發(fā)明背景工程蛋白質(zhì),例如能夠結(jié)合兩種或更多種抗原的雙或多特異性抗體是本領(lǐng)域中已知的?？梢允褂眉?xì)胞融合、化學(xué)綴合或重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生這樣的多特異性結(jié)合蛋白。不久前通過使例如IgG抗體形式和單鏈結(jié)構(gòu)域融合，已經(jīng)發(fā)展了多種重組的多特異性抗體形式,例如四價(jià)的雙特異性抗體(參見例如Coloma,M.J.等人,NatureBiotech.15(1997)159-163；WO2001/077342；和Morrison,S.L.,NatureBiotech.25(2007)1233-1234)。也已經(jīng)發(fā)展了幾種其它新的形式，其中所述的抗體核心結(jié)構(gòu)(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)不再被保留，例如能夠結(jié)合兩種或更多種抗原的雙、三或四抗體、小抗體、幾種單鏈形式(scFv、Bis-scFv)(Holliger,P.等人,NatureBiotech.23(2005)1126-1136；Fischer,N.和Léger,O.,Pathobiology74(2007)3-14；Shen,J.等人,J.Immunol.Methods318(2007)65-74；Wu,C.等人,NatureBiotech.25(2007)1290-1297)。所有這樣的形式利用接頭要么使所述的抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)與另外的結(jié)合蛋白(例如scFv)融合，要么使例如兩個(gè)Fab片段或scFv融合(Fischer,N.和Léger,O.,Pathobiology74(2007)3-14)。雖然很明顯接頭用于所述的雙特異性抗體的工程化具有優(yōu)點(diǎn),但是它們也可能在治療設(shè)置中引起問題。實(shí)際上,這些外源肽可以引發(fā)抗所述的接頭本身或所述的蛋白質(zhì)和所述的接頭之間的接合點(diǎn)的免疫應(yīng)答。此外,這些肽的柔性使得它們更易于蛋白酶剪切,潛在地導(dǎo)致差的抗體穩(wěn)定性、聚集和增大的免疫原性。另外，一個(gè)人可能想要保留效應(yīng)子功能,例如補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)或抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC),它們是通過保持與天然存在的抗體高度的相似性通過所述的Fc部分介導(dǎo)的。因此,理想地,應(yīng)該瞄準(zhǔn)發(fā)展具有最小的與人序列的偏差的、在一般結(jié)構(gòu)方面與天然存在的抗體(像IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)非常相似的雙特異性抗體。在一種方法中，已經(jīng)使用四體雜交瘤技術(shù)(參見Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature305(1983)537-540)產(chǎn)生了與天然抗體非常相似的雙特異性抗體，所述的四體雜交瘤技術(shù)基于表達(dá)具有所要的所述的雙特異性抗體的特異性的鼠單克隆抗體的兩種不同的雜交瘤細(xì)胞系的體細(xì)胞融合。由于在所得的雜交-雜交瘤(或四體雜交瘤)細(xì)胞系之內(nèi)兩種不同抗體的重和輕鏈的隨機(jī)配對,產(chǎn)生了至多十種不同的抗體種，其中只有一種是所想要的功能性雙特異性抗體。由于錯(cuò)誤配對的副產(chǎn)物的存在以及顯著地減少的生產(chǎn)收率,需要復(fù)雜的純化工序(參見例如Morrison,S.L.,NatureBiotech.25(2007)1233-1234)。一般而言，如果利用重組表達(dá)技術(shù)，仍然存在錯(cuò)誤配對的副產(chǎn)物的相同問題。一種規(guī)避所述的錯(cuò)誤配對的副產(chǎn)物問題的方法,它被稱為‘旋鈕入孔’(knobs-into-holes)，目的在于通過在CH3結(jié)構(gòu)域中引入突變以改進(jìn)所述的接觸界面，強(qiáng)迫兩種不同抗體的重鏈配對。在一條鏈上，把體積大的氨基酸替換為具有短的側(cè)鏈的氨基酸而產(chǎn)生一個(gè)‘孔’。相反地,把具有大的側(cè)鏈的氨基酸引入其它CH3結(jié)構(gòu)域中以產(chǎn)生一個(gè)‘旋鈕’。通過共表達(dá)這兩種重鏈(以及必須適合于這兩種重鏈的兩條相同的輕鏈),觀察到高收率的異二聚體形成(‘旋鈕-孔’)對同型二聚體形成(‘孔-孔’或‘旋鈕-旋鈕’)(Ridgway,J.B.等人,ProteinEng.9(1996)617-621；和WO96/027011)。通過使用噬菌體展示法重塑所述的兩種CH3結(jié)構(gòu)域的相互作用表面以及引入二硫橋來使所述的異二聚體穩(wěn)定，可以進(jìn)一步增加異二聚體的百分比(Merchant,A.M.等人,NatureBiotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26–35)。在例如在EP1870459A1中描述了用于所述的旋鈕入孔技術(shù)的新的方法。盡管這種形式似乎很有吸引力,但是目前沒有可利用的描述關(guān)于所述的臨床進(jìn)展的數(shù)據(jù)。對這種策略的一個(gè)重要的限制是所述的兩種親本抗體的輕鏈必須是相同的以防止錯(cuò)配和非活性分子的形成。因此，這種技術(shù)不適合作為從抗所述的第一和所述的第二抗原的兩種抗體出發(fā)，容易地發(fā)展重組的抗三個(gè)或四個(gè)抗原的三或四特異性抗體的基礎(chǔ),因?yàn)橐词紫缺仨氁獌?yōu)化這些抗體的重鏈和/要么必須要優(yōu)化所述的相同的輕鏈，然后必須添加另外的抗所述的第三和第四抗原的抗原結(jié)合肽。WO2006/093794涉及異二聚體蛋白質(zhì)結(jié)合組合物。WO99/37791描述了多用途抗體衍生物。Morrison,S.L.等人,J.Immunol.160(1998)2802-2808涉及可變區(qū)結(jié)構(gòu)域交換對IgG的功能性質(zhì)的影響。WO2013/02362涉及異二聚化多肽。WO2013/12733涉及包含異二聚體Fc區(qū)的多肽。WO2012/131555涉及工程的異二聚體免疫球蛋白。EP2647707涉及工程的異二聚體免疫球蛋白。WO2013/026835涉及具有結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性的不含F(xiàn)c的抗體。WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254和Schaefer,W.等人,PNAS,108(2011)11187-1191涉及具有結(jié)構(gòu)域交換的二價(jià)的雙特異性IgG抗體。在WO2009/080252中描述(也參見Schaefer,W.等人,PNAS,108(2011)11187-1191)的以一種結(jié)合方式來防止輕鏈錯(cuò)配(CrossMabVH-VL)的具有VH/VL替換/交換的多特異性抗體清楚地減少了由抗第一抗原的輕鏈與抗所述的第二抗原的錯(cuò)誤的重鏈的錯(cuò)配所引起的副產(chǎn)物(與沒有這樣的結(jié)構(gòu)域交換的方法相比)。然而，它們的制劑不完全不含副產(chǎn)物。所述的主要副產(chǎn)物基于本斯·瓊斯型相互作用-也參見Schaefer,W.等人,PNAS,108(2011)11187-1191；在附錄的圖S1I中)。因此，仍然存在著對進(jìn)一步減少這樣的副產(chǎn)品、改善例如這樣的雙特異性抗體的收率的需要。發(fā)明概述本發(fā)明涉及多特異性抗體,其包含:a)與第一抗原特異性地結(jié)合的第一抗體的第一輕鏈和第一重鏈；和b)與第二抗原特異性地結(jié)合的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈,并且其中在所述的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈中的可變域VL和VH被彼此替換；并且其中i)在a)中所述的第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)取代(在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R)取代),并且其中在a)中所述的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根據(jù)KabatEU索引編號)；或ii)在b)中所述的第二輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)取代(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R)取代),并且其中在b)所述的第二重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式是用于制備根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的方法，其包括下列步驟:A)采用包含核酸分子的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，該核酸分子編碼:a)與第一抗原特異性地結(jié)合的第一抗體的第一輕鏈和第一重鏈；和b)與第二抗原特異性地結(jié)合的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈,其中在所述的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈中可變域VL和VH被彼此替換；并且其中i)在根據(jù)a)所述的第一重鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)a)所述的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代；或ii)在根據(jù)b)所述的第二輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)b)所述的第二重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代；B)在允許合成所述抗體分子的條件下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；和C)從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體分子。本發(fā)明的另外的實(shí)施方式是編碼根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的氨基酸序列的核酸。本發(fā)明的另外的實(shí)施方式是包含根據(jù)本發(fā)明所述的核酸的表達(dá)載體，其能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸。本發(fā)明的另外的實(shí)施方式是包含根據(jù)本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另外的實(shí)施方式是根據(jù)本發(fā)明所述的抗體的組合物,例如藥物或診斷組合物。本發(fā)明的另外的實(shí)施方式是包含根據(jù)本發(fā)明的抗體和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。本發(fā)明的另外的實(shí)施方式是用于治療需要治療的患者的方法,其特征在于向所述的患者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的抗體。根據(jù)本發(fā)明,通過在CH1和CL結(jié)構(gòu)域中在特定的氨基酸位置引入用相反電荷替換帶電荷的氨基酸，可以改善所要的多特異性抗體相比于不受歡迎的本斯·瓊斯型主要副產(chǎn)物的比率。附圖說明圖1根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的一些實(shí)例，在一個(gè)抗體結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域替換并且在一個(gè)CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中具有特定的突變：至少處于CL結(jié)構(gòu)域的第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)取代,和至少處于CH1結(jié)構(gòu)域的第147位的氨基酸或處于CH1結(jié)構(gòu)域的第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。圖1A:在一個(gè)抗體結(jié)合臂中的VH/VL結(jié)構(gòu)域替換和在另一抗體結(jié)合臂的CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中的特定的突變。圖1B:在一個(gè)抗體結(jié)合臂中的VH/VL結(jié)構(gòu)域替換和在同一抗體結(jié)合臂的CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中的特定的突變。圖1C:在一個(gè)抗體結(jié)合臂中的VH/VL結(jié)構(gòu)域替換和在另一抗體結(jié)合臂的CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中的特定突變以及用于加強(qiáng)重鏈異二聚化的對CH3/CH3結(jié)構(gòu)域界面的修飾(如例如旋鈕入孔技術(shù)或備選的異二聚化技術(shù)如例如帶電荷的氨基酸被它們相應(yīng)的相反電荷替換)。圖2A在一個(gè)抗體結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域替換并且在一個(gè)CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面(左側(cè))中沒有突變的多特異性抗體的實(shí)例以及這種多特異性抗體的主要副產(chǎn)物(由于VL-VL本斯·瓊斯型結(jié)構(gòu)域相互作用)-直接地通過質(zhì)譜沒有檢測到，在纖溶酶或LysC消化以后，通過質(zhì)譜通過分析其Fab片段，也沒有檢測到其它可能的作為潛在的副產(chǎn)物的變體。圖2B在一個(gè)抗體結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域替換并且在一個(gè)CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中沒有突變的多特異性抗體的主要副產(chǎn)物的來源(由于VL-VL本斯·瓊斯型結(jié)構(gòu)域相互作用)。圖3圖3A:CH1結(jié)構(gòu)域(顯示了兩種IgG同種型)中的野生型(wt)氨基酸序列，第147位和第213位(根據(jù)KabatEU索引編號)氨基酸加下劃線并突出顯示。圖3B:κ同種型的CL結(jié)構(gòu)域中的野生型(wt)氨基酸序列，第124位和第123位(根據(jù)Kabat編號)氨基酸加下劃線并突出顯示。圖3C:λ同種型的CL結(jié)構(gòu)域中的野生型(wt)氨基酸序列，第124位和第123位氨基酸加下劃線并突出顯示(根據(jù)Kabat編號)。圖4圖4A:通過在CH1/CL界面中根據(jù)本發(fā)明的單一帶電荷的氨基酸取代減少了主要的本斯·瓊斯型副產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)的抗Ang2-VEGF多特異性抗體的實(shí)例。野生型(wt)和單一的帶電荷的氨基酸取代的不同組合的比較1)在CH1/CL界面中沒有特定的氨基酸取代的野生型(wt)抗Ang2-VEGFCrossMAbVh-VL多特異性抗體,2)根據(jù)本發(fā)明的抗Ang2-VEGF多特異性抗體:i)在CL結(jié)構(gòu)域的第124位以及在CH1結(jié)構(gòu)域的第147位(根據(jù)KabatEU索引編號)具有取代,或ii)在CL結(jié)構(gòu)域的第124位以及在CH1結(jié)構(gòu)域的第213位(根據(jù)KabatEU索引編號)具有取代,3)在不同的位置具有取代的其它抗Ang2-VEGFCrossMAbVh-VL多特異性抗體圖4B:在圖4A中顯示了其結(jié)果的多特異性抗體的序列(SEQIDNO)。圖5圖5A:通過在CH1/CL界面中不同的帶電荷的氨基酸取代減少主要的本斯·瓊斯型副產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)的抗Ang2-VEGF多特異性抗體的實(shí)例。野生型(wt)和帶電荷的氨基酸取代的不同組合的比較。圖5B:在圖5A中顯示了其結(jié)果的多特異性抗體的序列(SEQIDNO)。圖6圖6A:通過在CH1/CL界面中不同的帶電荷的氨基酸取代減少主要的本斯·瓊斯型副產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)的抗IL-17/TWEAK多特異性抗體的實(shí)例。野生型(wt)和帶電荷的氨基酸取代的不同組合的比較。圖6B:在圖6A中顯示了其結(jié)果的多特異性抗體的序列(SEQIDNO)。圖7根據(jù)本發(fā)明的二價(jià)多特異性抗體的一些實(shí)例，在一個(gè)抗體結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域替換并且在一個(gè)CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中具有特定的突變,其中所述的多特異性抗體缺乏Fc片段(Fab-CrossFabVH-VL形式和CrossFabVH-VL-Fab):至少處于CL結(jié)構(gòu)域的第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)取代,和至少處于CH1結(jié)構(gòu)域的第147位的氨基酸或處于所述的CH1結(jié)構(gòu)域的第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。圖7A:在一個(gè)抗體結(jié)合臂中的VH/VL結(jié)構(gòu)域替換和在另一個(gè)抗體結(jié)合臂的CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中的特定突變。圖7B:在一個(gè)抗體結(jié)合臂中的VH/VL結(jié)構(gòu)域替換和在同一個(gè)抗體結(jié)合臂的CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中的特定突變。圖7C:在一個(gè)抗體結(jié)合臂中的VH/VL結(jié)構(gòu)域替換，在同一個(gè)抗體結(jié)合臂的CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面具有特定突變；以及在另一抗體結(jié)合臂的CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中的另外的特定突變。圖7D:在一個(gè)抗體結(jié)合臂中的VH/VL結(jié)構(gòu)域替換和在另一個(gè)抗體結(jié)合臂的CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中的特定突變。圖8根據(jù)本發(fā)明的三價(jià)的多特異性抗體的一些實(shí)例，在一個(gè)抗體結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域替換并且在一個(gè)CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中具有特定突的,其中所述的多特異性抗體缺乏Fc片段(Fab-Fab-CrossFabVH-VL形式):至少處于所述的CL結(jié)構(gòu)域的第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)取代(根據(jù)Kabat編號),和至少處于所述的CH1結(jié)構(gòu)域的第147位的氨基酸或處于所述的CH1結(jié)構(gòu)域的第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代(根據(jù)KabatEU索引編號)。圖8A、B、C:在一個(gè)抗體結(jié)合臂中的VH/VL結(jié)構(gòu)域替換和在另一個(gè)抗體結(jié)合臂的CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中的特定突變。圖8D:在一個(gè)抗體結(jié)合臂中的VH/VL結(jié)構(gòu)域替換和在同一個(gè)抗體結(jié)合臂的CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中的特定突變。圖8E:在一個(gè)抗體結(jié)合臂中的VH/VL結(jié)構(gòu)域替換與在同一個(gè)抗體結(jié)合臂的所述的CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中的特定突變；以及在另一抗體結(jié)合臂的CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中的另外的特定突變。圖9根據(jù)本發(fā)明的四價(jià)多特異性抗體的一些實(shí)例，在一個(gè)抗體結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域替換并且在一個(gè)CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中具有特定突變,其中所述的多特異性抗體缺乏Fc片段(Fab-Fab-CrossFabVH-VL形式):至少處于所述的CL結(jié)構(gòu)域的第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)取代,和至少處于所述的CH1結(jié)構(gòu)域的第147位的氨基酸或處于所述的CH1結(jié)構(gòu)域的第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。圖9A:在一個(gè)抗體結(jié)合臂中的VH/VL結(jié)構(gòu)域替換和在另一個(gè)抗體結(jié)合臂的CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中的特定突變。圖9B:在一個(gè)抗體結(jié)合臂中的VH/VL結(jié)構(gòu)域替換和在同一個(gè)抗體結(jié)合臂的CH1/CL結(jié)構(gòu)域界面中的特定突變。發(fā)明詳述在WO2009/080252和Schaefer,W.等人,PNAS,108(2011)11187-1191)(將其并入本文中作為參考)中描述了在一個(gè)結(jié)合臂(CrossFabVH–VL)中具有結(jié)構(gòu)域替換/交換的多特異性抗體。它們清楚地減少了由抗第一抗原的輕鏈與抗第二抗原的錯(cuò)誤重鏈的錯(cuò)配所引起的副產(chǎn)物(與沒有這樣的結(jié)構(gòu)域交換的方法相比)。然而，它們的制劑不完全不含副產(chǎn)物。主要副產(chǎn)物基于本斯·瓊斯型相互作用-也參見Schaefer,W.等人,PNAS,108(2011)11187-1191；在所述的附錄的圖S1I中)。因此，我們現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了通過在CH1和CL結(jié)構(gòu)域中特定的氨基酸位置引入具有相反電荷的帶電荷氨基酸取代，用于進(jìn)一步減少這樣的副產(chǎn)物以改善這樣的多特異性抗體(即多特異性抗體，其僅僅在具有一種抗原特異性的結(jié)合臂中包含VH/VL結(jié)構(gòu)域替換/交換，而另一種抗原特異性的結(jié)合臂不包含VH/VL結(jié)構(gòu)域替換/交換，而是具有野生型抗體結(jié)構(gòu)域排列，如圖1中指示)的產(chǎn)率的方法。因此，本發(fā)明涉及多特異性抗體,其包含:a)與第一抗原特異性地結(jié)合的第一抗體的第一輕鏈和第一重鏈；和b)與第二抗原特異性地結(jié)合的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈,并且其中在所述的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈中可變域VL和VH被彼此替換；和其中i)在根據(jù)a)的第一輕鏈的恒定域CL中處于第124位的氨基酸(根據(jù)Kabat編號)被帶正電荷的氨基酸取代,并且其中根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸(根據(jù)KabatEU索引編號)被帶負(fù)電荷的氨基酸取代；或ii)在根據(jù)b)的第二輕鏈的所述的恒定域CL中，處于第124位的氨基酸(根據(jù)Kabat編號)被帶正電荷的氨基酸取代,并且其中根據(jù)b)的第二重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸(根據(jù)KabatEU索引編號)被帶負(fù)電荷的氨基酸取代。