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序列表

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技術(shù)背景

疼痛是尋求醫(yī)療救助最常見的癥狀之一，并且是所有求醫(yī)患者的一半的主要疾病。盡管存在許多疼痛藥物并得到廣泛使用，對于疼痛尤其是慢性疼痛的消除仍然未獲成功。因此，社會的負擔依然高昂。據(jù)多項研究評價，疼痛導致每年5千萬工作日損失和612億美元的生產(chǎn)力損失。對于慢性疼痛罹患者而言，僅有約一半能以可用的處方治療選擇來管控疼痛。并且，總的處方疼痛藥物市場約為每年250億美元。如這些數(shù)據(jù)所提示的，對于安全有效的新鎮(zhèn)痛藥的巨大需求依然存在。

降低分泌的神經(jīng)生長因子(NGF或β-NGF)的組織水平或抑制其效果的治療劑正是具有成為此種新鎮(zhèn)痛藥的潛力。NGF在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起著眾所周知的關(guān)鍵作用；然而，NGF還是公認的疼痛靶標，因為其在動物和人中引起疼痛。具體而言，在成人中NGF促進一部分中樞和周圍神經(jīng)元的健康和生存(Huang&Reichardt,Ann.Rev.Neurosci.24:677-736(2001))。NGF還有助于這些神經(jīng)元的功能特性的調(diào)整(modulation)并對痛感受體(稱為傷害性感受器(nociceptor))的敏感性或興奮性發(fā)揮緊張控制(tonic control)(Priestley等,Can.J.Physiol.Pharmacol.80:495-505(2002)；Bennett,Neuroscientist 7:13-17(2001))。傷害性感受器感覺到各種引發(fā)疼痛知覺的傷害性刺激并將其傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(傷害感受)。NGF受體定位在傷害性感受器上。NGF的表達在受傷或發(fā)炎的組織中增加，并且在人疼痛狀態(tài)中上調(diào)。因此，由于NGF在傷害感受中的作用，降低NGF水平的NGF結(jié)合劑作為鎮(zhèn)痛治療是具有實用性的。

NGF的皮下注射本身在人和動物產(chǎn)生疼痛。注射的NGF引起快速熱痛覺過敏，然后是延遲的熱痛覺過敏和機械異常性疼痛(allodynia)(Petty等,Ann.Neurol.36:244-46(1994)；McArthur等,Neurology 54:1080-88(2000))。內(nèi)源性分泌的NGF是類似地促傷害感受性的(pro-nociceptive)。組織損傷誘導的NGF釋放及其隨后的在周圍的作用，通過“周圍致敏作用”的過程在熱痛覺過敏的誘導中其主要作用(Mendell&Arvanian,Brain Res.Rev.40:230-39(2002))。組織損傷促進促傷害感受性細胞因子和促炎性細胞因子的釋放，其轉(zhuǎn)而誘導NGF從角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞釋放。這種釋放的NGF直接作用于傷害性感受器上，在傷害性侵犯數(shù)分鐘內(nèi)誘導疼痛或傷害感受性狀態(tài)。因此，NGF在前饋釋放中還間接作用誘導并維持傷害感受性/疼痛狀態(tài)。其誘發(fā)肥大細胞脫顆粒作用，釋放促傷害感受性劑如組胺和血清素，以及更重要的是釋放更多的NGF，并且還能刺激交感神經(jīng)末梢釋放促傷害感受性神經(jīng)遞質(zhì)，如去甲腎上腺素(Ma&Woolf,Neuroreport.8:807-10(1997))。

NGF的組織水平在注射了完全弗氏佐劑(CFA)和角叉菜膠(carrageenan)的動物中是升高的(Ma&Woolf,Neuroreport.8:807-10(1997)；Amann&Schuligoi,Neurosci.Lett.278:173-78(2000))。在大鼠中，NGF增強DRG(背根神經(jīng)節(jié))辣椒素(capsaicin)響應。在罹患類風濕性關(guān)節(jié)炎(Aloe&Tuveri,Clin.Exp.Rheumatol.15:433-38(1997))或膀胱炎(Lowe等,Br.J.Urol.79:572-77(1997))的患者中記錄到了提高的NGF水平。在嚙齒類動物中，周圍神經(jīng)損傷增加巨噬細胞、成纖維細胞、和施旺細胞(Schwann cell)中的NGF mRNA的表達(Heumann等,J.Cell Biol.104:1623-31(1987))。在神經(jīng)損傷后，轉(zhuǎn)基因小鼠中NGF的過表達導致了高于野生型小鼠的增強的神經(jīng)性疼痛行為(Ramer等,Pain,Supp.6:S111-20(1998))。在數(shù)小時和15天后，升高的NGF水平在促進“中樞致敏作用”(脊髓的傷害感受性途徑中突觸處神經(jīng)傳遞的增強)中起作用。中樞致敏作用導致持續(xù)且慢性的痛覺過敏和異常性疼痛。這個過程被認為涉及NGF與其高親和力受體，酪氨酸受體激酶A(trkA)的復合體的內(nèi)化。這些復合體在DRG中向傷害性感受器細胞體的逆向運輸增強脊髓背角(dorsal horn)中傷害感受性神經(jīng)肽(例如P物質(zhì)、或降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP))的分泌、蛋白激酶C(PKC)活化、和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體活化(Sah等,Nat.Rev.Drug Disc.2:460-72(2003))——所有促進傷害感受性途徑的致敏作用的過程。NGF還在電壓依賴性離子通道和配體門控離子通道的上調(diào)和重分布中起作用，包括鈉通道亞型和辣椒素受體，瞬時受體電位陽離子通道亞家族V成員1(TRPV1)(Mamet等,J.Biol.Chem.278:48907-13(1999)；Fjell等,J.Neurosci.Res.57:39-47(1999)；Priestley等,Can.J.Physiol.Pharmacol.80:495-505(2002))。遞質(zhì)、受體、和陽離子通道的改變的活性和/或表達是神經(jīng)性疼痛相關(guān)的傷害性感受器的增加的敏感性和興奮性的基礎。

NGF誘導的傷害感受/疼痛是由高親和力NGF受體trkA(酪氨酸受體激酶A)所介導的(Sah,等,Nat.Rev.Drug Disc.2:460-72(2003))。DRG中約40-45％的傷害性感受器細胞體表達trkA。這些是小直徑纖維或C-纖維的細胞體，其表達分泌的促傷害感受性肽、P物質(zhì)和CGRP。這些纖維末端是背角的I層或II層，其中它們將周圍傷害性感受器所感覺到的傷害性刺激傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在人(Indo,Clin.Auton.Res.12(Supp 1):I20-I32(2002))和在trkA敲除小鼠(de Castro等,Eur.J.Neurosci.10:146-52(1998))中trkA基因中的突變或刪除產(chǎn)生特征為痛覺喪失的表型。值得關(guān)注的是，在處于關(guān)節(jié)炎(Pozza等,J.Rheumatol.27:1121-27(2000))或膀胱炎疼痛(Qiao&Vizzard,J.Comp.Neurol.454:200-11(2002))模型的動物中或處于炎性疼痛(其由注射CFA或角叉菜膠入爪中所誘導)的動物(Cho等,Brain Res.716:197-201(1996))中trkA的表達是上調(diào)的。

NGF還結(jié)合至p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體(p75NTR)。p75NTR的作用取決于其細胞環(huán)境和其他受體的存在，據(jù)信所述其他受體起輔助受體或共同受體的功能。trkA和p75NTR的相互作用導致對NGF的高親和力結(jié)合位點的形成。此類受體相互作用在NGF介導的疼痛信號傳輸中的重要性尚未明確，但近期的研究已啟示了在細胞過程中p75NTR可能是相關(guān)的(Zhang&Nicol,Neurosci.Lett.366:187-92(2004))。然而，雖然p75NTR敲除小鼠表現(xiàn)出對傷害性刺激升高的閾值，但它們?nèi)员３謱GF的痛覺過敏效果的響應性，說明單獨trkA受體不足以介導這些效果(Bergmann等,Neurosci.Lett.255:87-90(1998))。

NGF阻斷在慢性傷害性疼痛(例如骨關(guān)節(jié)炎(OA))和慢性下背痛中產(chǎn)生對NSAID的階躍變化的(step-change)效力。一些靶向NGF的治療性抗體候選物正處于各種臨床前階段和臨床開發(fā)中。此類抗體包括例如他尼珠單抗(Tanezumab)(PF-4383119；Pfizer)，其是一種IgG2形式的人源化抗體；SAR164877/REGN475(Sanofi-Aventis/Regeneron Pharmaceuticals)，其是一種IgG4形式的人抗體；AMG403(Amgen/Johnson&Johnson)，其是一種IgG2形式的人抗體；PG110(PanGenetics/Abbott)，其是一種IgG4形式的人源化抗體。其他治療性抗體候選物公開于WO 2006/077441中，其涉及NGF抗體和用所述公開的抗體治療NGF在其中起作用的疾病或病癥的方法。MEDI-578是一種IgG4形式的人抗體。盡管開發(fā)了這些候選物，依然需要通過NGF結(jié)合劑對更廣范圍的疼痛病況提供鎮(zhèn)痛緩解，所述NGF結(jié)合劑具有強效力和改進的安全性概貌。

腫瘤壞死因子α(TNFα)也稱為惡病質(zhì)素(cachectin)，其是一種多效細胞因子，具有廣范圍的生物活性，包括細胞毒性、免疫細胞增殖、炎癥反應、腫瘤發(fā)生、和病毒復制(Kim等,J.Mol.Biol.374,1374(2007))。TNFα最初是作為跨膜蛋白產(chǎn)生(tm TNFα)，其隨后被金屬蛋白酶切割為可溶形式(sTNFα)(Wallis,Lancet Infect.Dis.8(10):601(2008))。TNFα(～17kDa)作為剛性的(rigid)同三聚體分子而存在，其結(jié)合至細胞表面TNF受體1或TNF受體2，誘導受體寡聚化和信號轉(zhuǎn)導。

已知炎性細胞因子，以及更具體而言TNFα，在產(chǎn)生痛覺過敏中具有作用(Leung,L.和Cahill,CM.,J.Neuroinflammation 7:27(2010))。一些初步數(shù)據(jù)已顯示TNFα抑制劑可能在控制神經(jīng)性疼痛中是有用的。參見例如Sommer C,等,J.Peripher.Nerv.Syst.6:67-72(2001),Cohen等,A&A Feb 2013,116,2,455-462,Genevay等,Ann Rheum Dis 2004,63,1120-1123。臨床研究測試了TNFα抑制劑作為單一治療用于治療神經(jīng)性疼痛，其結(jié)果仍然是不確定性的。參見Leung和Cahill(2010)。

盡管已在開發(fā)靶向NGF的和靶向TNFα的候選物用于治療疼痛，依然需要通過對當前標準療理更有效的制劑來對更多種疼痛病況提供鎮(zhèn)痛緩解。本發(fā)明提供了靶向NGF和TNFα二者的組合治療，其能提高效力且具有降低對罹患疼痛者的施用量和頻率二者的潛力。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供用于控制受試者中的疼痛的方法，包括將有效量的神經(jīng)生長因子(NGF)拮抗劑和腫瘤壞死因子-α(TNFα)拮抗劑、或包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域的結(jié)合分子施用于對其有需要的受試者。在一些實施方案中，所述施用比單獨施用等量的所述NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑更有效地控制受試者中的疼痛。在一些實施方案中，所述方法包括共同施用TNFα拮抗劑和NGF拮抗劑。在一些實施方案中，將TNFα拮抗劑和NGF拮抗劑序貫施用或同時施用。

在一些實施方案中，所述方法足以預防、減少、減輕、或消除受試者中的疼痛。在一些實施方案中，所述疼痛是急性疼痛、短期疼痛、持續(xù)或慢性傷害性疼痛、或是持續(xù)或慢性神經(jīng)性疼痛。在一些實施方案中，所述方法對于控制受試者中的疼痛比單獨施用等量的NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％更有效。

在一些實施方案中，所述結(jié)合分子的TNFα拮抗劑部分結(jié)合包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽。在一些實施方案中，所述NGF拮抗劑結(jié)合包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。

在一些實施方案中，所述結(jié)合分子的NGF拮抗劑部分是抗NGF抗體或其抗原結(jié)合片段。在一些實施方案中，抗NGF抗體或其片段能抑制NGF對TrkA、對p75NRT、或?qū)rkA和P75NRT二者的結(jié)合。在一些實施方案中，相對于NGF對p75NRT的結(jié)合，所述結(jié)合分子優(yōu)先地阻斷NGF對TrkA的結(jié)合。在一些實施方案中，所述抗NGF抗體或其片段以約0.25-0.44nM的親和力結(jié)合人NGF。在一些實施方案中，所述抗NGF抗體或其片段結(jié)合至與MEDI-578相同的表位。在一些實施方案中，所述抗NGF抗體或其片段競爭性地抑制MEDI-578對人NGF的結(jié)合。

在一些實施方案中，抗NGF抗體或其片段包含抗體VH域和抗體VL域，所述抗體VH域包含一組CDR，即HCDR1、HCDR2、HCDR3，所述抗體VL域包含一組CDR，即LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中所述HCDR1具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或SEQ ID NO:4具有多至兩個氨基酸取代的氨基酸序列，所述HCDR2具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列或SEQ ID NO:5具有多至兩個氨基酸取代的氨基酸序列，所述HCDR3具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列、SEQ ID NO:6具有多至兩個氨基酸取代的氨基酸序列、SSRIYDFNSALISYYDMDV(SEQ ID NO:11)、或SSRIYDMISSLQPYYDMDV(SEQ ID NO:12)，所述LCDR1具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列或SEQ ID NO:8具有多至兩個氨基酸取代的氨基酸序列，所述LCDR2具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列或SEQ ID NO:9具有多至兩個氨基酸取代的氨基酸序列，且所述LCDR3具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列或SEQ ID NO:10具有多至兩個氨基酸取代的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗NGF抗體或其片段包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH。在一些實施方案中，抗NGF抗體或其片段包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL。在一些實施方案中，抗NGF抗體或其片段包含VH，所述VH具有與SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗NGF抗體或其片段包含VL，所述VL具有與SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗NGF抗體或其片段包含具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH。在一些實施方案中，抗NGF抗體或其片段包含具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VL。在一些實施方案中，抗NGF抗體或其片段包含VH，所述VH具有與SEQ ID NO:94的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗NGF抗體或其片段包含VL，所述VL具有與SEQ ID NO:95的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。

在一些實施方案中，抗NGF抗體或其片段是完全H₂L₂抗體、Fab片段、Fab'片段、F(ab)₂片段或單鏈Fv(scFv)片段。在一些實施方案中，抗NGF抗體或其片段是人源化的、嵌合的、靈長類化的(primatized)、或完全人的。在一些實施方案中，NGF拮抗劑是抗NGF scFv片段。在一些實施方案中，scFv是SS-穩(wěn)定化的。在一些實施方案中，所述抗NGF scFv片段從N末端至C末端包含如下：包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH、15個氨基酸的接頭序列(GGGGS)₃(SEQ ID NO:15)、以及包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL。在一些實施方案中，所述抗NGF scFv片段從N末端至C末端包含如下：包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH、20個氨基酸的接頭序列(GGGGS)₄(SEQ ID NO:19)、以及包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VL。

在一些方面，所述方法包括施用TNFα拮抗劑，所述TNFα拮抗劑抑制TNFα對TNF受體(TNFR)的結(jié)合，由此阻斷TNFα活性。在一些實施方案中，TNFα拮抗劑包含抗TNFα抗體或其抗原結(jié)合片段。在一些實施方案中，抗TNFα抗體或其抗原結(jié)合片段包含抗體VH域和抗體VL域，所述抗體VH域包含一組CDR，即HCDR1、HCDR2、和HCDR3，所述抗體VL域包含一組CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中CDR與英夫利昔單抗(infliximab)的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3或阿達木單抗(adalimumab)的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3相同。

在一些實施方案中，所述結(jié)合分子包含完整的抗TNFα抗體和融合至抗TNFα抗體的重鏈的C末端的抗NGF scFv。此種結(jié)合分子可以包含輕鏈和重鏈，所述輕鏈包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。

在一些實施方案中，TNFα拮抗劑包含可溶的、TNFR的TNFα結(jié)合片段。在一些實施方案中，所述TNFR是TNFR-2或其可溶片段。在其他實施方案中，所述TNFR是TNFR-1或其可溶片段。在一些實施方案中，所述TNFR-1的可溶片段是55kD片段。在其他實施方案中，所述TNFR-2的可溶片段是75kD片段。在一些實施方案中，所述TNFR片段融合至免疫球蛋白Fc域。在一些實施方案中，所述免疫球蛋白Fc域是人IgG1Fc域。在一些實施方案中，所述TNFα拮抗劑具有SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列或其功能性片段。

在一些實施方案中，所述結(jié)合分子包含融合蛋白，所述融合蛋白包含經(jīng)接頭融合至TNFα拮抗劑的NGF拮抗劑。在一些實施方案中，所述結(jié)合分子是融合蛋白的同二聚體。

在一些實施方案中，所述NGF拮抗劑是抗NGF scFv域且所述TNFα拮抗劑是可溶的、TNFR-2的TNFα結(jié)合片段，其于其羧基末端處融合至免疫球蛋白Fc域。在一些實施方案中，所述scFv經(jīng)接頭融合至所述免疫球蛋白Fc域的羧基末端。

在一些實施方案中，所述結(jié)合分子包含融合多肽的同二聚體，所述融合多肽從N末端至C末端包含如下：TNFR-2的結(jié)合TNFα的75kD片段、人IgG1Fc域、10個氨基酸的接頭序列(GGGGS)₂、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH、15個氨基酸的接頭序列(GGGGS)₃(SEQ ID NO:15)、和包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL。在一些實施方案中，所述結(jié)合分子包含融合多肽的同二聚體，所述融合多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述結(jié)合分子包含融合多肽的同二聚體，所述融合多肽包含與SEQ ID NO:14的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述結(jié)合分子包含融合多肽的同二聚體，所述融合多肽從N末端至C末端包含如下：TNFR-2的結(jié)合TNFα的75kD片段、人IgG1Fc域、10個氨基酸的接頭序列(GGGGS)₂、包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH、20個氨基酸的接頭序列(GGGGS)₄(SEQ ID NO:19)、和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VL。在一些實施方案中，所述結(jié)合分子包含融合多肽的同二聚體，所述融合多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述結(jié)合分子包含融合多肽的同二聚體，所述融合多肽包含與SEQ ID NO:17的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。

在一些實施方案中，所述結(jié)合分子包含融合多肽的同二聚體，所述融合多肽自N末端至C末端包含如下：TNFR-2的結(jié)合TNFα的75kD片段、人IgG1Fc域、接頭序列、和抗NGF scFv域。

本公開內(nèi)容還提供用于抑制細胞中p38磷酸化的方法，其中所述方法包括使細胞接觸本文所述的任何多肽(例如包含本文所述NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域的任何結(jié)合分子)。本公開內(nèi)容還提供用于抑制細胞中ERK磷酸化的方法，其中所述方法包括使細胞接觸本文所述的任何多肽(例如包含本文所述NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域的任何結(jié)合分子)。在一些實施方案中，所述細胞是神經(jīng)元細胞。在其他實施方案中，所述細胞是周圍神經(jīng)元細胞。在又一些實施方案中，所述細胞是中樞神經(jīng)元細胞。在一些實施方案中，所述細胞在哺乳動物內(nèi)。在一些實施方案中，所述哺乳動物是人。在一些實施方案中，所述細胞在細胞培養(yǎng)物內(nèi)。

