(guò)程中用作本發(fā)明胰島素衍生物的合成中的中間體。

3.根據(jù)第1-2項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的化合物，其用作胰島素衍生物合成中的中間體化合物，該胰島素衍生物是?；娜艘葝u素類似物，該類似物相對(duì)于人胰島素具有突變A22K，并且第1-2項(xiàng)中任一項(xiàng)的化合物在該位置處被酰化。

4.根據(jù)第1-2項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的化合物，其用作胰島素衍生物合成中的中間體化合物，該胰島素衍生物是?；娜艘葝u素類似物，該類似物是相對(duì)于人胰島素的[A22K，desB27，B29R，desB30]，并且該類似物在A22K位置處被第1-2項(xiàng)中任一項(xiàng)的化合物酰化。

5.根據(jù)第1-2項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的化合物，其用作胰島素衍生物合成中的中間體化合物，該胰島素衍生物是?；娜艘葝u素類似物，該類似物是相對(duì)于人胰島素的[A22K，desB27，B29R，desB30]，并且該酰化的類似物可以另外包含A14E，和/或B3E或B3Q置換，并且該類似物在A22K位置處被第1-2項(xiàng)中任一項(xiàng)的化合物酰化。

6.根據(jù)第1項(xiàng)所述的化合物，其用作以下物質(zhì)的合成中的中間體化合物：

A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二酰基-4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A14E，A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二酰基-4xgGlu-2xOEG)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu-2xOEG)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；或

A14E，A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素。

生物活性

在另一方面，本發(fā)明提供了用作藥物或用于制備藥物或藥物組合物的新型胰島素衍生物。

發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的胰島素衍生物是被認(rèn)為非常適合餐時(shí)使用的短效和速效胰島素衍生物。

本發(fā)明的胰島素衍生物均具有足以激活胰島素受體的胰島素受體親和力，以便產(chǎn)生需要的血糖響應(yīng)，即，能夠降低動(dòng)物和人類的血糖。

發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的胰島素衍生物具有平衡的胰島素受體(IR)與胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(IGF-1R)親和力比(IR/IGF-1R)。

在一個(gè)方面，本發(fā)明的A22K?；葝u素具有高于0.3、高于0.4、高于0.5、高于0.6、高于0.7、高于0.8、高于0.9、高于1、高于1.5或高于2的IR/IGF-1R比。

在另一個(gè)方面，該A22K?；葝u素類似物是本發(fā)明的化合物，其中式II的?；苌?，14-十四烷二酸，并且在向豬皮下注射600μM(近似值)本發(fā)明的?；葝u素類似物的制劑(含有1.6％(w/vol，近似值)甘油和30mM苯酚/間甲酚，pH 7.4)后，該?；葝u素類似物具有短于250分鐘、短于200分鐘、短于175分鐘、短于150分鐘、短于125分鐘的平均停留時(shí)間(MRT)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，該A22K?；葝u素類似物是本發(fā)明的化合物，其中式II的?；苌?，16-十六烷二酸，并且在向豬皮下注射600μM(近似值)本發(fā)明的酰化胰島素類似物的制劑(含有1.6％(w/vol，近似值)甘油和30mM苯酚/間甲酚，pH 7.4)后，該?；葝u素類似物具有短于700分鐘、短于600分鐘、短于500分鐘、短于400分鐘、短于300分鐘的平均停留時(shí)間(MRT)。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的?；葝u素類似物的醫(yī)學(xué)用途，特別是這樣的胰島素衍生物用于治療、預(yù)防或減輕與糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、葡萄糖耐量減低、高血糖、血脂異常、肥胖癥、代謝綜合征(代謝綜合征X、胰島素抵抗綜合征)、高血壓、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、中風(fēng)、心血管疾病、冠心病、炎性腸綜合征、消化不良或胃潰瘍有關(guān)的疾病、病癥或狀況的用途，該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的本發(fā)明的胰島素衍生物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的胰島素衍生物用于治療、預(yù)防或減輕與糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病或葡萄糖耐量減低有關(guān)的疾病、病癥或狀況的用途，該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的本發(fā)明的胰島素衍生物。

在第三個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的胰島素衍生物用于治療、預(yù)防或減輕與糖尿病，特別是與1型糖尿病或2型糖尿病有關(guān)的疾病、病癥或狀況的用途。

藥物組合物

本發(fā)明涉及可用作藥物的?；葝u素類似物。

因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的胰島素衍生物的新型藥物組合物。

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物任選地包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。

本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步包含在藥物組合物中常用的其他賦形劑，例如，防腐劑、螯合劑、張度劑、吸收促進(jìn)劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、聚合物、表面活性劑、金屬離子、油性載體和蛋白質(zhì)(例如，人血清白蛋白、明膠或蛋白質(zhì))。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物是水性制劑，即包含水的制劑。這樣的制劑通常是溶液或懸浮液。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該藥物組合物是水溶液。

術(shù)語(yǔ)“水性制劑”被定義為包含至少50％w/w的水的制劑。同樣地，術(shù)語(yǔ)“水溶液”被定義為包含至少50％w/w的水的溶液，并且術(shù)語(yǔ)“水性懸浮液”被定義為包含至少50％w/w的水的懸浮液。水性懸浮液可以含有與適合于制備水性懸浮液的賦形劑混合的活性化合物。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰島素制劑包含本發(fā)明的胰島素衍生物的水溶液，其中所述胰島素化合物以約0.1mM至約20.0mM的濃度，更具體地以約0.2mM至約4.0mM、約0.3mM至約2.5mM、約0.5mM至約2.5mM、約0.6mM至約2.0mM或約0.6mM至約1.2mM的濃度存在。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述胰島素制劑包含本發(fā)明的胰島素衍生物的水溶液，其中所述胰島素化合物以約0.1mM、約0.3mM、約0.4mM、約0.6mM、約0.9mM、約1.2mM、約1.5mM或約1.8mM的濃度存在。

本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步包含緩沖液體系。該緩沖液可以選自但不限于乙酸鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥甲基)-氨基甲烷、N，N-二羥乙基甘氨酸(bicine)、N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)、蘋果酸、甘氨酰-甘氨酸、乙二胺、琥珀酸、馬來(lái)酸、富馬酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。這些具體緩沖液中的每一種均構(gòu)成本發(fā)明的替代實(shí)施方案。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖液是磷酸鹽緩沖液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述磷酸鹽緩沖液的濃度在約0.1mM至20mM的范圍內(nèi)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述磷酸鹽緩沖液的濃度在0.1mM至約10mM，或約0.1mM至約8mM，約1mM至約8mM，或約2mM至約8mM，或6mM至8mM的范圍內(nèi)。

本發(fā)明的可注射藥物組合物的pH在3至8.5的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的可注射藥物組合物具有在約6.8至約7.8范圍內(nèi)的pH。

在一個(gè)實(shí)施方案中，pH在約7.0至約7.8或7.2至7.6的范圍內(nèi)。

本發(fā)明的胰島素制劑可以進(jìn)一步包含張度劑。該張度劑可以選自鹽(例如，氯化鈉)、糖或糖醇、氨基酸(例如，L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、醛醇(例如，甘油(丙三醇)、1，2-丙二醇(丙二醇)、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇)、聚乙二醇(例如，PEG400)或其混合物?？梢允褂萌魏翁?，如單糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖苷、支鏈淀粉、糊精、環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素鈉。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖添加劑是蔗糖。糖醇包括例如甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、衛(wèi)矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖醇添加劑是甘露糖醇。以上提及的糖或糖醇可以單獨(dú)或組合使用。這些具體張度劑中的每一種或其混合物均構(gòu)成本發(fā)明的替代實(shí)施方案。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，甘油和/或甘露糖醇和/或氯化鈉可以以對(duì)應(yīng)于0至250mM、0至200mM或0至100mM濃度的量存在。

本發(fā)明的胰島素制劑可以進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的防腐劑。該防腐劑可以以足以獲得防腐效果的量存在。本發(fā)明的藥物組合物中的防腐劑的量可以從例如本領(lǐng)域的文獻(xiàn)和/或例如商業(yè)產(chǎn)品中的已知防腐劑量來(lái)確定。這些具體防腐劑中的每一種或其混合物均構(gòu)成本發(fā)明的替代實(shí)施方案。防腐劑在藥物制劑中的使用在例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995中進(jìn)行了描述。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可注射藥物組合物包含至少一種酚類化合物作為防腐劑。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的酚類化合物可以以最終可注射藥物組合物的最多約6mg/mL，特別是最終可注射藥物組合物的最多約4mg/mL的量存在。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的酚類化合物可以以最終可注射藥物組合物的最多約4.0mg/mL，特別是約0.5mg/mL至約4.0mg/mL，或約0.6mg/mL至約4.0mg/mL的量存在。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述防腐劑是苯酚。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述可注射藥物組合物包含苯酚與間甲酚的混合物作為防腐劑。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述可注射藥物組合物包含約16mM苯酚(1.5mg/mL)和約16mM間甲酚(1.72mg/mL)。

本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步包含螯合劑。螯合劑在藥物制劑中的使用是技術(shù)人員公知的。為方便起見，參考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。

本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步包含吸收促進(jìn)劑。吸收促進(jìn)劑的組可以包括但不限于煙堿化合物。術(shù)語(yǔ)煙堿化合物包括煙酰胺、煙酸、尼克酸、尼克酰胺(niacin amide)和維生素B3和/或其鹽和/或其任何組合。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述煙堿化合物是煙酰胺，和/或煙酸，和/或其鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述煙堿化合物是煙酰胺。根據(jù)本發(fā)明使用的煙堿化合物尤其可以是N-甲基煙酰胺、N，N-二乙基煙酰胺、N-乙基煙酰胺、N，N-二甲基煙酰胺、N-丙基煙酰胺或N-丁基煙酰胺。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，煙堿化合物以約5mM至約200mM的量；特別是以約20mM至約200mM的量；以約100mM至約170mM的量；或以約130mM至約170mM，例如約130mM、約140mM、約150mM、約160mM或約170mM的量存在。

本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定劑”是指添加至含有多肽的藥物制劑中以便穩(wěn)定該肽，即，延長(zhǎng)這類制劑的保質(zhì)期和/或使用時(shí)間的化學(xué)品。為方便起見，參考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。

本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步包含一定量的氨基酸堿，該量足以降低多肽或蛋白質(zhì)在該組合物儲(chǔ)存期間的聚集體形成。術(shù)語(yǔ)“氨基酸堿”是指氨基酸或氨基酸的組合，其中任何給定的氨基酸均以其游離堿形式或其鹽形式存在。該氨基酸尤其可以是精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、氨基胍、鳥氨酸或N-單乙基-L-精氨酸、乙硫氨酸或丁硫氨酸，或S-甲基-L半胱氨酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該氨基酸堿可以以對(duì)應(yīng)于1至100mM、1至50mM或1至30mM濃度的量存在。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以進(jìn)一步包含表面活性劑。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”是指由水溶性(親水性)部分、頭部和脂溶性(親脂性)部分組成的任何分子或離子。表面活性劑優(yōu)先在界面處積累，其親水性部分朝向水(親水相)而親脂性部分朝向油相或疏水相(即，玻璃、空氣、油等)。表面活性劑開始形成膠束時(shí)的濃度被稱為臨界膠束濃度或CMC。而且，表面活性劑降低液體的表面張力。表面活性劑也被稱為兩親化合物。表面活性劑在藥物制劑中的使用是技術(shù)人員公知的。為方便起見，參考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種用于制備這樣的胰島素制劑的方法。本發(fā)明的胰島素制劑可以通過(guò)采用多種公認(rèn)的方法中的任何方法來(lái)制備。例如，該制劑可以通過(guò)以下步驟來(lái)制備：將賦形劑的水溶液與胰島素衍生物的水溶液混合，隨后將pH調(diào)節(jié)至所需水平，并用水將該混合物補(bǔ)充至最終體積，隨后過(guò)濾除菌。

無(wú)鋅藥物組合物

胰島素制劑在傳統(tǒng)上包含作為例如氯鹽或乙酸鹽添加的鋅，以獲得可接受的藥物制劑穩(wěn)定性。然而，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的某些胰島素衍生物在保持足夠的化學(xué)和物理穩(wěn)定性的同時(shí)，可以被配制成未添加鋅的藥物組合物，從而比需要Zn²⁺離子來(lái)維持足夠的化學(xué)和物理穩(wěn)定性的相當(dāng)?shù)囊葝u素類似物起效更快。無(wú)鋅制劑被較快地從皮下組織吸收，因此允許餐時(shí)使用。

在這方面，需要提到的是，無(wú)鋅胰島素藥物組合物實(shí)際上難以獲得，因?yàn)楹哿康匿\可能或多或少地存在于常規(guī)用于制備藥物組合物的賦形劑中，特別是在醫(yī)學(xué)容器使用的橡膠材料中。

因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的胰島素衍生物的藥物組合物，其被配制為低鋅組合物，即沒有向該制劑中單獨(dú)添加鋅。這樣的藥物組合物通常被稱為“無(wú)鋅組合物”，盡管它們可能實(shí)際上被認(rèn)為是“低鋅組合物”。

然而，假如可以提供無(wú)鋅賦形劑，本發(fā)明的胰島素衍生物實(shí)際上允許制備無(wú)鋅藥物組合物。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的胰島素衍生物以及一種或多種沒有任何鋅的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的無(wú)鋅藥物組合物。

