本申請(qǐng)要求提交于2014年3月6日的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/949,049的35U.S.C.§119(e)下的權(quán)益，所述臨時(shí)專利申請(qǐng)出于所有目的以引用的方式全文納入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請(qǐng)?zhí)峁┝死冒?encapsulated)在水凝膠中并連接至水凝膠上的細(xì)胞，以例如用于測(cè)量細(xì)胞的機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力以及在細(xì)胞和分子水平上研究機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的組合物和方法。
背景技術(shù)：
：：感知機(jī)械應(yīng)力并對(duì)其作出應(yīng)答是生物細(xì)胞的根本需求。在心臟中，高外周阻力(高血壓、壓力超負(fù)荷)與增加心肌的收縮性(稱為Anrep效應(yīng))相對(duì)；擴(kuò)大的舒張期容積(容積超負(fù)荷)也與增加收縮性(稱為Frank-Starling機(jī)制)相對(duì)。盡管心臟感知機(jī)械應(yīng)力并調(diào)節(jié)收縮性以滿足變化的血液動(dòng)力學(xué)需求，但是過(guò)度的應(yīng)變和應(yīng)力(壓力超負(fù)荷，容積超負(fù)荷)也導(dǎo)致心功能障礙和心臟病發(fā)生。心肌細(xì)胞的機(jī)械完整性是由包括肋狀體(costamere)(黏著斑復(fù)合體的復(fù)雜版本)的結(jié)構(gòu)蛋白網(wǎng)絡(luò)保持，所述肋狀體圍繞z盤以提供結(jié)構(gòu)支持(圖1)。肋狀體包括抗肌萎縮蛋白(dystrophin)-糖蛋白復(fù)合體(DGC)和粘著斑蛋白(vinculin)-踝蛋白(talin)-整聯(lián)蛋白復(fù)合體(VTI)。這些機(jī)械應(yīng)力承受和感知蛋白的重要性在多種肌營(yíng)養(yǎng)不良癥中被證明，在肌營(yíng)養(yǎng)不良癥中DGC或VTI中的突變導(dǎo)致心功能障礙和擴(kuò)張型心肌病。盡管已經(jīng)知道了這些現(xiàn)象超過(guò)一個(gè)多世紀(jì)，將機(jī)械應(yīng)變和應(yīng)力轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)生物化學(xué)反應(yīng)的細(xì)胞和分子機(jī)制(所謂的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)(MCT)機(jī)制)迄今為止仍然了解的很少。因此，仍缺少用于治療機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的心臟病(例如，肌營(yíng)養(yǎng)不良性心肌病，以及高血壓誘導(dǎo)的心率失常和心力衰竭)的有效療法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝税ū话庠谒z中的細(xì)胞的組合物。在不同的實(shí)施方案中，所述水凝膠包含結(jié)合配偶體(bindingpartner)對(duì)的第一結(jié)合配偶體或綴合至生物相容性聚合物的結(jié)合配偶體對(duì)的第一結(jié)合配偶體，其中所述第一結(jié)合配偶體與Y-X-Y交聯(lián)劑交聯(lián)，其中X是線性親水性聚合物，Y是所述結(jié)合配偶體對(duì)的第二結(jié)合配偶體，并且其中所述細(xì)胞直接或間接連接至所述第一結(jié)合配偶體。在一些實(shí)施方案中，所述水凝膠包含綴合至生物相容性聚合物的結(jié)合配偶體對(duì)的第一結(jié)合配偶體，其中所述生物相容性聚合物與硼酸酯-X-硼酸酯(boronate)交聯(lián)劑交聯(lián)，其中X是線性親水性聚合物，并且其中所述細(xì)胞直接或間接連接至所述第一結(jié)合配偶體。在不同的實(shí)施方案中，所述結(jié)合配偶體對(duì)選自抗生物素蛋白/生物素、谷胱甘肽/谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)/麥芽糖、組氨酸標(biāo)簽(Histag)/咪唑+Zn2+，以及萬(wàn)古霉素/D-丙氨酸-D-丙氨酸(DADA)，其中所述結(jié)合配偶體對(duì)的任一成員可以為第一結(jié)合配偶體或第二結(jié)合配偶體。參見，例如，Rao,etal.,Science.(1998)280(5364):708-11?？墒褂玫念~外結(jié)合配偶體對(duì)記載于，例如，Lichtyetal.,ProteinExpressionandPurification(2005)41:98-105。一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝税ū话庠谒z中的細(xì)胞的組合物。在不同的實(shí)施方案中，所述水凝膠包含與生物素-X-生物素交聯(lián)劑交聯(lián)的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白-聚合物綴合物，其中X是線性親水性聚合物，其中所述細(xì)胞直接或間接連接至抗生物素蛋白。在不同的實(shí)施方案中，所述水凝膠包含綴合至生物相容性聚合物的抗生物素蛋白，其中所述生物相容性聚合物與硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑交聯(lián)，其中X是線性親水性聚合物，其中所述細(xì)胞直接或間接連接至抗生物素蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是通過(guò)生物素分子連接至抗生物素蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是通過(guò)綴合至配體的生物素分子連接至抗生物素蛋白。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝税ū话庠谒z中的細(xì)胞的組合物。在不同的實(shí)施方案中，所述水凝膠包含生物素或綴合至生物相容性聚合物的生物素，其中所述生物素與抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交聯(lián)劑交聯(lián)，其中X是線性親水性聚合物，其中所述細(xì)胞直接或間接連接至生物素。在一些實(shí)施方案中，所述水凝膠包含綴合至生物相容性聚合物的生物素，其中所述生物相容性聚合物與硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑交聯(lián)，其中X是線性親水性聚合物，其中所述細(xì)胞直接或間接連接至生物素。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是通過(guò)抗生物素蛋白分子連接至生物素。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞通過(guò)綴合至配體的抗生物素蛋白分子連接至生物素。在組合物的不同的實(shí)施方案中，所述硼酸酯-X-硼酸酯中的硼酸酯選自二硼酸酯、三硼酸酯、四硼酸酯及其混合物。在一些實(shí)施方案中，所述抗生物素蛋白選自抗生物素蛋白、抗生物素蛋白鏈菌素、中性抗生物素蛋白(neutravidin)和captavidin。在不同的實(shí)施方案中，所述萬(wàn)古霉素和D-丙氨酸-D-丙氨酸(DADA)是單價(jià)、二價(jià)或三價(jià)的。在不同的實(shí)施方案中，所述水凝膠包含綴合至生物相容性聚合物的配體，其中所述生物相通性聚合物與硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑交聯(lián)，其中X是線性親水性聚合物，其中所述細(xì)胞直接或間接連接至配體。在一些實(shí)施方案中，所述生物相容性聚合物包括范圍為約50-150kDa，例如約80-100kDa，例如約50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、110kDa、120kDa、130kDa、140kDa或150kDa的平均分子量。在不同的實(shí)施方案中，所述生物相容性聚合物包括用于交聯(lián)的功能部分，其選自羥基、二醇(例如，順式二醇)、羧基、氨基、氨基-氧基(amino-oxy)、疊氮化物或炔烴。在不同的實(shí)施方案中，所述生物相容性聚合物包括用于交聯(lián)的順式二醇部分。在一些實(shí)施方案中，所述生物相容性聚合物選自聚乙烯醇(PVA)、瓊脂糖和藻酸鹽。在一些實(shí)施方案中，所述交聯(lián)劑包括范圍為約1-50kDa，例如約10-30kDa，例如約15-25kDa，例如約5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa或50kDa的分子量。在一些實(shí)施方案中，X是線性親水性聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖。在一些實(shí)施方案中，所述交聯(lián)劑與所述聚合物的重量比(wt./wt.)的范圍為約0.2至約5.0，例如0.2至約2.0，例如約0.5至約1.5。在一些實(shí)施方案中，所述水凝膠包括范圍為約0.1kPa至約100kPa的剛度或楊氏模量值。在不同的實(shí)施方案中，所述水凝膠是光學(xué)透明的。在一些實(shí)施方案中，所述配體與細(xì)胞表面分子結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述表面分子選自整聯(lián)蛋白、糖蛋白、聚糖和細(xì)胞表面受體。在一些實(shí)施方案中，所述配體選自多肽、線性肽、環(huán)化肽、肽模擬物(peptidomimetic)、抗原結(jié)合分子、抗體和抗體片段。在一些實(shí)施方案中，所述配體為選自膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白原、玻璃體結(jié)合蛋白、VCAM-1和鈣粘蛋白以及它們的子序列(subsequence)的多肽。在一些實(shí)施方案中，所述整聯(lián)蛋白選自α3β1整聯(lián)蛋白、α4β1整聯(lián)蛋白和ανβ3整聯(lián)蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是肌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述肌細(xì)胞是心肌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述包封的細(xì)胞未接觸或不能接觸固體表面或另一細(xì)胞。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝税ㄉ鲜龊捅疚乃鼋M合物的裝置。在不同的實(shí)施方案中，所述裝置包括一個(gè)或多個(gè)灌注室。在不同的實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)灌注室包括改良的蒂羅德溶液(Tyrodesolution)，其包括用于替代葡萄糖的丙酮酸。在不同的實(shí)施方案中，所述改良的蒂羅德溶液包括濃度足夠低的Ca2+以允許肌細(xì)胞處于松弛態(tài)。在不同的實(shí)施方案中，所述改良的蒂羅德溶液包括低于約1mM的Ca2+濃度，例如，低于約100μΜ、75μΜ、50μΜ、40μΜ或30μΜ并且至少約10μΜ。在不同的實(shí)施方案中，所述包封的細(xì)胞未與所述裝置的固體表面或水凝膠內(nèi)的另一細(xì)胞接觸。在不同的實(shí)施方案中，所述凝膠在至少兩個(gè)維度上被拴系(tether)。在不同的實(shí)施方案中，所述裝置包括拴系所述凝膠的夾具(grip)，其中所述夾具能夠在所述凝膠上牽拉，從而在所述凝膠上和所述包封在凝膠中的細(xì)胞上引入機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力。在不同的實(shí)施方案中，所述凝膠與力傳感器和張力操控器(tensionmanipulator)進(jìn)行機(jī)械連通(mechanicalcommunication)。在不同的實(shí)施方案中，所述凝膠處于由電刺激器控制的電場(chǎng)內(nèi)，所述電刺激器將電信號(hào)施加于所述包封在凝膠中的細(xì)胞上。在不同的實(shí)施方案中，所述裝置與成像系統(tǒng)進(jìn)行連通。在不同的實(shí)施方案中，所述裝置與計(jì)算機(jī)連通。在不同的實(shí)施方案中，所述計(jì)算機(jī)記錄施加在所述細(xì)胞和凝膠上的機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力。在不同的實(shí)施方案中，所述計(jì)算機(jī)記錄細(xì)胞圖像。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包括：i)一個(gè)或多個(gè)灌注室，每個(gè)灌注室均包括如上所述和本文所述的組合物；ii)與凝膠接觸的第一和第二夾具，其中所述第一和第二夾具能夠在至少兩個(gè)維度上在凝膠上引入張力；iii)連接至第一夾具的力傳感器和連接至第二夾具的張力操控器，其中所述力傳感器感知施加在所述凝膠上的機(jī)械張力，其可用于計(jì)算所述細(xì)胞和凝膠中的應(yīng)力；iv)與所述力傳感器連通的計(jì)算機(jī)，其中所述計(jì)算機(jī)能夠存儲(chǔ)由所述力傳感器感知的機(jī)械張力讀數(shù)。在不同的實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)還包括成像系統(tǒng)，其能夠捕捉被包封在凝膠中的細(xì)胞的圖像，其中所述成像系統(tǒng)與所述力傳感器和計(jì)算機(jī)之一或兩者進(jìn)行連通。在不同的實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)還包括電刺激器，其將電信號(hào)施加于所述包封在凝膠中的細(xì)胞上。在不同的實(shí)施方案中，所述灌注室包括改良的蒂羅德溶液，其包括用于替代葡萄糖的丙酮酸。在不同的實(shí)施方案中，所述改良的蒂羅德溶液包括濃度足夠低的Ca2+以允許肌細(xì)胞處于松弛態(tài)。在不同的實(shí)施方案中，所述改良的蒂羅德溶液包括低于約1mM的Ca2+濃度，例如，低于約100μΜ、75μΜ、50μΜ并且至少約10μΜ。在不同的實(shí)施方案中，所述計(jì)算機(jī)被編程以控制和/或管理給予所述灌注室的試驗(yàn)刺激。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝吮O(jiān)測(cè)細(xì)胞上的機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括：a)將細(xì)胞包封在上述和本文所述的組合物中；b)獲得細(xì)胞上的機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力的第一測(cè)量值；c)將細(xì)胞暴露于試驗(yàn)刺激；d)獲得細(xì)胞上的機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力的第二測(cè)量值；和e)比較第一和第二測(cè)量值。在不同的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是肌細(xì)胞。在不同的實(shí)施方案中，所述肌細(xì)胞是心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞。在不同的實(shí)施方案中，所述肌細(xì)胞是心肌細(xì)胞。在不同的實(shí)施方案中，測(cè)量心肌細(xì)胞收縮。在不同的實(shí)施方案中，所述方法還包括連續(xù)記錄和測(cè)量細(xì)胞上的機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力。在不同的實(shí)施方案中，所述方法還包括在將細(xì)胞暴露于試驗(yàn)刺激之前在凝膠上引入機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力。在不同的實(shí)施方案中，所述方法還包括在將細(xì)胞暴露于試驗(yàn)刺激之前、期間和/或之后在凝膠上引入機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力。在不同的實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)刺激是物理的、化學(xué)的或藥理學(xué)的。在不同的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞上機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力的第一和/或第二測(cè)量值記錄在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝水a(chǎn)生上述或本文所述的凝膠包封細(xì)胞(Cell-in-Gel)組合物的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括：a)用結(jié)合配偶體對(duì)-配體綴合物的第二結(jié)合配偶體孵育一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞在，孵育條件為允許配體與一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表面分子結(jié)合；b)使結(jié)合至第二結(jié)合配偶體-配體綴合物的細(xì)胞與結(jié)合配偶體對(duì)的第一結(jié)合配偶體或包括第一結(jié)合配偶體的生物相容性聚合物接觸，接觸條件為足以使第一結(jié)合配偶體結(jié)合至第二結(jié)合配偶體-配體綴合物的第二結(jié)合配偶體上；和c)使來(lái)自步驟b)的細(xì)胞與Y-X-Y交聯(lián)劑接觸，接觸條件為足以交聯(lián)第一結(jié)合配偶體，其中X是線性親水性聚合物，Y是結(jié)合配偶體對(duì)的第二結(jié)合配偶體，從而將細(xì)胞包封在水凝膠中。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括：a)用結(jié)合配偶體對(duì)-配體綴合物的第二結(jié)合配偶體孵育一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，孵育條件為允許配體與一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表面分子結(jié)合；b)使結(jié)合至結(jié)合配偶體對(duì)-配體綴合物的第二結(jié)合配偶體的細(xì)胞與綴合至結(jié)合配偶體對(duì)的第一結(jié)合配偶體的生物相容性聚合物接觸，接觸條件為足以使第一結(jié)合配偶體結(jié)合至第二結(jié)合配偶體-配體綴合物上；和c)使來(lái)自步驟b)的細(xì)胞與硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑接觸，接觸條件為足以交聯(lián)生物相容性聚合物，其中X是線性親水性聚合物，從而將細(xì)胞包封在水凝膠中。在產(chǎn)生方法的不同實(shí)施方案中，所述結(jié)合配偶體對(duì)選自抗生物素蛋白/生物素、谷胱甘肽/谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)/麥芽糖、組氨酸標(biāo)簽/咪唑+Zn2+，以及萬(wàn)古霉素/D-丙氨酸-D-丙氨酸(DADA)。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括：a)用生物素-配體綴合物孵育一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，孵育條件為允許配體與一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表面分子結(jié)合；b)使結(jié)合至生物素-配體綴合物的細(xì)胞與抗生物素蛋白或包括抗生物素蛋白的生物相容性聚合物或綴合至抗生物素蛋白的生物相容性聚合物接觸，接觸條件為足以使抗生物素蛋白與生物素-配體綴合物的生物素結(jié)合；和c)使來(lái)自步驟b)的細(xì)胞和生物素-X-生物素交聯(lián)劑接觸，接觸條件為足以交聯(lián)抗生物素蛋白，其中X是線性親水性聚合物，從而將細(xì)胞包封在水凝膠中。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括：a)用生物素-配體綴合物孵育一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，孵育條件為允許配體與一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表面分子結(jié)合；b)使結(jié)合至生物素-配體綴合物的細(xì)胞與綴合至抗生物素蛋白的生物相容性聚合物接觸，接觸條件為足以使抗生物素蛋白與生物素-配體綴合物結(jié)合；和c)使來(lái)自步驟b)的細(xì)胞和硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑接觸，接觸條件為足以交聯(lián)生物相容性聚合物，其中X是線性親水性聚合物，從而將細(xì)胞包封在水凝膠中。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括：a)用抗生物素蛋白-配體綴合物孵育一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，孵育條件為允許配體與一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表面分子結(jié)合；b)使結(jié)合至抗生物素蛋白-配體綴合物的細(xì)胞與生物素或包含生物素的生物相容性聚合物接觸，接觸條件為足以使生物素與抗生物素蛋白-配體綴合物的抗生物素蛋白結(jié)合；和c)使來(lái)自步驟b)的細(xì)胞和抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交聯(lián)劑接觸，接觸條件為足以交聯(lián)生物素，從而將細(xì)胞包封在水凝膠中。在不同的實(shí)施方案中，X是線性親水性聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括：a)用抗生物素蛋白-配體綴合物孵育一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，孵育條件為允許配體與一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞上的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞表面分子結(jié)合；b)使結(jié)合至抗生物素蛋白-配體綴合物的細(xì)胞與綴合至生物素的生物相容性聚合物接觸，接觸條件為足以使生物素與抗生物素蛋白-配體綴合物結(jié)合；和c)將來(lái)自步驟b)的細(xì)胞與硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑接觸，接觸條件為足以交聯(lián)所述生物相容性聚合物，從而將細(xì)胞包封在水凝膠中。在不同的實(shí)施方案中，X是線性親水性聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖。在產(chǎn)生水凝膠的方法的不同的實(shí)施方案中，在進(jìn)行或不進(jìn)行機(jī)械混合的情況下包封所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。如以上和本文所述，X可以為任何親水性線性聚合物。在不同的實(shí)施方案中，X是線性親水性聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖。產(chǎn)生水凝膠的方法的其他實(shí)施方案如以上所述和本文所述。另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝嗽噭┖?。在一些?shí)施方案中，所述試劑盒包括：i)包含結(jié)合配偶體對(duì)的第一結(jié)合配偶體或綴合至所述第一結(jié)合配偶體綴合的生物相容性聚合物的溶液；和ii)包含Y-X-Y交聯(lián)劑的溶液；其中X是線性親水性聚合物，Y是結(jié)合配偶體對(duì)的第二結(jié)合配偶體。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包括：i)包含綴合至結(jié)合配偶體對(duì)的第一結(jié)合配偶體的生物相容性聚合物的溶液；和ii)包含硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑的溶液，其中X是線性親水性聚合物。在不同的實(shí)施方案中，所述結(jié)合配偶體對(duì)選自抗生物素蛋白/生物素、谷胱甘肽/谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)/麥芽糖、組氨酸標(biāo)簽/咪唑+Zn2+，以及萬(wàn)古霉素/D-丙氨酸-D-丙氨酸(DADA)，所述結(jié)合配偶體對(duì)的任一成員可以為第一結(jié)合配偶體或第二結(jié)合配偶體。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包括：i)包含抗生物素蛋白或綴合至抗生物素蛋白的生物相容性聚合物的溶液；和ii)包含生物素-X-生物素交聯(lián)劑的溶液；其中X是線性親水性聚合物。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包括：i)包含綴合至抗生物素蛋白的生物相容性聚合物的溶液；和ii)包含硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑的溶液；其中X是線性親水性聚合物。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包括：i)包含生物素或綴合至生物素的生物相容性聚合物的溶液；和ii)包含抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交聯(lián)劑的溶液；其中X是線性親水性聚合物。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包括：i)包含綴合至生物素的生物相容性聚合物的溶液；和ii)包含硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑的溶液；其中X是線性親水性分子。在一些實(shí)施方案中，硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑中的硼酸酯選自二硼酸酯、三硼酸酯、四硼酸酯及其混合物。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括含有生物素-配體綴合物的溶液。在一些實(shí)施方案中，所述抗生物素蛋白選自抗生物素蛋白、抗生物素蛋白鏈菌素、中性抗生物素蛋白和captavidin。在一些實(shí)施方案中，所述生物相容性聚合物包括范圍為約50-150kDa，例如約80-100kDa，例如約50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、110kDa、120kDa、130kDa、140kDa或150kDa的平均分子量。在一些實(shí)施方案中，所述生物相容性聚合物包括用于交聯(lián)的順式二醇部分。在一些實(shí)施方案中，所述生物相容性聚合物選自聚乙烯醇(PVA)、瓊脂糖和藻酸鹽。在一些實(shí)施方案中，所述交聯(lián)劑包括范圍為約1-50kDa，例如約10-30kDa，例如約15-25kDa，例如約5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa或50kDa的分子量。在一些實(shí)施方案中，X是線性親水性聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖。定義本文使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞粘附基質(zhì)”指模擬胞外微環(huán)境的生理特征和分子特征的三維基質(zhì)培養(yǎng)系統(tǒng)。通過(guò)使用具有至少兩個(gè)官能團(tuán)的交聯(lián)劑以與生物相容性聚合物鏈的兩個(gè)相鄰的官能團(tuán)結(jié)合，使生物相容性聚合物鏈交聯(lián)，從而形成本發(fā)明的細(xì)胞粘附基質(zhì)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“接觸”指使至少兩個(gè)不同的物質(zhì)接觸，從而使它們能夠反應(yīng)的過(guò)程。但是應(yīng)當(dāng)理解，可直接從添加的試劑之間的反應(yīng)，或從可在反應(yīng)混合物中產(chǎn)生的一種或多種添加的試劑的中間產(chǎn)物直接產(chǎn)生所得的反應(yīng)產(chǎn)物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“聚乙烯醇鏈”指聚乙烯醇的聚合物鏈。所述聚乙烯醇鏈可以具有任何分子量，并被更詳細(xì)記載于下文中。本文使用的術(shù)語(yǔ)“交聯(lián)的”指通過(guò)硼酸交聯(lián)劑使多個(gè)生物相容性聚合物鏈彼此相互連接以使它們形成單一結(jié)構(gòu)的狀態(tài)。連接交聯(lián)的單個(gè)生物相容性聚合物鏈的化學(xué)官能度被稱為“交聯(lián)劑”。交聯(lián)劑通常為多功能化合物，其與一條生物相容性聚合物鏈上至少一個(gè)官能團(tuán)反應(yīng)并且與另一條生物相容性聚合物鏈上的一個(gè)反應(yīng)性官能團(tuán)反應(yīng)，從而將兩條生物相容性聚合物鏈相互連接。本發(fā)明的交聯(lián)劑可具有多于兩個(gè)交聯(lián)基團(tuán)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“硼酸交聯(lián)劑”指具有至少兩個(gè)硼酸基團(tuán)的化學(xué)部分，所述硼酸基團(tuán)能夠通過(guò)與生物相容性聚合物鏈上的兩個(gè)相鄰羥基基團(tuán)結(jié)合而交聯(lián)生物相容性聚合物鏈。所述硼酸交聯(lián)劑也可包括具有生物相容性聚合物的接頭(參見本文)。所述硼酸可以是任何硼酸物質(zhì)，例如羧基苯硼酸。本文使用的術(shù)語(yǔ)“接頭”指將羧基苯硼酸基團(tuán)連接在一起的化學(xué)部分?？捎糜诒景l(fā)明的接頭具有生物相容性聚合物。術(shù)語(yǔ)“生物相容性聚合物”指在動(dòng)物中無(wú)毒性的聚合物。生物相容性聚合物的實(shí)例包括但不限于，聚乙二醇、聚丙二醇等?？捎米鹘宦?lián)劑的聚醚聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖?？捎梅种Р糠中揎桺EG和PPG。術(shù)語(yǔ)“分支部分”指通過(guò)一個(gè)官能團(tuán)連接至所述聚醚聚合物并提供用于連接至硼酸基團(tuán)的至少兩個(gè)其他官能團(tuán)的化學(xué)部分。分支部分的實(shí)例包括但不限于，賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。其他分支部分可以是賴氨酸衍生物，其具有羧酸基團(tuán)以及α-胺和ω-胺。其他分支基團(tuán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。附圖說(shuō)明圖1示出了肌肉細(xì)胞結(jié)構(gòu)和環(huán)繞z線以提供結(jié)構(gòu)支持的肋狀體復(fù)合體(上圖中的綠色束)。肋狀體包括抗肌萎縮蛋白-糖蛋白復(fù)合體(DGC)和粘著斑蛋白-踝蛋白-整聯(lián)蛋白復(fù)合體(VTI)。本發(fā)明人的研究示出了從DGC和VTI至一氧化氮合酶1(或nNOS)和一氧化氮合酶3(或eNOS)，以及至Ca2+處理蛋白的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)(MCT)途徑。圖2示出了實(shí)驗(yàn)中使用的Cell-in-Gel系統(tǒng)。連續(xù)灌注溶液以保持水凝膠中的生理?xiàng)l件(pH、溫度、離子環(huán)境等)。使用電場(chǎng)以刺激肌細(xì)胞收縮。使用顯微鏡以在細(xì)胞和分子水平上獲得肌細(xì)胞收縮和機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)事件的圖像。圖3示出了肋狀體中的DGC和VTI復(fù)合體(從Guoetal.,(2011)JournalofMolecularandCellularCardiology.50:606-12修改而得)。圖4示出了PVA-硼酸酯凝膠拴系細(xì)胞表面的聚糖和糖蛋白。圖5示出了PVA-抗生物素蛋白-硼酸酯凝膠能夠拴系細(xì)胞表面的聚糖、糖蛋白、整聯(lián)蛋白和任何目的分子。圖6示出了使用生物素-肽以將細(xì)胞表面分子拴系于PVA-抗生物素蛋白凝膠的示意圖。圖7A-B示出了使用生物素-抗體以將細(xì)胞表面分子拴系于PVA-抗生物素蛋白凝膠的示意圖。生物素綴合的一級(jí)抗體(生物素-一級(jí)抗體)能夠直接結(jié)合至細(xì)胞表面分子。生物素綴合的二級(jí)抗體(生物素-二級(jí)抗體)能夠結(jié)合至一級(jí)抗體，所述一級(jí)抗體直接結(jié)合至細(xì)胞表面分子。圖8A-C示出了使用多種凝膠組合物和生物素-配體以拴系肌細(xì)胞表面上的DGC和VTI的示意圖。圖9A-F示出了從DGC到nNOS和從VTI到eNOS的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)(MCT)。上圖(共聚焦圖像的3D顯示)示出了將機(jī)械應(yīng)力施加到DGC上激活了機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)以產(chǎn)生Ca2+火花(Ca2+spark)(A)；抑制nNOS阻斷了MCT，因此無(wú)火花(B)；抑制eNOS未阻斷MCT，因此火花仍然存在(C)。下圖(共聚焦圖像的2D顯示)示出了將機(jī)械應(yīng)力施加到DGC和VTI上激活了機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)以產(chǎn)生Ca2+火花(D)；僅抑制nNOS不足以阻斷MCT，因此火花仍然存在(E)；同時(shí)抑制nNOS和eNOS阻斷了MCT，因此無(wú)火花(F)。因此，DGC途徑激活了nNOS，而VTI途徑激活了eNOS。圖10A-C示出了Cell-in-Gel裝置的示意圖。圖11A-G示出了在心縮期和心舒期期間對(duì)Ca2+處理的機(jī)械應(yīng)力作用。(A)包埋于包含紅色熒光小珠的3D水凝膠基質(zhì)中的肌細(xì)胞示意圖。(B)肌細(xì)胞和小珠的共聚焦成像證明細(xì)胞收縮和凝膠變形，如在包埋于凝膠中的細(xì)胞邊緣和紅色熒光小珠的運(yùn)動(dòng)中所見。(C)在常規(guī)蒂羅德溶液中的細(xì)胞收縮提供了無(wú)負(fù)荷對(duì)照。(D)在機(jī)械負(fù)荷下凝膠中的細(xì)胞收縮。(E)與無(wú)負(fù)荷對(duì)照(n＝17)相比，凝膠中細(xì)胞收縮的縮短分?jǐn)?shù)(fractionalshortening)(n＝17細(xì)胞)。(F)與無(wú)負(fù)荷對(duì)照(n＝17)相比，凝膠中細(xì)胞的收縮期的Ca2+瞬時(shí)(CaT)峰(n＝17)。(G)在無(wú)負(fù)荷細(xì)胞(n＝18)中、由5％交聯(lián)劑制成的軟凝膠(凝膠5％，n＝9)中、具有7.5％交聯(lián)劑的凝膠(凝膠7.5％，n＝18)中和blebbistatin處理(n＝5)之后，舒張期的Ca2+火花頻率。單因素ANOVA以及Bonferroni事后檢驗(yàn)用于配對(duì)比較：P<0.001***。圖12示出了單獨(dú)的PVA或交聯(lián)劑并未影響肌細(xì)胞收縮。與常規(guī)蒂羅德溶液中的無(wú)負(fù)荷對(duì)照(n＝6細(xì)胞)相比，在PVA(n＝27細(xì)胞)或交聯(lián)劑(CL，n＝8細(xì)胞)中孵育后心肌細(xì)胞的縮短分?jǐn)?shù)(FS)。單因素ANOVA檢驗(yàn)表明無(wú)顯著差異(p＝0.86)。因此單獨(dú)的凝膠組分不改變肌細(xì)胞收縮，表明無(wú)毒性。圖13A-B示出了對(duì)收縮期的Ca2+瞬變和收縮的機(jī)械應(yīng)變作用。使用Fluo-4共聚焦成像測(cè)量肌細(xì)胞收縮和收縮期的Ca2+瞬變(CaT)。示出了在無(wú)負(fù)荷的肌細(xì)胞收縮(n＝18細(xì)胞)中、在由5％交聯(lián)劑制成的軟凝膠(凝膠5％，n＝9)中、在具有7.5％交聯(lián)劑的硬凝膠(凝膠7.5％，n＝18)中和blebbistatin處理之后(n＝5)，CaT峰(A)和縮短分?jǐn)?shù)(FS＝肌原纖維節(jié)長(zhǎng)度改變的百分?jǐn)?shù)(％))。單因素ANOVA以及Bonferroni事后檢驗(yàn)用于配對(duì)比較：P<0.05*，P<0.01**，P<0.001***視為顯著，P>0.05視為不顯著(NS)。圖14A-F示出了對(duì)凝膠中肌細(xì)胞收縮的收縮期Ca2+瞬變和SR負(fù)荷的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。通過(guò)監(jiān)測(cè)起搏之前、期間和之后肌細(xì)胞中的Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)研究機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)的瞬時(shí)反應(yīng)。(A)在起搏之前凝膠中的肌細(xì)胞具有非常少的Ca2+火花；然后，在初始延遲之后(插入a)，在起搏收縮期間發(fā)生大量Ca2+火花(插入b)；當(dāng)起搏停止時(shí)Ca2+火花立即消失(插入c)。(B)在起搏方案過(guò)程中在凝膠中肌細(xì)胞收縮對(duì)比無(wú)負(fù)荷的肌細(xì)胞收縮中的Ca2+火花率。(C)使用Fura-2比值(Rfura)測(cè)量的無(wú)負(fù)荷vs.凝膠中收縮的細(xì)胞中Ca2+瞬變(CaT)的代表性記錄。比例尺：R＝0.5,t＝2s。(D)在凝膠中(n＝29細(xì)胞)的收縮期Ca2+瞬變峰高于無(wú)負(fù)荷(n＝19)。(E)通過(guò)在起搏結(jié)束后以ΔT＝15s施用咖啡因(20mM)以從SR快速釋放Ca2+，來(lái)測(cè)量SR容量(content)。對(duì)于凝膠中細(xì)胞(n＝9)和無(wú)負(fù)荷細(xì)胞(n＝17)而言，SR容量是類似的。(F)與無(wú)負(fù)荷細(xì)胞(n＝19)相比，凝膠中細(xì)胞(n＝29細(xì)胞)的Ca2+瞬變的τ(tau)并未改變。與無(wú)負(fù)荷(n＝17)相比，凝膠中(n＝9)咖啡因誘導(dǎo)的Ca2+瞬變下降的tau更長(zhǎng)。非配對(duì)學(xué)生t檢驗(yàn)：P<0.05*,P<0.001***。圖15A-J示出了在機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)中nNOS與eNOS的差異作用。除非標(biāo)記了無(wú)負(fù)荷，所有示出的數(shù)據(jù)來(lái)自在凝膠中的肌細(xì)胞收縮。(A)野生型(wt)肌細(xì)胞中的Ca2+活動(dòng)。抑制(B)eNOS與(C)nNOS的作用。(D)nNOS-/-肌細(xì)胞無(wú)Ca2+火花。(E)eNOS-/-肌細(xì)胞具有頻繁的Ca2+火花。(F)在eNOS-/-肌細(xì)胞中抑制nNOS遏制了火花。(G)在凝膠中的野生型(wt)肌細(xì)胞收縮中的Ca2+瞬變峰，以及抑制NOS亞型的作用。(H)無(wú)負(fù)荷(n＝18細(xì)胞)、凝膠中(n＝18)的野生型細(xì)胞中Ca2+火花率和抑制劑作用的平均值±SEM，以及L-NAME10mM(n＝9)、L-NPA5μΜ(n＝9)和L-Nio10μΜ(n＝10)的分別作用。(I)nNOS-/-敲除中Ca2+火花率：從左至右的每組為n＝8、10、10、9細(xì)胞。(J)eNOS-/-敲除中Ca2+火花率：從左至右的每組為n＝10、13、6、6細(xì)胞。單因素ANOVA以及Bonferroni事后檢驗(yàn)用于配對(duì)比較：P<0.001***。圖16A-C示出了抑制nNOS或eNOS對(duì)肌細(xì)胞的作用。使用Fura-2比值(Rfura)和肌原纖維節(jié)檢測(cè)法同時(shí)測(cè)量Ca2+瞬變和肌細(xì)胞收縮。在無(wú)負(fù)荷的肌細(xì)胞收縮(n＝22)中、在凝膠中的肌細(xì)胞收縮(n＝18)中，以及使用L-NPA抑制nNOS之后的肌細(xì)胞收縮(n＝7)中或使用L-Nio抑制eNOS之后的肌細(xì)胞收縮(n＝12)中，(A)收縮期Ca2+瞬變(CaT)峰，(B)Ca2+瞬變降低的Tau，以及(C)縮短分?jǐn)?shù)(FS＝肌原纖維節(jié)長(zhǎng)度縮短的百分?jǐn)?shù))。單因素ANOVA檢驗(yàn)表明CaT(p<0.05)、Tau(p<0.01)和FS(p<0.001)中的顯著差異；Bonferroni事后檢驗(yàn)用于凝膠中組與其他組之間的配對(duì)比較：P<0.05*，P<0.01**，P<0.001***視為顯著差異，置信水平為95％。圖17A-D示出了野生型肌細(xì)胞中RyR、nNOS、eNOS的表達(dá)和分布。(A)示出了使用60X水浸物鏡、NA＝1.2、變焦＝10獲得的樣品共聚焦圖像。(B)為nNOS(綠)和RyR(紅)的超分辨率結(jié)構(gòu)光照顯微鏡(SIM)成像，(C)為eNOS(青)和RyR(紅)的超分辨率結(jié)構(gòu)光照顯微鏡(SIM)成像，每組n＝5。(D)nNOS-RyR和eNOS-RyR對(duì)的共定位被描繪為重疊的體元體積(voxelvolume)(bars)。nNOS-RyR和eNOS-RyR之間的分子間距離示出了最接近的鄰近距離的直方圖(概率密度函數(shù)，PDF)(曲線圖)。Mann-Whitney檢驗(yàn)用于比較nNOS-RyR距離與eNOS-RyR距離直方圖，發(fā)現(xiàn)差異顯著，p<0.0001。圖18示出了NO依賴性CaMKII激活。使用Camui傳感器的FRET測(cè)量表明Ca2+/CaM對(duì)野生型、非自磷酸化(T286A)和非氧化(CM280/281VV)突變CaMKII的直接激活(左側(cè)兩組柱)。當(dāng)Ca2+被+EGTA緩沖時(shí)，CaMKII的激活降低(柱被標(biāo)記為NoSNAP)。[SNAP]升高到500μΜ時(shí)觀察到自主CaMKII激活，但升高到50μΜ未觀察到激活。值得注意的是，與磷酸化(T286A)或氧化(CM/VV)相比，SNAP/NO依賴性自主激活并不是次要的，這與直接NO作用一致。每個(gè)柱中n＝6個(gè)樣品。單因素ANOVA以及Bonferroni事后檢驗(yàn)用于配對(duì)比較；p值示出在不同的條件下每對(duì)(相同顏色)之間的差異的顯著性。圖19A-C示出了在健康的心臟中和心肌病中的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)。(A)在體溫下1Hz起搏過(guò)程中，R92Q肌細(xì)胞中Ca2+信號(hào)的樣品圖像，以及抑制nNOS、eNOS、NOX2或CaMKII的作用。(B)比較WT肌細(xì)胞與R92Q肌細(xì)胞中Ca2+火花率。WT：無(wú)負(fù)荷(n＝18細(xì)胞)，Cell-in-Gel(n＝47)，以及藥物對(duì)Cell-in-Gel的作用：L-NPA5μΜ(n＝9)、L-Nio10μΜ(n＝9)、Gp91ds1μΜ(n＝31)、K931μΜ(n＝10)。R92Q：無(wú)負(fù)荷(n＝12)，Cell-in-Gel(n＝20)，以及藥物對(duì)Cell-in-Gel的作用：L-NPA5μΜ(n＝32)、L-Nio10μΜ(n＝12)、Gp91ds1μΜ(n＝16)、KN931μΜ(n＝23)。雙因素ANOVA檢驗(yàn)表明R92Q與WT細(xì)胞株之間自發(fā)Ca2+火花率的顯著差異(p<0.0001)，顯著的藥物作用(p<0.0001)，以及顯著的相互作用(p<0.0001)。Bonferroni事后檢驗(yàn)示出了與無(wú)藥物的Cell-in-Gel相比，對(duì)每種細(xì)胞株的藥物作用的顯著差異(p<0.001***)；也示出了對(duì)于Cell-in-Gel的條件，R92Q中比WT中顯著更高的火花率(p<0.05#)，以及對(duì)于Gp91ds作用，R92Q中比WT中顯著更高的火花率(p<0.001###)。(C)機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的示意圖。圖20A-E示出了用于將單個(gè)肌細(xì)胞包埋于3D彈性基質(zhì)中的PVA-交聯(lián)劑系統(tǒng)。包埋于3DPVA水凝膠基質(zhì)中的肌細(xì)胞的示意圖(Cell-in-Gel)。首先，將細(xì)胞(A)與PVA溶液(B)混合；然后加入4-硼酸酯-PEG交聯(lián)劑(C)。所述硼酸酯使細(xì)胞表面聚糖的順式二醇與PVA凝膠交聯(lián)，從而將細(xì)胞包埋于PVA凝膠中，且細(xì)胞表面拴系于凝膠(D)。(E)該Cell-in-Gel系統(tǒng)允許通過(guò)灌注進(jìn)行溶液交換以研究藥物作用，允許電場(chǎng)刺激以研究肌細(xì)胞的刺激-收縮偶聯(lián)，以及允許顯微鏡成像以研究包埋的肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。通過(guò)包埋的亞微米熒光小珠可追蹤凝膠中的移位。圖21A-C示出了破壞DGC中的指揮鏈(chain-of-command)改變了Ca2+信號(hào)。(A)當(dāng)DGC被拴系時(shí)機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)Ca2+火花；(B)掩蔽DG使Ca2+火花消失；(C)抗肌萎縮蛋白無(wú)效突變也使Ca2+火花消失。圖22A-D示出了DGC和VTI共同形成肋狀體以賦予機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)。有缺陷的DGC使M-C轉(zhuǎn)導(dǎo)失衡。具體實(shí)施方式1.引言本文所述的組合物、裝置、系統(tǒng)、方法和試劑盒增強(qiáng)了對(duì)機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)(MCT)機(jī)制的理解。它們實(shí)現(xiàn)了至少兩種重要的能力：一種是在模擬心肌的3-D環(huán)境中在單細(xì)胞水平上控制機(jī)械應(yīng)力；另一種是在肌細(xì)胞收縮過(guò)程中在特定的細(xì)胞表面機(jī)械傳感器上牽引(tug)。這些技術(shù)能力可用于在細(xì)胞和分子水平上研究MCT機(jī)制。與本發(fā)明的組合物、裝置、系統(tǒng)、方法和試劑盒相比，目前可用的技術(shù)并未同時(shí)具備這兩種能力。