本發(fā)明還提供編碼本文所述結(jié)合分子的多核苷酸序列、包含這些多核苷酸序列的載體、以及包含這些多核苷酸或載體的宿主細胞。

本發(fā)明還提供用于產(chǎn)生本文所述的結(jié)合分子的方法。

本發(fā)明還提供包含本文所述結(jié)合分子的組合物、藥物組合物和試劑盒。

附圖/圖表簡述

圖1：TNFR2-Fc融合蛋白(圖面A)，以及示例性的包含融合至抗NGF scFv域的TNFR2-Fc域的多特異性結(jié)合分子TNFR2-Fc_VH#4(圖面B)的示意圖。

圖2A顯示了一批純化的TNFR2-Fc_VH#4中聚集體、單體、和蛋白片段化水平的SEC-HPLC分析的結(jié)果。

圖2B顯示了還原和非還原條件下純化的TNFR2-Fc_VH#4和純化的TNFR2-Fc蛋白的SDS-PAGE分析。凝膠加載順序：1.TNFR2-Fc_VH#4，2.TNFR2-Fc_VL-VH(以反向可變域基因取向融合至抗NGF scFv的TNFR2-Fc)，3.TNFR2-Fc不相關(guān)scFv 1，4.TNFR2-Fc，5.TNFR2-Fc不相關(guān)scFv 2。

圖3A顯示了蛋白A柱純化后TNFR2-Fc_VH#4的純度。圖3B顯示了在SP瓊脂糖柱上的第二次純化步驟后TNFR2-Fc_VH#4的純度。

圖4顯示了用差示掃描量熱法進行的TNFR2-Fc_VH#4的穩(wěn)定性分析。

圖5顯示了TNFR2-Fc_VH#4對TNFα和NGF的結(jié)合(單獨和一起兩者)，如由ELISA確定。圖5A顯示了對NGF的結(jié)合，圖5B顯示了對TNFα的結(jié)合，而圖5C顯示了對TNFα和NGF的同時結(jié)合。

圖6顯示了TNFR2-Fc_VH#4的表面等離子體共振結(jié)合測定的傳感圖(sensorgram)。用BIAcore 2000來進行TNFR2-Fc_VH#4多特異性抗體的并行的抗原結(jié)合。通過將TNFα和NGF連續(xù)結(jié)合到結(jié)合至傳感器表面的TNFR2-Fc_VH#4之上(over)來評估同時的抗原結(jié)合。傳感圖的第一部分顯示了飽和量的TNFα對所述多特異性抗體的結(jié)合，傳感圖的第二部分顯示了當應用第二抗原時的結(jié)合，所述第二抗原或者又是TNFα(其顯示表面是飽和的)，或者是等摩爾的TNFα和NGF混合物。共振單位的增加等同于NGF對多特異性分子的結(jié)合，并且因此等同于同時的抗原銜接(antigen engagement)。還用相反順序添加抗原來進行測定以確定這些數(shù)據(jù)。

圖7顯示了NGF介導的TF-1細胞增殖的抑制。A.在不存在添加的NGF拮抗劑時NGF介導的增殖。B.通過TNFR2-Fc_VH#4對人NGF響應的抑制。C.通過TNFR2-Fc_VH#4對鼠NGF響應的抑制。NGF的活性通常表示為RLU–相對發(fā)光單位，而NGF介導的增殖的百分比以單獨針對NGF配體的百分比響應用如下公式來計算：100*(孔RLU–背景RLU)/(總RLU–背景RLU)，其中背景RLU＝介質(zhì)對照的平均值，并且總RLU＝僅配體對照的平均值。D.TNFR2-Fc_VarB和ndimab VarB對人NGF響應的抑制。E.TNFR2-Fc_VarB和ndimab VarB對鼠NGF響應的抑制。

圖8顯示了U937細胞中TNFα誘導的胱天蛋白酶3(Caspase 3)活性的抑制。A.在沒有添加TNFα拮抗劑的條件下U937細胞中TNFα誘導的胱天蛋白酶3活性。B.U937細胞中TNFα誘導的胱天蛋白酶3活性的抑制，其顯示為未添加拮抗劑的條件下的響應的百分比。TNF的活性通常表示為RLU–相對發(fā)光單位，而TNF介導的胱天蛋白酶3釋放的％以單獨對TNF配體的百分比響應用上述圖7C中所述的公式來計算。C.對相關(guān)分子TNFR2-Fc_varB和ndimab VarB顯示了相似的結(jié)果。

圖9顯示了用依那西普(etanercept)和MEDI-578組合治療對局部坐骨神經(jīng)結(jié)扎誘導的機械性痛覺過敏的效果。結(jié)果以同側(cè)/對側(cè)比率來顯示。N＝9-10每組。用2因素ANOVA分析、以時間和處理作為相關(guān)因子(dependent factor)來分析數(shù)據(jù)。隨后用Boniferroni事后檢驗(Boniferroni’s Post Hoc test)獲得了統(tǒng)計學顯著性。對比Op+CAT-251對照，***p<0.001。

圖10A顯示了TNFR2-Fc_VH#4對局部坐骨神經(jīng)結(jié)扎誘導的機械性痛覺過敏的效果。結(jié)果以同側(cè)/對側(cè)比率來顯示。N＝10每組。用2因素ANOVA分析、以時間和處理作為相關(guān)因子來分析數(shù)據(jù)。隨后用Boniferroni事后檢驗獲得了統(tǒng)計學顯著性。對比雙特異性同種型對照，***p<0.001。圖10B用相關(guān)分子TNFR2-Fc_varB顯示了相似的結(jié)果。

圖11顯示了共同施用MEDI-578和依那西普對機械超敏性的關(guān)節(jié)痛模型中的疼痛降低的效果。N＝9-10每組。用2因素ANOVA分析來分析數(shù)據(jù)。隨后用Boniferroni事后檢驗獲得了統(tǒng)計學顯著性。對比CAT-251，*P>0.05；***P<0.001。

圖12顯示了TNFR2-Fc_VH#4對機械超敏性的關(guān)節(jié)痛模型中的疼痛降低的效果。N＝9-10每組。用2因素ANOVA分析來分析數(shù)據(jù)。隨后用Boniferroni事后檢驗獲得了統(tǒng)計學顯著性。對比雙特異性同種型對照，***P<0.001。

圖13顯示了大鼠模型中五個不同劑量的TNFR2-Fc_varB對CFA誘導的痛覺過敏的效果。

圖14：顯示來自磷酸-p38反應的HTRF比率的熱圖。

圖15：劑量響應曲線，其顯示了TNFα、NGF、或TNFα和NGF的組合對p38磷酸化的效果。

圖16：顯示來自磷酸-ERK反應的HTRF比率的熱圖。

圖17：劑量響應曲線，其顯示了TNFα、NGF、或TNFα和NGF的組合對ERK磷酸化的效果。

發(fā)明詳述

定義

應當注意，術(shù)語“一(a)”或“一(an)”事物意指一個或多個該事物。同樣，一(a)”(或“一(an)”)、“一個或多個”、和“至少一個”在此可以互換地使用。

此外，本文所用的“和/或”應當認為是具體公開了兩個具體特征或組分的每一個連同或連同另一個。因此，本文的術(shù)語“和/或”用于短語如“A和/或B”中時意欲包括“A和B”、“A或B”、“A(單獨)”、和“B(單獨)”。同樣，術(shù)語“和/或”用于短語如“A、B、和/或C”中時意欲涵蓋如下的每一個方面：A、B和C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨)；B(單獨)；和C(單獨)。

應當理解，任何在此以語言“包含/包括(comprising)”來描述方面之處，也提供以術(shù)語“由……組成”和/或“基本由……組成”來描述的類似方面。

除另有定義外，本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明相關(guān)領域普通技術(shù)人員的通常理解相同的含義。例如，《簡明生物醫(yī)學及分子生物學詞典》，Juo,Pei-Show,第二版,2002,CRC Press；《細胞及分子生物學詞典》,第三版,1999,Academic Press；以及《牛津生物化學及分子生物學詞典》,2000修訂版,Oxford University Press，為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所用的許多術(shù)語的通用詞典。

單位、前綴、和符號以其國際單位制(Système International de Unites,SI)所接受的形式來表示。數(shù)字范圍為包含定義該范圍的數(shù)字。除另有說明外，氨基酸序列按從氨基至羧基方向從左至右書寫。本文提供的標題并非對本發(fā)明各種方面的限制，而是通過提述并入說明書作為一個整體。因而，緊接本段的下文所定義的術(shù)語通過對說明書的提述以其整體來更完整地定義。

如本文所用的，術(shù)語“結(jié)合分子”其最廣義是意指特異性結(jié)合抗原決定簇(例如抗原)的分子。結(jié)合分子的非限制性的例子包括抗體或其片段、可溶受體融合蛋白或其片段、非免疫球蛋白骨架或其片段，其各保留有抗原特異性結(jié)合。示例性的非免疫球蛋白骨架包括Tn3(Koide等,J Mol Biol 2012Jan 13；415(2):393-405)、DARPin(Boersma&Pluckthun,Curr Opin Biotechnol.2011 22(6):849-57)、Anticalin(Gebauer&Skerra,Methods Enzymol.2012；503:157-88)。示例性的可溶受體融合蛋白和抗體提供于下文。在一些實施方案中，可以對所述結(jié)合分子進行工程化以包含如下的組合：此類抗體或其片段、可溶受體融合蛋白或其片段、以及基于非免疫球蛋白的骨架或其片段。

結(jié)合分子或所述結(jié)合分子的任何識別抗原的部分在此處稱為“結(jié)合域”。除明確提及完整大小的(full-sized)結(jié)合分子如天然存在的抗體外，術(shù)語“結(jié)合分子”不受限地涵蓋完整大小的抗體或其他非抗體結(jié)合分子，以及此類結(jié)合分子的抗原結(jié)合片段、變體、類似物、或衍生物，例如天然存在的抗體或免疫球蛋白分子或工程化的結(jié)合分子或以與完整大小的結(jié)合分子相似的方式結(jié)合抗原的片段。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供一些多特異性結(jié)合分子，例如雙特異性、三特異性、四特異性等的結(jié)合分子，或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物。如本文所用的，多特異性結(jié)合分子可以包括一個或多個抗體結(jié)合域、一個或多個非抗體結(jié)合域、或其組合。

如本文所用的，術(shù)語“神經(jīng)生長因子”(“NGF”)，在字面上也稱為β-神經(jīng)生長因子，意指在多種神經(jīng)元的生長和存活中起作用的分泌蛋白。人NGF以Genbank登錄號NP_002497.2呈示，并在本文以SEQ ID NO:1呈示。如本文所用的，術(shù)語NGF不限于人NGF，并且包含人NGF的所有物種直向同源物。術(shù)語“NGF”涵蓋NGF的前體形式(pro-form)、前NGF(pro-NGF)、全長NGF、以及由細胞內(nèi)過程產(chǎn)生的任何形式的NGF。該術(shù)語還涵蓋天然存在的NGF的變體，例如剪接變體、等位基因變體、和同種型。NGF能結(jié)合兩個受體：p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體(p75(NTR))和TrkA，其是一種跨膜酪氨酸激酶。NGF是經(jīng)過充分驗證的針對疼痛的靶標，已知其介導傷害性感受器的致敏作用。

多種制劑正在作為NGF活性的拮抗劑接受測試。一種這樣的抗NGF劑是trkA-Fc，其充當誘餌或清道夫(scavenger)來結(jié)合至內(nèi)源性NGF并且由此使之失活。TrkA-Fc是由trkA的NGF結(jié)合區(qū)連接至IgG抗體的恒定域片段(Fc)組成的融合蛋白。TrkA-Fc在未處理動物中產(chǎn)生痛覺減退(hypoalgesia)，降低傷害性感受器響應，并降低無髓鞘的疼痛感受神經(jīng)元的出芽(sprouting)(Bennett,D.L.等(1998)Eur J Neurosci,10:1282-91)。

NGF介導的疼痛特別適于用本文所示的結(jié)合分子進行的安全有效的治療，這是因為周圍的NGF水平響應于傷害性刺激而升高且抗體具有低血腦屏障穿透性。一些可以用于本文所述的治療和組合物的抗NGF抗體及其抗原結(jié)合片段可見于文獻中，參見例如PCT公開No.WO02/096458和WO04/032870。

術(shù)語“MEDI-578”意指一種特異性結(jié)合NGF的抗體，其是國際申請No.PCT/GB2006/000238和美國專利申請公開No.2008/0107658A1的主題，二者在此均通過提述以其整體并入本文。MEDI-578重鏈和輕鏈序列分別示于SEQ ID NOs:3和7中。

術(shù)語NGF-NG意指一種特異性結(jié)合NGF的抗體。NGF-NG重鏈和輕鏈序列分別示于SEQ ID NOs:24和26中。

術(shù)語“腫瘤壞死因子α”(“TNFα”)，字面上也稱為惡病質(zhì)素，APC1蛋白；腫瘤壞死因子；TNF；或腫瘤壞死因子配體超家族2，如本文所用，意指具體的TNFα蛋白，并且不是TNF配體的超家族。人TNFα以Genbank登錄號NP_000585.2呈示，并在本文以SEQ ID NO:2呈示。如本文所用的，術(shù)語TNFα不限于人TNF，并且包括人TNFα的所有物種直向同源物。術(shù)語“TNFα”涵蓋TNFα的前體形式、前TNFα(pro-TNFα)、全長TNFα、以及由細胞內(nèi)過程產(chǎn)生的任何形式的TNFα。該術(shù)語還涵蓋TNFα的天然存在的和非天然存在的變體，例如剪接變體、等位基因變體、和同種型。TNFα能結(jié)合兩個受體，TNFR1(1型TNF受體；CD120a；p55/60)和TNFR2(2型TNF受體；CD120b；p75/80)。TNFα起促炎性細胞因子的作用，例如在神經(jīng)炎癥中起作用。例如TNFα被認為在功能上涉及神經(jīng)性疼痛的發(fā)生(Leung,L.和Cahill,CM.,J.Neuroinflammation 7:27(2010))。

本領域已知大量的TNFα拮抗劑，并且許多是商業(yè)上可獲得的治療劑。能用于本文提供的治療和組合物的商業(yè)上可獲得的TNF-α拮抗劑包括依那西普(Amgen/Pfizer)、英夫利昔單抗(infliximab)(例如Centocor)、聚乙二醇賽妥珠單抗(certolizumab pegol)(例如UCB)、戈利木單抗(golimumab)(例如SIMPONI^TM,Centocor)和阿達木單抗(例如Abbott)。

“分離的”結(jié)合分子、多肽、抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞、或組合物意指以非天然存在的形式存在的結(jié)合分子、多肽、抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞、或組合物。分離的結(jié)合分子、多肽、抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞、或組合物包括經(jīng)過改變、適應、組合、重排、工程化、或以其他方式操作達到不再是其天然存在的形式的程度。在一些方面，被分離的結(jié)合分子、多肽、抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞、或組合物是“重組的”。

如本文所用的，術(shù)語“多功能多肽”和“雙功能多肽”意指設計來靶向兩個或更多個抗原的非天然存在的結(jié)合分子。本文所述的多功能多肽通常是遺傳工程化的融合蛋白，其經(jīng)設計以將兩個不同的所需的生物學功能帶入單個結(jié)合分子。例如，多功能多肽可以是多功能結(jié)合分子。本文所述的示例性多功能多肽是包含NGF拮抗劑域(例如阻斷、降低、或抑制一種或多種天然NGF功能的肽結(jié)構(gòu)域)和TNFα拮抗劑域(例如阻斷、降低、或抑制一種或多種天然TNFα功能的肽結(jié)構(gòu)域)的多功能結(jié)合分子。

本文提供的一組多功能多肽是多特異性結(jié)合分子，例如包含一個或多個抗體結(jié)合域的(例如“多特異性抗體”)、一個或多個非抗體結(jié)合域的(例如誘餌受體)、或其組合的結(jié)合分子。例如，包含一個或多個抗體結(jié)合域、一個或多個非抗體結(jié)合域、或其組合的多特異性結(jié)合分子是具有能特異性識別并結(jié)合至至少兩個不同表位的結(jié)合域的分子。不同的表位或是可以在相同的分子(例如相同的NGF)內(nèi)或是在不同的分子上，從而使例如多特異性結(jié)合分子能特異性識別并結(jié)合NGF以及另一含有表位的分子，例如TNFα，從而使多特異性結(jié)合分子特異性識別NGF和TNFα。

用于制作多特異性結(jié)合分子(例如包含一個或多個抗體結(jié)合域、一個或多個非抗體結(jié)合域、或其組合的多特異性結(jié)合分子)的技術(shù)可從本領域獲得(Dimasi,N.,等,2009,J Mol Biol.393:672-92；Milstein等,1983,Nature 305:537-539；Brennan等,1985,Science 229:81；Suresh等,1986,Methods in Enzymol.121:120；Traunecker等,1991,EMBO J.10:3655-3659；Shalaby等,1992,J.Exp.Med.175:217-225；Kostelny等,1992,J.Immunol.148:1547-1553；Gruber等,1994,J.Immunol.152:5368；和U.S.Patent 5,731,168)。具有多于兩價(valencies)的抗體也涵蓋在內(nèi)。例如，可以制備三特異性抗體(Tutt等,J.Immunol.147:60(1991))。

術(shù)語“抗體”意指經(jīng)免疫球蛋白分子可變區(qū)內(nèi)的至少一個抗原識別位點識別并特異性結(jié)合至靶標的免疫球蛋白分子，所述靶標例如蛋白、多肽、肽、糖類、多核苷酸、脂質(zhì)、或前述的組合。如本文所用的，術(shù)語“抗體”涵蓋完整多克隆抗體、完整單克隆抗體、抗體片段(如Fab、Fab'、F(ab')₂、和Fv片段)、單鏈Fv(scFv)突變體、多特異性抗體如雙特異性、三特異性、四特異性抗體等，其從至少兩個包含抗體的抗原結(jié)合部分的完整抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、融合蛋白產(chǎn)生、以及任何其他包含抗原識別位點的修飾的免疫球蛋白分子，只要所述抗體表現(xiàn)出所需的生物學活性?？贵w可以屬于免疫球蛋白的五個主要類別的任一：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM、或其亞類(同種型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，其是基于它們的重鏈恒定域的身份分別稱為α、δ、ε、γ、和μ。不同類別的免疫球蛋白具有不同的且眾所周知的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型。

在一些實施方案中，“阻斷”結(jié)合分子，例如阻斷抗體或“拮抗劑”阻斷分子，例如拮抗劑抗體或融合蛋白，是抑制或降低其結(jié)合的抗原(如NGF或TNF)的生物活性的那種結(jié)合分子。在一些方面，阻斷抗體或拮抗劑結(jié)合分子基本上或完全抑制抗原的生物活性。例如，所述生物活性可以降低0.01％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％、或甚至100％。本文所用的“拮抗劑”和“拮抗劑域”包括這樣的多肽或其他分子，所述多肽或其他分子結(jié)合至其靶標(例如TNFα或NGF)，由此阻斷或抑制靶標與受體相互作用。因此，NGF和/或TNFα拮抗劑包括阻斷或抑制NGF與trkA或p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白相互作用、或TNFα與TNFR-1或TNFR-2相互作用的分子。NGF和/或TNFα拮抗劑還包括降低p38磷酸化和/或ERK磷酸化的分子。示例性的拮抗劑包括但不限于抗體或其抗原結(jié)合片段，以及靶標特異性的、可溶的、非信號傳輸?shù)氖荏w肽(“誘餌受體”，或其配體結(jié)合片段)。

術(shù)語“抗體片段”意指完整抗體的一部分并且意指完整抗體的抗原決定簇可變區(qū)?？贵w片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂、和Fv片段、線性抗體、單鏈抗體、和由抗體片段形成的多特異性抗體。在本文其他部分描述的非抗體結(jié)合分子的抗原結(jié)合片段也通過本文而提供。

