背景存在對(duì)用于許多應(yīng)用例如診斷生物傳感器、免疫診斷試劑、外科植入物和用于親和純化的生物加工介質(zhì)的各種材料上固定蛋白的簡(jiǎn)單、可放大規(guī)模的方法的需求。在全部應(yīng)用中，保持蛋白結(jié)構(gòu)和功能并且為了最大性能效率將它在基底上正確地定向是非常重要的。存在許多用于在表面上固定蛋白的策略，如Nakanishi,K.等人.((2008)CurrentProteomics5:161-175)中綜述的。物理吸附是通常使用的基于蛋白與表面的疏水相互作用或離子相互作用的方法。它方法上簡(jiǎn)單，但較不允許定量控制或定向控制；它可以通過(guò)解折疊改變蛋白的功能性質(zhì)，并且重復(fù)性和效率是可變的。這意味著當(dāng)結(jié)合時(shí)，蛋白可能不正確地定向用于分析物結(jié)合，或者可能完全地或部分地變性并且是非功能的。許多這些方法是復(fù)雜的，具有許多方法步驟并且難以放大規(guī)模用于大量制造。方法還導(dǎo)致有關(guān)蛋白的功能的大百分?jǐn)?shù)損失；例如，少于10％的吸附于塑料ELISA板的抗體是有活性的，而化學(xué)偶聯(lián)，例如胺偶聯(lián)導(dǎo)致75％-100％活性損失(ButlerJ.E.等人.(1992)JImmunolMethods150:77-90；ButlerJ.E.等人.(1992)JImmunolMethods150:77-90；Esser,P.(2010)ThermoScientificApplicationNote11b；Johnsson,B.等人.(1995)JMolecularRecognition8:125-131)。結(jié)合蛋白至表面的其他方法包括表面的官能化，例如通過(guò)胺化或羧化以允許蛋白共價(jià)偶聯(lián)至表面，或包被表面以介導(dǎo)結(jié)合(例如，鏈霉親和素包被或生物素包被、聚賴氨酸包被、蛋白A包被或鎳包被的表面)。其他方法包括通過(guò)加入結(jié)合至源自細(xì)菌的生物塑料PHA的結(jié)合標(biāo)簽(例如PhaF)來(lái)修飾蛋白。此類基于共價(jià)偶聯(lián)的方法提供了穩(wěn)定的連接，可以被應(yīng)用于一系列蛋白并具有良好的重復(fù)性。然而，定向可以是可變的，并且化學(xué)衍生法可以改變蛋白的功能并且要求穩(wěn)定的、相互作用的表面。利用蛋白上的標(biāo)簽(諸如六聚組氨酸/Ni-NTA或生物素/抗生物素蛋白)的生物捕獲方法提供穩(wěn)定的連接并特異性和以可重復(fù)的定向結(jié)合蛋白質(zhì)，但配偶體試劑必須先在表面上被充分地固定化。WO2002057780描述了蛋白與金表面在自組裝單層中的結(jié)合，其中蛋白的生物功能部分正確地定向并保持其活性的接近100％。該技術(shù)包括使用β-桶結(jié)構(gòu)的細(xì)菌外膜蛋白(OMP)的經(jīng)修飾的變體作為支架，在支架上可以融合其他感興趣的蛋白和肽。在金上，支架具有內(nèi)在的自組裝性質(zhì)并且被用作融合配偶體的錨點(diǎn)。融合配偶體被正確地定向并且保持功能。OMP與金表面的結(jié)合依賴于蛋白的修飾以在OMP的適當(dāng)位置包括半胱氨酸殘基，使得當(dāng)半胱氨酸與金表面形成共價(jià)鍵時(shí)，蛋白被正確地定向并直接偶聯(lián)至表面。這些方法具有以下缺點(diǎn)：需要蛋白中的特定的氨基酸介導(dǎo)與表面的反應(yīng)、修飾表面以接受來(lái)自半胱氨酸的共價(jià)鍵合以及存在兩親分子諸如硫酯或硫烷以穩(wěn)定蛋白單層。需要蛋白附接于表面的應(yīng)用是普遍的，經(jīng)常需要小區(qū)域上的高蛋白密度以使測(cè)定靈敏度最大化。塑料具有用作基于蛋白的測(cè)定中的基底的許多優(yōu)勢(shì)。但是，塑料表面的疏水性質(zhì)導(dǎo)致蛋白的非特異結(jié)合和變性。本發(fā)明的目的在于克服或改善與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的一些問(wèn)題。公開(kāi)內(nèi)容簡(jiǎn)述在本發(fā)明的第一個(gè)方面中，提供了用于將跨膜蛋白固定在聚合物基底上的方法，所述方法包括：i)提供于除垢劑中的跨膜蛋白的樣品；ii)提供聚合物基底；iii)將i)的蛋白樣品與ii)的聚合物基底一起孵育；和iv)降低所述蛋白樣品的除垢劑的濃度至該除垢劑的1x臨界膠束濃度(CMC)或低于該除垢劑的1x臨界膠束濃度(CMC)；其中，蛋白通過(guò)物理吸附變得固定在基底上?？缒さ鞍卓梢藻^定、或可以被修飾以錨定用于展示的異源蛋白或肽。因此，當(dāng)結(jié)合至聚合物基底時(shí)，跨膜蛋白能夠展示錨定于，優(yōu)選以定向的和有功能的方式錨定于，該跨膜蛋白的蛋白或肽。因此，錨定的肽和/或蛋白可以空間上遠(yuǎn)離聚合物基底的表面以協(xié)助展示。錨定的蛋白或肽可以是有功能的。跨膜蛋白包含頭(head)和足(foot)，所述頭和足被包含一個(gè)或更多個(gè)跨膜鏈的主體(body)彼此隔開(kāi)?！板^”意指，跨膜蛋白可以在該蛋白的頭的環(huán)中和/或該蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白?！靶揎椧藻^定”意指，跨膜蛋白被工程化以在該蛋白的頭包含N端和/或C端，和/或在該蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。異源肽和/或蛋白可以在蛋白的頭的工程化N端和/或C端提供，或在蛋白的頭的工程化環(huán)中提供，用于展示。因此，本發(fā)明的跨膜蛋白：i)在該蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白；ii)在該蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白；iii)被工程化以在該蛋白的頭包含N端和/或C端；和/或iv)被工程化以在該蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。異源肽和/或蛋白可以在蛋白的頭的工程化N端和/或C端提供，或在蛋白的頭的工程化環(huán)中提供，用于展示。優(yōu)選地，跨膜蛋白包含異源肽和/或蛋白?？梢蕴峁╅g隔物以在跨膜蛋白和用于展示的肽和/或蛋白之間產(chǎn)生空間距離。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白樣品可以包含大于1xCMC，例如1.5xCMC、2xCMC、2.5xCMC或更高的除垢劑濃度。蛋白樣品的除垢劑濃度是使得蛋白保留在溶液中的濃度。當(dāng)?shù)鞍滋幱诟邼舛葧r(shí)，例如1.5μM，蛋白更容易在低除垢劑濃度中沉淀；因此蛋白樣品可以具有約2xCMC溶液的除垢劑濃度以保持蛋白溶解。蛋白與聚合物基底的結(jié)合通過(guò)降低除垢劑濃度至1xCMC或低于1xCMC實(shí)現(xiàn)。除垢劑濃度優(yōu)選保持高于0xCMC以允許蛋白保持在溶液中一段時(shí)間并可以結(jié)合至基底。降低可以通過(guò)稀釋或透析、或任何其他適當(dāng)?shù)姆椒▽?shí)現(xiàn)?？梢栽诘鞍讟悠放c聚合物基底的孵育(步驟iii)之前降低除垢劑濃度?？蛇x擇地，可以在與聚合物基底孵育時(shí)或孵育后降低除垢劑濃度。蛋白的除垢劑濃度的降低使得跨膜蛋白能夠結(jié)合至聚合物基底，其中通過(guò)跨膜蛋白錨定的肽或蛋白優(yōu)選地是有功能的并被定向用于展示。除垢劑濃度的降低使得跨膜蛋白能夠結(jié)合至聚合物基底，不需要蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)或二級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾，或基底的修飾或官能化。稀釋可以包括添加水、緩沖液或任何其他適當(dāng)?shù)南♂寗?。稀釋劑可以包括除垢劑，條件是與稀釋劑混合的作用是蛋白樣品的除垢劑的濃度降低至1xCMC或低于1xCMC，優(yōu)選地0.05xCMC至1xCMC。降低蛋白樣品的除垢劑濃度的步驟還可以通過(guò)例如增加蛋白存在于其中的溶液的體積有效地降低蛋白濃度。稀釋足以允許蛋白保持在溶液中一段與基底結(jié)合的充足時(shí)間，但除垢劑濃度足夠低以允許蛋白物理吸附至聚合物基底。所述方法還可以包括洗滌基底。所述方法還可以包括將基底滅菌。在其中提供蛋白的除垢劑可以是任何離子型、非離子型或兩性離子型除垢劑。在本發(fā)明的第二方面中，提供了包含固定于其上的跨膜蛋白的聚合物基底，其中所述跨膜蛋白通過(guò)物理吸附固定于所述基底上，并且其中所述跨膜蛋白錨定、或被修飾以錨定用于展示的異源蛋白或肽。當(dāng)結(jié)合至(即，固定于)聚合物基底時(shí)，跨膜蛋白能夠以定向的和有功能的方式展示錨定于該跨膜蛋白的蛋白或肽。因此，通過(guò)固定的跨膜蛋白錨定的肽和/或蛋白可以在空間上遠(yuǎn)離聚合物基底的表面，以協(xié)助展示。錨定的蛋白或肽可以是有功能的。使用跨膜蛋白通過(guò)充當(dāng)小肽或蛋白的錨克服了將此類肽或蛋白以有功能的和定向的方式結(jié)合至聚合物基底的困難。因此，通過(guò)在固定于聚合物基底上的跨膜蛋白上展示肽和/或蛋白，該肽和/或蛋白保持功能、結(jié)構(gòu)和/或可以以能夠與其他組分相互作用的方式定向。跨膜蛋白可以如關(guān)于第一方面所定義的。因此，可以提供一種包含固定于其上的跨膜蛋白的聚合物基底，其中所述跨膜蛋白通過(guò)物理吸附固定于所述基底上，并且其中所述跨膜蛋白：i)在該蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白；ii)在該蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白；iii)被工程化以在該蛋白的頭包含N端和/或C端；和/或iv)被工程化以在該蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。異源肽和/或蛋白可以在蛋白的頭的工程化N端和/或C端提供，或在蛋白的頭的工程化環(huán)中提供，用于展示。優(yōu)選地，跨膜蛋白包含異源肽和/或蛋白?？梢蕴峁╅g隔物以在跨膜蛋白和用于展示的肽和/或蛋白之間產(chǎn)生空間距離。異源肽和/蛋白可以是有功能的。優(yōu)選地，跨膜蛋白不使用交聯(lián)劑固定。因此，蛋白被固定于聚合物基底上，而無(wú)使得蛋白能夠與其結(jié)合的表面的官能化或修飾。交聯(lián)劑包括例如標(biāo)簽、結(jié)合配偶體例如生物素和鏈霉親和素、蛋白A等。優(yōu)選地，跨膜蛋白不包含對(duì)底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的修飾，所述底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以在蛋白的足中提供。例如，蛋白在底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域中包含其天然一級(jí)序列和/或二級(jí)序列。優(yōu)選地，跨膜蛋白可以不包含使其能夠與聚合物基底共價(jià)結(jié)合的修飾。優(yōu)選地，跨膜蛋白在不存在穩(wěn)定劑諸如脂質(zhì)，例如脂質(zhì)單層時(shí)被固定。本文中，穩(wěn)定劑不包括除垢劑。優(yōu)選地，跨膜蛋白是β-桶蛋白。優(yōu)選地，跨膜蛋白是孔蛋白，優(yōu)選地是革蘭氏陰性菌的外膜蛋白(OMP)，更優(yōu)選地是OmpA或OmpF。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種包含聚合物基底的產(chǎn)品，所述聚合物基底包含固定于其上的跨膜蛋白，其中所述跨膜蛋白通過(guò)物理吸附固定于所述基底上，并且其中所述跨膜蛋白錨定、或被修飾以錨定用于展示的異源蛋白或肽。聚合物基底可以如關(guān)于本發(fā)明的第二方面所定義的。因此，提供了一種包含聚合物基底的產(chǎn)品，所述聚合物基底包含固定于其上的跨膜蛋白，其中所述跨膜蛋白通過(guò)物理吸附固定于所述聚合物基底上，并且其中所述跨膜蛋白：i)在所述蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白；ii)在所述蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白；iii)被工程化以在所述蛋白的頭包含N端和/或C端；和/或iv)被工程化以在所述蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。異源肽和/或蛋白可以在蛋白的頭的工程化N端和/或C端提供，或在蛋白的頭的工程化環(huán)中提供，用于展示。優(yōu)選地，跨膜蛋白包含異源肽和/或蛋白。在本發(fā)明的第四方面中，提供了結(jié)合樣品中的組分的方法，所述方法包括：i)提供包含固定于其上的跨膜蛋白的聚合物基底，其中所述跨膜蛋白通過(guò)物理吸附固定于所述基底上，并且其中所述跨膜蛋白錨定用于展示的異源蛋白或肽；ii)向所述基底添加樣品；iii)將所述基底與樣品保持在允許任何組分結(jié)合至所述基底的條件下。方法可以任選地包括洗滌基底以去除任何未結(jié)合的材料；檢測(cè)結(jié)合的組分的存在或不存在；和/或洗脫任何結(jié)合的組分。方法可用于篩選樣品的感興趣的組分，或從樣品純化感興趣的組分，或固定來(lái)自樣品的感興趣的組分，例如用于進(jìn)一步反應(yīng)。方法可以包括在聚合物基底上固定跨膜蛋白，如本文所述?？缒さ鞍卓梢匀珀P(guān)于本發(fā)明的第一方面和其他方面所定義的。聚合物基底可以如關(guān)于本發(fā)明的第二方面和其他方面所定義的。因此，方法可以包括：i)提供包含固定于其上的跨膜蛋白的聚合物基底，其中所述跨膜蛋白通過(guò)物理吸附固定于所述基底上，并且其中所述跨膜蛋白錨定用于展示的異源蛋白或肽；ii)向所述基底添加樣品；iii)將所述基底與樣品保持在允許任何組分結(jié)合至所述基底的條件下，其中所述聚合物基底聚合物基底包含固定于其上的跨膜蛋白，其中所述跨膜蛋白通過(guò)物理吸附被固定于聚合物基底上，并且其中所述跨膜蛋白：i)在所述蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白；ii)在所述蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白；iii)被工程化以在所述蛋白的頭包含N端和/或C端；和/或iv)被工程化以在所述蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。異源肽和/或蛋白可以在蛋白的頭的工程化N端和/或C端提供，或在蛋白的頭的工程化環(huán)中提供，用于展示。優(yōu)選地，跨膜蛋白包含異源肽和/或蛋白。在第五個(gè)方面，提供了介導(dǎo)錨定的肽和/或蛋白與樣品中的組分相互作用的方法，所述方法包括：i)提供包含固定于其上的跨膜蛋白的聚合物基底，其中所述跨膜蛋白通過(guò)物理吸附固定于所述基底上，并且其中所述跨膜蛋白錨定用于展示的異源蛋白或肽；ii)向所述基底添加包含組分的樣品；iii)將所述基底與樣品保持在允許所述組分與錨定的肽和/或蛋白相互作用的條件下。跨膜蛋白可以如關(guān)于本發(fā)明的第一方面和其他方面所定義的。聚合物基底可以如關(guān)于本發(fā)明的第二方面和其他方面所定義的。因此，方法可以包括：i)提供包含固定于其上的跨膜蛋白的聚合物基底，其中所述跨膜蛋白通過(guò)物理吸附固定于所述基底上，并且其中所述跨膜蛋白錨定用于展示的異源蛋白或肽；ii)向所述基底添加包含組分的樣品；iii)將所述基底與樣品保持在允許所述組分與錨定的肽和/或蛋白相互作用的條件下，其中所述聚合物基底包含固定于其上的跨膜蛋白，其中所述跨膜蛋白通過(guò)物理吸附固定于聚合物基底上，并且其中所述跨膜蛋白：i)在所述蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白；ii)在所述蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白；iii)被工程化以在所述蛋白的頭包含N端和/或C端；和/或iv)被工程化以在所述蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。異源肽和/或蛋白可以在蛋白的頭的工程化N端和/或C端提供，或在蛋白的頭的工程化環(huán)中提供，用于展示。優(yōu)選地，跨膜蛋白包含異源肽和/或蛋白。組分可以是細(xì)胞，使得肽和/或蛋白可以充當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和分化的效應(yīng)物。肽和/或蛋白可以介導(dǎo)酶促反應(yīng)，或可以充當(dāng)催化劑。例如，肽和/或蛋白可以是生長(zhǎng)因子或信號(hào)蛋白，或可以誘導(dǎo)細(xì)胞過(guò)程諸如信號(hào)傳導(dǎo)途徑等。設(shè)想，本發(fā)明的聚合物基底可以經(jīng)由一種或更多種跨膜蛋白錨定兩種或更多種不同的肽和/或蛋白，例如以同時(shí)提供不同的功能。因此，例如，可以在基底上提供細(xì)胞附著和生長(zhǎng)因子的組合。在本發(fā)明的第六方面中，提供了包含聚合物基底的外科植入物，所述聚合物基底包含固定于其上的跨膜蛋白，其中所述跨膜蛋白通過(guò)物理吸附固定于所述基底上，并且其中所述跨膜蛋白錨定、或被修飾以錨定用于展示的異源蛋白或肽?？缒さ鞍卓梢匀珀P(guān)于本發(fā)明的第一方面和其他方面所定義的。聚合物基底可以如關(guān)于本發(fā)明的第二方面和其他方面所定義的。在本發(fā)明的第七方面中，提供了一種孵育物(incubation)，所述孵育物包含聚合物基底、跨膜蛋白和濃度為1xCMC或低于1xCMC的除垢劑。本發(fā)明的此方面涉及本發(fā)明的聚合物基底的生產(chǎn)中的中間物。任何適當(dāng)?shù)姆椒梢员挥糜诮档统竸舛?，如本文中描述的。設(shè)想，跨膜蛋白中的一些可以固定于孵育物中的所述基底上。優(yōu)選地，跨膜蛋白錨定、或被修飾以錨定用于展示的異源蛋白或肽。優(yōu)選地，跨膜蛋白通過(guò)物理吸附變得固定于基底上。跨膜蛋白可以如關(guān)于本發(fā)明的第一方面和其他方面所定義的。聚合物基底可以如關(guān)于本發(fā)明的第二方面和其他方面所定義的。在本發(fā)明的第八方面中，提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含聚合物基底和跨膜蛋白，所述跨膜蛋白錨定、或被修飾以錨定用于展示的異源蛋白或肽?？缒さ鞍卓梢匀珀P(guān)于本發(fā)明的第一方面和其他方面所定義的。聚合物基底可以如關(guān)于本發(fā)明的第二方面和其他方面所定義的。在本發(fā)明的第九方面中，提供了一種跨膜蛋白，所述跨膜蛋白錨定、或被修飾以錨定用于展示的異源蛋白或肽?？缒さ鞍装^和足，所述頭和足被一個(gè)或更多個(gè)跨膜鏈彼此隔開(kāi)。“錨”意指，跨膜蛋白可以在該蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白，和/或在該蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白?！靶揎椧藻^定”意指，跨膜蛋白被工程化以在該蛋白的頭包含N端和/或C端，和/或在該蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。優(yōu)選地，跨膜蛋白：i)在所述蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白；ii)在所述蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白；iii)被工程化以在所述蛋白的頭包含N端和/或C端；和/或iv)被工程化以在所述蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。異源肽和/或蛋白可以在蛋白的頭的工程化N端和/或C端提供，或在蛋白的頭的工程化環(huán)中提供，用于展示。優(yōu)選地，跨膜蛋白包含異源肽和/或蛋白?？缒さ鞍卓梢允侨绫疚亩x的蛋白，例如如表7中定義的OMP蛋白。在本發(fā)明的第十方面中，提供了編碼跨膜蛋白的核酸序列，其中所述跨膜蛋白錨定、或被修飾以錨定用于展示的異源蛋白或肽。跨膜蛋白可以如關(guān)于本發(fā)明的第一方面和其他方面所定義的。附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的實(shí)施方案在下文中參考附圖被進(jìn)一步描述，其中：圖1示出了基于β桶支架蛋白OmpA的定向進(jìn)化的結(jié)合塑料的β桶蛋白的設(shè)計(jì)。OMP0是OmpA的原始的金結(jié)合的修飾版本，具有截短的N端和C端、用于親和純化的6xHis標(biāo)簽和用于與金共價(jià)結(jié)合的在蛋白的“足”的半胱氨酸。圖2示出了用抗-HIV1-P24(A、C)和抗-HIV1/2P24(B、D)單克隆抗體，檢測(cè)聚苯乙烯板(A、B)和Polysorp板(C、D)上固定的P24抗原和P24融合蛋白。圖3示出了在用展示不同生物學(xué)性質(zhì)的一系列OMP蛋白包被的96孔聚苯乙烯板上MG63骨細(xì)胞的培養(yǎng)物。空白代表未經(jīng)修飾的聚苯乙烯孔且OMP154是未經(jīng)修飾的支架蛋白，在OMP154中加入4個(gè)氨基酸RGDS產(chǎn)生OMP153，一種能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞附著的蛋白。圖4是OMP18和天然蛋白A的IgG結(jié)合功能測(cè)定的示意圖。OMP18的結(jié)構(gòu)在圖中示出。步驟1中，將蛋白附接至塑料表面；步驟2中，將IgG結(jié)合至任何有功能的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域；步驟3中，綴合至堿性磷酸酶的不能與蛋白A結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗-IgG抗體結(jié)合至已經(jīng)在表面上的任何IgG；和步驟4中，進(jìn)行比色的酶促反應(yīng)以辨別具有固定的IgG的表面。