本發(fā)明涉及基因工程藥物領(lǐng)域，特別涉及一種TRAIL雙靶點突變蛋白MuR5S4TR、制備方法及應(yīng)用，本發(fā)明中的TRAIL雙靶點突變蛋白MuR5S4TR對于多種不同類型的腫瘤具有優(yōu)越的治療作用，是極具潛力的新一代高效誘導腫瘤細胞凋亡藥物。

背景技術(shù)：

1、Apo 2L/TRAIL用于腫瘤治療的進展及意義

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)為腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)超家族的成員，其基因序列分別于1995年由Wiley等人和1996年由Pitti等人獨立克隆獲得，后者將其命名為凋亡素2配體(Apo 2Ligand，Apo 2L)。后來的研究證實，Apo 2L與TRAIL實質(zhì)上是同一種蛋白質(zhì)，因此習慣上可將其稱為Apo 2L/TRAIL。TRAIL的功能首先是作為生物體先天性或獲得性免疫的調(diào)節(jié)劑，其次在細胞外源性凋亡途徑中作為免疫監(jiān)視發(fā)揮抗腫瘤作用。TRAIL的最大優(yōu)點是可以選擇性地誘導多種腫瘤細胞凋亡而對正常細胞幾乎沒有毒性。研究資料表明，無論在體外還是體內(nèi)，Apo 2L/TRAIL對于各種來源的人腫瘤細胞系，包括結(jié)(直)腸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、甲狀腺癌、淋巴瘤、白血病以及多發(fā)性骨髓瘤等都具有誘導凋亡的作用。

從發(fā)現(xiàn)至今的近20年時間里，TRAIL一直被作為一種重要的潛在抗腫瘤藥物開發(fā)，TRAIL的臨床實驗在國外已進入Ⅱ期，在國內(nèi)已完成Ⅲ期。大量體內(nèi)外試驗均證實，TRAIL具有腫瘤特異性細胞毒性，尤其當它與小劑量化療藥物聯(lián)用時即表現(xiàn)出明顯的協(xié)同和增效作用。相反，研究發(fā)現(xiàn)機體中凋亡機制的缺失導致的TRAIL耐受與腫瘤細胞的快速生長和轉(zhuǎn)移明確相關(guān)。

腫瘤是一組高度異質(zhì)性的疾病，傳統(tǒng)上按照組織器官、病理改變的分型方法已經(jīng)不適合腫瘤的診療，目前的研究方向在于闡明不同腫瘤細胞的基因表達、分子分型，給予患者更具針對性的治療。對于抗腫瘤藥物認識的深入使人們了解到，無論細胞毒性藥物、分子靶向藥物還是單克隆抗體，其發(fā)揮作用的過程中均涉及到腫瘤細胞凋亡途徑的激活。誘導腫瘤細胞凋亡的信號通路途徑是這些藥物發(fā)揮作用的樞紐和中心環(huán)節(jié)，而凋亡逃避正是腫瘤發(fā)生發(fā)展以及耐藥的重要機制。

2、Apo 2L/TRAIL用于腫瘤治療的缺陷和對策

最近進展顯示，僅依賴Apo 2L/TRAIL治療多種不同類型的腫瘤仍是遠遠不夠的。盡管重組Apo 2L/TRAIL或TRAIL受體DR4/DR5的激動性單克隆抗體在Ⅰ期臨床治療中取得令人鼓舞的結(jié)果，但在隨后進行的Ⅱ期臨床研究中卻沒有顯示出明確的臨床受益。大量研究表明，正常細胞以及大約一半(甚至高達60％)以上的傳代腫瘤細胞株對TRAIL表現(xiàn)出耐藥。根據(jù)Roberta di peitro和Giorgia zauli的綜述，Apo 2L/TRAIL對已經(jīng)研究的92株原代或傳代腫瘤細胞中的61株敏感，敏感率為66.3％，而對其余的31株耐藥，耐藥率為33.7％。TRAIL對正常細胞的耐受有著其生理意義，TRAIL在體內(nèi)保持著精準的調(diào)控，只在生長發(fā)育過程中清除衰老退化和轉(zhuǎn)化細胞中發(fā)揮作用，而不至于對正常細胞產(chǎn)生殺傷。幾乎所有的TRAIL敏感腫瘤細胞在其凋亡信號通路中的各個環(huán)節(jié)和因素均具有相似的完整和功能，而每一種TRAIL耐藥腫瘤細胞均在凋亡信號通路中的一些環(huán)節(jié)和因素存在缺陷和變異，這些缺陷和變異使得這些耐藥的腫瘤細胞凋亡閾值異常升高，較易逃避凋亡清除，從而持續(xù)生長增殖。

大量研究證實，單用Apo 2L/TRAIL對于許多腫瘤細胞并不產(chǎn)生高效的抑制和殺傷作用。究其原因，腫瘤細胞凋亡信號通路是一個十分復雜龐大的系統(tǒng)，其中既包含許多促凋亡因素，又包含大量的凋亡抑制因子，這兩方面因素的相互作用決定了腫瘤細胞的最后歸宿。凋亡信號通路的健全和功能是腫瘤細胞凋亡的必要條件，但并不是充分條件。多種不同類型的藥物、分子或基因干預(yù)均可增強TRAIL對腫瘤細胞的敏感性，這些藥物包括不同類型的化療藥物、天然產(chǎn)物、小分子激酶抑制劑等。他們分別通過強化細胞外源性凋亡信號通路(如上調(diào)DRs表達，增強DRs在細胞膜上脂筏微區(qū)域的聚集和重分布，增強TRAIL/DRs復合物在細胞膜的內(nèi)吞，促使DISC向TRAIL/DRs復合物的募集，激活起始階段Caspase(Caspase 8)的活性，抑制凋亡拮抗因子FLIP、XIAP和IAPs的活性等)或線粒體凋亡信號通路(如增強線粒體膜電勢的去極化，促使線粒體通透性增加并釋放Cyt c、Smac或ARTs，促使Bid裂解為tBid，促使Bax、Bad寡聚化，抑制凋亡拮抗Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1、survivin因子等)或抑制其他細胞生存信號通路(如ERK/PI3K/AKt、MEK、Jak-STAT 3、MAPK、NF-κB等)或幾條通路的聯(lián)合而增強TRAIL誘導的腫瘤細胞凋亡活性。