根據(jù)本發(fā)明所述的概念,根據(jù)本發(fā)明的抗體僅僅包含根據(jù)上面和下面i)和ii)所指示的修飾中的一種。因此,根據(jù)本發(fā)明所述的多特異性抗體包含下列中的任何一個(gè):i)在根據(jù)a)所述的第一輕鏈的恒定域CL中，處于第124位的氨基酸(根據(jù)Kabat編號)被帶正電荷的氨基酸取代,并且在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸(根據(jù)KabatEU索引編號)被帶負(fù)電荷的氨基酸取代；或ii)在根據(jù)b)的第二輕鏈的恒定域CL中，處于第124位的氨基酸(根據(jù)Kabat編號)被帶正電荷的氨基酸取代,并且在根據(jù)b)的第二重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸(根據(jù)KabatEU索引編號)被帶負(fù)電荷的氨基酸取代,條件是所述的多特異性抗體不包含根據(jù)i)和ii)提到的兩種修飾。因此，本發(fā)明涉及多特異性抗體,其包含:a)與第一抗原特異性地結(jié)合的第一抗體的第一輕鏈和第一重鏈；和b)與第二抗原特異性地結(jié)合的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈,并且其中在所述的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈中的可變域VL和VH被彼此替換；和其中i)在根據(jù)a)所述的第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，所述的處于第147位的氨基酸或所述的處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代；或ii)在根據(jù)b)所述的第二輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)b)所述的第二重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。本發(fā)明進(jìn)一步涉及多特異性抗體,其包含:a)與第一抗原特異性地結(jié)合的第一抗體的第一輕鏈和第一重鏈；和b)與第二抗原特異性地結(jié)合的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈,并且其中在所述的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈中所述的可變域VL和VH被彼此替換；和其中i)在根據(jù)a)所述的第一輕鏈的恒定域CL中，處于第124位的氨基酸(根據(jù)Kabat編號)被帶正電荷的氨基酸取代,并且其中在根據(jù)a)所述的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸(根據(jù)KabatEU索引編號)被帶負(fù)電荷的氨基酸取代。本發(fā)明進(jìn)一步涉及多特異性抗體,其包含:a)與第一抗原特異性地結(jié)合的第一抗體的第一輕鏈和第一重鏈；和b)與第二抗原特異性地結(jié)合的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈,并且其中在所述的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈中所述的可變域VL和VH被彼此替換；和其中i)在根據(jù)a)所述的第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)a)所述的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。因此關(guān)于包含在根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體中的與第二抗原特異性地結(jié)合的所述第二抗體，下列適用:-在所述的輕鏈之內(nèi)，所述的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域VL被所述抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域VH替換；和-在所述的重鏈之內(nèi)，所述的重鏈可變結(jié)構(gòu)域VH被所述抗體的所述的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域VL替換；和-在所述的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈中的恒定域CL和CH1沒有被彼此替換(保持沒有被交換)。因此關(guān)于包含在根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體中的與第一抗原特異性地結(jié)合的所述抗體，下列適用:-在來源于所述第一抗體的所述第一輕鏈之內(nèi)，所述輕鏈的結(jié)構(gòu)域的順序排列(CL-VL)保持不變；和-在來源于所述第一抗體的所述第一重鏈之內(nèi)，所述重鏈的結(jié)構(gòu)域的順序排列(例如CH1-VH或CH3-CH2-CH1-VH)保持不變(因此與所述的第一抗體特異性地結(jié)合的所述抗體不包含結(jié)構(gòu)域交換,特別是沒有VH/VL的交換)。換句話說,包含在根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體中的與第一抗原特異性地結(jié)合的所述抗體包含:-來源于所述第一抗體的第一輕鏈，其包括所述輕鏈的所述結(jié)構(gòu)域的順序排列VL-CL(從N端到C端方向)；和-來源于所述第一抗體的第一重鏈，其包括所述重鏈的結(jié)構(gòu)域的順序排列CH1-VH(從N端到C端方向)(在一種實(shí)施方式中，所述的第一重鏈包括所述重鏈的所述結(jié)構(gòu)域的順序排列CH3-CH2-CH1-VH(從N端到C端方向)。如本文中所用的，“抗體的輕鏈”是多肽，其沿著N端到C端方向包含抗體輕鏈可變域(VL)和抗體輕鏈恒定域(CL),被縮寫為VL-CL。如本文中所用的，“抗體的重鏈”是多肽，其沿著N端到C端方向包含抗體重鏈可變域(VL)和抗體重鏈恒定域1(CH1)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述的多特異性抗體的重鏈沿著N端到C端方向包含抗體重鏈可變域(VH)和抗體重鏈恒定域1(CH1)并且缺乏重鏈恒定域CH2和CH3,因此被縮寫為VH-CH1。在一種實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體包含至少兩個(gè)Fab片段,其中所述的第一Fab片段包含至少一個(gè)對于第一抗原有特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)；并且所述的第二Fab片段包含至少一個(gè)對于第二抗原有特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn),其中在所述的第二Fab片段中，在所述的第二輕鏈和第二重鏈中的可變域VL和VH被彼此替換；并且其中所述的多特異性抗體缺乏Fc結(jié)構(gòu)域；并且其中i)在所述的第一Fab片段的輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在所述的第一Fab片段的重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代；或ii)在所述的第二Fab片段的輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在所述的第二Fab片段的所述重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體包含至少兩個(gè)Fab片段,其中所述的第一Fab片段包含至少一個(gè)對于第一抗原特異的抗原結(jié)合位點(diǎn)；并且所述的第二Fab片段包含至少一個(gè)對于第二抗原特異的抗原結(jié)合位點(diǎn),其中在所述的第二Fab片段中，在所述的第二輕鏈和第二重鏈中的可變域VL和VH被彼此替換；并且其中所述的多特異性抗體缺乏Fc結(jié)構(gòu)域；并且其中i)在所述的第一Fab片段的輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在所述的第一Fab片段的重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。如本文中所用的,“Fab片段”是指抗體片段，其包括包含輕鏈(CL)的可變VL結(jié)構(gòu)域和恒定域的輕鏈片段和重鏈的可變VH結(jié)構(gòu)域和第一恒定域(CH1)。根據(jù)這種實(shí)施方式所述的多特異性抗體包含至少兩個(gè)Fab片段,其中第二Fab片段的所述重和輕鏈的可變區(qū)被交換了。由于所述可變區(qū)的所述交換,所述第二Fab片段也被稱為“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交換Fab片段”。在所述第二Fab片段中，其中所述的Fab重和輕鏈的可變區(qū)被交換了,所述的交換Fab分子包含由所述的輕鏈可變區(qū)(VL)和所述的重鏈恒定區(qū)(CH1)組成的經(jīng)修飾的重鏈和由所述的重鏈可變區(qū)(VH)和所述的輕鏈恒定區(qū)(CL)組成的經(jīng)修飾的輕鏈。這種交換Fab分子也被稱為CrossFabVH/VL。在本文中使用術(shù)語“Fc結(jié)構(gòu)域”來定義包含至少一部分恒定區(qū)的免疫球蛋白重鏈的C端區(qū)域。例如在天然抗體中,所述的Fc結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)相同的蛋白質(zhì)片段組成,該蛋白質(zhì)片段來源于在IgG、IgA和IgD同種型中所述的抗體的兩個(gè)重鏈的第二和第三恒定域；IgM和IgEFc結(jié)構(gòu)域在每個(gè)多肽鏈中包含三個(gè)重鏈恒定域(CH域2–4)。如本文中所用的，“缺乏Fc結(jié)構(gòu)域”意指本發(fā)明的雙特異性抗體不包含CH2、CH3和CH4結(jié)構(gòu)域；即所述的恒定重鏈僅僅由一個(gè)或更多個(gè)CH1結(jié)構(gòu)域組成。在一種實(shí)施方式中，經(jīng)由肽接頭把所述的第一和第二Fab片段連接。如本文中所用的，術(shù)語“肽接頭”表示具有氨基酸序列的肽,優(yōu)選地它是合成來源的。在一種實(shí)施方式中，使用肽接頭來使所述的Fab片段中的一種與另一種Fab片段的C-或N-端連接，以便形成根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述肽接頭是具有至少5個(gè)氨基酸長度的氨基酸序列的肽,在一種實(shí)施方式中具有5至100個(gè)氨基酸的長度，在進(jìn)一步的實(shí)施方式中具有10至50個(gè)氨基酸的長度。在一種實(shí)施方式中，所述肽接頭是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸,S＝絲氨酸,并且(x＝3,n＝3、4、5或6,并且m＝0、1、2或3)或(x＝4,n＝2、3、4或5并且m＝0、1、2或3),在一種實(shí)施方式中，x＝4并且n＝2或3,在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，x＝4并且n＝2。在一種實(shí)施方式中，所述肽接頭是(G4S)2。使用所述的肽接頭來連接所述的第一Fab片段和所述的第二Fab片段。在一種實(shí)施方式中，使所述的第一Fab片段與所述的第二Fab片段的C-或N-端連接。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體的重鏈沿著N端到C端方向包含抗體重鏈可變域(VH)、抗體重鏈恒定域1(CH1)、抗體重鏈恒定域2(CH2)和抗體重鏈恒定域3(CH3),被縮寫為VH-CH1-CH2-CH3。在所述的多特異性抗體在每個(gè)重鏈中包含結(jié)構(gòu)域VH-CH1-CH2-CH3的情況下,本發(fā)明的另外一個(gè)方面是通過修飾所述所述多特異性抗體的所述第一和第二CH3域以增加包含這些第一和第二CH3結(jié)構(gòu)域的兩種重鏈的異二聚化，可以進(jìn)一步改善所要的多特異性抗體相比于不想要的副產(chǎn)物的比率。存在幾種用于CH3修飾以加強(qiáng)異二聚化的方法,它們被很好地描述在例如中。典型地，在所有這樣的方法中，以互補(bǔ)的方式把所述的第一CH3結(jié)構(gòu)域和所述的第二CH3結(jié)構(gòu)域工程化，使得每個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域(或包含它的重鏈)不再能與它本身同二聚化，而是被迫與所述的互補(bǔ)的工程化的其它CH3結(jié)構(gòu)域異二聚化(使得所述的第一和第二CH3結(jié)構(gòu)域異二聚化并且在所述的兩個(gè)第一或兩個(gè)第二CH3結(jié)構(gòu)域之間不形成同二聚體)。考慮把這些用于改善重鏈異二聚化的不同方法作為不同的備選方案，與在根據(jù)本發(fā)明所述的多特異性抗體中所述的重-輕鏈修飾(在一個(gè)結(jié)合臂中的VH和VL交換/替換和在所述的CH1/CL界面中引入帶電荷的氨基酸被相反電荷取代)組合，其減少輕鏈錯(cuò)配和本斯·瓊斯型副產(chǎn)物。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中(在所述的多特異性抗體在重鏈中包含CH3結(jié)構(gòu)域的情況下)，通過下列改變根據(jù)本發(fā)明所述多特異性抗體的CH3結(jié)構(gòu)域以支持異二聚化:-取代所述的第一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)氨基酸,和-取代所述的第二重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)氨基酸,其中所述氨基酸在所述的多特異性抗體的三級結(jié)構(gòu)之內(nèi)面對所述第一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)氨基酸,其中分別在所述的第一和第二重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域之內(nèi)的相應(yīng)氨基酸要么被-取代,使得具有相反的側(cè)鏈電荷的氨基酸被引入相對重鏈中,要么被-取代，使得具有大的和小的側(cè)鏈體積的氨基酸被引入相對重鏈中,由此通過在一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中具有大的側(cè)鏈體積的氨基酸產(chǎn)生突起,它能夠定位在位于另一CH3結(jié)構(gòu)域之內(nèi)的腔中,其中所述的腔是由具有小的側(cè)鏈體積的氨基酸產(chǎn)生的。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中(在所述的多特異性抗體在重鏈中包含CH3結(jié)構(gòu)域的情況下)，通過所述的“旋鈕入孔”技術(shù)改變根據(jù)本發(fā)明所述多特異性抗體的CH3結(jié)構(gòu)域，所述"旋鈕入孔"技術(shù)以幾個(gè)實(shí)例詳細(xì)地描述在例如WO96/027011，Ridgway,J.B.等人,ProteinEng.9(1996)617-621；和Merchant,A.M.等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；和WO98/050431中。在這種方法中，改變所述的兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的相互作用表面以增大包含這兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)重鏈的異二聚化。(所述的兩個(gè)重鏈的)兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中的每一個(gè)可以是“旋鈕”,同時(shí)另一個(gè)是“孔”。二硫橋的引入進(jìn)一步穩(wěn)定化所述的異二聚體(Merchant,A.M.等人,NatureBiotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并且增大產(chǎn)率。因此，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述多特異性抗體(在每個(gè)重鏈中包含CH3結(jié)構(gòu)域并且)的進(jìn)一步特征在于:根據(jù)a)所述的抗體的第一重鏈的第一CH3結(jié)構(gòu)域和根據(jù)b)所述的抗體的第二重鏈的第二CH3結(jié)構(gòu)域各自在界面處相遇，該界面包含在所述的抗體CH3結(jié)構(gòu)域之間的原始界面,其中改變所述界面以促進(jìn)所述的多特異性抗體的形成,其中所述的改變的特征在于:i)改變一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域,使得在所述的多特異性抗體之內(nèi)，在與另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面相遇的一個(gè)重鏈的所述CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面之內(nèi),氨基酸殘基被具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替換,從而在所述的一個(gè)重鏈的所述CH3結(jié)構(gòu)域的界面之內(nèi)產(chǎn)生突起，該突起能夠定位在另一重鏈的所述CH3結(jié)構(gòu)域的所述界面之內(nèi)的腔中和ii)改變另一重鏈的所述CH3結(jié)構(gòu)域,使得在所述的多特異性抗體之內(nèi)，在與所述的一個(gè)重鏈的所述CH3結(jié)構(gòu)域的所述原始界面相遇的另一重鏈的所述CH3結(jié)構(gòu)域的所述原始界面之內(nèi)，氨基酸殘基被具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替換,從而在另一重鏈的所述CH3結(jié)構(gòu)域的所述界面之內(nèi)產(chǎn)生腔，在所述的一個(gè)重鏈的所述CH3結(jié)構(gòu)域的所述界面之內(nèi)的突起能夠定位在該腔之內(nèi)。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述具有較大的側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)組成的組。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自由丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)和纈氨酸(V)組成的組。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，通過引入半胱氨酸(C)作為每個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)位置中的氨基酸，來進(jìn)一步改變這兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域，使得可以在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之間形成二硫橋。因此，根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面,進(jìn)一步改變所述的一個(gè)重鏈的所述CH3結(jié)構(gòu)域，使得在所述的多特異性抗體之內(nèi)，在與另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面相遇的一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面之內(nèi),一個(gè)氨基酸殘基被半胱氨酸(C)殘基替換,并且進(jìn)一步改變另一重鏈的所述CH3結(jié)構(gòu)域，使得在所述的多特異性抗體之內(nèi)，在與所述的一個(gè)重鏈的所述CH3結(jié)構(gòu)域的所述原始界面相遇的另一重鏈的所述CH3結(jié)構(gòu)域的所述原始界面之內(nèi)，一個(gè)氨基酸殘基被半胱氨酸(C)殘基替換,使得經(jīng)由所述的引入的半胱氨酸殘基可以在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之間形成二硫橋。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述多特異性抗體在所述的“旋鈕鏈”的一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸T366W突變并且在所述的“孔鏈”的另一CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸T366S、L368A、Y407V突變。還可以利用在所述的CH3結(jié)構(gòu)域之間的另外的鏈間二硫橋(Merchant,A.M.等人,NatureBiotech.16(1998)677-681),例如通過把氨基酸Y349C突變引入所述的“孔鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中；以及把氨基酸E356C突變或氨基酸S354C突變引入所述的“旋鈕鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述多特異性抗體(它在每個(gè)重鏈中包含CH3結(jié)構(gòu)域)在一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸S354C和T366W突變并且在所述的兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域中的另一個(gè)中包含氨基酸Y349C、T366S、L368A和Y407V突變(其中在一CH3結(jié)構(gòu)域個(gè)中另外的氨基酸S354C突變和在另一CH3結(jié)構(gòu)域中另外的氨基酸Y349C突變形成鏈間二硫橋)(根據(jù)KabatEU索引編號)?？紤]用于CH3修飾以加強(qiáng)所述的異二聚化的其它技術(shù)作為本發(fā)明的備選方案，并且這些方法被描述在例如WO96/27011、WO98/050431、EP1870459、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012058768、WO2013157954、和WO2013096291中。在一種實(shí)施方式中，備選地利用在EP1870459A1中描述的異二聚化方法。這種方法基于在兩個(gè)重鏈之間在所述的CH3/CH3結(jié)構(gòu)域界面中的特定的氨基酸位置引入帶電荷的氨基酸被相反電荷取代/帶電荷的氨基酸突變?yōu)樗龅南喾措姾?。關(guān)于所述多特異性抗體的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是在所述的多特異性抗體的一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中的氨基酸R409D和K370E突變和在所述的多特異性抗體的另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中的氨基酸D399K和E357K突變(根據(jù)KabatEU索引編號)。在另一種實(shí)施方式中，所述多特異性抗體在所述的“旋鈕鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸T366W突變并且在所述的“孔鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸T366S、L368A和Y407V突變；并且另外在所述的“旋鈕鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸R409D和K370E突變并且在所述的“孔鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸D399K和E357K突變。