本發(fā)明涉及顆粒文庫，所述文庫展示多種不同T細胞受體(TCR)，其中多種TCR基本由包含α鏈和β鏈的TCR組成，所述α鏈包含來自天然庫的α鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述β鏈包含來自天然庫的β鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中α鏈可變結(jié)構(gòu)域包含TRAV12-2或TRAV21基因產(chǎn)物，并且β鏈可變結(jié)構(gòu)域包含TRBV6基因產(chǎn)物。背景T細胞受體(TCR)介導T細胞識別特異性主要組織相容性復合物(MHC)-限制型的肽抗原并且對于免疫系統(tǒng)的細胞臂的功能而言是必要的。TCR僅以膜結(jié)合的形式存在，并且因此，TCR在歷史上非常難以分離。大多數(shù)TCR由2條二硫鍵連接的多肽鏈，α鏈和β鏈組成。本文使用國際免疫遺傳學(IMGT)TCR命名描述TCR并且連接到TCR序列的IMGT公共數(shù)據(jù)庫。天然α-β異二聚體TCR具有α鏈和β鏈。廣泛地，各鏈包含可變、連接和恒定區(qū)，并且β鏈通常含有可變區(qū)和連接區(qū)之間的短多變區(qū)，但是該多變區(qū)通常被認為是連接區(qū)的部分。各可變區(qū)包含包埋在框架序列中的3個高變CDR(互補決定區(qū))；CDR3被認為是抗原識別的主要介導物。存在幾種類型的α鏈可變區(qū)(Vα)和幾種類型的β鏈可變區(qū)(Vβ)，它們通過它們的構(gòu)架、CDR1和CDR2序列，以及通過部分限定的CDR3序列區(qū)分。Vα型在IMGT命名中由獨特的TRAV數(shù)指代。因此，“TRAV21”定義具有獨特構(gòu)架和CDR1以及CDR2序列和CDR3序列的TCRVα，該CDR3部分被氨基酸序列限定，該氨基酸序列在TCR之間保守，但是其也包含TCR之間變化的氨基酸序列。以相同的方式，“TRBV6-5”定義了具有獨特的構(gòu)架與CDR1和CDR2序列，但是僅僅有部分定義的CDR3序列的TCRVβ區(qū)。出于本申請的目的，我們使用在α和β基因座內(nèi)分別有54種功能性α可變基因和67種功能性β可變基因的一般假設(shè)。然而，由于功能限定或重復，這一數(shù)字可隨著研究過程變化并且可能認為α和β可變基因的數(shù)量與現(xiàn)在的不同。因此，為了清楚起見，我們一致指在IMGT網(wǎng)站www.imgt.org(2013年3月10日獲得)上發(fā)現(xiàn)的國際免疫遺傳學(IMGT)TCR命名。類似地，TCR的連接區(qū)由獨特IMGTTRAJ和TRBJ命名所定義，并且恒定區(qū)由IMGTTRAC和TRBC命名所定義。β鏈多變區(qū)在IMGT命名中以縮寫TRBD提及并且如上所述，級聯(lián)的TRBD/TRBJ區(qū)通常一起被認為是連接區(qū)。編碼TCRα和β鏈的基因集合位于不同的染色體上并且含有分離的V、(D)、J和C基因區(qū)段，其通過在T細胞發(fā)育期間重排而匯聚在一起。由于在54個TCRα可變基因和61個αJ基因之間或者67個β可變基因、2個βD基因和13個βJ基因之間出現(xiàn)的大量潛在重組事件，這導致T細胞α和β鏈非常高的多樣性。重組過程并不精確并且在CDR3區(qū)內(nèi)引入另外的多樣性。各α和β可變區(qū)也可含有等位基因變體，在IMGT命名中分別稱為TRAVxx*01和*02，或TRBVx-x*01和*02，因此進一步增加的變化形式的量。通過相同的方式，TRBJ序列中的一些具有2種已知變化形式。(請注意沒有限定符“*”表示相關(guān)序列僅已知一種等位基因)。已經(jīng)估計通過重組和胸腺選擇產(chǎn)生的人TCR的天然庫包含由CDR3多樣性所確定(Arstila,T.P.等，(1999)Science,286(5441),958-61)的大約106種獨特β鏈序列，并且甚至可能更高(Robins,H.S.等，(2009)Blood,114(9),4099-4107)。估計各β鏈與至少25種不同的α鏈配對，因此生成另外的多態(tài)性(Arstila,T.P.等，(1999)Science,286(5441),958-61)。在本申請的說明書和權(quán)利要求中，術(shù)語“TCRα可變結(jié)構(gòu)域”因此是指TRAV和TRAJ區(qū)的級聯(lián)，僅TRAV區(qū)，或僅TRAV和部分TRAJ區(qū)，并且術(shù)語TCRα恒定結(jié)構(gòu)域是指胞外TRAC區(qū)或者是指C-末端截短的TRAC序列。類似地，術(shù)語“TCRβ可變結(jié)構(gòu)域”可指TRBV和TRBD/TRBJ區(qū)的級聯(lián)，僅TRBV和TRBD區(qū)，僅TRBV和TRBJ區(qū)，或僅TRBV和部分TRBD和/或TRBJ區(qū)，并且術(shù)語TCRβ恒定結(jié)構(gòu)域是指胞外TRBC區(qū)或者是指C-末端截短的TRBC序列。由IMGT命名定義的獨特序列是TCR領(lǐng)域工作人員廣泛熟知并可得的。例如，可在IMGT公共數(shù)據(jù)庫中檢索到它們?！禩細胞受體資料手冊》(TcellReceptorFactsbook)，(2001)LeFranc和LeFranc，學術(shù)出版社(AcademicPress)，ISBN0-12-441352-8也公開了由IMGT命名定義的序列，但是由于其出版日期和隨后的時間延遲，其中的信息有時需要通過參考IMGT數(shù)據(jù)庫來確認。長期需要鑒定基本由特異性結(jié)合至特定抗原的天然α和β鏈序列組成的TCR，使得能夠開發(fā)出例如該TCR或其可溶性類似物以提供潛在治療的基礎(chǔ)。由鑒定的TCR識別的抗原可與疾病，如癌癥、病毒感染、自身免疫疾病、寄生蟲感染和細菌感染相關(guān)。因此，這類療法可用于治療所述疾病。此外，一旦已經(jīng)鑒定到天然或自然TCR并確定其序列，可根據(jù)需要引入導致親和性或半衰期增加的突變，如WO2012/013913中所述的那樣。傳統(tǒng)上，鑒定特異性結(jié)合至疾病相關(guān)抗原，如癌癥、病毒、自身免疫或細菌抗原的TCR的嘗試局限于使用從志愿者供體獲取的血液樣品?？墒褂眠@類樣品來分離T細胞及其結(jié)合疾病相關(guān)抗原的相應(yīng)TCR。這種方法一般需要至少20個供體。過程漫長且費力，并且無法保證鑒定到抗原結(jié)合T細胞受體。在鑒定到功能性T細胞受體的情況中，它們通常在體外對抗原有弱親和性，低特異性，和/或不恰當折疊。能夠分泌的T細胞的多樣性局限于供體內(nèi)的T細胞多樣性。一些疾病相關(guān)抗原，包括大多數(shù)的癌癥抗原是自身抗原；因為胸腺選擇去除了識別自身抗原的TCR，針對疾病相關(guān)抗原有特異性的TCR可能在供體的天然庫中不存在，或者可能對抗原有弱親和性。設(shè)計新的文庫來分離具有抗原結(jié)合特異性的新TCR的嘗試已經(jīng)持續(xù)多年。產(chǎn)生TCR文庫遠遠難于相當?shù)目贵w文庫，因為TCR鏈較不穩(wěn)定并且通常不正確展示。構(gòu)建TCR文庫所涉及的復雜性是巨大的。優(yōu)選在CDR3長度上保留變化(如天然庫中發(fā)現(xiàn)的那樣)。任何文庫的大量部分一般由于終止密碼子、移碼、折疊問題和僅僅不能結(jié)合HLA復合物的TCR鏈組合而丟失?？紤]到大量的可變α和可變β基因，以及J和D基因，產(chǎn)生并鑒定一起形成以需要的特異性結(jié)合至抗原肽的TCR的功能性折疊的α鏈和功能性折疊的β的幾率是極低的。在構(gòu)建文庫上已經(jīng)進行了多種嘗試。本文下文中首先描述的是基于合成TCR文庫；即，文庫中的TCR含有突變，一般在CDR內(nèi)，其已經(jīng)在體外使用隨機突變導入。因此，在這些文庫中含有的任意單獨TCR鏈的序列可能不對應(yīng)于天然庫中發(fā)現(xiàn)的任意。由于在合成文庫中僅存在某些突變，整個文庫將不對應(yīng)于天然庫。在之前公開的合成文庫中，向單個已知TCR的α和β鏈的CDR區(qū)中導入隨機突變，使得文庫中的所有TCR都含有相同的α和β框架序列，但有隨機生成的CDR序列。對文庫的進一步分析證明，鑒定抗原特異性TCR是不成功的。具體地，由于多種原因，發(fā)現(xiàn)很大比例的TCR鏈是非功能性的：在許多情況中，序列是截短的或含有移碼。在其他情況中，雖然鑒定到全長TCR鏈，但它們不能正確折疊；最后，當經(jīng)過進一步測試時，從文庫中分離的TCR不能特異性結(jié)合至抗原。這些合成文庫中的非天然多樣性被認為是文庫不成功一個原因。引入非天然突變可能干擾了適當?shù)腡CR功能。此外，與天然TCR庫相比，CDR3中引入的多樣性可能受到限制。如天然庫中CDR3序列長度所示，在T細胞中的TCR組裝期間，生成了CDR3序列中的巨大多樣性?；谠谔囟ㄎ恢蒙贤蛔兊奈膸?，CDR3序列的多樣性可能受到非常多的限制，尤其是對于CDR3序列長度。最后，合成TCR序列將不會經(jīng)過在體內(nèi)發(fā)生的胸腺選擇過程。這些原因在一定程度上解釋了(不受理論限制)為何構(gòu)建下述的希望從中鑒定到特異性結(jié)合TCR的文庫的嘗試是不成功的。WO2005/116646描述了一種基于已知(天然)TCR的文庫，其中6個CDR經(jīng)單獨或組合突變，即文庫中的所有TCR是合成的，但是基于天然鑒定的TCR框架區(qū)。WO2005/114215還涉及從這種文庫中獲得的產(chǎn)物。