本發(fā)明涉及經(jīng)工程改造而具有抗病毒性的哺乳動物細(xì)胞系和所述細(xì)胞系用于減少或防止生物生產(chǎn)系統(tǒng)的病毒污染的用途。背景重組產(chǎn)生的治療性蛋白質(zhì)用于治療許多疾病或病狀(諸如癌癥和自身免疫性疾病)的用途不斷增加。然而，這些蛋白質(zhì)治療劑的大規(guī)模生產(chǎn)仍然是一個挑戰(zhàn)。舉例來說，工業(yè)制造過程中必須實現(xiàn)可靠高收率，使得下游工藝產(chǎn)生極純的產(chǎn)物，只允許痕量污染物至優(yōu)選地?zé)o污染物。使用無動物成分的培養(yǎng)基已經(jīng)顯著地降低了外來病毒污染的發(fā)生率。另外，諸如超濾、高溫短時間處理和/或?qū)ι⒀b材料進行UVC照射之類的程序的實施進一步降低了污染的發(fā)生率。然而，病毒污染的風(fēng)險仍然存在。就產(chǎn)品損失、暫時退出市場和昂貴的去污成本而言，污染事件對制造商將是災(zāi)難性的。因此，需要對病毒感染具有增加的抗性的哺乳動物細(xì)胞系。附圖簡述圖1呈現(xiàn)了如通過Southern印跡分析所測定的MVM病毒感染的時間過程。利用在24、48、72和96小時針對野生型細(xì)胞(CHOZNGS-/-)、Slc35A1KO、COSMCKO、COSMCKO克隆F07、COSMCKO克隆G03和COSMCKO克隆H05所檢測的MVM病毒DNA的相對量進行作圖。克隆H05具有12bp的框內(nèi)缺失(即，無移碼突變)。圖2示出了如通過空斑測定所檢測的MVM病毒感染的時間過程。作圖的是在24、48、72和96小時針對野生型細(xì)胞(CHOZN)、Slc.35A1KO、COSMCKO、COSMCKO克隆F07、COSMCKO克隆G03和COSMCKO克隆H05所檢測的pfu/mL。圖3示出了MMV感染對細(xì)胞生長的影響。作圖的是野生型(2E3)(A)和COSMCKO克隆F07(B)細(xì)胞在MVM病毒不存在(實線)和以MOI1或8存在(斷線)的情況下在120小時過程中的活細(xì)胞數(shù)目(細(xì)胞/ml)。圖4呈現(xiàn)了MMV感染后的細(xì)胞相關(guān)病毒的時間過程。作圖的是每個細(xì)胞的MVM病毒基因組拷貝數(shù)(vgc)(基于假定每一個已感染的細(xì)胞可以產(chǎn)生2x104vgc)，如在MVM病毒以MOI1(A)或8(B)存在的情況下通過qPCR在120小時的過程中針對野生型(2E3)(實現(xiàn))和COSMCKO克隆F07(斷線)細(xì)胞所檢測。圖5示出了在指示的細(xì)胞系中的MMV復(fù)制的時間過程。作圖的是用MVM病毒以MOI0.3(A)或0.03(B)感染后0和21小時的vgc/樣品。圖6呈現(xiàn)了所指示的細(xì)胞系中的呼腸孤病毒3復(fù)制的時間過程。作圖的是在感染Reo-3病毒后0和24小時與野生型細(xì)胞(2E3)相關(guān)的vgc/樣品。.圖7呈現(xiàn)了在MVM病毒不存在(UN)或存在(IN)的情況下針對細(xì)胞生長進行的生長測定。圖A呈現(xiàn)了野生型(GS)、Slc35A1KO、COSMCKO克隆F07和COSMCKO克隆G03在10天內(nèi)的活細(xì)胞密度(VCD)。圖B呈現(xiàn)了野生型(GS)、來源于COSMCKO克隆F07的IgG產(chǎn)生克隆71H1和71C3在8天內(nèi)的VCD。圖8呈現(xiàn)了在MVM病毒不存在(UN)或存在(IN)的情況下針對細(xì)胞生長進行的生長測定。作圖的是野生型(GS)、St3Gal4KO克隆7D10、St3Gal4KO克隆1B08和St3Gal4KO克隆1B10在9天內(nèi)的VCD。概要在本公開的各種方面中，提供了經(jīng)工程改造以阻礙或防止細(xì)胞中的病毒進入和/或病毒繁殖的哺乳動物細(xì)胞系。在一些實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞系經(jīng)過基因修飾，使得與未經(jīng)修飾的親本細(xì)胞系相比，至少一種病毒的進入和/或繁殖被減少或消除。在各種實施方案中，本文中所公開的哺乳動物細(xì)胞系包含至少一個經(jīng)修飾的染色體序列。在其他實施方案中，所述經(jīng)修飾的染色體序列是失活的，使得所述細(xì)胞系不產(chǎn)生或產(chǎn)生降低水平的編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在一個實施方案中，所述細(xì)胞系包含至少一個編碼核心1酶伴侶(COSMC)的失活染色體序列。在另一個實施方案中，編碼COSMC的染色體序列的所有拷貝都是失活的且所述細(xì)胞系不產(chǎn)生COSMC。在一個替代實施方案中，所述細(xì)胞系包含至少一個編碼溶質(zhì)載體家族35(CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運體)成員A1(Slc35A1)的失活染色體序列。在另一個實施方案中，編碼Slc35A1的染色體序列的所有拷貝都是失活的且所述細(xì)胞系不產(chǎn)生Slc35A1。在又另一個實施方案中，所述細(xì)胞系包含至少一個編碼核心1伸長酶(C1GalT1)的失活染色體序列。在另一個實施方案中，編碼C1GalT1的染色體序列的所有拷貝都是失活的且所述細(xì)胞系不產(chǎn)生C1GalT1。在另一個實施方案中，所述細(xì)胞系包含至少一個編碼St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶1(St3Gal1)的失活染色體序列。在另一個實施方案中，編碼St3Gal1的染色體序列的所有拷貝都是失活的且所述細(xì)胞系不產(chǎn)生St3Gal1。在一個替代實施方案中，所述細(xì)胞系包含至少一個編碼St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶2(St3Gal2)的失活染色體序列。在另一個實施方案中，編碼St3Gal2的染色體序列的所有拷貝都是失活的且所述細(xì)胞系不產(chǎn)生St3Gal2。在又另一個實施方案中，所述細(xì)胞系包含至少一個編碼St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶3(St3Gal3)的失活染色體序列。在另一個實施方案中，編碼St3Gal3的染色體序列的所有拷貝都是失活的且所述細(xì)胞系不產(chǎn)生St3Gal3。在又另一個實施方案中，所述細(xì)胞系包含至少一個編碼St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶4(St3Gal4)的失活染色體序列。在另一個實施方案中，編碼St3Gal4的染色體序列的所有拷貝都是失活的且所述細(xì)胞系不產(chǎn)生St3Gal4。在一個替代實施方案中，所述細(xì)胞系包含至少一個編碼St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶5(St3Gal5)的失活染色體序列。在另一個實施方案中，編碼St3Gal5的染色體序列的所有拷貝都是失活的且所述細(xì)胞系不產(chǎn)生St3Gal5。在又另一個實施方案中，所述細(xì)胞系包含至少一個編碼St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶6(St3Gal6)的失活染色體序列。在另一個實施方案中，編碼St3Gal6的染色體序列的所有拷貝都是失活的且所述細(xì)胞系不產(chǎn)生St3Gal6。在一個替代實施方案中，所述細(xì)胞系包含編碼St3Gal1、St3Gal2、St3Gal3、St3Gal4、St3Gal5和St3Gal6中的任兩者的失活染色體序列。在又一個替代實施方案中，所述細(xì)胞系包含編碼St3Gal1、St3Gal2、St3Gal3、St3Gal4、St3Gal5和St3Gal6中的任兩者的失活染色體序列。在其他實施方案中，包含編碼COSMC、Slc35A1、C1GalT1、St3Gal1、St3Gal2、St3Gal3、St3Gal4、St3Gal5和/或St3Gal6的失活染色體序列的細(xì)胞系還包含編碼甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶1(Mgat1)、甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶2(Mgat2)、甘露糖基(α-1，4-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶3(Mgat3)、甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶4(Mgat4)和/或甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，6-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶5(Mgat5)的失活染色體序列。本文中所公開的包含經(jīng)修飾的染色體序列的哺乳動物細(xì)胞系與未經(jīng)修飾的親本細(xì)胞系相比對病毒進入和/或病毒繁殖具有增加的抗性。在又其他實施方案中，包含編碼St3Gal1、St3Gal2、St3Gal3、St3Gal4、St3Gal5和/或St3Gal6的失活染色體序列的細(xì)胞系經(jīng)過進一步工程改造以過度表達(dá)至少一種負(fù)責(zé)產(chǎn)生2，6-鍵聯(lián)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶(例如，St6β-半乳糖酰胺α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶1(St6Gal1)、St6β-半乳糖酰胺α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶2(St6Gal2)、St6(α-N-乙酰基-神經(jīng)氨?；?2，3-β-半乳糖基-1，3)-N-乙酰半乳糖酰胺1(St6GalNac1)、St6(α-N-乙?；?神經(jīng)氨?；?2，3-β-半乳糖基-1，3)-N-乙酰半乳糖酰胺2(St6GalNac2)、St6(α-N-乙酰基-神經(jīng)氨?；?2，3-β-半乳糖基-1，3)-N-乙酰半乳糖酰胺3(St6GalNac3)、St6(α-N-乙?；?神經(jīng)氨?；?2，3-β-半乳糖基-1，3)-N-乙酰半乳糖酰胺4(ST6GalNac4)、St6(α-N-乙酰基-神經(jīng)氨?；?2，3-β-半乳糖基-1，3)-N-乙酰半乳糖酰胺5(St6GalNac5)和/或St6(α-N-乙?；?神經(jīng)氨?；?2，3-β-半乳糖基-1，3)-N-乙酰半乳糖酰胺6(St6GalNac6)。在一些實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞系是非人細(xì)胞系。在其他實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞系是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系。在諸多具體實施方案中，所述細(xì)胞系是包含編碼COSMC、Slc35A1、C1GalT1、St3Gall、St3Gal2、St3Gal3、St3Gal4、St3Gal5、St3Gal6或其組合的滅活染色體序列的CHO細(xì)胞系。在某些實施方案中，本文中所公開的哺乳動物細(xì)胞系對選自細(xì)小病毒、呼腸孤病毒、輪狀病毒、流感病毒、腺相關(guān)病毒、杯狀病毒、副流感病毒、風(fēng)疹病毒、冠狀病毒、諾羅病毒、腦心肌炎病毒、多瘤病毒或其組合的病毒的進入和/或繁殖表現(xiàn)出抗性。在一些實施方案中，所述細(xì)小病毒是小鼠微小病毒(MVM)、1型小鼠細(xì)小病毒、2型小鼠細(xì)小病毒、3型小鼠細(xì)小病毒、豬細(xì)小病毒1、牛細(xì)小病毒1、人細(xì)小病毒B19、人細(xì)小病毒4、人細(xì)小病毒5或其組合。在另外的實施方案中，所述呼腸孤病毒是哺乳動物呼腸孤病毒3、哺乳動物正呼腸孤病毒、禽正呼腸孤病毒或其組合。在各種實施方案中，本文中所公開的哺乳動物細(xì)胞系是通過使用靶向核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因組修飾技術(shù)來修飾至少一個染色體序列而制得。所述靶向核酸內(nèi)切酶可以是鋅指核酸酶、CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶、轉(zhuǎn)錄活化因子樣效應(yīng)因子(TALE)核酸酶、大范圍核酸酶、位點特異性核酸內(nèi)切酶或人工靶向DNA雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑。在諸多具體實施方案中，所述靶向核酸內(nèi)切酶是一對鋅指核酸酶。在一些實施方案中，本文中所公開的哺乳動物細(xì)胞系還包含至少一種編碼選自抗體、抗體片段、疫苗、生長因子、細(xì)胞因子、激素、凝血因子或另一種治療蛋白質(zhì)的重組蛋白的核酸。本公開的另一個方面涵蓋一種減少或防止重組蛋白產(chǎn)物的病毒污染的方法，所述方法包括：獲得如本文中所公開的抗病毒哺乳動物細(xì)胞系，并且在所述細(xì)胞系中表達(dá)重組蛋白產(chǎn)物。本公開的另一個方面提供一種減小生物生產(chǎn)系統(tǒng)的病毒污染的風(fēng)險的方法，其中所述方法包括提供如本文中所公開的抗病毒哺乳動物細(xì)胞系以用于所述生物生產(chǎn)系統(tǒng)中。本公開的又另一個方面涵蓋一種組合物，其包含如本文中所公開的抗病毒哺乳動物細(xì)胞系和至少一種病毒，其中所述細(xì)胞系表現(xiàn)出了對由所述至少一種病毒所致的感染的抗性。以下更詳細(xì)地描述本公開的其他方面和迭代。詳細(xì)說明本公開提供了經(jīng)工程改造以阻礙或防止細(xì)胞系中的病毒進入和/或病毒繁殖的哺乳動物細(xì)胞系。具有抗病毒性的經(jīng)工程改造的細(xì)胞系可以經(jīng)過基因修飾以含有經(jīng)修飾的(例如，滅活的)染色體序列。還提供了使用本文中所公開的細(xì)胞系產(chǎn)生重組蛋白的方法，其中該重組蛋白產(chǎn)物基本上沒受到病毒污染。因此，使用對病毒感染具有抗性的細(xì)胞系能減小或消除生物生產(chǎn)系統(tǒng)和所得蛋白質(zhì)產(chǎn)物的病毒污染的風(fēng)險。(I)抗病毒細(xì)胞系本公開的一個方面涵蓋經(jīng)工程改造以具有病毒抗性的哺乳動物細(xì)胞系。換句話說，與未經(jīng)修飾的親本細(xì)胞系相比，本文中所公開的細(xì)胞系對由至少一種病毒所致的感染具有增加的抗性。更具體來說，與未經(jīng)修飾的親本細(xì)胞系相比，在本文中所公開的經(jīng)工程改造的細(xì)胞系中，病毒進入和/或病毒繁殖被減少或消除。在一些實施方案中，該哺乳動物細(xì)胞系經(jīng)過基因修飾并且含有至少一個經(jīng)修飾的染色體序列。一般來說，該經(jīng)修飾的序列包含突變。在諸多具體實施方案中，該經(jīng)修飾的染色體序列是失活的(或被敲除)，使得該細(xì)胞系不產(chǎn)生編碼蛋白產(chǎn)物。一般來說，對病毒感染的抗性(或敏感性)可以通過比較經(jīng)工程改造的哺乳動物細(xì)胞系對暴露于病毒的反應(yīng)與未經(jīng)修飾的(未經(jīng)工程改造的)親本細(xì)胞對相同病毒攻擊的反應(yīng)來確定。細(xì)胞系的病毒感染和/或細(xì)胞系中的病毒繁殖可以通過多種技術(shù)加以分析。合適的技術(shù)的非限制性實例包括核酸檢測法(例如，用于檢測具體病毒核酸的存在的南方核酸印跡測定、用于檢測病毒核酸的PCR或RT-PCR、測序法等等)、基于抗體的技術(shù)(例如，使用抗病毒蛋白質(zhì)抗體的西方免疫印跡技術(shù)、ELISA法，諸如此類)、生物測定(例如，斑點測定、細(xì)胞病變效應(yīng)測定等等)和顯微鏡技術(shù)(例如，用于檢測病毒顆粒的電子顯微鏡檢查等)。在一些實施方案中，相對于未經(jīng)修飾的親本細(xì)胞，經(jīng)工程改造的哺乳動物細(xì)胞系內(nèi)的病毒感染和/或繁殖可以減少至少約10％、至少約20％、至少約40％、至少約60％、至少約80％、至少約90％、至少約99％或超過約99％。在諸多具體實施方案中，經(jīng)工程改造的哺乳動物細(xì)胞系對病毒感染具有抗性，即，病毒不能進入和/或在該經(jīng)工程改造的哺乳動物細(xì)胞系中繁殖。本文中所公開的哺乳動物細(xì)胞系可以用多種不同的方式加以工程改造以賦予病毒抗性。在一些實施方案中，該細(xì)胞系可以經(jīng)過修飾，以使得通過細(xì)胞表面受體的病毒進入被減少或消除。在其他實施方案中，該細(xì)胞系可以經(jīng)過工程改造以表達(dá)能抑制或阻斷涉及復(fù)制和/或感染性的特定病毒蛋白的分子。在又其他實施方案中，該細(xì)胞系可以經(jīng)過工程改造以過度表達(dá)特定細(xì)胞抗病毒蛋白。在一些實施方案中，該工程改造可以是基因工程改造，其中基因組或染色體序列經(jīng)過修飾。換句話說，該細(xì)胞系經(jīng)過基因修飾。在其他實施方案中，該工程改造可以是表觀基因工程改造或染色體外工程改造。(a)抗病毒機制(i)擾亂細(xì)胞表面受體在某些實施方案中，該哺乳動物細(xì)胞系經(jīng)過工程改造以含有經(jīng)改變的細(xì)胞表面受體。病毒可以通過特異性附著于細(xì)胞表面上的互補受體而進入細(xì)胞。對于許多病毒來說，這些細(xì)胞表面受體包含與蛋白質(zhì)(或脂質(zhì))連接的聚糖結(jié)構(gòu)。唾液酸或其衍生物中的封端聚糖充當(dāng)許多病毒的受體(Matrosovich等，2013，TopCurrChem，DOI：10.1007/128_2013_466)。因此，包含具有末端唾液酸殘基的O連接型或N連接型聚糖的糖蛋白可以充當(dāng)許多病毒的細(xì)胞表面受體。唾液酸是指神經(jīng)氨酸的衍生物，并且包括例如N-乙?；窠?jīng)氨酸(Neu5Ac或NANA)和N-羥乙?；窠?jīng)氨酸(Neu5Gc或NGNA)。在一些實施方案中，該細(xì)胞系經(jīng)過工程改造以包含缺乏末端唾液酸殘基的糖蛋白。末端唾液酸殘基可以通過缺失(即，敲除)或改變涉及聚糖鏈合成的酶和/或蛋白質(zhì)而得以消除。合適的靶標(biāo)包括涉及O連接型聚糖的合成的酶或蛋白質(zhì)、涉及N連接型聚糖的合成的酶或蛋白質(zhì)和/或涉及唾液酸的合成或轉(zhuǎn)運的酶或蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，該細(xì)胞系可能缺乏以上提到的靶向酶或蛋白質(zhì)中的至少一種(或以上提到的靶標(biāo)的任何組合)。如本文中所使用，“缺乏”是指靶向酶或蛋白質(zhì)的水平有所降低或不可檢測，或者靶向酶或蛋白質(zhì)的活性有所降低或不可檢測。靶向酶或蛋白質(zhì)的量或活性可以通過修飾至少一個編碼靶向蛋白質(zhì)或酶的染色體序列而被減少或消除。舉例來說，染色體序列可以經(jīng)過修飾以含有至少一個核苷酸的缺失、至少一個核苷酸的插入、至少一個核苷酸的取代或其組合。