在另一種實(shí)施方式中，所述多特異性抗體在一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸S354C和T366W突變并且在另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸Y349C、T366S、L368A和Y407V突變；或所述多特異性抗體在一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸Y349C和T366W突變并且在另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸S354C、T366S、L368A和Y407V突變，以及另外在所述的“旋鈕鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸R409D和K370E突變和在所述的“孔鏈”的CH3結(jié)構(gòu)域中包含氨基酸D399K和E357K突變。在一種實(shí)施方式中，備選地利用在WO2013/157953中描述的異二聚化方法。在一種實(shí)施方式中，一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸T366K突變并且另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸L351D突變。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述的一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步包含氨基酸L351K突變。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步包含選自Y349E、Y349D和L368E的氨基酸突變(在一種實(shí)施方式中，包含L368E)。在一種實(shí)施方式中，備選地利用在WO2012/058768中描述的異二聚化方法。在一種實(shí)施方式中，一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸L351Y和Y407A突變并且另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸T366A和K409F突變。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步在第T411、D399、S400、F405、N390或K392位包含氨基酸突變。在一種實(shí)施方式中，所述氨基酸突變選自由下列組成的組:a)T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E和T411W,b)D399R、D399W、D399Y和D399K,c)S400E、S400D、S400R和S400K,d)F405I、F405M、F405T、F405S、F405V和F405W,e)N390R、N390K和N390D,f)K392V、K392M、K392R、K392L、K392F和K392E。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸L351Y和Y407A突變并且另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸T366V和K409F突變。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸Y407A突變并且另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸T366A和K409F突變。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步包含氨基酸K392E、T411E、D399R和S400R突變。在一種實(shí)施方式中，備選地利用在WO2011/143545中描述的異二聚化方法。在一種實(shí)施方式中，在所述重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域中在選自由368和409組成的組的位置處，引入根據(jù)WO2011/143545所述的氨基酸修飾。在一種實(shí)施方式中，備選地利用在WO2011/090762中描述的異二聚化方法，該文獻(xiàn)也使用上面描述的旋鈕入孔技術(shù)。在一種實(shí)施方式中，一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸T366W突變并且另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸Y407A突變。在一種實(shí)施方式中，一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸T366YK突變并且另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸Y407T突變。在一種實(shí)施方式中，所述的多特異性抗體是IgG2同種型的并且備選地利用在WO2010/129304中描述的異二聚化方法。在一種實(shí)施方式中，備選地利用在WO2009/089004中描述的異二聚化方法。在一種實(shí)施方式中，一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域包含K392或N392被帶負(fù)電荷的氨基酸取代(在一種實(shí)施方式中，被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代；在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，包含K392D或N392D突變)并且另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域包含D399、E356、D356或E357被帶正電荷的氨基酸取代(在一種實(shí)施方式中，被賴氨酸(K)或精氨酸(R)取代),在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，包含D399K、E356K、D356K或E357K取代；以及在更加進(jìn)一步的實(shí)施方式中，包含D399K或E356K突變)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述的一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步包含氨基酸K409或R409被帶負(fù)電荷的氨基酸取代(在一種實(shí)施方式中，被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代；在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，包含K409D或R409D突變)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述的一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步或備選地包含氨基酸K439和/或K370被帶負(fù)電荷的氨基酸取代(在一種實(shí)施方式中，被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)取代)。在一種實(shí)施方式中，備選地利用在WO2007/147901中描述的異二聚化方法。在一種實(shí)施方式中，一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸K253E、D282K和K322D突變并且另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域包含氨基酸D239K、E240K和K292D突變。在一種實(shí)施方式中，備選地利用在WO2007/110205中描述的異二聚化方法。如本文中所用的，術(shù)語“結(jié)合位點(diǎn)”或“抗原結(jié)合位點(diǎn)”表示實(shí)際上與配體(例如抗原或它的抗原片段)結(jié)合并且源自于抗體的抗體分子的區(qū)域。所述的抗原結(jié)合位點(diǎn)包括抗體重鏈可變域(VH)和/或抗體輕鏈可變域(VL)或VH/VL對。與所要的抗原特異性地結(jié)合的抗原結(jié)合位點(diǎn)可以來源于:a)抗所述抗原的已知抗體或b)新的抗體或抗體片段，其通過從頭免疫方法,使用(尤其地)所述的抗原蛋白或核酸或其片段,或者通過噬菌體展示獲得。本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)可以包含六個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其在不同程度上對所述的抗原結(jié)合位點(diǎn)的親和力有貢獻(xiàn)。有三個(gè)重鏈可變域CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三個(gè)輕鏈可變域CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。通過與氨基酸序列編譯的數(shù)據(jù)庫比較，確定所述的CDR和構(gòu)架區(qū)(FR)的范圍，在該數(shù)據(jù)庫中，已經(jīng)根據(jù)序列之中的可變性確定了那些區(qū)域。在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)還包括由較少的幾個(gè)CDR組成的功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)(即其中結(jié)合特異性由三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)CDR決定)。例如,少于整套6個(gè)的CDR對于結(jié)合來說可能足夠了。在一些情形中,VH或VL結(jié)構(gòu)域?qū)亲銐虻??？贵w特異性是指所述的抗體對于抗原的特定表位的選擇性識別。例如天然抗體是單特異性的。如本文中所用的，術(shù)語“單特異性”抗體表示具有一個(gè)或更多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)并且每一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與相同抗原的相同表位結(jié)合的抗體。多特異性抗體例如是雙特異性、三或四特異性抗體。雙特異性抗體是具有兩種不同的抗原結(jié)合特異性的抗體。相應(yīng)地,三特異性抗體是具有三種不同的抗原結(jié)合特異性的抗體。四特異性抗體是具有四種不同的抗原結(jié)合特異性的抗體。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的多特異性抗體是雙特異性抗體。如果抗體具有一種以上的特異性,所識別的表位可能與單一抗原或一個(gè)以上抗原有關(guān)。正如在本申請中使用的，術(shù)語“價(jià)”表示在一個(gè)抗體分子中存在指定數(shù)目的結(jié)合位點(diǎn)。例如天然抗體具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并且是二價(jià)的。同樣地,術(shù)語“三價(jià)的”表示在一個(gè)抗體分子中存在三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明所述的抗體包含一個(gè)或更多個(gè)免疫球蛋白種類的免疫球蛋白恒定區(qū)。免疫球蛋白種類包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同種型以及在IgG和IgA的情形中它們的亞型。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中,本發(fā)明的抗體具有IgG型抗體的恒定域結(jié)構(gòu)。如本文中所用的，術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指具有單一的氨基酸組成的抗體分子的制劑。術(shù)語“嵌合抗體”是指包含來自一種來源或物種的可變區(qū)(即結(jié)合區(qū))和來源于不同來源或物種的恒定區(qū)的至少一部分的抗體，其通常通過重組DNA技術(shù)制備。優(yōu)選包含鼠的可變區(qū)和人的恒定區(qū)的嵌合抗體。本發(fā)明所包括的其它優(yōu)選形式的“嵌合抗體”是那些抗體，其與原始抗體的恒定區(qū)相比，恒定區(qū)已經(jīng)被修飾或改變而產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明所述的性質(zhì),特別是關(guān)于C1q結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合。這樣的嵌合抗體也被稱為“類別轉(zhuǎn)換的抗體”。嵌合抗體是表達(dá)的免疫球蛋白基因的產(chǎn)物，所述基因包含編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段。用于產(chǎn)生嵌合抗體的方法涉及常規(guī)的重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，是本領(lǐng)域中熟知的。參見例如Morrison,S.L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855；US5,202,238和US5,204,244。術(shù)語“人源化抗體”是指抗體，其中構(gòu)架或“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)已經(jīng)被修飾而包含與親本免疫球蛋白的CDR相比具有不同特異性的免疫球蛋白的CDR。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,把鼠的CDR植入人抗體的構(gòu)架區(qū)以制備“人源化抗體”。參見例如Riechmann,L.等人,Nature332(1988)323-327；和Neuberger,M.S.等人,Nature314(1985)268-270。本發(fā)明所包括的其它形式的“人源化抗體”是那些抗體，其中與原始抗體的恒定區(qū)相比，所述的恒定區(qū)已經(jīng)被另外修飾或改變而產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明所述的性質(zhì),特別是在C1q結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合方面被改變。如本文中所用的,術(shù)語“人抗體”意圖包括具有來源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)中熟知的(vanDijk,M.A.和vandeWinkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。還可以在轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)中產(chǎn)生人抗體，所述轉(zhuǎn)基因動物在沒有內(nèi)源性免疫球蛋白生產(chǎn)的情況下，在免疫接種時(shí)，能夠產(chǎn)生人抗體的全部組成成分或其部分。在這樣的種系突變小鼠中，所述的人種系免疫球蛋白基因陣列的轉(zhuǎn)移將會導(dǎo)致在抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生人抗體(參見例如Jakobovits,A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)2551-2555；Jakobovits,A.等人,Nature362(1993)255-258；Bruggemann,M.等人,YearImmunol.7(1993)33-40)。還可以在噬菌體展示文庫中產(chǎn)生人抗體(Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks,J.D.等人,J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。也可利用Cole等人和Boerner等人所述的技術(shù)來制備人單克隆抗體(Cole等人,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985)；和Boerner,P.等人,J.Immunol.147(1991)86-95)。正如已經(jīng)關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的嵌合抗體和人源化抗體所提到的那樣，本文中所用的術(shù)語“人抗體”也包括這樣的抗體，它在恒定區(qū)中被修飾而產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明所述的性質(zhì),特別是關(guān)于C1q結(jié)合和/或FcR結(jié)合方面被修飾,例如通過“類別轉(zhuǎn)換”，即Fc部件的改變或突變(例如從IgG1變?yōu)镮gG4和/或IgG1/IgG4突變)。如本文中所用的,術(shù)語“重組的人抗體”意圖包括通過重組手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的所有的人抗體,例如從關(guān)于人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因的宿主細(xì)胞(例如NS0或CHO細(xì)胞)或動物(例如小鼠)中分離的抗體或使用轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)載體表達(dá)的抗體。這樣的重組人抗體在重排形式中具有可變區(qū)和恒定區(qū)。已經(jīng)使根據(jù)本發(fā)明所述的重組人抗體進(jìn)行活體內(nèi)體細(xì)胞高變。因此,所述的重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣的序列，其雖然來源于人種系VH和VL序列并且與人種系VH和VL序列相關(guān),但是可以不必天然地在體內(nèi)存在于所述的人抗體種系全部組成成分之內(nèi)。如本文中所用的，“可變域”(輕鏈的可變域(VL)、重鏈的可變域(VH))表示直接地參與抗體與抗原的結(jié)合的一對輕鏈和重鏈中的每一個(gè)?？勺兊娜溯p鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的通用結(jié)構(gòu)并且每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含四個(gè)構(gòu)架(FR)區(qū)，該構(gòu)架區(qū)的序列是廣泛地保守的,通過三個(gè)“高變區(qū)”(或互補(bǔ)決定區(qū)CDR)連接。構(gòu)架區(qū)采取β片層構(gòu)象并且CDR可以形成連接β片層結(jié)構(gòu)的環(huán)。通過構(gòu)架區(qū)使每個(gè)鏈中CDR保持它們的三維結(jié)構(gòu)，并且與來自另一個(gè)鏈的CDR一起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w重和輕鏈的CDR3區(qū)在根據(jù)本發(fā)明抗體的結(jié)合特異性/親和力中發(fā)揮特別重要的作用，因此提供了本發(fā)明的進(jìn)一步目標(biāo)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語“高變區(qū)”或“抗體的抗原結(jié)合部分”是指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基?！皹?gòu)架”或“FR”區(qū)是除如本文定義的高變區(qū)以外的那些可變域區(qū)域。因此,抗體的輕和重鏈包括從N-到C-端，結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在每個(gè)鏈上的CDR被這樣的構(gòu)架氨基酸分開。特別是,重鏈的CDR3是對抗原結(jié)合貢獻(xiàn)最大的區(qū)域。根據(jù)Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,BethesdaMD(1991)的標(biāo)準(zhǔn)定義確定CDR和FR區(qū)。如本文中所用的,術(shù)語“結(jié)合”、“其特異性地結(jié)合”和“特異性地結(jié)合”是指在采用純化的野生型抗原的體外試驗(yàn)中,優(yōu)選地在等離振子共振試驗(yàn)中，抗體與抗原表位的結(jié)合(GE-HealthcareUppsala,Sweden)。通過術(shù)語ka(關(guān)于來自抗體/抗原復(fù)合物的抗體締合的速率常數(shù))、kD(解離常數(shù))和KD(kD/ka)，來定義結(jié)合的親和力。在一種實(shí)施方式中，“結(jié)合”或“其與...特異性地結(jié)合”意指10-8摩爾/升或更小,在一種實(shí)施方式中10-8M至10-13摩爾/升的結(jié)合親和力(KD)。因此,根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體以10-8摩爾/升或更小的結(jié)合親和力(KD),在一種實(shí)施方式中以10-8至10-13摩爾/升的結(jié)合親和力(KD)與其特異的每個(gè)抗原特異性地結(jié)合。在一種實(shí)施方式中，多特異性抗體以10-9至10-13摩爾/升的結(jié)合親和力(KD)與它的抗原特異性地結(jié)合。通過試驗(yàn)(GE-HealthcareUppsala,Sweden)，可以研究抗體與FcγRIII的結(jié)合。通過術(shù)語ka(關(guān)于來自抗體/抗原復(fù)合物的抗體的締合的速率常數(shù))、kD(解離常數(shù))和KD(kD/ka)，來定義結(jié)合親和力。術(shù)語“表位”包括能夠與抗體特異性地結(jié)合的任何多肽決定簇。在某些實(shí)施方式中,表位決定簇包括分子的化學(xué)活性的表面基團(tuán)，例如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；?以及在某些實(shí)施方式中,表位決定簇可以具有特異的三維結(jié)構(gòu)特征和或特異性的電荷特征。表位是被抗體結(jié)合的抗原的區(qū)域。在某些實(shí)施方式中,當(dāng)抗體在蛋白質(zhì)和/或大分子的復(fù)雜混合物中優(yōu)先地識別它的靶抗原時(shí)，抗體被說成與抗原特異性地結(jié)合。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于:所述抗體是人IgG1亞類的或人IgG1亞類的，具有突變L234A和L235A(根據(jù)KabatEU索引編號)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于:所述抗體是人IgG2亞類的。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于:所述抗體是人IgG3亞類的。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于:所述抗體是人IgG4亞類的或人IgG4亞類的，具有另外的突變S228P(根據(jù)KabatEU索引編號)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于:它是人IgG1或人IgG4亞類的。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于:它是人IgG1亞類的，具有突變L234A和L235A(根據(jù)KabatEU索引編號)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于:它是人IgG1亞類的，具有突變L234A、L235A和P329G(根據(jù)KabatEU索引編號)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于:它是人IgG4亞類的，具有突變S228P和L235E(根據(jù)KabatEU索引編號)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體的特征在于:它是人IgG4亞類的，具有突變S228P、L235E和P329G(根據(jù)KabatEU索引編號)?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體具有改善的特征,例如生物學(xué)或藥理學(xué)活性、藥物動力學(xué)性質(zhì)或毒性?？梢允褂盟鼈兝缬糜谥委熂膊?例如癌癥。正如在本申請中使用的那樣，術(shù)語“恒定區(qū)”表示除可變區(qū)以外的抗體的結(jié)構(gòu)域的總和。恒定區(qū)不直接參與抗原的結(jié)合,但是展示各種效應(yīng)子功能。根據(jù)抗體的重鏈的恒定區(qū)的氨基酸序列,把抗體分成下列類別:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且可以把這些中的幾個(gè)進(jìn)一步分成亞類,例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1和IgA2。