本文提供了“Cell-in-Gel”系統(tǒng)以將單個(gè)活細(xì)胞(包括肌細(xì)胞)包埋于模擬體內(nèi)機(jī)械環(huán)境的3D彈性凝膠。該系統(tǒng)以兩種重要的方式區(qū)別于目前所用的技術(shù)。首先，細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)相對(duì)于彈性凝膠收縮，這不僅在細(xì)胞上施加了縱向的張力和橫向的壓縮，還在細(xì)胞表面施加了剪切應(yīng)力和法向應(yīng)力。其次，Cell-in-Gel系統(tǒng)使細(xì)胞表面上的特定機(jī)械傳感器(例如，整聯(lián)蛋白，糖蛋白)能夠拴系于凝膠基質(zhì)，以研究MCT復(fù)合體如何轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)械應(yīng)力以影響胞內(nèi)Ca2+動(dòng)力學(xué)。合成化學(xué)、肌肉力學(xué)，以及細(xì)胞和分子生物學(xué)的多學(xué)科知識(shí)已被結(jié)合起來(lái)以開發(fā)Cell-in-Gel系統(tǒng)并利用一組通用且易用的工具以在單細(xì)胞和分子水平上控制機(jī)械應(yīng)力。還提供了硬件和軟件，以在單細(xì)胞和分子水平上施加機(jī)械應(yīng)力并且研究機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。本發(fā)明人已改造了本發(fā)明的Cell-in-Gel系統(tǒng)，其允許將活的肌細(xì)胞包埋于模擬體內(nèi)環(huán)境的3D彈性水凝膠中。該系統(tǒng)使得能夠在收縮過(guò)程中控制單個(gè)肌細(xì)胞上的機(jī)械應(yīng)力并且監(jiān)測(cè)響應(yīng)于多種應(yīng)力水平的細(xì)胞和分子變化。對(duì)于適用性和通用性，所述Cell-in-Gel系統(tǒng)具有至少以下合乎需要的性質(zhì)(參見圖20)。(a)可使用已知的合成組分(而非含有不純組分的天然產(chǎn)品如基質(zhì)膠或ECM提取物)來(lái)制備所述Cell-in-Gel系統(tǒng)，從而提供明確的化學(xué)性質(zhì)以研究機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞和分子機(jī)制。(b)所述凝膠的化學(xué)組成對(duì)活細(xì)胞無(wú)毒性且不會(huì)損傷活細(xì)胞。分離的心肌細(xì)胞(以及其他肌細(xì)胞)特別脆弱。用于裝配凝膠的化學(xué)組分在生理pH和溫度下無(wú)毒性。這使得能夠使用所述Cell-in-Gel系統(tǒng)來(lái)研究活細(xì)胞功能。(c)可容易且快速地(在幾分鐘內(nèi))將細(xì)胞包埋于凝膠中，使在合理的時(shí)間范圍(幾小時(shí)和幾天之內(nèi))從脆弱的細(xì)胞獲取數(shù)據(jù)是可行的。(d)通過(guò)調(diào)節(jié)凝膠組分和交聯(lián)劑的比值，可容易地調(diào)節(jié)凝膠的剛度(楊氏模量)。這使得能夠精細(xì)調(diào)節(jié)施加到細(xì)胞上的機(jī)械應(yīng)力的水平。(e)所述凝膠基質(zhì)是多孔的以允許用于實(shí)驗(yàn)研究的快速溶液交換和藥物施用。(f)所述凝膠是光學(xué)透明的以允許在顯微鏡上成像。(g)所述凝膠包含允許拴系特定細(xì)胞表面分子的通用的“鉤”，其使得能夠控制不同細(xì)胞表面分子(機(jī)械傳感器等)上的機(jī)械應(yīng)力。研究MCT機(jī)制的主要障礙是缺少實(shí)現(xiàn)兩種重要能力的技術(shù)：一是在模擬心肌的3-D環(huán)境中在單細(xì)胞水平上控制機(jī)械應(yīng)力；另一個(gè)是在肌細(xì)胞收縮過(guò)程中在特定細(xì)胞表面機(jī)械傳感器上牽引以研究其在MCT中的作用。但是，所有目前可用的技術(shù)都無(wú)法同時(shí)具備這兩種能力。所述Cell-in-Gel系統(tǒng)相對(duì)于已存在的技術(shù)(使用碳纖維或玻璃桿拉伸細(xì)胞)具有至少兩個(gè)主要優(yōu)勢(shì)。(1)將活的心肌細(xì)胞包埋于3-D水凝膠(包含交聯(lián)的聚合物的彈性基質(zhì))中，從而它們?cè)谑湛s過(guò)程中經(jīng)受3-D機(jī)械應(yīng)力(縱向張力、橫向壓縮、剪切應(yīng)力)，模擬體內(nèi)環(huán)境。(2)凝膠的化學(xué)性質(zhì)允許將特定細(xì)胞表面機(jī)械傳感器(例如，抗肌萎縮蛋白聚糖、整聯(lián)蛋白)拴系于凝膠基質(zhì)以在細(xì)胞收縮過(guò)程中在所述機(jī)械傳感器上施加機(jī)械應(yīng)力。所述Cell-in-Gel系統(tǒng)使得能夠研究機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體、其下游信號(hào)傳導(dǎo)，以及在活的心肌細(xì)胞和其他細(xì)胞類型中的功能結(jié)果。本發(fā)明人使用Cell-in-Gel系統(tǒng)來(lái)評(píng)估，心肌細(xì)胞中的兩種大分子復(fù)合體——DGC和VTI——轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)械應(yīng)力以調(diào)節(jié)每次心跳的Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，這增強(qiáng)了響應(yīng)于機(jī)械負(fù)荷的Ca2+瞬變和收縮性，但是該相同的機(jī)制也能在過(guò)度負(fù)荷下導(dǎo)致Ca2+失調(diào)。解析該機(jī)制對(duì)于理解心臟如何應(yīng)答于機(jī)械負(fù)荷以自動(dòng)調(diào)節(jié)收縮性，過(guò)度的負(fù)荷如何導(dǎo)致心臟病，以及肌營(yíng)養(yǎng)不良癥中的DGC突變?nèi)绾螌?dǎo)致Ca2+失調(diào)和心功能障礙是重要的。所述Cell-in-Gel系統(tǒng)為研究和開發(fā)用于治療機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的心臟病的有效藥物療法提供了有力的新工具。2.組合物a.通常包封或包埋細(xì)胞的水凝膠通常是生物相容性的，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，不損傷細(xì)胞，不影響細(xì)胞功能并且允許細(xì)胞行使其天然生理學(xué)功能。所述水凝膠還具有允許水凝膠直接或間接地(例如，通過(guò)交聯(lián)劑)結(jié)合至或拴系于細(xì)胞上一個(gè)或多個(gè)表面分子的化學(xué)部分。在不同的實(shí)施方案中，用結(jié)合配偶體對(duì)分子的第一或第二結(jié)合配偶體將所述水凝膠功能化。所述結(jié)合配偶體對(duì)的第一或第二結(jié)合配偶體可直接或間接地(例如，通過(guò)所述結(jié)合配偶體對(duì)的互補(bǔ)配偶體(例如，第一結(jié)合配偶體與第二結(jié)合配偶體互補(bǔ)，并且第二結(jié)合配偶體與第一結(jié)合配偶體互補(bǔ))或與互補(bǔ)結(jié)合配偶體的配體綴合物，其中所述配體結(jié)合至細(xì)胞表面分子)結(jié)合或連接至包封的細(xì)胞。當(dāng)使用結(jié)合配偶體對(duì)的第一或第二結(jié)合配偶體來(lái)功能化時(shí)，所述結(jié)合配偶體分子也可在水凝膠中彼此相連，例如，通過(guò)Y-X-Y交聯(lián)劑，其中X是親水性線性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖)，Y是結(jié)合配偶體對(duì)的第一或第二結(jié)合配偶體。所述3D水凝膠具有剛度，所述剛度模擬體內(nèi)機(jī)械環(huán)境并且允許測(cè)量施加在拴系于或連接于水凝膠上的細(xì)胞上的應(yīng)變和應(yīng)力。b.結(jié)合配偶體對(duì)本領(lǐng)域中已知的任何結(jié)合配偶體對(duì)可用于本文所述的組合物。在不同的實(shí)施方案中，所述結(jié)合配偶體對(duì)選自抗生物素蛋白/生物素、谷胱甘肽/谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)/麥芽糖、組氨酸標(biāo)簽/咪唑+Zn2+，以及萬(wàn)古霉素/D-丙氨酸-D-丙氨酸(DADA)，其中所述結(jié)合配偶體對(duì)的任一成員可以是第一結(jié)合配偶體或第二結(jié)合配偶體。在一些實(shí)施方案中，所述抗生物素蛋白選自抗生物素蛋白、抗生物素蛋白鏈菌素、中性抗生物素蛋白、captavidin，及其混合物。在不同的實(shí)施方案中，所述萬(wàn)古霉素和D-丙氨酸-D-丙氨酸(DADA)是單價(jià)、二價(jià)或三價(jià)的。c.聚合物在不同的實(shí)施方案中，所述水凝膠具有由生物相容性聚合物構(gòu)建的基質(zhì)。通常，可使用的生物相容性聚合物是對(duì)動(dòng)物(特別是哺乳動(dòng)物，特別是對(duì)包封或包埋在凝膠中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞)無(wú)毒性的那些。示例性生物相容性聚合物包括瓊脂糖、藻酸鹽、聚乙烯醇(PVA)、聚醚如聚乙二醇和聚丙二醇，以及纖維素、多糖和聚酯。在不同的實(shí)施方案中，所述聚合物具有化學(xué)部分，其允許拴系于或連接至被包埋的細(xì)胞和/或組成所述凝膠的聚合物分子的內(nèi)部交聯(lián)?？墒褂镁哂腥魏斡糜诠矁r(jià)鍵合或化學(xué)交聯(lián)的功能性部分的生物相容性聚合物。在不同的實(shí)施方案中，所述功能性部分是羥基、二醇(例如，順式二醇)、羧基、氨基、氨基-氧基、疊氮化物或炔烴。在不同的實(shí)施方案中，所述生物相容性聚合物分子具有范圍為約50-150kDa的平均分子量，例如約80-100kDa，例如約50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、110kDa、120kDa、130kDa、140kDa或150kDa。所使用的示例性聚合物和細(xì)胞粘附基質(zhì)包括聚乙烯醇(PVA)，國(guó)際公開號(hào)WO2010/148346中記載的聚合物，瓊脂糖和藻酸鹽。國(guó)際公開號(hào)WO2010/148346出于所有目的在此以引用的方式全文納入本文。對(duì)于使用聚乙烯醇(PVA)的實(shí)施方案，用于水凝膠的聚乙烯醇鏈可以為任何適合的大小。例如，在不同的實(shí)施方案中，所述聚乙烯醇鏈具有約500至約150,000、或約50,000至約150,000、或約75,000至約125,000、或約85,000至約105,000的平均分子量。d.交聯(lián)劑所述水凝膠通常包含交聯(lián)劑分子。可使用任何生物相容性交聯(lián)劑分子。在不同的實(shí)施方案中，所述交聯(lián)劑是二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)的。在不同的實(shí)施方案中，所述交聯(lián)劑將聚合物分子連接至聚合物分子和/或?qū)⒕酆衔锓肿舆B接至或拴系于包埋或包封的細(xì)胞。聚合物分子可通過(guò)所連接的結(jié)合配偶體對(duì)的第一或第二結(jié)合配偶體或通過(guò)其他可用的化學(xué)官能團(tuán)連接。在不同的聚合物中，連接至聚合物的所述結(jié)合配偶體對(duì)的第一或第二結(jié)合配偶體是通過(guò)Y-X-Y交聯(lián)劑連接，其中X是線性親水性聚合物，Y是結(jié)合配偶體對(duì)的互補(bǔ)結(jié)合配偶體。在不同的實(shí)施方案中，聚合物上的抗生物素蛋白分子是通過(guò)生物素-X-生物素交聯(lián)劑連接，其中X是線性親水性聚合物。在不同的實(shí)施方案中，聚合物上的生物素分子是通過(guò)抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交聯(lián)劑連接，其中X是線性親水性聚合物。具有羥基或二醇官能團(tuán)的聚合物可與硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑交聯(lián)，其中X是線性親水性聚合物。在一些實(shí)施方案中，硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑中的硼酸酯選自二硼酸酯、三硼酸酯、四硼酸酯，以及其混合物。在不同的實(shí)施方案中，X指線性親水性聚合物，其選自聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖。討論了所使用的交聯(lián)聚合物，例如在Song,etal.,Bioorganic&MedicinalChemistryLetters14(2004)161-165中，其出于所有目的以引用的方式全文納入本文。在不同的實(shí)施方案中，所述交聯(lián)劑包括范圍為約1-50kDa的分子量，例如約10-30kDa，例如約15-25kDa，例如約5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa或50kDa?？墒褂玫木垡叶季酆衔锟梢允侨魏芜m合的大小。例如，聚乙二醇聚合物可具有約500至約50,000、或約500至約5,000、或約1,500至約2,500的分子量。其他聚乙二醇聚合物是可使用的，包括WO2010/148346中記載的那些。在不同的實(shí)施方案中，所述結(jié)合配偶體對(duì)的第一或第二結(jié)合配偶體的配體綴合物可用于將與細(xì)胞表面上配體特異性結(jié)合的細(xì)胞表面分子拴系于綴合至聚合物的互補(bǔ)結(jié)合配偶體。在不同的實(shí)施方案中，生物素-配體綴合物可用于將與細(xì)胞表面上配體特異性結(jié)合的細(xì)胞表面分子拴系于綴合至聚合物的抗生物素蛋白分子。在不同的實(shí)施方案中，抗生物素蛋白-配體綴合物可用于將與細(xì)胞表面上配體特異性結(jié)合的細(xì)胞表面分子拴系于綴合至聚合物的生物素分子。凝膠的剛度可通過(guò)調(diào)節(jié)交聯(lián)劑與PVA的混合比例來(lái)調(diào)節(jié)。在不同的實(shí)施方案中，聚合物:交聯(lián)劑的重量比(wt./wt.)的范圍為約0.1至約10。在不同的實(shí)施方案中，例如，當(dāng)所述細(xì)胞是肌細(xì)胞時(shí)，聚合物:交聯(lián)劑的重量比(wt./wt.)的范圍為約0.5至約5。具有相對(duì)更高的交聯(lián)劑比例或濃度的水凝膠具有相對(duì)更高的剛度或楊氏模量值。在不同的實(shí)施方案中，所述水凝膠具有范圍為約0.5kPa至約100kPa的剛度或楊氏模量值。在病理?xiàng)l件(例如纖維化或梗塞形成)下，心臟組織的剛度可增加至100kPa或更多。e.配體與所述結(jié)合配偶體對(duì)的第一或第二結(jié)合配偶體的配體綴合物的配體通常是與細(xì)胞表面分子結(jié)合的配體，以允許將所選擇的細(xì)胞表面分子栓系于水凝膠。在不同的實(shí)施方案中，所述配體選自多肽、線性肽、環(huán)化肽、肽模擬物、抗原結(jié)合分子(例如，納米抗體、Adnectin、Avimer、Anticalin、抗體模擬物等)、抗體、抗體片段(例如，F(xiàn)ab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、雙體抗體(diabody)、單鏈Fv(scFv)分子、僅包含一個(gè)輕鏈可變區(qū)的單鏈多肽、包含輕鏈可變區(qū)的3個(gè)CDR的單鏈多肽、僅包含一個(gè)重鏈可變區(qū)的單鏈多肽和包含重鏈可變區(qū)的3個(gè)CDR的單鏈多肽)、碳水化合物或結(jié)合于細(xì)胞表面的任何其他分子。在不同的實(shí)施方案中，所述配體結(jié)合于整聯(lián)蛋白、糖蛋白或聚糖。例如，所述配體可結(jié)合于選自α3β1整聯(lián)蛋白、α4β1整聯(lián)蛋白和ανβ3整聯(lián)蛋白的整聯(lián)蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述配體是選自膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白、纖維蛋白原、玻連蛋白、VCAM-1和鈣粘著蛋白及其子序列的多肽。在不同的實(shí)施方案中，所述配體是結(jié)合于細(xì)胞表面分子的抗體。在不同的實(shí)施方案中，與所述結(jié)合配偶體對(duì)的第一或第二結(jié)合配偶體的綴合物中的配體是結(jié)合于一級(jí)抗體的二級(jí)抗體，所述一級(jí)抗體結(jié)合于或被結(jié)合于細(xì)胞上的細(xì)胞表面分子。在不同的實(shí)施方案中，所述配體是結(jié)合于整聯(lián)蛋白的肽。在一些實(shí)施方案中，所述配體可以是細(xì)胞粘附配體，例如肽、蛋白質(zhì)、肽模擬物或抗體，或報(bào)告底物如熒光底物。適用的細(xì)胞粘附配體的實(shí)例包括但不限于RGD配體、LXY3、MSE、HYD1和LLP-2A。這些配體和其他適用于本發(fā)明的配體結(jié)合于不同的整聯(lián)蛋白類型，包括α6β1、α3β1、α4β1、α3β1、ανβ3、α1、α2及其他?？墒褂玫钠渌纠噪挠涊d于，例如Xiaoetal.,MolecularCancerTherapeutics.(2010)9:2714-23；Yao,etal.,JournalofMedicinalChemistry.(2009)52:126-33；Peng,etal.,NatChemBiol.(2006)2:381-9；Pennington,etal.,MolecularDiversity(1996)2:19-28；DeRoock,etal.,CancerResearch,(2001)61:3308-3313；Park,etal.,LettersinPeptideScience,(2002)8:171-178；Aina,etal.,MolecularCancerTherapeutics,(2005)4:806-813；Aina,etal.,MolecularImaging,(2005)4:439-447；Liu,Biopolymers(PeptideScience)(2006)84:595-604；Carpenter,etal.,JournalofCombinatorialChemistry,(2006)8:907-914；Aina,etal.,MolecularPharm.(2007)4:631-651,2007；Carpenter,etal.,JMedicinalChemistry.(2007)50:5863-5867；Peng,etal.,MolecularCancerTherapeutics.(2008)7:432-437；Luo,etal.,JournalofCombinatorialChemistry,(2008)10:599-604；Xiao,etal.,EuropeanJournalofNuclearMedicineandMolecularImaging,(2008)36:94-103；Yao,etal.,JMedChem(2009)52:126-133；Yao,etal.,JMedChem.52:6744-6751；Carpenter,etal.,CancerResearch.(2010)70:5448-556；Zhang,etal.,UrolOncol.(2012)30(5):635-45；Aina,etal.,VetImmunolImmunopathol.(2011)143:11-19；Zwingenberger,etal.,VetImmunolImmunopathol.(2012)145:298-304；Zwingenberger,etal.,PLosOne,(2012)7(4):e34404和Lin,etal.,IntJNanomedicine.(2012)7:2793-804中。所有以上列出的出版物出于所有目的以引用的方式全文納入本文。3.產(chǎn)生Cell-in-Gel組合物的方法本申請(qǐng)還提供了將細(xì)胞包封并拴系于水凝膠，從而使細(xì)胞保持活力和功能性(例如，通過(guò)細(xì)胞表面受體的信號(hào)傳導(dǎo)，收縮性)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞表面蛋白(例如，整聯(lián)蛋白)拴系于水凝膠，而不拴系聚糖。在不同的實(shí)施方案中，所述方法使：(1)與所述結(jié)合配偶體對(duì)的第一或第二結(jié)合配偶體的配體綴合物和細(xì)胞結(jié)合，其中所述配體綴合物結(jié)合于所述配體的結(jié)合配偶體；(2)第一結(jié)合配偶體或第二結(jié)合配偶體的配體綴合物與所述結(jié)合配偶體對(duì)的互補(bǔ)結(jié)合配偶體結(jié)合；以及(3)所述第一或第二結(jié)合配偶體與Y-X-Y交聯(lián)劑交聯(lián)，其中X是親水性線性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖)，Y是互補(bǔ)結(jié)合配偶體。在不同的實(shí)施方案中，所述方法使：(1)生物素-配體綴合物與細(xì)胞結(jié)合，其中所述生物素-配體綴合物結(jié)合于所述配體的配體結(jié)合配偶體；(2)抗生物素蛋白分子與生物素-配體綴合物結(jié)合；以及(3)抗生物素蛋白分子與生物素-X-生物素交聯(lián)劑交聯(lián)，其中X是親水性線性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖)。在不同的實(shí)施方案中，所述方法使：(1)抗生物素蛋白-配體綴合物與細(xì)胞結(jié)合，其中所述抗生物素蛋白-配體綴合物結(jié)合于與所述配體的配體結(jié)合配偶體；(2)生物素分子與抗生物素蛋白-配體綴合物結(jié)合；以及(3)生物素分子與抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交聯(lián)劑交聯(lián)，其中X是親水性線性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖)。在不同的實(shí)施方案中，產(chǎn)生具有以上構(gòu)型的Cell-in-Gel需要進(jìn)行以下步驟：(a)使細(xì)胞(例如，肌細(xì)胞)與結(jié)合配偶體對(duì)的第一或第二結(jié)合配偶體的配體綴合物接觸，接觸條件為足以使第一結(jié)合配偶體結(jié)合于細(xì)胞表面上所述配體的配體結(jié)合配偶體；(b)使結(jié)合于第一或第二結(jié)合配偶體的配體綴合物的細(xì)胞與互補(bǔ)結(jié)合配偶體接觸，接觸條件為使互補(bǔ)結(jié)合配偶體與第一或第二結(jié)合配偶體的配體綴合物的生物素結(jié)合；(c)使包含第一結(jié)合配偶體/第二結(jié)合配偶體-配體綴合物/細(xì)胞的復(fù)合體與Y-X-Y交聯(lián)劑接觸，接觸條件為足以使Y-X-Y交聯(lián)劑交聯(lián)第一結(jié)合配偶體并形成水凝膠——其中單個(gè)細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)被包埋于凝膠基質(zhì)中，并且細(xì)胞表面受體結(jié)合配偶體拴系于第一結(jié)合配偶體的凝膠，，其中X是親水性線性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖)，Y是第二結(jié)合配偶體。