用多種其他抗原篩選文庫(除了原始TCR結(jié)合的抗原以外)。然而，這導致僅分離一條復制性全長TCR序列。在其他實驗中，發(fā)現(xiàn)這種TCR是交叉反應(yīng)性的。因此，已經(jīng)構(gòu)建了基于體外-突變的TCR的文庫，但還不能分離具有抗原結(jié)合特異性的新TCR。已經(jīng)構(gòu)建了基于完整天然庫的文庫(其中天然衍生的α和β鏈隨機混合，如下所述)，但是沒有成功鑒定特異性結(jié)合抗原的任何TCR。具體地，WO2005/116074描述了核蛋白文庫，其各自在其表面上展示包含天然TCRα可變結(jié)構(gòu)域序列和天然TCRβ可變結(jié)構(gòu)域序列的多肽。該公開中所述的文庫從多個α和β鏈構(gòu)建；在用于生成文庫的cDNA從中擴增的mRNA集合中代表了43個Vα類基因和37個Vβ類基因。該文獻顯示3輪噬菌體展示導致分離與測試的肽結(jié)合的克隆。這些克隆描述為在ELISA篩選期間鑒定，如通過強ELISA信號所確定。然而，當測試這些克隆結(jié)合替代的肽-HLA時也觀察到強ELISA信號；因此，TCR克隆對肽無特異性。對該文庫的進一步分析顯示與上述合成文庫類似的問題，其中它們含有大比例的非復制性TCR鏈以及不能正確折疊的TCR。本文所述的文庫因此不能用于鑒定新的抗原結(jié)合TCR。因此，需要能夠更可靠地鑒定包含天然α鏈可變結(jié)構(gòu)域和天然β鏈可變結(jié)構(gòu)域的功能性TCR的TCR文庫，其文庫可使用多種肽抗原篩選以鑒定這類有用的TCR。然后，鑒定的TCR可以其天然親和性使用，或者可用于，例如噬菌體展示突變，以增強親和性。因此，本發(fā)明在第一方面提供了顆粒文庫，所述文庫展示多種不同T細胞受體(TCR)，其中多種TCR基本由包含α鏈和β鏈的TCR組成，所述α鏈包含來自天然庫的α鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述β鏈包含來自天然庫的β鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中α鏈可變結(jié)構(gòu)域包含TRAV12-2和/或TRAV21基因產(chǎn)物，并且β鏈可變結(jié)構(gòu)域包含TRBV6基因產(chǎn)物?？勺兘Y(jié)構(gòu)域如上所述，即，它們也可分別包含完整或部分TRAJ或TRBD和/或TRBJ區(qū)。本發(fā)明在第二方面還提供了顆粒文庫，所述文庫展示多種不同TCR，其中多種TCR基本由包含α鏈和β鏈的TCR組成，所述α鏈包含來自天然庫的α鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述β鏈包含來自天然庫的β鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中α鏈可變結(jié)構(gòu)域包含TRAV12-2和/或TRAV21基因產(chǎn)物，并且β鏈可變結(jié)構(gòu)域包含TRBV6基因產(chǎn)物，并且其中至少一部分的TCR包含具有非天然突變的β鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或α鏈可變結(jié)構(gòu)域。TRBV6基因產(chǎn)物可以是TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-5或TRBV6-6基因產(chǎn)物中的任意。TCRα鏈可變結(jié)構(gòu)域包含TRAV12-2基因產(chǎn)物?；蛘?，TCRα鏈可變結(jié)構(gòu)域包含TRAV21基因產(chǎn)物。α鏈可變結(jié)構(gòu)域和β鏈可變結(jié)構(gòu)域可展示為單個多肽鏈。TCR在顆粒上展示并且可在α鏈的恒定區(qū)與β鏈的恒定區(qū)之間包含非天然二硫鍵。例如，WO03/020763中描述了這類非天然二硫鍵。當在文庫的顆粒上展示的TCR包含恒定區(qū)1結(jié)構(gòu)域時，TCR可在α鏈的恒定區(qū)與β鏈的恒定區(qū)之間包含天然二硫鍵。各α鏈和各β鏈可包含優(yōu)選異源的二聚化結(jié)構(gòu)域。這種異源結(jié)構(gòu)域可以是亮氨酸拉鏈、5H3結(jié)構(gòu)域或疏水性富脯氨酸反結(jié)構(gòu)域、或其他類似方案，如本領(lǐng)域所知。形成文庫的顆?？梢允鞘删w顆粒。或者，文庫可以是核糖體文庫?；蛘撸膸炜梢允墙湍刚故疚膸?，因此顆粒可以是酵母細胞。本發(fā)明的另一個方面提供了從本發(fā)明的第一方面的文庫獲得的包含含有TRAV12-2基因產(chǎn)物或TRAV21基因產(chǎn)物的TCRα鏈可變結(jié)構(gòu)域和含有TRBV6基因產(chǎn)物的TCRβ鏈可變結(jié)構(gòu)域的分離的T細胞受體(TCR)。這種TCR的TRBV6基因產(chǎn)物可以是TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-5或TRBV6-6基因產(chǎn)物。TCR優(yōu)選是可溶的。本發(fā)明還包括編碼TCRα鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或TCR的β鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸。在另一個方面，本發(fā)明提供了使用第一或第二方面的文庫鑒定特異性結(jié)合至肽抗原的TCR。肽抗原可用于篩選本發(fā)明的文庫中與其結(jié)合的TCR。在其他實施方式中，本發(fā)明涉及制備顆粒文庫的方法，所述文庫展示多種不同TCR，所述方法包括：i)獲得編碼不同TRAV12-2或TRAV21α鏈可變結(jié)構(gòu)域的多種核酸；ii)獲得編碼不同TRBV6β鏈可變結(jié)構(gòu)域的多種核酸；iii)將TRAV12-2或TRAV21α鏈可變結(jié)構(gòu)域編碼核酸克隆到表達載體中；iv)將編碼TRBV6β鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸克隆到相同或不同載體中；和v)在顆粒中表達載體，從而生成基本由TCR組成的文庫，所述TCR包含由核酸編碼的α鏈可變結(jié)構(gòu)域和β鏈可變結(jié)構(gòu)域。提供了本發(fā)明的另一個制備顆粒文庫的方法，所述文庫展示多種不同的TCR，所述方法包括：i)使用與TRAV12-2或TRAV21α鏈可變結(jié)構(gòu)域雜交的引物獲得編碼不同TRAV12-2或TRAV21α鏈可變結(jié)構(gòu)域的多種核酸；ii)使用與編碼TRBV6β鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸雜交的引物獲得編碼不同TRBV6β鏈可變結(jié)構(gòu)域的多種核酸；iii)將TRAV12-2或TRAV21α鏈可變結(jié)構(gòu)域編碼核酸克隆到表達載體中；iv)將TRBV6β鏈可變結(jié)構(gòu)域編碼核酸克隆到相同或不同的載體中；和v)在顆粒中表達載體，從而生成基本由TCR組成的文庫，該TCR包含由與所述引物雜交的核酸所編碼的α鏈可變結(jié)構(gòu)域和β鏈可變結(jié)構(gòu)域。正向引物設(shè)計為與TRAV12-2基因座、TRAV21基因座或TRBV6基因座雜交。反相引物設(shè)計為分別至少部分與α或β恒定區(qū)雜交，使得所得的PCR產(chǎn)物含有可變區(qū)，至連接區(qū)和至少部分恒定區(qū)。轉(zhuǎn)錄、翻譯或轉(zhuǎn)錄后事件可能導致連接和/或恒定區(qū)，在β鏈序列的情況中包括遞送區(qū)的一些或所有的截短或刪除。優(yōu)選地，步驟(i)和步驟(ii)的核酸獲自天然庫。在一些情況中，在步驟iii)之前將非天然突變引入核酸。可在步驟i)和/或ii)之后，或步驟iii)和/或iv)之后引入突變。TRBV6β鏈可變結(jié)構(gòu)域可以是TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-5或TRBV6-6β鏈可變結(jié)構(gòu)域。在制備本發(fā)明的文庫的任一方法中，TCRα鏈可變結(jié)構(gòu)域和TCRβ鏈可變結(jié)構(gòu)域優(yōu)選表達成單鏈多肽，即，編碼各α鏈和β鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸被克隆到相同載體中。本發(fā)明在另一個方面提供了獲得特異性結(jié)合至肽抗原的T細胞受體，包括用肽抗原篩選本發(fā)明的第一或第二方面的文庫。按照本發(fā)明在其表面顯示TCR的顆粒也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的文庫是非天然產(chǎn)生的，因為其包含非天然產(chǎn)生的TCR或者在本文中使用時被認為“分離的”那些；并且因此，本發(fā)明的TCR可能是專利適格的對象，因為這類TCR不是天然產(chǎn)生的或者在本文中使用時被認為“分離的”那些。類似地，本發(fā)明的細胞和顆粒是專利適格的對象，因為通過在其表面上展示或表達本發(fā)明的TCR，該細胞或顆粒不是天然產(chǎn)生的或者本文中使用時會被認為是“分離的”。