“單克隆抗體”意指同質(zhì)性抗體群體，其涉及對單一抗原決定簇或表位的高度特異性識別和結(jié)合。這與多克隆抗體形成對比，多克隆抗體通常包含針對不同抗原決定簇的不同抗體。術(shù)語“單克隆抗體”涵蓋完整的和全長單克隆抗體以及抗體片段(如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv)、單鏈(scFv)突變體、包含抗體部分的融合蛋白、以及任何其他經(jīng)修飾的包含抗原識別位點的免疫球蛋白分子。此外，“單克隆抗體”意指這樣的以任何數(shù)目的方式制成的抗體，所述方式包括但不限于通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、以及轉(zhuǎn)基因動物。

術(shù)語“人源化抗體”意指非人(例如鼠)抗體的形式，其是特異性的免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白、或其含有最小非人(例如鼠)序列的片段。通常，人源化抗體是人免疫球蛋白，其中來自互補決定區(qū)(CDR)的殘基由來自具有合意的特異性、親和力、和能力的非人物種(例如小鼠、大鼠、兔、或倉鼠)的CDR的殘基所替代(Jones等,1986,Nature,321:522-525；Riechmann等,1988,Nature,332:323-327；Verhoeyen等,1988,Science,239:1534-1536)。在一些實例中，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR或FW)殘基由來自具有合意的特異性、親和力和能力的非人物種的抗體中的對應殘基替代。所述人源化抗體還可以通過取代額外的殘基來進行修飾，所述殘基或是在Fv框架區(qū)中和/或在替換的非人殘基內(nèi)，以改進和優(yōu)化抗體特異性、親和力和/或能力。一般而言，人源化抗體包含基本上全部的至少一個、且通常是兩個或三個含有全部或基本上全部的與非人免疫球蛋白對應的CDR區(qū)的可變域，但是全部的或基本上全部的FR區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體還可以包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)或域(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)或域。用于產(chǎn)生人源化抗體的方法描述于美國專利5,225,539或5,639,641中。

抗體的“可變區(qū)”意指抗體輕鏈的可變區(qū)或抗體重鏈的可變區(qū)，或是單獨或是以組合形式。所述重鏈和輕鏈可變區(qū)各自由通過3個互補決定區(qū)(CDR)(也稱為高變區(qū))連接的4個框架區(qū)(FR或FW)組成。各條鏈中的CDR通過FR聚在一起非?？拷⑶遗c來自另一條鏈的CDR促進抗體的抗原結(jié)合位點的形成。至少有兩種技術(shù)用于確定CDR：(1)基于跨物種序列可變性的手段(即，Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第五版,1991,National Institutes of Health,Bethesda Md.))；和(2)基于抗原-抗體復合體的晶體學研究的手段(Al-lazikani等(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。此外，有時也用這兩種手段的組合來確定CDR。

指代可變域中的殘基(約輕鏈的殘基1-107和重鏈的殘基1-113)時通常使用Kabat編號系統(tǒng)(例如Kabat等,Sequences of Immunological Interest,第五版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。

如Kabat中的氨基酸位置編號，意指Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)中用于抗體的匯編的重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統(tǒng)。使用這種編號系統(tǒng)，實際的線性氨基酸序列能包含與可變域的FR或CDR的縮短或插入相對應的更少的或額外的氨基酸。例如，重鏈可變域可以包括H2的殘基52之后的氨基酸插入(根據(jù)Kabat的殘基52a)和重鏈FR殘基82之后的插入殘基(例如根據(jù)Kabat的殘基82a、82b、和82c等)?？梢杂谩皹藴省盞abat編號序列通過抗體的序列同源性區(qū)域處的比對來確定給定抗體的殘基的Kabat編號。作為代替，Chothia意指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。當用Kabat編號慣例進行編號時，Chothia CDR-H1環(huán)的末端在H32和H34之間變化，這取決于環(huán)的長度(這是因為Kabat編號策略將插入置于H35A和H35B處；如果35A和35B都不存在，則環(huán)在32處結(jié)束；如果僅存在35A，則環(huán)在33處結(jié)束；如果35A和35B都存在，則環(huán)在34處結(jié)束)。AbM高變區(qū)代表Kabat CDR和Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的妥協(xié)，并由Oxford Molecular's AbM抗體建模軟件使用。下表1中提供了比較。

表1：抗體編號系統(tǒng)的比較

術(shù)語“人抗體”意指天然人抗體或具有與天然人抗體對應的氨基酸序列的抗體，其用本領域已知的任何技術(shù)制成。該人抗體的定義包括完整或全長抗體、其片段、和/或包含至少一個人重鏈和/或輕鏈多肽的抗體，例如包含鼠輕鏈和人重鏈多肽的抗體。

術(shù)語“嵌合抗體”意指這樣的抗體，其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列來源于兩個或更多個物種。通常，輕鏈和重鏈二者的可變區(qū)均對應于來源于一個具有合意的特異性、親和力和能力的哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)的抗體的可變區(qū)，而恒定區(qū)與來源與另一個物種(通常是人)的抗體中的序列是同源的，以避免在該物種中誘發(fā)免疫響應。多特異性結(jié)合分子，例如包含一個或多個抗體結(jié)合域、一個或多個非抗體結(jié)合域、或其組合，例如本文提供的TNFα拮抗劑和/或NGF拮抗劑的多特異性結(jié)合分子，可以包含抗體恒定區(qū)(例如Fc區(qū))，其中一個或多個恒定區(qū)域的至少一部分被刪除或是被修改從而提供合意的生化特性，如與免疫原性大致相同且包含天然的或未改變的恒定區(qū)的抗體相比提高的腫瘤定位或降低的血清半衰期。本文提供的修飾的恒定區(qū)可以包含對三個重鏈恒定域(CH1、CH2或CH3)的一個或多個和/或?qū)p鏈恒定域(CL)的變化或修飾。在一些方面，可以將一個或多個恒定域部分地或全部地刪除。在一些方面，可以刪除完整的CH2域(ΔCH2構(gòu)建體)。參見例如Oganesyan V,等,2008Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.64:700-4；Oganesyan V,等,Mol Immunol.46:1750-5；Dall’Acqua,W.F.,等,2006.J.Biol.Chem.281:23514-23524；和Dall’Acqua等,2002.J.Immunol.169:5171-5180。

術(shù)語“表位”或“抗原決定簇”在此處可以互換地使用并意指抗原的能被特定抗體識別并特異性結(jié)合的那一部分。當抗原是多肽時，可以從通過蛋白的三級折疊而并置的連續(xù)氨基酸和非連續(xù)氨基酸二者形成表位。從連續(xù)氨基酸形成的表位通常在蛋白變性時時得以保留，然而通過三級折疊形成的表位通常在蛋白變性時丟失。表位通常以獨特的空間構(gòu)象包含至少3個，更常見的是至少5個或8-10個氨基酸。如本文所述的表位不需要限定至形成表位的具體氨基酸。在一些方面，可以通過一組抗原特異性抗體，通過檢查對多肽抗原的肽亞基的結(jié)合或通過檢查對抗原的結(jié)合競爭來鑒定表位。

“受試者”或“個體”或“動物”或“患者”或“哺乳動物”意指任何需要對其進行診斷、預后、或治療的受試者，尤其是哺乳動物受試者。哺乳動物受試者包括人、家養(yǎng)動物、農(nóng)場動物、競技動物(sports animals)、和動物園動物，包括例如人、非人靈長類、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牲畜/牛(cattle)、熊、等等。

術(shù)語“組合物”和“藥物組合物”意指這樣的制備物，其處于允許活性成分的生物活性有效的形式，并且不含對于其所施用的受試者有不可接受的毒性的額外組分。此類組合物可以是無菌的。

如本文所用的，術(shù)語“有效量”和“治療有效量”意指對控制受試者中的疼痛有效的一個或多個治療組合物的量。術(shù)語“控制疼痛”和語法上等同的表達在本文用于描述任何在需要疼痛控制的患者中有益的或合意的效果。例如，本文所述的有效量的一個或多個治療組合物可以例如在受試者中防止疼痛、維持可耐受水平的疼痛、減輕疼痛、降低疼痛、將疼痛降至最小、或消除疼痛。

本文所述的術(shù)語“施用”意指對受試者施用一個或多個本文所述的治療組合物，例如包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域的雙功能多肽、包含NGF拮抗劑和TNFα拮抗劑的組合的治療組合物、或分開的治療組合物，其一個包含NGF拮抗劑，一個包含TNFα拮抗劑。術(shù)語“共同施用”意指對受試者施用兩個或更多個治療組合物，例如一個包含NGF拮抗劑而另一個包含TNFα拮抗劑。如本文所用的，共同施用包括但不一定需要所述兩個或更多個治療組合物同時施用于受試者。所述兩個或更多個治療組合物可以序貫地施用于受試者，例如相隔30分鐘、相隔1小時、相隔2小時、相隔3小時、相隔4小時、或相隔5個或更多個小時。如本文所述的共同施用的順序和時機可以是固定的，或者可以基于醫(yī)療機構(gòu)的專業(yè)人員的判斷而變化。

術(shù)語“多核苷酸”和“核酸”意指由共價連接的核苷酸殘基組成的多聚化合物。多核苷酸可以是DNA、cDNA、RNA、單鏈的、或雙鏈的、載體、質(zhì)粒、噬菌體、或病毒。

術(shù)語“載體”意指這樣的構(gòu)建體，其能在宿主細胞中傳遞和表達一個或多個目的基因或序列。載體的例子包括但不限于病毒載體、裸DNA或RNA表達載體、質(zhì)粒、粘粒或噬菌體載體、與陽離子凝聚劑/縮合劑(cationic condensing agent)相連的DNA或RNA表達載體、包囊于脂質(zhì)體中的DNA或RNA表達載體、以及一些真核細胞如生產(chǎn)者細胞。

本文的術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”可互換地用于意指任何長度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是線性的或分枝的，其可以包含修飾的氨基酸，并且非氨基酸能將其中斷。該術(shù)語還涵蓋經(jīng)天然修飾或通過干預修飾的氨基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操作或修飾，如與標記組分綴合。同樣涵蓋在本定義內(nèi)的是，例如含有一個或多個氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸等)以及其他本領域已知的修飾的多肽。

“保守氨基酸取代”是這樣的取代，其中氨基酸殘基由具有相似側(cè)鏈的另一氨基酸替代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領域已有定義，包括堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝的側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。例如，用酪氨酸取代苯丙氨酸是保守取代。在一些方面，本文提供的多肽和抗體的序列中的保守取代不消除含有氨基酸序列的多肽的結(jié)合或其他功能活性。鑒定不影響功能的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本領域熟知的(參見例如Brummell等,Biochem.32:1180-1 187(1993)；Kobayashi等Protein Eng.12:879-884(1999)；和Burks等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:.412-417(1997))。

包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域的結(jié)合分子

本發(fā)明提供包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域的雙功能多肽。在一些方面，施用有效量的本文提供的雙功能多肽能比單獨使用等量的所述NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑更有效地在對其有需要的受試者中控制疼痛。本文提供的雙功能多肽能以任何順序、結(jié)構(gòu)、或構(gòu)象包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域。任何合適的NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑都可以是本文提供的雙功能多肽的一部分。示例性的NGF拮抗劑和TNFα拮抗劑描述于本文的其他部分。

在一些方面，NGF拮抗劑是一種非抗體分子或其結(jié)合域，其能抑制NGF活性，例如可溶的、TrkA的NGF結(jié)合片段。在一些方面，NGF拮抗劑是抗NGF抗體或其抗原結(jié)合片段。合適的抗NGF拮抗劑(例如拮抗劑抗體)能抑制NGF對TrkA、對p75NRT、或?qū)rkA和p75NRT二者的結(jié)合。在一些方面，抗NGF拮抗劑，例如用于本文中提供的雙功能分子(例如多特異性結(jié)合分子)的拮抗劑抗體或其片段，相對于NGF對p75NRT的結(jié)合能優(yōu)先地阻斷NGF對TrkA的結(jié)合。

示例性的抗體或其用于本文所述的雙功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)中的片段可以獲取自美國申請公開No.2008/0107658，其在此通過提述以其整體并入本文。在一些方面，抗NGF抗體或其片段結(jié)合至與抗NGF抗體MEDI-578相同的表位、能與MEDI-578競爭性地抑制NGF、或能以比MEDI-578更大的親和力結(jié)合至NGF。在一些實施方案中，抗NGF抗體或其片段以或低于1、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3或0.2nM的親和力結(jié)合人NGF和/或大鼠NGF。例如，抗NGF抗體或其片段可以以約0.2-0.8、0.2-0.7、0.2-06(0.2-0.6)、0.2-0.5和/或0.25-0.44nM的親和力結(jié)合人NGF以及以約0.2-0.9、0.2-0.8和/或0.25-0.70nM的親和力結(jié)合大鼠NGF。

在一些方面，抗NGF抗體或其片段是MEDI-578。MEDI-578作為克隆1252A5公開于美國申請公開No.2008/0107658中。在其他方面，抗NGF抗體或其片段是他尼珠單抗(RN-624)，其是一種人源化的抗NGF單抗(Pfizer；描述于Kivitz等,(2013)PAIN,154,9,1603-161中)；Fulranumab，其是一種完全人抗NGF單抗(Amgen；描述于Sanga等,PAIN,154卷,第10期,2013年10月,第1910–1919頁中)；REGN475/SAR164877，其是一種完全人抗NGF單抗(Regeneron/Sanafi-Aventis)；ABT-110(PG110)，其是一種人源化的抗NGF單抗(Abbott Laboratories)。包含在雙功能多肽(例如本文提供的多特異性結(jié)合分子)中的抗NGF抗體或其片段可以是例如人源化的、嵌合的、靈長類化的、或完全人的。

在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VH域，所述抗體VH域包含MEDI-578的HCDR1、HCDR2、和HCDR3域，具有多至1、2、3、4、5、或更多個氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)的MEDI-578重鏈CDR的變體。例如，抗NGF抗體或其片段可以包含具有準確的SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR1，或具有SEQ ID NO:4經(jīng)一個或多個(例如1、2、3、4、5、或更多個)氨基酸取代的氨基酸序列的HCDR1。類似地，抗NGF抗體或其片段可以包含具有準確的SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR2，或具有SEQ ID NO:5經(jīng)一個或多個(例如1、2、3、4、5、或更多個)氨基酸取代的氨基酸序列的HCDR2。同樣，抗NGF抗體或其片段可以包含具有準確的SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3，或具有SEQ ID NO:6經(jīng)一個或多個(例如1、2、3、4、5、或更多個)氨基酸取代的氨基酸序列的HCDR3。在一些方面，所述HCDR3可以包含氨基酸序列SSRIYDFNSALISYYDMDV(SEQ ID NO:11)或SSRIYDMISSLQPYYDMDV(SEQ ID NO:12)。

在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VL域，所述抗體VL域包含MEDI-578的LCDR1、LCDR2、和LCDR3域，具有多至1、2、3、4、5、或更多個氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)的MEDI-578輕鏈CDR的變體。在一些方面，抗NGF抗體或其片段可以包含具有準確的SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR1，或具有SEQ ID NO:8經(jīng)一個或多個(例如1、2、3、4、5、或更多個)氨基酸取代的氨基酸序列的LCDR1。類似地，抗NGF抗體或其片段可以包含具有準確的SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR2，或具有SEQ ID NO:9經(jīng)一個或多個(例如1、2、3、4、5、或更多個)氨基酸取代的氨基酸序列的LCDR2。同樣地，抗NGF抗體或其片段可以包含具有準確的SEQ ID NO:10的氨基酸序列的LCDR3，或具有SEQ ID NO:10經(jīng)一個或多個(例如1、2、3、4、5、或更多個)氨基酸取代的氨基酸序列的LCDR3。

在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VH域，所述抗體VH域包含與SEQ ID NO:3的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的VH氨基酸序列。在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VH域，所述抗體VH域包含SEQ ID NO:3的VH氨基酸序列。

在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VL域，所述抗體VL域包含與SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的VL氨基酸序列。在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VL域，所述抗體VL域包含SEQ ID NO:7的VL氨基酸序列。

在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VH域，所述抗體VH域包含與SEQ ID NO:94的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的VH氨基酸序列。在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VH域，所述抗體VH域包含SEQ ID NO:94的VH氨基酸序列。

在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VL域，所述抗體VL域包含與SEQ ID NO:95的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的VL氨基酸序列。在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VL域，所述抗體VL域包含SEQ ID NO:95的VL氨基酸序列。

在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VH域，所述抗體VH域包含SEQ ID NOs:30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86和96的任一個的HCDR1、HCDR2、和HCDR3域，以及其具有多至1、2、3、4、5、或更多個氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)的變體。

在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VL域，所述抗體VL域包含SEQ ID NOs:31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87和97的任一個的LCDR1、LCDR2、和LCDR3域，以及其具有多至1、2、3、4、5、或更多個氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)的變體。

在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VH域，所述抗體VH域包含與SEQ ID NOs:30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86和96的任一個的氨基酸序列至少0％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的VH氨基酸序列。在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VH域，所述抗體VH域包含SEQ ID NOs:30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86和96的任一個的VH氨基酸序列。

在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VL域，所述抗體VL域包含與SEQ ID NOs:31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87和97的任一個的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的VL氨基酸序列。在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VL域，所述抗體VL域包含SEQ ID NOs:31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87和97的任一個的VL氨基酸序列。

在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VH域，所述抗體VH域包含NGF-NG的HCDR1、HCDR2、和HCDR3域，具有多至1、2、3、4、5、或更多個氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)的NGF-NG重鏈CDR的變體。例如，抗NGF抗體或其片段可以包含具有準確的SEQ ID NO:88的氨基酸序列的HCDR1，或具有SEQ ID NO:88經(jīng)一個或多個(例如1、2、3、4、5、或更多個)氨基酸取代的氨基酸序列的HCDR1。類似地，抗NGF抗體或其片段可以包含具有準確的SEQ ID NO:89的氨基酸序列的HCDR2，或具有SEQ ID NO:89經(jīng)一個或多個(例如1、2、3、4、5、或更多個)氨基酸取代的氨基酸序列的HCDR2。同樣的，抗NGF抗體或其片段可以包含具有準確的SEQ ID NO:90的氨基酸序列的HCDR3，或具有SEQ ID NO:90經(jīng)一個或多個(例如1、2、3、4、5、或更多個)氨基酸取代的氨基酸序列的HCDR3。

在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VL域，所述抗體VL域包含NGF-NG的LCDR1、LCDR2、和LCDR3域，具有多至1、2、3、4、5、或更多個氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)的NGF-NG輕鏈CDR的變體。在一些方面，抗NGF抗體或其片段可以包含具有準確的SEQ ID NO:91的氨基酸序列的LCDR1，或具有SEQ ID NO:91經(jīng)一個或多個(例如1、2、3、4、5、或更多個)氨基酸取代的氨基酸序列的LCDR1。類似地，抗NGF抗體或其片段可以包含具有準確的SEQ ID NO:92的氨基酸序列的LCDR2，或具有SEQ ID NO:92經(jīng)一個或多個(例如1、2、3、4、5、或更多個)氨基酸取代的氨基酸序列的LCDR2。同樣地，抗NGF抗體或其片段可以包含具有準確的SEQ ID NO:93的氨基酸序列的LCDR3，或具有SEQ ID NO:93經(jīng)一個或多個(例如1、2、3、4、5、或更多個)氨基酸取代的氨基酸序列的LCDR3。

在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VH域，所述抗體VH域包含與SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的VH氨基酸序列。在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VH域，所述抗體VH域包含SEQ ID NO:24的VH氨基酸序列。

在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VL域，所述抗體VL域包含與SEQ ID NO:26的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的VL氨基酸序列。在一些方面，抗NGF抗體或其片段包含抗體VL域，所述抗體VH域包含SEQ ID NO:26的VL氨基酸序列。