在不同的實(shí)施方案中，具有產(chǎn)生以上構(gòu)型的Cell-in-Gel需要進(jìn)行以下步驟：(a)使細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)與生物素-配體綴合物接觸，接觸條件為足以使生物素-配體結(jié)合于細(xì)胞表面上所述配體的配體結(jié)合配偶體；(b)使結(jié)合于生物素-配體綴合物細(xì)胞與抗生物素蛋白接觸，接觸條件為使抗生物素蛋白與生物素-配體綴合物的生物素結(jié)合；(c)使包含抗生物素蛋白/生物素-配體綴合物/細(xì)胞的復(fù)合體與生物素-X-生物素交聯(lián)劑接觸，接觸條件為足以使生物素-X-生物素交聯(lián)劑交聯(lián)抗生物素蛋白并形成水凝膠——其中單個(gè)細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)被包埋于凝膠基質(zhì)中并且細(xì)胞表面配體結(jié)合配偶體拴系于抗生物素蛋白凝膠，其中X是親水性線性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖)。在不同的實(shí)施方案中，產(chǎn)生具有以上構(gòu)型的Cell-in-Gel需要進(jìn)行以下步驟：(a)使細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)與生物素-配體綴合物接觸，接觸條件為足以使生物素-配體結(jié)合于細(xì)胞表面上配體的配體結(jié)合配偶體；(b)使結(jié)合于生物素-配體綴合物的細(xì)胞與抗生物素蛋白接觸，接觸條件為使抗生物素蛋白結(jié)合于生物素-配體綴合物的生物素；(c)使包含抗生物素蛋白/生物素-配體綴合物/細(xì)胞的復(fù)合體與生物素-X-生物素交聯(lián)劑接觸，接觸條件為足以使生物素-X-生物素交聯(lián)劑交聯(lián)抗生物素蛋白并形成水凝膠——其中單個(gè)細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)被包埋于凝膠基質(zhì)中并且細(xì)胞表面配體結(jié)合配偶體拴系于抗生物素蛋白凝膠，其中X是親水性線性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖)。在不同的實(shí)施方案中，產(chǎn)生具有以上構(gòu)型的Cell-in-Gel需要進(jìn)行以下步驟：(a)使細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)與抗生物素蛋白-配體綴合物接觸，接觸條件為足以使抗生物素蛋白-配體結(jié)合于細(xì)胞表面上配體的配體結(jié)合配偶體；(b)使結(jié)合于抗生物素蛋白-配體綴合物的細(xì)胞與生物素接觸，接觸條件為使生物素結(jié)合于抗生物素蛋白-配體綴合物的生物素；(c)使包含生物素/抗生物素蛋白-配體綴合物/細(xì)胞的復(fù)合體與抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交聯(lián)劑接觸，接觸條件為足以使抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交聯(lián)劑交聯(lián)生物素并形成水凝膠——其中單個(gè)細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)被包埋于凝膠基質(zhì)中并且細(xì)胞表面配體結(jié)合配偶體拴系于生物素凝膠，其中X是親水性線性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖)。通常，包含結(jié)合配偶體對(duì)的交聯(lián)的結(jié)合配偶體的水凝膠不拴系細(xì)胞表面聚糖，因此可用于選擇性地拴系合乎需要的細(xì)胞表面分子(例如，不是聚糖的那些)，這取決于所使用的第一或第二結(jié)合配偶體的配體綴合物所結(jié)合的配體結(jié)合配偶體。在以上實(shí)施方案中，抗生物素蛋白-生物素水凝膠不拴系細(xì)胞表面聚糖，因此可用于選擇性地拴系合乎需要的細(xì)胞表面分子(例如，不是聚糖的那些)，這取決于所使用的生物素-配體綴合物或抗生物素蛋白-配體綴合物所結(jié)合的配體結(jié)合配偶體?？股锼氐鞍拙哂?個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)。因此，當(dāng)將抗生物素蛋白與生物素-X-生物素交聯(lián)劑混合時(shí)或當(dāng)將生物素與抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交聯(lián)劑混合時(shí)，形成凝膠基質(zhì)。當(dāng)將生物素-配體綴合物或抗生物素蛋白-配體綴合物添加到預(yù)制成的凝膠中時(shí)，所述配體綴合物將分別連接抗生物素蛋白或生物素分子以將配體展示在凝膠基質(zhì)上?；蛘撸赏瑫r(shí)將抗生物素蛋白、生物素-X-生物素交聯(lián)劑和生物素-配體綴合物全部混合在一起以形成裝飾有配體的凝膠。類似地，可同時(shí)將生物素、抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交聯(lián)劑和抗生物素蛋白-配體綴合物全部混合在一起以形成裝飾有配體的凝膠。在下文概述的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗生物素蛋白或生物素也可共價(jià)連接至生物相容性聚合物(例如，聚乙烯醇)。在這種情況下，所述生物相容性聚合物與生物素-X-生物素或抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交聯(lián)劑一起作為三維凝膠基質(zhì)骨架?？赏ㄟ^(guò)混合不同比例的生物相容性聚合物(如果包括的話)、交聯(lián)劑和抗生物素蛋白(或生物素)，容易地調(diào)節(jié)和調(diào)整水凝膠的性質(zhì)。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，細(xì)胞表面蛋白(例如整聯(lián)蛋白)和細(xì)胞表面聚糖同時(shí)拴系于聚合物-第一或第二結(jié)合配偶體-硼酸酯水凝膠。所述聚合物-第一或第二結(jié)合配偶體-硼酸酯水凝膠包括：(1)與第一結(jié)合配偶體綴合的生物相容性聚合物；(2)硼酸酯交聯(lián)劑；和(3)第二結(jié)合配偶體-配體綴合物。在不同的實(shí)施方案中，產(chǎn)生具有以上構(gòu)型的Cell-in-Gel需要進(jìn)行以下步驟：(a)使細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)與第一或第二結(jié)合配偶體的配體綴合物接觸，接觸條件為足以使結(jié)合配偶體-配體結(jié)合于細(xì)胞表面上所述配體的結(jié)合配偶體；(b)使結(jié)合至第二結(jié)合配偶體-配體綴合物的細(xì)胞與聚合物-第一結(jié)合配偶體綴合物接觸，接觸條件為足以使第一結(jié)合配偶體結(jié)合至第二結(jié)合配偶體-配體綴合物的第二結(jié)合配偶體；(c)使包含聚合物-第一結(jié)合配偶體/第二結(jié)合配偶體-配體綴合物/細(xì)胞的復(fù)合體與硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑接觸，接觸條件為足以使硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑交聯(lián)聚合物和細(xì)胞并形成水凝膠——其中單個(gè)細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)被包埋于凝膠基質(zhì)中并且細(xì)胞表面配體結(jié)合配偶體拴系于聚合物-第一結(jié)合配偶體，其中X是親水性線性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖)。在不同的實(shí)施方案中，產(chǎn)生具有以上構(gòu)型的Cell-in-Gel需要進(jìn)行以下步驟：(a)使細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)與生物素-配體綴合物接觸，接觸條件為足以使生物素-配體結(jié)合于細(xì)胞表面上所述配體的配體結(jié)合配偶體；(b)使結(jié)合于生物素-配體綴合物的細(xì)胞和聚合物-抗生物素蛋白綴合物接觸，接觸條件為足以允許抗生物素蛋白結(jié)合于生物素-配體綴合物的生物素；(c)使包含聚合物-抗生物素蛋白/生物素-配體綴合物/細(xì)胞的復(fù)合體與硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑接觸，接觸條件為足以使硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑交聯(lián)聚合物和細(xì)胞并形成水凝膠——其中單個(gè)細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)被包埋于凝膠基質(zhì)中并且細(xì)胞表面配體結(jié)合配偶體拴系于聚合物-抗生物素蛋白，其中X是親水性線性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖)。在不同的實(shí)施方案中，產(chǎn)生具有以上構(gòu)型的Cell-in-Gel需要進(jìn)行以下步驟：(a)使細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)與抗生物素蛋白-配體綴合物接觸，接觸條件為足以使生物素-配體結(jié)合于細(xì)胞表面上所述配體的配體結(jié)合配偶體；(b)使結(jié)合于抗生物素蛋白-配體綴合物的細(xì)胞與聚合物-生物素綴合物接觸，接觸條件為足以允許生物素結(jié)合于抗生物素蛋白-配體綴合物的抗生物素蛋白；(c)使包含聚合物-生物素/抗生物素蛋白-配體綴合物/細(xì)胞的復(fù)合體與硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑接觸，接觸條件為足以使硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑交聯(lián)聚合物和細(xì)胞并形成水凝膠——其中單個(gè)細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)被包埋于凝膠基質(zhì)中并且細(xì)胞表面配體結(jié)合配偶體拴系于聚合物-生物素，其中X是親水性線性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖和線性低聚糖)。在不同的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞被懸浮于pH的范圍為7.2<pH<7.4的生理鹽水(例如，標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽緩沖鹽水或蒂羅德溶液)中，并且在4-37℃(例如，在20-25℃的室溫或36-37℃的體溫)的溫度范圍中與生物素-配體一起被孵育約20-30分鐘。硼酸酯(例如，二價(jià)、三價(jià)和/或四價(jià)的)自發(fā)結(jié)合于聚合物-抗生物素蛋白或聚合物-生物素中的官能團(tuán)(例如，二醇)以形成水凝膠，其中單個(gè)細(xì)胞(例如，肌細(xì)胞)被包埋于凝膠基質(zhì)中。通過(guò)硼酸酯結(jié)合至聚糖和聚合物中的順式二醇，細(xì)胞表面聚糖也被拴系于凝膠。通過(guò)生物素-配體或抗生物素蛋白-配體分別結(jié)合至凝膠中的抗生物素蛋白或生物素“鉤”，細(xì)胞表面蛋白(例如，整聯(lián)蛋白)或任何其他分子也可被拴系于凝膠。因此具有抗生物素蛋白鉤的聚合物-抗生物素蛋白-硼酸酯水凝膠或具有生物素鉤的聚合物-生物素-硼酸酯水凝膠提供了用于單獨(dú)地或共同地栓系任何細(xì)胞表面分子的通用系統(tǒng)?？蛇x擇生物素-配體或抗生物素蛋白-配體綴合物的配體以結(jié)合于任何目的細(xì)胞表面分子。在不同的實(shí)施方案中，細(xì)胞表面配體結(jié)合配偶體是整聯(lián)蛋白。不同的整聯(lián)蛋白結(jié)合至胞外基質(zhì)中不同的粘附配偶體。因此，生物素-配體綴合物和抗生物素蛋白-配體綴合物可作為胞外基質(zhì)中粘附分子的替代物而發(fā)揮作用。4.裝置、系統(tǒng)和試劑盒a.裝置本申請(qǐng)還提供了包括上述和本文所述的組合物的裝置。在不同的實(shí)施方案中，所述裝置包括一個(gè)或多個(gè)灌注室中的一個(gè)或多個(gè)Cell-in-Gel膠囊(capsule)。所述一個(gè)或多個(gè)灌注室被灌注了適合于被包封或包埋的細(xì)胞的生物相容性、等滲溶液，并且相互流體連通。在不同的實(shí)施方案中，例如當(dāng)被包封或包埋的細(xì)胞是肌細(xì)胞時(shí)，使用改良的蒂羅德溶液——其包括用于替代葡萄糖的丙酮酸——來(lái)灌注在灌注室中的Cell-in-Gel膠囊。在不同的實(shí)施方案中，所述改良的蒂羅德溶液包括低于50μΜ的Ca2+濃度，這允許了松弛態(tài)的肌細(xì)胞。通常，細(xì)胞的整個(gè)表面被包封或包埋在水凝膠中，以使細(xì)胞外表面不與裝置的固體表面(例如，灌注室的內(nèi)表面)或水凝膠內(nèi)部的另一細(xì)胞接觸。在不同的實(shí)施方案中，固定夾具用于將Cell-in-Gel膠囊固定在所述裝置上，例如，如圖10所示。所述固定夾具可以是包埋于凝膠中的梳狀?yuàn)A具，或凝膠膠囊周圍的彈性膜。當(dāng)用于牽拉凝膠時(shí)，凝膠中的梳狀?yuàn)A具允許在整個(gè)凝膠中實(shí)現(xiàn)幾乎均一的應(yīng)變場(chǎng)。在不同的實(shí)施方案中，所述Cell-in-Gel膠囊在至少兩個(gè)方向上(例如，在2、4或6個(gè)方向上，例如沿著x、y和/或z軸)被栓系?？赏ㄟ^(guò)固定夾具恰當(dāng)?shù)刈プell-in-Gel膠囊，然后將其固定在微操控器和力傳感器之間。通過(guò)微操控器控制Cell-in-Gel膠囊上的機(jī)械負(fù)荷，并通過(guò)力傳感器進(jìn)行監(jiān)測(cè)。因此，在不同的實(shí)施方案中，所述裝置包括能夠牽拉凝膠的固定夾具，從而在凝膠和被包封在凝膠中的細(xì)胞上引入機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力。在不同的實(shí)施方案中，所述凝膠在由電刺激器控制的電場(chǎng)內(nèi)，所述電刺激器將電信號(hào)施加到包封于凝膠中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。在不同的實(shí)施方案中，在不同的實(shí)施方案中，所述裝置可還包括成像系統(tǒng)(例如，用于捕獲細(xì)胞圖像)和/或計(jì)算機(jī)(例如，用于記錄施加在細(xì)胞和凝膠上的機(jī)械應(yīng)變和應(yīng)力和/或用于記錄細(xì)胞圖像)。b.系統(tǒng)在不同的實(shí)施方案中，可將相互間流體連通的多個(gè)裝置放大以構(gòu)建高通量篩選系統(tǒng)(例如，試驗(yàn)化合物(例如藥物)的系統(tǒng))，以尋找影響肌細(xì)胞機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)的新藥。在不同的實(shí)施方案中，所述高通量Cell-in-Gel系統(tǒng)包含以下組分。(a)處于流體連通的兩個(gè)或多個(gè)(例如，6、8、24、48、96、192、384個(gè))Cell-in-Gel膠囊的陣列。在不同的實(shí)施方案中，所述陣列可以是一維(例如，線性的)或二維排列。(b)通過(guò)每個(gè)Cell-in-Gel膠囊的一個(gè)或多個(gè)灌注通道；(c)任選地，電刺激器(例如，以起搏凝膠包封的肌細(xì)胞來(lái)經(jīng)歷刺激-Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)-收縮)；(d)任選地，裝備有激發(fā)光源、濾光器和發(fā)射光檢測(cè)器的成像系統(tǒng)；(e)任選地，模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器和計(jì)算機(jī)以記錄成像數(shù)據(jù)；和/或(f)任選地，可用于控制Cell-in-Gel膠囊的試驗(yàn)化合物灌注、數(shù)據(jù)采集、圖像存儲(chǔ)和數(shù)據(jù)分析的計(jì)算機(jī)。因此，本申請(qǐng)還提供了包括本文所述的組合物和/或裝置的系統(tǒng)。在不同的實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包括：i)一個(gè)或多個(gè)灌注室，每個(gè)灌注室包括組合物，其包括本文所述的Cell-in-Gel膠囊。在不同的實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)灌注室處于流體連通。在不同的實(shí)施方案中，灌注溶液包括本文所述的改良的蒂羅德溶液。ii)與凝膠接觸的第一和第二固定夾具，其中所述第一和第二夾具能在至少兩個(gè)維度上在凝膠上引入張力。在不同的實(shí)施方案中，所述第一和第二夾具在完全相反的方向上引入張力。iii)與力傳感器連通的計(jì)算機(jī)，其中所述計(jì)算機(jī)能夠存儲(chǔ)由力傳感器感知的機(jī)械張力讀數(shù)。在不同的實(shí)施方案中，對(duì)所述計(jì)算機(jī)進(jìn)行編程以控制和/或管理施加到灌注室的試驗(yàn)刺激。iv)任選地，能夠捕獲被包封在凝膠中的細(xì)胞的圖像的成像系統(tǒng)，其中所述成像系統(tǒng)與所述力傳感器和計(jì)算機(jī)之一或二者同時(shí)連通。v)任選地，電刺激器，其將電信號(hào)施加到包封于凝膠中的細(xì)胞。c.試劑盒本申請(qǐng)還提供了試劑盒。在不同的實(shí)施方案中，可從試劑盒提供的組分來(lái)包裝用于組裝Cell-in-Gel組合物的組分。在一個(gè)考慮到的實(shí)施方案中，所述試劑盒包括：i)包含生物相容性聚合物的溶液，所述生物相容性聚合物與結(jié)合配偶體對(duì)的第一結(jié)合配偶體綴合；和ii)包含Y-X-Y交聯(lián)劑的溶液；其中X是線性親水性聚合物，Y是結(jié)合配偶體對(duì)的第二結(jié)合配偶體。在一個(gè)考慮到的實(shí)施方案中，所述試劑盒包括：i)包含生物相容性聚合物的溶液，所述生物相容性聚合物與抗生物素蛋白綴合；和ii)包含生物素-X-生物素交聯(lián)劑的溶液；其中X是線性親水性聚合物。在一個(gè)考慮到的實(shí)施方案中，所述試劑盒包括：i)包含生物相容性聚合物的溶液，所述生物相容性聚合物與生物素綴合；和ii)包含抗生物素蛋白-X-抗生物素蛋白交聯(lián)劑的溶液；其中X是線性親水性聚合物。在不同的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括含有生物素-配體綴合物或抗生物素蛋白-配體綴合物的溶液。聚合物、抗生物素蛋白、生物素、交聯(lián)劑、生物素-配體綴合物和抗生物素蛋白-配體綴合物的其他實(shí)施方案如上文和本文所述。該試劑盒的組分適用于包封或包埋和拴系細(xì)胞表面聚糖以及任何其他細(xì)胞表面分子。在一個(gè)考慮到的實(shí)施方案中，所述試劑盒包括：i)包含生物相容性聚合物的溶液，所述生物相容性聚合物與抗生物素蛋白綴合；和ii)包含硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑的溶液；其中X是線性親水性聚合物。在一個(gè)考慮到的實(shí)施方案中，所述試劑盒包括：i)包含生物相容性聚合物的溶液，所述生物相容性聚合物與生物素綴合；和ii)包含硼酸酯-X-硼酸酯交聯(lián)劑的溶液；其中X是線性親水性聚合物。在不同的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包括含有生物素-配體綴合物或抗生物素蛋白-配體綴合物的溶液。聚合物、抗生物素蛋白、生物素、交聯(lián)劑、生物素-配體綴合物和抗生物素蛋白-配體綴合物的其他實(shí)施方案如上文和本文所述。該試劑盒的組分適用于拴系任何細(xì)胞表面分子而不拴系聚糖。所述試劑盒可還包含用于組裝和使用所述Cell-in-Gel組合物的說(shuō)明書。測(cè)量細(xì)胞機(jī)械應(yīng)變和應(yīng)力的方法本申請(qǐng)還提供了監(jiān)測(cè)和測(cè)量細(xì)胞上的機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力的方法，包括：a)將細(xì)胞包封在組合物中，如上文和本文所述；b)獲得細(xì)胞上的機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力的第一測(cè)量值；c)將細(xì)胞暴露于試驗(yàn)刺激；d)獲得細(xì)胞上的機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力的第二測(cè)量值；和e)比較第一次和第二次測(cè)量值。在不同的實(shí)施方案中，可在將細(xì)胞暴露于試驗(yàn)刺激之前和/或之后在凝膠上施加機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力。一種在凝膠上引入機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力的技術(shù)是牽拉凝膠，例如，使用本文所述的固定夾具。凝膠中的梳狀?yuàn)A具將材料向內(nèi)拉并稍微平移，這是獲得在整個(gè)凝膠中的近乎均一的應(yīng)變場(chǎng)的方法。視情況或所需，可同時(shí)或連續(xù)地在1、2、3、4、5或6個(gè)方向上牽拉凝膠?？赏ㄟ^(guò)梳狀?yuàn)A具抓住Cell-in-Gel膠囊，然后將其固定在微操控器和力傳感器之間。通過(guò)微操控器控制Cell-in-Gel膠囊上的機(jī)械負(fù)荷，并通過(guò)力傳感器進(jìn)行監(jiān)測(cè)?？赏ㄟ^(guò)使用微操控器在細(xì)胞上施加機(jī)械預(yù)負(fù)荷以拉伸Cell-in-Gel膠囊；通過(guò)拉伸或牽引凝膠的程度來(lái)控制預(yù)負(fù)荷水平。通過(guò)使用電場(chǎng)在細(xì)胞上施加機(jī)械后負(fù)荷以刺激Cell-in-Gel膠囊中的肌細(xì)胞收縮；通過(guò)凝膠的剛度來(lái)控制后負(fù)荷水平。將牽拉與收縮相結(jié)合，同時(shí)在細(xì)胞上施加預(yù)負(fù)荷和后負(fù)荷。因此，該系統(tǒng)允許控制單個(gè)細(xì)胞上的機(jī)械預(yù)負(fù)荷和后負(fù)荷。在不同的實(shí)施方案中，測(cè)量肌細(xì)胞(例如，心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞)上的機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力。在不同的實(shí)施方案中，測(cè)量肌細(xì)胞收縮。在不同的實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)刺激是物理的、化學(xué)的或藥理學(xué)的刺激。在不同的實(shí)施方案中，細(xì)胞上機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力的第一和/或第二測(cè)量值記錄于計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中。使用本領(lǐng)域已知的方法可測(cè)量和定量細(xì)胞上的機(jī)械應(yīng)變和/或應(yīng)力。一種這樣的方法包括使用3DCell-in-Gel系統(tǒng)的數(shù)學(xué)建模，并且記載于Shaw,etal.,PLoSOne.(2013)8(10):e75492)。實(shí)施例下列實(shí)施例用于舉例說(shuō)明，而不是限定所要求保護(hù)的發(fā)明。