對應(yīng)于不同的抗體類別的重鏈恒定區(qū)分別被稱為α、β、ε、γ和μ。可以在所有的五個(gè)抗體類別中發(fā)現(xiàn)的輕鏈恒定區(qū)(CL)被稱為κ(kappa)和λ(lambda)。如本文中所用的，“恒定域”來自于人源，其來自于亞類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人抗體的恒定重鏈區(qū)和/或恒定輕鏈κ或λ區(qū)。這樣的恒定域和區(qū)是現(xiàn)有技術(shù)中熟知的并且例如被Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)描述。如本文中所用的,根據(jù)在Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat編號系統(tǒng)，對重鏈和輕鏈的所有恒定區(qū)和結(jié)構(gòu)域的氨基酸位置進(jìn)行編號，并且在本文中將其稱為“根據(jù)Kabat編號”。具體地,把Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的Kabat編號系統(tǒng)(參見第647-660頁)用于κ和λ同種型的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域CL，并且將KabatEU索引編號系統(tǒng)(見第661－723頁)用于恒定重鏈結(jié)構(gòu)域(CH1、鉸鏈、CH2和CH3,在本文中在這種情況下，通過引用“根據(jù)KabatEU索引編號”進(jìn)一步澄清它)。雖然IgG4亞類的抗體顯示減小的Fc受體(FcγRIIIa)結(jié)合,但是其它IgG亞類的抗體顯示強(qiáng)結(jié)合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(Fc碳水化合物的損失)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435(根據(jù)KabatEU索引編號)是這樣的殘基，如果改變它們，也提供減小的Fc受體結(jié)合(Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.等人,FASEBJ.9(1995)115-119；Morgan,A.等人,Immunology86(1995)319-324；EP0307434)。在一種實(shí)施方式中，與IgG1抗體相比，根據(jù)本發(fā)明的抗體具有減小的FcR結(jié)合。因此,親本抗體是關(guān)于IgG4亞類或在S228、L234、L235和/或D265中具有突變的IgG1或IgG2亞類的FcR結(jié)合,和/或包含PVA236突變(根據(jù)KabatEU索引編號)。在一種實(shí)施方式中，在親本抗體中的突變是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236(根據(jù)KabatEU索引編號)。在另一種實(shí)施方式中，在親本抗體中的突變在IgG4的S228P中以及在IgG1的L234A和L235A(根據(jù)KabatEU索引編號)中。抗體的恒定區(qū)直接地參與ADCC(依賴于抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)和CDC(補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性)。通過補(bǔ)體因子C1q與大多數(shù)IgG抗體亞類的恒定區(qū)的結(jié)合來啟動補(bǔ)體激活(CDC)。C1q與抗體的結(jié)合是由在所謂的結(jié)合位點(diǎn)處確定的蛋白質(zhì)相互作用引起的。這樣的恒定區(qū)結(jié)合位點(diǎn)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的并且例如被Lukas,T.J.等人,J.Immunol.127(1981)2555-2560；Bunkhouse,R.和Cobra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等人,Nature288(1980)338-344；Thomason,J.E.等人,Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idiocies,E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hearer,M.等人,J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.等人,Immunology86(1995)319-324；和EP0307434描述。這樣的恒定區(qū)結(jié)合位點(diǎn)例如特征在于氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根據(jù)KabatEU索引編號)。術(shù)語“抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)”是指在效應(yīng)子細(xì)胞存在下，人靶細(xì)胞被根據(jù)本發(fā)明的抗體裂解。優(yōu)選地通過在效應(yīng)細(xì)胞(例如新鮮地分離的PBMC或從血沉棕黃層中純化的效應(yīng)細(xì)胞,如單核細(xì)胞或天然殺傷(NK)細(xì)胞或永久生長的NK細(xì)胞系)的存在下，采用根據(jù)本發(fā)明的抗體處理抗原表達(dá)細(xì)胞的制劑，來測定ADCC。術(shù)語“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)”表示通過補(bǔ)體因子C1q與大多數(shù)IgG抗體亞類的Fc部分的結(jié)合而啟動的過程。C1q與抗體的結(jié)合是由在所謂的結(jié)合位點(diǎn)處的確定的蛋白質(zhì)相互作用所引起的。這樣的Fc部分的結(jié)合位點(diǎn)是現(xiàn)有技術(shù)中已知的(參見上面)。這樣的Fc部分的結(jié)合位點(diǎn)例如特征在于氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根據(jù)KabatEU索引編號)。亞類IgG1、IgG2和IgG3的抗體通常顯示補(bǔ)體激活，包括C1q和C3結(jié)合,而IgG4不活化補(bǔ)體系統(tǒng)并且不與C1q和/或C3結(jié)合。通過使它們的寡糖組分工程化，可以增強(qiáng)單克隆抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能，正如Umana,P.等人,NatureBiotechnol.17(1999)176-180和US6,602,684中描述的那樣。最通常使用的治療性抗體IgG1型抗體是在每個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域中在Asn297處具有保守性N-糖基化位點(diǎn)的糖蛋白。與Asn297相連的兩個(gè)復(fù)合的二觸角寡糖被埋在CH2域之間,形成與多肽主鏈的廣泛接觸,并且它們的存在對抗體介導(dǎo)效應(yīng)子功能(例如抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC))是必不可少的(Lifely,M.,R.等人,Glycobiology5(1995)813-822；Jefferis,R.等人,Immunol.Rev.163(1998)59-76；Wright,A.和Morrison,S.L.,TrendsBiotechnol.15(1997)26-32)。Umana,P.等人,NatureBiotechnol.17(1999)176-180和WO99/54342顯示在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中催化二等分寡糖形成的糖基轉(zhuǎn)移酶——β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶III(“GnTIII”)的過表達(dá),顯著地增加抗體的體外ADCC活性。Asn297碳水化合物的組成的改變或它的消除也影響與FcγR和C1q的結(jié)合(Umana,P.等人,NatureBiotechnol.17(1999)176-180；Davies,J.等人,Biotechnol.Bioeng.74(2001)288-294；Mimura,Y.等人,J.Biol.Chem.276(2001)45539-45547；Radaev,S.等人,J.Biol.Chem.276(2001)16478-16483；Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.277(2002)26733-26740；Simmons,L.C.等人,J.Immunol.Methods263(2002)133-147)。報(bào)道了用來增強(qiáng)單克隆抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能的方法，例如在WO2005/018572,WO2006/116260,WO2006/114700,WO2004/065540,WO2005/011735,WO2005/027966,WO1997/028267,US2006/0134709,US2005/0054048,US2005/0152894,WO2003/035835,WO2000/061739中。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中,采用在Asn297處的糖鏈，使多特異性抗體糖基化(如果它包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞類的,優(yōu)選地IgG1或IgG3亞類的Fc部分)，由此在所述糖鏈之內(nèi)巖藻糖的量是65％或更低(根據(jù)KabatEU索引編號)。在另一種實(shí)施方式中，在所述糖鏈之內(nèi)巖藻糖的數(shù)量在5％和65％之間,優(yōu)選地在20％和40％之間。根據(jù)本發(fā)明的“Asn297”意指位于Fc區(qū)中大約第297位的氨基酸天冬酰胺。基于抗體微小的序列變化,Asn297還可以位于第297位的上游或下游的一些氨基酸上(通常不超過±3個(gè)氨基酸),即在第294位和第300位之間。在一種實(shí)施方式中，IgG亞類的根據(jù)本發(fā)明糖基化抗體是人IgG1亞類的、具有突變L234A和L235A的人IgG1亞類的或IgG3亞類的。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，在所述糖鏈之內(nèi)，N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NGNA)的數(shù)量是1％或更少和/或N端α-1,3-半乳糖的數(shù)量是1％或更少。糖鏈優(yōu)選地展示與在CHO細(xì)胞中重組表達(dá)的抗體的Asn297相連的N連接的聚糖的特征。術(shù)語“糖鏈顯示與在CHO細(xì)胞中重組表達(dá)的抗體的Asn297相連的N連接的聚糖的特征”表示除了巖藻糖殘基以外，在根據(jù)本發(fā)明的親本抗體的Asn297處的糖鏈具有與在未修飾的CHO細(xì)胞(例如在WO2006/103100中報(bào)告的那些)中表達(dá)的相同抗體的那些結(jié)構(gòu)和糖殘基序列相同的結(jié)構(gòu)和糖殘基序列。正如在本申請之內(nèi)使用的那樣，術(shù)語“NGNA”表示糖殘基N-羥乙酰神經(jīng)氨酸。人IgG1或IgG3的糖基化發(fā)生在Asn297，因?yàn)楹诵膸r藻糖化的二觸角復(fù)合寡糖糖基化以至多兩個(gè)Gal殘基結(jié)束。IgG1或IgG3亞類的人恒定重鏈區(qū)由Kabat,E.,A.等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991)和Brüggemann,M.等人,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361；Love,T.,W.等人,MethodsEnzymol.178(1989)515-527詳細(xì)地報(bào)道。這些結(jié)構(gòu)被定名為G0、G1(α-1,6-或α-1,3-)或G2聚糖殘基,取決于末端Gal殘基的數(shù)量(Raju,T.,S.,BioprocessInt.1(2003)44-53)?？贵wFc部分的CHO型糖基化例如被Routier,F.,H.,GlycoconjugateJ.14(1997)201-207描述。在非糖修飾的CHO宿主細(xì)胞中重組表達(dá)的抗體通常在Asn297處以至少85％的量被巖藻糖化?？贵w的修飾的寡糖可以是雜合體或復(fù)合物。優(yōu)選地，二等分的、減小的/沒有巖藻糖化的寡糖是雜合體。在另一種實(shí)施方式中,二等分的、減小的/沒有巖藻糖化的寡糖是復(fù)合物。根據(jù)本發(fā)明，“巖藻糖的數(shù)量”意指通過MALDI-TOF質(zhì)譜測定的在在Asn297處糖鏈之內(nèi)，與Asn297相連的所有糖結(jié)構(gòu)的全部相關(guān)的，所述糖的數(shù)量(例如復(fù)合物、雜合體和高甘露糖結(jié)構(gòu))，并且被計(jì)算成平均值。巖藻糖的相對量是通過MALDI-TOF在N-糖苷酶F處理的樣品(例如分別為復(fù)合物、雜合體和寡-和高-甘露糖結(jié)構(gòu))中鑒定的與所有糖結(jié)構(gòu)相關(guān)的包含巖藻糖的結(jié)構(gòu)的百分比。根據(jù)本發(fā)明的抗體可以與多種抗原結(jié)合。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,第一抗原和第二抗原均不是活化T細(xì)胞抗原。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,第一抗原和第二抗原均不是CD3。在一種實(shí)施方式中,抗體不與活化T細(xì)胞抗原特異性地結(jié)合。在一種實(shí)施方式中,抗體不與CD3特異性地結(jié)合。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，第一或第二抗原是人TWEAK。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，第一或第二抗原是人IL17。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，第一抗原是人TWEAK并且第二抗原是人IL17。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，第一抗原是人IL17并且第二抗原是人TWEAK。人TWEAK(UniProtKBO43508,細(xì)胞程序死亡的TNF相關(guān)的弱誘導(dǎo)劑)是與細(xì)胞表面締合的II型跨膜蛋白質(zhì)。TWEAK被描述在Chicheportiche,Y.等人,J.Biol.Chem.272(1997)32401-32410；Marsters,S.A.等人,Curr.Biol.8(1998)525-528；Lynch,C.N.等人,J.Biol.Chem.274(1999)8455-8459中。TWEAK的活性形式是可溶性同源三聚體。人和鼠的TWEAK在受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中顯示93％序列同一性。TWEAK受體Fn14(成纖維細(xì)胞生長因子可誘導(dǎo)的14kDa蛋白)是由在配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中富含單個(gè)半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域組成的129個(gè)氨基酸的I型跨膜蛋白。TWEAK的信號傳導(dǎo)經(jīng)由NF-KB途徑活化發(fā)生。TWEAKmRNA在多種組織中表達(dá)，并且在大多數(shù)主要器官如心臟、腦、骨骼肌和胰腺、與免疫系統(tǒng)相關(guān)的組織如脾、淋巴結(jié)和胸腺中被發(fā)現(xiàn)。已經(jīng)在心臟、腦、肺、胎盤、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中檢測到Fn14mRNA。TWEAK無效的和Fnl4無效的敲除小鼠是能生存的、健康的和能生育的，并且具有更多的天然殺傷細(xì)胞和顯示增強(qiáng)的先天的炎性應(yīng)答。TWEAK參與細(xì)胞程序性死亡、增殖、血管生成、缺血半影區(qū)、腦水腫、多發(fā)性硬化癥。人IL-17(也被稱為IL17-A；CTLA-8,SwissProtQ16552,IL17)是由與MS的發(fā)病機(jī)理有牽連的輔助T細(xì)胞(被稱為Th17)的亞組產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子。IL-17A在誘導(dǎo)其它炎性細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子中發(fā)揮作用。采用IL-17A中和抗體治療動物減小了自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)病率和嚴(yán)重度(Komiyama,Y.等人,J.Immunol.177(2006)566-573)。在MS患者的腦脊髓液中IL-17A被過度表達(dá)(Hellings,P.W.等人,Am.J.Resp.CellMol.Biol.28(2003)42-50；Matusevicius,D.等人,MultipleSclerosis5(1999)101-104；WO2005/051422)。另外,IL-17A中和抗體減小膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的小鼠RA模型的嚴(yán)重度和發(fā)生率,并且可以在來自RA患者的發(fā)炎關(guān)節(jié)的滑液中檢測到高水平的IL-17A(Ziolkowska,M.等人,J.Immunol.164(2000)2832-2838；Kotake,S.等人,J.Clin.Invest.103(1999)1345-1352；Hellings,P.W.等人,Am.J.Resp.CellMol.Biol.28(2003)42-50)。根據(jù)本發(fā)明的抗體是通過重組手段產(chǎn)生的。因此,本發(fā)明的一個(gè)方面是編碼根據(jù)本發(fā)明抗體的核酸，以及進(jìn)一步的方面是包含編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體的所述核酸的細(xì)胞。用于重組生產(chǎn)的方法是現(xiàn)有技術(shù)中廣為人知的并且包括在原核和真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)與隨后的分離抗體和通常純化到藥學(xué)上可接受的純度。為了如上在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體,通過標(biāo)準(zhǔn)方法把編碼各自修飾的輕鏈和重鏈的核酸插入表達(dá)載體中。在合適的原核生物或真核生物宿主細(xì)胞如CHO細(xì)胞、NS0細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、COS細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞、酵母或大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),并且從細(xì)胞(裂解以后的上清液或細(xì)胞)中回收抗體。用于抗體的重組生產(chǎn)的一般方法是現(xiàn)有技術(shù)中熟知的并且例如被描述在下列綜述文章中:Makrides,S.C.ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.等人,ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner,R.G.,DrugRes.48(1998)870-880。由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體可以經(jīng)歷從重鏈的C-端翻譯后切除一個(gè)或更多個(gè),特別是一個(gè)或兩個(gè)氨基酸。因此，通過編碼全長重鏈的特異性核酸分子的表達(dá)，由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的抗體可以包括全長重鏈,或者它可以包括全長重鏈的切割變體(在本文中也被稱為切割變體重鏈)。這可能是這樣的情形:其中重鏈的最后兩個(gè)C端氨基酸是甘氨酸(G446)和賴氨酸(K447,根據(jù)KabatEU索引編號)。因此,在本文中，如果不另外指出,包含CH3結(jié)構(gòu)域的重鏈的氨基酸序列被表示成沒有C端甘氨酸-賴氨酸二肽。在一種實(shí)施方式中,正如在本文中具體說明的那樣，包含含有CH3結(jié)構(gòu)域的重鏈的抗體包含另外的C端甘氨酸-賴氨酸二肽(G446和K447,根據(jù)Kabat的EU索引編號)。在一種實(shí)施方式中,正如在本文中具體說明的那樣,包含含有CH3結(jié)構(gòu)域的重鏈的抗體包含另外的C端甘氨酸殘基(G446,根據(jù)Kabat的EU索引編號)。本發(fā)明的組合物,例如本文中描述的藥物組合物,包含本發(fā)明的抗體群?？贵w群可以包括具有全長重鏈的抗體和具有切割的變體重鏈的抗體?？贵w群可以由具有全長重鏈的抗體和具有切割變異重鏈的抗體的混合物組成,其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗體具有切割變異重鏈。在一種實(shí)施方式中,正如在本文中具體說明的那樣，包含本發(fā)明的抗體群的組合物包含抗體，該抗體包含含有CH3結(jié)構(gòu)域的重鏈與另外的C端甘氨酸-賴氨酸二肽(G446和K447,根據(jù)KabatEU索引編號)。在一種實(shí)施方式中,正如在本文中具體說明的那樣，包含本發(fā)明的抗體群的組合物包含抗體，該抗體包含含有CH3結(jié)構(gòu)域的重鏈與另外的C端甘氨酸殘基(G446,根據(jù)KabatEU索引編號)。在一種實(shí)施方式中,這樣的組合物包含由下列抗體組成的抗體群:包含在本文中具體說明的含有CH3結(jié)構(gòu)域的重鏈的抗體；包含在本文中具體說明的含有CH3結(jié)構(gòu)域的重鏈與另外的C端甘氨酸殘基(G446,根據(jù)KabatEU索引編號)的抗體；和包含在本文中具體說明的含有CH3結(jié)構(gòu)域的重鏈與另外的C端甘氨酸-賴氨酸二肽(G446和K447,根據(jù)KabatEU索引編號)的抗體。通過常規(guī)的免疫球蛋白純化步驟例如,A蛋白瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析法，合適地從培養(yǎng)基中分離根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體。使用常規(guī)方法容易地分離編碼單克隆抗體的DNA和RNA并且測序。雜交瘤細(xì)胞可以充當(dāng)這樣的DNA和RNA的來源。一旦分離,就可以把DNA插入表達(dá)載體中,然后把該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到否則不產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞(例如HEK293細(xì)胞、CHO細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞)中，以在宿主細(xì)胞中獲得重組單克隆抗體的合成。通過把合適的核苷酸變化引入到抗體DNA中或通過核苷酸合成，制備了多特異性抗體的氨基酸序列變體(或突變體)。然而,可以僅僅在非常有限的范圍內(nèi)(例如如上述)進(jìn)行這樣的修飾。舉例來說,修飾不改變上述的抗體特征，例如IgG同種型和抗原結(jié)合,但是可以進(jìn)一步改善重組生產(chǎn)的產(chǎn)率、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或便于純化。在某些實(shí)施方式中,提供了具有一個(gè)或更多個(gè)保守性氨基酸取代的抗體變體?？梢愿鶕?jù)常見的側(cè)鏈性質(zhì)把氨基酸分組:(1)疏水性的:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水的:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的:Asp、Glu；(4)堿性的:His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向的殘基:Gly、Pro；(6)芳香族的:Trp、Tyr、Phe。