圖5示出了檢測(cè)功能蛋白在表面上的存在的免疫測(cè)定的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)清楚地證明，融合至OMPβ桶支架錨的蛋白AIgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的固定化在塑料表面上保持大得多的功能。優(yōu)勢(shì)的規(guī)模是出乎預(yù)料的，并且與親水表面相比，在疏水表面上的優(yōu)勢(shì)特別明顯。甚至在親水表面上，OMP18蛋白示出了比天然蛋白A強(qiáng)得多的功能。圖6示出了3D打印成開(kāi)放格狀3D圓盤(pán)的聚乳酸聚合物。用OMP0(未經(jīng)修飾的OmpA)和OMP5(被工程化以展示FLAG表位的OMP0)處理圓盤(pán)。蛋白處理后，可以用堿性磷酸酶綴合的抗-FLAG抗體檢驗(yàn)所有表面以定量蛋白附接。圖7示出了用堿性磷酸酶綴合的抗體和PNPP檢測(cè)FLAG表位。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)差。注意，此處OmpA指OMP0。在無(wú)蛋白和OMP0處理的表面上觀察到相似水平的非特異性結(jié)合，而顯著更多的抗體結(jié)合至OMP5處理的表面。圖8示出了在A.OMP36處理的聚合物纖維、B.無(wú)蛋白纖維上生長(zhǎng)的DAPI染色的PC12細(xì)胞。兩幅圖像都使用10x物鏡捕獲。圖9示出了3T3成纖維細(xì)胞在OMP36處理的板上的附著和生長(zhǎng)。圖10示出了聚苯乙烯上包被的OMPFGF與培養(yǎng)基中可溶性FGF2的比較。圖11OMP59和OMP171的比對(duì)。存在于OMP59上但從OMP171缺失的細(xì)胞外環(huán)和長(zhǎng)C端在OMP171序列上以虛線示出。α螺旋間隔物序列以斜體示出，OMP171中的突變殘基加有下劃線。OMP171的C端獨(dú)有的兩個(gè)額外的親水殘基以粗體示出并且半胱氨酸殘基以*標(biāo)出。圖12是示出了在此實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)的蛋白的結(jié)構(gòu)的示意圖。圖13OMP0和OMP154的氨基酸序列的比對(duì)。延長(zhǎng)的環(huán)1以斜體在OMP154序列上示出。OMP154中缺失的環(huán)和截短的C端尾巴以虛線在OMP154序列上示出。小基序的插入位點(diǎn)用黑色三角示出。在OMP154中，存在于OMP0的半胱氨酸被突變成甘氨酸(加下劃線)。圖14示出了通過(guò)去除信號(hào)結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域并加入N端his標(biāo)簽和在位置10加入半胱氨酸而修飾的OMP0“野生型”的核酸序列和氨基酸序列。TM1是殘基49-84；OL1是殘基85-126；TM2是殘基127-165；TM3是殘基175-213；OL2是殘基214-249；TM4是殘基250-285；TM5是殘基301-345；OL3是殘基346-387；TM6是殘基388-427；TM7是殘基436-465；OL4是殘基466-507；TM8是殘基508-540；半胱氨酸是殘基28-30。TM—跨膜鏈(穿過(guò)膜的鏈)，OL—外環(huán)(細(xì)胞外環(huán))。圖15示出了OMP9環(huán)1環(huán)狀排列(circularpermutation)的核酸序列和氨基酸序列。圖16示出了OMP13環(huán)3環(huán)狀排列的核酸序列和氨基酸序列。圖17示出了OMP14環(huán)4環(huán)狀排列的核酸序列和氨基酸序列。圖18示出了OMP140短環(huán)、α螺旋間隔物、C端his標(biāo)簽、無(wú)半胱氨酸的核酸序列和氨基酸序列。圖19示出了OMP154(具有短環(huán)和截短的C端，但環(huán)1被延長(zhǎng)的OMP0)的核酸序列和氨基酸序列。圖20示出了OMP170短環(huán)、n端his標(biāo)簽、在aa122的半胱氨酸的核酸序列和氨基酸序列。圖21示出了OMP171的核酸序列和氨基酸序列，OMP171如170但在his標(biāo)簽后具有α螺旋間隔物。圖22示出了蛋白在不同除垢劑濃度的固定化。在96孔板中以示出的除垢劑濃度稀釋OMP18蛋白(終濃度0.1μM)。6h后洗滌并干燥一組孔，而在第二組孔中允許吸附進(jìn)行24h。洗滌后，用小鼠IgG探測(cè)表面并用抗-小鼠AP綴合物和PNPP底物比色反應(yīng)檢測(cè)。用0.125xCMC的DM中的OMP18吸附24h獲得最佳結(jié)果。圖23示出了基底上的蛋白的飽和程度。OMP18濃度的作用。在0.125xCMC的除垢劑中將OMP18稀釋至不同終濃度并吸附24h。如本文所述進(jìn)行小鼠IgG結(jié)合測(cè)定。結(jié)果證明了，表面被所有除垢劑中100nM(0.1μM)蛋白幾乎飽和，并且這被選作用于吸附的標(biāo)準(zhǔn)濃度。圖24是OMP9和OMP18斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)的掃描。在每孔中放置白色紙塞以獲得孔底部的清楚的掃描。圖25示出了假設(shè)的6條鏈的桶蛋白。環(huán)狀排列導(dǎo)致N端和C端以及β鏈的重新定位。圖26示出了來(lái)自polybead實(shí)驗(yàn)的樣品的SDSPAGE分析。將5μL人血清裝載在泳道1，所有其他泳道裝載1mL樣品的20μL。HSA是人血清白蛋白。VH是IgG的～50kDa的重鏈，且VL是～25kDa的輕鏈。樣品在具有1mMDTT的SDS上樣染料中并在95℃加熱5min。圖27示出了0％SDS孔用SDW洗滌。全部洗滌一式三份進(jìn)行，并且示出的數(shù)據(jù)是三個(gè)孔的平均值。存在大于3個(gè)A405單位的非常高的讀數(shù)，因?yàn)樵试S與PNPP底物溶液的反應(yīng)進(jìn)行15min。圖28示出了用TweenTM洗滌后OMP203和OMP18的檢測(cè)。使用Tween20。圖29示出了洗滌頻率對(duì)免疫測(cè)定信號(hào)的作用。使用TweenTM20。與PNPP的孵育在室溫進(jìn)行5min。圖30示出了來(lái)自用如X-軸上示出的多種試劑洗滌后的免疫測(cè)定的數(shù)據(jù)。圖31示出了來(lái)自O(shè)MP203檢測(cè)的吸光度讀數(shù)。圖32示出了在用展示多種ECM基序的OMP蛋白包被的聚苯乙烯上MG63細(xì)胞的培養(yǎng)物的結(jié)果。圖33是Alvetex的多孔的3D結(jié)構(gòu)的電子顯微照片。圖34示出了在經(jīng)OMP蛋白處理的3D聚苯乙烯上堿性磷酸酶綴合的IgG的檢測(cè)結(jié)果。圖35示出了在1％tritonX-100中浸沒(méi)數(shù)天后的PLA上的OMP蛋白的抗體檢測(cè)。圖36示出了來(lái)自動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。圖示出了平均粒徑經(jīng)1小時(shí)時(shí)段的變化。圖37示出了預(yù)稀釋后OMP203檢測(cè)的免疫測(cè)定的結(jié)果。詳述本發(fā)明是基于通過(guò)物理吸附用蛋白使聚合物表面官能化的不同方法。本發(fā)明的方法使跨膜蛋白能固定于聚合物基底上，不需要共價(jià)結(jié)合，并且仍然保持物理吸附的優(yōu)點(diǎn)，即，不需要蛋白或基底的化學(xué)修飾，并且不需要存在穩(wěn)定化合物諸如硫酯和硫烷。本發(fā)明的方法使跨膜蛋白能夠被用作用于展示的蛋白和/或肽的錨。由于被錨定的肽和/或蛋白不直接固定于聚合物表面，它們保持功能和/或結(jié)構(gòu)，并且被定向用于展示。因此，跨膜蛋白以這樣的方式結(jié)合至基底，該方式使得跨膜蛋白能夠被用作用于展示的錨。本發(fā)明使得跨膜蛋白能夠如下地固定于聚合物基底上：i)非共價(jià)地(例如通過(guò)范德瓦爾斯相互作用或離子結(jié)合)；ii)不需要修飾跨膜蛋白的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如足)(例如，修飾一級(jí)結(jié)構(gòu)或二級(jí)結(jié)構(gòu))以包含底物結(jié)合殘基；iii)不使基底官能化或修飾基底以使得跨膜蛋白能夠與其結(jié)合；和/或iv)不存在穩(wěn)定劑諸如脂質(zhì)。另外，本發(fā)明的方法使得iv)跨膜蛋白能夠錨定用于展示的肽和/或蛋白，優(yōu)選地使得該肽和/或蛋白是有功能的并被定向用于展示。優(yōu)選地，被錨定的肽和/或蛋白被定向遠(yuǎn)離聚合物基底的表面，使得它可用于展示?？缒さ鞍椎母呤杷再|(zhì)意指，它們?cè)谌芤褐谐恋?，除非被高濃度的除垢?高于1xCMC，優(yōu)選地2xCMC)穩(wěn)定。這也防止此類蛋白結(jié)合至表面。預(yù)期，除垢劑的存在將防止蛋白通過(guò)疏水相互作用結(jié)合至表面，并且固定化至多是無(wú)效的。但是，出乎預(yù)料地發(fā)現(xiàn)，在低除垢劑濃度中稀釋蛋白使跨膜蛋白能夠以使錨定的肽和/蛋白有功能并且被定向的展示的方式固定于聚合物表面。根據(jù)本發(fā)明的固定跨膜蛋白至聚合物基底不同于現(xiàn)有技術(shù)的固定化方法。令人驚訝的是，發(fā)明人已經(jīng)示出了，當(dāng)?shù)鞍淄ㄟ^(guò)跨膜蛋白被錨定至表面時(shí)，本發(fā)明的方法產(chǎn)生大的功能增加。本發(fā)明的巨大優(yōu)勢(shì)由如圖2中示出的HIV抗原(P24蛋白)與跨膜蛋白(OMP170-型支架)的融合例證。本文中，基底包括蛋白可以固定于其的表面。基底可以采取能夠接收蛋白固定于其上的任何適當(dāng)?shù)男问??；變?yōu)選地是固體(即，不是凝膠或液體)。基底可以包括光滑表面或可以是有紋理的?；谆蚱浔砻婵梢允蔷W(wǎng)狀物、纖維、珠、針織物或梭織物、孔或微孔板、組織培養(yǎng)瓶或任何其他表面。基底至少在其結(jié)合表面上包含聚合物材料。基底可以包含一種或更多種不同的聚合物?；變?yōu)選地包含裸露的聚合物表面，意指，它未被其他材料(例如蛋白諸如生物素或鏈霉親和素)包被以協(xié)助蛋白質(zhì)結(jié)合至基底，或未被例如通過(guò)酰胺化或羧化官能化以介導(dǎo)結(jié)合。聚合物(聚合物基底)可以包括塑料、絲或其他蛋白纖維(例如毛發(fā)、毛皮(角蛋白絲)、肌動(dòng)蛋白絲、膠原蛋白絲等)以及石墨烯。聚合物可以是塑料。聚合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可以包括乙烯基樹(shù)脂(polyvinyl)、聚乙烯(PE)，包括例如聚乙烯對(duì)苯二甲酸酯(PET)和高密度聚乙烯(HDPE)和低密度聚乙烯(LDPE)、聚丙烯酸酯(亞克力)、聚苯乙烯(PS)，包括耐沖擊聚苯乙烯(HIPS)、硅酮、聚酯(例如聚乳酸(PLA)或聚乳酸羥基乙酸共聚物(PGLA))、聚氨酯、聚丙烯(PP)、聚酰胺(尼龍)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、聚乙烯/丙烯腈丁二烯苯乙烯(PE/ABS)、酚醛塑料(bakelite)、橡膠、膠乳、聚碳酸酯(PC)、聚碳酸酯/丙烯腈丁二烯苯乙烯(PC/ABS)和聚氯乙烯，包括例如聚偏二氯乙烯(PVDC)。聚合物可以是天然的或合成的。除了制造基底的有機(jī)聚合物以外，基底可以包含非有機(jī)添加劑或有機(jī)添加劑，以重量計(jì)從10％至50％。聚合物可以是生物可降解的。聚合物基底可以是疏水的、親水的、兩親的或其兩種或更多種的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少部分聚合物基底是疏水的。本文中，膜指圍繞細(xì)胞以將細(xì)胞內(nèi)部從周圍環(huán)境分開(kāi)的細(xì)胞膜(也被稱為質(zhì)膜或細(xì)胞質(zhì)膜)。本文中術(shù)語(yǔ)膜包括內(nèi)膜和外膜二者。術(shù)語(yǔ)“膜外的”指膜以外的，酌情地，例如細(xì)胞外的、周質(zhì)的或細(xì)胞質(zhì)空間。本文中對(duì)周質(zhì)的、細(xì)胞質(zhì)的或細(xì)胞外的提及是關(guān)于蛋白在膜中的原始定位做出的。細(xì)胞膜包括磷脂雙層，磷脂雙層中包埋了蛋白以幫助通訊和轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)細(xì)胞膜。因此，如本文中定義的跨過(guò)膜的蛋白為跨過(guò)磷脂雙層的蛋白。異源肽或蛋白意指，該肽或蛋白部分在自然中不天然地與提及的產(chǎn)品締合。它還可稱為外來(lái)的。因此，錨定的肽或蛋白序列或間隔物可以是與跨膜蛋白異源的，意味著，這些肽和/或蛋白在自然中不在跨膜蛋白中找到。工程化蛋白或核酸序列是已經(jīng)被人工修飾的蛋白或核酸序列，例如使用重組蛋白或DNA技術(shù)以提供與天然核酸或蛋白序列的一級(jí)序列、二級(jí)序列或三級(jí)序列不同的核酸序列或蛋白。蛋白可以被工程化以與天然蛋白空間上不同，這也可以被描述為工程化二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明中，肽或蛋白是由肽鍵連接的一串氨基酸。蛋白也可以被稱為多肽。氨基酸可以是天然的、非天然的或其組合。它們可以是L-氨基酸或D-氨基酸。肽和蛋白可以是化學(xué)合成的或從天然來(lái)源或重組來(lái)源純化的。蛋白可以具有二級(jí)結(jié)構(gòu)，和任選地三級(jí)結(jié)構(gòu)。另一方面，肽描述通常缺乏二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的短的、線性的氨基酸鏈。肽可以包含2個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基。蛋白可以包含20個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸序列”指任何長(zhǎng)度的單鏈或雙鏈的脫氧核糖核苷酸聚合物或核糖核苷酸聚合物，但優(yōu)選地至少15個(gè)核苷酸，并且作為非限制性實(shí)例，包括基因的編碼序列和非編碼序列、有義和反義序列互補(bǔ)物、外顯子、內(nèi)含子、基因組DNA、cDNA、前mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重組多肽、經(jīng)分離的和經(jīng)純化的天然存在的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探針、引物和片段。本文中，跨膜蛋白指其以天然形式位于細(xì)胞膜中并且跨過(guò)膜的蛋白。本文中跨膜蛋白還可以稱為整合膜蛋白或跨膜蛋白(transmembraneprotein)?？缒さ鞍装话粋€(gè)或更多個(gè)跨膜鏈的主體空間上分離的頭和足?！翱?spanning)”意指，它延伸穿過(guò)細(xì)胞膜的至少大部分脂質(zhì)雙層。因此，出于本發(fā)明的目的，“跨膜的”可以包括延伸超過(guò)膜邊界或不完全延伸穿過(guò)膜邊界的蛋白。它們可以與能夠運(yùn)輸穿過(guò)膜但不如本文定義的跨越膜的蛋白區(qū)分開(kāi)。跨膜蛋白可以是單次通過(guò)(pass)蛋白，意味著它跨越膜一次，或可以是多次通過(guò)蛋白，意味著它跨越膜一次或更多次?？缒さ鞍卓梢园粋€(gè)或更多個(gè)多肽。通常，在其天然形式中，跨膜蛋白可以在運(yùn)送通過(guò)細(xì)胞膜、離子交換、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)或通訊、作為接頭或酶的功能或在膜生物合成中起作用?！巴ㄟ^(guò)(pass)”意指由蛋白跨越膜，或基本上跨越膜。因此，單次通過(guò)蛋白將跨越膜一次，具有在頭或足的任一個(gè)處的N端，和在頭或足的另一個(gè)的C端。因此，單次通過(guò)蛋白將不具有膜外環(huán)。2次通過(guò)蛋白將跨越膜兩次，使得N端和C端都從頭或足伸出。2次通過(guò)蛋白將包含單個(gè)轉(zhuǎn)角(turn)或環(huán)?？蛇x擇地，跨膜蛋白可以被稱為X條鏈的蛋白，意味著它們具有跨越脂雙層的規(guī)定數(shù)目的鏈。本文中，當(dāng)提及跨越穿過(guò)脂雙層時(shí)，術(shù)語(yǔ)“通過(guò)(pass)”和“鏈”可以互換使用?？缒さ鞍讓⒈举|(zhì)上包含二級(jí)結(jié)構(gòu)，使得它具有將存在于膜并且如本文定義地跨越膜的大小和形狀。因此，該術(shù)語(yǔ)將不包括基本上缺乏二級(jí)結(jié)構(gòu)的短肽序列或線性序列。另外，預(yù)計(jì)，被錨定至膜并且主要存在于膜外的蛋白將不適合于在本發(fā)明中使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，術(shù)語(yǔ)“跨膜的”不應(yīng)被嚴(yán)格地解釋以至于從本發(fā)明排除部分延伸超過(guò)膜邊界或僅延伸穿過(guò)膜邊界之間的大部分區(qū)域的蛋白?？缒さ鞍卓梢园谅菪Y(jié)構(gòu)。此類跨膜蛋白可以在細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)膜中或真核細(xì)胞的質(zhì)膜中找到，并且有時(shí)在外膜中找到。跨膜蛋白的大部分是α螺旋?？蛇x擇地，跨膜蛋白可以包含β桶構(gòu)型。此類蛋白在革蘭氏陰性菌的外膜、革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁和線粒體和葉綠體的外膜中找到。多次通過(guò)蛋白可以包含連接二級(jí)結(jié)構(gòu)的單元(例如β-鏈)的連接(例如轉(zhuǎn)角)。此類連接可以暴露于水相，諸如細(xì)胞溶膠周質(zhì)或細(xì)胞外液體。本文描述的跨膜蛋白將在水中聚集。本發(fā)明的跨膜蛋白可以是天然存在的或可以是重組的。本發(fā)明的跨膜蛋白可以是工程化的。用于在本發(fā)明中使用的優(yōu)選的跨膜蛋白是包含β桶結(jié)構(gòu)的那些。β桶蛋白包含大β-折疊，所述大β-折疊采用中空的、圓柱狀結(jié)構(gòu)或桶形。在β桶中，β折疊的β鏈以反向平行的方式排列，盡管一些β-桶蛋白已被鑒定包含平行的鏈。疏水殘基可以被定向至桶的外側(cè)，并且親水殘基面向內(nèi)側(cè)。β桶中相鄰的β鏈可以序列上相鄰(被稱為“上下β桶”)或序列上不相鄰(被稱為希臘鑰匙或希臘鑰匙桶)。β桶蛋白可以包含任何數(shù)量的鏈，例如從8至22條β鏈。β桶蛋白可以包含偶數(shù)的β鏈或奇數(shù)的β鏈。跨膜蛋白的鄰近的鏈或螺旋諸如β桶各自由轉(zhuǎn)角或環(huán)連接。轉(zhuǎn)角是蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的元件，其中氨基酸鏈改變方向。轉(zhuǎn)角包括緊密轉(zhuǎn)角(包括α、β、γ、δ和π-轉(zhuǎn)角)、多轉(zhuǎn)角(multipleturns)、發(fā)夾轉(zhuǎn)角。轉(zhuǎn)角通常由該轉(zhuǎn)角的殘基之間的氫鍵的性質(zhì)定義。轉(zhuǎn)角，特別是β轉(zhuǎn)角，通常在跨膜蛋白的周質(zhì)末端找到。β轉(zhuǎn)角也被稱為β彎曲(β-bend)或緊密轉(zhuǎn)角。β轉(zhuǎn)角是蛋白的區(qū)域，其中多肽鏈以約180°在其自身上向后折疊。轉(zhuǎn)角可以包含2至6個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選地β轉(zhuǎn)角的4個(gè)氨基酸。β轉(zhuǎn)角可以包含脯氨酸和甘氨酸殘基。β桶蛋白中的每個(gè)轉(zhuǎn)角可以被編號(hào)，例如T1、T2等。通常，轉(zhuǎn)角不是膜外的?？缒さ鞍椎沫h(huán)通常長(zhǎng)于轉(zhuǎn)角，并且可以延伸出膜進(jìn)入膜外空間。環(huán)示出了高的序列可變性，并且通常缺乏二級(jí)結(jié)構(gòu)。與通?？梢允鞘杷再|(zhì)的跨膜蛋白的跨膜部分(例如β鏈或桶結(jié)構(gòu))相比，環(huán)可以是親水性質(zhì)。環(huán)可以被標(biāo)為L(zhǎng)1、L2等。跨膜蛋白將通常在膜的一側(cè)包含轉(zhuǎn)角，在另一側(cè)包含環(huán)。本文中，主要包含環(huán)的蛋白末端被稱為蛋白的頭。本文中，主要包含轉(zhuǎn)角的蛋白末端被稱為蛋白的足。在外膜蛋白中(即革蘭氏陰性菌、葉綠體和線粒體的外膜蛋白中)，環(huán)通常全部在蛋白的面向細(xì)胞外空間的一側(cè)發(fā)現(xiàn)。本文中，這是外膜蛋白的頭。包含轉(zhuǎn)角和端(termini)的末端通常面向周質(zhì)空間，并且在本文中被稱為蛋白的足。一個(gè)或更多個(gè)α螺旋鏈跨越膜，形成蛋白的主體。在內(nèi)膜蛋白或真核膜蛋白中，環(huán)可以在蛋白的面向周質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)的末端上找到。因此，在本文中，頭被定義為包含膜外結(jié)構(gòu)域例如環(huán)的大部分的末端。足是主要包含轉(zhuǎn)角的末端，具有比蛋白的另一個(gè)末端更少的膜外結(jié)構(gòu)域。N端和C端是蛋白的末端，C端包含游離羧基(COOH)并且N端包含游離氨基(NH2)基團(tuán)。本文中，對(duì)端的提及包括對(duì)末端N殘基或末端C殘基、或N端尾巴或C端尾巴、或其部分的提及。對(duì)于跨膜蛋白，尾是與從膜伸出的N端或C端相鄰的部分，即，尾是在跨膜鏈和N端或C端殘基之間的部分。尾可以包含2個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基，例如2個(gè)、5個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、30個(gè)、40個(gè)、50個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基。