本發(fā)明在其一些實(shí)施方案中涉及微RNA，更具體但并非唯一地講涉及所述微RNA用于疾病診斷、治療和監(jiān)測治療的用途。心境障礙，例如重性抑郁癥和焦慮障礙代表了影響約10%人口的某些全球最常見和激增的健康問題。盡管幾十年的研究，但僅僅部分了解抑郁發(fā)作背后的機(jī)制、易感性和可獲得的療法。目前只有約三分之一的患者對可獲得的治療起反應(yīng)，因此，極需要更好地認(rèn)識(shí)病理學(xué)。有關(guān)抑郁癥病因?qū)W現(xiàn)有的見解是環(huán)境因素和遺傳誘因之間的復(fù)雜的相互作用，表明了外遺傳過程的機(jī)制性作用。5-羥色胺(5HT)是一種在腦中通過中縫核(RN)產(chǎn)生的單胺神經(jīng)遞質(zhì)，其在整個(gè)腦中廣泛發(fā)射以調(diào)節(jié)各種認(rèn)知、情緒和生理功能。5-羥色胺能活性失調(diào)和抑郁之間的聯(lián)系已被充分證實(shí)[MichelsenKA.等,BrainResRev(2007)55(2):329-42]。5HT的水平以及負(fù)責(zé)其產(chǎn)生、分泌、重?cái)z取和失效的遺傳回路在抑郁時(shí)失調(diào)。此外，大多數(shù)目前可獲得的抗抑郁藥物靶向5HT系統(tǒng)相關(guān)蛋白質(zhì)的功能，導(dǎo)致突觸中5HT水平升高[KrishnanV和NestlerEJ，Nature(2008)455：894-902]。需要長期給予可獲得的療法后，才觀察到癥狀緩解。微RNA(MicroRNA，miR)是一類轉(zhuǎn)錄后抑制基因表達(dá)的內(nèi)源非編碼小(約22個(gè)核苷酸)RNA分子。miR作為初級(jí)miR分子轉(zhuǎn)錄，初級(jí)miR在細(xì)胞核中加工成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miR，其輸出到胞質(zhì)中，在其中進(jìn)一步加工成有活性的成熟miR。成熟miR隨后摻入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中，主要通過與特定mRNA分子的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)結(jié)合起作用。結(jié)合通過種子序列(一種在miR5′端的6-8個(gè)核苷酸序列)產(chǎn)生，該堿基與目標(biāo)mRNA3'UTR的互補(bǔ)種子匹配(seedmatch)序列配對。miR的結(jié)合導(dǎo)致直接的mRNA不穩(wěn)定或翻譯抑制，最終導(dǎo)致靶基因的蛋白質(zhì)水平降低。神經(jīng)系統(tǒng)中有大量的miR，最初的研究主要集中在發(fā)育、癌癥和神經(jīng)變性病癥和正常過程(例如可塑性)的情況下的神經(jīng)元中[KosikKS.NatRevNeurosci(2006)7:911-20]。若干miR篩選研究報(bào)告了不同的成年嚙齒動(dòng)物或人腦結(jié)構(gòu)的miR水平受各種行為和藥理學(xué)操縱影響[O'ConnorR.M.等,MolPsychiatry(2012)17:359-376]。另外，已表明miR在人和小鼠模型兩者的精神障礙例如精神分裂癥、孤獨(dú)癥還有抑郁癥和焦慮癥中起作用[MillerBH和WahlestedtC,BrainRes(2010)1338:89-99]。若干研究最近表明miR參與調(diào)節(jié)5HT相關(guān)基因[MillanMJ.CurrOpinPharmacol(2011)11(1):11-22]，顯示了miR在5HT系統(tǒng)調(diào)節(jié)中的新興作用及其與抑郁相關(guān)病癥的可能關(guān)系。美國專利申請?zhí)?0100222413(StoffelM.等人)公開了用于調(diào)節(jié)微RNA表達(dá)的化學(xué)修飾的寡核苷酸。U.S.20100222413另公開了用于使微RNA(例如miR-122、miR-16、miR-192和miR-194)沉默以治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的方面，提供治療有需要的受試者的雙相型障礙的方法，所述方法包括給予受試者治療有效量的miR-135、其前體或編碼miR-135或其前體的核酸分子，從而治療雙相型障礙。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的方面，提供治療有效量的miR-135、其前體或編碼miR-135或其前體的核酸分子用于制備經(jīng)鑒定用于治療有需要的受試者的雙相型疾病的藥物的用途。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的方面，提供包含包裝選自miR-135、其前體和編碼miR-135或其前體的核酸分子的作用劑和用于治療雙相型障礙的藥物的包裝材料的制造品。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的方面，提供監(jiān)測抗抑郁藥物或治療心境障礙的藥物的治療的方法，所述方法包括：(a)用抗抑郁藥物或治療心境障礙的藥物治療有需要的人類受試者；和(b)在治療之前和之后測量人類受試者的生物樣品中miR-135的表達(dá)水平，其中與在通過抗抑郁藥物或治療心境障礙的藥物治療之前miR-135的表達(dá)水平相比，在通過抗抑郁藥物或治療心境障礙的藥物治療之后miR-135的較高表達(dá)水平表明有效的治療。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的方面，提供診斷有需要的人類受試者的心境障礙的方法，所述方法包括測量人類受試者的生物樣品中miR-135的表達(dá)水平，其中與健康人類受試者的生物樣品中的相比，較低的miR-135表達(dá)水平表明有心境障礙。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的方面，提供包含miR-135的分離的多核苷酸，其中miR-135包含選自鎖定核酸(LNA)和2’-氟阿糖寡核苷酸(FANA)的修飾。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的方面，提供包含選自以下修飾的miR135的分離的多核苷酸：SEQIDNO:194、SEQIDNO:195、SEQIDNO:196、SEQIDNO:197、SEQIDNO:198、SEQIDNO:199、SEQIDNO:200、SEQIDNO:201、SEQIDNO:202、SEQIDNO:203、SEQIDNO:204、SEQIDNO:205、SEQIDNO:206、SEQIDNO:207、SEQIDNO:208和SEQIDNO:209。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的方面，提供包含選自miR-335、miR-181、miR-182、miR-26、miR-27、miR-15和miR-19的微RNA的分離的多核苷酸，其中微RNA包含選自鎖定核酸(LNA)和2’-氟阿糖寡核苷酸(FANA)的修飾。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的方面，提供包含本發(fā)明的一些實(shí)施方案的分離的多核苷酸和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的方面，提供增量調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的選自以下基因的表達(dá)的方法：腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1(Adcyap1或PACAP)；腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1受體1(Adcyap1r1)；腎上腺素能受體α2a(Adra2a)；錨蛋白3(ANK3)；活性調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(Arc)；RhoGTP酶激活蛋白6(Arhgap6)；激活轉(zhuǎn)錄因子3(Atf3)；β位點(diǎn)APP切割酶1(Bace1)；L型依賴電壓性鈣通道α1D亞基(Cacna1d)；細(xì)胞粘附分子3(Cadm3)；復(fù)蛋白1(Cplx1)；復(fù)蛋白2(Cplx2)；CUB和Sushi多個(gè)結(jié)構(gòu)域1(Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1(Csnk1g1)；雙皮層蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-結(jié)合RAS樣2(Diras2)；discs大同源物2(果蠅)(Dlg2)；ETS癌基因家族成員ELK1(Elk1)；fyn相關(guān)激酶(Frk)；巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶9(α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)(Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受體亞基β2(Gabrb2)；GATA結(jié)合蛋白3(Gata3)；生長激素促分泌素受體(Ghsr)；G蛋白偶聯(lián)受體3(Gpr3)；離子型谷氨酸受體AMPA3(α3)(GRIA3)；離子型谷氨酸受體紅藻氨酸3(Grik3)；G蛋白偶聯(lián)受體激酶5(Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超極化激活的環(huán)核苷酸門控鉀通道1(Hcn1)、超極化激活的環(huán)核苷酸門控K+2(Hcn2)、5-羥基色胺(5-羥色胺)受體1A(Htr1a)；肌醇單磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；鉀中/小電導(dǎo)鈣激活通道亞家族N成員3(KCNN3)；核周蛋白α3(輸入蛋白α4)(Kpna3)；髓鞘轉(zhuǎn)錄因子1樣(Myt1l)；核受體共激活蛋白2(Ncoa2)；N-Myc下游調(diào)節(jié)基因4(Ndrg4)；一氧化氮合酶1(神經(jīng)元)銜接蛋白質(zhì)(NOS1AP)；核受體亞家族3C組成員2(Nr3c2)；導(dǎo)蛋白G1(Ntng1)；核酪蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物1(Nucks1)；鈣調(diào)蛋白依賴性磷酸二酯酶1A(Pde1a)；cAMP特異性磷酸二酯酶1A(Pde4a)；磷酸二酯酶8B(Pde8b)；磷脂酶C，β1(Plcb1)；催乳素受體(Prlr)；RAB1B，成員RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相關(guān)蛋白R(shí)ap-2a(Rap2a)；類視黃醇相關(guān)孤兒受體β(Rorb)；sirtuin1(沉默交配型信息調(diào)節(jié)2同源物)1(Sirt1)；溶質(zhì)載體家族12(鉀/氯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員6(Slc12a6)；溶質(zhì)載體家族5(膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員7(Slc5a7)；溶質(zhì)載體家族6(5-羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員4(Slc6a4)；反式作用轉(zhuǎn)錄因子1(Sp1)；突觸小泡糖蛋白2b(Sv2b)；突觸核被膜1(編碼nesprin-1)(Syne1)；突觸結(jié)合蛋白I(Syt1)；突觸結(jié)合蛋白II(Syt2)；突觸結(jié)合蛋白III(Syt3)；轉(zhuǎn)化生長因子β受體II(Tgfbr2)；甲狀腺激素受體β(Thrb)；瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族C成員6(Trpc6)；囊泡相關(guān)膜蛋白2(Vamp2)；無翅相關(guān)MMTV整合位點(diǎn)3(Wnt3)和含BED結(jié)構(gòu)域的鋅指4(Zbed4)，所述方法包括：(a)減量調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的miR-135或其前體的活性或表達(dá)；和(b)測量神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中基因的表達(dá)，從而增量調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的方面，提供減量調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的選自以下基因的表達(dá)的方法：腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1(Adcyap1或PACAP)；腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1受體1(Adcyap1r1)；腎上腺素能受體α2a(Adra2a)；錨蛋白3(ANK3)；活性調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(Arc)；RhoGTP酶激活蛋白6(Arhgap6)；激活轉(zhuǎn)錄因子3(Atf3)；β位點(diǎn)APP切割酶1(Bace1)；L型依賴電壓性鈣通道α1D亞基(Cacna1d)；細(xì)胞粘附分子3(Cadm3)；復(fù)蛋白1(Cplx1)；復(fù)蛋白2(Cplx2)；CUB和Sushi多個(gè)結(jié)構(gòu)域1(Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1(Csnk1g1)；雙皮層蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-結(jié)合RAS樣2(Diras2)；discs大同源物2(果蠅)(Dlg2)；ETS癌基因家族成員ELK1(Elk1)；fyn相關(guān)激酶(Frk)；巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶9(α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)(Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受體亞基β2(Gabrb2)；GATA結(jié)合蛋白3(Gata3)；生長激素促分泌素受體(Ghsr)；G蛋白偶聯(lián)受體3(Gpr3)；離子型谷氨酸受體AMPA3(α3)(GRIA3)；離子型谷氨酸受體紅藻氨酸3(Grik3)；G蛋白偶聯(lián)受體激酶5(Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超極化激活的環(huán)核苷酸門控鉀通道1(Hcn1)，超極化激活的環(huán)核苷酸門控K+2(Hcn2)，5-羥基色胺(5-羥色胺)受體1A(Htr1a)；肌醇單磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；鉀中/小電導(dǎo)鈣激活通道亞家族N成員3(KCNN3)；核周蛋白α3(輸入蛋白α4)(Kpna3)；髓鞘轉(zhuǎn)錄因子1樣(Myt1l)；核受體共激活蛋白2(Ncoa2)；N-Myc下游調(diào)節(jié)基因4(Ndrg4)；一氧化氮合酶1(神經(jīng)元)銜接蛋白質(zhì)(NOS1AP)；核受體亞家族3C組成員2(Nr3c2)；導(dǎo)蛋白G1(Ntng1)；核酪蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物1(Nucks1)；鈣調(diào)蛋白依賴性磷酸二酯酶1A(Pde1a)；cAMP特異性磷酸二酯酶1A(Pde4a)；磷酸二酯酶8B(Pde8b)；磷脂酶C，β1(Plcb1)；催乳素受體(Prlr)；RAB1B，成員RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相關(guān)蛋白R(shí)ap-2a(Rap2a)；類視黃醇相關(guān)孤兒受體β(Rorb)；sirtuin1(沉默交配型信息調(diào)節(jié)2同源物)1(Sirt1)；溶質(zhì)載體家族12(鉀/氯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員6(Slc12a6)；溶質(zhì)載體家族5(膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員7(Slc5a7)；溶質(zhì)載體家族6(5-羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員4(Slc6a4)；反式作用轉(zhuǎn)錄因子1(Sp1)；突觸小泡糖蛋白2b(Sv2b)；突觸核被膜1(編碼nesprin-1)(Syne1)；突觸結(jié)合蛋白I(Syt1)；突觸結(jié)合蛋白II(Syt2)；突觸結(jié)合蛋白III(Syt3)；轉(zhuǎn)化生長因子β受體II(Tgfbr2)；甲狀腺激素受體β(Thrb)；瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族C成員6(Trpc6)；囊泡相關(guān)膜蛋白2(Vamp2)；無翅相關(guān)MMTV整合位點(diǎn)3(Wnt3)和含BED結(jié)構(gòu)域的鋅指4(Zbed4)，所述方法包括：(a)增量調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的miR-135或其前體的活性或表達(dá)；和(b)測量神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中基因的表達(dá)，從而減量調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案的方面，提供治療其中5-羥色胺水平的升高在有需要的受試者中是治療有益的醫(yī)學(xué)病況的方法，所述方法包括給予受試者能夠減量調(diào)節(jié)選自以下的miR-135靶標(biāo)的活性或表達(dá)的作用劑：腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1(Adcyap1或PACAP)；腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1受體1(Adcyap1r1)；腎上腺素能受體α2a(Adra2a)；錨蛋白3(ANK3)；活性調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(Arc)；RhoGTP酶激活蛋白6(Arhgap6)；激活轉(zhuǎn)錄因子3(Atf3)；β位點(diǎn)APP切割酶1(Bace1)；L型依賴電壓性鈣通道α1D亞基(Cacna1d)；細(xì)胞粘附分子3(Cadm3)；復(fù)蛋白1(Cplx1)；復(fù)蛋白2(Cplx2)；CUB和Sushi多個(gè)結(jié)構(gòu)域1(Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1(Csnk1g1)；雙皮層蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-結(jié)合RAS樣2(Diras2)；discs大同源物2(果蠅)(Dlg2)；ETS癌基因家族成員ELK1(Elk1)；fyn相關(guān)激酶(Frk)；巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶9(α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)(Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受體亞基β2(Gabrb2)；GATA結(jié)合蛋白3(Gata3)；生長激素促分泌素受體(Ghsr)；G蛋白偶聯(lián)受體3(Gpr3)；離子型谷氨酸受體AMPA3(α3)(GRIA3)；離子型谷氨酸受體紅藻氨酸3(Grik3)；G蛋白偶聯(lián)受體激酶5(Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超極化激活的環(huán)核苷酸門控鉀通道1(Hcn1)，超極化激活的環(huán)核苷酸門控K+2(Hcn2)，5-羥基色胺(5-羥色胺)受體1A(Htr1a)；肌醇單磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；鉀中/小電導(dǎo)鈣激活通道亞家族N成員3(KCNN3)；核周蛋白α3(輸入蛋白α4)(Kpna3)；髓鞘轉(zhuǎn)錄因子1樣(Myt1l)；核受體共激活蛋白2(Ncoa2)；N-Myc下游調(diào)節(jié)基因4(Ndrg4)；一氧化氮合酶1(神經(jīng)元)銜接蛋白質(zhì)(NOS1AP)；核受體亞家族3C組成員2(Nr3c2)；導(dǎo)蛋白G1(Ntng1)；核酪蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物1(Nucks1)；鈣調(diào)蛋白依賴性磷酸二酯酶1A(Pde1a)；cAMP特異性磷酸二酯酶1A(Pde4a)；磷酸二酯酶8B(Pde8b)；磷脂酶C，β1(Plcb1)；催乳素受體(Prlr)；RAB1B，成員RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相關(guān)蛋白R(shí)ap-2a(Rap2a)；類視黃醇相關(guān)孤兒受體β(Rorb)；sirtuin1(沉默交配型信息調(diào)節(jié)2同源物)1(Sirt1)；溶質(zhì)載體家族12(鉀/氯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員6(Slc12a6)；溶質(zhì)載體家族5(膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員7(Slc5a7)；溶質(zhì)載體家族6(5-羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員4(Slc6a4)；反式作用轉(zhuǎn)錄因子1(Sp1)；突觸小泡糖蛋白2b(Sv2b)；突觸核被膜1(編碼nesprin-1)(Syne1)；突觸結(jié)合蛋白I(Syt1)；突觸結(jié)合蛋白II(Syt2)；突觸結(jié)合蛋白III(Syt3)；轉(zhuǎn)化生長因子β受體II(Tgfbr2)；甲狀腺激素受體β(Thrb)；瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族C成員6(Trpc6)；囊泡相關(guān)膜蛋白2(Vamp2)；無翅相關(guān)MMTV整合位點(diǎn)3(Wnt3)和含BED結(jié)構(gòu)域的鋅指4(Zbed4)，其中所述作用劑不是miR-135，從而治療所述醫(yī)學(xué)病況。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，醫(yī)學(xué)病況選自雙相型障礙、抑郁癥、重性抑郁癥、焦慮癥、應(yīng)激、疲勞、認(rèn)知功能受損、驚恐發(fā)作、強(qiáng)迫行為、成癮性、社交恐怖癥、精神分裂癥、睡眠障礙、進(jìn)食障礙、生長障礙和生殖障礙。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，miR-135選自miR-135a和miR-135b。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，miR-135如SEQIDNO:58-62所示。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，miR-135包含SEQIDNO:192-193所示的miR-135*。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，miR-135包含選自修飾的糖-磷酸骨架和修飾的堿基的修飾。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，miR-135包含糖和核苷間鍵兩者中的修飾。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，修飾選自硫代磷酸酯(phosphorothioate)、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯、烷基膦酸酯、手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、硼羰磷酸酯(boranophosphate)、磷酸二酯、2'-O-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-氟、鎖定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和2'-氟阿糖寡核苷酸(FANA)。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，miR-135如SEQIDNO:194-209所示。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，雙相型障礙選自雙相I型、雙相II型、快速循環(huán)雙相型障礙、循環(huán)性氣質(zhì)和未分類雙相型障礙(BD-NOS)。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，miR-135選自SEQIDNO:58、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61和SEQIDNO:62。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，miR-135包含選自SEQIDNO:192和SEQIDNO:193的miR-135*。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，miR-135選自SEQIDNO:194、SEQIDNO:195、SEQIDNO:196、SEQIDNO:197、SEQIDNO:198、SEQIDNO:199、SEQIDNO:200、SEQIDNO:201、SEQIDNO:202、SEQIDNO:203、SEQIDNO:204、SEQIDNO:205、SEQIDNO:206、SEQIDNO:207、SEQIDNO:208和SEQIDNO:209。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，用于雙相型障礙治療的藥物選自鋰、抗精神病藥物和情緒穩(wěn)定藥物。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述方法另包括(c)當(dāng)在步驟(b)中觀察到較高miR-135表達(dá)水平時(shí)，則對人類受試者進(jìn)行治療。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述方法另包括在治療前從人類受試者中獲得生物樣品。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，心境障礙包含雙相型障礙。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，抗抑郁藥物選自選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑(SSRI)、三環(huán)類抗抑郁藥和去甲腎上腺素重?cái)z取抑制劑(NRI)。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，治療心境障礙的藥物選自鋰、抗精神病藥物和情緒穩(wěn)定藥物。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，生物樣品選自全血、血清、血漿和白細(xì)胞。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，心境障礙選自雙相型障礙、抑郁癥、重性抑郁癥、焦慮癥、應(yīng)激、疲勞、認(rèn)知功能受損、驚恐發(fā)作、強(qiáng)迫行為、成癮性、社交恐怖癥、精神分裂癥、睡眠障礙和進(jìn)食障礙。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，miR-135選自miR-135a或miR-135b。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，受試者是人類受試者。除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然與本文所述方法和材料類似或等同的方法和材料可用于實(shí)施或測試本發(fā)明的實(shí)施方案，但是下面描述了示例性方法和/或材料。萬一抵觸，則以專利說明書(包括定義)為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實(shí)施例只是說明性的，無意是必然限制性的。附圖簡述本文僅通過實(shí)例，參照附圖描述了本發(fā)明的一些實(shí)施方案。下面特別提及附圖詳情，要強(qiáng)調(diào)的是，所示細(xì)節(jié)舉例說明，并用于本發(fā)明的實(shí)施方案的說明性論述的目的。在這點(diǎn)上，隨附圖記錄的描述使本領(lǐng)域技術(shù)人員明白可如何實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方案。附圖中：圖1A-I表示5-羥色胺(5HT)神經(jīng)元中的微RNA表達(dá)。圖1A是5HT神經(jīng)元中差異表達(dá)的miRNA的示圖。Lowess歸一化值描述為對平均log強(qiáng)度繪制的斑點(diǎn)亮度的ln2倍數(shù)變化(MA圖)；圖1B是miR實(shí)時(shí)PCR中陣列結(jié)果的驗(yàn)證，表明與對照相比5HT神經(jīng)元中miR-375水平升高。n=55HT細(xì)胞，n=4非5HT。線條表示均值±s.e.m。**P=0.0071；圖1C是miR實(shí)時(shí)PCR中陣列結(jié)果的驗(yàn)證，表明與對照相比5HT神經(jīng)元中miR-135a水平降低。N=55HT細(xì)胞，n=4非5HT。**P=0.0075；圖1D是表示用5HT微陣列結(jié)果和選用于體外測試的列舉miR針對Slc6a4的交叉生物信息學(xué)預(yù)測的文氏圖(vandiagram)；圖1E是表示用5HT微陣列結(jié)果和選用于體外測試的列舉miR針對Htr1a的交叉生物信息學(xué)預(yù)測的文氏圖；圖1F是表示用5HT微陣列結(jié)果和選用于體外測試的列舉miR針對Tph2的交叉生物信息學(xué)預(yù)測的文氏圖；圖1G是表示用5HT微陣列結(jié)果和選用于體外測試的列舉miR針對MaoA的交叉生物信息學(xué)預(yù)測的文氏圖；圖1H是說明表明miR-181c和miR-27b可靶向Tph23'UTR的螢光素酶報(bào)道基因測定結(jié)果的圖；和圖1I是說明表明miR-27b可靶向Htr1aMaoA的螢光素酶報(bào)道基因測定結(jié)果的圖。圖2A-H表示Slc6a43'UTR(SEQIDNO:25)和Htr1a3'UTR(SEQIDNO:27)的微RNA打靶。圖2A是Slc6a43'UTR的miR-135a和miR-135b(分別為SEQIDNO:24和26)打靶的圖示；圖2B是Htr1a3'UTR的miR-135a和miR-135b(分別為SEQIDNO:24和26)打靶的圖示；圖2C是說明表明miR-135a和miR-135b可靶向Slc6a43'UTR的螢光素酶報(bào)道基因測定結(jié)果的圖。螢光素酶測定數(shù)據(jù)表示歸一化至用上述基因的3’UTR和空載體或過量表達(dá)特定miR的載體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中的共轉(zhuǎn)染的螢火蟲螢光素酶報(bào)道基因的活性的海腎螢光素酶(renillaluciferase)活性。線條表示均值±s.e.m。*P=0.014，***P=0.0002，對于miR-16#p<0.0535，對于miR-27#P=0.0967；圖2D是說明螢光素酶報(bào)道基因測定結(jié)果的圖，表明了miR-135a、miR-135b、miR-335、miR-181C和miR-26a可靶向Htr1a3'UTR。***P<0.0001，**P=0.0029；圖2E是miR-135種子匹配的slc6a43'UTR保守性(SEQIDNO:27-41)的圖示；圖2F是miR-135的Htr1a3'UTR種子匹配(SEQIDNO:42-54)的圖示，表明種子1只出現(xiàn)小鼠3’UTR中，種子2是高度保守的；圖2G是說明slc6a43'UTR中miR-135種子匹配的突變阻斷miR-135a和miR-135b的阻抑物作用的圖。***P<0.0001，**P=0.0032；和圖2H是說明Htr1a3'UTR中的miR-135種子匹配單獨(dú)和兩個(gè)一起的突變的圖，表明miR-135b通過兩個(gè)種子匹配靶向Htr1a，而miR-135a只通過種子2靶向Htr1a。***P<0.0001。圖3A-F表示不同條件下的miR-135a和miR-135b水平。圖3A是說明在急性應(yīng)激后在RN中miR-135a水平減量調(diào)節(jié)的圖。線條表示均值±s.e.m。(0組中n=8，90分鐘組中n=10，24小時(shí)組中n=9)，***P<0.0001，*P=0.0357；圖3B是說明在急性應(yīng)激后在RN中miR-135b水平減量調(diào)節(jié)的圖。***P<0.0001，**P=0.0055；圖3C是說明獨(dú)立于小鼠是否暴露于社交失敗在急性和慢性丙米嗪給藥后在RN中miR-135a水平增量調(diào)節(jié)的圖。(對照慢性鹽水和對照慢性丙米嗪中n=8，急性丙米嗪n=7，社交失敗慢性鹽水n=11，社交失敗慢性丙米嗪中n=9)，**P=0.003；圖3D是說明不依賴小鼠是否暴露于社交失敗在急性和慢性丙米嗪給藥后在RN中miR-135b水平增量調(diào)節(jié)的圖。**P=0.0093；圖3E是說明在急性或慢性給予的SSRI而非NRI或鹽水后在RN中miR-135a水平升高的圖。(除急性鹽水n=7以外，每組n=8)***P<0.0001；圖3F是說明在急性或慢性給予SSRI或NRI后在RN中miR-135b水平不改變的圖。圖4A-H表示miR-135b體內(nèi)過量表達(dá)。圖4A是用于過量表達(dá)miR-135b的慢病毒的示意圖；圖4B是說明表明成年小鼠背縫核(DRN)中miR-135b體內(nèi)過量表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的柱狀圖。線條表示均值±s.e.m。(n=5GFP注射，n=3miR-135OE)，P=0.0032；圖3C-D是通過顯示注射部位的GFP染色的DRN注射部位的圖示。(采用Paxinos的斷面圖)；圖4E是說明與對照小鼠相比在RN中過量表達(dá)miR-135b的小鼠中在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中不活動(dòng)時(shí)間減少的柱狀圖。(n=9對照，n=9miR-135)，第3分鐘P=0.0088，第4分鐘P=0.00330；圖4F是說明與對照小鼠相比在RN中過量表達(dá)miR-135b的小鼠在懸尾試驗(yàn)中不活動(dòng)時(shí)間減少的示圖。P=0.07351；圖4G-H是說明與對照相比在RN中過量表達(dá)miR-135b的小鼠在養(yǎng)育籠運(yùn)動(dòng)中無差異的柱狀圖。圖5表示在螢光素酶基因之后克隆的ADRb13'UTR。在Psicheck2質(zhì)粒中的螢光素酶基因下游克隆的帶有4個(gè)miR-19結(jié)合位點(diǎn)的完整(上部)ADRb13'UTR和缺乏所有4個(gè)miR-19結(jié)合位點(diǎn)的ADRb13'UTR的突變體(底部)形式的圖示。圖6A-E表示miR-19b通過其3’UTR上的種子匹配靶向ADRb13’UTR；圖6A-B是說明在用(圖6A)GFP質(zhì)?；?圖6B)pre-miR-19b過量表達(dá)(OE)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后表達(dá)低水平的內(nèi)源miR-19的HT22細(xì)胞中測量的歸一化螢光素酶水平的柱狀圖；圖6C-E是說明在表達(dá)高水平的內(nèi)源miR-19的HEK293T細(xì)胞中測量的歸一化螢光素酶水平的柱狀圖。用(圖6C)對照質(zhì)粒、(圖6D)miR-19b敲減(KD)探針或雜混探針(scrambledprobe)作為對照轉(zhuǎn)染，和(圖6E)用miR-19bmiArrest質(zhì)?；?qū)φ誱iArrest質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。***P<0.005。使海腎螢光素酶活性通過螢火蟲螢光素酶表達(dá)水平歸一化并表示為在對照治療存在下通過Adrb1-3'UTR(Adrb1-mut)的突變體形式實(shí)現(xiàn)的活性比。圖7A-D表示杏仁核(amygdale)中miRNA的差異表達(dá)。圖7A-B是說明在急性應(yīng)激后90分鐘杏仁核中miRNA的差異表達(dá)的圖示。圖7A說明agilent陣列結(jié)果。圖7b說明affymetrix陣列結(jié)果。歸一化值描述為對各條件(N=2，2)間的平均強(qiáng)度作圖的斑點(diǎn)亮度的log2比率(應(yīng)激與對照)。各miRNA的強(qiáng)度計(jì)算為各生物重復(fù)間的平均歸一化強(qiáng)度。miR-15a和miR-15b用紅色表示。不受應(yīng)激方案影響的miR-124(一種充分證實(shí)的神經(jīng)元標(biāo)志物)以白色表示；圖7C說明miR-15a和miR-15b在促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素1型受體3'UTR上具有半保守的種子匹配[CRHR1，改編自targetscan(dot)org]；圖7D是說明在用miR-15b-EGFP過量表達(dá)質(zhì)?；騁FP表達(dá)質(zhì)粒和由CRFR1-3'UTR控制的螢光素酶報(bào)道基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞中測量的螢光素酶活性的柱狀圖。使海腎螢光素酶活性通過螢火蟲螢光素酶表達(dá)水平歸一化。圖8是說明螢光素酶報(bào)道基因測定結(jié)果的柱狀圖，表明miR-182可能靶向Htr1a3'UTR。螢光素酶測定數(shù)據(jù)表示歸一化至用上述基因的3’UTR和空載體或過量表達(dá)特定miR的載體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染的螢火蟲螢光素酶報(bào)道基因活性的海腎螢光素酶活性。圖9是說明成年小鼠DRN中miR-182表達(dá)水平的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的柱狀圖，表明在慢性社交失敗后表達(dá)降低的趨勢。數(shù)據(jù)表示均值±SEM，n=7只對照，社交失敗組中18只小鼠，#=p=0.1。圖10是表示在2種算法中miR-182打靶的計(jì)算機(jī)生物信息學(xué)預(yù)測的文氏圖和在該預(yù)測中出現(xiàn)的對正常和病理性神經(jīng)元功能是高度相關(guān)的潛在靶基因的列表。圖11A-C表示miR-182的過量表達(dá)或敲減。圖11A是用于miR-182過量表達(dá)的慢病毒的示意圖；圖11B是說明表明N2A細(xì)胞系中體外miR-182過量表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的圖示；圖11C是用于miR-182敲減的慢病毒的示意圖。圖12A-D表示在NRI給藥后PFC中的miR-19水平。急性(一次)或慢性(持續(xù)18天)給予NRI瑞波西汀。值得注意的是，在急性給予NRI后，miR-19a和miR-19b水平在PFC中降低(分別為圖12A和圖12B)，但在慢性給予NRI后升高(分別為圖12C和圖12D)。圖13A-D表示經(jīng)歷社交失敗的小鼠的PFC和杏仁核中的miR-19水平。測量取自遭受社交失敗范例的小鼠杏仁核的樣品中的miR-19a和miR-19b水平。值得注意的是，PFC中的miR-19a和miR-19b水平在歸類為與對照小鼠相比對社交失敗“敏感的”小鼠中升高(分別為圖13A和圖13B)。miR-19水平還在歸類為與對照小鼠相比對社交失敗“敏感的”的小鼠杏仁核中升高(分別為圖13C和圖13D)。圖14表示靶向CB13’UTR的miRNA-19b。用CB13`UTR和過量表達(dá)miR-19b或GFP對照的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT-22細(xì)胞導(dǎo)致歸一化螢光素酶水平的50%降低。圖15A-B是小鼠腦冠狀面的示意圖。圖15A顯示腦中的幾種核，包括BLA(改編自Paxinos和Franklin的小鼠腦)；圖15B顯示腦中的CB1分布(改編自AllenBrainAtlaswwwdotmousedotbrain-mapdotorg/)。值得注意的是，BLA中富含CB1的這種分布是明顯的。圖16是基底外側(cè)杏仁核(BLA)中記憶鞏固的建議機(jī)制的示意圖。皮質(zhì)酮(CORT)與激活Gs-cAMP/PKA途徑以誘導(dǎo)內(nèi)源性大麻素(eCB)合成的尚未表征的膜結(jié)合的糖皮質(zhì)激素受體(mbGR)結(jié)合。內(nèi)源性大麻素釋放到突觸中，它們在其中與在γ-氨基丁酸能末稍上與CB1受體結(jié)合，抑制GABA釋放。GABA釋放的這種抑制解除對去甲腎上腺素(NE)釋放的抑制并提高突觸后β-腎上腺素受體的NE激活，增強(qiáng)不良情緒記憶的鞏固。圖17A-B說明RISC復(fù)合物中的Ago2。圖17A是介導(dǎo)miRNA和mRNA之間的相互作用的RISC復(fù)合物中的Ago2的示意圖；圖17B說明用抗Ago2抗體進(jìn)行的蛋白質(zhì)印跡分析。該IP對Ago2蛋白有特異性，如當(dāng)比較與Ago2抗體沉淀一次和與IgG1對照沉淀一次的全腦樣品時(shí)所見。值得注意的是，對與IgG1對照沉淀的樣品未檢出Ago2蛋白。圖18A-D表示社交回避試驗(yàn)。將小鼠單獨(dú)放入迷宮3分鐘使之習(xí)慣(圖18A和圖18B)，記錄其運(yùn)動(dòng)并作圖。在3分鐘后，將新的ICR小鼠放入緊鄰受測小鼠的室中(圖18C和圖18D)，再次記錄受測小鼠的運(yùn)動(dòng)并作圖。圖19A表示在陣列中增量調(diào)節(jié)的選定miRNA的熱點(diǎn)圖。圖19B表示在陣列中減量調(diào)節(jié)的選定miRNA的熱點(diǎn)圖。圖20A-B表示來自微陣列結(jié)果的miR-15a(圖20A)和FKBP5(圖20B)的log2表達(dá)。各紅色小點(diǎn)是指陣列的一個(gè)重復(fù)。對照組(CNT)有4個(gè)重復(fù)，“敏感的”組(SUSC)有3個(gè)重復(fù)，“適應(yīng)性強(qiáng)的”組(RESIL)有3個(gè)重復(fù)。黑色線條表示各組中重復(fù)的均值。圖20C表示小鼠FKBP5的3’UTR序列(獲自targetscan.org)。圖21A-B表示在社交失敗后與對照小鼠相比“敏感的”小鼠的杏仁核miR-15a(圖21A)和FKBP5(圖21B)的水平。值得注意的是，在遭受社交失敗并稱為“敏感的”小鼠的杏仁核中miR-15a水平升高(圖21A)。在遭受社交失敗并稱為“敏感的”小鼠的杏仁核中FKBP5水平降低(圖21B)。圖22是各帶有單一miRNA-15結(jié)合位點(diǎn)的Stx1a、Sgk1和Adrb2的3'UTR的示意圖。圖23表示與對照小鼠相比在遭受社交失敗的小鼠的杏仁核miR-181水平。值得注意的是，miR-181水平在遭受社交失敗的小鼠杏仁核中升高。圖24表示代表miR-181和谷氨酸受體的交叉生物信息學(xué)預(yù)測的文氏圖。圖25是miR-181的6個(gè)潛在靶標(biāo)的完整3'UTR的示意圖。圖26表示在應(yīng)激后在中縫核中miR182的表達(dá)水平。值得注意的是，如實(shí)時(shí)PCR測量的，當(dāng)在應(yīng)激后24小時(shí)測試時(shí)，急性30分鐘制動(dòng)應(yīng)激導(dǎo)致RN中miR182的表達(dá)水平降低。**=P<0.01；各組中n=8。圖27-29表示螢光素酶報(bào)道基因測定的結(jié)果，表明miR182靶向DSCAM、L1CAM和TSNAX3'UTR。圖27說明螢光素酶測定的數(shù)據(jù)，描述了歸一化至用上述基因的3’UTR和空載體或過量表達(dá)特定miR的載體轉(zhuǎn)染的N2a細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染的螢火蟲螢光素酶報(bào)道基因的活性的海腎螢光素酶活性。L1cam(圖28)和Tsnax(圖29)3'UTR中miR182種子匹配的突變阻斷miR182的抑制作用(represoriceffect)。線條表示均值±s.e.m。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖30A-E表示體外和體內(nèi)miR135KD的驗(yàn)證。圖30A-B說明螢光素酶報(bào)道基因測定的結(jié)果，表明Htr1a(圖30A)和slc6a4(圖30B)的miR135打靶被miR135bKD構(gòu)建體阻斷；圖30C是miR135bKD和對照病毒載體的示意圖；圖30D-E是DRN注射部位的圖示(圖30D，采用Paxinos)，圖30E是用miR135KD慢病毒感染的DRN的GFP染色。圖31A-G表示miR135KD小鼠中焦慮樣行為增加和對SSRI的反應(yīng)減弱。圖31A說明在曠場試驗(yàn)中miR135KD小鼠的行為與對照小鼠的相似；圖31B說明在高架十字迷宮(elevatedpulsemaze)中與對照小鼠相比miR135KD小鼠中的焦慮樣行為增加；圖31C說明在明暗轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中與對照小鼠相比，miR135KD小鼠在基礎(chǔ)應(yīng)激條件下但不在急性應(yīng)激后在明室花費(fèi)較多時(shí)間；圖31D說明與對照小鼠相比，miR135KD小鼠在基礎(chǔ)應(yīng)激條件下但不在急性應(yīng)激后到訪明室更多次；圖31E說明與對照小鼠相比，miR135KD小鼠在基礎(chǔ)應(yīng)激條件下但不在急性應(yīng)激后在明室行走較小距離；圖31F說明在懸尾試驗(yàn)中于在基礎(chǔ)條件下和在給予SSRI后兩者中miR135KD小鼠和對照小鼠之間無差異，然而與兩組的基礎(chǔ)條件相比，在SSRI治療后觀察到不活動(dòng)時(shí)間減少(圖31F-G)。在兩組中通過SSRI減少不活動(dòng)時(shí)間，然而在試驗(yàn)的最后2分鐘與對照相比，miR135KD小鼠中的減少減緩。~=p<0.1*=p<0.05;**=p<0.01；***=p<0.001。各組中n=10-11。圖32是miR135小鼠誘導(dǎo)型過量表達(dá)系統(tǒng)的示意圖。表達(dá)在miR135a序列和GFP報(bào)道分子之前的stop兩側(cè)前加flox位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因小鼠。突變體轉(zhuǎn)基因小鼠只在5-HTePet陽性細(xì)胞中表達(dá)miR135a。圖33A-C表示在5-HT神經(jīng)元中過量表達(dá)miR135的小鼠系的驗(yàn)證。圖33A說明與對照小鼠相比在miR135OE小鼠的RN中miR135過量表達(dá)。圖33B-C說明miR135靶基因mRNA，Slc6a4(圖33B)和Htr1a(圖33C)兩者在miR135OE小鼠RN中減量調(diào)節(jié)。#=p<0.1*=p<0.05；n=4各組中。圖34A-E表示在社交失敗后在miR135OE小鼠中焦慮和抑郁樣行為減少。圖34A顯示在曠場試驗(yàn)中miR135OE小鼠的焦慮樣行為減少；圖34B顯示在明暗轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中與miR135OE小鼠的對照相比較少的焦慮樣行為；圖34C顯示與對照相比miR135OE小鼠在高架十字迷宮中焦慮樣行為減少；圖34D顯示在懸尾試驗(yàn)中與對照相比miR135OE小鼠趨于不活動(dòng)時(shí)間減少的傾向；圖34E顯示中在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中與對照相比miR135OE小鼠的不活動(dòng)時(shí)間減少。#=p<0.1，*=p<0.05，**=p<0.01，各組中n=7-11。圖35A-D說明5HT神經(jīng)元的微RNA“指紋”。(圖35A)測定5HT神經(jīng)元微RNA“指紋”的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖。切下ePet-EYFP小鼠胚胎后腦，F(xiàn)ACS分選成5HT-YFP陽性和YFP陰性細(xì)胞。使用Agilent微RNA微陣列比較來自2個(gè)群的miR表達(dá)；(圖35B-35D)通過實(shí)時(shí)PCR對細(xì)胞表型的驗(yàn)證，表明了與非5HT細(xì)胞相比，YFP(圖35B)和TPH2(圖35C)在5HT中顯著富集，并且GAD67(一種γ-氨基丁酸能標(biāo)志物)在非5HT細(xì)胞中顯著較高(圖35D)。線條表示均值±s.e.m。***P<0.001。圖36A-C說明miR-135變體的進(jìn)化保守性。(圖36A-C)miR-135a-1(圖36A)、miR-135a-2(圖36B)和miR-135b(圖36C)在整個(gè)進(jìn)化中是高度保守的，而用彩色突出顯示的成熟miR序列幾乎是完全保守的。數(shù)據(jù)修改自UCSC基因組瀏覽器(KentWJ，2002)。圖37A-G說明在抗抑郁藥治療后miR-135在成年小鼠RN中增量調(diào)節(jié)。(圖37A)成熟miR-135a和miR-135b之間的對比表明1個(gè)核苷酸差異；(圖37B)小鼠RN中miR-135a和miR-135b的表達(dá)水平；(圖37C)成年小鼠RN中若干miR的表達(dá)概況表明miR-135a的豐富性是miR-124的約1/5，是miR-16的1/2.5。線條表示均值±s.e.m；(圖37D)暴露于社交失敗的小鼠顯示社交回避增加，除非用慢性丙米嗪治療?；?dòng)比計(jì)算為在接近陌生小鼠地帶中所花的時(shí)間除以習(xí)慣期間在同一地帶所花時(shí)間乘以100。線條表示均值±s.e.m。*P<0.05；(圖37E和37F)在慢性(圖37E)或急性(圖37F)丙米嗪給藥后miR-135a水平在RN中增量調(diào)節(jié)，并且在暴露于慢性社交失敗方案后不改變。線條表示均值±s.e.m。**P<0.01；(圖37G)在急性或慢性給藥后，SSRI而非NRI或鹽水引起RN中miR-135a水平顯著升高。