盡管TRAIL及其受體激動性單克隆抗體藥物開發(fā)過程暫時受挫，但是隨著細胞凋亡信號通路途徑的完全闡明，凋亡/耐受相互轉(zhuǎn)換關(guān)系的完全揭示，基于凋亡信號通路的靶向抗腫瘤藥物研發(fā)并未停步。目前研究較多的是將TRAIL與細胞毒類的聯(lián)合應(yīng)用，但大多數(shù)實驗顯示這種聯(lián)合僅能對TRAIL相對敏感的腫瘤細胞產(chǎn)生明顯的協(xié)同和增效作用，而不能完全逆轉(zhuǎn)多種不同耐藥機制產(chǎn)生的耐藥現(xiàn)象。由于TRAIL與細胞毒類藥物分屬兩類不同藥物，存在藥物品種劑量、給藥途徑、作用方式的不同和差異，開發(fā)成單一、穩(wěn)定、可控的新藥可能性較小，且TRAIL與細胞毒類藥物聯(lián)用后，其毒副作用依然存在，故其優(yōu)勢并不明顯。

3、Apo 2L/TRAIL雙靶點突變蛋白的設(shè)計思路

研究表明，凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis protein，IAPs)中的多個蛋白是腫瘤細胞凋亡的強力抑制劑。IAPs的過表達發(fā)現(xiàn)于許多耐藥性腫瘤細胞中，其中X-連鎖凋亡抑制劑(X-linked inhibitor of apoptosis，XIAP)是IAP家族中的重要成員，對于多種腫瘤細胞的凋亡具有負性調(diào)控作用。

Ducketl等人于1996年克隆了XIAP基因，該基因編碼一個497個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量約為57KD。XIAP屬于凋亡抑制蛋白家族中一個重要成員，因其序列中含有多個桿狀病毒重復序列片段(Baculovirus IAP repeats，BIRs)，是一個強力的凋亡信號抑制因子。XIAP在多種耐藥的腫瘤細胞中高水平表達。

Du等人于2000年鑒定和純化了一種蛋白質(zhì)，將其命名為第二線粒體衍生的凋亡酶激活劑(Second mitochondrial-derived activator of caspase，Smac)，該蛋白在其他文獻中又被稱為低pI凋亡結(jié)合蛋白直接抑制因子(Direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI，DIABLO)。Chai等人研究顯示，Smac不僅促進前凋亡酶3(Procaspase-3)的裂解活化，而且增強成熟凋亡酶3(Caspase-3)的酶活性，上述過程均依賴Smac與IAPs的特異性作用。Smac的晶體結(jié)構(gòu)研究證實，Smac N端的氨基酸序列與其功能存在著密切的關(guān)系，Smac N端7個氨基酸單獨應(yīng)用在體外即可促進前凋亡酶3的活化。為進一步理解Smac與IAPs作用的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，Liu等人和Wu等人分別測定了XIAP與Smac N端具有完整功能的9個氨基酸的分子結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Smac N端4個氨基酸(Ala-Val-Pro-Ile，AVPI)可識別XIAP蛋白BIR3區(qū)域表面小溝。這個結(jié)果提示，Smac N端序列可代表整個蛋白質(zhì)行使抑制XIAP蛋白的完整功能。由于Smac N端4個氨基酸與凋亡酶9(Caspase-9)N端4個氨基酸序列具有同源性，Smac亦能競爭性結(jié)合XIAP的BIR3區(qū)域而破壞凋亡酶9與XIAP BIR3片段的連接從而釋放Caspase-9，增強Caspase-9的活性。

線粒體啟動的下游凋亡事件在TRAIL耐受腫瘤細胞的藥物抵抗發(fā)生過程中具有重要作用。Smac/DIABLO激動劑增強TRAIL耐藥腫瘤細胞對TRAIL的敏感性，主要是因為Smac/DIABLO激動劑強有力地抑制了耐藥性凋亡抑制蛋白IAPs家族，尤其是XIAP活性，從而增強了線粒體凋亡途徑的信號轉(zhuǎn)導。

目前已有多種方法用于抑制IAPs家族蛋白活性，其中Smac激動劑通過抑制XIAP蛋白活性，從而提高耐藥性腫瘤細胞對TRAIL誘導細胞凋亡的敏感性。目前采用Smac激動劑與TRAIL聯(lián)用研究涉及的腫瘤類型主要有肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎癌、黑色素瘤、白血病、鼻咽癌、卵巢癌等多種。

Smac激動劑包括：

(1)Smac穿膜肽融合蛋白

Roa等觀察到Smac-Tat肽通過抑制XIAP的活性，從而增強耐藥性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞對TRAIL誘導細胞凋亡的敏感性。Yang等觀察到，Smac N7(R8)能靶向IAPs蛋白家族，尤其是XIAP，逆轉(zhuǎn)耐藥性肺癌細胞H460對TRAIL的耐受。

(2)Smac基因的病毒載體

Khorashadizadeh等采用hA-MSC-ST載體轉(zhuǎn)染細胞，分泌一種新型細胞穿膜形式Smac和三聚體TRAIL，能明顯增強耐藥性乳腺癌細胞對TRAIL誘導細胞凋亡的敏感性。Pei等采用腺病毒載體ZD55-Smac與ZD55-TRAIL聯(lián)用，能明顯降低肝癌細胞中XIAP水平，完全清除荷瘤動物移植瘤腫瘤細胞。Wang等采用包含TRAIL-IETD-Smac的腺病毒載體ZD55-TRAIL-IETD-Smac，能完全清除肝癌移植瘤模型動物的腫瘤細胞。

(3)Smac N末端4或7肽

Kandasamy等采用預(yù)先給予耐藥性腫瘤細胞Smac N端7肽處理，觀察到可以逆轉(zhuǎn)耐藥性腫瘤的藥物耐受，恢復其對TRAIL的敏感性。Mao等觀察到，Smac N7與TRAIL聯(lián)用可明顯增強耐藥性卵巢癌細胞A2780移植瘤模型對TRAIL的敏感性，二者具有明顯的協(xié)同增效作用。Yang等觀察到，Smac N7(R8)能靶向IAPs蛋白家族，尤其是XIAP，逆轉(zhuǎn)耐藥性肺癌細胞H460對TRAIL的耐受。Guo等采用Smac N端7肽(Smac-7)或N端4肽(Smac-4)均能明顯增強TRAIL誘導的caspase 3的PARP裂解活性，促進腫瘤細胞的凋亡。