OmpA蛋白的尾在圖14中示為殘基17至48(N端)和180至207(C端)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白的工程化包括排列蛋白的環(huán)以包括N端和/或C端尾，優(yōu)選地其中尾包含氨基酸17至48(N端)和/或180至207的氨基酸序列、或其部分?？缒さ鞍卓梢允钦夏さ鞍?，優(yōu)選地是β桶蛋白，優(yōu)選地是孔蛋白。跨膜蛋白可以是離子通道、配體的受體、酶或其他。β桶蛋白包括孔蛋白，其天然地起離子和其他不能擴(kuò)散穿過(guò)細(xì)胞膜的小分子的轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用。環(huán)設(shè)在β鏈之間?？椎鞍装ǜ锾m氏陰性菌的外膜蛋白(OMP)，其為外膜的孔蛋白。這些包括OmpA，也被稱為OmpII，一種8條鏈的β桶，以及OMPF，其為16條鏈的β桶的同三聚體(也被稱為孔蛋白o(hù)mpF外膜蛋白1A)。其他β桶蛋白包括存在于線粒體和葉綠體中的蛋白質(zhì)原移位酶；以及脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(lipocalins)。用于在本發(fā)明中使用的跨膜蛋白可以是真核的或原核的。它可以是細(xì)菌的。它可以是植物源的，或哺乳動(dòng)物。用于在本發(fā)明中使用的跨膜蛋白將是可被本領(lǐng)域技術(shù)人員獲得的。用于在本發(fā)明中使用的已知β桶蛋白的實(shí)例包括：(CurrOpinStruct.Biol2011Aug21(4)523-531)：8條鏈的蛋白：鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)的Ail(PDBID:3QRA、3QRC)；腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitides)的NspA(1P4T)；大腸桿菌(E.coli)的OmpA(1QJP、IBXW、1G90、2GE4、2JMM)；肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)的OmpA(2K0L)；嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)的OmpA(3LDT)；大腸桿菌(Escherichiacoli)的OmpW(2F1V、2F1T)；大腸桿菌的OmpX(1QJ8、1ORM、1Q9F、1Q9G、1QJ9)；銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的OprG(2X27)；大腸桿菌的PagP(1MM4、1MM5、3GP6、1THQ)；銅綠假單胞菌的PagL(2ERV)；Thermusthermophiles的TtoA(3DZM)；10條鏈的蛋白：大腸桿菌的OmpT(1I78)；腦膜炎奈瑟氏菌的OpcA(1K24、2VDF)；鼠疫耶爾森菌的Pla(2X55、2X56)；12條鏈的蛋白：大腸桿菌的EspP(2QOM)；銅綠假單胞菌的EstA(3KVN)；大腸桿菌的Hbp(3AEH)；流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenza)的Hia(2GR8)；鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)的LpxR(3FID)；弗氏志賀菌(Shigellaflexneri)的IcsA(3ML3)；腦膜炎奈瑟氏菌的NalP(1UYN、1UYO)；大腸桿菌的NanC(2WJQ、2WJR)；大腸桿菌的OMPLA(1QD5、1QD6、1FW2、1FW3、1ILD、1ILZ、1IMO)；銅綠假單胞菌的OprM(1WP1)；大腸桿菌的TolC(1EK9)；大腸桿菌的Tsx(1TLW、1TLY、1TLZ)；霍亂弧菌(Vibriocholera)的VceC(1YC9)；14條鏈的蛋白：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的α-HL(7AHL、3M2L、3M3R、3M4D、3M4E)；大腸桿菌的FadL(1T16、3DWN、2R4L、2R4N、2R4O、2R4P、2R88、2R89、2R8A、1T1L)；銅綠假單胞菌的FadL(3DWO)；大腸桿菌的OmpG(2F1C、2IWV、2IWW、2JQY、2WVP、2X9K)；皮氏羅爾斯通菌(Ralstoniapickettii)的TbuX(3BRY)；惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的TodX(3BS0、3BRZ)；16條鏈的蛋白：百日咳桿菌(Bordetellapertussis)的FhaC(2QDZ、2NJT)；MspA(1UUN)；食酸叢毛單胞菌(Comamonasacidovorans)的Omp32(1E54)；代爾夫特食酸菌(Delftiaacidovorans)的Omp32(2FGQ、2FGR)；肺炎克雷伯菌的OmpK36(1OSM)；大腸桿菌的OmpC(2J1N、2J4U、2XE1、2XE2、2XE3、2XE5、2XG6)；大腸桿菌的OmpF(2ZFG、1BT9、3FYX、1GFM、1GFN、1GFO、1GFP、1GFQ、3HW9、3HWB、1HXT、1HXU、1HXX、3K19、3K1B、1MPF、3O0E、2OMF、2OPF)；銅綠假單胞菌的OprP(2O4V)；大腸桿菌的PhoE(1PHO)；Gdpa，莢膜紅細(xì)菌(Rhodobactercapsulatus)，(2POR)；Gdpa，Rhodopseudomonasblastica，(1H6S、1PRN、2PRN、3PRN、5PRN、6PRN、7PRN、8PRN)；PorB，腦膜炎奈瑟氏菌，(3A2R、3A2S、3A2T、3A2U)；18條鏈的蛋白：熒光假單胞菌pf-5(Pseudomonasfluorescenspf-5)的BenF(3JTY)；LamB,大腸桿菌，(1MPM、1MPN、1MPO、1MPQ、1AF6、1MAL)；鼠傷寒沙門(mén)氏菌的LamB(2MPR)；銅綠假單胞菌的OpdK,(2QTK)；銅綠假單胞菌的OprD(2ODJ)或鼠傷寒沙門(mén)氏菌的ScrY(1A0T、1A0S、1OH2)；19條鏈的蛋白：小家鼠(Musmusculus)的VDAC1(3EMN)；智人(Homosapiens)的VDAC1(2K4T、2JK4)；22條鏈的蛋白：大腸桿菌的BtuB(1NQE、1NQF、2GUF、2GSK、1NQG、1NQH、1UJW、2YSU、3M8B、3M8D)；大腸桿菌的Cir(2HDI、2HDF)；百日咳桿菌的FauA(3EFM)；大腸桿菌的FecA(1KMO、1PNZ、1KMP、1PO0、1PO3)；FepA，大腸桿菌(1FEP)；FhuA，大腸桿菌(1BY3、1BY5、1FCP、2FCP、1FI1、2GRX、1QFF、1QFG、1QJQ、1QKC)；FptA，銅綠假單胞菌(1XKW)；FpvA，銅綠假單胞菌(2W75、2O5P、2W16、2W6T、2W6U、2IAH、2W76、2W77、2W78、1XKH)；HasR，黏質(zhì)沙雷氏桿菌(Serratiamarcescens)(3CSL、3CSN、3DDR)；ShuA，痢疾志賀菌(Shigelladysenteriae)，轉(zhuǎn)運(yùn)體(3FHH)；以及24條鏈的蛋白：大腸桿菌的PapC(3FIP)aGdp-一般擴(kuò)散孔蛋白。PDBID在括號(hào)中提供。列出的PDBID的另外的信息可以在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(www.rcsb.org)中找到。本文中，術(shù)語(yǔ)“OMPXX”或“ORLAXX”，其中X是已經(jīng)關(guān)于用于在本發(fā)明中使用的優(yōu)選支架使用的數(shù)值。術(shù)語(yǔ)“OMP”是非限制性的，并且任何如本文定義的適當(dāng)?shù)目缒さ鞍卓梢员蝗珀P(guān)于任何特定“OMPXX”或“ORLAXX”支架修飾以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。用于在本發(fā)明中使用的優(yōu)選的跨膜蛋白是圖14的OMP0。另外優(yōu)選的跨膜蛋白是表7中定義的OMPXX的任一個(gè)。本發(fā)明在其范圍內(nèi)包括如關(guān)于每個(gè)“OMPXX”具體描述修飾的跨膜蛋白，以及使用方法和包含如本文描述的此類蛋白的產(chǎn)品。適當(dāng)?shù)目缒さ鞍卓梢酝ㄟ^(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析鑒定。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)殘基間氫鍵定義，所述氫鍵導(dǎo)致三維結(jié)構(gòu)的形成。根據(jù)殘基和所得鍵的數(shù)量和類型，二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α螺旋、β折疊和多種轉(zhuǎn)角。氨基酸的形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力不同，使得能夠從氨基酸序列預(yù)測(cè)肽或蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明中可以使用任何適當(dāng)?shù)念A(yù)測(cè)方法以從一級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定跨膜蛋白，特別是β桶蛋白(例如，參見(jiàn)：Barton(1995)CurrentopinioninstructuralbiologyVol5p372-376；Jones(1999)JournalofMolecularBiologyVol292p195-202；Pirovano和Herringa(2010)Chapter19:ProteinSecondarystructureprediction.In:MethodsinMolecularBiology–DataMiningTechniquesforthelifesciencesEds.OCarugo和FEisenhaber,HumanaPressDOI10.1007/978-1-60327-241-4)。在本發(fā)明中，此類方法可以在跨膜蛋白的修飾期間使用以預(yù)測(cè)折疊，并且從而預(yù)測(cè)經(jīng)修飾的或合成的蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。臨界膠束濃度(CMC)被定義為高于該除垢劑的濃度則自發(fā)形成膠束的濃度。在高于CMC的濃度，除垢劑與親脂蛋白形成復(fù)合物。低于CMC時(shí)，除垢劑僅分配到膜中，不溶解膜蛋白?？缒さ鞍椎摩峦昂诵牡母呤杷再|(zhì)意味著，它們?cè)谌芤褐谐恋?，除非被高濃度的除垢?大于1xCMC)穩(wěn)定。這也防止此類蛋白結(jié)合至表面。CMC將根據(jù)除垢劑變化，例如SDS具有7-10mM的CMC；十二烷基麥芽糖苷具有0.15mM的CMC；辛基葡萄糖苷具有20-25mM的CMC。因此，對(duì)于SDS，7-10mM的除垢劑濃度被表示為1xCMC。十二烷基麥芽糖苷的0.3mM的除垢劑濃度被表示為2xCMC，等等。稀釋因子將取決于樣品中蛋白和除垢劑的起始濃度、以及需要的稀釋后的工作濃度，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于使用已知的稀釋技術(shù)計(jì)算以提供1xCMC或低于1xCMC的CMC，以及蛋白濃度，其中該蛋白在除垢劑的該濃度中保持溶解充足的時(shí)間以結(jié)合至基底。蛋白是否溶解可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用可用的溶解度測(cè)定容易地確定。如果蛋白是不溶的，它將沉淀并形成渾濁的溶液。濁度可以被測(cè)量，例如通過(guò)在400nm測(cè)量吸光度?？蛇x擇地，簡(jiǎn)單的目視評(píng)價(jià)可以被使用以檢測(cè)表明蛋白不再溶解的渾濁的溶液。本發(fā)明的方法包括降低i)的蛋白樣品的除垢劑濃度至1xCMC或低于1xCMC。優(yōu)選地，CMC保持在0以上。因此，CMC可以被降低至0.05xCMC至1xCMC、0.075xCMC至1xCMC、優(yōu)選地0.1xCMC至1xCMC、或0.05xCMC至0.9xCMC、0.075xCMC至0.9xCMC、優(yōu)選地0.1xCMC至0.9xCMC、或0.05xCMC至0.8xCMC、0.075xCMC至0.8xCMC、優(yōu)選地0.1xCMC至0.8xCMC、或0.05xCMC至0.7xCMC、0.075xCMC至0.7xCMC、優(yōu)選地0.1xCMC至0.7xCMC、或0.05xCMC至0.6xCMC、0.075xCMC至0.6xCMC、優(yōu)選地0.1xCMC至0.6xCMC、或0.05xCMC至0.5xCMC、0.075xCMC至0.5xCMC、優(yōu)選地0.1xCMC至0.5xCMC、或0.05xCMC至0.4xCMC、0.075xCMC至0.4xCMC、優(yōu)選地0.1xCMC至0.4xCMC，或0.05xCMC至0.3xCMC、0.075xCMC至0.3xCMC、優(yōu)選地0.1xCMC至0.3xCMC、或從0.05xCMC至0.2xCMC、0.075xCMC至0.2xCMC、優(yōu)選地0.1xCMC至0.2xCMC。優(yōu)選地，這些值是蛋白樣品已經(jīng)與聚合物基底孵育后的孵育混合物的除垢劑濃度，盡管設(shè)想，除垢劑濃度的降低可以在孵育之前進(jìn)行。在這些參數(shù)內(nèi)，防止蛋白在溶液中沉淀成顆粒，而是促進(jìn)蛋白與聚合物基底附接。任何特定除垢劑的合適的稀釋因子可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)檢驗(yàn)具有錨定至用于展示的肽和/或蛋白的跨膜蛋白的基底的飽和程度和當(dāng)與基底孵育時(shí)蛋白的溶解度容易地確定。適當(dāng)?shù)南♂屢蜃犹峁┲辽?0％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％的基底的飽和度，并且蛋白在溶液中保持至少6小時(shí)，優(yōu)選地至少8小時(shí)，優(yōu)選地至少10小時(shí)，和最優(yōu)選地過(guò)夜(即12至24小時(shí))。飽和可以使用如以下描述的結(jié)合測(cè)定確定?？梢允褂萌魏芜m當(dāng)?shù)某竸?yōu)選的除垢劑是穩(wěn)定蛋白并防止蛋白沉淀出溶液但允許蛋白與基底相互作用并結(jié)合至基底的那些。最優(yōu)選地，除垢劑可以選自由正辛基葡萄糖苷、十二烷基麥芽糖苷或Thesit組成的組。除垢劑可以單獨(dú)使用，或與一種或更多種其他除垢劑組合，所述其他除垢劑優(yōu)選地選自以上定義的那些。優(yōu)選地，相同的除垢劑被用于加至蛋白以提供蛋白樣品，和當(dāng)除垢劑在與稀釋劑組合的稀釋中使用時(shí)二者。適當(dāng)?shù)木彌_液包括磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、HEPES緩沖液、MES緩沖液、TES緩沖液、甘氨酸緩沖液、乙酸鹽緩沖液以及被本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)的任何其他緩沖液。蛋白可以在溶液中提供，或作為干燥的產(chǎn)品。優(yōu)選地，蛋白在向其中加入除垢劑的緩沖液中提供。當(dāng)?shù)鞍滓愿稍锏漠a(chǎn)品提供時(shí)，所述方法可以包括在適當(dāng)?shù)木彌_劑例如ROG-8(50mMTrisHCl，0.1mMEDTA，1％OG)中溶解蛋白的另外的步驟。在本發(fā)明的方法中，蛋白樣品的除垢劑濃度可以在與基底孵育之前降低。另外地或可選擇地，除垢劑濃度可以在樣品和基底孵育之后降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，稀釋劑可以在與樣品孵育之前加至基底，這有效地降低孵育后樣品的除垢劑濃度。因此，步驟ii)可以包括在基底與蛋白孵育之前向聚合物基底添加稀釋劑。因此，所述方法可以包括：i)提供于除垢劑中的跨膜蛋白的樣品；ii)提供聚合物基底；iii)向聚合物基底添加稀釋劑，使得在添加蛋白樣品后提供1x或低于1x的CMC；iv)將i)的蛋白樣品與iii)的聚合物基底孵育；其中，蛋白通過(guò)物理吸附變得固定在基底上。所述方法可以包括：i)提供于除垢劑中的跨膜蛋白的樣品；ii)提供聚合物基底；iii)降低蛋白樣品的除垢劑濃度，使得當(dāng)與基底孵育時(shí)CMC為1x或低于1x；iv)將iii)的蛋白樣品與ii)的聚合物基底孵育；其中，蛋白通過(guò)物理吸附變得固定在基底上。蛋白可以以任何適當(dāng)?shù)姆绞教砑又粱祝缢杀恍纬蓤D案(例如斑點(diǎn)狀的)。孵育優(yōu)選地在室溫或低于室溫(但高于0℃)進(jìn)行。優(yōu)選地，孵育保持至少6小時(shí)，優(yōu)選地至少8小時(shí)，優(yōu)選地至少10小時(shí)，并且最優(yōu)選地12-24小時(shí)。24小時(shí)是最佳的孵育時(shí)間段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法另外包括洗滌基底?；卓梢杂萌魏芜m當(dāng)?shù)木彌_液、水或包含除垢劑或乙醇的溶液洗滌，例如TBS、PBS、HEPES、TE、70％乙醇、Tween或去離子水，優(yōu)選地?zé)o菌的。洗滌具有從基底去除任何未結(jié)合的材料和任何殘留的除垢劑的目的?；卓杀桓稍?。它還可被滅菌。它可以被包裝用于銷售。跨膜蛋白與基底的結(jié)合可以使用本領(lǐng)域任何適當(dāng)?shù)姆椒ù_定，包括例如結(jié)合測(cè)定。在一個(gè)典型的結(jié)合測(cè)定中，基底可以與能夠結(jié)合至跨膜蛋白的結(jié)合位點(diǎn)或能夠結(jié)合至從而錨定的肽或蛋白的配體(例如IgG)一起孵育。通過(guò)洗滌去除任何未結(jié)合的配體。然后結(jié)合的配體可以被直接地監(jiān)測(cè)，例如如果該配體包括可以被測(cè)量的信號(hào)，或被間接地監(jiān)測(cè)，例如通過(guò)使用對(duì)該配體特異性的第二結(jié)合成員。第二結(jié)合成員可以是綴合至酶或催化劑或其他標(biāo)記物諸如熒光標(biāo)簽的抗體，并且檢測(cè)可以通過(guò)與底物一起孵育并測(cè)量產(chǎn)生的信號(hào)的量來(lái)執(zhí)行。任何適當(dāng)?shù)男盘?hào)可以被使用，適當(dāng)?shù)男盘?hào)的許多實(shí)例將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并可獲得的。優(yōu)選的信號(hào)是可以在電磁光譜中檢測(cè)的那些，諸如發(fā)色團(tuán)和熒光團(tuán)、和酶底物系統(tǒng)諸如辣根過(guò)氧化物酶/TMB。其他將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在后者的情況下，對(duì)該配體特異性的結(jié)合成員可以與酶結(jié)合，所述酶催化信號(hào)底物以產(chǎn)生比色輸出(colorimetricoutput)。優(yōu)選的信號(hào)是采用擴(kuò)增系統(tǒng)的那些。可以作用于底物以產(chǎn)生發(fā)色團(tuán)的酶標(biāo)簽是最優(yōu)選的，例如，辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶。適當(dāng)?shù)牡孜锇═MBABTS、OPD(對(duì)于HRP)、pNPP(對(duì)于AP)和ONPG(對(duì)于β半乳糖苷酶)。生成的信號(hào)提供跨膜蛋白與基底結(jié)合的程度(即底物的飽和程度)和錨定于其的任何肽或蛋白是否變性、和可用于配體結(jié)合的指示。飽和的意指，最大量的蛋白結(jié)合至基底，即基底被完全占據(jù)。因此，本發(fā)明的方法提供了包含固定于其上的跨膜蛋白的聚合物基底，其中所述跨膜蛋白通過(guò)物理吸附被固定于所述基底上，并且其中所述跨膜蛋白錨定、或被修飾以錨定用于展示的異源蛋白或肽。“固定的”意指，蛋白被結(jié)合至基底并在用包含除垢劑的水和/或緩沖液(例如以0.05％(w/v)的Tween20)洗滌后保持結(jié)合?？缒さ鞍卓梢栽诨咨暇鶆虻鼗蛞灶A(yù)定的圖案，例如點(diǎn)狀的提供。本發(fā)明還可以包括使表面具有圖案的方法，所述方法包括應(yīng)用本發(fā)明的跨膜蛋白至具有圖案的基底。優(yōu)選地，所述圖案是預(yù)定的。使表面具有圖案的適當(dāng)?shù)姆椒òㄆ桨嬗∷⑿g(shù)、噴墨、液滴注射(dropletinjection)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法。物理吸附是化合物通過(guò)非共價(jià)結(jié)合，例如范德瓦爾斯相互作用、疏水相互作用、電荷相互作用，物理吸附至表面。物理吸附不是蛋白和基底之間的化學(xué)反應(yīng)并且是非共價(jià)結(jié)合。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)示出了，出乎預(yù)料地，跨膜蛋白可以通過(guò)物理吸附結(jié)合至聚合物基底，并且能夠展示錨定的肽或蛋白。因此，本發(fā)明的方法使得跨膜蛋白能夠被固定在聚合物基底上并充當(dāng)展示可以具有功能并被定向用于展示的肽和/或蛋白的錨?？缒さ鞍着c基底的這種結(jié)合及其作為以有功能的和定向的方式展示的肽和/或蛋白的錨的有效性意味著，聚合物基底在結(jié)合測(cè)定以及其他方法學(xué)中具有效用。因此，本發(fā)明第一次提供了具有固定于其上的跨膜蛋白的基底，其中所述跨膜蛋白錨定、或被修飾以錨定用于展示的異源蛋白或肽?！