本發(fā)明涉及被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸。更具體而言，涉及可用作藥物的有效成分的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸，該藥物用于預防和/或治療肝缺血再灌注損傷。

背景技術：

已知，肝移植、肝切除時的術后肝功能衰竭的主要原因是由缺血再灌注產生的缺氧/復氧(Hypoxia-reoxygenation)；由缺血再灌注導致的肝損傷的預防中，重要的是肝竇內皮細胞(LSEC)的保護(Caldwell et al.Hepatology,10,pp.292-299,1989)。由于報告有，因缺氧/復氧而產生LSEC凋亡(Neal R.Banga et al.J.Surg.Res.,178,pp.e35-41,2012)，因此，可以認為，LSEC是肝缺血再灌注損傷的主要因素。

另外，作為鞘脂介質的鞘氨醇-1-磷酸(S1P)是來自作為細胞膜的構成組分的鞘磷脂的鞘氨醇被鞘氨醇激酶磷酸化而產生，通過S1P受體而表現(xiàn)出多彩的生理活性。還報告有例如，已知S1P具有抗凋亡作用(Cuvillier et al.,Nature,381,pp.800-803,1996)、醇性肝損傷中抑制LSEC的凋亡(Dong-Mei Zheng et al.Hepatology,44,pp.1278-1287,2006)、抑制由缺血再灌注導致的腎損傷(Lee et al.Nephrology,2011)。

由這樣的觀點出發(fā)，可以期待通過使用S1P保護LSEC來減輕由缺氧/復氧導致的肝損傷。然而，S1P是構成生物膜的鞘脂的代謝產物，大多包含于血小板、內皮細胞，因此存在不能將S1P自身用于以LSEC為靶標預防和/或治療缺血再灌注損傷的問題。

為了解決該問題，嘗試使用作為S1P受體激動劑的FTY720(芬戈莫德(Fingolimod)鹽酸鹽：在生物體內通過鞘氨醇激酶轉換為FTY720磷酸化體)來降低由缺氧/復氧導致的肝損傷(American Journal of Transplantation,5,pp.40-49,2005)。然而，有該化合物在長期給藥時會作為S1P的拮抗劑起作用的擔心。另外，該化合物作為整體具有與鞘氨醇類似的化學結構，但是碳鏈中具有亞苯基，因此不是S1P直接的衍生物，也不是用于將S1P自身用于保護LSEC的化合物。

另外，報告有透明質酸(HA)在血管內給藥之后集聚于LSEC(Fraser J et al.Cell Tissue Res.,242,pp.505-510,1985)；還報告有透明質酸受體(HARE/Stabilin-2)在LSEC上特異性地表達(Bin Zhou et al.J.Biol.Chem.,275,pp.37733-37741,2000)，因此嘗試了通過將S1P搭載于用透明質酸覆蓋的脂質體而有效地將S1P送達至LSEC(科學研究費助成事業(yè)，研究課題號:23390319、“使用了S1P·透明質酸修飾脂質體的對于難治性肝損傷的新治療藥物的開發(fā)”、大河內信弘等、2011～2013年度)。然而，存在如下問題：由于脂質體的電荷、分子量的大小等，作為透明質酸的配體的功能不充分且不能達到所希望的DDS效果。

現(xiàn)有技術文獻

非專利文獻

非專利文獻1：Caldwell et al.,Hepatology,10,pp.292-299,1989

非專利文獻2：Neal R.Banga et al.,J.Surg.Res.,178,pp.e35-41,2012

非專利文獻3：Cuvillier et al.,Nature,381,pp.800-803,1996

非專利文獻4：Dong-Mei Zheng et al.,Hepatology,44,1278-1287,2006

非專利文獻5：Lee et al.,Nephrology,16,pp.163-173,2011

非專利文獻6：American Journal of Transplantation,5,pp.40-49,2005

非專利文獻7：Fraser J et al.Cell Tissue Res.,242,505-510,1985

非專利文獻8：科學研究費助成事業(yè)、研究課題號:23390319、《S1P·ヒアルロン酸修飾リポソームを用いた難治性肝障害に対する新規(guī)治療薬の開発》(使用了S1P·透明質酸修飾脂質體的對于難治性肝損傷的新治療藥物的開發(fā))、大河內信弘等、2011～2013年度(2013年外科學會：以肝竇內皮細胞為靶標的搭載了Sphingosine-1-phosphate的肝再生新型DDS制劑的開發(fā))