表1–具有特異性性質(zhì)的氨基酸正如本申請中使用的那樣，術(shù)語“宿主細(xì)胞”表示可以被工程化而產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明抗體的任何種類的細(xì)胞系統(tǒng)。在一種實(shí)施方式中，使用HEK293細(xì)胞和CHO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。如本文中所用的,表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可被互換地使用并且所有這樣的名稱包括后代。因此,詞“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括原代受試者細(xì)胞和來源于其的培養(yǎng)物，不考慮轉(zhuǎn)移的數(shù)目。也理解由于故意的或非故意的突變，所有的后代可以不必在DNA含量方面精確地相同。包括具有與在最初轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選的相同功能或生物學(xué)活性的變異后代。當(dāng)意指不同的名稱時(shí)，從上下文中清楚地得知。在NS0細(xì)胞中的表達(dá)例如被Barnes,L.M.等人,Cytotechnology32(2000)109-123；Barnes,L.M.等人,Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。瞬時(shí)表達(dá)例如被Durocher,Y.等人,Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述。可變域的克隆被Orlandi,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)3833-3837；Carter,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289；和Norderhaug,L.等人,J.Immunol.Methods204(1997)77-87描述。優(yōu)選的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)(HEK293)被Schlaeger,E.-J.和Christensen,K.在Cytotechnology30(1999)71-83和被Schlaeger,E.-J.,J.Immunol.Methods194(1996)191-199描述。例如適用于原核生物的對照序列包含啟動子、任選地操縱子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動子、增強(qiáng)子和聚腺苷酸化信號。當(dāng)把核酸置于與另一核酸序列的功能關(guān)系中時(shí)，核酸是“有效連接的”。例如,前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA如果被表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)，那么所述DNA與所述多肽的DNA有效連接，如果啟動子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么所述啟動子或增強(qiáng)子與編碼序列有效連接；或如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于促進(jìn)翻譯的位置，那么核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列有效連接。一般地,“有效連接的”意指連接的DNA序列是鄰接的,以及在分泌前導(dǎo)序列的情形中，是鄰接的并且在讀框中。然而,增強(qiáng)子不必是鄰接的。通過在方便的限制位點(diǎn)處的連接來完成連接。如果這樣的位點(diǎn)不存在,根據(jù)通常的做法使用合成寡核苷酸銜接頭或接頭。通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行抗體的純化，以便除去細(xì)胞組分或其它污染物,例如其它細(xì)胞核酸或蛋白質(zhì),這些標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域中熟知的其它技術(shù)。參見Ausubel,F.等人主編,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork(1987)。不同的方法被很好地建立了并且被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)純化,例如采用微生物蛋白質(zhì)的親和層析法(例如A蛋白或G蛋白親和層析法)、離子交換層析法(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合方式交換)、親硫吸附(例如采用β-巰基乙醇和其它SH配體)、疏水性相互作用或芳香族吸附層析法(例如采用苯基-瓊脂糖、親氮雜芳基樹脂或間氨基苯基硼酸)、金屬螯合親和層析(例如采用Ni(II)-和Cu(II)親和性物質(zhì))、大小排阻層析和電泳方法(例如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。本發(fā)明的一個(gè)方面是包含根據(jù)本發(fā)明的抗體的藥物組合物。本發(fā)明的另一個(gè)方面是根據(jù)本發(fā)明的抗體用于生產(chǎn)藥物組合物的用途。本發(fā)明的進(jìn)一步方面是用于生產(chǎn)包含根據(jù)本發(fā)明的抗體的藥物組合物的方法。在一個(gè)方面中,本發(fā)明提供了包含與藥用載體配制在一起的根據(jù)本發(fā)明的抗體的組合物,例如藥物組合物。本發(fā)明的一種實(shí)施方式是根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體在治療癌癥中的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面是所述藥物組合物在治療癌癥中的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面根據(jù)本發(fā)明的抗體用于生產(chǎn)用于治療癌癥的藥物的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過向需要這類治療的患者施用根據(jù)本發(fā)明的抗體來治療遭受癌癥的患者的方法。本發(fā)明的一種實(shí)施方式是根據(jù)本發(fā)明的多特異性抗體在治療炎性疾病、自身免疫性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、肌肉疾病(例如肌肉萎縮)、多發(fā)性硬化癥、慢性腎臟疾病、骨疾病(例如在多發(fā)性骨髓瘤中的骨退化)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎和血管損傷中的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面是所述藥物組合物在治療炎性疾病、自身免疫性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、肌肉疾病(例如肌肉萎縮)、多發(fā)性硬化癥、慢性腎臟疾病、骨疾病(例如在多發(fā)性骨髓瘤中的骨退化)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎和血管損傷中的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面是根據(jù)本發(fā)明的抗體用于生產(chǎn)用于治療炎性疾病、自身免疫性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、肌肉疾病(例如肌肉萎縮)、多發(fā)性硬化癥、慢性腎臟疾病、骨疾病(例如在多發(fā)性骨髓瘤中的骨退化)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎和血管損傷的藥物的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過向需要這樣的治療的患者施用根據(jù)本發(fā)明的抗體來治療遭受炎性疾病、自身免疫性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、肌肉疾病(例如肌肉萎縮)、多發(fā)性硬化癥、慢性腎臟疾病、骨疾病(例如在多發(fā)性骨髓瘤中的骨退化)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎和血管損傷的患者的方法。如本文中所用的,“藥用載體”包括生理學(xué)上相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌藥、等滲劑和延遲吸收劑等等。優(yōu)選地,載體適用于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腸胃外、脊椎或表皮施用(例如通過注射或輸注)。可以通過本領(lǐng)域中已知的多種方法施用本發(fā)明的組合物。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解的那樣,施用途徑和/或方式將會隨所要的結(jié)果而變化。為了通過某種施用途徑施用本發(fā)明的化合物,采用防止它滅活的物質(zhì)包衣化合物或與防止它滅活的物質(zhì)共同施用化合物可能是必要的。例如,可以向受試者施用在合適的載體(例如脂質(zhì)體或稀釋劑)中的化合物。藥學(xué)上可接受的稀釋劑包括鹽水和水性緩沖溶液。藥用載體包括無菌水溶液或分散體和用于臨時(shí)配制無菌的注射溶液或分散體的無菌粉末。這樣的介質(zhì)和作用劑用于藥學(xué)上的活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域中已知的。如本文中所用的，短語“腸胃外施用”和“以腸胃外方式施用”意指除了腸內(nèi)和局部施用以外的施用方式,通常通過注射,并且非限定性地包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外和胸骨內(nèi)的注射和輸注。如本文中所用的，術(shù)語癌癥是指增生性疾病,例如淋巴瘤、淋巴細(xì)胞性白血病、肺癌、非小細(xì)胞肺(NSCL)癌、細(xì)支氣管肺泡細(xì)胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部癌癥、皮膚或眼內(nèi)黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區(qū)癌癥、胃癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病、食管癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌癥、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細(xì)胞性癌癥、膽癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)瘤、脊椎軸腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、施萬鞘瘤(schwanomas)、室管膜瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細(xì)胞癌、垂體腺瘤和尤因氏肉瘤,包括上述癌癥中任意一種或一種或更多種上述癌癥的的組合的難治性形式。這些組合物也可以包含佐劑例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。通過上文的滅菌方法和通過包含各種抗菌劑和抗真菌藥(例如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等等)，可以確保防止微生物存在。把等滲劑(例如糖、氯化鈉等等)包括到組合物中也可以是所希望的。另外,可以通過包含延遲吸收的作用劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，帶來可注射的藥物形式的延長吸收。與選擇的施用途徑無關(guān),通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，把可以以合適的水合形式和/或在本發(fā)明藥物組合物中使用的本發(fā)明化合物配制成藥學(xué)上可接受的劑型?？梢愿淖儽景l(fā)明藥物組合物中活性成分的真實(shí)的劑量水平，以便在對患者無毒的情況下，獲得有效地達(dá)到針對特定的患者、組合物和施用方式的相要的治療應(yīng)答的活性成分的量。所選擇的劑量水平將會取決于多種藥物動力學(xué)因素，包括使用的本發(fā)明特定的組合物的活性、施用途徑、施用時(shí)間、所使用的特定的化合物的排泄速率、治療的持續(xù)時(shí)間、與所使用的特定的組合物組合使用的其它藥物、化合物和/或材料、被治療的患者的年齡、性別、體重、狀況、一般健康情況和醫(yī)療史等等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中熟知的因素。組合物必須是無菌的和流動的達(dá)到這樣的程度以至可通過注射器遞送組合物。除了水之外,載體還優(yōu)選地是等滲的緩沖鹽水溶液。例如在分散體的情形中，通過利用包衣例如卵磷脂,通過保持需要的粒子大小和通過利用表面活性劑，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。在很多情況下,優(yōu)選在組合物中包含等滲劑,例如糖、多元醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)和氯化鈉。如本文中所用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指載體核酸轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的過程。如果使用沒有可怕的細(xì)胞壁屏障的細(xì)胞作為宿主細(xì)胞,例如通過由Graham和VanderEh,Virology52(1978)546ff描述的磷酸鈣沉淀方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。然而,也可以使用用于把DNA引入到細(xì)胞中的其它方法，例如通過核注射或通過原生質(zhì)體融合。如果使用原核細(xì)胞或包含實(shí)質(zhì)性的細(xì)胞壁構(gòu)造的細(xì)胞,例如一種轉(zhuǎn)染方法是使用氯化鈣的鈣處理，如由Cohen,F.N等人,PNAS69(1972)7110及以下所描述的那樣。如本文中所用的,“表達(dá)”是指借以把核酸轉(zhuǎn)錄成mRNA的過程和/或隨后借以把轉(zhuǎn)錄的mRNA(也被稱為轉(zhuǎn)錄物)翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的過程。轉(zhuǎn)錄物和編碼多肽總體地被稱為基因產(chǎn)物。如果多核苷酸源自于基因組DNA,在真核細(xì)胞中的表達(dá)可以包括剪接mRNA?！拜d體”是核酸分子,特別是自我復(fù)制的核酸分子,它把插入的核酸分子轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中和/或之間。該術(shù)語包括主要地起把DNA或RNA插入到細(xì)胞中(例如染色體整合)作用的載體、主要地起復(fù)制DNA或RNA作用的載體和起轉(zhuǎn)錄和/或翻譯DNA或RNA作用的表達(dá)載體的復(fù)制。也包括提供一種以上功能的載體?！氨磉_(dá)載體”是多核苷酸,當(dāng)它被引入合適的宿主細(xì)胞中時(shí),可以被轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽?！氨磉_(dá)系統(tǒng)”通常是指由可以起產(chǎn)生所要的表達(dá)產(chǎn)物作用的表達(dá)載體組成的合適的宿主細(xì)胞。在下列本發(fā)明的具體實(shí)施方式中列舉了:1.多特異性抗體,其包含:a)與第一抗原特異性地結(jié)合的第一抗體的第一輕鏈和第一重鏈；和b)與第二抗原特異性地結(jié)合的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈,并且其中在第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈中可變域VL和VH被彼此替換；和其中i)在根據(jù)a)的第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代；或ii)在根據(jù)b)的第二輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)b)的第二重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。2.多特異性抗體,其包含:a)與第一抗原特異性地結(jié)合的第一抗體的第一輕鏈和第一重鏈；和b)與第二抗原特異性地結(jié)合的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈,并且其中在第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈中可變域VL和VH被彼此替換；和其中i)在根據(jù)a)的第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。3.根據(jù)實(shí)施方式1或2的多特異性抗體,其中在根據(jù)a)第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。4.根據(jù)實(shí)施方式1或2的多特異性抗體,其中在根據(jù)a)的第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)取代,并且其中在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。5.根據(jù)實(shí)施方式4的多特異性抗體,其中在根據(jù)a)的第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且處于第123位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)取代；并且其中在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代并且處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。6.根據(jù)實(shí)施方式1或2的多特異性抗體,其中在根據(jù)a)的第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R)(根據(jù)Kabat編號)取代,并且其中在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。7.根據(jù)實(shí)施方式1或2的多特異性抗體,其中在根據(jù)b)的第二輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代；并且其中在根據(jù)b)的第二重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。8.根據(jù)實(shí)施方式1或2的多特異性抗體,其中在根據(jù)b)的第二輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)b)的第二重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。9.根據(jù)實(shí)施方式8的多特異性抗體,其中在根據(jù)b)的第二輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且處于第123位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)取代,并且其中在根據(jù)b)的第二重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代并且處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。10.根據(jù)實(shí)施方式1或2的多特異性抗體,其中在根據(jù)b)的第二輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)取代,并且其中在根據(jù)b)的第二重鏈的恒定域CH1中，處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。11.根據(jù)實(shí)施方式5的多特異性抗體,其中在根據(jù)a)的第一輕鏈的恒定域CL中，處于第124位的氨基酸被賴氨酸(K)(根據(jù)Kabat編號)取代并且處于第123位的氨基酸被賴氨酸(K)(根據(jù)Kabat編號)取代,并且其中在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸被谷氨酸(E)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代并且處于第213位的氨基酸被谷氨酸(E)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。12.根據(jù)實(shí)施方式9的多特異性抗體,其中在根據(jù)b)的第二輕鏈的恒定域CL中，處于第124位的氨基酸被賴氨酸(K)(根據(jù)Kabat編號)取代并且處于第123位的氨基酸被賴氨酸(K)(根據(jù)Kabat編號)取代,并且其中在根據(jù)b)的第二重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸被谷氨酸(E)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代并且處于第213位的氨基酸被谷氨酸(E)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。13.根據(jù)前面的實(shí)施方式中任意一種的多特異性抗體,其中根據(jù)a)的第一輕鏈和根據(jù)b)的第二輕鏈的恒定域CL是kappa同種型的。14.根據(jù)實(shí)施方式1至12中任意一種的多特異性抗體,其中根據(jù)a)的第一輕鏈的恒定域CL是λ同種型的并且根據(jù)b)的第二輕鏈的恒定域CL是kappa同種型的。15.根據(jù)實(shí)施方式1至12中任意一種的多特異性抗體,其中根據(jù)a)的第一輕鏈和根據(jù)b)的第二輕鏈的恒定域CL是λ同種型的。16.根據(jù)前面的實(shí)施方式中任意一種的多特異性抗體，其中在根據(jù)a)的第一輕鏈或根據(jù)b)的第二輕鏈的恒定域CL中,其中處于第124位的氨基酸沒有獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)取代并且它是kappa同種型的,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中被谷氨酸(E))(根據(jù)Kabat編號)取代。17.根據(jù)前面的實(shí)施方式中任意一種的抗體,其特征在于:根據(jù)a)的抗體的第一重鏈的第一CH3結(jié)構(gòu)域和根據(jù)b)的抗體的第二重鏈的第二CH3結(jié)構(gòu)域各自在界面處相遇，該界面包括在抗體的CH3結(jié)構(gòu)域之間的原始界面,其中改變所述界面以促進(jìn)多特異性抗體的形成,其中改變的特征在于:i)改變一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域,使得在多特異性抗體之內(nèi)，在與另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面相遇的一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面之內(nèi)，氨基酸殘基被具有較大側(cè)鏈體積的氨基酸替換,從而在一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面之內(nèi)產(chǎn)生突起，該突起能夠定位在另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面之內(nèi)的腔中并且ii)改變另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域,使得在多特異性抗體之內(nèi)，在與一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面相遇的另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的原始界面之內(nèi)，氨基酸殘基被具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基替換,從而在另一重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面之內(nèi)產(chǎn)生腔，在一個(gè)重鏈的CH3結(jié)構(gòu)域的界面之內(nèi)的突起能夠定位在該腔之內(nèi)。