因此，缺失、插入和/或取代可以移動染色體序列的閱讀框，以致不產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物(即，染色體序列是失活的)。或者，經(jīng)修飾的染色體序列中的缺失、插入和/或取代可能導(dǎo)致產(chǎn)生改變的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。對感興趣的染色體序列的修飾可以使用以下部分(III)(a)中詳述的靶向核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)來實現(xiàn)。在編碼靶向酶或蛋白質(zhì)的一個染色體序列失活的情況下，經(jīng)工程改造的細(xì)胞系產(chǎn)生較低水平的靶向酶或蛋白質(zhì)。在編碼靶向酶或蛋白質(zhì)的染色體序列的所有拷貝都失活的其他情況下，經(jīng)工程改造的細(xì)胞系不產(chǎn)生靶向酶或蛋白質(zhì)(即，該細(xì)胞系是敲除或KO)。在又其他實施方案中，靶向酶或蛋白質(zhì)的水平可以使用以下部分(III)(b)中詳述的RNA干擾介導(dǎo)的機制來減少或消除。在一些實施方案中，靶向酶或蛋白質(zhì)的水平可以降低至少約5％、約5％至10％、約10％至20％、約20％至30％、約30％至40％、約40％至50％、約50％至60％、約60％至70％、約70％至80％、約80％至90％或約90％至約100％。在其他實施方案中，靶向酶或蛋白質(zhì)的水平可以降至使用本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如，西方免疫印跡測定、ELISA酶測定等等)不可檢測的水平。在一些實施方案中，該細(xì)胞系可能缺乏涉及O連接型糖基化的酶或蛋白質(zhì)。舉例來說，該細(xì)胞系可能缺乏核心1伸長酶(也稱為核心1合成酶糖蛋白-N-乙酰基半乳糖酰胺3-β-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶1或C1GalT1)、核心1酶侶伴蛋白(也稱為C1GalT1特異性侶伴蛋白或COSMC)或兩者。COSMC促進C1GalT1的折疊、穩(wěn)定性和活性，由此催化半乳糖殘基轉(zhuǎn)移至O-連接于蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸的N-乙?；肴樘酋０?GalNAc)殘基。在諸多具體實施方案中，該細(xì)胞系缺乏C1GalT1、COSMC或兩者。該缺乏可能是由于編碼C1GalT1和/或COSMC的失活染色體序列所致，從而產(chǎn)生了較低水平的C1GalT1和/或COSMC蛋白質(zhì)或不產(chǎn)生C1GalT1和/或COSMC蛋白質(zhì)。在一些情況下，至少一個編碼C1GalT1和/或COSMC的染色體序列是失活的。在其他情況下，編碼C1GalT1和/或COSMC的染色體序列的所有拷貝都是失活，導(dǎo)致該細(xì)胞系缺乏C1GalT1蛋白和/或COSMC蛋白。在其他實施方案中，該細(xì)胞系可能缺乏至少一種唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST)。該唾液酸轉(zhuǎn)移酶可以是將唾液酸添加至呈α-2，3鍵聯(lián)構(gòu)象的半乳糖的唾液酸轉(zhuǎn)移酶、將唾液酸添加至呈α-2，6鍵聯(lián)構(gòu)象的半乳糖或N-乙酰半乳糖酰胺的唾液酸轉(zhuǎn)移酶或?qū)⑼僖核崽砑又脸师?2，8鍵聯(lián)構(gòu)象的其他唾液酸單元的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。合適的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的非限制性實例包括St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶1(St3Gal1)、St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶2(St3Gal2)、St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶3(St3Gal3)、St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶4(St3Gal4)、St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶5(St3Gal5)、St3β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶6(St3Gal6)、St6β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶1(St6Gal1)、St6β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶2(St6Gal2)、St6(α-N-乙酰基-神經(jīng)氨?；?2，3-β-半乳糖基-1，3)-N-乙酰半乳糖酰胺1(St6GalNac1)、St6(α-N-乙?；?神經(jīng)氨酰基-2，3-β-半乳糖基-1，3)-N-乙酰半乳糖酰胺2(St6GalNac2)、St6(α-N-乙?；?神經(jīng)氨?；?2，3-β-半乳糖基-1，3)-N-乙酰半乳糖酰胺3(St6GalNac3)、St6(α-N-乙酰基-神經(jīng)氨?；?2，3-β-半乳糖基-1，3)-N-乙酰半乳糖酰胺4(ST6GalNac4)、St6(α-N-乙?；?神經(jīng)氨酰基-2，3-β-半乳糖基-1，3)-N-乙酰半乳糖酰胺5(St6GalNac5)、St6(α-N-乙?；?神經(jīng)氨酰基-2，3-β-半乳糖基-1，3)-N-乙酰半乳糖酰胺6(St6GalNac6)、St8α-N-乙?；?神經(jīng)氨酸苷α-2，8-唾液酸轉(zhuǎn)移酶1(St8Sia1)、St8α-N-乙?；?神經(jīng)氨酸苷α-2，8-唾液酸轉(zhuǎn)移酶2(St8Sia2)、St8α-N-乙酰基-神經(jīng)氨酸苷α-2，8-唾液酸轉(zhuǎn)移酶3(St8Sia3)、St8α-N-乙?；?神經(jīng)氨酸苷α-2，8-唾液酸轉(zhuǎn)移酶4(St8Sia4)、St8α-N-乙?；?神經(jīng)氨酸苷α-2，8-唾液酸轉(zhuǎn)移酶5(St8Sia5)或St8α-N-乙酰基-神經(jīng)氨酸苷α-2，8-唾液酸轉(zhuǎn)移酶6(St8Sia6)。在諸多具體實施方案中，該細(xì)胞系可能缺乏至少一種α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(例如，St3Gal1、St3Gal2、St3Gal3、St3Gal4、St3Gal5和/或St3Gal6)。該缺乏可能是由于編碼至少一種α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的失活染色體序列所致，從而產(chǎn)生了較低水平的該至少一種α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶或不產(chǎn)生該α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。在一些情況下，編碼該至少一種α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的至少一個染色體序列可以是失活的。在其他情況下，編碼該至少一種α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的染色體序列的所有拷貝都可以是失活的，使得該細(xì)胞系缺乏該至少一種α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。換句話說，編碼St3Gal1、St3Gal2、St3Gal3、St3Gal4、St3Gal5和/或St3Gal6的染色體序列可能被敲除。在該細(xì)胞系包含編碼至少一種α-2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(例如，St3Gal1、St3Gal2、St3Gal3、St3Gal4、St3Gal5和/或St3Gal6)的至少一個失活染色體序列的一些情況下，該細(xì)胞系可以經(jīng)過進一步工程改造以過度表達(dá)至少一種負(fù)責(zé)產(chǎn)生2，6-鍵聯(lián)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶(例如，St6Gal1、St6Gal2、St6GalNac1、St6GalNac2、St6GalNac3、ST6GalNac4、St6GalNac5和/或St6GalNac6)。因此，這類細(xì)胞系可以包含具有減少數(shù)目的(或沒有)末端2，3連接型唾液酸殘基和增加數(shù)目的末端2，6連接型唾液酸殘基的糖蛋白。在其他實施方案中，該細(xì)胞系可能缺乏至少一種涉及唾液酸合成或轉(zhuǎn)運的酶或蛋白質(zhì)。涉及唾液酸合成或轉(zhuǎn)運的酶或蛋白質(zhì)的實例包括但不限于葡糖胺(UDP-N-乙酰基)-2-表異構(gòu)酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(GNE)、N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(NANS)、N-乙酰神經(jīng)氨酸磷酸酶(NANP)、單磷酸胞苷N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶(CMAS)和單磷酸胞苷N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶(CMAH)、溶質(zhì)載體家族35(CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運體)成員A1(Slc35A1)。在某些實施方案中，該細(xì)胞系可能缺乏將CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運至高爾基體中的Slc35A1。在一些情況下，編碼Slc35A1的至少一個染色體序列可以是失活的。在其他情況下，編碼Slc35A1的染色體序列的所有拷貝都可以是失活的，使得該細(xì)胞是缺乏Slc35A1蛋白。在另外的實施方案中，該細(xì)胞系可能缺乏涉及N-糖基化的至少一種酶或蛋白質(zhì)。在一些情況下，涉及N-糖基化的酶或蛋白質(zhì)可以是N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶，其給N連接型聚糖的β-連接型甘露糖殘基增加了GlcNAc殘基。實例包括甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶1(Mgat-1)、甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶2(Mgat-2)、甘露糖基(α-1，4-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶3(Mgat-3)、甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，4-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶4(Mgat-4)和甘露糖基(α-1，6-)-糖蛋白β-1，6-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶5(Mgat-5)。在其他情況下，涉及N-糖基化的酶或蛋白質(zhì)可以是半乳糖轉(zhuǎn)移酶，其給N連接型聚糖的GlcNAc殘基增加了處于β-1，4鍵聯(lián)中的半乳糖殘基。半乳糖轉(zhuǎn)移酶可以是UDP-Gal：βGlcNAcβ1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶多肽1(B4GalT1)、UDP-Gal：βGlcNAcβ1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶多肽2(B4GalT2)、UDP-Gal：βGlcNAcβ1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶多肽3(B4GalT3)、UDP-Gal：βGlcNAcβ1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶多肽4(B4GalT4)、UDP-Gal：βGlcNAcβ1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶多肽5(B4GalT5)、UDP-Gal：βGlcNAcβ1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶多肽6(B4GalT6)或UDP-Gal：βGlcNAcβ1，4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶多肽7(B4GalT7)。在某些情況下，該細(xì)胞系可能缺乏至少一種N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶和/或半乳糖轉(zhuǎn)移酶。在一些迭代中，編碼至少一種N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶和/或半乳糖轉(zhuǎn)移酶的至少一個染色體序列可以是失活的。在其他情況下，編碼該至少一種N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶和/或半乳糖轉(zhuǎn)移酶的染色體序列的所有拷貝都可以是失活的，使得該細(xì)胞系缺乏該至少一種N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶和/或半乳糖轉(zhuǎn)移酶。(ii)干擾病毒蛋白質(zhì)在其他實施方案中，該哺乳動物細(xì)胞系可以經(jīng)過工程改造以表達(dá)能抑制或阻斷病毒復(fù)制和/或感染性的分子。舉例來說，該細(xì)胞系可以經(jīng)過工程改造以穩(wěn)定地表達(dá)至少一種針對涉及復(fù)制和/或感染性的特定病毒蛋白質(zhì)的RNA干擾(RNAi)劑。合適的病毒蛋白質(zhì)的非限制性實例包括非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，諸如NS1或NS2，和殼體蛋白質(zhì)，諸如VP1或VP2。RNAi劑結(jié)合靶轉(zhuǎn)錄物且通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物裂解的裂解或破壞轉(zhuǎn)錄物的翻譯而防止蛋白質(zhì)表達(dá)。在一些實施方案中，RNAi劑可以是短干擾RNA(siRNA)。一般來說，siRNA包含介于約15至約29個核苷酸長，或更一般來說，約19至約23個核苷酸長的范圍內(nèi)的雙鏈RNA分子。在諸多具體實施方案中，該siRNA可以是約21個核苷酸長。該siRNA可以任選地進一步包含一個或兩個單鏈懸突，例如在一端或兩端上的3′懸突。該siRNA可以由雜交在一起的兩個RNA分子形成，或替代地，可以由短發(fā)夾RNA(shRNA)生成(見下文)。在一些實施方案中，該siRNA的兩個鏈可以是完全互補的，使得兩個序列之間所形成的雙鏈體中不存在錯配或隆凸。在其他實施方案中，該siRNA的兩個鏈可以是基本上互補的，使得兩個序列之間所形成的雙鏈體中存在一個或多個錯配和/或隆凸。在某些實施方案中，該siRNA的5′端中的一個或兩個可以具有磷酸酯基，而在其他實施方案中，該5′端中的一個或兩個可以缺乏磷酸酯基。該siRNA中被稱為“反義鏈”或“引導(dǎo)鏈”的一個鏈包括能與靶轉(zhuǎn)錄物雜交的部分。在一些實施方案中，該siRNA的反義股可以與靶轉(zhuǎn)錄物的一個區(qū)域完全互補，即，其在整個siRNA長度上不存在單個錯配或隆凸的情況下與靶轉(zhuǎn)錄物雜交。在其他實施方案中，該反義股可以與靶區(qū)域基本上互補，即，由該反義股和該靶轉(zhuǎn)錄物形成的雙鏈體中可以存在一個或多個錯配和/或隆凸。典型地，使siRNA靶向靶轉(zhuǎn)錄物的外顯子序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)熟悉設(shè)計針對靶轉(zhuǎn)錄物的siRNA的程序、算法和/或商業(yè)服務(wù)。在其他實施方案中，RNAi劑可以是短發(fā)夾RNA(shRNA)。一般來說，shRNA是包含可雜交或能夠雜交以形成長度足以介導(dǎo)RNA干擾(如以上所描述)的雙鏈結(jié)構(gòu)的至少兩個互補部分和形成了連接形成該雙鏈體的shRNA區(qū)域的環(huán)的至少一個單鏈部分的RNA分子。該結(jié)構(gòu)還可以稱為莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，其中該莖是雙鏈體部分。在一些實施方案中，該結(jié)構(gòu)的雙鏈體部分可以是完全互補的，使得shRNA的雙鏈體區(qū)域中不存在錯配或隆凸。在其他實施方案中，該結(jié)構(gòu)的雙鏈體部分可以是基本上互補的，使得shRNA的雙鏈體部分中可以存在一個或多個錯配和/或隆凸。該結(jié)構(gòu)的環(huán)可以是約1至約20個核苷酸長，具體來說是約6至約9個核苷酸長。該環(huán)可以位于與靶轉(zhuǎn)錄物互補的區(qū)域(即，shRNA的反義部分)的5′或3′端。該shRNA可以進一步包含處于5′或3′端上的懸突。該可選懸突可以是約1至約20個核苷酸長，或更具體來說是約2至約15個核苷酸長。在一些實施方案中，該懸突可以包含一個或多個U殘基，例如介于約1個與約5個之間的U殘基。在一些實施方案中，該shRNA的5′端可以具有磷酸酯基。一般來說，通過保守細(xì)胞RNAi機制將shRNA處理成siRNA。因此，shRNA是siRNA的前驅(qū)物，并且類似地能夠抑制與shRNA的一部分(即，shRNA的反義部分)互補的靶轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)熟悉用于設(shè)計和合成shRNA的可用資源。一個示例性實例是shRNA(Sigma-Aldrich)。可以在活體內(nèi)由RNAi表達(dá)構(gòu)建體表達(dá)siRNA或shRNA。合適的構(gòu)建體包括質(zhì)粒載體、噬菌粒、粘粒、人工/微型染色體、轉(zhuǎn)座子和病毒載體(例如，慢病毒載體、腺相關(guān)病毒載體等)。在一個實施方案中，該RNAi表達(dá)構(gòu)建體可以是質(zhì)粒載體(例如，pUC、pBR322、pET、pBluescript及其變體)。該RNAi表達(dá)構(gòu)建體可以包含兩個啟動子控制序列，其中每一個可操作地連接適當(dāng)?shù)木幋a序列，使得兩個獨立的互補siRNA鏈可以被轉(zhuǎn)錄。該兩個啟動子控制序列可以呈相同的取向或相反的取向。在另一個實施方案中，該RNAi表達(dá)載體可以含有驅(qū)動包含兩個互補區(qū)域的單個RNA分子的轉(zhuǎn)錄，從而使得轉(zhuǎn)錄物形成shRNA的啟動子控制序列。