板^”意指跨膜蛋白可以在該蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白，和/或在該蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白。因此，跨膜蛋白結(jié)合至或融合至肽或蛋白，所述肽或蛋白在該跨膜蛋白的頭被展示。因此，跨膜蛋白和肽和/或蛋白可以被表達(dá)為單個(gè)多肽鏈。被修飾以錨定意指，跨膜蛋白被工程化以在該蛋白的頭包含N端和/或C端，和/或在該蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)，以使其在固定于基底上時(shí)能夠展示肽或蛋白。因此，肽或蛋白可以在該蛋白的頭展示。修飾使得待被錨定的蛋白或肽空間上遠(yuǎn)離該基底的表面，并且優(yōu)選地，不被跨膜蛋白或表面空間上阻礙。因此，錨定的肽或蛋白可以是有功能的，并且可用于結(jié)合或其他相互作用。工程化以在蛋白的頭提供N端和/或C端可以通過(guò)環(huán)狀排列實(shí)現(xiàn)。此環(huán)狀排列意指，蛋白的特征的順序被改變，對(duì)該蛋白的整體三級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)實(shí)質(zhì)的影響。這可以通過(guò)使用本領(lǐng)域可獲得的技術(shù)工程化跨膜蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)。因此，跨膜蛋白可以被工程化以使N端和/或C端從蛋白的頭而非足延伸。端可以被工程化以代替環(huán)提供、或鄰近環(huán)提供、從環(huán)內(nèi)提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，N端或C端被工程化以從環(huán)延伸。這可以通過(guò)將環(huán)工程化以包括N端和/或C端實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，當(dāng)N端和C端二者都被排列，它們可以被工程化以在相同的環(huán)中提供。因此，環(huán)的部分可以形成N端且環(huán)的部分可以形成C端。在此類情況中，環(huán)被分割，形成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域而非一個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)。因此，環(huán)的全部或部分可以被N端和/或C端代替。當(dāng)?shù)鞍资荗MP時(shí)，環(huán)可以是環(huán)1、3或4。當(dāng)固定于基底上時(shí)，工程化的端從基底的表面延伸離開(kāi)，提供用于蛋白或肽的有效的展示位點(diǎn)。間隔物也可以在一個(gè)或兩個(gè)端的末端上提供，以進(jìn)一步協(xié)助錨定于其的肽或蛋白的展示。在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)或N端或C端可以包含間隔物序列，所述間隔物序列用于將與其連接的肽或蛋白與基底空間上分開(kāi)。異源肽和/或蛋白被跨膜蛋白錨定用于展示。這意味著，在跨膜蛋白中提供一個(gè)位置，使得當(dāng)固定于基底上時(shí)，肽和/或蛋白與基底的結(jié)合表面空間上分開(kāi)，并且如此是可用于感興趣的組分接近的(例如，在結(jié)合反應(yīng)中)。優(yōu)選地，錨定用于展示意指，它空間上與可以防止它與感興趣的組分相互作用的跨膜蛋白的空間阻礙分開(kāi)。異源肽或蛋白的展示可以使用如本文描述的檢測(cè)測(cè)定確定。錨定的蛋白優(yōu)選地保持任何二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使其能夠保持功能?！氨３制涠?jí)結(jié)構(gòu)”意指，基本上所有錨定的蛋白(即，結(jié)合的蛋白的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)具有其天然的二級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白的天然的二級(jí)結(jié)構(gòu)是在非變性條件下的折疊結(jié)構(gòu)。盡管設(shè)想，蛋白的一些變性可以在結(jié)合后發(fā)生，蛋白的整體二級(jí)結(jié)構(gòu)與天然二級(jí)結(jié)構(gòu)是基本上相同的，并且任何變性對(duì)蛋白的整體折疊或其結(jié)合配體的能力不具有顯著的作用。本文中，二級(jí)結(jié)構(gòu)也可以被稱為構(gòu)象。當(dāng)異源肽被插入到跨膜蛋白的環(huán)中時(shí)，它優(yōu)選地在跨膜鏈之間的長(zhǎng)環(huán)中提供。它優(yōu)選地向著環(huán)的中部提供。環(huán)可以在肽序列的插入前被截短。除了肽序列的插入以外，環(huán)可以被延長(zhǎng)，例如通過(guò)間隔物。可選擇地，肽序列可以被引至天然的環(huán)中，這樣環(huán)與其天然形式相比被延長(zhǎng)。經(jīng)修飾的環(huán)可以比天然環(huán)更長(zhǎng)或更短。當(dāng)插入至環(huán)中時(shí)，異源肽可以是任何適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度，但優(yōu)選是足夠短以至于不能采取可以影響跨膜蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。例如，適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度可以是從3至70個(gè)氨基酸。異源肽序列可以在N端、C端或二者中提供。異源序列(肽或蛋白)可以在端的末端獨(dú)立地提供，或在形成端的序列內(nèi)提供。優(yōu)選地，它在N端提供，優(yōu)選地在N端的末端提供。端可以如本文描述的被工程化以提供肽或蛋白的錨定(展示)位點(diǎn)。有功能的意指，肽和/或蛋白保持它的天然功能的一個(gè)或更多個(gè)，例如結(jié)合功能、受體功能、信號(hào)傳導(dǎo)功能或酶促功能。跨膜蛋白包含頭和足，所述頭和足被包含一個(gè)或更多個(gè)跨膜鏈的主體彼此隔開(kāi)?！板^”意指跨膜蛋白可以在該蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白，和/或在該蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白?！靶揎椧藻^定”意指跨膜蛋白被工程化以在該蛋白的頭包含N端和/或C端，和/或在該蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。異源肽和/或蛋白可以在蛋白的頭的工程化N端和/或C端提供，或在蛋白的頭的工程化環(huán)中提供，用于展示。因此，跨膜蛋白可以：i)在所述蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白；ii)在所述蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白；iii)被工程化以在所述蛋白的頭包含N端和/或C端；和/或iv)被工程化以在所述蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。異源肽和/或蛋白可以在蛋白的頭的工程化N端和/或C端提供，或在蛋白的頭的工程化環(huán)中提供，用于展示。異源肽可以是任何肽序列，優(yōu)選地有功能的肽序列。肽序列可以由以下組成、可以源自以下或可以充當(dāng)以下：生長(zhǎng)因子、參與蛋白-蛋白相互作用或結(jié)合的蛋白或肽、抗體結(jié)合基序、表位、抗原、過(guò)敏原、酶、催化劑、參與與DNA和/或碳水化合物相互作用或結(jié)合的蛋白或肽；參與與小分子(藥物等)相互作用或結(jié)合、細(xì)胞結(jié)合或細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白或肽；細(xì)胞外基質(zhì)蛋白；以及實(shí)際上出于任何目的可以被期望在聚合物基底上展示的任何其他蛋白或肽。用于在本發(fā)明中使用的肽和蛋白的具體實(shí)例包括蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，例如FLAG表位(DYKDDDDK)；生長(zhǎng)因子諸如FGF1或FGF2、白介素、血小板生成素(TPO)、干細(xì)胞因子(SCF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)、白細(xì)胞抑制因子(LIF)、sonichedgehog(Shh)；細(xì)胞結(jié)合基序例如膜外基質(zhì)蛋白諸如整聯(lián)蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白或纖連蛋白(例如，如表3中描述)的結(jié)合基序；細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白基序，例如RGDS、抗原(例如HIV(例如)p24抗原、BMP-2、玻連蛋白、骨橋蛋白、生腱蛋白-C)以及實(shí)際上本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他肽和蛋白。肽序列可以包含兩個(gè)或更多個(gè)此類肽序列的任何組合。優(yōu)選地，肽或蛋白可以是生長(zhǎng)因子。肽或蛋白可以是任何生長(zhǎng)因子。優(yōu)選的生長(zhǎng)因子是FGF1或FGF2。在一個(gè)實(shí)施方案中，生長(zhǎng)因子可以被錨定至融合蛋白，優(yōu)選地直接錨定至跨膜蛋白的N端或C端。優(yōu)選地，間隔物可以在跨膜蛋白和生長(zhǎng)因子之間提供。間隔物的提供使得生長(zhǎng)因子和跨膜蛋白能夠在表達(dá)后獨(dú)立地重新折疊。另外，生長(zhǎng)因子與跨膜蛋白的空間分離使得生長(zhǎng)因子能夠在聚合物表面上方延伸并且具有生長(zhǎng)因子的功能，不被跨膜蛋白空間上阻礙。在聚合物表面提供生長(zhǎng)因子在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中具有特定應(yīng)用，例如以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分化。間隔物序列與異源肽和/或蛋白的組合使用通過(guò)使肽或蛋白定向離開(kāi)聚合物基底來(lái)改進(jìn)肽或蛋白的展示。間隔物的提供還可以使得異源蛋白和跨膜蛋白能夠在表達(dá)后獨(dú)立地重新折疊，從而增加獲得被錨定至跨膜蛋白的有功能的異源肽或蛋白的可能性。由間隔物提供的空間分開(kāi)使得異源肽或蛋白能夠在聚合物表面上方延伸并且是有功能的，不被基底或跨膜蛋白空間上阻礙。間隔物可以在環(huán)中和/或在N端和/或C端的末端提供。間隔物可以繼而融合至肽或蛋白，例如用于結(jié)合。因此，N端和/或C端可以被用于展示更大的序列，因?yàn)椴惶赡苁┘訉?duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用的相同限制。間隔物可以是與跨膜蛋白和/或與該肽和/或蛋白異源的。間隔物可以是錨定至N端或C端，優(yōu)選N端的游離末端的一個(gè)末端的α螺旋序列。間隔物可以在環(huán)中提供，優(yōu)選地鄰近異源肽或蛋白。間隔物可以是親水的、剛性的或半剛性的。間隔物可以包含任何適當(dāng)?shù)囊患?jí)序列或二級(jí)序列，但優(yōu)選地缺乏功能諸如信號(hào)傳導(dǎo)、結(jié)合或其他功能。優(yōu)選的間隔物可以包含α螺旋或PT接頭，例如如Poon等人,JBiolChem282:2091-20112006中描述的，或甘氨酸-絲氨酸間隔物接頭，例如PL剛性(PLrigid)、2aaGS接頭、6aa[GS]x接頭、10aa[GS]x接頭、10aa柔性的蛋白結(jié)構(gòu)域接頭、8aa蛋白結(jié)構(gòu)域接頭、Split熒光團(tuán)接頭；Freiburg標(biāo)準(zhǔn)、15aa柔性的甘氨酸-絲氨酸蛋白結(jié)構(gòu)域接頭；Freiburg標(biāo)準(zhǔn)、短接頭(Gly-Gly-Ser-Gly)、中接頭(Gly-Gly-Ser-Gly)x2、長(zhǎng)接頭(Gly-Gly-Ser-Gly)x3、GSAT接頭、SEG、SEG-接頭、GSAT-接頭、Z-EGFR-1907短接頭、Z-EGFR-1907中接頭、Z-EGFR-1907長(zhǎng)接頭、Z-EGFR-1907_SEG-接頭、(Gly4Ser)3柔性的肽接頭、短融合蛋白接頭：具有標(biāo)準(zhǔn)25前綴/后綴的GGSG、具有標(biāo)準(zhǔn)25前綴/后綴的長(zhǎng)10AA融合蛋白接頭、中6AA融合蛋白接頭：具有標(biāo)準(zhǔn)25前綴/后綴的GGSGGS。(http://parts.igem.org/Protein_domains/Linker)。α螺旋序列可以被提供用于融合至異源肽或蛋白，例如如圖12的OMP173中所示的。本發(fā)明具有以下優(yōu)勢(shì)：跨膜蛋白結(jié)合至基底的方式使得，結(jié)合配偶體能夠與在N端和/或C端或環(huán)中提供的異源蛋白或肽結(jié)合。這與現(xiàn)有技術(shù)的方法不同，現(xiàn)有技術(shù)的方法中蛋白通常以雜亂無(wú)章的方式結(jié)合至基底，或需要另外的試劑將蛋白保持在適當(dāng)位置(例如，脂單層)，使得結(jié)合成為可能。令人驚訝的是，在本發(fā)明中，基本上所有錨定的肽和/或蛋白都以使其能夠被展示用于結(jié)合或相互作用的方式定向。因此，在本發(fā)明中，錨定的肽和/或蛋白的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％被定向遠(yuǎn)離聚合物基底表面，并且被展示用于結(jié)合或相互作用。如本文描述的，這可以使用結(jié)合測(cè)定或本領(lǐng)域可獲得的其他技術(shù)確定，例如如本文描述的關(guān)于結(jié)合至基底的確認(rèn)?？缒さ鞍椎腘端和/或C端可以被修飾。例如，N端或C端的一個(gè)或兩者可以被截短，例如以增加疏水性，或以引入如以上描述的異源序列?？梢赃M(jìn)行對(duì)跨膜蛋白基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的其他修飾以改善結(jié)合性質(zhì)。這些包括：缺失不與膜整合的大的內(nèi)部結(jié)構(gòu)域或外部結(jié)構(gòu)域；截短一個(gè)或更多個(gè)環(huán)以降低桶的親水性；延長(zhǎng)一個(gè)或更多個(gè)環(huán)，例如用親水間隔物以允許蛋白在環(huán)上插入和展示；環(huán)狀排列以改變N端和/或C端的空間定位；引入純化標(biāo)簽(例如his標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽和其他)。N端或C端的一個(gè)或兩個(gè)可以被修飾以包括一個(gè)或更多個(gè)氨基酸缺失、置換或插入，以改變其結(jié)構(gòu)和/或功能性質(zhì)。如本文描述的，跨膜蛋白的一個(gè)或更多個(gè)環(huán)可以被工程化。增加蛋白的疏水性可能是理想的，例如通過(guò)截短該蛋白的一個(gè)或更多個(gè)環(huán)(通常是親水的)。這可以用來(lái)增強(qiáng)蛋白與疏水基底的結(jié)合，不需要塑料表面的官能化或蛋白的修飾以引入結(jié)合部分諸如用于與基底共價(jià)結(jié)合的特定氨基酸。跨膜蛋白的一個(gè)或更多個(gè)長(zhǎng)的、親水環(huán)的縮短還具有在測(cè)定中降低來(lái)自血清或其他基質(zhì)蛋白的非特異性結(jié)合的優(yōu)勢(shì)。蛋白的疏水性是蛋白聚集和排斥水的傾向的量度。蛋白的疏水性是存在于一級(jí)結(jié)構(gòu)中的氨基酸的因子，但也是二級(jí)結(jié)構(gòu)的因子。因此，蛋白的不同部分可以是疏水的或親水的。存在用于分類氨基酸殘基的疏水性的多種方法，包括色譜法、可及表面面積法、分配法。該值可以被稱為親水指數(shù)?？梢允褂糜H水性圖或X射線結(jié)構(gòu)分析來(lái)預(yù)測(cè)沿著氨基酸序列的長(zhǎng)度的疏水性。量表是基于20種氨基酸的疏水性質(zhì)和親水性質(zhì)。從5至20個(gè)氨基酸的移動(dòng)的“窗”決定序列(Y坐標(biāo))中每個(gè)點(diǎn)的總親水性。然后將這些和對(duì)它們的各自位置(X坐標(biāo))作圖(Kyte和DoolittleJolMol.Bio.(1982)157105-132)。在其中期望改變跨膜蛋白的疏水性，例如以協(xié)助蛋白與聚合物基底的結(jié)合的實(shí)施方案中，親水性圖可以在任何修飾之前和之后預(yù)測(cè)環(huán)的疏水性中有用，以確定建議的修飾是否導(dǎo)致疏水性的期望的改變。在實(shí)施方案中，例如，增加蛋白的疏水性可能是理想的，例如通過(guò)截短該蛋白的一個(gè)或更多個(gè)環(huán)(通常是親水的)。用于在本發(fā)明中使用的跨膜蛋白是包含至少一個(gè)環(huán)并因此跨過(guò)膜至少兩次的那些。用于在本發(fā)明中使用的跨膜蛋白可以包含兩個(gè)或更多個(gè)環(huán)。跨膜蛋白的每個(gè)環(huán)的長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)可以與該蛋白的一個(gè)或更多個(gè)其他環(huán)不同。當(dāng)需要修飾蛋白時(shí)，任何一個(gè)或更多個(gè)環(huán)可以如本文所述地被截短，例如以增加蛋白的疏水性，并使得能夠?qū)⒐潭ǘㄏ蛴谑杷住１唤囟痰沫h(huán)的數(shù)量將取決于蛋白和環(huán)導(dǎo)致的親水性期望被降低的程度。這可以是任何具體環(huán)的具體序列和長(zhǎng)度的因子。使用一級(jí)序列分析和任選的方法諸如X射線晶體學(xué)和親水性繪圖，技術(shù)人員可以評(píng)估環(huán)和經(jīng)修飾的跨膜蛋白的預(yù)測(cè)的親水性質(zhì)/疏水性質(zhì)以確定待被截短的合適的環(huán)和截短多少個(gè)氨基酸。方法是本領(lǐng)域用于確定疏水性可獲得的，包括溶劑相分配、RPLC、TLC。優(yōu)選的方法包括X射線結(jié)構(gòu)和預(yù)測(cè)的親水性圖(Kyte和Doolittle)的分析以決定何時(shí)將蛋白工程化。待被截短的環(huán)的數(shù)量可以由數(shù)量定義，基于C端位于周質(zhì)側(cè)的蛋白的天然構(gòu)型。在2次或3次或更多次通過(guò)蛋白中，1個(gè)或更多個(gè)環(huán)可以被截短。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，除一個(gè)環(huán)以外的全部環(huán)可以被截短。本文中環(huán)的編號(hào)是基于在胞質(zhì)溶膠側(cè)的天然C端?！敖囟痰摹币庵?，與其天然形式相比，該環(huán)的長(zhǎng)度減少。長(zhǎng)度的減少通過(guò)從環(huán)缺失一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基實(shí)現(xiàn)。環(huán)被截短的程度將取決于因素諸如通過(guò)修飾蛋白將實(shí)現(xiàn)的疏水性的程度和缺失對(duì)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。因此，“截短”意指，環(huán)的全部或部分可以被去除。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的跨膜蛋白保持其天然三級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，當(dāng)跨膜蛋白是β-桶蛋白時(shí)，經(jīng)修飾的蛋白優(yōu)選地保持β-桶三級(jí)確認(rèn)。因此，優(yōu)選地，與其天然形式相比，縮短或去除一個(gè)或更多個(gè)環(huán)不顯著影響蛋白的最終三級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白中的每個(gè)環(huán)可以與蛋白中的一個(gè)或更多個(gè)其他環(huán)不同地修飾，或以與蛋白中的一個(gè)或更多個(gè)其他環(huán)相同的方式修飾。優(yōu)選地，環(huán)被截短至使其能夠不受限制地且優(yōu)選地不改變蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)地連接跨膜鏈的長(zhǎng)度。優(yōu)選地，環(huán)被截短，使得它不延伸至膜外的水相。如本文描述的跨膜蛋白的一個(gè)或更多個(gè)環(huán)的截短幫助增加蛋白的疏水性，并且還幫助降低與蛋白的非特異性結(jié)合。在除垢劑的存在下，蛋白能夠與疏水基底結(jié)合。因此，蛋白被直接地固定于聚合物基底，不需要標(biāo)簽、官能化或接頭序列。優(yōu)選地，頭被定向遠(yuǎn)離聚合物基底，并且這樣頭可以用于結(jié)合，例如在篩選測(cè)定中。優(yōu)選地，當(dāng)被固定至基底時(shí)，蛋白保持其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，并且優(yōu)選地被正確地定向用于展示結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選地，蛋白是有功能的。優(yōu)選地，蛋白被定向用于并且能夠結(jié)合至分析物或配體。優(yōu)選地，蛋白在基底表面非-無(wú)序地組織，使得多個(gè)蛋白以基本上相同的方式定向。