本發(fā)明系關(guān)于雙特異性抗體、靶向CD20和CD3抗原及殺死腫瘤之方法。本發(fā)明亦關(guān)于降低及/或控制可由與腫瘤治療之抗體療法有關(guān)之Fc結(jié)合所產(chǎn)生的效應(yīng)子功能。

【先前技術(shù)】

雙靶向抗體策略已應(yīng)用于其中多因素調(diào)節(jié)系瞄準(zhǔn)改善治療效用的復(fù)合疾病。CD20為一表現(xiàn)在成熟B細(xì)胞之細(xì)胞膜上的非糖基化磷蛋白。CD20被視為B-細(xì)胞腫瘤相關(guān)抗原，因?yàn)橛谐^95％的B-細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)和其他B-細(xì)胞惡性腫瘤表現(xiàn)CD20，但其在B-細(xì)胞前體、樹突細(xì)胞和漿細(xì)胞中則無。以CD20為標(biāo)靶之治療癌癥的方法已為本項(xiàng)技術(shù)所知。例如，嵌合的抗-CD20單株抗體利妥昔單抗(rituximab)已用于或建議用于治療癌癥，例如NHL、慢性淋巴性白血病(CLL)和小淋巴性淋巴瘤(SLL)。咸信抗-CD20抗體系藉由補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)、抗體依賴的細(xì)胞媒介細(xì)胞毒性(ADCC)及/或引發(fā)細(xì)胞凋亡和對(duì)化學(xué)治療的敏感性，殺死CD20-表現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞，雖然某些病患已顯示對(duì)抗-CD20治療發(fā)生阻抗性或出現(xiàn)不完全反應(yīng)(例如，對(duì)利妥昔單抗具抗性)。

CD3為一表現(xiàn)在與T細(xì)胞受體復(fù)合物(TCR)有關(guān)之T細(xì)胞上的同源二聚性或異源二聚性抗原，且為T細(xì)胞活化所需。功能性CD3系由四條不同鏈中的二條鏈二聚結(jié)合所形成：ε、ζ、δ和γ。能與CD3和目標(biāo)抗原，例如CD20結(jié)合之雙特異性抗體己被提出作為涉及針對(duì)組織和表現(xiàn)目標(biāo)抗原細(xì)胞之T細(xì)胞免疫反應(yīng)的治療用途。

具有CD20-及結(jié)合臂和CD3-結(jié)合臂之雙特異性抗體可提供增大抗腫瘤活性之必須的相互干擾(crosstalk)。在此雙特異性抗體中的第三形式為Fc區(qū)。修改Fc結(jié)合性質(zhì)可進(jìn)一步增大治療性抗體的抗腫瘤效力。

免疫球蛋白Fc區(qū)與其受體的結(jié)合產(chǎn)生了各種訊號(hào)傳遞及免疫反應(yīng)。這些各種的「效應(yīng)子功能」，例如CDC和ADCC，為G類(IgGs)免疫球蛋白在IgG的Fab區(qū)和目標(biāo)抗原之間形成一復(fù)合物之結(jié)果，然而IgG的Fc區(qū)系在效應(yīng)子細(xì)胞上與Fc受體結(jié)合。某些IgG的效應(yīng)子功能系與抗原結(jié)合無關(guān)并包括例如循環(huán)血清量和轉(zhuǎn)移Ig跨過屏障之能力的功能其他的效應(yīng)子功能被視為用于免疫球蛋白治療，例如癌癥治療所必須。特別是ADCC機(jī)制被視為市面上治療性抗體，例如曲妥珠單抗(rastuzumab)(轉(zhuǎn)移性乳癌)和利妥昔單抗(非何杰金氏淋巴瘤)之主要的抗腫瘤機(jī)制之一。

目前的治療策略典型地系建議，降低效應(yīng)子功能(或降低Fcγ受體結(jié)合)對(duì)于其目標(biāo)為中和或抑制抗原之生物活性(例如抗體阻斷劑或拮抗劑)，或活化或觸發(fā)下游細(xì)胞訊號(hào)傳遞(例如抗體促效劑)的抗體可能為有用的。然而，具有降低的效應(yīng)子功能之腫瘤靶向抗體的設(shè)計(jì)為違反直覺的，因?yàn)轭A(yù)料中降低標(biāo)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性對(duì)于治療疾病，亦即破壞腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤生長將不會(huì)有功效。

文中所描述的一策略系利用分化的Fc受體結(jié)合與雙特異性抗原特異性結(jié)合標(biāo)靶腫瘤標(biāo)記組合，以及觸發(fā)腫瘤-特異性T細(xì)胞致死。抗體的Fc區(qū)系設(shè)計(jì)用以小心控制Fc受體結(jié)合，以消除或降低細(xì)胞，如帶有Fc受體之T細(xì)胞、中性殺手細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之不欲的死亡。有關(guān)包括FcγRII受體結(jié)合相互作用，但缺乏FcγRI或FcγRIII相互作用之Fc受體相互作用的獨(dú)特結(jié)合模式以描述于本項(xiàng)技術(shù)中供腫瘤-靶向的Ig治療。

因此，具有降低與Fc受體結(jié)合之雙特異性B細(xì)胞和T細(xì)胞靶向抗體的組合產(chǎn)生意想不到的有利治療性質(zhì)。與CD3和CD20二者結(jié)合之雙特異性抗體特別可用于其中控制以特異性CD20為標(biāo)靶及有效細(xì)胞毒性為所希望之臨床狀況。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在第一方面，本發(fā)明系提供結(jié)合人類CD3和CD20之具有改變的Fc結(jié)合區(qū)的雙特異性抗體。根據(jù)本發(fā)明此方面之抗體可用于，其中包括，以表現(xiàn)CD3之T細(xì)胞為標(biāo)靶，及用于刺激T細(xì)胞活化，例如于其中T細(xì)胞媒介的毒殺就針對(duì)特定細(xì)胞類型，例如抗-CD20腫瘤細(xì)胞之CD3-媒介T細(xì)胞活化的部分雙特異性抗體為有利或所欲的之情況。此等抗體系進(jìn)一步經(jīng)工程化，以具有在免疫系統(tǒng)的天然庫中未發(fā)現(xiàn)之特定效應(yīng)子功能。