此外，我們發(fā)現(xiàn)，在B3位置處具有置換的本發(fā)明A22K酰化胰島素衍生物的亞組同時(shí)提高了在未添加鋅離子并且未添加表面活性劑的情況下配制的藥物組合物的化學(xué)和物理穩(wěn)定性。因此，在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了如上所述的低鋅或無(wú)鋅藥物組合物，其包含本發(fā)明的胰島素衍生物(其在B3位置處包含另外的置換(即，B3E或B3Q))以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，然而該藥物組合物中未添加表面活性劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種被配制為未添加鋅離子的低鋅組合物的藥物組合物，其包含胰島素衍生物和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，其中該胰島素衍生物是酰化的人胰島素類似物，該類似物是：

相對(duì)于人胰島素的[A22K，B3E或B3Q，desB27，B29R，desB30]；

并且該胰島素類似物是通過(guò)用以下式II的基團(tuán)對(duì)A22位置處的賴氨酸殘基的ε氨基進(jìn)行?；苌模?/p>

[?；鵠-[連接體]-

其中該連接體基團(tuán)是由1到10個(gè)選自-gGlu-和-OEG-的氨基酸殘基組成的氨基酸鏈；其中

gGlu代表γ谷氨酸殘基；

OEG代表8-氨基-3，6-二氧雜辛酸殘基(即，式-NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-的基團(tuán))；

該氨基酸殘基可以以任意順序存在；并且

該氨基酸鏈包含至少一個(gè)gGlu殘基；并且

其中該酰基是選自以下的α，ω-二羧酸殘基：

1，14-十四烷二酸；

1，15-十五烷二酸；和

1，16-十六烷二酸；

該?；念愃莆锟梢粤硗獍珹14E置換。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，在B3位置處的另外的置換是B3E。

在第三個(gè)實(shí)施方案中，在B3位置處的另外的置換是B3Q。

在第四個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種被配制成未添加鋅離子的低鋅組合物的藥物組合物，其包含選自以下的?；娜艘葝u素類似物：

A22K(N(eps)-十四烷二酰基-4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二?；?4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二酰基-gGlu-2xOEG)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二?；?3x(gGlu-OEG)-gGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十五烷二酰基-4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二?；?3x(gGlu-OEG)-gGlu)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二?；?4xgGlu)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A14E，A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A14E，A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?2xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?3xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu-2xOEG)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；以及

A22K(N(eps)-十四烷二酰基-gGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素。

在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的低鋅藥物組合物，其中鋅離子可以以對(duì)應(yīng)于每6個(gè)胰島素分子少于0.2個(gè)Zn²⁺離子、每6個(gè)胰島素分子少于0.15個(gè)Zn²⁺離子、每6個(gè)胰島素分子少于0.12個(gè)Zn²⁺離子、每6個(gè)胰島素分子0.1個(gè)Zn²⁺離子、每6個(gè)胰島素分子少于0.09個(gè)Zn²⁺離子、每6個(gè)胰島素分子少于0.08個(gè)Zn²⁺離子、每6個(gè)胰島素分子少于0.07個(gè)Zn²⁺離子、每6個(gè)胰島素分子少于0.06個(gè)Zn²⁺離子、每6個(gè)胰島素分子少于0.05個(gè)Zn²⁺離子、每6個(gè)胰島素分子少于0.04個(gè)Zn²⁺離子、每6個(gè)胰島素分子少于0.03個(gè)Zn²⁺離子、每6個(gè)胰島素分子少于0.02個(gè)Zn²⁺離子或每6個(gè)胰島素分子少于0.01個(gè)Zn²⁺離子的濃度的量存在。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種被配制成可注射組合物的如上所述的低鋅或無(wú)鋅藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可以采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法獲得。例如，可以將組分以水溶液的形式混合在一起，隨后將pH調(diào)節(jié)至所需水平，并用水將該混合物補(bǔ)充至最終體積，隨后進(jìn)行過(guò)濾除菌。

可以通過(guò)借助于注射器(任選筆狀注射器)皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行腸胃外施用?；蛘?，可以借助于輸液泵進(jìn)行腸胃外施用。作為進(jìn)一步的選擇，含有本發(fā)明的胰島素化合物的胰島素制劑還可以適于通過(guò)例如無(wú)針注射或從微針貼片(任選離子電滲貼片)經(jīng)皮施用，或經(jīng)粘膜例如頰部施用。

根據(jù)本發(fā)明的胰島素制劑可以在若干部位處施用至需要這種治療的患者，例如，在局部部位例如皮膚和粘膜部位處，在旁路吸收部位處例如在動(dòng)脈、靜脈、心臟中以及在涉及吸收的部位處施用，例如，在皮膚中、皮膚下、在肌肉或腹部中施用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素制劑非常適合在用于注射胰島素治療的筆狀裝置中應(yīng)用。

本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)腸胃外施用在糖尿病治療中使用。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的胰島素制劑還可以被制備成在常用于胰島素施用(包括使用泵的連續(xù)皮下胰島素輸注治療)的各種醫(yī)學(xué)設(shè)備中使用，和/或用于在基礎(chǔ)胰島素治療中應(yīng)用。

推薦由醫(yī)師來(lái)選擇向患者施用的本發(fā)明胰島素制劑的劑量。目前預(yù)期，根據(jù)本發(fā)明的胰島素衍生物應(yīng)以約0.1mM至約20.0mM的量，更具體地以約0.2mM至約4.0mM、約0.3mM至約2.5mM、約0.5mM至約2.5mM、約0.6mM至約2.0mM或約0.6mM至約1.2mM的量存在于最終藥物組合物中。

本發(fā)明的藥物組合物的優(yōu)選特征

可以參考以下特征中的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步表征本發(fā)明：

1.一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的?；娜艘葝u素類似物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。

2.根據(jù)第1項(xiàng)所述的藥物組合物，其被配制為未添加鋅離子的低鋅組合物。

3.根據(jù)第1項(xiàng)所述的藥物組合物，其被配制為包含在B3位置處具有置換的?；艘葝u素類似物的未添加鋅離子的低鋅組合物。

4.根據(jù)第1項(xiàng)所述的藥物組合物，其被配制為包含具有B3E或B3Q置換的?；艘葝u素類似物的未添加鋅離子的低鋅組合物。

5.根據(jù)第1項(xiàng)所述的藥物組合物，其被配制為包含具有B3E置換的?；艘葝u素類似物的未添加鋅離子的低鋅組合物。

6.根據(jù)第1項(xiàng)所述的藥物組合物，其被配制為包含具有B3Q置換的?；艘葝u素類似物的未添加鋅離子的低鋅組合物。

7.根據(jù)第1項(xiàng)所述的藥物組合物，其被配制為包含選自以下的酰化人胰島素類似物的未添加鋅離子的低鋅組合物：

A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二酰基-4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二?；?3x(gGlu-OEG)-gGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十五烷二?；?4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu-2xOEG)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A14E，A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A14E，A22K(N(eps)-十四烷二酰基-4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?2xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；以及

A22K(N(eps)-十四烷二?；?3xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素。

8.根據(jù)第1項(xiàng)所述的藥物組合物，其被配制為包含選自以下的?；艘葝u素類似物的未添加鋅離子的低鋅組合物：

A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十六烷二?；?3x(gGlu-OEG)-gGlu)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；以及

A22K(N(eps)-十六烷二酰基-4xgGlu)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素。

9.根據(jù)第7-8項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中每6個(gè)胰島素分子包含少于0.2個(gè)Zn²⁺離子。

10.根據(jù)第7-8項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的低鋅藥物組合物，其中未添加表面活性劑。

11.根據(jù)第7-8項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其包含煙堿化合物。

12.根據(jù)第7-8項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其包含總濃度為約20mM至約170mM的煙堿化合物、苯丙氨酸和/或其鹽。

13.根據(jù)第7-8項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其包含總濃度為約130mM至約170mM的煙堿化合物、苯丙氨酸和/或其鹽。

14.根據(jù)第7-8項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其包含藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑和/或佐劑。

治療方法

本發(fā)明涉及用于治療用途的藥物。更具體地，本發(fā)明涉及本發(fā)明的人胰島素類似物的?；苌镉糜谥委熁蝾A(yù)防與糖尿病有關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況的用途。

因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于治療或減輕活動(dòng)物體(包括人)的疾病或病癥或狀況的方法，該疾病、病癥或狀況可以選自與糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、葡萄糖耐量減低、高血糖、血脂異常、肥胖癥、代謝綜合征(代謝綜合征X、胰島素抵抗綜合征)、高血壓、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、中風(fēng)、心血管疾病、冠心病、炎性腸綜合征、消化不良或胃潰瘍有關(guān)的疾病、病癥或狀況，該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的本發(fā)明的?；艘葝u素類似物的步驟。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于治療或減輕活動(dòng)物體(包括人)的疾病或病癥或狀況的方法，該疾病、病癥或狀況可以選自與糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、葡萄糖耐量減低、高血糖、血脂異常、肥胖癥、代謝綜合征(代謝綜合征X、胰島素抵抗綜合征)、高血壓、認(rèn)知障礙、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、中風(fēng)、心血管疾病、冠心病、炎性腸綜合征、消化不良或胃潰瘍有關(guān)的疾病、病癥或狀況，該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的本發(fā)明的?；艘葝u素類似物。

在第三個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于治療或減輕活動(dòng)物體(包括人)的疾病或病癥或狀況的方法，該疾病、病癥或狀況可以選自與糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、葡萄糖耐量減低、高血糖、血脂異常、肥胖癥或代謝綜合征(代謝綜合征X、胰島素抵抗綜合征)有關(guān)的疾病、病癥或狀況。

在第四個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于治療或減輕活動(dòng)物體(包括人)的疾病或病癥或狀況的方法，該疾病、病癥或狀況可以選自與糖尿病，特別是與1型糖尿病或2型糖尿病有關(guān)的疾病、病癥或狀況。

附圖說(shuō)明

參考附圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明，附圖中：

圖1示出了與(門冬胰島素，商用制劑，每6個(gè)胰島素分子3個(gè)鋅(0.5和1nmol/kg))的譜相比，以每6個(gè)胰島素分子0個(gè)鋅配制的實(shí)施例1的胰島素衍生物(1nmol/kg)的PK(藥代動(dòng)力學(xué))譜(胰島素濃度相對(duì)于時(shí)間)；

圖2示出了與圖1相同的數(shù)據(jù)，但僅示出了前2小時(shí)的數(shù)據(jù)；

圖3a示出了與圖1相同的數(shù)據(jù)，但僅示出了與(門冬胰島素，商用制劑，每6個(gè)胰島素分子3個(gè)鋅(1nmol/kg))的譜相比，以每6個(gè)胰島素分子0個(gè)鋅配制的實(shí)施例1的胰島素(1nmol/kg)的數(shù)據(jù)；

圖3b示出了來(lái)源于圖3a中的胰島素譜的所引起的血漿葡萄糖變化。

圖4a和4b分別示出了與(門冬胰島素，商用制劑，每6個(gè)胰島素分子3個(gè)鋅(0.5和1nmol/kg))的譜相比，以每6個(gè)胰島素分子0個(gè)鋅配制的實(shí)施例2的胰島素(1nmol/kg)的PK(藥代動(dòng)力學(xué))譜(胰島素濃度相對(duì)于時(shí)間)，以及所引起的血漿葡萄糖變化；

圖5a和5b分別示出了與圖4a和4b相同的數(shù)據(jù)，但僅示出了與(門冬胰島素，商用制劑，每6個(gè)胰島素分子3個(gè)鋅(1nmol/kg))的譜相比，以每6個(gè)胰島素分子0個(gè)鋅配制的實(shí)施例2的胰島素(1nmol/kg)的數(shù)據(jù)，以及所引起的血漿葡萄糖變化；

圖6和7分別示出了以每6個(gè)胰島素分子0個(gè)鋅配制的實(shí)施例11的胰島素(1nmol/kg)的PK(藥代動(dòng)力學(xué))譜(胰島素濃度相對(duì)于時(shí)間)，以及所引起的血漿葡萄糖變化；

圖8和9分別示出了以每6個(gè)胰島素分子0個(gè)鋅配制的實(shí)施例44的胰島素(1nmol/kg)的PK(藥代動(dòng)力學(xué))譜(胰島素濃度相對(duì)于時(shí)間)，以及所引起的血漿葡萄糖變化(1nmol/kg)；

圖10和11分別示出了以每6個(gè)胰島素分子0個(gè)鋅配制的現(xiàn)有技術(shù)胰島素A22K(N(eps)-十六烷二?；?gGlu-2xOEG)，B29R，desB30人胰島素(WO 2009/022013，實(shí)施例45)(1nmol/kg)的PK(藥代動(dòng)力學(xué))譜(胰島素濃度相對(duì)于時(shí)間)，以及所引起的血漿葡萄糖變化(1nmol/kg)；

圖12和13分別示出了以每6個(gè)胰島素分子0個(gè)鋅配制的、圖10和11中所示的、代表現(xiàn)有技術(shù)(WO 2009/022013，實(shí)施例45)的十四烷二酸類似物(72nmol/動(dòng)物)的PK(藥代動(dòng)力學(xué))譜(胰島素濃度相對(duì)于時(shí)間)，以及所引起的血漿葡萄糖變化；

圖14A、14B和14C示出了熒光相對(duì)于時(shí)間的曲線圖，從中可以將滯后時(shí)間估計(jì)為滯后區(qū)與原纖維形成區(qū)的線性近似之間的截距；