還應(yīng)注意，在該公開文件以及特別在權(quán)利要求和/或段落中，諸如“包含”等的術(shù)語具有對其賦予的通常含義，例如，其可表示“包括”等；且諸如“基本由……組成”的術(shù)語具有一般對其賦予的含義，例如，其允許未明確列出的要素，但排除發(fā)現(xiàn)于現(xiàn)有技術(shù)中或影響本發(fā)明基本或新穎性的要素。公開了這些和其他實施方式，其在下述發(fā)明詳述中明顯并包括于其中。附圖說明以下發(fā)明詳述以示例的形式給出但不旨在單獨將本發(fā)明限制為所述特定實施方式，其最好可連同所附附圖進行理解，其中：圖1列出了用于產(chǎn)生文庫的克隆策略；圖2詳細描述了文庫產(chǎn)生中使用的引物序列；圖3顯示了來自用4種不同的肽HLA抗原淘選的TRAV12.2/21TRBV6*集合文庫的ELISA篩選的結(jié)果。CMV表示陰性對照抗原；圖4顯示了來自由單個HLA-A2/A24陰性供體制備并用3種肽HLA抗原淘選的TRAV12.2/21TRBV6*集合文庫的ELISA篩選結(jié)果。CMV表示陰性對照抗原；圖5顯示了用2種肽HLA抗原淘選的TRAV12.2TRBV6*/TRAV21TRBV6*單個文庫的ELISA篩選的結(jié)果。CMV表示陰性對照抗原；圖6顯示了從市售mRNA源制備并用2種肽HLA抗原淘選的TRAV12.2TRBV6*/TRAV21TRBV6*單個文庫的ELISA篩選的結(jié)果。CMV表示陰性對照抗原；圖7顯示了對從本發(fā)明的文庫分離的TCR的其他特異性測試；和圖8顯示了從本發(fā)明的文庫中分離的抗原特異性TCR的可溶版本的Biacore結(jié)合曲線。根據(jù)本發(fā)明，提供了顆粒文庫，所述文庫展示多種不同T細胞受體(TCR)，其中多種TCR基本由包含α鏈和β鏈的TCR組成，所述α鏈包含來自天然庫的α鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述β鏈包含來自天然庫的β鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中α鏈可變結(jié)構(gòu)域包含TRAV12-2和/或TRAV21基因產(chǎn)物，并且β鏈可變結(jié)構(gòu)域包含TRBV6基因產(chǎn)物?！盎居伞M成”表示文庫上大部分的TCR包含TRAV12-2或TRAV21和TRBV6，但是少量由于制備文庫時引物的非特異性雜交，或者在α或β鏈可變基因座基因中的基因之間高度同源性的區(qū)域而包含不同的α或β鏈可變結(jié)構(gòu)域。如下定義大部分的量。多種TCR可由80％的包含含有TRAV12-2或TRAV21基因產(chǎn)物的α鏈可變結(jié)構(gòu)域和含有TRBV6基因產(chǎn)物的β鏈可變結(jié)構(gòu)域的TCR組成。多種TCR可由85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的包含含有TRAV12-2或TRAV21基因產(chǎn)物的α鏈可變結(jié)構(gòu)域和含有TRBV6基因產(chǎn)物的β鏈可變結(jié)構(gòu)域的TCR組成。多種TCR中剩余的20％或更少包含與TRBV6β鏈可變結(jié)構(gòu)域基因產(chǎn)物配對的不同α鏈可變結(jié)構(gòu)域基因產(chǎn)物，與TRAV12-2或TRAV21可變結(jié)構(gòu)域基因產(chǎn)物或截短/非復制型鏈配對的不同β鏈可變結(jié)構(gòu)域基因產(chǎn)物。因此，在一些實施方式中，TCRα鏈可變結(jié)構(gòu)域包含TRAV12-2基因產(chǎn)物并且在其他實施方式中，TCRα鏈可變結(jié)構(gòu)域包含TRAV21基因產(chǎn)物。文庫可包含多種TCR，其中TCR的一部分包含TRAV12-2基因產(chǎn)物并且TCR的一部分包含TRAV21基因產(chǎn)物。本發(fā)明的文庫因此可含有多種TCR，各自具有以下的α鏈和β鏈V、J、(D)和C基因使用：α鏈-TRAV21/TRAJxx/TRAC；或α鏈-TRAV12-2/TRAJxx/TRAC；和β鏈-TRBV6-y/TRBDx/TRBJxx/TRBC1，TRBC2，或C1和C2的嵌合體，其中xx分別是61個αJ基因或13個βJ基因中的任意，并且Dx代表2個βD基因中的任一。TRBV6-y表示使用的TRBV6等位基因可以變化。TRBV基因產(chǎn)物可以是TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-5或TRBV6-6基因產(chǎn)物。如上所述，J、D或C區(qū)可各自是完全的或部分存在或缺失?！皝碜蕴烊粠臁北硎綯CRα和β鏈可變結(jié)構(gòu)域從已經(jīng)獲自人供體的DNA序列表達。換而言之，文庫的TCR的α和β可變結(jié)構(gòu)域的多樣性在體內(nèi)T細胞發(fā)育期間已經(jīng)天然產(chǎn)生。此外，這意味著文庫中所有的α和β鏈的序列已經(jīng)在胸腺選擇期間被選擇。與體內(nèi)原始存在的相比(即，在供體中)，在文庫產(chǎn)生期間發(fā)生的這些α和β鏈的隨機組合可能導致αβ鏈組合的替代庫。例如，可通過從供體mRNA產(chǎn)生cDNA來直接獲得DNA序列。然后cDNA序列可用作模板來產(chǎn)生DNA序列，從中產(chǎn)生多種不同的TCR?；虍a(chǎn)物表示可包括翻譯后修飾的多肽，其被所示基因的核酸序列編碼。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，各TCRα或β鏈可變結(jié)構(gòu)域基因在CDR3區(qū)中含有變化形式，如上所述，意味著基因產(chǎn)物也將大幅變化。本發(fā)明的文庫優(yōu)選包含至少1x108個展示αβTCR鏈組合的顆粒。文庫可以是噬菌體顆粒文庫。噬菌體展示描述于WO2004/044004。或者，文庫是核糖體文庫。核糖體展示為本領(lǐng)域已知。顆?？梢允峭耆颂求w復合物或其部分?？墒褂媒湍刚故鞠到y(tǒng)，意味著文庫可以是酵母細胞文庫。適用于產(chǎn)生TCR文庫的其他展示方法是哺乳動物細胞展示。該系統(tǒng)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來將TCRα和β鏈導入TCR-陰性T細胞雜交瘤。該方法還描述于Chervin等，(2008)JImmunolMethods,339,175-84；和Kessels等，(2000)ProcNatlAcadSciUSA,97,14578-83。本發(fā)明包括能夠展示所述異二聚或單鏈TCR的顆粒文庫。α和/或β鏈恒定結(jié)構(gòu)域可相對于天然/自然產(chǎn)生的TRAV/TRBV序列截短。另外，存在時，TRAC/TRBC可含有修飾。α鏈胞外序列可相對于天然/自然產(chǎn)生的TRAC包含修飾，從而參考IMGT編號的TRAC的氨基酸T48被C48替換。類似地，β鏈胞外序列可包含相對于天然/自然產(chǎn)生的TRBC1或TRBC2的修飾，從而參考IMGT編號的TRBC1或TRBC2的S57被C57替換，并且C75被A75替換，并且N89被D89替換。這些與天然α和β鏈胞外序列相關(guān)的半胱氨酸取代能夠形成非天然鏈間二硫鍵，其使得重折疊的可溶性TCR穩(wěn)定化，即通過重折疊胞外α和β鏈形成的TCR。這個非天然二硫鍵促進了噬菌體上正確折疊的TCR的展示(Li,Y.等，NatBiotechnol2005:23(3),349-54)。另外，使用穩(wěn)定的二硫鍵連接的可溶性TCR能夠更方便地評價結(jié)合親和性和結(jié)合半衰期。替代性取代描述于WO03/020763。或者，α和β恒定結(jié)構(gòu)域可通過對應(yīng)于自然中發(fā)現(xiàn)的那些的二硫鍵連接。為了進一步或另外使異二聚TCR穩(wěn)定化，各α鏈和各β鏈可包含二聚化結(jié)構(gòu)域，其可相對于天然TCR鏈序列異源。具體地，二聚化結(jié)構(gòu)域可以是亮氨酸拉鏈。該術(shù)語描述了互相以特定方式相互作用以形成異二聚體的螺旋肽對。發(fā)生相互作用，因為在各拉鏈肽的一側(cè)上有互補的疏水性殘基。肽的本質(zhì)是異二聚體的形成遠比螺旋同二聚體的形成更為有利。亮氨酸拉鏈可以是合成的或天然產(chǎn)生的，如WO99/60120中所述的那些。替代性的二聚化結(jié)構(gòu)域包括二硫鍵橋形成元件?；蛘?，其可由負責參與信號轉(zhuǎn)導的蛋白質(zhì)之間看到的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的SH3結(jié)構(gòu)域和疏水性/富脯氨酸反結(jié)構(gòu)域提供(由Schlessinger綜述(Schlessinger,J.,CurrOpinGenetDev.1994年2月；4(1):25-30))。參與信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)的蛋白質(zhì)之間發(fā)現(xiàn)的其他天然蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用依賴于翻譯后修飾的氨基酸和特異性識別這類經(jīng)修飾殘基的蛋白質(zhì)模塊之間的結(jié)合。這類翻譯后修飾的氨基酸和蛋白質(zhì)模塊可形成本發(fā)明的文庫的TCR鏈的二聚化結(jié)構(gòu)域。