本發(fā)明之例示性抗-CD3/CD20抗體系列于文中的表1至表8中。表1系列出例示的雙特異性抗體之重鏈可變區(qū)(HCVR)和輕鏈可變區(qū)(LCVR)，以及重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(LCDR1、LCDR2和LCDR3)之氨基酸序列標(biāo)識(shí)符。表2系列出編碼例示的雙特異性抗體之HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸分子之序列標(biāo)識(shí)符組合。表3系列出包括HCVR、重鏈恒定區(qū)(CH)和LCVR組合之例示雙特異性抗體的氨基酸序列標(biāo)識(shí)符。表4系列出編碼例示雙特異性抗體之HCVR、重鏈恒定區(qū)(CH)和LCVR組合的核酸分子之核酸序列辨識(shí)碼組合。

表5系描述本發(fā)明之重鏈實(shí)例的氨基酸序列辨識(shí)碼，其中此雙特異性抗體系包括一HCVR，而該HCVR系包含與本發(fā)明CH配對(duì)之表5的HCDR1、HCDR2和HCDR3。表6個(gè)別地系描述本發(fā)明之輕鏈實(shí)例的氨基酸序列辨識(shí)碼，其中此雙特異性抗體系包括一包含表6之LCDR1、LCDR2和LCDR3的LCVR。

本發(fā)明系提供包括一HCVR之抗體或其抗原結(jié)合片段，而該HCVR系包括一由表1所列的HCVR氨基酸序列中選出之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％其序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似序列。

本發(fā)明亦提供包括一LCVR之抗體或其抗原結(jié)合片段，而該LCVR系包括一由表1所列的LCVR氨基酸序列中選出之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％其序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似序列。

本發(fā)明亦提供包括一HCVR和LCVR氨基酸序列對(duì)(HCVR/LCVR)之抗體或其抗原結(jié)合片段，而該HCVR和LCVR氨基酸序列對(duì)系包括一包含在表1所列的例示抗-CD3/CD20抗體中之氨基酸序列對(duì)。在特定的實(shí)施例，此HCVR/LCVR氨基酸序列對(duì)系由下列組成之群中選出：SEQ ID NO：2/18和10/18(例如，抗體1和抗體2)。

本發(fā)明亦提供包括一重鏈CDR1(HCDR1)之抗體或其抗原結(jié)合片段，而該重鏈CDR1系包括一由表1所列的HCDR1氨基酸序列中選出之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

本發(fā)明亦提供包括一重鏈CDR2(HCDR2)之抗體或其抗原結(jié)合片段，而該重鏈CDR2系包括一由表1所列的HCDR2氨基酸序列中選出之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

本發(fā)明亦提供包括一重鏈CDR3(HCDR3)之抗體或其抗原結(jié)合片段，而該重鏈CDR3系包括一由表1所列的HCDR3氨基酸序列中選出之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

本發(fā)明亦提供包括一輕鏈CDR1(LCDR1)之抗體或其抗原結(jié)合片段，而該輕鏈CDR1系包括一由表1所列的LCDR1氨基酸序列中選出之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

本發(fā)明亦提供包括一輕鏈CDR2(LCDR2)之抗體或其抗原結(jié)合片段，而該輕鏈CDR2系包括一由表1所列的LCDR2氨基酸序列中選出之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

本發(fā)明亦提供包括一輕鏈CDR3(LCDR3)之抗體或其抗原結(jié)合片段，而該輕鏈CDR3系包括一由表1所列的LCDR3氨基酸序列中選出之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

本發(fā)明亦提供包括一HCDR3和LCDR3氨基酸序列對(duì)(HCDR3/LCDR3)之抗體或其抗原結(jié)合片段，而該HCDR3和LCDR3氨基酸序列對(duì)系包括表1所列的HCDR3氨基酸序列與表1所列的任何LCDR3氨基酸序列配對(duì)，例如，由SEQ ID NO：8/16(例如，抗體1或抗體2)組成之群中選出的HCDR3/LCDR3氨基酸序列對(duì)。

本發(fā)明亦提供包括一組六個(gè)包含在表1中之CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗體或其抗原結(jié)合片段。在特定的實(shí)施例中，此HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列組為SEQ ID NO：4-6-8-20-22-24；或12-14-16-20-22-24(例如，抗體1或抗體2)。

在一相關(guān)的實(shí)施例中，本發(fā)明系提供包括一組六個(gè)包含在如表1所列的例示性抗體所定義的HCVR/LCVR氨基酸序列對(duì)中之CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)的抗體或其抗原結(jié)合片段。例如，本發(fā)明系包括含有HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列組之抗體或其抗原結(jié)合片段，而該氨基酸序列組系包含在由SEQ ID NO:2/18(例如，抗體1或抗體2)組成之群中選出的HCVR/LCVR氨基酸序列對(duì)中。用于辨識(shí)HCVR和LCVR氨基酸序列中之CDR的方法和技術(shù)已為本項(xiàng)技術(shù)所熟知并可用于鑒別文中所揭示的特定HCVR及/或LCVR氨基酸序列內(nèi)的CDR?？捎糜阼b別CDR界限之例示性習(xí)用法包括，例如Kabat定義、Chothia定義和AbM定義。一般而言，Kabat定義系以序列變異性為基準(zhǔn)，Chothia定義系以結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)域之位置為基準(zhǔn)，而AbM定義為介于Kabat和Chothia法之折衷。參見，例如Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；及Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。亦可取得公開的數(shù)據(jù)庫用以鑒別抗體內(nèi)的CDR序列。