(4)Smac小分子模擬物

Metwalli等發(fā)現(xiàn)Smac模擬物單獨應(yīng)用僅有輕微的抑制膀胱癌細胞的作用，但與TRAIL聯(lián)用能明顯增強TRAIL的抑瘤作用。Wu等觀察到Smac模擬物與TRAIL聯(lián)用能減少鼻咽癌細胞SP中腫瘤干細胞樣(CSC-like)細胞比例，抑制腫瘤干細胞克隆和微球形成，在動物移植瘤模型上，聯(lián)合用藥可引起干細胞樣腫瘤細胞的清除。Allensworth等觀察發(fā)現(xiàn)，一種雙價Smac模擬物Birinapant單獨應(yīng)用可誘導TRAIL耐藥SUM 190(Erb2過表達)乳腺癌細胞死亡，增強TRAIL敏感SUM149(三陰性，EGFR活化)乳腺癌細胞對TRAIL誘導細胞凋亡的敏感性。Rockbrader等觀察到Smac模擬物能明顯增強TRAIL對MDA-MB-231、T47D和MDA-MB-453乳腺癌細胞的抑制作用。Huang等觀察發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用TRAIL與Smac模擬物可明顯增強誘導KRAS突變肺癌細胞凋亡能力而對正常細胞幾乎沒有影響，體內(nèi)實驗觀察到荷瘤動物腫瘤負荷的明顯降低。Lu等觀察到Smac模擬物SM-164與TRAIL聯(lián)用，無論對于TRAIL敏感細胞還是TRAIL非敏感細胞，包括乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌均能發(fā)揮高度的協(xié)同增效作用，在乳腺癌動物體內(nèi)模型上，SM-164與TRAIL聯(lián)用能引起動物移植瘤的快速清除。此外，Smac模擬物能誘導耐藥性卵巢癌、肝癌、白血病細胞及黑色素瘤細胞的死亡，Smac模擬物能克服TRAIL導致的NF-κB活性增高，具有同時抑制NF-κB活性的作用。

(5)Smac siRNA

Vogler等通過RNA干擾敲除XIAP基因的方法能與TRAIL發(fā)生協(xié)同增效，誘導胰腺癌細胞凋亡。在兩項胰腺癌細胞動物體內(nèi)移植瘤模型實驗中，通過XIAP siRNA抑制與TRAIL聯(lián)合可獲得移植瘤的完全消退。Chawla-Sarkar等觀察到在黑色素瘤細胞中，siRNA干擾XIAP或Survivin具有最強的抑瘤作用，同樣的結(jié)果也在腎癌細胞中觀察到。

(6)Smac-TRAIL融合蛋白

Jerzy等將Smac N端8肽(AVPIAQKP)、R7(RRRRRRR)穿膜肽結(jié)構(gòu)、MMP2及MMP9和尿激酶酶切位點(PLGLAGRVVR)序列、TRAIL(95～281aa)序列編碼cDNA順序連接，克隆于原核表達載體pET30a，得到重組表達載體pET30a-AD-O53.2。該表達載體轉(zhuǎn)化表達大腸桿菌BL21(DE3)，獲得良好表達，通過離子交換純化得到目的蛋白。融合突變蛋白O53.2對于大多數(shù)敏感細胞(包括肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、肝癌、腎癌和泌尿系統(tǒng)腫瘤等)的半數(shù)致死劑量為fmol級，而對非轉(zhuǎn)化的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)、人或鼠肝細胞沒有毒性。該融合蛋白對于動物耐受性良好，在移植瘤動物模型上能明顯抑制結(jié)直腸癌和肺癌細胞的生長。

TRAIL-Smac雙靶點聯(lián)合的方法治療多種不同類型的腫瘤，在體內(nèi)外均證實可明顯增強多種不同類型腫瘤細胞或腫瘤移植瘤模型對藥物的敏感性，增強其抗腫瘤的活性，而對正常細胞較少毒性。

上述TRAIL與Smac聯(lián)合治療方法盡管獲得了一定的效果，但離臨床應(yīng)用仍有較遠的距離。在小分子Smac激動劑藥物的開發(fā)進程中，受制于小分子藥物的安全性，與TRAIL兩類不同藥物的差異，單獨使用的便利性，臨床療效的穩(wěn)定性等因素的制約，不是一種最佳的藥學實現(xiàn)方式?；诨蛑委煹腟mac激動策略，由于基因治療潛在的安全性問題，目前仍有大量關(guān)切有待闡明，很長一段時間內(nèi)仍停留在基礎(chǔ)研究階段，成藥的可能性小。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

文獻研究表明Smac N4具有完整Smac蛋白的功能，是多種耐藥性腫瘤細胞中主要存在的TRAIL耐藥的關(guān)鍵凋亡拮抗因子XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis)的強有力的抑制因子。因此我們設(shè)想，在TRAIL穿膜肽樣突變體TRAIL-MuR5的基礎(chǔ)上，采用組合生物學的手段和方法，在緊鄰TRAIL-MuR5的RRRRR(R5)序列后，將原TRAIL序列中的PQRV突變?yōu)镾mac N端4肽AVPI，將新構(gòu)建的突變蛋白命名為TRAIL雙靶點突變蛋白MuR5S4TR。TRAIL雙靶點突變蛋白MuR5S4TR同時針對腫瘤細胞凋亡的細胞外受體凋亡途徑和多種耐藥性腫瘤細胞的凋亡抑制因子XIAP，具有雙靶點明確的協(xié)同增效作用。多靶點組合的作用方式，符合誘導腫瘤細胞凋亡藥物設(shè)計的最新思想，對于XIAP高表達的耐藥性腫瘤具有更好的治療效果。在藥物結(jié)構(gòu)設(shè)計中主動地引進了XIAP基因表達的生物分子標記物，優(yōu)選最佳分子表型的腫瘤類型，可望極大地提高抗腫瘤的臨床療效。

本發(fā)明是在TRAIL穿膜肽樣突變體TRAIL-MuR5(PCT/CN2015/073504：TRAIL穿膜肽樣突變體MuR5、制備方法及應(yīng)用)序列的基礎(chǔ)上，選擇性地將MuR5序列中第2～6位RRRRR(R5)之后的第7～10位氨基酸序列由脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸(PQRV)順序突變?yōu)镾mac蛋白N端4肽，即丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、異亮氨酸(AVPI)序列，使得新的突變蛋白既具有穿膜肽樣突變體的性能，又具有第二線粒體衍生的凋亡酶激活劑(Second mitochondrial-derived activator of caspase)的活性。我們將新的突變蛋白命名為TRAIL雙靶點突變蛋白MuR5S4TR。該蛋白同時針對腫瘤細胞凋亡的細胞外受體凋亡途徑和多種耐藥性腫瘤細胞的凋亡抑制因子XIAP，具有雙靶點明確的協(xié)同增效作用。