18.根據(jù)實(shí)施方式17的抗體,其特征在于:具有較大側(cè)鏈體積的所述氨基酸殘基選自由精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)組成的組,并且所述具有較小側(cè)鏈體積的氨基酸殘基選自由丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)和纈氨酸(V)組成的組。19.根據(jù)實(shí)施方式17或18的抗體,其特征在于:通過引入半胱氨酸(C)作為每個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)位置中的氨基酸來進(jìn)一步改變這兩種CH3結(jié)構(gòu)域，使得可以在兩個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域之間形成二硫橋。20.根據(jù)前面的實(shí)施方式中任意一種的多特異性抗體，其中所述抗體是雙特異性的。21.根據(jù)前面的實(shí)施方式中任意一種的多特異性抗體，其與人TWEAK特異性地結(jié)合并且與人IL17特異性地結(jié)合,其中A)所述多特異性抗體包含SEQIDNO:24的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和SEQIDNO:25的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)；和B)所述多特異性抗體包含SEQIDNO:26的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和SEQIDNO:27的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)。22.雙特異性抗體，其包含:a)與人TWEAK特異性地結(jié)合的第一抗體的第一輕鏈和第一重鏈,它包括SEQIDNO:24的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和SEQIDNO:25的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)；和b)與人IL-17特異性地結(jié)合的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈,它包括SEQIDNO:26的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和SEQIDNO:27的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)；其中在第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈中可變域VL和VH被彼此替換,并且其中i)在根據(jù)a)的第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R)取代,并且其中在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。23.根據(jù)實(shí)施方式21的雙特異性抗體,其中在根據(jù)a)的第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且處于第123位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)取代；并且其中在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代并且處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代。24.根據(jù)實(shí)施方式21至23中任意一種的抗體在治療癌癥或炎性疾病、自身免疫病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、肌肉疾病(例如肌肉萎縮)、多發(fā)性硬化癥、慢性腎臟疾病、骨疾病(例如在多發(fā)性骨髓瘤中的骨退化)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎和血管損傷中的用途。25.根據(jù)實(shí)施方式21至23中任意一種的抗體用于生產(chǎn)用于治療癌癥或炎性疾病、自身免疫病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、肌肉疾病(例如肌肉萎縮)、多發(fā)性硬化癥、慢性腎臟疾病、骨疾病(例如在多發(fā)性骨髓瘤中的骨退化)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎和血管損傷的藥物的用途。26.根據(jù)實(shí)施方式1至23中任意一種的多特異性抗體，其特征在于:它是人IgG1或人IgG4亞類的。27.根據(jù)實(shí)施方式1至23和26中任意一種的多特異性抗體,其特征在于它是具有突變L234A和L235A(根據(jù)KabatEU索引編號)的人IgG1亞類的。28.根據(jù)實(shí)施方式1至23和26至27中任意一種的多特異性抗體,其特征在于它是具有突變L234A、L235A和P329G(根據(jù)KabatEU索引編號)的人IgG1亞類的。29.根據(jù)前面的實(shí)施方式1至23和26中任意一種的多特異性抗體，其特征在于它是具有突變S228P和L235E(根據(jù)KabatEU索引編號)的人IgG4亞類的。30.根據(jù)前面的實(shí)施方式1至23和26至29中任意一種的多特異性抗體，其特征在于它是具有突變S228P、L235E和P329G(根據(jù)KabatEU索引編號)的人IgG4亞類的。31.用于制備根據(jù)實(shí)施方式1至23和26至30中任意一種的多特異性抗體的方法,包括下列步驟:A)采用包含核酸分子的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，該核酸分子編碼:a)與第一抗原特異性地結(jié)合的第一抗體的第一輕鏈和第一重鏈；和b)與第二抗原特異性地結(jié)合的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈,并且其中在第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈中可變域VL和VH被彼此替換；和其中i)在根據(jù)a)的第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代；或ii)在根據(jù)b)的第二輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)b)的第二重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代；B)在允許合成所述抗體分子的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和C)從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體分子。32.編碼根據(jù)實(shí)施方式1至23和26至30中任意一種的多特異性抗體的氨基酸序列的核酸。33.包含根據(jù)實(shí)施方式32核酸的表達(dá)載體，它能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸。34.包含根據(jù)實(shí)施方式33的載體的宿主細(xì)胞。35.包含根據(jù)實(shí)施方式1至23和26至30中任意一種的抗體的組合物。36.包含根據(jù)實(shí)施方式1至23和26至30中任意一種的抗體和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。37.用于治療需要治療的患者的方法,其特征在于向患者施用治療有效量的根據(jù)實(shí)施方式1至23和26至30中任意一種的抗體。38.用于減少多特異性抗體的副產(chǎn)物的方法,包括下列步驟:A)采用包含核酸分子的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，該核酸分子編碼:a)與第一抗原特異性地結(jié)合的第一抗體的第一輕鏈和第一重鏈；和b)與第二抗原特異性地結(jié)合的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈,并且其中在第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈中可變域VL和VH被彼此替換；和其中為了減少多特異性抗體的副產(chǎn)物,包括了下列取代:i)在根據(jù)a)的第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代；或ii)在根據(jù)b)的第二輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)b)的第二重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代；B)在允許合成所述抗體分子的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和C)從所述培養(yǎng)物中回收所述抗體分子。39.用于減少多特異性抗體的副產(chǎn)物的方法,包括下列步驟:A)采用包含核酸分子的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，該核酸分子編碼:a)與第一抗原特異性地結(jié)合的第一抗體的第一輕鏈和第一重鏈；和b)與第二抗原特異性地結(jié)合的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈,并且其中在第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈中可變域VL和VH被彼此替換；和其中包括了下列取代:i)在根據(jù)a)的第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)、組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R))取代，并且其中在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代；或ii)在根據(jù)b)的第二輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R))取代，并且其中在根據(jù)b)的第二重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代，B)在允許合成所述抗體分子的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和C)從所述培養(yǎng)物中回收具有減少的副產(chǎn)物分布的所述抗體分子。40.用于減少多特異性抗體的副產(chǎn)物的方法,包括下列步驟:A)采用包含核酸分子的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，該核酸分子編碼:a)與第一抗原特異性地結(jié)合的第一抗體的第一輕鏈和第一重鏈；和b)與第二抗原特異性地結(jié)合的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈,并且其中在第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈中可變域VL和VH被彼此替換；和其中包括了下列取代:i)在根據(jù)a)的第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R))取代，并且其中在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代，B)在允許合成所述抗體分子的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和C)從所述培養(yǎng)物中回收具有減少的副產(chǎn)物分布的所述抗體分子。41.下列取代用于減少多特異性抗體的副產(chǎn)物形成(或用于減少副產(chǎn)物分布)的用途:i)在根據(jù)a)的第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代；或ii)在根據(jù)b)的第二輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)b)的第二重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代；其中所述多特異性抗體包含:a)與第一抗原特異性地結(jié)合的第一抗體的第一輕鏈和第一重鏈；和b)與第二抗原特異性地結(jié)合的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈,并且其中在第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈中可變域VL和VH被彼此替換。42.下列取代用于減少多特異性抗體的副產(chǎn)物形成(或用于減少副產(chǎn)物分布)的用途:i)在根據(jù)a)的第一輕鏈的恒定域CL中,處于第124位的氨基酸獨(dú)立地被賴氨酸(K)、精氨酸(R)或組氨酸(H)(根據(jù)Kabat編號)(在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，獨(dú)立地被賴氨酸(K)或精氨酸(R))取代,并且其中在根據(jù)a)的第一重鏈的恒定域CH1中，處于第147位的氨基酸或處于第213位的氨基酸獨(dú)立地被谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)(根據(jù)KabatEU索引編號)取代；其中所述多特異性抗體包含a)與第一抗原特異性地結(jié)合的第一抗體的第一輕鏈和第一重鏈；和b)與第二抗原特異性地結(jié)合的第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈,并且其中在第二抗體的第二輕鏈和第二重鏈中可變域VL和VH被彼此替換。43.根據(jù)實(shí)施方式1至16和20至23中任意一種的多特異性抗體,其中所述抗體包含至少兩個(gè)Fab片段,其中第一Fab片段包含至少一個(gè)對于第一抗原特異的抗原結(jié)合位點(diǎn)；并且第二Fab片段包含至少一個(gè)對于第二抗原特異的抗原結(jié)合位點(diǎn),其中在第二Fab片段中，在第二輕鏈和第二重鏈中可變域VL和VH被彼此替換；并且其中所述多特異性抗體缺乏Fc結(jié)構(gòu)域。44.根據(jù)實(shí)施方式43的多特異性抗體,其中所述抗體包含兩個(gè)至四個(gè)Fab片段。45.根據(jù)實(shí)施方式43或44的多特異性抗體,其中所述抗體與人Ang-2和VEGF特異性地結(jié)合。46.生產(chǎn)抗體的方法，包括培養(yǎng)實(shí)施方式34的宿主細(xì)胞以致產(chǎn)生抗體。47.實(shí)施方式46的方法,進(jìn)一步包括從所述的宿主細(xì)胞中回收所述的抗體。提供了下列實(shí)施例、序列表和附圖以幫助理解本發(fā)明,在所附的權(quán)利要求書中給出了本發(fā)明的真正的保護(hù)范圍。應(yīng)該明白可以在不偏離本發(fā)明的精神的情況下，在所陳述的步驟中做多種修改。氨基酸序列的說明SEQIDNO:1輕鏈(LC)<Ang-2>野生型(wt)SEQIDNO:2重鏈(HC)<Ang-2>野生型(wt)SEQIDNO:3重鏈(HC)<VEGF>具有VH-VL交換野生型(wt)SEQIDNO:4輕鏈(LC)<VEGF>具有VH-VL交換野生型(wt)SEQIDNO:5輕鏈(LC)<Ang-2>具有Q124K取代SEQIDNO:6重鏈(HC)<Ang-2>具有K147E取代SEQIDNO:7重鏈(HC)<Ang-2>具有K213E取代SEQIDNO:8輕鏈(LC)<Ang-2>具有E123K取代SEQIDNO:9輕鏈(LC)<Ang-2>具有Q124K取代和E123K取代SEQIDNO:10重鏈(HC)<Ang-2>具有K147E取代和K213E取代SEQIDNO:11輕鏈(LC)<Ang-2>具有Q124R取代和E123K取代SEQIDNO:12輕鏈(LC)<VEGF>具有Q124E取代SEQIDNO:13輕鏈(LC)<Ang-2>具有E124K取代和E123K取代SEQIDNO:14重鏈(HC)<Ang-2>具有K147E取代和K213D取代SEQIDNO:15輕鏈(LC)<IL-17>野生型(wt)SEQIDNO:16重鏈(HC)<IL-17>野生型(wt)SEQIDNO:17重鏈(HC)<TWEAK>具有VH-VL交換野生型(wt)SEQIDNO:18輕鏈(LC)<TWEAK>具有VH-VL交換的野生型(wt)SEQIDNO:19輕鏈(LC)<IL-17>具有Q124K取代和E123R取代SEQIDNO:20重鏈(HC)<IL-17>具有K147E取代和K213E取代SEQIDNO:21輕鏈(LC)<TWEAK>具有Q124E取代SEQIDNO:22重鏈(HC)<IL-17>具有K147E取代和K213D取代SEQIDNO:23輕鏈(LC)<IL-17>具有Q124K取代和E123K取代SEQIDNO:24重鏈可變結(jié)構(gòu)域VH<TWEAK>305-HC4SEQIDNO:25輕鏈可變結(jié)構(gòu)域VL<TWEAK>305-LC2SEQIDNO:26重鏈可變結(jié)構(gòu)域VH<IL-17>HC136SEQIDNO:27輕鏈可變結(jié)構(gòu)域VL<IL-17>LC136SEQIDNO:28重鏈(HC)<TWEAK>具有VH-VL交換的野生型(wt)(包含末端GK二肽)SEQIDNO:29重鏈(HC)<IL-17>具有K147E取代和K213E取代(包含末端GK二肽)SEQIDNO:30重鏈(HC)<IL-17>具有K147E取代和K213D取代(包含末端GK二肽)SEQIDNO:31重鏈(HC)<Ang-2>野生型(wt)(包含末端GK二肽)SEQIDNO:32重鏈(HC)<VEGF>具有VH-VL交換的野生型(wt)(包含末端GK二肽)SEQIDNO:33重鏈(HC)<Ang-2>具有K147E取代(包含末端GK二肽)SEQIDNO:34重鏈(HC)<Ang-2>具有K213E取代(包含末端GK二肽)SEQIDNO:35重鏈(HC)<Ang-2>具有K147E取代和K213E取代(包含末端GK二肽)SEQIDNO:36重鏈(HC)<Ang-2>具有K147E取代和K213D取代(包含末端GK二肽)SEQIDNO:37重鏈(HC)<IL-17>野生型(wt)(包含末端GK二肽)SEQIDNO:38經(jīng)由甘氨酸-絲氨酸-接頭與具有VH-VL交換的野生型(wt)的一個(gè)重鏈(HC)偶聯(lián)的野生型(wt)<VEGF>的Fab2-CrossFab重鏈(HC)，其包含兩個(gè)重鏈(HC)<Ang-2>SEQIDNO:39經(jīng)由甘氨酸-絲氨酸-接頭與具有VH-VL交換的野生型(wt)的一個(gè)重鏈(HC)<VEGF>偶聯(lián)的具有K147E和K213E取代的Fab2-CrossFab重鏈(HC)，其包含兩個(gè)重鏈(HC)<Ang-2>SEQIDNO:40經(jīng)由甘氨酸-絲氨酸-接頭與具有K147E和K213E取代的一個(gè)重鏈(HC)<Ang-2>偶聯(lián)的具有VH-VL交換的野生型(wt)的-CrossFab-Fab重鏈(HC)，其包含一個(gè)重鏈(HC)<VEGF>SEQIDNO:41經(jīng)由甘氨酸-絲氨酸-接頭與具有K147E和K213E取代的一個(gè)重鏈(HC)<Ang-2>偶聯(lián)的具有VH-VL交換的野生型(wt)的CrossFab-Fab重鏈(HC)，其包含一個(gè)重鏈(HC)<VEGF>SEQIDNO:42經(jīng)由甘氨酸-絲氨酸-接頭與野生型(wt)的一個(gè)重鏈(HC)<Ang-2>偶聯(lián)的具有VH-VL交換的野生型(wt)的CrossFab2-Fab重鏈(HC)，其包含兩個(gè)重鏈(HC)<VEGF>SEQIDNO:43經(jīng)由甘氨酸-絲氨酸-接頭與具有K147E和K231E取代的一個(gè)重鏈(HC)<Ang-2>偶聯(lián)的具有VH-VL交換的野生型(wt)的CrossFab2-Fab重鏈(HC)，其包含兩個(gè)重鏈(HC)<VEGF>SEQIDNO:44重鏈(HC)<VEGF>具有VH-VL交換具有K147E取代SEQIDNO:45輕鏈(HC)<VEGF>具有VH-VL交換具有Q124K取代SEQIDNO:46重鏈(HC)<VEGF>具有VH-VL交換具有K147E和K213E取代SEQIDNO:47輕鏈(HC)<VEGF>具有VH-VL交換具有E123K和Q124K取代實(shí)施例材料與一般方法關(guān)于人免疫球蛋白的輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息在下文中提供:Kabat,E.A.等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)。正如上面定義的那樣，按照根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)(Kabat,E.A.等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))，把抗體鏈的氨基酸編號和命名。重組DNA技術(shù)正如Sambrook,J.等人,MolecularCloning:Alaboratorymanual；ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,1989中描述的那樣,使用標(biāo)準(zhǔn)方法來操作DNA。按照生產(chǎn)商的說明書使用分子生物學(xué)試劑。基因合成從通過化學(xué)合成制造的寡核苷酸制備所要的基因區(qū)段。通過退火和連接寡核苷酸，包括PCR擴(kuò)增，來裝配側(cè)翼具有單一的限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)的600-1800bp長基因區(qū)段并隨后經(jīng)由所指示的限制性位點(diǎn)(例如KpnI/SacI或AscI/PacI)克隆到基于pPCRScript(Stratagene)的pGA4克隆載體中。亞克隆基因片段的DNA序列通過DNA測序證實(shí)。按照在Geneart(Regensburg,Germany)提供的說明書把基因合成片段排序。DNA序列測定通過在MediGenomixGmbH(Martinsried,Germany)或SequiserveGmbH(Vaterstetten,Germany)進(jìn)行的雙鏈測序，來確定DNA序列。DNA和蛋白質(zhì)序列分析以及序列數(shù)據(jù)管理使用GCG的(GeneticsComputerGroup,Madison,Wisconsin)軟件包版本10.2和Infomax的VectorNT1Advance全套版本8.0進(jìn)行序列創(chuàng)造、制圖、分析、注解以及闡明。表達(dá)載體為了表達(dá)所述的抗體,應(yīng)用基于有或沒有CMV-A內(nèi)含子啟動子的cDNA組織或基于具有CMV啟動子的基因組組織的用于瞬時(shí)表達(dá)(例如在HEK293EBNA或HEK293-F中)細(xì)胞的表達(dá)質(zhì)粒的變體。除了抗體表達(dá)盒之外，載體還包含:－允許這個(gè)質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)，和－賦予在大腸桿菌中的氨芐青霉素抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因?？贵w基因的轉(zhuǎn)錄單位由下列元件組成:-處于5’端的獨(dú)特的限制性位點(diǎn)，-來自人巨細(xì)胞病毒的立即早期增強(qiáng)子和啟動子,--人抗體基因的5’-非翻譯區(qū),-免疫球蛋白重鏈信號序列,-人抗體鏈(野生型或具有結(jié)構(gòu)域交換)，要么呈cDNA要么呈具有免疫球蛋白外顯子-內(nèi)含子組織的基因組組織，-具有聚腺苷酸化信號序列的3’非翻譯區(qū)，和－3’末端的獨(dú)特的限制性位點(diǎn)。如下包含抗體鏈的融合基因是通過PCR和/或基因合成，以及通過已知的重組方法和技術(shù)，通過例如使用在相應(yīng)載體中獨(dú)特的限制性位點(diǎn)把相符的核酸區(qū)段連接而裝配來產(chǎn)生的。通過DNA測序證實(shí)了亞克隆的核酸序列。為了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，通過來自轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物(NucleobondAX,Macherey-Nagel)的質(zhì)粒制劑制備了較大量的質(zhì)粒。