本發(fā)明亦提供編碼抗體或其部分之核酸分子。例如，本發(fā)明系提供編碼表1中所列的HCVR或LCVR氨基酸序列之核酸分子；在特定的實(shí)施例中，此核酸分子系包括由表2所列的HCVR/LCVR核酸序列中選出之多核苷酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％其序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

本發(fā)明亦提供編碼表1中所列的HCDR1或HCDR2或HCDR3氨基酸序列之核酸分子；在特定的實(shí)施例中，此核酸分子系包括由表2所列的HCDR1或HCDR2或HCDR3核酸序列中選出之多核苷酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％其序相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

本發(fā)明亦提供編碼表1中所列的LCDR1或LCDR2或LCDR3氨基酸序列之核酸分子；在特定的實(shí)施例中，此核酸分子系包括由表2所列的LCDR1或LCDR2或LCDR3核酸序列中選出之多核苷酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％其序相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

本發(fā)明亦提供編碼HCVR之核酸分子，其中該HCVR系包括一組三個(gè)CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中該HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列組系如表1所列的例示性抗-CD3抗體所定義。

本發(fā)明亦提供編碼LCVR之核酸分子，其中該LCVR系包括一組三個(gè)CDR(亦即LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中該LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列組系如表1所列的例示性抗-CD3抗體所定義。

本發(fā)明亦提供編碼HCVR和LCVR二者之核酸分子，其中此HCVR系包括一表1中所列的HCVR氨基酸序列之氨基酸序列，及其中此LCVR系包括一表1中所列的LCVR氨基酸序列之氨基酸序列。在特定的實(shí)施例中，此核酸分子系包括由表2所列的任何HCVR核酸序列中選出之多核苷酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％其序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列，及由表2所列的LCVR核酸序列中選出之多核苷酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％其序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。在根據(jù)本發(fā)明此方面之特定的實(shí)施例中，此核酸分子系編碼HCVR和LCVR，其中該HCVR和LCVR二者系衍生自表1中所列的相同抗-CD3抗體。

本發(fā)明亦提供包括重鏈恒定區(qū)(CH)之抗體或其抗原結(jié)合片段，而該重鏈恒定區(qū)(CH)系包括一選自表2所列的CH氨基酸序列之氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

本發(fā)明亦提供包括一重鏈恒定區(qū)(CH)之抗體或其抗原結(jié)合片段，而該重鏈恒定區(qū)(CH)系由選自表2所列的CH核酸序列之核酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列所編碼。

本發(fā)明亦提供能表現(xiàn)包括抗-CD3抗體之重鏈或輕鏈可變區(qū)及抗-CD20抗體之重鏈或輕鏈可變區(qū)之多肽的重組表現(xiàn)載體。例如，本發(fā)明系包括重組的表現(xiàn)載體，該載體系包括任何上文所提之核酸分子，亦即編碼表1和表2中所列的任何HCVR、LCVR及/或CDR序列，及/或CH序列之核酸分子。本發(fā)明之范圍亦包括已導(dǎo)入此等載體之宿主細(xì)胞，以及藉由在得以產(chǎn)生抗體和抗體片段之條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并回收所產(chǎn)生的抗體和抗體片段來制造抗體或其部分之方法。

在另一方面，本發(fā)明系提供一治療上有效量之專一與CD3和CD20結(jié)合的重組人類抗體或其片段，其中該抗體系包括一嵌合的Fc區(qū)及一醫(yī)藥上可接受載劑。在一相關(guān)的方面，本發(fā)明之特征為組合抗-CD3/CD20抗體和第二治療劑之組成物。在一實(shí)施例中，此第二治療劑為任何有利地與抗-CD3/CD20抗體組合之試劑?？捎欣嘏c抗-CD3/CD20抗體組合之例示性試劑包括(不限于)結(jié)合及/或活化CD3訊號(hào)之其他試劑(包括其他抗體或其抗原結(jié)合片段等)，及/或不直接與CD3結(jié)合然而卻活化或刺激免疫細(xì)胞活化作用，或增進(jìn)腫瘤死亡之試劑。涉及本發(fā)明抗-CD3抗體之另外的組合治療及共調(diào)配物系揭示于文中的他處。

根據(jù)另外的方面，本發(fā)明系提供與CD3和一目標(biāo)抗原結(jié)合之雙特異性抗原-結(jié)合分子，其中該分子系包括一如文中所述的嵌合Fc區(qū)。根據(jù)特定的例示性實(shí)施例，此雙特異性抗原-結(jié)合分子系與CD3和CD20結(jié)合；此等雙特異性抗原-結(jié)合分子在文中亦稱為「抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子」?？?CD3/抗-CD20雙特異性分子之抗-CD20部分系用于以表現(xiàn)CD20之腫瘤細(xì)胞(例如B-細(xì)胞腫瘤)為標(biāo)靶，而雙特異性分子之抗-CD3部分系用于活化T-細(xì)胞。同時(shí)結(jié)合腫瘤細(xì)胞上的CD20和T-細(xì)胞上的CD3，藉由活化的T-細(xì)胞和結(jié)合嵌合Fc區(qū)之效應(yīng)子細(xì)胞的幫助，媒介了定向性殺死標(biāo)靶的腫瘤細(xì)胞(細(xì)胞裂解)。本發(fā)明之抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子因此可用于，其中包括，治療與CD20-表現(xiàn)腫瘤或由其造成的疾病和病癥(例如淋巴瘤和黑色素瘤腫瘤)。