不受理論限制，本發(fā)明的文庫大小，即其中代表的α和β鏈可變結(jié)構(gòu)域基因相對于完全(或接近完全)的庫減少的數(shù)量被認為是能夠從本發(fā)明的文庫中鑒定特異性功能性TCR的一個可能原因。在之前所述的更大的“天然”文庫中，可能某些α鏈并不與某些β鏈配對，并且因此許多文庫是非功能性的。某些鏈類型可能不在噬菌體表面上正確折疊?？赡芡ǔ８鳓伶湶怀渥惚磉_或充分展示以與“理想”β鏈配對，反之亦然，并且因此降低了鑒定到包含α和β鏈的特異性功能性TCR的幾率。此外，某些α或β鏈序列可能不是主導的，并且因此作用是“毒害”文庫。本發(fā)明還提供了顆粒文庫，所述文庫展示多種不同TCR，其中多種TCR基本由包含來自天然庫的α鏈可變結(jié)構(gòu)域和來自天然庫的β鏈可變結(jié)構(gòu)域的TCR組成，其中α鏈可變結(jié)構(gòu)域包含TRAV12-2和/或TRAV21基因產(chǎn)物，并且β鏈可變結(jié)構(gòu)域包含TRBV6基因產(chǎn)物，并且其中至少一部分的TCR包含具有非天然突變的β鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或α鏈可變結(jié)構(gòu)域?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任意方法導入非天然突變。非天然突變可隨機生成，或特異性限定，或同時通過兩者生成。例如，隨機生成的突變可使用位點飽和誘變在限定位置處納入，其中天然氨基酸編碼序列被所有其他天然產(chǎn)生的氨基酸的編碼序列替換；從而在限定位置處產(chǎn)生其他文庫多樣性。該方法可包括使用采用簡并合成寡核苷酸作為引物的PCR擴增來復制感興趣的DNA。或者，或另外，使用例如市售試劑盒，如來自司查塔基公司(Stratagene)的快速改變定點誘變試劑盒(QuikChangeSiteDirectedMutagensisKit)可在特定位置處導入限定的突變，包括插入和刪除。優(yōu)選地，將非天然突變納入CDR區(qū)。文庫可展示TCR，其中10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的α鏈可變結(jié)構(gòu)域或β鏈可變結(jié)構(gòu)域包含非天然突變。本發(fā)明的另一個方面提供了根據(jù)本發(fā)明的第一方面的文庫分離的包含含有TRAV12-2基因產(chǎn)物或TRAV21基因產(chǎn)物的TCRα鏈可變結(jié)構(gòu)域和含有TRBV6基因產(chǎn)物的TCRβ鏈可變結(jié)構(gòu)域的分離的T細胞受體(TCR)。“分離的”表示TCR從其天然環(huán)境中移出，即，不是在體內(nèi)T細胞上天然展示的TCR。TCR可特異性結(jié)合至肽抗原。如通過，例如但不限于ELISA或BiaCore所測定，獲自本發(fā)明的文庫的這種TCR可以高親和性和高特異性結(jié)合至肽抗原?？赏ㄟ^進一步親和性成熟來獲取TCR，使得結(jié)合親和性和/或半衰期增加。TCR可以是可溶的，即其可從跨膜結(jié)構(gòu)域上切下，如WO03/020763中所述。TCR可含有非天然二硫鍵，如上所述。TCR可與可檢測的標記物融合，包括但不限于熒光標記物、放射性標記物、酶、核酸探針和造影劑，或者與治療劑融合，包括但不限于，免疫調(diào)節(jié)劑、放射性化合物、酶(例如，穿孔蛋白)或化療劑(例如，順鉑)(WO2010/133828)。TCr可在細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞，更優(yōu)選免疫細胞，甚至更優(yōu)選T細胞表面上非天然表達?？赏ㄟ^任意合適的方法來確定結(jié)合親和性(與平衡常數(shù)KD呈反比)和結(jié)合半衰期(表示為T1/2)。將理解TCR的親和性翻倍導致KD減半。T1/2計算為ln2除以解離速率(koff)。因此，T1/2翻倍導致koff減半。通常對TCR的可溶形式測量TCR的KD和koff值，即截短以去除疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域殘基的那些形式。因此，應(yīng)理解如果給定TCR的可溶形式滿足對肽抗原的結(jié)合親和性和/或結(jié)合半衰期的要求，則該TCR滿足該要求。優(yōu)選地，使用相同的試驗方案多次在限定溫度下測量給定的TCR的結(jié)合親和性或結(jié)合半衰期，并且取結(jié)果的平均值。更優(yōu)選地，通過在25℃的溫度下的表面等離振子共振來測量結(jié)合親和性或結(jié)合半衰期。實施例10中給出了優(yōu)選的方法。出于上述目的，如上所述，TCR是具有至少一個TCRα和至少一個TCRβ可變結(jié)構(gòu)域的部分。通常，其將同時包含TCRα可變結(jié)構(gòu)域和TCRβ可變結(jié)構(gòu)域。它們可以是αβ異二聚體，或者可以是單鏈形式，其表示同時含有α鏈和β鏈的單個多肽，如WO2004/033685中所述?；蛘撸琓CR可包含通過一對C-端二聚化肽，如亮氨酸拉鏈與TCRβ鏈包圍結(jié)構(gòu)域二聚化的TCRα鏈胞外結(jié)構(gòu)域，如WO99/60120中所述的TCR。為了在過繼性治療中使用，αβ異二聚體TCR可以例如以具有胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域的全長鏈轉(zhuǎn)染到細胞，如T細胞中。如果需要，相應(yīng)恒定區(qū)的殘基之間導入的二硫鍵可以存在(參見例如WO2006/000830)?；蛘?，α和β恒定結(jié)構(gòu)域可通過對應(yīng)于自然中發(fā)現(xiàn)的那些的二硫鍵連接。重要的是注意到無論哪種形式，本發(fā)明第一方面的文庫的TCR，就α和β可變結(jié)構(gòu)域而言，來自天然產(chǎn)生的序列，其與作為用于生成cDNA的模板的供體mRNA相比未經(jīng)修飾或突變，所述cDNA用于從中擴增TCR鏈。本發(fā)明包括編碼本發(fā)明的TCR的TCRα鏈可變結(jié)構(gòu)域和/或TCRβ鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸。α和β鏈可從分開的核酸或一個核酸分子表達。如果從相同的核酸分子，α和β鏈可以獨立的多肽，或單鏈表達。核酸包含TRAV12-2或TRAV21序列和/或TRBV6核酸序列。核酸也可包括TRAJ序列和/或TRBD/TRBJ序列。核酸也可包括TRAC和/或TRBC1或TRBC2核酸序列，或其部分序列。在本發(fā)明的另一個方面，提供了使用第一或第二方面的文庫鑒定特異性結(jié)合至肽抗原的TCR。如上所述，由于多種原因，需要特異性結(jié)合至肽抗原的TCR。本發(fā)明的另一個方面提供了制備本發(fā)明的第一方面的文庫的方法。該方法包括：i)獲得編碼不同TRAV12-2或TRAV21α鏈可變結(jié)構(gòu)域的多個核酸；ii)獲得編碼不同TRBV6β鏈可變結(jié)構(gòu)域的多個核酸；iii)將TRAV12-2或TRAV21α鏈可變結(jié)構(gòu)域編碼核酸克隆到表達載體中；iv)將編碼TRBV6β鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸克隆到相同或不同載體中；和v)在顆粒中表達載體，從而生成基本由TCR組成的文庫，該TCR包含由核酸編碼的α鏈可變結(jié)構(gòu)域和β鏈可變結(jié)構(gòu)域?？赏ㄟ^PCR，或合成型構(gòu)建獲得核酸，例如，使用固相DNA合成，如生命技術(shù)公司(LifeTechnologies)商業(yè)運營?？赏ㄟ^復制/擴增核苷酸序列反式cDNA來獲得i)和ii)的核酸，其已經(jīng)從來自供體的T細胞庫的mRNA制備。獲得的編碼不同TRAV12-2或TRAV21α或TRBV6β鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸可以是獲得的唯一核酸，即，步驟i)可包括僅獲得編碼不同TRAV12-2或TRAV21α鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸，并且步驟ii)可包括僅獲得編碼不同TRBV6β鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸。生成的文庫可以是基本由包含來自天然庫的α鏈可變結(jié)構(gòu)域和來自天然庫的β鏈可變結(jié)構(gòu)域的TCR組成的文庫，其中α鏈可變結(jié)構(gòu)域包含TRAV12-2或TRAV21基因產(chǎn)物并且β鏈可變結(jié)構(gòu)域包含TRBV6基因產(chǎn)物。本發(fā)明還提供了制備顆粒文庫的方法，所述文庫展示多種不同的TCR，所述方法包括：i)使用與TRAV12-2或TRAV21α鏈可變結(jié)構(gòu)域雜交的引物獲得編碼不同TRAV12-2或TRAV21α鏈可變結(jié)構(gòu)域的多種核酸；ii)使用與編碼TRBV6β鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸雜交的引物獲得編碼不同TRBV6β鏈可變結(jié)構(gòu)域的多種核酸；iii)將TRAV12-2或TRAV21α鏈可變結(jié)構(gòu)域編碼核酸克隆到表達載體中；iv)將TRBV6β鏈可變結(jié)構(gòu)域編碼核酸克隆到相同或不同的載體中；和v)在顆粒中表達載體，從而生成基本由TCR組成的文庫，該TCR包含由與所述引物雜交的核酸所編碼的α鏈可變結(jié)構(gòu)域和β鏈可變結(jié)構(gòu)域。