一般來說，啟動子控制序列將是RNA聚合酶III(PolIII)啟動子，諸如U6或H1啟動子。在其他實施方案中，可以使用RNA聚合酶II(PolII)啟動子控制序列(以下給出了一些實例)。RNAi表達(dá)構(gòu)建體可以含有額外的序列元件，諸如轉(zhuǎn)錄終止序列、可選標(biāo)記序列等?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)程序?qū)NAi表達(dá)構(gòu)建體引入感興趣的細(xì)胞系中?？梢詫NAi表達(dá)構(gòu)建體染色體整合在該細(xì)胞系中以便穩(wěn)定表達(dá)?；蛘撸谠摷?xì)胞系中，RNAi表達(dá)構(gòu)建體可以在染色體外(例如，附加型)以便穩(wěn)定表達(dá)。在又其他實施方案中，該細(xì)胞系可以經(jīng)過工程改造以穩(wěn)定地表達(dá)涉及復(fù)制和/或感染性的病毒蛋白質(zhì)的顯性陰性形式。使蛋白質(zhì)的顯性陰性形式發(fā)生改變或突變，以使其勝過或抑制野生型蛋白質(zhì)。合適的蛋白質(zhì)的非限制性實例包括病毒非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，諸如NS1或NS2，和病毒殼體蛋白，諸如VP1或VP2。在諸多具體實施方案中，該細(xì)胞系可以經(jīng)過工程改造以表達(dá)一種或多種NS1蛋白的顯性陰性形式。相對于野生型蛋白質(zhì)，顯性陰性蛋白質(zhì)可以具有缺失、插入和/或取代(Lagna等，1998，Curr.TopicsDev.Biol，36：75-98)。缺失、插入和/或取代可以在蛋白質(zhì)的N末端、C末端或內(nèi)部位置。用于生成突變蛋白質(zhì)的手段(通過定點誘變、基于PCR的誘變、隨機誘變等)在本領(lǐng)域中是眾所周知的，如同用于鑒定具有顯性負(fù)面作用的那些的手段。可用包含編碼顯性陰性蛋白質(zhì)的序列的表達(dá)構(gòu)建體(見上文)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，其中該編碼序列可操作地連接于PolII啟動子控制序列以便表達(dá)。啟動子控制序列可以是組成性的、調(diào)節(jié)型的或組織特異性的。合適的組成性啟動子控制序列包括但不限于巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子(CMV)、猿猴病毒(SV40)啟動子、腺病毒主要晚期啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、伸長因子(ED1)-α啟動子、泛素啟動子、肌動蛋白啟動子、微管蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、其片段或上述任一者的組合。合適的調(diào)節(jié)型啟動子控制序列的實例包括但不限于通過熱激、金屬、類固醇、抗生素或醇加以調(diào)節(jié)的那些。組織特異性啟動子的非限制性實例包括B29啟動子、CD14啟動子、CD43啟動子、CD45啟動子、CD68啟動子、結(jié)蛋白啟動子、彈性蛋白酶1啟動子、內(nèi)皮糖蛋白啟動子、纖連蛋白啟動子、Flt-1啟動子、GFAP啟動子、GPIIb啟動子、ICAM-2啟動子、INF-β啟動子、Mb啟動子、NphsI啟動子、OG-2啟動子、SP-B啟動子、SYN1啟動子和WASP啟動子。該啟動子序列可以是野生型的，或其可以經(jīng)過修飾以實現(xiàn)更高效或有效的表達(dá)。該表達(dá)構(gòu)建體可以包含額外的表達(dá)控制序列(例如，增強子序列、Kozak序列、聚腺苷酸化序列、轉(zhuǎn)錄終止序列等)、可選標(biāo)記序列(例如，抗生素抗性基因)、復(fù)制起點等等。額外信息可見于“CurrentProtocolsinMolecularBiology″Ausubel等，JohnWiley&Sons，NewYork，2003；或″MolecularCloning：ALaboratoryManual″Sambrook&Russell，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY，第3版，2001。(iii)涉及抗病毒反應(yīng)的細(xì)胞蛋白質(zhì)的過度表現(xiàn)在諸多替代實施方案中，該哺乳動物細(xì)胞系可以經(jīng)過工程改造以過度表達(dá)涉及宿主細(xì)胞抗病毒反應(yīng)的細(xì)胞蛋白質(zhì)。涉及抗病毒反應(yīng)的蛋白質(zhì)的非限制性實例包括雙鏈RNA激活蛋白激酶R(PKR，其也被稱為真核翻譯起始因子2-α激酶2或Eif2ak2)、受體相互作用蛋白激酶2(RIPK2)、干擾素(例如，I型和II型)、白介素(例如，IL-1和IL-6)、腫瘤壞死因子α、干擾素調(diào)節(jié)因子1、STAT、p53、激活轉(zhuǎn)錄因子3、NF-κB、真核起始因子2(eIF2)、細(xì)胞凋亡蛋白抑制劑(IAP)和鋅指抗病毒蛋白(ZAP)。在諸多具體實施方案中，該細(xì)胞系可以經(jīng)過工程改造以過度表達(dá)PKR。過度表達(dá)可以通過引入編碼感興趣的蛋白質(zhì)的核酸序列的一個或多個外源拷貝來實現(xiàn)。編碼感興趣的細(xì)胞蛋白質(zhì)的序列一般被可操作地連接于PolII啟動子控制序列(見上文)。可以將該編碼序列的多個拷貝串聯(lián)連接并且置于單個啟動子控制序列的控制之下?？梢詫⒕幋a感興趣的蛋白質(zhì)的序列引入該細(xì)胞系中作為表達(dá)構(gòu)建體的一部分(見上文)。因此，可以將該表達(dá)構(gòu)建體插入染色體位置中，或替代地，該表達(dá)構(gòu)建體可以在染色體外(例如，附加型)，以便進行穩(wěn)定表達(dá)。過度表達(dá)還可以通過修飾編碼感興趣的蛋白質(zhì)的內(nèi)源性染色體序列的啟動子控制序列來實現(xiàn)。舉例來說，內(nèi)源啟動子控制序列可以通過插入至少一個外源“強”啟動子控制序列(即，對RNA聚合酶和/或相關(guān)因子具有高親和力)(其實例呈現(xiàn)在上文中)而加以修飾。或者，內(nèi)源啟動子控制序列的序列可以經(jīng)過修飾以模擬“強”啟動子控制序列。內(nèi)源染色體序列可以使用以下部分(III)中詳述的靶向核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因組修飾技術(shù)加以修飾。(b)細(xì)胞類型本文中所公開的抗病毒細(xì)胞系是哺乳動物細(xì)胞系。在一些實施方案中，對病毒感染具有抗性的細(xì)胞系可以來源于中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞；小鼠骨髓瘤NS0細(xì)胞；幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3細(xì)胞(NIH3T3)；鼠標(biāo)B細(xì)胞淋巴瘤A20細(xì)胞；小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞；小鼠成肌細(xì)胞C2C12細(xì)胞；小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞；小鼠胚胎間充質(zhì)C3H-10T1/2細(xì)胞；小鼠癌瘤CT26細(xì)胞、小鼠前列腺DuCuP細(xì)胞；小鼠乳房EMT6細(xì)胞；小鼠肝癌Hepalc1c7細(xì)胞；小鼠骨髓瘤J5582細(xì)胞；小鼠上皮MTD-1A細(xì)胞；小鼠心肌MyEnd細(xì)胞；小鼠腎RenCa細(xì)胞；小鼠胰腺RIN-5F細(xì)胞；小鼠黑色素瘤X64細(xì)胞；小鼠淋巴瘤YAC-1細(xì)胞；大鼠成膠質(zhì)細(xì)胞瘤9L細(xì)胞；大鼠B淋巴瘤RBL細(xì)胞；大鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤B35細(xì)胞；大鼠肝癌細(xì)胞(HTC)；水牛大鼠肝BRL3A細(xì)胞；犬腎細(xì)胞(MDCK)；犬乳腺(CMT)細(xì)胞；大鼠骨肉瘤D17細(xì)胞；大鼠單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞DH82細(xì)胞；猴腎SV-40轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞(COS7)細(xì)胞；猴腎CVI-76細(xì)胞；非洲綠猴腎(VERO-76)細(xì)胞；人胚腎細(xì)胞(HEK293、HEK293T)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA)；人肺細(xì)胞(W138)；人肝細(xì)胞(HepG2)；人U2-OS骨肉瘤細(xì)胞、人A549細(xì)胞、人A-431細(xì)胞或人K562細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞系的詳盡列表可見于美國典型培養(yǎng)物保藏中心目錄(ATCC，Manassas，VA)。在其他實施方案中，具有病毒抗性的細(xì)胞系是非人哺乳動物細(xì)胞系。在其他實施方案中，具有病毒抗性的細(xì)胞系是非人非小鼠哺乳動物細(xì)胞系。在某些實施方案中，具有病毒抗性的細(xì)胞系是CHO細(xì)胞系。眾多CHO細(xì)胞系可購自ATCC。合適的CHO細(xì)胞系包括但不限于CHO-K1細(xì)胞和其衍生物。在各種實施方案中，該細(xì)胞系可能缺乏谷氨酰胺合成酶(GS)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)或其組合。舉例來說，編碼GS、DHFR和/或HPRT的染色體序列可以是失活的。在諸多具體實施方案中，編碼GS的所有染色體序列在該細(xì)胞系中都是失活的。(c)病毒具有病毒抗性的經(jīng)工程改造的哺乳動物細(xì)胞系可以抵抗多種哺乳動物病毒。該病毒可以是DNA病毒或RNA病毒，且該病毒可以有包膜或無包膜(“裸”)。可以通過唾液酸受體結(jié)合并進入哺乳動物細(xì)胞的病毒的非限制性實例包括細(xì)小病毒、呼腸孤病毒、輪狀病毒、流感病毒、腺相關(guān)病毒、杯狀病毒、副流感病毒、風(fēng)疹病毒、冠狀病毒、諾羅病毒、腦心肌炎病毒和多瘤病毒。在一些實施方案中，經(jīng)工程改造的哺乳動物細(xì)胞系對由至少一種細(xì)小病毒所致的感染具有抗性。合適的細(xì)小病毒的非限制性實例包括小鼠的微小病毒(MVM)(其還被稱為小鼠微小病毒(MMV)或嚙齒類原細(xì)小病毒1)、1型小鼠細(xì)小病毒(MPV-1)、2型小鼠細(xì)小病毒(MPV-2)、3型小鼠細(xì)小病毒(MPV-3)、豬細(xì)小病毒1、牛細(xì)小病毒1和人細(xì)小病毒(例如，人細(xì)小病毒B19、人細(xì)小病毒4、人細(xì)小病毒5等)。在諸多具體實施方案中，該細(xì)小病毒可以是MVM。在其他實施方案中，該病毒可以是呼腸孤病毒，諸如哺乳動物呼腸孤病毒3、哺乳動物正呼腸孤病毒、禽正呼腸孤病毒等等)。在一些實施方案中，對病毒感染性具有抗性的經(jīng)工程改造的哺乳動物細(xì)胞系還可以對由柔膜細(xì)菌目中的生物體所致的感染具有抗性。具體來說，本文中所公開的細(xì)胞系可以對由支原體屬或螺原體屬所致的感染具有抗性。(d)編碼重組蛋白的可選核酸在一些實施方案中，對病毒感染具有抗性的哺乳動物細(xì)胞系可以進一步包含至少一種編碼重組蛋白的核酸。一般來說，重組蛋白是異源的，這意味著該蛋白質(zhì)對細(xì)胞來說不是天然的。該重組蛋白可以是但不限于選自以下的治療性蛋白質(zhì)：抗體、抗體片段、單克隆抗體、人源化抗體、人源化單克隆抗體、嵌合抗體、IgG分子、IgG重鏈、IgG輕鏈、IgA分子、IgD分子、IgE分子、IgM分子、疫苗、生長因子、細(xì)胞因子、干擾素、白介素、激素、凝血(或凝結(jié))因子、血液組分、酶、治療性蛋白質(zhì)、營養(yǎng)性蛋白質(zhì)、上述任一者的功能片段或功能變體、或包含上述蛋白質(zhì)和/或其功能片段或變體中的任一者的融合蛋白。在一些實施方案中，編碼重組蛋白的核酸可以被連接到編碼次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)、二氫葉酸還原酶(DHFR)和/或谷氨酰胺合酶(GS)的序列，使得HPRT、DHFR和/或GS可以被用作可擴增的可選標(biāo)記。編碼重組蛋白的核酸還可以連接到編碼至少一個抗生素抗性基因的序列和/或編碼諸如熒光蛋白之類的標(biāo)記蛋白的序列。在一些實施方案中，編碼重組蛋白的核酸可以是表達(dá)構(gòu)建體的一部分。如其他部分所詳述，表達(dá)構(gòu)建體或載體可以包含額外的表達(dá)控制序列(例如，增強子序列、Kozak序列、聚腺苷酸化序列、轉(zhuǎn)錄終止序列等)、可選標(biāo)記序列、復(fù)制起點等等。額外的信息可見于Ausubel等，2003，同上和Sambrook&Russell，2001，同上。在一些實施方案中，編碼重組蛋白的核酸可以位于染色體外。即，編碼重組蛋白的核酸可以由質(zhì)粒、粘粒、人工染色體、微型染色體或另一個染色體外構(gòu)建體瞬時表達(dá)。在其他實施方案中，編碼重組蛋白的核酸可以染色體整合到細(xì)胞的基因組中。該整合可以是隨機的或靶向的。因此，該重組蛋白可以被穩(wěn)定地表達(dá)。在這個實施方案的一些迭代中，編碼重組蛋白的核酸序列可以可操作地連接到適當(dāng)?shù)漠愒幢磉_(dá)控制序列(即，啟動子)。在其他迭代中，編碼重組蛋白的核酸序列可以被置于內(nèi)源表達(dá)控制序列的控制之下。編碼重組蛋白的核酸序列可以使用同源重組、靶向核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因組編輯、病毒載體、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒和其他眾所周知的手段而整合到細(xì)胞系的基因組中。額外的指導(dǎo)可見于Ausubel等，2003，同上和Sambrook&Russell，2001，同上。(e)組合物在某些實施方案中，經(jīng)工程改造而表現(xiàn)出病毒抗性的哺乳動物細(xì)胞系可以是組合物的一部分，該組合物還包含至少一種病毒。該組合物因此包含本文中所公開的經(jīng)工程改造的細(xì)胞系(任選地進一步包含編碼重組蛋白的核酸)和病毒，其中該至少一種病毒的進入和/或繁殖在該經(jīng)工程改造的哺乳動物細(xì)胞系中被減少或消除。因此，該組合物中的細(xì)胞能夠繁殖，但該組合物中的病毒不能夠繁殖，因為其進入和/或復(fù)制在該細(xì)胞內(nèi)被減少或消除。該組合物可以進一步包含至少一種細(xì)胞生長培養(yǎng)基以支持該經(jīng)工程改造的哺乳動物細(xì)胞系細(xì)胞的生長。在一些情況下，該細(xì)胞生長培養(yǎng)基是無動物組分的培養(yǎng)基。(f)示例性實施方案在諸多具體實施方案中，具有病毒抗性的哺乳動物細(xì)胞系是CHO細(xì)胞系。該抗病毒CHO細(xì)胞系可以對由小鼠的微小病毒(MVM)(其還被稱為小鼠微小病毒(MMV)或嚙齒類原細(xì)小病毒1)和/或哺乳動物呼腸孤病毒3所致的感染具有抗性。具體來說，相對于未經(jīng)修飾的親本CHO細(xì)胞系，經(jīng)基因修飾的CHO細(xì)胞系對MVM或呼腸孤病毒3感染的抗性已經(jīng)有所提高。在一些實施方案中，該未經(jīng)修飾的親本細(xì)胞系是CHO(GS-/-)細(xì)胞系。該抗病毒CHO細(xì)胞系包含至少一個編碼COSMC、Slc35A1、C1GalT1、St3Gal1、St3Gal2、St3Gal3、St3Gal4、St3Gal5和/或St3Gal6的失活染色體序列。在一些實施方案中，在CHO細(xì)胞系中，編碼COSMC、Slc35A1、C1GalT1、St3Gal1、St3Gal2、St3Gal3、St3Gal4、St3Gal5和/或St3Gal6的染色體序列的所有拷貝都是失活的或被敲除。在其他實施方案中，包含編碼COSMC、Slc35A1、C1GalT1、St3Gal1、St3Gal2、St3Gal3、St3Gal4、St3Gal5和/或St3Gal6的失活染色體序列的CHO細(xì)胞進一步包含編碼Mgat1、Mgat2、Mgat3、Mgat4和/或Mgat5的失活染色體序列。在其他實施方案中，包含編碼St3Gal1、St3Gal2、St3Gal3、St3Gal4、St3Gal5和/或St3Gal6的失活染色體序列的CHO細(xì)胞經(jīng)過進一步工程改造以過度表達(dá)St6Gal1、St6Gal2、St6GalNac1、St6GalNac2、St6GalNac3、ST6GalNac4、St6GalNac5和/或St6GalNac6。(II)用于減少或防止病毒污染的方法本公開的另一個方面涵蓋用于減少或防止重組蛋白產(chǎn)物的病毒污染或減小生物生產(chǎn)系統(tǒng)的病毒污染的風(fēng)險的方法。一般來說，該方法包括提供經(jīng)工程改造的哺乳動物細(xì)胞系，其中至少一種病毒的進入和/或繁殖被減少或消除，和使用所述細(xì)胞系來產(chǎn)生該重組蛋白。該經(jīng)工程改造的哺乳動物細(xì)胞系詳述于以上部分(I)中。與未經(jīng)修飾的親本細(xì)胞系相比，該經(jīng)工程改造的哺乳動物細(xì)胞系對病毒感染表現(xiàn)出抗性。該經(jīng)工程改造的哺乳動物細(xì)胞系對部分(I)(c)中所描述的病毒表現(xiàn)出了抗性。合適的重組蛋白描述于部分(I)(d)中。用于產(chǎn)生或制造重組蛋白的手段在本領(lǐng)域中是眾所周知的(參見例如“BiopharmaceuticalProductionTechnology”，Subramanian(編)，2012，Wiley-VCH；ISBN：978-3-527-33029-4)。在諸多具體實施方案中，該經(jīng)工程改造的哺乳動物細(xì)胞系經(jīng)過基因修飾而包含至少一個經(jīng)修飾的染色體序列，使得該細(xì)胞系對病毒感染具有抗性。一般來說，使用本文中所公開的經(jīng)工程改造的哺乳動物細(xì)胞系能降低病毒在發(fā)酵罐或其他生物生產(chǎn)容器中復(fù)制的能力，使得可復(fù)制病毒的水平處在痕量水平，或者，理想地，處在工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)最佳做法檢測不到的水平。合適的方法包括核酸檢測法(例如，用于檢測病毒核酸的南方印跡、用于檢測病毒核酸的PCR或RT-PCR、測序法等等)、基于抗體的技術(shù)(例如，使用抗病毒蛋白質(zhì)抗體的西方免疫印跡、ELISA法，諸如此類)和顯微鏡技術(shù)(例如，細(xì)胞病變效應(yīng)測定法、用于檢測病毒顆粒的電子顯微鏡檢查等)。(III)用于制備抗病毒細(xì)胞系的方法本公開的又另一個方面提供了制備如以上部分(I)(a)(i)中詳述的具有改變的細(xì)胞表面受體的抗病毒細(xì)胞的方法。編碼涉及糖鏈合成的酶或蛋白質(zhì)的染色體序列可以使用各種技術(shù)敲低或敲除，以便生成抗病毒細(xì)胞系。在一些實施方案中，該抗病毒細(xì)胞系可以通過靶向核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因組修飾方法來制備。