線條表示均值±s.e.m。***P<0.001。圖38A-M說明miR-135在5HT神經(jīng)元中的特異性過量表達(dá)引起對社交失敗的行為復(fù)原力(behavioralresiliency)。(圖38A)miR-135條件性過量表達(dá)小鼠模型的示意圖。使在miR-135a和GFP序列上游的轉(zhuǎn)錄STOP序列兩側(cè)加入loxP位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因小鼠與ePet-Cre重組酶小鼠雜交。雙重轉(zhuǎn)基因小鼠在5HT陽性細(xì)胞中特異性過量表達(dá)miR-135a。僅攜帶miR-135a的轉(zhuǎn)基因且無ePet-Cre轉(zhuǎn)基因的同窩小鼠(littermatemice)用作對照；(圖38B)與對照相比，在miR-135過量表達(dá)(OE)小鼠中，RN中的miR-135a表達(dá)水平增量調(diào)節(jié)達(dá)約2倍；(圖38C和38D)與對照同胞仔鼠相比，miR-135OE小鼠中miR-135靶基因Slc6a4(圖38C)和Htr1a(圖38D)mRNA減量調(diào)節(jié)。線條表示均值±s.e.m。#P<0.1；*P<0.05；(圖38E-38G)在明暗轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中，在“基礎(chǔ)”應(yīng)激條件下或在慢性社交失敗后對miR-135OE小鼠及其對照同胞仔鼠進(jìn)行了測試。在“基礎(chǔ)”條件下在基因型間未觀察到差異，然而，在慢性社交失敗后miR-135OE小鼠在光下渡過較多時(shí)間(圖38E)，較頻繁地到訪亮光室(圖38F)，并在光下行走較長距離(圖38G)；miR-135OE小鼠的行為表現(xiàn)在社交失敗方案后無顯著不同。相比之下，在社交失敗后在光暗試驗(yàn)的所有所測參數(shù)中，對照小鼠顯示焦慮樣行為增加。線條表示均值±s.e.m。*P<0.05，***P<0.001；(圖38H-38J)在高架十字迷宮試驗(yàn)中，與在“基礎(chǔ)”條件下測試的對照小鼠相比，暴露于社交失敗的對照小鼠在開放臂中花較少時(shí)間(圖38H)，具有較少的到訪次數(shù)(圖38I)，且行走較小距離(圖38J)。在miR-135OE組中，在“基礎(chǔ)”和應(yīng)激條件之間未觀察到顯著差異。線條表示均值±s.e.m。**P<0.01，***P<0.001；(圖38K和38L)在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中，當(dāng)在“基礎(chǔ)”應(yīng)激條件測試時(shí)，組間未觀察到顯著差異(圖38K)，然而，當(dāng)在慢性社交失敗后測試時(shí)，與對照同胞仔鼠相比，miR-135OE小鼠顯示不活動(dòng)減少(圖38L)。線圖表示均值±s.e.m。***p<0.001；(圖38M)在miR-135OE和對照同胞仔鼠間未觀察到自主活動(dòng)能力(locomotoractivity)的差異，通過在曠場試驗(yàn)中行走的總距離測量。線條表示均值±s.e.m。圖39A-N說明成年小鼠RN中miR-135的敲減引起焦慮樣行為增加和對抗抑郁藥的反應(yīng)減弱。(圖39A)“miR-135俘獲”結(jié)構(gòu)的示意圖；(圖39B)miR-135KD和對照病毒載體的示意圖；(圖39C)miR-135KD慢病毒感染在內(nèi)源表達(dá)這些基因和miR-135的RN46a細(xì)胞中提高Htr1a和Slc6a4mRNA表達(dá)水平；(圖39D)顯示注射部位的腦斷面圖，改編自Paxinos和Franklin小鼠腦圖集(Paxinos，1997)(左圖)和用miR-135KD慢病毒感染的成年小鼠的DRD中的GFP免疫染色；(圖39E-39H)在明暗轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中，與對照KD注射小鼠相比，miR-135KD小鼠在明室花較少時(shí)間(圖39E)，較少到訪(圖39F)，并行走較小距離(圖39G和39H)。線條表示均值±s.e.m。*P<0.05；(圖39I-39L)在高架十字迷宮試驗(yàn)中，miR-135KD小鼠顯示在開放臂中花較少時(shí)間(圖39I)、較少到訪(圖39J)并行走顯著較小距離(圖39K和39L)的傾向。線條表示均值±s.e.m。#P<0.1，*P<0.05；(圖39M)在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中，當(dāng)在“基礎(chǔ)”條件下測試時(shí)，miR-135KD小鼠在其不活動(dòng)時(shí)間上與對照小鼠無不同，然而當(dāng)在給予SSRI后30分鐘測試時(shí)，miR-135KD小鼠顯示不活動(dòng)時(shí)間增加，表明對抗抑郁藥的反應(yīng)減弱。線條表示均值±s.e.m。*p<0.05；***p<0.001；(圖39N)在miR-135KD和對照小鼠之間在自主活動(dòng)能力方面未觀察到明顯差異，通過在曠場試驗(yàn)中行走的總距離測量。線條表示均值±s.e.m。圖40A-O說明5HT神經(jīng)元中miR-135的過量表達(dá)改變腦中的5HT水平，并阻斷社交失敗誘導(dǎo)的5HT降低。(圖40A、40D、40G、40J、40M)在基礎(chǔ)條件下或在慢性社交失敗后miR-135OE5HT和對照小鼠腦的顯微切割部位的示意圖。PrL—緣前皮質(zhì)(prelimbiccortex)，BLA—基底外側(cè)杏仁核，CA1V—腹側(cè)海馬CA1，DRV—中縫背核腹側(cè)部，MnR—中縫正中核。采用自(Paxinos，1997)的斷面圖；(圖40B、40E、40H、40K、40N)在基礎(chǔ)應(yīng)激條件下，通過HPLC測量的不同腦部位的5HT水平顯示與對照相比miR-135OE小鼠的5HT水平降低。另外，與基礎(chǔ)應(yīng)激條件相比，在暴露于社交失敗的對照小鼠中5HT水平減量調(diào)節(jié)，在miR-135OE5HT小鼠中未觀察到作用；(圖40C、40F、40I、40L、40O)在基礎(chǔ)應(yīng)激條件下，與對照相比，計(jì)算為代謝物5HIAA水平與5HT水平之間的比率的5HT代謝在miR-135OE5HT小鼠中增量調(diào)節(jié)。此外，與來自相同基因型的對照小鼠相比，在暴露于慢性社交失敗的miR-135OE5HT中BLA、CA1V、DRV和MnR中的5HT代謝減弱。在PrL、DRV和MnR中，與基礎(chǔ)條件相比，在暴露于社交失敗的對照小鼠中5HT代謝增量調(diào)節(jié)。線條表示均值±s.e.m。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖41A-E說明人類抑郁患者血液中較低的miR-135水平。(圖41A)與健康對照的相比，人類抑郁患者全血中的miR-135a水平穩(wěn)固下降；(圖41B)miR-16血液水平在組間無明顯不同。線條表示均值±s.e.m。***P<0.001；(圖41C)用認(rèn)知行為療法(CBT)治療3個(gè)月的抑郁患者顯示全血miR-135a水平顯著升高；(圖41D)miR-16水平在所有患者組中相似。線條表示均值±s.e.m。*P<0.05；(圖41E)描述在正常條件(上圖)、抑郁(中圖)和給予抗抑郁藥(下圖)條件下miR-135參與調(diào)節(jié)5-羥色胺能突觸組分的建議模型的圖示。圖42A-L說明在“基礎(chǔ)”條件下和在慢性應(yīng)激條件之后miR-135OE小鼠RN結(jié)構(gòu)中的5HT水平。(圖42A、42D、42G、42J)在基礎(chǔ)條件下或在慢性社交失敗后來自miR-135OE5HT和對照小鼠腦的RN顯微切割部位的示意圖。DRD—中縫背核背側(cè)部分，DRI—中縫背核束間部分，DRVL—中縫背核腹外側(cè)部分，VLPAG—導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)腹外側(cè)；DRC—中縫背核尾側(cè)部分。采用自(PaxinosG.，1997)的斷面圖；(圖42B、42E、42H、42K)在基礎(chǔ)應(yīng)激條件下，與對照相比，miR-135OE-5HT小鼠中除DRVL以外所示全部腦區(qū)的5HT水平降低。另外，與基礎(chǔ)條件相比，在暴露于社交失敗的對照小鼠中5HT水平降低，在miR-135OE5HT小鼠中作用喪失；(圖42C、42F、42I、42L)在基礎(chǔ)應(yīng)激條件下，與對照相比，miR-135OE5HT小鼠中計(jì)算為代謝物5HIAA水平與5HT水平間的比率的5HT代謝增強(qiáng)。此外，與在基礎(chǔ)條件下測試的來自相同基因型的小鼠相比，在暴露于慢性社交失敗的miR-135OE5HT中所述全部區(qū)域的5HT代謝減弱。線條表示均值±s.e.m。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖43A-L說明在“基礎(chǔ)”條件下和在慢性應(yīng)激條件之后miR-135OE小鼠腦結(jié)構(gòu)中的5HT水平。(圖43A、43D、43G、43J)在基礎(chǔ)條件下或在慢性社交失敗后，來自miR-135OE5HT和對照小鼠腦的顯微切割部位的示意圖。IL—下邊緣皮質(zhì)(infralimbiccortex)，BNST—終紋床核，CeA—中央杏仁核，S—下托。采用自(PaxinosG.，1997)的斷面圖；(圖43B、43E、43H、43K)在基礎(chǔ)應(yīng)激條件下，與對照相比，miR-135OE-5HT小鼠中所述全部腦區(qū)的5HT水平降低。另外，與基礎(chǔ)條件相比，在暴露于社交失敗的對照小鼠中5HT水平降低，在miR-135OE5HT小鼠中作用喪失；(圖43C、43F、43I、43L)在基礎(chǔ)應(yīng)激條件下，與對照相比，在miR-135OE5HT小鼠中計(jì)算為代謝物5HIAA水平與5HT水平間的比率的5HT代謝增強(qiáng)。此外，與在基礎(chǔ)條件下測試的來自相同基因型的小鼠相比，在暴露于慢性社交失敗的miR-135OE5HT中所述全部區(qū)域的5HT代謝減弱。線條表示均值±s.e.m。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖44說明miR-135寡核苷酸的修飾。5’Ph說明5’磷酸化，而粗體下劃線說明2’O-甲基化。發(fā)明的具體實(shí)施方案的描述在其一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及微RNA，更具體但并非唯一地講涉及所述微RNA用于疾病、診斷、監(jiān)測和治療的用途。參照附圖和附圖說明，可更好地理解本發(fā)明的原理和操作。在詳細(xì)說明至少一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案之前，應(yīng)該了解本發(fā)明在其申請中并不限于以下說明中所描述的細(xì)節(jié)或者實(shí)施例中所例舉的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠有其它實(shí)施方案，或者能夠以各種方式實(shí)施或?qū)崿F(xiàn)。同樣，還應(yīng)了解本文所采用的措辭和術(shù)語是為了說明目的，不應(yīng)視為限制。之前已證實(shí)了5-羥色胺能活性失調(diào)和精神障礙(例如焦慮癥和抑郁癥)之間的關(guān)系，但尚未完全了解在這些病理基礎(chǔ)之上的分子機(jī)制。微RNA(miR)是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的一類小的RNA分子，并且在腦中極豐富。在將本發(fā)明付諸實(shí)施時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)特定的微RNA(miR)參與5-羥色胺(5HT)神經(jīng)膠質(zhì)相關(guān)基因的調(diào)節(jié)，因此參與調(diào)節(jié)與異常5-羥色胺水平有關(guān)的醫(yī)學(xué)病況例如精神障礙。如下文和隨附實(shí)施例部分所示，本發(fā)明人使用miR微陣列，測定了獲自5HT報(bào)道基因小鼠(ePET-YFP)的中縫核(RN)的5HT神經(jīng)元中的miR表達(dá)模式(參見隨附實(shí)施例部分中的表2A-B)。對獲自陣列的5-羥色胺能神經(jīng)元獨(dú)特的miR表達(dá)概況進(jìn)行生物信息學(xué)分析以鑒定推定靶向例如以下關(guān)鍵5-羥色胺能相關(guān)基因的miR：5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Slc6a4，圖1D)、5-羥色胺自身受體(Htr1a，圖1E)、色氨酸羥化酶2(Tph2，圖1F)和單胺羥化酶(MaoA，圖1G)。體外進(jìn)一步測試了這些基因的3'UTR的miRNA打靶，說明了特異性靶向并調(diào)節(jié)5HT神經(jīng)元基因的特定miR(例如miR-135)(參見圖1H-I和圖2C-D)。本發(fā)明人進(jìn)一步表明在急性應(yīng)激后(圖3A-D)和在用抗抑郁藥治療后在RN中miR-135表達(dá)水平改變(圖3E-F)。成年小鼠RN中體內(nèi)miR-135過量表達(dá)減少社交失敗后抑郁樣行為(圖4A-H)。此外，本發(fā)明人表明miR-182作為神經(jīng)元活性(通過Htr1a的直接抑制，圖8)和精神病理學(xué)行為(圖9)的調(diào)節(jié)劑和miR-15作為應(yīng)激反應(yīng)[通過CRH1R(圖7A-B)、FK506結(jié)合蛋白5(FKBP5)(圖21A-B)和Stx1a、Sgk1和Adrb2(圖22)的直接抑制]的調(diào)節(jié)劑的活性。本發(fā)明人還表明β腎上腺素能受體(Adrb1)和大麻素受體1(CB1)被miR-19特異性打靶。miR-19過量表達(dá)抑制Adrb1(圖6A-C)，而miR-19的敲減提高Adrb1表達(dá)(圖6D-E)。miR-19過量表達(dá)還抑制CB1(圖14)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了miR-181的靶標(biāo)。準(zhǔn)確地講，本發(fā)明人表明miR-181特異性地調(diào)節(jié)谷氨酸受體(圖24和25)?？傊?，這些結(jié)果證明miRNA或調(diào)節(jié)所述miRNA的序列(例如miR-135、miR-335、miR-181、miR-182、miR-26、miR-27、miR-15和miR-19等)作為治療形式的用途。在本發(fā)明人將本發(fā)明進(jìn)一步付諸實(shí)施時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)miR135可用作強(qiáng)力治療劑以治療雙相型障礙，其影響差不多4%的人。在本發(fā)明人將本發(fā)明進(jìn)一步付諸實(shí)施時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)miR-135在人類抑郁患者的血液中顯著減量調(diào)節(jié)(與健康對照相比)，并且在患者的精神病學(xué)評(píng)分改善后增量調(diào)節(jié)。實(shí)際上，發(fā)現(xiàn)miR-135是負(fù)責(zé)在正常條件下維持完整5-羥色胺能健康狀態(tài)(serotonergictone)且是腦對抗抑郁藥起反應(yīng)所必需的必需調(diào)節(jié)成分(參見圖41E中的圖解模型)。發(fā)現(xiàn)miR-135的水平升高抑制Slc6a4和突觸前Htr1a水平兩者，引起突觸間隙中的5HT增加，這與抑郁癥狀減少有關(guān)。本發(fā)明人進(jìn)行的進(jìn)一步生物信息學(xué)分析預(yù)測了與神經(jīng)精神障礙(包括雙相情感障礙)或鋰作用有關(guān)的miR135的新靶標(biāo)。這些靶標(biāo)因此可用作靶向神經(jīng)精神障礙的治療性干預(yù)。本發(fā)明的測定法進(jìn)一步提供用于針對精神病狀態(tài)篩選患者和監(jiān)測治療兩者的非侵入試驗(yàn)。總之，這些結(jié)果將miR-135歸類為用于其中連續(xù)監(jiān)測患者心理平衡是關(guān)鍵的精神病狀態(tài)(例如心境障礙)的診斷和管理的關(guān)鍵工具。因此，按照本發(fā)明的一方面，提供治療其中5-羥色胺水平的升高在有需要的受試者中是治療有益的醫(yī)學(xué)病況的方法，所述方法包括將編碼至少一種微RNA或其前體的外源多核苷酸給予受試者的細(xì)胞或在受試者的細(xì)胞中表達(dá)編碼至少一種微RNA或其前體的外源多核苷酸。按照具體的實(shí)施方案，對于治療其中5-羥色胺水平升高是治療有益的醫(yī)學(xué)病況，微RNA包含miR-135、miR-335、miR-26和miR-182。按照本發(fā)明的一方面，提供治療有需要的受試者的雙相型障礙的方法，所述方法包括給予受試者治療有效量的miR-135、其前體或編碼miR-135或其前體的核酸分子，從而治療雙相型障礙。按照本發(fā)明的另一方面，提供治療其中低的腎上腺素或去甲腎上腺素水平在有需要的受試者中是治療有益的醫(yī)學(xué)病況的方法，所述方法包括將編碼微RNA或其前體的外源多核苷酸給予受試者的細(xì)胞或在受試者的細(xì)胞中表達(dá)編碼微RNA或其前體的外源多核苷酸。按照具體的實(shí)施方案，對于治療其中低的腎上腺素或去甲腎上腺素水平是治療有益的醫(yī)學(xué)病況，微RNA包含miR-19。按照本發(fā)明的另一方面，提供治療其中低的促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(CRH)水平在有需要的受試者中是治療有益的醫(yī)學(xué)病況的方法，所述方法包括將編碼微RNA或其前體的外源多核苷酸給予受試者的細(xì)胞或在受試者的細(xì)胞中表達(dá)編碼微RNA或其前體的外源多核苷酸。按照具體的實(shí)施方案，對于治療其中低的促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(CRH)水平是治療有益的醫(yī)學(xué)病況，微RNA包含miR-15。按照本發(fā)明的另一方面，提供治療其中低的谷氨酸受體水平在有需要的受試者中是治療有益的醫(yī)學(xué)病況的方法，所述方法包括將編碼微RNA或其前體的外源多核苷酸給予受試者的細(xì)胞或在受試者的細(xì)胞中表達(dá)編碼微RNA或其前體的外源多核苷酸。按照具體的實(shí)施方案，對于治療其中低的谷氨酸受體水平是治療有益的醫(yī)學(xué)病況，微RNA包含miR-181。術(shù)語“治療”是指抑制或制止疾病、病癥或病況的發(fā)展和/或引起疾病、病癥或病況減輕、緩解或消退或防止在可能有疾病、病癥或病況的風(fēng)險(xiǎn)但尚未診斷出患有疾病、病癥或病況的受試者發(fā)生疾病、病癥或醫(yī)學(xué)病況。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，各種方法和測定法可用來評(píng)價(jià)疾病、病癥或病況的發(fā)展，同樣地，各種方法和測定法可用來評(píng)價(jià)疾病、病癥或病況的減輕、緩解或消退。本文所用術(shù)語“受試者”或“有需要的受試者”包括哺乳動(dòng)物，例如患有病理或有發(fā)生病理的風(fēng)險(xiǎn)的任何年齡的人類，男人或女人。本文所述短語“其中5-羥色胺水平升高是治療有益的醫(yī)學(xué)病況”是指其中5-羥色胺水平的升高可預(yù)防疾病或與之有關(guān)的醫(yī)學(xué)癥狀的發(fā)生或終止疾病發(fā)展或與之有關(guān)的醫(yī)學(xué)癥狀的疾病或病癥(如下文進(jìn)一步的詳細(xì)描述)。本文所用術(shù)語“5-羥色胺”是指單胺神經(jīng)遞質(zhì)[亦稱為5-羥基色胺(5-HT)]。5-羥色胺例如以CAS編號(hào)50-67-9給出。按照一個(gè)實(shí)施方案，提供提高突觸間隙中的5-羥色胺水平的方法，所述方法包括將編碼至少一種微RNA或其前體的外源多核苷酸給予受試者的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(例如5-羥色胺能神經(jīng)元)或在所述細(xì)胞中表達(dá)。本文所用術(shù)語“突觸間隙”是指電或化學(xué)信號(hào)通道從中穿過的2個(gè)神經(jīng)元之間的區(qū)域?！吧窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞”是指神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(例如少突膠質(zhì)細(xì)胞或星形細(xì)胞)。本文所用術(shù)語“5-羥色胺能神經(jīng)元”是指分泌5-羥色胺或能夠5-羥色胺重?cái)z取(即通過在其細(xì)胞表面上表達(dá)的5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的神經(jīng)元。其中5-羥色胺水平升高是治療有益的醫(yī)學(xué)病況可包括例如任何心境障礙，包括抑郁癥、重性抑郁癥、焦慮癥、應(yīng)激、疲勞、認(rèn)知功能受損、驚恐發(fā)作、強(qiáng)迫行為、成癮性、社交恐怖癥、精神分裂癥、睡眠障礙、食物相關(guān)障礙(例如進(jìn)食障礙)、生長障礙和生殖障礙。按照具體的實(shí)施方案，其中5-羥色胺水平升高是治療有益的醫(yī)學(xué)病況包含抑郁癥。按照具體的實(shí)施方案，其中5-羥色胺水平升高是治療有益的醫(yī)學(xué)病況包含雙相型障礙。本文所用術(shù)語“雙相型障礙”，亦稱雙相情感障礙、躁狂抑郁性障礙或躁狂抑郁癥，是指歸類為心境障礙的心理疾病。通常，患有雙相型障礙的個(gè)人經(jīng)歷異常高狀態(tài)的一次或多次發(fā)作，臨床上稱為躁狂癥。躁狂癥可以不同的嚴(yán)重性水平發(fā)生。在輕微的躁狂癥水平或“輕躁狂”下，個(gè)體可出現(xiàn)精力充沛、易激動(dòng)，并且可為高產(chǎn)的。當(dāng)躁狂癥變得更嚴(yán)重，則個(gè)體開始行為怪異和沖動(dòng)，常常因有關(guān)未來不現(xiàn)實(shí)的想法所致而作出不佳決定，并且可能很難入睡。在最嚴(yán)重的水平下，個(gè)體可能經(jīng)歷精神病。躁狂發(fā)作通常與抑郁的發(fā)作或癥狀交替，或表現(xiàn)躁狂癥和抑郁兩者的特征的混合發(fā)作。所述發(fā)作通常被正常狀態(tài)時(shí)期分隔。躁狂和抑郁發(fā)作可持續(xù)幾天到幾個(gè)月，但在一些患者中，抑郁癥和躁狂癥可快速交替，稱為快速循環(huán)。按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，雙相型障礙包括雙相型障礙的任何類型和雙相型障礙的任何形式和從屬形式，包括但不限于躁狂癥、急性躁狂癥、重度躁狂癥、輕躁狂、抑郁癥、中度抑郁癥、精神抑郁癥、重度抑郁癥、躁狂癥和/或抑郁癥發(fā)作、精神病/精神病癥狀(例如幻覺、妄想)、混合雙相狀態(tài)、雙相I型障礙、雙相II型障礙、快速循環(huán)雙相型障礙、循環(huán)性氣質(zhì)和/或未分類雙相型障礙(BD-NOS)。按照一個(gè)實(shí)施方案，治療雙相型障礙可通過給予受試者治療有效量的miR-135、其前體或編碼miR-135或其前體的核酸分子來實(shí)現(xiàn)。按照一個(gè)實(shí)施方案，治療雙相型障礙可通過給予受試者用于治療雙相型障礙的藥物來實(shí)現(xiàn)?？砂凑毡景l(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容使用的用于雙相型障礙治療的示例性藥物包括但不限于下文進(jìn)一步詳細(xì)描述的鋰、抗精神病藥物和情緒穩(wěn)定藥物。按照一個(gè)實(shí)施方案，提供治療有效量的miR-135、其前體或編碼miR-135或其前體的核酸分子用于制備經(jīng)鑒定用于治療有需要的受試者的雙相型疾病的藥物的用途。因此，按照一個(gè)實(shí)施方案，當(dāng)醫(yī)學(xué)病況是例如雙相型疾病、抑郁癥或焦慮癥等心境障礙時(shí)，微RNA是miR-135。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，例如雙相型疾病、抑郁癥或焦慮癥等心境障礙可能不一定與5-羥色胺有關(guān)。按照一個(gè)實(shí)施方案，提供治療其中5-羥色胺水平的升高在有需要的受試者中是治療有益的醫(yī)學(xué)病況的方法，所述方法包括給予受試者能夠減量調(diào)節(jié)選自以下miR-135靶基因的活性或表達(dá)的作用劑：腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1(Adcyap1或PACAP)；腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1受體1(Adcyap1r1)；腎上腺素能受體α2a(Adra2a)；錨蛋白3(ANK3)；活性調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(Arc)；RhoGTP酶激活蛋白6(Arhgap6)；激活轉(zhuǎn)錄因子3(Atf3)；β位點(diǎn)APP切割酶1(Bace1)；L型依賴電壓性鈣通道α1D亞基(Cacna1d)；細(xì)胞粘附分子3(Cadm3)；復(fù)蛋白1(Cplx1)；復(fù)蛋白2(Cplx2)；CUB和Sushi多個(gè)結(jié)構(gòu)域1(Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1(Csnk1g1)；雙皮層蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-結(jié)合RAS樣2(Diras2)；discs大同源物2(果蠅)(Dlg2)；ETS癌基因家族成員ELK1(Elk1)；fyn相關(guān)激酶(Frk)；巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶9(α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)(Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受體亞基β2(Gabrb2)；GATA結(jié)合蛋白3(Gata3)；生長激素促分泌素受體(Ghsr)；G蛋白偶聯(lián)受體3(Gpr3)；離子型谷氨酸受體AMPA3(α3)(GRIA3)；離子型谷氨酸受體紅藻氨酸3(Grik3)；G蛋白偶聯(lián)受體激酶5(Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超極化激活的環(huán)核苷酸門控鉀通道1(Hcn1)，超極化激活的環(huán)核苷酸門控K+2(Hcn2)，5-羥基色胺(5-羥色胺)受體1A(Htr1a)；肌醇單磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；鉀中/小電導(dǎo)鈣激活通道亞家族N成員3(KCNN3)；核周蛋白α3(輸入蛋白α4)(Kpna3)；髓鞘轉(zhuǎn)錄因子1樣(Myt1l)；核受體共激活蛋白2(Ncoa2)；N-Myc下游調(diào)節(jié)基因4(Ndrg4)；一氧化氮合酶1(神經(jīng)元)銜接蛋白質(zhì)(NOS1AP)；核受體亞家族3C組成員2(Nr3c2)；導(dǎo)蛋白G1(Ntng1)；核酪蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物1(Nucks1)；鈣調(diào)蛋白依賴性磷酸二酯酶1A(Pde1a)；cAMP特異性磷酸二酯酶1A(Pde4a)；磷酸二酯酶8B(Pde8b)；磷脂酶C，β1(Plcb1)；催乳素受體(Prlr)；RAB1B，成員RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相關(guān)蛋白R(shí)ap-2a(Rap2a)；類視黃醇相關(guān)孤兒受體β(Rorb)；sirtuin1(沉默交配型信息調(diào)節(jié)2同源物)1(Sirt1)；溶質(zhì)載體家族12(鉀/氯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員6(Slc12a6)；溶質(zhì)載體家族5(膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員7(Slc5a7)；溶質(zhì)載體家族6(5-羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員4(Slc6a4)；反式作用轉(zhuǎn)錄因子1(Sp1)；突觸小泡糖蛋白2b(Sv2b)；突觸核被膜1(編碼nesprin-1)(Syne1)；突觸結(jié)合蛋白I(Syt1)；突觸結(jié)合蛋白II(Syt2)；突觸結(jié)合蛋白III(Syt3)；轉(zhuǎn)化生長因子β受體II(Tgfbr2)；甲狀腺激素受體β(Thrb)；瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族C成員6(Trpc6)；囊泡相關(guān)膜蛋白2(Vamp2)；無翅相關(guān)MMTV整合位點(diǎn)3(Wnt3)和含BED結(jié)構(gòu)域的鋅指4(Zbed4)。按照具體的實(shí)施方案，作用劑不是miR-135。下面詳細(xì)描述了可按照本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容使用的作用劑(例如能夠減量調(diào)節(jié)miR-135靶基因的活性或表達(dá))。本文所述短語“其中低的腎上腺素或去甲腎上腺素水平是治療有益的醫(yī)學(xué)病況”是指其中降低腎上腺素或去甲腎上腺素的表達(dá)或活性可防止疾病或與之有關(guān)的醫(yī)學(xué)癥狀的發(fā)生或終止疾病進(jìn)展或與之有關(guān)的醫(yī)學(xué)癥狀的疾病或病癥(如下文進(jìn)一步的詳細(xì)描述)。本文所用術(shù)語“腎上腺素”是指激素和神經(jīng)遞質(zhì)(亦稱腎上腺素)。腎上腺素以例如CAS編號(hào)51-43-4中提供。本文所用術(shù)語“去甲腎上腺素”是指起激素和神經(jīng)遞質(zhì)作用的兒茶酚胺(亦稱降甲腎上腺素)。去甲腎上腺素以例如CAS編號(hào)(l)51-41-2(l)和138-65-8(dl)提供。其中低的腎上腺素或去甲腎上腺素水平是治療有益的醫(yī)學(xué)病況可包括例如應(yīng)激相關(guān)障礙、焦慮癥、記憶受損、心臟病況(例如心悸、心動(dòng)過速和心律失常)、頭痛、震顫、高血壓和急性肺水腫。本文所述短語“其中低的促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(CRH)水平是治療有益的醫(yī)學(xué)病況”是指疾病或病癥其中降低CRH的表達(dá)或活性可防止疾病或與之有關(guān)的醫(yī)學(xué)癥狀的發(fā)生或終止疾病進(jìn)展或與之有關(guān)的醫(yī)學(xué)癥狀(如下文進(jìn)一步的詳細(xì)描述)。本文所用術(shù)語“促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(CRH)”是指多肽激素和神經(jīng)遞質(zhì)(亦稱促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(CRF)或促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素)。CRH以例如NP_000747.1中給出。其中低的CRH水平是治療有益的醫(yī)學(xué)病況可包括例如應(yīng)激、抑郁癥、焦慮癥、應(yīng)激、疲勞、認(rèn)知功能受損、驚恐發(fā)作、強(qiáng)迫行為、成癮性、社交恐怖癥、睡眠障礙、食物相關(guān)障礙、生長障礙、生殖障礙和肥胖癥。本文所述短語“其中低的谷氨酸受體水平是治療有益的醫(yī)學(xué)病況”是指其中降低谷氨酸受體的表達(dá)或活性可防止疾病或與之有關(guān)的醫(yī)學(xué)癥狀的發(fā)生或終止疾病進(jìn)展或與之有關(guān)的醫(yī)學(xué)癥狀的疾病或病癥(如下文進(jìn)一步的詳細(xì)描述)。本文所用術(shù)語“谷氨酸受體”是指通常位于神經(jīng)元細(xì)胞膜上的突觸受體(例如Grm1、Grik3、Grm5、Gria2、Grik2和Grm7)。谷氨酸受體例如以NP_000822.2[谷氨酸受體離子型紅藻氨酸3(Grik3)]；NP_000817.2、NP_001077088.1、NP_001077089.1[谷氨酸受體離子型AMPA2(Gria2)]；NP_001159719.1、NP_068775.1、NP_786944.1[谷氨酸受體離子型紅藻氨酸2(Grik2)]；NP_000833.1、NP_001137303.1[代謝型谷氨酸受體5(Grm5)]；NP_000835.1、NP_870989.1[代謝型谷氨酸受體7(Grm7)]；NP_000829.2，NP_001107801.1[代謝型谷氨酸受體1(Grm1)]中給出。其中低的谷氨酸受體水平是治療有益的醫(yī)學(xué)病況可包括例如癲癇發(fā)作(例如癲癇)、亨廷頓舞蹈病、精神分裂癥、脆性X綜合征、廣泛性焦慮障礙和癌癥(例如黑素瘤)。本文所用術(shù)語“微RNA或其前體”是指起轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑作用的微RNA(miRNA)分子。微RNA通常從pre-miR(前微RNA前體)加工。Pre-miR是一類被RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄的、例如在轉(zhuǎn)染進(jìn)入培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)有效加工成為功能性miRNA的前體miRNA分子。Pre-miR可用來在通常不表達(dá)這種miRNA的細(xì)胞類型中誘導(dǎo)特定miRNA活性，因此在“(miRNA)功能獲取(gainof(miRNA)function)”實(shí)驗(yàn)中通過減量調(diào)節(jié)其表達(dá)來強(qiáng)調(diào)其靶標(biāo)的功能。存在miRNA登記處所列的所有已知miRNA的Pre-miR設(shè)計(jì)，并可容易地設(shè)計(jì)用于任何研究?？蓪⑽NA本身或由連接至核酸構(gòu)建體的前體分子編碼的微RNA給予細(xì)胞，如下文進(jìn)一步的描述。按照一個(gè)實(shí)施方案，該術(shù)語包括微RNA的任何類型，包括5prime(即miR)或3prime(即miR*)及其前體。本文所用術(shù)語“miR-135或其前體”意指包括miR-135的任何類型，包括miR-135a和miR-135b5prime(即miR-135)或3prime(即miR-135*)及其前體。示例性前體miR-135包括但不限于登錄號(hào)MI0000452、ENTREZGENE406925和SEQIDNO:58所示miR-135a-1；登錄號(hào)MI0000453、ENTREZGENE：406926和SEQIDNO:59所示miR-135a-2和登錄號(hào)MI0000810、ENTREZGENE：442891和SEQIDNO:60所示miR-135b。示例性成熟miR-135包括但不限于登錄號(hào)MIMAT0000428(SEQIDNO:61)所示miR-135a和登錄號(hào)MIMAT0000758(SEQIDNO:62)所示miR-135b。示例性成熟miR-135*包括但不限于登錄號(hào)MIMAT0004595(SEQIDNO:192)所示miR-135a*和登錄號(hào)MIMAT0004698(SEQIDNO:193)所示miR-135b*。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明教導(dǎo)內(nèi)容的微RNA(例如miR-135)可以結(jié)合、連接、調(diào)節(jié)、加工、干預(yù)、增加任何微RNA靶標(biāo)、使之穩(wěn)定和/或去穩(wěn)定。這類靶標(biāo)可以是任何分子，包括但不限于DNA分子、RNA分子和多肽，例如但不限于5-羥色胺相關(guān)基因，例如5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(即SERT或Slc6a4)、5-羥色胺抑制性受體1a(Htr1a)、色氨酸羥化酶2(Tph2)和單胺羥化酶(MaoA)；腎上腺素或去甲腎上腺素受體(腎上腺素能受體，例如Adr1)；腺苷酸環(huán)化酶1型(ADCY1)；CRH受體例如Crh1R；或任何其它分子，例如FK506結(jié)合蛋白5(FKBP5)、大麻素受體1(CB1)、唐氏綜合征細(xì)胞粘附分子(Dscam)、易位蛋白相關(guān)蛋白X(Tsnax)和細(xì)胞粘附分子L1(L1cam)；以及與應(yīng)激相關(guān)神經(jīng)精神障礙(例如雙相型障礙)有關(guān)的其它靶標(biāo)，包括下表1所列靶標(biāo)。表1：與應(yīng)激相關(guān)神經(jīng)精神障礙有關(guān)的miR-135的推定靶標(biāo)續(xù)表1。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的微RNA可通過各種數(shù)據(jù)庫鑒定，包括例如微RNA登記處(wwwdotsangerdotacdotuk/Software/Rfam/mirna/indexdotshtml)。本發(fā)明的方法可通過給予受試者微RNA(例如miR-135)或其效應(yīng)物或在受試者的細(xì)胞中表達(dá)編碼微RNA(例如miR-135)或其前體的外源核酸分子(即多核苷酸)來實(shí)現(xiàn)。術(shù)語“多核苷酸”是指核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的單鏈或雙鏈寡聚體或多聚體。該術(shù)語包括來源于天然存在的核酸分子(例如RNA或DNA)的多核苷酸和/或寡核苷酸；由天然存在的堿基、糖和共價(jià)核苷間鍵(例如骨架)組成的合成多核苷酸和/或寡核苷酸分子；以及具有非天然存在的部分(其類似地起相應(yīng)的天然存在的部分的作用)的合成多核苷酸和/或寡核苷酸。這類修飾的或取代的寡核苷酸因?yàn)樗栊再|(zhì)對于天然形式可能是優(yōu)選的，所需性質(zhì)例如細(xì)胞攝取增加、對核酸靶標(biāo)的親和力提高和在核酸酶存在下的穩(wěn)定性提高。本發(fā)明的多核苷酸的長度任選為100個(gè)核苷酸或更少、任選90個(gè)核苷酸或更少、任選80個(gè)核苷酸或更少、任選70個(gè)核苷酸或更少、任選60個(gè)核苷酸或更少、任選50個(gè)核苷酸或更少、任選40個(gè)核苷酸或更少、任選30個(gè)核苷酸或更少、例如29個(gè)核苷酸、28個(gè)核苷酸、27個(gè)核苷酸、26個(gè)核苷酸、25個(gè)核苷酸、24個(gè)核苷酸、23個(gè)核苷酸、22個(gè)核苷酸、21個(gè)核苷酸、20個(gè)核苷酸、19個(gè)核苷酸、18個(gè)核苷酸、17個(gè)核苷酸、16個(gè)核苷酸、15個(gè)核苷酸、任選介于12和24個(gè)核苷酸之間、任選介于5-15之間、任選介于5-25之間、更優(yōu)選約20-25個(gè)核苷酸。按照本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容設(shè)計(jì)的多核苷酸(包括寡核苷酸)可按照本領(lǐng)域已知的任何寡核苷酸合成方法產(chǎn)生，包括酶促合成和固相合成兩者。用于執(zhí)行固相合成的設(shè)備和試劑可市購獲自例如AppliedBiosystems。也可采用用于這類合成的任何任何其它方法；寡核苷酸的實(shí)際合成盡在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)，并且以下詳述的已確立的方法實(shí)現(xiàn)，例如：Sambrook,J.和Russell,D.W.(2001),"MolecularCloning:ALaboratoryManual"；Ausubel,R.M.等編輯(1994,1989),"CurrentProtocolsinMolecularBiology,"第I-III卷,JohnWiley&Sons,Baltimore,Maryland；Perbal,B.(1988),"APracticalGuidetoMolecularCloning,"JohnWiley&Sons,NewYork；andGait,M.J.,ed.(1984),"OligonucleotideSynthesis"；利用固相化學(xué)，例如氰基氨基亞磷酸酯接著脫保護(hù)，脫鹽，并通過例如自動(dòng)化trityl-on方法或HPLC純化。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可使用下文進(jìn)一步描述的表達(dá)載體以生物學(xué)方法產(chǎn)生包含RNA分子的多核苷酸?；蛘撸墒褂锰烊淮嬖诘暮塑账峄蛳率霾煌揎椀暮塑账幔曰瘜W(xué)方法合成包含RNA分子的多核苷酸。按照一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的多核苷酸是修飾的多核苷酸。多核苷酸可采用本領(lǐng)域已知的各種方法修飾。因此，可以合成本發(fā)明的多核苷酸以包括賦予所需特性的修飾。例如，修飾可提高穩(wěn)定性、與靶核酸的雜交熱力學(xué)、特定組織或細(xì)胞類型的打靶或例如通過依賴或不依賴胞吞的機(jī)制的細(xì)胞滲透性。修飾還可提高序列特異性，因此降低脫靶。下面更詳細(xì)地描述了化學(xué)修飾。按照一個(gè)實(shí)施方案，多核苷酸包含單一修飾。按照另一個(gè)實(shí)施方案，多核苷酸包含2、3、4、5或更多個(gè)修飾。例如，本發(fā)明的寡核苷酸或多核苷酸可包含由以3'-至-5'磷酸二酯鍵鍵合的嘌呤和嘧啶堿基組成的雜環(huán)核苷。優(yōu)選所用的寡核苷酸或多核苷酸是在骨架(例如糖-磷酸骨架)、核苷間鍵或堿基上被修飾的那些，如下文廣義描述的一樣。按照本發(fā)明這個(gè)方面使用的優(yōu)選的寡核苷酸或多核苷酸的具體實(shí)例包括含有修飾的骨架或非天然的核苷間鍵的寡核苷酸或多核苷酸。具有修飾的骨架的寡核苷酸或多核苷酸包括如以下所公開的保留骨架中的磷原子的那些：美國專利號(hào)4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,625,050和8,017,763以及美國專利申請?zhí)?0100222413，通過引用結(jié)合到本文中。按照一個(gè)實(shí)施方案，多核苷酸包含在核苷酸序列的5'端或3'端的磷修飾的核苷酸間鍵合。優(yōu)選的修飾寡核苷酸或多核苷酸骨架包括例如：硫代磷酸酯；手性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；氨基烷基磷酸三酯；甲基和其它烷基膦酸酯，包括3'-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯；次膦酸酯；氨基磷酸酯，包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯；硫羰氨基磷酸酯；硫羰烷基膦酸酯；硫羰烷基磷酸三酯；具有正常3'-5'鍵的硼羰磷酸酯、這些的2'-5'連接的類似物和其中相鄰的核苷單元對是3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'連接的反轉(zhuǎn)極性的那些；以及硼膦酸酯。還可使用上述修飾的各種鹽、混合鹽和游離酸形式。按照一個(gè)實(shí)施方案，修飾的多核苷酸在核苷酸序列的5'端或3'端的核苷酸間鍵合上包含硫代磷酸酯。按照一個(gè)實(shí)施方案，修飾的多核苷酸在核苷酸序列的5'端或3'端的核苷酸間鍵合上包含硼羰磷酸酯。按照一個(gè)實(shí)施方案，修飾的多核苷酸在核苷酸序列的5'端或3'端的核苷酸間鍵合上包含甲基膦酸酯。按照一個(gè)實(shí)施方案，修飾的多核苷酸在核苷酸序列的5'端或3'端的核苷酸間鍵合上包含磷酸二酯。按照一個(gè)實(shí)施方案，多核苷酸包含糖修飾(例如核糖修飾)。按照一個(gè)實(shí)施方案，多核苷酸包含相當(dāng)于核糖2位的修飾。按照一個(gè)實(shí)施方案，修飾的多核苷酸包含至少一個(gè)2'-修飾的核苷酸，例如2'-脫氧、2'-氟、2'-脫氧-2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、2'-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2'-O-DMAEOE)、2'-氟阿糖寡核苷酸(FANA)或2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)。按照一個(gè)實(shí)施方案，修飾的多核苷酸包含至少一個(gè)2'-O-甲基-修飾的核苷酸，而在一些實(shí)施方案中，修飾的多核苷酸的所有核苷酸都包括2'-O-甲基修飾。按照一個(gè)實(shí)施方案，修飾的多核苷酸包含修飾的核苷酸間鍵合和糖骨架修飾。按照一個(gè)實(shí)施方案，修飾的多核苷酸包含磷修飾的核苷酸間鍵合和糖骨架修飾(例如2'-修飾的核苷酸)。示例性修飾的miR-135多核苷酸包括但不限于SEQIDNO:194-209?；蛘?，在其中不包括磷原子的修飾寡核苷酸或多核苷酸骨架具有通過短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵形成的骨架。這些包括具有嗎啉代鍵(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲?；羌?；亞甲基甲?；土虼柞；羌?；含有烯烴的骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架的骨架和具有公開于以下美國專利號(hào)的混合N、O、S和CH2成分的其它骨架：5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439。可按照本發(fā)明使用的其它寡核苷酸或多核苷酸是在糖和核苷間鍵兩者中修飾的那些，即核苷酸單元的骨架被新的基團(tuán)取代。堿基單元保持與多核苷酸靶標(biāo)互補(bǔ)。這類寡核苷酸模擬物的實(shí)例包括肽核酸(PNA)。PNA寡核苷酸是指其中糖-骨架被含有酰胺的骨架(具體地講氨基乙基甘氨酸骨架)置換的寡核苷酸。堿基保留，并與骨架酰胺部分的氮雜-氮原子直接或間接連接。教導(dǎo)PNA化合物制備的美國專利包括但不限于美國專利號(hào)5,539,082、5,714,331和5,719,262；其每一個(gè)通過引用結(jié)合到本文中。可用于本發(fā)明的其它骨架修飾公開于美國專利號(hào)6,303,374。按照一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的多核苷酸可在與靶核酸無互補(bǔ)性的內(nèi)部(即非末端)區(qū)域的核苷酸具有化學(xué)修飾。例如，修飾的核苷酸可摻入形成凸出的miRNA的區(qū)域中。修飾可包括例如通過接頭與miRNA連接的配基。例如，修飾可生改進(jìn)多核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)或穩(wěn)定性，或改進(jìn)多核苷酸與靶核酸雜交性質(zhì)(例如雜交熱力學(xué))。在一些實(shí)施方案中，使摻入多核苷酸的凸出區(qū)或與之連接的修飾或配基的方向以占據(jù)凸出區(qū)的空區(qū)取向。例如，修飾可包括核酸鏈上修飾的堿基或糖或起嵌入劑作用的配基。這些優(yōu)選位于凸出部位。嵌入劑可為芳族的，例如多環(huán)芳族或雜環(huán)芳族化合物。多環(huán)嵌入劑可具有堆碼能力，并可包括具有2、3或4個(gè)稠環(huán)的系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，使摻入多核苷酸的凸出區(qū)或與之連接的修飾或配基的方向以占據(jù)凸出區(qū)的空區(qū)取向。這種方向有利于雜交性質(zhì)或多核苷酸的其它所需特性改進(jìn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸可包括氨基糖苷配基，這可使多核苷酸具有改進(jìn)的雜交性質(zhì)或改進(jìn)的序列特異性。示例性氨基糖苷包括糖基化聚賴氨酸；半乳糖苷化聚賴氨酸；新霉素B；妥布霉素；卡那霉素A和氨基糖苷的吖啶綴合物，例如Neo-N-吖啶、Neo-S-吖啶、Neo-C-吖啶、Tobra-N-吖啶和KanaA-N-吖啶。吖啶類似物的使用可增加序列特異性。例如，新霉素B對RNA具有比DNA高的親和力，但具有低的序列特異性。在一些實(shí)施方案中，氨基糖苷配基的胍類似物(胍基糖苷)與多核苷酸作用劑(polynucleotideagent)連接。在胍基糖苷中，氨基酸的胺基交換成胍基。胍類似物的連接可提高多核苷酸的細(xì)胞滲透性。可以設(shè)計(jì)并合成多核苷酸以包括非互補(bǔ)性區(qū)域(例如長為3、4、5或6個(gè)核苷酸的區(qū)域)，其兩側(cè)是充分互補(bǔ)性區(qū)域以與靶RNA形成雙鏈體(例如長為7、8、9、10或11個(gè)核苷酸區(qū)域)。對于核酸酶抗性和/或?qū)Π袠?biāo)的結(jié)合親和力提高，本發(fā)明的多核苷酸可包括2'-O-甲基、2'-氟、2'-O-甲氧基乙基、2'-O-氨基丙基、2'-氨基和/或硫代磷酸酯鍵。加入鎖定核酸(LNA)，例如加入其中核糖環(huán)被連接2’-O原子和4’-C原子的亞甲基橋、亞乙基核酸(ENA)例如2'-4'-亞乙基-橋接核酸和某些核堿基修飾例如2-氨基-A、2-巰基(例如2-巰基-U)、G-夾環(huán)(G-clamp)修飾“鎖定”的核酸類似物，還可增加對靶標(biāo)的結(jié)合親和力。在寡核苷酸骨架中加入吡喃糖還可降低內(nèi)核分離。可通過包括3'陽離子基團(tuán)，或通過使在末端具有3'-3'鍵的核苷反轉(zhuǎn)，進(jìn)一步修飾多核苷酸。在另一個(gè)備選方法中，3'端可用氨基烷基(例如3'C5-氨基烷基dT)封阻。其它3'綴合物可抑制3'-5'核酸外切。雖然不受理論束縛，但是3'綴合物(例如奈普生或布洛芬)可通過在空間上阻斷外切核酸酶與寡核苷酸的3'端結(jié)合來抑制核酸外切。甚至小的烷基鏈，芳基或雜環(huán)綴合物或修飾的糖(D-核糖、脫氧核糖、葡萄糖等)可阻斷3'-5'-外切核酸酶。5'端可用氨基烷基(例如5'-O-烷基氨基取代基)封阻。其它5'綴合物可抑制5'-3'核酸外切。雖然不受理論束縛，但是5'綴合物(例如奈普生或布洛芬)可通過在空間上阻斷外切核酸酶與寡核苷酸的5'端結(jié)合來抑制核酸外切。甚至小的烷基鏈、芳基或雜環(huán)綴合物或修飾的糖(D-核糖、脫氧核糖、葡萄糖等)可阻斷3'-5'-外切核酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸包括改進(jìn)打靶的修飾，例如本文所述打靶修飾。使單鏈寡核苷酸作用劑靶向特定細(xì)胞類型的修飾的實(shí)例包括糖類例如半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖；維生素例如葉酸；其它配基例如RGD和RGD模擬物；和小分子包括奈普生、布洛芬或其它已知的蛋白質(zhì)結(jié)合分子?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知方法，利用化學(xué)合成和/或酶促連接反應(yīng)構(gòu)建本發(fā)明的多核苷酸。