針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明涉及一種TRAIL雙靶點突變蛋白MuR5S4TR、其制備方法及其應(yīng)用的三個目的，其中第一個目的是提供一種能夠大幅度增強TRAIL野生型蛋白抗腫瘤活性，尤其是能夠逆轉(zhuǎn)多種耐藥腫瘤細胞對TRAIL野生型蛋白耐藥的新型TRAIL雙靶點突變蛋白MuR5S4TR。制備的突變蛋白既能通過穿透細胞膜直接進入細胞漿而快速起效，又能促進死亡受體/突變蛋白復合物在細胞膜脂筏微區(qū)域的聚集和內(nèi)化，增強外源性凋亡信號途徑的轉(zhuǎn)導。MuR5S4TR突變蛋白具有更高的表達效率和更好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。TRAIL雙靶點突變蛋白MuR5S4TR對于各種耐藥性腫瘤細胞具有優(yōu)越的治療作用，是極具潛力的新一代高效誘導耐藥性腫瘤細胞凋亡的藥物。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種TRAIL雙靶點突變蛋白MuR5S4TR，該突變蛋白是通過選擇性地將TRAIL-MuR5序列中的第7～10位氨基酸序列由PQRV改造為AVPI，即第7位由脯氨酸突變?yōu)楸彼?，?位由谷氨酰胺突變?yōu)槔i氨酸，第9位由精氨酸突變?yōu)楦彼?，?0位由纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔沟猛蛔兊鞍譔端第2～10位成為既包含穿膜肽序列RRRRR(R5)，又包含凋亡抑制因子XIAP結(jié)合序列AVPI的雙靶點突變蛋白。這種突變蛋白的結(jié)構(gòu)設(shè)計不同于傳統(tǒng)上采用外源性序列融合的蛋白質(zhì)改造思路，采用內(nèi)源性突變的方法使原有蛋白獲得新的性能，在盡量不改變原有蛋白序列長短、空間構(gòu)像的前提下，最大程度維護蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和生物活性。

進一步的，所述突變蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2。

進一步的，編碼所述突變蛋白的cDNA序列如SEQ ID NO：1。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種上述TRAIL雙靶點突變蛋白MuR5S4TR的制備方法，包括如下步驟：

A、cDNA片段擴增與克?。?/p>

B、表達載體的構(gòu)建與鑒定；

C、重組TRAIL雙靶點突變蛋白的表達；

D、TRAIL雙靶點突變蛋白的純化；

E、TRAIL雙靶點突變蛋白的鑒定。

進一步的，步驟B中，表達載體的構(gòu)建與鑒定步驟包括：

B₁、將原核表達載體中對應(yīng)的融合標簽序列切除；

B₂、將優(yōu)化后編碼TRAIL雙靶點突變蛋白的cDNA序列克隆于原核表達載體上以獲得高效可溶性非融合表達。

進一步的，步驟B₁中，所述原核表達載體為pET 32a。

進一步的，步驟C中，重組蛋白的表達時，誘導溫度為18～30℃。

進一步的，步驟D中，TRAIL雙靶點突變蛋白的純化步驟包括：

D₁、陽離子交換樹脂作為第一步純化以捕獲破菌后上清中的目的蛋白；

D₂、高密度苯基疏水作為第二步中度純化以進一步提高蛋白質(zhì)純度和去除內(nèi)毒素；

D₃、采用陰離子交換樹脂作為最終步驟精細純化以使產(chǎn)品滿足工業(yè)化放大和將來臨床應(yīng)用所需。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種上述TRAIL雙靶點突變蛋白MuR5S4TR在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明誘導腫瘤細胞凋亡的作用機理，TRAIL雙靶點突變蛋白MuR5S4TR既具有穿膜肽樣突變體的性能，又具有第二線粒體衍生的凋亡酶激活劑(Smac)的活性。該蛋白同時針對腫瘤細胞凋亡的細胞外受體凋亡途徑和多種耐藥性腫瘤細胞的凋亡抑制因子XIAP，具有雙靶點明確的協(xié)同增效作用，對于耐藥性腫瘤具有更好的療效。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：

1、全新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。采用較少位點的突變，在現(xiàn)有成熟蛋白質(zhì)前體的基礎(chǔ)上進行最小化改構(gòu)，保留了原有野生型蛋白的空間構(gòu)像和活性基礎(chǔ)，大幅度提高了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和生物學活性。

2、高的蛋白表達水平及可溶性表達比例。采用高效原核表達載體pET32a的改造形式，表達載體在18～30℃的較寬誘導溫度范圍內(nèi)均可獲得大大高于TRAIL野生型蛋白的表達水平和可溶性表達比例，可溶性蛋白比例達80％。

3、不同于TRAIL野生型蛋白的純化制備工藝，工藝的有效性、回收率和產(chǎn)品質(zhì)量顯著提升，由于不采用特異性親和層析的純化方法，純化成本相應(yīng)降低，可放大潛力顯著，能完全滿足將來的臨床所需。

4、廣泛的體內(nèi)外生物學活性。TRAIL雙靶點突變蛋白MuR5S4TR與TRAIL野生型蛋白相比，在經(jīng)過檢測的幾乎所有腫瘤細胞類型中，其抗腫瘤活性均明顯提高，尤其對于TRAIL耐藥的腫瘤細胞株，能明顯逆轉(zhuǎn)TRAIL野生型蛋白的耐受，具有更強的治療作用。預(yù)期MuR5S4TR單用或聯(lián)用，可用于耐藥性結(jié)(直)腸癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌及腦瘤的治療。

5、完善的作用靶點選擇組合。選擇將經(jīng)典的腫瘤細胞凋亡受體激動劑TRAIL經(jīng)過穿膜肽樣突變與線粒體途徑凋亡促進劑Smac分子的N端4肽組合，同時激活誘導腫瘤細胞凋亡的細胞外受體途徑和細胞內(nèi)線粒體途徑。TRAIL雙靶點突變蛋白MuR5S4TR針對多種耐藥性腫瘤細胞中主要存在的TRAIL耐藥關(guān)鍵因素，增強腫瘤細胞凋亡的同時強力抑制凋亡拮抗因子XIAP的活性，并同時具有穿透細胞膜進入細胞漿的能力，成為多途徑抗腫瘤突變蛋白。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為MuR5S4TR-1片段PCR產(chǎn)物電泳圖。電泳條件：1％Agarose，電壓150V，25min。Lane 1：MuR5S4TR-1PCR產(chǎn)物電泳條帶；M：DL2000(條帶分子量從上到下依次為：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，上樣量5μl；PCR產(chǎn)物上樣量均為3μl。

圖2為MuR5S4TR片段PCR產(chǎn)物電泳圖。電泳條件：1％Agarose，電壓150V，25min。Lane 1：MuR5S4TR PCR產(chǎn)物電泳條帶；M：DL2000(條帶分子量從上到下依次為：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，上樣量5μl；PCR產(chǎn)物上樣量均為3μl。

圖3為Nde I、EcoR I酶切后膠回收電泳結(jié)果圖。電泳條件：1％Agarose，電壓150V，25min。Lane 1：pET32a酶切后膠回收產(chǎn)物電泳條帶；Lane 2：MuR5S4TR酶切后膠回收產(chǎn)物電泳條帶；M：GeneRuler 1kb DNA Ladder(條帶分子量從上到下依次為：10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3500bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp)，上樣量5μl；PCR產(chǎn)物上樣量均為3μl。