在其他實施方案中，該抗病毒細(xì)胞系可以通過RNA干擾介導(dǎo)的機制來制備。在又其他實施方案中，該抗病毒細(xì)胞系可以通過位點特異性重組系統(tǒng)、隨機誘變或本領(lǐng)域中已知的其他方法來制備。(a)靶向核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因組編輯靶向核酸內(nèi)切酶可以用于修飾(即，使失活或改變)感興趣的特定染色體序列?？梢酝ㄟ^向細(xì)胞中引入靶向特定的染色體序列的靶向核酸內(nèi)切酶或編碼該靶向核酸內(nèi)切酶的核酸而使特定的染色體序列失活。在一個實施方案中，該靶向核酸內(nèi)切酶識別并結(jié)合特定的染色體序列，并且引入了可由非同源端連接(NHEJ)修復(fù)過程修復(fù)的雙鏈斷裂。因為NHEJ容易出錯，所以可能發(fā)生至少一個核苷酸的缺失、插入和/或取代，從而破壞染色體序列的閱讀框，從而不產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在另一個實施方案中，該靶向核酸內(nèi)切酶還可以被用于通過共引入與靶向染色體序列的一部分具有實質(zhì)性序列同一性的多核苷酸經(jīng)由同源重組反應(yīng)來改變?nèi)旧w序列。由該靶向核酸內(nèi)切酶引入的雙鏈斷裂被同源定向修復(fù)過程修復(fù)，從而以使得染色體序列被改變或修改的方式使該染色體序列與該多核苷酸進行交換。多種靶向核酸內(nèi)切酶可以用于修飾感興趣的染色體序列。該靶向核酸內(nèi)切酶可以是天然存在的蛋白質(zhì)或經(jīng)工程改造的蛋白質(zhì)。合適的靶向核酸內(nèi)切酶包括但不限于鋅指核酸酶(ZFN)、CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶、轉(zhuǎn)錄活化因子樣效應(yīng)因子(TALE)核酸酶(TALEN)、大范圍核酸酶、位點特異性核酸內(nèi)切酶和人工靶向DNA雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑。(i)鋅指核酸酶在諸多具體實施方案中，該靶向核酸內(nèi)切酶可以是鋅指核酸酶(ZFN)。ZFN結(jié)合特定靶向序列，并且將雙鏈斷裂引入該靶向序列中。典型地，ZFN包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即，鋅指)和裂解結(jié)構(gòu)域(即，核酸酶)，各自描述如下。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或鋅指可以經(jīng)過工程改造而識別并結(jié)合所選擇的任何核酸序列。參見例如Beerli等，(2002)Nat.Biotechnol.20：135-141；Pabo等，(2001)Ann.Rev.Biochem.70∶313-340；Isalan等，(2001)Nat.Biotechnol.19∶656-660；Segal等，(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo等，(2000)Curr.Opin.Stmct.Biol.10：411-416；Zhang等，(2000)J.Biol.Chem.275(43)：33850-33860；Doyon等，(2008)Nat.Biotechnol.26：702-708；和Santiago等，(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA105：5809-5814。與天然存在的鋅指蛋白相比，經(jīng)工程改造的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以具有新穎的結(jié)合特異性。工程改造方法包括但不限于合理的設(shè)計和各種類型的選擇。合理的設(shè)計包括例如使用包括二聯(lián)、三聯(lián)和/或四聯(lián)核苷酸序列和個別鋅指氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫，其中各二聯(lián)、三聯(lián)或四聯(lián)核苷酸序列與結(jié)合特定三聯(lián)或四聯(lián)序列的鋅指的一個或多個氨基酸序列締合。參見例如美國專利號6,453,242和6,534,261，其公開內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。作為一個實例，可以使用美國專利6,453,242中所描述的算法來設(shè)計鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以靶向預(yù)先選定的序列。還可以使用替代方法，諸如使用非簡并識別密碼表的合理設(shè)計來設(shè)計鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以靶向特定序列(Sera等，(2002)Biochemistry41：7074-7081)。用于鑒別DNA序列中的潛在靶位點以及設(shè)計鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的公開可用的基于網(wǎng)絡(luò)的工具在本領(lǐng)域中是公知的。舉例來說，用于識別DNA序列中的潛在靶位點的工具可見于http：//www.zincfingertools.org。用于設(shè)計鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的工具可見于http：//zifit.partners.org/ZiFiT。(還參見Mandell等，(2006)Nuc.AcidRes.34：W516-W523；Sander等，(2007)Nuc.AcidRes.35：W599-W605。)鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以經(jīng)過設(shè)計以識別并結(jié)合介于約3個核苷酸至約21個核苷酸長的DNA序列。在一個實施方案中，該鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以經(jīng)過設(shè)計以識別并結(jié)合介于約9個至約18個核苷酸長的DNA序列。一般來說，本文中所使用的鋅指核酸酶的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括至少三個鋅指識別區(qū)或鋅指，其中各鋅指結(jié)合3個核苷酸。在一個實施方案中，該鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括四個鋅指識別區(qū)。在另一個實施方案中，該鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括五個鋅指識別區(qū)。在又另一個實施方案中，該鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括六個鋅指識別區(qū)。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以經(jīng)過設(shè)計以結(jié)合任何合適的靶DNA序列。參見例如美國專利號6,607,882、6,534,261和6,453,242，其公開內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。選擇鋅指識別區(qū)的示例性方法包括噬菌體呈現(xiàn)和雙雜交系統(tǒng)，該方法描述于美國專利號5,789,538、5,925,523、6,007,988、6,013,453、6,410,248、6,140,466、6,200,759和6,242,568；以及WO98/37186、WO98/53057、WO00/27878、WO01/88197和GB2,338,237中，各專利以全文引用的方式并入本文中。另外，鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特異性的增強已經(jīng)描述于例如WO02/077227中，其全部公開內(nèi)容以引用的方式并入本文中。用于設(shè)計和構(gòu)建融合蛋白(和編碼其的多核苷酸)的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并且詳述于例如美國專利號7,888,121中，該專利以全文引用的方式并入本文中。鋅指識別區(qū)和/或多指鋅指蛋白可以使用合適的接頭序列，包括例如五個或更多個氨基酸長的接頭連接在一起。參見美國專利號6,479,626、6,903,185和7,153,949，該專利的公開內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中，從而得到六個或更多個氨基酸長的接頭序列的非限制性實例。本文中所描述的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以包括介于蛋白質(zhì)的個別鋅指之間的合適的接頭的組合。在一些實施方案中，該鋅指核酸酶還包括核定位信號或序列(NLS)。NLS是氨基酸序列，其促進該鋅指核酸酶蛋白靶向細(xì)胞核，從而在染色體中的靶序列處引入雙鏈斷裂。核定位信號在本領(lǐng)域中是已知的。參見例如Makkerh等，(1996)CurrentBiology6：1025-1027。裂解結(jié)構(gòu)域。鋅指核酸酶還包括裂解結(jié)構(gòu)域。該鋅指核酸酶的裂解結(jié)構(gòu)域部分可以獲自任何核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶?？梢詮闹械玫搅呀饨Y(jié)構(gòu)域的內(nèi)切核酸酶的非限制實例包括但不限于限制性核酸內(nèi)切酶和歸巢核酸內(nèi)切酶。參見例如NewEnglandBiolabsCatalog或Belfort等，(1997)NucleicAcidsRes.25：3379-3388。使DNA裂解的額外的酶是已知的(例如，S1核酸酶、綠豆核酸酶、胰DNA酶I、微球菌核酸酶、酵母HO核酸內(nèi)切酶)。也參見Linn等(編)Nucleases，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1993。這些酶(或其功能片段)中的一種或多種可以用作裂解結(jié)構(gòu)域的來源。裂解結(jié)構(gòu)域還可以來源于酶或其部分，如以上所描述，這需要裂解活性的二聚化。裂解可能需要兩個鋅指核酸酶，因為各核酸酶包含活性酶二聚體的單體?；蛘?，單個鋅指核酸酶可以包含兩種單體以形成活性酶二聚體。如本文中所使用，“活性酶二聚體”是能夠使核酸分子裂解的酶二聚體。該兩個裂解單體可以來源于同一核酸內(nèi)切酶(或其功能片段)，或各單體可以來源于不同的核酸內(nèi)切酶(或其功能片段)。當(dāng)使用兩個裂解單體來形成活性酶二聚體時，兩個鋅指核酸酶的識別位點優(yōu)選地經(jīng)過布置以使得該兩個鋅指核酸酶與其相應(yīng)的識別位點的結(jié)合將裂解單體相對于彼此置于允許裂解單體形成活性酶二聚體(例如，通過二聚化)的空間方向上。結(jié)果是，該識別位點的鄰近邊緣可以間隔約5個至約18個核苷酸。舉例來說，鄰近邊緣可以間隔約5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個或18個核苷酸。然而，應(yīng)理解，任何整數(shù)個核苷酸或核苷酸對可以介入兩個識別位點之間(例如，約2個至約50個核苷酸對或更多)。該鋅指核酸酶(諸如例如本文中詳細(xì)描述的那些)的識別位點的鄰近邊緣可以間隔6個核苷酸。一般來說，裂解位點位于識別位點之間。限制性核酸內(nèi)切酶(限制性酶)存在于許多物種中，并且能夠序列特異性結(jié)合DNA(在識別位點處)且使結(jié)合位點處或附近的DNA裂解。某些限制性酶(例如，IIS型)在與識別位點相距較遠(yuǎn)的位點處使DNA裂解，并且具有可分離的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和裂解結(jié)構(gòu)域。舉例來說，IIS型酶FokI在與其一個鏈上的識別位點相距9個核苷酸且與其在另一個鏈上的識別位點相距13個核苷酸處催化DNA的雙鏈裂解。參見例如美國專利號5,356,802、5,436,150和5,487,994；以及Li等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4275-4279；Li等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2764-2768；Kim等，(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：883-887；Kim等，(1994b)J.Biol.Chem.269：31978-31982。因此，鋅指核酸酶可以包含來自至少一種IIS型限制性酶的裂解結(jié)構(gòu)域和一個或多個鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其可能經(jīng)過或可能沒經(jīng)過工程改造。示例性IIS型限制性酶描述于例如國際公開WO07/014,275中，其公開內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。額外的限制性酶還含有可分離的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和裂解結(jié)構(gòu)域，并且這些也被本發(fā)明涵蓋。參見例如Roberts等，(2003)NucleicAcidsRes.31：418-420。裂解結(jié)構(gòu)域與結(jié)合結(jié)構(gòu)域可分離的示例性IIS型限制性酶是FokI。這種特別的酶是活性二聚體(Bitinaite等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：10，570-10，575)。因此，出于本公開的目的，鋅指核酸酶中所使用的FokI酶部分被視為裂解單體。因此，對于使用FokI裂解結(jié)構(gòu)域的靶向雙鏈裂解，兩個鋅指核酸酶(各自包含F(xiàn)okI裂解單體)可以用來重建活性酶二聚體?；蛘?，還可以使用含有鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和兩個FokI裂解單體的單個多肽分子。在某些實施方案中，該裂解結(jié)構(gòu)域包含一個或多個能減少或防止同源二聚化的經(jīng)工程改造的裂解單體。作為非限制性實例，在FokI的位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538上的氨基酸殘基是影響FokI裂解半結(jié)構(gòu)域的二聚化的所有靶標(biāo)。形成專性異源二聚體的示例性經(jīng)工程改造的FokI裂解單體包括一對，其中第一裂解單體包括在FokI的氨基酸殘基位置490和538上的突變，且第二裂解單體包括在氨基酸殘基位置486和499上的突變。因此，在經(jīng)工程改造的裂解單體的一個實施方案中，氨基酸位置490上的突變以Lys(K)置換Glu(E)；氨基酸殘基538上的突變以Lys(K)置換Iso(I)；氨基酸殘基486上的突變以Glu(E)置換Gln(Q)；且499位上的突變以Lys(K)置換Iso(I)。具體來說，該經(jīng)工程改造的裂解單體可以通過以下方式制得：在一個裂解單體中使490位從E突變至K且使538位從I突變至K，以產(chǎn)生經(jīng)工程改造的裂解單體，命名為“E490K：I538K”，并且在另一個裂解單體中使486位從Q突變至E且使499位從I突變至K，以產(chǎn)生經(jīng)工程改造的裂解單體，命名為“Q486E：I499K”。以上所描述的經(jīng)工程改造的裂解單體是專性異源二聚體突變體，其中異常裂解被減至最少或被消除?？梢允褂煤线m的方法來制備經(jīng)工程改造的裂解單體，例如通過如美國專利號7,888,121中所描述的野生型裂解單體(FokI)的定點誘變，該專利全文并入本文中。其他結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，該鋅指核酸酶還包含至少一個核定位序列(NLS)。NLS是氨基酸序列，其促進該鋅指核酸酶蛋白靶向細(xì)胞核，從而在染色體中的靶序列處引入雙鏈斷裂。核定位信號在本領(lǐng)域中是已知的(參見例如Lange等，J.Biol.Chem.，2007，282：5101-5105)。舉例來說，在一個實施方案中，該NLS可以是單份序列，諸如PKKKRKV(SEQIDNO：1)或PKKKRRV(SEQIDNO：2)。在另一個實施方案中，該NLS可以是二分序列。在又另一個實施方案中，該NLS可以是KRPAATKKAGQAKKKK(SEQIDNO：3)。該NLS可以位于蛋白質(zhì)的N末端、C末端或內(nèi)部位置。在另外的實施方案中，該鋅指核酸酶還可以包含至少一個細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，該細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域可以是來源于HIV-1TAT蛋白的細(xì)胞穿透肽序列。作為一個實例，該TAT細(xì)胞穿透序列可以是GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV(SEQIDNO：4)。在另一個實施方案中，該細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域可以是來源于人乙型肝炎病毒的細(xì)胞穿透肽序列TLM(PLSSIFSRIGDPPKKKRKV，SEQIDNO：5)。在另一個實施方案中，該細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域可以是MPG(GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV，SEQIDNO：6；或GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV，SEQIDNO：7)。在一個另外的實施方案中，該細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域可以是Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV，SEQIDNO：8)、VP22、來自單純皰疹病毒的細(xì)胞穿透肽、或聚精氨酸肽序列。該細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域可以位于鋅指核酸酶的N末端、C末端或內(nèi)部位置。在又其他實施方案中，該鋅指核酸酶還可以包含至少一個標(biāo)記結(jié)構(gòu)域。標(biāo)記結(jié)構(gòu)域的非限制性實例包括熒光蛋白、純化標(biāo)簽和表位標(biāo)簽。在一個實施方案中，該標(biāo)記結(jié)構(gòu)域可以是熒光蛋白。