例如，可使用天然存在的核苷酸或經(jīng)設(shè)計(jì)以提高分子的生物穩(wěn)定性或提高在多核苷酸和靶核酸間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性的不同修飾的核苷酸，來化學(xué)合成多核苷酸，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。本發(fā)明的寡核苷酸或多核苷酸還可包括堿基修飾或取代。本文所用的“未修飾的”或“天然”堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)?！靶揎椀摹眽A基包括但不限于其它合成和天然的堿基，例如：5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物；2-巰基尿嘧啶、2-巰基胸腺嘧啶和2-巰基胞嘧啶；5-鹵素尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-巰基尿嘧啶；8-鹵素、8-氨基、8-巰基、8-巰基烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤；5-鹵素，特別是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤；7-脫氮雜鳥嘌呤和7-脫氮雜腺嘌呤；以及3-脫氮雜鳥嘌呤和3-脫氮雜腺嘌呤。其它的修飾堿基包括公開于以下的修飾堿基：美國專利號(hào)3,687,808；Kroschwitz,J.I.編輯(1990),"TheConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering,"第858-859頁,JohnWiley&Sons；Englisch等(1991),"AngewandteChemie,"國際版,30,613；以及Sanghvi,Y.S.,"AntisenseResearchandApplications,"第15章,第289-302頁,S.T.Crooke和B.Lebleu編輯,CRCPress,1993。這類修飾的堿基可特別用于提高本發(fā)明的寡聚體化合物的結(jié)合親和力。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6和O-6-取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代顯示提高核酸雙鏈體穩(wěn)定性達(dá)0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.等(1993),"AntisenseResearchandApplications,"第276-278頁,CRCPress,BocaRaton)，并且是目前優(yōu)選的堿基取代，甚至更特別當(dāng)與2'-O-甲氧基乙基糖修飾組合時(shí)。按照一個(gè)實(shí)施方案，修飾的多核苷酸被進(jìn)一步修飾，使得與經(jīng)選擇改進(jìn)作用劑(例如膽固醇)的穩(wěn)定性、分布或細(xì)胞攝取的配基連接。因此，多核苷酸可被修飾以包括非核苷酸部分，例如膽固醇部分。非核苷酸部分(例如膽固醇部分)可與例如多核苷酸的3'端或5'端連接。按照具體的實(shí)施方案，本發(fā)明的miRNA多核苷酸具有SEQIDNO:58-94所示核酸序列(參見表1A)。表1A：miRN多核苷酸序列miRNA序列miR-15SEQIDNO:77-80miR-19SEQIDNO:72-76miR-26SEQIDNO:65-69miR-27SEQIDNO:81-84miR-135SEQIDNO:58-62miR-181SEQIDNO:85-94miR-182SEQIDNO:70-71miR-335SEQIDNO:63-64如上文所述和隨附實(shí)施例部分所示，微RNA是來源于特定前體(即pre-miRNA)的加工分子，可使用特定miRNA前體分子，實(shí)現(xiàn)特定miRNA功能的增量調(diào)節(jié)。按照具體的實(shí)施方案，miR-135包含miR-135a或miR-135b。按照具體的實(shí)施方案，本發(fā)明的前體miR-135多核苷酸具有SEQIDNO:58-60所示核酸序列。按照具體的實(shí)施方案，本發(fā)明的成熟miR-135多核苷酸具有SEQIDNO:61-62所示核酸序列。按照具體的實(shí)施方案，本發(fā)明的成熟miR-135*多核苷酸具有SEQIDNO:192-193所示核酸序列。還考慮了與miRNA及其前體同源的序列。同源性水平對于成熟miRNA應(yīng)相對高，但是在前體水平上允許更高的自由度(例如至少60%、70%、80%、85%、90%、95%或更高)，只要序列變化在發(fā)夾序列中，不在對應(yīng)于成熟miR的核酸區(qū)段中。通常將所述前體多核苷酸作用劑作為表達(dá)構(gòu)建體的一部分給予靶細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或心臟細(xì)胞)。在這種情況下，多核苷酸作用劑在能夠在以組成型或誘導(dǎo)型方式指導(dǎo)微RNA在靶細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或心臟細(xì)胞)中表達(dá)的順式作用調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)控制下連接在核酸構(gòu)建體中。本發(fā)明的微RNA多核苷酸作用劑的實(shí)例包括但不限于miR-15(例如GenBank登錄號(hào)NR_029485)、miR-19(例如GenBank登錄號(hào)NR_029489.1)、miR-26(例如GenBank登錄號(hào)NR_029500和NR_029499)、miR-27(例如GenBank登錄號(hào)NR_029501)、miR-135(例如GenBank登錄號(hào)NR_029677.1、NR_029678.1，NR_029893.1)、miR-335(例如GenBank登錄號(hào)NR_029899.1)、miR-181(例如GenBank登錄號(hào)NR_029611.1)和miR-182(例如GenBank登錄號(hào)NR_029614)。通常將所述前體多核苷酸作用劑作為表達(dá)構(gòu)建體的一部分給予靶細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、脈絡(luò)叢(CP)細(xì)胞、干細(xì)胞或分化的干細(xì)胞)。在這種情況下，多核苷酸作用劑連接到在能夠以組成型或誘導(dǎo)型方式指導(dǎo)微RNA在靶細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、CP細(xì)胞、干細(xì)胞或分化的干細(xì)胞)中表達(dá)的順式作用調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)的控制下的核酸構(gòu)建體中。神經(jīng)元細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于神經(jīng)元特異性烯醇化酶基因啟動(dòng)子、突觸蛋白啟動(dòng)子、增強(qiáng)型突觸蛋白(enhancedsynapsin)啟動(dòng)子、鈣調(diào)蛋白啟動(dòng)子和Thy1啟動(dòng)子。示例性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子包括膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動(dòng)子。脈絡(luò)叢特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于2型促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體啟動(dòng)子β剪接變體(CRFR2β)、G蛋白偶聯(lián)受體125(GPR125)啟動(dòng)子和運(yùn)甲狀腺素蛋白啟動(dòng)子。按照一個(gè)實(shí)施方案，啟動(dòng)子序列(例如脈絡(luò)叢特異性啟動(dòng)子)被置于核酸構(gòu)建體上的多核苷酸序列(例如miR-135多核苷酸序列)的3'，使得其表達(dá)是構(gòu)成型的，但是組織特異性的。按照另一個(gè)實(shí)施方案，使脈絡(luò)叢特異性啟動(dòng)子序列處于與核酸構(gòu)建體上的多核苷酸序列(例如miR-135多核苷酸序列)相對，使得其表達(dá)是組織特異性的，但還可以外源可調(diào)節(jié)的方式受到控制。為了確保目標(biāo)多核苷酸即在脈絡(luò)叢細(xì)胞中又以外源可控制的方式特異性地表達(dá)，可設(shè)計(jì)核酸構(gòu)建體，使得其包含編碼在脈絡(luò)叢特異性啟動(dòng)子控制下的反式激活蛋白的多核苷酸?？蓪⒍嗪塑账岵迦胨龊怂針?gòu)建體或其它在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的構(gòu)建體中。與誘導(dǎo)物組合的反式激活蛋白起調(diào)節(jié)來自誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)。適用于本發(fā)明的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子優(yōu)選為能夠指導(dǎo)多核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的應(yīng)答元件。合適的應(yīng)答元件可為例如四環(huán)素應(yīng)答元件(例如描述于Gossen和Bujard(Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-551,1992)；ectysone誘導(dǎo)型應(yīng)答元件(NoD等,ProcNatlAcadSciUSA.93:3346-3351,1996)；金屬離子應(yīng)答元件例如描述于Mayo等(Cell.29:99-108,19822)；Brinster等(Nature296:39-42，1982)和Searle等(Mol.Cell.Biol.5:1480-1489,1985)；熱激應(yīng)答元件例如描述于Nouer等(載于：HeatShockResponse,編輯Nouer,L.,CRC,BocaRaton,Fla.,第167-220,19911頁)；或激素應(yīng)答元件例如描述于Lee等(Nature294:228-232，1981)；Hynes等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2038-2042,19811)；Klock等(Nature329:734-736，1987)；以及Israel和Kaufman(Nucl.AcidsRes.17:2589-2604,1989)。優(yōu)選應(yīng)答元件為ectysone誘導(dǎo)型應(yīng)答元件，更優(yōu)選應(yīng)答元件為四環(huán)素應(yīng)答元件。心臟細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于心臟NCX1啟動(dòng)子和α-肌球蛋白重鏈(αMHC)啟動(dòng)子。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體還可包括使其適于在真核生物中復(fù)制和整合的其它序列(例如穿梭載體)。典型的克隆載體含有轉(zhuǎn)錄和翻譯起始序列(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子)和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子(例如多腺苷酸化信號(hào))。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可進(jìn)一步包括可與啟動(dòng)子序列相鄰或遠(yuǎn)離并且可在從其轉(zhuǎn)錄中起增量調(diào)節(jié)作用的增強(qiáng)子。增強(qiáng)子元件可刺激來自所連接的同源或異源啟動(dòng)子高達(dá)1,000倍的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子當(dāng)置于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游或上游時(shí)是有活性的。來源于病毒的許多增強(qiáng)子元件具有寬泛的宿主范圍，并且在多種組織中是有活性的。例如，SV40早期基因增強(qiáng)子適于許多細(xì)胞類型。適于本發(fā)明的其它增強(qiáng)子/啟動(dòng)子組合包括來源于多瘤病毒或人或鼠巨細(xì)胞病毒(CMV)和來自各種反轉(zhuǎn)錄病毒(例如鼠白血病病毒、鼠或勞斯肉瘤病毒和HIV)的長串聯(lián)重復(fù)序列(LTR)的那些。參見Gluzman，Y.和Shenk，T.編輯(1983).EnhancersandEukaryoticGeneExpression,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，其通過引用結(jié)合到本文中。還可將多腺苷酸化序列加入本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體中以提高可檢測部分表達(dá)的效率。對于準(zhǔn)確和有效的多腺苷酸化需要兩個(gè)不同的序列元件：位于多腺苷酸化位點(diǎn)下游的富集GU或U的序列和位于該位點(diǎn)11-30個(gè)核苷酸上游6個(gè)核苷酸的高度保守的序列，即AAUAAA。適于本發(fā)明的終止和多腺苷酸化信號(hào)包括來源于SV40的那些。除了已描述的實(shí)施方案以外，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體通?？珊杏岣呖寺『怂岬谋磉_(dá)水平或有利于攜帶重組DNA的細(xì)胞的鑒定的其它專門元件。例如，多種動(dòng)物病毒含有促進(jìn)病毒基因組在允許細(xì)胞類型中的染色體外復(fù)制的DNA序列。攜帶這些病毒復(fù)制子的質(zhì)粒以附加體形式復(fù)制，只要質(zhì)粒所攜帶的基因或宿主細(xì)胞基因組提供合適的因子。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可包括或不包括真核復(fù)制子。如果真核復(fù)制子存在，則載體能夠利用合適的選擇標(biāo)記在真核細(xì)胞中擴(kuò)增。如果構(gòu)建體不包含真核復(fù)制子，則附加型擴(kuò)增是不可能的。相反，重組DNA整合至工程改造細(xì)胞的基因組中，在其中啟動(dòng)子指導(dǎo)所需核酸表達(dá)?？墒褂煤线m的基因遞送載體/方法(轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等)和合適的表達(dá)系統(tǒng)，將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入本發(fā)明的靶細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或心臟細(xì)胞)中。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的實(shí)例包括但不限于可獲自Invitrogen的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41和pNMT81；可獲自Promega的pCI；可獲自Strategene的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV；可獲自Clontech的pTRES；及其衍生物。還可使用含有來自真核生物的病毒(例如反轉(zhuǎn)錄病毒)的調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體。SV40載體包括例如pSVT7和pMT2。來源于牛乳頭瘤病毒的載體包括pBV-1MTHA，來源于Epstein-Barr病毒的載體包括pHEBO和p2O5。其它示例性載體包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5和桿狀病毒pDSVE。表達(dá)構(gòu)建體也可以是病毒。病毒構(gòu)建體的實(shí)例包括但不限于腺病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、牛痘病毒載體、腺伴隨病毒載體、多瘤病毒載體、甲病毒載體、棒狀病毒載體、慢病毒載體和皰疹病毒載體。反轉(zhuǎn)錄病毒載體代表特別適用于本發(fā)明的載體類別。缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒常規(guī)用于將基因轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中(有關(guān)綜述參見Miller,A.D.(1990).Blood76,271))?？刹捎帽娝苤姆肿蛹夹g(shù)，構(gòu)建包含本發(fā)明的多核苷酸的重組反轉(zhuǎn)錄病毒?？沙シ崔D(zhuǎn)錄病毒基因組的一部分以賦予反轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制機(jī)器缺陷，然后復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒可被包裝到病毒體中，在采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的同時(shí)，可通過使用輔助病毒，將病毒體用來感染靶細(xì)胞。體外或體內(nèi)用于產(chǎn)生重組反轉(zhuǎn)錄病毒和用于用病毒感染細(xì)胞的方案可參見例如Ausubel等(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology(GreenePublishingAssociates,Inc.&JohnWiley&Sons,Inc.)。反轉(zhuǎn)錄病毒已用來將多種基因?qū)朐S多不同的細(xì)胞類型中，包括神經(jīng)元細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和骨髓細(xì)胞。按照一個(gè)實(shí)施方案，按照本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容使用慢病毒載體(反轉(zhuǎn)錄病毒載體的一種類型)。慢病毒載體由于其整合到非分裂細(xì)胞以及分裂細(xì)胞基因組中的能力而被廣泛用作載體。當(dāng)病毒進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，呈RNA形式的病毒基因組被反轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生DNA，所述DNA然后被病毒整合酶在隨機(jī)位置處插入基因組。載體(原病毒)保留在基因組中，當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，傳代到細(xì)胞子代中。出于安全理由，慢病毒載體從不攜帶其復(fù)制所需的基因。為了產(chǎn)生慢病毒，將若干質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到所謂的包裝細(xì)胞系中，通常為HEK293。一種或多種質(zhì)粒，統(tǒng)稱為包裝質(zhì)粒，編碼病毒體蛋白，例如衣殼和逆轉(zhuǎn)錄酶。另一種質(zhì)粒含有由載體遞送的遺傳物質(zhì)。它被轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生單鏈RNA病毒基因組，并且以ψ(psi)序列的存在為標(biāo)志。該序列用來把基因組包裝到病毒體中。用于在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或心臟細(xì)胞中引入和表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸序列的合適慢病毒載體的具體實(shí)例是慢病毒pLKO.1載體。可按照本發(fā)明這個(gè)方面使用的另一種合適的表達(dá)載體是腺病毒載體。腺病毒是廣泛研究且常規(guī)使用的基因轉(zhuǎn)移載體。腺病毒載體的關(guān)鍵優(yōu)勢包括分裂和靜息細(xì)胞相對高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、對各種上皮組織的天然向性和容易產(chǎn)生高滴度(Russel,W.C.(2000)JGenVirol81,57-63)。腺病毒DNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到核中，但不整合在其中。因此使被腺病毒載體誘變的危險(xiǎn)被降到最低，同時(shí)短期表達(dá)特別適于治療癌細(xì)胞。用于實(shí)驗(yàn)性癌癥治療的腺病毒載體描述于Seth等(1999)."Adenoviralvectorsforcancergenetherapy(用于癌癥基因療法的腺病毒載體),"第103-120頁,P.Seth編輯,Adenoviruses:BasicBiologytoGeneTherapy,Landes,Austin,TX)。合適的病毒表達(dá)載體還可以是將反轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒組分合并的嵌合腺病毒/反轉(zhuǎn)錄病毒載體。對于轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞，所述載體可能比傳統(tǒng)表達(dá)載體更有效(Pan等(2002).CancerLetts184,179-188))。可采用各種方法將本發(fā)明的核酸構(gòu)建體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。所述方法一般描述于Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborLaboratory,NewYork(1989,1992)；Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,Md.(1989)；Chang等,SomaticGeneTherapy,CRCPress,AnnArbor,Mich.(1995)；Vega等,GeneTargeting,CRCPress,AnnArborMich.(1995)；Vectors:ASurveyofMolecularCloningVectorsandTheirUses,Butterworths,BostonMass.(1988)和Gilboa等[Biotechniques4(6):504-512,1986]，包括例如用重組病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔和感染。另外，有關(guān)陽性-陰性選擇方法參見美國專利號(hào)5,464,764和5,487,992。當(dāng)通過病毒感染將本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入靶細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或心臟細(xì)胞)中時(shí)，用于感染的病毒劑量為至少103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015或更高pfu或病毒顆粒。為了克服血腦屏障，可如本文進(jìn)一步的描述通過脊髓(例如通過硬膜外導(dǎo)管)或通過在脈絡(luò)叢中表達(dá)，將本發(fā)明的構(gòu)建體直接給予腦(通過腦室)、嗅球(通過鼻內(nèi)給藥)?；蛘?，可使用基于脂質(zhì)的系統(tǒng)將這些構(gòu)建體遞送至本發(fā)明的靶細(xì)胞(例如腦細(xì)胞，例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)中。脂質(zhì)體包括由脂質(zhì)雙層組成的包封一定體積的任何合成的(即非天然存在的)結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體包括乳液、泡沫、微團(tuán)、不溶性單層、液晶、磷脂分散體、片層等。脂質(zhì)體可通過本領(lǐng)域的任何已知方法制備[Monkkonen,J.等,1994,J.DrugTarget,2:299-308；Monkkonen,J.等,1993,Calcif.TissueInt.,53:139-145；LasicDD.,LiposomesTechnologyInc.,Elsevier,1993,63-105.(第3章)；WinterhalterM,LasicDD,ChemPhysLipids,1993年9月;64(1-3):35-43]。脂質(zhì)體可以是帶正電荷的、中性的或帶負(fù)電荷的。對于單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(MPS)攝取，脂質(zhì)體可以是疏水的，因?yàn)橹|(zhì)體膜的親水掩蔽(例如通過使用聚乙二醇連接的脂質(zhì)和親水顆粒)可能較不易于MPS攝取。任選脂質(zhì)體不包含空間上被屏蔽的脂質(zhì)，例如神經(jīng)節(jié)苷脂-GM1和磷脂酰肌醇，因?yàn)檫@些脂質(zhì)防止MPS攝取。脂質(zhì)體可以是單一脂質(zhì)層或可以是多層。如果治療劑是親水的，由于其較大的內(nèi)體積所致可使用大的單層脂質(zhì)體進(jìn)一步改進(jìn)治療劑的遞送。相反地，如果治療劑是疏水的，則可使用多層脂質(zhì)體進(jìn)一步改進(jìn)其遞送?；蛘?，治療劑(例如寡核苷酸)不能夠滲入脂質(zhì)雙層，因此可保持吸附在脂質(zhì)體表面。在這種情況下，增加脂質(zhì)體的表面積可進(jìn)一步改進(jìn)治療劑的遞送。本發(fā)明的合適的脂質(zhì)體是無毒脂質(zhì)體，例如由磷脂酰-膽堿磷酸甘油和膽固醇制備的那些。所使用的脂質(zhì)體的直徑范圍可為0.1-1.0微米。然而，還可使用適于被吞噬細(xì)胞吞噬的其它大小范圍。對于確定脂質(zhì)體的大小，可利用勻漿化，這取決于使大的脂質(zhì)體片段化成較小的脂質(zhì)體的剪切能?？煞奖愕厥褂玫膭驖{器包括由Boston，MA的Microfluidics生產(chǎn)的微流化器(microfluidizer)。在典型的勻漿化方法中，使脂質(zhì)體通過標(biāo)準(zhǔn)乳液勻漿器再循環(huán)直到觀察到所選擇的脂質(zhì)體?？赏ㄟ^常規(guī)激光束粒度識(shí)別，監(jiān)測粒度分布。使脂質(zhì)體通過小孔聚碳酸酯膜或非對稱陶瓷膜壓出是用于使脂質(zhì)體大小減小到相對十分明確的大小分布的有效方法。通常，將混懸液通過膜循環(huán)一次或多次直到達(dá)到所需脂質(zhì)體大小分布。可將脂質(zhì)體從較小的孔膜中成功地壓出以達(dá)到脂質(zhì)體大小的逐步減小?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的任何方法將微RNA多核苷酸作用劑(miR-135或其前體)摻入脂質(zhì)體中。例如，可將微RNA多核苷酸作用劑(miR-135或其前體)包封在脂質(zhì)體內(nèi)。或者，可使其吸附在脂質(zhì)體的表面。可用于將藥劑摻入本發(fā)明的脂質(zhì)體中的其它方法是描述于以下文獻(xiàn)的那些：Alfonso等[Thescienceandpracticeofpharmacy,MackPublishing,EastonPa,第19版,(1995)]和Kulkarni等[J.Microencapsul.1995,12(3)229-46]。用于本發(fā)明方法的脂質(zhì)體可跨越血液屏障。因此，按照一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的脂質(zhì)體在其膜部分中不包含血液屏障打靶多糖(例如甘露糖)。任選本發(fā)明的脂質(zhì)體在其使脂質(zhì)體靶向血液屏障上的受體的膜部分中不包含肽。所述肽的實(shí)例包括但不限于運(yùn)鐵蛋白、胰島素、IGF-1、IGF-2抗運(yùn)鐵蛋白受體抗體、抗胰島素受體抗體、抗IGF-1受體抗體和抗IGF-2受體抗體。為了確定特別適宜本發(fā)明的脂質(zhì)體，可進(jìn)行篩選測定法，例如美國專利申請?zhí)?0040266734和美國專利申請?zhí)?0040266734以及Danenberg等，Journalofcardiovascularpharmacology2003，42:671-9；Circulation2002，106:599-605；Circulation2003，108:2798-804的測定法?？砂凑毡景l(fā)明這個(gè)方面使用的其它非脂質(zhì)型載體包括但不限于聚賴氨酸、樹枝狀聚體(dendrimer)和Gagomers。不論所采用的方法或構(gòu)建體如何，如上文詳述，提供包含編碼微RNA的核酸構(gòu)建體的分離細(xì)胞。本文所用術(shù)語“分離的”是指至少部分從天然環(huán)境(例如人體)中分離出來。按照一個(gè)實(shí)施方案，提供包含表達(dá)至少一種微RNA或其前體的核酸構(gòu)建體的分離細(xì)胞，其中微RNA選自在順式作用調(diào)節(jié)元件的轉(zhuǎn)錄控制下的miR-135、miR-335、miR-15、miR-19、miR-26、miR-27、miR-181和miR-182。按照具體的實(shí)施方案，提供包含表達(dá)至少一種微RNA或其前體的核酸構(gòu)建體的分離的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其中微RNA選自在順式作用調(diào)節(jié)元件的轉(zhuǎn)錄控制下的miR-135、miR-335、miR-26和miR-182。按照具體的實(shí)施方案，提供包含表達(dá)在順式作用調(diào)節(jié)元件的轉(zhuǎn)錄控制下的miR-19或其前體的核酸構(gòu)建體的分離細(xì)胞。按照具體的實(shí)施方案，提供包含表達(dá)在順式作用調(diào)節(jié)元件的轉(zhuǎn)錄控制下的miR-15或其前體的核酸構(gòu)建體的分離細(xì)胞。按照具體的實(shí)施方案，細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或心臟細(xì)胞。按照具體的實(shí)施方案，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)元例如5-羥色胺能神經(jīng)元。將體內(nèi)(即在生物體或受試者內(nèi))或離體(例如在組織培養(yǎng)中)向本發(fā)明的細(xì)胞即靶細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或心臟細(xì)胞)提供微RNA或其前體。假如離體處理細(xì)胞，則所述方法優(yōu)選包括將所述細(xì)胞給回個(gè)體的步驟(離體細(xì)胞療法)。對于離體療法，細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞例如少突膠質(zhì)細(xì)胞、CP細(xì)胞、干細(xì)胞和/或分化的干細(xì)胞)優(yōu)選用本發(fā)明的作用劑(例如微RNA，例如miR-135或其前體或編碼微RNA例如miR-135或其前體的多核苷酸)處理，之后將其給予有需要的受試者。本發(fā)明的離體處理細(xì)胞的給予可采用任何合適的引入途徑實(shí)現(xiàn)，例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腎內(nèi)、胃腸道內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、肌內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)、硬膜外和直腸。根據(jù)目前優(yōu)選的實(shí)施方案，可使用靜脈內(nèi)、腎內(nèi)、胃腸道內(nèi)和/或腹膜內(nèi)給藥將本發(fā)明的離體處理細(xì)胞引入個(gè)體內(nèi)。本發(fā)明的細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞例如少突膠質(zhì)細(xì)胞、CP細(xì)胞、干細(xì)胞、分化的干細(xì)胞和/或心臟細(xì)胞)可來源于自體來源或同種異體來源例如人尸體或供體。因?yàn)楫?dāng)給予機(jī)體時(shí)非自體細(xì)胞可能引起免疫反應(yīng)，所以開發(fā)了若干方法以降低非自體細(xì)胞排斥的可能性。這些包括在移植前抑制受體免疫系統(tǒng)或把非自體細(xì)胞包封在免疫隔離的半透膜中。囊化技術(shù)一般被歸類為微囊化(包括小的球形載體)和大囊化(macroencapsulation)，包括較大的平板和中空纖維膜(Uludag,H.等(2000).Technologyofmammaliancellencapsulation(哺乳動(dòng)物細(xì)胞囊化的技術(shù)).AdvDrugDelivRev42,29-64)。制備微膠囊劑的方法是本領(lǐng)域已知的，包括例如公開于以下文獻(xiàn)的那些：Lu,M.Z.等(2000).Cellencapsulationwithalginateandalpha-phenoxycinnamylidene-acetylatedpoly(allylamine)(用藻酸鹽和α-苯氧基亞肉桂基-乙?；?烯丙胺)的細(xì)胞囊化).BiotechnolBioeng70,479-483；Chang,T.M.和Prakash,S.(2001)Proceduresformicroencapsulationofenzymes,cellsandgeneticallyengineeredmicroorganisms(用于酶、細(xì)胞和基因工程的微生物的微囊化方法).MolBiotechnol17,249-260；以及Lu,M.Z.等(2000).Anovelcellencapsulationmethodusingphotosensitivepoly(allylaminealpha-cyanocinnamylideneacetate)(一種使用光敏的聚(烯丙胺α-氰基亞肉桂基乙酸酯)的新的細(xì)胞囊化方法).JMicroencapsul17,245-521。例如，使用與2-羥基乙基甲基丙烯酸酯(HEMA)、甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)的三元共聚物殼復(fù)合的改性膠原，來制備微膠囊，產(chǎn)生厚為2-5μm的膠囊。所述微膠囊可用另外的2-5μm三元共聚物殼進(jìn)一步囊化，以賦予帶負(fù)電荷的平滑表面，并使血漿蛋白質(zhì)吸收降到最低(Chia,S.M.等(2002).Multi-layeredmicrocapsulesforcellencapsulation(用于細(xì)胞囊化的多層微膠囊).Biomaterials23,849-856。其它微膠囊基于藻酸鹽、海產(chǎn)多糖(Sambanis,A.(2003).Encapsulatedisletsindiabetestreatment(糖尿病治療中的囊化小島).DiabetesThechnolTher5,665-668)或其衍生物。例如，還可通過在氯化鈣存在下聚陰離子藻酸鈉和纖維素硫酸鈉和聚陽離子(亞甲基-胍)鹽酸鹽共聚物之間的聚電解質(zhì)絡(luò)合，制備微膠囊。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，當(dāng)使用較小的膠囊時(shí)，細(xì)胞囊化得到改進(jìn)。因此，當(dāng)膠囊大小從1mm減至400μm時(shí)，例如囊化細(xì)胞的質(zhì)量控制、機(jī)械穩(wěn)定性、擴(kuò)散性質(zhì)和體外活性改進(jìn)(Canaple,L.等(2002).Improvingcellencapsulationthroughsizecontrol(通過大小控制改進(jìn)細(xì)胞囊化).JBiomaterSciPolymEd13,783-96。此外，發(fā)現(xiàn)具有小至7nm受嚴(yán)格控制的孔徑、定制表面化學(xué)和精細(xì)微體系結(jié)構(gòu)的納米多孔生物膠囊成功地使細(xì)胞的微環(huán)境免疫隔離(參見：Williams,D.(1999).Smallisbeautiful:microparticleandnanoparticletechnologyinmedicaldevices(小則好：醫(yī)學(xué)裝置中的微粒子和納米粒技術(shù)).MedDeviceTechnol10,6-9；及Desai,T.A.(2002).Microfabricationtechnologyforpancreaticcellencapsulation(胰腺細(xì)胞囊化的微細(xì)加工技術(shù)).ExpertOpinBiolTher2,633-646)。?？膳c離體治療聯(lián)合使用的免疫抑制劑的實(shí)例包括但不限于甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢菌素、環(huán)孢菌素A、氯喹、羥氯喹、柳氮磺吡啶(sulphasalazopyrine)、金鹽、D-青霉胺、來氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滯素、英利昔單抗(REMICADE.sup.R)、依那西普、TNF.α.阻滯劑、靶向炎性細(xì)胞因子的生物制劑和非甾體抗炎藥(NSAID)。NSAID的實(shí)例包括但不限于乙酰水楊酸、水楊酸膽堿鎂、二氟尼柳、水楊酸鎂、雙水楊酯、水楊酸鈉、雙氯芬酸、依托度酸、非諾洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸、奈普生、萘丁美酮、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、托美丁、對乙酰氨基酚、布洛芬、Cox-2抑制劑和曲馬多。對于體內(nèi)療法，將作用劑(例如微RNA，例如miR-135、其前體或編碼微RNA或其前體的多核苷酸)本身或作為藥物組合物的一部分給予受試者。優(yōu)選配制所述組合物以允許通過血腦屏障(BBB)。用于藥物遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的常規(guī)方法包括：神經(jīng)外科策略(例如大腦內(nèi)注射或腦室內(nèi)輸注)；力圖開發(fā)BBB的內(nèi)源轉(zhuǎn)運(yùn)途徑之一的作用劑的分子操作(例如包含對內(nèi)皮細(xì)胞表面分子有親和力的轉(zhuǎn)運(yùn)肽以及本身不能夠跨越BBB的作用劑的嵌合融合蛋白的產(chǎn)生)；被設(shè)計(jì)成提高作用劑脂溶性的藥物策略(例如水溶性作用劑與脂質(zhì)或膽固醇載體的綴合)；以及通過高滲破壞(產(chǎn)生于甘露糖醇溶液輸注至頸動(dòng)脈或使用生物活性劑例如血管緊張素肽)短暫破壞BBB的完整性。用于藥物遞送至BBB之后的方法包括大腦內(nèi)植入(例如用針)和對流強(qiáng)化分布(convection-enhanceddistribution)。甘露糖醇可用于繞過BBB。同樣地，粘膜(例如鼻)給藥可用來繞過BBB?？蓪⑵渲信c合適的載體或賦形劑混合的藥物組合物中的本發(fā)明的微RNA多核苷酸作用劑給予生物。本文所用“藥物組合物”是指本文所述活性成分的一種或多種與其它化學(xué)組分例如生理上合適的載體和賦形劑的制品。藥物組合物的目的是利于將化合物給予生物。本文術(shù)語“活性成分”是指可負(fù)責(zé)生物作用的肽(例如miroRNA，例如miR-135、其前體或編碼微RNA或其前體的多核苷酸)。下文中，可互換使用的短語“生理上可接受的載體”和“藥學(xué)上可接受的載體”是指不會(huì)對生物產(chǎn)生明顯刺激性并且不會(huì)削弱所給予化合物的生物活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。佐劑包括在這些短語內(nèi)。本文術(shù)語“賦形劑”是指加到藥物組合物中以進(jìn)一步促進(jìn)活性成分給藥的惰性物質(zhì)。賦形劑的實(shí)例包括而不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和淀粉類型、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。藥物的配制和給藥技術(shù)可參見“Remington’sPharmaceuticalSciences”,MackPublishingCo.,Easton,PA,最新版本，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。合適的給藥途徑可包括例如口服、直腸、經(jīng)黏膜(尤其是經(jīng)鼻、經(jīng)腸)或胃腸外遞送，包括肌內(nèi)、皮下和髓內(nèi)注射以及鞘內(nèi)、直接腦室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射?；蛘撸梢园淳植糠绞蕉皇前慈矸绞浇o予藥物組合物，例如通過將藥物組合物直接注射到患者身體的組織區(qū)域。本發(fā)明的藥物組合物可通過本領(lǐng)域眾所周知的方法制備，例如通過常規(guī)的混合、溶解、制粒、制錠(dragee-making)、研碎、乳化、包膠囊、包封或凍干步驟。因此可使用一種或多種生理上可接受的載體，按常規(guī)方式配制用于本發(fā)明的藥物組合物，所述載體包括有助于將活性成分加工成可以藥用的制劑的賦形劑和助劑。合適的劑型取決于所選擇的給藥途徑。對于注射，可以在水溶液中，優(yōu)選在生理上相容的緩沖液(例如Hank溶液(Hank'ssolution)、林格液(Ringer'ssolution)或生理鹽緩沖液)中配制本發(fā)明的活性成分。對于經(jīng)黏膜給藥，在劑型中使用適于穿過屏障的滲透劑。這類滲透劑一般為本領(lǐng)域所知。對于口服給藥，藥物組合物可容易地通過將活性化合物與本領(lǐng)域眾所周知的藥學(xué)上可接受的載體相混合來制備。這類載體能夠使藥物組合物配制成片劑、丸劑、錠劑、膠囊劑、液體制劑、凝膠劑、糖漿劑、膏劑、混懸劑等，以用于患者口服攝取?？梢允褂霉腆w賦形劑，任選將所得混合物研磨，并對顆粒混合物進(jìn)行加工，如有需要在加入合適的助劑之后，得到片劑或錠劑芯，從而制備口服使用的藥物制劑。合適的賦形劑特別為填充劑，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制品，例如玉米淀粉、小麥淀粉、稻米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉；和/或生理上可接受的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如有需要，可以加入崩解劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，例如藻酸鈉。錠劑芯與合適的包衣材料一起提供。為此，可以使用濃糖溶液，它可任選含有阿拉伯樹膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普膠、聚乙二醇、二氧化鈦、清漆溶液(lacquersolution)和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。還可將染料或顏料加到片劑或錠劑包衣材料中以區(qū)分或鑒別活性化合物劑量的不同組合?？梢钥诜褂玫乃幬锝M合物包括由明膠制成的兩節(jié)式膠囊劑(push-fitcapsules)以及由明膠和增塑劑(例如甘油或山梨醇)制成的密封軟膠囊劑。兩節(jié)式膠囊劑可含有與以下成分相混合的活性成分：填充劑，例如乳糖；粘合劑，例如淀粉類；潤滑劑，例如滑石粉或硬脂酸鎂；以及任選穩(wěn)定劑。在軟膠囊劑中，可將活性成分溶于或懸浮于合適液體例如脂肪油、液狀石蠟或液態(tài)聚乙二醇中。另外，可加入穩(wěn)定劑。用于口服給藥的所有劑型都應(yīng)為適于所選擇的給藥途徑的劑量。于口腔給藥，組合物可以呈按常規(guī)方式配制的片劑或糖錠劑形式。對于通過經(jīng)鼻吸入給藥，本發(fā)明所用的活性成分適宜以氣霧劑噴霧提供的形式由使用合適拋射劑的加壓包裝或噴霧器遞送，合適的拋射劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在壓縮氣霧劑的情況下，可以通過提供閥門遞送計(jì)量的用量來確定劑量單位。用于分配器的諸如明膠的膠囊和針筒，可以制成裝有化合物和合適粉末基料(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物?？梢耘渲票疚乃鏊幬锝M合物用于胃腸外給藥，例如通過推注注射或連續(xù)輸注。用于注射的劑型可呈單位劑型，例如安瓿或多劑量容器，任選加入防腐劑。組合物可以是油性或水性溶媒中的混懸劑、溶液劑或乳劑，并可含有調(diào)配劑(formulatoryagent)，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。胃腸外給藥的藥物組合物包括水溶性形式的活性制劑的水溶液。另外，活性成分的混懸劑可制備成合適的油基或水基注射混懸劑。合適的親脂性溶劑或溶媒包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯、甘油三酯)或脂質(zhì)體。水性注射混懸劑可含有增加混懸劑粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選混懸劑還可含有合適的穩(wěn)定劑或增加活性成分溶解度的物質(zhì)供制備高度濃縮的溶液劑?；蛘?，活性成分可以是粉針劑的形式，用前與合適的溶媒(例如無菌無熱原水基溶液)重配。本發(fā)明的藥物組合物還可以使用例如常用的栓劑基料(例如可可脂或其它甘油酯)配制成直腸用組合物，例如栓劑或滯留型灌腸劑。適用于本發(fā)明這個(gè)方面的藥物組合物包括這樣的組合物，其中所包含的活性成分的有效量可達(dá)到預(yù)期目的。更準(zhǔn)確地講，治療有效量意指活性成分(例如微RNA)的量可有效地預(yù)防、減輕或改善疾病癥狀(例如心境障礙例如雙相型疾病)或延長待治療的受治療者的生存期。按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，miR-135的過量表達(dá)具有抗抑郁作用。治療有效量的確定盡在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力之內(nèi)，尤其是根據(jù)本文所提供的詳細(xì)的公開內(nèi)容。對于用于本發(fā)明方法的任何制劑，劑量或治療有效量可從體外實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中作出初步估計(jì)。例如，可以在動(dòng)物模型中調(diào)配劑量以獲得所需要的濃度或效價(jià)。可以用這類信息更準(zhǔn)確地確定在人體中的有益劑量。可通過體外標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法，在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中確定本文所述活性成分的毒性和治療功效。在調(diào)配人用劑量范圍時(shí)，可以利用從這些體外實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物研究中獲得的數(shù)據(jù)。劑量可根據(jù)所使用的劑型和所采用的給藥途徑而變化。確切的劑型、給藥途徑和劑量可由各名醫(yī)師考慮患者狀況后做出選擇(參見例如FinglE.等(1975),“ThePharmacologicalBasisofTherapeutics”,第1章,第1頁)?？梢詡€(gè)別調(diào)節(jié)用量和給藥間隔以提供誘導(dǎo)或抑制生物效應(yīng)的活性成分的足夠血漿水平(即最低有效濃度，MEC)。各種制劑的MEC可以不同，但是可以通過體外數(shù)據(jù)估計(jì)。要達(dá)到MEC所需要的劑量將取決于個(gè)體特征和給藥途徑?？刹捎脵z測實(shí)驗(yàn)來測定血漿濃度。根據(jù)待治療疾病的嚴(yán)重程度和反應(yīng)性，給藥可以是單次給藥或多次給藥，其中療程持續(xù)數(shù)天至數(shù)周，或者直到實(shí)現(xiàn)治愈，或者達(dá)到減輕疾病。待給予的組合物的量必然將取決于待治療的受治療者、疾病的嚴(yán)重程度、給藥方式、處方醫(yī)師的判斷等等。給藥的劑量和時(shí)機(jī)應(yīng)響應(yīng)各項(xiàng)變化情況的仔細(xì)和連續(xù)的監(jiān)測。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可在人類治療之前，測試通過本發(fā)明的作用劑存活下來的動(dòng)物模型。例如，可使用例如抑郁癥、應(yīng)激、焦慮癥的動(dòng)物模型，例如習(xí)得性無助模型(LH)、慢性輕度應(yīng)激(CMS)模型、社交失敗應(yīng)激(SDS)模型和母愛剝奪模型和睡眠剝奪模型。例如，雙相型疾病動(dòng)物模型包括例如具有突變體Polg(D181A)神經(jīng)元特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠[如Kato等,NeuroscienceandBiobehavioralReviews(2007)6(31):832-842的教導(dǎo)，通過引用結(jié)合到本文中]，并且可以使用充分確定的苯丙胺誘導(dǎo)的活動(dòng)過度[例如美國專利號(hào)6,555,585的教導(dǎo)]和氯胺酮誘導(dǎo)的活動(dòng)過度[例如Ghedim等,JournalofPsychiatricResearch(2012)46:1569-1575中的教導(dǎo)](通過引用予以結(jié)合)的躁狂癥大鼠模型。如有需要，本發(fā)明的組合物可以用包裝或分配裝置提供，例如經(jīng)FDA核準(zhǔn)的藥盒，藥盒可裝有一種或多種含有活性成分的單位劑型。例如，包裝可包括金屬箔或塑料薄片(plasticfoil)，例如泡罩包裝。包裝或分配裝置可隨附用藥說明書。包裝或分配裝置還可隨附由監(jiān)管藥品生產(chǎn)、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定格式的批文，該批文反映出組合物的形式已獲政府機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于人用或獸用給藥。例如，這類批文可以包括經(jīng)美國食品與藥物管理局(U.S.FoodandDrugAdministration)批準(zhǔn)的處方藥物的標(biāo)識(shí)或核準(zhǔn)藥品插頁的標(biāo)識(shí)。還可制備包含在相容的藥用載體中配制的本發(fā)明制劑的組合物，將其裝入合適容器中，貼上治療指定病況的標(biāo)簽，有關(guān)更多詳情見上文。