圖4為酶切鑒定結(jié)果圖。電泳條件：1％Agarose，電壓150V，30min。Lane 1～8：pET32a/MuR5S4TR 1^#～8^#菌種所提取質(zhì)粒酶切后電泳圖；M：GeneRuler 1kb DNA Ladder(條帶分子量從上到下依次為：10000bp、8000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3500bp、3000bp、2500bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp)。鑒定產(chǎn)物上樣量均為10μl，Marker上樣量為5μl。

圖5為pET32a/MuR5S4TR SDS-PAGE電泳圖。電泳條件：15％凝膠，200V，35min。Lane 1：pET32a/MuR5S4TR誘導前電泳條帶，Lane 2：pET32a/MuR5S4TR誘導后電泳條帶，Lane 3：pET32a/MuR5S4TR破菌后上清電泳條帶，Lane 4：pET32a/MuR5S4TR破菌后沉淀電泳條帶，M：Unstained Protein Molecular Weight Marker(條帶分子量從上到下依次為：116.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、35.0KDa、25.0KDa、18.4KDa、14.4KDa)，Marker上樣量為5μl，其它樣品上樣量均為20μl。

圖6為陽離子交換過程SDS-PAGE電泳圖。電泳條件：15％凝膠，200V，50min。Lane 1：料液，Lane 2：穿透液，Lane 3：第一步洗脫液，Lane 4：第二步洗脫液，Lane 5：NaOH洗脫液，M：Unstained Protein Molecular Weight Marker(條帶分子量從上到下依次為：116.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、35.0KDa、25.0KDa、18.4KDa、14.4KDa)。樣品上樣量Marker為5μl，其它均為20μl。

圖7為高密度苯基疏水過程SDS-PAGE電泳圖。電泳條件：15％凝膠，200V，50min。Lane 1：料液，Lane 2：穿透液，Lane 3：第一步洗脫液，Lane 4：第二步洗脫液，Lane 5：NaOH洗脫液，M：Unstained Protein Molecular Weight Marker(條帶分子量從上到下依次為：116.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、35.0KDa、25.0KDa、18.4KDa、14.4KDa)。樣品上樣量Marker為5μl，其它均為20μl。

圖8為陰離子交換過程SDS-PAGE電泳圖。電泳條件：15％凝膠，200V，50min；Lane 1：陰離子交換原液，Lane 2：陰離子交換穿透液，Lane 3：2M NaCl洗脫液，Lane 4：0.5M NaOH洗脫液，M：Unstained Protein Molecular Weight Marker(條帶分子量從上到下依次為：116.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、35.0KDa、25.0KDa、18.4KDa、14.4KDa)；樣品上樣量Marker為5μl，其它均為20μl；

圖9為MuR5S4TR Western blot鑒定圖。Lane 1：pET32a/MuR5S4TR破菌上清Western blot結(jié)果圖；Lane 2：pET32a/TRAIL破菌上清Western blot結(jié)果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

TRAIL雙靶點突變蛋白的序列及引物設(shè)計

本發(fā)明是在TRAIL穿膜肽樣突變體TRAIL-MuR5(PCT/CN2015/073504：TRAIL穿膜肽樣突變體MuR5、制備方法及應(yīng)用)序列的基礎(chǔ)上，選擇性地將MuR5序列中第2～6位RRRRR(R5)之后的7～10位氨基酸序列由脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、纈氨酸(PQRV)順序突變?yōu)镾mac蛋白N端4肽，即丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、異亮氨酸(AVPI)序列，突變位點為4處，使得突變體蛋白的N端成為連續(xù)5個精氨酸(RRRRR)之后緊接Smac蛋白N端4肽丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、異亮氨酸(AVPI)的編碼序列。新的突變蛋白既具有穿膜肽樣突變體性能，又具有第二線粒體衍生的凋亡酶激活劑(Second mitochondrial-derived activator of caspase)活性。我們將新的突變蛋白命名為TRAIL雙靶點突變蛋白MuR5S4TR。

編碼突變蛋白的cDNA如SEQ ID NO：1，突變蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2。

引物合成如下：

上游引物：

MuR5S4TR-NdeI-1：

GGTCATATGCGTCGTCGTCGTCGTGCTGTTCCGATTGCT

MuR5S4TR-2：

CGTCGTGCTGTTCCGATTGCTGCTCACATCACTGG

下游引物：

TR-Eco-R：

GTTGAATTCTTATTAACCAACAAGGAAAGCACCGAAGAAAG

實施例2

分兩步PCR擴增MuR5S4TR基因片段，將片段雙酶切后直接與相同酶切的表達載體pET32a連接，連接產(chǎn)物單菌落挑取及鑒定。

引物設(shè)計見實施例1，pET32a/MuR5TR模板來自專利PCT/CN2015/073504。

具體的，該pET32a/MuR5TR cDNA序列見SEQ ID No：3。

實驗步驟

一、PCR擴增MuR5S4TR目的片段

1、以MuR5S4TR-2/TR-Eco-R引物對擴增MuR5S4TR-1目的片段，根據(jù)表1配制反應(yīng)體系，反應(yīng)體系50μl。

2、渦旋震蕩混勻，短暫離心，將溶液收集到管底。

3、PCR擴增反應(yīng)條件見表2。

4、電泳，照相。

5、將PCR擴增的MuR5S4TR-1目的片段以O(shè)mega PCR純化試劑盒純化樣本，用30μl超純水洗脫，電泳，照相，以備作為第二輪PCR的模板。

6、以MuR5S4TR-NdeI-1/TR-Eco-R引物對擴增MuR5S4TR目的片段，根據(jù)表3配制反應(yīng)體系，反應(yīng)體系50μl。

7、渦旋震蕩混勻，短暫離心，將溶液收集到管底。

8、PCR擴增反應(yīng)條件見表4。

9、電泳，照相。

10、將PCR擴增的MuR5S4TR目的片段用Omega膠回收試劑盒做膠回收，用50μl超純水洗脫，電泳，照相，備用。

表1 MuR5S4TR-1PCR反應(yīng)體系

表2 MuR5S4TR-1PCR反應(yīng)條件

表3 MuR5S4TR PCR反應(yīng)體系

表4 MuR5S4TR PCR反應(yīng)條件

二、目的片段MuR5S4TR與pET32a質(zhì)粒雙酶切后連接

1、用NdeI和EcoRI雙酶切載體與目的基因片段，酶切體系見表5，反應(yīng)體系100μl。

2、將EP管放入多用恒溫箱中，30℃，2小時。

3、用OMEGA的膠回收試劑盒做膠回收，載體和目的片段分別用30μl超純水洗脫。電泳，照相。

4、將膠回收目的片段和載體連接，連接體系見表6。

5、于16℃金屬浴孵育過夜。

6、將連接產(chǎn)物10μl加入100μl Top10感受態(tài)細胞，冰浴30min。

7、在水浴42℃熱擊90秒。

8、置冰上孵育2分鐘。

9、加入500μl SOC培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45分鐘。

10、轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞離心后，在超凈工作臺，棄去400μl，余約100μl培養(yǎng)基，將細菌吹勻，全部涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。