合適的熒光蛋白的非限制性實例包括綠色熒光蛋白(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、EGFP、Emerald、AzamiGreen、MonomericAzamiGreen、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黃色熒光蛋白(例如，YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、藍(lán)色熒光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青色熒光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、紅色熒光蛋白(mKate、mKate2、mPlum、DsRed單體、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)和橙色熒光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、MonomericKusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)或任何其他合適的熒光蛋白。在另一個實施方案中，該標(biāo)記結(jié)構(gòu)域可以是純化標(biāo)簽和/或表位標(biāo)簽。合適的標(biāo)簽包括但不限于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、甲殼素結(jié)合蛋白(CBP)、麥芽糖結(jié)合蛋白、硫氧還蛋白(TRX)、聚(NANP)、串聯(lián)親和純化(TAP)標(biāo)簽、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag1、Softag3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、生物素羧基載體蛋白(BCCP)和鈣調(diào)蛋白。該標(biāo)記結(jié)構(gòu)域可以位于鋅指核酸酶的N末端、C末端或內(nèi)部位置。該標(biāo)記結(jié)構(gòu)域可以通過2A肽連接到鋅指核酸酶(Szymczak等，2004，Nat.Biotechnol.，589(5)：589-94)。該2A肽最初是在正鏈RNA病毒中被表征，該病毒產(chǎn)生在翻譯成成熟個別蛋白質(zhì)期間被“裂解”的多蛋白。更具體來說，該2A肽區(qū)(～20個氨基酸)在其自身的C末端介導(dǎo)“裂解”，以使其自身從該多蛋白的下游區(qū)域釋放。一般來說，2A肽序列以甘氨酸和脯氨酸殘基封端。在2A肽的翻譯期間，核糖體在甘氨酸殘基之后暫停，從而釋放新生的多肽鏈。翻譯恢復(fù)，同時2A序列的脯氨酸殘基變成下游蛋白的第一個氨基酸。(ii)CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶在其他實施方案中，該靶向核酸內(nèi)切酶可以是CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶。CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶是來源于CRISPR/Cas系統(tǒng)的RNA引導(dǎo)型核酸內(nèi)切酶。細(xì)菌和古細(xì)菌已經(jīng)進化出使用CRISPR(成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列)和Cas(CRISPR相關(guān))蛋白來檢測和消滅入侵的病毒或質(zhì)粒的基于RNA的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶可以經(jīng)過編程，以便通過提供靶特異性合成引導(dǎo)RNA而引入靶向位點特異性雙鏈斷裂(Jinek等，2012，Science，337：816-821)。核酸內(nèi)切酶。該CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶可以來源于I型、II型或III型CRISPR/Cas系統(tǒng)。合適的CRISPR/Cas蛋白的非限制性實例包括Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966。在一個實施方案中，該CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶來源于II型CRISPR/Cas系統(tǒng)。在示例性實施方案中，該CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶來源于Cas9蛋白。該Cas9蛋白可以來自化膿性鏈球菌、嗜熱鏈球菌、鏈球菌屬、達(dá)松維爾類諾卡菌、始旋鏈霉菌、綠產(chǎn)色鏈霉菌、綠產(chǎn)色鏈霉菌、玫瑰鏈孢囊菌、玫瑰鏈孢囊菌、酸熱脂環(huán)酸桿菌、假真菌樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、西伯利亞微小桿菌、保加利亞乳桿菌、唾液乳桿菌、海洋微顫藍(lán)細(xì)菌、伯克霍爾德氏菌、萘降解極地單胞菌、極地單胞菌屬、瓦氏鱷球藻、藍(lán)桿藻屬、銅綠微囊藻、聚球藻屬、阿拉伯糖醋鹽桿菌、丹氏制氨菌、極端嗜熱纖維素降解厭氧菌、金礦菌、肉毒梭菌、難辨梭狀芽孢桿菌、大芬戈爾德菌、嗜熱鹽堿厭氧菌、喜溫丙酸互營菌、喜溫嗜酸硫桿菌、氧化亞鐵硫桿菌、紫色硫細(xì)菌、海桿菌屬、嗜鹽亞硝化球菌、瓦氏亞硝化球菌、游海假交替單胞菌、消旋纖線桿菌、極端嗜鹽甲烷鹽菌、多變魚腥藻、泡沫節(jié)球藻、念珠藻屬、極大節(jié)螺藻、節(jié)旋螺旋藻、節(jié)旋藻屬、鞘絲藻屬、原型微鞘藻、顫藻屬、運動石油神袍菌、非洲棲熱腔菌或海濱藍(lán)藻菌。在一個具體實施方案中，該Cas9蛋白來自化膿性鏈球菌。一般來說，CRISPR/Cas蛋白包含至少一個RNA識別結(jié)構(gòu)域和/或RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。RNA識別結(jié)構(gòu)域和/或RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與引導(dǎo)RNA相互作用，從而將CRISPR/Cas蛋白引向特定的染色體或染色體序列(即，靶位點)。該CRISPR/Cas蛋白還可以包含核酸酶結(jié)構(gòu)域(即，DNA酶或RNA酶結(jié)構(gòu)域)、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、解螺旋酶結(jié)構(gòu)域、蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域、二聚結(jié)構(gòu)域以及其他結(jié)構(gòu)域。該CRISPR/Cas蛋白可以來源于野生型CRISPR/Cas蛋白、經(jīng)修飾的CRISPR/Cas蛋白或者野生型或經(jīng)修飾的CRISPR/Cas蛋白的片段。該CRISPR/Cas蛋白可以經(jīng)修飾以增加核酸結(jié)合親和力和/或特異性，改變酶活性和/或改變該蛋白質(zhì)的另一種性質(zhì)。舉例來說，該CRISPR/Cas蛋白的核酸酶(即，DNA酶、RNA酶)結(jié)構(gòu)域可以被修飾、缺失或失活。該CRISPR/Cas蛋白可以被截短以去除對于該蛋白質(zhì)的功能來說并非必不可少的結(jié)構(gòu)域。該CRISPR/Cas蛋白還可以被截短或經(jīng)修飾以使該蛋白質(zhì)或與該CRISPR/Cas蛋白融合的效應(yīng)因子結(jié)構(gòu)域的活性最優(yōu)化。在一些實施方案中，該CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶可以來源于野生型Cas9蛋白或其片段。在其他實施方案中，該CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶可以來源于經(jīng)修飾的Cas9蛋白。舉例來說，Cas9蛋白的氨基酸序列可以經(jīng)修飾而改變該蛋白質(zhì)的一種或多種性質(zhì)(例如，核酸酶活性、親和力、穩(wěn)定性等)?；蛘?，不涉及RNA引導(dǎo)型裂解的Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)域可以被從該蛋白質(zhì)中消除，使得經(jīng)修飾的Cas9蛋白比野生型Cas9蛋白小。一般來說，Cas9蛋白包含至少兩個核酸酶(即，DNA酶)結(jié)構(gòu)域。舉例來說，Cas9蛋白可以包含RuvC樣核酸酶結(jié)構(gòu)域和HNH樣核酸酶結(jié)構(gòu)域。RuvC和HNH結(jié)構(gòu)域一起起作用以切開單鏈，從而在DNA中產(chǎn)生雙鏈斷裂(Jinek等，Science，337：816-821)。在一個實施方案中，該基于CRISPR的核酸內(nèi)切酶來源于Cas9蛋白且包含兩個功能核酸酶結(jié)構(gòu)域。由天然存在的CRISPR/Cas系統(tǒng)來識別典型地具有約14-15bp長度的靶位點(Cong等，Science，339：819-823)。該靶位點不具有序列限制，除了與引導(dǎo)RNA的5′端互補的序列(即，稱為原型間隔序列)緊隨(3′或下游)共有序列之后。這個共有序列也被稱為原型間隔序列相鄰基元(或PAM)。PAM的實例包括但不限于NGG、NGGNG和NNAGAAW(其中N被定義為任何核苷酸且W被定義為A或T)。在典型長度下，在靶基因組內(nèi)只有約5-7％的靶位點將是唯一的，這表明脫靶效應(yīng)可能是顯著的。靶位點的長度可以通過命令兩個結(jié)合事件而加以擴展。舉例來說，基于CRISPR的核酸內(nèi)切酶可以經(jīng)過修改，使得其只能裂解雙鏈序列的一個鏈(即，轉(zhuǎn)化至切口酶)。因此，與兩個不同的引導(dǎo)RNA組合使用基于CRISPR的切口酶將基本上使靶位點的長度翻倍，同時仍實現(xiàn)雙鏈斷裂。因此，在一些實施方案中，Cas9衍生核酸內(nèi)切酶可以經(jīng)修飾以含有一個功能核酸酶結(jié)構(gòu)域(RuvC樣或HNH樣核酸酶結(jié)構(gòu)域)。舉例來說，Cas9衍生蛋白可以經(jīng)修飾以使核酸酶結(jié)構(gòu)域之一缺失或突變，使其不再具有功能性(即，該結(jié)構(gòu)域缺乏核酸酶活性)。在一些實施方案中，核酸酶結(jié)構(gòu)域之一是無活性的，該Cas9衍生蛋白能夠向雙鏈核酸中引入缺口(這類蛋白質(zhì)被稱為“切口酶”)，但不能使雙鏈DNA裂解。舉例來說，RuvC樣結(jié)構(gòu)域中的天冬氨酸至丙氨酸(D10A)轉(zhuǎn)化將Cas9衍生蛋白轉(zhuǎn)化成“HNH”切口酶。同樣，HNH結(jié)構(gòu)域中的組氨酸至丙氨酸(H840A)轉(zhuǎn)化(在一些情況下，該組氨酸位于839位)將Cas9衍生蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成“RuvC”切口酶。因此，舉例來說，在一個實施方案中，該Cas9衍生切口酶在RuvC樣結(jié)構(gòu)域中具有天冬氨酸至丙氨酸(D10A)轉(zhuǎn)化。在另一個實施方案中，該Cas9衍生切口酶在HNH結(jié)構(gòu)域中具有組氨酸至丙氨酸(H840A或H839A)轉(zhuǎn)化。該Cas9衍生切口酶的RuvC樣或HNH樣核酸酶結(jié)構(gòu)域可以使用眾所周知的方法，諸如定點誘變、PCR介導(dǎo)的誘變和全基因合成以及本領(lǐng)域中已知的其他方法加以修飾。其他結(jié)構(gòu)域。該CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶或切口酶一般包括至少一個核定位信號(NLS)。舉例來說，在一個實施方案中，該NLS可以是單份序列，諸如PKKKRKV(SEQIDNO：1)或PKKKRRV(SEQIDNO：2)。在另一個實施方案中，該NLS可以是二分序列。在又另一個實施方案中，該NLS可以是KRPAATKKAGQAKKKK(SEQIDNO：3)。該NLS可以位于蛋白質(zhì)的N末端、C末端或內(nèi)部位置。在一些實施方案中，該CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶或切口酶可以進一步包括至少一個細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域。該細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域可以是來源于HIV-1TAT蛋白的細(xì)胞穿透肽序列。作為一個實例，該TAT細(xì)胞穿透序列可以是GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV(SEQIDNO：4)。在另一個實施方案中，該細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域可以是來源于人乙型肝炎病毒的細(xì)胞穿透肽序列TLM(PLSSIFSRIGDPPKKKRKV，SEQIDNO：5)。在另一個實施方案中，該細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域可以是MPG(GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV，SEQIDNO：6；或GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV，SEQIDNO：7)。在一個另外的實施方案中，該細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域可以是Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV，SEQIDNO：8)、VP22、來自單純皰疹病毒的細(xì)胞穿透肽、或聚精氨酸肽序列。該細(xì)胞穿透結(jié)構(gòu)域可以位于該蛋白質(zhì)的N末端、C末端或內(nèi)部位置。在又其他實施方案中，該CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶或切口酶可以進一步包括至少一個標(biāo)記結(jié)構(gòu)域。標(biāo)記結(jié)構(gòu)域的非限制性實例包括熒光蛋白、純化標(biāo)簽和表位標(biāo)簽。在一個實施方案中，該標(biāo)記結(jié)構(gòu)域可以是熒光蛋白。合適的熒光蛋白的非限制性實例包括綠色熒光蛋白(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、EGFP、Emerald、AzamiGreen、MonomericAzamiGreen、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黃色熒光蛋白(例如，YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、藍(lán)色熒光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青色熒光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、紅色熒光蛋白(mKate、mKate2、mPlum、DsRed單體、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)和橙色熒光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、MonomericKusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)或任何其他合適的熒光蛋白。在另一個實施方案中，該標(biāo)記結(jié)構(gòu)域可以是純化標(biāo)簽和/或表位標(biāo)簽。合適的標(biāo)簽包括但不限于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、甲殼素結(jié)合蛋白(CBP)、麥芽糖結(jié)合蛋白、硫氧還蛋白(TRX)、聚(NANP)、串聯(lián)親和純化(TAP)標(biāo)簽、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag1、Softag3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、生物素羧基載體蛋白(BCCP)和鈣調(diào)蛋白。該標(biāo)記結(jié)構(gòu)域可以位于該蛋白質(zhì)的N末端、C末端或內(nèi)部位置。該標(biāo)記結(jié)構(gòu)域可以通過2A肽連接到該CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶或切口酶(Szymczak等，2004，Nat.Biotechnol.，589(5)：589-94)。引導(dǎo)RNA。該CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶由引導(dǎo)RNA引導(dǎo)至靶位點。引導(dǎo)RNA在染色體中與該CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶和該靶位點相互作用，在該位點處，該CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶或切口酶使該雙鏈序列的至少一個鏈裂解?？梢詫⒃撘龑?dǎo)RNA與CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶或編碼該CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶的核酸一起引入細(xì)胞中。或者，可以將編碼CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶和引導(dǎo)RNA的DNA引入到細(xì)胞中。引導(dǎo)RNA包含三個區(qū)域：5′端上與靶位點上的序列互補的第一區(qū)域；形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的第二內(nèi)部區(qū)域；和基本上保持單鏈的第三3′區(qū)域。各引導(dǎo)RNA的第一區(qū)域是不同的，使得各引導(dǎo)RNA將CRISPR/Cas核酸內(nèi)切酶或切口酶引導(dǎo)至特定的靶位點。各引導(dǎo)RNA的第二區(qū)域和第三區(qū)域(也稱為支架區(qū)域)在所有的引導(dǎo)RNA中可以相同。引導(dǎo)RNA的第一區(qū)域與靶位點上的序列(即，原型間隔序列)互補，使得引導(dǎo)RNA的第一區(qū)域可以與靶位點上的序列進行堿基配對。一般來說，引導(dǎo)RNA的第一區(qū)域的序列與靶位點上的序列之間沒有錯配(即，完全互補)。在各種實施方案中，引導(dǎo)RNA的第一區(qū)域可以包含約10個核苷酸至超過約25個核苷酸。舉例來說，引導(dǎo)RNA的第一區(qū)域與染色體序列中的靶位點之間進行堿基配對的區(qū)域的長度可以是約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、23、24、25或超過25個核苷酸。