本發(fā)明之抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子進(jìn)一步系提供消退CD20-陽性腫瘤之方法。本發(fā)明因此系于一患者中提供治療B細(xì)胞癌癥之方法，此方法系包括投予一治療上有效量之本發(fā)明抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子，其中該量系足以在患者中降低腫瘤負(fù)荷，產(chǎn)生腫瘤消退或降低腫瘤發(fā)展。

本發(fā)明之抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子進(jìn)一步系提供抑制或消退CD20-陽性(亦即CD20-表現(xiàn))黑色素瘤之方法。本發(fā)明因此系于一患者中提供治療CD20-陽性黑色素瘤之方法，此方法系包括投予一治療上有效量之本發(fā)明抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子，其中該量系足以在患者中抑制腫瘤生長，降低腫瘤負(fù)荷或降低腫瘤發(fā)展。

在另外方面，本發(fā)明系提供雙特異性抗體用于患者中治療或改善癌癥之用途，其中該雙特異性抗體系包括一結(jié)合人類CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)，一結(jié)合人類CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)，以及一拴住各第一和第二抗原區(qū)之嵌合Fc區(qū)，而此治療或改善癌癥系包括：(a)于患者中抑制腫瘤生長，(b)于患者中媒介B-系胞裂解，(c)于患者中治療B-細(xì)胞癌癥，(d)于患者中治療CD20表現(xiàn)為陽性的癌癥，或(e)于患者中治療CD20-表現(xiàn)的黑色瘤癌癥。

在另外方面，本發(fā)明系提供雙特異性抗體用于患者中抑制腫瘤生長之用途，其中該雙特異性抗體系包括一結(jié)合人類CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)，一結(jié)合人類CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)，以及拴住各第一和第二抗原區(qū)之嵌合Fc區(qū)。在某些案例中，抑制腫瘤生長系包括：(a)于患者中抑制腫瘤生長，(b)于患者中降低腫瘤大小，或(c)于患者中降低腫瘤數(shù)目。

在另外方面，本發(fā)明系提供雙特異性抗體用于患者中媒介B-細(xì)胞裂解之用途，其中該雙特異性抗體系包括一結(jié)合人類CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)，一結(jié)合人類CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)，以及一拴住各第一和第二抗原區(qū)之嵌合Fc區(qū)。在某些案例中，此B-細(xì)胞為前-B淋巴細(xì)胞、成熟的B-淋巴細(xì)胞，或B-細(xì)胞非何杰金氏淋巴癌細(xì)胞。

在另外方面，本發(fā)明系提供雙特異性抗體用于患者中治療B-細(xì)胞癌癥之用途，其中該雙特異性抗體系包括一結(jié)合人類CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)，一結(jié)合人類CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)，以及一拴住各第一和第二抗原區(qū)之嵌合Fc區(qū)。在某些情況下，此B-細(xì)胞癌癥系由下列組成之群中選出：濾泡型淋巴癌、B-細(xì)胞慢性淋巴性白血病、B-細(xì)胞淋巴母細(xì)胞淋巴癌、何杰金氏淋巴癌、非何杰金氏淋巴癌、彌漫型大B細(xì)胞淋巴癌、邊緣區(qū)淋巴癌、被套細(xì)胞淋巴癌、發(fā)樣細(xì)胞白血病和勃氏淋巴癌。在某些案例中，該患者系患有對(duì)(a)單獨(dú)的抗-CD20單特異性治療，或(b)利妥昔單抗單一治療具抗性或不完全反應(yīng)之腫瘤。在某些案例中，該患者在投予雙特異性抗體之前，系接受一抗-CD20單特異性抗體治療至少1天至1年。在某些案例中，此抗-CD20單特異性治療系包括或由抗-CD20單特異性抗體所組成。在某些案例中，此抗-CD20單特異性抗體為利妥昔單抗(rituximab)。

在另外方面，本發(fā)明系提供雙特異性抗體用于患者中治療B-細(xì)胞癌癥之用途，其系包括：(a)選擇患有對(duì)單獨(dú)的抗-CD20單特異性治療具抗性或不完全反應(yīng)之癌癥的患者；及(b)投予該患者一治療量的雙特異性抗體，而該雙特異性抗體系包括一結(jié)合人類CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)，一結(jié)合人類CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)，以及一拴住各第一和第二抗原區(qū)之嵌合Fc區(qū)。

在某些案例中，此患者系以具有對(duì)抗-CD20單特異性治療具阻抗性、難以治療或不完全反應(yīng)之腫瘤為基準(zhǔn)作選擇。在某些案例中，此抗-CD20單特異性治療系包括或由一抗-CD20單特異性抗體所組成。在某些案例中，此抗-CD20單特異性抗體為利妥昔單抗。在某些案例中，此B-細(xì)胞癌為淋巴癌。在某些案例中，此淋巴癌為非何杰金氏淋巴癌(NHL)。在某些案例中，此B-細(xì)胞癌為慢性淋巴性白血病(CLL)。

在另外方面，本發(fā)明系提供雙特異性抗體用于患者中治療B-細(xì)胞癌癥之用途，其中該雙特異性抗體系包括一結(jié)合人類CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)，一結(jié)合人類CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)，以及一拴住各第一和第二抗原區(qū)之嵌合Fc區(qū)，且其中該雙特異性抗體系以足以于患者中降低腫瘤負(fù)荷，產(chǎn)生腫瘤消退、抑制腫瘤生長或降低腫瘤發(fā)展之量來給藥。