根據(jù)雜交反應(yīng)發(fā)生的條件以及雜交核酸序列的組成和長度，兩條單鏈序列將互相雜交，即使兩條序列之間沒有100％序列相同性。一般而言，雜交溫度和雜交緩沖劑的離子強度(如Mg2+濃度)將決定雜交的嚴謹性。高嚴謹性，如高雜交溫度和雜交緩沖劑中低鹽使得雜交僅發(fā)生在高度相似的核酸序列之間，而低嚴謹性，如低溫和高鹽，能在序列相似性較低時雜交。關(guān)于達到某些程度的嚴謹性的雜交條件的計算可易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員進行，并且描述于Sambrook等，(1989)，《分子克隆》(MolecularCloning)，第二版，紐約州普萊恩維尤的冷泉港實驗室(ColdSpringHarborLaboratory)，(第9章和第11章)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)敏感性和特異性測試的結(jié)果優(yōu)化雜交條件。下面是用于本發(fā)明的一組示例性雜交條件：非常高嚴謹性(檢測有至少90％相同性的序列)雜交:5xSSC，65℃下持續(xù)16小時洗滌兩次:2xSSC，室溫(RT)下各持續(xù)15分鐘洗滌兩次:0.5xSSC，65℃下各持續(xù)20分鐘高嚴謹性(檢測有至少80％相同性的序列)雜交:5x-6xSSC，65℃-70℃下持續(xù)16-20小時洗滌兩次:2xSSC，室溫下各持續(xù)5-20分鐘洗滌兩次:1xSSC，55℃-70℃下各持續(xù)30分鐘低嚴謹性(檢測有至少50％相同性的序列)雜交:6xSSC，室溫至55℃下持續(xù)16-20小時洗滌至少兩次:2x-3xSSC，室溫至55℃下各持續(xù)20-30分鐘。本文所述的引物可在低嚴謹性、高嚴謹性、和非常高嚴謹性條件下雜交編碼Trav12或TRAV21α鏈可變結(jié)構(gòu)域或TRBV6β鏈可變結(jié)構(gòu)域的核酸。引物可以高嚴謹性結(jié)合至編碼α和β鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列。然而，引物可結(jié)合至與TRAV12-2、TRAV21和/或TRVB6有高度同源性的一些其他基因座。兩種方法的TRBV6編碼核酸可以是TRBV6-1、TRBV6-2、TRBV6-3、TRBV6-5或TRBV6-6基因產(chǎn)物。步驟i)和ii)的核酸可來自天然庫。在步驟iii)之前或在步驟iii)之后，非天然突變可導入α或β可變結(jié)構(gòu)域，即，可在克隆到載體中之前向核酸序列導入非天然突變?；蛘撸稍趇ii)和/或iv)的克隆步驟之后導入非天然突變。TRAV12-2或TRAV21可變結(jié)構(gòu)域的擴增可來自預制的cDNA文庫，其本身來自供體mRNA，正向引物設(shè)計為特異性結(jié)合至感興趣的基因座。反向引物可設(shè)計為特異性結(jié)合至(至少部分)TCRα恒定區(qū)，使得所得的PCR產(chǎn)物含有TRAV12-2或TRAV21核酸序列、連接區(qū)和至少部分恒定區(qū)。這類引物設(shè)計確保捕獲α鏈可變結(jié)構(gòu)域CDR3的變化和多態(tài)性，導致本發(fā)明的文庫中代表了大量獨特的TCRα鏈序列。優(yōu)選地，供體是人。類似地，TRBV6可變結(jié)構(gòu)域的擴增可來自可及的cDNA文庫，用設(shè)計為特異性結(jié)合至感興趣基因座的正向引物。反向引物可設(shè)計為特異性結(jié)合至TCRβ恒定區(qū)，使得所得的PCR產(chǎn)物含有TRBV6核酸序列、連接區(qū)(含有D和J基因座)和至少部分恒定區(qū)。這類引物設(shè)計確保捕獲β鏈可變結(jié)構(gòu)域CDR3的變化和多態(tài)性，導致本發(fā)明的文庫中代表了大量獨特的TCRβ鏈序列。mRNA分離自至少一個供體。“來自至少一個供體”表示α或β鏈可變結(jié)構(gòu)域的多肽序列基本與其在獲得mRNA的供體的T細胞中天然產(chǎn)生的相同。所得的PCR產(chǎn)物可直接連接至噬菌體載體，如果其含有完全恒定基因序列，前提是所需的連接和重組序列存在于載體和引物序列中。或者，α和βPCR產(chǎn)物可分別用含α恒定結(jié)構(gòu)域基因序列和β恒定結(jié)構(gòu)域基因序列的縫合在一起以獲得完全TCR鏈序列。α鏈和β鏈可隨機縫合在一起以增加噬菌體文庫的多樣性。然后可將完全序列克隆到噬菌體載體中，以表達成開放閱讀框(如圖1所示)?；蛘?，也可使用其他顆粒展示形式來產(chǎn)生本發(fā)明的文庫。這類方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且可包括但不限于在核糖體顆?；蚪湍讣毎险故?。這些展示方法落入2大類，體外和體內(nèi)展示。所有體內(nèi)展示方法依賴于這樣一個步驟，其中，將通常在可靠顆粒如質(zhì)?；蚴删w復制子的基因組核酸中編碼的文庫或與之一起編碼的文庫導入細胞以表達蛋白質(zhì)或多肽(Plückthun(2001)AdvProteinChem55367-403)。有多種已經(jīng)證明適于蛋白質(zhì)或多肽的體內(nèi)展示的復制子/宿主系統(tǒng)。這些包括：噬菌體/細菌細胞質(zhì)粒/CHO細胞基于酵母2μm質(zhì)粒/酵母細胞的載體桿狀病毒/昆蟲細胞質(zhì)粒/細菌細胞逆轉(zhuǎn)錄病毒載體/哺乳動物體內(nèi)展示方法包括細胞表面展示方法，其中向宿主細胞引入質(zhì)粒，所述質(zhì)粒編碼由與細胞表面蛋白質(zhì)或多肽融合的感興趣蛋白質(zhì)或多肽組成的融合蛋白。這種融合蛋白的表達導致細胞表面上展示感興趣的蛋白質(zhì)或多肽。展示這些感興趣蛋白質(zhì)或多肽的細胞然后可經(jīng)過選擇過程，如FACS并且可從選擇的一個或多個細胞獲得的質(zhì)?？山?jīng)分離和測序。已經(jīng)針對哺乳動物細胞(Higuschi(1997)JImmunol.Methods202193-204),yeastcells(Shusta(1999)JMolBiol292949-956)和細菌細胞(Sameulson(2002)J.Biotechnol96(2)129-154)設(shè)計了細胞表面展示系統(tǒng)。在酵母細胞上展示單鏈TCR是本領(lǐng)域已知的(WO01/48145)。已經(jīng)公開了各種體內(nèi)展示技術(shù)的多篇綜述。例如，(Hudson(2002)ExpertOpinBiolTher(2001)1(5)845-55)和(Schmitz(2000)21(SuppA)S106-S112)。體外展示技術(shù)基于使用核糖體來將mRNA的文庫翻譯成蛋白質(zhì)或多肽變體的多樣化陣列。通過兩種方法中的一種來維持形成的蛋白質(zhì)或多肽與編碼這些分子的mRNA之間的連接。常規(guī)核糖體展示采用編碼短(一般40-100個氨基酸)接頭序列和待展示的蛋白質(zhì)或多肽的mRNA序列。接頭序列給予展示的蛋白質(zhì)或多肽足夠的空間來重折疊而不受核糖體的空間位阻。mRNA序列缺少“終止”密碼子，這確保了表達的蛋白質(zhì)或多肽和RNA保持接合在核糖體顆粒上。相關(guān)的mRNA展示方法基于制備編碼感興趣的蛋白質(zhì)或多肽的mRNA和攜帶嘌呤霉素部分的DNA接頭。只要核糖體到達mRNA/DNA連接處，翻譯停止并且嘌呤霉素與核糖體形成共價連接。這兩種相關(guān)的體外展示方法的綜述參見(Amstutz(2001)CurrOpinBiotechnol12400-405)。特別優(yōu)選的是，基于噬菌體顆粒表達與其表面蛋白融合的異源肽或多肽的能力的噬菌體展示技術(shù)(Smith(1985)Science2171315-1317)。該過程非常普遍，并且為多肽單體展示領(lǐng)域所熟知。二聚蛋白，如異二聚TCR的展示也是本領(lǐng)域所中成熟的(WO04/044004)。有兩種同時應(yīng)用于單體和二聚體展示的主要過程：首先(方法A)，通過將與編碼噬菌體外殼蛋白(例如，編碼蛋白質(zhì)P3或P8的DNA)融合的編碼異源肽或多肽的DNA插入載體(噬菌粒)中。然后通過用噬菌粒轉(zhuǎn)染細菌細胞來進行展示異源肽或多肽的噬菌體顆粒的表達，然后用“復制噬菌體”來感染轉(zhuǎn)染的細胞。輔助噬菌體用作未由產(chǎn)生功能性噬菌體顆粒所需的噬菌粒所編碼的噬菌體蛋白的來源。其次(方法B)，通過將編碼異源肽或多肽的DNA插入與編碼噬菌體外殼蛋白的DNA融合的完整噬菌體基因組。然后通過用噬菌體基因組感染細菌細胞來進行展示異源肽或多肽的噬菌體顆粒的表達。該方法具有第一方法的“單步驟”過程的優(yōu)勢。然而，可被成功包裝到所得噬菌體顆粒中的異源DNA序列的尺寸降低。M13、T7和λ是適用于該方法的噬菌體的示例。方法B的變化形式包括向編碼待展示異源肽的噬菌體基因組中的DNA加入編碼核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA序列，并且另外向噬菌體基因組加入相應(yīng)的核苷酸結(jié)合位點。這導致異源肽直接結(jié)合至噬菌體基因組。然后將這種肽/基因組組合物包裝成展示異源肽的噬菌體顆粒。該方法完全描述于WO99/11785。