優(yōu)選地，蛋白被定位在基底上，使得任何有功能的位點(diǎn)，諸如結(jié)合位點(diǎn)被暴露，優(yōu)選地指向溶液/反應(yīng)表面。保留在經(jīng)修飾的跨膜蛋白中的環(huán)可以被修飾以包括親水殘基，所述修飾是通過(guò)插入或置換。在環(huán)中引入親水殘基的目的是從疏水基底產(chǎn)生排斥，和放置環(huán)和它的活性內(nèi)容在表面上方使得它可被接近。此類親水殘基可以是間隔物肽或其以外的部分。蛋白可以被修飾以包括標(biāo)簽，例如聚組氨酸標(biāo)簽。聚組氨酸標(biāo)簽可以包含6個(gè)或更多個(gè)組氨酸殘基。本文中該標(biāo)簽可以被稱為His6標(biāo)簽、6xhis標(biāo)簽或hexa-his標(biāo)簽。其他適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽包括FLAG、c-myc或其他小親和標(biāo)簽。標(biāo)簽可以在C端或N端提供。端可以如本文描述地修飾。標(biāo)簽可以在截短的C端或N端提供。蛋白可以被修飾以去除一個(gè)或更多個(gè)天然半胱氨酸殘基，特別是在與聚合物基底接觸的蛋白的那些部分中。因此，一個(gè)或更多個(gè)環(huán)可以被修飾以去除(通過(guò)缺失或置換)一個(gè)或更多個(gè)天然半胱氨酸殘基。這樣的修飾對(duì)于待結(jié)合至塑料基底且不要求表現(xiàn)結(jié)合至塑料和其他基底諸如金的雙官能的蛋白可以是合適的。除了以上描述的修飾，跨膜蛋白可以被修飾以包括一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的一個(gè)或更多個(gè)保守置換而不顯著地改變?cè)摰鞍椎纳飳W(xué)活性和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚進(jìn)行此類氨基酸置換的方法。OmpA是8次通過(guò)蛋白，意味著，它包含形成桶形且各自跨過(guò)膜的8條β鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，OmpA可以被修飾以包含3個(gè)被截短的細(xì)胞外環(huán)。優(yōu)選地，每個(gè)環(huán)被截短至轉(zhuǎn)角的長(zhǎng)度，優(yōu)選4個(gè)氨基酸的β轉(zhuǎn)角的長(zhǎng)度。在一個(gè)實(shí)施方案中，4個(gè)細(xì)胞外環(huán)中的3個(gè)被截短。環(huán)1被保留并用PT接頭和親水氨基酸修飾(參見(jiàn)圖14)。在一個(gè)實(shí)施方案中，保留的環(huán)被延長(zhǎng)。優(yōu)選地，細(xì)胞外環(huán)通過(guò)引入親水殘基被延長(zhǎng)。優(yōu)選地，環(huán)通過(guò)引入肽間隔物序列和/或親水殘基被延長(zhǎng)。此蛋白在本文中被稱為OMP154。OMP154的變體在表3中描述。經(jīng)修飾的跨膜蛋白可以在細(xì)胞外環(huán)1中包含F(xiàn)LAG表位(DYKDDDDK)。在本文中以此方式修飾的OmpA被稱為OMP5。經(jīng)修飾的跨膜蛋白可以在細(xì)胞外環(huán)1中包含來(lái)自層粘連蛋白的YIGSR基序。在本文中此蛋白被稱為OMP36。經(jīng)修飾的跨膜蛋白可以包含：i)被截短的所有細(xì)胞外環(huán)，優(yōu)選地每個(gè)細(xì)胞外環(huán)被截短至β轉(zhuǎn)角的長(zhǎng)度；ii)位于蛋白的細(xì)胞外末端(頭)的N端和C端；iii)被修飾以包括α螺旋間隔物序列的N端；iv)半胱氨酸殘基，以使蛋白能夠結(jié)合至金表面。此蛋白能夠結(jié)合至金和塑料基底。優(yōu)選地，蛋白骨架是環(huán)狀排列的OmpA的β桶(圖14)。優(yōu)選地，α螺旋間隔物是不與IgG結(jié)合的金黃色葡萄球菌蛋白AB結(jié)構(gòu)域的突變形式(其序列在Kim等人.(2010)JournalofexperimentalmedicineVol.207p1863-1870中公開(kāi))。在本文中此蛋白被稱為OMP171。在本文中缺乏α螺旋間隔物的版本被稱為OMP171。提供這樣的跨膜蛋白的經(jīng)修飾的版本，其中蛋白融合至間隔物。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白是HIV抗原p24，并且本文中該蛋白被稱為OMP173。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的跨膜蛋白包含i)被截短的所有細(xì)胞外環(huán)，優(yōu)選地每個(gè)細(xì)胞外環(huán)被截短至β轉(zhuǎn)角的長(zhǎng)度；ii)位于蛋白的細(xì)胞外末端(頭)的N端和C端；iii)被修飾以包括α螺旋間隔物序列的N端；iv)在C端提供的His標(biāo)簽，v)蛋白不含半胱氨酸殘基。這些修飾允許包含多個(gè)半胱氨酸殘基的大生長(zhǎng)因子的融合并幫助確保只有全長(zhǎng)表達(dá)的蛋白包含His標(biāo)簽。優(yōu)選地，蛋白骨架是環(huán)狀排列的OmpA的β桶。在本文中此蛋白被稱為OMP140。OMP140的變體在表4中描述。OMP90和OMP128在OMP59支架中包含F(xiàn)GF1和FGF2(OMP59是具有α螺旋間隔物的OMP9，在圖11中示出)。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的跨膜蛋白包含i)位于蛋白的細(xì)胞外末端的N端和C端；iii)被截短并融合至金黃色葡萄球菌的蛋白A的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的N端。這些修飾允許蛋白融合至該蛋白的抗體的Fc區(qū)域。本文中此蛋白被稱為OMP18。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供了一種跨膜蛋白，所述跨膜蛋白錨定、或被修飾以錨定用于展示的異源蛋白或肽?？缒さ鞍装^和足，所述頭和足被一個(gè)或更多個(gè)跨膜鏈彼此隔開(kāi)。“錨”意指，跨膜蛋白可以在該蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白，和/或在該蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白?！靶揎椧藻^定”意指，跨膜蛋白被工程化以在該蛋白的頭包含N端和/或C端，和/或在該蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。優(yōu)選地，跨膜蛋白：i)在所述蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白；ii)在所述蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白；iii)被工程化以在所述蛋白的頭包含N端和/或C端；和/或iv)被工程化以在所述蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。異源肽和/或蛋白可以在蛋白的頭的工程化N端和/或C端提供，或在蛋白的頭的工程化環(huán)中提供，用于展示。優(yōu)選地，跨膜蛋白包含異源肽和/或蛋白。本發(fā)明包括本發(fā)明的跨膜蛋白的變體跨膜蛋白。優(yōu)選地，變體蛋白可以在一級(jí)序列中不同，但保持與本發(fā)明的經(jīng)修飾的跨膜蛋白基本相同的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)?；鞠嗤庵?，蛋白在適當(dāng)?shù)拇?例如10至500個(gè)氨基酸)內(nèi)共享至少40％、優(yōu)選地50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。肽或蛋白序列同一性可以通過(guò)本領(lǐng)域可獲得的方法確定，例如使用bl2seq中的BLASTP(來(lái)自BLAST程序套件，版本2.2.5[Nov2002])，其可以從NCBI公開(kāi)地獲得(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)；EMBOSS-needle(可從http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/獲得)和GAP(Huang,X.(1994)OnGlobalSequenceAlignment.ComputerApplicationsintheBiosciences10,227-235.)；ClustalW(Thompson等人1994,NucleicAcidRes11(22)4673-4680。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，跨膜蛋白是如本文描述的。優(yōu)選地，它是OmpA。對(duì)跨膜蛋白的修飾可以由任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)引入，許多適當(dāng)?shù)募夹g(shù)將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，重組DNA技術(shù)可以被用于向編碼跨膜蛋白的核酸序列引入修飾，該核酸序列被表達(dá)為經(jīng)修飾的跨膜蛋白。重組DNA技術(shù)在Sambrook(Sambrook,J.和Russell,D.W.(2001)Molecularcloning.ALaboratoryManual.CSHLPress)中提供。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供了編碼如本文描述的經(jīng)修飾的跨膜蛋白的核酸序列。編碼跨膜蛋白的核酸序列可以被工程化以提供如本文描述的經(jīng)修飾的跨膜蛋白。OmpA由本領(lǐng)域稱為OmpA、con、tolG和tut的基因編碼。基因座的名稱是b0957和JW0940。編碼OmpA的核酸序列在大腸桿菌的基因組中公開(kāi)(http://bmb.med.miami.edu/sources/1)，在本文中在圖14中公開(kāi)。圖14中示出的序列是野生型基因的工程化形式。編碼細(xì)胞外環(huán)的序列被加下劃線。細(xì)胞外環(huán)L1由核酸85-126編碼；L2由核酸214-249編碼；L3由核酸346-387編碼；L4由核酸466-507編碼。C端脯氨酸由核酸589-591編碼。N端甲硫氨酸由核酸1-3編碼。環(huán)之間的序列編碼跨膜蛋白β鏈，如表1中所示。OmpF(也被稱為T(mén)OLF或CMLB或COA或CRY或B0929)也可以在本發(fā)明中使用。本發(fā)明包括編碼本發(fā)明的跨膜蛋白的變體核酸序列。變體或功能等價(jià)序列與編碼本發(fā)明的跨膜蛋白的序列的序列同一性通過(guò)以下確定：在預(yù)定的比較窗口比較兩個(gè)對(duì)齊的序列或其片段，并確定相同殘基發(fā)生的位置的數(shù)量。比較窗口可以包含序列的全部或部分，例如窗口包含10、20、30、40、50、100、200、500或1000個(gè)或更多個(gè)核苷酸。通常，序列同一性被表示為百分比。核苷酸序列的序列同一性的測(cè)量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，使用計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)的數(shù)學(xué)算法諸如ALIGN(版本2.0)、GAP、BESTFIT、BLAST(Altschul等人J.Mol.Biol.215:403(1990))、FASTA和TFASTA(WisconsinGeneticSoftwarePackageVersion8，可從GeneticsComputerGroup,AccelrysInc.SanDiego,California獲得)和CLUSTAL(Higgins等人,Gene73:237-244(1998))，使用默認(rèn)參數(shù)。優(yōu)選地，核酸分子在遺傳構(gòu)建體中提供，遺傳構(gòu)建體可以被用于例如在宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的經(jīng)修飾的跨膜蛋白。優(yōu)選地，核酸分子被可操作地連接至調(diào)控元件，調(diào)控元件是調(diào)控與其可操作地連接的編碼序列的表達(dá)(即轉(zhuǎn)錄或翻譯)的任何核酸序列。調(diào)控序列包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、起始密碼子、剪接信號(hào)，包括受體和供體剪接位點(diǎn)、終止密碼子、琥珀密碼子(ambercodon)或赭石密碼子(ochrecodon)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、IRES、和靶向序列諸如細(xì)胞區(qū)室化信號(hào)(例如至細(xì)胞溶膠、核、質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、葉綠體、溶酶體、內(nèi)體或高爾基體)和/或分泌信號(hào)。其他調(diào)控序列可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體可以包括任何一個(gè)或更多個(gè)(2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)等)調(diào)控序列。一個(gè)或更多個(gè)調(diào)控元件可以在5’UTR中提供。另外，還可以提供3’UTR。關(guān)于本發(fā)明的啟動(dòng)子可以被定義為指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的控制序列。啟動(dòng)子包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的必要的核酸序列，諸如，在聚合酶II型啟動(dòng)子的情況下，TATA元件。啟動(dòng)子可以任選地包括可以位于距離轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)最多達(dá)數(shù)千堿基對(duì)的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或阻遏物元件。組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子都可以被包括用于在本發(fā)明中使用。任何組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以被使用。用于大腸桿菌中的異源基因表達(dá)的啟動(dòng)子的常見(jiàn)實(shí)例為tac、trp、lac、T7、araomp、λ噬菌體；但任何啟動(dòng)子可以被用于表達(dá)這些融合蛋白。與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子不同，組成型啟動(dòng)子在多數(shù)環(huán)境條件下起作用。許多不同的組成型啟動(dòng)子可以關(guān)于此公開(kāi)內(nèi)容的方法使用。用于在本發(fā)明中使用的優(yōu)選的啟動(dòng)子包括T7、ara和tac。本發(fā)明的核酸分子可以可操作地連接至選擇標(biāo)記。當(dāng)在遺傳構(gòu)建體中提供核酸分子時(shí)，該構(gòu)建體可以包含選擇標(biāo)記。在實(shí)施方案中，選擇標(biāo)記可以可操作地連接至核酸分子?？蛇x擇地，選擇標(biāo)記可以與核酸分子獨(dú)立地被控制，例如在單獨(dú)的啟動(dòng)子和/或其他調(diào)控元件的控制下。適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記將是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且可以包括在表達(dá)后提供可檢測(cè)的表型的任何核酸序列。通常，表達(dá)的多肽是在細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)的，優(yōu)選地不會(huì)不利地影響細(xì)胞。例如，選擇標(biāo)記可以是綠色熒光蛋白或酶，諸如當(dāng)與適當(dāng)?shù)脑噭┙佑|時(shí)生成信號(hào)的熒光素酶。其他選擇標(biāo)記包括賦予細(xì)胞在某些條件中生長(zhǎng)的選擇能力的那些，所述某些條件例如缺乏具體的營(yíng)養(yǎng)物，或在原本將對(duì)細(xì)胞有害的試劑的存在下。用于在本發(fā)明中使用的優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素和四環(huán)素抗性，但其他選擇標(biāo)記將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且可獲得的。用于在本發(fā)明中使用的適當(dāng)?shù)倪z傳構(gòu)建體包括載體，包括例如病毒載體、質(zhì)粒(環(huán)狀的或線性的)、噬菌粒(phagemid)、線性DNA。用于在本發(fā)明中使用的優(yōu)選的遺傳構(gòu)建體包括攜帶用于Omp融合蛋白的過(guò)表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的質(zhì)粒。載體可以包括一個(gè)或更多個(gè)選擇標(biāo)記(如本文定義的)、一個(gè)或更多個(gè)克隆位點(diǎn)，例如以允許與天然核酸的同源重組、一個(gè)或更多個(gè)如本文定義的調(diào)控元件和一個(gè)或更多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。當(dāng)期望時(shí)，兩個(gè)或更多個(gè)如本文定義的核酸分子可以在單個(gè)載體中提供。這些可以在單獨(dú)的調(diào)控控制下，或被可操作地連接至相同的調(diào)控元件。如本文描述的核酸序列或遺傳構(gòu)建體可以在宿主細(xì)胞中提供用于本發(fā)明的經(jīng)修飾的跨膜蛋白的表達(dá)。用于重組蛋白表達(dá)的適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括真核細(xì)胞或原核細(xì)胞，優(yōu)選后者。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且可獲得的，并且包括例如大腸桿菌、BL21、BL21AI、BLR和Rosetta-2。還可以提供包含如本文所述的遺傳構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是重組體。本發(fā)明提供了結(jié)合樣品中的組分的方法，所述方法包括：i)提供包含固定于其上的跨膜蛋白的聚合物基底，其中所述跨膜蛋白通過(guò)物理吸附被固定于所述基底上，并且其中所述跨膜蛋白錨定用于展示的異源蛋白或肽；ii)向所述基底添加樣品；iii)將所述基底與樣品保持在允許任何組分結(jié)合至所述基底的條件下。優(yōu)選地，在向基底添加樣品后，基底可以被孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段以允許任何分析物結(jié)合至基底。孵育期可以根據(jù)測(cè)定和樣品類型變化，但通?？梢詮?分鐘至24小時(shí)，更優(yōu)選地10min至1h，取決于被執(zhí)行的測(cè)定。本發(fā)明的方法可以是篩選測(cè)定，以檢測(cè)樣品中感興趣的組分的存在或不存在。在此類測(cè)定中，在檢測(cè)之前，為使測(cè)定的準(zhǔn)確性最大化，方法可以包括洗滌基底以去除任何未結(jié)合的材料的步驟。洗滌可以用任何適當(dāng)?shù)木彌_液、水或包含除垢劑或乙醇的溶液執(zhí)行，例如TBS、PBS、HEPES、TE、70％乙醇、Tween或去離子水，優(yōu)選地?zé)o菌的。結(jié)合的組分的檢測(cè)可以使用本領(lǐng)域任何適當(dāng)?shù)姆椒▓?zhí)行，例如使用對(duì)該分析物特異性的結(jié)合配偶體的結(jié)合測(cè)定。在典型的結(jié)合測(cè)定中，基底可以與對(duì)該分析物特異性的結(jié)合配偶體(例如，IgG)一起孵育。然后結(jié)合的分析物可以被直接地檢測(cè)，例如如果該分析物包含可以被測(cè)量的信號(hào)，或被間接地檢測(cè)，例如通過(guò)使用對(duì)第一結(jié)合配偶體特異性的第二結(jié)合配偶體。第二結(jié)合配偶體可以是綴合至酶或催化劑或其他標(biāo)記物諸如熒光標(biāo)簽的抗體，并且檢測(cè)可以通過(guò)與底物孵育并測(cè)量產(chǎn)生的信號(hào)的量來(lái)執(zhí)行。任何適當(dāng)?shù)男盘?hào)可以被使用，適當(dāng)?shù)男盘?hào)的許多實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并可獲得的。優(yōu)選的信號(hào)是可以在電磁光譜中檢測(cè)的那些，諸如發(fā)色團(tuán)和熒光團(tuán)，且酶底物系統(tǒng)諸如辣根過(guò)氧化物酶/TMB。其他將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在后者的情況下，該配體特異性的結(jié)合成員可以與酶結(jié)合，所述酶催化信號(hào)底物以產(chǎn)生比色輸出(colorimetricoutput)。優(yōu)選的信號(hào)是采用擴(kuò)增系統(tǒng)的那些?？梢宰饔糜诘孜镆援a(chǎn)生發(fā)色團(tuán)的酶標(biāo)簽是最優(yōu)選的，例如，辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶。適當(dāng)?shù)牡孜锇═MBABTS、OPD(對(duì)于HRP)、pNPP(對(duì)于AP)和ONPG(對(duì)于β半乳糖苷酶)。色度輸出可以視覺(jué)上測(cè)量，或通過(guò)測(cè)量光的吸光度的變化定量地測(cè)量。方法可以還包括比較生成的信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)表，以基于信號(hào)獲得分析物的量的定量值。樣品可以源自人或動(dòng)物體(例如唾液、全血、血漿、尿液、精液、糞便等)或可以是細(xì)胞裂解物或來(lái)自生產(chǎn)過(guò)程的粗提物。組分可以是任何部分，優(yōu)選地是能夠被結(jié)合配偶體結(jié)合的部分。配體的非限制性選擇包括核酸、抗原、抗體、寡核苷酸、激素、半抗原、激素受體、維生素、類固醇、代謝物、適配體、糖、肽、多肽、蛋白、糖蛋白、細(xì)胞、生物體(諸如真菌、細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物和多細(xì)胞寄生物)、治療藥物或非治療藥物、或其任何組合或片段。優(yōu)選地，組分可以是免疫活性蛋白或多肽，諸如抗原性多肽或蛋白。方法還可以被用于從樣品純化感興趣的組分。這樣的方法可以如以上關(guān)于篩選方法描述的，其中任何結(jié)合的組分而不是檢測(cè)組分可以從基底洗脫。任何結(jié)合的產(chǎn)品可以使用本領(lǐng)域已知的方法從基底被洗脫，所述方法例如鹽洗脫、由pH改變洗脫、由競(jìng)爭(zhēng)物結(jié)合洗脫。方法還可以被用于固定來(lái)自樣品的感興趣的組分，例如用于進(jìn)一步反應(yīng)，例如如本文描述的。例如，肽和/或蛋白可以包含F(xiàn)c結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如來(lái)自蛋白A、G或L)，其可以用來(lái)固定展示Fc結(jié)構(gòu)域的組分(例如，加Fc標(biāo)簽的重組蛋白)。此類固定化可以在例如結(jié)合測(cè)定、細(xì)胞培養(yǎng)等中具有多種用途。方法可以包括在聚合物基底上固定跨膜蛋白，如本文所述。優(yōu)選地，聚合物基底包含固定于其上的跨膜蛋白，其中所述跨膜蛋白通過(guò)物理吸附被固定于所述基底上，并且其中所述跨膜蛋白包含異源肽和/或蛋白?？缒さ鞍装^和足，所述頭和足被一個(gè)或更多個(gè)跨膜鏈彼此隔開(kāi)?！板^”意指，跨膜蛋白可以在該蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白，和/或在該蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白?！靶揎椧藻^定”意指，跨膜蛋白被工程化以在該蛋白的頭包含N端和/或C端，和/或在該蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。因此，跨膜蛋白可以：i)在所述蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白；ii)在所述蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白；iii)被工程化以在所述蛋白的頭包含N端和/或C端；和/或iv)被工程化以在所述蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。異源肽和/或蛋白可以在蛋白的頭的工程化N端和/或C端提供，或在蛋白的頭的工程化環(huán)中提供，用于展示。本發(fā)明還提供了介導(dǎo)錨定的肽和/或蛋白與樣品中的組分相互作用的方法，所述方法包括：i)提供包含固定于其上的跨膜蛋白的聚合物基底，其中所述跨膜蛋白通過(guò)物理吸附被固定于所述基底上，并且其中所述跨膜蛋白錨定用于展示的異源蛋白或肽；ii)向所述基底添加包含組分的樣品；iii)將所述基底與樣品保持在允許所述組分與錨定的肽和/或蛋白相互作用的條件下。優(yōu)選地，所述方法包括提供包含固定于其上的跨膜蛋白的聚合物基底，如本文描述的。樣品可以源自人或動(dòng)物體(例如唾液、全血、血漿、尿液、精液、糞便等)或可以是細(xì)胞裂解物或來(lái)自生產(chǎn)過(guò)程的粗提物，或可以是反應(yīng)混合物的細(xì)胞培養(yǎng)物。組分可以是能夠與錨定的肽或蛋白相互作用的組分。它可以是任何部分，包括例如核酸、抗原、抗體、寡核苷酸、激素、半抗原、激素受體、維生素、類固醇、代謝物、適配體、糖、肽、多肽、蛋白、糖蛋白、細(xì)胞、生物體(諸如真菌、細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物和多細(xì)胞寄生物)、治療藥物或非治療藥物、或其任何組合或片段。組分可以是免疫活性蛋白或多肽，諸如抗原性多肽或蛋白。優(yōu)選地，組分是細(xì)胞。細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如真菌細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞，或真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞。優(yōu)選地，在向基底加入樣品后，基底可以被孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段以允許肽和/或蛋白與樣品的組分的任何反應(yīng)。孵育期可以根據(jù)測(cè)定和樣品類型變化，但通常可以從5分鐘至24小時(shí)，更優(yōu)選地10min至1h，取決于被執(zhí)行的測(cè)定。當(dāng)組分是細(xì)胞時(shí)，測(cè)定可以在提供與細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞反應(yīng)中有用，例如例如提供指示細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂和/或分化，或表達(dá)特定特征或功能的肽或蛋白。例如，蛋白可以是當(dāng)基底與細(xì)胞培養(yǎng)物孵育時(shí)，與細(xì)胞表面上的受體相互作用的生長(zhǎng)因子?？蛇x擇地，肽可以包含ECM基序，其也可以與細(xì)胞表面上的受體相互作用，促進(jìn)特定細(xì)胞特征或分化。用于在細(xì)胞結(jié)合測(cè)定中使用的經(jīng)修飾的OMP蛋白的實(shí)例包括OMP153、154、162-165、167、174-179和180-192(表3和表4)。使用表面包被的基底促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分化的方法和細(xì)胞培養(yǎng)的方法是本領(lǐng)域已知的，并且它們的教導(dǎo)可以容易地應(yīng)用至在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分化的細(xì)胞培養(yǎng)的方法中使用本發(fā)明的基底(參見(jiàn)例如Helgason和Miller(Eds.)(2004)Basiccellcultureprotocols,HumanaPress,ISBN1588292843)。用于在本發(fā)明的方法中使用的細(xì)胞可以是真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。細(xì)胞可以是昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母、細(xì)菌、植物細(xì)胞、藻類和動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞。它可以是細(xì)胞系。動(dòng)物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、原代細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。方法還可以在酶測(cè)定中有用，例如當(dāng)肽和/或蛋白編碼酶或催化劑時(shí)。與樣品孵育后，錨定的酶或催化劑與樣品中的組分反應(yīng)以提供反應(yīng)產(chǎn)物。方法可以包括從基底去除樣品和純化來(lái)自其的任何反應(yīng)產(chǎn)物，或檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物的存在。方法可以被用于固定測(cè)定例如細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定中需要的肽或蛋白。如上所述，例如，肽和/或蛋白可以包含F(xiàn)c結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如來(lái)自蛋白A、G或L)，其可以用來(lái)固定展示Fc結(jié)構(gòu)域的組分(例如，加Fc標(biāo)簽的重組蛋白)。此類固定化可以在例如結(jié)合測(cè)定、細(xì)胞培養(yǎng)等中具有多種用途。本發(fā)明還提供了一種孵育物，所述孵育物包含聚合物基底、跨膜蛋白和濃度為1xCMC或低于1xCMC的除垢劑。優(yōu)選地，跨膜蛋白、基底和除垢劑是如本文描述的。孵育物反映本發(fā)明的聚合物基底或產(chǎn)品的制造中的中間物，其中聚合物基底與如本文定義的跨膜蛋白一起孵育，其中孵育中的除垢劑濃度為1xCMC或低于1xCMC。聚合物基底可以是未結(jié)合的或與變得固定于其上的跨膜蛋白部分結(jié)合。在本發(fā)明的第九方面中，提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含聚合物基底和跨膜蛋白，所述跨膜蛋白錨定、或被修飾以錨定用于展示的異源蛋白或肽?？缒さ鞍装^和足，所述頭和足被一個(gè)或更多個(gè)跨膜鏈彼此隔開(kāi)?！板^”意指，跨膜蛋白可以在該蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白，和/或在該蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白。“修飾以錨定”意指，跨膜蛋白被工程化以在該蛋白的頭包含N端和/或C端，和/或在該蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。因此，可以提供一種包含固定于其上的跨膜蛋白的聚合物基底，其中跨膜蛋白通過(guò)物理吸附被固定于聚合物基底上，并且其中所述跨膜蛋白：i)在所述蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白；ii)在所述蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白；iii)被工程化以在所述蛋白的頭包含N端和/或C端；和/或iv)被工程化以在所述蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。異源肽和/或蛋白可以在蛋白的頭的工程化N端和/或C端提供，或在蛋白的頭的工程化環(huán)中提供，用于展示。試劑盒可以另外地包含提供使得跨膜蛋白能夠物理吸附至聚合物基底的圖表、稀釋因子、稀釋劑、緩沖液、基底、免疫球蛋白和結(jié)合試劑。試劑盒可以被包裝用于供應(yīng)和運(yùn)輸。試劑盒的各組分可以被單獨(dú)地包裝并作為實(shí)施本發(fā)明的方法的試劑的組合供應(yīng)。本發(fā)明的方法還可以包括在聚合物基底上固定蛋白之前修飾如本文描述的跨膜蛋白的步驟。本發(fā)明的步驟還可以包括在塑料基底上固定經(jīng)修飾的跨膜蛋白之前，修飾編碼跨膜蛋白的核酸序列以提供如本文描述的經(jīng)修飾的跨膜蛋白的步驟，和從宿主細(xì)胞表達(dá)蛋白的步驟。本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括包含錨定、或被修飾以錨定用于展示的異源蛋白或肽的跨膜蛋白的聚合物基底?？缒さ鞍装^和足，所述頭和足被一個(gè)或更多個(gè)跨膜鏈彼此隔開(kāi)?！板^”意指，跨膜蛋白可以在該蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白，和/或在該蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白?！靶揎椧藻^定”意指，跨膜蛋白被工程化以在該蛋白的頭包含N端和/或C端，和/或在該蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。因此，可以提供一種包含固定于其上的跨膜蛋白的聚合物基底，其中跨膜蛋白通過(guò)物理吸附被固定于聚合物基底上，并且其中所述跨膜蛋白：i)在所述蛋白的頭的環(huán)中包含異源肽和/或蛋白；ii)在所述蛋白的頭的N端和/或C端包含異源肽和/或蛋白；iii)被工程化以在所述蛋白的頭包含N端和/或C端；和/或iv)被工程化以在所述蛋白的頭包含一個(gè)或更多個(gè)環(huán)。異源肽和/或蛋白可以在蛋白的頭的工程化N端和/或C端提供，或在蛋白的頭的工程化環(huán)中提供，用于展示。產(chǎn)品可以包括微孔板、組織培養(yǎng)瓶或組織培養(yǎng)板、塑料珠、纖維、網(wǎng)狀基底、醫(yī)療裝置諸如外科植入物、聚合物的微米?；蚣{米粒。提供了一種外科植入物，包括包含固定于其上的跨膜蛋白的聚合物基底，其中跨膜蛋白通過(guò)物理吸附固定于基底上，并且其中蛋白保持其天然二級(jí)結(jié)構(gòu)。實(shí)施例為了研究我們的基于β-桶的蛋白與聚合物的結(jié)合和功能，我們采取以下方法；1.用于檢測(cè)聚合物上的蛋白的免疫測(cè)定比較OMP18(融合至OmpA的SPA的兩個(gè)IgG-結(jié)合B結(jié)構(gòu)域)和天然金黃色葡萄球菌蛋白A(五個(gè)IgG-結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。在多種聚合物上檢測(cè)加FLAG標(biāo)簽的OMP蛋白用特異性抗體檢測(cè)融合至OMP支架的人HIVp24抗原并與天然抗原比較2.細(xì)胞培養(yǎng)比較與OMP0支架蛋白和包含ECM蛋白基序或在OMP支架上展示的生長(zhǎng)因子的多種構(gòu)建體的細(xì)胞附著。IgG與天然蛋白A或用β桶狀支架錨定的蛋白A結(jié)構(gòu)域的結(jié)合對(duì)于將有效作為第二獨(dú)立蛋白的錨的任何支架，當(dāng)?shù)鞍妆晃街帘砻鏁r(shí)，它必須增強(qiáng)該蛋白的功能。為了檢查β桶狀支架的此作用，使用一系列IgG-結(jié)合蛋白OMP18進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，OMP18具有融合至OMP9支架的N末端的金黃色葡萄球菌蛋白A的IgG-結(jié)合B結(jié)構(gòu)域的串聯(lián)重復(fù)。OMP9在圖1中示出，并且是金結(jié)合β桶狀蛋白，包含全部細(xì)胞外環(huán)、用于金結(jié)合的半胱氨酸殘基、環(huán)狀排列的N端和C端和截短的N端，該截短的N端在OMP18中融合至金黃色葡萄球菌蛋白A的IgG-結(jié)合B-結(jié)構(gòu)域的串聯(lián)重復(fù)。此后一結(jié)構(gòu)域結(jié)合至抗體的Fc區(qū)域，暴露抗原結(jié)合區(qū)域。OMP18可以以比吸附的或胺偶聯(lián)的蛋白A更大的效力在金生物傳感器表面捕獲IgG抗體(未公開(kāi)的數(shù)據(jù))。為了檢驗(yàn)這是否是經(jīng)由OMP支架拴系至塑料的蛋白A結(jié)構(gòu)域的情況，我們?cè)趫D4中描述的免疫測(cè)定的類型中比較OMP18與蛋白A在聚苯乙烯表面上的固定化。在此情境下，我們?cè)O(shè)想，正確定向的蛋白將比不正確定向的蛋白或變性的蛋白結(jié)合更大量的抗體，從而獲得來(lái)自免疫檢測(cè)的更強(qiáng)的信號(hào)。OMP18和蛋白A與塑料孔板的蛋白吸附使用一個(gè)疏水的24孔板(Corning)和一個(gè)“親水的”板(Corning)。OMP18(Lot15910BE16511LH)以70μg/mL(2μM)在PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)+0.25％OG(正辛基葡萄糖苷)中且天然金黃色葡萄球菌蛋白A(SigmaCat.No.P7387；Lot055K09261)以84μg/mL(2μM)在PBS+0.25％OG中。向兩個(gè)板的孔施加300μL蛋白溶液。僅用PBS+0.25％OG制備空白孔(無(wú)蛋白)。將板在室溫(RT)在振蕩平臺(tái)(振蕩器)上孵育過(guò)夜。將孔用每種蛋白包被，一式三份。免疫測(cè)定以在塑料上比較OMP18與天然蛋白A用Tris-緩沖的鹽水+0.05％(v/v)Tween20(本文中被稱作TBS-T)洗滌孔1次。注意，除非另有說(shuō)明，所有洗滌和孵育用300μL溶液進(jìn)行。向每個(gè)類型的兩個(gè)孔中加入2μg/mL的于Tris-緩沖的鹽水+0.05％(v/v)Tween20+3％(w/v)BSA(本文中被稱作TBS-TB)中的小鼠IgG(SigmaCatNo.I5381,Lot.025K7580)，并且TBS-T被加至無(wú)抗體對(duì)照孔并在RT在振蕩器上孵育1h。去除小鼠IgG溶液和TBS-T溶液，并用TBS-T洗滌孔三次。向所有孔添加在TBS-T中1/5000稀釋的兔抗-小鼠IgG-AP綴合物(SigmaCat.No.A3688,Lot.103K9157)。將各孔在室溫下在振蕩器上保持1h。去除綴合物，并用3xTBS-T洗滌孔。向每孔加入200μL(PNPP)底物并在室溫、黑暗中孵育30min。通過(guò)加入去離子水中的50μL3MNaOH溶液停止反應(yīng)。將孔的內(nèi)容物與0.75mL去離子水混合并在Shimadzu1240分光光度計(jì)中測(cè)量在405nm的吸光度。原始數(shù)據(jù)在表1中并在圖5中繪制為條形圖。表1.來(lái)自每孔的A405讀數(shù)。在PLA上使用加Flag-標(biāo)簽的OMP支架作為一種疏水聚合物，我們認(rèn)為聚乳酸(PLA)將是我們可以將其與OMP蛋白附接的材料的優(yōu)良候選物。為了評(píng)價(jià)這點(diǎn)，我們從KDalgarno教授(NewcastleUniversity)得到一些3D打印的PLA圓盤(pán)。圓盤(pán)的結(jié)構(gòu)在圖6中示出。蛋白吸附于PLA圓盤(pán)上在處理期間使用疏水的48孔板(Nunc)支持圓盤(pán)。在如之前的包含稀釋的除垢劑的PBS中將OMP0(在位置10包含半胱氨酸殘基以使得能夠與金結(jié)合的經(jīng)修飾的OmpA蛋白；(對(duì)于Omp0的序列，參見(jiàn)圖13).)(Lot.91012BE12313)和OMP5(Lot.8910BE18213)稀釋至32μM。向每個(gè)PLA圓盤(pán)加入600μL，用缺乏蛋白的相同溶液處理對(duì)照?qǐng)A盤(pán)。用封口膜(parafilm)密封48孔板并在4℃保存16小時(shí)。用滅菌的500μL去離子水(Lot.251013YD)洗滌每個(gè)PLA圓盤(pán)兩次以去除多余的未附接的蛋白。OMP5是在細(xì)胞外環(huán)1中具有FLAG表位的OmpA。FLAG表位是DYKDDDDK。OMP5的抗體檢測(cè)在TBS-T中制備M2抗-FLAG堿性磷酸酶綴合的抗體(SigmaCatNo.A9469；Lot.091M6287)的1:1000稀釋液。將經(jīng)處理的PLA圓盤(pán)轉(zhuǎn)移到新的48孔板(Nunc)并向每個(gè)PLA圓盤(pán)添加500μL稀釋的抗體。室溫下30分鐘后，去除抗體溶液，并將每個(gè)圓盤(pán)在500μLTBS-T中孵育5分鐘，重復(fù)2次。向每個(gè)PLA圓盤(pán)添加500μL1步PNPP試劑(SigmaCatNo.；Lot.NI14473612)，在室溫5分鐘后，通過(guò)加入500μL1MNaOH(Lot.)終止反應(yīng)。從包含PLA圓盤(pán)的每孔取出200μL溶液并將其轉(zhuǎn)移至96孔板。使用ThermoScientificMultiskanFC酶標(biāo)儀在405nm測(cè)量每孔的吸光度。原始數(shù)據(jù)在表2中并在圖7中繪制為條形圖。表2.每孔在405nm的吸光度。空白OmpAOMP50.4120.3120.880.3350.3611.0860.3690.3740.877OMP支架在聚酯纖維和聚苯乙烯板上展示ECM基序的用途之前已經(jīng)示出了，OMP的經(jīng)修飾的OmpA蛋白在金上組裝為定向的單層7以及向β-桶加入整聯(lián)蛋白結(jié)合基序可以改進(jìn)細(xì)胞與金表面的附接9。在此處詳述的實(shí)驗(yàn)中，檢查了這些蛋白與聚酯纖維的結(jié)合是否改進(jìn)細(xì)胞的附接。使用OMP蛋白與從靜電紡聚酯纖維制造的圓盤(pán)用具有聚乙烯核心的靜電紡聚丙烯纖維制造的圓盤(pán)從AppliedCellBiotechnologiesInc.獲得并且使用透析用OMP36包被以從蛋白溶液去除除垢劑。OMP36包含來(lái)自層粘連蛋白的YIGSR基序。一旦用蛋白處理后，用細(xì)胞接種纖維圓盤(pán)并通過(guò)顯微術(shù)估算附接的細(xì)胞的數(shù)量。蛋白處理聚合物纖維。將靜電紡的聚合物樣品與ROG-8緩沖液中的10μg/mL的5mLOMP36(Lot.22605BE23407)置于Spectra/Porrcdispodialyser(15000道爾頓分子量截留；Lot.3205922)，用無(wú)蛋白的ROG-8處理一式兩份樣品。將透析袋置于包含800mL透析緩沖液(50mMTris,0.1mMEDTA)的1升燒杯中，使用磁力攪拌器緩慢地?cái)嚢枞芤骸３ネ肝鼍彌_液并在2小時(shí)、30小時(shí)、38小時(shí)和4天更換為新鮮的緩沖液。5天后，從透析管中取出聚合物樣品并用去離子水洗滌。用細(xì)胞檢驗(yàn)靜電紡聚合物纖維在加入細(xì)胞之前，將聚合物圓盤(pán)浸泡在70％乙醇中10分鐘以將其滅菌；之后在PBS(Lot.15307SP)中快速洗滌以去除任何殘留的乙醇。