在示例性實施方案中，引導(dǎo)RNA的第一區(qū)域的長度是約19或20個核苷酸。引導(dǎo)RNA還包含形成二級結(jié)構(gòu)的第二區(qū)域。在一些實施方案中，該二級結(jié)構(gòu)包括莖(或發(fā)夾)和環(huán)。該環(huán)和該莖的長度可以變化。舉例來說，該環(huán)的長度可以介于約3至約10個核苷酸的范圍內(nèi)，且該莖的長度可以介于約6至約20個堿基對的范圍內(nèi)。該莖可以包括一個或多個具有1至約10個核苷酸的隆凸。因此，該第二區(qū)域的整個長度可以介于約16至約60個核苷酸的長度范圍內(nèi)。在一個示例性實施方案中，該環(huán)的長度是約4個核苷酸，且該莖包括約12個堿基對。該引導(dǎo)RNA還包括處于3′端上的基本上保持單鏈的第三區(qū)域。因此，該第三區(qū)域與感興趣的細(xì)胞中的任何染色體序列都不具有互補性，而且與引導(dǎo)RNA的其余部分不具有互補性。該第三區(qū)域的長度可以變化。一般來說，該第三區(qū)域的長度超過約4個核苷酸。舉例來說，該第三區(qū)域的長度可以介于約5至約60個核苷酸的長度范圍內(nèi)。該引導(dǎo)RNA的第二和第三區(qū)域(或支架)的組合長度可以介于約30至約120個核苷酸的長度范圍內(nèi)。在一個方面，該引導(dǎo)RNA的第二和第三區(qū)域的組合長度在約70至約100個核苷酸的長度范圍內(nèi)。在一些實施方案中，該引導(dǎo)RNA包含一個包括所有三個區(qū)域的分子。在其他實施方案中，該引導(dǎo)RNA可以包括兩個獨立的分子。該第一RNA分子可以包含該引導(dǎo)RNA的第一區(qū)域和該引導(dǎo)RNA的第二區(qū)域的“莖”的一半。該第二RNA分子可以包括該引導(dǎo)RNA的第二區(qū)域的“莖”的另一半和該引導(dǎo)RNA的第三區(qū)域。因此，在這個實施方案中，該第一RNA分子和該第二RNA分子各自含有彼此互補的核苷酸序列。舉例來說，在一個實施方案中，該第一RNA分子和該第二RNA各自包含與另一序列進行堿基配對以形成功能性引導(dǎo)RNA的序列(約6至約20個核苷酸)。(iii)其他靶向核酸內(nèi)切酶在其他實施方案中，該靶向核酸內(nèi)切酶可以是大范圍核酸酶。大范圍核酸酶是以長識別序列為特征的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶，即，該識別序列一般介于約12個堿基對至約40個堿基對的范圍內(nèi)。作為這種要求的結(jié)果，該識別序列一般僅在任何給定的基因組中出現(xiàn)一次。在大范圍核酸酶中，被命名為LAGLIDADG的歸巢核酸內(nèi)切酶家族已經(jīng)成為用于基因組和基因組工程改造研究的有價值的工具(參見例如Amould等，2011，ProteinEngDesSel，24(1-2)：27-31)。大范圍核酸酶可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)來修飾其識別序列而靶向特定的染色體序列。在另外的實施方案中，靶向核酸內(nèi)切酶可以是轉(zhuǎn)錄活化因子樣效應(yīng)因子(TALE)核酸酶。TALE是可以容易進行工程改造以結(jié)合新的DNA靶標(biāo)的來自植物病原體黃單胞菌的轉(zhuǎn)錄因子。TALE或其截短版本可連接到核酸內(nèi)切酶的催化結(jié)構(gòu)域，諸如FokI，以建立被稱為TALE核酸酶或TALEN的靶向核酸內(nèi)切酶(Sanjana等，2012，NatProtoc，7(1)：171-192)。在又其他實施方案中，該靶向核酸內(nèi)切酶可以是位點特異性核酸內(nèi)切酶。具體來說，該位點特異性核酸內(nèi)切酶可以是“稀有切割”核酸內(nèi)切酶，其識別序列很少出現(xiàn)在基因組中?；蛘撸撐稽c特異性核酸內(nèi)切酶可以經(jīng)工程改造以使感興趣的位點裂解(Friedhoff等，2007，MethodsMolBiol352：1110123)。一般來說，該位點特異性核酸內(nèi)切酶的識別序列只在基因組中出現(xiàn)一次。在替代其他實施方案中，該靶向核酸內(nèi)切酶可以是人工靶向DNA雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑。(iv)可選多核苷酸靶向基因組修飾方法可以進一步包括向細(xì)胞中引入至少一種多核苷酸，該多核苷酸包含與靶向裂解位點的至少一側(cè)上的序列具有實質(zhì)性序列同一性的序列，使得由該靶向核酸內(nèi)切酶引入的雙股斷裂可以通過同源性定向修復(fù)方法加以修復(fù)；和使該多核苷酸的序列與內(nèi)源染色體序列進行交換，從而修飾該內(nèi)源染色體序列。舉例來說，該多核苷酸包含與該靶向裂解位點的一側(cè)上的序列具有實質(zhì)性序列同一性的第一序列和與該靶向裂解位點的另一側(cè)上的序列具有實質(zhì)性序列一致性的第二序列?；蛘?，該多核苷酸包含與該靶向裂解位點的一側(cè)上的序列具有實質(zhì)性序列同一性的第一序列和與位于遠(yuǎn)離該靶向裂解位點處的序列具有實質(zhì)性序列一致性的第二序列。該位于遠(yuǎn)離該靶向裂解位點處的序列可以是該靶向裂解位點上游或下游的數(shù)十、數(shù)百或數(shù)千個核苷酸。該多核苷酸中與該靶向染色體序列中的序列具有實質(zhì)性序列同一性的第一序列和第二序列的長度可以并且將會變化。一般來說，該多核苷酸中的第一序列和第二序列各自的長度是至少約10個核苷酸。在各種實施方案中，與染色體序列具有實質(zhì)性序列同一性的多核苷酸序列的長度可以是約15個核苷酸、約20個核苷酸、約25個核苷酸、約30個核苷酸、約40個核苷酸、約50個核苷酸、約100個核苷酸或超過100個核苷酸。短語“實質(zhì)性序列同一性”意指多核苷酸中的序列與感興趣的染色體序列具有至少約75％的序列同一性。在一些實施方案中，該聚核苷酸中的序列與感興趣的染色體序列具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。該多核苷酸的長度可以并且將會變化。舉例來說，該多核苷酸可以介于約20個核苷酸的長度直至約200,000個核苷酸的長度的范圍內(nèi)。在各種實施方案中，該多核苷酸介于約20個核苷酸至約100個核苷酸的長度、約100個核苷酸約1000個核苷酸的長度、約1000個核苷酸至約10,000個核苷酸的長度、約10,000個核苷酸至約100,000個核苷酸的長度或約100,000個核苷酸至約200,000個核苷酸的長度的范圍內(nèi)。典型地，該多核苷酸是DNA。該DNA可以是單鏈或雙鏈的。該多核苷酸可以是DNA質(zhì)粒、細(xì)菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)、病毒載體、線性DNA片、PCR片段、裸核酸、或核酸與諸如脂質(zhì)體或泊洛沙姆之類的遞送媒劑的復(fù)合物。在某些實施方案中，該多核苷酸是單鏈的。在諸多示例性實施方案中，該多核苷酸是包含少于約200個核苷酸的單鏈寡核苷酸。在一些實施方案中，該多核苷酸進一步包括標(biāo)記。這種標(biāo)記可以使得能夠篩選靶向整合。在一些實施方案中，該標(biāo)記是限制性核酸內(nèi)切酶位點。在其他實施方案中，該標(biāo)記物是熒光蛋白、純化標(biāo)簽或表位標(biāo)簽。合適的熒光蛋白的非限制性實例包括綠色熒光蛋白(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、EGFP、Emerald、AzamiGreen、MonomericAzamiGreen、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黃色熒光蛋白(例如，YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、藍(lán)色熒光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青色熒光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、紅色熒光蛋白(mKate、mKate2、mPlum、DsRed單體、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)和橙色熒光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、MonomericKusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)或任何其他合適的熒光蛋白。在其他實施方案中，該標(biāo)記可以是純化標(biāo)簽和/或表位標(biāo)簽。示例性標(biāo)簽包括但不限于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、甲殼素結(jié)合蛋白(CBP)、麥芽糖結(jié)合蛋白、硫氧還蛋白(TRX)、聚(NANP)、串聯(lián)親和純化(TAP)標(biāo)簽、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag1、Softag3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、生物素羧基載體蛋白(BCCP)和鈣調(diào)蛋白。(v)遞送至細(xì)胞該方法包括該靶向核酸內(nèi)切酶將引入感興趣的細(xì)胞中。可以將該靶向核酸內(nèi)切酶作為已純化的分離蛋白質(zhì)或編碼該靶向核酸內(nèi)切酶的核酸引入細(xì)胞中。該核酸可以是DNA或RNA。在編碼核酸是mRNA的實施方案中，該mRNA可以是5′封端的和/或3′聚腺苷酸化的。在編碼核酸是DNA的實施方案中，該DNA可以是線性或環(huán)狀的。該DNA可以是載體的一部分，其中該編碼DNA可以可操作地連接到合適的啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)熟悉適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、其他控制元件和將該載體引入感興趣的細(xì)胞中的手段。該靶向核酸內(nèi)切酶分子和上述可選多核苷酸可以通過多種手段引入到細(xì)胞中。合適的遞送手段包括顯微注射、電穿孔、超聲波穿孔、基因槍法、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽離子轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、樹枝狀聚合物轉(zhuǎn)染、熱激轉(zhuǎn)染、核轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染、磁轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、刺穿轉(zhuǎn)染、光學(xué)轉(zhuǎn)染、專有劑增強核酸吸收，和經(jīng)由脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、病毒體或人工病毒體進行遞送。在一個具體實施方案中，通過核轉(zhuǎn)染將該靶向核酸內(nèi)切酶分子和多核苷酸引入細(xì)胞中。在將多于一個靶向核酸內(nèi)切酶分子和多于一個多核苷酸引入細(xì)胞中的實施方案中，可以同時或依次引入該分子。舉例來說，可以在同時引入諸多靶向核酸內(nèi)切酶分子，各分子對靶向裂解位點(和可選多核苷酸)具有特異性?；蛘?，可以依次引入各靶向核酸內(nèi)切酶分子以及可選多核苷酸。該靶向核酸內(nèi)切酶分子與可選多核苷酸的比率可以并且將會變化。一般來說，靶向核酸內(nèi)切酶分子與多核苷酸的比率介于約1∶10至約10∶1的范圍內(nèi)。在各種實施方案中，該靶向核酸內(nèi)切酶分子與多核苷酸的比率可以是約1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1。在一個實施方案中，該比率是約1∶1。(vi)培養(yǎng)細(xì)胞該方法還包括將細(xì)胞維持在適當(dāng)?shù)臈l件下，使得通過靶向核酸內(nèi)切酶引入的雙鏈斷裂可以通過以下方式得以修復(fù)：(i)非同源末端連接修復(fù)方法，使得染色體序列通過至少一個核苷酸的缺失、插入和/或取代而被修飾，或者，任選地，(ii)同源定向修復(fù)方法，使得染色體序列與多核苷酸的序列交換，從而對染色體序列進行修飾。在將編碼靶向核酸內(nèi)切酶的核酸引入細(xì)胞中的實施方案中，該方法包括將該細(xì)胞維持在適當(dāng)?shù)臈l件下，使得該細(xì)胞表達(dá)該靶向核酸內(nèi)切酶。一般來說，將該細(xì)胞維持在適于細(xì)胞生長和/或維持的條件下。合適的細(xì)胞培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域中是眾所周知的并且描述于例如以下文獻中：Santiago等，(2008)PNAS105：5809-5814；Moehle等，(2007)PNAS104：3055-3060；Umov等，(2005)Nature435：646-651；和Lombardo等，(2007)Nat.Biotechnology25：1298-1306。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，用于培養(yǎng)細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是已知的，而且可以并且將會取決于細(xì)胞類型而變化。在所有情況下，可以使用常規(guī)優(yōu)化來確定用于特定細(xì)胞類型的最佳技術(shù)。在該方法的這個步驟期間，該靶向核酸內(nèi)切酶在染色體序列中的靶向裂解位點上識別、結(jié)合并創(chuàng)建雙鏈斷裂，而在雙鏈斷裂修復(fù)期間，至少一個核苷酸的缺失、插入和/或取代被引入該靶向染色體序列中。在諸多具體實施方案中，該靶向染色體序列是失活的。在證實已經(jīng)修飾了感興趣的染色體序列后，可以分離單個細(xì)胞克隆并且進行基因分型(通過DNA測序和/或蛋白質(zhì)分析)。包含一個經(jīng)修飾的染色體序列的細(xì)胞可以進行一輪或多輪額外的靶向基因組修飾以修飾其他染色體序列(例如，參見實施例1)。(b)RNA干擾在另一個實施方案中，可以使用能抑制靶mRNA或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)的RNA干擾(RNAi)劑來制備該抗病毒細(xì)胞系。該RNAi劑可能引起靶mRNA或轉(zhuǎn)錄物的裂解。或者，該RNAi劑可以防止或破壞靶mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，RNAi劑可以是短干擾RNA(siRNA)。一般來說，siRNA包含長度介于約15至約29個核苷酸范圍內(nèi)的雙鏈RNA分子。該siRNA的長度可以是約16-18、17-19、21-23、24-27或27-29個核苷酸。在一個具體實施方案中，該siRNA的長度是約21個核苷酸。該siRNA可以任選地進一步包含一個或兩個單鏈懸突，例如在一端或兩端上的3′懸突。該siRNA可以由雜交在一起的兩個RNA分子形成，或替代地，可以由短發(fā)夾RNA(shRNA)生成(見下文)。在一些實施方案中，該siRNA的兩個鏈?zhǔn)峭耆パa的，使得兩個序列之間所形成的雙鏈體中不存在錯配或隆凸。在其他實施方案中，該siRNA的兩個鏈?zhǔn)腔旧匣パa的，使得兩個序列之間所形成的雙鏈體中存在一個或多個錯配和/或隆凸。在某些實施方案中，該siRNA的5′端中的一個或兩個具有磷酸酯基，而在其他實施方案中，該5′端中的一個或兩個缺乏磷酸酯基。在其他實施方案中，該siRNA的3′端中的一個或兩個具有羥基，而在其他實施方案中，該5′端中的一個或兩個缺乏羥基。該siRNA中被稱為“反義鏈”或“引導(dǎo)鏈”的一個鏈包括能與靶轉(zhuǎn)錄物雜交的部分。在某些實施方案中，該siRNA的反義鏈與靶轉(zhuǎn)錄物的一個區(qū)域完全互補，即，其在介于約15至約29個核苷酸之間長、優(yōu)選地至少16個核苷酸長且更優(yōu)選地約18-20個核苷酸長的靶區(qū)域上不具有單個錯配或隆凸的情況下與靶轉(zhuǎn)錄物雜交。在其他實施方案中，該反義股與靶區(qū)域基本上互補，即，由該反義股和該靶轉(zhuǎn)錄物形成的雙鏈體中可能存在一個或多個錯配和/或隆凸。典型地，使siRNA靶向靶轉(zhuǎn)錄物的外顯子序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)熟悉設(shè)計針對靶轉(zhuǎn)錄物的siRNA的程序、算法和/或商業(yè)服務(wù)。一個示例性實例是RosettasiRNADesignAlgorithm(RosettaInpharmatics，NorthSeattle，WA)和siRNA(Sigma-A1drich，St.Louis，MO)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法在活體外酶促合成該siRNA?；蛘撸梢允褂帽绢I(lǐng)域中眾所周知的寡核苷酸合成技術(shù)化學(xué)合成該siRNA。在其他實施方案中，RNAi劑可以是短發(fā)夾RNA(shRNA)。一般來說，shRNA是包含可雜交或能夠雜交以形成長度足以介導(dǎo)RNA干擾(如以上所描述)的雙鏈結(jié)構(gòu)的至少兩個互補部分和形成了連接形成該雙鏈體的shRNA區(qū)域的環(huán)的至少一個單鏈部分的RNA分子。該結(jié)構(gòu)還被稱為莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，其中該莖是雙鏈體部分。在一些實施方案中，該結(jié)構(gòu)的雙鏈體部分是完全互補的，使得shRNA的雙鏈體區(qū)域中不存在錯配或隆凸。在其他實施方案中，該結(jié)構(gòu)的雙鏈體部分是基本上互補的，使得shRNA的雙鏈體部分中存在一個或多個錯配和/或隆凸。該結(jié)構(gòu)的環(huán)可以是約1至約20個核苷酸長，優(yōu)選地約4至約10個左右核苷酸長，且更優(yōu)選地約6至約9個核苷酸長。該環(huán)可以位于與靶轉(zhuǎn)錄物互補的區(qū)域(即，shRNA的反義部分)的5′或3′端。該shRNA可以進一步包含處于5′或3′端上的懸突。該可選懸突可以是約1至約20個核苷酸長，且更優(yōu)選地約2至約15個核苷酸長。在一些實施方案中，該懸突包含一個或多個U殘基，例如介于約1個與約5個之間的U殘基。在一些實施方案中，該shRNA的5′端具有磷酸酯基，而在其他實施方案中則不然。在其他實施方案中，該shRNA的3′端具有羥基，而在其他實施方案中則不然。一般來說，通過保守細(xì)胞RNAi機制將shRNA處理成siRNA。因此，shRNA是siRNA的前驅(qū)物，并且類似地能夠抑制與shRNA的一部分(即，shRNA的反義部分)互補的靶轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)熟悉用于設(shè)計和合成shRNA的可用資源(如以上所詳述)。在又其他實施方案中，該RNAi劑可以是RNAi表達(dá)載體。