圖15示出了在不存在/存在170mM煙酰胺的情況下，在肥胖Zucker大鼠中皮下注射后，實(shí)施例2的胰島素衍生物的PK/PD譜；

圖16-17示出了在不存在/存在170mM煙酰胺的情況下，在肥胖Zucker大鼠中皮下注射后，實(shí)施例7的胰島素衍生物的PK/PD譜；

圖18-19示出了在不存在/存在170mM煙酰胺的情況下，在肥胖Zucker大鼠中皮下注射后，實(shí)施例7的胰島素衍生物的PK/PD譜；以及

圖20-21示出了在不存在/存在170mM煙酰胺的情況下，在肥胖Zucker大鼠中皮下注射后，實(shí)施例4的胰島素衍生物的PK/PD譜。

實(shí)施例

參照以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例并非意在以任何方式限制所請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。

胰島素類似物表達(dá)和純化

胰島素類似物表達(dá)

根據(jù)本發(fā)明使用的胰島素類似物，即雙鏈非?；囊葝u素類似物，是通過(guò)采用公知的技術(shù)(例如，如US 6500645中公開的)在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所討論的胰島素類似物的DNA序列而重組產(chǎn)生的。該胰島素類似物或者直接表達(dá)或者表達(dá)為可以具有在B鏈上的N末端延伸和/或在B鏈與A鏈之間的連接肽(C-肽)的前體分子。通過(guò)合適的蛋白酶，例如水解無(wú)色桿菌(Achromobactor lyticus)蛋白酶(ALP)或胰蛋白酶，在體外切掉該N末端延伸和C-肽，并將因此分別具有緊挨著B1和A1位置的切割位點(diǎn)。適合根據(jù)本發(fā)明使用的類型的N-末端延伸和C-肽在例如US 5395922、EP 765395和WO 9828429中公開。

編碼根據(jù)本發(fā)明使用的胰島素類似物前體的多核苷酸序列可以通過(guò)確立的方法合成制備，例如由Beaucage等人，(1981)Tetrahedron Letters 22 1859-1869描述的亞磷酰胺方法，或由Matthes等人，(1984)EMBO Journal 3 801-805描述的方法。根據(jù)該亞磷酰胺方法，在例如自動(dòng)化DNA合成儀中合成寡核苷酸，純化，雙鏈化，并連接，以形成合成的DNA構(gòu)建體。當(dāng)前優(yōu)選的制備DNA構(gòu)建體的方式是通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。

重組方法通常將采用能夠在選定的微生物或宿主細(xì)胞中復(fù)制并攜帶編碼根據(jù)本發(fā)明使用的胰島素類似物前體的多核苷酸序列的載體。該重組載體可以是自主復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。該載體可以含有用于確保自我復(fù)制的任何元件(means)?；蛘?，該載體可以是這樣的載體，當(dāng)其被引入到宿主細(xì)胞中時(shí)，其被整合到基因組中并與其所整合至的染色體一起復(fù)制。此外，可以使用單個(gè)載體或質(zhì)粒，或一起包含待引入至宿主細(xì)胞的基因組中的總DNA的兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。該載體可以是線性或閉合環(huán)狀質(zhì)粒，并將優(yōu)選地含有允許該載體穩(wěn)定整合至宿主細(xì)胞基因組中或允許該載體在該細(xì)胞中獨(dú)立于基因組而自主復(fù)制的元件。

所述重組表達(dá)載體可以是能夠在酵母中復(fù)制的載體。使得載體能夠在酵母中復(fù)制的序列的實(shí)例是酵母質(zhì)粒2μm復(fù)制基因REP 1-3和復(fù)制起點(diǎn)。

所述載體可以含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記，該選擇性標(biāo)記允許容易地選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是一種基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、原養(yǎng)型至營(yíng)養(yǎng)缺陷型等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來(lái)自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的dal基因，或者賦予抗生素抗性如氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四環(huán)素抗性的標(biāo)記。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脫羧酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)。用于酵母宿主細(xì)胞的合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1 和URA3。用于酵母的非常合適的選擇性標(biāo)記是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pompe)TPI基因(Russell(1985)Gene 40 125-130)。

在所述載體中，多核苷酸序列與合適的啟動(dòng)子序列可操作地連接。該啟動(dòng)子可以是在選擇的宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得。

用于引導(dǎo)在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動(dòng)子的實(shí)例是從大腸桿菌lac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)和地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)獲得的啟動(dòng)子。用于引導(dǎo)在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動(dòng)子的實(shí)例是從米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶和黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶的基因獲得的啟動(dòng)子。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ma1、TPI、ADH、TDH3或PGK啟動(dòng)子。

編碼根據(jù)本發(fā)明使用的胰島素肽骨架的多核苷酸序列通常還將與合適的終止子可操作地連接。在酵母中，合適的終止子為TPI終止子(Alber等人，(1982)J.Mol.Appl.Genet.1 419-434)。

用于將編碼根據(jù)本發(fā)明使用的胰島素類似物的多核苷酸序列分別與啟動(dòng)子和終止子組合，并將它們插入到含有在選定宿主中復(fù)制所需的信息的適當(dāng)載體中的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。將會(huì)理解，載體可以如下構(gòu)建：首先制備含有編碼根據(jù)本發(fā)明使用的胰島素骨架的完整DNA序列的DNA構(gòu)建體，隨后將該片段插入到合適的表達(dá)載體中，或者順序插入含有單個(gè)元件(如信號(hào)肽和前肽(B鏈的N端延伸)、C肽、A鏈和B鏈)的遺傳信息的DNA片段，隨后連接。

將包含編碼根據(jù)本發(fā)明使用的胰島素類似物的多核苷酸序列的載體引入到宿主細(xì)胞中，使得該載體保持為染色體組成部分或自我復(fù)制的染色體外載體。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括由于在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不相同的親本細(xì)胞的任何后代。該宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如原核生物，或非單細(xì)胞微生物，例如真核生物。有用的單細(xì)胞細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，如革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，包括但不限于芽孢桿菌(Bacillus)細(xì)胞、鏈霉菌(Streptomyces)細(xì)胞，或革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌(E.coli)和假單胞菌屬的種(Pseudomonas sp)。真核細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物或真菌細(xì)胞。

所述宿主細(xì)胞尤其可以是酵母細(xì)胞。酵母生物體可以是在培養(yǎng)時(shí)向培養(yǎng)基中分泌胰島素肽骨架或其前體的任何合適的酵母生物體。合適的酵母生物體的實(shí)例包括選自釀酒酵母、克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、葡萄汁酵母(Sacchoromyces uvarum)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、克魯弗畢赤酵母(Pichia kluyveri)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、假絲酵母屬的種(Candida sp.)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)、可可假絲酵母(Candida cacaoi)、地霉屬的種(Geotrichum sp.)和發(fā)酵地霉(Geotrichum fermentans)的菌株。

例如，可以通過(guò)原生質(zhì)體形成，隨后采用已知方法轉(zhuǎn)化，來(lái)實(shí)現(xiàn)酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于使酵母生物體生長(zhǎng)的任何常規(guī)培養(yǎng)基。

胰島素類似物純化

可以通過(guò)常規(guī)程序從培養(yǎng)基中回收分泌的胰島素類似物或其前體，這些程序包括通過(guò)離心、通過(guò)過(guò)濾或通過(guò)在離子交換基質(zhì)或反相吸附基質(zhì)上捕獲或吸附胰島素類似物或其前體來(lái)從培養(yǎng)基中分離酵母細(xì)胞，通過(guò)過(guò)濾或借助于鹽例如硫酸銨使上清液的蛋白質(zhì)組分沉淀，隨后通過(guò)多種色譜程序例如離子交換色譜法、親和色譜法等純化。

本發(fā)明的胰島素肽骨架的純化和消化如下進(jìn)行：

通過(guò)陽(yáng)離子交換將可能含有B鏈的N-末端延伸和在B鏈與A鏈之間的修飾的C肽的單鏈胰島素類似物前體從酵母培養(yǎng)物上清液純化并濃縮(Kjeldsen等人(1998)Prot.Expr.Pur.14 309-316)。

通過(guò)用賴氨酸特異性固定化ALP消化(Kristensen等人(1997)J.Biol.Chem.20 12978-12983)，或利用胰蛋白酶切掉B鏈的N-末端延伸(如果存在的話)以及C肽，來(lái)使單鏈胰島素類似物前體熟化成雙鏈胰島素肽骨架。

胰蛋白酶消化

將來(lái)自陽(yáng)離子交換色譜步驟的、含有胰島素類似物前體的洗脫物用水稀釋至乙醇濃度為15-20％。添加甘氨酸至50mM的濃度，并用NaOH將pH調(diào)節(jié)至9.0-9.5。以1∶300(w∶w)的比例添加胰蛋白酶，并使消化在4度下進(jìn)行。每20分鐘通過(guò)分析監(jiān)測(cè)該消化，直到消化完成。通過(guò)以3∶100(體積：體積)的比例添加1M檸檬酸來(lái)終止消化。

在采用C18柱的Waters Acquity超高效液相色譜系統(tǒng)上，通過(guò)分析型LC來(lái)分析該消化反應(yīng)，并通過(guò)MALDI-TOF MS(Bruker Daltonics Autoflex II TOF/TOF)確認(rèn)分子量。

采用乙腈梯度，在C18柱上通過(guò)反相HPLC(Waters 600系統(tǒng))純化雙鏈胰島素類似物。通過(guò)凍干法回收所需的胰島素類似物，例如A22K，desB27，B29R，desB30人胰島素，A22K，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素，或A22K，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素。

在采用C18柱的Waters Acquity超高效液相色譜系統(tǒng)上，通過(guò)分析型LC來(lái)確定純度，并通過(guò)MALDI-TOF MS確定認(rèn)分子量。

縮寫

ALP-水解無(wú)色桿菌蛋白酶

C肽-連接肽

HPLC-高效液相色譜法

IR-胰島素受體

IGF-1R-胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體

LC-液相色譜法

MALDI-TOF-基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間

MS-質(zhì)譜法

PCR-聚合酶鏈反應(yīng)

PD-藥效學(xué)(血液/血漿葡萄糖降低效應(yīng))

PG-血漿葡萄糖

PK-藥代動(dòng)力學(xué)(血液/血漿胰島素濃度相對(duì)于時(shí)間的譜圖)

tBu是叔丁基；

DCM是二氯甲烷；

DIC是二異丙基碳二亞胺；

DIPEA＝DIEA，是N，N-二異丙基乙胺；

DMF是N，N-二甲基甲酰胺；

DMSO是二甲基亞砜；

EtOAc是乙酸乙酯；

Fmoc是9-芴基甲氧羰基；

γGlu(gGlu)是γL-谷氨?；?；

HCl是鹽酸；

HOBt是1-羥基苯并三唑；

NMP是N-甲基吡咯烷酮；

MeCN是乙腈；

OEG是[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基羰基；

Su是琥珀酰亞胺-1-基＝2，5-二氧代-吡咯烷-1-基；

OSu是琥珀酰亞胺-1-基氧基＝2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基；

RPC是反相色譜法；

RT是室溫；

TCTU是O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽；

TFA是三氟乙酸；

THF是四氫呋喃；

TNBS是2，4，6-三硝基苯磺酸；

TRIS是三(羥甲基)氨基甲烷；并且

TSTU是O-(N-琥珀酰亞胺基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽。

一般性說(shuō)明

以下實(shí)施例和通用程序涉及在本說(shuō)明書和合成方案中鑒別的中間體化合物和最終產(chǎn)物。使用以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明化合物的制備進(jìn)行詳細(xì)描述，但所描述的化學(xué)反應(yīng)是就其對(duì)本發(fā)明化合物制備的一般適用性而公開的。

偶爾，所述反應(yīng)可能并不如所述的那樣適用于包含在本發(fā)明公開范圍內(nèi)的每種化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到發(fā)生這種情況的化合物。在這些情況下，該反應(yīng)可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)改動(dòng)，即通過(guò)干擾基團(tuán)的適當(dāng)保護(hù)、通過(guò)更換成其他常規(guī)試劑或通過(guò)反應(yīng)條件的常規(guī)修改而成功進(jìn)行。

或者，本文公開的或常規(guī)的其他反應(yīng)將可適用于本發(fā)明相應(yīng)化合物的制備。在所有制備方法中，所有起始材料都是已知的或可以從已知的起始材料容易地制備。所有溫度均以攝氏度表示，并且除非另有說(shuō)明，當(dāng)提及產(chǎn)量時(shí)，所有份數(shù)(parts)和百分比都按重量計(jì)，而當(dāng)提及溶劑和洗脫液時(shí)，所有份數(shù)都按體積計(jì)。

可以通過(guò)采用在本領(lǐng)域內(nèi)典型的一種或多種以下程序來(lái)純化本發(fā)明的化合物。若需要，這些程序可以在梯度、pH、鹽、濃度、流動(dòng)、柱子等方面進(jìn)行修改。根據(jù)諸如雜質(zhì)分布、所討論的胰島素的溶解度等因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地認(rèn)識(shí)到并作出這些修改。

在酸性HPLC或脫鹽后，通過(guò)將純級(jí)分凍干來(lái)分離化合物。

在中性HPLC或陰離子交換色譜分析后，將該化合物脫鹽，在等電pH下沉淀，或通過(guò)酸性HPLC純化。

典型的純化程序

RP-HPLC系統(tǒng)：

Gilson系統(tǒng)由以下部分組成：215型液體處理器、322-H2型泵和155型UV檢測(cè)器(UV 215nm和280nm)。

陰離子交換和脫鹽系統(tǒng)：

Explorer系統(tǒng)由以下部分組成：P-900型泵、UV-900型UV檢測(cè)器(UV 214、254和280nm)、pH/C-900型pH與電導(dǎo)率檢測(cè)器、Frac-950型級(jí)分收集器。