用胰蛋白酶/EDTA收獲PC12神經(jīng)元細(xì)胞(傳代27次，～90％融合)并以1x106細(xì)胞/mL懸浮于RPMI1640介質(zhì)(包含10％胎牛血清)。將3ml細(xì)胞加至一式兩份的OMP36處理的聚合物圓盤(pán)和無(wú)蛋白的ROG-8處理的聚合物圓盤(pán)。細(xì)胞在濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中、在37℃、5％CO2孵育過(guò)夜。16小時(shí)后，在室溫下將圓盤(pán)在包含4％w/v多聚甲醛(BDH；Lot.K32259648)的PBS中浸泡10分鐘，之后在包含1μg/mLDAPI(Lot.50307SP)的PBS中浸泡30分鐘。使用熒光顯微鏡使細(xì)胞可視化。DAPI染色清楚地示出了每個(gè)纖維材料上的許多細(xì)胞的細(xì)胞核，但在OMP36處理的纖維上有更多的細(xì)胞。在聚苯乙烯板上吸附的OMP支架與細(xì)胞以上示出了，即使當(dāng)β桶狀分子被吸附在聚酯纖維上時(shí)，它們?nèi)阅軌蚋倪M(jìn)細(xì)胞附著。然后檢查僅通過(guò)在板上干燥蛋白是否能夠在聚苯乙烯組織培養(yǎng)多孔板上實(shí)現(xiàn)類似的效果。聚苯乙烯板的蛋白處理。與之前相同，在4℃，將6孔和12孔組織培養(yǎng)改性的(親水的)NunclonΔ板(Nunc)與OMP36在具有0.25％OG的PBS中孵育16小時(shí)。6孔板含有500μL蛋白/孔，24孔板含有300μL蛋白/孔。孵育后，用去離子水洗滌每孔兩次，然后噴灑70％乙醇以滅菌。將板放置在細(xì)胞培養(yǎng)櫥10分鐘以允許大多數(shù)乙醇蒸發(fā)，然后用無(wú)菌PBS洗滌每孔。用3T3鼠科動(dòng)物成纖維細(xì)胞檢驗(yàn)蛋白處理的板用胰蛋白酶/EDTA收獲3T3成纖維細(xì)胞(傳代147次，～70％融合)，并以5x104細(xì)胞/ml重懸于Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清)。6孔板中3個(gè)未處理的孔和3個(gè)蛋白處理的孔各自用3mL細(xì)胞接種。24孔板中4個(gè)未處理的孔和4個(gè)蛋白處理的孔各自用750μL細(xì)胞接種。將板在37℃、5％C02在濕潤(rùn)的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。孵育16小時(shí)后，丟棄每板的培養(yǎng)基，在室溫下將每個(gè)板在包含4％w/v多聚甲醛(BDH；Lot.K32259648)的PBS中浸泡30分鐘，之后在包含1μg/mLDAPI(Lot.50307SP)的PBS中浸泡10分鐘。使用熒光顯微鏡使細(xì)胞可視化，并計(jì)數(shù)每孔的自由隨機(jī)視野中的細(xì)胞的數(shù)量。數(shù)據(jù)在圖9中示出的條形圖中繪制。用OMP36處理聚苯乙烯板改進(jìn)細(xì)胞與聚苯乙烯的附著。OMP支架用于展示生長(zhǎng)因子用于細(xì)胞培養(yǎng)的用途第一細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)在于提高細(xì)胞與表面的附著，隨著蛋白技術(shù)被開(kāi)發(fā)以允許在OMP支架中插入更大的蛋白和肽，我們擴(kuò)大了我們的興趣以包括更大得多的靶諸如生長(zhǎng)因子。被選擇作為工程化的靶的前兩種生長(zhǎng)因子是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1(FGF1，酸性FGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2，堿性FGF)。此處記錄的工作包括將FGF1和FGF2附接至聚苯乙烯板并用小鼠3T3成纖維細(xì)胞檢驗(yàn)效果的實(shí)驗(yàn)。蛋白處理聚苯乙烯板在包含0.25％正辛基葡萄糖苷的Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(D-PBS，來(lái)自Sigma,Lot.090512SP)中制備500μL2μM蛋白溶液：OMP0(Lot.230511)、OMP90(FGF1；Lot.170809BE201009)和OMP128(FGF2；Lot120111BE170111)。將100μL每種蛋白溶液加至96孔聚苯乙烯板的4個(gè)孔，之后每孔加入100μLD-PBS。將96孔板包裹在封口膜中并在4℃-8℃保存過(guò)夜。16小時(shí)后，去除蛋白溶液并用100μL去離子水中的1％Triton-X-100洗滌每孔，之后用100μL去離子水洗滌兩次。將96孔板晾干，然后在塑料中密封并在4℃-8℃保存。用3T3成纖維細(xì)胞檢驗(yàn)FGF處理的板用胰蛋白酶/EDTA收獲鼠科動(dòng)物3T3成纖維細(xì)胞(傳代157次，～90％融合)，并以1x104細(xì)胞/ml重懸于Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM；包含10％胎牛血清)。12個(gè)蛋白包被的孔和4個(gè)未處理的孔各自用200μL細(xì)胞懸浮液接種。用200μL包含12.5ng/mL可溶的FGF2(R&DSystems)的細(xì)胞懸液接種另外的4個(gè)未處理的孔。將用細(xì)胞接種的板在37℃、5％CO2在濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中孵育18小時(shí)。丟棄含有未附著的細(xì)胞的培養(yǎng)基，向每孔加入100μl包含4％w/v多聚甲醛(BDH；Lot.K32259648)的D-PBS，室溫下30分鐘后，用100μL結(jié)晶紫溶液(Pro-LabDiagnostics；Lot.K12560)代替D-PBS，繼續(xù)孵育30分鐘后，丟棄染色溶液，用100μL去離子水洗滌每孔3次。使用倒置顯微鏡檢查接種有細(xì)胞的孔，每孔選擇1個(gè)隨機(jī)視野并計(jì)數(shù)所有可見(jiàn)的細(xì)胞。數(shù)據(jù)在以下圖10中示出。當(dāng)在12.5ng/mL可溶FGF2的存在下培養(yǎng)成纖維細(xì)胞時(shí)，OMP90(FGF1)和OMP128(FGF2)二者都重復(fù)觀察到的促有絲分裂作用。用OMP0(OmpA支架)處理聚苯乙烯孔對(duì)24小時(shí)后觀察的細(xì)胞的數(shù)量沒(méi)有作用。當(dāng)?shù)鞍自诮鸢坏牟Ａw玻片上自組裝為定向的蛋白單層是，OMP90和OMP128的促有絲分裂作用是相似的。β桶蛋白支架的工程化變體Leckband,D.和Langer,R.(1991)描述用于穩(wěn)定固定蛋白的方法。BiotechnolBioeng37:227–237).此處描述的研究已經(jīng)用大腸桿菌OmpA蛋白的衍生物進(jìn)行。表達(dá)克隆的構(gòu)建在每個(gè)情況中，將氨基酸的新序列回譯成DNA序列并為了在大腸桿菌中表達(dá)，進(jìn)行密碼子優(yōu)化。由外部承包商IntegratedDNATechnologies(IDT)在保密條件下且無(wú)對(duì)新的基因的目的或功能的任何知識(shí)而將DNA片段合成為盒或全基因。關(guān)于每個(gè)堿基支架類型的更多細(xì)節(jié)在以下(向前2.5.3)提供。使用在其他地方(Sambrook,J.和Russell,D.W.(2001)Molecularcloning.ALaboratoryManual.CSHLPress)詳細(xì)描述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行β桶蛋白的新的修飾的表達(dá)克隆的分子構(gòu)建。首先用限制分析鑒定正確的構(gòu)建體，并且由外部承包商BeckmanCoulterGenomics在保密條件下且無(wú)關(guān)于序列的目的或功能的任何知識(shí)而通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證。新的β桶蛋白被用作用于感興趣的其它蛋白和肽的融合體的支架，用于如以下章節(jié)所述的在塑料上固定。融合至HIVP24抗原的OMP170-型支架為了示例該技術(shù)的顯著優(yōu)勢(shì)，我們創(chuàng)造了融合至HIVP24蛋白的OMP170-型β桶蛋白的變體并且證明了明顯改進(jìn)的被抗體識(shí)別。實(shí)驗(yàn)在Book55中記錄。OMP170和OMP171是具有截短的環(huán)和截短的C端的兩種支架蛋白。它們也具有完整的半胱氨酸，使得該蛋白可以在金和塑料二者上使用。另外，OMP170在N端具有分隔融合位點(diǎn)與β桶的α螺旋間隔物——這分隔結(jié)構(gòu)域并允許更有效的重新折疊。α螺旋間隔物是不結(jié)合IgG的金黃色葡萄球菌蛋白AB結(jié)構(gòu)域的突變形式。構(gòu)建是基于由Kim等人Kim,H.K.(2010)NontoxigenicProteinAvaccineformethicillin-resistantStaphylococcusaureusinfectionsinmice.JExpMedicine207:1863-1870報(bào)道的D結(jié)構(gòu)域的突變版本。OMP171與OMP59的比對(duì)在圖11中示出，OMP59是具有α螺旋間隔物的OMP9。融合蛋白的構(gòu)建和純化將具有源自主要亞型(C、B、A、D、F、G、H、J、K、CRF01_AG和CRF03_AB)的人HIVP24蛋白共有序列的新的重組融合蛋白融合至OMP171支架蛋白(圖12)。通過(guò)回譯氨基酸序列產(chǎn)生用于融合至OMP支架的P24共有序列的編碼序列，并且為了在大腸桿菌中表達(dá)，進(jìn)行密碼子優(yōu)化。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(Sambrook,以上)將其與支架編碼序列連接。天然P24為從CapricornInc.購(gòu)買(mǎi)的重組HIVP24抗原(CatNo.HIV-007-B0646,Lot.HIV130759)。如以下所述，從包涵體純化并重新折疊OMP171和OMP173(參見(jiàn)以下一般方法)。在塑料板上固定化在PBS緩沖液中將天然P24稀釋至4μg/mL。在含有0.25％(w/v)OG的PBS中將OMP171和OMP173稀釋至2μM。將200μL稀釋的蛋白加至96-孔未處理的聚苯乙烯板(Corning#3370)和Polysorp板(Nunc#475094)的孔。允許蛋白在4℃結(jié)合過(guò)夜，并且然后用200μL高壓滅菌的去離子水(SDW)洗滌3次并立即使用。用抗-P24抗體檢測(cè)從Capricorn購(gòu)買(mǎi)兩種類型的單克隆抗-P24抗體：1.來(lái)自小鼠的抗-HIV1-P24單克隆抗體(CatNo.HIV-018-48294,Lot.HIV122936)；2.來(lái)自小鼠的抗-HIV1/2P24單克隆抗體(CatNo.HIV-018-48304,Lot.HIV111641)。1.用TBS-TB阻斷孔。30min室溫。2.在TBS-TB中將兩種抗體各自稀釋至終濃度0.5ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL。將每個(gè)濃度的200μL加至每種類型的抗原表面的3個(gè)孔。通過(guò)僅加入TBS-TB在每個(gè)表面上進(jìn)行零對(duì)照。30min室溫。3.用200μLTBS-T洗滌孔三次。4.將在TBS-TB中的200μL二級(jí)抗體，山羊抗-小鼠IgG堿性磷酸酶綴合物的1/10000稀釋液(SigmaCat.No.A3688,Lot.103K9157)加至每孔。30min室溫。5.用200μLTBS-T洗滌孔三次。6.向每孔加入100μL對(duì)硝基苯基磷酸鹽液體底物(Sigma)。于室溫15min。7.通過(guò)向每孔加入50μL3MNaOH停止反應(yīng)。8.使用酶標(biāo)儀測(cè)量A405。數(shù)據(jù)圖在圖2中示出。用聚苯乙烯板上的任一種抗體根本無(wú)法識(shí)別直接吸附至表面的天然P24抗原。在Polysorp板上，天然P24顯示出與兩種抗體的信號(hào)，但與抗-HIV1/2P24相比，抗-HIV1-P24單克隆的信號(hào)相當(dāng)微弱。作為與β桶支架的融合體展示的P24蛋白在具有兩種抗體的兩種類型的板上給出優(yōu)異的結(jié)果。與天然P24相比，結(jié)果比預(yù)期的好得多，并且不存在與支架自身(OMP171)的非特異性結(jié)合。這些數(shù)據(jù)表明，與天然P24相比，經(jīng)由β桶支架錨結(jié)合至表面的P24對(duì)抗體識(shí)別是高度有功能的，最可能歸因于正確結(jié)構(gòu)以活躍的、可接近的定向的展示。有益效果比我們預(yù)期的或認(rèn)為可能的大得多。因此，β桶支架技術(shù)滿足當(dāng)固定于表面上時(shí)保留融合配偶體的功能的重要要求和顯著改善目前現(xiàn)有技術(shù)。經(jīng)修飾的β桶支架用于展示小肽基序3-50個(gè)氨基酸的小肽基序的展示提出與較大蛋白不同的挑戰(zhàn)。它們可能不被從表面提升的足夠高，并且可能在大量蛋白中保持隱蔽且不可接近。這是一個(gè)劣勢(shì)，因?yàn)樾』蛘故镜闹饕獞?yīng)用之一是在細(xì)胞培養(yǎng)中，其中基序需要被充分地暴露以與細(xì)胞被膜的組分相互作用。為此我們?cè)O(shè)計(jì)了允許在具有親水氨基酸和半剛性PT接頭(OMP154型)的延長(zhǎng)的環(huán)上插入小基序的支架骨架。PT接頭是天然存在的氨基酸序列(Poon,D.K.Y.等人.(2006)DirectDemonstrationoftheFlexibilityoftheGlycosylatedProline-ThreonineLinkerintheCellulomonasfimiXylanaseCexthroughNMRSpectroscopicAnalysis,JBiolChem282:2091-2011)。融合蛋白的構(gòu)建和純化OMP0支架蛋白被修飾以去除4個(gè)細(xì)胞外環(huán)中的3個(gè)，基礎(chǔ)的經(jīng)修飾的支架被命名為OMP154。OMP0和OMP154之間的區(qū)別在圖14的比對(duì)中示出。編碼OMP154的基因在IDT合成并使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)操作(Sambrook,以上)克隆和驗(yàn)證并使用我們的標(biāo)準(zhǔn)方法(參見(jiàn)以下的一般方法)純化。一旦OMP154骨架支架蛋白完成，在其中進(jìn)行如表3中示出的多種插入。表3：具有在OMP154的長(zhǎng)環(huán)中展示的基序的新蛋白的列表這些蛋白通過(guò)完整編碼序列的基因合成產(chǎn)生，或通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook,以上)在pOMP154表達(dá)質(zhì)粒的環(huán)中間的克隆位點(diǎn)插入編碼感興趣的基序的小雙鏈寡核苷酸盒產(chǎn)生。蛋白如以下標(biāo)題為一般方法的部分所述的表達(dá)和純化。在聚苯乙烯上固定小肽基序如之前一樣，在包含稀釋的除垢劑溶液的PBS中制備1μM的蛋白。如之前一樣，將其加至孔板的每個(gè)孔。16小時(shí)后，用滅菌的200μL去離子水洗滌每孔兩次以去除多余的未附接的蛋白。在小肽基序處理的板上培養(yǎng)MG63細(xì)胞用70％乙醇噴灑經(jīng)蛋白處理的96孔板，并將其置于細(xì)胞培養(yǎng)中10分鐘以使乙醇蒸發(fā)。然后用D-PBS洗滌每孔以去除任何未蒸發(fā)的乙醇。MG63骨肉瘤細(xì)胞(傳代5次)生長(zhǎng)至～80％融合后，用胰蛋白酶/EDTA收獲。以1x104細(xì)胞/mL將細(xì)胞重懸于DMEM(包含10％胎牛血清)。向96孔板的每孔加入100μL細(xì)胞懸浮液，然后將板在濕潤(rùn)的細(xì)胞培養(yǎng)箱中在37℃、5％CO2孵育16小時(shí)。在經(jīng)小肽基序處理的板上培養(yǎng)的細(xì)胞的定量使用細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶以在PNPP試劑中產(chǎn)生顏色變化，用PNPP測(cè)定來(lái)提供每孔中附著的細(xì)胞的數(shù)量的半定量評(píng)價(jià)。通過(guò)在PNPP試劑緩沖液(0.1M乙酸鈉pH5+0.1％TritonX-100；Lot.220113SP)中溶解1mg/mlPNPP(SigmaLot.SLBC5466V)來(lái)制備PNPP試劑。從所有孔去除細(xì)胞培養(yǎng)基，向每孔加入100μLPNPP試劑，將96孔板裹在鋁箔中并在37℃孵育2小時(shí)。通過(guò)向每孔加入10μL1MNaOH(Lot.021111DS)停止反應(yīng)。輕輕晃動(dòng)后，從每孔轉(zhuǎn)移85μL至新的96孔板并使用ThermoFisherMultiskanFc酶標(biāo)儀測(cè)量在405nm的吸光度。結(jié)果與我們用來(lái)自不同蛋白的寬范圍的作用預(yù)測(cè)的一致，與空白孔相比，OMP154通過(guò)降低表面的疏水性并且從而使細(xì)胞更容易地附著，改進(jìn)細(xì)胞附著。用大百分比的檢測(cè)蛋白觀察到了相似的改進(jìn)水平。與OMP154相比，當(dāng)在表面OMP153、177和178上生長(zhǎng)時(shí)，MG63細(xì)胞顯示了增加的細(xì)胞附著。OMP153展示RGDS基序，RGDS基序在纖連蛋白、玻連蛋白、骨橋蛋白等中發(fā)現(xiàn)并且是與許多不同細(xì)胞類型相互作用的非常強(qiáng)的整聯(lián)蛋白結(jié)合基序。OMP177和OMP178都展示玻連蛋白基序，玻連蛋白基序是在礦化骨(mineralisedbone)中發(fā)現(xiàn)的ECM組分。結(jié)果清楚地示出，基于OMP154的蛋白以這樣的方式展示它們的工程化基序，使得它們可被細(xì)胞接近以相互作用。數(shù)種檢測(cè)的蛋白顯著地增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞系MG63的附著。融合至生長(zhǎng)因子的OMP140型支架為了示例用于展示固定于組織培養(yǎng)板上的生長(zhǎng)因子的技術(shù)的明顯優(yōu)勢(shì)，我們創(chuàng)造了融合至如表4中列出的多種生長(zhǎng)因子的OMP140-型β桶蛋白的變體。ORL140是具有截短的細(xì)胞外環(huán)和截短的C端的支架蛋白。它在C端具有his標(biāo)簽，這確保只有全長(zhǎng)表達(dá)蛋白攜帶該his標(biāo)簽并且可以通過(guò)金屬親和層析純化。這允許大蛋白諸如生長(zhǎng)因子的融合并緩解過(guò)表達(dá)大蛋白時(shí)可能發(fā)生的成熟前翻譯終止的擔(dān)心。它的半胱氨酸殘基也被去除。大多數(shù)生長(zhǎng)因子具有對(duì)于保持結(jié)構(gòu)和功能必需的多個(gè)內(nèi)部的二硫橋；存在于支架中的半胱氨酸可以干擾這些特定的二硫橋的形成，且支架的無(wú)半胱氨酸的變體緩解這一問(wèn)題。注意，除了C端His標(biāo)簽、缺乏半胱氨酸殘基和缺乏C端NQ殘基以外，OMP140與OMP171相同(參見(jiàn)圖9)。融合蛋白的構(gòu)建和純化由IDT合成OMP140編碼序列并使用標(biāo)準(zhǔn)方法(Samboork,以上)克隆至表達(dá)載體中。通過(guò)將編碼生長(zhǎng)因子的合成盒(在OMP設(shè)計(jì)并為大腸桿菌進(jìn)行密碼子優(yōu)化)連接至pOMP140中，使它們?cè)谌诤系鞍椎腘端而創(chuàng)造一系列與OMP140的新融合蛋白。目前創(chuàng)造的構(gòu)建體的列表在表4中示出。表4.生長(zhǎng)因子與OMP140的融合如3.1節(jié)所述表達(dá)并純化蛋白，但它們的重新折疊條件不同：標(biāo)準(zhǔn)重新折疊緩沖液補(bǔ)充有1mMDTT和0.4M精氨酸。一般方法蛋白純化和重新折疊通過(guò)IPTG誘導(dǎo)，OMP蛋白在1升LB選擇培養(yǎng)基中在大腸桿菌BL21菌株中作為包涵體表達(dá)。在BugBuster溶液(Novagen)中裂解細(xì)胞，并使用BugBuster使用指南中的洗滌方案富集包涵體。在HTBB緩沖液(20mMNaPO4、0.5MNaCl、20mM咪唑、8M尿素pH7.4，過(guò)濾并排氣)中溶解包涵體。在具有分部收集器的AKTAPrime系統(tǒng)上使用預(yù)編程的結(jié)合-洗滌-洗脫法——洗脫是在HTBB+250mM咪唑中的分步洗脫，用HisTrapHP柱(GEHealthcare)上的固定化金屬親和層析純化溶解的制備物。收集來(lái)自洗脫液的峰級(jí)分并用SDSPAGE確定純度。將對(duì)于感興趣的蛋白的認(rèn)為>95％同質(zhì)的級(jí)分合并并使用Vivaspin離心濃縮器濃縮至體積<1mL。通過(guò)在重新折疊緩沖液(50mM乙醇胺、0.1mMEDTA、1％OG、1mMDTT)中稀釋(以至少1于10的因子)使經(jīng)純化的蛋白重新折疊。通過(guò)在SDSPAGE上的帶移估計(jì)重新折疊的程度，并在必要時(shí)用圓二色譜學(xué)和功能測(cè)定(此處未示出)進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。SDSPAGE根據(jù)生廠商的說(shuō)明使用來(lái)自Invitrogen的NuPAGESDSPAGE凝膠、緩沖液和染色劑。除垢劑對(duì)OMP18的結(jié)合的作用為了檢驗(yàn)除垢劑的作用，我們考慮一些生物學(xué)中常用的除垢劑允許OMP蛋白結(jié)合至聚苯乙烯表面的適合性。以下表5列出了除垢劑及其性質(zhì)。為了得到除垢劑的實(shí)際的比較，我們使用CMC作為確定濃度的因子，例如22.5mM的OG被定義為1xCMC，或0.3mM的DM被定義為2xCMC等。