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，除微RNA(例如miR-135或編碼miR-135的多核苷酸)以外，本發(fā)明的治療組合物還可包含用于抑郁癥、應(yīng)激、焦慮癥、睡眠剝奪等治療的其它已知藥物，例如但不限于選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑(SSRI)、5-羥色胺-去甲腎上腺素重?cái)z取抑制劑(SNRI)、去甲腎上腺素能與特異性5-羥色胺能抗抑郁藥(NaSSA)、去甲腎上腺素(去甲腎上腺素)重?cái)z取抑制劑(NRI)、去甲腎上腺素-多巴胺重?cái)z取抑制劑、選擇性5-羥色胺重?cái)z取增強(qiáng)劑、去甲腎上腺素-多巴胺去抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥(例如丙米嗪)、單胺氧化酶抑制劑(MAOI)。這些藥物可以單個(gè)包裝或以單獨(dú)包裝包括在制造品中。按照一個(gè)實(shí)施方案，除微RNA(例如miR-135或編碼miR-135的多核苷酸)以外，本發(fā)明的治療組合物還包含用于雙相型障礙治療的藥物。可按照本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容使用用于雙相型障礙治療的任何藥物或任何藥物組合，包括但不限于鋰(例如碳酸鋰、檸檬酸鋰、硫酸鋰)、抗精神病藥物(例如如下所述的典型抗精神病藥和非典型抗精神病藥)、情緒穩(wěn)定藥物(例如丙戊酸(VPA、丙戊酸鹽)、礦物質(zhì)、抗驚厥藥、抗精神病藥)和抗抑郁藥。可按照本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容使用的示例性典型抗精神病藥物包括但不限于低效價(jià)藥物：氯丙嗪(Largactil、Thorazine)、氯普噻噸(Truxal)、硫利達(dá)嗪(Mellaril)、美索達(dá)嗪和左美丙嗪；中效價(jià)藥物：洛沙平(Loxapac、Loxitane)、嗎茚酮(Moban)、奮乃靜(Trilafon)和替沃噻噸(Navane)；高效價(jià)藥物：氟哌啶醇(Haldol、Serenace)、氟奮乃靜(Prolixin)、氟哌利多、珠氯噻醇(Clopixol)、氟哌噻噸(Depixol)、丙氯拉嗪和三氟拉嗪(Stelazine)。另外，可以使用丙氯拉嗪(Compazine、Buccastem、Stemetil)和匹莫齊特(Orap)?？砂凑毡景l(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容使用的示例性非典型抗精神病藥物(亦稱為第二代抗精神病藥)包括但不限于氨磺必利(Solian)、阿立哌唑(Abilify)、阿塞那平(Saphris)、布南色林(Lonasen)、Bitopertin(RG1678)、Brexpiprazole(OPC-34712)、卡匹帕明(Prazinil)、氯卡帕明(Clofekton)、氯氮平(Clozaril)、Cariprazine(RGH-188)、伊潘立酮(Fanapt)、魯拉西酮(Latuda)、LY2140023、美哌隆(Buronil)、莫沙帕明(Cremin)、奧氮平(Zyprexa)、帕潘立酮(Invega)、哌羅匹隆(Lullan)、Pimavanserin(ACP-103)、喹硫平(Seroquel)、瑞莫必利(Roxiam)、利培酮(Risperdal)、舍吲哚(Serdolect)、舒必利(Sulpirid)、Vabicaserin(SCA-136)、齊拉西酮(Geodon)、佐替平(Nipolept)和Zicronapine(Lu31-130)?？砂凑毡景l(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容使用的示例性心境穩(wěn)定劑(moodstabilizer)包括但不限于礦物質(zhì)(例如鋰)；抗驚厥心境穩(wěn)定劑包括丙戊酸(Depakine)、雙丙戊酸鈉(Depakote)和丙戊酸鈉(Depacon、Epilim)、拉莫三嗪(Lamictal)、卡馬西平(Tegretol)、奧卡西平(Trileptal)、托吡酯(Topamax)、利魯唑(Rilutek)和加巴噴丁(Neurontin)；抗精神病藥(如上所述)；和食物補(bǔ)充劑(例如ω-3脂肪酸)?？砂凑毡景l(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容使用的示例性抗抑郁藥包括但不限于選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑(SSRI，例如西酞普蘭、依他普侖、氟西汀、氟伏沙明、帕羅西汀和舍曲林)；5-羥色胺-去甲腎上腺素重?cái)z取抑制劑(SNRI，例如地文拉法辛、度洛西汀、米那普侖和文拉法辛)；去甲腎上腺素能與特異性5-羥色胺能抗抑郁藥(例如米安色林和米氮平)；降腎上腺素(去甲腎上腺素)重?cái)z取抑制劑(NRI，例如托莫西汀、馬吲哚、瑞波西汀和維洛沙秦)；去甲腎上腺素-多巴胺重?cái)z取抑制劑(例如安非他酮)；選擇性5-羥色胺重?cái)z取增強(qiáng)劑(例如噻奈普汀)；去甲腎上腺素-多巴胺去抑制劑(NDDI例如gomelatine)；三環(huán)類抗抑郁藥(包括叔胺三環(huán)類抗抑郁藥和仲胺三環(huán)類抗抑郁藥)；及單胺氧化酶抑制劑(MAOI)。按照一個(gè)實(shí)施方案，抗抑郁藥物包含選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑(SSRI)、三環(huán)類抗抑郁藥和去甲腎上腺素重?cái)z取抑制劑(NRI)。按照具體的實(shí)施方案，抗抑郁藥物包含選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑(SSRI)。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可與本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容聯(lián)用的其它非藥物治療策略包括但不限于臨床心理學(xué)、電驚厥療法、非自愿院禁、光療法、精神療法、經(jīng)顱磁刺激和認(rèn)知行為療法。本發(fā)明人表明，miR-27的過量表達(dá)導(dǎo)致MaoA的抑制(參見下文實(shí)施例1)；miR-135的過量表達(dá)導(dǎo)致Slc6a4的抑制(參見下文實(shí)施例1)；miR-135、miR-335、miR-26、miR-181或miR-182的過量表達(dá)導(dǎo)致Htr1a的抑制(參見下文實(shí)施例1)；miR-19的過量表達(dá)導(dǎo)致Adr1的抑制(參見參見下文實(shí)施例2)和CB1的抑制(參見參見下文實(shí)施例3B)；miR-15的過量表達(dá)導(dǎo)致Crh1R的抑制(參見參見下文實(shí)施例4)和FKBP5的抑制(參見參見下文實(shí)施例4B)。因此，按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Slc6a4)基因的表達(dá)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)微RNA或其前體的活性或表達(dá)，其中微RNA選自miR-135和miR-335。本文所用術(shù)語“5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Slc6a4)”是指涉及從突觸間隙中重?cái)z取5-羥色胺的單胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)(亦稱SERT)。NP_001036.1給出示例性的Slc6a4。按照另一個(gè)實(shí)施方案，提供調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的5-羥色胺抑制性受體1a(Htr1a)基因的表達(dá)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的微RNA或其前體的活性或表達(dá)，其中微RNA選自miR-135、miR-335、miR-181、miR-182和miR-26。本文所用術(shù)語“5-羥色胺抑制性受體1a(Htr1a)”是指在突觸前神經(jīng)元中起自身受體和5-羥色胺釋放介導(dǎo)性抑制的作用的G蛋白偶聯(lián)受體。NP_000515.2給出示例性的Htr1a。按照另一個(gè)實(shí)施方案，提供調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的單胺羥化酶(MaoA)基因的表達(dá)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)miR-27或其前體的活性或表達(dá)。本文所用術(shù)語“單胺羥化酶(MaoA)”是指降解例如多巴胺、去甲腎上腺素和5-羥色胺等胺神經(jīng)遞質(zhì)的酶。NP_000231.1給出示例性的MaoA。按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的色氨酸羥化酶2(Tph2)基因的表達(dá)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的微RNA或其前體的活性或表達(dá)，其中微RNA選自miR-181和miR27。本文所用術(shù)語“色氨酸羥化酶2(Tph2)”是指5-羥色胺的生物合成中催化第一和限速步驟的酶。NP_NP_775489.2給出示例性的Tph2。按照另一個(gè)實(shí)施方案，提供調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或心臟細(xì)胞中的β腎上腺素能受體1(Adrb1)基因的表達(dá)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)miR-19或其前體的活性或表達(dá)。本文所用術(shù)語“β腎上腺素能受體1(Adrb1)”是指介導(dǎo)腎上腺素和去甲腎上腺素的生理作用的受體。NP_000675.1給出示例性的Adrb1。按照另一個(gè)實(shí)施方案，提供調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的β2腎上腺素能受體(Adrb2)基因的表達(dá)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)miR-15或其前體的活性或表達(dá)。本文所用術(shù)語“β2腎上腺素能受體(Adrb2)”是指與C類L型鈣通道Ca(V)1.2直接締合的受體。例如NP_000015.1中給出Adrb2。按照另一個(gè)實(shí)施方案，提供調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的CRH1型受體基因的表達(dá)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)miR-15或其前體的活性或表達(dá)。本文所用術(shù)語“CRH1型”是指結(jié)合促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(CRH)的受體。例如NP_001138618.1、NP_001138619.1、NP_001138620.1和NP_004373.2中給出CRH1型。按照另一個(gè)實(shí)施方案，提供調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的谷氨酸受體基因的表達(dá)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)miR-181或其前體的活性或表達(dá)。按照另一個(gè)實(shí)施方案，谷氨酸受體基因包含上文更詳細(xì)描述的代謝型谷氨酸受體1(Grm1)、谷氨酸受體離子型紅藻氨酸3(Grik3)、代謝型谷氨酸受體5(Grm5)、谷氨酸受體離子型紅藻氨酸2(Grik2)和代謝型谷氨酸受體7(Grm7)。按照另一個(gè)實(shí)施方案，提供調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的唐氏綜合征細(xì)胞粘附分子(Dscam)基因的表達(dá)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)miR-182或其前體的活性或表達(dá)。本文所用術(shù)語“唐氏綜合征細(xì)胞粘附分子(Dscam)”是指在神經(jīng)元自回避中起作用的細(xì)胞粘附分子。例如在NP_001380.2中給出Dscam。按照另一個(gè)實(shí)施方案，提供調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的細(xì)胞粘附分子L1(L1cam)基因的表達(dá)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)miR-182或其前體的活性或表達(dá)。本文所用術(shù)語“細(xì)胞粘附分子L1(L1cam)”是指神經(jīng)元細(xì)胞粘附分子。例如在NP_000416.1、NP_001137435.1、NP_076493.1中給出L1cam。按照另一個(gè)實(shí)施方案，提供調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的易位蛋白相關(guān)蛋白X(Tsnax)基因的表達(dá)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)miR-182或其前體的活性或表達(dá)。本文所用術(shù)語“易位蛋白相關(guān)蛋白X(Tsnax)”是指與易位蛋白特異性相互作用的蛋白質(zhì)。例如在NP_005990.1中給出Tsnax。按照另一個(gè)實(shí)施方案，提供調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的大麻素受體1(CB1)基因的表達(dá)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)miR-19或其前體的活性或表達(dá)。本文所用術(shù)語“大麻素受體1(CB1)”是指細(xì)胞膜受體(亦稱CNR1)。例如在NP_001153698.1、NP_001153730.1、NP_001153731.1、NP_057167.2、NP_149421.2中給出CB1。按照另一個(gè)實(shí)施方案，提供調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的FK506結(jié)合蛋白5(FKBP5)基因的表達(dá)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)miR-15或其前體的活性或表達(dá)。本文所用術(shù)語“FK506結(jié)合蛋白5(FKBP5)”是指與免疫抑制劑FK506和雷帕霉素特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。例如在NP_001139247.1、NP_001139248.1、NP_001139249.1、NP_004108.1中給出FKBP5。按照另一個(gè)實(shí)施方案，提供調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的突觸融合蛋白1a(Stx1a)基因的表達(dá)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)miR-15或其前體的活性或表達(dá)。本文所用術(shù)語“突觸融合蛋白1a(Stx1a)”是指神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白質(zhì)。例如在NP_001159375.1、NP_004594.1中給出Stx1a。按照另一個(gè)實(shí)施方案，提供調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的血清/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶(Sgk1)基因的表達(dá)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)miR-15或其前體的活性或表達(dá)。本文所用術(shù)語“血清/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶(Sgk1)”是指絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶。例如在NP_001137148.1、NP_001137149.1、NP_001137150.1、NP_005618.2中給出Sgk1。本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容考慮增量調(diào)節(jié)(即增加)或減量調(diào)節(jié)(即降低)前述基因的表達(dá)水平。本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容的基因表達(dá)的減量調(diào)節(jié)通常通過給予靶細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或心臟細(xì)胞)微RNA多核苷酸(如上文更詳細(xì)的描述)或在靶細(xì)胞中表達(dá)微RNA多核苷酸來進(jìn)行。按照具體的實(shí)施方案，當(dāng)調(diào)節(jié)(regulating)包括減量調(diào)節(jié)Slc6a4基因的表達(dá)時(shí)，則調(diào)整(modulating)包括增量調(diào)節(jié)miR-135和/或miR-335。按照具體的實(shí)施方案，當(dāng)調(diào)節(jié)包括減量調(diào)節(jié)Htr1a基因的表達(dá)時(shí)，則調(diào)整包括增量調(diào)節(jié)miR-135、miR-335、miR-181、miR-182和/或miR-26。按照具體的實(shí)施方案，當(dāng)調(diào)節(jié)包括減量調(diào)節(jié)MaoA基因的表達(dá)時(shí)，則調(diào)整包括增量調(diào)節(jié)themiR-27。按照具體的實(shí)施方案，當(dāng)調(diào)節(jié)包括減量調(diào)節(jié)Adrb1基因的表達(dá)時(shí)，則調(diào)整包括增量調(diào)節(jié)miR-19。按照具體的實(shí)施方案，當(dāng)調(diào)節(jié)包括減量調(diào)節(jié)CRH1型受體基因的表達(dá)時(shí)，則調(diào)整包括增量調(diào)節(jié)miR-15。按照具體的實(shí)施方案，當(dāng)調(diào)節(jié)包括減量調(diào)節(jié)CB1基因的表達(dá)時(shí)，則調(diào)整包括增量調(diào)節(jié)miR-19。按照具體的實(shí)施方案，當(dāng)調(diào)節(jié)包括減量調(diào)節(jié)FKBP5基因的表達(dá)時(shí)，則調(diào)整包括增量調(diào)節(jié)miR-15。按照一個(gè)實(shí)施方案，提供減量調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中選自以下基因的表達(dá)的方法：腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1(Adcyap1或PACAP)；腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1受體1(Adcyap1r1)；腎上腺素能受體α2a(Adra2a)；錨蛋白3(ANK3)；活性調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(Arc)；RhoGTP酶激活蛋白6(Arhgap6)；激活轉(zhuǎn)錄因子3(Atf3)；β位點(diǎn)APP切割酶1(Bace1)；L型依賴電壓性鈣通道α1D亞基(Cacna1d)；細(xì)胞粘附分子3(Cadm3)；復(fù)蛋白1(Cplx1)；復(fù)蛋白2(Cplx2)；CUB和Sushi多個(gè)結(jié)構(gòu)域1(Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1(Csnk1g1)；雙皮層蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-結(jié)合RAS樣2(Diras2)；discs大同源物2(果蠅)(Dlg2)；ETS癌基因家族成員ELK1(Elk1)；fyn相關(guān)激酶(Frk)；巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶9(α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)(Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受體亞基β2(Gabrb2)；GATA結(jié)合蛋白3(Gata3)；生長激素促分泌素受體(Ghsr)；G蛋白偶聯(lián)受體3(Gpr3)；離子型谷氨酸受體AMPA3(α3)(GRIA3)；離子型谷氨酸受體紅藻氨酸3(Grik3)；G蛋白偶聯(lián)受體激酶5(Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超極化激活的環(huán)核苷酸門控鉀通道1(Hcn1)，超極化激活的環(huán)核苷酸門控K+2(Hcn2)，5-羥基色胺(5-羥色胺)受體1A(Htr1a)；肌醇單磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；鉀中/小電導(dǎo)鈣激活通道亞家族N成員3(KCNN3)；核周蛋白α3(輸入蛋白α4)(Kpna3)；髓鞘轉(zhuǎn)錄因子1樣(Myt1l)；核受體共激活蛋白2(Ncoa2)；N-Myc下游調(diào)節(jié)基因4(Ndrg4)；一氧化氮合酶1(神經(jīng)元)銜接蛋白質(zhì)(NOS1AP)；核受體亞家族3C組成員2(Nr3c2)；導(dǎo)蛋白G1(Ntng1)；核酪蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物1(Nucks1)；鈣調(diào)蛋白依賴性磷酸二酯酶1A(Pde1a)；cAMP特異性磷酸二酯酶1A(Pde4a)；磷酸二酯酶8B(Pde8b)；磷脂酶C，β1(Plcb1)；催乳素受體(Prlr)；RAB1B，成員RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相關(guān)蛋白R(shí)ap-2a(Rap2a)；類視黃醇相關(guān)孤兒受體β(Rorb)；sirtuin1(沉默交配型信息調(diào)節(jié)2同源物)1(Sirt1)；溶質(zhì)載體家族12(鉀/氯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員6(Slc12a6)；溶質(zhì)載體家族5(膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員7(Slc5a7)；溶質(zhì)載體家族6(5-羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員4(Slc6a4)；反式作用轉(zhuǎn)錄因子1(Sp1)；突觸小泡糖蛋白2b(Sv2b)；突觸核被膜1(編碼nesprin-1)(Syne1)；突觸結(jié)合蛋白I(Syt1)；突觸結(jié)合蛋白II(Syt2)；突觸結(jié)合蛋白III(Syt3)；轉(zhuǎn)化生長因子β受體II(Tgfbr2)；甲狀腺激素受體β(Thrb)；瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族C成員6(Trpc6)；囊泡相關(guān)膜蛋白2(Vamp2)；無翅相關(guān)MMTV整合位點(diǎn)3(Wnt3)和含BED結(jié)構(gòu)域的鋅指4(Zbed4)，所述方法包括：(a)增量調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的miR-135或其前體的活性或表達(dá)；和(b)測量神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中基因的表達(dá)，從而減量調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。按照具體的實(shí)施方案，減量調(diào)節(jié)基因的表達(dá)通過增量調(diào)節(jié)不是miR-135的微RNA或其前體的活性或表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。按照具體的實(shí)施方案，減量調(diào)節(jié)miR-135靶基因的表達(dá)通過給予受試者能夠減量調(diào)節(jié)miR-135靶基因的活性或表達(dá)的作用劑來實(shí)現(xiàn)?？墒褂酶深A(yù)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的各種分子[例如RNA沉默劑(RNAsilencingagent)(例如反義物、siRNA、shRNA、微RNA)、核酶、DNA核酶和CRISPR系統(tǒng)(例如CRISPR/Cas)]在基因組和/或轉(zhuǎn)錄物水平上，或使用例如拮抗劑、切割多肽的酶等在蛋白質(zhì)水平上，實(shí)現(xiàn)基因(例如miR-135靶基因)或基因產(chǎn)物的減量調(diào)節(jié)。下面是能夠減量調(diào)節(jié)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)水平和/或活性的一系列作用劑。能夠減量調(diào)節(jié)多肽基因產(chǎn)物的活性的作用劑的一個(gè)實(shí)例是能夠特異性結(jié)合基因產(chǎn)物(即蛋白質(zhì))的抗體或抗體片段。所述抑制特別對于胞外、細(xì)胞表面或分泌的多肽是有價(jià)值的。本文所用術(shù)語“表位”是指抗體的抗原互補(bǔ)位與之結(jié)合的抗原上的任何抗原決定簇。表位決定簇通常由分子的化學(xué)活性表面群聚(例如氨基酸或糖側(cè)鏈)組成，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。本文所用術(shù)語“抗體”是指完整的抗體分子，術(shù)語“抗體片段”是指其功能性片段，例如能夠結(jié)合巨噬細(xì)胞的Fab、F(ab')2和Fv。這些功能性抗體片段如下定義：(1)Fab，該片段含有抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段，可通過用酶即木瓜蛋白酶消化完整抗體產(chǎn)生，得到完整的輕鏈和一條重鏈的一部分；(2)Fab'，可通過用胃蛋白酶處理完整抗體后還原來獲得抗體分子的這個(gè)片段，得到完整輕鏈和重鏈的一部分；每個(gè)抗體分子得到2個(gè)Fab'片段；(3)(Fab')2，可以用酶即胃蛋白酶處理完整抗體但無需隨后的還原獲得該抗體片段；F(ab')2是2個(gè)Fab'片段由2個(gè)二硫鍵連接在一起的二聚體；(4)Fv，定義為含有表達(dá)成2條鏈的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的基因工程片段；(5)單鏈抗體(“SCA”)，是一種基因工程分子，含有由合適的多肽接頭連接的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)作為遺傳融合的單鏈分子。產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體及其片段的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如，Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1988，通過引用結(jié)合到本文中)?；?例如miR-135靶基因)的減量調(diào)節(jié)也可通過RNA沉默實(shí)現(xiàn)。本文所用短語“RNA沉默”是指由RNA分子介導(dǎo)的一類調(diào)節(jié)機(jī)制[例如RNA干擾(RNAi)、轉(zhuǎn)錄基因沉默(TGS)、轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)、壓抑、共抑制和翻譯抑制]，這導(dǎo)致相應(yīng)的蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)受抑制或“沉默”。在許多生物類型(包括植物、動(dòng)物和真菌)中觀察到RNA沉默。本文所用術(shù)語“RNA沉默劑”是指能夠特異性地抑制或“沉默”靶基因的表達(dá)的RNA。在某種實(shí)施方案中，RNA沉默劑能夠通過轉(zhuǎn)錄后沉默機(jī)制防止mRNA分子的完整加工(例如整個(gè)翻譯和/或表達(dá))。RNA沉默劑包括非編碼RNA分子，例如包含配對鏈的RNA雙鏈體，以及可從中產(chǎn)生這類小的非編碼RNA的前體RNA。示例性RNA沉默劑包括dsRNA例如siRNA、miRNA和shRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，RNA沉默劑能夠誘導(dǎo)RNA干擾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA沉默劑能夠介導(dǎo)翻譯抑制。按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，RNA沉默劑對靶RNA(例如靶基因)有特異性，不交叉抑制或沉默與靶基因顯示99%或更小整體同源性、例如與靶基因小于98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%整體同源性的基因或剪接變體。RNA干擾是指由短干擾RNA(siRNA)介導(dǎo)的動(dòng)物中的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的方法。植物中的相應(yīng)方法通常稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默或RNA沉默，在真菌中亦稱為壓抑。轉(zhuǎn)錄后基因沉默的方法被認(rèn)為是用于防止外源基因表達(dá)的進(jìn)化保守的細(xì)胞防御機(jī)制，并且被不同的植物區(qū)系和種系(phyla)共有。在響應(yīng)雙鏈RNA(dsRNA)產(chǎn)生時(shí)，可產(chǎn)生對外源基因表達(dá)的這種防止，所述雙鏈RNA來源于病毒感染或來源于通過特異性破壞同源單鏈RNA或病毒基因組RNA的細(xì)胞反應(yīng)轉(zhuǎn)座子元件隨機(jī)整合到宿主基因組。細(xì)胞中長的dsRNA的存在刺激稱為切酶的核糖核酸酶III的活性。切酶參與將dsRNA加工成短dsRNA段(稱為短干擾RNA(siRNA))的過程。來源于切酶活性的短干擾RNA通常長約21-約23個(gè)核苷酸，并包含約19個(gè)堿基對雙鏈體。RNAi反應(yīng)的特征還在于內(nèi)切核酸酶復(fù)合物，通常稱為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)，這介導(dǎo)單鏈RNA的切割，該單鏈RNA具有與siRNA雙鏈體的反義鏈互補(bǔ)的序列。靶RNA的切割發(fā)生在與siRNA雙鏈體的反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域中部。因此，本發(fā)明的一些實(shí)施方案考慮使用dsRNA以減量調(diào)節(jié)來自mRNA的蛋白質(zhì)表達(dá)。按照一個(gè)實(shí)施方案，dsRNA大于30bp。由于認(rèn)為雙鏈RNA的這些較長區(qū)域?qū)?dǎo)致誘導(dǎo)干擾素和PKR反應(yīng)，因此長dsRNA(即大于30bp的dsRNA)的應(yīng)用是非常有限的。然而，長dsRNA的使用可提供多個(gè)優(yōu)勢，因?yàn)榧?xì)胞可選擇最適沉默序列，這減少了對測試多種siRNA的需要；長dsRNA可允許沉默文庫具有較少的復(fù)雜性，這對于siRNA將是必需的；或許最重要的是，長dsRNA當(dāng)用作療法時(shí)，可防止病毒逃逸突變。不同的研究表明，長dsRNA可用于使基因表達(dá)沉默而不誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)或引起顯著的脫靶作用(off-targeteffect)—參見例如[Strat等,NucleicAcidsResearch,2006,第34卷,第13期3803-3810；BhargavaA等,BrainRes.Protoc.2004;13:115-125；DialloM.等,Oligonucleotides.2003;13:381-392；PaddisonP.J.等,Proc.NatlAcad.Sci.USA.2002;99:1443-1448；TranN.等,FEBSLett.2004;573:127-134]。按照一些實(shí)施方案，本發(fā)明的還考慮了經(jīng)特別設(shè)計(jì)不誘導(dǎo)用于減量調(diào)節(jié)基因表達(dá)的干擾素和PKR途徑的長dsRNA的引入。例如，Shinagwa和Ishii[Genes&Dev.17(11):1340-1345,2003]開發(fā)了名為pDECAP的載體以由RNA聚合酶II(PolII)啟動(dòng)子表達(dá)長雙鏈RNA。因?yàn)閜DECAP的轉(zhuǎn)錄物沒有促進(jìn)ds-RNA輸出到胞質(zhì)的5'-帽結(jié)構(gòu)和3'-聚(A)尾兩者，所以pDECAP的長ds-RNA不誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)。在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中避開干擾素和PKR途徑的另一種方法是通過轉(zhuǎn)染或內(nèi)源表達(dá)的小抑制RNA(siRNA)的引入。術(shù)語“siRNA”是指誘導(dǎo)RNA干擾(RNAi)途徑的小抑制RNA雙鏈體(一般介于18-30個(gè)堿基對)。通常，siRNA作為21聚體經(jīng)化學(xué)合成，具有中央19bp雙鏈體區(qū)和末端的不對稱2-堿基3'-突出端，然而最近披露，長25-30個(gè)堿基的化學(xué)合成的RNA雙鏈體可具有較之于相同位置的21聚體的效能的差不多100倍。據(jù)推理，觀察到的在靶向RNAi時(shí)使用較長RNA獲得的效能提高產(chǎn)生于為底物(27聚體)而非產(chǎn)生(21聚體)提供切酶，并且這改進(jìn)siRNA雙鏈體進(jìn)入RISC的速率或效率。已發(fā)現(xiàn)3'-突出端的位置影響siRNA的效能，并且在反義鏈上具有3'-突出端的不對稱雙鏈體一般比有義鏈上具有3'-突出端的雙鏈體更有效(Rose等，2005)。這可歸因于加載到RISC中的不對稱鏈，因?yàn)楫?dāng)靶向反義轉(zhuǎn)錄物時(shí)，觀察到相反的功效模式。雙鏈干擾RNA(例如siRNA)的鏈可連接形成發(fā)夾或莖環(huán)結(jié)構(gòu)(例如shRNA)。因此，如所述，本發(fā)明的一些實(shí)施方案的RNA沉默劑也可以是短發(fā)夾RNA(shRNA)。本文所用術(shù)語“shRNA”是指是這樣的RNA分子：具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，包含互補(bǔ)序列的第一區(qū)和第二區(qū)，互補(bǔ)程度和區(qū)域方向足夠使得堿基配對發(fā)生在區(qū)域之間，第一區(qū)和第二區(qū)通過環(huán)區(qū)連接，環(huán)產(chǎn)生于環(huán)區(qū)內(nèi)核苷酸(或核苷酸類似物)間缺乏堿基配對。環(huán)中核苷酸的數(shù)目是且包括3-23、或5-15、或7-13、或4-9、或9-11之間的數(shù)目。環(huán)的一些核苷酸可參與與環(huán)中其它核苷酸的堿基對相互作用。可用于形成環(huán)的寡核苷酸序列的實(shí)例包括5'-UUCAAGAGA-3'(Brummelkamp,T.R.等(2002)Science296:550)和5'-UUUGUGUAG-3'(Castanotto,D.等(2002)RNA8:1454)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，所得單鏈寡核苷酸形成包含能夠與RNAi機(jī)器相互作用的雙鏈區(qū)的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。適用于本發(fā)明的一些實(shí)施方案的RNA沉默劑的合成可如下實(shí)現(xiàn)。首先，在AA二核苷酸序列的AUG起始密碼子下游掃描靶基因mRNA序列。記錄各AA和3’鄰接19個(gè)核苷酸的出現(xiàn)為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。優(yōu)選從可讀框選擇siRNA靶位點(diǎn)，因?yàn)榉欠g區(qū)(UTR)在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)中更豐富。UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物可干預(yù)siRNA內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的結(jié)合[TuschlChemBiochem.2:239-245]。然而應(yīng)認(rèn)識(shí)到，指向非翻譯區(qū)的siRNA也可有是有效的，如GAPDH所顯示的，其中指向5’UTR的siRNA介導(dǎo)細(xì)胞GAPDHmRNA的約90%降低，并且完全消除蛋白質(zhì)水平(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)。其次，應(yīng)用任何序列比對軟件，例如可獲自NCBI服務(wù)器的BLAST軟件(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，將潛在靶位點(diǎn)與合適的基因組數(shù)據(jù)庫(例如人、小鼠、大鼠等)進(jìn)行比較。過濾出顯示與其它編碼序列有顯著同源性的推定靶位點(diǎn)。選擇合格的靶序列作為siRNA合成的模板。優(yōu)選的序列包括低G/C含量的序列，因?yàn)檫@些已被證實(shí)與G/C含量高于55%的序列相比，在介導(dǎo)基因沉默中更有效。優(yōu)選沿靶基因的長度選出若干靶位點(diǎn)用于評(píng)價(jià)。為了更好地評(píng)價(jià)選出的siRNA，優(yōu)選聯(lián)合使用陰性對照。陰性對照siRNA優(yōu)選包括與siRNA相同的核苷酸組成，但與基因組沒有明顯的同源性。因此，優(yōu)選使用siRNA的混雜核苷酸序列，條件是不顯示與任何其它基因有任何顯著同源性。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的一些實(shí)施方案的RNA沉默劑不必限于只含有RNA的分子，而且另包括化學(xué)修飾的核苷酸和非核苷酸。在一些實(shí)施方案中，本文提供的RNA沉默劑可與細(xì)胞穿透肽功能性締合。本文所用的“細(xì)胞穿透肽”是包含短的(約12-30個(gè)殘基)氨基酸序列或功能基序、賦予與跨越細(xì)胞的質(zhì)膜和/或核膜的透膜復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的不依賴于能量的(即非胞吞)易位性質(zhì)的肽。用于本發(fā)明的一些實(shí)施方案的透膜復(fù)合物的細(xì)胞穿透肽優(yōu)選包含至少一個(gè)非功能半胱氨酸殘基，其是游離的或被衍化形成與為此鍵被修飾的雙鏈核糖核酸形成二硫鍵。賦予所述性質(zhì)的代表性氨基酸基序列于美國專利號(hào)6,348,185，其內(nèi)容通過引用明確結(jié)合到本文中。本發(fā)明的一些實(shí)施方案的細(xì)胞穿透肽優(yōu)選包括但不限于penetratin、transportan、pIsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS和MAP。待使用RNA沉默劑靶定的mRNA包括但不限于其表達(dá)與不需要的表型性狀有關(guān)的mRNA?？砂卸ǖ氖纠詍RNA是編碼截短蛋白即包含缺失的mRNA。因此可使本發(fā)明的一些實(shí)施方案的RNA沉默劑靶向缺失任一側(cè)的橋接區(qū)。將這類RNA沉默劑導(dǎo)入細(xì)胞可引起突變蛋白質(zhì)的減量調(diào)節(jié)，同時(shí)留下非突變蛋白質(zhì)不受影響。能夠減量調(diào)節(jié)基因(例如miR-135靶基因)的另一種作用劑是能夠特異性切割mRNA轉(zhuǎn)錄物或靶基因的DNA序列的DNA核酶分子。DNA核酶是能夠切割單鏈和雙鏈靶序列兩者的單鏈多核苷酸(Breaker,R.R.和Joyce,G.ChemistryandBiology1995;2:655；Santoro,S.W.和Joyce,G.F.Proc.Natl,Acad.Sci.USA1997;943:4262)。提出了DNA核酶的通用模型(“10-23”模型)?！?0-23”DNA核酶15個(gè)脫氧核糖核苷酸的催化結(jié)構(gòu)域，其兩側(cè)是各為7-9個(gè)脫氧核糖核苷酸的2個(gè)底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域。這種DNA核酶類型可在嘌呤:嘧啶連接處有效切割其底物RNA(Snatoro,S.W.和Joyce,G.F.Proc.Natl,Acad.Sci.USA199；有關(guān)DNA核酶的綜述參見Khachigian，LM[CurrOpinMolTher4:119-21(2002)]。識(shí)別單鏈和雙鏈靶切割位點(diǎn)的合成的工程改造的DNA核酶的構(gòu)建和擴(kuò)增的實(shí)例公開于Joyce等人的美國專利號(hào)6,326,174。最近觀察到針對人尿激酶受體的類似設(shè)計(jì)的DNA核酶抑制尿激酶受體表達(dá)，并在體內(nèi)成功地抑制結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移(Itoh等,20002,Abstract409,AnnMeetingAmSocGenTherwww.asgt.org)。在另一個(gè)應(yīng)用中，與bcr-ab1癌基因互補(bǔ)的DNA核酶在白血病細(xì)胞中抑制癌基因表達(dá)，并在CML和ALL的情況下在自體骨髓移植時(shí)降低復(fù)發(fā)率。通過使用能夠與編碼基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物特異性雜交的反義多核苷酸，也可實(shí)現(xiàn)基因(例如miR-135靶基因)的減量調(diào)節(jié)。必須實(shí)施可用來有效減量調(diào)節(jié)基因的反義分子的設(shè)計(jì)，同時(shí)考慮對反義方法是重要的兩個(gè)方面。第一方面是將寡核苷酸遞送到合適細(xì)胞的胞質(zhì)中，而第二方面是以抑制其翻譯的方式、在細(xì)胞內(nèi)與指定mRNA特異性結(jié)合的寡核苷酸的設(shè)計(jì)。能夠減量調(diào)節(jié)基因(例如miR-135靶基因)的另一種作用劑是能夠特異性切割編碼基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的核酶分子。核酶通過切割編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的mRNA，被越來越多地用于基因表達(dá)的序列特異性抑制[Welch等,CurrOpinBiotechnol.9:486-96(1998)]。設(shè)計(jì)核酶切割任何特定靶RNA的可能性使其在基礎(chǔ)研究和治療應(yīng)用中成為有價(jià)值的工具。在治療領(lǐng)域，已利用核酶以在感染性疾病、癌癥中的顯性癌基因和遺傳紊亂中的特異性體細(xì)胞突變中靶向病毒RNA[Welch等,ClinDiagnVirol.10:163-71(1998)]。更值注意的是，用于HIV患者的若干核酶基因療法方案已處于1期試驗(yàn)。最近，核酶已用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究、基因打靶驗(yàn)證和途徑闡釋。若干核酶處于臨床試驗(yàn)的不同階段。ANGIOZYME是在人臨床試驗(yàn)中研究的第1個(gè)化學(xué)合成的核酶。ANGIOZYME特異性地抑制VEGF-r(血管內(nèi)皮生長因子受體)(血管生成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵組分)的形成。RibozymePharmaceuticals,Inc.以及其它公司表明抗血管生成療法在動(dòng)物模型中的重要性。發(fā)現(xiàn)HEPTAZYME(一種被設(shè)計(jì)成選擇性破壞丙型肝炎病毒(HCV)RNA的核酶)，在細(xì)胞培養(yǎng)測定法中在降低丙型肝炎病毒RNA中是有效的(RibozymePharmaceuticals,Incorporated—WEB主頁)。能夠減量調(diào)節(jié)基因(例如miR-135靶基因)的另一種作用劑是RNA引導(dǎo)內(nèi)切核酸酶技術(shù)例如CRISPR系統(tǒng)。本文所用術(shù)語“CRISPR系統(tǒng)”，亦稱成簇有規(guī)間隔短回文重復(fù)序列(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat)總的來說是指參與CRISPR相關(guān)基因的表達(dá)或指導(dǎo)CRISPR相關(guān)基因的活性的轉(zhuǎn)錄物和其它元件，包括編碼Cas基因(例如CRISPR相關(guān)內(nèi)切核酸酶9)的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或有活性的部分tracrRNA)、tracr-mate序列(包括“同向重復(fù)序列”和tracrRNA加工的部分同向重復(fù)序列)或指導(dǎo)序列(亦稱為“間隔區(qū)”)，包括但不限于crRNA序列或sgRNA序列(即單指導(dǎo)RNA)。在一些實(shí)施方案中，CRISPR系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)元件來源于I型、II型或III型CRISPR系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，CRISPR系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)元件(例如Cas)來源于包含內(nèi)源CRISPR系統(tǒng)的特定生物，例如釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitides)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)或齒垢密螺旋體(Treponemadenticola)。一般來說，CRISPR系統(tǒng)的特征在于促進(jìn)在靶序列(在內(nèi)源CRISPR系統(tǒng)的情況下亦稱為前間區(qū))的位點(diǎn)形成CRISPR復(fù)合物的元件。在形成CRISPR復(fù)合物的情況下，“靶序列”是指被設(shè)計(jì)成與之具有互補(bǔ)性的指導(dǎo)序列(即指導(dǎo)RNA)的序列，其中靶序列和指導(dǎo)序列間的雜交促進(jìn)CRISPR復(fù)合物的形成。不必需要完全互補(bǔ)性，條件是有充分的互補(bǔ)性以引起雜交并促進(jìn)CRISPR復(fù)合物的形成。因此，按照一些實(shí)施方案，與靶序列的全局同源性可有50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。靶序列可包含任何多核苷酸，例如DNA或RN多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，靶序列位于細(xì)胞的核或胞質(zhì)中。因此，CRISPR系統(tǒng)包含2種不同的組分，與靶序列雜交的指導(dǎo)RNA(gRNA)和核酸酶(例如II型Cas9蛋白)，其中g(shù)RNA靶向靶序列，核酸酶(例如Cas9蛋白)切割靶序列或使靶基因沉默。指導(dǎo)RNA可包含內(nèi)源細(xì)菌crRNA和tracrRNA的組合，即gRNA使crRNA的打靶特異性與tracrRNA的支架性質(zhì)(Cas9結(jié)合所需要的)結(jié)合。或者，指導(dǎo)RNA可包含能夠直接結(jié)合Cas的單指導(dǎo)RNA(sgRNA)。通常，在內(nèi)源CRISPR系統(tǒng)的情況下，CRISPR復(fù)合物(包含與靶序列雜交并且與一個(gè)或多個(gè)Cas蛋白形成復(fù)合物的指導(dǎo)序列)的形成導(dǎo)致在靶序列中或附近(例如距之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多個(gè)堿基對內(nèi))的1條或2條鏈被切割。這例如通過插入或缺失，導(dǎo)致目標(biāo)基因(即靶序列)被破壞。按照一個(gè)實(shí)施方案，Cas蛋白(例如Cas9)沒有核酸酶活性(即無催化活性)，被稱為“死”(dCas9)。無催化活性的Cas9蛋白可按照本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容使用以與DNA結(jié)合(根據(jù)指導(dǎo)RNA特異性)，這通常導(dǎo)致RNA聚合酶結(jié)合或延伸被阻斷，引起轉(zhuǎn)錄抑制。因此，dCas9可用于轉(zhuǎn)錄抑制。如所述，可包含野生型tracr序列(例如差不多或超過野生型tracr序列約20、26、32、45、48、54、63、67、85或更多個(gè)核苷酸)的全部或部分或由其組成的tracrRNA序列，例如還可通過沿tracrRNA序列的至少一部分與同指導(dǎo)序列(例如crRNA)有效連接的tracr配偶序列(matesequence)的全部或部分雜交，形成CRISPR復(fù)合物的一部分。在一些實(shí)施方案中，tracr序列與tracr配偶序列具有充分的互補(bǔ)性以雜交并參與CRISPR復(fù)合物的形成。如同靶序列一樣，不需要完全互補(bǔ)性，只要是足夠功能性的。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)最適比對時(shí)，tracr序列沿tracr配偶序列的長度有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%序列互補(bǔ)性?？扇缦聦?shí)現(xiàn)將CRISPR/Cas導(dǎo)入細(xì)胞：使用驅(qū)動(dòng)CRISPR系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)元件表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)載體，使得CRISPR系統(tǒng)元件的表達(dá)在一個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)指導(dǎo)CRISPR復(fù)合物的形成。