然后可回收噬菌體顆粒并用于研究異源肽或多肽的結(jié)合特性。一旦分離，可從肽或多肽展示噬菌體顆粒上回收噬菌?；蚴删wDNA，并且該DNA可通過PCR復制?？墒褂肞CR產(chǎn)物可對給定噬菌體顆粒展示的異源肽或多肽進行測序。單鏈抗體或其片段的噬菌體展示已經(jīng)成為研究這些多肽的結(jié)合特性的常規(guī)手段。存在多本對噬菌體展示技術(shù)和噬菌體生物學的綜述的書籍(參見，例如，《噬菌體展示-實驗室手冊》(PhageDisplay–ALaboratoryManual)，Barbas等，(2001)，冷泉港實驗室出版社(ColdSpringHarbourLaboratoryPress))。第三種噬菌體展示方法(方法C)依賴于在所需的位置處有半胱氨酸殘基的異源多肽可被噬菌粒或噬菌體基因組以可溶形式表達，并且導致與在表面暴露位置處也有半胱氨酸殘基的修飾的噬菌體表面蛋白通過在2個半胱氨酸之間形成二硫鍵而結(jié)合。WO01/05950詳細描述了使用這種替代性連接方法來表達單鏈抗體衍生的肽。如上所述，本發(fā)明的αβ異二聚TCR可在它們的恒定結(jié)構(gòu)域之間有引入的(非天然)二硫鍵。這可在通過將擴增的核酸序列縫合到修飾的恒定基因序列來制備本發(fā)明的文庫的方法期間實現(xiàn)。這類序列可包括具有TRAC恒定結(jié)構(gòu)域序列和TRBC1或TRBC2恒定結(jié)構(gòu)域序列的那些(除TRAC的Thr48和TRBC1或TRBC2的Ser57被半胱氨酸殘基替換以外)，參考IMGT編號，所述半胱氨酸在文庫的TCR的TRAC恒定結(jié)構(gòu)域序列和TRBC1或TRBC2恒定結(jié)構(gòu)域序列之間形成二硫鍵。在具有或沒有前述段落中提及的導入的鏈間鍵的情況下，本發(fā)明的αβ異二聚TCR可能具有TRAC恒定結(jié)構(gòu)域序列和TRBC1或TRBC2恒定結(jié)構(gòu)域序列，并且TCR的TRAC恒定結(jié)構(gòu)域序列和TRBC1或TRBC2恒定結(jié)構(gòu)域序列可通過TRAC的外顯子2的Cys4和TRBC1或TRBC2的外顯子2的Cys2之間的天然二硫鍵連接。或者，TCRα鏈可變結(jié)構(gòu)域和TCRβ鏈可變結(jié)構(gòu)域可表達成單鏈多肽。這類構(gòu)造可包括突變的氨基酸殘基之間的非天然二硫鍵。本發(fā)明還提供了獲得特異性結(jié)合肽抗原的T細胞受體的方法，包括用肽抗原篩選本發(fā)明的第一方面的文庫。篩選可包括以下一個或多個步驟a)使用肽抗原作為靶標淘選文庫b)重復步驟a)一次或多次c)篩選步驟a)或b)中鑒定的噬菌體克隆d)鑒定特異性結(jié)合肽抗原的TCR。按照步驟(b)，步驟(a)可重復1次、2次、3次、4次、5次或6次。其可重復高至10次。步驟(a)可重復高至20次或更多。淘選表示使噬菌體克隆接觸抗原并且從未結(jié)合的噬菌體克隆中分離結(jié)合的噬菌體克隆。這可包括將抗原固定在固體支持物如管、磁珠、柱基質(zhì)或BiaCore傳感器芯片上?？赏ㄟ^非特異性吸附，或通過使用特異性接合標簽如生物素化的抗原和鏈霉親和素包被的表面來介導抗原接合。替代性方法可包括在完整細胞上淘選(Hoogenboom,H.R.等，(1998)Immunotechnology,4(1),1-20)。洗去未結(jié)合的噬菌體克隆(即，不展示結(jié)合至抗原的TCR的噬菌體)。然后可通過以下洗脫結(jié)合的噬菌體克?。篢CRβ鏈和基因III之間蛋白酶位點，如胰蛋白酶的酶切割；極端pH；或過量抗原競爭。這些噬菌體克隆可經(jīng)過另外幾輪淘選，或進行篩選實驗以鑒定具有最優(yōu)結(jié)合特性的克隆。可通過，例如使用包被的抗原或完整細胞的并且可以96-孔形式基于ELISA的方法來進行篩選，其中使用完整細胞，可使用流式細胞術(shù)進行篩選?？墒褂帽砻娴入x振子共振，例如在BiaCore儀器上，或使用石英晶體微天平來進行對親和性和動力學的篩選。篩選方法描述于Pande,J.等，(2010).BiotechnolAdv28(6):849-58。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，篩選生物分子相互作用的其他合適方法可及并包括：來自ForteBIO的Octet系統(tǒng)，其采用生物膜層干涉量度法(BLI)來實時測量生物膜相互作用并提供關(guān)于親和性和動力學的信息；擴增發(fā)光接近均相測定法(例如，AlphaScreenTM)其中潛在相互作用分子接合至靠近時有特定熒光性質(zhì)的“供體”或“受體”珠；閃爍迫近試驗，其中通過在靠近的分子之間轉(zhuǎn)移的β粒子來評價相互作用；其他合適的光學干涉試驗描述于，例如，WO2004/044004。可通過測試鑒定的TCR結(jié)合至除了用于篩選文庫的肽抗原以外的肽來確定特異性。如果結(jié)合發(fā)生在其他肽，則可認為TCR是非特異性的。可使用上述方法評價特異性。肽抗原可以是已知抗原，如Bridgeman,J.S.等，(2012)Immunology,135(1),9-18中所述的那些。篩選本發(fā)明的文庫的方法也可與新肽抗原聯(lián)用，以鑒定可用于治療領(lǐng)域的特異性結(jié)合TCR。本發(fā)明的最后方面提供了在其表面上展示獲自本發(fā)明的第一或第二方面的本發(fā)明的TCR的分離的細胞，即，包含含有TRAV12-2基因產(chǎn)物或TRAV21基因產(chǎn)物的TCRα鏈可變結(jié)構(gòu)域和含有TRBV6基因產(chǎn)物的TCRβ鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中TCR特異性結(jié)合肽抗原。該細胞可以是T細胞。細胞可以是人、鼠或其他動物細胞。存在多種適用于用編碼本發(fā)明的TCR的DNA或RNA轉(zhuǎn)染T細胞的方法(參見例如Robbins等，(2008)JImmunol.180:6116-6131)。表達本發(fā)明的TCR的T細胞將適用于疾病如癌癥、病毒感染、自身免疫疾病、寄生蟲感染和細菌感染的基于過繼性療法的治療。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，存在多種可進行過繼性療法的合適方法(參見例如Rosenberg等，(2008)NatRevCancer8(4):299-308)。為了用于過繼性療法，本發(fā)明可包括含有TCR表達載體的細胞，其在單個開放閱讀框或2個不同的開放閱讀框中包含編碼本發(fā)明的TCR的核酸。本發(fā)明的范圍中還包括含有第一表達載體和第二表達載體的細胞，第一表達載體包含編碼本發(fā)明的TCR的α鏈的核酸，而第二表達載體包含編碼本發(fā)明的TCR的β鏈的核酸。或者，一個載體可同時表達本發(fā)明的TCR的α和β鏈。計劃用于過繼性療法的本發(fā)明的TCR可在由轉(zhuǎn)染的T細胞表達時經(jīng)糖基化。眾所周知，可通過對轉(zhuǎn)染的基因的突變來控制轉(zhuǎn)染的TCR的糖基化模式(KuballJ等，(2009),JExpMed206(2):463–475)。為了給予患者，在藥物組合物中提供了用本發(fā)明的TCR轉(zhuǎn)染的T細胞和藥學上可接受的運載體。本發(fā)明的細胞通常將以無菌的藥物組合物的部分提供，其通常包含藥學上可接受的運載體。這種藥物組合物可以是任意合適的形式(取決于將其給予患者所需的方法)。可以單位劑型提供，通常以密封的容器提供或可以試劑盒的部分提供。這種試劑盒將通常(雖然不必需)包括使用說明。其可包括多種所述的單位劑型。給藥的合適組合物和方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，例如，參見Johnson等，Blood(114):535-46(2009)，參考臨床試驗號NCI-07-C-0175和NCI-07-C-0174。藥物組合物可適應(yīng)通過任意合適的途徑給藥，如通過胃腸外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi))、吸入或口服途徑。這類制劑可通過藥學領(lǐng)域已知的任何方法制備，例如通過將活性成分與運載體或賦形劑在無菌條件下混合。本發(fā)明的物質(zhì)的劑量可在廣泛的限制之間變化，取決于待治療的疾病或病癥，如癌癥、病毒感染、自身免疫疾病、細菌感染或寄生蟲感染、待治療的個體的年齡和條件等。例如，ImmTAC試劑(與抗-CD3結(jié)構(gòu)域融合的可溶性TCR)的合適劑量范圍可以是25ng/kg至50μg/kg。由藥師最終確定使用的合適劑量。本發(fā)明的TCR也可用成像化合物標記，例如，適用于診斷目的的標記物。這類標記的高親和性TCR可用于檢測選自以下的TCR配體的方法：CD1-抗原復合物、細菌超級抗原、和MHC-肽/超抗原復合物，該方法包括將TCR配體與高親和性TCR(或多聚高親和性TCR復合物)接觸，該TCR對TCR配體有特異性；并且檢測對TCR配體的結(jié)合。在例如采用生物素化的雜二聚體形成的高親和性TCR復合物中，可采用熒光鏈霉親和素(市售)來提供可檢測標記物。熒光標記的四聚體適用于FACS分析，例如，以檢測攜帶肽的抗原呈遞細胞，其中肽對于高親和性TCR有特異性。本發(fā)明的高親和性TCR(或其多價復合物)可以，或者或此外，與治療劑相關(guān)聯(lián)(例如通過共價或其它方式連接)，所述治療劑可以是例如用于細胞殺傷的毒性部分或免疫刺激劑如白介素或細胞因子。