實(shí)施例1用于將細(xì)胞包埋在3D彈性基質(zhì)中和拴系細(xì)胞表面分子的Cell-in-Gel系統(tǒng)1.1設(shè)計(jì)凝膠組合物以拴系不同類型的細(xì)胞表面分子在體內(nèi)，將細(xì)胞表面粘附至胞外基質(zhì)(ECM)上。細(xì)胞表面上的機(jī)械傳感器通常連接于胞外基質(zhì)中其粘附配偶體上。在心肌細(xì)胞中，例如，環(huán)繞z盤以提供結(jié)構(gòu)支撐的肋狀體包含抗肌萎縮蛋白-糖蛋白復(fù)合體(DGC)和粘著斑蛋白-踝蛋白-整聯(lián)蛋白復(fù)合體(VTI)。如圖3所示，DGC中的細(xì)胞表面分子為抗肌萎縮蛋白聚糖和肌聚糖(sarcoglycan)(其連接至胞外基質(zhì)中的層粘連蛋白和膠原上)；VTI中的細(xì)胞表面分子為整聯(lián)蛋白(其連接至胞外基質(zhì)中的纖連蛋白、纖維蛋白原、玻連蛋白等)(Guo,etal.,JournalofMolecularandCellularCardiology.(2011)50:606-12；Campbell,Cell.(1995)80:675-9；和Anastasi,IntJMolMed.(2009)23:149-59)。這些細(xì)胞表面分子用作胞外基質(zhì)和胞內(nèi)細(xì)胞骨架(以及在肌細(xì)胞的情況下的肌絲)之間的結(jié)構(gòu)連接。這些細(xì)胞表面分子還用作機(jī)械傳感器以便通過(guò)其大分子復(fù)合體和下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活機(jī)械-化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本發(fā)明人已設(shè)計(jì)了凝膠組合物以拴系不同類型的細(xì)胞表面分子，其能夠施加機(jī)械應(yīng)力于特定的分子上以研究它們對(duì)機(jī)械應(yīng)力的應(yīng)答和下游機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。本文中，本發(fā)明人記載了三種不同的用于拴系多種細(xì)胞表面分子(其包括聚糖、整聯(lián)蛋白和任何其他普通的分子)的凝膠組合物。1.2用于拴系細(xì)胞表面聚糖的PVA-硼酸酯凝膠組合物用于拴系細(xì)胞表面聚糖的基礎(chǔ)PVA-硼酸酯凝膠組合物記載于國(guó)際公開WO2010/148346中。盡管該凝膠原本設(shè)計(jì)為維持3D支架中癌細(xì)胞生長(zhǎng)，但其化學(xué)性質(zhì)還可用于將聚糖結(jié)合至PVA凝膠中。因此本發(fā)明人應(yīng)用它將細(xì)胞(包括心肌細(xì)胞)包埋在凝膠中并拴系細(xì)胞表面聚糖(例如DGC的抗肌萎縮蛋白聚糖、肌聚糖)。PVA-硼酸酯凝膠(圖4)包括兩部分：未衍生化的聚乙烯醇(PVA)和四價(jià)4-硼酸酯-PEG交聯(lián)劑。在混合兩種組分時(shí)，在室溫下1-3分鐘內(nèi)硼酸酯自發(fā)地結(jié)合在PVA的羥基基團(tuán)上以形成PVA水凝膠。該系統(tǒng)可用于通過(guò)下列步驟產(chǎn)生Cell-in-Gel的膠囊：首先將新鮮分離的細(xì)胞(例如心肌細(xì)胞)懸浮在PVA溶液中，然后加入交聯(lián)劑以形成具有包埋在凝膠基質(zhì)中的單個(gè)肌細(xì)胞的PVA水凝膠。凝膠的剛度可通過(guò)調(diào)節(jié)交聯(lián)劑和PVA的混合比來(lái)調(diào)整。因此，本發(fā)明人可設(shè)計(jì)具有所需可變剛度(例如約0.5kPa至約50kPa)的彈性凝膠以模擬用于細(xì)胞的多種病理-生理環(huán)境。所述凝膠還可通過(guò)添加山梨糖醇(或其他糖)可逆地溶于浴溶液(bathsolution)中以競(jìng)爭(zhēng)掉并洗去交聯(lián)劑。1.3用于拴系細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白的抗生物素蛋白-生物素凝膠組合物為了拴系細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白而不拴系聚糖，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了包括三部分的抗生物素蛋白-生物素凝膠：抗生物素蛋白、生物素-PEG-生物素交聯(lián)劑和生物素-配體(整聯(lián)蛋白結(jié)合配體)。該實(shí)施方案可通過(guò)下列步驟產(chǎn)生Cell-in-Gel構(gòu)型：(a)用生物素-配體(其結(jié)合于所選的整聯(lián)蛋白亞型上)孵育細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)；(b)將細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)懸浮在抗生物素蛋白溶液中；(c)添加生物素-PEG-生物素交聯(lián)劑；生物素和抗生物素蛋白自發(fā)地結(jié)合以形成水凝膠，其具有包埋在凝膠基質(zhì)中的單個(gè)細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)和拴系在抗生物素蛋白凝膠上的細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白?？股锼氐鞍?生物素凝膠不會(huì)拴系細(xì)胞表面聚糖，因此可只用于選擇性拴系細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白。不同亞型的整聯(lián)蛋白可通過(guò)使用不同的抗生物素蛋白-配體來(lái)拴系。例如，表1列舉了數(shù)種結(jié)合于不同亞型的整聯(lián)蛋白上的肽(Xiaoetal.,MolecularCancerTherapeutics.(2010)9:2714-23；Yaoetal.,JournalofMedicinalChemistry.(2008)52:126-33；Pengetal.,NatChemBiol.(2006)2:381-9)。表1肽整聯(lián)蛋白亞型ECM結(jié)合配偶體LXY3α3β1層粘連蛋白LLP2Aα4β1纖連蛋白(Fn)、VCAM-1LXW7αvβ3纖連蛋白、纖維蛋白原、玻連蛋白LXW7為：cGRGDdvcLXY3為：cdG-Tyr(3-NO2)-G-BNc；其中B＝羥基脯氨酸；小寫字母表示D-氨基酸；以及Tyr(3-NO2)為L(zhǎng)-3-硝基-酪氨酸。不同的整聯(lián)蛋白結(jié)合在在胞外基質(zhì)中不同的粘附配偶體上。因此，生物素-肽配體可用作胞外基質(zhì)中粘附分子的替代物。當(dāng)所述細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)相對(duì)于凝膠被拉伸或收縮時(shí)，生物素-肽配體將牽引整聯(lián)蛋白以激活它們的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，若該細(xì)胞在體內(nèi)被連接至胞外基質(zhì)上則其也可被激活。本文中，本發(fā)明人利用本發(fā)明人的合成凝膠系統(tǒng)(而非基質(zhì)膠或ECM提取物)的優(yōu)勢(shì)單獨(dú)地牽引每個(gè)整聯(lián)蛋白的亞型以剖析其作用，并還可牽引整聯(lián)蛋白的組合以研究它們的共同效果。1.4用于拴系細(xì)胞表面分子的雜合的PVA-抗生物素蛋白-硼酸酯凝膠組合物本發(fā)明人還研制了雜合(hybrid)的PVA-抗生物素蛋白-硼酸酯凝膠，其被設(shè)計(jì)為拴系聚糖和整聯(lián)蛋白以及任何細(xì)胞表面分子。該P(yáng)VA-抗生物素蛋白-硼酸酯凝膠包含三部分：PVA-抗生物素蛋白、4-硼酸酯-PEG交聯(lián)劑以及生物素-配體。合成PVA-抗生物素蛋白以在PVA中加入抗生物素蛋白“鉤”，用于拴系生物素綴合的分子?？蛇x擇生物素-配體以結(jié)合任何目的細(xì)胞表面分子。例如，配體可為結(jié)合整聯(lián)蛋白上肽或可為結(jié)合特定的細(xì)胞表面分子的抗體或抗體片段。該雜合系統(tǒng)用于通過(guò)下列步驟產(chǎn)生Cell-in-Gel構(gòu)型(參見圖5)：(a)用生物素-配體(其結(jié)合于所選的細(xì)胞表面分子上)孵育細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)；(b)將細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)懸浮在PVA-抗生物素蛋白溶液(參見下文中PVA抗生物素蛋白合成步驟)中；(c)添加4-硼酸酯-PEG交聯(lián)劑。硼酸酯自發(fā)地結(jié)合于PVA抗生物素蛋白中的羥基基團(tuán)上以形成具有包埋在凝膠基質(zhì)中的單個(gè)細(xì)胞(例如肌細(xì)胞)的水凝膠。通過(guò)硼酸酯結(jié)合至聚糖和PVA中的順式-二醇上，將細(xì)胞表面聚糖拴系在凝膠中。通過(guò)生物素-配體結(jié)合至凝膠中的抗生物素蛋白“鉤”上，可將細(xì)胞表面整合蛋白或任何其他分子拴系至凝膠中。因此，具有抗生物素蛋白鉤的PVA-抗生物素蛋白-硼酸酯凝膠提供了用于單獨(dú)地或共同地拴系任何細(xì)胞表面分子的通用系統(tǒng)。1.5用于將細(xì)胞表面分子拴系至凝膠中的生物素-配體Cell-in-Gel系統(tǒng)提供了一種實(shí)驗(yàn)工具以在單個(gè)細(xì)胞上施加機(jī)械應(yīng)力以及牽引細(xì)胞表面分子。將細(xì)胞表面分子直接地或通過(guò)生物素-配體拴系至凝膠中。直接拴系的實(shí)例為細(xì)胞表面聚糖結(jié)合至基于硼酸酯的交聯(lián)劑上，從而被拴系在PVA凝膠中。利用生物素-配體作為中間鍵的實(shí)例為所述生物素綴合至結(jié)合細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白的整聯(lián)蛋白結(jié)合配體上；在另一端，所述生物素結(jié)合PVA-抗生物素蛋白凝膠中的抗生物素蛋白，從而將整聯(lián)蛋白拴系至凝膠中。具有生物素-配體系統(tǒng)的PVA-抗生物素蛋白凝膠提供了用于拴系任何細(xì)胞表面分子的一般方法。本發(fā)明人已設(shè)計(jì)了單獨(dú)地或共同地靶向細(xì)胞表面分子的下列生物素-配體：(a)生物素綴合的肽(生物素-肽)提供了另一種通用方法以將細(xì)胞表面分子拴系至凝膠中(圖6)。所述肽可以是結(jié)合不同整聯(lián)蛋白亞型的整聯(lián)蛋白結(jié)合肽。所述肽還可模擬胞外基質(zhì)中細(xì)胞粘附蛋白質(zhì)的結(jié)合域，從而用作其替代物以結(jié)合其在細(xì)胞表面上的粘附配偶體。(b)生物素綴合的抗體(生物素-抗體)提供了一種通用方法以將細(xì)胞表面分子拴系至凝膠中。一種簡(jiǎn)單方法為使用生物素綴合的抗IgG的二級(jí)抗體(生物素-二抗)；生物素-二抗可結(jié)合靶向所選擇的細(xì)胞表面分子的一級(jí)抗體(一抗)上，從而將所述分子拴系到凝膠中(圖7A)。一種替代方法為使用生物素綴合的一級(jí)抗體(生物素-一抗)以結(jié)合至所選擇的細(xì)胞表面分子上(圖7B)。與使用生物素-一抗相比，使用生物素-二抗提供了更通用的方法。本發(fā)明人使用一系列生物素綴合的二級(jí)抗體以結(jié)合不同種類(小鼠、大鼠、兔子、山羊和綿羊)的IgG上，所述種類通常用于產(chǎn)生一級(jí)抗體。這允許使用任何一級(jí)抗體來(lái)拴系任何細(xì)胞表面的目的分子。1.6用于拴系心肌細(xì)胞中的細(xì)胞表面分子的凝膠組合物和生物素-配體作為上述設(shè)計(jì)的原理證明，本發(fā)明人已進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以使用生物素-配體來(lái)拴系心肌細(xì)胞中的細(xì)胞表面分子。對(duì)肌細(xì)胞功能和疾病來(lái)說(shuō)，特別值得注意的是將機(jī)械應(yīng)力轉(zhuǎn)導(dǎo)至生化反應(yīng)中的DGC和VTI分子復(fù)合體，如圖8所示。DGC的細(xì)胞表面機(jī)械傳感器為抗肌萎縮蛋白聚糖和肌聚糖；VTI的為整聯(lián)蛋白。本發(fā)明人使用PVA-硼酸酯凝膠來(lái)拴系所述聚糖(圖8A)；使用抗生物素蛋白-生物素凝膠來(lái)拴系整聯(lián)蛋白(圖8B)；以及使用PVA-抗生物素蛋白-硼酸酯凝膠來(lái)拴系DGC和VTI(圖8C)。使用PVA-硼酸酯凝膠來(lái)激活DGC的實(shí)驗(yàn)結(jié)果記載在下文的實(shí)施例7中。圖9(上圖)中的數(shù)據(jù)示出使用PVA-硼酸酯凝膠來(lái)牽引DGC在肌細(xì)胞中產(chǎn)生Ca2+火花(參見在圖9A中的3D圖像中的亮熒光斑點(diǎn))。Ca2+火花可通過(guò)抑制nNOS來(lái)清除(圖9B)。因此牽引聚糖激活的DGC及其締合的nNOS，這反過(guò)來(lái)增強(qiáng)了蘭尼堿受體活性以產(chǎn)生Ca2+火花。抑制eNOS(圖9C)不會(huì)影響Ca2+火花，這表明eNOS不會(huì)被DGC激活，因此其不參與Ca2+火花的產(chǎn)生。使用PVA-抗生物素蛋白-硼酸酯凝膠和生物素-配體來(lái)拴系DGC和VTI的結(jié)果示于圖9(下圖)中。在該實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人使用表1中列出的肽來(lái)拴系三種亞型的整聯(lián)蛋白。圖9的數(shù)據(jù)示出了在凝膠中肌細(xì)胞收縮期間牽引DGC和VTI導(dǎo)致肌細(xì)胞產(chǎn)生Ca2+火花(圖9E，2D圖像)。Ca2+火花并不能僅通過(guò)抑制nNOS清除(圖9F)，但是可通過(guò)抑制nNOS和eNOS來(lái)去除(圖9G)。因此，牽引DGC和VTI會(huì)激活nNOS和eNOS(還參見圖8C)。將細(xì)胞表面分子拴系至凝膠中的有用替代方法為保護(hù)特定的分子不被拴系在凝膠中。這可通過(guò)使用非綴合的抗體來(lái)結(jié)合特定的分子，從而掩蔽它不被拴系在凝膠中來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，本發(fā)明人用抗α-抗肌萎縮蛋白聚糖的抗體預(yù)孵育肌細(xì)胞，然后將所述細(xì)胞包埋在上文和本文所述的PVA-硼酸酯凝膠中。除了α-抗肌萎縮蛋白聚糖之外，所述凝膠拴系細(xì)胞表面上的所有其他聚糖(例如肌聚糖、β-抗肌萎縮蛋白聚糖等)。該方法可用于從命令的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈上除去α-抗肌萎縮蛋白聚糖。本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)示出當(dāng)α-抗肌萎縮蛋白聚糖未被拴系時(shí)，Ca2+火花率減小，這顯示了在轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)械應(yīng)力以產(chǎn)生Ca2+火花的過(guò)程中α-抗肌萎縮蛋白聚糖的作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了使用多種凝膠組合物和生物素-配體來(lái)拴系所選的細(xì)胞表面分子的可行性。1.7Cell-in-Gel試劑盒：用于拴系細(xì)胞表面分子的凝膠組分和生物素-配體用于裝配Cell-in-Gel膠囊的組分可被包裝在試劑盒中?？紤]到至少兩種構(gòu)型：(1)包含PVA-抗生物素蛋白凝膠的試劑盒可用于拴系細(xì)胞表面聚糖和任何其他分子；(2)包含抗生物素蛋白-生物素凝膠的試劑盒可用于拴系任何細(xì)胞表面分子而不拴系聚糖。可任選地包括生物素-配體；用戶還可使用其他來(lái)源的其他生物素綴合的配體或抗體。實(shí)施例2用于合成和純化凝膠組分的方法合成和純化Cell-in-Gel組分的方法記載于本實(shí)施例中。2.1PVA-抗生物素蛋白PVA抗生物素蛋白是通過(guò)利用PVA(98kDa)作為起始材料合成。通過(guò)綴合將抗生物素蛋白添加到PVA中。然后通過(guò)過(guò)濾移出過(guò)量的抗生物素蛋白。下面詳細(xì)說(shuō)明用于合成和純化PVA-抗生物素蛋白的示例性逐步方法。(a)在室溫下N2氣氛中用NaH(0.05當(dāng)量，0.23mmol，溶于純度60％的礦物油中的9.1mgNaH)處理10mL無(wú)水DMSO中的2％聚乙烯醇溶液(PVA，98kDa)，磁力攪拌2小時(shí)。(b)然后將過(guò)量的環(huán)氧氯丙烷(epichlorophydrin)(0.5當(dāng)量)加入到所述反應(yīng)中并攪拌過(guò)夜。將5倍體積的乙醇加入到DMSO溶液中以沉淀環(huán)氧-PVA。(c)再將聚合物用乙醇洗滌3次并真空干燥。(d)然后將聚合物溶于20mlPBS中，隨后添加(0.05當(dāng)量)ml的抗生物素蛋白。(e)在4℃下再將反應(yīng)混合物攪拌24小時(shí)。(f)然后用100kDa離心過(guò)濾裝置將反應(yīng)混合物離心過(guò)濾以除去過(guò)量的未綴合的抗生物素蛋白。(g)在每次離心過(guò)濾步驟后，通過(guò)加入PBS使滯留溶液(retentatesolution)的最終體積回到起始體積。2.2生物素-PEG-生物素生物素-PEG-生物素是通過(guò)使用NH2-PEG-NH2(20kDa)作為起始材料合成。在DMF中經(jīng)一整夜使用1,3-二異丙基碳二亞胺(DIC)(6當(dāng)量)和6-氯-1羥基苯并三唑(Cl-HOBt)(6當(dāng)量)作為偶聯(lián)劑將D-生物素(6當(dāng)量)偶聯(lián)至PEG的氨基基團(tuán)上。通過(guò)Kaiser試驗(yàn)檢測(cè)偶聯(lián)的完成情況：黃色表示未剩余氨基基團(tuán)，藍(lán)色表示存在氨基基團(tuán)。通過(guò)加入冷乙醚沉淀PEG化的分子，并用乙醚洗滌3次。隨后將該生物素-PEG-生物素透析并凍干以得到白色粉末。下面詳細(xì)說(shuō)明用于合成生物素-PEG-生物素的示例性逐步方法。(a)分別稱出NH2-PEG-NH2(20K)和6當(dāng)量的Cl-HOBt、D-生物素和DIC。(b)將D-生物素添加至10-15ml的偶聯(lián)DMF中并用微波加熱約30s直至所有粉末完全溶于DMF中，然后將NH2-PEG-NH2和Cl-HOBt添加至溶液中并進(jìn)行渦旋直至所有試劑溶解，最后添加DIC。(c)將全部反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)移至100ml的塑料瓶中并在200rpm下震蕩所述瓶過(guò)夜。(d)第二天，取出約200μl反應(yīng)溶液，用冷乙醚沉淀溶液，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行Kaiser試驗(yàn)。(e)對(duì)于陰性Kaiser試驗(yàn)，繼續(xù)使所有反應(yīng)溶液沉淀，用冷乙醚洗滌產(chǎn)物三次。(f)將反應(yīng)產(chǎn)物放置在真空下直至粉末完全干燥。(g)將最終的生物素-PEG-生物素溶于偶聯(lián)DMF中并用孔徑在6-8k之間的膜透析溶液。(h)最后，凍干所述溶液并且將粉末備使用。實(shí)施例3用于在Cell-in-Gel系統(tǒng)中使用活細(xì)胞的工作de溶液和方案使用活細(xì)胞的工作的溶液是基于標(biāo)準(zhǔn)蒂羅德溶液或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。每種凝膠組分溶于蒂羅德(例如119mMNaCl、5mMKCl、25mMHEPES緩沖液、2mMCaCl2、2mMMgCl2、6g/升葡萄糖，pH用NaOH調(diào)節(jié)至7.4)或具有生理性pH(7.2-7.4)值的PBS中。本發(fā)明人改良該蒂羅德溶液以除去葡萄糖(其通常是存在的)，并用丙酮酸(用于能量供應(yīng)的葡萄糖的下游代謝物)替代它。這是由于葡萄糖與硼酸酯交聯(lián)劑競(jìng)爭(zhēng)而在延長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)緩慢地軟化凝膠。用丙酮酸替代葡萄糖解決了該問(wèn)題。以下是示例性逐步方案以將細(xì)胞快速地包埋在凝膠中、將特定的細(xì)胞表面分子拴系到凝膠中，同時(shí)避免細(xì)胞損傷以保持活細(xì)胞的功能。(a)將新鮮分離的細(xì)胞(心室肌細(xì)胞)懸浮至改良的蒂羅德溶液(參見下文的制法)中并在室溫下儲(chǔ)存。將20μM生物素-配體溶液添加至細(xì)胞懸浮液中，緩慢地混合，并孵育15-20分鐘。(b)用蒂羅德洗去未結(jié)合的生物素-配體，并通過(guò)使細(xì)胞在1.5mlEppendorf管形瓶中沉降來(lái)濃縮細(xì)胞濃度，并除去上清液以剩下0.5ml溶液。緩緩地混合以懸浮細(xì)胞。注意：為了防止在機(jī)械擾動(dòng)下肌細(xì)胞收縮，將蒂羅德溶液中Ca2+濃度從1mM降低至20μM以使細(xì)胞松弛，因此細(xì)胞將在松弛狀態(tài)下被包埋。(c)緩緩地將15μl細(xì)胞懸浮液混合至35μlPVA-抗生物素蛋白溶液中。(d)將15μl懸浮在PVA-抗生物素蛋白中的細(xì)胞移液至1號(hào)玻璃蓋玻片上的室中。如下文圖6所述，該室被制成含有約100μm厚度的Cell-in-Gel膠囊。該室底部的1號(hào)玻璃蓋玻片(厚度約0.15mm)允許在使用具有較短工作距離的物鏡的顯微鏡上成像(高放大率下的熒光成像需要使用大數(shù)值口徑NA的物鏡，因此縮短工作距離)。(e)使細(xì)胞在PVA抗生物素蛋白溶液中沉淀2-3分鐘。然后在頂部加入15μl交聯(lián)劑，快速但輕輕地混合。在3-5分鐘內(nèi)水凝膠自發(fā)地形成以將單個(gè)細(xì)胞包埋在3D凝膠基質(zhì)中。注意：僅需要較小體積來(lái)用于包埋單個(gè)細(xì)胞(心肌細(xì)胞尺寸～120x40x30μm；癌細(xì)胞直徑尺寸～15-20μm)，因此本發(fā)明人建議制作一個(gè)小的Cell-in-Gel膠囊，以促進(jìn)交聯(lián)劑的擴(kuò)散和避免機(jī)械混合。這對(duì)于肌細(xì)胞來(lái)說(shuō)是非常重要的，因?yàn)闄C(jī)械擾動(dòng)可導(dǎo)致肌細(xì)胞收縮。(f)將Cell-in-Gel膠囊在室溫下于增濕室(用濕濾紙包封培養(yǎng)皿)中孵育5分鐘用于形成凝膠。(g)將具有Cell-in-Gel膠囊的玻璃蓋玻片固定在灌注室中，并迅速用蒂羅德溶液覆蓋凝膠。此時(shí)Cell-in-Gel系統(tǒng)被組裝并準(zhǔn)備好用于實(shí)驗(yàn)。表2基于蒂羅德溶液的配方實(shí)施例4Cell-in-Gel膠囊和用于控制細(xì)胞上機(jī)械預(yù)負(fù)荷和后負(fù)荷的裝置本發(fā)明人設(shè)計(jì)了一個(gè)梳狀固定夾具以便將Cell-in-Gel膠囊固定到實(shí)驗(yàn)設(shè)備上，如圖10所示。凝膠中的梳狀?yuàn)A具可將材料向內(nèi)牽拉并稍微平移，這是一種在整個(gè)凝膠中獲得接近均一應(yīng)變場(chǎng)的方法。Cell-in-Gel膠囊可被梳狀?yuàn)A具夾住，然后固定在微操控器和力傳感器之間。Cell-in-Gel膠囊上的機(jī)械載荷是通過(guò)微操控器來(lái)控制并通過(guò)力傳感器來(lái)監(jiān)測(cè)。利用微操控器在細(xì)胞上施加機(jī)械預(yù)負(fù)荷以拉伸Cell-in-Gel膠囊；預(yù)負(fù)荷水平是通過(guò)拉伸的程度來(lái)控制。利用電場(chǎng)在細(xì)胞上施加機(jī)械后負(fù)荷以刺激Cell-in-Gel膠囊中的肌細(xì)胞收縮；后負(fù)荷水平是通過(guò)凝膠的剛度來(lái)控制。將拉伸與收縮結(jié)合可同時(shí)在細(xì)胞上施加預(yù)負(fù)荷和后負(fù)荷。因此，該系統(tǒng)允許在單個(gè)細(xì)胞上控制機(jī)械預(yù)負(fù)荷和后負(fù)荷。