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的問題

本發(fā)明目的在于提供能夠通過保護LSEC來減輕由缺氧/復氧導致的肝損傷的物質。更具體而言，本發(fā)明的課題在于提供通過靜脈內給藥等給藥形式效率良好地集聚于LSEC而發(fā)揮抗凋亡作用來保護LSEC，從而能夠減輕由缺氧/復氧導致的肝損傷的物質。

用于解決問題的方案

本發(fā)明人等為了解決上述問題而進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)，被S1P修飾的透明質酸極有效率地集聚于LSEC；以及該修飾透明質酸對于由缺氧/復氧導致的LSEC凋亡的抑制具有高的有效性。還發(fā)現(xiàn)了，例如，通過靜脈內給藥等給藥路徑對包括人的哺乳類動物給藥該被S1P修飾的透明質酸，能夠有效地預防和/或治療由缺氧/復氧導致的肝損傷。本發(fā)明是基于該見解而完成的。

即，通過本發(fā)明，可以提供被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸。該透明質酸是通過使鞘氨醇-1-磷酸與透明質酸共價鍵合而得到的。

根據本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，可以提供能夠通過使透明質酸與鞘氨醇-1-磷酸縮合而得到的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸。該透明質酸優(yōu)選通過使透明質酸的羧基與鞘氨醇-1-磷酸的氨基酰胺鍵合而得到。

從其他的觀點來看，通過本發(fā)明，可以提供用于預防和/或治療伴隨著肝缺血再灌注的肝功能衰竭且包含被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸作為有效成分的藥物；以及用于預防和/或治療伴隨著肝血流阻斷的肝手術后的肝功能衰竭且包含被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸作為有效成分的藥物。作為伴隨著肝血流阻斷的肝手術，可列舉出例如，肝移植、肝部分切除等。

另外，通過本發(fā)明，可以提供用于預防和/或治療由肝缺血再灌注產生的缺氧/復氧導致的肝功能衰竭且包含被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸作為有效成分的藥物；以及用于抑制由肝缺血再灌注產生的缺氧/復氧導致的肝竇內皮細胞的凋亡且包含被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸作為有效成分的藥物。

進而，從其他的觀點出發(fā)，通過本發(fā)明，可以提供被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸在制造上述藥物中的應用；伴隨著肝缺血再灌注的肝功能衰竭的預防和/或治療方法，其包括對包括人的哺乳類動物給藥預防和/或治療有效量的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸的工序；伴隨著肝血流阻斷的肝手術后的肝功能衰竭的預防和/或治療方法，其包括對包括人的哺乳類動物給藥預防和/或治療有效量的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸的工序；由肝缺血再灌注產生的缺氧/復氧導致的肝功能衰竭的預防和/或治療方法，其包括對包括人的哺乳類動物給藥預防和/或治療有效量的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸的工序；抑制由肝缺血再灌注產生的缺氧/復氧導致的肝竇內皮細胞凋亡的方法，其包括對包括人的哺乳類動物給藥預防和/或治療有效量的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸的工序。

發(fā)明的效果

由本發(fā)明提供的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸極有效地集聚于肝竇內皮細胞并且能夠抑制由缺氧/復氧導致的肝竇內皮細胞的凋亡。另外，將通過本發(fā)明提供的包含被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸作為有效成分的藥物對于由伴隨著肝缺血再灌注的缺氧/復氧產生的肝功能衰竭的預防和/或治療具有高的有效性，因此，作為用于預防和/或治療伴隨著肝血流阻斷的肝手術后的肝功能衰竭的藥物是極其有用的。