本發(fā)明的多價高親和性TCR復合物與非多聚野生型或高親和性T細胞受體異二聚體相比可具有強化的對TCR配體的結(jié)合能力。因此，根據(jù)本發(fā)明的此類多價高親和性TCR復合物具體用于體內(nèi)或體外追蹤或靶向那些呈遞特定抗原的細胞，并且還可用作生產(chǎn)具有此類用途的其他多價TCR復合物的中間體。因此，可以藥學上可接受的制劑提供高親和性TCR或多價高親和性TCR復合物用于體內(nèi)使用。本發(fā)明的高親和性TCR可用于產(chǎn)生可溶性雙特異性試劑。在一個優(yōu)選的實施方式中，這些是ImmTAC試劑。ImmTAC試劑包含可溶性TCR，其通過接頭融合至抗-CD3特異性抗體片段。包括如何產(chǎn)生這類試劑的其他細節(jié)描述于WO10/133828。本發(fā)明各方面的優(yōu)選或任選特征可經(jīng)修改作為各其他方面。因此，盡管已經(jīng)詳細描述了本發(fā)明和其優(yōu)勢，但是應(yīng)當理解，可對本文進行各種變化、替代和改變而不背離所附權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍。本發(fā)明將以實施例進行進一步說明，實施例僅用于說明目的，且不以任何方式限制本發(fā)明。實施例實施例1制備用于構(gòu)建TRAV12.2/TRBV6*和TRAV21/TRBV6*天然TCR噬菌體展示文庫的cDNA從外周血淋巴細胞(PBL)中分離mRNA從獲自已知HLA類型的三個供體的大約3000萬個PBL的集合中提取RNA.按照生產(chǎn)商推薦的方案使用TRI試劑(西格瑪，目錄號T9424)來進行RNA提取。隨后根據(jù)生產(chǎn)商的指導，使用μMACSTMmRNA分離試劑盒(美天旎，目錄號130-075-101)來分離mRNA。從mRNA制備cDNA按照生產(chǎn)商推薦的方案，使用SMARTScribeTM逆轉(zhuǎn)錄酶(克隆泰克實驗室公司(Clontech)，639536)從mRNA合成cDNA。使用S.N.A.P.凝膠純化試劑盒(英杰公司，45-0078)來進一步純化cDNA。實施例2噬菌體文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建的概覽示于圖1并且相應(yīng)的引物序列詳述于圖2。通過PCR使用TRAV12.2、TRAV21或TRBV6*正向引物和反向引物從純化的cDNA擴增TCR鏈，該引物在TRAC(引物YOL237)或TRBC區(qū)(引物YOL240)內(nèi)退火。參考人TCR鏈的已知序列設(shè)計引物組(《T細胞受體資料手冊》(TCellReceptorFactsBook)，Lefranc和Lefranc,Publ.AcademicPress2001)。所得的PCR產(chǎn)物由完全可變結(jié)構(gòu)域序列和截短的恒定結(jié)構(gòu)域組成(在圖1中標記為A和B)。使用針對TRAC的引物YOL236和YOL238，和針對TRBC2的YOL239和YOL22通過PCR從分離的克隆載體擴增含有非天然半胱氨酸殘基的TRAC和TRBC2結(jié)構(gòu)域的剩余C-端區(qū)(圖1中標記為C和D)。純化的A/C和B/D片段然后在分開的反應(yīng)中通過它們的重疊引物區(qū)(分別是YOL237/YOL236和YOL240/YOL239)縫合在一起。所得的A-C和B-D片段經(jīng)凝膠純化并使用TRAV12.2/21正向引物和YOL22通過重疊PCR縫合在一起，TRBV6*和YOL238引物區(qū)提供重疊序列。該最后縫合反應(yīng)在α鏈和β鏈之間產(chǎn)生隨機重組。使用Nco1/Not1限制性位點來將隨機重組的鏈插入合適的噬菌粒載體中，稱為pIM672(pIM672基于之前所述的pEX922載體(參見WO2005116074))，其然后用于轉(zhuǎn)化高度轉(zhuǎn)化有效的電感受態(tài)TG1大腸桿菌細胞。在30℃下將培養(yǎng)物接種到2xTYag(EzMix，西格瑪，目錄號Y2627加100μg/ml氨芐青霉素和2％葡萄糖)瓊脂平板上，并且所得的細胞菌苔刮到小體積的含2％甘油和2％葡萄糖的2xTYag培養(yǎng)基中。將文庫的甘油儲液儲存在-80℃下。實施例3文庫繁衍和淘選噬菌體顆粒的繁衍使用足夠覆蓋文庫多樣性的等份的噬菌體文庫甘油儲液(TRAV12.2/TRBV6和TRAV21/TRBV6)來接種2xYTag培養(yǎng)基，至0.05的初始OD600。然后將培養(yǎng)物孵育至約0.5的OD600。然后以約20:1噬菌體的感染比例向大腸桿菌加入輔助噬菌體。培養(yǎng)物然后通過反轉(zhuǎn)混合并在37℃下孵育30分鐘。培養(yǎng)物經(jīng)離心并且團塊在2xYTak(2xYTag但沒有葡萄糖并加入50μg/ml卡那霉素)中重懸，并隨后在26℃下?lián)u晃孵育16小時。噬菌體顆粒的分離培養(yǎng)物經(jīng)匯集、離心并且收集上清并經(jīng)0.45μm過濾。洗脫物與7mlPEG/NaCl(20％PEG-8000(西格瑪，目錄號5413)，2.5MNaCl)混合并在冰上孵育30分鐘。樣品然后經(jīng)離心并且棄去上清。團塊在10mlPBS(達氏，西格瑪，目錄號D8537-無Mg，無Ca)中重懸并再離心。收集所得上清，與5mlPEG/NaCl混合并在冰上儲存30分鐘。離心后，團塊在3mlPBS中重懸，重離心，并且收集上清。使用Nanodrop分光光度儀，其中每ml的噬菌體數(shù)量＝OD260x(22.14x1010)來確定噬菌體濃度的估值。按照該方法制備的文庫計算為含有6.8x1012/ml噬菌體顆粒。淘選純化的噬菌體顆粒與3％MPBS緩沖液(PBS(達氏，西格瑪，目錄號D8537–無Mg，無Ca)加3％奶粉孵育，先與鏈霉親和素包被的順磁性珠孵育，然后用15mMEDTA處理，之后廣泛透析，并且最終在0.22μm處過濾)混合并且在室溫下孵育1小時。對于淘選2和淘選3，在前30分鐘后，以2μM的終濃度加入不相關(guān)的非生物素化的肽-HLA構(gòu)建體作為陰性選擇并且另外孵育30分鐘。然后加入10％(v/v)吐溫-20，加上100nM或1μM生物素化的肽-HLA。樣品在室溫下混合60分鐘。通過加入在3％MPBS緩沖液中預封閉的鏈霉親和素包被的順磁性珠來拯救噬菌體-生物素化-HLA復合物，并在室溫下孵育7分鐘。捕獲后，使用磁性濃縮器(代納公司(Dynal))分離珠并用3％MPBS(未EDTA處理的)洗滌三次并用PBS-0.1％吐溫洗滌兩次。噬菌體顆粒在0.5mlTBSC(10mMTris，pH7.4，137mMNaCl，1mMCaCl2和0.1mg/ml胰蛋白酶)中在室溫下洗脫25分鐘并且在37℃下溫和旋轉(zhuǎn)5分鐘。使用洗脫的噬菌體顆粒來感染早對數(shù)期的TG1大腸桿菌細胞。培養(yǎng)物在37℃下培養(yǎng)30分鐘，隨后以1μl、0.1μl和0.01μl的連續(xù)稀釋接種到Y(jié)TEag(1LMQ-水中10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，8gNaCl，15g細菌用瓊脂，加上100μg/ml氨芐青霉素，和2％葡萄糖)上。剩余的培養(yǎng)物經(jīng)濃縮，并且也接種到Y(jié)TEag上。平板在30℃下孵育16小時。第二天將來自平板的菌落加入2xTYag，在干冰上冷凍并在-80℃下儲存用于下一輪淘選。通過PCR分析來自各選擇的菌落以檢查全長插入物。在第三輪選擇后，將菌落從瓊脂平板上刮下并用于以每孔一個克隆接種96孔Cellstar細胞培養(yǎng)平板中的無菌2xTYag。平板在26℃下?lián)u晃孵育16小時。使用這些培養(yǎng)物來接種96孔板中的新鮮2xTYag培養(yǎng)基，并在37℃下?lián)u晃孵育30分鐘直至OD600＝0.5。然后以20:1噬菌體-大腸桿菌感染比例向每孔加入輔助噬菌體，并在37℃下?lián)u晃孵育平板30分鐘。通過離心收集團塊并在2xYTak中重懸。平板在26℃下?lián)u晃孵育16小時。細胞然后經(jīng)離心并且收集上清用于ELISA篩選。實施例4通過ELISA篩選對含抗原結(jié)合TCR的噬菌體進行檢測方法通過ELISA篩選鑒定結(jié)合至肽-HLA復合物的噬菌體克隆。使用感興趣的生物素化肽-HLA和對照肽-HLA來制備ELISA平板。向ELISA平板一式兩份加入噬菌體顆粒，使得一個樣品加入含感興趣的肽-HLA的孔中而另一個加入相鄰的對照孔。使用抗-Fd抗體(西格瑪，目錄號B7786)，之后單克隆抗兔IgG過氧化物酶偶聯(lián)物(γ鏈特異性克隆RG96)(西格瑪，目錄號A1949)來進行檢測。使用KPL實驗室TMB微孔過氧化物酶底物系統(tǒng)(目錄號50-76-00)來檢測結(jié)合的抗體。孔中出現(xiàn)藍色表示噬菌體克隆已經(jīng)結(jié)合至HLA抗原。相應(yīng)對照孔中沒有顏色表明結(jié)合是特異性的。結(jié)果使用實施例1、2和3所述的方法制備TRAV12.2/21TRBV6*文庫，區(qū)別在于在實施例3所述的噬菌體顆粒分離和淘選步驟之前收集2個文庫培養(yǎng)物[TRAV12.2TRBV6*和TRAV21TRBV6*]。在用于制備文庫的3個供體中，一個是HLA-A2陽性，HLA-24陰性，一個是HLA-24陽性，HLA-A2陰性，并且第三個對HLA-A2和HLA-A24都是陰性。如上所述進行ELISA篩選。在包含總共16種不同肽HLA復合物的2輪淘選周期(campaign)中，獲得針對12種不同HLA-A2肽和1種HLA-A24肽的陽性ELISA結(jié)果。