表5 載體與目的基因酶切反應(yīng)體系

表6 載體與目的基因連接反應(yīng)體系

三、單菌落挑取及酶切鑒定

(一)單菌落挑取

1、準備已滅菌試管40支，已加入氨芐青霉素LB培養(yǎng)基100ml。

2、將培養(yǎng)基分裝于各個試管中，每管分裝約4ml。

3、在已長好菌落的平皿上，使用經(jīng)充分灼燒的鑷子夾取無菌槍頭，挑取平板所長出的菌落8個。將槍頭投入裝有LB培養(yǎng)基的試管中。

4、將各試管捆扎好，放入搖床夾具上充分固定。37℃、220rpm振搖過夜。

(二)質(zhì)粒提取

1、將菌液各取1ml分別加入離心管中。10000×g離心1min，盡量吸取上清。

2、向留有菌體沉淀的離心管中加入250μl Solution I(預(yù)先加入RNAase A)，徹底懸浮細菌沉淀。

3、加入250μl Solution II，溫和地混勻，使菌體充分裂解，此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，并在5min內(nèi)完成此步驟。

4、向離心管中加入350μl Solution III，立即顛倒混勻，此時出現(xiàn)白色絮狀沉淀，13000×g以上離心10min，此時在離心管底部形成沉淀。

5、將步驟5中所得上清均分加入到2個已裝入收集管的HiBind Miniprep吸附柱中，注意不要吸出沉淀，10000×g離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

6、向收集管中加入500μl Buffer HB，10000×g離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7、向收集管中加入700μl Wash Buffer，10000×g離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

8、重復步驟7。

9、將吸附柱重新放回收集管中，13000×g以上離心2min干燥吸附柱，倒掉收集管中的廢液。

10、將各吸附柱置于一個新的1.5ml EP管中，向每個吸附膜的中間部位懸空滴加65μl Elution Buffer，室溫放置數(shù)分鐘，13000×g以上離心1min，將質(zhì)粒溶液收集到1.5ml EP管中。

11、各得到60μl質(zhì)粒DNA。-20℃保存質(zhì)粒。

(三)酶切鑒定

1、pET32a/MuR5S4TR質(zhì)粒用Xba I和EcoR I雙酶切。酶切反應(yīng)體系見表7。

2、將EP管放入多用恒溫箱中，37℃，孵育2小時。

3、酶切結(jié)束后電泳鑒定。

表7pET32a/MuR5S4TR質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系

(四)選擇酶切正確的連接成功的菌種，保存甘油菌種，送測序。

實驗結(jié)果

一、PCR擴增目的片段結(jié)果

1、以MuR5S4TR-2/TR-Eco-R引物對擴增MuR5S4TR-1目的基因片段，片段分子量大小均為500bp左右。如圖1所示，根據(jù)上述PCR反應(yīng)條件得到目的基因。

2、以MuR5S4TR-NdeI-1/TR-Eco-R引物對擴增MuR5S4TR目的基因片段，片段分子量大小均為500bp左右。如圖2所示，根據(jù)上述PCR反應(yīng)條件得到目的基因。

二、目的片段分別與pET32a連接及轉(zhuǎn)化結(jié)果

(一)理論上MuR5S4TR與pET32a用NdeI和EcoRI雙酶切后片段大小分別約為500bp左右和5.4Kb左右，如圖3所示，酶切后膠回收均得到單一條帶。

(二)MuR5S4TR與pET32a連接及轉(zhuǎn)化結(jié)果

1、平皿有菌落長出，密度正常。

2、挑取的單菌落，第二日所有試管長出細菌，密度正常。

3、用酶切方法鑒定質(zhì)粒，pET32a/MuR5S4TR質(zhì)?？捎肵baI和EcoRI雙酶切鑒定，連接成功質(zhì)粒酶切后應(yīng)出現(xiàn)5.4Kb左右載體片段及550bp左右目的片段。如圖所示pET32a/MuR5S4TR 1^#～8^#8個樣本都為陽性克隆。

實施例3

質(zhì)粒pET32a-MuR5S4TR表達試驗

將在實施例2中獲得測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，挑取1個單菌進行表達試驗，考察表達效果。

實驗步驟

一、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及菌種保存

1、配制LB培養(yǎng)基100ml，121℃滅菌20min。

2、取pET32a-MuR5S4TR質(zhì)粒1μl加入100μl BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，冰浴30min。

3、在水浴42℃熱擊90秒。

4、置冰上孵育3分鐘。

5、取20μl轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞全部涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。

6、次日平板長出菌落后，在平板上挑取兩個單菌加入50ml LB(Amp⁺⁾中，37℃培養(yǎng)過夜。

7、保存甘油菌20支，甘油終濃度15％，-20℃保存。

二、菌種表達

1、取過夜培養(yǎng)的pET32a-MuR5S4TR培養(yǎng)液1000μl接入50ml LB(Amp⁺)培養(yǎng)基中。接種后37℃，250rpm振搖培養(yǎng)3h后降低培養(yǎng)溫度至24℃。按1％的比例加入0.1M IPTG誘導培養(yǎng)，誘導前取樣0.5ml離心棄去上清，加入50μl H₂O重懸后加入50μl 2×loading buffer制成誘導后電泳樣品。

2、誘導過夜后收菌，檢測A600值，取樣150μl離心棄去上清，加入50μl H₂O重懸后加入50μl 2×loading buffer制成誘導后電泳樣品，剩余菌液使用5430R型離心機，12000rpm離心5min。

3、取50ml培養(yǎng)液離心獲得菌體，使用8ml 50mM Na₂HPO₄溶液重懸，超聲

波破菌。破菌條件為：Φ6探頭，200W脈沖破菌2s后暫停2s，循環(huán)共10min。。

4、破菌液取1ml 12000rpm離心10min，分離上清和沉淀，沉淀使用1ml H₂O重懸，上清和沉淀重懸液各取20μl，加入30μl H₂O及50μl 2×loading buffer，制成電泳樣品。

5、將制成的電泳樣品置于沸水浴中處理10min，使用5430R型離心機，A-45-30-11型轉(zhuǎn)頭，12000rpm離心10min，各取上清10μl電泳。