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)正如在CurrentProtocolsinCellBiology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(編輯),JohnWiley&Sons,Inc中描述的那樣，使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。通過如下在貼壁生長的HEK293-EBNA中或在生長在懸浮液中的HEK29-F細(xì)胞中的各自表達(dá)質(zhì)粒的瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染，來表達(dá)多特異性抗體。在HEK293-EBNA系統(tǒng)中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染通過在補(bǔ)充有10％UltraLowIgGFCS(胎牛血清,)、2mML-谷氨酰胺和250μg/ml遺傳霉素的DMEM(Dulbecco修飾的Eagle培養(yǎng)基,)中培養(yǎng)的貼壁生長的HEK293-EBNA細(xì)胞(表達(dá)Epstein-Barr病毒核抗原的人胚腎細(xì)胞系293；美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Americantypeculturecollection)保藏號ATCC#CRL-10852,Lot.959218)中相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒(例如編碼重鏈和修飾的重鏈以及相應(yīng)的輕鏈和修飾的輕鏈)的瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染，表達(dá)多特異性抗體。為了轉(zhuǎn)染，以4:1(范圍從3:1到6:1)的FuGENETM試劑(μl)與DNA(μg)的比率使用FuGENETM6TransfectionReagent(RocheMolecularBiochemicals)。分別使用范圍從1:2到2:1的1:1的(等摩爾的)編碼(修飾的和野生型)輕鏈和重鏈的質(zhì)粒的摩爾比率，從相應(yīng)的質(zhì)粒表達(dá)了蛋白質(zhì)。在第3天，采用4mM的L-谷氨酰胺、葡萄糖[Sigma]和NAA喂養(yǎng)細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染以后的第5天到第11天，通過離心作用收獲包含多特異性抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液并且儲藏在-20℃。關(guān)于在例如HEK293細(xì)胞中人免疫球蛋白的重組表達(dá)的一般信息被提供在下文中:Meissner,P.等人,Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203。在HEK293-F系統(tǒng)中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染按照生產(chǎn)商的說明書使用HEK293-F系統(tǒng)(Invitrogen)，采用相應(yīng)的質(zhì)粒(例如編碼重鏈和修飾的重鏈以及相應(yīng)的輕鏈和修飾的輕鏈)，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生多特異性抗體。簡單來說,采用四種表達(dá)質(zhì)粒和293fectinTM或fectin(Invitrogen)的混合物轉(zhuǎn)染生長在搖瓶或攪拌的發(fā)酵罐中的不含血清的FreeStyleTM293表達(dá)培養(yǎng)基(Invitrogen)中的懸浮液中的HEK293-F細(xì)胞(Invitrogen)。對于2L搖瓶(Corning)，在600mL中以1.0E*6個(gè)細(xì)胞/mL的密度，接種HEK293-F細(xì)胞并且以120轉(zhuǎn)數(shù)/分鐘、8％CO2下培育。第二天，以大約1.5E*6個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞密度，采用大約42mL的A)具有600g分別編碼重鏈或修飾的重鏈和等摩爾比率的相應(yīng)輕鏈的總質(zhì)粒DNA(1g/mL)的20mLOpti-MEM(Invitrogen)和B)20ml的Opti-MEM+1.2mL293fectin或fectin(2l/mL)的混合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在發(fā)酵期間，根據(jù)葡萄糖消耗，添加葡萄糖溶液。在5-10天以后，收獲包含分泌抗體的上清液，并且要么直接地從上清液中純化抗體，要么把上清液冷凍和儲藏。蛋白質(zhì)測定按照Pace等人,ProteinScience,1995,4,2411-1423，通過測定在280nm處的光密度(OD),使用基于氨基酸序列計(jì)算的摩爾消光系數(shù)，確定了純化的抗體和衍生物的蛋白質(zhì)濃度。在上清液中的抗體濃度測定通過采用A蛋白瓊脂糖珠子(Roche)的免疫沉淀反應(yīng)估測了在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中抗體和衍生物的濃度。在TBS-NP40(50mMTris,pH7.5,150mMNaCl,1％Nonidet-P40)中洗滌60μLA蛋白瓊脂糖珠子三次。隨后,把1-15mL細(xì)胞培養(yǎng)上清液施加到在TBS-NP40中預(yù)平衡過的A蛋白瓊脂糖珠子中。在室溫下溫育1小時(shí)以后，在Ultrafree-MC過濾柱(Amicon)上采用0.5mLTBS-NP40洗滌珠子一次,采用0.5mL2x磷酸緩沖鹽水(2xPBS,Roche)洗滌兩次以及采用0.5mL100mMpH5.0的檸檬酸鈉快速洗滌四次。通過添加35μlLDS樣品緩沖液(Invitrogen)洗脫結(jié)合的抗體。將樣品的一半分別與樣品還原劑組合或留下不還原,并且在70℃加熱10分鐘。因此,把5-30μl施加到4-12％雙TrisSDS-PAGE(Invitrogen)(對于非還原的SDS-PAGE，采用MOPS緩沖液，以及對于還原的SDS-PAGE，采用具有抗氧化劑運(yùn)行緩沖液添加劑(Invitrogen)的MES緩沖液)并且采用考馬斯藍(lán)染色。通過親和HPLC層析定量地測定在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中抗體和衍生物的濃度。簡單地,把包含與A蛋白結(jié)合的抗體和衍生物的細(xì)胞培養(yǎng)上清液應(yīng)用到在pH7.4的200mMKH2PO4，100mM檸檬酸鈉中的AppliedBiosystemsPorosA/20柱上，并且在AgilentHPLC1100系統(tǒng)上，采用pH2.5的200mMNaCl、100mM檸檬酸從基質(zhì)中洗脫。通過紫外線吸光度和峰面積的積分，把洗脫的蛋白質(zhì)定量化。純化的標(biāo)準(zhǔn)IgG1抗體作為標(biāo)準(zhǔn)。備選地,通過夾心IgG-ELISA測定在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中抗體和衍生物的濃度。簡單地,在室溫下以0.1μg/mL給StreptaWellHighBindStrepatavidinA-96孔微量滴定板(Roche)涂覆100μL/孔生物素化的抗人IgG捕獲分子F(ab’)2<h-Fcγ>BI(Dianova)1小時(shí)或備選地在4℃過夜，并且隨后采用200μL/孔PBS、0.05％Tween(PBST,Sigma)洗滌三次。向孔中添加100μL/孔含有各自的抗體的細(xì)胞培養(yǎng)上清液在PBS(Sigma)中的系列稀釋液，并且在微量滴定板振蕩器上在室溫下溫育1-2小時(shí)。采用200μL/孔PBST洗滌孔三次，并且在微量滴定板振蕩器上在室溫下，采用100μl0.1μg/mL的F(ab‘)2<hFcγ>POD(Dianova)作為檢測抗體，來檢測結(jié)合的抗體1-2小時(shí)。采用200μL/孔PBST洗掉未結(jié)合的檢測抗體三次，并且通過添加100μLABTS/孔檢測結(jié)合的檢測抗體。在TecanFluor分光計(jì)上在405nm的測量波長(參考波長492nm)處進(jìn)行吸光度的測定。蛋白質(zhì)純化參考標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)規(guī)程，從過濾的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化蛋白質(zhì)。簡單說來,把抗體應(yīng)用到A蛋白瓊脂糖柱(GEhealthcare)上并且用PBS洗滌。在pH2.8下實(shí)現(xiàn)對抗體的洗脫，隨后立即中和樣品。通過在PBS中或在20mM組氨酸、150mMNaClpH6.0中的大小排阻層析(Superdex200,GEHealthcare)，從單體抗體中分離聚集的蛋白質(zhì)。匯集單體抗體流分,使用例如MILLIPOREAmiconUltra(30MWCO)離心濃縮機(jī)濃縮(如果需要的話),冷凍和在-20℃或-80℃儲藏。提供部分樣品用于隨后的蛋白質(zhì)分析和分析表征，例如通過SDS-PAGE、大小排阻層析(SEC)或質(zhì)譜。SDS-PAGE按照生產(chǎn)商的說明書使用Pre-Cast凝膠系統(tǒng)(Invitrogen)。特別是,使用10％或4-12％Bis-TRISPre-Cast凝膠(pH6.4)和MES(還原的凝膠,采用抗氧化劑運(yùn)行緩沖液添加劑)或MOPS(非還原的凝膠)運(yùn)行緩沖液。分析性大小排阻層析通過HPLC層析進(jìn)行大小排阻層析(SEC)，用于測定抗體的聚集和寡聚狀態(tài)。簡單來說,把A蛋白純化的抗體應(yīng)用到在AgilentHPLC1100系統(tǒng)上的在300mMNaCl、50mMKH2PO4/K2HPO4、pH7.5中的TosohTSKgelG3000SW柱子上或在DionexHPLC系統(tǒng)上的在2xPBS中的Superdex200柱子(GEHealthcare)上。通過紫外線吸光度和峰面積的積分來把洗脫的蛋白質(zhì)定量。BioRadGelFiltrationStandard151–1901作為標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)譜本節(jié)描述具有VH/VL交換的多特異性抗體(VH/VLCrossMab)的表征，著重于它們的正確裝配。通過去糖基化的完整CrossMab和去糖基化的/纖溶酶消化的或備選地去糖基化的/有限的LysC消化的CrossMab的電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)來分析預(yù)期的一級結(jié)構(gòu)。在磷酸鹽或Tris緩沖液中在37℃，采用N-糖苷酶F以1mg/ml的蛋白質(zhì)濃度把VH/VLCrossMab去糖基化長達(dá)17小時(shí)。采用在Tris緩沖液pH8中的100μg去糖基化的VH/VLCrossMab進(jìn)行纖溶酶或有限的LysC(Roche)消化，分別在室溫下持續(xù)120小時(shí)和在37℃持續(xù)40分鐘。在質(zhì)譜之前，經(jīng)由HPLC在SephadexG25柱子(GEHealthcare)上將樣品脫鹽。經(jīng)由ESI-MS在裝備有TriVersaNanoMate源(Advion)的maXis4GUHR-QTOFMS系統(tǒng)(BrukerDaltonik)上測定總質(zhì)量。使用表面等離振子共振(SPR)(BIACORE)測定多特異性抗體與各自抗原的結(jié)合和結(jié)合親和力使用BIACORE儀器(GEHealthcareBiosciencesAB,Uppsala,Sweden)，通過表面等離振子共振研究了產(chǎn)生的抗體與各自抗原(例如ANG2和VEGF)的結(jié)合。簡單來說,針對親和力測定，經(jīng)由胺偶聯(lián)把山羊抗人IgG、JIR109-005-098抗體固定在CM5芯片上，用于呈遞抗各自抗原的抗體。在25℃(或備選地在37℃)的HBS緩沖液(HBS-P(10mMHEPES、150mMNaCl、0.005％吐溫20、ph7.4)中測定了結(jié)合。以在溶液中的不同濃度添加抗原(R&DSystems或內(nèi)部純化的)。通過80秒至3分鐘的抗原注射測定締合；通過采用HBS緩沖液洗滌芯片表面3-10分鐘來測定解離，并且使用1:1朗繆爾結(jié)合模型估測KD值。從樣品曲線中減去陰性對照數(shù)據(jù)(例如緩沖液曲線)，用于校正系統(tǒng)固有的基線漂移和用于減少噪聲信號。使用各自的BiacoreEvaluationSoftware對傳感圖進(jìn)行分析并且計(jì)算親和力數(shù)據(jù)。實(shí)施例1A在一個(gè)結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)并且在CH1/CL界面中具有單個(gè)帶電荷的氨基酸取代的結(jié)合血管生成素-2(ANG2)和VEGF的多特異性抗體的生產(chǎn)和表達(dá)在第一個(gè)實(shí)施例中，正如一般方法部分中描述的那樣，通過經(jīng)典的分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生了與人血管生成素-2(ANG2)和人VEGF結(jié)合的多特異性抗體，并且如上述在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。在圖1A至C中提供了這些各自的多特異性抗體的一般方案。為了比較，也制備了在CH1/CL界面中沒有取代的野生型(wt)VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換抗體。也使用在CH1CL界面(例如在EP2647707中提到的)中緊鄰的其它備選的取代來進(jìn)行比較。使用包含編碼表2a中所描繪的氨基酸序列的核酸的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)了多特異性抗體。表2a:具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)的抗Ang2-VEGF多特異性抗體Ang2VEGF-0273、Ang2VEGF-0396、Ang2VEGF-0397、Ang2VEGF-0394、Ang2VEGF-0395的輕鏈(LC)和重鏈(HC)的氨基酸序列:野生型(wt)和單個(gè)帶電荷的氨基酸取代的不同組合對于所有的構(gòu)建體，把旋鈕入孔異二聚化技術(shù)和在第一CH3結(jié)構(gòu)域中典型的旋鈕(T366W)取代和在第二CH3結(jié)構(gòu)域中相應(yīng)的孔取代(T366S、L368A和Y407V)(以及兩個(gè)另外引入的半胱氨酸殘基S354C/Y349’C)(包含在上面描繪的各自相應(yīng)的重鏈(HC)序列中)一起使用。實(shí)施例1B在一個(gè)結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)并且在CH1/CL界面中具有單個(gè)帶電荷的氨基酸取代的與血管生成素-2(ANG2)和VEGF結(jié)合的多特異性抗體的純化和表征。通過A蛋白親和層析和大小排阻層析的組合，從上清液中純化了上面表達(dá)的多特異性抗體。所有的多特異性抗體能夠以良好的產(chǎn)率生產(chǎn)并且是穩(wěn)定的。對所獲得的產(chǎn)物表征了身份(通過質(zhì)譜)和分析性質(zhì)如純度(通過SDS-PAGE)、單體含量和穩(wěn)定性。質(zhì)譜通過去糖基化的完整CrossMab和去糖基化的/纖溶酶消化的或備選地去糖基化的/有限的LysC消化的CrossMab的電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)，分析了預(yù)期的一級結(jié)構(gòu)。在磷酸鹽或Tris緩沖液中在37℃，采用N-糖苷酶F以1mg/ml的蛋白質(zhì)濃度把VH/VLCrossMab去糖基化長達(dá)17小時(shí)。采用在Tris緩沖液pH8中的100μg去糖基化的VH/VLCrossMab進(jìn)行纖溶酶或有限的LysC(Roche)消化，分別在室溫下持續(xù)120小時(shí)和在37℃持續(xù)40分鐘。在質(zhì)譜之前，經(jīng)由HPLC在SephadexG25柱子(GEHealthcare)上將樣品脫鹽。經(jīng)由ESI-MS在裝備有TriVersaNanoMate源(Advion)的maXis4GUHR-QTOFMS系統(tǒng)(BrukerDaltonik)上測定總質(zhì)量。結(jié)果顯示在表2b中和圖4a中。表2b:通過在CH1/CL界面中根據(jù)本發(fā)明的單一帶電荷的氨基酸取代減少主要的本斯·瓊斯型副產(chǎn)物。表2b和圖4a中的結(jié)果顯示:根據(jù)本發(fā)明/正如關(guān)于本發(fā)明描述的那樣，在CH1和CL結(jié)構(gòu)域中具有單個(gè)帶電荷的氨基酸被相反電荷取代(CL:Q124K和CH1:K147E對；或CL:Q124K和CH1:K213E對)，當(dāng)與沒有這樣的取代的野生型多特異性抗體相比時(shí)，主要副產(chǎn)物(本斯·瓊斯型錯(cuò)配)被強(qiáng)有力地減少了(～減少17％)。在緊鄰近處的其它取代(CL:Q123K和CH1:K147E對；或CL:Q123K和CH1:K213E對)與沒有這樣的取代的野生型多特異性抗體相比，僅僅輕微地減少了主要副產(chǎn)物(～減少5％)。實(shí)施例1C在一個(gè)結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)并且在CH1/CL界面中具有單個(gè)帶電荷的氨基酸取代的與血管生成素-2(ANG2)和VEGF結(jié)合的多特異性抗體的抗原結(jié)合性質(zhì)通過評定了前面的實(shí)施例1A和1Bd的多特異性抗體與它們各自的靶抗原(即ANG2和VEGF)的結(jié)合。按照下列方法評定了VEGF結(jié)合使用T200儀器(GEHealthcare)，通過表面等離振子共振研究了所指示的抗體與人VEGFA-121的結(jié)合。在pH5.0，通過使用由GEHealthcare提供的胺偶聯(lián)試劑盒，使10000(RU)左右的抗His抗體(1μg/ml抗His抗體；訂單代碼:28995056；GEHealthcareBio-SciencesAB,Sweden)偶聯(lián)到SCM5系列芯片(GEHealthcareBR-1005-30)上。在固定程序期間，使用HBS-N(pH7.4的10mMHEPES、150mMNaCl,GEHealthcare)作為運(yùn)行緩沖液。對于下列動力學(xué)表征,樣品和運(yùn)行緩沖液是pH7.4的PBS-T(包含0.05％Tween20的10mM磷酸緩沖鹽水)。把流動池設(shè)定到25℃并且把樣品阻斷設(shè)定到12℃以及在動力學(xué)表征之前，采用運(yùn)行緩沖液引發(fā)兩次。通過以5μl/分鐘的流速注射0.5μg/ml溶液30秒，捕獲了VEFGA-121-His。通過以1:3的系列稀釋度，從1000nM開始，以30μl/分鐘的流速，以在溶液中的不同濃度注射所指示的抗體180秒，測定了締合。通過從樣品溶液轉(zhuǎn)換到運(yùn)行緩沖液來監(jiān)測解離階段長達(dá)600秒和觸發(fā)解離階段。通過以30μl/分鐘的流速，用pH1.5的甘氨酸溶液洗滌60秒來再生表面。通過減去從抗His抗體表面獲得的應(yīng)答，校正了本體折射率差。也減去了空白注射(＝雙參考)。為了計(jì)算KD和其它動力學(xué)參數(shù)，使用了朗繆爾1:1模型。按照下列步驟評定了Ang-2結(jié)合:使用T200儀器(GEHealthcare)，通過表面等離振子共振研究了所指示的抗體與人Ang-2-RBD-Fc的結(jié)合。在pH5.0，通過使用由GEHealthcare提供的胺偶聯(lián)試劑盒，使8000(RU)左右的山羊抗人F(ab’)2(10μg/ml抗人F(ab)’2；訂單代碼:28958325；GEHealthcareBio-SciencesAB,Sweden)偶聯(lián)到SCM5系列芯片(GEHealthcareBR-1005-30)上。在固定化程序期間，使用HBS-N(pH7.4的10mMHEPES、150mMNaCl,GEHealthcare)作為運(yùn)行緩沖液。對于下列動力學(xué)表征,樣品和運(yùn)行緩沖液是處于pH7.4的PBS-T(包含0.05％Tween20的10mM磷酸緩沖鹽水)。把流動池設(shè)定到25℃并且把樣品區(qū)組設(shè)定到12℃以及在動力學(xué)表征之前，采用運(yùn)行緩沖液引發(fā)兩次。通過以5μl/分鐘的流速注射5nM溶液25秒，捕獲了雙特異性抗體。通過以1:3的系列稀釋度從100nM開始，以30μl/分鐘的流速，以在溶液中的不同濃度注射人Ang2-RBD-Fc120秒，測定了締合。通過從樣品溶液轉(zhuǎn)換到運(yùn)行緩沖液來監(jiān)測解離階段長達(dá)180秒和觸發(fā)解離階段。通過以30μl/分鐘的流速，用pH2.1的甘氨酸溶液洗滌60秒來再生表面。通過減去從山羊抗人F(ab’)2表面獲得的應(yīng)答，校正了本體折射率差。也減去了空白注射(＝雙參考)。為了計(jì)算表觀KD，使用了朗繆爾1:1模型。像比較實(shí)施例那樣,平行地評估了包含VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換但是缺乏帶電荷的氨基酸取代(表2b的Ang2VEGF-0273抗體)的特異性結(jié)合Ang2和VEGF的參考抗體。在表2c和2d中指示了結(jié)果。表2c:所指示的抗體對于VEGF的親和力表2d:所指示的抗體對于Ang2的親和力所有測試的抗體都與靶Ang2和VEGF這兩者特異性地結(jié)合,并且展示在納摩爾范圍中的抗原親和力。實(shí)施例1D在一個(gè)結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)并且在CH1/CL界面中具有單個(gè)帶電荷的氨基酸取代的與血管生成素-2(ANG2)和VEGF結(jié)合的多特異性抗體的穩(wěn)定性為了評定抗體構(gòu)建體的穩(wěn)定性,按照下列方法評定了熱穩(wěn)定性以及聚集開始溫度。制備了在pH6.0的20mM組氨酸/氯化組氨酸，140mMNaCl中的處于1mg/mL濃度的所指示的抗體的樣品,將其轉(zhuǎn)移到10μL微樣品池陣列中，并且采用Optim1000儀器(AvactaInc.),當(dāng)以0.1℃/分鐘的速率把樣品從25℃加熱到90℃時(shí)，記錄靜態(tài)光散射數(shù)據(jù)以及在采用266nm激光激發(fā)時(shí)的熒光數(shù)據(jù)。把聚集開始溫度(Tagg)定義為散射光強(qiáng)度開始增大時(shí)的溫度。把熔解溫度(Tm)定義為在熒光強(qiáng)度對波長圖中的拐點(diǎn)。結(jié)果顯示在表2e中。表2e:所指示的抗體的聚集開始溫度(Tagg)和熔解溫度(Tm)樣品Tagg(℃)Tm(℃)Ang2VEGF-027356.061.3Ang2VEGF-039656.962.0Ang2VEGF-039756.061.7Ang2VEGF-039456.962.2Ang2VEGF-039556.862.1實(shí)施例1E在一個(gè)結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)并且在CH1/CL界面中具有單個(gè)帶電荷的氨基酸取代的與血管生成素-2(ANG2)和VEGF結(jié)合的多特異性抗體的生產(chǎn)產(chǎn)率在A蛋白純化(ProtA)以后，評定了所指示的多特異性抗體的生產(chǎn)產(chǎn)率。結(jié)果顯示在表2f中。表2f:所指示的抗體的生產(chǎn)產(chǎn)率[mg/L上清液]樣品A蛋白Ang2VEGF-027365Ang2VEGF-039680.8Ang2VEGF-039768.4Ang2VEGF-039479.2Ang2VEGF-039593.6實(shí)施例2A在一個(gè)結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)并且在CH1/CL界面中具有不同的帶電荷的氨基酸取代的與血管生成素-2(ANG2)和VEGF結(jié)合的多特異性抗體的生產(chǎn)和表達(dá)在第一個(gè)實(shí)施例中，正如一般方法部分中描述的那樣，通過經(jīng)典的分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生了與人血管生成素-2(ANG2)和人VEGF結(jié)合的多特異性抗體，并且如上述在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。在圖1A至C中提供了這些各自的多特異性抗體的一般方案。為了比較，也制備了在CH1/CL界面中沒有取代的野生型(wt)VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換抗體。使用包含編碼表3a中所描繪的氨基酸序列的核酸的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)了多特異性抗體。