這些數(shù)據(jù)證明可使用本發(fā)明的文庫來分離抗原結(jié)合TCR。使用實施例1、2和3所述的方法制備第二TRAV12.2/21TRBV6*文庫，區(qū)別在于在實施例3所述的噬菌體顆粒分離和淘選步驟之前收集2個文庫培養(yǎng)物[TRAV12.2TRBV6*和TRAV21TRBV6*]，并且另外，所有3個用于制備文庫的供體都是HLA-A2HLA-A24陽性的。使用上述方法進行ELISA篩選。在包含18種不同肽HLA復合物的一輪淘選周期中，獲得針對16種不同HLA-A2肽和1HLA-A24肽的陽性ELISA結(jié)果。這些數(shù)據(jù)證明可使用本發(fā)明的文庫來分離抗原結(jié)合TCR。圖3顯示了在用四種不同HLA-A2肽淘選后從ELISA篩選獲得的結(jié)果。實施例5來自淘選由HLA-A2/HLA-A24陰性供體制備的TRAV12.2/21TRBV6*文庫的ELISA篩選為了確認可從HLA-A2/HLA-A24陰性供體制備的文庫中分離抗原結(jié)合TCR，使用與實施例1、2和3所述相同的方法產(chǎn)生第三TRAV12-2/21/TRBV6*文庫，區(qū)別在于在實施例3所述的噬菌體顆粒分離和淘選步驟之前收集2個文庫培養(yǎng)物[TRAV12.2TRBV6*和TRAV21TRBV6*]，并且另外，從單個HLA-A2和HLA-A24陰性供體產(chǎn)生cDNA。使用實施例4所述方法進行ELISA篩選。從包括8種抗原的單個淘選周期中(包括三輪淘選)，獲得了針對4種不同HLA-A2肽和4種不同HLA-A24肽的ELISA結(jié)果。圖4顯示了在用3種不同抗原淘選后ELISA篩選的結(jié)果。實施例6來自淘選單個TRAV12.2TRBV6*和TRAV21TRBV6*文庫的ELISA篩選使用實施例1、2和3所述的方法來制備單個TRAV12.2TRBV6*和TRAV21TRBV6*文庫。文庫在噬菌體分離前不匯集并單獨淘選。TRAV12.2TRBV6*和TRAV21TRBV6*文庫都獲得陽性ELISA結(jié)果。圖5顯示了在用2種不同抗原淘選后ELISA篩選的結(jié)果。實施例7來自淘選由市售mRNA源產(chǎn)生的單個TRAV12.2TRBV6*和TRAV21TRBV6*的ELISA篩選使用與實施例1、2和3相同的方法產(chǎn)生合并的TRAV12-2/21/TRBV6*文庫，區(qū)別在于從市售來源獲得的mRNA集合制備cDNA(基因泰克，目錄號636170；批號：1304103A。供體是380名男性(年齡18-40)和170名女性(年齡18-40)。測試所有供體的HIV-I,II，乙型肝炎和梅毒)。使用50ugmRNA來產(chǎn)生cDNA。文庫在噬菌體分離前不匯集并單獨淘選。使用實施例4所述方法進行ELISA篩選。TRAV12.2TRBV6*和TRAV21TRBV6*文庫都獲得陽性ELISA結(jié)果。圖6顯示了在用一種抗原淘選后ELISA篩選的結(jié)果。實施例8TCR序列的分析可通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測序來獲得來自ELISA陽性噬菌體克隆的TCR的DNA序列。在一些情況中，TCR在單一序列中匯聚，在其他情況中，鑒定到超過一個TCR序列。例如，從圖3所述的ELISA平板中，抗原1獲得3種不同TCR序列，并且抗原2獲得4種不同TCR序列。這些結(jié)果證明，在單次淘選周期中可從本發(fā)明的文庫中分離針對HLA限制型抗原有特異性的多種TCR。實施例9文庫TCR的特異性進一步測試TCR以確定它們對淘選期間選擇它們的肽-HLA復合物的特異性。這可使用與上述相同的ELISA方法，和一組不同的肽-HLA復合物來實現(xiàn)。圖7顯示了來自用從ELISA篩選分離的TCR的其他特異性測試的結(jié)果，其針對結(jié)合抗原1、抗原3和抗原5選擇。這證明可從文庫中分離針對抗原有高親和性的TCR。實施例10對獲自文庫的TCR的Biacore分析方法通過使用BIAcore3000設(shè)備的表面等離振子共振確定從文庫中分離的TCR對抗原的親和性并且以平衡解離常數(shù)(KD)報告。獲自噬菌體克隆的TCR序列用于使用Boulter等，ProteinEng,2003.16:707-711中所述的方法產(chǎn)生TCR的可溶版本。如Garboczi等，ProcNatlAcadSciUSA1992.89:3429-3433和O'Callaghan等，AnalBiochem1999.266:9-15所述制備生物素特異性和對照pMHC單體，并且固定在鏈霉親和素偶聯(lián)的CM-5傳感器芯片上。所有測量以恒定流速在25℃下在補充0.005％吐溫(西格瑪)的PBS緩沖液(西格瑪)中進行。為了測量親和性，可溶TCR的連續(xù)稀釋物流過固定的pMHC并且測定各濃度的平衡響應(yīng)值。通過將具體平衡結(jié)合針對蛋白質(zhì)濃度作圖，之后最小二乘法擬合至朗格繆爾結(jié)合等式，假設(shè)1:1相互作用來確定平衡解離常數(shù)(KD)。結(jié)果圖8顯示了針對抗原2獲得的4個TCR和針對抗原3獲得的2個TCR的平衡解離常數(shù)(KD)。這證明從文庫中分離的TCR對相應(yīng)抗原有可用的親和性。實施例11從文庫中獲得的TCR可具有增強的親和性如通過實施例10所述的表面等離振子共振方法所測定，從TRAV12.2/21TRBV6*文庫分離的特異性肽-HLATCR具有25μM的親和性(KD)。為了獲得這種TCR的更高親和性變體，對α和β鏈的可變結(jié)構(gòu)域序列進行突變。用于產(chǎn)生突變的高親和性TCR變體的方法，如噬菌體展示和定點誘變?yōu)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知(例如，參見WO04044004和Li等，(2005)NatureBiotech23(3):349-354)。通過使用BIAcore3000的單循環(huán)動力學來分析TCR變體針對抗原的親和性和半衰期。將特異性和對照pHLA固定在不同流動池并且注射濃度增加的TCR。使用BIAevaluation軟件來進行總體擬合以同時獲得kon、koff、KD和半衰期值。結(jié)果分離了多種在α(A)或β(B)鏈有突變并且對抗原有更高親和性的變體幾條β鏈變體與抗-CD3抗體融合并且與選擇的α鏈變體重折疊以產(chǎn)生溶解性TCR融合蛋白，其適用于免疫治療應(yīng)用。描述這類TCR融合蛋白產(chǎn)生的其他詳細內(nèi)容見WO10133828。如上所述進行親和性和半衰期測量。TCR融和蛋白KD(pM)半衰期(小時)A2B12420A2B52024A2B33915A10B11820A10B32513A10B51916比較例從新鮮血液分離抗原結(jié)合TCR在構(gòu)建本發(fā)明的文庫之前，在用感興趣的肽-HLA抗原刺激后，從分離自新鮮供體血液的T細胞獲得抗原-特異性TCR。將實驗分成克隆周期，涉及高至20種不同的抗原和從12-20個單個供體獲得的新鮮血液。從相應(yīng)T細胞擴增TCR鏈并用于產(chǎn)生可溶性TCR。由實施例10的Biacore方法來證明抗原結(jié)合。方法從200ml新鮮供體血液中獲得T細胞、B細胞和樹突細胞。進行三輪刺激，首先用自體同源DC，然后用由一組感興趣的抗原肽脈沖處理的自體同源B細胞。通過ELISpot試驗(BD生命科學公司(BDBiosciences))檢測活化的T細胞并且用感興趣的抗原肽，或不相關(guān)的對照抗原來脈沖處理T2細胞。相應(yīng)細胞用干擾素γ(IFNγ)染色并由IFNγ或CD8表達分選。通過ELISpot試驗和四聚體染色來確認抗原結(jié)合細胞系。來自驗證的克隆的TCR鏈通過cDNA末端的快速擴增(RACE)來擴增并且克隆到大腸桿菌表達載體中。TCR從包涵體中純化并再折疊。通過在Biacore上的結(jié)合確認抗原結(jié)合。結(jié)果從多年中進行的5次克隆周期中，鑒定到少于10種特異性抗原結(jié)合TCR。因此，本發(fā)明的文庫在獲得TCR上比該實施例中使用的方法高效得多。參考上述示例性的抗原，抗原1和2包括在2次周期中(分別是4+5和3+4)，并且抗原3和4包括在一次周期中(分別是4和5)。使用該方法沒有獲得針對抗原1、2和3有特異性的TCR。已經(jīng)獲得了結(jié)合抗原4的單個TCR。這證明，即使針對相同抗原，本發(fā)明的文庫在獲得TCR上比該實施例中使用的方法高效得多。用于產(chǎn)生上述實施例4的第二文庫的三種HLA-A2/HLA-A24血液供體已經(jīng)用于克隆周期中的一些。一種用于周期1、2、4和5；第二種用于周期4和5；并且第三種用于周期5。這證明，即使使用相同供體，本發(fā)明的文庫在獲得TCR上比該實施例中使用的方法高效得多。正如證明的那樣，已經(jīng)進行了許多克隆周期來嘗試分離特異性抗原結(jié)合TCR，有非常有限的成功。周期是費力的、不可靠的并且包括收集來自許多供體的多次獻血。本文所示的結(jié)果顯示本發(fā)明能夠快速、有效并可靠鑒定多種抗原結(jié)合TCR，這通過先前已知的技術(shù)無法鑒定或難以鑒定。***如上詳細地描述了優(yōu)選實施方式后，應(yīng)理解，上文所定義的本發(fā)明不限于說明書中所列的特定細節(jié)，能夠在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下進行各種明顯的變化。當前第1頁1 2 3