酸性RP-HPLC：

柱子：Phenomenex Gemini，5μM 5u C1830x250mm

流速：20mL/min

緩沖液A：在水中的0.1％TFA

緩沖液B：在乙腈中的0.1％TFA

中性RP-HPLC：

柱子：Phenomenex Gemini，5μM 5u C1830x250mm

流速：20mL/min

緩沖液A：10mM Tris，15mM(NH₄)₂SO₄，pH＝7.3，在milliQ中的20％乙腈

緩沖液B：在乙腈中的20％milliQ

陰離子交換色譜法：

柱材料：Poros50HQ或Source30Q

流速：取決于柱子

緩沖液A：15mM Tris，25mM NH₄OAc，50％EtOH，pH＝7.5

緩沖液B：15mM Tris，500mM NH₄OAc，50％EtOH，pH＝7.5

脫鹽：

柱子：HiPrep 26/10

流速：20mL/min

緩沖液A：在水中的0.1％TFA

緩沖液B：在乙腈中的0.1％TFA

?；噭┰谌芤褐?見下文)或如例如WO 2009/115469中所述在固相上合成。

用于固相合成通式III的?；噭┑耐ㄓ贸绦?/u>

[?；鵠-[連接體]-Act

其中酰基和連接體基團(tuán)如上文所定義，而Act是活性酯的離去基團(tuán)，如N-羥基琥珀酰亞胺(OSu)或1-羥基苯并三唑，并且

其中?；糠值孽；瓦B接體部分內(nèi)的羧酸作為叔丁酯得到保護(hù)。

可以采用技術(shù)人員已知的固相肽合成領(lǐng)域中的程序在固體支持體上合成通式III的化合物。

一種這樣的程序包括Fmoc保護(hù)的氨基酸與聚苯乙烯2-氯三苯甲基氯樹脂的附接。可以在叔胺如三乙胺或N，N-二異丙基乙胺的存在下采用游離的N-保護(hù)的氨基酸實(shí)現(xiàn)該附接(參見以下參考文獻(xiàn))。該氨基酸的C末端(附接至該樹脂)處于偶聯(lián)至本發(fā)明的母體胰島素的合成序列的末端處。

在Fmoc氨基酸附接至樹脂后，采用例如仲胺如哌啶或二乙胺將Fmoc基團(tuán)去保護(hù)，隨后偶聯(lián)另一種(或相同的)Fmoc保護(hù)的氨基酸并去保護(hù)。通過(guò)偶聯(lián)單叔丁基保護(hù)的脂肪(α，ω)二酸如十六烷二酸單叔丁酯、十五烷二酸單叔丁酯或十四烷二酸單叔丁酯來(lái)終止合成序列。

采用稀酸如0.5-5％TFA/DCM(在二氯甲烷中的三氟乙酸)、乙酸(例如，在DCM中的10％乙酸，或HOAc/三氟乙醇/DCM 1∶1∶8)或在DCM中的六氟異丙醇來(lái)實(shí)現(xiàn)該化合物從樹脂上的切割(參見，例如，F(xiàn).Z.：Organic Synthesis on Solid Phase；Wiley-VCH 2000，ISBN 3-527-29950-5；N.Sewald&H.-D.Jakubke：Peptides：Chemistry and Biology；Wiley-VCH，2002，ISBN 3-527-30405-3；或The Combinatorial Cheemistry Catalog，1999，Novabiochem AG，以及其中引用的參考文獻(xiàn))。這確保在該化合物中作為羧酸保護(hù)基團(tuán)存在的叔丁酯沒有被去保護(hù)。

最后，將C-末端羧基(從該樹脂上釋放的)活化為例如N-羥基琥珀酰亞胺酯(OSu)。將該活化的酯例如用純TFA去保護(hù)，并直接用作或在純化(結(jié)晶)后用作附接本發(fā)明的母體胰島素的偶聯(lián)劑。該程序在下文中示出。

說(shuō)明在固相上合成?；噭┑耐ㄓ贸绦虻膶?shí)施例：

十四烷二?；?4xgGlu-OSu(化學(xué)式4)的合成

將100-200目1.5mmol/g的2-氯三苯甲基樹脂(15.79g，23.69mmol)置于無(wú)水二氯甲烷(150mL)中溶脹20分鐘。將Fmoc-Glu-OtBu(6.72g，15.79mmol)和N，N-二異丙基乙胺(10.46mL，60.01mmol)在無(wú)水二氯甲烷(120mL)中的溶液添加至樹脂，并將該混合物搖動(dòng)16hr。將樹脂過(guò)濾并用N，N-二異丙基乙胺(5.5mL，31.59mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(9∶1，150mL，5min)中的溶液處理。然后，用N，N-二甲基甲酰胺(2 x 150mL)、二氯甲烷(2 x 150mL)和N，N-二甲基甲酰胺(2x 150mL)洗滌樹脂。

通過(guò)用在N，N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶處理(2 x 150mL，1 x 5min，1 x 20min)來(lái)去除Fmoc基團(tuán)。用N，N-二甲基甲酰胺(2 x 150mL)、2-丙醇(2 x 150mL)、二氯甲烷(2 x 150mL)和N，N-二甲基甲酰胺(2x 150mL)洗滌樹脂。將Fmoc-Glu-OtBu(10.08g，23.69mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TCTU，8.42g，23.69mmol)和N，N-二異丙基乙胺(7.43mL，42.64mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(120mL)中的溶液添加至樹脂，并將混合物搖動(dòng)16hr。將樹脂過(guò)濾并用N，N-二異丙基乙胺(5.5mL，31.59mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(9∶1，150mL，5min)中的溶液處理。然后，用N，N-二甲基甲酰胺(2 x 150mL)、二氯甲烷(2 x 150mL)和N，N-二甲基甲酰胺(2 x 150mL)洗滌樹脂。

通過(guò)用在N，N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶處理(2 x 150mL，1 x 5min，1 x 20min)來(lái)去除Fmoc基團(tuán)。用N，N-二甲基甲酰胺(2 x 150mL)、2-丙醇(2 x 150mL)、二氯甲烷(2 x 150mL)和N，N-二甲基甲酰胺(2 x 150mL)洗滌樹脂。將Fmoc-Glu-OtBu(10.08g，23.69mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TCTU，8.42g，23.69mmol)和N，N-二異丙基乙胺(7.43mL，42.64mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(120mL)中的溶液添加至樹脂，并將混合物搖動(dòng)16hr。將樹脂過(guò)濾并用N，N-二異丙基乙胺(5.5mL，31.59mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(9∶1，150mL，5min)中的溶液處理。然后，用N，N-二甲基甲酰胺(2 x 150mL)、二氯甲烷(2 x 150mL)和N，N-二甲基甲酰胺(2 x 150mL)洗滌樹脂。

通過(guò)用在N，N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶處理(2 x 150mL，1 x 5min，1 x 20min)來(lái)去除Fmoc基團(tuán)。用N，N-二甲基甲酰胺(2 x 150mL)、2-丙醇(2 x 150mL)、二氯甲烷(2 x 150mL)和N，N-二甲基甲酰胺(2 x 150mL)洗滌樹脂。將Fmoc-Glu-OtBu(10.08g，23.69mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TCTU，8.42g，23.69mmol)和N，N-二異丙基乙胺(7.43mL，42.64mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(120mL)中的溶液添加至樹脂，并將混合物搖動(dòng)16hr。將樹脂過(guò)濾并用N，N-二異丙基乙胺(5.5mL，31.59mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(9∶1，150mL，5min)中的溶液處理。然后，用N，N-二甲基甲酰胺(2 x 150mL)、二氯甲烷(2 x 150mL)和N，N-二甲基甲酰胺(2 x 150mL)洗滌樹脂。

通過(guò)用在N，N-二甲基甲酰胺中的20％哌啶處理(2 x 150mL，1 x 5min，1 x 20min)來(lái)去除Fmoc基團(tuán)。用N，N-二甲基甲酰胺(2 x 150mL)、2-丙醇(2 x 150mL)、二氯甲烷(2 x 150mL)和N，N-二甲基甲酰胺(2 x 150mL)洗滌樹脂。將十四烷二酸單叔丁酯(7.45g，23.69mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TCTU，8.42g，23.69mmol)和N，N-二異丙基乙胺(7.43mL，42.64mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(40mL)與二氯甲烷(80mL)的混合物中的溶液添加至樹脂，并將混合物搖動(dòng)16hr。將樹脂過(guò)濾，并用二氯甲烷(2 x 150mL)、N，N-二甲基甲酰胺(2 x 150mL)、甲醇(2 x 150mL)和二氯甲烷(10 x 150mL)洗滌。

通過(guò)用三氟乙醇(150mL)處理過(guò)夜而從樹脂上切下產(chǎn)物。將樹脂過(guò)濾出并用二氯甲烷(3 x 100mL)洗滌。減壓去除溶劑。通過(guò)硅膠柱色譜法(梯度洗脫，二氯甲烷/甲醇100∶0至95∶5)純化殘余物，得到呈白色固體的標(biāo)題化合物。

將產(chǎn)物真空干燥，以產(chǎn)生(S)-2-((S)-4-叔丁氧羰基-4-{(S)-4-叔丁氧羰基-4-[(S)-4-叔丁氧羰基-4-(13-叔丁氧羰基-十三碳?；被?-丁?；被鵠-丁?；被鶀-丁?；被?-戊二酸1-叔丁酯。

產(chǎn)量：14.77g(89％)。

¹H NMR譜(300MHz，CDCl₃，δH)：7.22(d，J＝7.7Hz，1H)；6.97(d，J＝7.9Hz，1H)；6.72(d，J＝7.9Hz，1H)；6.41(d，J＝7.9Hz，1H)；4.59-4.43(m，4H)；2.49-2.13(m，16H)；2.06-1.72(m，4H)；1.70-1.52(m，4H)；1.52-1.38(m，45H)；1.35-1.21(m，16H)。

LC-MS純度：100％(ELSD)。

LC-MS Rt(Sunfire 4.6mm x 100mm，乙腈/水50∶50至100∶0+0.1％FA)：7.39min。

LC-MS m/z：1055.0(M+H)+。

將獲得的叔丁基保護(hù)的十四烷二酰基-4xgGlu-OH((S)-2-((S)-4-叔丁氧羰基-4-{(S)-4-叔丁氧羰基-4-[(S)-4-叔丁氧羰基-4-(13-叔丁氧羰基-十三碳?；被?-丁酰基氨基]-丁?；被鶀-丁酰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯)溶解在四氫呋喃中。添加DIPEA，隨后添加溶解在乙腈中的TSTU。將反應(yīng)混合物攪拌3h，隨后真空蒸發(fā)，在乙酸乙酯中再溶解，用0.1M HCl(水溶液)洗滌，經(jīng)MgSO₄干燥，過(guò)濾，并真空蒸發(fā)。LC-MS(電噴霧)：m/z＝1174.7(M+Na⁺)。計(jì)算值：1175.4。

將保護(hù)的且OSu活化的化合物溶解在10mL TFA中，并在室溫下攪拌過(guò)夜。添加二乙醚，并過(guò)濾出所形成的沉淀物，并真空干燥過(guò)夜，以得到(S)-2-((S)-4-羧基-4-{(S)-4-羧基-4-[(S)-4-羧基-4-(13-羧基-十三碳?；被?-丁?；被鵠-丁?；被鶀-丁?；被?-戊二酸5-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(十四烷二酰基-4xgGlu-OSu)。LC-MS(電噴霧)：m/z＝872.2(M+H⁺)。計(jì)算值：871.9。

說(shuō)明在固相上合成?；噭┑耐ㄓ贸绦虻膶?shí)施例：

十四烷二?；?gGlu-2xOEG-OSu(化學(xué)式5)的合成

13-{(S)-1-叔丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基-乙氧基)-乙基氨基甲酰基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基氨基甲酰基]-丙基氨基甲?；鶀-十三烷酸叔丁酯

將100-200目1.7mmol/g的2-氯三苯甲基樹脂(79.8g，135.6mmol)置于無(wú)水二氯甲烷(450mL)中溶脹20分鐘。將{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，34.9g，90.4mmol)和N，N-二異丙基乙胺(59.9mL，343.6mmol)在無(wú)水二氯甲烷(100mL)中的溶液添加至樹脂，并將該混合物搖動(dòng)4hr。將樹脂過(guò)濾并用N，N-二異丙基乙胺(31.5mL，180.8mmol)在甲醇/二氯甲烷混合物(4∶1，150mL，2 x 5min)中的溶液處理。然后，用N，N-二甲基甲酰胺(2 x 300mL)、二氯甲烷(2 x 300mL)和N，N-二甲基甲酰胺(3 x 300mL)洗滌樹脂。通過(guò)用在二甲基甲酰胺中的20％哌啶處理(1 x 5min，1 x 30min，2 x 300mL)來(lái)去除Fmoc基團(tuán)。用N，N-二甲基甲酰胺(3 x 300mL)、2-丙醇(2 x 300mL)和二氯甲烷(350mL，2 x 300mL)洗滌樹脂。

將{2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-乙氧基]-乙氧基}-乙酸(Fmoc-OEG-OH，52.3g，135.6mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TCTU，48.2g，135.6mmol)和N，N-二異丙基乙胺(42.5mL，244.1mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(250mL)中的溶液添加至樹脂，并將混合物搖動(dòng)2hr。由于茚三酮試驗(yàn)仍然是陽(yáng)性，因此將樹脂過(guò)濾并用相同量的試劑另外處理30分鐘。將樹脂過(guò)濾，并用N，N-二甲基甲酰胺(2 x 300mL)、二氯甲烷(2 x 300mL)和N，N-二甲基甲酰胺(3 x 300mL)洗滌。通過(guò)用在二甲基甲酰胺中的20％哌啶處理(1 x 5min，1 x 30min，2 x 300mL)來(lái)去除Fmoc基團(tuán)。用N，N-二甲基甲酰胺(3 x 300mL)、2-丙醇(2 x 300mL)和二氯甲烷(350mL，2 x 300mL)洗滌樹脂。