例如，Cas酶(一種與tracr-配偶序列連接的指導(dǎo)序列)和tracrRNA序列可各自與各個(gè)載體上各個(gè)調(diào)節(jié)元件有效連接。或者，從相同或不同調(diào)節(jié)元件中表達(dá)的元件的兩個(gè)或更多個(gè)可在單個(gè)載體中與提供不包括在第一載體中的CRISPR系統(tǒng)的任何組分的一個(gè)或多個(gè)其它載體組合。在單個(gè)載體中組合的CRISPR系統(tǒng)元件可以任何合適的方向排列，例如一個(gè)元件位于相對于第二個(gè)元件的5'(“上游”)或3'(“下游”)。一個(gè)元件的編碼序列可位于第二個(gè)元件的編碼序列的相同或相對鏈，以與相同或相對方向取向。單一啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)編碼CRISPR酶的轉(zhuǎn)錄物和指導(dǎo)序列的一個(gè)或多個(gè)、tracr配偶序列(任選任選與指導(dǎo)序列連接)和嵌在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子序列中的tracrRNA序列(例如各自在不同的內(nèi)含子中、兩個(gè)或更多個(gè)在至少一個(gè)內(nèi)含子中或全部在單個(gè)內(nèi)含子中)表達(dá)。或者，按照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，通過給予靶細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或心臟細(xì)胞)能夠減量調(diào)節(jié)微RNA的表達(dá)的作用劑或在靶細(xì)胞中表達(dá)能夠減量調(diào)節(jié)微RNA的表達(dá)的作用劑，來實(shí)現(xiàn)增量調(diào)節(jié)基因表達(dá)。可使用上述干擾轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的各種分子(例如RNA沉默劑、核酶、DNA核酶和反義)，在基因組和/或轉(zhuǎn)錄物水平上實(shí)現(xiàn)微RNA的減量調(diào)節(jié)。減量調(diào)節(jié)微RNA表達(dá)的方法是本領(lǐng)域已知的。減量調(diào)節(jié)miR活性的核酸作用劑包括但不限于靶模擬物(targetmimic)、微RNA抗性基因和miRNA抑制劑。假如允許一個(gè)或多個(gè)下列錯(cuò)配，則靶模擬物或微RNA抗性靶標(biāo)(micro-RNAresistanttarget)與微RNA基本互補(bǔ)：(a)微RNA5'端處的核苷酸與靶模擬物或微RNA抗性靶標(biāo)中的相應(yīng)核苷酸序列之間的錯(cuò)配；(b)微RNA的1位-9位的任一個(gè)核苷酸與靶模擬物或微RNA抗性靶標(biāo)中相應(yīng)核苷酸序列之間的錯(cuò)配；或(c)微RNA的12位-21位的任一個(gè)核苷酸與靶模擬物或微RNA抗性靶標(biāo)的相應(yīng)核苷酸序列之間的3個(gè)錯(cuò)配，條件是不超過2個(gè)連續(xù)錯(cuò)配。靶模擬物RNA與經(jīng)如下修飾以賦予其對miRNA誘導(dǎo)切割的抗性的靶RNA基本相似：例如通過修飾其序列，使得將變化引入與導(dǎo)致錯(cuò)配的miRNA的核苷酸10或11互補(bǔ)的靶序列的核苷酸中?；蛘?，可使微RNA抗性靶標(biāo)生效。因此，可將沉默突變引入靶基因的微RNA結(jié)合位點(diǎn)，使得可以防止微RNA結(jié)合、但蛋白質(zhì)的氨基酸序列不改變的方式使DNA和所得RNA序列改變。因此，可合成新的序列替代現(xiàn)有結(jié)合位點(diǎn)，其中DNA序列改變，導(dǎo)致miRNA不與其靶標(biāo)結(jié)合。按照具體的實(shí)施方案，將靶模擬物或微RNA抗性靶標(biāo)與同識(shí)別靶基因的pre-miRNA天然締合的啟動(dòng)子連接，并導(dǎo)入細(xì)胞中。這樣，miRNA靶模擬物或微RNA抗性靶RNA可在相同情況下表達(dá)，因?yàn)閙iRNA和靶模擬物或微RNA抗性靶RNA可取代被miRNA誘導(dǎo)切割降解的非靶模擬物/微RNA抗性靶RNA。還可通過同源重組引入非功能miRNA等位基因或miRNA抗性靶基因以取代miRNA編碼等位基因或miRNA敏感靶基因。通過將目標(biāo)核酸(例如miRNA、靶基因、沉默劑等)克隆到合適啟動(dòng)子控制下的核酸表達(dá)構(gòu)建體中，來實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，合成單鏈核酸用作miRNA抑制劑。miRNA抑制劑的長度通常介于約17-25個(gè)核苷酸，并包含與成熟miRNA的5'-3'序列至少90%互補(bǔ)的5'-3'序列。在某種實(shí)施方案中，miRNA抑制劑分子長度為17、18、19、20、21、22、23、24或25個(gè)核苷酸或其中可派生的任何范圍。此外，miRNA抑制劑具與成熟miRNA(特別是成熟的天然存在的miRNA)的5'-3'序列為或至少為90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%或其中可派生的任何范圍互補(bǔ)的序列(5'-3')。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，可使用能夠與微RNA或與其前體特異性雜交的反義多核苷酸，實(shí)現(xiàn)微RNA的減量調(diào)節(jié)。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的微RNA反義作用劑(例如抗miRNA寡聚體)還可包含化學(xué)修飾、分子修飾和/或部分例如膽固醇部分的添加(例如antagomirs)?？刹捎盟矔r(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，使miRNA抑制劑與細(xì)胞接觸。miRNA抑制劑可市購獲自例如AppliedBiosystems等公司?；蛘?，miRNA抑制劑可為本文上述表達(dá)載體的一部分。在這種情況下，細(xì)胞可用載體瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。按照具體的實(shí)施方案，當(dāng)調(diào)節(jié)包括增量調(diào)節(jié)的表達(dá)Tph2基因，則調(diào)整包括減量調(diào)節(jié)miR-181和/或miR-27。按照另一個(gè)具體的實(shí)施方案，提供增量調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的選自以下基因的表達(dá)的方法：腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1(Adcyap1或PACAP)；腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1受體1(Adcyap1r1)；腎上腺素能受體α2a(Adra2a)；錨蛋白3(ANK3)；活性調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(Arc)；RhoGTP酶激活蛋白6(Arhgap6)；激活轉(zhuǎn)錄因子3(Atf3)；β位點(diǎn)APP切割酶1(Bace1)；L型依賴電壓性鈣通道α1D亞基(Cacna1d)；細(xì)胞粘附分子3(Cadm3)；復(fù)蛋白1(Cplx1)；復(fù)蛋白2(Cplx2)；CUB和Sushi多個(gè)結(jié)構(gòu)域1(Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1(Csnk1g1)；雙皮層蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-結(jié)合RAS樣2(Diras2)；discs大同源物2(果蠅)(Dlg2)；ETS癌基因家族成員ELK1(Elk1)；fyn相關(guān)激酶(Frk)；巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶9(α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)(Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受體亞基β2(Gabrb2)；GATA結(jié)合蛋白3(Gata3)；生長激素促分泌素受體(Ghsr)；G蛋白偶聯(lián)受體3(Gpr3)；離子型谷氨酸受體AMPA3(α3)(GRIA3)；離子型谷氨酸受體紅藻氨酸3(Grik3)；G蛋白偶聯(lián)受體激酶5(Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超極化激活的環(huán)核苷酸門控鉀通道1(Hcn1)，超極化激活的環(huán)核苷酸門控K+2(Hcn2)，5-羥基色胺(5-羥色胺)受體1A(Htr1a)；肌醇單磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；鉀中/小電導(dǎo)鈣激活通道亞家族N成員3(KCNN3)；核周蛋白α3(輸入蛋白α4)(Kpna3)；髓鞘轉(zhuǎn)錄因子1樣(Myt1l)；核受體共激活蛋白2(Ncoa2)；N-Myc下游調(diào)節(jié)基因4(Ndrg4)；一氧化氮合酶1(神經(jīng)元)銜接蛋白質(zhì)(NOS1AP)；核受體亞家族3C組成員2(Nr3c2)；導(dǎo)蛋白G1(Ntng1)；核酪蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物1(Nucks1)；鈣調(diào)蛋白依賴性磷酸二酯酶1A(Pde1a)；cAMP特異性磷酸二酯酶1A(Pde4a)；磷酸二酯酶8B(Pde8b)；磷脂酶C，β1(Plcb1)；催乳素受體(Prlr)；RAB1B，成員RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相關(guān)蛋白R(shí)ap-2a(Rap2a)；類視黃醇相關(guān)孤兒受體β(Rorb)；sirtuin1(沉默交配型信息調(diào)節(jié)2同源物)1(Sirt1)；溶質(zhì)載體家族12(鉀/氯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員6(Slc12a6)；溶質(zhì)載體家族5(膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員7(Slc5a7)；溶質(zhì)載體家族6(5-羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員4(Slc6a4)；反式作用轉(zhuǎn)錄因子1(Sp1)；突觸小泡糖蛋白2b(Sv2b)；突觸核被膜1(編碼nesprin-1)(Syne1)；突觸結(jié)合蛋白I(Syt1)；突觸結(jié)合蛋白II(Syt2)；突觸結(jié)合蛋白III(Syt3)；轉(zhuǎn)化生長因子β受體II(Tgfbr2)；甲狀腺激素受體β(Thrb)；瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族C成員6(Trpc6)；囊泡相關(guān)膜蛋白2(Vamp2)；無翅相關(guān)MMTV整合位點(diǎn)3(Wnt3)和含有BED結(jié)構(gòu)域4的鋅指(Zbed4)，所述方法包括：(a)減量調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的miR-135或其前體的活性或表達(dá)；和(b)測量神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中基因的表達(dá)，從而增量調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。按照具體的實(shí)施方案，通過減量調(diào)節(jié)微RNA(例如miR-135)或其前體的活性或表達(dá)以外的方法，來實(shí)現(xiàn)增量調(diào)節(jié)這些基因任一個(gè)的表達(dá)。因此，增量調(diào)節(jié)基因的活性或表達(dá)可通過過量表達(dá)基因或其靶標(biāo)來實(shí)現(xiàn)。按照一個(gè)實(shí)施方案，通過使用特異性結(jié)合并減量調(diào)節(jié)微RNA的表達(dá)核酸序列，實(shí)現(xiàn)減量調(diào)節(jié)微RNA的表達(dá)?？砂凑毡景l(fā)明使用的示例性核酸序列可購自任何生產(chǎn)商，例如購自Genecopoeia(miArrest，基于微RNA載體的抑制劑)。因此，按照另一個(gè)實(shí)施方案，提供包含用于減量調(diào)節(jié)miR-181、miR-182、miR-26、miR-27、miR-135、miR-335、miR-15和miR-19或其前體的表達(dá)的核酸序列的分離的多核苷酸?？砂凑毡景l(fā)明使用的減量調(diào)節(jié)miR-181的表達(dá)的示例性多核苷酸包括但不限于SEQIDNO:134-137和SEQIDNO:154-157給出的那些?？砂凑毡景l(fā)明使用的減量調(diào)節(jié)miR-182的表達(dá)的示例性多核苷酸包括但不限于SEQIDNO:138-141和SEQIDNO:147給出的那些?？砂凑毡景l(fā)明使用的減量調(diào)節(jié)miR-26的表達(dá)的示例性多核苷酸包括但不限于SEQIDNO:126-129和SEQIDNO:145-146給出的那些?？砂凑毡景l(fā)明使用的減量調(diào)節(jié)miR-27的表達(dá)的示例性多核苷酸包括但不限于SEQIDNO:130-133和SEQIDNO:152-153給出的那些?？砂凑毡景l(fā)明使用的減量調(diào)節(jié)miR-135的表達(dá)的示例性多核苷酸包括但不限于SEQIDNO:110-113和SEQIDNO:142-143給出的那些。可按照本發(fā)明使用的減量調(diào)節(jié)miR-335的表達(dá)的示例性多核苷酸包括但不限于SEQIDNO:114-117和SEQIDNO:144給出的那些。可按照本發(fā)明使用的減量調(diào)節(jié)miR-15的表達(dá)的示例性多核苷酸包括但不限于SEQIDNO:118-121和SEQIDNO:150-151給出的那些?？砂凑毡景l(fā)明使用的減量調(diào)節(jié)miR-19的表達(dá)的示例性多核苷酸包括但不限于SEQIDNO:122-125和SEQIDNO:148-149給出的那些。所述核酸序列可進(jìn)一步包含在上文更詳細(xì)描述的表達(dá)載體中。本發(fā)明另考慮在減量調(diào)節(jié)或增量調(diào)節(jié)細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或心臟細(xì)胞)中的微RNA水平后評(píng)價(jià)靶基因的表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄物或多肽)。因此，可使用能夠與靶基因的核酸序列(例如NM_001045.4所示Slc6a4或其部分；例如NM_000524.3所示Htr1a或其部分；例如NM_000240.3或NM_001270458.1所示MaoA或其部分；例如NM_000684.2所示Adrb1或其部分；例如NM_000024.5所示Adrb2或其部分；例如NM_001145146.1、NM_001145147.1所示CRH1型受體或其部分；例如NM_001160226.1、NM_033181.3所示CB1或其部分；例如NM_001145775.1、NM_001145777.1所示FKBP5或其部分；例如NM_173353.3所示Tph2或其部分；例如NM_000838.3、NM_001114329.1所示Grm1或其部分；例如NM_000831.3所示Grik3或其部分；例如NM_000842.3、NM_001143831.2所示Grm5或其部分；例如NM_001166247.1、NM_021956.4所示Grik2或其部分；例如NM_000844.3、NM_181874.2所示Grm7或其部分；例如NM_000826.3、NM_001083619.1所示Gria2或其部分；例如NM_001389.3所示Dscam或其部分；例如NM_000425.3、NM_001143963.1、NM_024003.2所示L1cam或其部分；例如NM_005999.2所示Tsnax或其部分；例如NM_001143676.1、NM_001143677.1、NM_001143678.1所示Sgk1或其部分和/或例如NM_001165903.1、NM_004603.3所示Stx1a或其部分；例如NM_001117.4、NM_001099733.1所示Adcyap1或其部分；例如NM_001118.4、NM_001199635.1、NM_001199636.1、NM_001199637.1所示Adcyap1r1或其部分；例如NM_000681.3所示Adra2a或其部分；例如NM_001149.3、NM_001204403.1、NM_001204404.1或NM_020987.3所示ANK3或其部分；例如NM_015193.4所示Arc或其部分；例如NM_001287242.1、NM_006125.2、NM_013423.2、NM_013427.2所示Arhgap6或其部分；例如NM_001030287.3、NM_001040619.2、NM_001206484.2、NM_001206486.2、NM_001206488.2、NM_001674.3所示Atf3或其部分；例如NM_001207048.1、NM_001207049.1、NM_012104.4、NM_138971.3、NM_138972.3、NM_138973.3所示Bace1或其部分；例如NM_000720.3、NM_001128839.2、NM_001128840.2所示Cacna1d或其部分；例如NM_001127173.1、NM_021189.3所示Cadm3或其部分；例如NM_006651.3所示Cplx1或其部分；例如NM_001008220.1、NM_006650.3所示Cplx2或其部分；例如NM_033225.5所示Csmd1或其部分；例如NM_022048.3所示Csnk1g1或其部分；例如NM_000555.3、NM_001195553.1、NM_178151.2、NM_178152.2、NM_178153.2所示Dcx或其部分；例如NM_017594.3所示Diras2或其部分；例如NM_001142699.1、NM_001142700.1、NM_001142702.1、NM_001206769.1、NM_001364.3所示Dlg2或其部分；例如NM_001114123.2、NM_001257168.1、NM_005229.4所示Elk1或其部分；例如NM_002031.2所示Frk或其部分；例如NM_006581.3所示Fut9或其部分；例如NM_000813.2、NM_021911.2所示Gabrb2或其部分；例如NM_001002295.1、NM_002051.2所示Gata3或其部分；例如NM_004122.2、NM_198407.2所示Ghsr或其部分；例如NM_005281.3所示Gpr3或其部分；例如NM_000828.4、NM_001256743.1、NM_007325.4所示GRIA3或其部分；例如NM_005308.2所示Grk5或其部分；例如NM_001146156.1、NM_002093.3所示GSK3B或其部分；例如NM_021072.3所示Hcn1或其部分；例如NM_001194.3所示Hcn2或其部分；例如NM_001144878.1、NM_001144879.1、NM_005536.3所示IMPA1或其部分；例如NM_001024660.3、NM_003947.4、NM_007064.3所示Kalrn或其部分；例如NM_001204087.1、NM_002249.5、NM_170782.2所示KCNN3或其部分；例如NM_002267.3所示Kpna3或其部分；例如NM_015025.2所示Myt1l或其部分；例如NM_006540.2所示Ncoa2或其部分；例如NM_020465.3、NM_022910.3、NM_001130487.1、NM_001242836.1所示Ndrg4或其部分；例如NM_001126060.1、NM_001164757.1、NM_014697.2所示NOS1AP或其部分；例如NM_000901.4、NM_001166104.1所示Nr3c2或其部分；例如NM_001113226.1、NM_001113228.1、NM_014917.2所示Ntng1或其部分；例如NM_022731.4所示Nucks1或其部分；例如NM_005019.4、NM_001003683.2、NM_001258312.1所示Pde1a或其部分；例如NM_001111307.1、NM_001111308.1、NM_001111309.1所示Pde4a或其部分；例如NM_003719.3、NM_001029851.2、NM_001029852.2所示Pde8b或其部分；例如NM_015192.3、NM_182734.2所示Plcb1或其部分；例如NM_000949.5、NM_001204315.1、NM_001204316.1所示Prlr或其部分；例如NM_030981.2所示Rab1b或其部分；例如NM_021033.6所示Rap2a或其部分；例如NM_006914.3所示Rorb或其部分；例如NM_001142498.1、NM_012238.4所示Sirt1或其部分；例如NM_133647.1、NM_005135.2、NM_001042495.1所示Slc12a6或其部分；例如NM_021815.2所示Slc5a7或其部分；例如NM_138473.2、NM_003109.1、NM_001251825.1所示Sp1或其部分；例如NM_001167580.1、NM_014848.4所示Sv2b或其部分；例如NM_033071.3、NM_182961.3所示Syne1或其部分；例如NM_001135805.1、NM_001135806.1、NM_005639.2所示Syt1或其部分；例如NM_001136504.1、NM_177402.4所示Syt2或其部分；例如NM_001160328.1、NM_001160329.1、NM_032298.2所示Syt3或其部分；例如NM_001024847.2、NM_003242.5所示Tgfbr2或其部分；例如NM_000461.4、NM_001128176.2、NM_001128177.1、NM_001252634.1所示Thrb或其部分；例如NM_004621.5所示Trpc6或其部分；例如NM_014232.2所示Vamp2或其部分；例如NM_030753.4所示W(wǎng)nt3或其部分和/或例如NM_014838.2所示Zbed4或其部分)雜交的分離的多核苷酸(例如多核苷酸探針、寡核苷酸探針/引物)，測定靶基因(例如Slc6a4、Htr1a、MaoA、Adrb1、Adrb2、CRH1型受體、CB1、FKBP5、Tph2、Grm1、Grik3、Grm5、Grik2、Grm7、Gria2、Dscam、L1cam、Tsnax、Sgk1、Stx1a、Adcyap1、Adcyap1r1、Adra2a、Ank3、Arc、Arhgap6、Atf3、Bace1、Cacna1d、Cadm3、Cplx1、Cplx2、Csmd1、Csnk1g1、Dcx、Diras2、Dlg2、Elk1、Frk、Fut9、Gabrb2、Gata3、Ghsr、Gpr3、Gria3、Grk5、Gsk3b、Hcn1、Hcn2、Impa1、Kalrn、Kcnn3、Kpna3、Myt1l、Ncoa2、Ndrg4、Nos1ap、Nr3c2、Ntng1、Nucks1、Pde1a、Pde4a、Pde8b、Plcb1、Prlr、Rab1b、Rap2a、Rorb、Sirt1、Slc12a6、Slc5a7、Sp1、Sv2b、Syne1、Syt1、Syt2、Syt3、Tgfbr2、Thrb、Trpc6、Vamp2、Wnt3和/或Zbed4)核酸序列(例如轉(zhuǎn)錄物)的存在和/或水平。所述多核苷酸可為任何大小，例如短多核苷酸(例如具有15-200個(gè)堿基)、中等多核苷酸(例如200-2000個(gè)堿基)或2000個(gè)堿基以上的長多核苷酸。本發(fā)明所用的分離的多核苷酸探針可以是對本發(fā)明的靶基因RNA轉(zhuǎn)錄物有特異性的任何直接或間接標(biāo)記的RNA分子(例如RNA寡核苷酸、體外轉(zhuǎn)錄的RNA分子)、DNA分子(例如寡核苷酸、cDNA分子、基因組分子)和/或其類似物[例如肽核酸(PNA)]。按本發(fā)明的教導(dǎo)內(nèi)容設(shè)計(jì)的寡核苷酸可按照上文詳細(xì)描述的本領(lǐng)域已知的任何寡核苷酸合成方法產(chǎn)生。本發(fā)明的寡核苷酸具有至少17、至少18、至少19、至少20、至少22、至少25、至少30或至少40個(gè)可與上文所述序列變化特異性雜交的堿基。本發(fā)明的寡核苷酸可包含由以3'-5'磷酸二酯鍵鍵合的嘌呤和嘧啶堿基組成的雜環(huán)核苷。優(yōu)選的所用寡核苷酸是在骨架(例如糖-磷酸骨架)、核苷間鍵和/或堿基修飾的那些，如上文大體描述的一樣。本發(fā)明所用的分離的多核苷酸可使用標(biāo)簽或標(biāo)記分子直接或間接標(biāo)記。所述標(biāo)記可為例如熒光分子(例如熒光素或德克薩斯紅)、放射性分子(例如32P-γ-ATP或32P-α-ATP)和顯色底物[例如可獲自(ABCAM、Cambridge、MA)的堅(jiān)牢紅、BCIP/INT]?？赏ㄟ^使標(biāo)記分子與多核苷酸共價(jià)綴合(例如使用固相合成)或通過聚合摻入(例如使用體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或隨機(jī)引發(fā)標(biāo)記)實(shí)現(xiàn)直接標(biāo)記。使未標(biāo)記的標(biāo)簽分子(例如洋地黃毒苷或生物素)與多核苷酸共價(jià)綴合或摻入多核苷酸中，隨后進(jìn)行把多核苷酸加上能夠特異性識(shí)別未標(biāo)記的標(biāo)簽的標(biāo)記分子(例如抗洋地黃毒苷抗體或鏈霉抗生物素)，來實(shí)現(xiàn)間接標(biāo)記。可將上述多核苷酸應(yīng)用于多種RNA檢測方法例如RNA印跡分析、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)[例如半定量RT-PCR、使用例如LightCyclerTM(Roche)的定量RT-PCR]、RNA原位雜交(RNA-ISH)、原位RT-PCR染色[例如描述于NuovoGJ等,1993,Intracellularlocalizationofpolymerasechainreaction(PCR)-amplifiedhepatitisCcDNA(聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增的丙型肝炎cDNA的胞內(nèi)定位).AmJSurgPathol.17:683-90；以及KomminothP等,1994,EvaluationofmethodsforhepatitisCvirusdetectioninarchivalliverbiopsies.Comparisonofhistology,immunohistochemistry,insituhybridization,reversetranscriptasepolymerasechainreaction(RT-PCR)andinsituRT-PCR(用于歸檔肝活檢樣品中的丙型肝炎病毒檢測的評(píng)價(jià)方法：組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、原位雜交、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和原位RT-PCR的比較).PatholResPract.,190:1017-25]和寡核苷酸微陣列分析[例如使用Affymetrix微陣列(Affymetrix?，SantaClara，CA)]?？墒褂美缣禺愋钥贵w通過免疫復(fù)合物的形成[即存在于生物樣品中的靶基因抗原(氨基酸序列)和特異性抗體之間形成的復(fù)合物]，來測定靶基因(例如Slc6a4、Htr1a、MaoA、Adrb1、Adrb2、CRH1型受體、CB1、FKBP5、Tph2、Grm1、Grik3、Grm5、Grik2、Grm7、Gria2、Dscam、L1cam、Tsnax、Sgk,1Stx1a、Adcyap1、Adcyap1r1、Adra2a、Ank3、Arc、Arhgap6、Atf3、Bace1、Cacna1d、Cadm3、Cplx1、Cplx2、Csmd1、Csnk1g1、Dcx、Diras2、Dlg2、Elk1、Frk、Fut9、Gabrb2、Gata3、Ghsr、Gpr3、Gria3、Grk5、Gsk3b、Hcn1、Hcn2、Impa1、Kalrn、Kcnn3、Kpna3、Myt1l、Ncoa2、Ndrg4、Nos1ap、Nr3c2、Ntng1、Nucks1、Pde1a、Pde4a、Pde8b、Plcb1、Prlr、Rab1b、Rap2a、Rorb、Sirt1、Slc12a6、Slc5a7、Sp1、Sv2b、Syne1、Syt1、Syt2、Syt3、Tgfbr2、Thrb、Trpc6、Vamp2、Wnt3和/或Zbed4)氨基酸序列(例如蛋白質(zhì))的存在和/或水平。本發(fā)明的免疫復(fù)合物可在不同的溫度、鹽濃度和pH值下形成，這可取決于所用的方法和生物樣品，且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠調(diào)節(jié)適于各種免疫復(fù)合物形成的條件。本發(fā)明所用術(shù)語“抗體”包括完整分子及其功能片段，例如Fab、F(ab')2、Fv或單一結(jié)構(gòu)域分子例如抗原表位的VH和VL。這些功能性抗體片段如下定義：(1)Fab，含有抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段的該片段，可通過用酶即木瓜蛋白酶消化完整抗體產(chǎn)生，得到完整的輕鏈和一條重鏈的一部分；(2)Fab'，可通過用胃蛋白酶處理完整抗體后還原來獲得抗體分子的這個(gè)片段，得到完整輕鏈和重鏈的一部分；每個(gè)抗體分子得到2個(gè)Fab'片段；(3)(Fab')2，可以用酶即胃蛋白酶處理完整抗體但無需隨后的還原獲得該抗體片段；F(ab')2是2個(gè)Fab'片段由2個(gè)二硫鍵連接在一起的二聚體；(4)Fv，定義為含有表達(dá)成2條鏈的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的基因工程片段；(5)單鏈抗體(“SCA”)，是一種基因工程分子，含有由合適的多肽接頭連接的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)作為遺傳融合的單鏈分子；和(6)單域抗體由顯示對抗原有足夠親和力的單一VH或VL結(jié)構(gòu)域組成。產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體及其片段的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,1988，通過引用結(jié)合到本文中)?？梢酝ㄟ^抗體的蛋白水解，或者通過使編碼片段的DNA在大腸桿菌(E.coli)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)物或其它蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng))中的表達(dá)，來制備本發(fā)明的抗體片段?？赏ㄟ^常規(guī)方法，用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗體獲得抗體片段。如上所述，可通過用胃蛋白酶對抗體進(jìn)行酶促切割得到5S片段，從而產(chǎn)生(Fab’)2抗體片段。還可以使用巰基還原劑，任選使用由二硫鍵裂解所產(chǎn)生的巰基的封端基團(tuán)，使該片段進(jìn)行進(jìn)一步裂解產(chǎn)生3.5SFab'單價(jià)片段?；蛘?，使用胃蛋白酶進(jìn)行酶促切割來直接產(chǎn)生2個(gè)單價(jià)Fab'片段和Fc片段。這些方法描述于例如Goldenberg的美國專利號(hào)4,036,945和4,331,647和其中所包含的參考文獻(xiàn)，所述專利通過引用以其整體結(jié)合到本文中。另參見Porter,R.R.[Biochem.J.73:119-126(1959)]。切割抗體的其它方法，例如重鏈分離形成單價(jià)輕鏈-重鏈片段，進(jìn)一步切割片段，或者還可以使用其它酶技術(shù)、化學(xué)技術(shù)或遺傳技術(shù)，只要該片段與被完整抗體識(shí)別的抗原結(jié)合。Fv片段包含VH鏈和VL鏈的締合物。該締合物可以是非共價(jià)的，如描述于Inbar等[Proc.Nat'lAcad.Sci.USA69:2659-62(1972)]?；蛘?，可變鏈可以通過分子間的二硫鍵連接，或者通過化學(xué)試劑(例如戊二醛)交聯(lián)。優(yōu)選Fv片段包含通過肽接頭連接的VH和VL鏈。這些單鏈抗原結(jié)合蛋白(sFv)通過構(gòu)建結(jié)構(gòu)基因來制備，該結(jié)構(gòu)基因包含編碼由寡核苷酸連接的VH和VL結(jié)構(gòu)域的DNA序列。將該結(jié)構(gòu)基因插入表達(dá)載體中，隨即將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌)中。重組宿主細(xì)胞合成具有橋接2個(gè)V結(jié)構(gòu)域的接頭肽的單一多肽鏈。有關(guān)產(chǎn)生scFv的方法描述于例如Whitlow和Filpula，Methods,2:97-105,1991；Bird等，Science242:423-426，1988；Pack等，Bio/Technology11:1271-77，1993；以及Ladner等，美國專利第4,946,778號(hào)，所述專利通過引用以其整體結(jié)合到本文中。抗體片段的另一形式是編碼單一互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的肽。CDR肽(“最小識(shí)別單位”)可以通過構(gòu)建編碼目標(biāo)抗體CDR的基因獲得。例如，通過采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以由產(chǎn)抗體細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)，來制備這類基因。參見例如Larrick和Fry[Methods,2:106-10(1991)]。還可以采用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)制備抗體，包括噬菌體展示文庫[Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.,222:581(1991)]。還可獲得Cole等和Boerner等人的技術(shù)用于制備人單克隆抗體(Cole等,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,第77頁(1985)和Boerner等,J.Immunol.,147(1):86-95(1991))。同樣，可通過將人免疫球蛋白基因座導(dǎo)入其中內(nèi)源免疫球蛋白基因部分或完全失活的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)中，來制備人抗體。在攻擊時(shí)，觀察到人抗體的產(chǎn)生，這在包括基因重排、裝配和抗體庫在內(nèi)的所有方面都與在人體中觀察到的十分相似。該方法描述于例如美國專利號(hào)5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016和下列科學(xué)出版物：Marks等,Bio/Technology10:779-783(1992)；Lonberg等,Nature368:856-859(1994)；Morrison,Nature368812-13(1994)；Fishwild等,NatureBiotechnology14,845-51(1996)；Neuberger,NatureBiotechnology14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13,65-93(1995)。可按照本發(fā)明使用的示例性抗體包括諸如例如可獲自AbnovaCorporation、Abgent和MBLInternational的抗Slc6a4抗體；例如可獲自NovusBiologicals、AcrisAntibodiesGmbH和AbnovaCorporation的抗Htr1a抗體；例如可獲自AbnovaCorporation、ProteintechGroup,Inc.和Abgent的抗MaoA抗體；例如可獲自Biorbyt、Abgent和在線抗體(antibodies-online)的抗Adrb1抗體；例如可獲自TocrisBioscience、AbnovaCorporation和在線抗體的抗Adrb2抗體；例如可獲自MyBioSource.com、Abcam和NovusBiologicals的抗CRH1型受體抗體；例如可獲自SantaCruzBiotechnology,Inc.和Epitomics,Inc.的抗CB1抗體；例如可獲自BDBiosciences和AbnovaCorporation的抗FKBP5抗體；例如可獲自NovusBiologicals和AcrisAntibodiesGmbH的抗Tph2抗體；例如可獲自NovusBiologicals和Biorbyt的抗Grm1抗體；例如可獲自AcrisAntibodiesGmbH和AtlasAntibodies的抗Grik3抗體；例如可獲自Biorbyt和AcrisAntibodiesGmbH的抗Grm5抗體；例如可獲自ProteintechGroup,Inc.、AvivaSystemsBiology和Abgent的抗Grik2抗體；例如可獲自AcrisAntibodiesGmbH和在線抗體的抗Grm7抗體；例如可獲自ProteintechGroup,Inc.和AbnovaCorporation的抗Gria2抗體；抗Dscam抗體例如可獲自NovusBiologicals和R&D系統(tǒng)；例如可獲自GeneTex、NovusBiologicals和AcrisAntibodiesGmbH的抗L1cam抗體；例如可獲自BDBiosciences和GenWayBiotech、Inc.的抗Tsnax抗體；例如可獲自Epitomics,Inc.和AcrisAntibodiesGmbH的抗Sgk1抗體和/或例如可獲自MBLInternational和SpringBioscience的抗Stx1a抗體。可采用各種方法以檢測本發(fā)明的免疫復(fù)合物的形成，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定哪一種方法適于用于診斷的各免疫復(fù)合物和/或細(xì)胞類型。用于本發(fā)明的免疫復(fù)合物的特異性抗體(例如抗Slc6a4抗體、抗Htr1a抗體、抗MaoA抗體、抗Adrb1抗體、抗Adrb2抗體、抗CRH1型受體抗體、抗CB1抗體、抗FKBP5抗體、抗Tph2抗體、抗Grm1抗體、抗Grik3抗體、抗Grm5抗體、抗Grik2抗體、抗Grm7抗體、抗Gria2抗體、抗Dscam抗體、抗L1cam抗體、抗Tsnax抗體、抗Sgk1抗體和/或抗Stx1a抗體)可采用本領(lǐng)域已知方法標(biāo)記。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，標(biāo)記的抗體可以是第一抗體(即其與特定抗原(例如靶基因特異性抗原)結(jié)合)或與第一抗體結(jié)合的第二抗體(例如標(biāo)記的山羊抗兔抗體、標(biāo)記的小鼠抗人抗體)?？贵w可與標(biāo)記直接綴合或可與酶綴合。本發(fā)明的抗體可以被熒光標(biāo)記(使用與抗體綴合的熒光染料)、放射性標(biāo)記(使用例如125I等放射性標(biāo)記的抗體)或與酶(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)綴合和與顯色底物一起使用以產(chǎn)生比色反應(yīng)。被本發(fā)明的酶綴合的抗體利用的顯色底物包括但不限于用于堿性磷酸酶的AEC、堅(jiān)牢紅、ELF-97底物[2-(5'-氯-2-磷?；趸交?-6-氯-4(3H)-喹唑啉酮]、磷酸對硝基苯酯(PNPP)、酚酞二磷酸和ELF39-磷酸、BCIP/INT、VectorRed(VR)、橙紅和品紅磷酸(AviviC.等,1994,JHistochem.Cytochem.1994；42:551-4)和用于過氧化物酶的NovaRed、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、Vector(R)SG底物、基于魯米諾(luminol)的化學(xué)發(fā)光底物。這些酶的底物可市購獲自Sigma(StLouis，MO，USA)、MolecularProbesInc.(Eugene,OR,USA)、VectorLaboratoriesInc.(Burlingame，CA，USA)、ZymedLaboratoriesInc.(SanFrancisco，CA，USA)、DakoCytomation(Denmark)。可采用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡和放射免疫測定(RIA)分析、免疫沉淀(IP)或通過基于分子量的方法，進(jìn)行可能含有可溶性(例如分泌的、排出的)靶基因多肽的生物樣品(例如血樣或血清)中免疫復(fù)合物的檢測。對于蛋白質(zhì)印跡，從細(xì)胞樣品中提取蛋白質(zhì)，對其進(jìn)行電泳(例如SDS-PAGE)，并印在膜(例如尼龍或PVDF)上。然后使膜與特異性抗體(例如抗Slc6a4抗體、抗Htr1a抗體、抗MaoA抗體、抗Adrb1抗體、抗Adrb2抗體、抗CRH1型受體抗體、抗CB1抗體、抗FKBP5抗體、抗Tph2抗體、抗Grm1抗體、抗Grik3抗體、抗Grm5抗體、抗Grik2抗體、抗Grm7抗體、抗Gria2抗體、抗Dscam抗體、抗L1cam抗體、抗Tsnax抗體、抗Sgk1抗體和/或抗Stx1a抗體)相互作用，所述特異性抗體可直接標(biāo)記或進(jìn)一步經(jīng)過第二標(biāo)記抗體處理。檢測可以是通過放射自顯影、比色反應(yīng)或化學(xué)發(fā)光。該方法允許根據(jù)膜上的相對位置(其表示在電泳期間在丙烯酰胺凝膠中的遷移距離)，定量測定底物的量，并確定其身份。在生物樣品中抗原濃度低的情況下，抗原(靶基因氨基酸序列)的檢測可通過免疫沉淀(IP)進(jìn)行。對于免疫沉淀分析，可使特異性抗體(例如抗Slc6a4抗體、抗Htr1a抗體、抗MaoA抗體、抗Adrb1抗體、抗Adrb2抗體、抗CRH1型受體抗體、抗CB1抗體、抗FKBP5抗體、抗Tph2抗體、抗Grm1抗體、抗Grik3抗體、抗Grm5抗體、抗Grik2抗體、抗Grm7抗體、抗Gria2抗體、抗Dscam抗體、抗L1cam抗體、抗Tsnax抗體、抗Sgk1抗體和/或抗Stx1a抗體)與包括靶基因多肽的樣品(例如細(xì)胞裂解物)直接相互作用，并且可使用與珠粒綴合的第二抗體(例如如果特異性抗體是小鼠單克隆抗體，則第二抗體可以是與例如瓊脂糖珠粒綴合的抗小鼠抗體)，檢測所形成的復(fù)合物。然后可通過離心使珠粒沉淀，之后可使所沉淀的蛋白質(zhì)(例如靶基因多肽和特異性抗體)從珠粒上脫落(例如使用在95℃下的變性)，并使用抗體進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析?；蛘?，可將特異性抗體和珠粒綴合的第二抗體加到含有抗原(靶基因多肽)的生物樣品中從而形成免疫復(fù)合物。或者，如果靶基因多肽是高度糖基化的蛋白質(zhì)，則它也可使用能夠結(jié)合同樣可與珠粒綴合的糖基化多肽(例如ConcavalinA(GEHealthcareBio-Sciences，Uppsala，Sweden))的底物沉淀，接著進(jìn)行上述特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡分析。FACS分析使得能夠檢測存在于細(xì)胞膜上的抗原。簡單地說，將上述特異性抗體與熒光團(tuán)連接，通過細(xì)胞分選儀進(jìn)行檢測，細(xì)胞分選儀在當(dāng)細(xì)胞通過光束時(shí)，讀取每個(gè)細(xì)胞發(fā)射出的光波長。這種方法可以同時(shí)使用兩種或更多種抗體。。靶基因多肽的存在和/或水平還可采用ELISA測定。簡單地說，將含有靶基因抗原的樣品固定在表面(例如微量滴定板的孔)上。加入與酶偶聯(lián)的抗原特異性抗體(例如抗Slc6a4抗體、抗Htr1a抗體、抗MaoA抗體、抗Adrb1抗體、抗Adrb2抗體、抗CRH1型受體抗體、抗CB1抗體、抗FKBP5抗體、抗Tph2抗體、抗Grm1抗體、抗Grik3抗體、抗Grm5抗體、抗Grik2抗體、抗Grm7抗體、抗Gria2抗體、抗Dscam抗體、抗L1cam抗體、抗Tsnax抗體、抗Sgk1抗體和/或抗Stx1a抗體)，并允許與抗原結(jié)合。然后通過利用與抗體偶聯(lián)的酶的比色反應(yīng)，檢測抗體的存在并量化。常用于該方法的酶包括辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶。如果適當(dāng)校準(zhǔn)且在反應(yīng)的線性范圍內(nèi)，則樣品中存在的底物的量與所產(chǎn)生的顏色的量成比例。一般應(yīng)用底物標(biāo)準(zhǔn)以改進(jìn)定量準(zhǔn)確性。靶基因多肽的存在和/或水平還可采用放射免疫測定(RIA)測定。在一個(gè)方案中，該方法包括所需抗原(靶基因多肽)與固定在可沉淀載體(例如瓊脂糖珠粒)上的特異性抗體和放射性標(biāo)記的抗體結(jié)合蛋白(例如用I125標(biāo)記的蛋白A)的沉淀。在沉淀小顆粒中的清點(diǎn)次數(shù)與抗原的量成比例。在RIA的替代方案中，使用標(biāo)記的抗原和未標(biāo)記的抗體結(jié)合蛋白。以不同的量加入含有未知量的抗原的樣品中。標(biāo)記抗原沉淀計(jì)數(shù)的減少與所加樣品中的抗原量成比例。靶基因多肽的存在和/或水平還可采用基于分子量的方法測定。因?yàn)槊庖邚?fù)合物顯示比其組分高的分子量，所以也可采用能夠檢測分子量的這種變化的方法。例如，免疫復(fù)合物可通過凝膠延遲測定法檢測。簡單地說，非變性丙烯酰胺凝膠與樣品一起加載。與其組分相比蛋白質(zhì)產(chǎn)物的大小(分子量)的變化表明免疫復(fù)合物存在。使用非特異性蛋白質(zhì)染色(例如銀染或考馬斯藍(lán)染色)，可觀察到這種向較高分子量的變化。生物樣品例如組織切片(例如石蠟包埋或冷凍切片)中靶基因多肽的原位檢測可采用原位檢測細(xì)胞上抗體結(jié)合的免疫染色方法進(jìn)行。免疫染色方法的實(shí)例包括但不限于熒光標(biāo)記免疫組織化學(xué)(使用與抗體綴合的熒光染料)、放射性標(biāo)記免疫組織化學(xué)(使用放射性標(biāo)記的(例如125I)抗體)和免疫細(xì)胞化學(xué)[使用酶(例如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)和顯色底物以產(chǎn)生比色反應(yīng)]。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，與抗體綴合的酶可利用上述各種顯色底物。優(yōu)選本發(fā)明所用免疫染色是免疫組織化學(xué)和/或免疫細(xì)胞化學(xué)。免疫染色優(yōu)選接著使用與未染色細(xì)胞區(qū)室結(jié)合的染料，使細(xì)胞復(fù)染。例如，如果標(biāo)記的抗體與細(xì)胞質(zhì)中存在的抗原結(jié)合，則核染色(例如Hematoxylin-Eosinstain)是合適的對比染色。按照一個(gè)實(shí)施方案，所述方法包括在減量調(diào)節(jié)miR-181和/或miR-27后測量Tph2基因的表達(dá)。按照一個(gè)實(shí)施方案，所述方法包括在增量調(diào)節(jié)miR-135和/或miR-335后測量Slc6a4基因的表達(dá)。按照一個(gè)實(shí)施方案，所述方法包括在增量調(diào)節(jié)miR-135、miR-335、miR-181、miR-182和/或miR-26后測量Htr1a基因的表達(dá)。按照一個(gè)實(shí)施方案，所述方法包括在增量調(diào)節(jié)miR-27后測量MaoA基因的表達(dá)。按照一個(gè)實(shí)施方案，所述方法包括在增量調(diào)節(jié)miR-19后測量Adrb1基因的表達(dá)。按照一個(gè)實(shí)施方案，所述方法包括在增量調(diào)節(jié)CB1后測量CB1基因的表達(dá)。按照一個(gè)實(shí)施方案，所述方法包括在增量調(diào)節(jié)miR-15后測量CRH1型受體基因的表達(dá)。按照一個(gè)實(shí)施方案，所述方法包括在增量調(diào)節(jié)miR-15后測量FKBP5基因的表達(dá)。如上所述，本發(fā)明人進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，患有心境障礙包括抑郁癥、焦慮癥、雙相型障礙和應(yīng)激的人類受試者血樣中miR-135的水平顯著減量調(diào)節(jié)(與健康人類受試者相比)，且在用抗抑郁療法治療的人類受試者的血樣中增量調(diào)節(jié)(與開始治療前的同一受試者或未治療的人類受試者相比)。因此，提供診斷有需要的人類受試者的心境障礙的方法，所述方法包括測量人類受試者的生物樣品中miR-135的表達(dá)水平，其中與健康受試者生物樣品中的相比，較低的miR-135表達(dá)水平表明有心境障礙。任何心境障礙可按照本發(fā)明診斷，包括但不限于雙相型障礙、抑郁癥、重性抑郁癥、焦慮癥、應(yīng)激、疲勞、認(rèn)知功能受損、驚恐發(fā)作、強(qiáng)迫行為、成癮性、社交恐怖癥、精神分裂癥、睡眠障礙和進(jìn)食障礙(例如神經(jīng)性厭食癥、神經(jīng)性貪食癥、未分類的進(jìn)食障礙、暴食障礙(BED)或異食癖障礙)。測量miR-135(例如miR-135a)的表達(dá)水平通常在生物樣品中進(jìn)行。按照具體的實(shí)施方案，術(shù)語“生物樣品”是指體液例如新鮮全血、分級(jí)全血、血漿、血清、腦脊液(CSF)、尿液、淋巴液和呼吸道、腸道和泌尿生殖道的各種外分泌物、眼淚、唾液、乳汁以及白細(xì)胞包括單核細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞)。通常，全血和分級(jí)全血(即例如通過離心分級(jí)成為單獨(dú)的組分的血樣)包含血液組分的全部，包括血漿、白細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞。血清是即無血細(xì)胞又無凝血因子的血液組分，它是其中除去了血纖蛋白原的血漿。血清包括不用于血液凝固(凝血)的蛋白質(zhì)和電解質(zhì)、抗體、抗原、激素和任何外源物質(zhì)(例如藥物和微生物)。此外，血漿包含血清組分的全部以及凝血因子。按照具體的實(shí)施方案，生物樣品是全血樣品。按照具體的實(shí)施方案，生物樣品是血清或血漿樣品。按照具體的實(shí)施方案，生物樣品是單核細(xì)胞樣品。按照具體的實(shí)施方案，細(xì)胞樣品沒有紅細(xì)胞。按照一個(gè)具體的實(shí)施方案，生物樣品為至少90%白細(xì)胞(例如至少90%單核細(xì)胞)。