在某些案例中，此B-細(xì)胞癌癥系由下列組成之群中選出：濾泡型淋巴癌、B-細(xì)胞慢性淋巴性白血病、B-細(xì)胞淋巴母細(xì)胞淋巴癌、何杰金氏淋巴癌、非何杰金氏淋巴癌、彌漫型大B細(xì)胞淋巴癌、邊緣區(qū)淋巴瘤、被套細(xì)胞淋巴瘤、發(fā)樣細(xì)胞白血病和勃氏淋巴癌。在某些案例中，該患者系患有對(duì)單獨(dú)的抗-CD20單特異性治療具阻抗性或不完全反應(yīng)之腫瘤。在某些案例中，該患者系患有對(duì)利妥昔單抗單一治療具阻抗性或不完全反應(yīng)之腫瘤。在某些案例中，該患者在投予雙特異性抗體之前，已接受一抗-CD20單特異性抗體治療至少1天至1年。在某些案例中，此抗-CD20單特異性治療系包括或由一抗-CD20單特異性抗體所組成。在某些案例中，此抗-CD20單特異性抗體為利妥昔單抗。在某些案例中，足以于患者中降低腫瘤負(fù)荷、產(chǎn)生腫瘤消退、抑制腫瘤生長或降低腫瘤發(fā)展之量系介于約0.001mg/kg至約1mg/kg。在某些案例中，足以于患者中降低腫瘤負(fù)荷、產(chǎn)生腫瘤消退或降低腫瘤發(fā)展之量為約0.4mg/kg。

在另外方面，本發(fā)明系提供雙特異性抗體用于患者中治療CD20表現(xiàn)為陽性之癌癥的用途，其系包括：(a)選擇患有癌癥及/或腫瘤之患者；及(b)從患者中收集一或多個(gè)生物樣本；(c)鑒定一或多個(gè)樣本中CD20-表現(xiàn)癌癥或腫瘤；及(d)投予該患者一治療量之雙特異性抗體，而該雙特異性抗體系包括一結(jié)合人類CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)，一結(jié)合人類CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)，以及一拴住各第一和第二抗原區(qū)之嵌合Fc區(qū)。

在某些案例中，此患者系以具有對(duì)抗-CD20治療具阻抗性、難以治療或不完全反應(yīng)之癌癥或腫瘤為基準(zhǔn)作選擇。在某些案例中，此患者系以具有殘存癌癥為基準(zhǔn)作選擇。在某些案例中，此抗-CD20單特異性治療系包括或由一抗-CD20單特異性抗體所組成。在某些案例中，此抗-CD20單特異性抗體為利妥昔單抗。在某些案例中，此癌癥為淋巴癌或白血病。在某些案例中，此淋巴癌系由下列組成之群中選出：濾泡型淋巴癌、B-細(xì)胞淋巴母細(xì)胞淋巴癌、何杰金氏淋巴癌、非何杰金氏淋巴癌、彌漫型大B細(xì)胞淋巴癌、邊緣區(qū)淋巴瘤、被套細(xì)胞淋巴瘤、發(fā)樣細(xì)胞白血病和勃氏淋巴癌。在某些案例中，此白血病為B-細(xì)胞慢性淋巴性白血病(CLL)。

在另外方面，本發(fā)明系提供雙特異性抗體用于患者中治療CD20-表現(xiàn)黑色素癌之用途，其系包括投予一治療量之雙特異性抗體，而該雙特異性抗體系包括一結(jié)合人類CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)，一結(jié)合人類CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)，以及拴住各第一和第二抗原區(qū)之嵌合Fc區(qū)，其中此量系以足以于患者中降低腫瘤負(fù)荷、抑制腫瘤生長或降低腫瘤發(fā)展。

根據(jù)本發(fā)明之雙特異性抗原結(jié)合分子系包括一專一結(jié)合人類CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)，一專一結(jié)合CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)，以及一嵌合的Fc區(qū)。本發(fā)明系包括抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子(例如，雙特異性抗體)其中各抗原結(jié)合區(qū)系包括一重鏈可變區(qū)(HCVR)與輕鏈可變區(qū)(LCVR)配對(duì)。在本發(fā)明特定的例示性實(shí)施例中，抗-CD3抗原結(jié)合區(qū)和抗-CD20抗原結(jié)合區(qū)各包括不同、有區(qū)別、與共同LCVR配對(duì)之HCVR。例如，如文中實(shí)例2所示，建構(gòu)雙特異性抗體系包括專一結(jié)合CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)，其中該第一抗原結(jié)合區(qū)系包括衍生自抗-CD3抗體之HCVR/LCVR對(duì)；及專一結(jié)合CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)，其中該第二抗原結(jié)合區(qū)系包括衍生自抗-CD20抗體之HCVR與衍生自抗-CD3抗體之LCVR配對(duì)(例如，包括在抗-CD3抗原結(jié)合區(qū)內(nèi)的相同LCVR)。換言之，在文中所揭示的例示性分子中，來自抗-CD20抗體之HCVR與來自抗-CD3抗體之LCVR的配對(duì)，產(chǎn)生專一結(jié)合CD20之抗原結(jié)合區(qū)(但不與CD3結(jié)合)。在此等實(shí)施例中，第一和第二抗原結(jié)合區(qū)系包括不同的抗-CD3和抗-CD20HCVR，但享有共同的抗-CD3LCVR。

本發(fā)明系提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子，其中專一結(jié)合CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)系包括表1或表2中所列的任何HCVR氨基酸序列。專一結(jié)合CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)亦包括表1或表2中所列的任何LCVR氨基酸序列。根據(jù)特定的實(shí)施例，專一結(jié)合CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)系包括表1或表2中所列的任何HCVR/LCVR氨基酸序列對(duì)。本發(fā)明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子，其中專一結(jié)合CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)系包括如表1或表2中所列的任何重鏈CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列，及/或如表1或表2中所列的任何輕鏈CDR1-CDR2-CDR3氨基酸序列。