將(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-戊二酸1-叔丁酯(Fmoc-LGlu-OtBu，57.7g，135.6mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TCTU，48.2g，135.6mmol)和N，N-二異丙基乙胺(42.5mL，244.1mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(250mL)中的溶液添加至樹脂，并將混合物搖動(dòng)1hr。將樹脂過(guò)濾，并用N，N-二甲基甲酰胺(2 x 300mL)、二氯甲烷(2 x 300mL)和N，N-二甲基甲酰胺(2 x 300mL)洗滌。通過(guò)用在二甲基甲酰胺中的20％哌啶處理(1 x 5min，1 x 30min，2 x 300mL)來(lái)去除Fmoc基團(tuán)。用N，N-二甲基甲酰胺(3 x 300mL)、2-丙醇(2 x 300mL)和二氯甲烷(350mL，2 x 300mL)洗滌樹脂。

將十四烷二酸單叔丁酯(C14(OtBu)-OH，42.7g，135.6mmol)、O-(6-氯-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TCTU，48.2g，135.6mmol)和N，N-二異丙基乙胺(42.5mL，244.1mmol)在二氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺混合物(4∶1，300mL)中的溶液添加至樹脂，并將混合物搖動(dòng)1.5hr。將樹脂過(guò)濾，并用N，N-二甲基甲酰胺(6 x 300mL)、二氯甲烷(4 x 300mL)、甲醇(4 x 300mL)和二氯甲烷(7 x 600mL)洗滌。通過(guò)用2，2，2-三氟乙醇(600mL)處理18hr從樹脂上切下產(chǎn)物。過(guò)濾出樹脂，并用二氯甲烷(4 x 300mL)、二氯甲烷/2-丙醇混合物(1∶1，4 x 300mL)、2-丙醇(2 x 300mL)和二氯甲烷(6 x 300mL)洗滌。將溶液合并；蒸發(fā)溶劑，并通過(guò)柱色譜法(硅膠60A，0.060-0.200mm；洗脫液：二氯甲烷/甲醇1∶0-9∶1)純化粗產(chǎn)物。

將純13-{(S)-1-叔丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基-乙氧基)-乙基氨基甲?；鵠-甲氧基}-乙氧基)-乙基氨基甲?；鵠-丙基氨基甲?；鶀-十三烷酸叔丁酯真空干燥，并以橙色油形式獲得。

產(chǎn)量：55.2g(77％)。

RF(SiO₂，二氯甲烷/甲醇9∶1)：0.35。

1H NMR譜(300MHz，CDCl₃，δH)：7.37(bs，1H)；7.02(bs，1H)；6.53(d，J＝7.9Hz，1H)；4.54-4.38(m，1H)；4.17(s，2H)；4.02(s，2H)；3.82-3.40(m，16H)；2.37-2.12(m，7H)；2.02-1.82(m，1H)；1.71-1.51(m，4H)；1.47(s，9H)；1.43(s，9H)；1.25(bs，16H)。

LC-MS純度：100％。

LC-MS Rt(Sunfire 4.6mm x 100mm，乙腈/水70∶30至100∶0+0.1％FA)：3.93min。

LC-MS m/z：791.0(M+H)+。

將13-{(S)-1-叔丁氧羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基-乙氧基)-乙基氨基甲酰基]-甲氧基}-乙氧基)-乙基氨基甲?；鵠-丙基氨基甲?；鶀-十三烷酸叔丁酯(十四烷二酰基-gGlu-2xOEG-OH，8.89g，11.3mmol)溶解在100mL乙腈中，將TSTU(4.07g，13.5mmol)和DIPEA(2.35mL，13.5mmol)添加至攪拌溶液，并將該混合物在室溫下攪拌1小時(shí)。蒸發(fā)溶劑，將殘余物溶解在二氯甲烷中并用0.05M HCl洗滌兩次。

將有機(jī)相干燥(MgSO₄)并真空蒸發(fā)。這樣得到9.98g(100％)呈油的13-((S)-1-叔丁氧羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲?；鶀-甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲酰基}-丙基氨基甲?；?-十三烷酸叔丁酯。

將13-((S)-1-叔丁氧羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲?；鶀-甲氧基)-乙氧基]-乙基氨基甲?；鶀-丙基氨基甲?；?-十三烷酸叔丁酯(4g)溶解在三氟乙酸(10mL)中，并將該混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，并真空蒸發(fā)。將殘余物溶解在二氯甲烷(10mL)中并真空蒸發(fā)。添加冷二乙醚(10mL)導(dǎo)致沉淀出白色油脂狀固體。通過(guò)傾析分離該沉淀物并將其真空干燥。這樣得到3.4g(定量的)14-[[(1S)-1-羧基-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2，5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基-2-氧代乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-2-氧代乙氧基]乙氧基]乙基氨基]-4-氧代丁基]氨基]-14-氧代十四烷酸(十四烷二?；?gGlu-2xOEG-OSu)，將其在-18℃下儲(chǔ)存。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝775.33；計(jì)算值：774.8。

胰島素衍生物的?；图兓?/u>

用于本發(fā)明胰島素衍生物的?；图兓耐ㄓ贸绦?A)在以下實(shí)施例1中進(jìn)行了描述。該程序也應(yīng)用于以下實(shí)施例2-25的化合物的合成。還對(duì)這些衍生物中的一些進(jìn)行了采用其他方法(如上所述)的純化。

實(shí)施例1：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，desB27，B29R，desB30人胰島素；IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳?；被?丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]丁酰基]氨基]丁?；鵠Lys，(B)-肽。

將A22K，desB27，B29R，desB30人胰島素(2.0g)溶解在40mL 0.1M Na₂CO₃(水溶液)中，并用1M NaOH(水溶液)將pH調(diào)節(jié)至11.2。將十四烷二?；?4xgGlu-OSu(0.454g)溶解在2mL DMF中并逐滴添加至胰島素溶液中，同時(shí)用1M NaOH(水溶液)將pH保持在恒定值11.2。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌30min，然后用0.1M HCl(水溶液)中和至pH＝7.5，并用1∶1 EtOH/milliQ水稀釋。

將所得胰島素在Poros50HQ 74mL柱上通過(guò)陰離子交換色譜法純化，用在15mM Tris，50v/v％乙醇，pH 7.5(乙酸)中的25至500mM乙酸銨洗脫。在反向柱上通過(guò)采用在含有0.1％三氟乙酸的milliQ水中的乙腈梯度洗脫來(lái)進(jìn)行純級(jí)分的脫鹽。將所得的純胰島素凍干。LC-MS(電噴霧)：m/z＝1629.98(M+4)/4。計(jì)算值：1630.65。

如上所述合成?；噭┦耐槎；?4xgGlu-OSu。

實(shí)施例2：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GluB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳?；被?丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]丁酰基]氨基]丁?；鵠Lys，(B)-肽。

根據(jù)實(shí)施例1中描述的方法制備該類似物。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1633.9(M+4H⁺)。計(jì)算值：1634.4。

實(shí)施例3：通用程序(A)

A14E，A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GluA14，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳酰基氨基)丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]丁?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1622.2(M+4)/4。計(jì)算值：1622.1。

實(shí)施例4：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十六烷二?；?4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GluB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]丁?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1641.2(M+4H⁺)。計(jì)算值：1641.4。

實(shí)施例5：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十六烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GluB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1616.6(M+4)/4。計(jì)算值：1617.1

實(shí)施例6：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十六烷二酰基-3x(gGlu-OEG)-gGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GluB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]丁?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1749.9(M+4)/4。計(jì)算值：1750.3

實(shí)施例7：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十四烷二酰基-4xgGlu)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GlnB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳?；被?丁酰基]氨基]丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]丁?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1634.2(M+4)/4。計(jì)算值：1633.1。

實(shí)施例8：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十六烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GlnB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1616.6(M+4)/4。計(jì)算值：1615.8。

實(shí)施例9：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十六烷二?；?3x(gGlu-OEG)-gGlu)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GlnB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳?；被?丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]丁?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1749.8(M+4)/4。計(jì)算值：1748.5。

實(shí)施例10：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十四烷二?；?2xgGlu)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳?；被?丁?；鵠氨基]丁?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1565.6(M+4)/4。計(jì)算值：1566.1。

實(shí)施例11：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十六烷二?；?4xgGlu)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳?；被?丁?；鵠氨基]丁酰基]氨基]丁?；鵠氨基]丁?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1637.4(M+4)/4。計(jì)算值：1636.6。

實(shí)施例12：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十六烷二?；?gGlu-2xOEG)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1613.2(M+4)/4。計(jì)算值：1613.4。

實(shí)施例13：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十六烷二酰基-3x(gGlu-OEG)-gGlu)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳酰基氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]丁?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1746.4(M+4)/4。計(jì)算值：1746.5。

實(shí)施例14：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十四烷二酰基-gGlu)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳?；被?丁?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1533.2(M+4)/4。計(jì)算值：1533.8。

實(shí)施例15：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GluB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1610.7(M+4)/4。計(jì)算值：1610.1。

實(shí)施例16：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu-2xOEG)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GlnB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳?；被?丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1609.7(M+4)/4。計(jì)算值：1609.9。

實(shí)施例17：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十四烷二?；?2xOEG)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1606.3(M+4)/4。計(jì)算值：1606.4。

實(shí)施例18：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十六烷二?；?4xgGlu)，B3Q，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GlnB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(15-羧基十五碳?；被?丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]丁?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1640.9(M+4)/4。計(jì)算值：1641.1。

實(shí)施例19：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十五烷二?；?4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GluB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(14-羧基十四碳?；被?丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]丁?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1637.63(M+4)/4。計(jì)算值：1636.76

實(shí)施例20：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十四烷二酰基-4xgGlu-2xOEG)，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳酰基氨基)丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]-丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]-乙氧基]乙?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1703.0(M+4)/4。計(jì)算值：1703.2

實(shí)施例21：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu-2xOEG)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GluB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳酰基氨基)丁?；鵠氨基]丁酰基]氨基]-丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]-乙酰基]Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1706.6(M+4)/4。計(jì)算值：1707.0

實(shí)施例22：通用程序(A)

A14E，A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu-2xOEG、)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GluA14，GluB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳酰基氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1601.9(M+4)/4。計(jì)算值：1601.6

實(shí)施例23：通用程序(A)

A14E，A22K(N(eps)-十四烷二?；?4xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GluA14，GluB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳?；被?丁酰基]氨基]丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]丁酰基]Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1625.9(M+4)/4。計(jì)算值：1625.8

實(shí)施例24：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十四烷二酰基-2xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GluB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳酰基氨基)丁?；鵠氨基]丁?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1537.7(M+4)/4。計(jì)算值：1537.5

實(shí)施例25：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GluB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳?；被?丁?；鵠Lys，(B)-肽。

LC-MS(電噴霧)：m/z＝1537.7(M+4)/4。計(jì)算值：1537.5

實(shí)施例26：通用程序(A)

A22K(N(eps)-十四烷二?；?3xgGlu)，B3E，desB27，B29R，desB30人胰島素；

IUPAC(OpenEye，IUPAC類型)名稱：N{α}([GluB3，ArgB29]，des-ThrB27，ThrB30-胰島素(人)-(A)-肽基)-N{ε}[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三碳酰基氨基)丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]丁?；鵠Lys，(B)-肽。

可以根據(jù)實(shí)施例1中描述的方法制備該類似物。

實(shí)施例27：在溶解的受體上測(cè)量的、選定的本發(fā)明胰島素衍生物的胰島素受體親和力

本發(fā)明的胰島素類似物對(duì)人胰島素受體(IR)的相對(duì)結(jié)合親和力通過(guò)閃爍迫近測(cè)定法(SPA)(根據(jù)Glendorf T等人(2008)Biochemistry 47 4743-4751)中的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合來(lái)確定。

簡(jiǎn)言之，在96孔Optiplates(Perkin-Elmer Life Sciences)中進(jìn)行人胰島素標(biāo)準(zhǔn)物和待測(cè)胰島素類似物的稀釋系列，隨后添加[¹²⁵I-A14Y]-人胰島素、抗IR小鼠抗體83-7、溶解的人IR-A(通過(guò)麥胚凝集素色譜法從過(guò)表達(dá)該IR-A全受體(holoreceptor)的幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞中半純化的)以及在由100mM HEPES(pH 7.8)、100mM NaCl、10mM MgSO₄和0.025％(v/v)吐溫20組成的結(jié)合緩沖液中的SPA珠子(抗小鼠聚乙烯基甲苯SPA珠子，GE Healthcare)。在22℃溫和搖動(dòng)下將板溫育22-24h，以2000rpm離心2分鐘，并在TopCount NXT(Perkin-Elmer Life Sciences)上計(jì)數(shù)。

根據(jù)四參數(shù)logistic模型(A(1978)Biometrics 34357-365)分析來(lái)自SPA的數(shù)據(jù)，并且相對(duì)于在相同板內(nèi)測(cè)量的人胰島素標(biāo)準(zhǔn)物的結(jié)合親和力，計(jì)算類似物的結(jié)合親和力。

還使用了相關(guān)的測(cè)定法，其中結(jié)合緩沖液含有1.5％HSA(w/v)(Sigma A1887)，以便模擬更接近的生理?xiàng)l件。