附圖說明

圖1是實施例的例1中合成的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸的NMR圖。

圖2是表示實施例的例2中的4組實驗步驟的圖。

圖3是表示肝功能(ALT)的測定結果的圖。

圖4是表示確認了通過蛋白質印跡表達活化型半胱天冬酶(Cleaved caspase)3的結果的圖。

圖5是表示作為肝臟病理評價的HE染色的結果的圖。

圖6是表示作為肝臟病理評價的TUNEL染色的結果的圖。

圖7是表示用TUNEL染色將顯示出需要的細胞數進行定量化的結果的圖。

圖8是表示基于電子顯微鏡的肝臟微細結構的評價結果的圖。

圖9是表示通過蛋白質印跡確認S1P在肝臟的集聚的結果的圖。

具體實施方式

通過本發(fā)明，可以提供被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸(以下,有時簡稱為“HA-S1P”)。HA-S1P可以通過使鞘氨醇-1-磷酸與透明質酸共價鍵合而得到，例如，可以通過使透明質酸與鞘氨醇-1-磷酸在縮合劑的存在下縮合而得到。通常情況下，通過縮合使透明質酸的羧基與鞘氨醇-1-磷酸的氨基之間生成酰胺鍵即可。當然，對于鞘氨醇-1-磷酸的透明質酸的共價鍵合的方式，并不限定于上述的酰胺鍵，也可以為透明質酸的羧基與鞘氨醇-1-磷酸的羥基的酯鍵等。

透明質酸是N-乙酰葡糖胺與葡糖醛酸的二糖單元(該單元的分子量大約為400)連接而成的高分子，通常具有5000～8000000左右的分子量。例如，分子量600000的透明質酸所包含的二糖單元為約1500個，分子量8000的透明質酸所包含的二糖單元為約20個。透明質酸通常以游離形態(tài)的透明質酸或透明質酸鈉的形式獲得。本說明書中所使用的“透明質酸”這樣的術語包含透明質酸鈉。透明質酸或透明質酸鈉可以以食品用、化妝品用的形式提供，也可以以藥物的形式使用。

例如：作為適用于變形性關節(jié)病的透明質酸鈉使用分子量為600000～1200000左右(商品名“ALTS”)、500000～730000左右(商品名“Hyalgan”)的物質；在眼科手術用中使用分子量為600000～1200000左右(商品名“OPEGAN”)、分子量為1900000～3900000左右(商品名“OPEGAN Hi”)、分子量為1900000～3900000左右(商品名“Hyarone”)、1530000～2130000左右(商品名“OPELEAD”)等的物質，還通過酶處理提供分子量為10000～100000左右的低分子量的物質，進而分子量為500～5000左右超低分子量的物質等。

對于作為用于制備本發(fā)明的HA-S1P的原料而使用的透明質酸的分子量，沒有特別的限定，除了上述例示的物質之外，也可以使用多種分子量的透明質酸。例如可以將平均分子量為500000～700000左右的物質、通過酶處理使平均分子量為8000左右的透明質酸等作為原料來使用。對于作為用于制備本發(fā)明的被鞘氨醇-1-磷酸修飾的透明質酸的原料而使用的透明質酸的來源，沒有特別的限定，例如可以為來源于雞冠或來源于發(fā)酵等任意來源的物質。

對于本發(fā)明的HA-S1P的制造方法，沒有特別的限定，但例如可以通過使透明質酸與鞘氨醇-1-磷酸在縮合劑的存在下縮合來容易地制造。對于縮合劑的種類，沒有特別的限定，通常能夠使用的縮合劑都可以使用，可以使用例如碳二亞胺系縮合劑、咪唑系縮合劑、三嗪系縮合劑等。作為碳二亞胺系縮合劑，可列舉出例如：N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N,N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)鹽酸鹽等，但特別優(yōu)選使用EDC。作為縮合劑兼羧酸的活化劑，可以使用例如，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)等。