根據(jù)特定的實(shí)施例，本發(fā)明系提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子，其中該專一結(jié)合CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)系包括一重鏈可變區(qū)(HCVR)，其具有一包括SEQ ID NO:10之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

本發(fā)明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子，其中專一結(jié)合CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)系包括一輕鏈可變區(qū)(LCVR)，其具有一包括SEQ ID NO:18之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

本發(fā)明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子，其中專一結(jié)合CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)系包括一由SEQ ID NO：10/18組成之群中選出的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)氨基酸序列對(duì)。

本發(fā)明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子，其中專一結(jié)合CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)系包括一重鏈CDR3(HCDR3)區(qū)，其具有一包括SEQ ID NO:16之胺基序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列；及一輕鏈CDR3(LCDR3)區(qū)，其具有一包括SEQ ID NO:24之胺基序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

在特定的實(shí)施例中，此專一結(jié)合CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)系包括一包含SEQ ID NO：16/24之HCDR3/LCDR3氨基酸序列對(duì)。

本發(fā)明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子，其中該專一結(jié)合CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)系包括一重鏈CDR1(HCDR1)區(qū)，其具有一包括SEQ ID NO:12之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列；一重鏈CDR2(HCDR2)區(qū)，其具有一包括SEQ ID NO:14之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列；一輕鏈CDR1(LCDR1)區(qū)，其具有一包括SEQ ID NO:20之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列；及一輕鏈CDR2(LCDR2)區(qū)，其具有一包括SEQ ID NO:22之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

本發(fā)明之特定非限定、例示性抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子系包括專一結(jié)合CD3之含有HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3區(qū)的第一抗原結(jié)合區(qū)，其分別具有由下列組成之群中選出之氨基酸序列：SEQ ID NO:12-14-16-20-22-24。

本發(fā)明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子，其中該專一結(jié)合CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)系包括一重鏈可變區(qū)(HCVR)，其具有SEQ ID NO：2之胺基序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

本發(fā)明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子，其中該專一結(jié)合CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)系包括一輕鏈可變區(qū)(LCVR)，其具有SEQ ID NO：18之胺基序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。本發(fā)明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子，其中該專一結(jié)合CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)系包括一輕鏈可變區(qū)(LCVR)，其具有SEQ ID NO：75之胺基序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

本發(fā)明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子，其中專一結(jié)合CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)系包括一包含SEQ ID NO：2/18或SEQ ID NO:2/75之HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)氨基酸序列對(duì)。

本發(fā)明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性分子，其中該專一結(jié)合CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)系包括一重鏈CDR3(HCDR3)區(qū)，其具有一SEQ ID NO:8之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列；一輕鏈CDR3(LCDR3)區(qū)，其具有一包括SEQ ID NO:24之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

在特定的實(shí)施例中，專一結(jié)合CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)系包括一包含SEQ ID NO：8/24之HCDR3/LCDR3氨基酸序列對(duì)。

本發(fā)明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子，其中該專一結(jié)合CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)系包括一重鏈CDR1(HCDR1)區(qū)，其具有SEQ ID NO:4之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列；一重鏈CDR2(HCDR2)區(qū)，其具有SEQ ID NO:6之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列；一輕鏈CDR1(LCDR1)區(qū)，其具有SEQ ID NO:20之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列；及一輕鏈CDR2(LCDR2)區(qū)，其具有SEQ ID NO:22之氨基酸序列，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列相同度之實(shí)質(zhì)上其類似的序列。

本發(fā)明之特定非限定、例示性抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子系包括專一結(jié)合CD20之含有HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3區(qū)的第二抗原結(jié)合區(qū)，其分別具有由下列組成之群中選出之氨基酸序列：SEQ ID NO:4-6-8-20-22-24(例如，抗體1或抗體2)。

在一實(shí)施例中，本發(fā)明之抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子系包括一專一結(jié)合人類CD3并包括三個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(A1-HCDR1、A1-HCDR2、A1-HCDR3)和三個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(A1-LCDR1、A1-LCDR2、A1-LCDR3)之第一抗原結(jié)合區(qū)(A1)，以及一專一結(jié)合人類CD20并包括三個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3)和三個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3)之第二抗原結(jié)合區(qū)(A2)；其中：(a)A1-HCDR1系包括SEQ ID NO:12之氨基酸序列；(b)A1-HCDR2系包括SEQ ID NO:14之氨基酸序列；(c)A1-HCDR3系包括SEQ ID NO:16之氨基酸序列；(d)A1-LCDR1系包括SEQ ID NO:20之氨基酸序列；(e)A1-LCDR2系包括SEQ ID NO:22之氨基酸序列；(f)A1-LCDR3系包括SEQ ID NO:24之氨基酸序列；(g)A2-HCDR1系包括SEQ ID NO:4之氨基酸序列；(h)A2-HCDR2系包括SEQ ID NO:6之氨基酸序列；(i)A2-HCDR3系包括SEQ ID NO:8之氨基酸序列；(j)A2-LCDR1系包括SEQ ID NO:20之氨基酸序列；(k)A2-LCDR2系包括SEQ ID NO:22之氨基酸序列；及(l)A2-LCDR3系包括SEQ ID NO:24之氨基酸序列。

在一相關(guān)的實(shí)施例中，本發(fā)明系包括抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子，其中專一結(jié)合CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)系包括一重鏈和輕鏈CDR區(qū)，其系包含在SEQ ID NO：2/18之重鏈和輕鏈可變區(qū)(HCVR/LCVR)序列內(nèi)。