選定的本發(fā)明胰島素類似物的胰島素受體親和力以及其他體外數(shù)據(jù)在以下表1中呈現(xiàn)。

實(shí)施例28：在膜結(jié)合受體上測(cè)量的、選定的本發(fā)明胰島素衍生物的胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體親和力

從用含有人IR-A、IR-B或IGF-1R插入物的pZem219B載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞中純化膜結(jié)合人IR和IGF-IR。在冰冷的緩沖液(25mM HEPES pH 7.4，25mM CaCl₂和1mM MgCl₂，250mg/L桿菌肽，0.1mM Pefablock)中收獲并勻漿化BHK細(xì)胞。使勻漿物在41％(w/v)蔗糖墊上分層，并在4℃下以95000g離心75分鐘。收集質(zhì)膜，用緩沖液(如上所述)1∶5稀釋，并在4℃下以40000g再次離心45分鐘。將沉淀物重懸于最小體積的緩沖液中，并用針(23號(hào))抽取3次，之后在-80℃下儲(chǔ)存直到使用。

通過(guò)SPA設(shè)置(setup)中的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合來(lái)確定與膜結(jié)合的人IR-A、IR-B或IGF-1R中任一種的相對(duì)結(jié)合親和力。在96孔Optiplates(Perkin-Elmer Life Sciences)中一式兩份進(jìn)行IR測(cè)定。在25℃溫和攪拌下，將膜蛋白與在總體積為200μL的測(cè)定緩沖液(50mM HEPES，150mM NaCl，5mM MgSO₄，0.01％Triton X-100，0.1％(w/v)HSA(Sigma A1887)，Complete的無(wú)EDTA(Complete EDTA-free)蛋白酶抑制劑)中的50pM[¹²⁵I-A14Y]-人胰島素、50μg麥胚凝集素(WGA)涂覆的PVT微球(GE Healthcare)以及濃度逐漸增加的配體一起溫育150分鐘。通過(guò)將板以2000rpm離心2分鐘來(lái)終止測(cè)定，并通過(guò)在TopCount NXT(Perkin-Elmer Life Sciences)上計(jì)數(shù)來(lái)定量結(jié)合放射性。

除了采用膜結(jié)合的IGF-1R和50pM[¹²⁵I-Tyr31]-人IGF-1外，基本上如IR結(jié)合測(cè)定一樣進(jìn)行IGF-1R測(cè)定。根據(jù)四參數(shù)logistic模型(A(1978)Biometrics 34357-365)分析來(lái)自SPA的數(shù)據(jù)，并相對(duì)于在相同板內(nèi)測(cè)量的人胰島素標(biāo)準(zhǔn)物的結(jié)合親和力，計(jì)算待測(cè)類似物的結(jié)合親和力。

選定的本發(fā)明胰島素類似物的IR(A同種型)和IGF-1R結(jié)合數(shù)據(jù)在以下表1中給出。

表1

選定的本發(fā)明胰島素類似物的IR(A同種型)和IGF-1受體結(jié)合數(shù)據(jù)

*)溶解的克隆人胰島素受體A同種型，數(shù)據(jù)以相對(duì)于人胰島素的百分比表示，方案在實(shí)施例27中給出。

**)膜結(jié)合的克隆人胰島素受體A同種型受體，數(shù)據(jù)以相對(duì)于人胰島素的百分比表示，方案在實(shí)施例28中給出。

***)膜結(jié)合的克隆人胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體，數(shù)據(jù)以相對(duì)于人胰島素的百分比表示，方案在實(shí)施例28中給出。

****)來(lái)自膜結(jié)合受體的IR-A與IGF-1R親和力的比例，方案來(lái)自實(shí)施例28。

實(shí)施例29：通過(guò)SEC-HPLC稀釋分析的單體-二聚體平衡

進(jìn)行采用SEC-HPLC(大小排阻HPLC)的一系列稀釋，以評(píng)價(jià)無(wú)鋅胰島素的單體-二聚體平衡。通過(guò)注射不同體積(2.5-80μL)的有待在Superose 12 10/300 GL柱上測(cè)試的0.6mM胰島素類似物，并用140mM NaCl、10mM Tris pH 7.7以0.8mL/min的流速洗脫，該樣品幾乎與注射體積成比例地被稀釋?；谧鳛橄♂尪鹊暮瘮?shù)的保留時(shí)間的改變，計(jì)算兩個(gè)參數(shù)：分子量的增加(Mw增加)和R斜率。

R斜率被推導(dǎo)為保留時(shí)間相對(duì)于log(注射體積)圖線的斜率，而Mw增加通過(guò)一組參考樣品被計(jì)算為最低與最高注射體積之間的表觀分子量的增加。這兩個(gè)參數(shù)均反映了胰島素類似物響應(yīng)于稀釋而解離的趨勢(shì)，并因此反映了在皮下注射后快速解離為單體的可能性。

這些測(cè)定的結(jié)果以及現(xiàn)有技術(shù)胰島素類似物的結(jié)果在以下表2-4中呈現(xiàn)。

表2

分子量增加(Mw增加)

本發(fā)明的化合物

表3

分子量增加(Mw增加)

現(xiàn)有技術(shù)(WO 2009/022013)的化合物

給定實(shí)施例編號(hào)是已知的和現(xiàn)有技術(shù)(例如，WO 2009/022013)中描述的沒有B27Thr殘基缺失(desB27)的A22K?；念愃莆铩?/p>

表4

分子量增加(Mw增加)

現(xiàn)有技術(shù)(WO 2007/096431)的化合物

*)由于胰島素類似物在pH7.4下的溶解性較差，不能獲得數(shù)據(jù)。

給定實(shí)施例編號(hào)是已知的和現(xiàn)有技術(shù)(例如，WO 2007/096431)中描述的沒有B27Thr殘基缺失(desB27)的A22K?；念愃莆?。

結(jié)論

可以得出以下結(jié)論：與現(xiàn)有技術(shù)的相似的A22K?；愃莆?沒有B27Thr殘基缺失)相比，作為desB27類似物的本發(fā)明A22K?；葝u素更易響應(yīng)于稀釋而解離，并因此更加可用于餐時(shí)團(tuán)注施用?？梢赃M(jìn)一步得出以下結(jié)論：在該試驗(yàn)中，本發(fā)明的胰島素比人胰島素(也用作餐時(shí)胰島素，但具有比門冬胰島素更慢的作用譜)更像門冬胰島素(可作為或(Novo Nordisk A/S)商購(gòu)獲得，用作餐時(shí)胰島素)，從而突出了本發(fā)明的衍生物相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的改善的性質(zhì)。

本發(fā)明的類似物均具有較小的負(fù)R斜率-0.13至-0.02(表2)，因此比人胰島素(R斜率-0.65；見表3)更像門冬胰島素(R斜率-0.04；見表3)。相反，所有測(cè)試的現(xiàn)有技術(shù)的相似類似物均具有與人胰島素相似的R斜率(-0.52至-0.78；表3和表4)。因此，本發(fā)明的所有類似物均分別顯示出比現(xiàn)有技術(shù)的類似物更小的Mw增加(相對(duì)于53-83％，最多為10.7％)(參見表2、表3和表4)。

這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的化合物比現(xiàn)有技術(shù)的相似類似物更加單體化。在這方面，本發(fā)明的化合物與門冬胰島素相似，而現(xiàn)有技術(shù)的相似類似物與人胰島素相似。

實(shí)施例30：通過(guò)小角度X射線散射(SAXS)測(cè)量的自締合(self-association)

使用SAXS數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)估待測(cè)胰島素類似物在皮下注射后的自締合狀態(tài)。從含有0.6mM待測(cè)胰島素類似物和140mM pH 7.4的NaCl的無(wú)Zn制劑收集SAXS數(shù)據(jù)。對(duì)于每種類似物，利用SAXS散射譜具有來(lái)自多組分混合物中的所有單獨(dú)組分的強(qiáng)度貢獻(xiàn)這一事實(shí)，來(lái)評(píng)估單體、二聚體和更大物質(zhì)的相對(duì)量。通過(guò)采用每個(gè)組分的強(qiáng)度(形狀因數(shù)，form factors)，可以評(píng)估混合物中每個(gè)組分的體積分?jǐn)?shù)貢獻(xiàn)。使用非負(fù)或無(wú)約束最小二乘算法的線性方程的系統(tǒng)用來(lái)最小化實(shí)驗(yàn)散射曲線與計(jì)算的散射曲線之間的差異性。從單體、二聚體、六聚體等的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)計(jì)算形狀因數(shù)。該體積分?jǐn)?shù)以百分比(％)表示。

通過(guò)使用具有已知濃度的參考樣品并假設(shè)分子量的比與零角度下散射強(qiáng)度I(0)的比相同，近似估計(jì)平均分子量，將其相對(duì)于測(cè)量的濃度進(jìn)行歸一化。

從本發(fā)明衍生物和現(xiàn)有技術(shù)衍生物獲得的結(jié)果在以下表5、表6和表7中示出。

表5

本發(fā)明衍生物的SAXS數(shù)據(jù)

表6

現(xiàn)有技術(shù)(WO 2009/022013)衍生物的SAXS數(shù)據(jù)

表7

現(xiàn)有技術(shù)(WO 2007/096431)衍生物的SAXS數(shù)據(jù)

*)在測(cè)定緩沖液中沉淀的衍生物，表明非常大的物質(zhì)或聚集體的存在。不能獲得數(shù)據(jù)。

從這些研究可以得出以下結(jié)論：在模擬注射后皮下組織中的條件的條件下，與現(xiàn)有技術(shù)類似物相比，本發(fā)明的衍生物更易于解離成單體，并因此將在皮下注射后更快地被吸收。本發(fā)明類似物的單體含量在63-83％的范圍內(nèi)(相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)類似物的0-48％)?？梢赃M(jìn)一步得出以下結(jié)論：對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)類似物，所觀察到的最大的分子物質(zhì)在大小(Rg和Dmax)上都較大，而且以較大的量(42-62％，相對(duì)于本發(fā)明類似物的1-22％)被發(fā)現(xiàn)。這突出了該類似物與現(xiàn)有技術(shù)類似物相比用于餐時(shí)使用的實(shí)用性。

實(shí)施例31：藥物制劑的制備

本發(fā)明的藥物制劑可以被配制成水溶液。例如用氯化鈉和/或甘油使該水溶液成為等滲的。此外，該水性介質(zhì)可以含有緩沖液和防腐劑。將該制劑的pH值調(diào)節(jié)至期望值，并且根據(jù)所討論的胰島素類似物的等電點(diǎn)pI，該pH值可以為約3至約8.5，約3至約5，或約6.5，或約7.4，或約7.5。

無(wú)鋅胰島素制劑的制備

將無(wú)鋅胰島素類似物溶解在水溶液中，該最終制劑中含有0.6mM胰島素類似物、16mM間甲酚、16mM苯酚、7mM磷酸二鈉、適量的煙酰胺和甘油，并且采用1N鹽酸/1 N NaOH將pH調(diào)節(jié)至7.3-7.5(在室溫下測(cè)量)。加水至最終體積，并通過(guò)0.2μm過(guò)濾器將溶液過(guò)濾除菌。將該制劑裝入2ml小瓶中，并使用卷邊蓋密封。

表8

胰島素制劑的示例性組成

實(shí)施例32：用于評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)制劑的物理穩(wěn)定性的ThT原纖維形成試驗(yàn)

肽的低物理穩(wěn)定性可以導(dǎo)致淀粉樣原纖維形成，觀察到其在樣品中為井然有序的線狀大分子結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致凝膠形成。硫代黃素T(ThT)在與原纖維結(jié)合時(shí)具有獨(dú)特的熒光特征[Naiki等人(1989)Anal.Biochem.177 244-249；LeVine(1999)Methods.Enzymol.309 274-284]。

肽的部分折疊中間體的形成被認(rèn)為是原纖維形成的一般引發(fā)機(jī)制。這些中間體中的少數(shù)成核以形成模板，更多的中間體可以組裝到該模板上，并且原纖維形成繼續(xù)進(jìn)行。滯后時(shí)間對(duì)應(yīng)于核的臨界質(zhì)量積聚的時(shí)間間隔，而表觀速率常數(shù)是原纖維自身形成的速率(圖1)。

樣品制備

在每次試驗(yàn)前新制備樣品。將每種組合物的樣品與水性ThT-溶液(0.1mM ThT)以990∶10的體積比混合，并轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板(Packard Opti-Plate^TM-96，白色聚苯乙烯)中。通常，將每種樣品的四個(gè)或八個(gè)復(fù)制物(對(duì)應(yīng)于一種測(cè)試條件)放置在一列孔中。將板用Scotch 15 Pad(Qiagen)密封。

溫育和熒光測(cè)量

在Fluoroskan Ascent FL熒光讀板器或Varioskan讀板器(Thermo Labsystems)中完成在給定溫度下的溫育、搖動(dòng)以及ThT熒光發(fā)射的測(cè)量。將溫度調(diào)節(jié)至37℃。在所有呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)中，將定軌搖動(dòng)調(diào)節(jié)至960rpm、1mm的振幅。采用通過(guò)444nm濾光器的激發(fā)以及通過(guò)485nm濾光器測(cè)量發(fā)射來(lái)完成熒光測(cè)量。通過(guò)將板在測(cè)定溫度下溫育10分鐘來(lái)開始每一次運(yùn)行。每20分鐘對(duì)該板進(jìn)行測(cè)量，持續(xù)最多45小時(shí)。在各次測(cè)量之間，如所述地?fù)u動(dòng)并加熱該板。