縮合反應通常向透明質酸(游離形態(tài))添加EDC等縮合劑和NHS等羧酸的活化劑，然后加入鞘氨醇-1-磷酸，在室溫或加溫下使其反應幾小時至幾天左右即可。反應可以相對于透明質酸1mg使用鞘氨醇-1-磷酸0.5～2μg左右來進行。縮合劑可以相對于鞘氨醇-1-磷酸使用1～20摩爾當量左右，優(yōu)選使用10摩爾當量左右。反應可以在例如水、甲醇、乙醇、二甲基亞砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、四氫呋喃(THF)、二氯甲烷等溶劑中或它們的混合溶劑或無溶劑下進行。反應結束后，通?？梢酝ㄟ^透析等方法去除EDC、NHS和未反應的鞘氨醇-1-磷酸，由此得到目標產物。透明質酸鍵合有鞘氨醇-1-磷酸通?？梢酝ㄟ^NMR來確認。通常，制備1分子透明質酸的羧酸的總數的10～50％左右、優(yōu)選12～40％左右與鞘氨醇-1-磷酸的胺進行鍵合而成的修飾體即可。每1分子透明質酸鍵合的鞘氨醇-1-磷酸的個數可以通過如下計算來確定：例如利用質子NMR由透明質酸的N-乙?；?1.8ppm)和鞘氨醇-1-磷酸的脂質部分末端甲基和亞甲基(0.9ppm和1.1ppm)取得積分值來計算。

由本發(fā)明提供的HA-S1P有效地集聚于肝竇內皮細胞并且能夠抑制由缺氧/復氧導致的肝竇內皮細胞的凋亡，因此，包含HA-S1P作為有效成分的藥物作為用于預防和/或治療由伴隨著肝缺血再灌注的肝功能衰竭的藥物是有用的。對于產生肝缺血再灌注的處置、治療的種類沒有特別的限定，可列舉出例如，以伴隨著肝血流阻斷的肝手術等為代表的處置。作為這樣的肝手術，可列舉出例如肝移植、肝部分切除等，但并不限定于此，對于暫時將通向肝臟的血管夾住而阻斷血流、經過幾分鐘至15分鐘左右解除夾具再流通血流這樣的手術，均可以作為本發(fā)明藥物的適用對象。不會拘泥于任何理論，在由肝缺血再灌注產生的缺氧/復氧導致的肝功能衰竭中，產生了由缺氧/復氧導致的肝竇內皮細胞的凋亡，但本發(fā)明的藥物具有抑制該凋亡的作用。

本發(fā)明的藥物通常通過靜脈內給藥、腹腔內給藥等非經口給藥對包括人的哺乳類動物進行給藥。進行靜脈內給藥的情況下，可以采用靜脈內注射、點滴等通常的方法?；蛘?，也可以在手術中由門靜脈向血管內給藥本發(fā)明的藥物。使用低分子量的透明質酸的情況下，有時也通過經口給藥利用液劑、膠囊劑等進行給藥。理想的是，給藥在血流阻斷的幾分鐘前至1小時前左右之間、例如在10分鐘前至30分鐘前左右的時期進行，但只要在血流阻斷之前則沒有特別的限定。進行肝移植的情況下，在由供體摘除肝臟的一部分時，可以預先給藥本發(fā)明的藥物以使本發(fā)明的藥物在肝臟內殘留有充分量，對于接受移植的患者也可以在剛要進行移植之前給藥本發(fā)明的藥物，但這樣的給藥方法可以適宜選擇，并不限定于特定的方式。

本發(fā)明的藥物通常以水溶液的形態(tài)、冷凍干燥品的形態(tài)作為注射劑或點滴劑來提供，但在制劑的制備時，也可以使用注射劑、點滴劑的制造中通常使用的制劑用添加物。例如，為水溶液的情況下，可以使用pH調節(jié)劑、穩(wěn)定化劑或緩沖劑等；為冷凍干燥制劑的情況下，除了這些之外也可以使用助溶劑等；但并不限定于這些特定的制劑用添加物，本領域技術人員可以根據目的選擇適宜的制劑用添加物。

實施例

以下，通過實施例對本發(fā)明進一步詳細地進行說明，但本發(fā)明的范圍并不限定于以下的實施例。

例1:HA-S1P的合成

在5ml透明質酸(2mg/ml，分子量600000的物質或分子量8000的物質)中加入EDC(100mg/ml)95.85μl、NHS(100mg/ml)57.535μl并充分混合。向其中加入S1P(25mg/ml)67.378μl在55℃下進行攪拌使之反應24小時。進行透析操作來進行EDC、NHS和未鍵合的S1P的去除。S1P的導入通過測定NMR而存在1.15ppm附近的峰來確認(圖1)。與該透明質酸的羧酸進行鍵合的S1P的量為13.5～40％。