表3a:具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)的抗Ang2-VEGF多特異性抗體Ang2VEGF-0273、Ang2VEGF-0274、Ang2VEGF-0282、Ang2VEGF-0283、Ang2VEGF-0284、Ang2VEGF-0285、Ang2VEGF-0286的輕鏈(LC)和重鏈(HC)的氨基酸序列:野生型(wt)和帶電荷的氨基酸取代的不同組合對于所有的構(gòu)建體，把旋鈕入孔異二聚化技術(shù)和在第一CH3結(jié)構(gòu)域中典型的旋鈕(T366W)取代和在第二CH3結(jié)構(gòu)域中相應(yīng)的孔取代(T366S、L368A和Y407V)(以及兩個(gè)另外引入的半胱氨酸殘基S354C/Y349’C)(包含在上面描繪的各自相應(yīng)的重鏈(HC)序列中)一起使用。實(shí)施例2B在一個(gè)結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)并且在CH1/CL界面中具有不同的帶電荷的氨基酸取代的與血管生成素-2(ANG2)和VEGF結(jié)合的多特異性抗體的純化和表征通過A蛋白親和層析和大小排阻層析的組合，從上清液中純化了上面表達(dá)的多特異性抗體。能夠以良好的產(chǎn)率生產(chǎn)所有的多特異性抗體并且所有的多特異性抗體是穩(wěn)定的。對所獲得的產(chǎn)物表征了身份(通過質(zhì)譜)和分析性質(zhì)如純度(通過SDS-PAGE)、單體含量和穩(wěn)定性。質(zhì)譜通過去糖基化的完整CrossMab和去糖基化的/纖溶酶消化的或備選地去糖基化的/有限的LysC消化的CrossMab的電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)，分析了預(yù)期的一級結(jié)構(gòu)。在磷酸鹽或Tris緩沖液中在37℃，采用N-糖苷酶F以1mg/ml的蛋白質(zhì)濃度把VH/VLCrossMab去糖基化長達(dá)17小時(shí)。采用在Tris緩沖液pH8中的100μg去糖基化的VH/VLCrossMab進(jìn)行纖溶酶或有限的LysC(Roche)消化，分別在室溫下持續(xù)120小時(shí)和在37℃持續(xù)40分鐘。在質(zhì)譜之前，經(jīng)由HPLC在SephadexG25柱子(GEHealthcare)上將樣品脫鹽。經(jīng)由ESI-MS在裝備有TriVersaNanoMate源(Advion)的maXis4GUHR-QTOFMS系統(tǒng)(BrukerDaltonik)上測定總質(zhì)量。結(jié)果顯示在表中3b和圖5a中。表3b:通過在CH1/CL界面中根據(jù)本發(fā)明的單一帶電荷的氨基酸取代減少主要的本斯·瓊斯型副產(chǎn)物表3b和圖5a中的結(jié)果表明根據(jù)本發(fā)明/正如關(guān)于本發(fā)明所描述的那樣，在CH1和CL結(jié)構(gòu)域中具有帶電荷的氨基酸被相反電荷取代的雙取代(CL:Q124K/E123K和CH1:K147E/K213E；CL:Q124R/E123K和CH1:K147E/K213E；CL:Q124R/E123K和CH1:K147E/K213D)，當(dāng)與沒有這樣的取代的野生型多特異性抗體相比時(shí)，主要副產(chǎn)物(本斯·瓊斯型錯(cuò)配)被完全除去了。這獨(dú)立于在另一結(jié)合臂的CL結(jié)構(gòu)域中進(jìn)一步單取代Q124E,后者不影響表達(dá)也不影響副產(chǎn)物的分布。實(shí)施例2C在一個(gè)結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)并且在CH1/CL界面中具有不同的帶電荷的氨基酸取代的與血管生成素-2(ANG2)和VEGF結(jié)合的多特異性抗體的抗原結(jié)合性質(zhì)正如在實(shí)施例1C中描繪的那樣，通過評定了前面的實(shí)施例2A和2B的多特異性抗體與它們各自的靶抗原(即ANG2和VEGF)的結(jié)合。像比較實(shí)施例那樣,平行地評定了包含VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換但是缺乏帶電荷的氨基酸取代(表2b的Ang2VEGF-0273抗體)的與Ang2和VEGF特異性地結(jié)合的參考抗體。在表3c和3d中給出了結(jié)果。表3c:所指示的抗體對于VEGF的親和力表3d:所指示的抗體對于Ang2的親和力樣品KD(nM)Ang2VEGF-027315Ang2VEGF-027417Ang2VEGF-028214Ang2VEGF-028315Ang2VEGF-028413Ang2VEGF-028514Ang2VEGF-028612所有測試的抗體都與靶Ang2和VEGF這兩者特異性地結(jié)合,并且展示在納摩爾范圍中的抗原親和力。實(shí)施例2D在一個(gè)結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)并且在CH1/CL界面中具有單個(gè)帶電荷的氨基酸取代的與血管生成素-2(ANG2)和VEGF結(jié)合的多特異性抗體的穩(wěn)定性為了評定抗體構(gòu)建體的穩(wěn)定性,正如在實(shí)施例1D中描繪的那樣，評定了熱穩(wěn)定性以及聚集開始溫度。將結(jié)果顯示在表3e中。表3e:所指示的抗體的聚集開始溫度(Tagg)和熔解溫度(Tm)樣品Tagg(℃)Tm(℃)Ang2VEGF-027356.061.3Ang2VEGF-027453.558.9Ang2VEGF-028256.961.4Ang2VEGF-028356.361.0Ang2VEGF-028456.361.1Ang2VEGF-028556.361.1Ang2VEGF-028656.361.6實(shí)施例3A在一個(gè)結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)并且在CH1/CL界面中具有不同的帶電荷的氨基酸取代的與IL-17和TWEAK結(jié)合的多特異性抗體的生產(chǎn)和表達(dá)在第一個(gè)實(shí)施例中，正如一般方法部分中描述的那樣，通過經(jīng)典的分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生了與人IL-17和人TWEAK結(jié)合的多特異性抗體，并且如上述在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。在圖1A至C中提供了這些各自的多特異性抗體的一般方案。為了比較，也制備了在CH1/CL界面中沒有取代的野生型(wt)VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換抗體。使用包含編碼表4a中所描繪的氨基酸序列的核酸的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)了多特異性抗體。表4a:具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)的抗TWEAK-IL17多特異性抗體TweakIL17-0096、TweakIL17-0097、TweakIL17-0098、TweakIL17-0099、TweakIL17-0100、TweakIL17-0101的輕鏈(LC)和重鏈(HC)的氨基酸序列:野生型(wt)和帶電荷的氨基酸取代的不同組合對于所有的構(gòu)建體，把旋鈕入孔異二聚化技術(shù)和在第一CH3結(jié)構(gòu)域中典型的旋鈕(T366W)取代和在第二CH3結(jié)構(gòu)域中相應(yīng)的孔取代(T366S、L368A和Y407V)(以及兩個(gè)另外引入的半胱氨酸殘基S354C/Y349’C)(包含在上面描繪的各自相應(yīng)的重鏈(HC)序列中)一起使用。實(shí)施例3B在一個(gè)結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)并且在CH1/CL界面中具有不同的帶電荷的氨基酸取代的與IL-17和TWEAK結(jié)合的多特異性抗體的純化和表征通過A蛋白親和層析和大小排阻層析的組合，從上清液中純化了上面表達(dá)的多特異性抗體。能夠以良好的產(chǎn)率生產(chǎn)所有的多特異性抗體并且所有的多特異性抗體是穩(wěn)定的。對所獲得的產(chǎn)物表征了身份(通過質(zhì)譜)和分析性質(zhì)如純度(通過SDS-PAGE)、單體含量和穩(wěn)定性。質(zhì)譜通過去糖基化的完整CrossMab和去糖基化的/纖溶酶消化的或備選地去糖基化的/有限的LysC消化的CrossMab的電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)，分析了預(yù)期的一級結(jié)構(gòu)。在磷酸鹽或Tris緩沖液中在37℃，采用N-糖苷酶F以1mg/ml的蛋白質(zhì)濃度把VH/VLCrossMab去糖基化長達(dá)17小時(shí)。采用在Tris緩沖液pH8中的100μg去糖基化的VH/VLCrossMab進(jìn)行纖溶酶或有限的LysC(Roche)消化，分別在室溫下持續(xù)120小時(shí)和在37℃持續(xù)40分鐘。在質(zhì)譜之前，經(jīng)由HPLC在SephadexG25柱子(GEHealthcare)上將樣品脫鹽。經(jīng)由ESI-MS在裝備有TriVersaNanoMate源(Advion)的maXis4GUHR-QTOFMS系統(tǒng)(BrukerDaltonik)上測定總質(zhì)量。將結(jié)果顯示在表中4b和圖6a中。表4b:通過在CH1/CL界面中根據(jù)本發(fā)明的單一帶電荷的氨基酸取代減少主要的本斯·瓊斯型副產(chǎn)物表2b和圖6a中的結(jié)果表明根據(jù)本發(fā)明/正如關(guān)于本發(fā)明所描述的那樣，在CH1和CL結(jié)構(gòu)域中具有帶電荷的氨基酸被相反電荷取代的雙取代(CL:Q124K/E123R和CH1:K147E/K213E；CL:Q124K/E123R和CH1:K147E/K213D；CL:Q124K/E123K和CH1:K147E/K213E)，當(dāng)與沒有這樣的取代的野生型多特異性抗體相比時(shí)，主要副產(chǎn)物(本斯·瓊斯型錯(cuò)配)被完全除去了。這獨(dú)立于在另一結(jié)合臂的CL結(jié)構(gòu)域中進(jìn)一步單取代Q124E，后者不影響表達(dá)也不影響副產(chǎn)物的分布。實(shí)施例4A與Ang2和VEGF結(jié)合的二價(jià)和三價(jià)多特異性抗體的生產(chǎn)和表達(dá),其中抗體缺乏Fc片段并且在一個(gè)結(jié)合臂中包含VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換并且在CH1/CL界面中包含一個(gè)或更多個(gè)帶電荷的氨基酸取代在進(jìn)一步的實(shí)施例中，正如一般方法部分中描述的那樣，通過經(jīng)典的分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生了與人Ang2和人VEGF結(jié)合的多特異性抗體并且如上述在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。所產(chǎn)生的抗體在其結(jié)合臂中包含與VEGF特異性地結(jié)合的具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換的Fab片段并且在其另一個(gè)結(jié)合臂中包含與Ang2特異性地結(jié)合的沒有結(jié)構(gòu)域交換的Fab片段,同時(shí)所述多特異性抗體缺乏Fc片段。相應(yīng)地,第一輕鏈源自于與人Ang2特異性地結(jié)合的抗體并且從N端到C端方向包含結(jié)構(gòu)域VL-CL。經(jīng)由甘氨酸-絲氨酸肽接頭，把第一(抗Ang2)和第二(抗VEGF)抗體的重鏈連接。在與VEGF特異性地結(jié)合的抗體的重鏈中，原始可變結(jié)構(gòu)域VH被來源于抗VEGF抗體的可變域VL替換。因此,包含抗Ang2和抗VEGF抗體的重鏈的多肽從N端到C端方向包含結(jié)構(gòu)域VH(Ang2)-CH1(Ang2)-接頭-VL(VEGF)-CH1(VEGF)。在與人VEGF特異性地結(jié)合的輕鏈中,原始可變結(jié)構(gòu)域VL被來源于抗VEGF抗體的可變域VH替換。因此,抗VEGF抗體的修飾的輕鏈從N端到C端方向包含結(jié)構(gòu)域VH-CL。在圖5b中指示了在CH1/CL界面中不同的氨基酸的取代。在這個(gè)實(shí)施例中,產(chǎn)生了三個(gè)通用結(jié)構(gòu)的多特異性抗體:i)CrossFabVH-VL-(Fab)形式的二價(jià)多特異性的Ang2-VEGF雙特異性抗體(圖7D中指示的通用結(jié)構(gòu))；ii)(CrossFabVH-VL)2-Fab形式的三價(jià)多特異性的Ang2-VEGF雙特異性抗體(圖8C(neu)中指示的通用結(jié)構(gòu))；iii)(Fab)2-CrossFabVH-VL形式的三價(jià)多特異性的Ang2-VEGF雙特異性抗體(圖8D中指示的通用結(jié)構(gòu))；為了比較，也制備了在CH1/CL界面中沒有取代的野生型(wt)VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換抗體。使用包含編碼表5a中描繪的氨基酸序列的核酸的表達(dá)質(zhì)粒，來表達(dá)多特異性抗體。表5a:具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換的抗Ang2-VEGF多特異性抗體的輕鏈(LC)和重鏈(HC)的氨基酸序列:野生型(“不帶電的”)和帶電荷的氨基酸取代(“帶電荷的”)的不同組合表5b:在表5a中提到的根據(jù)本發(fā)明的抗體中，在CH1/CL界面中的氨基酸取代實(shí)施例4B：與Ang2和VEGF結(jié)合的二價(jià)和三價(jià)多特異性抗體的生產(chǎn)和表達(dá),其中所述抗體缺乏Fc片段并且在一個(gè)結(jié)合臂中包含VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換并且在CH1/CL界面中包含不同的帶電荷的氨基酸取代使用親和純化，通過標(biāo)準(zhǔn)程序純化分泌的蛋白質(zhì)。在表5c中指示了通過分析性大小排阻層析測定的抗體分子的親和純化以后的生產(chǎn)產(chǎn)率和級分。表5c:在親和純化以后的生產(chǎn)產(chǎn)率和想要的抗體級分質(zhì)譜:通過去糖基化的完整抗體和去糖基化的/纖溶酶消化的或備選地去糖基化的/有限的LysC消化的抗體的電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)，分析了預(yù)期的一級結(jié)構(gòu)。在磷酸鹽或Tris緩沖液中在37℃，采用N-糖苷酶F以1mg/ml的蛋白質(zhì)濃度把VH/VLFab-CrossFab構(gòu)建體去糖基化長達(dá)17小時(shí)。采用在pH8的Tris緩沖液中的100μg去糖基化的VH/VLFab-CrossFab進(jìn)行纖溶酶或有限的LysC(Roche)消化，分別在室溫下持續(xù)120小時(shí)和在37℃持續(xù)40分鐘。在質(zhì)譜之前，經(jīng)由HPLC在SephadexG25柱子(GEHealthcare)上將樣品脫鹽。經(jīng)由ESI-MS在裝備有TriVersaNanoMate源(Advion)的maXis4GUHR-QTOFMS系統(tǒng)(BrukerDaltonik)上測定總質(zhì)量。由于在提供的物質(zhì)和我們的MS方法之間重疊的質(zhì)量范圍，采用兩種不同的方法取得了樣品，以便在更大的質(zhì)量范圍中觀察潛在的副產(chǎn)物。當(dāng)在較大的質(zhì)量范圍(1000-4000m/z)中運(yùn)行時(shí)，該方法包括CID電壓(在這種情況下，90的cCID),在較低的質(zhì)量范圍(600-2000)中，測定不使用CID。由于應(yīng)用CID，有更高的獲得片段的機(jī)會，這些片段按照順序出現(xiàn)在質(zhì)譜儀中的源片段化中。將結(jié)果顯示在表5d中。表5d:相對于想要的主要分子定量的通過MS分析的所指示的抗體的副產(chǎn)物實(shí)施例4C與ANG2和VEGF結(jié)合的二價(jià)和三價(jià)多特異性抗體的抗原結(jié)合性質(zhì),其中抗體缺乏Fc片段并且在一個(gè)結(jié)合臂中包含VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換并且在CH1/CL界面中包含不同的帶電荷的氨基酸取代通過評定了前面的實(shí)施例4A和4B的多特異性抗體與它們各自的靶抗原(即ANG2和VEGF)的結(jié)合。按照下列方法評定了VEGF結(jié)合使用T200儀器(GEHealthcare)，通過表面等離振子共振研究了所指示的抗體與人VEGFA-121的結(jié)合。在pH5.0，通過使用由GEHealthcare提供的胺偶聯(lián)試劑盒，目的是使50RU的VEFGA-121-His偶聯(lián)到SC1系列芯片(GEHealthcareBR-1005-35)上。在固定化程序期間，使用HBS-N(pH7.4的10mMHEPES、150mMNaCl,GEHealthcare)作為運(yùn)行緩沖液。對于下列動力學(xué)表征,樣品和運(yùn)行緩沖液是pH7.4的PBS-T(包含0.05％Tween20的10mM磷酸緩沖鹽水)。把流動池設(shè)定到25℃并且把樣品區(qū)組設(shè)定到12℃以及在動力學(xué)表征之前，采用運(yùn)行緩沖液引發(fā)兩次。通過以30μl/分鐘的流速，以1:3的系列稀釋度，從100nM開始，以在溶液中的不同濃度注射所指示的抗體180秒，測定了締合。通過樣品溶液轉(zhuǎn)換到運(yùn)行緩沖液來監(jiān)測解離階段長達(dá)300秒并且觸發(fā)解離階段。通過以30μl/分鐘的流速，用0.85％H3PO4(磷酸)溶液洗滌30秒來再生表面。通過減去從抗His抗體表面獲得的應(yīng)答，校正了本體折射率差。也減去了空白注射(＝雙參考)。為了計(jì)算KD和其它動力學(xué)參數(shù)，使用了朗繆爾1:1模型。按照下列步驟評定了Ang-2結(jié)合:使用T200儀器(GEHealthcare)，通過表面等離振子共振研究了所指示的抗體與人Ang-2-RBD-Fc的結(jié)合。在pH5.0，通過使用由GEHealthcare提供的胺偶聯(lián)試劑盒，使8000(RU)左右的山羊抗人F(ab’)2(10μg/ml抗人F(ab)’2；訂單代碼:28958325；GEHealthcareBio-SciencesAB,Sweden)偶聯(lián)到SCM5系列芯片(GEHealthcareBR-1005-30)上。在固定化程序期間，使用HBS-N(pH7.4的10mMHEPES、150mMNaCl,GEHealthcare)作為運(yùn)行緩沖液。對于下列動力學(xué)表征,樣品和運(yùn)行緩沖液是處于pH7.4的PBS-T(包含0.05％Tween20的10mM磷酸緩沖鹽水)。把流動池設(shè)定到25℃并且把樣品區(qū)組設(shè)定到12℃以及在動力學(xué)表征之前，采用運(yùn)行緩沖液引發(fā)兩次。通過以5μL/分鐘的流速注射5nM溶液持續(xù)25秒，捕獲了雙特異性抗體。通過以30μl/分鐘的流速，從100nM開始，以1:3的系列稀釋度，以在溶液中的不同濃度注射人Ang2-RBD-Fc120秒，測定了締合。通過從樣品溶液轉(zhuǎn)換到運(yùn)行緩沖液來監(jiān)測解離階段長達(dá)180秒和觸發(fā)解離階段。通過以30μl/分鐘的流速，用pH2.1的甘氨酸溶液洗滌60秒來再生表面。通過減去從山羊抗人F(ab’)2表面獲得的應(yīng)答，校正了本體折射率差。也減去了空白注射(＝雙參考)。為了計(jì)算表觀KD和其它動力學(xué)參數(shù)，使用了朗繆爾1:1模型。在表5e和5f中指示了結(jié)果。表5e:所指示的抗體對于VEGF的親和力抗體KD(nM)Ang2VEGF-04520.35Ang2VEGF-04470.36Ang2VEGF-04530.22Ang2VEGF-04480.18表5f:所指示的抗體對于Ang2的親和力抗體KD(nM)Ang2VEGF-04523Ang2VEGF-04473Ang2VEGF-04535Ang2VEGF-04484抗原結(jié)合沒有被在不含F(xiàn)c的抗體的CH1/CL界面中引入的突變削弱。實(shí)施例5A:在VEGF結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)并且在VEGF結(jié)合臂的CH1/CL界面中具有不同的帶電荷的氨基酸取代的與血管生成素-2(ANG2)和VEGF結(jié)合的多特異性抗體的生產(chǎn)和表達(dá)在進(jìn)一步的實(shí)施例中，正如一般方法部分中描述的那樣，通過經(jīng)典的分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生了與人血管生成素-2(ANG2)和人VEGF結(jié)合的多特異性抗體，并且如上在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)。在圖1B中提供了這些各自的多特異性抗體的一般方案，該圖指示在包含VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換的結(jié)合臂的CH1/CL界面之內(nèi)存在不同的帶電荷的氨基酸取代。為了比較，也制備了在CH1/CL界面中沒有取代的野生型(wt)VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換抗體。使用包含編碼表6a中所描繪的氨基酸序列的核酸的表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)了多特異性抗體。表6a:具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)的抗Ang2-VEGF多特異性抗體Ang2VEGF-0273、Ang2VEGF-0425和Ang2VEGF-0424的輕鏈(LC)和重鏈(HC)的氨基酸序列:野生型(wt)和帶電荷的氨基酸取代的不同組合對于所有的構(gòu)建體，把旋鈕入孔異二聚化技術(shù)和在第一CH3結(jié)構(gòu)域中典型的旋鈕(T366W)取代和在第二CH3結(jié)構(gòu)域中相應(yīng)的孔取代(T366S、L368A和Y407V)(以及兩個(gè)另外引入的半胱氨酸殘基S354C/Y349’C)(包含在上面描繪的各自相應(yīng)的重鏈(HC)序列中)一起使用。實(shí)施例5B在一個(gè)結(jié)合臂中具有VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換(CrossMAbVh-VL)并且在CH1/CL界面中具有不同的帶電荷的氨基酸取代的與血管生成素-2(ANG2)和VEGF結(jié)合的多特異性抗體的純化和表征通過A蛋白親和層析和大小排阻層析的組合，從上清液中純化了上面表達(dá)的多特異性抗體。能夠以良好的產(chǎn)率生產(chǎn)所有的多特異性抗體并且所有的多特異性抗體是穩(wěn)定的。對所獲得的產(chǎn)物表征了身份(通過質(zhì)譜)和分析性質(zhì)如純度(通過SDS-PAGE)、單體含量和穩(wěn)定性。質(zhì)譜通過去糖基化的完整CrossMab和去糖基化的/纖溶酶消化的或備選地去糖基化的/有限的LysC消化的CrossMab的電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)，分析了預(yù)期的一級結(jié)構(gòu)。在磷酸鹽或Tris緩沖液中在37℃，采用N-糖苷酶F以1mg/ml的蛋白質(zhì)濃度把VH/VLCrossMab去糖基化長達(dá)17小時(shí)。采用在Tris緩沖液pH8中的100μg去糖基化的VH/VLCrossMab進(jìn)行纖溶酶或有限的LysC(Roche)消化，分別在室溫下持續(xù)120小時(shí)和在37℃持續(xù)40分鐘。在質(zhì)譜之前，經(jīng)由HPLC在SephadexG25柱子(GEHealthcare)上將樣品脫鹽。經(jīng)由ESI-MS在裝備有TriVersaNanoMate源(Advion)的maXis4GUHR-QTOFMS系統(tǒng)(BrukerDaltonik)上測定總質(zhì)量。將結(jié)果顯示在表6b中。表6b:由在包含VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換的結(jié)合臂之內(nèi)的CH1/CL界面中單個(gè)的帶電荷的氨基酸取代產(chǎn)生的副產(chǎn)物分布(主要的本斯·瓊斯型副產(chǎn)物)表6b中的結(jié)果證明:在位于包含VH/VL結(jié)構(gòu)域交換/替換的結(jié)合臂之內(nèi)的CH1/CL界面中，在具有氨基酸取代的Ang2VEGF雙特異性抗體中副產(chǎn)物的分布(包含本斯·瓊斯型錯(cuò)配)不能被改善。當(dāng)前第1頁1 2 3