多功能多肽，例如本發(fā)明提供的多特異性結(jié)合分子可以包含完整的抗NGF抗體，即包含兩條完整重鏈和兩條完整輕鏈的呈H₂L₂形式的抗體。當抗NGF抗體是完整抗體時，可以將一個或多個TNFα拮抗劑域融合至所述抗NGF抗體的一個或多個重鏈的N末端或C末端或所述抗NGF抗體的一個或多個輕鏈的N末端或C末端?；蛘?，多功能多肽(即本發(fā)明提供的多特異性結(jié)合分子)可以包含抗NGF抗體的抗原結(jié)合片段。在一些方面，抗NGF抗體片段可以包含抗體的恒定域的任何部分或可僅包含可變域。供包含在雙功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)中的示例性抗NGF抗體片段包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab)₂片段或單鏈Fv(scFv)片段。

在本文提供的一些示例性的組合物中，抗NGF抗體是scFv片段(例如MEDI-578的scFv片段)或其NGF結(jié)合變體。在本文提供的一些示例性的組合物中，抗NGF抗體是scFv片段(例如NGF-NG的scFv片段)或其NGF結(jié)合變體。抗NGF scFv多肽可以以任何順序包含VH和VL域，或是N-VH-VL-C，或是N-VL-VH-C。ScFv分子通常經(jīng)工程化從而通過柔性接頭將VH和VL域連接。示例性的scFv結(jié)構(gòu)，包括多種接頭，可見于Dimasi,N.,等,J Mol Biol.393:672-92(2009)中，以及PCT公開No.WO 2013/070565中，二者在此均通過提述以其整體并入本文。如本領域普通技術(shù)人員所理解的，scFv抗體片段可以具有相對于標準Fab構(gòu)造中存在的可變域降低的穩(wěn)定性。在一些方面，可以通過引入穩(wěn)定化的突變或通過引入鏈間二硫鍵(例如SS-穩(wěn)定化的)將scFv在結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定化。然而，穩(wěn)定化的突變和/或引入的鏈間二硫鍵不是必要的，并且在一些方面是不存在的?？梢杂迷S多本領域承認的方法來將scFv多肽穩(wěn)定化。

可以用接頭來連接本文提供的雙功能多肽的域/區(qū)。可以用接頭來連接雙功能分子的NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域，并且還可用于將scFv的可變重鏈和輕鏈互相連接。示例性的接頭的非限制實例是包含至少4個殘基的多肽鏈。此類接頭的多個部分(portions)可以是柔性的、親水性的并且具有極少的或是沒有其自身二級結(jié)構(gòu)(接頭部分或柔性接頭部分)。至少4個氨基酸的接頭可以用于在雙功能多肽分子組裝之后連接互相接近的域和/或區(qū)。還可以使用較長的接頭。因此，接頭可以是約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50個殘基。接頭還可以是例如約100-175個殘基。當用多個接頭將雙功能多肽分子的多個部分互相連接時，所述接頭可以是相同的或不同的(例如相同的或不同的長度和/或氨基酸序列)。

雙功能多肽分子中的接頭有助于形成所需的結(jié)構(gòu)。接頭可以包含(Gly-Ser)_n殘基(其中n是至少1、2并多至例如3、4、5、6、10、20、50、100或更多的整數(shù))，并具有一些Glu或Lys殘基分散于各處以增加溶解性?；蛘?，某些接頭不包含任何絲氨酸殘基，例如在接頭發(fā)生O-連接的糖基化之處不包含任何絲氨酸殘基。在一些方面，接頭可以含有半胱氨酸殘基，例如如果使用接頭的二聚化以將雙功能多肽的域引入其適當折疊的構(gòu)象，則接頭可以含有半胱氨酸殘基。在一些方面，雙功能多肽可以包含連接多肽的域的至少1、2、3、4、或更多個多肽接頭。

在一些方面，多肽接頭可以包含1-50個殘基、1-25個殘基、25-50個殘基、或30-50個殘基。在一些方面，所述多肽接頭可以包含F(xiàn)c模塊的一部分。例如，在一些方面，所述多肽接頭可以包含IgGl、IgG2、IgG3、和/或IgG4抗體或其變體的免疫球蛋白鉸鏈域的一部分。

在一些方面，多肽接頭可以包含gly-ser接頭或由gly-ser接頭組成。如本文所用的，術(shù)語“gly-ser接頭”意指由甘氨酸和絲氨酸殘基組成的肽。示例性的gly-ser接頭包含式(Gly₄Ser)n的氨基酸序列，其中n是至少1、2直至3、4、5、6、10、20、50、100或更多的整數(shù)。在一些方面，多肽接頭可以包含鉸鏈域(例如來源于IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4分子)的至少一部分和一系列g(shù)ly-ser氨基酸殘基(例如gly-ser接頭如(Gly₄Ser)n)。

當多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)包含scFv時，柔性接頭能連接所述scFv的重鏈和輕鏈。這種柔性接頭通常不包含鉸鏈部分，而是gly-ser接頭或其他柔性接頭。將scFv的域互相連接的柔性接頭的長度和氨基酸序列可以容易地進行選擇和優(yōu)化。

在一些方面，多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)可以包含抗NGF scFv片段，所述抗NGF scFv片段從N末端至C末端包含：VH、15個氨基酸的接頭序列(GGGGS)₃、和VL。在一些實施方案中，連接scFv的VH和VL的接頭是20個氨基酸的接頭序列(GGGGS)₄。在一些方面，所述VH包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些方面，所述VL包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述VH包含SEQ ID NOs:24、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、94和96的任一個的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述VL包含SEQ ID NOs:26、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、95和97的任一個的氨基酸序列。在一些方面，所述VH域包含與SEQ ID NOs:3、24、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、94和96的任一個的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。在一些方面，所述VL域包含與SEQ ID NOs:7、26、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、95和97的任一個的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。

在其他方面，可以通過在VH域和VL域之間添加鏈間二硫鍵來提高多肽的穩(wěn)定性，所述添加二硫鍵通過將VH和VL域內(nèi)的某些殘基修飾為半胱氨酸殘基而進行。參見例如Michaelson,J.S.,等(2009)MAbs 1,128-41；Brinkmann,U.,等,(1993)Proc Natl Acad Sci U S A 90,7538-42；Young,N.M.,等,(1995)FEBS Lett 377,135-9。例如，可以將VL的位置100、101或102處的甘氨酸殘基修飾為半胱氨酸殘基并且可以將VH的位置44處的甘氨酸殘基修飾為半胱氨酸殘基。

本文提供的多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)可以包括TNFα拮抗劑域。在一些方面，TNFα拮抗劑域能抑制TNFα對細胞表面上TNF受體(TNFR)的結(jié)合，由此阻斷TNF活性。

在一些方面，本文提供的多功能多肽的TNFα拮抗劑域是抗TNFα抗體或其抗原結(jié)合片段。在一些方面，所述抗TNFα抗體是英夫利昔單抗、阿達木單抗、聚乙二醇賽妥珠單抗、戈利木單抗、或這些抗體的任一個的抗原結(jié)合片段。

在一些方面，抗TNFα抗體或其片段結(jié)合至與如下任一個相同的表位、能競爭性地抑制如下任一個、或能以比如下任一個更大的親和力結(jié)合至TNFα：抗TNFα抗體英夫利昔單抗、阿達木單抗、聚乙二醇賽妥珠單抗、或戈利木單抗、或這些抗體的任一個的抗原結(jié)合片段。在一些方面，所述抗TNFα抗體是英夫利昔單抗、阿達木單抗、聚乙二醇賽妥珠單抗、或戈利木單抗、或這些抗體的任一個的抗原結(jié)合片段。技術(shù)人員可以容易地獲得這些抗TNFα抗體的結(jié)構(gòu)或序列，并且其可以被包含入本文所述的多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)，而不需要過多的實驗。包含在多功能多肽中的抗TNFα抗體或其片段可以是例如人源化的、嵌合的、靈長類化的、或完全人的。

在一些方面，抗TNFα抗體或其片段包含抗體VH域，所述抗體VH域包含英夫利昔單抗、阿達木單抗、聚乙二醇賽妥珠單抗、或戈利木單抗的HCDR1、HCDR2、和HCDR3域，或英夫利昔單抗、阿達木單抗、聚乙二醇賽妥珠單抗、或戈利木單抗的重鏈CDR具有多至1、2、3、4、5個或更多個氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)的變體。

在一些方面，抗TNFα抗體或其片段包含抗體VL域，所述抗體VL域包含英夫利昔單抗、阿達木單抗、聚乙二醇賽妥珠單抗、或戈利木單抗的LCDR1、LCDR2、和LCDR3域，或英夫利昔單抗、阿達木單抗、聚乙二醇賽妥珠單抗、或戈利木單抗的輕鏈CDR具有多至1、2、3、4、5個或更多個氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)的變體。

在一些方面，抗TNFα抗體或其片段包含抗體VH域，所述抗體VH域包含與英夫利昔單抗、阿達木單抗、聚乙二醇賽妥珠單抗、或戈利木單抗的VH氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的VH氨基酸序列。在一些方面，所述抗TNFα抗體或其片段包含抗體VH域，所述抗體VH域包含英夫利昔單抗、阿達木單抗、聚乙二醇賽妥珠單抗、或戈利木單抗的VH氨基酸序列。

在一些方面，抗TNFα抗體或其片段包含抗體抗體VL域，所述抗體VL域包含英夫利昔單抗、阿達木單抗、聚乙二醇賽妥珠單抗、或戈利木單抗的VL氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的VL氨基酸序列。在一些方面，所述抗TNFα抗體或其片段包含抗體VL域，所述抗體VL域包含英夫利昔單抗、阿達木單抗、聚乙二醇賽妥珠單抗、或戈利木單抗的VL氨基酸序列。

在一些方面，抗TNFα抗體或其片段包含抗體VH域，所述抗體VH域包含與SEQ ID NO:28的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的VH氨基酸序列。在一些方面，所述抗TNFα抗體或其片段包含具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的抗體VH域。

在一些方面，抗TNFα抗體或其片段包含抗體VL域，所述抗體VL域包含與SEQ ID NO:29的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的VL氨基酸序列。在一些方面，所述抗TNFα抗體或其片段包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的抗體VL域。

本發(fā)明提供的多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)可以包含完整抗TNFα抗體，即包含鏈2條完整重鏈和2條完整輕鏈的呈H₂L₂形式的抗體。當抗TNFα抗體是完整抗體時，可以將一個或多個NGF拮抗劑域融合至所述抗TNFα抗體的一個或多個重鏈的N末端或C末端或所述抗TNFα抗體的一個或多個輕鏈的N末端或C末端。或者，本發(fā)明提供的多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)可以包含抗TNFα抗體的抗原結(jié)合片段。在一些方面，抗TNFα抗體片段可以包含所述抗體的恒定域的任何部分或可僅包含可變域。用于包含在多功能多肽內(nèi)的示例性的抗TNFα抗體片段包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab)₂片段或單鏈Fv(scFv)片段。

在一些方面，多功能分子是ndimab varB，其是包含完整抗TNFα抗體(即包含鏈2條完整重鏈和2條完整輕鏈的呈H₂L₂形式的抗體)以及融合至所述抗TNFα抗體的重鏈的C末端的MEDI-578scFv的分子。Ndimab varB包含輕鏈和重鏈，所述輕鏈包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，所述重鏈包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些方面，雙功能分子包含輕鏈和重鏈，所述輕鏈包含與SEQ ID NO:20的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列，所述重鏈包含與SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。

在一些方面，抗TNFα抗體是scFv片段，例如來源于英夫利昔單抗、阿達木單抗、聚乙二醇賽妥珠單抗、或戈利木單抗的scFv片段，或其TNFα結(jié)合變體?？筎NFαscFv多肽可以以任何順序包含VH和VL域，無論是N-VH-VL-C還是N-VL-VH-C。ScFv分子通常經(jīng)過工程化從而通過柔性接頭將VH和VL連接，并且能承擔一些不同的結(jié)構(gòu)，如上文所述?？梢詫⒖筎NFαscFv多肽穩(wěn)定化，同樣如上文所述。

在一些方面，TNFα拮抗劑是TNF受體(例如TNFR-1或TNFR-2)的結(jié)合TNFα的可溶片段，或其變體或其可溶片段。在一些方面，TNFR-1的可溶片段是55kD片段。在一些實施方案中，TNFR-2的可溶片段是75kD片段。在一些方面，TNF受體片段融合至異源多肽，例如免疫球蛋白Fc片段，例如IgG1Fc域。在一些方面，TNFα拮抗劑包含SEQ ID NO:13中所示的氨基酸，或其TNFα結(jié)合片段。TNFR-2部分包含SEQ ID NO:13的氨基酸1至235。在一些方面，TNFR-2的結(jié)合TNFα的可溶片段的變體包含與SEQ ID NO:13的氨基酸1至235至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的氨基酸序列。在一些方面，TNFR-2的結(jié)合TNFα的可溶片段的變體包含SEQ ID NO:13的氨基酸1至235，除了還有例如1、2、3、4、5、10、20、20、40、或50個氨基酸的插入、取代或刪除之外。IgG1Fc部分包含SEQ ID NO:13的氨基酸236至467。在一些方面，TNFR-2的結(jié)合TNFα的可溶片段可以融合至任何人或非人抗體的Fc部分，或提供穩(wěn)定性的任何其他蛋白或非蛋白物質(zhì)，如白蛋白或聚乙二醇。在一些方面，TNFR-2的結(jié)合TNFα的可溶片段包含與SEQ ID NO:13的氨基酸236至467至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的氨基酸序列。在一些方面，TNFR-2的結(jié)合TNFα的可溶片段的變體包含SEQ ID NO:13的氨基酸236至467，除了還有例如1、2、3、4、5、10、20、20、40、或50個氨基酸的插入、取代或刪除之外。在一些方面，TNFR-2的結(jié)合TNFα的可溶片段的變體包含與SEQ ID NO:13至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％相同的氨基酸序列。在一些方面，TNFR-2的結(jié)合TNFα的可溶片段的變體包含SEQ ID NO:13，除了還有例如1、2、3、4、5、10、20、20、40、或50個氨基酸的插入、取代或刪除之外。

在一些方面，TNFR-2的結(jié)合TNFα的可溶片段是單鏈融合蛋白。在一些方面，TNFR-2的結(jié)合TNFα的可溶片段是兩個融合蛋白的二聚體，其通過例如兩個Fc域之間的二硫鍵相連。

本文提供的多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)能具有多種不同的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象。在一個方面，本文提供的多功能多肽包含融合蛋白，其中如上文所述的NGF拮抗劑域通過柔性接頭融合至如上文所述的TNFα拮抗劑域。接頭的例子在本文其他部分已作描述。在一些方面，多功能多肽包含融合蛋白的同二聚體。

在一個示例性的方面，提供了多功能多肽，其中NGF拮抗劑是來源于MEDI-578的抗NGF scFv域并且TNFα拮抗劑是TNFR-2的可溶的、結(jié)合TNFα的片段，所述片段于其羧基末端融合至免疫球蛋白Fc域。在一些方面，抗NGF scFv可以經(jīng)接頭融合至免疫球蛋白Fc域的羧基末端。在一些方面，這種多功能多肽的單體形成同二聚體，其各個亞基從N末端至C末端包含：TNFR-2的結(jié)合TNFα的75kD片段、人IgG1Fc域、10個氨基酸的接頭(GGGGS)₂(SEQ ID NO:98)、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的抗NGF VH、15個氨基酸的接頭(GGGGS)₃(SEQ ID NO:15)、和包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的抗NGF VL。在一個方面，所述多功能多肽是TNFR2-Fc_VH#4，其包含融合多肽的同二聚體，所述融合多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些方面，所述多功能多肽包含融合多肽的同二聚體，所述融合多肽包含與SEQ ID NO:14至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的氨基酸序列。

在另一個示例性的方面，多功能多肽從N末端至C末端包含：TNFR-2的結(jié)合TNFα的75kD片段、人IgG1Fc域、10個氨基酸的接頭(GGGGS)₂(SEQ ID NO:98)、包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列的抗NGF VH、20個氨基酸的接頭序列(GGGGS)₄(SEQ ID NO:19)、和包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列的抗NGF VL。在一些方面，所述多功能多肽是TNFR2-Fc_varB，其包含融合多肽的同二聚體，所述融合多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些方面，所述多功能多肽包含融合多肽的同二聚體，所述融合多肽包含與SEQ ID NO:17至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的氨基酸序列。

多肽

如本文提供的包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域的多肽(例如多功能多肽)，或分別包含NGF拮抗劑域或TNFα拮抗劑域的單獨的多肽，可以是重組多肽、衍生自天然多肽或合成多肽。本領域會理解，一些氨基酸序列可以在不顯著影響該蛋白的結(jié)構(gòu)或功能的前提下變化。因此，本發(fā)明還提供了本文所述的多肽的變化，其具有大體的活性或其包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域。此類突變體包括刪除、插入、倒位、重復、和類型取代(type substitution)。

可以對所述多肽和類似物進行進一步修飾以含有非蛋白質(zhì)常規(guī)部分的額外的化學模塊。這些衍生的模塊能提高溶解度、生物半衰期或所述蛋白的吸收。所述模塊還能降低或清除蛋白質(zhì)等等的任何不合意的副作用。對這些模塊的綜述可見于REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第20版,Mack Publishing Co.,Easton,PA(2000)。

在一些方面，本文提供的多功能多肽可以包含非抗體的NGF或TNFα結(jié)合域。本領域已知多種用于鑒定和生產(chǎn)以高親和力結(jié)合至蛋白靶標的非抗體多肽的方法。參見例如Skerra,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304(2007),Hosse等,Protein Science,15:14-27(2006)，Gill等,Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-658(2006)，Nygren,FEBS J.,275:2668-76(2008)，和Skerra,FEBS J.,275:2677-83(2008)，其各自在此通過提述以其整體并入本文。在一些方面，噬菌體展示技術(shù)能用于鑒定/生產(chǎn)合適的多功能多肽。在一些方面，本文提供的多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)可以包含選自下組的類型的蛋白骨架：蛋白A、脂質(zhì)運載蛋白(lipocalin)、纖連蛋白(fribronectin)域、錨蛋白共有重復域(ankyrin consensus repeat domain)、和硫氧還蛋白。

多核苷酸、載體、和宿主細胞

本發(fā)明提供了包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸編碼包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域的多功能多肽。本發(fā)明還提供了包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸編碼分別包含NGF拮抗劑和TNFα拮抗劑的單獨多肽。在一些方面，此類多核苷酸編碼特異性結(jié)合NGF或其片段并且還結(jié)合TNFα或其片段的肽域。例如，本發(fā)明提供了編碼包含抗NGF抗體或其抗原結(jié)合片段的多肽域，以及包含TNFα拮抗劑(如抗TNFα抗體或其抗原結(jié)合片段)或TNF受體(例如TNFR2)的可溶的、TNFα結(jié)合部分的多肽域的多核苷酸。多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因組DNA、和合成DNA；并且可以是雙鏈的或單鏈的，并且如果是單鏈的話，可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。

在一些實施方案中，編碼本文所述多功能多肽的分離的多核苷酸包含SEQ ID NO:16、18或99的核苷酸序列或其片段，或與SEQ ID NO:16、18或99或其片段至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。

本文所述的分離的多肽可以通過任何合適的本領域已知方法來生產(chǎn)。此類方法范圍從直接蛋白合成法到構(gòu)建編碼分離多肽序列的DNA序列并在合適的轉(zhuǎn)化宿主中表達這些序列。在一些方面，用重組技術(shù)通過分離或合成DNA序列來構(gòu)建DNA序列，所述DNA序列編碼包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域的多功能多肽，或分別包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域的單獨多肽。因此，本發(fā)明提供了編碼包含如上文詳述的NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域的雙功能多肽的分離的多核苷酸。還提供了編碼分別包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域的單獨多肽的分離的多核苷酸。