例2

(1)方法

動物

200～250g的雄性Sprague-Dawley(以下SD)大鼠通過CLEA Japan,Inc.(日本東京)獲得。對于4組SD大鼠進行了研究。

針對如下組進行研究：作為S1P的溶劑的甲醇給藥組(給藥內容為甲醇50μl+3％BSA150μl、總計200μl)、HA給藥組(給藥內容是使8kDa的HA以0.32564g/l溶解于甲醇:超純水＝1:3，總計200μl)、S1P給藥組(給藥內容以S1P給藥量計，100μg/kg、S1P50μl+3％BSA150μl、總計200μl)、HA-S1P給藥組(給藥內容以S1P給藥量計為100μg/kg、北大制作的HA-S1P制劑以0.358g/l溶解于甲醇:超純水＝1:3，總計200μl)。

動物實驗中使用的全部的步驟根據筑波大學的動物實驗中的對策和用途的指南中所述的基準。

肝缺血模型

對大鼠尾靜脈注射各藥劑。注射10分鐘之后，使用微型夾具使肝動脈、門靜脈、膽管一起阻塞20分鐘。在20分鐘的全肝缺血之后，解除阻塞。在進行再灌注120分鐘之后，為了進行病理檢查，自各組10～15只大鼠去除肝組織。另外，在要進行藥劑注射之前和再灌注的30、60、120分鐘后采集血液。

組織的調節(jié)

將肝組織在10％緩沖福爾馬林中固定，接著埋入于石蠟中，使用蘇木精和曙紅進行染色。對各組的組織切片進行評價。在同一視野中包含門靜脈、中心靜脈的中倍率視場(x200)中，觀察竇結構。

免疫組織化學研究

使用Promega Corporation的DeadEnd(注冊商標)Colorimetric TUNEL System(G7360)，免疫組織化學地檢測出凋亡陽性細胞。對各組的組織切片進行評價。以隨機選擇的門靜脈為中心的10強倍率視場(x400)中，對TUNEL陽性細胞和肝細胞總數進行計數。將其以TUNLE陽性細胞數/肝細胞總數的比表示，對于每組進行比較。

蛋白提取和蛋白質印跡分析

肝組織在-80℃下保存，在150mmol/L的NaCl和50mM的TrisCl、1％NP-40、蛋白分解酶抑制劑中進行均化處理。將樣品進行離心，采集上清液用于分析。樣品使用12％十二烷基硫酸鹽和聚丙烯酰胺凝膠進行電泳使之分離，轉印至硝酸纖維素膜(Millipore、Bedford、MA、USA)。作為第一抗體使用抗活化型半胱天冬酶(cleaved caspase)3抗體(9661)和HO-1抗體(5141)(Cell Signaling Technology、Beverly、MA、USA)。作為第二抗體使用抗兔子IgG HRP linked(7074)(Cell Signaling Technology、Beverly、MA、USA)。

生物化學分析

為了評價肝實質損傷，使用自動分析儀(FujiPhotoFilmCo.Ltd.7000V、Fuji Film、東京、日本)測定血清ALT值。

電子顯微鏡

使用電子顯微鏡對缺血再灌注后的肝竇內皮細胞進行評價。再灌注120分鐘后迅速地摘除肝臟。將自肝左葉摘除的樣品切除1mm³并保存于2.5％戊二醛中。后固定中使用了1％四氧化鋨。之后，濃度梯度地通過乙醇脫水并進行Epon包埋。超薄切片使用Ultracut S microtome(Leica Aktiengesellschaft、Vienna、Austria)、用銅載網(copper grid)制成。為了強調對比度，切片用乙酸鈾酰鹽進行調節(jié)并通過檸檬酸鹽。標本使用日立H-7000透射型電子顯微鏡(日立、東京、日本)進行觀察。

統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析使用Kruskal Wallis H-test、post hoc test與Mann-Whitney U test with Bonferroni correction。作為統(tǒng)計學有意義，接受p＜0.05。