數(shù)據(jù)處理

在Microsoft Excel中生成熒光相對(duì)于時(shí)間的曲線圖，并將滯后時(shí)間估計(jì)為如圖14A、14B和14C(分別是插圖1A、1B和1C)中所示的滯后區(qū)與原纖維形成區(qū)的線性近似之間的截距。滯后時(shí)間的增加對(duì)應(yīng)于物理穩(wěn)定性的增加。數(shù)據(jù)點(diǎn)通常為4個(gè)或8個(gè)樣品的平均值。

針對(duì)本發(fā)明的A22K酰化類似物以及沒有B27Thr殘基缺失(desB27)的現(xiàn)有技術(shù)的相似A22K?；愃莆铽@得的結(jié)果在以下表8中示出。

表8

無(wú)鋅制劑的以ThT滯后時(shí)間測(cè)量的物理穩(wěn)定性

*在ThT試驗(yàn)的時(shí)間跨度內(nèi)沒有原纖維形成

得出以下結(jié)論：與現(xiàn)有技術(shù)的相似類似物相比，在添加和未添加煙酰胺的無(wú)鋅制劑中，本發(fā)明的A22K酰化胰島素類似物表現(xiàn)出更好或相似的對(duì)原纖維形成的穩(wěn)定性(即，具有增加的物理穩(wěn)定性)。這是非常令人驚訝的，因?yàn)镾AXS和SEC-HPLC稀釋數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的胰島素類似物在大小上較小(即，由單體和二聚體組成)，技術(shù)人員預(yù)期這將會(huì)導(dǎo)致較低的物理穩(wěn)定性。

實(shí)施例33：胰島素化學(xué)穩(wěn)定性的分析

大小排阻色譜法

使用的制劑：見實(shí)施例31

在Waters Acquity BEH200 SEC柱(150 x 2.4mm，部件號(hào)186005225)上采用含有55％(v/v)乙腈、0.05％TFA的洗脫液在流速0.2ml/min以及柱溫40℃下進(jìn)行高分子量蛋白質(zhì)(HMWP)和單體胰島素類似物的定量測(cè)定。用可調(diào)節(jié)的吸光度檢測(cè)器(Waters Acquity TUV)在215nm處進(jìn)行檢測(cè)。600μM胰島素類似物制劑和600μM人胰島素標(biāo)準(zhǔn)物的注射體積均為1.5μl。每種類似物制劑在2ml小瓶中在5℃、25℃和37℃下溫育。在限定的時(shí)間測(cè)量制劑的HMWP和含量。結(jié)果在以下表9中示出。

表9

在37℃下儲(chǔ)存的HMWP含量

*未測(cè)定

得出以下結(jié)論：在37℃下在無(wú)鋅制劑中儲(chǔ)存時(shí)，本發(fā)明胰島素衍生物的高分子量蛋白質(zhì)(HMWP)的形成少得多(實(shí)施例2、4和7的本發(fā)明胰島素儲(chǔ)存8周后分別形成最多6.8％的HMWP)，而現(xiàn)有技術(shù)的相似胰島素衍生物導(dǎo)致29.1％HMWP的形成。進(jìn)一步得出以下結(jié)論：在無(wú)鋅制劑中以及在煙酰胺的存在下，在37℃下儲(chǔ)存時(shí)，本發(fā)明的胰島素衍生物形成低水平的HMWP。

反相色譜法(UPLC)

在采用Phenomenex Kinetex C18柱(大小為2.1x150mm，顆粒大小為1.7μm，且孔隙大小為)(Phenomenex部件號(hào)00F-4475-AN)的UPLC系統(tǒng)上，在50℃下以0.3ml/min的流速以及在215nm處UV檢測(cè)下進(jìn)行胰島素相關(guān)雜質(zhì)的測(cè)定。通過(guò)如下組成的流動(dòng)相進(jìn)行洗脫：A：10％(v/v)乙腈、0.09M磷酸氫二銨，pH 3.6，以及B：80％(v/v) 乙腈。梯度：0-7min，從15％B線性變化至26％B；7-34min，線性變化至40％B；34-36分鐘，線性變化至80％B，以用于柱洗滌，之后回到初始條件，在39min時(shí)15％B。雜質(zhì)的量被確定為測(cè)量的吸收面積在防腐劑洗脫后測(cè)定的總吸收面積中的百分比。每種類似物制劑在2ml小瓶中在5℃、25℃和37℃下溫育。在限定的時(shí)間測(cè)量制劑的胰島素相關(guān)雜質(zhì)。結(jié)果在以下表10中示出。

表10

在37℃下儲(chǔ)存的純度

得出以下結(jié)論：與現(xiàn)有技術(shù)的相似A22K?；愃莆锵啾龋景l(fā)明的胰島素衍生物在沒有鋅的制劑中穩(wěn)定得多?，F(xiàn)有技術(shù)的類似物如此不穩(wěn)定，以至于在37℃下儲(chǔ)存8周后，少于5％(對(duì)應(yīng)于84％的純度損失)的衍生物是完整的。本發(fā)明的胰島素類似物(實(shí)施例2、4和7的化合物所代表的)在37℃下儲(chǔ)存8周后分別具有小于7.7％、5.5％和15％的純度損失。進(jìn)一步得出以下結(jié)論：本發(fā)明的胰島素類似物在添加煙酰胺的無(wú)鋅制劑中是穩(wěn)定的。

實(shí)施例34：在LYD豬中的皮下PK/PD譜

可以根據(jù)該方案，通過(guò)向豬的皮下施用，例如，與商用制劑中的門冬胰島素(NovoRapid)進(jìn)行比較或與現(xiàn)有技術(shù)的相似A22K酰化胰島素類似物進(jìn)行比較，來(lái)測(cè)試本發(fā)明的胰島素衍生物?？梢詼y(cè)試該衍生物的藥代動(dòng)力學(xué)和/或藥效學(xué)參數(shù)。

使用的通用方法

超聲檢查和注射區(qū)的標(biāo)記

在麻醉以放置永久靜脈內(nèi)導(dǎo)管的過(guò)程中，使用型號(hào)為“MyLabFive”的Esaote超聲掃描儀以及“LA435 6-18 MHz”型線性探針通過(guò)超聲對(duì)豬進(jìn)行檢查。找到在右側(cè)或左側(cè)(與導(dǎo)管相對(duì))的、耳朵與肩胛之間的中頸部，即下方?jīng)]有肌肉(適合皮下注射)的2 x 2cm區(qū)域，并用刺青進(jìn)行標(biāo)記。

喂養(yǎng)時(shí)間表

豬在實(shí)驗(yàn)前禁食(沒有早餐)。

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，豬都在其正常的圍欄中并且它們沒有被麻醉。豬在采集第12小時(shí)血液樣品之前禁食，但可以自由地獲取水。在采集第12小時(shí)血液樣品后，給豬喂食食物和蘋果。

給藥

將Penfill安裝在中。針對(duì)每只豬使用新的針。使用針阻擋器(needle stopper)，以確保到表皮以下5mm的最大皮下穿透。針對(duì)每只豬計(jì)算并記錄劑量體積(IU體積)。

劑量體積(U)＝((體重x劑量nmol/kg)/濃度nmol/mL)x 100U/mL

在豬頸部的右側(cè)或左側(cè)(與導(dǎo)管相對(duì))在皮下組織中側(cè)向給藥，并且在注射后將針保持在皮下組織中最少10秒，以確?；衔锍练e。

低血糖的治療

在皮下給藥后，葡萄糖溶液應(yīng)準(zhǔn)備好用于靜脈內(nèi)注射以預(yù)防低血糖，即，將4-5個(gè)注射器(20mL)用無(wú)菌的20％葡萄糖填充，備用。低血糖的診斷基于臨床癥狀以及血糖儀(Glucocard X-計(jì))上的血糖測(cè)量。

治療由緩慢靜脈內(nèi)注射50-100ml 20％葡萄糖(10-20g葡萄糖)組成。經(jīng)5-10分鐘分份給予葡萄糖，直到起效。

血液采樣

在實(shí)驗(yàn)前，用未添加10IU/mL肝素的無(wú)菌0.9％NaCl檢查頸部導(dǎo)管的通暢性。

在給藥之前和之后，在以下時(shí)間點(diǎn)從中央靜脈導(dǎo)管以穩(wěn)定的形式取得血液樣品：

給藥前(-10、0)、3、6、9、12、15、20、30、45、60、90、120、150、180、240、300、360、420、480、540、600和720分鐘。

采用3通旋塞閥取得樣品。在取樣前放出4-5mL的廢血并丟棄。

將0.8ml的血液樣品收集至EDTA涂覆的管中，以用于葡萄糖和胰島素分析。

在取得每個(gè)血液樣品后，將導(dǎo)管用未添加10IU/mL肝素的5ml無(wú)菌0.9％NaCl沖洗。

將管輕輕地傾斜至少10次，以確保血液和抗凝劑(EDTA)充分混合，并在一分鐘后將其放置在濕冰上。在采樣后1小時(shí)內(nèi)，將該管在3000rpm和4℃下旋轉(zhuǎn)10分鐘。將樣品儲(chǔ)存在濕冰上，直到用移液管移取。

要求無(wú)菌技術(shù)，以避免導(dǎo)管中的細(xì)菌生長(zhǎng)使凝血風(fēng)險(xiǎn)增加。

實(shí)驗(yàn)后導(dǎo)管的封閉

如果沒有采用無(wú)菌技術(shù)進(jìn)行血液采樣，則可以將采用1ml/10kg的(溶解在10ml 0.9％NaCl中的1g氨芐青霉素)的單次靜脈內(nèi)處理經(jīng)由已用于血液采樣的導(dǎo)管緩慢地靜脈內(nèi)施用。在該處理后，用10ml 0.9％NaCl沖洗導(dǎo)管。

用添加有肝素(10IU/mL)的5ml無(wú)菌0.9％NaCl沖洗導(dǎo)管。將導(dǎo)管用具有乳膠注射膜的新魯爾鎖(luer-lock)封閉，并通過(guò)作為該導(dǎo)管的鎖的該膜注射1.0ml的TauroLockHep500。

血液樣品的分析

血漿葡萄糖：將10ul的血漿用移液管移到500ul的緩沖溶液中，以用于在BIOSEN自動(dòng)分析儀中測(cè)定血漿中的葡萄糖濃度。

血漿胰島素：將1 x 50μl的血漿用移液管移到0.65ml管(ELISA/LOCI/SPA設(shè)置)中，以用于采用ELISA或LC-MS進(jìn)行分析。

將血漿在-20℃下冷凍儲(chǔ)存。

實(shí)施例35：實(shí)施例1的胰島素衍生物在LYD豬中的皮下PK/PD譜

在上述通用程序后，獲得了實(shí)施例1的胰島素衍生物的以下PK和PD譜。

使用的制劑

實(shí)施例1的胰島素衍生物，pH＝7.4，609μM；1.6％(w/vol)甘油；30mM苯酚(0個(gè)Zn/六聚體)。

門冬胰島素，商用制劑，600μM；1.6％(w/vol)甘油；7mM磷酸鹽；10mM氯化鈉；300μM乙酸鋅；16mM苯酚；16mM間甲酚。

這些測(cè)定的結(jié)果在附圖1-4和以下表11中呈現(xiàn)。

表11

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(平均值±SD)

^aT_max以中值給出

^bT_1/2以調(diào)和平均值±偽SD給出

^c基于靜脈內(nèi)數(shù)據(jù)(未示出)計(jì)算的生物利用度

結(jié)論

得出以下結(jié)論：在無(wú)鋅制劑中的實(shí)施例1的胰島素衍生物具有與門冬胰島素商用制劑非常相似的PK/PD譜。此外，該胰島素衍生物的平均保留時(shí)間為165分鐘?？梢缘贸鲆韵陆Y(jié)論：實(shí)施例1的胰島素衍生物作為速效(餐時(shí))胰島素是有用的。

實(shí)施例36：實(shí)施例2的胰島素衍生物在LYD豬中的皮下PK/PD譜

在上述通用程序后，獲得了實(shí)施例2的胰島素衍生物的以下PK和PD譜。

使用的制劑

實(shí)施例2的胰島素衍生物，pH＝7.367，607μM；1.6％(w/vol)甘油；30mM苯酚(0個(gè)Zn/六聚體)。

門冬胰島素，商用制劑，600μM；1.6％(w/vol)甘油；7mM磷酸鹽；10mM氯化鈉；300μM乙酸鋅；16mM苯酚；16mM間甲酚。

這些測(cè)定的結(jié)果在附圖4-5和以下表12中呈現(xiàn)。

表12

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(平均值±SD)

^aT_max以中值給出

^bT_1/2以調(diào)和平均值±偽SD給出

^c基于靜脈內(nèi)數(shù)據(jù)(未示出)計(jì)算的生物利用度

結(jié)論

得出以下結(jié)論：在無(wú)鋅制劑中的實(shí)施例2的胰島素衍生物具有與門冬胰島素非常相似的PK/PD譜。此外，該胰島素衍生物的平均保留時(shí)間為111分鐘，與(門冬胰島素)沒有顯著不同?？梢缘贸鲆韵陆Y(jié)論：實(shí)施例2的胰島素衍生物作為速效(餐時(shí))胰島素是有用的。

實(shí)施例37：實(shí)施例11的胰島素衍生物在LYD豬中的皮下PK/PD譜

在上述通用程序后，獲得了實(shí)施例11的胰島素衍生物的以下PK和PD譜。

使用的制劑

實(shí)施例11的胰島素衍生物，pH＝7.44，689μM；1.6％(w/vol)甘油；30mM苯酚(0個(gè)Zn/六聚體)。

這些測(cè)定的結(jié)果在附圖6-7和以下表13中呈現(xiàn)。

圖6和圖7分別示出了以每6個(gè)胰島素分子0個(gè)鋅配制的實(shí)施例11的胰島素(1nmol/kg)的PK(藥代動(dòng)力學(xué))譜(胰島素濃度相對(duì)于時(shí)間)，以及所引起的血漿葡萄糖變化；1nmol/kg；