在一些方面，編碼目的多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)或分別包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域的單獨多肽的DNA序列可以用寡核苷酸合成儀器通過化學合成來構(gòu)建。此類寡核苷酸可以基于所需的多功能多肽的氨基酸序列而設計，并且選擇這些密碼子在產(chǎn)生目的重組蛋白的宿主細胞中是有利的?？梢詰脴藴史椒▉砗铣删幋a目的多功能多肽的分離的多肽序列。例如，可以用完整氨基酸序列來構(gòu)建逆向翻譯(back-translated)的基因。此外，可以合成含有編碼具體多功能多肽或單獨多肽的核苷酸序列的DNA寡聚體。例如，可以合成一些編碼所需多肽的部分的小寡核苷酸然后進行連接。單獨寡核苷酸通常含有5’或3’懸臂(overhang)以供互補裝配。

在一些方面，本文提供的多核苷酸能包含成熟多肽的編碼序列，所述成熟多肽融合進與標志序列相同的讀框，從而允許例如對編碼的多肽進行純化。例如，標志序列可以是pQE-9載體提供的6-組氨酸標簽以提供對融合至標志的成熟多肽的純化(對細菌宿主而言)，或者標志序列可以是來源于流感血凝素蛋白的血凝素(HA)標簽(當使用哺乳動物宿主(例如COS-7細胞)時)。

本文提供的多核苷酸還含有編碼區(qū)、非編碼區(qū)、或二者的變化。在一些方面，多核苷酸變體含有產(chǎn)生沉默取代、添加、或刪除但不改變編碼多肽的活性的變化。在一些方面，核苷酸變體通過由遺傳密碼簡并性引起的沉默取代產(chǎn)生。多核苷酸變體可以出于多種原因而產(chǎn)生，例如為了針對具體宿主而優(yōu)化密碼子表達(將人mRNA中的密碼子改變成細菌宿主如大腸桿菌(E.coli)所偏好的密碼子)。

還提供了包含本文所述多核苷酸的載體和細胞。一旦裝配(通過合成、定向誘變或其他方法)，可以將編碼具體的目的分離多肽的多核苷酸序列插入表達載體并可操作地連接至適于在所需宿主中表達蛋白的表達控制序列。本發(fā)明提供了此類載體。核苷酸測序、限制性酶切作圖、和合適宿主中生物活性多肽的表達能確認適當?shù)难b配。如本領域所熟知的，為了在宿主中獲得高表達水平的轉(zhuǎn)染基因，該基因必須可操作地連接至在選定的表達宿主中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達控制序列。

在一些方面，存在表達載體可用于擴增和表達編碼多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)或單獨多肽的DNA，所述多功能多肽包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域，所述單獨多肽分別包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域。重組表達載體是可復制的DNA構(gòu)建體，其具有合成的或cDNA來源的DNA片段，其編碼多功能多肽或分別包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域的單獨多肽，所述DNA構(gòu)建體可操作地連接至來自哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因的合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控元件。轉(zhuǎn)錄單位通常包含如下的裝配：(1)在基因表達中具有調(diào)控作用的一個或多個遺傳元件，例如轉(zhuǎn)錄啟動子或增強子，(2)轉(zhuǎn)錄至mRNA中且翻譯至蛋白中的結(jié)構(gòu)或編碼序列，以及(3)適當?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止序列，如下文所詳述的。此類調(diào)控元件可以包括操縱基因(operator)序列以控制轉(zhuǎn)錄。在宿主中復制的能力通常由復制起點賦予，并且促進轉(zhuǎn)化株的識別的選擇基因能夠被額外地整合。當DNA區(qū)域在功能上互相聯(lián)系時，可以將其可操作地連接。例如，將用于信號肽(分泌引導物)的DNA可操作地連接至多肽的DNA，如果其表達為參與該多肽分泌的前體的話；將啟動子可操作地連接至編碼序列，如果其控制該序列的轉(zhuǎn)錄的話；或者將核糖體結(jié)合位點可操作地連接至編碼序列，如果其位置允許翻譯的話。意欲在酵母表達系統(tǒng)中使用的結(jié)構(gòu)元件包括允許翻譯的蛋白被宿主細胞分泌到細胞外的引導物序列?；蛘?，當重組蛋白在沒有引導物或轉(zhuǎn)運序列的情況下表達時，其可以包含N末端甲硫氨酸殘基。該殘基隨后可以任選地從表達的重組蛋白切除，以提供最終產(chǎn)物。

表達控制序列和表達載體的選擇取決于對宿主的選擇。許多表達宿主/載體組合都是可以采用的。對于真核宿主有用的表達載體包括例如包含來自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和巨細胞病毒的表達控制序列的載體。對于細菌宿主有用的表達載體包括已知的細菌質(zhì)粒，如來自大腸桿菌的質(zhì)粒，包括pCR 1、pBR322、pMB9及它們的衍生物，更廣的宿主范圍的質(zhì)粒，如M13以及絲狀單鏈DNA噬菌體。

本發(fā)明還提供了包含編碼本文所述多肽的多核苷酸的宿主細胞。適于表達本文所述多肽的宿主細胞包括處于合適的啟動子控制下的原核生物、酵母、昆蟲或較高級的真核細胞。原核生物包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如大腸桿菌或桿菌綱(bacilli)。較高級的真核細胞包括如下所述已建立的哺乳動物來源的細胞系。還可以采用無細胞的翻譯系統(tǒng)。適于與細菌、真菌、酵母、和哺乳動物細胞宿主一起使用的克隆和表達載體在Pouwels等(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)中有描述，其相關(guān)公開內(nèi)容在此通過提述并入本文。關(guān)于蛋白生產(chǎn)(包括抗體生產(chǎn))的其他方法可見于例如美國專利公開No.2008/0187954、美國專利No.6,413,746和6,660,501、以及國際專利公開No.WO 04009823中，其各自在此通過提述以其整體并入本文。

還可以有利地采用多種哺乳動物或昆蟲細胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達重組蛋白。在哺乳動物細胞中表達重組蛋白能夠進行，是因為此類蛋白通常是正確折疊、適當修飾、并且具有完整功能性的。合適的哺乳動物宿主細胞系的例子包括HEK-293和HEK-293T、猴腎細胞的COS-7系(描述于Gluzman(Cell 23:175,1981))、以及其他細胞系，包括例如L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體可以包含非轉(zhuǎn)錄元件，如與要表達的基因相連的復制起點、合適的啟動子和增強子，以及其他5’或3’側(cè)翼的非轉(zhuǎn)錄序列，以及5’或3’非翻譯序列，如必需的核糖體結(jié)合位點、多聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、以及轉(zhuǎn)錄終止序列。用于在昆蟲細胞中生產(chǎn)異源蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)在Luckow和Summers,Bio/Technology 6:47(1988)中進行了綜述。

本發(fā)明還提供了生產(chǎn)如本文所述的多功能多肽的方法，或生產(chǎn)分別包含NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑的單獨多肽的方法。所述方法需要在促進表達所述多功能多肽或單獨多肽的條件下培養(yǎng)如上文所述的宿主細胞，并回收所述多功能多肽或單獨多肽。

對于長期的、高產(chǎn)量/得率(yield)的重組蛋白生產(chǎn)而言，穩(wěn)定的表達是合適的。例如，可以工程化生成穩(wěn)定表達多功能多肽的細胞系?？梢杂檬芎线m的表達控制元件(例如啟動子、增強子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸化位點等等)控制的DNA以及選擇標志物來轉(zhuǎn)化宿主細胞，而不是使用含有病毒復制起點的表達載體。在引入外來的DNA后，可以允許工程化的細菌在富集培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)入選擇性培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的選擇標志物賦予選擇抗性并允許細胞將質(zhì)粒穩(wěn)定地整合至它們的染色體中并生長以形成集落(foci)，其又可以被克隆并擴大為細胞系。該方法可以用于對表達多功能多肽的細胞系進行工程化。

在一些實施方案中，本文提供的多功能多肽在細胞系中以所述多功能多肽的瞬時表達而表達。瞬時轉(zhuǎn)染是這樣的過程，其中引入細胞的核酸不整合入該細胞的基因組或染色體DNA中而是保持為細胞中染色體外的元件，例如附加體(episome)。附加體的核酸的轉(zhuǎn)錄過程不受影響并且產(chǎn)生由附加體的核酸編碼的蛋白。

將細胞系(穩(wěn)定的或瞬時轉(zhuǎn)染的)維持在細胞培養(yǎng)基以及本領域已知導致多肽的表達和生產(chǎn)的條件中。在一些實施方案中，哺乳動物細胞培養(yǎng)基是基于商業(yè)上可獲得的培養(yǎng)基配制物，包括例如DMEM或Ham's F12。在一些實施方案中，對細胞培養(yǎng)基進行改良以支持細胞生長和生物蛋白表達的增加。如本文所用的，術(shù)語“細胞培養(yǎng)基”、“培養(yǎng)基”和“培養(yǎng)基配制物”意指用于細胞在多細胞生物體或組織外的人工或體外環(huán)境中的維持、生長、繁殖、或擴大的營養(yǎng)溶液。可以針對特定細胞培養(yǎng)用途而優(yōu)化細胞培養(yǎng)基，包括但不限于細胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基(其經(jīng)配制來促進細胞生長)、或細胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基(其經(jīng)配制來促進重組蛋白生產(chǎn))。術(shù)語營養(yǎng)物、成分、和組分可以互換地使用，用于意指組成細胞培養(yǎng)基的組成部分。

在多種實施方案中，用補料分批方法來維持細胞系。如本文所用的，“補料分批方法”意指這樣的方法，通過所述方法在首先用基底培養(yǎng)基溫育后向補料分批細胞培養(yǎng)物供應額外的營養(yǎng)物。例如，補料分批方法可以包括根據(jù)確定的補料方案在給定的時間段內(nèi)添加補充的培養(yǎng)基。因此，“補料分批細胞培養(yǎng)”意指這樣的細胞培養(yǎng)，其中首先向培養(yǎng)容器供應細胞(通常為哺乳動物細胞)和培養(yǎng)基并在培養(yǎng)期間向培養(yǎng)物連續(xù)地或離散遞增地補料額外的培養(yǎng)營養(yǎng)物，伴隨或不伴隨培養(yǎng)終止前的定期的細胞和/或產(chǎn)物收獲。

在一些實施方案中，細胞培養(yǎng)基包含基底培養(yǎng)基和至少一種水解產(chǎn)物，例如基于大豆的水解產(chǎn)物、基于酵母的水解產(chǎn)物，或這兩種類型水解產(chǎn)物的組合物，其產(chǎn)生改良的基底培養(yǎng)基。額外的營養(yǎng)物有時可僅含有基底培養(yǎng)基，如濃縮的基底培養(yǎng)基，或可僅含有水解產(chǎn)物，如濃縮的水解產(chǎn)物。合適的基底培養(yǎng)基包括但不限于達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium,DMEM)、DME/F12、最小必需培養(yǎng)基(Minimal Essential Medium,MEM)、基底培養(yǎng)基伊格爾(Basal Medium Eagle,BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、.alpha.-最小必需培養(yǎng)基(.alpha.-MEM)、格拉斯哥最小必需培養(yǎng)基(Glasgow's Minimal Essential Medium,G-MEM)、PF CHO(參見例如CHO無蛋白培養(yǎng)基(Sigma)或EX-CELL.TM.325PF CHO無血清培養(yǎng)基用于CHO細胞無蛋白(SAFC Bioscience)、以及Iscove改良達爾伯克培養(yǎng)基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)?？捎糜诒疚乃龅募夹g(shù)中的基底培養(yǎng)基的其他例子包括BME基底培養(yǎng)基(Gibco-Invitrogen；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM，粉劑)(Gibco-Invitrogen(#31600))。

在一些實施方案中，基底培養(yǎng)基可以是無血清的(意即所述培養(yǎng)基不含血清(例如胎牛血清(FBS)、馬血清、山羊血清，或本領域技術(shù)人員已知的任何其他動物來源的血清))或無動物蛋白培養(yǎng)基或是化學成分確定的培養(yǎng)基。

可以改良基底培養(yǎng)基從而去除標準基底培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的一些非營養(yǎng)組分，如各種無機或有機緩沖劑、表面活性劑、和氯化鈉。從基底培養(yǎng)基去除這些組分允許了剩余營養(yǎng)組分的濃度增加，并且可能改進總體細胞生長和蛋白表達。此外，根據(jù)細胞培養(yǎng)條件的需要，可以將遺漏的組分添加回含有改良基底培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)基。在一些實施方案中，所述細胞培養(yǎng)基含有改良的基底培養(yǎng)基，以及至少一種如下營養(yǎng)物：鐵源、重組生長因子；緩沖劑；表面活性劑；滲透壓調(diào)節(jié)劑；能量源；以及非動物水解產(chǎn)物。此外，改良的基底細胞培養(yǎng)基可以任選地含有氨基酸、維生素、或氨基酸和維生素二者的組合。在一些實施方案中，改良的培養(yǎng)基還含有谷氨酰胺，例如L-谷氨酰胺和/或甲氨蝶呤。

在一些實施方案中，用本領域已知的補料分批、分批、灌注或連續(xù)補料生物反應器方法通過生物反應器工藝進行大量蛋白生產(chǎn)。大規(guī)模生物反應器具有至少50L升的容積，有時約超過500升或1,000至100,000升的容積。這些生物反應器使用攪拌葉輪來分配氧和營養(yǎng)物。小規(guī)模生物反應器通常意指不超過約100升的容積中的細胞培養(yǎng)，并且所述溶劑范圍可以是約1升至約100升?；蛘?，可將單用途生物反應器(SUB)用于大規(guī)?；蛐∫?guī)模培養(yǎng)。

溫度、pH、攪拌、通氣、和接種密度可以根據(jù)所用的宿主細胞和要表達的重組蛋白而變化。例如，重組蛋白培養(yǎng)物可以維持在30至45攝氏度的溫度?？梢栽谂囵B(yǎng)過程期間監(jiān)測培養(yǎng)基的pH，從而使pH保持在最佳水平，所述最佳水平對于一些宿主細胞而言可以是在6.0至8.0的范圍內(nèi)。可以采用葉輪驅(qū)動的混合用于此類培養(yǎng)方法以進行攪拌。葉輪的旋轉(zhuǎn)速度可以是約50至200cm/sec尖端速度，但還可以使用已知的其他空氣運輸(airlift)或其他混合/通氣系統(tǒng)，其取決于培養(yǎng)的宿主細胞的類型。提供充分的通氣以在培養(yǎng)物中維持溶解氧濃度為約20％至80％空氣飽和度，其同樣取決于所選擇的培養(yǎng)的宿主細胞?；蛘?，生物反應器可以將氣體或氧直接噴射至培養(yǎng)基中。存在其他氧供應方法，包括采用中空纖維膜通氣裝置的無氣泡通氣系統(tǒng)。

蛋白純化

由如上文所述的轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的蛋白可以根據(jù)任何合適的方法進行純化。此類標準方法包括色譜法(例如離子交換、親和力、以及大小(sizing)柱色譜法)、離心法、差示溶解度法(differential solubility)、或通過任何其他標準技術(shù)用于蛋白純化?？梢詫⒂H和力標簽(如六聚組氨酸、麥芽糖結(jié)合域、流感外殼(coat)序列和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)附接至所述蛋白以允許通過流經(jīng)合適的親和力柱而容易地純化。還可以用此類技術(shù)(如蛋白水解、核磁共振和x射線晶體分析)來物理地表征分離的蛋白。

例如，來自將重組蛋白分泌至培養(yǎng)基中的系統(tǒng)的上清可以用商業(yè)上可獲得的蛋白濃縮濾器加以濃縮，所述濾器例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元。在濃縮步驟之后，將濃縮液涂在合適的純化基質(zhì)上?；蛘呖梢圆捎藐庪x子交換樹脂，其為一種具有懸垂(pendant)二乙氨乙基(DEAE)基團的基質(zhì)或基底材料?；|(zhì)可以是丙烯酰胺、瓊脂糖、右旋糖酐(dextran)、纖維素或常應用于蛋白純化的其他類型。合適的陽離子交換物包括多種不可溶的基質(zhì)，包括磺丙基或羧甲基。最后，可以用一個或多個逆相(reversed-phase)高效液相色譜(RP-HPLC)步驟(其采用疏水性RP-HPLC介質(zhì)，例如具有懸垂甲基或其他脂肪族基團的二氧化硅凝膠)來進一步純化NGF結(jié)合劑。前述純化步驟的一些或全部還能以各種組合用于提供均質(zhì)的重組蛋白。

可以對細菌培養(yǎng)物中產(chǎn)生的重組蛋白進行分離，例如通過首先從細胞沉淀物提取，然后是一次或多次濃縮、鹽析、含水離子交換(aqueous ion exchange)或大小排阻色譜步驟?？梢詫⒏咝б合嗌V(HPLC)用于最終純化步驟。重組蛋白表達中采用的微生物細胞可以通過任何便利的方法加以破碎，包括反復凍融、機械破碎、或使用細胞裂解劑。

本領域已知用于純化重組多肽的方法還包括例如美國專利公開No.2008/0312425、2008/0177048、和2009/0187005中描述的那些，其各自在此通過提述以其整體并入本文。

使用方法和藥物組合物

本發(fā)明提供了用于控制或治療受試者中的疼痛的方法，包括施用治療有效量的TNFα和NGF拮抗劑多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)，如本文所提供的，或是包括共同施用TNFα拮抗劑和NGF拮抗劑。在一些方面，所述受試者是人。

本發(fā)明還提供了包含如本文提供的TNFα和NGF拮抗劑多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)的藥物組合物，或包含如本文提供的TNFα和NGF拮抗劑的組合的藥物組合物。在一些方面，所述藥物組合物還包含藥學上可接受的載劑。這些藥物組合物對于治療疼痛(例如神經(jīng)性疼痛和炎性疼痛(例如骨關(guān)節(jié)炎或類風濕性關(guān)節(jié)炎))是有用的。

本文提供的包含NGF拮抗劑和TNFα拮抗劑的多功能多肽和組合物可用于多種應用，包括但不限于控制或治療疼痛，例如神經(jīng)性疼痛。使用的方法可以是體外、離體、或體內(nèi)方法。

在一些方面，用NGF結(jié)合劑(例如抗體或多肽)治療的疾病、病癥、或病況與疼痛有關(guān)。在一些方面，所述疼痛與慢性傷害性疼痛、慢性下背痛、神經(jīng)性疼痛、癌性疼痛、帶狀皰疹神經(jīng)痛(PHN)疼痛、或內(nèi)臟痛病況有關(guān)。

本發(fā)明提供了用于控制受試者中的疼痛的方法，包括將有效量的神經(jīng)生長因子(NGF)拮抗劑和腫瘤壞死因子(TNFα)拮抗劑施用于需要疼痛控制的受試者，其中所述施用能比單獨施用等量的所述NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑更有效地控制受試者中的疼痛。

在一些方面，所述施用是共同施用NGF拮抗劑和TNFα拮抗劑作為組合治療。如本文其他部分所討論的，可以同時或序貫地施用多個單獨組分。單獨的NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑可以是本文提供的任何NGF或TNFα拮抗劑，例如可溶的結(jié)合NGF的TrkA受體片段、抗NGF抗體或其抗原結(jié)合片段、TNF受體(例如TNFR-2)的可溶的TNFα結(jié)合片段、或抗TNFα抗體或其片段(例如英夫利昔單抗、阿達木單抗、聚乙二醇賽妥珠單抗、戈利木單抗、或這些抗體任一種的抗原結(jié)合片段)。

共同施用可以包括多種劑量的控制疼痛所需的各種拮抗劑。在一些方面，共同施用可以包括比作為單獨治療所常規(guī)施用更低的劑量或更低頻率的劑量的各種組分，由此提供更多的安全性、便利性、和經(jīng)濟性。