用于Cell-in-Gel膠囊的梳狀?yuàn)A具還可定制成適合任何裝置，例如，IonOptixMyoStretcher(原本設(shè)計(jì)成用一對(duì)玻璃桿夾住單個(gè)肌細(xì)胞(Iribe,CircRes.(2009)104:787-95),IonOptixLLC,USA)。實(shí)施例5用于高通量藥物篩選的Cell-in-Gel陣列可放大Cell-in-Gel系統(tǒng)以建立大通量藥物篩選系統(tǒng)來(lái)尋找影響肌細(xì)胞機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)的新藥。高通量的Cell-in-Gel系統(tǒng)包含下列組件。(a)Cell-in-Gel膠囊的陣列；(b)穿過(guò)每個(gè)Cell-in-Gel膠囊的灌注通道；(c)電刺激器來(lái)起搏(pace)凝膠內(nèi)肌細(xì)胞以經(jīng)歷刺激-Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)-收縮；(d)裝配有激光激發(fā)光源、濾光器和發(fā)射光檢測(cè)器的成像系統(tǒng)；(e)模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器和用于記錄成像數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)；(f)用于計(jì)算機(jī)控制Cell-in-Gel膠囊的藥物灌注、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析的軟件。實(shí)施例6Cell-in-Gel系統(tǒng)的試驗(yàn)6.1凝膠組分及其組合對(duì)活細(xì)胞是無(wú)毒的本發(fā)明人設(shè)計(jì)凝膠以包含抗生物素蛋白“鉤”，所述抗生物素蛋白“鉤”允許經(jīng)由自發(fā)的抗生物素蛋白-生物素結(jié)合將任何生物素-配體拴系在凝膠中。凝膠的基礎(chǔ)組分包括：PVA、PVA-抗生物素蛋白、4-硼酸酯-PEG交聯(lián)劑，以及所有組分均溶于生理鹽水(磷酸鹽緩沖鹽水PBS，或溶于蒂羅德溶液，其中pH為7.3)。本發(fā)明人通過(guò)在每種凝膠組分中預(yù)孵育新鮮分離的肌細(xì)胞，然后測(cè)定肌細(xì)胞收縮作為靈敏功能性輸出量來(lái)檢驗(yàn)每種組分的細(xì)胞毒性。本發(fā)明人的數(shù)據(jù)表明肌細(xì)胞收縮不會(huì)被任何這些組分改變。然后本發(fā)明人將這些組分混合以形成具有包埋在3D彈性凝膠基質(zhì)中的肌細(xì)胞的水凝膠。肌細(xì)胞能夠在凝膠中經(jīng)歷刺激-收縮偶聯(lián)。因此，在通常預(yù)期新鮮分離的肌細(xì)胞在生理鹽水(無(wú)凝膠)中正常發(fā)揮作用的時(shí)間間隔中，肌細(xì)胞能夠在凝膠中以及在每種凝膠組分中實(shí)施它們天然生理學(xué)功能，而沒(méi)有表現(xiàn)出任何明顯的損傷。6.2Cell-in-Gel系統(tǒng)的機(jī)械分析在后負(fù)荷下收縮期間為了定量肌細(xì)胞中的機(jī)械應(yīng)變和應(yīng)力，本發(fā)明人進(jìn)行3DCell-in-Gel系統(tǒng)的數(shù)學(xué)建模(Shawetal.,,PLoSOne.(2013)8(10):e75492)。結(jié)果表明(B)在凝膠內(nèi)收縮期間，所述細(xì)胞在其表面上經(jīng)歷正常和剪切牽引(力/單位面積)的高度非均一分布。(C)縱向應(yīng)力的3D應(yīng)力圖表明細(xì)胞內(nèi)部的壓力狀態(tài)基本上是均一的，然而外部(凝膠)應(yīng)力場(chǎng)非常不均一，其表面上肌細(xì)胞的中部(waist)和頂點(diǎn)處具有“熱點(diǎn)”。其他應(yīng)力組分的應(yīng)力圖(例如橫向應(yīng)力)是相似的(但是細(xì)胞內(nèi)是收縮的)，這表明細(xì)胞經(jīng)歷著多個(gè)軸向負(fù)荷。因此，在細(xì)胞表面上不同幾何位置處的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)(MCT)復(fù)合體應(yīng)當(dāng)經(jīng)歷不同水平的正應(yīng)力和剪切應(yīng)力。這再次確保了頂點(diǎn)處的最高應(yīng)力水平與IntercalatedDisc(一種已知的應(yīng)力支承結(jié)構(gòu))相符。這是第一次定量分析肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的這種3D應(yīng)力圖。目前，本發(fā)明人的分析方案以無(wú)量綱(標(biāo)準(zhǔn)化)術(shù)語(yǔ)表示，這些術(shù)語(yǔ)容易用于參數(shù)研究。實(shí)施例7心臟收縮期間的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過(guò)使局部一氧化氮信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)每次心跳期間心肌細(xì)胞應(yīng)機(jī)械負(fù)荷發(fā)生收縮，以及過(guò)度的機(jī)械應(yīng)力導(dǎo)致心臟疾病。利用在肌細(xì)胞收縮期間施加后負(fù)荷的新的Cell-in-Gel系統(tǒng)，本發(fā)明人確定一氧化氮合酶(NOS)為參與轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)械負(fù)荷以改變Ca2+動(dòng)態(tài)的關(guān)鍵分子。在小鼠的心室肌細(xì)胞中，細(xì)胞收縮期間的后負(fù)荷提高了收縮期的Ca2+瞬變和舒張期的自發(fā)性Ca2+火花，這是由于SR負(fù)荷保持不變而增強(qiáng)了蘭尼堿受體(RyR)的敏感性。后負(fù)荷誘發(fā)的Ca2+火花是通過(guò)nNOS的藥理學(xué)抑制作用或遺傳缺失來(lái)阻止，但是eNOS并不能如此。這種差異作用可能源于與eNOS到RyR的物理接近度相比，nNOS到RyR的物理接近度更近，這可通過(guò)超分辨率成像來(lái)解析。除了NOS，Ca2+-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白質(zhì)激酶II(CaMKII)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(NOX2)也參與機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)。在具有增加的肌絲Ca2+敏感性的心肌病的小鼠模型中，機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)被進(jìn)一步加強(qiáng)以引起頻繁的Ca2+火花以及Ca2+波。自發(fā)的Ca2+活性可通過(guò)抑制nNOS和CaMKII而不是NOX2來(lái)消除，這證明通過(guò)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體對(duì)NOS和NOX的獨(dú)立激活?？傊?，本發(fā)明人的數(shù)據(jù)顯示在心臟收縮期間的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)中nNOS和CaMKII為新的關(guān)鍵介質(zhì)，其提供了用于治療機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的Ca2+調(diào)節(jié)異常、心律失常和心肌病的新的機(jī)械學(xué)見解和治療目標(biāo)。引言心臟必須應(yīng)機(jī)械負(fù)荷而泵血液，所述機(jī)械負(fù)荷隨身體活動(dòng)、姿勢(shì)、情感和病理生理狀態(tài)而不斷變化。Anrep效應(yīng)(1-4)描述了由增加的后負(fù)荷引起的心臟收縮性的增強(qiáng)，其是對(duì)描述由增加的預(yù)負(fù)荷而增強(qiáng)的收縮性的Frank-Starling機(jī)制(5)的補(bǔ)充。Petroffetal.,的開創(chuàng)性研究(6)發(fā)現(xiàn)拉伸心肌細(xì)胞以增加預(yù)負(fù)荷可通過(guò)激活一氧化氮合酶3(eNOS)而誘導(dǎo)自發(fā)性Ca2+火花。Prosseretal.,最近的研究(7,8)顯示拉伸肌細(xì)胞可激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(NOX2)以引發(fā)Ca2+火花。預(yù)負(fù)荷誘導(dǎo)的Ca2+處理的改變促成Frank-Starling機(jī)制。但是，后負(fù)荷是否也可引起Ca2+處理的改變以及類似的機(jī)械--化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是否可在應(yīng)機(jī)械負(fù)荷而收縮的肌細(xì)胞中被激活仍然是未知的。已知在病理學(xué)病癥(例如高血壓、異步收縮和梗死)下過(guò)度后負(fù)荷可導(dǎo)致心臟重塑、肥大、心律失常和心力衰竭(9-11)。本文中，本發(fā)明人確定nNOS、eNOS、NOX2和Ca2+-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白質(zhì)激酶II(CaMKII)為將機(jī)械后負(fù)荷與Ca2+處理聯(lián)系起來(lái)的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵介質(zhì)。這豐富了Anrep效應(yīng)的機(jī)械理解，并有助于鑒別用于治療機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的心臟疾病的可能分子靶標(biāo)。材料和方法所有實(shí)驗(yàn)室方案均符合US國(guó)家衛(wèi)生研究院出版的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南”(theGuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals)。動(dòng)物使用由當(dāng)?shù)貦C(jī)構(gòu)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。細(xì)胞分離從JacksonLaboratories(USA)購(gòu)得野生型及轉(zhuǎn)基因小鼠(8周齡的雄性)：C57BL/6J(野生型)、B6.129S4-Nos1tm1Plh/J(NOS1-/-)、B6.129P2-Nos3tm1Unc/J(NOS3-/-)。在Tardiff實(shí)驗(yàn)室中在制備心肌鈣蛋白T中具有R92Q突變的轉(zhuǎn)基因小鼠(22)，并在Chen-Izu實(shí)驗(yàn)室中繁殖。利用標(biāo)準(zhǔn)酶學(xué)技術(shù)(40)使用Worthington膠原酶II型和Sigma蛋白酶XIV型分離心室肌細(xì)胞。所有實(shí)驗(yàn)在21-22℃下進(jìn)行。Cell-in-Gel系統(tǒng)彈性凝膠基質(zhì)是由包含未衍生化PVA(98KD)和四價(jià)硼酸酯-PEG交聯(lián)劑的聚乙烯醇(PVA)水凝膠系統(tǒng)制成(12)。首先將新鮮分離的肌細(xì)胞懸浮在7％PVA溶液中；然后加入相同體積的7.5％交聯(lián)劑溶液(凝膠7.5％)。一旦混合，硼酸酯基團(tuán)就交聯(lián)PVA水凝膠，將細(xì)胞包埋在3D凝膠基質(zhì)中。硼酸酯基團(tuán)還將細(xì)胞表面聚糖的順式-二醇交聯(lián)至PVA上，從而將細(xì)胞表面拴系在凝膠中。本發(fā)明人在該研究的所有實(shí)驗(yàn)中使用Gel7.5％，除了圖11G中的一組(其使用凝膠5％)。本Cell-in-Gel系統(tǒng)具有數(shù)個(gè)有利的性質(zhì)。(1)在電場(chǎng)刺激下，肌細(xì)胞在彈性凝膠中經(jīng)歷刺激-收縮，并且凝膠基質(zhì)抵抗收縮期間得到細(xì)胞的縮短和變寬，從而對(duì)細(xì)胞施加多軸向機(jī)械應(yīng)力。(2)凝膠的剛度可通過(guò)交聯(lián)劑和PVA的混合比來(lái)調(diào)節(jié)[41]。在絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，混合相同體積的7.5％交聯(lián)劑和7％PVA以形成7.5％凝膠。在少數(shù)實(shí)驗(yàn)中，將5％交聯(lián)劑和7％PVA混合以形成較軟的5％凝膠。(3)凝膠基質(zhì)是多孔的以允許快速的浴溶液交換用于研究藥物作用。(4)凝膠基質(zhì)是光學(xué)透明的，用于細(xì)胞收縮的實(shí)時(shí)成像以及Ca2+信號(hào)的熒光成像。本發(fā)明人通過(guò)以下步驟進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)PVA或交聯(lián)劑單獨(dú)對(duì)肌細(xì)胞的效應(yīng)：在PVA或CL中預(yù)孵育所述細(xì)胞10分鐘，然后用正常蒂羅德溶液灌注細(xì)胞并測(cè)量細(xì)胞收縮。圖12表明單獨(dú)用PVA或CL的預(yù)孵育不能改變兔肌細(xì)胞的收縮。本發(fā)明人還進(jìn)一步檢驗(yàn)了凝膠內(nèi)肌細(xì)胞收縮誘發(fā)的自發(fā)性Ca2+活性(參見下文)。數(shù)據(jù)表明在電起搏前位于凝膠中的細(xì)胞沒(méi)有Ca2+火花；然后凝膠內(nèi)細(xì)胞收縮產(chǎn)生舒張期的自發(fā)性Ca2+火花和波；然后停止起搏去除細(xì)胞收縮并消除自發(fā)性Ca2+活性。這些證據(jù)清楚地排除了單獨(dú)的凝膠會(huì)改變Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞收縮的可能性。在單個(gè)細(xì)胞水平上控制機(jī)械應(yīng)力的現(xiàn)代技術(shù)可分類如下。通過(guò)使用一對(duì)微懸臂支架(碳纖維[42]，玻璃棒[43])拉伸細(xì)胞的1D(單軸)技術(shù)已產(chǎn)生有價(jià)值的數(shù)據(jù)，但其與體內(nèi)3D環(huán)境不同。在可變形膜或微柱(micropost)上培養(yǎng)細(xì)胞的2D技術(shù)用于拉伸新生兒肌細(xì)胞[44]等，但是新鮮分離的成體肌細(xì)胞不容易連接到膜上。3D技術(shù)，通過(guò)將細(xì)胞包裹在纖維蛋白原-凝血酶凝膠[45]和然后在瓊脂中[6]，但細(xì)胞表面不粘附于瓊脂。而且，去皮(“死”細(xì)胞)的肌肉或肌原纖維制品通常用于研究被動(dòng)肌肉力學(xué)，但機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)需要在活的完整肌細(xì)胞中研究。因此，本發(fā)明人的Cell-in-Gel系統(tǒng)通過(guò)將細(xì)胞表面拴系在凝膠上并對(duì)單個(gè)活的成體心肌細(xì)胞施加3D機(jī)械應(yīng)力來(lái)更接近地模擬生理環(huán)境。本發(fā)明人的數(shù)據(jù)與以下結(jié)論一致：細(xì)胞表面粘附到3D凝膠基質(zhì)(模擬對(duì)體內(nèi)胞外基質(zhì)的粘附)在機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明人工作假說(shuō)為：在Cell-in-Gel系統(tǒng)，將細(xì)胞表面聚糖通過(guò)硼酸酯結(jié)合連接至PVA凝膠基質(zhì)。由于在肌細(xì)胞收縮期間細(xì)胞表面遭受正應(yīng)力和剪切應(yīng)力[13]，凝膠牽引細(xì)胞表面糖蛋白(包括抗肌萎縮蛋白聚糖和肌聚糖)以在抗肌萎縮蛋白-糖蛋白復(fù)合體中的這些機(jī)械感應(yīng)分子上施加機(jī)械應(yīng)變和應(yīng)力似乎是合理的?？辜∥s蛋白連接至nNOS上是已知的。該觀點(diǎn)與本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)是一致的，即nNOS在凝膠內(nèi)收縮的肌細(xì)胞中被激活。此外，當(dāng)心肌在舒張末期被拉伸并隨后應(yīng)機(jī)械負(fù)荷而收縮時(shí)，體內(nèi)的心肌細(xì)胞最可能在一個(gè)心臟周期內(nèi)經(jīng)受預(yù)負(fù)荷和后負(fù)荷。Cell-in-Gel系統(tǒng)提供了用于研究后負(fù)荷作用的實(shí)驗(yàn)工具[6][42][43]。該系統(tǒng)還可被進(jìn)一步開發(fā)以通過(guò)拉伸凝膠來(lái)施加預(yù)負(fù)荷。本研究是本發(fā)明人的第一個(gè)關(guān)于后負(fù)荷誘導(dǎo)的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)的成就，其補(bǔ)充預(yù)負(fù)荷作用的在先研究。本文中本發(fā)明人的研究為下一階段施加預(yù)負(fù)荷和后負(fù)荷以研究它們的組合作用的研究調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。在3D彈性基質(zhì)中的肌細(xì)胞收縮的機(jī)械分析。PVA凝膠的剛度是使用TA-XT2質(zhì)構(gòu)分析儀(StableMicroSystems,England)來(lái)測(cè)定。50mm直徑和1.5mm厚度的PVA凝膠樣品經(jīng)受單向應(yīng)變。所施加的10％的應(yīng)變足夠小以保持在應(yīng)力-應(yīng)變響應(yīng)的線性區(qū)域中，并且根據(jù)應(yīng)力與應(yīng)變曲線的斜率計(jì)算楊氏模量。凝膠的剛度是由交聯(lián)劑和PVA的混合比來(lái)控制[41]。除非另有說(shuō)明，本研究中的實(shí)驗(yàn)是使用楊氏模量為1KPa的7.5％的凝膠進(jìn)行。本發(fā)明人已在彈性凝膠中進(jìn)行了用于肌細(xì)胞收縮的3D機(jī)械分析[13]。主要發(fā)現(xiàn)包括(1)應(yīng)力狀態(tài)在細(xì)胞內(nèi)是均一的；沿著縱向軸線的軸向應(yīng)力是沿著橫向軸線的橫向應(yīng)力的約15倍。(2)表面牽引力(剪切應(yīng)力)高度不均一；它在細(xì)胞的中部最小，沿著長(zhǎng)度方向逐漸增大，并且在頂點(diǎn)附近達(dá)到最大。(3)凝膠內(nèi)肌細(xì)胞的縮短分?jǐn)?shù)(fractionalshortening)小于無(wú)負(fù)荷收縮的縮短分?jǐn)?shù)。擊倒因子(knock-downfactor)是由細(xì)胞的幾何尺寸和細(xì)胞對(duì)凝膠的相對(duì)剛度決定；更細(xì)或更軟的細(xì)胞具有較少的縮短分?jǐn)?shù)。來(lái)自嚴(yán)格的3D機(jī)械分析的上述結(jié)果可使用Cell-in-Gel系統(tǒng)確認(rèn)以在模擬的體內(nèi)機(jī)械環(huán)境中對(duì)單個(gè)肌細(xì)胞施加縱向張力、橫向壓縮和表面牽引。Ca2+信號(hào)的共聚焦成像。將肌細(xì)胞負(fù)載Ca2+指示劑Fluo-4，然后包埋在凝膠中。使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行共聚焦成像(41)。為了Ca2+信號(hào)的共聚焦成像，在pH7.4下將負(fù)載有Ca2+指示劑Fluo-4的新鮮分離的肌細(xì)胞在包含(以mM計(jì)):150NaCl、5.4KCl、1.2MgCl2、1CaCl2的蒂羅德溶液中連續(xù)灌注，然后包埋在PVA凝膠中。使用具有雙極轉(zhuǎn)換(在連續(xù)刺激脈沖中轉(zhuǎn)換正極和負(fù)極)的短(4ms)去極化脈沖通過(guò)電場(chǎng)刺激以0.5Hz頻率對(duì)細(xì)胞進(jìn)行起搏。鉑電極與新鮮蒂羅德溶液的持續(xù)灌注結(jié)合使用以保持恒定浴條件(pH、葡萄糖、離子組成、溫度等)。使用具有水浸式熒光物鏡UPlanSApo60X，NA1.2的OlympusFluoView1000共聚焦顯微鏡(倒置配置)獲得共聚焦圖像，就灌注室底部使用的1號(hào)玻璃蓋玻片的厚度進(jìn)行修正。用488nm激光束(激光功率設(shè)置為5％)激發(fā)Fluo-4，并使發(fā)射的熒光通過(guò)帶通濾波器BA505-605并用PMT收集。設(shè)置PMT電壓、增益和偏移以避免任何飽和并獲得高保真度圖像。使用2μs/像素的最高掃描速度獲得線掃描圖像。Ca2+火花是使用基于本發(fā)明人的火花識(shí)別算法的自制程序自動(dòng)檢測(cè)并適用于x-t線掃描[47]。如在本發(fā)明人的2-D程序中，火花是在兩個(gè)階段中鑒定。在第一階段中，基于Chengetal.,的說(shuō)明書[48]檢測(cè)假定的火花，并且使用本發(fā)明人先前的出版物[49]中記載的“活或死”算法消除可見但空間上小的事件。在第二階段中，基于統(tǒng)計(jì)篩將假定的火花被歸類為火花或噪音，如在本發(fā)明人先前的出版物[47]中所述。該分析軟件提供了對(duì)Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)事件的自動(dòng)化和客觀(通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)篩選的不可預(yù)知性(agnostic))檢測(cè)和分類。Flou-4信號(hào)的共聚焦成像主要用于檢測(cè)Ca2+火花和波，因?yàn)镕luo-4是可用于檢測(cè)具有局部Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)的較小變化的最佳指示劑之一，這是由于Fluo-4的高量子產(chǎn)率。對(duì)肌細(xì)胞收縮和收縮期的Ca2+瞬變的機(jī)械負(fù)荷的作用。為了確定舒張期的自發(fā)性Ca2+火花確實(shí)是由機(jī)械負(fù)荷引起的，本發(fā)明人檢測(cè)了在不同機(jī)械負(fù)荷下收縮的肌細(xì)胞中的Ca2+火花率，如圖11G所示。本發(fā)明人還檢測(cè)了在這些不同的負(fù)荷條件下收縮期的Ca2+瞬變和肌細(xì)胞收縮。圖13A表明：與無(wú)負(fù)荷收縮相比，在中度機(jī)械負(fù)荷下軟凝膠(凝膠5％，由5％的交聯(lián)劑制得)中的肌細(xì)胞收縮不會(huì)顯著地改變Ca2+瞬變；然而，由于機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)，在高度機(jī)械負(fù)荷下剛性凝膠(凝膠7.5％，由7.5％的交聯(lián)劑制得)中的肌細(xì)胞收縮顯著地增強(qiáng)了Ca2+瞬變，盡管收縮幅度由于更大的負(fù)荷而減小(圖13B)。Blebbistatin(10μM)處理(其將細(xì)胞收縮從Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)中去耦合(圖13B))消除機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)和恢復(fù)Ca2+瞬變至無(wú)負(fù)荷條件(圖13A)；Ca2+瞬變的正常化還與消除機(jī)械負(fù)荷后的Ca2+火花率的正?；恢?圖11G)。使用Fura-2比率法的全細(xì)胞Ca2+瞬變的測(cè)定。為了更準(zhǔn)確地測(cè)定全細(xì)胞Ca2+濃度，本發(fā)明人使用Fura-2比率法(40)而不是Fura-4單波長(zhǎng)測(cè)量法。通過(guò)用2.5μMFura-2/AM和0.75μMPluronic-127(在20％DMSO中)在室溫下將細(xì)胞孵育30分鐘進(jìn)行Fura-2負(fù)載。