測量miR-135的表達(dá)水平可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行，例如通過RNA印跡分析、核糖核酸酶保護(hù)測定法和PCR(例如實(shí)時(shí)PCR)。如所述，與健康人類受試者(即未受累于心境障礙的受試者)的生物樣品中的相比，miR-135的較低表達(dá)水平表明有心境障礙。按照一個(gè)實(shí)施方案，與健康人類受試者的生物樣品中的相比，miR-135的較低表達(dá)水平是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的?；加行木痴系K的人類受試者中miR-135的表達(dá)水平可低于健康人類受試者的約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。診斷可采用金標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)一步評(píng)價(jià)并證實(shí)。通常，完整患者病史、身體評(píng)估和全面癥狀評(píng)價(jià)的至少一種有助于確診所述障礙(包括抑郁癥或雙相型障礙的心境障礙)。標(biāo)準(zhǔn)化問卷可用于診斷抑郁癥，例如漢密爾頓抑郁等級(jí)量表(HamiltonRatingScaleforDepression)和貝克抑郁調(diào)查表(BeckDepressionInventory)?？刹捎玫湫蜆?biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)雙相型障礙的診斷。用于診斷雙相型障的最廣泛采用的標(biāo)準(zhǔn)來自美國精神病協(xié)會(huì)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(AmericanPsychiatricAssociation'sDiagnosticandStatisticalManualofMentalDisorders)(例如DSM-IV-TR版)和世界衛(wèi)生組織疾病與有關(guān)健康問題的國際統(tǒng)計(jì)分類(WorldHealthOrganization'sInternationalStatisticalClassificationofDiseasesandRelatedHealthProblems)(例如ICD-10)。此外，可進(jìn)行試驗(yàn)以排除內(nèi)科疾病，例如甲狀腺機(jī)能減退或甲狀腺功能亢進(jìn)、代謝紊亂、全身感染或慢性疾病和梅毒或HIV感染?？刹捎肊EG以排除癲癇，采用頭部CT掃描以排除腦損傷。本發(fā)明人進(jìn)一步表明，在抗抑郁藥療法以后，人類受試者的血液miR-135(例如miR-135a)的水平增量調(diào)節(jié)(參見隨附實(shí)施例部分的實(shí)施例16)。因此，按照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，提供監(jiān)測抗抑郁藥物或治療心境障礙(例如雙相型障礙)的藥物的治療的方法，所述方法包括：(a)用抗抑郁藥物或治療心境障礙的藥物治療有需要的人類受試者；和(b)在治療之前和之后測量人類受試者的生物樣品中miR-135的表達(dá)水平，其中與在通過抗抑郁藥物或治療心境障礙的藥物治療之前miR-135的表達(dá)水平相比在通過抗抑郁藥物或治療心境障礙的藥物治療之后miR-135的較高表達(dá)水平表明有效的治療。按照一個(gè)實(shí)施方案，所述方法另包括(c)當(dāng)在步驟(b)中觀察到較高miR-135表達(dá)水平時(shí)，則對人類受試者進(jìn)行治療以改進(jìn)治療。生物樣品(例如新鮮全血、分級(jí)全血、血漿或血清)通常獲自在用抗抑郁藥物或用治療心境障礙的藥物治療后的人類受試者，然而，血樣還可獲自治療前的受試者用于miR-135水平的進(jìn)一步比較。按照具體的實(shí)施方案，miR-135包含miR-135a。本文所用術(shù)語“抗抑郁藥物”是指任何用于緩解例如重性抑郁癥和精神抑郁癥等心境障礙和例如社交焦慮障礙等焦慮障礙的藥物。示例性抗抑郁藥物包括但不限于選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑(SSRI，例如西酞普蘭、依他普侖、氟西汀、氟伏沙明、帕羅西汀和舍曲林)；5-羥色胺-去甲腎上腺素重?cái)z取抑制劑(SNRI，例如地文拉法辛、度洛西汀、米那普侖和文拉法辛)；去甲腎上腺素能與特異性5-羥色胺能抗抑郁藥(例如米安色林和米氮平)；去甲腎上腺素(去甲腎上腺素)重?cái)z取抑制劑(NRI，例如托莫西汀、馬吲哚、瑞波西汀和維洛沙秦)；去甲腎上腺素-多巴胺重?cái)z取抑制劑(例如安非他酮)；選擇性5-羥色胺重?cái)z取增強(qiáng)劑(例如噻奈普汀)；去甲腎上腺素-多巴胺去抑制劑(NDDI例如gomelatine)；三環(huán)類抗抑郁藥(包括叔胺三環(huán)類抗抑郁藥和仲胺三環(huán)類抗抑郁藥)和單胺氧化酶抑制劑(MAOI)。按照一個(gè)實(shí)施方案，抗抑郁藥物包含選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑(SSRI)、三環(huán)類抗抑郁藥或去甲腎上腺素重?cái)z取抑制劑(NRI)。按照具體的實(shí)施方案，抗抑郁藥物包含選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑(SSRI)。本文所用術(shù)語“治療心境障礙的藥物”是指用于治療包括雙相型障礙在內(nèi)的心境障礙的任何藥物或藥物的任何組合。示例性藥物包括但不限于鋰(例如碳酸鋰、檸檬酸鋰、硫酸鋰)、抗精神病藥物(例如上文所述典型抗精神病藥和非典型抗精神病藥)和情緒穩(wěn)定藥物(例如上文所述丙戊酸(VPA、丙戊酸鹽)、礦物質(zhì)、抗驚厥藥、抗精神病藥)。本發(fā)明方法(單獨(dú)或與上述組合)所包括的其它治療選擇包括非藥物治療策略，包括但不限于臨床心理學(xué)、電驚厥療法、非自愿院禁、光療法、精神療法、經(jīng)顱磁刺激和認(rèn)知行為療法。當(dāng)與治療前的miR-135表達(dá)水平相比治療后達(dá)到miR-135顯著較高的表達(dá)水平時(shí)，確定為有效的抗抑郁/心境障礙治療。治療后受試者中miR-135的表達(dá)水平可比抗抑郁或心境障礙治療前受試者的高約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。還可通過評(píng)價(jià)患者的舒適感，另外或備選，對受試者進(jìn)行行為試驗(yàn)、MRI或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它方法，來實(shí)施監(jiān)測治療。預(yù)期在從該申請完成的專利的使用期限內(nèi)，將研發(fā)出miRNA或備選miRNA修飾的許多相關(guān)抑制劑，術(shù)語微RNA的范圍欲包括所推衍的所有這類新技術(shù)。本文所用術(shù)語“約”是指±10%。術(shù)語“包含”、“含有”、“包括”、“納入”、“具有”及其同根詞意指“包括但不限于”。術(shù)語“由……組成”意指“包括且限于”。術(shù)語“基本由……組成”意指組合物、方法或結(jié)構(gòu)可包括其它成分、步驟和/或部分，但只要其它成分、步驟和/或部分不實(shí)質(zhì)性地改變要求保護(hù)的組合物、方法或結(jié)構(gòu)的基本和新的特征。本文所用單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)指代，除非文中另有明確規(guī)定。例如，術(shù)語“一種化合物”或“至少一種化合物”可包括多種化合物，包括其混合物。在本申請中，本發(fā)明的不同的實(shí)施方案可以范圍形式存在。應(yīng)了解，范圍形式的描述僅出于方便和簡潔，不應(yīng)解釋為本發(fā)明范圍的不可變更的限制。因此，范圍的描述應(yīng)視為具體公開了所有可能的子范圍以及該范圍的各個(gè)數(shù)值。例如，范圍例如1-6的描述應(yīng)視為具體公開了例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等子范圍，以及該范圍的各個(gè)數(shù)，例如1、2、3、4、5和6。不論范圍寬度均適用。每當(dāng)本文規(guī)定數(shù)值范圍時(shí)，均意指包括該指定范圍的任何引述的數(shù)值(分?jǐn)?shù)或整數(shù))。短語“介于”第一標(biāo)示數(shù)字和第二標(biāo)示數(shù)字“之間的范圍”和“從”第一標(biāo)示數(shù)字“到”第二標(biāo)示數(shù)字“的范圍”在本文互換使用，意指包括第一標(biāo)示數(shù)字和第二標(biāo)示數(shù)字和之間的所有分?jǐn)?shù)和整數(shù)。本文所用術(shù)語“方法”是指用于完成指定任務(wù)的方式、手段、技術(shù)和程序，包括但不限于化學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域從業(yè)人員已知或容易由他們從已知的方式、手段、技術(shù)和程序開發(fā)的方式、手段、技術(shù)和程序。要認(rèn)識(shí)到，為了清楚起見，在各個(gè)實(shí)施方案的情況下描述的本發(fā)明的某些特征，也可在單一實(shí)施方案中組合提供。相反，出于簡潔起見，在單一實(shí)施方案的情況下描述的本發(fā)明的不同特征，也可單獨(dú)提供或以任何合適的亞組合提供或適用于本發(fā)明的任何其它描述的實(shí)施方案。在不同實(shí)施方案的情況下描述的某些特征不視為所述實(shí)施方案的必需特征，除非該實(shí)施方案在無所述要素時(shí)是無效的。在下面的實(shí)施例中，提供對上文描述和隨附權(quán)利要求書部分要求保護(hù)的本發(fā)明的不同實(shí)施方案和方面的實(shí)驗(yàn)支持。實(shí)施例下面參照以下實(shí)施例，連同上文的描述，以非限制性方式說明本發(fā)明的一些實(shí)施方案。一般而言，本文所用命名法和用于本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)室程序包括分子、生物化學(xué)、微生物和重組DNA技術(shù)。參考文獻(xiàn)中全面闡釋了所述技術(shù)。參見例如"MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrook等(1989)；"CurrentProtocolsinMolecularBiology"第I-III卷,Ausubel,R.M.編輯(1994)；Ausubel等,"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning",JohnWiley&Sons,NewYork(1988)；Watson等,"RecombinantDNA",ScientificAmericanBooks,NewYork；Birren等(編輯)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries",第1-4卷,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998)；美國專利號(hào)4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057給出的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook",第I-III卷,Cellis,J.E.編輯(1994)；"CurrentProtocolsinImmunology"第I-III卷,ColiganJ.E.編輯(1994)；Stites等(編輯),"BasicandClinicalImmunology"(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(編輯),"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.FreemanandCo.,NewYork(1980)；可獲得的免疫測定法大量描述于專利和科學(xué)文獻(xiàn)中，參見例如美國專利號(hào)3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.編輯(1984)；“NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.和HigginsS.J.,編輯(1985)；"TranscriptionandTranslation"Hames,B.D.和HigginsS.J.編輯(1984)；"AnimalCellCulture"Freshney,R.I.編輯(1986)；"ImmobilizedCellsandEnzymes"IRLPress,(1986)；"APracticalGuidetoMolecularCloning"Perbal,B.,(1984)以及"MethodsinEnzymology"第1-317卷,AcademicPress；"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress,SanDiego,CA(1990)；Marshak等,"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996)；其全部通過引用予以結(jié)合就像在本文完全闡述一樣。在該整個(gè)文件中提供其它普通參考文獻(xiàn)。本文的方法被視為是本領(lǐng)域眾所周知的，出于方便讀者而提供。其中所含全部信息通過引用予以結(jié)合。實(shí)施例15-羥色胺神經(jīng)元中miR的差異表達(dá)材料與實(shí)驗(yàn)方法5HT神經(jīng)元微RNA微陣列培養(yǎng)來自ePETYFP小鼠胚期第12天的后腦細(xì)胞，分選以將5HT神經(jīng)元與周圍的非5HT神經(jīng)元區(qū)分開來。將包括miRNA群的總RNA純化，標(biāo)記，并按照生產(chǎn)商說明書，在基于SangermiRBase12.0版的AgilentMousemiRNAMicroarray(AgilentTech，Mississauga，ON，Canada)設(shè)計(jì)編號(hào)021828上雜交。掃描微陣列，提取數(shù)據(jù)，應(yīng)用FeatureExtractionSoftware(AgilentTechnologies)處理。在掃描后，應(yīng)用Partek?GenomicsSuite(PartekInc.,St.Louis,MO)分析GeneView.txt文件的強(qiáng)度輸出數(shù)據(jù)，使微RNA的差異性相對表達(dá)量化。對數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2變換，進(jìn)行分位數(shù)歸一化，并按照GeneView文件中的標(biāo)記“gIsGeneDetected”過濾。666種鼠miR中，在該過濾步驟時(shí)，保留198種用于進(jìn)一步分析。然后通過使用1.5倍變化的閾值，以ANOVA的顯著性，鑒定差異表達(dá)的miR。在ANOVA檢驗(yàn)內(nèi)計(jì)算對比度。對于假陽性降低應(yīng)用Benjamini和Hochberg校正(多重檢驗(yàn)校正)。將3'UTR克隆至Psicheck2螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒中從小鼠基因組DNA或總腦cDNA中PCR擴(kuò)增Slc6a4、Htr1a、MaoA和Tph2的3'UTR序列。按照生產(chǎn)商準(zhǔn)則，使3'UTRPCR片段與pGEM-Teasyvector(Promega)連接，并進(jìn)一步亞克隆至Psicheck2報(bào)道質(zhì)粒(Promega)中螢光素酶3'端的單一NotI位點(diǎn)中。用種子匹配序列間的引物突出端合成沒有miR-135種子序列的突變的3'UTR序列。通過判斷性切割和測序證實(shí)克隆方向。轉(zhuǎn)染和螢光素酶測定使HEK293T細(xì)胞以48孔形式在聚L-賴氨酸生長至70-85%匯合，用下列質(zhì)粒使用聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染：5ngPsicheck2-3'UTR質(zhì)粒和215ng特定miRNA的過量表達(dá)載體或空miR-vec過量表達(dá)質(zhì)粒。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，使細(xì)胞溶解，并如前所述測定螢光素酶報(bào)道分子活性[ChenA.等,MolEndocrinol(2005)19:441-58]。使海腎螢光素酶值歸一化至對照螢火蟲螢光素酶水平(從同一載體轉(zhuǎn)錄，但不受所測3'UTR影響)，對每個(gè)條件的6孔重復(fù)取平均。動(dòng)物和飼養(yǎng)在顛倒的12小時(shí)光/暗周期下，將10周齡成年C57BL/6J雄性小鼠(Harlan，Jerusalem，Israel)關(guān)養(yǎng)在受控溫度室(22±1℃)下。食物和水可任意獲得。所有實(shí)驗(yàn)方案均獲魏茨曼科學(xué)研究所機(jī)構(gòu)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(InstitutionalAnimalCareandUseCommitteeofTheWeizmannInstituteofScience)批準(zhǔn)。急性制動(dòng)應(yīng)激范例在其暗周期，將成年小鼠引入50ml通風(fēng)管30分鐘。慢性社交失敗如前所述，對小鼠進(jìn)行社交失敗方案處理[KrishnanV.等,Cell(2007)131:391-404]。簡單地說，將小鼠放到攻擊性ICR小鼠的養(yǎng)育籠中，它們在籠中在身體上互動(dòng)5分鐘。在此期間，ICR小鼠攻擊闖入小鼠，闖入者顯露附屬姿態(tài)。然后將穿孔的透明有機(jī)玻璃隔板放在動(dòng)物之間，把小鼠留在同一籠中24小時(shí)以允許感官接觸。然后在接下來的10天，每天用陌生ICR小鼠重復(fù)該過程?？挂钟羲幹委熜∈蠼邮苋h(huán)類-丙米嗪，或SSRI-氟西汀，或NRI-瑞波西汀(20mg/kg，在鹽水中)或鹽水的i.p.注射。慢性注射連續(xù)進(jìn)行18-21天，在顯微切割前24小時(shí)進(jìn)行急性注射。中縫核的顯微切割和血漿收集在取出腦后從小鼠中縫核(RN)提取腦樣品，將腦樣品放在丙烯酸酯類腦基質(zhì)(acrylbrainmatrix)(Stoelting)中。根據(jù)指定的解剖標(biāo)記，使用標(biāo)準(zhǔn)刀片(GEM)取出切片。使用鈍的14G注射器，從自基質(zhì)取出的3mm切片中提取RN區(qū)。另外，在含EDTA的管中收集軀干血以避免凝血。在4℃下以3,500g離心30分鐘后，分離血漿，并保持在-70℃下直到RNA純化。微RNA純化和定量RT-PCR表達(dá)分析按照生產(chǎn)商說明書，使用miRNeasymini試劑盒(Qiagen)，從分選出的神經(jīng)元、冰凍腦鉆取物(brainpunch)和血漿分離mRNA，包括微RNA，使用miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒miRNA處理以產(chǎn)生cDNA。然后在AB7500熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)中，按照生產(chǎn)商準(zhǔn)則使用SYBR?GreenPCR試劑盒(Qiagen)，分析cDNA樣品。每種miR的特異性引物與商品化通用引物一同使用，同時(shí)U6snRNA用作內(nèi)部對照。表1B：用于實(shí)時(shí)PCR的引物序列基因引物序列SEQIDNO.miR135aTATGGCTTTTTATTCCTATGTGA1miR135bTATGGCTTTTCATTCCTATGTGA2miR375TTTGTTCGTTCGGCTCGCGTGA3U6GATGACACGCAAATTCGTGAA4miR124TAAGGCACGCGGTGAATGCC5表1C：用于分子克隆的引物序列miR135b過量表達(dá)病毒載體的克隆用加入限制性內(nèi)切酶AgeI位點(diǎn)的引物，通過PCR從小鼠基因組DNA擴(kuò)增Pre-miR-135b，然后使pGEM-TEasy載體(Promega，Madison，WI)Slc6a4化。在pGEM-TEasy測序和pGEM-TEasy和pEGFP載體(ClontechlaboratoriesInc.，MountainView，CA)兩者用AgeI消化后，使成熟前miR-135b序列與pEGFP載體連接以構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-miR-135b。之后，用BamHI和BsrGI切割pEGFP-miR-135b，同時(shí)用相同的酶切割pCSC-E/Syn-eGFP質(zhì)粒，并且使miR-135b-eGFP序列與pCSC-E/Syn連接以構(gòu)建pCSC-eSNY-pre-miR-135b-eGFP質(zhì)粒，該質(zhì)粒通過限制性內(nèi)切核酸酶分析和DNA測序證實(shí)。慢病毒載體的產(chǎn)生如前所述，在HEK293T細(xì)胞中通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組慢病毒[NaldiniL等，ProcNatlAcadSciUSA(1996)93:11382-8]。簡單地說，在轉(zhuǎn)染后48和72小時(shí)收獲感染性慢病毒，通過0.45μm小孔醋酸纖維素濾器過濾，并通過超速離心濃縮。慢病毒的大腦內(nèi)注射為了提供對立體定位手術(shù)和慢病毒遞送部位的精確控制，發(fā)明人使用計(jì)算機(jī)導(dǎo)向立體定位儀和電動(dòng)納米注射器(motorizednanoinjector)(AngleTwoTMStereotaxicInstrument，myNeurolab)。如前所述[SingerO.等,NatNeurosci(2005).8,1343-9]，將小鼠在全身麻醉下放在立體定位儀上，按照Franklin和Paxinos圖集的定義確定坐標(biāo)。使用與電動(dòng)納米注射器系統(tǒng)連接的Hamilton注射器遞送慢病毒制品，以每分鐘0.2μl的速率注射溶液。在兩周恢復(fù)期后，對小鼠進(jìn)行行為和生理研究，之后麻醉，并用磷酸鹽緩沖的4%低聚甲醛灌注。將固定腦連續(xù)切成30μ切片，以利用免疫組織化學(xué)證實(shí)注射部位的準(zhǔn)確性。免疫組織化學(xué)如前所述，進(jìn)行用于免疫組織化學(xué)的方法[ChenA等,JNeurosci(2006)26:5500-10]。對于GFP免疫染色，發(fā)明人使用在兔中產(chǎn)生的生物素化抗GFP抗體作為第一抗體(Abcam，Cambridge，UK)，鏈霉抗生物素綴合的Cy2作為第二抗體(JacksonImmunoresearchLaboratoriesInc,WestGrove,PA,USA)。行為評(píng)估在每個(gè)試驗(yàn)之前，在習(xí)慣試驗(yàn)室2小時(shí)后，進(jìn)行所有的行為評(píng)估。懸尾試驗(yàn)在TSE懸尾監(jiān)測儀(TSESystems,BadHomburg,Germany)中進(jìn)行懸尾試驗(yàn)。用帶子捆住每只小鼠尾，從力傳感器上懸掛10分鐘。根據(jù)預(yù)設(shè)置的閾值，通過軟件計(jì)算并記錄不活動(dòng)所花時(shí)間和掙扎所花時(shí)間。改良強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)如前所述，進(jìn)行懸尾試驗(yàn)[KrishnanV和NestlerEJ，Nature(2008)455：894-902]。簡而言之，所用裝置是塑料水桶，直徑為18cm，裝入25℃水至15cm深度。將各小鼠放入塑料水桶的中央，開始6分鐘視頻記錄的試驗(yàn)階段。采用EtoVisionXT(Noldus，Wageningen，Netherlands)，在測試的2-6分鐘內(nèi)為不活動(dòng)所花持續(xù)時(shí)間自動(dòng)評(píng)分。自主活動(dòng)能力為了控制產(chǎn)生于步行運(yùn)動(dòng)差異的行為效果的可能性，在48小時(shí)期內(nèi)檢查小鼠的自主活動(dòng)能力，這之前習(xí)慣幾天。把小鼠單只關(guān)養(yǎng)在專門的養(yǎng)育籠中，并采用InfraMot系統(tǒng)(TSESystems,BadHamburg,Germany)測量運(yùn)動(dòng)。統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)表示為均值+/-SEM。為了檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)顯著性，在其中只比較兩組的情況下，例如在微陣列驗(yàn)證qPCR間，應(yīng)用斯氏t檢驗(yàn)。應(yīng)用單因素ANOVA，對例如螢光素酶測定中不同處理間的多個(gè)組進(jìn)行比較。在2個(gè)獨(dú)立變量的情況下，例如在急性和慢性兩個(gè)期間的SSRINRI注射，采用兩因素ANOVA。當(dāng)需要顯示統(tǒng)計(jì)顯著性時(shí)，應(yīng)用事后t檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)，組間的差異被視為顯著。結(jié)果從ePETYFP胚胎的RN分離5HT神經(jīng)元，使用miR微陣列，將其miR表達(dá)概況與獲自同一核的非5HT神經(jīng)元進(jìn)行比較(圖1A)。發(fā)現(xiàn)14種miR增量調(diào)節(jié)，且5HT神經(jīng)元中27種減量調(diào)節(jié)是非5HT神經(jīng)元的2倍(參見下表2A-B)。對于在5HT神經(jīng)元中增量調(diào)節(jié)的miR例如miR-375(P=0.0071；圖1B)和減量調(diào)節(jié)的miR例如miR-135a(P=0.0075；圖1C)，采用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行了陣列結(jié)果的代表性驗(yàn)證。為了進(jìn)一步研究miR作為5HT神經(jīng)元的調(diào)節(jié)劑的作用，以假設(shè)驅(qū)動(dòng)方式進(jìn)行了廣泛的生物信息學(xué)分析。之前顯示與精神病理學(xué)有關(guān)的已知5-羥色胺相關(guān)基因的靶向預(yù)測與微陣列結(jié)果交叉。選擇下列在RN的5HT神經(jīng)元中表達(dá)的4種蛋白質(zhì)編碼靶基因用于測試：負(fù)責(zé)5HT重?cái)z取的5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(亦稱SERT或Slc6a4)；5-羥色胺抑制性受體1a(亦稱Htr1a)；腦中5HT合成的限速酶色氨酸羥化酶2(Tph2)和使5HT鈍化的單胺羥化酶(MaoA)。應(yīng)用2種不同的基于網(wǎng)絡(luò)的算法，進(jìn)行了這些基因的微RNA靶向預(yù)測：TargetScan[www(dot)targetscan(dot)org]和Miranda[www(dot)microrna(dot)org]，并且同與非-5RH細(xì)胞相比在5HT神經(jīng)元miR陣列中變化達(dá)至少±1.5的91種miR列表交集。根據(jù)miR陣列數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析，選擇8種miR用于進(jìn)一步的體外研究(圖1D-G)。表2A：與非5-羥色胺能相比在5HT神經(jīng)元中增量調(diào)節(jié)的miR的列表(2倍以上)。微RNA名稱倍數(shù)變化mmu-miR-37520.72mmu-miR-376c11.73mmu-miR-7a4.44mmu-miR-1372.87mghv-miR-M1-22.79mmu-miR-7092.61mmu-miR-291b-5p2.51mmu-miR-12242.40mmu-miR-18922.37mmu-miR-7022.31mmu-miR-139-3p2.25mmu-miR-7622.24mmu-miR-671-5p2.10mmu-miR-483*2.04表2B：與非5-羥色胺能相比在5HT神經(jīng)元中減量調(diào)節(jié)的miR的列表(2倍以上)。微RNA名稱倍數(shù)變化mmu-miR-691-5.10mmu-miR-466l-4.11mmu-miR-17-3.95mmu-miR-376b-3.18mmu-miR-124-3.13mmu-miR-218-3.08mmu-miR-128-2.99mmu-miR-140*-2.92mmu-miR-148a-2.86mmu-miR-340-5p-2.86mmu-miR-181c-2.82mmu-miR-210-2.72mmu-miR-135a-2.69mmu-miR-27a-2.66mmu-miR-452-2.45mmu-miR-370-2.20mmu-miR-300-2.19mmu-miR-376a-2.17mmu-miR-127-2.13mmu-miR-15b-2.12mmu-miR-101a-2.07mmu-miR-16-2.06mmu-miR-324-5p-2.05mmu-miR-434-5p-2.05mmu-miR-92a-2.03mmu-miR-669i-2.00進(jìn)行了體外螢光素酶測定法以檢測受測5HT相關(guān)基因的3’UTR和所預(yù)測的推定靶向它的miR之間的miR-靶標(biāo)相互作用。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Tph23'UTR被miR-27b(P=0.0051)和miR-181C(P=0.0305，圖1H)輕微抑制(約20%)，MaoA3'UTR也被miR-27b抑制(P=0.0008，圖1I)。Slc6a43'UTR(圖2A和2C)和Htr1a3'UTR(圖2B和2D)的miR-135打靶導(dǎo)致這些轉(zhuǎn)錄物的翻譯被強(qiáng)抑制。雖然miR-135a導(dǎo)致Slc6a4(P=0.014)和Htr1a(P<0.0001)約30%抑制，但miR-135b引起Slc6a4(P=0.0002)和Htr1a(P<0.0001)約50%抑制。另外通過miR-335(P<0.0001)、miR-181c(P=0.0029)和miR-26a(P<0.0001，圖2D)產(chǎn)生Htr1a3'UTR的顯著抑制。更多的基因組方法生物信息學(xué)分析顯示slc6a43'UTR中miR-135種子匹配(圖2E)和Htr1a3'UTR中2個(gè)已鑒定的種子匹配之一(圖2F)的強(qiáng)保守性。Slc6a4轉(zhuǎn)錄物3’UTR中的突變(其除去了miR-135的miR種子匹配)研究顯示，通過其種子匹配序列介導(dǎo)Slc6a4的miR-135a和miR-135b打靶兩者。由miR-135誘導(dǎo)的抑制被Slc6a43'UTR的突變完全阻斷(圖2G)。單獨(dú)或同時(shí)使Htr1amiR-135種子匹配突變顯示，miR-135a通過遠(yuǎn)端且非近端的種子匹配抑制Htr1a3'UTR，而miR-135b通過兩個(gè)預(yù)測的位點(diǎn)起作用(圖2H)。發(fā)明人進(jìn)一步測試了在不同的環(huán)境攻擊或藥物治療后RN-miR-135表達(dá)體內(nèi)的調(diào)節(jié)。在操控小鼠(即急性制動(dòng)應(yīng)激)后，取出RN，提取RNA，采用實(shí)時(shí)PCR測試miR-135水平。由于已知通過急性應(yīng)激使5HT水平處于警戒狀態(tài)，發(fā)明人測試了在急性約束應(yīng)激后不同時(shí)間點(diǎn)的miR-135水平，并且發(fā)現(xiàn)在急性應(yīng)激后90分鐘miR-135a和miR-135b兩者減量調(diào)節(jié)(P<0.0001)。與對照小鼠相比，這些miR水平的降低在應(yīng)激后24小時(shí)仍保持(對于miR-135a，P=0.0357，圖3A；對于miR-135b，P=0.0055，圖3B)。此外，由于已知在抑郁患者和在抗抑郁藥施藥后5HT神經(jīng)元功能及Slc6a4和Htr1a表達(dá)水平受強(qiáng)烈影響，因此發(fā)明人測試了暴露于用于誘導(dǎo)抑郁樣行為的環(huán)境模型(慢性社交失敗模型)和三環(huán)類抗抑郁藥丙米嗪的小鼠中兩種miR變體的水平。引人關(guān)注的是，慢性社交失敗應(yīng)激不改變中縫核中的miR-135水平，然而，在受應(yīng)激和未受應(yīng)激的小鼠兩者中，急性或慢性給予丙米嗪增加RN中的miR-135a(P=0.003；圖3C)和miR-135b(P=0.0093；圖3D)表達(dá)水平。由于丙米嗪不是特異性5HT重?cái)z取抑制劑，因此發(fā)明人進(jìn)一步測試了急性和慢性選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑(SSRI)氟西汀和去甲腎上腺素重?cái)z取抑制劑(NRI)瑞波西汀兩者的影響，并發(fā)現(xiàn)在急性和慢性SSRI治療后miR-135a水平的穩(wěn)固升高(P<0.0001，圖3E)，但RN中的miR-135b水平則不(圖3F)。為了進(jìn)一步探索miR-135水平在整個(gè)動(dòng)物背景下的重要性，發(fā)明人操作體內(nèi)特別是成年小鼠RN中的miR-135水平，并測試了其對小鼠抑郁樣行為的作用。為此，發(fā)明人使用也在GFP報(bào)道分子中共表達(dá)的增強(qiáng)型突觸蛋白啟動(dòng)子，構(gòu)建了在神經(jīng)元中特異性過量表達(dá)miR-135b的重組慢病毒(參見上文的材料與實(shí)驗(yàn)方法部分和圖4A)。發(fā)明人通過將其注射到成年小鼠的RN中，對慢病毒進(jìn)行了體內(nèi)測試，并與對照慢病毒注射小鼠RN中的miR-135b水平進(jìn)行了比較。miR-135b水平的實(shí)時(shí)PCR分析顯示與對照慢病毒注射小鼠相比的10倍誘導(dǎo)(P=0.0032，圖4B)。將用miR-135b過量表達(dá)注射的成年小鼠暴露于慢性社交失敗，以開始抑郁樣行為，隨后進(jìn)行行為測試。在行為測試后，給小鼠灌注，針對注射部位的位置對腦進(jìn)行分析(圖4C-D)。RNmiR-135過量表達(dá)小鼠顯示在強(qiáng)迫游泳中(P=0.0088在第3分鐘內(nèi)，P=0.00330對于第4分鐘；圖4E)和在懸尾試驗(yàn)中(P=0.07356在試驗(yàn)的最后5分鐘內(nèi)，圖4F)不活動(dòng)時(shí)間減少，而無任何所觀察到的在其養(yǎng)育籠運(yùn)動(dòng)中的變化(圖4G-H)，表明了miR-135過量表達(dá)的抗抑郁作用。總之，本發(fā)明人測定了RN5-羥色胺能和非5-羥色胺能神經(jīng)元的特異性miR表達(dá)指紋。本發(fā)明人將該獨(dú)特的數(shù)據(jù)集與5HT相關(guān)基因的miR打靶的生物信息學(xué)預(yù)測交集。本發(fā)明人采用3’UTR螢光素酶測定并且在突變研究中體外測試了Tph2、MaoA、Slc6a4和Htr1a的靶向預(yù)測，揭示了除miR-靶標(biāo)相互作用以外，miR-135對Sl6a4和Htr1a3’UTR兩者的強(qiáng)抑制作用。最后，本發(fā)明人顯示，成年小鼠RN中miR-135的位點(diǎn)特異性過量表達(dá)導(dǎo)致社交失敗后抑郁樣行為減少。實(shí)施例2miR-19特異性靶向1型β腎上腺素能受體(Adrb1)材料與實(shí)驗(yàn)方法將3'UTR克隆至Psicheck2螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒中從小鼠基因組DNA中PCR擴(kuò)增ADRb1的3'UTR序列。缺乏所有4個(gè)miR-19種子匹配的突變的3'UTR序列由EpochBiolabs,Inc.(TX，USA)合成。按照生產(chǎn)商準(zhǔn)則，使3'UTRPCR片段與pGEM-Teasy載體(Promega)連接，并進(jìn)一步亞克隆至Psicheck2報(bào)道質(zhì)粒(Promega)中螢光素酶3'端的單一NotI位點(diǎn)中。通過判斷性切割和測序證實(shí)克隆方向。轉(zhuǎn)染和螢光素酶測定使HEK293T細(xì)胞或HT22神經(jīng)元細(xì)胞以48孔形式在聚L-賴氨酸上生長至70-85%匯合，并用下列質(zhì)粒使用聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染：Psicheck2-3'UTR質(zhì)粒、pEGFP質(zhì)粒中的前-mmu-miR-19b過量表達(dá)或僅pEGFP質(zhì)粒(clontech)、miR-19b敲減(KD)質(zhì)粒(Genecopoeia)或?qū)φ?KD質(zhì)粒(Genecopoeia)。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，使細(xì)胞溶解，并如前所述測定螢光素酶報(bào)道分子活性[ChenA.等,MolEndocrinol(2005)19:441-58]。使海腎螢光素酶值歸一化至對照螢火蟲螢光素酶水平(從同一載體轉(zhuǎn)錄，但不受所測3'UTR影響)，對每個(gè)條件的6孔重復(fù)取平均。結(jié)果在其3'UTR含有若干重復(fù)序列的具有不同的進(jìn)化保守的miRNA靶序列的應(yīng)激相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析顯示miR-19為用于1型β腎上腺素能受體(Adrb1)打靶的有力備選物，其在Adrb13'UTR上具有3個(gè)極保守和1個(gè)不太保守的miR-19種子匹配。Adrb1是在不同的腦區(qū)(包括杏仁核、海馬和室旁核(PVN))表達(dá)的腎上腺素能受體。如前所述杏仁核的Adrb1影響焦慮樣行為[FuA等,BrainRes(2008)1211:85-92；RudoyCA和VanBockstaeleEJ,ProgNeuropsychopharmacolBiolPsychiatry(2007)31:1119-29]和恐懼記憶[RoozendaalB等，JNeurosci(2004)24：8161-9；RoozendaalB等，Neuroscience(2006)138：901-10]。引人注意的是，Adrb1存在于杏仁核的CRF陽性細(xì)胞中，并且是通過進(jìn)一步激活腺苷酸環(huán)化酶(AC)的G發(fā)揮其作用的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。有10個(gè)已知的編碼AC的基因，即ADCY1-10。這些中的3個(gè)(ADCY1、ADCY7和ADCY9)在生物信息學(xué)上預(yù)測為被miR-19打靶。ADCY1具有腦特異性表達(dá)，并且之前顯示ADCY1在小鼠前腦中的過量表達(dá)增強(qiáng)再認(rèn)記憶和LTP[WangH等，NatNeurosci(2004)7：635-42]。為了研究miR-19是否的確通過其在Adrb1-3'UTR或ADCY1-3’UTR上的假定靶序列調(diào)節(jié)Adrb1或ADCY1表達(dá)，將Adrb1-3'UTR(圖5)或ADCY1-3’UTR的完整或突變形式克隆在Psicheck2表達(dá)質(zhì)粒螢光素酶基因的下游。在ADRb1-3'UTR的突變形式中，缺乏miR-19b的全部4個(gè)種子匹配(圖5)。在部分ADCY1-3'UTR的突變形式中，只是缺乏保守的種子匹配(3個(gè)之一)。采用螢光素酶測定法測定miR-19和Adrb1-3'UTR之間以及miR-19和ADCY1-3’UTR之間的相互作用的性質(zhì)。在內(nèi)源表達(dá)低水平的miR-19的HT22細(xì)胞中，在由ADRb1-3’UTR的完整或突變形式控制的螢光素酶水平間未觀察到差異(圖6A)。然而，當(dāng)miR-19b在HT22細(xì)胞中過量表達(dá)時(shí)，螢光素酶水平在由完整形式驅(qū)動(dòng)時(shí)顯著(約2倍)低于ADRb1-3’UTR的突變形式(歸一化螢光素酶表達(dá)的普遍的似乎非特異性降低除外)(圖6B)。在內(nèi)源表達(dá)高水平的miR-19b的HEK293T細(xì)胞中，受ADRb1-3’UTR調(diào)節(jié)的螢光素酶表達(dá)水平是ADRb1-3’UTR的突變形式調(diào)節(jié)時(shí)表達(dá)的1/2-1/4(圖6C)。采用miR敲減(KD)系統(tǒng)以操作HEK293T細(xì)胞中的miR-19水平。即，(1)miRCURYLNAKD探針(Exiqon，MA，USA，圖6D)，和(2)基于敲減序列miArrest的質(zhì)粒(Genecopoeia，Rockville，MD?，USA，圖6E)。相對于對照混雜KD探針，LNA-抗miR-19b提高在ADRb1-3’UTR的情況下調(diào)節(jié)時(shí)表達(dá)的螢光素酶水平約20%，并且對ADRb1-3’UTR的突變形式?jīng)]有作用(圖6D)。而基于miR-19bKD的質(zhì)粒，引起相對于對照KD序列受ADRb1-3’UTR的完整形式調(diào)節(jié)而表達(dá)的螢光素酶高達(dá)2倍的提高(圖6E)。由ADRb1-3’UTR的突變體形式驅(qū)動(dòng)的水平，未實(shí)現(xiàn)螢光素酶水平的完全拯救。這可通過如下解釋：探針/基因組序列的miR-19b特異性(省去(spearing)miR-19a調(diào)節(jié))，可能難以完全減量調(diào)節(jié)的HEK293T細(xì)胞中的高miR-19水平，或可與ADRb1-3’UTR中相同種子匹配序列結(jié)合的HEK293T細(xì)胞中表達(dá)的其它可能的miRNA的作用。實(shí)施例3A在慢性應(yīng)激后miR-19a和miR-19b在PFC和杏仁核中增量調(diào)節(jié)材料與實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物和飼養(yǎng)使miR17~92flx/flx小鼠[VenturaA等,Cell(2008)7;132(5):875-86]與CamKIIa-Cre小鼠[DragatsisI等,Genesis.(2000)26(2):133-5]雜交。在顛倒的12小時(shí)光/暗周期下，將轉(zhuǎn)基因小鼠或成年C57BL/6J雄性小鼠關(guān)養(yǎng)在受控溫度室(22±1℃)中。食物和水可任意獲得。所有實(shí)驗(yàn)方案均獲魏茨曼科學(xué)研究所機(jī)構(gòu)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。產(chǎn)生用于成年腦中的miR-19b操作的慢病毒將miR-19bKD序列在RNA聚合酶III-H1啟動(dòng)子后克隆至慢病毒質(zhì)粒中。另外，將Pre-miR-19b序列在神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子(增強(qiáng)型突觸蛋白，ESyn)克隆到慢病毒質(zhì)粒中。產(chǎn)生用于體內(nèi)miR-19b-KD和Pre-miR-19b-過量表達(dá)(OE)實(shí)驗(yàn)的慢病毒。使用這些慢病毒操作靶區(qū)的miR-19b水平，發(fā)現(xiàn)所述靶區(qū)中的miR-19水平在行為/藥物攻擊后改變。產(chǎn)生前腦中沒有miR-19的小鼠為了產(chǎn)生前腦中沒有miR-19的小鼠，發(fā)明人飼養(yǎng)攜帶編碼在CamKIIa啟動(dòng)子下的Cre重組酶的基因的小鼠與攜帶miR簇miR17~92的條件形式的小鼠。miR-19家族包括miR-19a和miR-19b。在小鼠中，基因組miR-19b具有2個(gè)相同的拷貝miR-19b-1和miR-19b-2。miR19a和miR-19b-1位于相同的miRNA簇即miR17~92中，而miR-19b-2位于不同的基因組基因座miR106a~363中。后者似乎在小鼠組織中幾乎沒有或沒有表達(dá)，因此預(yù)期miR17~92簇的敲除足以能夠?qū)η澳X中的miR-19a和miR-19b表達(dá)水平產(chǎn)生重大作用。行為/藥物攻擊可針對ADRb1、ADCY1和其它轉(zhuǎn)錄物和基因產(chǎn)物的表達(dá)水平，對前腦中缺乏miR-17~92簇的小鼠，或其中miR-19被特異性操作(在特定腦區(qū)過量表達(dá)或減量調(diào)節(jié)(KD))的小鼠進(jìn)行檢查。還可針對焦慮樣行為、自主活動(dòng)能力和記憶特性，對這些動(dòng)物進(jìn)行測試。此外，在野生型小鼠中用去甲腎上腺素重?cái)z取抑制劑瑞波西汀急性和慢性全身治療后，檢查了不同的目標(biāo)區(qū)的miR-19a和miR-19b的表達(dá)水平(例如海馬、杏仁核和前腦)。結(jié)果通過評(píng)價(jià)急性或慢性注射瑞波西汀(一種去甲腎上腺素重?cái)z取抑制劑(NRI))的小鼠額葉前皮質(zhì)(PFC)中miR-19a/b的水平，研究了miRNA-19和Adrb1間的生理聯(lián)系(圖12A-D)。如圖12A-D所示，miR-19a/b水平在急性給予瑞波西汀后減量調(diào)節(jié)(圖12A、B)，而在慢性給予瑞波西汀后增量調(diào)節(jié)(圖12C、D)。接下來，通過測量遭受社交失敗方案的小鼠PFC和杏仁核中miR-19a和b的水平，評(píng)價(jià)了應(yīng)激后miR-19的水平(圖13A-D)。如圖13A-D所示，miR-19a和b的水平在慢性應(yīng)激后在PFC和杏仁核兩者中升高。這些結(jié)果說明，miR-19參與中樞應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)。實(shí)施例3BmiRNA-19和大麻素受體1(CB1)材料與實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物和飼養(yǎng)如上文實(shí)施例3A中所述。產(chǎn)生用于成年腦中miRNA-19b操作的慢病毒如上文實(shí)施例3A中所述。結(jié)果CB1是腦中最豐富表達(dá)的GPCR之一，并且在皮質(zhì)、杏仁核、海馬、基底核和小腦中特別豐富(圖15A-B)[HerkenhamM.等,TheJournalofneuroscience:theofficialjournaloftheSocietyforNeuroscience(1991)11:563-583；Mackie,K.Handbookofexperimentalpharmacology(2005)299-325]。CB1受體在其中明確定位以調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞的軸突和軸突終末中高度表達(dá)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，CB1含有與miRNA-19相容的2種子位點(diǎn)。采用螢光素酶測定法，測定miRNA-19和CB1-3'UTR之間的相互作用的性質(zhì)。當(dāng)miRNA-19b在HT22細(xì)胞中與CB1的3`UTR一起過量表達(dá)時(shí)，與相同的3`UTR一起過量表達(dá)的GFP相比，螢光素酶水平顯著(50%)較低(圖14)，這支持miR-19在CB1水平調(diào)節(jié)中的可能作用。進(jìn)行了其它突變實(shí)驗(yàn)以證實(shí)預(yù)測的miR-19種子序列對所觀察的調(diào)節(jié)的作用(如上文對Adrb1的描述)。引人關(guān)注的是，之前的研究令人信服的表明，厭惡記憶的鞏固被基底外側(cè)杏仁核(BLA)中糖皮質(zhì)激素、去甲腎上腺素能和大麻素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)間的相互作用促進(jìn)[Roozendaal,B.等,Neurobiologyoflearningandmemory(2006)86:249-255]。由Hill和McEwen提出的模型[HillM.N.和McEwenB.S.ProcoftheNatAcadofScioftheUSA(2009)106:4579-4580]顯示在BLA中用于記憶鞏固可能的作用機(jī)制(圖16)。如本發(fā)明結(jié)果所示，miRNA-19顯得體外調(diào)節(jié)Adrb1和CB1兩者。使用例如特異性遞送至可能改變Adrb1和CB1水平的BLA中的慢病毒，實(shí)施了miR-19的過量表達(dá)和敲減，以及檢查小鼠在暴露和未暴露于應(yīng)激性攻擊下的學(xué)習(xí)和記憶范例(例如恐懼條件)的行為的試驗(yàn)。實(shí)施例3C經(jīng)歷慢性應(yīng)激的小鼠中差異表達(dá)的miRNA的鑒定材料與實(shí)驗(yàn)方法Ago2蛋白的免疫沉淀將來自是同組(“敏感的”、“適應(yīng)性強(qiáng)的”或?qū)φ?一部分的3只動(dòng)物的3份杏仁核的合并物在補(bǔ)充RNA酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和磷酸抑制劑的NP40緩沖液中勻漿。將樣品在4℃下保持連續(xù)攪拌2小時(shí)。然后將樣品在微量離心機(jī)中在4℃下以12,000rpm離心20分鐘，將上清液放入保持在冰上的新的管中，棄去沉淀。使磁性G蛋白珠粒(Dynabeads，Invitrogen)與Ago2單克隆抗體(WAKO)一起在室溫下旋轉(zhuǎn)溫育10分鐘。在幾次洗滌后，將樣品加入Ago2包被的G蛋白珠粒中，并在4℃下在攪拌中溫育過夜。次日，將珠粒用PBS洗滌3次。對于RNA純化，將珠粒在RLT緩沖液(RNeasy試劑盒，miRNA補(bǔ)充方案)中勻漿。對于蛋白質(zhì)印跡分析，將珠粒在樣品緩沖液中煮沸以從珠粒中釋放蛋白質(zhì)。RNA純化和微陣列按照Qiagen補(bǔ)充方案1：含有miRNA的總RNA的純化，使用RNeasyplus試劑盒(Qiagen)，從Ago2免疫沉淀樣品中分離RNA。按照生產(chǎn)商的建議，使用miRNeasymini試劑盒(Qiagen)，從冰凍腦鉆取物中分離RNA用于其它所有目的，并采用Agilent2100生物分析儀，評(píng)價(jià)RNA完整性。在AffymetrixmiRNA2.0陣列(富集RNA方案)和Affymetrix小鼠基因1.0ST陣列中，進(jìn)一步分析了在Ago2免疫沉淀后來源于應(yīng)激小鼠組織的RNA。結(jié)果為了鑒定和研究從經(jīng)歷慢性應(yīng)激的小鼠范例和/或與“適應(yīng)性強(qiáng)的”或“敏感的”行為表型有關(guān)的杏仁核中分離的差異表達(dá)的miRNA，采用社交失敗方案(參見方法部分)。為了鑒定在社交失敗范例后miRNA及其靶基因的3`UTR之間的真實(shí)聯(lián)系，進(jìn)行了Ago2復(fù)合物的免疫沉淀(IP)，分析了共沉淀的miRNA和mRNA群。當(dāng)形成成熟的miRNA時(shí)，它摻入RISC復(fù)合物中。在RISC復(fù)合物中期間，Ago2促進(jìn)特定miRNA及其靶標(biāo)mRNA3`UTR的相互作用[MeisterG.等,Molecularcell(2004)15:185-197](圖17A)。為了證實(shí)Ago2復(fù)合物確實(shí)可與其結(jié)合的RNA沉淀，在幼稚小鼠的杏仁核上進(jìn)行了IP。使用與單克隆Ago2抗體反應(yīng)的G蛋白磁珠進(jìn)行IP。如圖17B所示，特定的Ago2條帶從NIH3T3細(xì)胞的提取物(圖17B，泳道1)或杏仁核組織的提取物(圖17B，泳道2)中沉淀。