在一些方面，本文提供的控制疼痛的方法包括施用包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域的多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)。用于在此方法中使用的示例性的多功能多肽在本文中有詳細描述。基于本公開，可用于本方法中的其他多功能多肽對于本領域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。

比單獨施用的組分“更有效地”控制疼痛，意指組合治療對于控制疼痛比單獨施用等量的NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑更有效。在一些方面，以及如下文中進一步詳述的，本文提供的控制疼痛的方法可以提供協(xié)同效力，例如施用所述NGF拮抗劑和TNFα拮抗劑二者的效果可以提供大于累加的效果，或者在單獨NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑均無效時，所述二者共同施用是有效的。在一些方面，所述組合可以允許劑量節(jié)約，例如在共同施用時，各組分的有效劑量可以比單獨施用任一組分的有效劑量更低。

在一些方面，本文提供的控制疼痛的方法對于控制受試者中的疼痛是比單獨施用等量的NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％更有效的。在一些方面，共同施用于受試者的個體NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑的劑量或施用本文提供的雙功能多肽后提供的NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑的相對劑量的劑量可以比單獨施用所述組分所需的劑量低例如5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

疼痛控制的效力可以通過詢問患者來測量，以根據(jù)不同的標度來評定經(jīng)歷疼痛的質(zhì)量和強度。文字疼痛標度使用詞語來形容范圍，所述范圍從無疼痛、輕度疼痛、中度疼痛和重度疼痛，各自分配到0-3的分值?；蛘呖梢砸蠡颊吒鶕?jù)從0(無疼痛)至10(可能的最大疼痛)的數(shù)字疼痛標度來評定他們的疼痛。在視覺類比標度(visual analog scale,VAS)上，垂直或水平線具有文字以描述從無疼痛至可能的最大疼痛的疼痛，并且要求患者在代表他們當前疼痛水平的點處對這些線條進行標記。McGill疼痛指數(shù)使患者能通過選擇最佳描述其疼痛的詞語描述疼痛的質(zhì)量和強度二者，所述詞語選自短候選名單，例如重擊、灼燒、掐捏。其他疼痛標度可以用于經(jīng)歷困難的成人，所述標度使用VAS或數(shù)字標度例如FACES，或是用于無語言能力的(non-verbal)患者，例如行為評定標度。功能活性標度評分涉及患者是如何被他們的疼痛所妨礙的，其通過要求他們執(zhí)行一個與疼痛區(qū)域相關(guān)的任務而進行。使用這些類型的標度的疼痛評分的改進會潛在地指示鎮(zhèn)痛劑效力的改進。

根據(jù)本文提供的控制疼痛的方法，所述施用足以在需要疼痛控制的受試者中控制疼痛，例如共同施用NGF拮抗劑和TNFα拮抗劑，或施用包含NGF拮抗劑域和TNFα拮抗劑域的多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)能防止、降低、減輕、或消除受試者中的疼痛。在一些方面，所述疼痛可以是急性疼痛、短期疼痛、持續(xù)或慢性傷害性疼痛、或是持續(xù)或慢性神經(jīng)性疼痛。

在一些方面，制備了用于儲存和使用的配制物，所述制備是通過將本文提供的TNFα和NGF拮抗劑多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)或本文提供的TNFα拮抗劑和NGF拮抗劑的組合、以及藥學上可接受的載體(例如載劑、賦形劑)進行組合來完成的(Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing,2000)。合適的藥學上可接受的載體包括但不限于無毒緩沖劑如磷酸、檸檬酸、和其他有機酸；鹽類如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙銨(hexamethonium chloride)；苯扎氯銨；芐索氯銨；苯酚，丁基或芐基醇；烷基對羥基苯甲酸酯類(alkyl parabens)，如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量多肽(例如小于約10個氨基酸殘基)；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，組氨酸，精氨酸或賴氨酸；碳水化合物如單糖(monosacchandes)，二糖，葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合劑如EDTA；糖，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成鹽反離子(salt-forming counter-ions)如鈉；金屬復合物(例如，Zn-蛋白質(zhì)復合物)；和非離子表面活性劑如吐溫(TWEEN)或聚乙二醇(PEG)。

本發(fā)明的多功能多肽可以配制為液體、半固體、或固體形式，取決于分子和遞送途徑的理化特性。配制物可以包含賦形劑，或賦形劑的組合，例如：糖、氨基酸和表面活性劑。液體配制物可以包含多種多肽濃度和pH。固體配制物可以通過例如冷凍干燥、噴霧干燥、或通過超臨界流體技術(shù)的干燥來產(chǎn)生。在一些實施方案中，本文所述的任何配制物為冷凍干燥的配制物。

在一個具體實施方案中，本發(fā)明的多功能多肽配制于20mM磷酸鈉、50mM L-精氨酸-HCL、150mM蔗糖、0.03％(w/v)聚山梨醇酯80、pH 6.5中。

本文提供的藥物組合物可以以任何數(shù)量的方法施用，用于局部或全身治療。施用可以是局部的(如施用于粘膜，包括陰道和直腸遞送)如透皮貼片、軟膏劑(ointment)、洗劑、乳膏劑(cream)、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體或粉劑；肺的(例如通過吸入或吹入粉劑或氣霧劑，包括通過噴霧器來進行；氣管內(nèi)的、鼻內(nèi)的、表皮的和經(jīng)皮的)；口腔的；或胃腸外的，包括靜脈內(nèi)的、動脈內(nèi)的、皮下的、腹膜內(nèi)的或肌內(nèi)的注射或輸注；或是顱內(nèi)的(例如鞘內(nèi)的或腦室內(nèi)的)施用。

本文提供的TNFα和NGF拮抗劑多功能多肽或本文提供的TNFα拮抗劑與NGF拮抗劑的組合還可以進一步與具有抗傷害感受性特性的第二(或第三)化合物組合于藥物組合配制物中，或給藥方案中作為組合治療。

對于治療的治療，本文提供的TNFα和NGF拮抗劑多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)或本文提供的TNFα拮抗劑和NGF拮抗劑的組合的合適劑量取決于要治療的疼痛類型、疼痛的嚴重程度和病因、疼痛的響應性、多功能多肽或多肽組合的施用是出于治療還是預防目的、既往治療、患者的臨床史、等等，其均由治療的醫(yī)師決定。多功能多肽或多肽組合組合可以施用一次或在一系列治療內(nèi)持續(xù)數(shù)天至數(shù)月以維持有效的疼痛控制?？梢杂苫颊唧w內(nèi)藥物積累的測量值來計算最佳給藥方案，并且其根據(jù)各抗體或多肽的相對效力而變化。施用的醫(yī)師能容易地確定最佳劑量、給藥方法和重復率。

本文提供的多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)或多肽組合治療的施用能提供“協(xié)同作用”并且證明是“協(xié)同的”，即當活性成分一起使用時達到的效果大于將化合物分開使用所產(chǎn)生的效果的總和。當活性成分：(1)作為單個的多功能融合多肽施用；(2)共同配制并施用或在組合的單位劑量配制物中同時遞送；(3)作為分開的配制物以交替或并行遞送；或(4)按照一些其他方案時，其達到協(xié)同效果。當按照交替治療遞送時，當化合物以序貫施用或遞送(例如在分開的注射器中通過不同次注射進行)時能達到協(xié)同作用。一般而言，在交替治療期間，有效劑量的各活性成分是序貫施用的，而在組合治療中，有效劑量的兩個或更多個活性成分是一起施用的。

疼痛

在最廣義的用法中，“疼痛”意指一種經(jīng)驗現(xiàn)象，其高度依賴于經(jīng)歷其的個體的主觀性，并且受到該個體的心理狀態(tài)的影響，包括環(huán)境和文化背景?！拔锢硇浴碧弁赐ǔ？梢耘c第三方可感知的刺激相聯(lián)系，所述刺激引起實際的或潛在的組織損傷。從這個意義上講，根據(jù)國際疼痛研究協(xié)會(International Association for the Study of Pain,IASP)，可以認為疼痛是“與實際或潛在組織損傷相關(guān)的或按照此種損傷來描述的感覺和情感體驗”。然而，一些疼痛的實例沒有可感知的引發(fā)因素。例如心因性疼痛，包括在患有心理病癥且沒有任何可感知疼痛引發(fā)因素的證據(jù)的人中預成的物理性疼痛的惡化，其由心理因素或是有時持續(xù)的感知到的疼痛的綜合征導致。

疼痛的類型

疼痛包括傷害性疼痛、神經(jīng)性疼痛/神經(jīng)源性疼痛(neurogenic pain)、爆發(fā)性疼痛、異常性疼痛、痛覺過敏、感覺過敏(hyperesthesia)、感覺遲鈍(dysesthesia)、感覺異常、痛覺過度(hyperpathia)、幻肢疼痛、心理性疼痛、痛性感覺缺失、神經(jīng)痛、神經(jīng)炎。其他分類包括惡性疼痛、心絞痛、和/或特發(fā)性疼痛、復雜性局部疼痛綜合征I、復雜性局部疼痛綜合征II。疼痛的類型和癥狀不必互斥。這些術(shù)語意在如IASP所定義的那樣。

傷害性疼痛是通過周圍神經(jīng)中的專門的感覺傷害性感受器響應于傷害性刺激而起始的，其將傷害性刺激編碼為動作電位。傷害性感受器，其通常在Aδ纖維和(Polymodal)C纖維上，是一種終止于皮膚下、肌腱、關(guān)節(jié)中、以及身體器官中的游離神經(jīng)末梢。背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元提供了周圍和脊髓之間通信的部位。信號經(jīng)過脊髓處理至腦干和丘腦部位并最終傳遞至大腦皮層，信號通常(但不全是)在該處引發(fā)疼痛感覺。傷害性疼痛可以由多種具有刺激或損傷身體組織可能性的化學的、熱的、生物的(例如炎性的)、或機械的事件引發(fā)，其通常超過了在傷害性感受器中引起傷害感受性活性所需的一定的最小閾值強度。

神經(jīng)性疼痛通常是由周圍或中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的異常作用引起的，其分別產(chǎn)生周圍或中樞神經(jīng)性疼痛。神經(jīng)性疼痛由IASP定義為神經(jīng)系統(tǒng)中的原發(fā)性病損(lesion)或功能紊亂所起始的或引起的疼痛。神經(jīng)性疼痛常常涉及對神經(jīng)系統(tǒng)的實際損傷，尤其是對于慢性情況而言。炎性的傷害性疼痛通常是組織損傷及其產(chǎn)生的炎性過程的結(jié)果。神經(jīng)性疼痛能在組織的任何可觀察到的損傷明顯愈合后(例如數(shù)月或數(shù)年后)充分持續(xù)。

對于神經(jīng)性疼痛的情況而言，來自受影響區(qū)域的感覺處理能變成異常而無害的刺激(例如熱、接觸/壓力)，其通常不會引起疼痛(即異常性疼痛)或者傷害性刺激響應于正常疼痛刺激可誘發(fā)對疼痛夸大的知覺(即痛覺過敏)。此外，與電麻刺感或電擊或“針扎和針刺(pins and needles)”(即感覺異常)和/或具有令人不快的特質(zhì)的感覺(即感覺遲鈍)相似的感覺可能由正常刺激誘發(fā)。爆發(fā)性疼痛是已存在的慢性疼痛的加劇。痛覺過敏是由對刺激的異常疼痛反應所引起的疼痛綜合征。所述刺激在大多數(shù)情況下是重復性的且具有升高的疼痛閾值，所述閾值可以視為患者能識別為疼痛的最小的疼痛經(jīng)歷。

神經(jīng)性疼痛的實例包括觸覺異常性疼痛(例如在神經(jīng)損傷后誘導的)、神經(jīng)痛(例如皰疹后的(或帶狀皰疹后的)神經(jīng)痛、三叉神經(jīng)痛)、反射交感性營養(yǎng)不良/灼痛(神經(jīng)創(chuàng)傷)、癌癥疼痛的組分(例如癌癥本身或其相關(guān)病況如炎癥引起的疼痛，或治療如化療、手術(shù)或放療引起的疼痛)、幻肢疼痛、嵌壓性神經(jīng)病變(entrapment neuropathy)(例如腕管綜合征)、和神經(jīng)病變?nèi)缰車窠?jīng)病變(例如由糖尿病、HIV、慢性酒精使用、暴露于其他毒素(包括許多化療)、維生素缺乏、和大量的各種其他醫(yī)學情況引起)。神經(jīng)性疼痛包括由多種因素引起的神經(jīng)損傷后的神經(jīng)系統(tǒng)病理學操作(pathological operation)的表達而誘導的疼痛，例如外科手術(shù)，創(chuàng)傷，帶狀皰疹，糖尿病性神經(jīng)病，腿或手臂的截肢，癌癥等等。與神經(jīng)性疼痛相關(guān)的醫(yī)學情況包括創(chuàng)傷性神經(jīng)損傷、中風、多發(fā)性硬化、脊髓空洞癥、脊髓損傷、和癌癥。

引發(fā)疼痛的刺激通常引起炎性響應，其本身能促成疼痛體驗。在一些情況中，疼痛表現(xiàn)為通過傷害感受性和神經(jīng)病變因素的復雜混合體引起。例如，慢性疼痛通常包括炎性傷害性疼痛或神經(jīng)性疼痛，或二者的混合體。初始神經(jīng)系統(tǒng)障礙或損失可能引發(fā)炎性介導物質(zhì)的釋放及隨后的神經(jīng)性炎癥。例如，偏頭疼可以代表神經(jīng)性和傷害性疼痛的混合體。同樣，肌盤膜痛可能是從肌肉輸入(input)傷害感受性的次級疼痛，但異常肌肉活動可能是由神經(jīng)性病況導致的。

包含TNFα和NGF拮抗劑的試劑盒

本公開提供了包含如本文所述的TNFα和NGF拮抗劑多功能多肽(例如多特異性結(jié)合分子)或本文所述的TNFα拮抗劑與NGF拮抗劑的組合的試劑盒，其能用于進行本文所述的方法。在一些方面，試劑盒在一個或多個容器中包含至少多功能融合多肽，所述多功能融合多肽包含TNFα拮抗劑與NGF拮抗劑，例如包含SEQ ID NO:14或17的氨基酸序列的多肽，或者試劑盒包含NGF拮抗劑(例如MEDI-578)和TNFα拮抗劑(例如抗TNFα抗體如英夫利昔單抗或阿達木單抗，或TNF受體的結(jié)合TNFα的可溶片段，例如TNFR2-Fc)的組合。本領域技術(shù)人員會容易地認識到本文公開的TNFα和NGF拮抗劑能容易地整合至已確立的試劑盒形式之一中，其是本領域所熟知的。

實施例

本發(fā)明在此進行一般描述，其通過參考如下實施例會更容易理解，所述實施例僅出于闡釋本發(fā)明的一些方面和實施方案而包含在內(nèi)，而非意欲限制本發(fā)明。

實施例1.抗NGF scFv/TNFR2-Fc多特異性結(jié)合分子的構(gòu)建和表征

包含抗NGF抗體域和TNFR2-Fc域的多功能分子(具體而言是多特異性結(jié)合分子)如下文產(chǎn)生。將抗NGF抗體scFv片段經(jīng)重鏈CH3域融合至TNFR2-Fc融合蛋白(SEQ ID NO:13)的C末端，其是根據(jù)Dimasi,N.,等,J Mol Biol.393:672-92(2009)及PCT公開No.WO 2013/070565中所述的Bs3Ab形式。結(jié)構(gòu)圖示于圖1中。通過GeneArt(Invitrogen)合成了編碼TNFR2-Fc多肽和多特異性結(jié)合分子的DNA構(gòu)建體。對于多特異性結(jié)合分子而言，構(gòu)建了包含通過15個氨基酸接頭序列(GGGGS)₃(SEQ ID NO:15)連接在一起的MEDI-578的VH(SEQ ID NO:3)和VL(SEQ ID NO:7)域的抗NGF scFv。將scFv的N末端經(jīng)10個氨基酸的接頭序列(GGGGS)₂融合至SEQ ID NO:13的C末端。該多特異性結(jié)合分子在本文稱為TNFR2-Fc_VH#4。對編碼所述多特異性結(jié)合分子的DNA構(gòu)建體進行工程化以在3’末端含有終止密碼子和EcoRI限制位點，以供克隆至Bs3Ab表達載體中。編碼TNFR2-Fc_VH#4的DNA序列表示為SEQ ID NO:16并且其氨基酸序列為SEQ ID NO:14。

通過在所述多特異性結(jié)合分子的MEDI-578scFv部分的VH和VL域之間添加鏈間二硫鍵而改進了TNF-NGF多特異性結(jié)合分子的熱穩(wěn)定性。這是通過在VH域(SEQ ID NO:94)的氨基酸44處和VL域(SEQ ID NO:95)的氨基酸102處引入G->C突變而完成的。該克隆稱為TNFR2-Fc_varB。TNFR2-Fc_varB的氨基酸序列表示為SEQ ID NO:17。編碼TNFR2-Fc_varB的DNA序列表示為SEQ ID NO:18。經(jīng)密碼子優(yōu)化的編碼TNFR2-Fc_varB的DNA序列表示為SEQ ID NO:99。TNFR2-Fc_varB與TNFR2-Fc_VH#4的不同還在于連接所述scFv部分的VH與VL的15個氨基酸的接頭序列(GGGGS)₃由20個氨基酸的接頭(GGGGS)₄(SEQ ID NO:19)所替代。使用差示掃描熒光測定法(DSF)來測量TNFR2-Fc_VH#4和TNFR2-Fc_varB的Tm。該方法測量熒光染料Sypro Orange(Invitrogen)的并入，所述熒光染料結(jié)合至在暴露于升高的溫度后蛋白域解折疊過程中揭示的疏水表面。在DSF測定中，TNFR2-Fc_VH#4的Tm是62℃，而TNFR2-Fc_varB的Tm是66℃。因此，在多特異性分子的MEDI-578scFv部分中添加鏈間二硫鍵將分子的熱穩(wěn)定性提高了4℃。

用聚乙烯亞胺(PEI)(Polysciences)作轉(zhuǎn)染試劑將TNFR2-Fc蛋白和TNFR2-Fc_VH#4瞬時表達于懸浮的CHO細胞中。將細胞維持在CD-CHO培養(yǎng)基(Life Technologies)中。用1ml HiTrap MabSelect SuRe^TM親和色譜根據(jù)制造商的規(guī)程(GE Healthcare)對來自小規(guī)模轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)收獲物進行純化，并隨后在1％蔗糖、100mM NaCl、25mM L-精氨酸鹽酸鹽、和25mM磷酸鈉(pH 6.3)中進行緩沖液交換。在還原性條件下用SDS-PAGE并用分析性大小排阻色譜(參見下文方法)來分析重組蛋白的純度，并通過讀取280nm處的吸光度用理論上確定的消光系數(shù)來確定濃度。

TNFR2-Fc融合蛋白與TNF-NGF多特異性構(gòu)建體TNFR2-Fc_VH#4的小規(guī)模瞬時表達和蛋白A柱純化分別產(chǎn)出了36.6和79.9mg L^-1的產(chǎn)量/得率。

如下文產(chǎn)生了較大批次的TNFR2-Fc_VH#4。用深層過濾來過濾了來自大規(guī)模轉(zhuǎn)染(多至6L)的粗培養(yǎng)收獲物并將其裝載至用緩沖液A(磷酸鹽緩沖鹽水，pH 7.2)預平衡的1.6x 20cm蛋白A瓊脂糖柱(GE Healthcare)上。然后用緩沖液A洗滌所述柱并在緩沖液B(50mM乙酸鈉，pH<4.0)的不連續(xù)梯度(step gradient)中洗脫產(chǎn)物。通過加載至在緩沖液C(50mM乙酸鈉緩沖液，pH<5.5)中預平衡的1.6x 20cm Poros HS 50柱(Applied Biosystems)上將產(chǎn)物進一步純化，于緩沖液C中洗滌并隨后在50mM乙酸鈉緩沖液pH<5.5中的0至1M NaCl的線性梯度中洗脫產(chǎn)物。通過大小排阻HPLC來分析所得的洗脫物。通過A280光譜法用Beckman DU520分光光度計使用計算的1.36的消光系數(shù)來確定蛋白濃度。