實驗結(jié)果

實驗電泳圖見圖5，pET32a-MuR5S4TR單菌表達量高。

實驗結(jié)果顯示pET32a-MuR5S4TR目的蛋白表達量高，破菌后上清含有約80％目的蛋白，便于分離純化。

實施例4

MuR5S4TR蛋白的純化制備

根據(jù)對于MuR5S4TR大量小試工藝的探索，我們建立了MuR5S4TR蛋白純化工藝，我們使用SP-HP陽離子交換、高密度苯基疏水、陰離子交換穿透三步法批量純化MuR5S4TR蛋白，以獲取樣品供體內(nèi)外活性分析用。

實驗步驟

一.菌體破碎及離心

1.取30g MuR5S4TR表達菌體，加入Na₂HPO₄-NaH₂PO₄、甘油、Tween 20、DTT及NaCl，使以上物質(zhì)終濃度分別為20mM、5％、0.1％、1mM、600mM，另加入H₂O使總體積達到80ml。

2.將菌液進行超聲波破菌，破菌條件為：使用Φ10探頭，500W脈沖破菌2s后暫停2s，共破菌15min。

3.使用5430R型離心機，F(xiàn)-35-6-30型轉(zhuǎn)頭，7850rpm離心40min，取上清，使用0.45μm濾膜過濾后作為上柱樣品。

二.蛋白質(zhì)純化溶液及柱準備

1.配制如下溶液：

(1)陽離子交換緩沖液A：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，600mM NaCl，5％甘油，0.1％Tween 20，1mM DTT，調(diào)節(jié)pH至7.0。

(2)陽離子交換緩沖液B：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，800mM NaCl，5％甘油，0.1％Tween 20，1mM DTT，調(diào)節(jié)pH至7.0。

(3)陽離子交換洗脫液：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，1.2M NaCl，5％甘油，0.1％Tween 20，1mM DTT，調(diào)節(jié)pH至7.0。

(4)0.5M NaOH。

(5)苯基疏水緩沖液A：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，30％飽和度(NH₄)₂SO₄，1.2M NaCl，5％甘油，0.1％Tween 20，1mM DTT，調(diào)節(jié)pH至7.0。

(6)苯基疏水緩沖液B：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，12％飽和度(NH₄)₂SO₄，1.2M NaCl，5％甘油，0.1％Tween 20，1mM DTT，調(diào)節(jié)pH至7.0。

(7)苯基疏水洗脫液：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，600mM NaCl，5％甘油，0.1％Tween 20，1mM DTT，調(diào)節(jié)pH至7.0。

(8)陰離子交換緩沖液：20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，60mM NaCl，0.3M甘氨酸，調(diào)節(jié)pH至7.0。

2.使用SP Sepharose Fast Flow凝膠層析柱，使用5CV純水沖洗柱上殘存的乙醇，然后使用5CV相應(yīng)的平衡緩沖液平衡。

3.使用MPC HCT XK16Grad凝膠層析柱，使用1CV純水沖洗稀釋柱上的NaOH，然后使用5CV預(yù)平衡緩沖液平衡，再使用平衡緩沖液平衡。

4.使用Sephadex G-25medium凝膠層析柱，使用5CV純水沖洗柱上殘存的乙醇，然后使用5CV陰離子交換緩沖液平衡。

5.使用Q Sepharose Fast Flow凝膠層析柱，使用5CV純水沖洗柱上殘留的乙醇，然后使用5CV陰離子交換緩沖液平衡。

三.陽離子交換純化

按照如下純化步驟進行陽離子交換純化。純化期間收集所有穿透及洗脫成分以備電泳分析：

1.平衡：使用陽離子交換A緩沖液平衡SP Sepharose Fast Flow層析柱至UV穩(wěn)定。

2.樣品制備及上樣：取破菌離心上清，上樣。

3.清洗：使用2CV陽離子交換緩沖液A洗滌柱子以除去殘留的未結(jié)合蛋白。

4.洗脫：使用3CV陽離子交換緩沖液B洗脫目的蛋白。

5.NaOH清洗：使用2CV 0.5M NaOH溶液清洗柱子。

6.再平衡(Reequilibration)：使用5CV陽離子交換緩沖液A再平衡柱子。

四.苯基疏水純化

按照如下純化步驟進行苯基疏水純化。純化期間收集所有穿透及洗脫成分以備電泳分析：

1.平衡：使用苯基疏水平衡緩沖液平衡MPC HCT XK16Grad層析柱至UV穩(wěn)定。

2.樣品制備及上樣：取陽離子交換洗脫液樣品，加入(NH₄)₂SO₄至30％飽和度，上樣。

3.清洗：使用2CV苯基疏水緩沖液B洗滌柱子以除去殘留的未結(jié)合蛋白。

4.洗脫：使用3CV苯基疏水洗脫液洗滌柱子，控制pH。

5.NaOH清洗：使用2CV 0.5M NaOH溶液洗脫剩余的雜質(zhì)，并保存柱子。

6.再平衡(Reequilibration)：使用5CV苯基疏水緩沖液A再平衡柱子。

五.陰離子交換純化

按照如下純化步驟進行第三步陰離子交換純化。純化期間收集所有穿透及洗脫成分以備電泳分析：

1.平衡：使用陰離子交換緩沖液平衡Q Sepharose Fast Flow層析柱至UV穩(wěn)定。

2.樣品制備及上樣：取苯基疏水洗脫樣品，經(jīng)Sephadex G-25medium層析柱置換緩沖液為陰離子交換緩沖液后，上樣。

3.平衡液清洗：使用1CV陰離子交換緩沖液清洗柱子以獲得未結(jié)合上柱子的目的蛋白。

4.NaCl清洗：使用2CV 2M NaCl洗滌柱子以除去結(jié)合在柱上的蛋白。

5.NaOH清洗：使用2CV 0.5M NaOH溶液清洗柱子。

6.再平衡(Reequilibration)：使用陰離子交換緩沖液再平衡柱子。

實驗結(jié)果

每一步純化過程樣品的電泳結(jié)果見圖6、7、8，陽離子交換純化目的蛋白洗脫液收集30ml，濃度10.0mg/ml，經(jīng)檢測目的蛋白純度為79.6％，第二步高密度苯基疏水目的蛋白洗脫液收集29ml，濃度4.68mg/ml，經(jīng)檢測目的蛋白純度為84.1％，而第三部陰離子交換穿透120ml，濃度0.846mg/ml，目的蛋白純度為94.7％。多次重復本實施例的實驗操作，獲得了足夠體外生活學活性評價的蛋白量。

實施例5

MuR5S4TR蛋白的Western Blot檢測

由于MuR5S4TR為野生型TRAIL N端9個位點突變所得，TRAIL的抗原決定簇仍然保留，能夠與TRAIL的多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，因此可用TRAIL多克隆抗體進行檢測鑒定。