洗去Fura-2/AM后，再將該細(xì)胞孵育45分鐘，然后在2小時(shí)內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。具有Hyperswitch并安裝在具有水浸式熒光物鏡UPlanSPao40X，1.15NA的OlympusX71倒置顯微鏡上的IonOptix系統(tǒng)(IonOptixInc.，USA)，針對(duì)1號(hào)玻璃蓋玻片的厚度進(jìn)行修正。使用高強(qiáng)度弧光燈(Cairn)產(chǎn)生激發(fā)光。Hyperswitch(基于使用340/370d/380濾波器立方體在500Hz的頻率下在340mm和380nm之間轉(zhuǎn)換的電流計(jì))用于釋放340nm和380nm的雙激發(fā)光束，在兩個(gè)波長(zhǎng)之間轉(zhuǎn)換。Fura-2熒光發(fā)射光穿過(guò)帶通濾波器D510/40m，然后在光電倍增管(PMT)中收集。設(shè)置PMT的增益以避免任何飽并獲得高保真光子計(jì)數(shù)。記錄來(lái)自細(xì)胞的在340nm和380nm處的激發(fā)的Fura-2熒光發(fā)射(F)。在溶液和沒(méi)有細(xì)胞的凝膠中獲得340nm和380nm波長(zhǎng)處的背景熒光(BG)。發(fā)現(xiàn)凝膠中的BG信號(hào)稍微高于溶液中的，但是兩者都顯著地低于來(lái)自細(xì)胞的Fura-2熒光發(fā)射。Fura-2熒光比RFura是在扣除背景后計(jì)算。為了測(cè)定收縮期的Ca2+瞬變，首先將細(xì)胞起搏以達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)(>2分鐘)，然后在穩(wěn)態(tài)期間記錄至少10次搏動(dòng)的Fura-2熒光。為了測(cè)定SR容量，細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后停止場(chǎng)刺激以使細(xì)胞保持休眠狀態(tài)15秒；然后應(yīng)用高濃度(20mM)的咖啡因以快速放空SR負(fù)荷(圖14A、B)。通過(guò)咖啡因誘導(dǎo)的Ca2+瞬變的速度增加來(lái)獲得SRCa2+釋放的快速性，并且Ca2+峰值用作測(cè)量SR負(fù)荷的指數(shù)。值得注意的是，使用fura-2(圖14D)或其它指示劑的SRCa2+含量在Cell-in-Gel和無(wú)負(fù)荷收縮之間沒(méi)有顯示出任何可辨別的差異。由于RyR對(duì)內(nèi)SR[Ca2+]的敏感性是急劇的，本發(fā)明人還證實(shí)，本發(fā)明人不能檢測(cè)到的SRCa2+的較小變化可能具有功能性影響。肌細(xì)胞收縮測(cè)定。通過(guò)由明亮的Fluo-4信號(hào)以及來(lái)自PVA凝膠或浴溶液的調(diào)光信號(hào)劃分的左邊界和右邊界的位置的差異，從共聚焦x-t線掃描來(lái)確定使用Fluo-4共聚焦成像的收縮測(cè)定。肌細(xì)胞的長(zhǎng)度是通過(guò)將沿著每個(gè)x方向的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成二元向量來(lái)計(jì)算。高于背景的熒光值加上閾值被認(rèn)為是1，否則為0。然后將“1”像素的數(shù)量乘以比例因子(通過(guò)使用具有2.5間距的Ronchi刻線法確定)以獲得以微米為單位的細(xì)胞縮短。閾值設(shè)置為鈣熒光最大值的一半。使用具有肌原纖維節(jié)檢測(cè)的IonOptix系統(tǒng)(IonOptixCo.，USA)的收縮測(cè)量是通過(guò)使用高速照相機(jī)(Myocam-S，240至最高達(dá)1000幀/s)記錄收縮期間的肌原纖維節(jié)運(yùn)動(dòng)來(lái)進(jìn)行。然后使用快速傅立葉變換算法(FFT)將肌細(xì)胞中的肌原纖維節(jié)模式用于計(jì)算肌原纖維節(jié)長(zhǎng)度變化。本發(fā)明人決定在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)中使用IonOptix肌原纖維節(jié)檢測(cè)和FFT方法來(lái)測(cè)量肌細(xì)胞收縮，而不是Flou-4共聚焦成像邊緣檢測(cè)法，這是因?yàn)槿绻诩〖?xì)胞收縮期間細(xì)胞端移出焦點(diǎn)，則Flou-4共聚焦成像邊緣檢測(cè)法可包括一些不精確性。就平均肌原纖維節(jié)長(zhǎng)度縮短而言，肌原纖維節(jié)FFT法通常提供對(duì)肌細(xì)胞收縮的更穩(wěn)定(避免邊緣運(yùn)動(dòng))和精確的測(cè)量。抑制nNOS與eNOS對(duì)Ca2+瞬變和凝膠內(nèi)肌細(xì)胞收縮的影響。通過(guò)抑制nNOS而不是eNOS來(lái)抑制機(jī)械負(fù)荷誘發(fā)的自發(fā)性Ca2+火花(圖15)；該差異作用促使本發(fā)明人來(lái)探索是否收縮期的Ca2+瞬變也是通過(guò)抑制nNOS而不是eNOS來(lái)抑制的。圖16表明，使用L-NPA(5μM)抑制nNOS確實(shí)減少Ca2+瞬變(圖A)；使用L-Nio(10μM)抑制eNOS不僅減少Ca2+瞬變(A)，而且減慢Ca2+瞬變下降的速度(在B中延長(zhǎng)tau)。綜合來(lái)看，nNOS抑制會(huì)顯著地抑制舒張期的Ca2+火花并輕微地減少了收縮期的Ca2+瞬變；而eNOS抑制沒(méi)有抑制Ca2+火花并顯著地減少了Ca2+瞬變，還減緩了Ca2+從細(xì)胞溶質(zhì)中的移出。這些數(shù)據(jù)與以下結(jié)論是相符的：nNOS與eNOS在調(diào)節(jié)不同的Ca2+處理途徑上的差異作用。本發(fā)明人的工作假說(shuō)為：由于nNOS更接近于SR則nNOS可顯著地調(diào)節(jié)RyR和SERCA，而eNOS可顯著地影響肌纖維膜附近的Ca2+處理蛋白，包括Na+/Ca2+交換、肌纖維膜Ca2+泵和L-型Ca2+通道。該誘人的假說(shuō)需要通過(guò)關(guān)于nNOS與eNOS對(duì)所有這些Ca2+處理分子的作用的全面研究進(jìn)行測(cè)試。根據(jù)nNOS和eNOS的減小Ca2+瞬變的作用，nNOS和eNOS的抑制作用還減弱了肌細(xì)胞收縮(作為縮短分?jǐn)?shù)測(cè)定，圖16C中的FS)。對(duì)收縮數(shù)據(jù)的解釋需要考慮以下復(fù)雜性。當(dāng)肌細(xì)胞在牽拉機(jī)械負(fù)荷時(shí)，收縮幅度預(yù)計(jì)會(huì)降低。然而，如果沒(méi)有Ca2+瞬變的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的增加，收縮的降低將更嚴(yán)重。換句話說(shuō)，如果肌細(xì)胞僅僅是彈性的，則收縮將小于在活的肌細(xì)胞(其具有活性的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)以增加Ca2+瞬變)中測(cè)量的收縮。為了解決此問(wèn)題，本發(fā)明人已對(duì)假設(shè)沒(méi)有機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)的彈性模型進(jìn)行了機(jī)械分析[13]，這提供了容易參與參數(shù)計(jì)算的分析方案。例如，擊倒因子(KF＝凝膠內(nèi)肌細(xì)胞縮短與無(wú)負(fù)荷狀態(tài)下肌細(xì)胞縮短的比率)是機(jī)械負(fù)荷的函數(shù)。對(duì)于本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)條件下的標(biāo)準(zhǔn)凝膠內(nèi)肌細(xì)胞，彈性模型預(yù)測(cè)KF為0.2。然而，實(shí)驗(yàn)測(cè)定的KF為約0.4(圖16C)，因?yàn)闄C(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致的Ca2+瞬變的增加提高了收縮性。抑制nNOS或eNOS會(huì)中斷機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)，因此將KF降低至基礎(chǔ)水平(圖16C)。Cell-in-Gel系統(tǒng)提供了一種強(qiáng)大的技術(shù)使能夠進(jìn)行這種研究。在本文中，本發(fā)明人致力于建立Cell-in-Gel技術(shù)以及研究nNOS和eNOS對(duì)RyR的作用。新鮮分離的心室肌細(xì)胞的抗體標(biāo)記。新鮮分離的心室肌細(xì)胞的抗體標(biāo)記是基于稍作修改的本發(fā)明人先前描述的方案[49]進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞在室溫下在正常磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中洗滌，然后在1％多聚甲醛PBS溶液中固定10分鐘。在冷PBS(在冰上或在4℃的冰箱中)中洗滌兩次后，然后將細(xì)胞在冷的0.1％TritonX-100PBS溶液中透化10分鐘。在室溫下將細(xì)胞用一級(jí)抗體(1：100稀釋)溶液(包含溶于PBS中的5％牛血清白蛋白、3％山羊血清和0.01％TritonX-100)孵育2小時(shí)；在冷PBS中洗滌兩次，然后在室溫下用二級(jí)抗體(1：100稀釋，MolecularProbe，USA)溶液孵育2小時(shí)或在4℃孵育過(guò)夜。對(duì)于RyR、nNOS和eNOS的抗體標(biāo)記，本發(fā)明人分別使用了抗RyR單克隆抗體(克隆C3-33，AffinityBioReagentsInc.USA)、抗nNOS多克隆抗體(ThermoScientific)和抗eNOS多克隆抗體(ThermoScientific)。對(duì)于共定位研究，本發(fā)明人使用來(lái)自不同物種的兩種一級(jí)抗體來(lái)雙標(biāo)記所述細(xì)胞，以在同一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)標(biāo)記分子A和B(A/B對(duì))；然后同時(shí)使用靶向每個(gè)一級(jí)抗體的熒光團(tuán)-綴合的二級(jí)抗體來(lái)將A和B顯影。在具有足夠光譜分離的兩個(gè)單獨(dú)的發(fā)射通道中選擇熒光團(tuán)檢測(cè)A和B。例如，用Alexa555綴合的抗兔IgG抗體標(biāo)記nNOS，而用Alexa488綴合的抗小鼠IgG抗體標(biāo)記RyR。共聚焦顯微鏡上的“順序模式”能夠分別激發(fā)兩個(gè)熒光團(tuán)，以便使串?dāng)_最小化。本發(fā)明人使用上述方法標(biāo)記nNOS/RyR對(duì)和eNOS/RyR對(duì)，然后使用共聚焦顯微鏡和結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡對(duì)其成像。分子的偽彩色編碼如下：RyR為紅色、nNOS為綠色以及eNOS為青色。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)(即棒狀、清晰紋理)、標(biāo)記的亮度和標(biāo)記的均一性的保持來(lái)評(píng)價(jià)抗體標(biāo)記的質(zhì)量。例如，在保存良好和標(biāo)記良好的細(xì)胞中，外周RyR標(biāo)記顯示出干凈和平滑的輪廓，并且插入的RyR單元清晰可見；標(biāo)記是明亮的并均勻分布在整個(gè)細(xì)胞中[49]。細(xì)胞圖像的實(shí)例示出在圖17中。抗體標(biāo)記細(xì)胞的共聚焦成像。共聚焦成像是使用具有水浸式熒光物鏡UPlanSApo60X,NA1.2的OlympusFlowView1000共聚焦顯微鏡(倒置配置)來(lái)獲得，針對(duì)在灌注室底部使用的1號(hào)玻璃蓋玻片的厚度進(jìn)行修正。水浸式物鏡用于核對(duì)溶液的折射率，其中將細(xì)胞保存在容納室底部的1號(hào)玻璃蓋片上，以使球面像差最小化。共聚焦圖像是通過(guò)2D掃描得到。設(shè)置共聚焦口徑(CA)為1Airyunit以獲得用于最高空間分辨率的最薄的光學(xué)切片。為了雙標(biāo)記細(xì)胞的成像，使用“順序模式”在兩種激發(fā)光束之間轉(zhuǎn)換(例如逐行掃描的488nm和543nm之間)以便使兩個(gè)不同熒光團(tuán)的光譜之間的串?dāng)_最小化。所發(fā)射的熒光被二向色鏡分成兩個(gè)通道，并穿過(guò)相應(yīng)的帶通濾波器(用于綠色的BA505-525和用于紅色的BA560-660)，然后在每個(gè)通道中用PMT收集。設(shè)置PMT電壓、增益和偏移以避免任何飽和以及獲得高保真度圖像。圖像的空間分辨率由最高共聚焦分辨率定義，通常具有～0.3μm的x,y分辨率和0.8-1.0μm的z分辨率。使用結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡(SIM)的超分辨率成像。使用SIM來(lái)實(shí)現(xiàn)具有x,y～100nm和z～250nm的空間分辨率的超分辨率成像。使用Pearson共定位分析測(cè)量nNOS-RYR和eNOS-RyR的共定位(42)；由各個(gè)分子簇的質(zhì)心的最小成對(duì)距離計(jì)算最近相鄰距離(43)。本發(fā)明人使用DeltaVisionOMXV3.0Blaze系統(tǒng)(AppliedPrecisionInc，GEHealthcareCompany，Issaquah，WA)獲得抗體標(biāo)記的肌細(xì)胞的熒光圖像。詳細(xì)的SIM成像方法此前已有記載[40]。簡(jiǎn)言之，該系統(tǒng)使用488和532nm激光作為照明的光源。光路中的光柵用于產(chǎn)生三個(gè)相干光束，其在樣品中產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)化照明模式。將抗體標(biāo)記的細(xì)胞浸入具有1.47RI的抗衰退試劑ProLongGold中，并置于樣品臺(tái)上。用浸入在具有1.514RI的油中的60X，1.42NA物鏡收集熒光發(fā)射。不同顏色的熒光是通過(guò)二向色鏡分離，并通過(guò)帶通發(fā)射濾波器過(guò)濾，然后通過(guò)兩個(gè)快速sCMOS照相機(jī)(PCO-TECHInc.，Romulus，MI)收集。為了獲得3D圖像，將樣品沿著z方向以125nm的步長(zhǎng)移動(dòng)。對(duì)于每個(gè)切片，照明模式旋轉(zhuǎn)三次并移位五次，導(dǎo)致每個(gè)通道總共有15次曝光。用專有軟件包(SoftWoRxv5.0，AppliedPrecisionInc.)處理所獲得的原始圖像以重建超分辨率3D圖像。然后使用定制的軟件記錄不同顏色的重建圖像以校正色差和圖像失真。在實(shí)驗(yàn)之前，已使用0.1微米的多色聚合小珠(四譜珠，MolecularProbe，Eugene，OR)校正系統(tǒng)和彩色記錄軟件。發(fā)現(xiàn)所述系統(tǒng)的空間分辨率對(duì)于x軸、y軸為～110nm，對(duì)于z軸為～250nm。發(fā)現(xiàn)彩色記錄誤差小于一個(gè)像素，即40nm。使用VolocityplusVisualization軟件包進(jìn)行SIM圖像的3D渲染。使用具有Quantitation的軟件包Volocity(Perkin-Elmer，Waltham，MA)分析nNOS-RYR對(duì)和eNOS-RyR對(duì)的共定位，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)Pearson共定位分析[39]。按照先前描述的方法[40]，仔細(xì)設(shè)置用戶自定義的閾值以從背景中分離信號(hào)，并且計(jì)算Manders重疊系數(shù)(M1和M2)。M1和M2被用作共定位程度的指標(biāo)，如圖17D所示(左邊的條)。該條表示nNOS(綠色)-RyR(紅色)對(duì)和eNOS(青色)-RyR(紅色)對(duì)的體元體積，每個(gè)均被標(biāo)準(zhǔn)化為RyR體元體積。M1和M2值是由條中的重疊區(qū)域(混合色)來(lái)描述。例如，對(duì)于nNOS(綠色)-RyR(紅色)對(duì)，M1＝0.349和M2＝0.524。這被看作在圖17D中最左側(cè)條柱中綠色和紅色混合區(qū)域占nNOS條(綠色)的34.9％和RyR條(紅色)的52.4％。注意，上述指標(biāo)給出了共定位程度的稍微一般性的評(píng)價(jià)。它們不能定量不同分子之間的距離。NOS同種型簇和RyR簇之間的最近相鄰距離被定義為各個(gè)簇的質(zhì)心之間的最小成對(duì)距離。在成對(duì)距離計(jì)算中排除具有低于0.00189的體積的對(duì)象(斑點(diǎn))(其可能源自光子噪聲)。使用具有Quantitation軟件包的Volocity確定質(zhì)心和最近相鄰距離。nNOS-RYR對(duì)之間和eNOS-RyR對(duì)之間的最近相鄰距離的概率密度函數(shù)(PDF)如圖17D所示(右側(cè)曲線)。nNOS-RYR和eNOS-RyR之間的峰最近相鄰距離分別為0.19μm和0.37μm。以前，已發(fā)現(xiàn)nNOS與不同亞細(xì)胞區(qū)域的各種分子相關(guān)，包括SR膜中的SERCA[50]，細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷中的PMCA[19]以及靠近肌纖維膜和t小管的抗肌萎縮蛋白[46]。本發(fā)明人的SIM成像數(shù)據(jù)(圖15G)還顯示一個(gè)以上的nNOS-RyR距離群(由直方圖中的扭結(jié)表示)；第一個(gè)峰出現(xiàn)在0.19μm處，這使得一個(gè)nNOS的亞群與RyR緊密接近。使用Camui傳感器的體外CaMKII活性測(cè)量。之前描述了野生型、抗磷酸化和抗氧化的Camui構(gòu)建體的設(shè)計(jì)和合成[51]。將HEK293細(xì)胞在加有5％胎牛血清和青霉素/鏈霉素的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，然后使用哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染試劑盒(Stratagene)利用編碼Camui(或突變同種型)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。再經(jīng)過(guò)24小時(shí)后，通過(guò)熒光顯微鏡檢查Camui表達(dá)。將表達(dá)Camui的HEK細(xì)胞在包含50mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)、5mMMgCl2和蛋白酶抑制劑的不含Ca2+的緩沖液中裂解。使用MSSpectraMax板讀分光光度計(jì)(MolecularDevices)進(jìn)行熒光測(cè)量，其中激發(fā)和發(fā)射狹縫設(shè)置為4nm，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為440nm，發(fā)射波長(zhǎng)分別設(shè)置為477nm(FCFP)和527nm(FYFP)。將轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)級(jí)分被稀釋，在存在10μMCaM和200μMCa2+的情況下測(cè)量Camui熒光。將EGTA1mM用于螯合Ca2+并在存在1mMEGTA和50μM或500μMSNAP的情況下測(cè)量自主CaMKII活性。已知CaMKII活性可通過(guò)自磷酸化[52]和通過(guò)氧化作用[53]來(lái)提高。本文中，本發(fā)明人使用基于FRET的生物傳感器Camui(其在激活期間檢測(cè)CaMKII的構(gòu)象變化)來(lái)測(cè)量一氧化氮(NO)對(duì)CaMKII活性的作用。為了確定NO能否激活CaMKII，本發(fā)明人在HEK細(xì)胞中表達(dá)CaMKII活性傳感器Camui[51]并測(cè)量由NO供體SNAP誘發(fā)的自主激活。Camui包含在激酶的任一端具有CFP/YFP對(duì)的全長(zhǎng)CaMKII，其在閉合(自身抑制)狀態(tài)下產(chǎn)生大量FRET。如果通過(guò)Ca2+/CaM結(jié)合直接地或通過(guò)激酶的翻譯后修飾自發(fā)地破壞自身抑制，則FRET減少，導(dǎo)致FCFP/FYFP增加。如圖18所示，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在用EGTA和50μMSNAP處理的HEK細(xì)胞溶解產(chǎn)物中對(duì)FCFP/FYFP沒(méi)有影響(與僅用EGTA處理的溶解產(chǎn)物相比)，但是施用500μMSNAP導(dǎo)致CaMKII激活的顯著增加(至約50％的Ca2+/CaM依賴性活性)。已知CaMKII可通過(guò)T286磷酸化[52]和CM280/281氧化[53]來(lái)自主激活。為了測(cè)試這些機(jī)制中的一個(gè)或兩個(gè)是否負(fù)責(zé)SNAP誘導(dǎo)的CaMKII激活，本發(fā)明人使用缺乏磷酸化(T286)或氧化(CM280/281)靶位點(diǎn)的Camui的突變體重復(fù)HEK細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。在兩種情況下，CaMKII的SNAP依賴性激活得到保持。總之，本發(fā)明人的數(shù)據(jù)表明CaMKII經(jīng)受NO誘導(dǎo)的激活，并且該激活是通過(guò)獨(dú)立于先前描述的磷酸化和氧化途徑的機(jī)制進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)。計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)的數(shù)值。平均值±SEM值顯示在條形圖中。平均值±SD值記錄在文本中。每組中的細(xì)胞數(shù)在圖標(biāo)中記錄，每組中的細(xì)胞來(lái)自3-6只個(gè)體動(dòng)物。考慮到細(xì)胞之間的生物差異性，每個(gè)細(xì)胞均在統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試中被視為獨(dú)立的，盡管多個(gè)細(xì)胞可能來(lái)自一個(gè)動(dòng)物。在每組中合并來(lái)自至少3只個(gè)體動(dòng)物的細(xì)胞。對(duì)于具有正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，使用學(xué)生t檢驗(yàn)或方差分析(ANOVA)來(lái)評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。條形圖中所示的數(shù)據(jù)是每組的在相同條件下由細(xì)胞數(shù)(N＝圖標(biāo)中給出的細(xì)胞的#)計(jì)算的平均值±SEM值。每組中的細(xì)胞間差異性(生物差異性)要求遵循正態(tài)分布。例如，由在共聚焦線掃描圖像中的每秒每100μm的火花數(shù)目(圖像中以100μm*s作為單位面積，參見圖11G)計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的火花率；然后計(jì)算無(wú)負(fù)荷組中18個(gè)細(xì)胞的這種數(shù)值火花率數(shù)據(jù)的平均值、SD、SEM值。使用學(xué)生t檢驗(yàn)(使用不等方差的非配對(duì)檢驗(yàn))來(lái)評(píng)估兩個(gè)不同組的平均值的差異。如果p<0.05，該差異被認(rèn)為是顯著的，并且通過(guò)本領(lǐng)域的慣例表示為*p<0.05、p<0.01**、p<0.001***。單因素ANOVA用于比較兩個(gè)以上的組，然后使用Bonferroni后檢驗(yàn)進(jìn)行配對(duì)比較。