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在大約CMC的不同濃度使用全部三種除垢劑以固定OMP186小時(shí)或24小時(shí)并進(jìn)行以上的免疫檢測(cè)。在包含2xCMC的除垢劑的PBS中制備1μM濃度的OMP18蛋白。將其以系列稀釋加至96孔板的孔中以得到每種除垢劑的2xCMC、1xCMC、0.5xCMC和0.25xCMC。在6小時(shí)后洗滌并處理一組孔，將第二組孵育24小時(shí)。洗滌并干燥后，如上所述進(jìn)行免疫測(cè)定，但使用1μg/mL的單個(gè)小鼠IgG濃度。數(shù)據(jù)在圖22中以圖形方式示出。在CMC或高于CMC的高除垢劑濃度，蛋白很少結(jié)合至表面，如來(lái)自免疫測(cè)定的低信號(hào)指出的。在所有情況中，在最低除垢劑濃度沒(méi)有觀察到沉淀。在每個(gè)情況中，與Orla蛋白孵育6-24h給出最佳結(jié)果。OMP18濃度的作用此實(shí)驗(yàn)的目的是確定OMP18濃度對(duì)表面性能的影響。它可用于對(duì)某些應(yīng)用限制表面上的蛋白的量，并且控制表面密度的能力是人們期望的。在96孔未處理的聚苯乙烯板的孔中，于PBS緩沖液中的0.125xCMC除垢劑中將OMP18稀釋至不同濃度。每孔含有200μL溶液，并將板在4℃孵育過(guò)夜。洗滌和干燥后，如上所述以1μg/mL小鼠IgG進(jìn)行免疫檢測(cè)。數(shù)據(jù)在圖23中以圖形方式示出。數(shù)據(jù)示出了，加入100nM的蛋白，表面接近飽和，以及可能通過(guò)改變蛋白濃度(和如以上所示，除垢劑濃度)控制覆蓋率。表面上的圖案布點(diǎn)使表面上的蛋白形成圖案對(duì)于多種應(yīng)用諸如陣列、細(xì)胞培養(yǎng)、藥物研發(fā)等等將是有用的。本文描述的方法應(yīng)服從于打印和形成圖案。將10μLOMP9(對(duì)照蛋白)和OMP18(OMP9支架上的IgG-結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的斑點(diǎn)用移液管吸取至6孔聚苯乙烯板的底部并在室溫、可調(diào)濕度室(himiditychamber)中吸附過(guò)夜(在這些條件下，斑點(diǎn)不干燥過(guò)夜)。每斑點(diǎn)中，0.4xCMC的除垢劑中的蛋白的終濃度為5μM。將孔用2mLTBS-T洗滌2次并用水洗滌一次并干燥。用2mLTBS-T+3％BSA阻斷1h。然后向每孔加入1mL0μg/mL、0.1μg/mL或1μg/mL的于TBS-T+3％BSA中的小鼠IgG并孵育15min。用2mLTBS-T洗滌3次后，加入1mL抗-小鼠IgG-AP綴合物1/10000稀釋物并在RT孵育15min。將孔用2mLTBS-T洗滌3次并用水洗滌一次。加入BCIP/NBT底物(0.5mL)并在RT孵育15min。通過(guò)用2mL水洗滌3次停止反應(yīng)，并將孔干燥。板的掃描在圖25中示出。陰影表示蛋白被結(jié)合的區(qū)域。這些與放置斑點(diǎn)的位置一致。在此情況中，10μL溶液展開(kāi)為斑點(diǎn)，平均直徑為5.5mm。此斑點(diǎn)尺寸對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用將是有益的。應(yīng)該可能通過(guò)使用更小體積的更高濃度的蛋白產(chǎn)生更小的斑點(diǎn)。注意，一般存在多克隆抗體與OMP9的一些交叉反應(yīng)性。這些數(shù)據(jù)表明，用于在表面固定OMP蛋白的方法應(yīng)當(dāng)能服從于更精確且復(fù)雜的圖案化和蝕刻技術(shù)。用Omp蛋白使聚苯乙烯珠官能化我們已經(jīng)證明了塑料平面上的OMP蛋白的改進(jìn)的功能，并且需要驗(yàn)證這些功能上的優(yōu)勢(shì)和改進(jìn)能否在對(duì)于許多應(yīng)用諸如生物加工中重要的顆粒和珠上重現(xiàn)。為了示例這一點(diǎn)，我們用OMP85蛋白(融合至Omp支架的蛋白G結(jié)構(gòu)域)或天然形式的葡萄球菌蛋白A包被聚苯乙烯珠，并試圖使用經(jīng)包被的珠作為捕獲試劑從人血清純化IgG。從PolysciencesInc.獲得1μm直徑的polybead。在20mLPBS+0.01％SDS中制備0.5gpolybead的懸浮液以得到包含2.5％固體即4.55x1010顆粒/mL的制備物。在終體積為2mL、包含1mL的2.5％polybead、0.5mg蛋白和濃度為0.125xCMC的十二烷基麥芽糖苷(DM)的PBS中進(jìn)行蛋白A或OMP85與polybead的結(jié)合。通過(guò)混合1mLpolybead和1mLPBS制備另外的“未處理”的樣品。完全混合后，將它們?nèi)恐糜?℃過(guò)夜。離心polybead，并通過(guò)在1mLTBS-T中重新懸浮并離心洗滌3次。然后，將每種沉淀重新懸浮于0.5mLTBST并加入0.5mL人血清并在室溫孵育10min。離心polybead并用1mLTBS-T洗滌沉淀4次。保留上清液用于在SDSPAGE上分析。通過(guò)將經(jīng)洗滌的沉淀重新懸浮于1mL50mM乙酸鈉pH2.5之后立即離心并用50μL3MNaOH中和上清液來(lái)洗脫結(jié)合的IgG。如圖26中所示，在SDSPAGE上分析樣品。來(lái)自polybead實(shí)驗(yàn)的樣品的SDSPAGE分析。將5μL人血清裝載在泳道1，所有其他泳道裝載1mL樣品的20μL。HSA是人血清白蛋白。VH是～50kDa的IgG的重鏈，且VL是～25kDa的輕鏈。樣品在具有1mMDTT的SDS上樣染料中并在95℃加熱5min。來(lái)自未處理的珠的洗脫液中不存在IgG，而OMP85處理的珠在洗脫液中包含經(jīng)純化的IgG。蛋白A處理的珠也具有經(jīng)純化的IgG，但量如此小以至于它們?cè)谝陨鲜境龅哪z掃描中不可見(jiàn)。這清楚地證明了，OMP85可以結(jié)合至polybead并且對(duì)于IgG結(jié)合是高度有功能的。蛋白包被的表面對(duì)用多種試劑洗滌的持久性為了檢查用經(jīng)修飾的Omp蛋白包被的表面的持久性，我們檢驗(yàn)了經(jīng)包被的表面對(duì)經(jīng)常使用的洗滌劑和清潔劑的回復(fù)性。使用標(biāo)準(zhǔn)方案用omp蛋白包被孔板，然后用清潔劑洗滌，之后如前述的免疫檢測(cè)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，用不同濃度的SDS洗滌OMP203包被的孔，然后用綴合至堿性磷酸酶的抗-FLAG單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果示于圖27中。用SDW洗滌0％SDS孔。全部洗滌以一式三份進(jìn)行，且以3個(gè)孔的平均數(shù)示出數(shù)據(jù)。存在大于3個(gè)A405單位的非常高的讀數(shù)，因?yàn)樵试S與PNPP底物溶液的反應(yīng)進(jìn)行15min。結(jié)論：SDS不除去大量蛋白，表明一旦蛋白與塑料表面附接，它們不被強(qiáng)除垢劑取代。在用OMP203和OMP18包被的孔上進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)，但此次使用不同濃度的Tween20。數(shù)據(jù)在圖28中示出。再次，蛋白證明了對(duì)用Tween20洗滌的回復(fù)性。由于大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)ELISA方案需要多次除垢劑洗滌，檢驗(yàn)1-7個(gè)洗滌循環(huán)的作用。用包含除垢劑的溶液以不同洗滌次數(shù)洗滌OMP203包被的孔(Book59p44,p55)。用水(SDW)洗滌一組的三個(gè)孔，而用除垢劑以最高達(dá)7次洗滌其他孔。數(shù)據(jù)示于圖29中。還檢驗(yàn)了各種各樣的其他洗滌條件。用OMP18或OMP203包被板。此次在用水洗滌前，將孔與檢驗(yàn)洗滌溶液在RT孵育15min，并如上所述完成檢測(cè)測(cè)定。注意，OMP18測(cè)定要求結(jié)合小鼠IgG后，用抗-小鼠AP綴合物檢測(cè)。結(jié)果示于圖30中。來(lái)自用多種試劑洗滌后的免疫測(cè)定的數(shù)據(jù)在X軸上示出。DMSO是二甲基亞砜；Arg–精氨酸；OG–辛基葡萄糖苷；EDTA是乙二胺四乙酸；使用HellmanexTMII。注意，僅用水洗滌未處理的孔。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)是來(lái)自3個(gè)孔的讀數(shù)的平均值。檢測(cè)的洗滌條件都不能從表面除去顯著量的蛋白。此數(shù)據(jù)證明了結(jié)合至聚苯乙烯的OMP蛋白在面對(duì)使用苛刻的試劑諸如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、離液劑(chaotroph)諸如尿素和精氨酸以及常見(jiàn)除垢劑和溶劑洗滌時(shí)的回復(fù)性。OMP蛋白與聚苯乙烯的結(jié)合非常穩(wěn)健并且難以取代。為了檢驗(yàn)長(zhǎng)期暴露于洗滌劑的作用，將用OMP203包被的板與洗滌劑孵育過(guò)夜并通過(guò)使用抗-FLAG-AP綴合物的免疫測(cè)定分析。數(shù)據(jù)示于圖31中。讀數(shù)又非常高并且高于酶標(biāo)儀的飽和限值。但是，與之前的數(shù)據(jù)相比，在孔之間存在更大的變異程度，并且3MNaOH浸泡具有明顯地降低的信號(hào)，表明3MNaOH浸泡已經(jīng)去除或破壞表面結(jié)合的蛋白。然而，表面結(jié)合的OMP203蛋白證明了對(duì)包括苛刻的洗滌緩沖液諸如純HellmanexII、6MGuHCl、8M尿素、1％TritonX100的所有其他試劑中浸泡過(guò)夜的非凡的回復(fù)性。細(xì)胞與Orla蛋白包被的聚苯乙烯的增強(qiáng)的附著使用我們的標(biāo)準(zhǔn)方案，用展示多種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)源的基序的OMP蛋白(參見(jiàn)下頁(yè)的表)包被Sarstedt疏水96孔板的孔，一式三份。用70％乙醇噴灑板并將其置于細(xì)胞培養(yǎng)櫥柜，10分鐘后丟棄殘留的乙醇，并用200μLDulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水洗滌每孔。使用胰蛋白酶從75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶收獲MG63人骨肉瘤細(xì)胞，并將其接種至蛋白包被的孔上，向每孔加入包含1x104細(xì)胞/mL的200μL細(xì)胞懸浮液。在濕潤(rùn)的細(xì)胞培養(yǎng)箱中在37℃孵育細(xì)胞過(guò)夜。蛋白基序氨基酸數(shù)量基序的來(lái)源OMP154對(duì)照蛋白0N/AOMP153RGDS4纖連蛋白OMP162IKVAV5層粘連蛋白α1OMP164PHSRN5纖連蛋白OMP203可變(CS3)結(jié)構(gòu)域110纖連蛋白表6：用MG63細(xì)胞檢驗(yàn)的蛋白的細(xì)節(jié)，所有蛋白是基于OMP154蛋白，在相同的延長(zhǎng)的環(huán)中具有不同大小的插入。孵育16小時(shí)后，使用酸性磷酸酶測(cè)定評(píng)估每孔中附著的細(xì)胞的數(shù)量。在此測(cè)定中，用包含除垢劑的酸性緩沖液破壞細(xì)胞。這暴露細(xì)胞內(nèi)的酸性磷酸酶，該酶將無(wú)色的磷酸對(duì)硝基苯酯(Pnpp)轉(zhuǎn)化成黃色的化合物對(duì)硝基苯酚?？字懈嗟募?xì)胞將引起Pnpp向?qū)ο趸椒拥霓D(zhuǎn)化的增加，這可以容易地通過(guò)測(cè)量在405nm的光的吸光度檢測(cè)。從每孔去除培養(yǎng)基，并向每孔加入包含0.1％TritonX-100和1mg/mLPnpp的100μL0.1M乙酸鈉pH5。將板包裹在鋁箔中并在37℃孵育2小時(shí)。通過(guò)向每孔加入10μL1MNaOH停止反應(yīng)。從每孔轉(zhuǎn)移85μL溶液至新的96孔板并使用酶標(biāo)儀測(cè)量在405nm的吸光度(Book58pp10-25)。圖32示出了在用展示多種ECM基序的Orla蛋白包被的聚苯乙烯上培養(yǎng)MG63細(xì)胞的結(jié)果。結(jié)論：與用對(duì)照OMP154蛋白包被的孔相比，展示不同大小和來(lái)自不同ECM蛋白的ECM基序的OMP蛋白能夠增加附著的MG63細(xì)胞的數(shù)量。3D聚苯乙烯的蛋白官能化用于聚苯乙烯板的標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯包被方案可以適應(yīng)于蛋白包被其他聚苯乙烯材料諸如3D細(xì)胞培養(yǎng)材料Alvetex，Alvetex是ReinnervateLtd.的商標(biāo)(參見(jiàn)圖33)。使用的蛋白濃度從1.6μM升高至15μM，以適應(yīng)Alvetex的增加的表面積(Book52pp137-141)。用對(duì)照OmpA蛋白處理Alvetex的3個(gè)樣品，用IgG結(jié)合蛋白OMP85處理3個(gè)樣品。用2mL包含0.05％Tween20的Tris緩沖鹽水(TBS-T)洗滌經(jīng)處理的樣品2次。在TBS-T中將堿性磷酸酶綴合的抗-小鼠IgG1:10,000稀釋，向每個(gè)Alvetex樣品加入500μL稀釋的抗體并在室溫孵育1小時(shí)。用500μLTBS-T洗滌每個(gè)樣品2次后，加入600μL磷酸對(duì)硝基苯酯(Pnpp)試劑。10分鐘后，從每孔去除1mLPnpp試劑，用分光光度計(jì)在405nm測(cè)量吸光度。圖34：在經(jīng)OMP蛋白處理的3D聚苯乙烯上檢測(cè)堿性磷酸酶綴合的IgG。結(jié)論：與用對(duì)照OmpA蛋白包被的表面相比，用OMP85處理3D聚苯乙烯增加IgG的結(jié)合。OMP蛋白可被用于使許多不同格式的聚苯乙烯官能化；2D板和瓶、珠和3D結(jié)構(gòu)。與聚(乳酸)的蛋白附接至今，大多數(shù)研究已經(jīng)檢查了在聚苯乙烯的多種格式上使用ompA蛋白。用于蛋白附接的相同方法可被用于蛋白包被其他材料諸如聚乳酸(PLA)。在此實(shí)例中，使用用于聚苯乙烯的相同稀釋法(Book58pp28-53)將OMP5(展示FLAG表位的ompA)固定于3D打印的PLA3mmx8mm支架上。圖6示出了3D打印的2mmx8mmPLA圓盤(pán)的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。用OMP5(經(jīng)修飾以展示FLAG表位的ompA)處理18個(gè)PLA圓盤(pán)，F(xiàn)LAG表位可以使用抗-FLAG抗體容易地檢測(cè)。制備OMP5的32μM溶液，向每個(gè)PLA圓盤(pán)加入37.5μL蛋白和562.5μL磷酸鹽緩沖鹽水。將圓盤(pán)在4℃-8℃孵育過(guò)夜，在第二天用500μL無(wú)菌去離子水洗滌圓盤(pán)3次。將圓盤(pán)分成6組，每組3個(gè)圓盤(pán)，將每組在37℃在TritonX-100的1％溶液中浸泡不同天數(shù)?！の从肨ritonX-100處理·在1％TritonX-100中浸泡1天·在1％TritonX-100中浸泡2天·在1％TritonX-100中浸泡3天·在1％TritonX-100中浸泡4天·在1％TritonX-100中浸泡7天在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從所有樣品中去除并置換1％TritonX-100溶液，以防止從樣品去除的任何蛋白重新附接。在最后時(shí)間點(diǎn)，用500μLTBS-T洗滌全部圓盤(pán)然后在包含1μL/mLM2堿性磷酸酶綴合的抗-FLAGIgG的500μL中在室溫孵育30分鐘。用500μLTBS-T洗滌每個(gè)圓盤(pán)3次，然后轉(zhuǎn)移至新的48孔板。向每個(gè)圓盤(pán)加入500μLPnpp試劑，在室溫下10分鐘后，通過(guò)加入500μL1MNaOH終止反應(yīng)。從每個(gè)圓盤(pán)取出200μLPnpp試劑并置于96孔板中，使用酶標(biāo)儀測(cè)量所有樣品在405nm的吸光度。圖35示出了在1％tritonX-100中浸沒(méi)數(shù)天后的PLA上的OMP蛋白的抗體檢測(cè)。結(jié)論：用OMP5處理PLA增加M2抗-FLAG抗體與PLA的結(jié)合。將OMP5處理的PLA在1％tritonX-100中浸泡1天減少M(fèi)2抗-FLAG抗體與PLA的結(jié)合。將PLA在1％tritonX-100中浸泡更長(zhǎng)時(shí)間不進(jìn)一步減少抗體的結(jié)合。蛋白的預(yù)稀釋用于將omp支架結(jié)合至塑料表面的方法依賴于除垢劑的稀釋。標(biāo)準(zhǔn)方案要求在原處稀釋，即先向表面加入稀釋劑，然后向稀釋劑加入蛋白溶液。對(duì)于一些技術(shù)諸如微滴或納米滴圖案化而言，此兩步法難以精確實(shí)現(xiàn)。在此情況下，將需要在外部預(yù)稀釋并以單個(gè)液滴應(yīng)用至表面。我們知道，變性的omp蛋白不能夠直接稀釋于不含除垢劑的緩沖液中，因?yàn)樗鼈兂恋聿娜芤褐形龀?。但是，稀釋保存于除垢劑中的重新折疊的蛋白的作用是未知的。進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)預(yù)稀釋和短期保存的作用。a)動(dòng)態(tài)光散射在含有2xCMC(0.3mM)的DM(十二烷基麥芽糖苷)的PBS中制備蛋白o(hù)mp208的0.1mg/mL溶液。在MalvernZetasizer-納米儀器上通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量確定此溶液中的蛋白的平均粒徑為7.9nm(±0.9nm)。然后在包含PBS的比色皿(cuvette)中制備2mg/mL的omp208溶液的20x稀釋液，并且在1h期間監(jiān)測(cè)平均粒徑。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次，并且在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)讀取3個(gè)讀數(shù)。數(shù)據(jù)在圖36中示出。圖36示出了來(lái)自動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。圖示出了在1小時(shí)的期間內(nèi)平均粒徑的變化。數(shù)據(jù)示出了，在稀釋后，粒徑從～8nm增加至45-55nm，但之后在此水平穩(wěn)定1h。這些數(shù)據(jù)表明，在稀釋后立即出現(xiàn)一些聚集，但聚集物處于45-55nm的穩(wěn)定狀態(tài)持續(xù)至少1h。b)預(yù)稀釋后的免疫測(cè)定我們檢驗(yàn)了預(yù)稀釋是否影響omp蛋白與塑料表面的物理吸附。制備omp203的稀釋液：2μMomp203，PBS中0.1xCMC的DM。稀釋后立刻將200μL該溶液加至96孔未處理的聚苯乙烯板中的3個(gè)孔(時(shí)間0)。然后，以最長(zhǎng)至6h的每小時(shí)間隔，從預(yù)稀釋的溶液中取200μL樣品并加至同一板上的孔，每次一式三份。在6h，還準(zhǔn)備一組對(duì)照孔，其中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作將蛋白在孔中直接稀釋(在圖38的圖中這作為-1樣品繪圖)。圖37示出了預(yù)稀釋后omp203檢測(cè)的免疫測(cè)定的結(jié)果。數(shù)據(jù)示出了，預(yù)稀釋后蛋白結(jié)合塑料的能力在至少6h內(nèi)保持不受損害。表7：遍及本說(shuō)明書(shū)的描述和權(quán)利要求，詞語(yǔ)“包括”和“包含”和它們的變化形式意指“包括但不限于”，并且它們不預(yù)期(并且不)排除其他部分、添加劑、組分、整數(shù)或步驟。貫穿本說(shuō)明書(shū)的描述和權(quán)利要求書(shū)，單數(shù)包括復(fù)數(shù)，除非上下文另有要求。特別是，當(dāng)使用不定冠詞時(shí)，本說(shuō)明書(shū)應(yīng)理解為考慮復(fù)數(shù)以及單數(shù)，除非上下文另有要求。應(yīng)理解，結(jié)合本發(fā)明的特定方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├枋龅奶卣?、整?shù)、特性、化合物、化學(xué)部分或基團(tuán)適用于本文描述的任何其他方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├?，除非與其不相容。本說(shuō)明書(shū)(包括任何附隨的權(quán)利要求書(shū)、摘要和附圖)中公開(kāi)的所有特征、和/或這樣公開(kāi)的任何方法或過(guò)程的所有步驟可以以任何組合被組合，除了其中這樣的特征和/或步驟中的至少一些是互相排斥的組合。本發(fā)明不受任何前述實(shí)施方案的細(xì)節(jié)的限制。本發(fā)明延伸至本說(shuō)明書(shū)(包括任何附隨的權(quán)利要求書(shū)、摘要和附圖)中公開(kāi)的特征的任何新穎的一個(gè)或任何新穎的組合，或延伸至這樣公開(kāi)的任何方法或過(guò)程的步驟的任何新穎的一個(gè)或任何新穎的組合。讀者的注意力關(guān)注到當(dāng)前與本說(shuō)明書(shū)一起遞交或在本說(shuō)明書(shū)之前遞交的與本申請(qǐng)有關(guān)的并且隨本說(shuō)明書(shū)公開(kāi)供公眾查閱的所有論文和文件，并且所有這樣的論文和文件的內(nèi)容通過(guò)引用被并入本文。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3