實驗步驟

一.樣品配制

1.實施例4純化的MuR5S4TR蛋白從-20℃解凍后，按其提供的濃度用超純水稀釋成1mg/ml。取樣本50μl加入50μl 2×loading buffer，制成電泳樣品。各取10μl電泳，即上樣量為5ug。

2.對照品TRAIL-20131204凍干品(實驗室自備)用1mlPBS溶解，取樣本50μl加入50μl 2×loading buffer，制成電泳樣品。各取10μl電泳，即上樣量為5ug。

二.檢測過程

樣品經(jīng)15％SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。首先4℃封閉過夜，再與一抗[兔抗人TRAIL多克隆抗體(1:500)]室溫孵育2小時，然后與二抗[羊抗兔IgG-HRP(1:5000)]室溫孵育2小時，最后使用增強型化學發(fā)光(ECL)檢測。具體步驟如下：

1.15％SDS-PAGE電泳分離蛋白；取出凝膠，切去凝膠邊緣，浸于TBST緩沖液中，時間15min。

2.使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))：PVDF膜使用前必須用甲醇略微浸濕15秒，然后在蒸餾水中浸泡1～3min，隨后在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡；在轉(zhuǎn)膜夾中，由負極到正極依次鋪上：海綿墊、濾紙(4～8張)、目的膠、PVDF膜、濾紙(4～8張)、海綿墊，排氣泡后加緊夾子放入轉(zhuǎn)膜槽中，電壓40V，時間45min。

3.封閉膜：將膜在封閉液(3％BSA)中4℃條件下封閉過夜，次日取出在室溫振搖30min，以封閉非特異結(jié)合位點。

4.一抗孵育：將一抗用封閉液稀釋至工作濃度[兔抗人TRAIL多克隆抗體(1:500)]，與膜一起振搖，室溫孵育2h。

5.洗膜：用TBST洗膜三次，每次10min。10×10cm的膜需洗滌液50ml以上。

6.二抗孵育：將HRP標記的二抗用封閉液稀釋至工作濃度[羊抗兔IgG-HRP(1:5000)]，與膜一起振搖，室溫孵育2h。

7.洗膜：用TBST洗膜三次，每次10min。10×10cm的膜需洗滌液50ml以上。

8.顯色：(1)將等體積的Solution A和Solution B混合，制備足夠的檢測混合液(0.125ml/cm²)。檢測混合液配置后立即使用，室溫1h內(nèi)可保持穩(wěn)定。(2)瀝去洗過的印跡膜上多余的洗液，但不可使膜干燥。在膜上有蛋白的一面加上檢測混合液，瀝去多余的檢測混合液，放在柯達凝膠成像Image Station 4000R上，用X-ray曝光，首次選擇曝光時間1min，根據(jù)圖像結(jié)果調(diào)整曝光時間。電腦記錄圖像。

9.結(jié)果判斷：陽性結(jié)果應(yīng)呈現(xiàn)明顯色帶。陰性結(jié)果不顯色。

實驗結(jié)果

如圖9所示，MuR5S4TR及TRAIL對照品呈陽性反應(yīng)，陰性對照呈陰性反應(yīng)。

實施例6

蛋白MuR5S4TR及TRAIL生物活性分析

應(yīng)用CCK-8檢測試劑盒檢測MuR5S4TR及野生型TRAIL 2個蛋白樣品對11個腫瘤細胞株的體外抗增殖活性IC50值，以評價其體外生物活性。

材料和方法

檢測用細胞株均來自中國科學院上海細胞庫或美國ATCC。

試劑和耗材

Cell Counting Kit-8(Cat#CK04-13，Dojindo)

96孔培養(yǎng)板(Cat#3599，Corning Costar)

胎牛血清(Cat#10099-141，GIBCO)

培養(yǎng)基(購自GIBCO)

臺式酶標儀SpectraMax M5 Microplate Reader(Molecular Devices)

2個蛋白樣品：通過實施例4制備或?qū)嶒炇易詡洹?/p>

實驗步驟

1.試劑配制

培養(yǎng)基的配制

蛋白樣品的制備

用無菌的PBS緩沖液稀釋2個蛋白樣品使終濃度為5mg/ml，并過濾除菌。

2.IC50實驗

a)收集對數(shù)生長期細胞，計數(shù)，用完全培養(yǎng)基重新懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度至合適濃度(依照細胞密度優(yōu)化試驗結(jié)果確定)，接種96孔板，每孔加100μl細胞懸液。細胞(SW620細胞除外，不需要5％CO₂)在37℃，100％相對濕度，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育24小時。

b)用無菌PBS緩沖液將待測蛋白樣品稀釋至5mg/ml后梯度稀釋8次，按25μl/孔加入細胞?；衔锝K濃度從1mg/ml至0，3倍梯度稀釋，共10個濃度點；并根據(jù)初步的實驗結(jié)果，對蛋白樣品的作用終濃度進行相應(yīng)的調(diào)整。

c)細胞(SW620細胞除外，不需要5％CO₂)置于37℃，100％相對濕度，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育48小時。

d)吸棄培養(yǎng)基，加入含10％CCK-8的完全培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2～4小時。

e)輕輕震蕩后在SpectraMax M5 Microplate Reader上測定450nm波長處的吸光度，以650nm處吸光度作為參比，計算抑制率。

3.數(shù)據(jù)處理

按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率：腫瘤細胞生長抑制率％＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％

As：樣品的OA/RLU(細胞+CCK-8+待測化合物)

Ac：陰性對照的OA/RLU(細胞+CCK-8)

Ab：陽性對照的OA/RLU(培養(yǎng)基+CCK-8)

運用軟件Graphpad Prism 5并采用計算公式log(inhibitor)vs.normalized response-Variable slope進行IC50曲線擬合并計算出IC50值。

實驗結(jié)果

本實驗測試了2個蛋白樣品(MuR5S4TR和野生型TRAIL)對3個胰腺癌細胞株(CFPAC-1、BxPC-3、PANC-1)，2個肺癌細胞株(NCI-H460、A 549、)，3個結(jié)(直)腸癌細胞株(SW620、HT-29、HCT 116),3個乳腺癌細胞株(MDA-MB-231、MCF-7、T47D、)的體外抗細胞增殖活性。實驗結(jié)果如下表所示。

實驗結(jié)論

TRAIL雙靶點突變蛋白MuR5S4TR與TRAIL野生型蛋白相比，在經(jīng)過檢測的幾乎所有的腫瘤細胞類型中(包括多種結(jié)直腸癌細胞、多種肺癌細胞、多種胰腺細胞、多種乳腺細胞)，其抗腫瘤活性均明顯提高，尤其對于TRAIL野生型蛋白耐藥的腫瘤細胞株，能明顯逆轉(zhuǎn)這些細胞對TRAIL野生型蛋白的耐受，具有更強的治療作用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。