為了證實(shí)IP的特異性，將全腦樣品分成2份，其中一份與抗Ago2一起沉淀，另一份與對照IgG1非特異性抗體一起沉淀。特異性Ago2條帶只存在于Ago2沉淀物中(圖17B，泳道3，4)。因此，通過牽出Ago2復(fù)合物，并且分析沉淀物質(zhì)中的miRNA以及mRNA群，有較大機(jī)會(huì)發(fā)現(xiàn)特定腦區(qū)中指定miRNA及其靶定mRNA3`UTR之間的正確關(guān)系。從經(jīng)歷社交失敗范例的小鼠杏仁核中分離Ago2相關(guān)的RNA接下來，根據(jù)Ago2IP實(shí)驗(yàn)的具體結(jié)果，執(zhí)行相同策略以揭示經(jīng)歷社交失敗方案的小鼠腦中的miRNA及其靶標(biāo)mRNA的可能差異。在社交失敗范例10天后，將小鼠分成3組：對照、“敏感的”和“適應(yīng)性強(qiáng)的”。在當(dāng)小鼠在社交失敗范例期間遇到攻擊它的來自相同品系的新的小鼠時(shí)顯示社交回避時(shí)，小鼠被稱為“敏感的”。如果小鼠不回避新的攻擊性小鼠并且與之互動(dòng)，則小鼠稱為“適應(yīng)性強(qiáng)的”。大多數(shù)經(jīng)歷社交失敗的小鼠通常顯示社交回避，因此可被歸類為“敏感的”。預(yù)期實(shí)驗(yàn)中約僅10-20%的小鼠是“適應(yīng)性強(qiáng)的”的。下文顯示所進(jìn)行的社交回避試驗(yàn)的實(shí)例。如圖18A所示，把小鼠單獨(dú)放入社交迷宮中習(xí)慣3分鐘。攝象機(jī)跟蹤整個(gè)迷宮中的小鼠運(yùn)動(dòng)。在圖18C中，使同一小鼠暴露于放在隔板另一邊的新的ICR小鼠。攝象機(jī)跟蹤到遠(yuǎn)離新小鼠的位置的活動(dòng)場地的最遠(yuǎn)角落的小鼠。這種反應(yīng)被視為社交回避，因此這種小鼠被歸類為“敏感的”。相比之下，在圖18B和圖18D中，小鼠不顯示社交回避，因此被歸類為“適應(yīng)性強(qiáng)的”。40只小鼠經(jīng)歷社交失敗范例，40只小鼠用作對照。在社交回避試驗(yàn)后，選擇9只“適應(yīng)性強(qiáng)的”小鼠，9只“敏感的”小鼠和12只對照小鼠用于腦顯微切割。除軀干血外，在社交回避試驗(yàn)后8天從杏仁核、BNST、PFC、中縫背核(中縫背核)和海馬中收集腦樣品。將從3只不同小鼠獲得的3個(gè)杏仁核鉆取物的合并物混合，并進(jìn)行與抗Ago2一起的免疫沉淀。在IP后，從沉淀的物質(zhì)中提取RNA。在從各組中取出3個(gè)杏仁核后，有3個(gè)RNA樣品來自“適應(yīng)性強(qiáng)的”小鼠，有3個(gè)RNA樣品來自“敏感的”小鼠，有4個(gè)RNA樣品來自對照小鼠—共總10個(gè)RNA樣品。在小鼠ST微陣列以及miRNA陣列(兩者均為Affymetrix)中測試各個(gè)樣品。檢查以下2組的每個(gè)中增量或減量調(diào)節(jié)的基因和miRNA：“敏感的”或“適應(yīng)性強(qiáng)的”相對于對照組。如果某種miRNA和靶基因之間發(fā)生相互作用，則發(fā)明人預(yù)期在其總水平上為對立關(guān)系。然而，預(yù)期存在于RISC復(fù)合物(與抗Ago2一起沉淀)中的mRNA處于高水平，因?yàn)樗鼈兩形幢磺谐善?，因此在評(píng)判陣列數(shù)據(jù)時(shí)，發(fā)明人檢查了相對于對照樣品兩者均升高或減量調(diào)節(jié)的miRNA和潛在mRNA靶標(biāo)，因?yàn)檫@表明它們在RISC復(fù)合物中相互作用。微陣列結(jié)果下表3說明使用常規(guī)濾器分析的初步陣列結(jié)果。表3A-B：在與Ago2IP后增量調(diào)節(jié)(表3A)或減量調(diào)節(jié)(表3B)的杏仁核miRNA的列表(表3A)(表3B)*對于表3A-B兩者，數(shù)據(jù)表示為與對照相比“敏感的”或“適應(yīng)性強(qiáng)的”小鼠的倍數(shù)變化。用黑體表示的值顯著改變。選擇在“敏感的”和“適應(yīng)性強(qiáng)的”小鼠組中顯著增量調(diào)節(jié)的幾個(gè)miRNA，并在熱點(diǎn)圖中說明(參見圖19A-B)?；虮磉_(dá)陣列(mRNA)表4：在與Ago2IP后增量調(diào)節(jié)的杏仁核mRNA的列表(續(xù)表4)*數(shù)據(jù)表示為與對照相比“敏感的”或“適應(yīng)性強(qiáng)的”小鼠的倍數(shù)變化。用黑體表示的值顯著改變。表5：在與Ago2IP后減量調(diào)節(jié)的杏仁核mRNA的列表分析了腦中幾種可能的miRNA及其推定靶標(biāo)。實(shí)施例4A作為應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的miR-15a和miR-15b材料與實(shí)驗(yàn)方法總RNA提取在急性應(yīng)激過程后90分鐘，解剖杏仁核組織。使用miRNeasy試劑盒(Qiagen)分離總RNA以保存miRNA。將冰凍腦鉆取物轉(zhuǎn)移到溶解緩沖液中，立即勻漿。將神經(jīng)元原代培養(yǎng)物或N2a細(xì)胞培養(yǎng)物在冰上在孔中溶解。按照生產(chǎn)商建議，進(jìn)行了進(jìn)一步處理。將RNA提取物保存在-80℃下備用。miRNA陣列按照生產(chǎn)商說明書，通過Agilent(Agilent，SantaClara，CA，USA)或Affymetrix(Affymetrix，SantaClara，CA，USA)miRNA微陣列測定miRNA差異表達(dá)。為了評(píng)價(jià)使用Agilent陣列的miRNA差異表達(dá)，按照生產(chǎn)商說明書，將每個(gè)樣品(3個(gè)對照樣品和2個(gè)急性應(yīng)激樣品)100ng總RNA分別標(biāo)記并雜交。使用Agilent微陣列掃描儀掃描陣列。應(yīng)用AgilentFeatureExtraction軟件v9提取數(shù)據(jù)，并應(yīng)用Partek?GenomicsSuite(PartekInc.,St.Louis,Missouri,USA)分析。對來自GeneView.txt文件的數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og變換和分位數(shù)歸一化。為了評(píng)價(jià)使用Affymetrix陣列的miRNA差異表達(dá)，按照生產(chǎn)商說明書，將1μg總RNA/樣品(2個(gè)對照樣品和2個(gè)急性應(yīng)激樣品)分別標(biāo)記并雜交。使用Affymetrix微陣列掃描儀掃描陣列。應(yīng)用Affymetrix掃描儀軟件提取數(shù)據(jù)，并使用AffymetrixmiRNAQCtool軟件的默認(rèn)參數(shù)(背景調(diào)節(jié)、分位數(shù)歸一化、log變換和閾值確定)歸一化。將來自4個(gè)文件的歸一化數(shù)據(jù)輸入PartekGenomics軟件。濾出不存在于任何微陣列中的基因。由于miRNA分布的差異所致，選擇各陣列的不同log比截?cái)嘀?相當(dāng)于各陣列約1標(biāo)準(zhǔn)誤差)：對于Agilent為0.2，對于Affymetrix為0.4。比較陣列之間的log比大于截?cái)嘀档膍iRNA，報(bào)告常見的miRNA。將3'UTR克隆至Psicheck2螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒中從小鼠基因組DNA中PCR擴(kuò)增CRFR1的3'UTR序列。按照生產(chǎn)商準(zhǔn)則，使3'UTRPCR片段與pGEM-Teasy載體(Promega)連接，并進(jìn)一步亞克隆至Psicheck2報(bào)道質(zhì)粒(Promega)中螢光素酶3'端的單一NotI位點(diǎn)中。通過判斷性切割和測序證實(shí)克隆方向。轉(zhuǎn)染和螢光素酶測定使HEK293T細(xì)胞以48孔形式在聚L-賴氨酸中生長至70-85%匯合，并用下列質(zhì)粒使用聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染：Psicheck2-3'UTR質(zhì)粒、pEGFP質(zhì)粒中的前-mmu-miR-15過量表達(dá)或僅pEGFP質(zhì)粒(clontech)。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將細(xì)胞溶解，并如前所述測定螢光素酶報(bào)道分子活性[ChenA.等,MolEndocrinol(2005)19:441-58]。使海腎螢光素酶值歸一化至對照螢火蟲螢光素酶水平(從同一載體轉(zhuǎn)錄，但不受所測3'UTR影響)，對每個(gè)條件的6孔重復(fù)取平均。結(jié)果在急性約束應(yīng)激后90分鐘，miR-15a和miR-15b顯現(xiàn)為增量調(diào)節(jié)(圖7A-B)。以生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-15a和miR-15b靶向CRFR1-3'UTR(圖7C)。HEK293T細(xì)胞中miR-15b的體外過量表達(dá)顯著降低受CRFR1-3'UTR控制的螢光素酶表達(dá)的水平(圖7D)。實(shí)施例4BmiR15對FKBP5的作用材料與實(shí)驗(yàn)方法按上文實(shí)施例4A中的說明。結(jié)果按照陣列結(jié)果，相對于對照組，miR-15a和FK506結(jié)合蛋白5(亦稱FKBP5)兩者均在“敏感的”和“適應(yīng)性強(qiáng)的”小鼠中增量調(diào)節(jié)(圖20A-B)，這表明由于慢性應(yīng)激的結(jié)果它們以RISC復(fù)合物增量調(diào)節(jié)。遺傳研究確立了FKBP5在創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙、抑郁癥和焦慮癥中的作用。例如，發(fā)現(xiàn)FKBP5中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與兒童期創(chuàng)傷相互影響以預(yù)測成年創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)的嚴(yán)重性[Binder,E.B.等,Naturegenetics(2004)36:1319-1325]。這些研究結(jié)果表明，童年時(shí)被虐待、具有這些SNP的個(gè)體在成年時(shí)對PTSD更敏感。發(fā)現(xiàn)在當(dāng)前患有PTSD的個(gè)體中FKBP5較少表達(dá)[Yehuda，R.等，Biologicalpsychiatry(2009)66:708-711]。發(fā)現(xiàn)FKBP5基因具有多個(gè)多腺苷酸化位點(diǎn)，并且與較高比率的抑郁障礙在統(tǒng)計(jì)上關(guān)聯(lián)[Binder等，同上]。FKBP5的3`UTR的進(jìn)一步分析顯示，它具有miR-15的一個(gè)保守種子匹配序列(圖20C)。如果miR-15a的確調(diào)節(jié)FKBP5mRNA，則預(yù)期雖然miR-15a和FKBP5兩者在Ago-2沉淀物中增量調(diào)節(jié)(如微陣列結(jié)果所示，圖20B)，但杏仁核樣品中FKBP5的mRNA或蛋白質(zhì)的總水平應(yīng)下降。為了檢查miR-15a和FKBP5之間的相互作用是否發(fā)生在杏仁核中，對獲自“敏感的”和對照小鼠杏仁核的總RNA樣品進(jìn)行了實(shí)時(shí)PCR分析。如圖21A-B所示，取自敏感小鼠的總RNA提取物中miR-15a水平升高，而FKBP5水平降低。這些結(jié)果表明，在慢性應(yīng)激條件后，miR-15a抑制杏仁核中的FKBP5水平。進(jìn)行了FKBP5的完整和突變的3`UTR形式的克隆用于螢光素酶測定分析，以找出miR-15a和FKBP5間的直接相互作用是否在體外發(fā)生。除FKBP5以外，miR-15可能調(diào)節(jié)參與應(yīng)激反應(yīng)的多個(gè)基因，包括Stx1a(突觸融合蛋白1a)、Sgk1(血清/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶)和Adrb2(圖22)。實(shí)施例4CmiR-181調(diào)節(jié)谷氨酸受體材料與實(shí)驗(yàn)方法將3'UTR克隆至Psicheck2螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒中從小鼠基因組DNA中PCR擴(kuò)增Grm1、Grik3、Grm5、Grik2和Grm7的3'UTR序列。按照生產(chǎn)商準(zhǔn)則，將3'UTRPCR片段連接至pGEM-Teasy載體(Promega)或pJET1.2載體(Fermentas)中，并進(jìn)一步亞克隆至Psicheck2報(bào)道質(zhì)粒(Promega)的螢光素酶3'端處的單個(gè)NotI或XhoI位點(diǎn)。通過判斷性切割和測序證實(shí)克隆方向。慢性社交失敗如前所述，對小鼠進(jìn)行社交失敗方案處理[KrishnanV.等,Cell(2007)131:391-404]。簡單地說，將小鼠放在攻擊性ICR小鼠的養(yǎng)育籠中，它們在籠中在身體上互動(dòng)5分鐘。在此期間，ICR小鼠攻擊闖入小鼠，闖入者顯露附屬姿態(tài)。將穿孔的透明有機(jī)玻璃隔板放在動(dòng)物之間，把小鼠留在同一籠中24小時(shí)以允許感官接觸。然后在接下來的10天，每天用陌生ICR小鼠重復(fù)該過程。結(jié)果miR-181d水平在遭受慢性應(yīng)激的小鼠中顯著提高(圖23)。為了找出miR-181和潛在mRNA靶標(biāo)間的相互作用，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)miR-181可能調(diào)節(jié)谷氨酸受體的許多類型。一般來說，可將谷氨酸受體分成2組，離子型谷氨酸受體(iGluR)(當(dāng)谷氨酸與受體結(jié)合時(shí)形成激活的離子通道孔)和代謝型谷氨酸受體(mGluR)(通過包括G蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)間接激活質(zhì)膜上的離子通道)。在谷氨酸受體的許多特定亞型中，習(xí)慣上將以比谷氨酸高的選擇性與之結(jié)合的化學(xué)物質(zhì)稱為主要亞型。然而研究仍在繼續(xù)，因?yàn)殍b定出亞型，并測量了化學(xué)親和力。幾種化合物常規(guī)用于谷氨酸受體研究中，并且與受體亞型締合：表6：歸類為亞類的谷氨酸受體如圖24和25所示，在miR-181的所有保守的預(yù)測靶標(biāo)中，有6種谷氨酸受體(Grm1、Grik3、Grm5、Gria2、Grik2和Grm7)。之前已表明，miR-181a控制Gria2在海馬神經(jīng)元中的表面表達(dá)[Saba.R.等,MolecularandCellularBiology(2012)32(3):619-32]。進(jìn)行了螢光素酶測定法，以驗(yàn)證miRNA-mRNA相互作用。此外，使條件性miR-181KO小鼠系與特異性cre系雜交從而獲得特定腦核中miR-181的缺失。實(shí)施例5AmiR-182，正常神經(jīng)元活性和精神病理學(xué)行為的精細(xì)調(diào)諧器材料與實(shí)驗(yàn)方法將3'UTR克隆至Psicheck2螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒中從小鼠基因組DNA中PCR擴(kuò)增Htr1a的3'UTR序列。按照生產(chǎn)商準(zhǔn)則，使3'UTRPCR片段與pGEM-Teasy載體(Promega)連接，并進(jìn)一步亞克隆至Psicheck2報(bào)道質(zhì)粒(Promega)中螢光素酶3'端的單一NotI位點(diǎn)中。通過判斷性切割和測序證實(shí)克隆方向。轉(zhuǎn)染和螢光素酶測定使HEK293T細(xì)胞以48孔形式在聚L-賴氨酸上生長至70-85%匯合，并用下列質(zhì)粒使用聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染：Psicheck2-3'UTR質(zhì)粒、pEGFP質(zhì)粒中的前-mmu-miR-182過量表達(dá)或僅pEGFP質(zhì)粒(clontech)。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，使細(xì)胞溶解，并如前所述測定螢光素酶報(bào)道分子活性[ChenA.等,MolEndocrinol(2005)19:441-58]。使海腎螢光素酶值歸一化至對照螢火蟲螢光素酶水平(從同一載體轉(zhuǎn)錄，但不受所測3'UTR影響)，對每個(gè)條件的6孔重復(fù)取平均。慢性社交失敗如前所述，對小鼠進(jìn)行社交失敗方案處理[KrishnanV.等,Cell(2007)131:391-404]。簡單地說，將小鼠放到攻擊性ICR小鼠的養(yǎng)育籠中，它們在籠中在身體上互動(dòng)5分鐘。在此期間，ICR小鼠攻擊闖入小鼠，闖入者顯露附屬姿態(tài)。穿孔的透明有機(jī)玻璃隔板放在動(dòng)物之間，把小鼠留在同一籠中24小時(shí)以允許感官接觸。然后在接下來的10天，每天用陌生ICR小鼠重復(fù)該過程。中縫核的顯微切割和血漿收集在取出腦后，從小鼠中縫核(RN)提取腦樣品，將腦樣品放在丙烯酸酯類腦基質(zhì)(Stoelting)中。根據(jù)指定的解剖標(biāo)記，使用標(biāo)準(zhǔn)刀片(GEM)取出切片。使用鈍的14G注射器，從自基質(zhì)取出的3mm切片中提取RN區(qū)。微RNA純化和定量RT-PCR表達(dá)分析按照生產(chǎn)商說明書，使用miRNeasymini試劑盒(Qiagen)，從分選出的神經(jīng)元、冰凍腦鉆取物和血漿中分離mRNA，包括微RNA，使用miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒miRNA處理，以產(chǎn)生cDNA。然后在AB7500熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)中，按照生產(chǎn)商準(zhǔn)則，使用SYBR?GreenPCR試劑盒(Qiagen)，分析cDNA樣品。每種miR的特異性引物與商品化通用引物一同使用，同時(shí)U6snRNA用作內(nèi)部對照。miR182過量表達(dá)病毒載體的克隆用加入限制性內(nèi)切酶AgeI位點(diǎn)的引物，通過PCR從小鼠基因組DNA中擴(kuò)增Pre-miR-182，然后使pGEM-TEasy載體(Promega，Madison，WI)Slc6a4化。在pGEM-TEasy測序和pGEM-TEasy和pEGFP載體(ClontechlaboratoriesInc.，MountainView，CA)兩者用AgeI消化后，使成熟前miR-182序列與pEGFP載體連接以構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-miR-182。之后，用BamHI和BsrGI切割pEGFP-miR-182，同時(shí)相同的酶切割pCSC-E/Syn-eGFP質(zhì)粒，使miR-182-eGFP序列與pCSC-E/Syn連接以構(gòu)建pCSC-eSNY-pre-miR-182-eGFP質(zhì)粒，該質(zhì)粒通過限制性內(nèi)切核酸酶分析和DNA測序證實(shí)。慢病毒載體的產(chǎn)生如前所述，在HEK293T細(xì)胞中通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生重組慢病毒[NaldiniL等，ProcNatlAcadSciUSA(1996)93:11382-8]。簡單地說，在轉(zhuǎn)染后48和72小時(shí)收獲感染性慢病毒，通過0.45μm小孔醋酸纖維素濾器過濾，并通過超速離心濃縮。結(jié)果迄今為止，主要在癌癥相關(guān)研究(例如人肺腺癌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、膀胱癌、黑素瘤)和DNA修復(fù)中報(bào)告了miR-182。另外，發(fā)現(xiàn)miR-182參與發(fā)育過程(例如內(nèi)耳和視網(wǎng)膜發(fā)育)、在免疫系統(tǒng)中參與T淋巴細(xì)胞的激活，并涉及狼瘡疾病。在神經(jīng)系統(tǒng)中，在感覺器官特異性大鼠背根神經(jīng)節(jié)中包含mi-R182，并且作為晝夜節(jié)律鐘調(diào)節(jié)劑，同時(shí)在重性抑郁癥患者中發(fā)現(xiàn)pre-miR-182的遺傳變體間的關(guān)系[SausE等,HumMolGenet.(2010)19(20):4017-25]。另外，miR-182在12種miR中被列為在習(xí)得性無助行為適應(yīng)性強(qiáng)的雄性大鼠額葉前皮質(zhì)中減量調(diào)節(jié)[SmalheiserNR等，IntJNeuropsychopharmacol.(2011)1-11]。作為5HTmiR微陣列分析一部分進(jìn)行的Htr1a3'UTR的生物信息學(xué)分析意指該基因可能被miR-182打靶。因此，發(fā)明人通過螢光素酶測定法進(jìn)行了體外測試，測試顯示Ht1a3'UTR被miR-182強(qiáng)抑制(圖8)。miR-182的2個(gè)保守種子匹配序列出現(xiàn)在Htr1a小鼠3'UTR中。調(diào)節(jié)研究表明與對照相比，暴露于慢性社交失敗的成年雄性小鼠RN中miR-182表達(dá)水平減量調(diào)節(jié)的極強(qiáng)趨勢(圖9)，這表明miR-182參與對已知誘導(dǎo)抑郁樣行為的環(huán)境刺激物的分子反應(yīng)。針對2個(gè)數(shù)據(jù)庫中的miR-182產(chǎn)生靶向預(yù)測的進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析顯示可能靶標(biāo)的長的列表，包括在正常和病理?xiàng)l件下與神經(jīng)元活性相關(guān)的基因(圖10)。為了進(jìn)一步測試miR-182體外用于鑒定特定miR靶標(biāo)相互作用并揭示miR-182在體內(nèi)調(diào)節(jié)正常和病理性行為中的作用，開發(fā)了用于miR-182操作的質(zhì)粒和慢病毒系統(tǒng)。制備了神經(jīng)元特異性過量表達(dá)慢病毒(圖11A)，并且在神經(jīng)元細(xì)胞系N2a中進(jìn)行了體外測試。這些結(jié)果顯示與對照相比，在用miR-182過量表達(dá)慢病毒感染的細(xì)胞中miR-182水平提高(圖11B)。購買對miR-182有特異性的名為miArrest的敲減質(zhì)粒序列(Genecopoeia，Rockville，MD?，USA，圖11C)，并亞克隆至病毒構(gòu)建體中(圖11C)。在細(xì)胞培養(yǎng)物測試這些系統(tǒng)，并通過位點(diǎn)特異性注射至成年小鼠腦中。開發(fā)了miR-12的失效小鼠以研究miR在視網(wǎng)膜發(fā)育中的作用。最近，發(fā)明人獲得該系的育種配對，并且在產(chǎn)生集落時(shí)，在行為和生理上對miR-182KO及其野生型同胞仔鼠進(jìn)行了表型確定。實(shí)施例6通過急性應(yīng)激調(diào)節(jié)miR182表達(dá)水平材料與實(shí)驗(yàn)方法如上文實(shí)施例5A中所述。結(jié)果檢查了急性應(yīng)激對miR182水平的作用。如圖26所示，在應(yīng)激誘導(dǎo)后24小時(shí)，急性制動(dòng)應(yīng)激導(dǎo)致小鼠中縫核(RN)中miR182表達(dá)水平降低(P<0.01)。miR182顯示在急性和慢性應(yīng)激兩者后，中縫核中的表達(dá)水平降低，表明了可能通過影響其靶基因Ht1a調(diào)節(jié)突觸中的5-HT水平，在中縫核中具有調(diào)節(jié)對應(yīng)激的分子反應(yīng)的作用。用于miR182預(yù)測靶基因的miR-靶標(biāo)相互作用測定法采用螢光素酶測定法，檢查了在廣泛生物信息學(xué)研究后選擇的11個(gè)miR182的預(yù)測靶基因(圖27)。體外測試了靶基因的3'UTR以檢查miR182是否具有抑制作用，通過綴合的報(bào)道基因螢光素酶的活性測量。11個(gè)受測基因中的3個(gè)基因：Dscam(唐氏綜合征細(xì)胞粘附分子)、L1cam(細(xì)胞粘附分子L1)和Tsnax(易位蛋白相關(guān)蛋白X)表明由miR182引起的抑制作用，按照螢光素酶測定(圖27)。在測試miR182的上列靶基因的3'UTR時(shí)，在Tsnax、L1cam和Dscam中觀察到miR182的保守種子匹配序列，這表明這種miR-靶標(biāo)相互作用具有功能性作用(數(shù)據(jù)未顯示)。接下來，證實(shí)了miR182對這3個(gè)基因的直接抑制作用。因此，使3'UTR突變以除去miR182種子匹配序列，并通過螢光素酶測定法體外將正常3'UTR與突變3'UTR進(jìn)行了比較。當(dāng)使其種子匹配序列突變時(shí)，破壞了miR182對L1cam3'UTR的抑制作用(圖28)，同樣在突變的3'UTR中破壞miR182對Tsnax的作用(圖29)，表明了miR182直接靶向該基因。進(jìn)行了用突變的3'UTR針對Dscam和Htr1a的類似驗(yàn)證。使用沒有miR182的小鼠模型以研究體內(nèi)miR182及其靶基因之間的相互作用。發(fā)明人在試驗(yàn)中針對社交行為、學(xué)習(xí)與記憶和精神分裂癥樣行為檢查了miR182KO小鼠的行為表型。實(shí)施例7miR135敲減系統(tǒng)的建立；克隆、慢病毒產(chǎn)生和體外和體內(nèi)驗(yàn)證材料與實(shí)驗(yàn)方法miR135KD病毒載體的克隆miR135bKD質(zhì)粒pEZX-H1-miR135KD-CMV-mCherry和對照pEZX-H1-對照KD-CMV-mCherry購自GeneCopeia(USA)。H1啟動(dòng)子和KD序列使用側(cè)接NheI位點(diǎn)的引物擴(kuò)增，并連接至pGEM-TEasy中。在pGEM-TEasy測序和具有NheI位點(diǎn)的pGEM-TEasy和p156-pRRL-CMV-GFP消化后，使H1-KDmiR和帶切口的p156連接以產(chǎn)生p156-pRRL-H1-miR135bKD-CMV-GFP和p156-pRRL-H1-對照KD-CMV-GFP。結(jié)果為了評(píng)價(jià)RN中miR135水平降低對小鼠5-HT相關(guān)行為的作用，使用基于質(zhì)粒的miR135b抑制劑，在螢光素酶測定法中測試其效率。在該測定法中，將HEK293T細(xì)胞用miR135OE、miR135KD和3'UTR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，并測試了miR135bKD質(zhì)粒阻斷miR135對Slc6a4和Htr1a3'UTR的抑制性作用的能力。Htr1a3'UTR的miR135b抑制作用被miR135KD質(zhì)粒阻斷(圖30A)。同樣，miR135b對Slac6a43'UTR的作用被miR135KD阻斷(圖30B)。這些結(jié)果表明，miR135KD質(zhì)粒的確阻斷miR135的生物活性。將miR135KD序列和對照序列亞克隆至病毒載體中(圖30C)，并產(chǎn)生表達(dá)不同敲減(KD)序列的慢病毒。為了測試慢病毒感染腦組織的能力，將小鼠RN用慢病毒之一感染。實(shí)際上，感染引起GFP表達(dá)(圖30D-E)，表明了miR135bKD慢病毒感染腦組織的能力。實(shí)施例8成年小鼠RN中miR135敲減的行為效果材料與實(shí)驗(yàn)方法行為評(píng)估如上文實(shí)施例6所述，采用用于焦慮和抑郁樣行為的試驗(yàn)，在行為上對小鼠進(jìn)行表征。結(jié)果在miR135KD慢病毒的體外和體內(nèi)驗(yàn)證后，使用慢病毒操作RN中的miR135水平，并測試其對小鼠行為的作用。給成年小鼠注射miR135KD慢病毒，或?qū)D對照慢病毒注射到RN中，在恢復(fù)期后測試焦慮和抑郁樣行為。由于miR135抑制5-HT的負(fù)調(diào)節(jié)劑，我們預(yù)期miR135KD導(dǎo)致突觸中5-HT水平降低，并以此導(dǎo)致焦慮和抑郁樣行為增加。在曠場試驗(yàn)中，觀察到組間無差異(圖31A)，然而在高架十字迷宮試驗(yàn)中，miR135KD小鼠通過表明在開放臂中花較少時(shí)間(P=0.0644)和到訪開放臂較少次數(shù)(P=0.0572，圖31B)的傾向，顯示較高的焦慮樣行為。另外，miR135KD小鼠在開放臂中行走顯著較小的距離(P=0.0433)，并具有在開放臂中到訪較久的傾向(P=0.0124，圖31B)。同樣，在基礎(chǔ)應(yīng)激條件下進(jìn)行的光/暗試驗(yàn)中，與對照相比，通過在光中花較少時(shí)間(P=0.0454，圖31C)，在明室中到訪較少時(shí)間(P=0.0107，圖31D)和在明室行走較短距離(P=0.0402s，圖31E)，miR135KD小鼠顯示焦慮樣行為顯著增加。結(jié)果表明在急性應(yīng)激后40分鐘和24小時(shí)miR135水平降低(圖30A-B)，因此，本發(fā)明的理論是當(dāng)在急性應(yīng)激后測試時(shí)，經(jīng)應(yīng)激的miR135KD小鼠在焦慮樣行為方面與其對照無不同，因?yàn)閷φ招∈罂梢驊?yīng)激所致具有低的miR135水平。實(shí)際上，當(dāng)在明暗轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中再測試時(shí)，在急性應(yīng)激后40分鐘或24小時(shí)測試時(shí)，任何參數(shù)在組間均無差異(圖31C-E)。即在基礎(chǔ)條件下又在藥物操作后，測試了miR135KD的抑郁樣行為。由于顯示miR135水平在給予SSRI后在RN升高(圖31E)，因此推測miR135水平的降低可導(dǎo)致對SSRI反應(yīng)降低。在基礎(chǔ)水平和在SSRI給藥后進(jìn)行的懸尾試驗(yàn)中，在miR135bKD小鼠和對照KD小鼠之間在不活動(dòng)時(shí)間上沒有差異(圖31F)，并觀察到由于SSRI治療所致不活動(dòng)時(shí)間的預(yù)期減少(P<0.0008)。然而，在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中，除了SSRI注射的主要作用以外(P<0.0001)，與對照KD小鼠相比，注射SSRI的miR135KD小鼠在試驗(yàn)的最后2分鐘更不活動(dòng)(P=0.01415分鐘，P=0.04046分鐘；圖31G表明通過降低RN中的miR135水平減少SSRI抗抑郁作用)。這個(gè)結(jié)果意味著miR135是導(dǎo)致由SSRI引起的行為改變的內(nèi)源替代的一部分。實(shí)施例95-HT神經(jīng)元中的miR135過量表達(dá)材料與實(shí)驗(yàn)方法在miR135及其靶基因的表達(dá)水平和在行為方面，將在5-HT神經(jīng)元中過量表達(dá)miR135a的小鼠與其同胞仔鼠對照進(jìn)行了比較。結(jié)果針對焦慮和抑郁樣行為，測試了在小鼠RN的5-HT神經(jīng)元中特異性操作miR135水平的作用。為此，采用Cre-loxP系統(tǒng)，開發(fā)了一個(gè)遺傳系統(tǒng)。準(zhǔn)確地講，使用在5-HTRN陽性神經(jīng)元中特異性表達(dá)Cre重組酶的ePetCre小鼠獲得5-HT特異性，并通過使5-HT特異性Cre系(ePetCre)與有條件的過量表達(dá)miR135a的轉(zhuǎn)基因小鼠系雜交(圖32)，來進(jìn)行miR135過量表達(dá)。通過miR135的實(shí)時(shí)PCR，測試了在5-HT神經(jīng)元中特異性過量表達(dá)miR135的小鼠(miR135OE)RN中的miR135表達(dá)水平，并與對照小鼠(對miR135有條件的過量表達(dá)等位基因陽性但對ePetCRE陰性)進(jìn)行了比較。與對照小鼠相比，miR135OE小鼠顯示近2倍過量表達(dá)(圖33A；P<0.05)。miR135的過量表達(dá)水平類似于在給予SSRI后小鼠RN中測量的水平，表明了該小鼠系是用于研究miR135抗抑郁性質(zhì)的良好模型。另外，與對照相比，miR135靶基因mRNA，Slc6a4(圖33B；P<0.05)和Htr1a(圖33C；P<0.1)在miR135OE小鼠的RN中減量調(diào)節(jié)，表明其靶基因在體內(nèi)被miR135抑制。為了測試在5-HT神經(jīng)元中特異性過量表達(dá)的miR135，將miR135OE小鼠及其同胞仔鼠對照暴露于慢性社交失敗范例，一種已知誘導(dǎo)抑郁和焦慮樣行為的方法，隨后測試焦慮和抑郁樣行為。與對照同胞仔鼠相比，miR135OE小鼠顯示在社交失敗后焦慮樣行為增加。在曠場中，根據(jù)到中心的時(shí)間和到訪次數(shù)，在miR135OE小鼠中觀察到焦慮加強(qiáng)的傾向(P<0.1，圖34A)。然而在明暗轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中，miR135OE小鼠在光下渡過較多時(shí)間(P<0.05，圖34B)，在明室花較少時(shí)間(P<0.01，圖34B)。在高架十字迷宮中觀察到類似結(jié)果(P<0.05，圖34B)，同時(shí)miR135OE小鼠在開放臂中花較多時(shí)間(P<0.05，圖34C)，在開放臂中行走較長距離(P<0.05，圖34C)。miR135OE小鼠在社交失敗后的抑郁樣行為低于對照同胞仔鼠。在懸尾試驗(yàn)中觀察到與對照相比miR135OE小鼠趨于不活動(dòng)時(shí)間減少的傾向(P<0.1，圖34D)，以及在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中不活動(dòng)時(shí)間顯著減少(P<0.05，圖34E)。用于MIR-135SECTION的材料與實(shí)驗(yàn)方法5HT神經(jīng)元的微RNA微陣列如前所述(Wylie等，2010)，對來自ePet-EYFP小鼠胚期第12天的后腦細(xì)胞進(jìn)行FACS分選以將5HTYFP陽性神經(jīng)元與周圍的非5HTYFP陰性細(xì)胞區(qū)分開來。將具有來自各細(xì)胞類型的3個(gè)生物重復(fù)序列的總RNA(包括miRNA群)純化，標(biāo)記，并按照生產(chǎn)商說明書在基于SangermiRBase12.0版的AgilentMousemiRNAMicroarray(AgilentTech，Mississauga，ON，Canada)設(shè)計(jì)編號(hào)021828上雜交。掃描微陣列，提取數(shù)據(jù)，并應(yīng)用FeatureExtractionSoftware(AgilentTechnologies)處理。在掃描后，應(yīng)用Partek?GenomicsSuite(PartekInc.,St.Louis,MO)，對GeneView.txt文件的強(qiáng)度輸出數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使微RNA的差異性相對表達(dá)量化。對數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2變換，進(jìn)行分位數(shù)歸一化，并按照基因View文件中的標(biāo)記“gIsGeneDetected”過濾。666種鼠miR中，在該過濾步驟后保留198種用于進(jìn)一步的分析。然后使用1.5倍變化的閾值鑒定差異表達(dá)的miR。將靶轉(zhuǎn)錄物3'UTR克隆至psiCHEK-2螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒中從小鼠基因組DNA中PCR擴(kuò)增Slc6a4和Htr1a的3'UTR序列。按照生產(chǎn)商準(zhǔn)則，使3'UTRPCR片段與pGEM-Teasy載體(Promega)連接，進(jìn)一步亞克隆至psiCHECK-2報(bào)道質(zhì)粒(Promega)的螢光素酶3'端處的單一NotI位點(diǎn)。用種子匹配序列間的引物突出端合成沒有miR-135種子序列的突變的3'UTR序列。通過判斷性切割和測序證實(shí)克隆方向。表7：用于克隆的寡核苷酸引物轉(zhuǎn)染和螢光素酶測定法使HEK293T細(xì)胞在組織培養(yǎng)板中在聚L-賴氨酸上生長至70-85%匯合，并用下列質(zhì)粒使用聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染：含有野生型或突變的3'UTR和特定miRNA的過量表達(dá)載體(SEQIDNO:210所示miR-135a或SEQIDNO:211所示miR-135b)的psiCHECK-2質(zhì)?；蚩者^量表達(dá)質(zhì)粒。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，使細(xì)胞溶解，并如前所述測定螢光素酶報(bào)道基因活性(Kuperman等，2011)。使海腎螢光素酶值歸一化至對照螢火蟲螢光素酶水平(從同一載體轉(zhuǎn)錄，但不受3'UTR影響)，然后測試，并在對每個(gè)條件的6孔重復(fù)取平均。動(dòng)物和飼養(yǎng)將成年C57BL/6雄性小鼠(Harlan，Jerusalem，Israel)用于體內(nèi)慢病毒實(shí)驗(yàn)。如前所述，使用在5-羥色胺能神經(jīng)元中特異性表達(dá)Cre重組酶的ePet-Cre小鼠(Scott等，2005)。還使用攜帶用于miR-135過量表達(dá)的條件盒(conditionalcassette)的轉(zhuǎn)基因小鼠。在顛倒的12小時(shí)光/暗周期下，將小鼠關(guān)養(yǎng)在受控溫度室(22±1℃)中。食物和水可任意獲得。所有實(shí)驗(yàn)方案在雄性小鼠中進(jìn)行，并且均獲魏茨曼科學(xué)研究所機(jī)構(gòu)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。苯丙胺誘導(dǎo)的活動(dòng)過度大鼠模型在這些實(shí)驗(yàn)中，將大鼠等分到4個(gè)治療組。用miR-135、鋰、丙戊酸鹽或鹽水(對照)對大鼠預(yù)治療，然后各組中一半大鼠給予苯丙胺(0.5mg/kg皮下(s.c.))，另一半給予鹽水(s.c.)?；蛘?，先給予大鼠苯丙胺(0.5mg/kg皮下(s.c.))或鹽水(s.c.)，接著用miR-135、鋰、丙戊酸鹽或鹽水(對照)治療。10分鐘后，將所有大鼠放在活動(dòng)測量儀中，將用miR-135預(yù)治療或治療的大鼠的活動(dòng)度與未治療大鼠(對照組)和與用鋰或用丙戊酸鹽預(yù)治療或治療的大鼠進(jìn)行比較。一周后重復(fù)該程序。氯胺酮誘導(dǎo)的活動(dòng)過度大鼠模型在這些實(shí)驗(yàn)中，將大鼠等分到4個(gè)治療組中：對照、鋰、丙戊酸鹽和miR-135治療大鼠，并如下治療：將大鼠用miR-135、鋰(47.5mg/kg，i.p.，一天兩次)、丙戊酸鹽(200mg/kg，i.p.，一天兩次)或鹽水(i.p.，一天兩次)作為對照預(yù)治療(持續(xù)14天)。在第8和14天之間，用氯胺酮(25mg/kg，i.p.)或鹽水治療這些大鼠。在一個(gè)顛倒的方案中，先給予大鼠氯胺酮(25mg/kg，i.p.)或鹽水，接著給予miR-135、鋰、丙戊酸鹽或鹽水持續(xù)7天。然后，如本文所述監(jiān)測大鼠活動(dòng)度。慢性社交失敗如前所述，對小鼠進(jìn)行社交失敗方案處理(Elliott等，2010)。簡單地說，將小鼠放到攻擊性ICR小鼠的養(yǎng)育籠中，它們在籠中在身體上互動(dòng)5分鐘。在此期間，ICR小鼠攻擊闖入小鼠，闖入者顯露附屬姿態(tài)。將穿孔的透明有機(jī)玻璃隔板放在動(dòng)物之間，把小鼠留在同一籠中24小時(shí)以允許感官接觸。然后在接下來的10天，每天用陌生ICR小鼠重復(fù)該過程。抗抑郁藥治療小鼠接受三環(huán)類丙米嗪、SSRI氟西汀或NRI瑞波西汀(20mg/kg，在鹽水中)或鹽水的i.p.注射。慢性注射連續(xù)進(jìn)行18-21天，并在腦顯微切割前24小時(shí)進(jìn)行急性注射。對于行為測試，在試驗(yàn)前給小鼠i.p.注射20mg/kgSSRI30分鐘。腦顯微切割使用丙烯酸酯類腦基質(zhì)(Stoelting)，從小鼠中縫核(RN)中獲取腦樣品。根據(jù)指定的解剖標(biāo)記，使用標(biāo)準(zhǔn)刀片獲取切片。使用鈍的14G注射器從2mm切片中提取中縫核區(qū)，將組織保持在-70℃下直到RNA純化。微RNA純化和定量實(shí)時(shí)PCR表達(dá)分析按照生產(chǎn)商說明書，使用miRNeasymini試劑盒(Qiagen)分離mRNA，包括微RNA，使用miScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒處理以產(chǎn)生cDNA。然后按照生產(chǎn)商準(zhǔn)則，在AB7500熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)中，使用SYBR?GreenPCR試劑盒(Qiagen)分析樣品。每種miR的特異性引物與商品化通用引物一同使用，同時(shí)U6snRNA用作內(nèi)部對照。對于mRNA量化，應(yīng)用軟件“primerexpress2”設(shè)計(jì)每個(gè)轉(zhuǎn)錄物的特異性引物，并如前所述采用實(shí)時(shí)PCR測定表達(dá)(Haramati等，2011)。表8：用于微RNA實(shí)時(shí)PCR的寡核苷酸引物基因引物序列miR-135aTATGGCTTTTTATTCCTATGTGA(SEQIDNO:1)miR-135bTATGGCTTTTCATTCCTATGTGA(SEQIDNO:2)miR-375TTTGTTCGTTCGGCTCGCGTGA(SEQIDNO:3)U6GATGACACGCAAATTCGTGAA(SEQIDNO:4)miR-124TAAGGCACGCGGTGAATGCC(SEQIDNO:5)miR-16TAGCAGCACGTAAATATTGGCG(SEQIDNO:158)表9：用于mRNA實(shí)時(shí)PCR的寡核苷酸引物miR-135敲減慢病毒構(gòu)建體的克隆、慢病毒的產(chǎn)生和體外驗(yàn)證miR-135敲減(KD)質(zhì)粒pEZX-H1-miR-135KD-CMV-mCherry和對照pEZX-H1-對照KD-CMV-mCherry購自GeneCopeia(USA)。使用含有NheI側(cè)接位點(diǎn)的引物擴(kuò)增H1啟動(dòng)子和KD序列，并連接至pGEM-TEasy載體中。使用NheI限制位點(diǎn)，將H1-135KD片段亞克隆至p156-pRRL-CMV-GFP慢病毒構(gòu)建體，產(chǎn)生p156-pRRL-H1-miR-135bKD-CMV-GFP和p156-pRRLH1-對照KD-CMV-GFP慢病毒構(gòu)建體，這通過DNA測序進(jìn)一步證實(shí)。如前所述，通過在HEK293T細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，來產(chǎn)生重組慢病毒(Tiscornia等，2006)。簡單地說，在轉(zhuǎn)染后48和72小時(shí)收獲感染性慢病毒，通過0.45μm小孔醋酸纖維素濾器過濾，并通過超速離心濃縮。對于miR-135KD效率驗(yàn)證，將大鼠中縫核細(xì)胞系(RN46A)用miR-135KD或?qū)φ誎D慢病毒感染，48小時(shí)后收獲mRNA，采用實(shí)時(shí)PCR測試Htr1a和Slc6a4的表達(dá)水平。慢病毒的大腦內(nèi)注射對于立體定位手術(shù)和慢病毒遞送，如前所述(Lebow等，2012)，使用計(jì)算機(jī)導(dǎo)向立體定位儀和電動(dòng)納米注射器(AngleTwoTMStereotaxicInstrument，myNeurolab)。將小鼠在全身麻醉下放在立體定位儀上，將慢病毒制品通過Franklin和Paxinos圖集定義確定的坐標(biāo)遞送至DR：ML0mm；AP-4.6mm；DV-3.9mm以300傾斜。注射以0.2μl/1分鐘的速率進(jìn)行。在兩周恢復(fù)期后，對小鼠進(jìn)行行為和生理研究。在確定表型后，使小鼠麻醉，用磷酸鹽緩沖的4%低聚甲醛灌注。將固定的腦連續(xù)切成30mm切片，使用免疫組織化學(xué)證實(shí)注射部位的位置。免疫組織化學(xué)用于免疫組織化學(xué)的方法如前所述(Regev等，2011)。對于GFP免疫染色，使用在山羊中產(chǎn)生的生物素化抗GFP抗體作為第一抗體(Abcam，Cambridge，UK)，鏈霉抗生物素綴合的Cy2作為第二抗體(JacksonImmunoresearchLaboratoriesInc,WestGrove,PA,USA)。行為評(píng)估在每次試驗(yàn)前在習(xí)慣試驗(yàn)室2小時(shí)后，在暗期進(jìn)行所有行為評(píng)估。對于焦慮樣行為采用高架十字迷宮、光/暗轉(zhuǎn)移和曠場試驗(yàn)，對于抑郁樣行為采用強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)，測試小鼠。曠場試驗(yàn)：曠場試驗(yàn)在120lux光照、50x50x22cm白箱中進(jìn)行。把小鼠放入箱中10分鐘。采用視頻跟蹤系統(tǒng)(VideoMot2；TSESystems,BadHamburg,Germany)，量化箱中的小鼠運(yùn)動(dòng)。光/暗轉(zhuǎn)移試驗(yàn)：光/暗轉(zhuǎn)移試驗(yàn)儀器由分成黑暗室(14x27x26cm)和相連的白光1200lx照明室(30x27x26cm)的聚氯乙烯箱組成。在5分鐘試驗(yàn)內(nèi)，用視頻跟蹤系統(tǒng)(VideoMot2；TSESystems,BadHamburg,Germany)定量測定在明室所花時(shí)間、在光下行走的距離和光-暗轉(zhuǎn)移的次數(shù)。高架十字迷宮試驗(yàn)：該試驗(yàn)裝置具有加號(hào)形狀，含有2個(gè)屏障壁和2個(gè)照明的(6lux)開放臂。在5分鐘試驗(yàn)內(nèi)，利用視頻跟蹤系統(tǒng)(VideoMot2；TSESystems,BadHamburg,Germany)，對在開放臂中的進(jìn)入次數(shù)、行走距離和所花時(shí)間進(jìn)行自動(dòng)評(píng)分。改良強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)：如前所述進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)(Krishnan等，2007)。裝置為直徑為18cm、裝入25℃水至15cm深度的塑料水桶。將各小鼠放入塑料水桶的中央，開始6分鐘視頻記錄的試驗(yàn)階段。采用EthoVisionXT(Noldus，Wageningen，Netherlands)，對在試驗(yàn)的3-6分鐘內(nèi)不活動(dòng)所花持續(xù)時(shí)間進(jìn)行自動(dòng)評(píng)分。社交回避試驗(yàn)：在社交回避試驗(yàn)中，把小鼠放入15cmx35cm活動(dòng)場地，其中有一個(gè)小的被隔板隔開的15cmx8cm鄰室，隔板上有小的開通狹縫，允許充分的感官接觸。允許受測小鼠習(xí)慣活動(dòng)場地3分鐘，然后將陌生的ICR小鼠放入鄰室又一個(gè)3分鐘。使用視頻跟蹤通過Ethovision軟件(Noldus，Wageningen，Netherlands)，定量測定靠近隔板所花時(shí)間。通過將小鼠在靠近陌生ICR的規(guī)定區(qū)域所花時(shí)間除以在習(xí)慣期間小鼠在同一區(qū)域所花時(shí)間再乘以100，計(jì)算互動(dòng)比。顯微切割、樣品制備和5HT和5-HIAA濃度的HPLC-ED分析如前所述(Neufeld-Cohen等，2010a)，使用Palkovits顯微切割技術(shù)(Palkovitz，1988)，進(jìn)行顯微切割。采用LeicaCM1950恒冷切片機(jī)(NorthCentralInstruments,USA)，獲取腦冠狀切片(300μm)。將切片裝在載玻片上，在立體顯微鏡下使用不同內(nèi)徑的顯微切割針在-10℃下在冷卻臺(tái)上顯微切割。將顯微切割物各放入含有100μL乙酸鹽緩沖液(3.0g/L乙酸鈉、4.3mL/L冰醋酸；pH調(diào)節(jié)于5.0)的管中。接下來，將樣品勻漿，并在4℃和13,000rpm下離心3分鐘。沉淀用175μL0.2MNaOH復(fù)溶用于蛋白質(zhì)含量，并如前所述(Evans等，2008)，采用高效液相色譜法與電化學(xué)檢測(HPLC-ED)，將50μL上清液用于5HT和5-羥基吲哚乙酸(HIAA)的檢測。將樣品加到使樣品注入HPLC色譜系統(tǒng)(ESA，Chelmsford，MA，USA)的ESA542型自動(dòng)進(jìn)樣器中。HPLC系統(tǒng)還包括ESA582型SolventDeliveryModule以將流動(dòng)相(9.53g/L磷酸二氫鉀二水合物、300mg/L辛烷磺酸、35mg/LEDTA、920mL/LHPLC級(jí)H2O和80mL/LHPLC級(jí)甲醇；使用正磷酸調(diào)節(jié)pH至3.4)泵送通過色譜系統(tǒng)。其中發(fā)生色譜分離的固定相由整合的前置柱/柱系統(tǒng)(Ultrasphere-XL3μmOctylGuardCartridge，5/70x4.6mm；MAC-MODAnalytical，USA)組成。電化學(xué)檢測使用具有雙重穩(wěn)壓器的ESA5200A型CoulochemII檢測器完成，所述雙重穩(wěn)壓器與電極電位設(shè)定為0mV的ESA5021預(yù)處理室及通道1和通道2電極電位分別設(shè)定為25mV和250mV的ESA5014B微透析室連接。對于每次行程，應(yīng)用色譜分析軟件(EZChromElite用于Windows，2.8版；AgilentTechnologies，USA)測定已知濃度的5HT和5-HIAA的平均峰高，并用來計(jì)算未知樣品的濃度。使5HT和5-HIAA的組織濃度標(biāo)準(zhǔn)化至蛋白質(zhì)的量。人類樣品研究病例對照研究：如(Menke等，2012)中詳述的研究中，選出診斷為重性抑郁癥(N=9)或雙相型障礙(N=2)的17名男性患者和12名健康男性對照。簡單地說，從Max-PlanckInstituteofPsychiatry招募患者，在因抑郁綜合征住院病人入院的前5天內(nèi)，針對RNA抽血。入院時(shí)平均HRDS評(píng)分為24.3(SD：5.3，范圍17-32)。利用復(fù)合性國際診斷交談表(CompositeInternationalDiagnosticInterview,CIDI)(WittchenHU，1999)針對不存在終身精神障礙并利用HRDS針對不存在現(xiàn)行精神病癥狀篩選對照。在6pm禁食2小時(shí)后，使用PAXgene(PreAnalytiXGmbH，Hombrechtikon，Switzerland)全血RNA收集管收集全血。使用PAXgene血液RNA試劑盒，以用于核酸柱純化的Qiagen方法(PreAnalytiXGmbH，Hombrechtikon，Switzerland)，從PAXgene全血樣品中分離總RNA。