典型地，RNAi表達(dá)載體被用于細(xì)胞內(nèi)(活體內(nèi))合成RNAi劑，諸如siRNA或shRNA。在一個實施方案中，使用含有兩個啟動子的單個載體來轉(zhuǎn)錄兩個獨立的互補siRNA鏈，各啟動子指導(dǎo)單個siRNA鏈的轉(zhuǎn)錄(即，各啟動子被可操作地連接到該siRNA的模板，使得可以發(fā)生轉(zhuǎn)錄)。該兩個啟動子可以呈相同取向，在這種情況下，各啟動子可操作地連接到互補siRNA鏈之一的模板。或者，該兩個啟動子可以呈相反的取向，從而側(cè)接單個模板，以便啟動子的轉(zhuǎn)錄可合成兩個互補siRNA鏈。在另一個實施方案中，該RNAi表達(dá)載體可以含有驅(qū)動包含兩個互補區(qū)域的單個RNA分子的轉(zhuǎn)錄，從而使得轉(zhuǎn)錄物形成shRNA的啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，優(yōu)選在活體內(nèi)通過多于一個轉(zhuǎn)錄單元的轉(zhuǎn)錄來產(chǎn)生siRNA和shRNA劑。一般來講，用于指導(dǎo)一個或多個siRNA或shRNA轉(zhuǎn)錄單元的活體內(nèi)表達(dá)的啟動子可能是針對RNA聚合酶III(PolIII)的啟動子。某些PolIII啟動子，諸如U6或H1啟動子，并不需要所轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)的順式作用調(diào)節(jié)元件，且因此，在某些實施方案中是優(yōu)選的。在其他實施方案中，針對PolII的啟動子可以用于驅(qū)動一個或多個siRNA或shRNA轉(zhuǎn)錄單元的表達(dá)。在一些實施方案中，可以使用組織特異性、細(xì)胞特異性或可誘導(dǎo)性PolII啟動子。可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA方法來產(chǎn)生為合成siRNA或shRNA提供模板的構(gòu)建體，并且插入到多種適于在真核細(xì)胞中表達(dá)的不同載體中的任一種中。重組DNA技術(shù)描述于以下文獻中：Ausubel等，2003，同上和Sambrook&Russell，2001，同上。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)了解，載體可以包含額外的調(diào)節(jié)序列(例如，終止序列、翻譯控制序列等)，以及可選標(biāo)記序列。DNA質(zhì)粒在本領(lǐng)域中是已知的，包括基于pBR322、PUC等等的那些。由于許多表達(dá)載體已經(jīng)含有合適的啟動子，所以可能只需要將編碼感興趣的RNAi劑的核酸序列插入在相對于該啟動子而言適當(dāng)?shù)奈恢蒙?。病毒載體還可以用于提供RNAi劑的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。合適的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、皰疹病毒載體等等。在一個具體實施方案中，該RNAi表達(dá)載體是shRNA慢病毒基載體或慢病毒顆粒，諸如TRCshRNA產(chǎn)品(Sigma-Aldrich)中所提供的那個?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法將該RNAi劑或RNAi表達(dá)載體引入該細(xì)胞中。這類技術(shù)描述于例如以下文獻中：Ausubel等，2003，同上；或Sambrook&Russell，2001，同上。在某些實施方案中，將該RNAi表達(dá)載體(例如病毒載體)穩(wěn)定地整合到該細(xì)胞的基因組中，以便在隨后的細(xì)胞世代中破壞Mgat1表達(dá)。(c)位點特異性重組在替代實施方案中，可以使用位點特異性重組技術(shù)來制備該病毒抗性細(xì)胞系。舉例來說，可以使用位點特異性重組技術(shù)來缺失所有或部分感興趣的染色體序列，或向感興趣的染色體序列中引入單核苷酸多態(tài)性(SNP)。在一個實施方案中，使用Cre-loxP位點特異性重組系統(tǒng)、Flp-FRT位點特異性重組系統(tǒng)或其變化形式來靶向感興趣的染色體序列。這類重組系統(tǒng)可購自市面，并且這些技術(shù)的額外教授內(nèi)容見于例如Ausubel等，2003，同上。定義除非另外定義，否則本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的含義。以下參考文獻給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語的一般定義：Singleton等，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology(第2版，1994)；TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnology(Walker編，1988)；TheGlossaryofGenetics，第5版，R.Rieger等(編)，SpringerVerlag(1991)；和Hale&Marham，TheHarperCollinsDictionaryofBiology(1991)。如本文中所使用，除非另外規(guī)定，否則以下術(shù)語具有賦予它們的含義。當(dāng)介紹本發(fā)明的要素或其優(yōu)選實施方案時，冠詞“一個”、“一種”、“該”和“所述”意圖指存在一個或多個要素。術(shù)語“包含”、“包括”和“具有”意圖是包括性的，并且意指可能存在除了所列出的要素以外的額外要素。如本文中所使用，“缺乏”是指靶向酶或蛋白質(zhì)的水平有所降低或不可檢測，或者靶向酶或蛋白質(zhì)的活性有所降低或不可檢測。如本文中所使用，術(shù)語“內(nèi)源序列”是指對細(xì)胞來說是天然的染色體序列。術(shù)語“外源序列”是指對細(xì)胞來說不是天然的染色體序列，或被移動到不同的染色體位置的染色體序列。“經(jīng)基因修飾的”細(xì)胞是指基因組已經(jīng)被修飾的細(xì)胞，即，該細(xì)胞至少含有已經(jīng)過工程改造而含有至少一個核苷酸的插入、至少一個核苷酸的缺失和/或至少一個核苷酸的取代的染色體序列。術(shù)語“基因組修飾”和“基因組編輯”是指藉以改變特定染色體序列，使得該染色體序列被修飾的方法。該染色體序列可以經(jīng)過修飾以包含至少一個核苷酸的插入、至少一個核苷酸的缺失和/或至少一個核苷酸的取代。經(jīng)修飾的染色體序列是失活的，從而不產(chǎn)生產(chǎn)物。或者，該染色體序列可以經(jīng)過修飾，從而產(chǎn)生經(jīng)改變的產(chǎn)物。如本文中所使用的“基因”是指編碼基因產(chǎn)物的DNA區(qū)(包括外顯子和內(nèi)含子)，以及調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的產(chǎn)生的所有DNA區(qū)域，無論這類調(diào)節(jié)序列是否與編碼序列和/或所轉(zhuǎn)錄的序列相鄰。因此，基因包括但未必限于啟動子序列、終止子、翻譯調(diào)節(jié)序列(諸如核糖體結(jié)合位點和內(nèi)部核糖體進入位點)、增強子、沉默子、隔離子、邊界元件、復(fù)制起點、基質(zhì)附著位點和基因座控制區(qū)。術(shù)語“異源”是指對于感興趣的細(xì)胞或物種來說不是天然的實體。術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”是指呈線性或環(huán)狀構(gòu)象的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。出于本公開的目的，這些術(shù)語不應(yīng)被視為對于聚合物的長度具有限制性。該術(shù)語可以涵蓋天然核苷酸的已知類似物，以及在堿基、糖和/或磷酸部分中經(jīng)修飾的核苷酸。一般來說，特定核苷酸的類似物具有相同的堿基配對特異性；即，A的類似物將與T堿基配對。核酸或多核苷酸的核苷酸可以通過磷酸二酯、硫代磷酸酯、亞磷酰胺、二氨基磷酸酯鍵或其組合來連接。.術(shù)語“核苷酸”是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。該核苷酸可以是標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(即，腺苷、鳥苷、胞苷、胸苷和尿苷)或核苷酸類似物。核苷酸類似物是指具有經(jīng)修飾的嘌呤或嘧啶堿基或者經(jīng)修飾的核糖部分的核苷酸。核苷酸類似物可以是天然存在的核苷酸(例如，肌苷)或非天然存在的核苷酸。核苷酸的糖或堿基部分的修飾的非限制性實例包括乙?；?、氨基、羧基、羧甲基、羥基、甲基、磷?；蛶€基的添加(或去除)，以及用其他原子對堿基的碳原子和氮原子的取代(例如，7-脫氮嘌呤)。核苷酸類似物還包括二脫氧核苷酸、2′-O-甲基核苷酸、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和嗎啉基。術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”可以互換使用來指氨基酸殘基的聚合物。如本文中所使用，術(shù)語“靶位點”或“靶序列”是指定義欲修飾或編輯的且對靶向核酸內(nèi)切酶進行工程改造以識別并結(jié)合其(條件是存在足以結(jié)合的條件)的染色體序列的一部分的核酸序列。術(shù)語“上游”和“下游”是指核酸序列中相對于固定位置的位置。上游是指相對于該位置是5′(即，靠近該鏈的5′端)的區(qū)域，而下游是指相對于該位置是3′(即，靠近該鏈的3′端)的區(qū)域。如本文中所使用，“病毒抗性”是指細(xì)胞抵抗病毒感染的能力。更具體來說，與未經(jīng)修飾的親本細(xì)胞系相比，在本文中所公開的經(jīng)工程改造的細(xì)胞系中，病毒進入和/或病毒繁殖有所減少或被消除。用于確定核酸和氨基酸序列同一性的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。典型地，這類技術(shù)包括確定基因的mRNA的核苷酸序列和/或確定由其編碼的氨基酸序列，并且將這些序列與第二核苷酸或氨基酸序列相比較。還可以用這種方式確定并且比較基因組序列。一般來說，同一性是指兩個多核苷酸或多肽序列分別的確切核苷酸與核苷酸或氨基酸與氨基酸對應(yīng)性。兩個或更多個序列(多核苷酸或氨基酸)可以通過確定其同一性百分比來進行比較。兩個序列(不論是核酸序列還是氨基酸序列)的同一性百分比是兩個對齊的序列之間的確切匹配數(shù)除以較短序列的長度并乘以100。Smith和Waterman，AdvancesinAppliedMathematics2：482-489(1981)的局部同源性算法提供了核酸序列的近似比對法。這種算法可以通過使用評分矩陣而應(yīng)用于氨基酸序列，該評分矩陣是由Dayhoff，AtlasofProteinSequencesandStructure，M.O.Dayhoff編，5增刊3∶353-358，NationalBiomedicalResearchFoundation，Washington，D.C.，USA開發(fā)，且由Gribskov，Nucl.AcidsRes.14(6)：6745-6763(1986)正規(guī)化。用于確定序列同一性百分比的這種算法的一種示例性實現(xiàn)方式是由“BestFit”實用應(yīng)用程序中的GeneticsComputerGroup(Madison，Wis.)提供。用于計算序列之間的同一性或相似性百分比的其他合適的程序在本領(lǐng)域中一般是已知的，例如，另一個比對程序是以缺省參數(shù)使用的BLAST。舉例來說，可以使用BLASTN和BLASTP，使用以下缺省參數(shù)：遺傳密碼＝標(biāo)準(zhǔn)；過濾器＝無；鏈＝兩個；截止值＝60；期望值＝10；矩陣＝BLOSUM62；描述＝50個序列；分選＝高評分；數(shù)據(jù)庫＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDS翻譯+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。這些程序的細(xì)節(jié)可以在GenBank網(wǎng)站上找到。相對于本文中所描述的序列，所期望的序列同一性程度的范圍是大約80％至100％和介于其之間的任何整數(shù)值。典型地，序列之間的同一性百分比是至少70-75％，優(yōu)選地80-82％，更優(yōu)選地85-90％，甚至更優(yōu)選地92％，又更優(yōu)選地95％，且最優(yōu)選地98％序列同一性。由于可以在不偏離本發(fā)明的范圍的情況下在上述細(xì)胞和方法中進行各種改變，所以意圖以上描述中和以下給出的實施例中所含有的所有內(nèi)容都應(yīng)該被解釋為說明性的而不具有限制意義。實施例以下實施例說明了本發(fā)明的某些方面。實施例1：靶向基因經(jīng)修飾的CHO細(xì)胞系的制備采用ZFN介導(dǎo)的基因修飾技術(shù)來使編碼涉及N連接型或O連接型糖基化反應(yīng)的酶或蛋白質(zhì)的基因失活(即，敲除)。一般來說，使用專有算法來設(shè)計靶向感興趣的基因的編碼區(qū)內(nèi)的特定位點的數(shù)對ZFN。使用標(biāo)準(zhǔn)程序來制備ZFN表達(dá)構(gòu)建體，并且使用活體外轉(zhuǎn)錄、mRNA聚腺苷酸化和封端方法，由如敲除鋅指核酸酶(ZFN)(Sigma-Aldrich)產(chǎn)品信息中所描述的ZFN質(zhì)粒DNA產(chǎn)生ZFNmRNA。簡要地說，將質(zhì)粒ZFNDNA線性化，并且使用苯酚/氯仿DNA提取進行純化。使用MessageMaxTMT7ARCA-CappedMessageTranscriptionKit(CellScriptInc.)對線性化DNA進行封端。使用Poly(A)PolymeraseTailingKit(EpiCentre)來添加聚(A)尾。使用MEGAclearTM試劑盒(Ambion)來純化ZFNmRNA。將親本細(xì)胞作為懸浮液培養(yǎng)物維持在CHOCD融合培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich)中。在轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞以0.5×106個細(xì)胞/mL接種在生物反應(yīng)器管中。典型地，各轉(zhuǎn)染含有處于150μL生長培養(yǎng)基中的1×106個細(xì)胞和5μgZFNDNA或mRNA。通過在0.2cm試管中在140V和950uF下電穿孔來進行轉(zhuǎn)染。將已電穿孔的細(xì)胞放在處于6孔板靜態(tài)培養(yǎng)中的2mL生長培養(yǎng)基中。在轉(zhuǎn)染后第3天和第10天，將細(xì)胞從培養(yǎng)中取出，并且使用GeneEluteTM哺乳動物基因組DNA微型制備試劑盒(Sigma-Aldrich)分離基因組DNA。如敲除ZFN產(chǎn)品信息中所描述，使用Cel-1核酸酶測定來驗證ZFN誘導(dǎo)的裂解。進行該測定以確定如先前所描述的ZFN介導(dǎo)的基因突變的效率(Miller等，Nat.Biotechnol.2007，25：778-785)。該測定法檢測由于對ZFN誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂的非同源末端連接(NHEJ)介導(dǎo)的不完美修復(fù)而來源于野生型的靶向基因座的等位基因。對來自經(jīng)ZFN處理的細(xì)胞池的靶向區(qū)域進行PCR擴增產(chǎn)生了野生型(WT)與突變擴增子的混合物。對該混合物進行的熔融和重退火導(dǎo)致了WT和突變等位基因的異源雙鏈體之間的錯配形成。通過Surveyor核酸酶Cel-1使錯配位點上所形成的DNA“泡”裂解，并且可以通過凝膠電泳來拆分裂解產(chǎn)物。在證實ZFN活性后，使用有限稀釋對經(jīng)ZFN轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進行單細(xì)胞克隆。為此，使用80％CHO無血清克隆培養(yǎng)基、20％條件培養(yǎng)基和4mML-谷氨酰胺的混合物將細(xì)胞以約0.5個細(xì)胞/孔的近似密度鋪板。分別在鋪板后第7天和第14天以顯微鏡驗證克隆度和生長。通過PCR和DNA測序?qū)τ猩L的克隆進行擴增和基因分型。Mgat1KO細(xì)胞系。作為復(fù)雜N聚糖合成的一部分，Mgat1將GlnNac添加到Man5GlcNAc2N連接型多糖結(jié)構(gòu)。設(shè)計一對ZFN以靶向CHOMgat1基因中的5′-AACAAGTTCAAGTTCccagcaGCTGTGGTAGTGGAGGAC-3′(SEQIDNO：9；ZFN結(jié)合位點以大寫字母表示且裂解位點以小寫字母表示)。親本細(xì)胞系是CHOK1(GS-/-)(SigmaAldrich)，其中谷氨酸合成酶被敲除。該親本細(xì)胞系產(chǎn)生野生型N-聚糖和O-聚糖結(jié)構(gòu)?；旧先缫陨纤斒觯瑢HOK1(GS-/-)細(xì)胞系用Mgat1ZFNDNA進行轉(zhuǎn)染。Cel-1測定證實轉(zhuǎn)染后第3天和第10天都存在兩個裂解片段，220和197bp，從而表明ZFN活性。經(jīng)鑒定，單細(xì)胞克隆在一個等位基因中具有介于2bp至55bp范圍內(nèi)的缺失(未檢測第二個等位基因)。該細(xì)胞系產(chǎn)生了以五個甘露糖殘基封端的截短型N連接型結(jié)構(gòu)(即，Man5NeuAc2糖型)和野生型O聚糖結(jié)構(gòu)。COSMCKO細(xì)胞系。O-糖基化中最常見的第二生物合成步驟是核心-1伸長。核心-1伸長是由需要專用伴侶COSMC以發(fā)揮功能的單一酶C1GalT1(akaT-synthase)催化。COSMC是看起來特異性結(jié)合T-合酶且確保其在高爾基體中具有充分活性的ER蛋白。為了破壞COSMC基因，將CHOK1(GS-/-)細(xì)胞用編碼經(jīng)設(shè)計以靶向CHOCOSMC基因中的序列5′-GCCTTCTCAGTGTTCCGGAaaagtgTCCTGAACAAGGTGGGAT-3′(SEQIDNO：10)的ZFN的DNA或RNA加以轉(zhuǎn)染。Cel-1核酸酶測定證實經(jīng)ZFN轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中存在三個裂解片段(即，318bp、184bp、134bp)。分離在COSMC的一個等位基因中具有4bp缺失(未檢測第二個等位基因)的單細(xì)胞克隆。該細(xì)胞系產(chǎn)生了截短型(即，未成熟)O-聚糖結(jié)構(gòu)和野生型N-聚糖。COSMC/Mgat3KO細(xì)胞系。設(shè)計一對ZFN以靶向Mgat3的編碼區(qū)中的5′-TTCCTGGACCACTTCCCAcccggtGGCCGGCAGGATGGC-3′(SEQIDNO：11)。將以上詳述的COSMCKO細(xì)胞系用如以上詳述的ZFNDNA進行轉(zhuǎn)染。在證實ZFN裂解之后，分離單細(xì)胞克隆。測序顯示，突變克隆在Mgat3基因中具有9、10、11或41bp缺失。