雙因素ANOVA檢驗(yàn)用于比較具有兩個(gè)不同的因素的多個(gè)組。例如，在圖19A和19B中，在兩種不同的小鼠品系(R92Q和WT)之間以及同一品系中藥物處理組與未處理組之間比較Ca2+火花率。因此，使用雙因素ANOVA檢驗(yàn)，其顯示R92Q與WT品系之間的Ca2+火花率中的顯著差異(p<0.0001)，每個(gè)品系內(nèi)的顯著的藥物作用(p<0.0001)以及顯著的相互作用(p<0.0001)。Bonferroni后檢驗(yàn)用于配對(duì)比較，并且示出了與不含藥物的Cell-in-Gel相比，對(duì)每個(gè)品系的藥物作用的顯著差異(p<0.001***)，以及對(duì)于Cell-in-Gel條件(p<0.05#)和對(duì)于Gp91ds作用(p<0.001###)，在R92Q中比WT中顯著更高的火花率。對(duì)于具有非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，用Mann-Whitney檢驗(yàn)來(lái)比較兩個(gè)組。例如，在圖15C中，分子間距離直方圖具有非正態(tài)分布。因此，用Mann-Whitney檢驗(yàn)來(lái)比較nNOS-RyR距離與eNOS-RyR距離的直方圖，發(fā)現(xiàn)具有p<0.0001的顯著差異。使用GraphPadPRISM軟件進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)(http://www.graphpad.com/,USA)。結(jié)果在單個(gè)肌細(xì)胞收縮期間Cell-in-Gel系統(tǒng)施加機(jī)械負(fù)荷以前，機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究因難以在單細(xì)胞水平上控制對(duì)肌細(xì)胞收縮的機(jī)械負(fù)荷而受到限制。本發(fā)明人通過(guò)將新鮮分離的肌細(xì)胞包埋在由聚乙烯醇水凝膠和硼酸交聯(lián)劑制成的3D彈性基質(zhì)中來(lái)開發(fā)一種新的“Cell-in-Gel”系統(tǒng)；硼酸酯基團(tuán)還交聯(lián)細(xì)胞表面聚糖，從而將細(xì)胞表面拴系在凝膠上(圖11A，圖20)(12)。當(dāng)凝膠內(nèi)肌細(xì)胞相對(duì)于凝膠基質(zhì)收縮時(shí)，在收縮期間彈性基質(zhì)抵抗細(xì)胞的縮短和增寬，并在松弛期間相反(圖11B)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，凝膠成分是無(wú)毒的并且不影響細(xì)胞功能(圖12)。這種Cell-in-Gel系統(tǒng)在兩個(gè)重要方面模擬體內(nèi)機(jī)械環(huán)境：一是在收縮期間施加多軸向3D機(jī)械應(yīng)力；另一方面是將細(xì)胞表面拴系至凝膠上以對(duì)細(xì)胞表面施加正應(yīng)力和剪切應(yīng)力。(13)在收縮和舒張期間后負(fù)荷誘導(dǎo)的Ca2+處理的變化本發(fā)明人使用Cell-in-Gel系統(tǒng)研究了在機(jī)械后負(fù)荷下的肌細(xì)胞收縮期間的機(jī)械應(yīng)力作用。將肌細(xì)胞以0.5Hz起搏以達(dá)到穩(wěn)態(tài)收縮，同時(shí)用蒂羅德溶液連續(xù)灌注。與無(wú)負(fù)荷收縮(圖11C)相比，凝膠內(nèi)肌肉收縮(圖11D)示出更小的縮短分?jǐn)?shù)(圖11E)；還示出收縮中增強(qiáng)了的Ca2+瞬變(圖11F)以及舒張期間的自發(fā)性Ca2+火花(圖11G)。Ca2+火花率(每個(gè)單位面積的火花)在無(wú)負(fù)荷條件下較低，在軟凝膠(凝膠5％)中稍微增加，在硬凝膠(凝膠7.5％)中顯著增加；用Blebbistatin去耦收縮以恢復(fù)Ca2+瞬變和火花率至無(wú)負(fù)荷條件(圖11G)，這表明機(jī)械負(fù)荷和自發(fā)性Ca2+火花產(chǎn)生之間的正相關(guān)性。因此，收縮期間對(duì)肌細(xì)胞的后負(fù)荷提高了收縮期的Ca2+瞬變，其增強(qiáng)了收縮性以抵抗機(jī)械負(fù)荷；而且在舒張期間引起自發(fā)性Ca2+火花，其可導(dǎo)致致心律不齊活動(dòng)。在下面的所有實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明人用具有凝膠7.5％的Cell-in-Gel系統(tǒng)在肌細(xì)胞收縮期間施加機(jī)械后負(fù)荷。瞬態(tài)響應(yīng)(圖14A、14B)示出了在最初數(shù)次收縮搏動(dòng)期間，舒張期的Ca2+火花很少，但接著在隨后搏動(dòng)中明顯上升。一旦起搏停止，火花幾乎立即消失。最初的延遲表明機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)的積聚過(guò)程以激活導(dǎo)致RyR調(diào)節(jié)并增加Ca2+火花的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。這種延遲與Anrep效應(yīng)的緩慢起動(dòng)一致，其需要幾分鐘才在組織水平上完全發(fā)生(3)。Ca2+火花在起搏停止后立即消失的事實(shí)也與可逆的NO信號(hào)傳導(dǎo)作用相符(14、15)。為了檢測(cè)Ca2+瞬變和Ca2+火花的增加是否是由于肌質(zhì)網(wǎng)(SR)Ca2+含量升高，本發(fā)明人使用Fura-2比率法測(cè)量細(xì)胞溶質(zhì)的Ca2+濃度和SR含量。如圖14C所示，將肌細(xì)胞以0.5Hz起搏；達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，停止起搏，15秒后迅速應(yīng)用咖啡因以釋放SRCa2+含量。雖然與無(wú)負(fù)荷的情況相比，在凝膠內(nèi)肌細(xì)胞收縮中收縮期的Ca2+瞬變?cè)黾?圖14D)，但是SRCa2+含量沒(méi)有示出可檢測(cè)的變化(圖14E)。因此，對(duì)于凝膠內(nèi)肌細(xì)胞收縮，分級(jí)的SRCa2+釋放更高(Ca2+瞬變峰值與SR含量的比率：凝膠內(nèi)85±6％對(duì)比無(wú)負(fù)荷的77±7％)，表明RyR敏感性增加。增加的RyR敏感性也可解釋舒張期的Ca2+火花的增加。高RyR敏感性和舒張期SRCa2+釋放將減少SRCa2+含量(16)，除非通過(guò)以下方式對(duì)其補(bǔ)償：通過(guò)SERCA增強(qiáng)SRCa2+攝取或通過(guò)Na+/Ca2+交換減少Ca2+移出。實(shí)際上，收縮期的Ca2+瞬變下降沒(méi)有改變(圖14F、圖16B)，這表明盡管有更大的釋放，SRCa2+攝取仍然能夠減少(Ca2+)。此外，凝膠內(nèi)肌細(xì)胞表現(xiàn)出咖啡因誘導(dǎo)的Ca2+瞬變更慢的降低(圖14G)，這表明通過(guò)Na+/Ca2+交換和肌纖維膜Ca2+泵減少Ca2+移出通量。盡管SRCa2+釋放增加，上述伴隨的變化允許肌細(xì)胞維持正常的SRCa2+含量。機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)中的局部的nNOS和eNOS信號(hào)傳導(dǎo)為了破譯介導(dǎo)后負(fù)荷誘導(dǎo)的Ca2+處理的變化的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，本發(fā)明人檢驗(yàn)了一氧化氮信號(hào)傳導(dǎo)的參與性。將肌細(xì)胞以0.5Hz起搏直至收縮達(dá)到穩(wěn)態(tài)。凝膠內(nèi)肌細(xì)胞表現(xiàn)出高度自發(fā)性的Ca2+火花率(圖15A)。抑制所有NOS同種型的L-NAME有效抑制了Ca2+火花(圖15B)，表明NOS信號(hào)傳導(dǎo)是機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的。接下來(lái)，本發(fā)明人區(qū)分在心室肌細(xì)胞中組成性表達(dá)的NOS的神經(jīng)同種型(nNOS或NOS1)和內(nèi)皮同種型(eNOS或NOS3)(17)。令本發(fā)明人驚訝的是，用L-Nio-二鹽酸鹽(L-Nio)選擇性抑制eNOS不能抑制Ca2+火花(圖15A、15B)。然而，使用Nω-丙基-L-精氨酸鹽酸鹽(L-NPA)選擇性抑制nNOS有效抑制了Ca2+火花(圖15A、15B)。這些數(shù)據(jù)與nNOS(而不是eNOS)介導(dǎo)后負(fù)荷誘導(dǎo)的自發(fā)性Ca2+火花的結(jié)論相符。為了排除藥理學(xué)抑制劑的可能的非特異性作用，本發(fā)明人還用遺傳敲除nNOS-/-和eNOS-/-小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。nNOS-/-肌細(xì)胞表現(xiàn)出非常少的后負(fù)荷誘導(dǎo)的Ca2+火花(圖15A、15C)。相比之下，eNOS-/-肌細(xì)胞在凝膠內(nèi)收縮期間表現(xiàn)出高的Ca2+火花頻率(圖15A、15D)；抑制eNOS-/-肌細(xì)胞中的nNOS有效抑制了Ca2+火花(圖15A、15D)。因此，nNOS而不是eNOS介導(dǎo)后負(fù)荷誘導(dǎo)的自發(fā)性SRCa2+釋放。nNOS與eNOS對(duì)Ca2+火花的選擇性作用的看似合理的解釋是nNOS與RyR的接近度，因?yàn)镹O被認(rèn)為是短壽命的局部信號(hào)傳導(dǎo)分子。在心肌細(xì)胞中，eNOS據(jù)報(bào)道在細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷中(18)，而nNOS定位于SR(19)和肌纖維膜中(20)。然而，RyR與nNOS以及RyR與eNOS的分子間距離尚未唄測(cè)量。由于共聚焦分辨率不足以辨別這些距離(圖17A)，本發(fā)明人使用超分辨率的結(jié)構(gòu)化照明顯微鏡(SIM)來(lái)定量nNOS-RyR與eNOS-RyR的共定位。SIM圖像顯示出nNOS與RyR緊密共定位(圖17B)，而eNOS定位距RyR的更遠(yuǎn)處(圖15F)。共定位分析產(chǎn)生nNOS-RyR的0.438和eNOS-RyR的0.125的重疊系數(shù)(圖17C)。最近相鄰距離直方圖(圖17D)也顯示出顯著不同的模式，其中nNOS-RyR距離峰值在0.19μm處，eNOS-RyR距離在0.37μm處，其為兩倍的差距。有效的NO信號(hào)傳導(dǎo)范圍應(yīng)該受擴(kuò)散距離、NOS產(chǎn)生的NO量、降解/去除和緩沖能力以及靶向修飾動(dòng)力學(xué)的影響。信號(hào)傳導(dǎo)距離的2倍變化將轉(zhuǎn)換為靶位點(diǎn)的慢4倍的擴(kuò)散時(shí)間和8倍的NO濃度降低。上述與功能數(shù)據(jù)結(jié)合的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與下列結(jié)論一致：nNOS與eNOS信號(hào)傳導(dǎo)的有效范圍高度定位在心肌細(xì)胞亞微米結(jié)構(gòu)域中。健康心臟中和心肌病中的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)為了進(jìn)一步探討機(jī)械應(yīng)力和Ca2+動(dòng)力學(xué)之間的關(guān)系，本發(fā)明人還研究了在肌鈣蛋白T中具有R92Q突變的家族性肥厚性心肌病模型。人或小鼠心臟中的R92Q突變導(dǎo)致肌絲Ca2+敏感性增加，并表現(xiàn)出心律失常和心臟性猝死(21)(22)(23)(24)(25)。一個(gè)主要的未解決的問(wèn)題是收縮蛋白中的突變?nèi)绾螌?dǎo)致心律失常(26)(27)。因此，本發(fā)明人研究了R92Q肌細(xì)胞中的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)。后負(fù)荷誘導(dǎo)的自發(fā)性Ca2+火花率在R92肌細(xì)胞中(圖19A、19B)顯著高于野生型肌細(xì)胞(圖19B)。一致地，通過(guò)抑制nNOS而不是eNOS可抑制火花(圖19A，19B)。本發(fā)明人的數(shù)據(jù)與下列結(jié)論一致：機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)敏感性增加導(dǎo)致自發(fā)性Ca2+活性增加；從而提供對(duì)R92QFHC心臟中的Ca2+誘導(dǎo)的心律失常的機(jī)械性解釋(28-31)。為了擴(kuò)展信號(hào)傳導(dǎo)分析，本發(fā)明人測(cè)試了由預(yù)負(fù)荷激活的(8)NOX2-ROS信號(hào)是否也可由后負(fù)荷進(jìn)行。圖19B示出用gp91ds-tat抑制NOX2減少了野生型而不是R92Q肌細(xì)胞中的后負(fù)荷誘導(dǎo)的Ca2+火花；這顯示了NOX2的復(fù)雜參與性。由于NOX2被發(fā)現(xiàn)可被nNOS信號(hào)傳導(dǎo)激活(32)，預(yù)期這兩者之間存在復(fù)雜的相互作用。CaMKII被ROS(53)激活，本發(fā)明人證明了它還可被NO信號(hào)傳導(dǎo)激活(圖18)；然后CaMKII可將RyR磷酸化以刺激Ca2+火花(33)。實(shí)際上，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)CaMKII抑制在WT和R92Q小鼠中均防止了后負(fù)荷誘導(dǎo)的Ca2+火花增加(圖19B)。討論總之，使用本Cell-in-Gel系統(tǒng)，本發(fā)明人已確定了參與機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵分子，其在肌細(xì)胞收縮期間響應(yīng)于機(jī)械負(fù)荷而引發(fā)Ca2+處理的變化。收縮期的Ca2+瞬變可通過(guò)后負(fù)荷來(lái)增加，這可較好地以機(jī)械方式促進(jìn)Anrep效應(yīng)(3,4,34,35)。后負(fù)荷誘導(dǎo)的自發(fā)性Ca2+火花可通過(guò)抑制nNOS而不是eNOS來(lái)抑制，盡管這兩種NOS同種型都參與增加Ca2+瞬變。nNOS與eNOS對(duì)調(diào)節(jié)RyR的趨異作用可通過(guò)高度定位的NO信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)解釋；來(lái)自超分辨率成像的數(shù)據(jù)與以下結(jié)論相符：胞分泌NO信號(hào)傳導(dǎo)在肌細(xì)胞中的亞微米范圍內(nèi)。除了NOS之外，還發(fā)現(xiàn)在肌細(xì)胞收縮期間NOX2和CaMKII參與由機(jī)械后負(fù)荷觸發(fā)的SRCa2+釋放增強(qiáng)。關(guān)于后負(fù)荷作用的本研究補(bǔ)充了關(guān)于預(yù)負(fù)荷作用的先前研究，所述預(yù)負(fù)荷中并不涉及nNOS并且未研究CaMKII(6,8)。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在已知的具有高的心律失常發(fā)生率的家族性肥大性心肌病模型中選擇性抑制nNOS和CaMKII可有效地抑制后負(fù)荷誘導(dǎo)的自發(fā)性Ca2+活性(25)(36)(37)。因此，除了包括NOX(8)、血管緊張素II(38)、瞬時(shí)受體電位典型通道(39)以及更多(由(4)述及)的其他已知的途徑之外，本發(fā)明人在本文中描述的機(jī)械NOS-CaMKII途徑還提供了基本的機(jī)械工作模型(圖19C)，用于了解Anrep效應(yīng)。通過(guò)NOS和CaMKII信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了關(guān)于治療機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的Ca2+調(diào)節(jié)異常、心律失常和心肌病的治療性見解。實(shí)施例7的參考文獻(xiàn)1vonAnrep，G.(1912)Onthepartplayedbythesuprarenalsinthenormalvascularreactionsofthebody.J.Physiol.45，307-3172Sarnoff，S.J.，Mitchell，J.H.，Gilmore，J.P.andRemensnyder，J.P.(1960)Homeometricautoregulationintheheart.Circ.Res.8，1077-10913Nichols，C.G.，Hanck，D.A.andJewell，B.R.(1988)TheAnrepeffect：anintrinsicmyocardialmechanism.CanJPhysiolPharmacol.66，924-9294Cingolani，H.E.，Pérez，N.G.，Cingolani，O.H.and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RyR活性以引發(fā)Ca2+火花(Jian,etal.,SciSignal.(2014)Mar18；7(317):ra27)。因此，本發(fā)明人的數(shù)據(jù)與下列結(jié)論相符：在α-DG或在抗肌萎縮蛋白點(diǎn)上破壞命令鏈可切斷從DGC到NOS信號(hào)傳導(dǎo)和到Ca2+處理系統(tǒng)的機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過(guò)選擇性拴系細(xì)胞表面機(jī)械傳感器研究特定的MCT復(fù)合體。在本發(fā)明人的Cell-in-Gel系統(tǒng)的一個(gè)特征中，將抗生物素蛋白改造到凝膠聚合物中以“鉤”在生物素綴合的分子上。這能使特定的細(xì)胞表面分子被拴系在凝膠基質(zhì)中。在Jianetal.,中(參見上文)，發(fā)現(xiàn)抗肌萎縮蛋白聚糖通過(guò)硼酸酯-PEG交聯(lián)劑結(jié)合至凝膠上，其在野生型心肌細(xì)胞中通過(guò)DGC轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)械應(yīng)力以產(chǎn)生Ca2+火花(圖22A)。然而，在不存在抗肌萎縮蛋白的mdx小鼠心肌細(xì)胞中，缺失抗肌萎縮蛋白和nNOS破壞了機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)中的命令鏈；因此它使機(jī)械應(yīng)力與產(chǎn)生Ca2+火花之間去耦和(圖22B)。然后，本發(fā)明人通過(guò)使用具有抗β1整聯(lián)蛋白亞基的一級(jí)抗體和生物素綴合的二級(jí)抗體的PVA-抗生物素蛋白凝膠將抗肌萎縮蛋白聚糖和整聯(lián)蛋白拴系在凝膠上。將DGC和VTI兩者拴系到凝膠中，產(chǎn)生了明顯不同于單獨(dú)拴系DGC的作用。在wt心肌細(xì)胞中，機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的Ca2+火花增加(圖22C)。然而，當(dāng)DGC被拴系時(shí)，mdx心肌細(xì)胞缺乏Ca2+火花(圖22D)，但當(dāng)DGC和VTI都被拴系時(shí)(因?yàn)閮烧叨急凰┫抵馏w內(nèi)的胞外基質(zhì)中)，則表現(xiàn)出高頻率的自發(fā)性Ca2+火花和波。這與mdx對(duì)機(jī)械負(fù)荷(壓力過(guò)載)的脆弱性相符?？墒褂眠@種“拴系”技術(shù)以及“掩蔽”來(lái)研究各種機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體(整聯(lián)蛋白同種型、其他機(jī)械傳感器)。成為機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)物的DGC的生理和病理生理學(xué)影響。本發(fā)明人的數(shù)據(jù)與下列結(jié)論相符：的DGC在收縮自身調(diào)節(jié)反饋回路中作為機(jī)械-化學(xué)-轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體發(fā)揮作用。這可以解釋為什么杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)中缺陷性DGC可破壞反饋回路導(dǎo)致收縮自身調(diào)節(jié)受損。在全心臟水平上，受損的自身調(diào)節(jié)表現(xiàn)為對(duì)響應(yīng)于變化的后負(fù)荷的心輸出量的調(diào)節(jié)更差。事實(shí)上，許多DMD患者表現(xiàn)出與該預(yù)測(cè)相符的癥狀。例如，在年輕的DMD患者中，超聲心動(dòng)圖測(cè)量值顯示出縮短分?jǐn)?shù)減小(Ramaciotti,etal.,J.ChildNeurol.(2002)17:191-194)，以及無(wú)抗肌萎縮蛋白的mdx小鼠極易受到壓力過(guò)載的損傷(Kamogawa,etal.,CardiovascularResearch(2001)50:509-515)。相反，降低心臟的負(fù)荷(ACE抑制劑和β-阻斷劑處理)對(duì)心臟有所幫助(Jefferies,etal.,Circulation(2005)112:2799-2804)。先前研究還表明，mdx心肌細(xì)胞具有錯(cuò)位的nNOS、不變的eNOS和上調(diào)的iNOS(Bia,etal.,JournalofMolecularandCellularCardiology(1999)3:1857-1862)。在mdx小鼠中表達(dá)nNOS可減少ECG的異常(Wehling-Henricks,etal.,HumanMolecularGenetics(2005)14:1921-1933)。這些數(shù)據(jù)支持了本發(fā)明人關(guān)于DGC在M-C轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到重要作用的新發(fā)現(xiàn)。肌營(yíng)養(yǎng)不良領(lǐng)域的先前的研究主要集中在DGC作為膜完整性的支撐結(jié)構(gòu)的作用，而DGC在M-C轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用還沒(méi)有得到全面的研究并且尚不明確。Cell-in-Gel系統(tǒng)提供了一個(gè)在分子和細(xì)胞水平上研究通過(guò)DGC進(jìn)行的M-C轉(zhuǎn)導(dǎo)的有用的工具。本文中，本發(fā)明人的數(shù)據(jù)表明DGC轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)械應(yīng)力來(lái)影響心肌細(xì)胞中的調(diào)節(jié)Ca2+動(dòng)力學(xué)的NOS信號(hào)傳導(dǎo)。識(shí)別參與的關(guān)鍵分子將為開發(fā)用于治療肌營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的心肌病的新療法提供新的藥物靶標(biāo)。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于舉例說(shuō)明目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)想到對(duì)其的各種修改或改變并且這些修改和改變包括在本申請(qǐng)的精神和權(quán)屬內(nèi)以及隨附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。出于所有目的，本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均通過(guò)引證的方式全文納入本說(shuō)明書中。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3