TNFR2-Fc_VH#4的表征方法

用標準實驗方案進行了Western印記分析。用Xcell SureLock^TM系統(tǒng)(Invitrogen)根據(jù)制造商的說明將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(Life Technologies)上。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的3％(w/v)脫脂奶粉來封閉該膜室溫1小時。用標準實驗方案采用HRP綴合的抗人IgG Fc特異性抗體(Sigma)來對Western印記進行顯影。

用Gilson HPLC系統(tǒng)(等度泵-307，UV/Vis-151檢測器，液體操縱器-215和注射模塊-819)、采用Phenomenex BioSep-SEC-S3000(300x 7.8mm)柱、以D-PBS(life Technologies)為移動相、以1ml/分鐘的流速來進行大小排阻HPLC。將25μL樣品注射至柱上并于A280nm監(jiān)測蛋白種類的分離。

對小規(guī)模純化的TNFR2-Fc_VH#4的酶促去糖基化用EDGLY試劑盒(Sigma Aldrich)根據(jù)制造商的規(guī)程來進行。在變性條件和天然條件下將蛋白去糖基化。對于變性蛋白而言，用PNGase F、O-糖苷酶、和α-(2→3,6,8,9)-神經(jīng)氨酸苷酶、β-N-乙酰葡糖胺酶和β-(1→4)-半乳糖苷酶將30μg的蛋白于37℃去糖基化3小時。在未處理條件下，用與上述相同的酶將35μg的蛋白于37℃去糖基化3天。通過考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE以及通過Western印跡用標準測定實驗方案來分析了去糖基化的蛋白。

如下文所述對TNFR2-Fc_VH#4進行了N末端氨基酸測序。在SDS-PAGE凝膠上用標準實驗方案運行了約2μg的TNFR2-Fc_VH#4。用Xcell SureLock^TM系統(tǒng)(Invitrogen)根據(jù)制造商的說明將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。在軌道振蕩平臺上用0.1％(w/v)氨基黑(amidoblack)對膜染色約15分鐘，然后用dH₂O洗滌以降低PVDF膜的背景染色。對膜進行空氣干燥，然后進行N末端測序。將目的條帶切出并在Applied Biosystems 494HT測序儀(Applied Biosystems,San Francisco,CA,U.S.A.)上用在線乙內(nèi)酰苯硫脲分析使用Applied Biosystems 140A微HPLC進行多特異性結(jié)合分子的N末端的序列確認。

表征結(jié)果

通過對聚集物、單體、和蛋白片段化水平的SEC-HPLC來對純化的TNFR2-Fc_VH#4和TNFR2-Fc進行概述(圖2A和2B)。包含單體的主峰組成為約90％的總蛋白連同剩余的約10％的具有較低柱保留時間的蛋白團塊(mass)，指示存在較高階的種類或聚集體。然而，來自SEC-HPLC的單體峰具有兩個顯著的肩部(pronounced shoulders)，指示峰內(nèi)的蛋白不是單一種。用考馬斯亮藍染色進行的SDS-PAGE分析顯示了在還原條件下TNFR2-Fc_VH#4的兩個不同的條帶(約100和75kD處)以及TNFR2-Fc融合蛋白也類似地顯示兩個不同條帶(約70和45kD處)(圖2B)。在非還原條件下，TNFR2-Fc_VH#4存在三個主條帶(在150和250kD之間)而TNFR2-Fc融合蛋白具有一個主條帶和一個副條帶(分別位于約150和120kD)。由于還原條件下兩個條帶之間的分子量差異與scFv片段(～26.5kD)的大小是約為相等的，進行了進一步分析以了解正在生成何種形式的多特異性結(jié)合分子。未處理條件下的質(zhì)譜分析確認了SDS-PAGE數(shù)據(jù)，對于兩個單獨純化的蛋白制備物在純化的TNFR2-Fc_VH#4制備物中在約125、152和176kD處存在3個分子量(圖2C)。

如果通過SDS-PAGE觀察到的條帶型是由于TNFR2-Fc_VH#4的差別糖基化引起的，則在去糖基化時其會解析回到(resolved back)單個條帶。然而，無論當TNFR2-Fc_VH#4作為天然蛋白還是作為變性蛋白而去糖基化時，所述條帶模式在還原和非還原條件下均得以維持(數(shù)據(jù)未顯示)。用多克隆抗人IgG Fc特異性抗體對糖基化的和去糖基化的TNFR2-Fc_VH#4二者進行的Western印跡染色顯示，全長預期條帶和較低分子量條帶二者均與抗Fc特異性抗體具有反應性(數(shù)據(jù)未顯示)。

通過蛋白的N末端氨基酸測序?qū)囟坍a(chǎn)物進行了最終鑒定。其揭示了階段蛋白的N末端的起始8個氨基酸是SMAPGAVH，其對應于TNFR2-Fc_VH#4序列(SEQ ID NO:14)的氨基酸176至183。這代表了在TNFR2-Fc_VH#4的N末端處175個氨基酸的截短，其僅剩余TNFR2域的42個氨基酸。這允許我們精確解釋來自SDS-PAGE、質(zhì)譜分析和SEC-HPLC分析的大量數(shù)據(jù)。有三種可能的TNFR2-Fc_VH#4二聚體的組合，其均存在于純化蛋白制備物中：(1)全長同二聚體，(2)全長和截短種的異二聚體，以及(3)截短種的同二聚體。為了精確測量體內(nèi)和體外二者的生物活性，通過兩步柱色譜工藝生成了全長同二聚體的制備物。在第一步中，在蛋白A純化之后，產(chǎn)物含有80.5％單體(圖3A)，而在第二柱純化步驟(SP瓊脂糖)后單體百分比為97.8％(圖3B)。整個過程的產(chǎn)量/得率為7.3％。

實施例2.通過差示掃描量熱法(DSC)的熱穩(wěn)定性分析

將自動MicroCal VP毛細管DSC(GE Healthcare,USA)用于量熱測量。在25mM組氨酸/組氨酸-HCL緩沖液(pH 6.0)中于1mg/mL處測試蛋白樣品。對蛋白樣品和緩沖液進行線性加熱，所述加熱以每小時95℃的速率從25℃至100℃來進行。用Origin 7軟件從蛋白樣品減去作為參照的緩沖液并確定熱轉(zhuǎn)變(thermal transitions)。

TNFR2-Fc_VH#4的熱譜圖(圖4)顯示了3個不同的解折疊轉(zhuǎn)變，變性溫度(Tm)為64、67、和84℃。我們推知64℃的Tm與TNFR2域和抗NGF scFv域二者的變性均符合，67℃和84℃的Tm分別是IgG1CH2和CH3域的典型變性溫度(例如Dimasi,N.,等,J Mol Biol.393:672-92(2009)，以及PCT公開No.WO 2013/070565)。不愿受理論束縛，scFv通常具有比其他抗體域更低的變性溫度，并且它們的解折疊的特征在于單個轉(zhuǎn)換事件(Roberge等,2006，Jung等,1999，Tischenko等,1998)。

實施例3.抗原對TNFR2-Fc_VH#4的結(jié)合的確認

A.通過ELISA的單或雙抗原結(jié)合

將Nunc Maxisorp孔用50μl的稀釋于PBS(pH 7.4)中至5μg ml^-1的TNFα(R&D Systems)在4℃涂覆過夜。在隨后那天將涂覆的溶液去除并用150μl的封閉緩沖液[3％脫脂奶-PBS]將孔在室溫封閉1小時，在PBS中將孔漂洗3次，然后添加50μl的封閉緩沖液中制成的TNFR2-Fc_VH#4稀釋系列液(dilution series)。在室溫1小時后，將孔在PBS-吐溫20(0.1％v/v；PBS-T)中洗滌3次。然后向孔添加50微升的生物素化的NGF并在室溫再溫育1小時，然后如上文所述洗滌并添加50μl的鏈霉親和素-HRP(1:100)。在室溫1小時后，用PBS-T洗滌孔，向孔添加50μl的3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺基質(zhì)并允許進行顯色。通過添加1M H₂SO₄來終止反應并用微量滴定板讀取儀(reader)于450nm處測量吸光度。用Prism 5軟件(GraphPad,San Diego,CA)來分析得到的數(shù)據(jù)。對于單抗原結(jié)合ELISA，用TNFα或NGF-生物素如上文所述來涂覆孔，并用抗人IgG Fc特異性HRP綴合的抗體(1:5000)來檢測抗體結(jié)合，并如上文所述進行顯色。

ELISA結(jié)果顯示于圖5中。將TNFR2-Fc_VH#4設計為結(jié)合TNFα和NGF抗原二者。通過首先將一個抗原固定到96孔微量滴定板上然后添加TNFR2-Fc_VH#4的系列稀釋液，從而進行了單抗原結(jié)合。通過使用辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗IgG Fc特異性抗體檢測了特異性結(jié)合。對于雙抗原結(jié)合ELISA，將第一抗原TNFα固定于ELISA板上，然后添加TNFR2-Fc_VH#4的系列稀釋液，然后添加生物素化的第二抗原，即固定濃度的NGF。然后用HRP綴合的鏈霉親和素來檢測特異性結(jié)合。TNFR2-Fc_VH#4在單抗原結(jié)合ELISA中結(jié)合至TNFα和NGF(圖5A和B)。在雙抗原結(jié)合ELISA中，TNFR2-Fc_VH#4同時結(jié)合至TNFα和NGF二者(圖5C)。

B.通過表面等離子體共振的同時抗原結(jié)合

同時抗原結(jié)合實驗基本如Dimasi,N.,等,J Mol Biol.393:672-92(2009)中所述用BIAcore 2000儀器(GE Healthcare)進行。簡言之，用CM5傳感器芯片將大約1500個共振單位的TNFR2-Fc_VH#4以100nM進行固定化。然后將傳感器芯片表面用于TNFα和NGF的同時結(jié)合。將抗原制備于HBS-EP緩沖液(10mM HEPES(pH 7.4)，150mM NaCl，3mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.005％P20)中。對結(jié)合測量使用30μl/分鐘的流速。為了確定多特異性抗體對TNFα和NGF的同時結(jié)合，將1μM的TNFα(分子量17.5kD)注射于傳感器芯片表面上，并且在完成注射之時隨后注射TNFα和NGF(分子量13.5kD)的混合物(均為1μM)。將TNFα包括在與NGF的混合物中以防止由于NGF結(jié)合階段中的TNFα解離引起的信號丟失。作為對照，進行了類似的結(jié)合步驟，并在最后一次注射時僅添加了TNFα，這次注射的共振單位沒有進一步增加，指示TNFα以飽和水平被結(jié)合。進行了類似的結(jié)合和對照實驗，其中將TNFα和NGF的注射順序顛倒。

通過表面等離子體共振表征了TNFR2-Fc_VH#4的同時抗原結(jié)合。以順序方式定性地分析了結(jié)合事件。用胺偶聯(lián)化學方法將TNFR2-Fc_VH#4共價固定至傳感器芯片表面上。隨后，注射第一抗原以提供對TNFR2-Fc_VH#4的飽和水平的結(jié)合，然后將第二抗原作為與抗原1的等摩爾摻合物予以注射。結(jié)合傳感圖明確顯示，TNFR2-Fc_VH#4同時結(jié)合至TNFα和NGF(圖6)。無論抗原注射順序如何，都發(fā)生對兩種抗原的同時結(jié)合。

實施例4.由NGF誘導的TF-1細胞增殖的抑制

將TF-1細胞(ECACC產(chǎn)品編號：93022307)以1.5x10⁴細胞/孔接種于96孔組織培養(yǎng)板(Corning Costar)內(nèi)的50μl無血清培養(yǎng)基中并在37℃以5％CO₂溫育18小時。將重組人(Sigma)或小鼠NGF(R&D Systems)于37℃在96孔圓底平板(Greiner)中與TNFR2-Fc_VH#4、MEDI-578IgG1TM YTE(MEDI-578的一種非結(jié)合的IgG1TM YTE同種型對照)、或非結(jié)合的雙特異性同種型對照R347Bs3Ab的稀釋液預溫育30分鐘。然后將50微升的每個樣品添加至細胞平板并于37℃溫育48小時。在溫育期后，添加100μl的細胞TITRE測定緩沖液(Promega)并將平板于37℃以5％CO₂溫育10分鐘。然后用標準發(fā)光規(guī)程來測量發(fā)光。在沒有抗體時標準NGF誘導的TF-1增殖顯示于圖7A中。

用NGF誘導的TF-1增殖確定了TNFR2-Fc_VH#4的功能活性。TNFR2-Fc_VH#4能夠完全抑制人和鼠NGF二者誘導的增殖(分別為圖7B和7C)。圖7B：用對應于EC₈₀濃度的重組人NGF刺激TF-1細胞。將細胞與配體與抗體的系列稀釋液一起溫育48小時，之后通過用細胞TITRE測定緩沖液(Promega)培養(yǎng)10分鐘來對細胞增殖進行定量。圖7C：用對應于EC₈₀濃度的重組鼠NGF來刺激TF-1細胞。將細胞與配體與抗體的系列稀釋液一起溫育48小時，之后通過用細胞TITRE測定緩沖液(Promega)培養(yǎng)10分鐘來對細胞增殖進行定量。這些數(shù)據(jù)證明，TNFR2-Fc_VH#4的NGF抑制性部分是生物學上活性的，并且以類似于IgG1TM對MEDI-578的效力來抑制NGF誘導的增殖。對TNFR2-Fc_varB和另一個TNF-NGF多特異性結(jié)合分子ndimab var B也觀察到了相似的數(shù)據(jù)(圖7D和7E)。ndimab varB包含完全抗TNFα抗體，即以H₂L₂形式包含兩條完整重鏈和兩條完整輕鏈的抗體，及融合至所述抗TNFα抗體的重鏈C末端的MEDI-578scFv。ndimab varB的輕鏈描述于SEQ ID NO:20中而ndimab varB的重鏈描述于SEQ ID NO:22中。

實施例5.由TNFα誘導的U937細胞凋亡的抑制

將U937細胞(ECACC產(chǎn)品編號：85011440)以8x10⁵細胞/孔的濃度置于黑壁(black walled)96孔組織培養(yǎng)平板(Corning Costar)中的50μl培養(yǎng)基中。用對應于EC₈₀濃度的重組人TNFα來刺激U937細胞。將細胞與配體與抗體的系列稀釋液溫育2小時，然后通過與胱天蛋白酶3測定反應緩沖液一起培養(yǎng)2小時對胱天蛋白酶3活性進行定量。將TNFR2-Fc_VH#4，一種非結(jié)合的雙特異性同種型對照，R347Bs3Ab，以及依那西普在37℃與細胞預溫育30分鐘。之后添加50μl重組人TNFα(R&D Systems)以獲得20ng/ml的最終測定濃度，然后在37℃溫育2小時。在溫育期后，添加50μl的胱天蛋白酶3測定反應緩沖液(0.2％w/v CHAPS、0.5％v/v Igepal CA-630、200mM NaCl、50mM HEPES、20μM DEVD-R110底物(Invitrogen))并將細胞在37℃溫育2.5小時。通過在475nm處激發(fā)和512nm處發(fā)射來測量熒光。缺乏TNFα拮抗劑的胱天蛋白酶活性示于圖8A。

用U937細胞中的TNFα誘導的胱天蛋白酶3活性測定來確定TNFR2-Fc_VH#4的功能活性。TNFR2-Fc_VH#4完全抑制了TNFα誘導的胱天蛋白酶3活性，正如依那西普一樣(圖8B)。這清楚地說明了TNFR2-Fc_VH#4的TNFα抑制性部分是生物學上活性的并且具有與依那西普相似的效力。對TNFR2-Fc_varB和ndimab varB也觀察到了相似數(shù)據(jù)(見圖8C)。

實施例6.體內(nèi)測定

所有體內(nèi)程序根據(jù)英國內(nèi)政部動物(科學程序)法案(1986)進行，并經(jīng)當?shù)貍惱砦瘑T會批準。整個過程中使用了雌性C57Bl/6小鼠(Charles River,UK)。將小鼠養(yǎng)在每籠5/6只的組中，于單獨通風的籠(IVC)中，并能在12小時亮/暗周期(在07:00-19:00亮燈)下自由接觸食物和水。飼養(yǎng)和操作間維持在24℃，并藉由常規(guī)廣播電臺維持恒定的背景噪音。出于鑒定目的，所有小鼠在開始各項研究之前至少5天在麻醉條件下(氧氣中3％的異氟烷)經(jīng)歷了轉(zhuǎn)發(fā)器(transponders)的插入。

A.神經(jīng)性疼痛的Seltzer模型

用無痛量器(analgysemeter)(Randall LO,Selitto JJ,Arch Int Pharmacodyn Ther.111:409-19(1957))(Ugo Basile)來確定機械痛覺過敏。對每個后爪的背表面輪流施加增加的力，直至觀察到撤回(withdrawal)響應。在這個點處停止施加力，并以克記錄重量。數(shù)據(jù)表示為同側(cè)和對側(cè)爪的撤回閾值，以克計。在確立基線讀數(shù)后，將小鼠以大致相等的同側(cè)/對側(cè)比率分為2組，并經(jīng)歷手術(shù)。用3％異氟烷麻醉小鼠。此后，經(jīng)大腿中段水平的切口通過鈍性分離暴露大約1cm的左坐骨神經(jīng)。然后將縫合線(10/0Virgin Silk:Ethicon)穿過背部第三神經(jīng)并綁牢。用膠關(guān)閉傷口并允許小鼠在開始測試前恢復至少7天。經(jīng)假手術(shù)的小鼠經(jīng)歷了相同的實驗方案，但在暴露神經(jīng)后將傷口粘合并允許恢復。在手術(shù)后第7和10天測試小鼠的痛覺過敏。在第10天的測試后，將經(jīng)手術(shù)的小鼠進一步細分為接受CAT251IgG1同種型對照(0.03mg/kg皮下)、依那西普(0.01mg/kg皮下)、MEDI-578(0.03mg/kg皮下)、或依那西普(0.01mg/kg皮下)與MEDI-578(0.03mg/kg皮下)的組合的組。經(jīng)假手術(shù)的小鼠全部接受了CAT251(0.03mg/kg皮下)。在給藥后第4小時、第1、2、3、4、和7天測量機械痛覺過敏。

在機械痛覺過敏模型中共同施用依那西普和MEDI-578，在手術(shù)后第10天顯示為與經(jīng)假手術(shù)的對照相比同側(cè)/對側(cè)比率的顯著降低(圖9)。施用單劑的依那西普(0.01mg/kg皮下)或MEDI-578(0.03mg/kg皮下)不能顯著逆轉(zhuǎn)該種痛覺過敏。共同施用依那西普(0.01mg/kg皮下)連同MEDI-578(0.03mg/kg皮下)在給藥后4小時處顯著逆轉(zhuǎn)了機械痛覺過敏，并且其效果維持直至給藥后7天。

在第二項研究中，評估了TNFR2-Fc_VH#4的效果。在確立機械痛覺過敏后，對小鼠在手術(shù)后第13天給藥R347Bs3Ab同種型對照(0.03mg/kg皮下)、依那西普(0.01mg/kg皮下)、MEDI-578(0.03mg/kg皮下)或TNFR2-Fc_VH#4(0.01mg/kg或0.03mg/kg皮下)。假手術(shù)處理的動物接受了R347Bs3Ab同種型對照(0.03mg/kg皮下)。如上文所述在給藥后4小時以及給藥后第1、2、4和7天測試了小鼠的機械痛覺過敏。