表13

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(平均值±SD)

^aT_max以中值給出

^bT_1/2以調(diào)和平均值±偽SD給出

得出以下結(jié)論：在無(wú)鋅制劑中的實(shí)施例11的胰島素衍生物具有適合作為餐時(shí)胰島素的PK譜。此外，該胰島素衍生物的平均保留時(shí)間為334分鐘，與相似的(同樣是)含有1，16-十六烷二酸的現(xiàn)有技術(shù)胰島素衍生物A22K(N(eps)-十六烷二?；?gGlu-2xOEG)，B29R，desB30人胰島素(WO 2009/022013，實(shí)施例45，(MRT＝1287分鐘)，見下文)所獲得的譜相比顯著縮短?？梢缘贸鲆韵陆Y(jié)論：實(shí)施例11的胰島素衍生物作為速效(餐時(shí))胰島素是有用的。

實(shí)施例38：實(shí)施例4的胰島素衍生物在LYD豬中的皮下PK/PD譜

在上述通用程序后，獲得了實(shí)施例4的胰島素衍生物的以下PK和PD譜。

使用的制劑

實(shí)施例4的胰島素衍生物，pH＝7.43，621μM；1.8％(w/vol)甘油；16mM苯酚；16mM間甲酚，10mM氯化鈉(0個(gè)Zn/六聚體)。

這些測(cè)定的結(jié)果在附圖8-9和以下表14中呈現(xiàn)。

表14

藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)

a)T_max以中值給出

b)T_1/2以調(diào)和平均值±偽SD給出

得出以下結(jié)論：在無(wú)鋅制劑中的實(shí)施例4的胰島素衍生物具有適合作為餐時(shí)胰島素的PK譜。此外，該胰島素衍生物的平均保留時(shí)間為160分鐘，與相似的含有1，16-十六烷二酸的現(xiàn)有技術(shù)胰島素衍生物A22K(N(eps)-十六烷二酰基-gGlu-2xOEG)，B29R，desB30人胰島素(WO 2009/022013，實(shí)施例45，(MRT＝1287分鐘)，見下文)所獲得的譜相比顯著縮短。可以得出以下結(jié)論：實(shí)施例4的胰島素衍生物作為速效(餐時(shí))胰島素是有用的。

實(shí)施例39：現(xiàn)有技術(shù)胰島素衍生物在LYD豬中的皮下PK/PD譜

在上述通用程序后，獲得了現(xiàn)有技術(shù)胰島素衍生物A22K(N(eps)-十六烷二?；?gGlu-2xOEG)，B29R，desB30人胰島素(WO 2009/022013，實(shí)施例45)的以下PK和PD譜。

使用的制劑

WO 2009/022013實(shí)施例45的化合物，588μM；1.6％(w/vol)甘油；30mM苯酚；7mM tris，pH＝7.4(0個(gè)Zn/六聚體)，1nmol/kg。

這些測(cè)定的結(jié)果在附圖10和11以及以下表15中呈現(xiàn)。

圖10和11分別示出了以每6個(gè)胰島素分子0個(gè)鋅配制的現(xiàn)有技術(shù)胰島素衍生物，即A22K(N(eps)-十六烷二?；?gGlu-2xOEG)，B29R，desB30人胰島素(WO 2009/022013，實(shí)施例45)(1nmol/kg)的PK(藥代動(dòng)力學(xué))譜(胰島素濃度相對(duì)于時(shí)間)，以及所引起的血漿葡萄糖變化(1nmol/kg)。

表15

1nmol/kg的WO 2009/022013實(shí)施例45的化合物皮下給藥后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

^aT_max以中值±SD給出

^bT_1/2以調(diào)和平均值±偽SD給出

得出以下結(jié)論：在無(wú)鋅制劑中的現(xiàn)有技術(shù)(WO 2009/022013，實(shí)施例45)胰島素衍生物與持久的拖尾有關(guān)，這可能源自于一部分皮下儲(chǔ)留物的延遲吸收。該胰島素在24小時(shí)(1440分鐘)時(shí)間點(diǎn)時(shí)的血漿濃度為98pM。而且，血糖降低效應(yīng)被延長(zhǎng)至持續(xù)至少8小時(shí)(480分鐘)。平均停留時(shí)間為1287分鐘，差不多1天。這使得該現(xiàn)有技術(shù)胰島素不適合于餐時(shí)使用。

實(shí)施例40：現(xiàn)有技術(shù)胰島素衍生物的相近類似物在LYD豬中的皮下PK/PD譜

在上述通用程序后，獲得了如WO 2009/022013(特別參見實(shí)施例45(A22K(N(eps)-十六烷二酰基-gGlu-2xOEG)，B29R，desB30人胰島素))中描述的代表現(xiàn)有技術(shù)的C14二酸類似物A22K(N(eps)-十四烷二酰基-gGlu-2xOEG)，B29R，desB30人胰島素的以下PK和PD譜。

使用的制劑

A22K(N(eps)-十四烷二?；?gGlu-2xOEG)，B29R，desB30人胰島素(WO 2009/022013實(shí)施例45的1，16-十六烷二?；?C16二酸)類似物的1，14-十四烷二?；?C14二酸)類似物)，588μM；1.6％(w/vol)甘油；30mM苯酚；7mM tris，pH＝7.4(0個(gè)Zn/六聚體)。

這些測(cè)定的結(jié)果在附圖9和以下表16中呈現(xiàn)。

圖12和13分別示出了以每6個(gè)胰島素分子0個(gè)鋅配制的代表現(xiàn)有技術(shù)的胰島素衍生物的C14二酸類似物，即A22K(N(eps)-十六烷二酰基-gGlu-2xOEG)，B29R，desB30人胰島素(WO 2009/022013，實(shí)施例45)(1nmol/kg)的PK(藥代動(dòng)力學(xué))譜(胰島素濃度相對(duì)于時(shí)間)，以及所引起的血漿葡萄糖變化(72nmol/動(dòng)物)。

表16

1nmol/kg WO 2009/0022013實(shí)施例45的現(xiàn)有技術(shù)化合物的C16二酸類似物的C14二酸類似物皮下給藥后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(72nmol/動(dòng)物)

結(jié)論

得出以下結(jié)論：在無(wú)鋅制劑中的現(xiàn)有技術(shù)(WO 2009/022013，實(shí)施例45)胰島素衍生物的C14二酸形式與持久的拖尾有關(guān)，這可能源自于一部分皮下儲(chǔ)留物的延遲吸收。該胰島素在10小時(shí)(600分鐘)時(shí)間點(diǎn)時(shí)的血漿濃度為24pM。發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)有技術(shù)的C14二酸類似物的平均保留時(shí)間(MRT)為271分鐘。采用本發(fā)明實(shí)施例1和2的C14二酸類似物獲得的相應(yīng)結(jié)果分別為165和111分鐘。而且，血糖降低效應(yīng)被延長(zhǎng)至持續(xù)至少11小時(shí)(660分鐘)。

這使得該現(xiàn)有技術(shù)胰島素不適合于餐時(shí)使用。

實(shí)施例41：實(shí)施例2的胰島素衍生物在肥胖Zucker大鼠中的皮下PK/PD譜，在制劑中含有和不含170mM煙酰胺的情況下譜的比較

在上述通用程序后，獲得了實(shí)施例2的胰島素衍生物的以下PK和PD譜。

使用的制劑

實(shí)施例2的胰島素衍生物，pH＝7.43，621μM；1.8％(w/vol)甘油；16mM苯酚；16mM間甲酚，10mM氯化鈉(0個(gè)Zn/六聚體)，含有和不含170mM煙酰胺。

向大鼠給藥40nmol/kg。

這些測(cè)定的結(jié)果在附圖15中呈現(xiàn)。

得出以下結(jié)論：在實(shí)施例2的胰島素?zé)o鋅制劑中包含170mM煙酰胺(向Zucker大鼠皮下給藥)導(dǎo)致更加速效、具有更早T_max的PK譜。因此表明，在本發(fā)明實(shí)施例2的胰島素制劑中包含煙酰胺產(chǎn)生了更加適合于餐時(shí)使用的胰島素制劑。

實(shí)施例42：實(shí)施例7的胰島素衍生物在肥胖Zucker大鼠中的皮下PK/PD譜，在制劑中含有和不含170mM煙酰胺的情況下譜的比較

在上述通用程序后，獲得了實(shí)施例7的胰島素衍生物的以下PK和PD譜。

使用的制劑：

實(shí)施例7的胰島素衍生物，pH＝7.39，604μM；1.6％(w/vol)甘油；16mM苯酚；16mM間甲酚；7mM磷酸鈉；10mM氯化鈉(0個(gè)Zn/六聚體)；170mM煙酰胺。

實(shí)施例7的胰島素衍生物，pH＝7.39，599μM；1.6％(w/vol)甘油；16mM苯酚；16mM間甲酚，7mM磷酸鈉；10mM氯化鈉(0個(gè)Zn/六聚體)。

向大鼠給藥40nmol/kg。

這些測(cè)定的結(jié)果在附圖16-17中呈現(xiàn)。

得出以下結(jié)論：在實(shí)施例7的胰島素?zé)o鋅制劑中包含170mM煙酰胺(向Zucker大鼠皮下給藥)導(dǎo)致更加速效、具有更早T_max的PK譜。因此表明，在本發(fā)明實(shí)施例7的胰島素制劑中包含煙酰胺產(chǎn)生了更加適合于餐時(shí)使用的胰島素制劑。

實(shí)施例43：實(shí)施例16的胰島素衍生物在肥胖Zucker大鼠中的皮下PK/PD譜，在制劑中含有和不含170mM煙酰胺的情況下譜的比較

在上述的通用程序后，獲得了實(shí)施例16的胰島素衍生物的以下PK和PD譜。

使用的制劑

實(shí)施例16的胰島素衍生物，pH＝7.44，599μM；1.6％(w/vol)甘油；16mM苯酚；16mM間甲酚；7mM磷酸鈉；10mM氯化鈉(0個(gè)Zn/六聚體)；170mM煙酰胺。

實(shí)施例16的胰島素衍生物，pH＝7.40，581uM；1.6％(w/vol)甘油；16mM苯酚；16mM間甲酚；7mM磷酸鈉；10mM氯化鈉(0個(gè)Zn/六聚體)。

向大鼠給藥40nmol/kg。

這些測(cè)定的結(jié)果在附圖18-19中呈現(xiàn)。

得出以下結(jié)論：在實(shí)施例16的胰島素?zé)o鋅制劑中包含170mM煙酰胺(向Zucker大鼠皮下給藥)導(dǎo)致更加速效、具有更早T_max的PK譜。因此表明，在本發(fā)明實(shí)施例16的胰島素制劑中包含煙酰胺產(chǎn)生了更加適合于餐時(shí)使用的胰島素制劑。

實(shí)施例44：實(shí)施例4的胰島素衍生物在LYD豬中的皮下PK/PD譜，在制劑中含有和不含170μM煙酰胺的情況下譜的比較

在上述通用程序后，獲得了實(shí)施例4的胰島素衍生物的以下PK和PD譜。

使用的制劑

實(shí)施例4的胰島素衍生物，pH＝7.42，0.604mM胰島素衍生物；16mM苯酚；16mM間甲酚；2％(w/vol)甘油；7mM磷酸鹽(0個(gè)Zn/六聚體)。

實(shí)施例4的胰島素衍生物，pH＝7.43，0.605mM胰島素衍生物；170mM煙酰胺；16mM苯酚；16mM間甲酚；0.6％(w/vol)甘油；7mM磷酸鹽

向豬給藥1nmol/kg。

這些測(cè)定的結(jié)果在附圖20中呈現(xiàn)。

得出以下結(jié)論：在實(shí)施例4的胰島素?zé)o鋅制劑中包含170μM煙酰胺(向豬皮下給藥)導(dǎo)致更加速效、具有更早T_max的PK譜。因此表明，在本發(fā)明實(shí)施例4的胰島素制劑中包含煙酰胺產(chǎn)生了更加適合于餐時(shí)使用的胰島素制劑。

實(shí)施例45：實(shí)施例2的胰島素衍生物在LYD豬中的皮下PK/PD譜，在制劑中含有和不含170μM煙酰胺的情況下譜的比較

在上述通用程序后，獲得了實(shí)施例2的胰島素衍生物的以下PK和PD譜。

使用的制劑

實(shí)施例2的胰島素衍生物，pH＝7.4，608μM；2％(w/vol)甘油；16mM苯酚；16mM間甲酚；7mM磷酸鈉(0個(gè)Zn/六聚體)。

實(shí)施例2的胰島素衍生物，pH＝7.4，614μM；170μM煙酰胺，0.6％(w/vol)甘油；16mM苯酚；16mM間甲酚；7mM磷酸鈉(0個(gè)Zn/六聚體)。

向豬給藥1nmol/kg。

這些測(cè)定的結(jié)果在附圖21中呈現(xiàn)。

得出以下結(jié)論：在實(shí)施例2的胰島素?zé)o鋅制劑中包含170μM煙酰胺(向豬皮下給藥)導(dǎo)致更加速效、具有更早T_max的PK譜。因此表明，在本發(fā)明實(shí)施例2的胰島素制劑中包含煙酰胺產(chǎn)生了更加適合于餐時(shí)使用的胰島素制劑。