使用Agilent2100生物分析儀(AgilentTechnologies，USA)和260nmUV吸收(Nanophotometer，Germany)，評(píng)價(jià)RNA品質(zhì)、濃度和純度。認(rèn)知行為療法(CBT)：該分析的患者來源于設(shè)計(jì)成鑒定認(rèn)知行為療法(CBT)緩解的神經(jīng)成像和其它生物學(xué)預(yù)測因子的隨機(jī)臨床試驗(yàn)。所有患者在參與研究前提供書面知情同意。研究遵照赫爾辛基宣言(DeclarationofHelsinki)及其修正案進(jìn)行，并經(jīng)Emory’sInstitutionalReviewBoard批準(zhǔn)。研究設(shè)計(jì)詳細(xì)描述于Dunlop等，2012。簡單地說，合格的參與者是介于18和60歲的成年門診病人，他們符合用于MDD而無精神病特征的初步診斷的DiagnosticandStatisticalManualofMentalDisorders(精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊),第4版(DSM-IV)標(biāo)準(zhǔn)?；颊呓邮?6期的CBT。所提供的CBT遵循標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)議(Beck等，1979)。使用漢密頓抑郁評(píng)定量表(HamiltonDepressionRatingScale，HRDS)，前6周每周評(píng)價(jià)所有患者的癥狀改變，然后剩下的6周每隔一周評(píng)價(jià)。所有患者具有隨機(jī)的15分以上的HRDS評(píng)分。從該研究中，選擇在基線、第2周(N=16)和第12周抽血用于RNA的12名患者。在基線抽血時(shí)，不允許現(xiàn)行藥物治療。75%的患者為女性，87%為歐洲血統(tǒng)。CBT組的平均年齡為42.4(SD：9.6)歲。將全血收集在TempusRNA管(AppliedBiosystems)中，使用TempusSpinRNAIsolationReagent試劑盒(AppliedBiosystems)提取。分別使用Agilent2100生物分析儀(AgilentTechnologies，PaloAlto，CA，USA)和光度測定方法(Nanophotometer，Implen，Munich，Germany)測量RNA質(zhì)量和數(shù)量。統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)表示為均值+/-SEM。為了檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)顯著性，在只有比較2個(gè)組情況下，例如對于微陣列實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)驗(yàn)證，采用斯氏t檢驗(yàn)。單因素ANOVA用于多組之間的比較，例如在螢光素酶測定法中不同治療之間。在2個(gè)獨(dú)立變量的情況下，例如在急性或慢性給藥兩者中的SSRI或NRI注射，采用雙因素ANOVA。需要時(shí)采用重復(fù)測量分析。當(dāng)需要顯示統(tǒng)計(jì)顯著性時(shí)，應(yīng)用事后t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用Jmp7軟件進(jìn)行，且當(dāng)P<0.05時(shí)，組間的差異被視為顯著。實(shí)施例105HT神經(jīng)元的微RNA“指紋”從ePet-EYFP胚胎的RN中分離5HT神經(jīng)元，并使用miR微陣列將其miR表達(dá)概況與獲自同一腦區(qū)的非5HT細(xì)胞相比(圖35A)。通過有關(guān)標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)水平，來進(jìn)行細(xì)胞分選驗(yàn)證。YFP(ePET陽性神經(jīng)元的熒光標(biāo)志物)在5HT群中顯著富集(圖35B)；色氨酸羥化酶2(TPH2)(5HT產(chǎn)生中的關(guān)鍵酶)在5HT細(xì)胞中穩(wěn)固表達(dá)(圖35C)；谷氨酸脫羧酶67(GAD67)(在RN的非5HT神經(jīng)遞質(zhì)中普遍的催化GABA合成的酶)在非5HT細(xì)胞中極豐富(圖35D)。獲自微陣列的miR“指紋”(圖1A)含有14種(下表10)和27種(下表11)miR在5HT神經(jīng)元中的表達(dá)分別是非5HT神經(jīng)元的2倍或1/2。對于在5HT神經(jīng)元例如miR-375(圖1B)中高表達(dá)的miR和在5HT神經(jīng)元例如miR-135a(圖1C)中以較低水平表達(dá)的miR，采用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行陣列結(jié)果的代表性驗(yàn)證。表10：微RNA微陣列結(jié)果—在5HT神經(jīng)元中的表達(dá)是小鼠RN的非5HT細(xì)胞的至少2倍的微RNA的列表微RNA名稱倍數(shù)變化mmu-miR-37520.72mmu-miR-376c11.73mmu-miR-7a4.44mmu-miR-1372.87mghv-miR-M1-22.79mmu-miR-7092.61mmu-miR-291b-5p2.51mmu-miR-12242.40mmu-miR-18922.37mmu-miR-7022.31mmu-miR-139-3p2.25mmu-miR-7622.24mmu-miR-671-5p2.10mmu-miR-483*2.04表11：微RNA微陣列結(jié)果—在5HT神經(jīng)元中的表達(dá)是小鼠RN的非5HT細(xì)胞的至多1/2的微RNA列表微RNA名稱倍數(shù)變化mmu-miR-691-5.10mmu-miR-466l-4.11mmu-miR-17-3.95mmu-miR-376b-3.18mmu-miR-124-3.13mmu-miR-218-3.08mmu-miR-128-2.99mmu-miR-140*-2.92mmu-miR-148a-2.86mmu-miR-340-5p-2.86mmu-miR-181c-2.82mmu-miR-210-2.72mmu-miR-135a-2.69mmu-miR-27a-2.66mmu-miR-452-2.45mmu-miR-370-2.20mmu-miR-300-2.19mmu-miR-376a-2.17mmu-miR-127-2.13mmu-miR-15b-2.12mmu-miR-101a-2.07mmu-miR-16-2.06mmu-miR-324-5p-2.05mmu-miR-434-5p-2.05mmu-miR-92a-2.03mmu-miR-669i-2.00為了進(jìn)一步研究miR作為5HT神經(jīng)元的調(diào)節(jié)劑的可能作用，以假設(shè)驅(qū)動(dòng)的方式進(jìn)行了廣泛的生物信息學(xué)分析。使之前表明與精神病理學(xué)有關(guān)在5-羥色胺能神經(jīng)元表達(dá)的已知5HT相關(guān)基因的靶向預(yù)測在生物信息學(xué)上與微陣列結(jié)果交集。應(yīng)用2種不同的基于網(wǎng)絡(luò)的算法，進(jìn)行了這些基因的miR靶向預(yù)測：TargetScan(www(dot)targetscan(dot)org)和miRanda(www(dot)microrna(dot)org)，并且與非5HT細(xì)胞相比，與在5HT神經(jīng)元miR陣列中變化達(dá)至少±1.5倍的91種miR的列表交集。選擇在RN的5HT神經(jīng)元中表達(dá)的2種蛋白質(zhì)編碼靶基因：負(fù)責(zé)5HT重?cái)z取的5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(亦稱SERT或Slc6a4)和5-羥色胺抑制性受體1a(亦稱Htr1a)。根據(jù)miR陣列數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)分析，選擇7種miR用于進(jìn)一步的體外驗(yàn)證(圖1D-E)。實(shí)施例11miR-135靶向Htr1a和Slc6a4轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行了體外螢光素酶測定法，以測試受測5HT相關(guān)基因的3’UTR和預(yù)測的推定靶向這些轉(zhuǎn)錄物的miR之間的miR-靶標(biāo)相互作用。Slc6a43'UTR(圖2A，2C)和Htr1a3'UTR(圖2B，2D)的miR-135打靶導(dǎo)致這些轉(zhuǎn)錄物的翻譯被強(qiáng)抑制。另外，Htr1a3'UTR的顯著抑制由miR-335、miR-181c和miR-26a介導(dǎo)(圖2D)。由于miR-135對Htr1a和Slc6a4兩者的強(qiáng)大作用，本發(fā)明研究進(jìn)一步集中在該miR-靶標(biāo)相互作用。進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析揭示，miR-135具有3個(gè)高度保守的變體miR-135a-1、miR-135a-2和miR-135b(圖36A-C)。另外，Slc6a43'UTR中的miR-135種子匹配序列是高度保守的(圖2E)，并且在Htr1a3'UTR中的2個(gè)種子匹配之一中，觀察到強(qiáng)保守性(圖2F)。其中Slc6a4轉(zhuǎn)錄物3’UTR上的突變研究(其中除去miR-135種子匹配序列)顯示，Slc6a4的miR-135a和miR-135b打靶兩者均通過其種子匹配序列介導(dǎo)，因?yàn)橛蒻iR-135誘導(dǎo)的抑制被Slc6a43'UTR的突變完全阻斷(圖2G)。單獨(dú)或一起使Htr1amiR-135種子匹配突變顯示，miR-135a通過遠(yuǎn)端且非近端的種子匹配抑制Htr1a3'UTR，而miR-135b通過兩個(gè)預(yù)測的位點(diǎn)起作用(圖2H)。實(shí)施例12RN-miR-135水平被抗抑郁藥增量調(diào)節(jié)由于之前表明，Htr1a(Savitz等，2009)和Slc6a4(Murphy等，2008)兩者與抑郁和抗抑郁細(xì)胞機(jī)器有關(guān)，因此本發(fā)明人試圖檢查在響應(yīng)抗抑郁治療時(shí)miR-135表達(dá)的調(diào)節(jié)。成熟miR-135a和miR-135b只以1個(gè)核苷酸之差而不同(圖37A)，但仍在RN中差異表達(dá)，如對獲自成年野生型小鼠顯微切割RN中的cDNA進(jìn)行的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果所觀察的一樣(圖37B)。miR135b的表達(dá)是miR-135a的約1/10，而后者是相對高表達(dá)的，僅miR-124(腦中最豐富的miR)的1/5，且是之前顯示在控制5HT功能中起作用的miR-16的1/2.5(圖37C)。鑒于miR-135a在RN中以高于miR-135b的水平表達(dá)，并且還是在5HT微陣列中不同變化的變體，本發(fā)明人集中在對這種形式的調(diào)節(jié)研究上。接下來，在暴露于慢性社交失敗模型(一種用于誘導(dǎo)抑郁樣行為的環(huán)境模型)和用三環(huán)類抗抑郁藥丙米嗪慢性治療的小鼠中，測試了miR-135的水平。采用社交回避試驗(yàn)，證實(shí)了社交失敗可引起社交回避，給予抗抑郁藥可將其逆轉(zhuǎn)(圖37D)。實(shí)際上，只有顯露社交失敗并注射鹽水的小鼠發(fā)生社交回避，而接受丙米嗪的小鼠不發(fā)生，如低于100%的互動(dòng)比所表示的一樣(圖37D)。引人關(guān)注的是，慢性社交失敗應(yīng)激不改變RN中的miR-135a水平，然而，在應(yīng)激和非應(yīng)激小鼠兩者中，慢性(圖37E)或急性(圖37F)給予的丙米嗪均顯著增加RN中的miR-135a表達(dá)水平。因?yàn)楸奏翰皇翘禺愋?HT重?cái)z取抑制劑，所以進(jìn)一步測試了急性和慢性給予選擇性5-羥色胺重?cái)z取抑制劑(SSRI)氟西汀和去甲腎上腺素重?cái)z取抑制劑(NRI)瑞波西汀兩者的作用，發(fā)現(xiàn)在急性和慢性SSRI治療兩者后，RN中穩(wěn)固的miR-135a水平升高，但在NRI治療后未觀察到差異(圖37G)。實(shí)施例13在5HT神經(jīng)元中特異性的miR-135過量表達(dá)減少社交失敗后的焦慮和抑郁樣行為為了進(jìn)一步探索體內(nèi)5HT-miR-135的作用，建立了在RN的5HT神經(jīng)元中特異性過量表達(dá)miR-135的小鼠模型(miR-135OE)。使在RN5HT陽性神經(jīng)元中特異性表達(dá)Cre重組酶(ePet-Cre)的小鼠與攜帶條件性miR-135a盒的轉(zhuǎn)基因小鼠系雜交(圖38A)。作為對照，使用對miR-135過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因陰性和對ePet-Cre陰性的小鼠。在5HT神經(jīng)元中特異性過量表達(dá)miR-135a的小鼠RN中的miR-135a表達(dá)水平通過實(shí)時(shí)PCR測試，并顯示較之于對照小鼠約2倍的過量表達(dá)(圖38B)。該小鼠模型中miR-135的過量表達(dá)水平與在給予SSRI后小鼠RN中測量的類似。另外，與對照小鼠相比，miR-135靶轉(zhuǎn)錄物Slc6a4(圖38C)和Htr1a(圖38D)的水平在miR-135OE小鼠RN中降低，表明了miR-135靶基因的體內(nèi)抑制。在“基礎(chǔ)”條件下或在慢性社交失敗方案后，在焦慮和抑郁樣行為的試驗(yàn)中在行為上對miR-135OE及其同胞仔鼠對照進(jìn)行了表征。在焦慮和抑郁樣行為的試驗(yàn)中，在“基礎(chǔ)”條件下在miR-135OE和對照小鼠之間觀察到無差異(圖38E-J，左條形柱和38K)。然而，miR-135OE小鼠顯示對慢性社交失敗的作用的顯著適應(yīng)性。在光/暗轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中，與對照小鼠相比，暴露于社交失敗的miR-135OE小鼠在光下渡過較多時(shí)間(圖38E)，較頻繁地到訪亮光室(圖38F)，并在光下行走較長距離(圖38G)。miR-135OE小鼠的行為表現(xiàn)在社交失敗方案后無顯著不同。相比之下，對照小鼠顯示在社交失敗后在光暗試驗(yàn)的所有所測參數(shù)中焦慮樣行為顯著增加(圖38E-G)。在高架十字迷宮試驗(yàn)中觀察到類似結(jié)果，因?yàn)榕c在相同條件下測試的miR-135OE小鼠相比，暴露于社交失敗的對照小鼠花在開放臂中較少時(shí)間(圖38H)、較少到訪(圖38I)和行走較小距離(圖38J)。在miR-135OE組中在“基礎(chǔ)”和應(yīng)激條件之間未觀察到差異。在評(píng)價(jià)抑郁樣行為的試驗(yàn)中觀察到類似結(jié)果。雖然當(dāng)在慢性社交失敗后測試時(shí)，在“基礎(chǔ)”條件下未觀察到差異(圖38K)，但與對照相比，miR-135OE小鼠在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中顯示顯著較少的不活動(dòng)時(shí)間(圖38L)，這可解釋為抑郁樣行為減少。這些差異無法說明自主活動(dòng)能力的改變，因?yàn)樵跁鐖鲋行凶叩木嚯x在2個(gè)基因型中是類似的(圖38M)。總之，miR-135在5HT神經(jīng)元中特異性過量表達(dá)保護(hù)慢性應(yīng)激對焦慮和抑郁樣行為的不良作用。實(shí)施例14成年小鼠RN中miR-135的敲減增加焦慮樣行為并降低對抗抑郁藥的反應(yīng)為了確定miR-135內(nèi)源水平在介導(dǎo)在響應(yīng)抗抑郁治時(shí)的抑郁樣行為和在“基礎(chǔ)”條件下的焦慮樣行為的重要性，建立了基于慢病毒的系統(tǒng)以特異性敲減(KD)野生型小鼠RN中內(nèi)源miR-135的水平。將含有miR-135抑制劑(miRNA俘獲，圖39A)或?qū)φ招蛄械谋磉_(dá)質(zhì)粒亞克隆至含有H1啟動(dòng)子和GFP報(bào)道分子的慢病毒構(gòu)建體(圖39B)中以允許miR-135俘獲序列的組成型表達(dá)。通過感染內(nèi)源表達(dá)Htr1a、Slc6a4兩者和miR-135的RN46A細(xì)胞，體外測試了從這些構(gòu)建體產(chǎn)生的慢病毒抑制靶基因Htr1a和Slc6a4表達(dá)的效率。與被KD對照慢病毒感染的細(xì)胞相比，被miR-135KD慢病毒感染的RN46A細(xì)胞表達(dá)顯著較高水平的Htr1a和Slc6a4mRNA，如通過實(shí)時(shí)PCR所測(圖39C)。野生型成年小鼠RN用miR-135KD或?qū)φ章《靖腥荆诨謴?fù)期后，采用針對焦慮和抑郁樣行為的試驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠行為。隨后采用GFP免疫組織化學(xué)，證實(shí)了感染準(zhǔn)確性(圖39D)。在光/暗轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中，與對照注射小鼠相比，miR-135KD小鼠顯示焦慮樣行為顯著增加(圖39E-H)。miR-135KD小鼠在照明室中花較少時(shí)間(圖39E)、較少到訪(圖39F)和行走較短距離(圖39G)。同樣，在高架十字迷宮試驗(yàn)中，與對照注射小鼠相比，miR-135KD小鼠顯示焦慮樣行為增加。miR-135KD小鼠顯示在迷宮的開放臂中花較少時(shí)間(圖39I)、較少到訪(圖39J)和行走顯著較小距離(圖39K)的傾向(圖39I-L)。在“基礎(chǔ)”條件下和在SSRI治療后均測試了miR-135KD小鼠的抑郁樣行為。在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中觀察到在“基礎(chǔ)”條件下組間無差異(圖39M)。然而，在給予SSRI后，與對照注射小鼠相比，miR-135KD小鼠顯著更不活動(dòng)(圖39M)，表明了內(nèi)源RN-miR-135水平在介導(dǎo)SSRI誘導(dǎo)的抗抑郁作用中的重要作用。RN中miR-135的水平降低不影響這些小鼠的自主活動(dòng)能力(圖39N)。實(shí)施例15miR-135過量表達(dá)改變5HT水平和代謝為了評(píng)價(jià)miR-135水平的變化是否還影響中樞5HT的組織濃度及其周轉(zhuǎn)，對RN細(xì)分區(qū)域和來自miR-135OE小鼠模型和對照同胞仔鼠的受這些區(qū)域神經(jīng)支配的腦區(qū)進(jìn)行顯微分割。圖40A-40O、圖42A-L和圖43A-L表示在“基礎(chǔ)”條件下和在社交失敗方案后這些小鼠中的5HT的組織濃度和5HT代謝(5HIAA/5HT比)。焦慮和抑郁相關(guān)神經(jīng)回路內(nèi)的5HT的組織濃度和5HT代謝受miR-135基因型影響，以及社交失敗操作miR-135OE降低組織5HT濃度，增加5-羥色胺代謝，一種與在涉及調(diào)節(jié)焦慮相關(guān)行為和應(yīng)激復(fù)原力的以下腦區(qū)中5-羥色胺周轉(zhuǎn)增加的模式：例如緣前皮質(zhì)(PrL)、下邊緣皮質(zhì)(IL)、基底外側(cè)杏仁核(BLA)、腹側(cè)海馬CA1區(qū)(CA1V)、下托(S)、終紋床核(BNST)、中央杏仁核(CeA)、中縫背核的背側(cè)、腹側(cè)、尾部和束間部分(DRD、DRV、DRC、DRI)和中縫正中核(MnR)(圖40A-40O、圖42A-L和圖43A-L)。這些結(jié)果與在“基礎(chǔ)”條件下miR-135OE降低Htr1a和Slc6a4表達(dá)一致(圖38C-D)，為可預(yù)期導(dǎo)致5-羥色胺能神經(jīng)元放電速度和5-羥色胺能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分別提高的作用。在對照小鼠中，社交失敗降低焦慮相關(guān)腦區(qū)中組織5HT濃度并增加5HT代謝，一種符合5-羥色胺周轉(zhuǎn)(包括PrL和BNST)提高的模式(圖40A-40O和圖42A-L)，與表明社交失敗誘導(dǎo)的DRD和DRC中5-羥色胺能神經(jīng)元的焦慮相關(guān)亞型活化的之前的研究一致。社交失敗的這些作用在miR-135OE小鼠中被阻止，表明了在這些小鼠中觀察到的對慢性應(yīng)激的行為復(fù)原性的機(jī)制性解釋。實(shí)施例16血液中的miR-135a水平在抑郁患者中被減量調(diào)節(jié)而通過療法增量調(diào)節(jié)因?yàn)檠h(huán)miR水平顯示與疾病狀態(tài)相關(guān)，所以本發(fā)明人測試了人類抑郁患者中血液miR-135水平是否改變。在兩組人血樣中測試了miR-135和miR-16的相對水平。一組比較抑郁患者與匹配的健康對照，另一組miRNA水平在接受3個(gè)月認(rèn)知行為療法(CBT)的抑郁患者中隨時(shí)間變化。與對照相比，miR-135a水平在現(xiàn)行的抑郁患者(平均漢密頓抑郁評(píng)定量表(HRDDS)=24.3(SD：5.3)，即中度到重度抑郁癥狀)中穩(wěn)固降低(圖41A)，而觀察到在miR-16中無明顯變化(圖41B)。比較治療之前和治療后3個(gè)月抑郁患者的miR-135a血液水平顯示在CBT后miR-135a水平顯著升高(圖41C)。對于miR-16水平，在同一血樣中觀察到無作用(圖41D)。這些結(jié)果表明人血液中的miR-135a水平為抑郁狀態(tài)和對治療起反應(yīng)的可能的生物標(biāo)志物。實(shí)施例17miR-135在苯丙胺誘導(dǎo)的活動(dòng)過度大鼠模型中的抗雙相作用為了臨床前評(píng)價(jià)miR-135的抗雙相障礙作用，使用體內(nèi)苯丙胺誘導(dǎo)的大鼠躁狂癥活動(dòng)過度模型，這與雙相型障礙的躁狂期有關(guān)。該模型集中在動(dòng)物活動(dòng)水平的誘導(dǎo)性提高(活動(dòng)過度)作為躁狂患者活動(dòng)過度的對應(yīng)物。通過用藥物預(yù)治療在嚙齒動(dòng)物逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)的活動(dòng)過度表明該藥物在治療人類躁狂癥時(shí)的可能功效。與鋰(用于躁狂癥的標(biāo)準(zhǔn)藥物)最一致的研究結(jié)果是在站立減少。通過觀察動(dòng)物的直立活動(dòng)在模型中跟蹤站立。因此，針對雙相型疾病的治療，測試了在苯丙胺誘導(dǎo)的活動(dòng)過度前用miR-135預(yù)治療的大鼠。此外，針對雙相型疾病的治療，測試了在苯丙胺誘導(dǎo)的活動(dòng)過度后用miR-135治療的大鼠。將大鼠關(guān)養(yǎng)在12小時(shí)光/暗周期下，在光期進(jìn)行行為測試。準(zhǔn)確地講，以基于2水平激光束和配備可清點(diǎn)大鼠直立運(yùn)動(dòng)(站立)數(shù)的計(jì)算機(jī)化系統(tǒng)的活動(dòng)測量儀(Elvicom，Israel)跟蹤大鼠活動(dòng)度。對于每期記錄活動(dòng)持續(xù)30分鐘，每30分鐘報(bào)告由此而來的適當(dāng)運(yùn)動(dòng)。將用miR-135預(yù)治療或治療的大鼠的活動(dòng)度與未治療大鼠(對照組)和用躁狂癥的標(biāo)準(zhǔn)藥物(即鋰或丙戊酸鹽)預(yù)治療或治療的大鼠進(jìn)行了比較。在用苯丙胺攻擊之前和之后跟蹤大鼠。應(yīng)用雙因素ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)施例18miR-135在氯胺酮誘導(dǎo)的躁狂癥大鼠模型中的抗雙相作用為了臨床前評(píng)價(jià)miR-135的抗雙相障礙作用，使用體內(nèi)氯胺酮誘導(dǎo)的大鼠躁狂癥活動(dòng)過度模型。氯胺酮誘導(dǎo)經(jīng)治療大鼠的運(yùn)動(dòng)過度，這可如上所述監(jiān)測。將大鼠用miR-135或躁狂癥的標(biāo)準(zhǔn)藥物即鋰(47.5mg/kg，i.p.，一天兩次)或丙戊酸鹽(200mg/kg，i.p.，一天兩次)或用鹽水(i.p.，一天兩次)作為對照預(yù)治療(持續(xù)14天)。在第8和14天之間，將這些大鼠用氯胺酮(25mg/kg，i.p.)或鹽水治療。在一個(gè)顛倒的方案中，大鼠首先接受氯胺酮(25mg/kg，i.p.)或鹽水接著給予miR-135、鋰、丙戊酸鹽或鹽水為期7天。將用miR-135預(yù)治療或治療的大鼠的活動(dòng)度與未治療大鼠(對照組)和與用躁狂癥的標(biāo)準(zhǔn)藥物(即鋰或丙戊酸鹽)預(yù)治療或治療的大鼠進(jìn)行比較。在用氯胺酮攻擊之前和之后跟蹤大鼠。應(yīng)用雙因素ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。討論在最新研究中，闡述了在“基礎(chǔ)”和攻擊條件下特定miR在調(diào)節(jié)中樞5HT系統(tǒng)活性中的作用。在5-羥色胺能神經(jīng)元中測定了miR表達(dá)的獨(dú)特“指紋”，并以生物信息學(xué)方法鑒定了若干5HT相關(guān)的靶基因。體外螢光素酶測定法和突變研究顯示，miR-135對Slc6a4和Htr1a轉(zhuǎn)錄物兩者的強(qiáng)抑制作用。引人注意的是，RN中的miR-135水平在急性或慢性SSRI給藥后穩(wěn)固地增量調(diào)節(jié)。表達(dá)較高或較低的miR-135水平的遺傳修飾的小鼠模型顯示焦慮和抑郁樣行為的較多交替、5HT水平和代謝和響應(yīng)抗抑郁治療時(shí)的行為。最后，提供人類抑郁患者血液中的miR-135水平和對治療的反應(yīng)。用于分離來自小鼠RN的5HT和非5HT細(xì)胞的ePet-EYFP小鼠模型的使用首次允許測定5-羥色胺能神經(jīng)元的特定miR概況。雖然該方法是成功的和提供信息的，但是為了從小鼠RN胚期有效地分選5HT陽性神經(jīng)元，使用了未成年腦組織，這意味著5HTmiR概況中所提供的miR至少一部分可能與發(fā)育過程和未成年5HT神經(jīng)元功能有關(guān)。然而，已知在特定發(fā)育期內(nèi)5-羥色胺能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響成年焦慮表型(Gross等，2002)。引人關(guān)注的是，與對照相比，通常與胰腺β細(xì)胞分化有關(guān)的miR-375在5HT神經(jīng)元中穩(wěn)固表達(dá)，支持所提出的這些組織的共同發(fā)育途徑。生物信息學(xué)分析表明，5-羥色胺受體1A(Htr1a)和5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SERT或Slc6a4)3'UTR和在5HT微陣列中差異表達(dá)的miR之間的推定的若干miR-靶標(biāo)相互作用。Htr1a和Slc6a4顯示在5-羥色胺能系統(tǒng)功能、抑郁和焦慮障礙和在響應(yīng)抗抑郁藥時(shí)起重大作用(Savitz等，2009)和(Murphy等，2008)。Htr1a是抑制性G蛋白偶聯(lián)受體，在產(chǎn)5HT的細(xì)胞中作為自身受體表達(dá)，并且突觸后跨越5HT發(fā)射部位的腦。刺激Htr1a自身受體抑制5-羥色胺能神經(jīng)元放電并在神經(jīng)末梢釋放5-羥色胺，據(jù)假設(shè)是通常報(bào)告的大多數(shù)5-羥色胺能抗抑郁藥(例如SSRI)的治療滯后的原因之一。Slc6a4是一種質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過以鈉依賴性方式使之從突觸間隙到突觸前神經(jīng)元再循來終止5-羥色胺作用。Slc6a4是最常用的抗抑郁藥的直接靶標(biāo)，所述抗抑郁藥為抑制不同單胺重?cái)z取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性(包括Slc6a4)的前一代三環(huán)類抗抑郁藥或更特異性的SSRI?？深A(yù)期Slc6a4和突觸前Htr1a兩者的活性降低提高突觸中的5HT水平，這與抗抑郁作用和抑郁癥狀減輕一致。螢光素酶測定法證實(shí)miR-135變體為Slc6a4和Htr1a轉(zhuǎn)錄物兩者的重要阻抑物。突變研究進(jìn)一步顯示miR-135種子結(jié)合位點(diǎn)在Htr1a和Slc6a43’UTR在介導(dǎo)所觀察的miR-135阻抑作用中的重要性。之前報(bào)告的用于這些基因人Slc6a4和Htr1a的3’UTR的單核苷酸多態(tài)性(SNP)(Piva等，2010)不在miR-135種子匹配序列內(nèi)。據(jù)之前的報(bào)告，miR-135主要參與癌癥相關(guān)病理和發(fā)育過程。已顯示miR-135靶向腺瘤狀結(jié)腸息肉病基因，因此促進(jìn)結(jié)腸直腸癌、改進(jìn)化療抗性并在典型霍奇金淋巴瘤中調(diào)節(jié)JAK2。在巨核細(xì)胞生成、豬腦發(fā)育和在骨源性分化中通過調(diào)節(jié)mad5的礦化、BMP2成骨信號(hào)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)物中顯示了miR-135在發(fā)育過程中的作用。另外，表明miR-135參與通過抑制NR3C2調(diào)節(jié)血壓，并且在心力衰竭中具有潛在作用。若干微RNA篩選研究報(bào)告了不同成年嚙齒動(dòng)物或大鼠腦結(jié)構(gòu)中的微RNA水平受各種行為和藥理學(xué)操縱影響(Kye等，2011)。使用不同的范例，顯示了應(yīng)激性攻擊在不同的腦部位改變miR表達(dá)(Smalheiser等，2011)。本發(fā)明人最近表明miR-34參與調(diào)節(jié)焦慮樣行為(Haramati等，2011)，而miR-22、miR-138-2、miR-148a和miR-488與驚恐障礙有關(guān)(Muinos-Gimeno等，2011)?，F(xiàn)有手稿提供的使用小鼠的研究顯示，在給予抗抑郁藥后miR-135顯然增量調(diào)節(jié)。SSRI和NRI抗抑郁藥的進(jìn)一步比較顯示SSRI特異性和非NRI特異性作用，這進(jìn)一步表明miR-135在5HT神經(jīng)元生物學(xué)中的作用。雖然慢性應(yīng)激與對抑郁發(fā)生的敏感性增強(qiáng)有關(guān)，但出乎意料的是，慢性應(yīng)激條件不影響RN中的miR-135水平。據(jù)報(bào)告，慢性SSRI治療促進(jìn)Slc6a4和Htr1a蛋白質(zhì)水平但非mRNA的降低[Slc6a4(Benmansour等，2002)、Htr1a(Savitz等，2009)]，表明了轉(zhuǎn)錄后機(jī)制可能參與介導(dǎo)SSRI活性。顯示了miR-16靶向Slc6a4，并且在抗抑郁反應(yīng)中具有作用(Baudry等，2010)，而給予鋰顯示改變miR表達(dá)(Creson等，2011)。發(fā)現(xiàn)了重性抑郁癥患者中miR-182(Saus等，2010)和miR-30e(Xu等，2010b)的變體之間的關(guān)系，并且miR表達(dá)在患有自殺性抑郁的患者的額葉前皮質(zhì)中改變(Smalheiser等，2012)。另外，顯示了miR448控制若干5HT受體的表達(dá)作為脂肪組織發(fā)育的一部分，并且5-羥色胺受體1B的多態(tài)性節(jié)制通過miR96的調(diào)節(jié)，并且與攻擊性行為有關(guān)(Jensen等，2009)。最后，顯示了5-羥色胺受體-3E型的miR510靶向位點(diǎn)在腸易激綜合征中起作用。據(jù)報(bào)告抗抑郁治療激活cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并促進(jìn)CREB與CRE位點(diǎn)結(jié)合。miR-1355’側(cè)翼區(qū)的啟動(dòng)子分析鑒定出幾個(gè)推定的CRE位點(diǎn)，表明了所觀察到的miR-135被SSRI增量調(diào)節(jié)的可能機(jī)制?？傊诮o予抗抑郁藥后RN中miR-135表達(dá)水平的增量調(diào)節(jié)，連同顯示Htr1a和Slc6a4的miR-135打靶的結(jié)果，表明了miR-135是一種內(nèi)源抗抑郁藥。為了進(jìn)一步支持miR-135作為內(nèi)源抗抑郁藥的作用，進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，其中體內(nèi)操縱miR-135水平，并評(píng)價(jià)了對動(dòng)物行為的作用。以在抗抑郁治療后觀察到的相當(dāng)?shù)乃皆?HT神經(jīng)元中特異性過量表達(dá)miR-135的轉(zhuǎn)基因小鼠模型顯示，對慢性社交失敗的不利行為效果的強(qiáng)保護(hù)作用。這些結(jié)果類似于在使用siRNA方法敲減Htr1a(Bortolozzi等，2012)或Slc6a4(Thakker等，2005)時(shí)觀察到的作用，表明抑郁樣行為減少，或在使用精致的轉(zhuǎn)基因小鼠模型提高Htr1a自身受體水平時(shí)，導(dǎo)致焦慮和抑郁樣行為增加和對抗抑郁藥的反應(yīng)降低(Richardson-Jones等，2010)。相比之下，Htr1a(Savitz等，2009)和Slc6a4(Holmes等，2003)的發(fā)育敲除小鼠模型顯示焦慮和抑郁樣行為的是非而是的增加，這表明是由發(fā)育補(bǔ)償性改變介導(dǎo)的。除Htr1a和Slc6a4以外，還很可能miR-135a影響5-羥色胺神經(jīng)元中的其它基因，其可能有助于所觀察到的表型。采用補(bǔ)充方法，使用慢病毒在成年野生型小鼠RN中特異性敲減miR-135的水平，并且在“基礎(chǔ)”(非應(yīng)激)條件下和在給予SSRI后評(píng)價(jià)小鼠的行為。與通過過量表達(dá)miR-135的小鼠觀察到的行為形成對比，這種miR的水平降低引起焦慮樣行為的穩(wěn)固增加和對抗抑郁藥的反應(yīng)減弱。這些結(jié)果支持miR-135在維持在“基礎(chǔ)”條件下對攻擊的整個(gè)反應(yīng)中的重要作用及其在抗抑郁作用和機(jī)制中的基本作用。這些研究結(jié)果與已發(fā)表的文獻(xiàn)一致，所述文獻(xiàn)顯示Htr1a的較高水平與行為絕望加重和對抗抑郁藥反應(yīng)遲鈍有關(guān)(Richardson-Jones等，2010)。此外，人Htr1a基因中的多態(tài)性與較高的Htr1a自身受體結(jié)合與焦慮和抑郁加重有關(guān)(Fakra等，2009)。相比之下，據(jù)報(bào)告，由于較短的啟動(dòng)子變體所致的較低的Slc6a4表達(dá)水平與焦慮和抑郁加重和對抗抑郁藥的反應(yīng)降低有關(guān)(Homberg和Lesch，2011)。對miR-135在5HT回路中的作用的更多支持產(chǎn)生于HPLC數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)表明miR-135OE小鼠模型腦中5HT水平及其代謝的穩(wěn)固變化。與對照相比，在其中合成5HT的中縫下核(sub-nucleioftheraphe)和對控制焦慮和抑郁樣行為是重要的突出部位兩者中，在“基礎(chǔ)”應(yīng)激條件下，miR-135OE小鼠的5HT水平較低，而5HT代謝較高。5HT水平和5HT代謝中的這種變化模式與miR-135OE小鼠中5-羥色胺能神經(jīng)元放電增加和5-羥色胺能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增加一致。這些差異可能是與來自成人期的發(fā)育的miR-135的過量表達(dá)有關(guān)的代償性改變的結(jié)果。然而，盡管低的“基礎(chǔ)”5HT水平，但小鼠在“基礎(chǔ)”條件下仍顯示正常行為，可能由于更活躍的5HT系統(tǒng)所致，如通過在“基礎(chǔ)”條件下其較高的5HT代謝所述一樣。令人信服地，在RN中起5HT分泌抑制劑作用的Slc6a4和Htr1a的較低的表達(dá)水平使得小鼠能夠以較低的5HT水平正常地起作用。引人關(guān)注的是，慢性應(yīng)激如預(yù)期在對照小鼠一些腦區(qū)中引起5HT水平降低伴以5HT代謝增加，而在miR-135OE小鼠中，未觀察到這些作用。這些變化可提供對miR-135OE小鼠中觀察到的慢性應(yīng)激的行為復(fù)原性的機(jī)制性解釋。作為病理?xiàng)l件的非侵入性生物標(biāo)志物的循環(huán)miR的可能用途是一種增強(qiáng)場(risingfield)，其被循環(huán)中的miR相對高的水平和穩(wěn)定性促進(jìn)。雖然有關(guān)胞外miR的作用和來源知之甚少，但循環(huán)miR與例如不同的癌癥類型、心臟病、氧化性肺損傷、膿毒癥、妊娠等病理生理狀態(tài)有關(guān)。在現(xiàn)有的研究中，測定抑郁患者全血中miR-135的水平，并觀察到與匹配對照相比，抑郁患者血液中的miR-135水平穩(wěn)固降低。這些研究結(jié)果與表明miR-135是內(nèi)源抗抑郁藥的來自動(dòng)物模型的之前的數(shù)據(jù)一致，并表明miR-135作為抑郁狀態(tài)和可能對治療起反應(yīng)的可能的生物標(biāo)志物。最后，本發(fā)明人提出，由5HT神經(jīng)元表達(dá)的miR-135，是在正常條件下負(fù)責(zé)維持完整5-羥色胺能健康狀態(tài)的必需調(diào)節(jié)成分，并且是腦對抗抑郁藥起反應(yīng)所必需的(參見圖41E中的圖解模型)。miR-135的水平升高抑制Slc6a4和突觸前Htr1a水平兩者，引起突觸間隙中5HT的增加，這與抑郁癥狀減輕有關(guān)。本發(fā)明人進(jìn)行的進(jìn)一步生物信息學(xué)分析預(yù)測了下列miR135靶標(biāo)與應(yīng)激相關(guān)神經(jīng)精神障礙(包括雙相情感障礙)或鋰作用有關(guān)：腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1(Adcyap1或PACAP)；腺苷酸環(huán)化酶激活多肽1受體1(Adcyap1r1)；腎上腺素能受體α2a(Adra2a)；錨蛋白3(ANK3)；活性調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白(Arc)；RhoGTP酶激活蛋白6(Arhgap6)；激活轉(zhuǎn)錄因子3(Atf3)；β位點(diǎn)APP切割酶1(Bace1)；L型依賴電壓性鈣通道α1D亞基(Cacna1d)；細(xì)胞粘附分子3(Cadm3)；復(fù)蛋白1(Cplx1)；復(fù)蛋白2(Cplx2)；CUB和Sushi多個(gè)結(jié)構(gòu)域1(Csmd1)；酪蛋白激酶1γ1(Csnk1g1)；雙皮層蛋白(Dcx)；DIRAS家族GTP-結(jié)合RAS樣2(Diras2)；discs大同源物2(果蠅)(Dlg2)；ETS癌基因家族成員ELK1(Elk1)；fyn相關(guān)激酶(Frk)；巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶9(α(1,3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)(Fut9)；γ-氨基丁酸(GABA-A)受體亞基β2(Gabrb2)；GATA結(jié)合蛋白3(Gata3)；生長激素促分泌素受體(Ghsr)；G蛋白偶聯(lián)受體3(Gpr3)；離子型谷氨酸受體AMPA3(α3)(GRIA3)；G蛋白偶聯(lián)受體激酶5(Grk5)；糖原合酶激酶-3β(GSK3B)；超極化激活的環(huán)核苷酸門控鉀通道1(Hcn1)，超極化激活的環(huán)核苷酸門控K+2(Hcn2)，肌醇單磷酸酶(IMPA1)、千手蛋白、RhoGEF激酶(Kalrn)；鉀中/小電導(dǎo)鈣激活通道亞家族N成員3(KCNN3)；核周蛋白α3(輸入蛋白α4)(Kpna3)；髓鞘轉(zhuǎn)錄因子1樣(Myt1l)；核受體共激活蛋白2(Ncoa2)；N-Myc下游調(diào)節(jié)基因4(Ndrg4)；一氧化氮合酶1(神經(jīng)元)銜接蛋白質(zhì)(NOS1AP)；核受體亞家族3C組成員2(Nr3c2)；導(dǎo)蛋白G1(Ntng1)；核酪蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶底物1(Nucks1)；鈣調(diào)蛋白依賴性磷酸二酯酶1A(Pde1a)；cAMP特異性磷酸二酯酶1A(Pde4a)；磷酸二酯酶8B(Pde8b)；磷脂酶C，β1(Plcb1)；催乳素受體(Prlr)；RAB1B，成員RAS癌基因家族(Rab1b)；Ras相關(guān)蛋白R(shí)ap-2a(Rap2a)；類視黃醇相關(guān)孤兒受體β(Rorb)；sirtuin1(沉默交配型信息調(diào)節(jié)2同源物)1(Sirt1)；溶質(zhì)載體家族12(鉀/氯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員6(Slc12a6)；溶質(zhì)載體家族5(膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)成員7(Slc5a7)；反式作用轉(zhuǎn)錄因子1(Sp1)；突觸小泡糖蛋白2b(Sv2b)；突觸核被膜1(編碼nesprin-1)(Syne1)；突觸結(jié)合蛋白I(Syt1)；突觸結(jié)合蛋白II(Syt2)；突觸結(jié)合蛋白III(Syt3)；轉(zhuǎn)化生長因子β受體II(Tgfbr2)；甲狀腺激素受體β(Thrb)；瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族C成員6(Trpc6)；囊泡相關(guān)膜蛋白2(Vamp2)；無翅相關(guān)MMTV整合位點(diǎn)3(Wnt3)和含有BED結(jié)構(gòu)域4(Zbed4)的鋅指?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明miR-135a可在雙相情感障礙的病理生理學(xué)、其治療和診斷中起關(guān)鍵作用。盡管本發(fā)明結(jié)合其具體的實(shí)施方案加以描述，但是顯然許多替換、修改和變動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，本發(fā)明旨在包括所有落入所附權(quán)利要求書精神和廣大范圍中的這些替換、修改和變動(dòng)。本說明書所提及的所有出版物、專利和專利申請都通過引用全部結(jié)合到本說明書中，其程度與每個(gè)獨(dú)立出版物、專利或?qū)＠暾埦唧w而單獨(dú)指明通過引用結(jié)合到本文中一樣。另外，在本申請中，任何參考文獻(xiàn)的引用或標(biāo)識(shí)都不得解釋為承認(rèn)這樣的參考文獻(xiàn)都可作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)獲得。就使用章節(jié)標(biāo)題而言，它們不得解釋為必要限制性的。參考文獻(xiàn)Baldwin,D.S.,Anderson,I.M.,Nutt,D.J.,Bandelow,B.,Bond,A.,Davidson,J.R.,denBoer,J.A.,Fineberg,N.A.,Knapp,M.,Scott,J.和Wittchen,H.U.(2005).Evidence-basedguidelinesforthepharmacologicaltreatmentofanxietydisorders:recommendationsfromtheBritishAssociationforPsychopharmacology(用于焦慮障礙的藥物治療基于證據(jù)的準(zhǔn)則：英國精神藥理學(xué)協(xié)會(huì)建議).JPsychopharmacol19,567-596。Baudry,A.,Mouillet-Richard,S.,Schneider,B.,Launay,J.M.和Kellermann,O.(2010).miR-16targetstheserotonintransporter:anewfacetforadaptiveresponsestoantidepressants(miR-16靶向5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：對抗抑郁藥的適應(yīng)性響應(yīng)的新方面).Science329,1537-1541。BeckA.T.,Rush.,A.J.和B.F.Shaw(1979).Cognitivetherapyofdepression(抑郁癥的認(rèn)知療法).GuilfordPress,NewYork。Benmansour,S.,Owens,W.A.,Cecchi,M.,Morilak,D.A.和Frazer,A.(2002).Serotoninclearanceinvivoisalteredtoagreaterextentbyantidepressant-induceddownregulationoftheserotonintransporterthanbyacuteblockadeofthistransporter(通過抗抑郁藥誘導(dǎo)的5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白減量調(diào)節(jié)比通過該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的急性阻斷改變體內(nèi)5-羥色胺清除率至更大程度).JNeurosci22,6766-6772。Bortolozzi,A.,Castane,A.,Semakova,J.,Santana,N.,Alvarado,G.,Cortes,R.,Ferres-Coy,A.,Fernandez,G.,Carmona,M.C.,Toth,M.等(2012).SelectivesiRNA-mediatedsuppressionof5-HT1Aautoreceptorsevokesstronganti-depressantlikeeffects(選擇性siRNA介導(dǎo)的5-HT1A自身受體抑制引起強(qiáng)的抗抑郁樣作用).MolPsychiatry17,612-623。Creson,T.K.,Austin,D.R.,Shaltiel,G.,McCammon,J.,Wess,J.,Manji,H.K.和Chen,G.(2011).LithiumtreatmentattenuatesmuscarinicM(1)receptordysfunction(鋰治療減輕毒蕈堿性M(1)受體功能障礙).BipolarDisord13,238-249。Deneris,E.S.和Wyler,S.C.(2012).Serotonergictranscriptionalnetworksandpotentialimportancetomentalhealth(5-羥色胺能轉(zhuǎn)錄網(wǎng)和對精神健康可能的重要性).NatNeurosci15,519-527。Dunlop,B.W.,Kelley,M.E.,Mletzko,T.C.,Velasquez,C.M.,Craighead,W.E.和Mayberg,H.S.(2012).Depressionbeliefs,treatmentpreference和outcomesinarandomizedtrialformajordepressivedisorder(重度抑郁癥隨機(jī)化試驗(yàn)中的抑郁信念、治療優(yōu)先選擇和結(jié)局).JPsychiatrRes46,375-381。Elliott,E.,Ezra-Nevo,G.,Regev,L.,Neufeld-Cohen,A.和Chen,A.(2010).ResiliencetosocialstresscoincideswithfunctionalDNAmethylationoftheCrfgeneinadultmice(對社交應(yīng)激的復(fù)原力與成年小鼠中Crf基因的功能性DNA甲基化一致).NatNeurosci13,1351-1353。Evans,A.K.,Reinders,N.,Ashford,K.A.,Christie,I.N.,Wakerley,J.B.和Lowry,C.A.(2008).Evidenceforserotoninsynthesis-dependentregulationofinvitroneuronalfiringratesinthemidbrainraphecomplex(中腦縫復(fù)合體中體外神經(jīng)元放電率的5-羥色胺合成依賴性調(diào)節(jié)的證據(jù)).EurJPharmacol590,136-149。Fakra,E.,Hyde,L.W.,Gorka,A.,Fisher,P.M.,Munoz,K.E.,Kimak,M.,Halder,I.,Ferrell,R.E.,Manuck,S.B.和Hariri,A.R.(2009).EffectsofHTR1AC(-1019)Gonamygdalareactivityandtraitanxiety(HTR1AC(-1019)G對杏仁核反應(yīng)性和物質(zhì)焦慮的作用).ArchGenPsychiatry66,33-40。Gross,C.,Zhuang,X.,Stark,K.,Ramboz,S.,Oosting,R.,Kirby,L.,Santarelli,L.,Beck,S.和Hen,R.(2002).Serotonin1Areceptoractsduringdevelopmenttoestablishnormalanxiety-likebehaviourintheadult(5-羥色胺1A受體在發(fā)育中起作用以在成年動(dòng)物中建立平常焦慮樣行為).Nature416,396-400。Haramati,S.,Navon,I.,Issler,O.,Ezra-Nevo,G.,Gil,S.,Zwang,R.,Hornstein,E.和Chen,A.(2011).MicroRNAasrepressorsofstress-inducedanxiety:thecaseofamygdalarmiR-34(微RNA作為應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮的阻抑物：杏仁核miR-34的實(shí)例).JNeurosci31,14191-14203。Holmes,A.,Murphy,D.L.和Crawley,J.N.(2003).Abnormalbehavioralphenotypesofserotonintransporterknockoutmice:parallelswithhumananxietyanddepression(5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白敲除小鼠的異常行為表型：人焦慮和抑郁的對應(yīng)物).BiolPsychiatry54,953-959。Homberg,J.R.和Lesch,K.P.(2011).Lookingonthebrightsideofserotonintransportergenevariation(查找5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因變異的光明面).BiolPsychiatry69,513-519。Jensen,K.P.,Covault,J.,Conner,T.S.,Tennen,H.,Kranzler,H.R.和Furneaux,H.M.(2009).Acommonpolymorphisminserotoninreceptor1BmRNAmoderatesregulationbymiR-96andassociateswithaggressivehumanb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