施用TNFR2-Fc_VH#4在手術(shù)后第10天產(chǎn)生了與經(jīng)假手術(shù)的對照相比同側(cè)/對側(cè)比率的顯著降低(圖10A)。施用依那西普(0.01mg/kg皮下)或MEDI-578(0.03mg/kg皮下)都不能顯著逆轉(zhuǎn)該種機械痛覺過敏。然而，施用TNFR2-Fc_VH#4(0.01和0.03mg/kg皮下)在給藥后4小時產(chǎn)生了機械痛覺過敏的顯著逆轉(zhuǎn)，這種效果維持到直至給藥后6天。在施用R347對照Bs3Ab后未觀察到效果。當施用TNFR2-Fc_varB時觀察到了相似的數(shù)據(jù)(參見圖10B)。這些數(shù)據(jù)提示，TNFR2-Fc_VH#4能以非常低的劑量顯著逆轉(zhuǎn)疼痛，而單獨用等量的MEDI-578或依那西普則已顯示為無效或最低的效果。

B.慢性關(guān)節(jié)痛模型

在小鼠雙足平衡測痛儀(incapacitance tester)(Linton Instrumentation)中確定了機械超敏感性。將小鼠置于設備中，將其后爪放在分離的傳感器上，并在4秒的時間段計算體重分布。數(shù)據(jù)以同側(cè)和對側(cè)承重的比率以克表示。

在確立基線讀數(shù)后，將小鼠以大致相等的同側(cè)/對側(cè)比率分為2組。用如下技術(shù)進行關(guān)節(jié)內(nèi)注射：用氧氣中的3％異氟烷麻醉動物并將左膝除毛并清潔。用10μl的弗氏完全佐劑(FCA)(10mg/ml)或介質(zhì)(輕礦物油)以裝載于100μl Hamilton注射器上的25-號針頭注射每只小鼠的膝關(guān)節(jié)。直接注射至膝關(guān)節(jié)的滑膜空間(synovial space)中。如上文所述允許小鼠恢復并在注射后7和10天再次測試其機械超敏感性的變化。在第10天的測試后，將FCA處理的小鼠進一步隨機化至各組中，并在第13天對小鼠給藥依那西普(0.01mg/kg腹膜內(nèi))或介質(zhì)，然后小鼠接受一劑MEDI-578(0.03mg/kg靜脈內(nèi))或CAT251同種型對照(0.03mg/kg靜脈內(nèi))。如上文所述在給藥后4小時以及在給藥后第1、2、4和7天處測試小鼠的機械超敏感性。

用炎性疼痛的關(guān)節(jié)內(nèi)FCA模型評估了共同施用依那西普和MEDI-578的效果。關(guān)節(jié)內(nèi)施用FCA引起機械超敏感性，其顯示為第7和10天與介質(zhì)對照相比同側(cè)/對側(cè)比率的顯著降低(圖11)。在假手術(shù)處理的組中未觀察到與處理前基線水平相比的同側(cè)/對側(cè)比率降低。施用依那西普(0.01mg/kg腹膜內(nèi))+CAT251(0.03mg/kg靜脈內(nèi))或PBS(10ml/kg腹膜內(nèi))+MEDI-578(0.03mg/kg靜脈內(nèi))在給藥后4小時或第1、2、4和7天處引起FCA誘導的機械超敏感性的輕微逆轉(zhuǎn)，但其未達到統(tǒng)計學顯著性。然而，施用依那西普(0.01mg/kg腹膜內(nèi))+MEDI-578(0.03mg/kg靜脈內(nèi))在給藥后所有測試時間均引起FCA誘導的機械超敏感性的顯著逆轉(zhuǎn)。

在第二項研究中，評估了TNFR2-Fc_VH#4的效果。在確立FCA誘導的機械超敏感性后，在FCA后第13天對小鼠給藥如下藥劑：R347Bs3Ab同種型對照(0.01mg/kg皮下)、依那西普(0.01mg/kg皮下)、MEDI-578(0.01mg/kg皮下)或TNFR2-Fc_VH#4(0.003mg/kg或0.01mg/kg皮下)。如上文所述在給藥后4小時以及在給藥后第1、2、4和7天處再次測試小鼠的機械超敏感性。

TNFR2-Fc_VH#4(“雙特異性”)的效果與依那西普和MEDI-578單獨的效果相比顯示于圖12中。依那西普(0.01mg/kg皮下)和MEDI-578(0.01mg/kg皮下)在給藥后任何時間點處均未顯著逆轉(zhuǎn)FCA誘導的機械超敏感性。然而，施用TNFR2-Fc_VH#4引起FCA誘導的機械超敏感性的顯著逆轉(zhuǎn)。較高劑量的TNFR2-Fc_VH#4(0.01mg/kg皮下)顯示出對于研究持續(xù)時間的顯著活性，而較低劑量(0.003mg/kg皮下)在給藥后第1天達到顯著性并且在研究持續(xù)時間保持在與較高劑量相似的水平。

C.大鼠中機械超敏感性的FCA誘導模型的確立

弗氏完全佐劑(FCA)的足底(intraplantar)注射引起炎癥反應，其誘導超敏感性和水腫，并且模擬臨床炎性疼痛的一些方面。這些效果可以用測量負重的裝備來研究。對TNFR2-Fc_VH#4的潛在抗痛覺過敏特性的評估，用承重方法FCA誘導的超敏感性。未處理大鼠的體重在兩個后爪之間均等分布。然而，當注射的(左)后爪發(fā)炎和/或疼痛時，其重量重新分布從而在受影響的爪上重量較輕(在受傷的爪上承重降低)。使用大鼠雙足平衡測痛儀(Linton Instruments,UK)測量各條后肢的承重。將大鼠置于雙足平衡測痛儀中，使其后爪在分離的傳感器上，并在4秒記錄兩條后肢發(fā)出的平均力。

對于本項研究，使未處理的大鼠(rats)(雄性，Sprague Dawley大鼠(Harlan,UK)，198-258g)適應于其居住籠中的操作間，并且食物與水可任取。在數(shù)天進行對雙足平衡測痛儀的習慣。在誘導傷害前取得基線承重記錄。通過足底注射FCA(可獲取自Sigma，100μl的1mg/ml溶液)至左后爪中來誘導炎性超敏感性。取處理前的承重測量值來評估FCA后23小時的超敏感性。

然后根據(jù)承重FCA窗口以拉丁方設計對動物進行評級并隨機化至治療組。在FCA注射后24小時，用0.003、0.01、0.03、0.3、和3mg/kg的靜脈內(nèi)給予的TNFR2-Fc_VH#4(“雙特異性”)、3mg/kg的靜脈內(nèi)給予的陰性對照抗體NIP228(產(chǎn)生以結(jié)合至半抗原硝基酚的抗體)、2ml/kg的口服給予的介質(zhì)(1％甲基纖維素)、或10mg/kg的口服給予的吲哚美辛來處理動物。

在抗體/藥物處理后4或24小時評估承重。通過在每個時間點將處理組與介質(zhì)對照組進行比較來分析數(shù)據(jù)。統(tǒng)計學分析包括重復測量ANOVA，然后是用InVivoStat(invivostat.co.uk)的計劃的比較檢驗(Planned comparison test)，(p<0.05認為是顯著的)。結(jié)果顯示于圖13中。在4和24小時處對吲哚美辛(10mg/kg)觀察到了超敏感性的顯著逆轉(zhuǎn)。以0.3和3mg/kg給藥的TNFR2-Fc_VH#4在4和24小時處顯示出超敏感性的顯著逆轉(zhuǎn)，以0.003和0.03mg/kg給藥的TNFR2-Fc_VH#4也顯示出超敏感性的顯著逆轉(zhuǎn)，但其僅在24小時處顯示。同種型對照NIP228在任何時間點對FCA反應都沒有顯著效果。

實施例7.通過TNFα和NGF的p38磷酸化

文獻表明了p38磷酸化在神經(jīng)性疼痛的進展中起重要作用。例如，用p38抑制劑治療已顯示出在保留性神經(jīng)損傷模型中(Wen YR等,Anesthesiology 2007,107:312-321)和坐骨神經(jīng)炎性神經(jīng)病變模型中(Milligan ED等,J Neurosci 2003,23:1026-1040)預防神經(jīng)性疼痛癥狀的進展。在本實驗中，在細胞培養(yǎng)測定中研究了TNFα、NGF、以及TNFα和NGF的組合對p38磷酸化的作用。簡言之，將Neuroscreen-1細胞(一種PC-12大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的亞克隆)與增加的量的TNFα、NGF、或TNFα和NGF的組合一起溫育。在20分鐘溫育期后，用均質(zhì)時間解析熒光(HTRF)測定(Cisbio)對磷酸-p38進行定量。

HTRF測定：在用TNFα、NGF、或TNFα和NGF的組合刺激后，快速去除細胞上清液并在裂解緩沖液中裂解細胞。在夾心測定形式中用兩種不同的特異性抗體在裂解液中檢測磷酸-p38MAPK(Thr180/Tyr182)；所述抗體為綴合至銪穴狀化合物(europium cryptate)(供體熒光團)的抗磷酸-p38抗體和綴合至d2(受體熒光團)的抗-p38(總)抗體。將抗體與細胞裂解液一起溫育并從665nm和620nm處的熒光測量值計算HTRF比率，所述測量值用EnVision Multilabel Plate Reader(Perkin Elmer)測得。

數(shù)據(jù)以HTRF比率表示，其計算為665nm處的發(fā)射和620nm處的發(fā)射之間的比率。顯示來自磷酸-p38反應的HTRF比率的熱圖顯示于圖14中。顯示TNFα、NGF、或TNFα和NGF的組合的效果的劑量響應曲線示于圖15中。如圖15所示，較高濃度的TNFα和NGF對磷酸-p38的組合效果大于任一單個因子所誘導的磷酸-p38信號的預測總量。這些數(shù)據(jù)提示，TNFα和NGF可一起作用以誘導p38磷酸化，以及兩個途徑可涉及導致疼痛的分子信號傳輸。

實施例8.通過TNFα和NGF的ERK磷酸化

如同p38一樣，ERK在神經(jīng)性疼痛進展過程中也被激活(Zhuang ZY等,Pain 2005,114:149-159)。在本實驗中，在細胞培養(yǎng)測定中研究了TNFα、NGF、以及TNFα和NGF的組合對ERK磷酸化的作用。簡言之，將Neuroscreen-1細胞(一種PC-12大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的亞克隆)與增加的量的TNFα、NGF、或TNFα和NGF的組合一起溫育。在20分鐘溫育期后，用均質(zhì)時間解析熒光(HTRF)測定(Cisbio)對磷酸-ERK進行定量。

HTRF測定：在刺激后，快速去除細胞上清液并在裂解緩沖液中裂解細胞。在夾心測定形式中用兩種不同的特異性抗體在裂解液中檢測磷酸-ERK MAPK(Thr202/Tyr204)；所述抗體為綴合至銪穴狀化合物(供體熒光團)的抗磷酸-ERK抗體和綴合至d2(受體熒光團)的抗ERK(總)抗體。將抗體與細胞裂解液一起溫育并從665nm和620nm處的熒光測量值計算HTRF比率，所述測量值用EnVision Multilabel Plate Reader(Perkin Elmer)測得。

數(shù)據(jù)以HTRF比率表示，其計算為665nm處的發(fā)射和620nm處的發(fā)射之間的比率。顯示來自磷酸-ERK反應的HTRF比率的熱圖顯示于圖16中。顯示TNFα、NGF、或TNFα和NGF的組合的效果的劑量響應曲線示于圖17中。如圖17所示，單獨的低量TNFα不誘導磷酸-ERK，但較高量增強了NGF誘導的磷酸-ERK。這些數(shù)據(jù)提示，TNFα和NGF可一起作用以誘導ERK磷酸化，以及兩個途徑可涉及導致疼痛的分子信號傳輸。

序列表

SEQ ID NO:1 NP_002497.2|β-神經(jīng)生長因子前體[人(Homo sapiens)]

SEQ ID NO:2 NP_000585.2|腫瘤壞死因子[人]

SEQ ID NO:3 MEDI-578VH(1256A5VH)

SEQ ID NO:4 MEDI-578VHCDR1

1 TYGIS

SEQ ID NO:5 MEDI-578VHCDR2

1 GIIPIFDTGN SAQSFQG

SEQ ID NO:6 MEDI-578VHCDR3

1 SSRIYDLNPS LTAYYDMDV

SEQ ID NO:7 MEDI-578VL(1256A5VL)

SEQ ID NO:8 MEDI-578VLCDR1

1 SGSSSNIGNN YVS

SEQ ID NO:9 MEDI-578VLCDR2

1 DNNKRPS

SEQ ID NO:10 MEDI-578VLCDR3

1 GTWDSSLSAW V

SEQ ID NO:11

1 SSRIYDFNSA LISYYDMDV

SEQ ID NO:12

1 SSRIYDMISS LQPYYDMDV

SEQ ID NO:13 可溶的TNFR2氨基酸序列

SEQ ID NO:14 TNFR2-Fc_VH#4-氨基酸序列

SEQ ID NO:15 (Gly4Ser)₃ 15aa接頭序列

1 GGGGSGGGGS GGGGS

SEQ ID NO:16 TNFR2-Fc_VH#4–核苷酸序列

SEQ ID NO:17–TNFR2-Fc_varB-氨基酸序列

SEQ ID NO:18-TNFR2-Fc_varB-核苷酸序列

SEQ ID NO:19-(Gly4Ser)₄ 20aa接頭序列

1 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS

SEQ ID NO:20-ndimab varB-L鏈氨基酸序列

SEQ ID NO:21-ndimab varB-L鏈核苷酸序列

SEQ ID NO:22-ndimab varB-H鏈氨基酸序列

SEQ ID NO:23-ndimab varB-H鏈核苷酸序列

SEQ ID NO:24–NGF-NG VH氨基酸序列

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFWFGAFTWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGLTNLAQNFQGRVTITADESTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:25–NGF-NG VH核苷酸序列

SEQ ID NO:26–NGF-NG VL氨基酸序列

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSDIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:27–NGF-NG VL核苷酸序列

SEQ ID NO:28–ndimab VH氨基酸序列

SEQ ID NO:29–ndimab VL氨基酸序列

SEQ ID NO:30–1126F1VH氨基酸序列

EVQLVQTGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDANRQAVPYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:31–1126F1VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQMVTISCSGSSSDIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:32–1126G5VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFTSGLAPYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:33–1126G5VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPPGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSTWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:34–1126H5VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDAGNSAQSFQGRVTITADESTSTAHMEVSSLRSEDTAVYYCASSSRIYDHHIQKGGYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:35–1126H5VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:36–1127D9VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDYHTIAYYD

SEQ ID NO:37–1127D9VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:38–1127F9VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMKVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDYIPGMRPYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:39–1127F9VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGNSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSRSGTLATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:40–1131D7VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFNSSLIAYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:41–1131D7VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDETDYYCGTWDSSLSAWVFSGGTKLTVL

SEQ ID NO:42–1131H2VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSTVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:43–1131H2VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGTSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:44–132A9VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFGTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFEPSLIYYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:45–132A9VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:46–1132H9VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:47–1132H9VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSDIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPTGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:48–1133C11VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:49–1133C11VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:50–1134D9VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVAITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:51–1134D9VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSGLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:52–1145D1VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTSNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFRTLYSTYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:53–1145D1VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGISDRFSGSKSGTSATLGIAGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:54–1146D7VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:55–1146D7VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQEVTISCSGSSTNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:56–1147D2VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVRISCKASGGTFSTYGVSWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:57–1147D2VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGVPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:58–1147G9VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSAYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFNTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTV

SEQ ID NO:59–1147G9VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTVSCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:60–1150F1VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQDRVTITADESTSTAYMEVGSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGHGTMVTVSS

SEQ ID NO:61–1150F1VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:62–1152H5VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLVWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDMISSLQPYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:63–1152H5VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKATISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:64–1155H1VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFHLANKGYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:65–1155H1VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKATISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLDITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:66–1158A1VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFGTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDHHNHVGGYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:67–1158A1VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYASWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDGSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:68–1160E3VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSAKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:69–1160E3VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSNSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTV

SEQ ID NO:70–1165D4VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:71–1165D4VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIENNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:72–1175H8VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQRLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDATTGLTPYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:73–1175H8VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLRTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:74–1211G10VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVRKPGSSVKVSCKAYGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWVGGIIPIFDTRNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDMVSTLIPYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:75–1211G10VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:76–1214A1VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDAHLQAYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:77–1214A1VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPPGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTRDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:78–1214D10VH氨基酸序列

EVQLVQSGAEAKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGRGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVAITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDAHLNHHGYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:79–1214D10VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQAGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:80–1218H5VH氨基酸序列

EVQLVQSGAVVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGSSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:81–1218H5VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNTGNNYVSWYQQLSGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:82–1230H7VH氨基酸序列

EMQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFNSALISYYDMDVWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO:83–1230H7VL氨基酸序列

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTV

SEQ ID NO:84–1083H4VH氨基酸序列

QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFAYHYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTNYAQRFQDRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASADYVWGSYRPDWYFDLWGRGTMVTVSS

SEQ ID NO:85–1083H4VL氨基酸序列

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQRLPGAAPQLLIYNNDQRPSGIPDRFSGSKSGTSGSLVISGLQSEDEADYYCASWDDSLNGRVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO:86–1227H8VH氨基酸序列

QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGHTFAYHYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTNYAQRFQDRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASADYAWESYQPPQINGVWGRGTMVTVSS

SEQ ID NO:87–1227H8VL氨基酸序列

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTITCSGSTSNIGNNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNSASLDISGLQSEDEADYYCAAWDDSLSEFFFGTGTKLTVL

SEQ ID NO:88–NGF-NG HCDR1

FGAFT

SEQ ID NO:89–NGF-NG HCDR2

GIIPIFGLTNLAQNFQG

SEQ ID NO:90–NGF-NG HCDR3

SSRIYDLNPSLTAYYDMDV

SEQ ID NO:91–NGF-NG LCDR1

SGSSSDIGNNYVS

SEQ ID NO:92–NGF-NG LCDR2

DNNKRPS

SEQ ID NO:93–NGF-NG LCDR3

GTWDSSLSAWV

SEQ ID NO:94–MEDI-578VH氨基酸序列，具有G->C

SEQ ID NO:95–MEDI-578VL氨基酸序列，具有G->C

SEQ ID NO:96–1230D8VH氨基酸序列

QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFPYHYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTNYAQRFQDRVTITADESTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCASADYVWESYHPATSLSLWGRGTMVTVSS

SEQ ID NO:97–1230D8VL氨基酸序列

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCPGSTSNIGNNYVSWYQQRPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNSASLDISELQSEDEADYYCAAWDDSLSEFLFGTGTKLTVL

SEQ ID NO:98

GGGGSGGGGS

SEQ ID NO:99–TNFR2-Fc_varB–密碼子優(yōu)化的核苷酸序列

***

本發(fā)明的范圍不受所描述的具體方面的限制，所述具體方面意為對本發(fā)明的個體方面的單個描述，并且功能上等同的任何組合或方法均在本發(fā)明范圍內(nèi)。實際上，對本文所顯示和描述的內(nèi)容所添加的本發(fā)明的多種修飾，對于本領域技術(shù)人員在本文的描述及所附的附圖基礎上會是顯而易見的。此類修飾意欲落在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。

本說明書中提及的所有出版物和專利申請在此通過提述并入本文，其公開程度相當于具體且單獨地說明每個單獨出版物或?qū)＠暾埻ㄟ^提述并入一樣。