該細(xì)胞系產(chǎn)生了野生型N-聚糖和截短型O-聚糖(即，類似于親本細(xì)胞系)。COSMC/Mgat3/Mgat5KO細(xì)胞系。將以上詳述的COSMC/Mgat3KO細(xì)胞系用編碼經(jīng)設(shè)計以靶向Mgat5的編碼區(qū)中的5′-TTCTGCACTTCACCATCCAgcagcgGACTCAGCCTGAGAGCAGCT-3′(SEQIDNO：12)的ZFN的質(zhì)粒DNA進行轉(zhuǎn)染。分離在Mgat5基因中具有129bp缺失的單細(xì)胞克隆。該細(xì)胞系產(chǎn)生了具有較少側(cè)分支的N-聚糖和截短型O-聚糖。實施例2：病毒感染和病毒抗性測試測定使上述CHO細(xì)胞系生長且測試其在用原型MVM病毒(病毒株MVMp)攻擊后支持或抵抗感染的能力。簡要地說，使細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中生長，且以1或10的感染復(fù)數(shù)(MOI)加入MVMp病毒，并且在測定之前將已感染的細(xì)胞再孵育24、48或72小時。作為對照，在無病毒的情況下使細(xì)胞生長且進行孵育。未感染的細(xì)胞也用酶神經(jīng)氨酸酶加以處理，以去除來自表面聚糖(N連接型和O連接型)的末端唾液酸，且隨后以所指示的MOI進行感染。用肉眼觀察已感染的和未感染的細(xì)胞中細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的存在，并且在所指示的時間點，通過離心收集細(xì)胞。使用對總基因組DNA的南方印跡分析和使用抗病毒蛋白抗體的西方免疫印跡分析來篩檢病毒DNA感染性和產(chǎn)量。對于南方分析，收集來自24h時獲取的兩份樣品的細(xì)胞小球且分離總基因組DNA。通過Nanodrop光譜來定量DNA，并且將樣品正規(guī)化以確保瓊脂糖凝膠上具有相等負(fù)載，以便進行大小分級。將經(jīng)過大小分級的DNA轉(zhuǎn)移到帶電膜上(南方印跡)，并且使用32P標(biāo)記的病毒DNA探針對該膜探測病毒DNA合成。對特定32P標(biāo)記的病毒雙鏈DNA譜帶的定量是通過磷成像獲取且相對值報告在表1中。對于西方分析，將24h時收集的細(xì)胞小球溶解在SDS緩沖液中，并且使用SDS-PAGE來分離蛋白質(zhì)。在電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加以阻斷并且使用抗NS1抗體針對病毒NS1蛋白的存在進行免疫印跡(西方免疫測定法)。通過西方印跡檢測到的病毒蛋白水平在表2中表示。當(dāng)感染了病毒的MVMp病毒株時，該親本細(xì)胞系CHOK1(GS-/-)(即，具有野生型聚糖結(jié)構(gòu))表現(xiàn)出了正如所預(yù)期的經(jīng)典感染性和病毒DNA產(chǎn)量和蛋白質(zhì)合成。當(dāng)細(xì)胞在任一MOI下被感染時，感染后24小時病毒DNA和病毒蛋白產(chǎn)物顯而易見。在稍后的時間點還見到了病毒產(chǎn)物的強產(chǎn)生。正如所預(yù)期，不管時間點如何，未受感染的野生型細(xì)胞都沒有表現(xiàn)出感染的證據(jù)。當(dāng)用酶神經(jīng)氨酸酶(NA)處理野生型細(xì)胞以去除細(xì)胞表面唾液酸且隨后用MVMp感染細(xì)胞時，還觀察到病毒產(chǎn)量減少(表明感染減輕)(介于從MOI＝10時的5.32倍至MOI＝1時的7.34倍的范圍內(nèi))。盡管經(jīng)NA處理的細(xì)胞仍表現(xiàn)出對感染輕微敏感性，但已知CHO細(xì)胞在這種處理后快速再生出唾液酸(SA)結(jié)構(gòu)。因此，所見到的低感染水平可能來自已再生出末端SA聚糖且因此為病毒提供入口的細(xì)胞。CHOMgat1基因失活且不產(chǎn)生Mgat1酶的Mgat1KO細(xì)胞的病毒感染只引起輕微抗性(例如，降低2.1至2.7倍，如通過對印跡進行磷成像所測量)。因為該細(xì)胞系具有截短型N-聚糖，所以這些結(jié)果表明，具有2-3連接型唾液酸的高階N-聚糖受體可能在最初病毒衣殼結(jié)合和病毒進入細(xì)胞中只能發(fā)揮次要作用。當(dāng)COSMCKO細(xì)胞感染有MVMp病毒時，該細(xì)胞系對病毒感染表現(xiàn)出顯著抗性?？剐员稊?shù)(當(dāng)與野生型細(xì)胞系相比時)在5.5倍(MOI＝10)至190倍(MOI＝1)的范圍內(nèi)。靶向Mgat3基因(假定是CHO細(xì)胞中的假基因)和Mgat5基因(負(fù)責(zé)高階N連接型分支)的額外基因敲除得到了類似的結(jié)果。西方印跡分析得到了類似的結(jié)果，表明當(dāng)O-聚糖結(jié)構(gòu)被截短時發(fā)生病毒抗性。這些研究揭示了破壞唾液酸受體可大幅減少MVM結(jié)合和/或進入細(xì)胞。實施例3：其他COSMCKO和Slc35A1KO細(xì)胞系的產(chǎn)生如以上實施例1中所描述，使用CHOK1(GS-/-)細(xì)胞和經(jīng)設(shè)計以靶向CHOCOSMC基因的外顯子2中的序列5′-GCCTTCTCAGTGTTCCGGAaaagtgTCCTGAACAAGGTGGGAT-3′(SEQIDNO：10)的一對ZFN來產(chǎn)生新的COSMCKO細(xì)胞系克隆。Cel-1核酸酶測定證實經(jīng)ZFN轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中存在三個裂解片段(即，318bp、184bp、134bp)。分離五個單細(xì)胞克隆，且測序顯示1至12bp的缺失，如以下所示?？寺』蛐虲OSMCF072bp缺失COSMCG031bp插入COSMCH041bp插入COSMCA099bp缺失COSMCH0512bp缺失使用標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)寺07進行進一步修飾以表達(dá)人IgG。在所鑒定的許多克隆中，分離了兩個產(chǎn)生IgG的克隆(鑒定為71H1、71C3)以便進一步測試(見下文)。使用經(jīng)設(shè)計以靶向5′-AGCTTATACCGTAGCTTTaagataCACAAGGACAACAGCTAAA-3′(SEQIDNO：13)的ZFN或經(jīng)設(shè)計以靶向CHOSlc35A1基因的外顯子1中的5′-TTCAAGCTATACTGCTTGGCAGTGATGACTCTGGTGGCT-3′(SEQIDNO：17)的ZFN將編碼核苷酸糖轉(zhuǎn)運子(CMP-唾液酸轉(zhuǎn)運子)的Slc35A1基因從CHOK1(GS-/-)細(xì)胞中敲除。Cel-1核酸酶測定證實經(jīng)ZFN轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中存在兩個裂解片段。分離出一個單細(xì)胞克隆(B12)，且測序顯示了在ZFN結(jié)合位點周圍的1bp缺失。Slc35A1KO細(xì)胞系形成了不具有末端唾液酸的N連接型和O連接型聚糖結(jié)構(gòu)。利用生物素標(biāo)記的山槐凝集素II(MALII；20μg/mL)和AlexaFluor647標(biāo)記的鏈霉親和素(5μg/mL)的染色顯示了COSMCKO克隆F07、COSMCKO克隆G03和Slc35A1KO細(xì)胞系中的染色與親本細(xì)胞系相比顯著減少(表明KO細(xì)胞系中不存在末端唾液酸殘基)。實施例4：COSMCKO和Slc35A1KO細(xì)胞系對MMV病毒的抗性基本上如以上實施例2中所述，用MVMp病毒以MOI0.3感染野生型(即，CHOZNGS-/-)、COSMCKO(以上實施例1和實施例3中所產(chǎn)生的)和Slc35A1KO(以上實施例3中所產(chǎn)生的)細(xì)胞。通過南方分析(基本上如以上所描述)和標(biāo)準(zhǔn)噬菌斑測定法來測定感染。如圖1中所示，野生型細(xì)胞表現(xiàn)出高水平的病毒DNA，而Slc35A1KO和COSMCKO細(xì)胞系具有非常低水平的病毒DNA；COSMCF07KO和COSMCG03KO克隆具有低水平的病毒DNA；且具有12bp缺失的COSMCH05FO克隆具有與親本細(xì)胞系類似的水平的病毒DNA。由于H05中的缺失是同框的，所以該細(xì)胞表現(xiàn)出接近野生型水平的病毒敏感性并不奇怪。噬菌斑測定結(jié)果示于圖2中。Slc35A1KO、COSMCKO、COSMCF07KO和COSMCG03KO細(xì)胞具有極低的病毒水平。使用野生型(即，CHOZNGS-/-，也稱為2E3)、COSMCKO克隆F07和G03以及Slc35A1KO克隆B12進行了額外的病毒抗性測試。使細(xì)胞在補充有6mML-谷氨酰胺的培養(yǎng)基中生長且用MMVp以MOI1或8進行感染，并且在合適的條件下孵育。在0、24、48、72、96和120小時取出細(xì)胞樣品；用錐蟲藍(lán)染色來測定細(xì)胞活力，并且通過qPCR來確定MMV定量。細(xì)胞活力呈現(xiàn)于圖3中。在感染后120小時，野生型細(xì)胞(即，2E3)中細(xì)胞活力降至約50％(參見圖A)，而在COSMC克隆F07中，至少93％的細(xì)胞在感染后120小時是活的(參見圖B)。圖4示出了在野生型(2E3)和COSMC克隆F07中以MOI1(參見圖A)或MOI8(參見圖B)進行MMV感染之后細(xì)胞相關(guān)病毒(每個細(xì)胞的病毒基因組拷貝(vgc))的時間過程(計算是基于各感染細(xì)胞可以產(chǎn)生2×104vgc的假設(shè))。以下呈現(xiàn)已感染的細(xì)胞在各條件下的級分。在時間-3小時用MMVp以MOI0.3或0.03感染野生型(即，2E3)、COSMCKO克隆F07、G03和H04以及Slc35A1KO克隆B12細(xì)胞。在時間0小時，用生長培養(yǎng)基將細(xì)胞洗滌三次，然后孵育21小時(即，單個復(fù)制周期)。通過在0和21小時確定細(xì)胞相關(guān)病毒來測定病毒復(fù)制。如圖5中所示，病毒復(fù)制在COSMCKO細(xì)胞系中有所減少且在Slc35A1KO細(xì)胞系中被消除。實施例5：COSMCKO和Slc35A1KO細(xì)胞系對呼腸孤病毒3的抗性在時間-3小時用呼腸孤病毒3以兩個稀釋度感染野生型(即，2E3)、COSMCKO克隆F07和Slc35A1KO克隆B12細(xì)胞(TCID50＝5.6E+07和5.6E+06)。在時間0小時，將細(xì)胞洗滌三次，然后孵育24小時(即，單個復(fù)制周期)。通過在0和24小時確定細(xì)胞相關(guān)病毒來測定病毒復(fù)制。在24小時，細(xì)胞相關(guān)病毒的水平在COSMCKO克隆中大幅降低，且在Slc35A1KO克隆中幾乎被消除(參見圖6)。實施例6：COSMCKO和Slc35A1KO細(xì)胞系的生長測定在不存在或存在MVMp病毒(MOI0.1)的情況下使野生型(即，CHOZNGS-/-)、COSMCKO克隆F07和G03以及Slc35A1KO克隆B12細(xì)胞生長8至10天。通過在第0天、第1天、第2天、第3天、第6天、第7天、第8天和第10天測量活細(xì)胞密度(通過錐蟲藍(lán)染色)來監(jiān)測細(xì)胞生長。如圖7的圖A中所示，各種KO細(xì)胞在存在或不存在病毒的情況下具有類似的生長概況，表明了對病毒注入的抗性。與此相反，當(dāng)與未感染的培養(yǎng)物相比時，野生型細(xì)胞表現(xiàn)出經(jīng)典感染性、受損的生長和低細(xì)胞活力?；旧先缫陨纤斒鲈诓淮嬖诨虼嬖诓《镜那闆r下監(jiān)測COSMCKO克隆F07的野生型和IgG產(chǎn)生克隆(即，71H1和71C3)的細(xì)胞生長。如圖7的圖B所示，產(chǎn)生IgG的KO細(xì)胞系也對病毒感染表現(xiàn)出顯著抗性。已感染的培養(yǎng)物以與未感染的培養(yǎng)物類似的速率生長且達(dá)到峰值細(xì)胞密度。這些數(shù)據(jù)表明，分泌細(xì)胞表面IgG對COSMCKO親本所表現(xiàn)出的病毒抗性程度沒有明顯影響。雖然產(chǎn)生IgG的細(xì)胞系與野生型細(xì)胞相比以較慢速率增長，但兩種IgG生產(chǎn)者都對病毒感染表現(xiàn)出了抗性(即，當(dāng)與未感染的培養(yǎng)物相比時，沒有差別)。實施例7：St3Gal4KO細(xì)胞系的產(chǎn)生和細(xì)胞生長測定基本上如實施例1中所描述，使用經(jīng)設(shè)計以靶向CHOSt3Gal4基因中的5′-GGCAGCCTCCAGTGTCGTCgttgtgTTGTGGTGGGGAATGGGC(SEQIDNO：14)的ZFN來產(chǎn)生St3Gal4KO細(xì)胞。Cel-1核酸酶測定證實經(jīng)ZFN轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中存在三個裂解片段(即，344bp、210bp和135bp)。分離出四個單細(xì)胞克隆，且測序顯示了以下突變。St3Gal4KO細(xì)胞具有較低水平的2-3連接型唾液酸結(jié)構(gòu)?？寺〉任换?基因型等位基因2基因型St3Gal41B084bp插入5bp缺失St3Gal47D102bp缺失8bp缺失St3Gal41B105bp缺失11bp缺失St3Gal41H113bp插入11bp缺失在不存在或存在MVMp病毒(MOI0.1)的情況下使St3Gal4KO(即，克隆7D10、1B8和1B10)和野生型細(xì)胞生長，并且監(jiān)測細(xì)胞生長，持續(xù)9天。St3Gal4KO細(xì)胞也對病毒感染表現(xiàn)出顯著抗性，如圖8中所示。已感染的KO培養(yǎng)物以與未感染的KO培養(yǎng)物類似的速率生長且達(dá)到峰值細(xì)胞密度。這些研究顯示了破壞細(xì)胞表面上的特定2-3連接型唾液酸結(jié)構(gòu)似乎也能大幅減少MVM進入這種細(xì)胞。實施例8：St3Gal4和St3Gal6雙KO細(xì)胞系的產(chǎn)生使用St3Gal4KO(即，克隆7D10、1B8和1B10)細(xì)胞系作為起始細(xì)胞，以產(chǎn)生也含有敲除的St3Gal6基因的細(xì)胞系。ZFN被設(shè)計為靶向5′-CGGTACCTCTGATTTTGCTttgccCTATGGGACAAGGCC-3′(SEQIDNO：15)，且基本上如實施例1中所描述來進行基因編輯。Cel-1核酸酶測定證實經(jīng)ZFN轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中存在三個裂解片段(即，308bp、171bp和137bp)。分離出六個單細(xì)胞克隆，且測序顯示了以下突變。實施例9：C1GalT1KO細(xì)胞系的產(chǎn)生基本上如實施例1中所描述，使用經(jīng)設(shè)計以靶向5′-ACCCTCATGCTAGACatttaGATGATAACGAACCCAGTC-3′(SEQIDNO：16)的ZFN來敲除CHOK1(GS-/-)細(xì)胞中的C1GalT1基因。Cel-1核酸酶測定證實經(jīng)ZFN轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中存在兩個裂解片段(即，223bp和148bp)。分離出七個單細(xì)胞克隆，且測序顯示了以下突變。C1GalT1克隆等位基因1基因型等位基因2基因型2A88bp缺失8bp缺失2A115bp缺失90bp插入2C128bp缺失未檢測到2G125bp缺失未檢測到3D128bp缺失未檢測到3E61bp缺失2bp缺失和97bp插入3F25bp缺失5bp缺失和31bp插入利用生物素標(biāo)記的MALII和AlexaFluor647標(biāo)記的鏈霉親和素的染色顯示了C1GalT1KO克隆2C12中的染色與親本細(xì)胞系相比顯著減少。實施例10：過度表達(dá)St6Gal1的細(xì)胞系的產(chǎn)生因為假設(shè)MVM病毒不結(jié)合α-2，6連接型唾液酸，所以產(chǎn)生了過度表達(dá)St6Gal1的CHO細(xì)胞系。中國倉鼠St6Gal1的編碼序列是獲自GenBank(AB492855)和chogenome.orgAQ2(AFTD01061789和AFTD01061790)。批量合成Kozak序列(5′-GCCGCCACCAatg-3′；SEQIDNO：18)被添加至5′-未翻譯區(qū)(UTR)的開放閱讀框。將所合成的片段克隆到表達(dá)載體pJ602(DNA2.0；MenloPark，CA)中。用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)染(通過電穿孔)CHO(GS-/-)宿主細(xì)胞系和表達(dá)IgG的CHO細(xì)胞系。使用FACSAriaTMIII細(xì)胞分選儀分離出單細(xì)胞克隆。為此，用可結(jié)合α-2，6連接型唾液酸的FITC綴合型黑接骨木凝集素(FITC-SNA)將細(xì)胞染色，并且將具有前5％熒光的細(xì)胞以1個細(xì)胞/孔鋪板并培養(yǎng)。在用可結(jié)合α-2，3連接型唾液酸的經(jīng)生物素標(biāo)記的MALII和AlexaFluor647標(biāo)記的鏈酶親和素染色之后，在MACSQuantVR分析儀(MiltenyiBiotec，SanDiego，CA)上對單細(xì)胞克隆進行雙色FACS分析。過度表達(dá)St6Gal1的單細(xì)胞克隆與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的親本細(xì)胞系相比具有增高的FITC與AlexaFluor之比。從兩個過度表達(dá)St6Gal1的克隆(即，克隆31和克隆32)和親本細(xì)胞克隆中分離出IgG。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)gG或總細(xì)胞蛋白提取物進行還原和羧酰胺基甲基化，隨后在37℃下進行胰蛋白酶處理過夜(12-16h)。通過在100℃下加熱5分鐘將胰蛋白酶滅活。利用C18SPE濾筒(Waters，300mg填料)進行片段的純化。在用5％乙酸(AcOH)洗滌之后，依次在20％異丙醇/5％AcOH、40％異丙醇/5％AcOH和100％異丙醇中洗脫肽/糖肽。干燥洗脫液以減少體積，在含有PNG酶F的磷酸鹽緩沖液中重構(gòu)，并且在37℃下孵育過夜。使用C18濾筒來純化所釋放的聚糖，進行全甲基化且稀釋至1mM碳酸鋰/50％MeOH中，并且以0.5mL/min的流速直接輸注到LTQOrbitrapDiscovery質(zhì)譜儀(ThermoScientific)中以便進行納米噴霧電離。在30,000分辨率下獲得了各樣品的完整傅立葉變換質(zhì)譜儀(FTMS)譜圖以確定哪些聚糖含有唾液酸。通過MSn分析來確定唾液酸化聚糖的唾液酸鍵聯(lián)。在離子阱內(nèi)對各樣品進行多個離子選擇和碎裂步驟，以使復(fù)合型聚糖分解成單個半乳糖，然后觀察碎裂模式。GS(-/-)宿主細(xì)胞系與兩個過度表達(dá)St6Gall的細(xì)胞系(即，克隆31和32)的N-聚糖分布之間存在驚人的差異。具體來說，在宿主細(xì)胞系中沒有鑒定出唾液酸化的聚糖，這是由于其豐度較低。相比之下，在兩個過度表達(dá)St6Gal1的細(xì)胞系中都鑒定出了單唾液酸化、二唾液酸化、三唾液酸化和四唾液酸化N-聚糖。具體來說，克隆32中除了一個唾液酸化群體以外的所有唾液酸化群體都表現(xiàn)出含有α-2，3鍵聯(lián)和α-2，6鍵聯(lián)。當(dāng)前第1頁1 2 3