在另外方面，本發(fā)明系提供編碼文中所揭示的抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子之任何HCVR、LCVR或CDR序列的核酸分子，其系包括：包含文中表2、7和8中所列之多核苷酸序列的核酸分子，以及包括二或多個(gè)如表2、7和8中所列之多核苷酸序列以其任何功能性組合或排列的核酸分子。攜帶本發(fā)明核酸分子之重組的表現(xiàn)載體，和已導(dǎo)入此等載體之宿主細(xì)胞亦涵蓋在本發(fā)明中，以及藉由在得以產(chǎn)生抗體的條件下培養(yǎng)此等宿主細(xì)胞，并回收所產(chǎn)生的抗體來制造抗體之方法，亦涵蓋在本發(fā)明中。

本發(fā)明系包括抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子，其中任何專一結(jié)合CD3之前述抗原結(jié)合區(qū)系與任何專一結(jié)合CD20之前述抗原結(jié)合區(qū)組合、相連或另外結(jié)合，形成一結(jié)合CD3和CD20之雙特異性抗原結(jié)合分子。

在另外方面，本發(fā)明系提供一雙特異性抗體，其系包括一結(jié)合人類CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)，一結(jié)合人類CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)，以及一拴住各第一和第二抗原區(qū)之嵌合Fc區(qū)。在一相關(guān)方面，此雙特異性抗體能專一與人類FcγRIIA和人類FcγRIIB結(jié)合。本發(fā)明系提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子，其系專一與人類FcγRIIA和人類FcγRIIB結(jié)合并顯現(xiàn)對(duì)人類FcγRI或人類FcγRIII極小或無結(jié)合親和力。在一方面，此雙特異性抗體，如活體外分析所測(cè)，能以高于結(jié)合人類FcγRIIB、人類FcγRI及/或人類FcγRIII之親和力與專一人類FcγRIIA結(jié)合。本發(fā)明之雙特異性抗體，如活體外分析所測(cè)，能以高于此抗體與人類FcγRI或人類FcγRIII結(jié)合之親和力專一與人類FcγRIIA或人類FcγRIIB結(jié)合。在某些實(shí)施例中，其中與人類FcγRIIA和人類FcγRIIB二者專一結(jié)合之抗體，如活體外分析所測(cè)，對(duì)各人類FcγRI和人類FcγRIII具有低于1μM K_D之結(jié)合親和力。

在其他方面，本發(fā)明系提供雙特異性抗體，其包括各自包含嵌合Fc區(qū)之第一和第二重鏈多肽，其中該第一重鏈多肽系包括一結(jié)合人類CD3之抗原結(jié)合區(qū)，及其中該第二重鏈多肽系包括一結(jié)合人類CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)。

在其他的實(shí)施例中，如活體外分析所測(cè)，此抗體，相對(duì)于其結(jié)合人類FcγRIIB，系對(duì)于人類FcγRIIA具有較高，亦即較強(qiáng)的結(jié)合親和力。又在其他的實(shí)施例中，此抗體系與人類FcγRIIA結(jié)合且如活體外分析所測(cè)，相對(duì)于其與人類FcγRIIB之結(jié)合，系具有較低的K_D值。在某些實(shí)施例中，此抗體系與FcγRIIA結(jié)合，如活體外分析所測(cè)，在25℃具有介于10至30μM之K_D值。在某些實(shí)施例中，此抗體系與FcγRIIB結(jié)合，如活體外分析所測(cè)，在25℃具有介于100至250μM之K_D值。

在另外的實(shí)施例中，此抗體對(duì)于人類FcγRI，如活體外分析所測(cè)，具有極小或無可偵測(cè)的結(jié)合親和力。在某些實(shí)施例中，此抗體對(duì)于人類FcγRIII，如活體外分析所測(cè)，具有極小或無可偵測(cè)的結(jié)合親和力。

在某些實(shí)施例中，此活體外分析為表面電漿共振分析。

在某些實(shí)施例中，相較于包括野生型Fc區(qū)之抗體，此抗體如活體外細(xì)胞毒性分析所測(cè)，具有降低的抗體-依賴-細(xì)胞毒性(ADCC)。

在某些實(shí)施例中，此抗體具有極輕微或無可偵測(cè)的抗體-依賴-細(xì)胞毒性(ADCC)。

在某些實(shí)施例中，相較于包括野生型Fc區(qū)之抗體，此抗體如活體外細(xì)胞毒性分析所測(cè)，具有降低的補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)。

在某些實(shí)施例中，如于活體外分析藉由測(cè)量細(xì)胞裂解測(cè)得，此抗體具有低于50％細(xì)胞毒性。

在某些實(shí)施例中，此抗體具有極輕微或無可偵測(cè)的補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒性(CDC)。

在某些實(shí)施例中，相較于包括野生型Fc區(qū)之抗體，此抗體引發(fā)降低的T細(xì)胞媒介之殺死帶有Fc受體細(xì)胞，例如NK細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。

在特定的實(shí)施例中，相較于包括野生型Fc區(qū)之抗體，此抗體引發(fā)降低的由帶有Fc受體細(xì)胞，例如NK細(xì)胞或巨噬細(xì)胞所媒介之殺死T細(xì)胞。