(2)實驗體系

使用200～250g的SD大鼠制成4個實驗組(A)～(D)。(A)作為S1P溶劑的甲醇單獨的溶劑對照組(甲醇50μl+3％BSA150μl，計200μl)；(B)透明質酸單獨的HA組(以8000kDa的透明質酸成為0.32564g/L的方式溶解于甲醇:超純水＝1:3而成的物質，計200μl)；(C)S1P單獨的S1P組(作為S1P給藥量為100μg/kg、溶解于甲醇的S1P50μl+3％BSA 150μl，計200μl)；(D)HA-S1P組(作為S1P給藥量100μg/kg、以HA-S1P成為0.358g/L的方式溶解于甲醇:超純水＝1:3，計200μl)。使用戊巴比妥和異氟烷對大鼠進行全身麻醉，采血后通過尾靜脈給藥各種藥劑。將大鼠進行剖腹，給藥藥劑10分鐘之后使用微型夾具實施20分鐘的全肝缺血。20分鐘后去除夾具進行再灌注，自再灌注起30、60和120分鐘后實施采血。120分鐘之后，處死大鼠，采集肝組織(左葉)。將實驗步驟示于圖2。

(3)肝功能(ALT)的測定

血清ALT在再灌注30分鐘之后，與溶劑對照·S1P組相比較，HA-S1P組為顯著低的值。再灌注60分鐘后，與溶劑對照·HA·S1P組相比較，HA-S1P組為顯著低的值。再灌注120分鐘后，與HA組相比較，HA-S1P組為顯著低的值。將結果示于圖3。

(3)利用蛋白質印跡的凋亡和肝保護作用的確認

通過文獻記載的方法(Tamura et al.,J Surg Res,178,pp.443-451,2012)利用蛋白質印跡確認凋亡相關蛋白即活化型半胱天冬酶(cleaved caspase)3的表達，結果，只有HA-S1P組被抑制。由此可知，HA-S1P給藥組顯著地抑制了凋亡。另外，具有肝保護作用的HO-1的表達僅在HA-S1P組增加。將結果示于圖4。

(4)肝臟病理評價

HE染色中，HA-S1P中保護了竇結構，與此相對，其他的組中，確認到了竇的窄小化、蜿蜒曲折(圖5)。TUNEL染色中，HA-S1P組中近乎沒有確認到陽性細胞，其他的組中，以容易受到缺血再灌注損傷的門靜脈附近的Zone1為中心，確認到了陽性細胞(圖6)。另外，TUNEL染色的各樣品中，以Zone1為中心，用400倍視野以每10視野以TUNEL陽性細胞數/總肝細胞數的形式進行計數、定量化時，HA-S1P組中成為TUNEL陽性細胞率顯著低的結果(圖7)。

(5)利用電子顯微鏡進行肝臟微細結構評價

電子顯微鏡圖像中，HA-S1P組中保存了LSEC的內襯結構；與此相對，其他的組中，確認到了LSEC受到損傷而在竇內剝離的圖像(圖8)。

例3：利用蛋白質印跡的S1P在肝臟集聚的確認

用下述的方法，通過蛋白質印跡確認到肝組織內的S1P的表達。

對于-80℃下保存的大鼠的肝組織使用各種試劑(150mmol/L NaCl,50mM Tris-Cl,1％NP-40,蛋白分解酶抑制劑)制作的緩沖液進行均質化處理。為了進行分析，將樣品進行離心而采集上清液。采集的樣品使用10％SDS-PAGE凝膠進行分離，轉印至硝酸纖維素膜(Millipore,Bedford,MA)。作為第一抗體使用Anti-S1P antibody(ab140592)(1:1000,rabbit polyclonal,Abcam,Cambridge,UK)。作為第二抗體，使用Anti-rabbit IgG,HRP-linked antibody(#7074S)(1:1000,Cell Signalling Technology,Beverley,MA,USA)。

將結果示于圖9。相比于S1P單獨，HA-S1P的樣品中，S1P的表達增加。由此可知，HA-S1P相比于S1P單獨，對肝臟特異地集聚。