在某些實(shí)施例中，如于活體外分析由測(cè)量K_D所測(cè)定，此抗體展現(xiàn)對(duì)人類FcγRIIA之結(jié)合親和力比其對(duì)人類FcγRIIB的結(jié)合親和力更強(qiáng)，該對(duì)人類FcγRIIB的結(jié)合親和力比該抗體對(duì)人類FcγRI的結(jié)合親和力更強(qiáng)，該對(duì)人類FcγRI的結(jié)合親和力比該抗體對(duì)人類FcγRIII的結(jié)合親和力更強(qiáng)或相當(dāng)。在其他的實(shí)施例中，如活體外分析所測(cè)，此抗體具有對(duì)人類FcγRIIA>人類FcγRIIB>人類FcγRI>＝人類FcγRIII之結(jié)合親和力。

在某些實(shí)施例中，如于活體外分析由測(cè)量K_D所測(cè)定，此抗體展現(xiàn)對(duì)人類FcγRIIA之結(jié)合親和力比其對(duì)人類FcγRIIB的結(jié)合親和力更強(qiáng)，該對(duì)人類FcγRIIB的結(jié)合親和比此抗體對(duì)人類FcγRIII的結(jié)合親和力更強(qiáng)，該對(duì)人類FcγRIII的結(jié)合親和力比此抗體對(duì)人類FcγRI的結(jié)合親和力更強(qiáng)或相當(dāng)。在其他的實(shí)施例中，如活體外分析所測(cè)，此抗體具有對(duì)人類FcγRIIA>人類FcγRIIB>人類FcγRIII>＝人類FcγRI之結(jié)合親和力。

在某些實(shí)施例中，此人類FcγRIII為人類FcγRIIIA或人類FcγRIIIB。

在某些實(shí)施例中，此嵌合的Fc區(qū)系包括一嵌合的絞鏈。

在另外方面，本發(fā)明系提供雙特異性抗體，其包括一第一抗原結(jié)合區(qū)、一第二抗原結(jié)合區(qū)及一嵌合的重鏈恒定(CH)區(qū)，其中(a)第一抗原結(jié)合區(qū)系與CD3結(jié)合，(b)第二抗原結(jié)合區(qū)系與CD20結(jié)合。在本發(fā)明特定方面，相較于包括野生型CH區(qū)之抗體，如活體外分析所測(cè)，此嵌合的CH區(qū)系以較高，亦即較強(qiáng)的親和力與人類FcγRIIA和人類FcγRIIB結(jié)合。又在另外方面，相較于包括野生型CH區(qū)之抗體，如活體外分析所測(cè)，此嵌合的CH系以較低，亦即較弱或無親和力與人類FcγRI和人類FcγRIII結(jié)合。

本發(fā)明系提供包括一嵌合絞鏈區(qū)之雙特異性抗體。在某些方面，此嵌合絞鏈區(qū)系包括來自位置216至236之氨基酸序列殘基(EU編號(hào))。建構(gòu)本發(fā)明之雙特異性抗體，其中該嵌合的絞鏈區(qū)系包括來自位置228至236(EU編號(hào))之人類IgG2下絞鏈氨基酸序列PCPAPPVA(SEQ ID NO:52)。在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明之雙特異性抗體系包括一嵌合的絞鏈及此嵌合絞鏈之上絞鏈部分系包括來自IgG1上絞鏈之位置216至227(EU編號(hào))的氨基酸殘基。在其他的實(shí)施例中，本發(fā)明之雙特異性抗體系包括一嵌合的絞鏈及此嵌合絞鏈之上絞鏈部分系包括來自IgG4上絞鏈之位置216至227(EU編號(hào))的氨基酸殘基。

在一實(shí)施例中，此雙特異性抗體系包括一嵌合的絞鏈氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO:53)。在另外的實(shí)施例中，此雙特異性抗體系包括一嵌合的絞鏈氨基酸序列ESKYGPPCPPCPAPPVA(SEQ ID NO:54)。在特定的實(shí)施例中，此雙特異性抗體系包括來自位置237至340(EU編號(hào))之人類IgG4 CH2區(qū)氨基酸序列。在其他的實(shí)施例中，此雙特異性抗體系包括一衍生自人類IgG1 CH3區(qū)或人類IgG4 CH3區(qū)之CH3區(qū)。又在其他的實(shí)施例中，此雙特異性抗體系包括一人類IgG1 CH1區(qū)及一人類IgG1 CH3區(qū)。在更多的實(shí)施例中，此雙特異性抗體系包括一人類IgG4 CH1區(qū)及一人類IgG4 CH3區(qū)。

本發(fā)明一方面系提供制造包括一嵌合恒定重鏈區(qū)之雙特異性抗體的方法，該方法系包括：(a)以編碼能結(jié)合CD3抗原之第一輕鏈的核酸分子轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，該核酸分子系包括一編碼第一VL區(qū)之核苷酸序列和編碼Ig之恒定CL區(qū)的核苷酸序列，其中該編碼所選的抗原特異性抗體之VL區(qū)的核苷酸序列和該編碼Ig之CL區(qū)的核苷酸序列系經(jīng)操作上連接一起；(b)以編碼能結(jié)合CD3抗原之抗體的第一重鏈之核酸分子轉(zhuǎn)染步驟(a)的宿主細(xì)胞，該核酸分子系包括一編碼VH區(qū)的核苷酸序列和一編碼人類Ig之嵌合恒定CH區(qū)的核苷酸序列，其中該編碼VH區(qū)的核苷酸序列和編碼該Ig之CH區(qū)的核苷酸序列系經(jīng)操作上連接一起；其中CH區(qū)系編碼一或多個(gè)CH3區(qū)內(nèi)的一或多個(gè)氨基酸修飾，其降低或消除了第二CH3區(qū)與蛋白A之結(jié)合；(c)以編碼能結(jié)合CD20抗原之抗體的第二重鏈之核酸分子轉(zhuǎn)染步驟(a)的宿主細(xì)胞，該核酸分子系包括一編碼VH區(qū)的核苷酸序列和一編碼人類Ig之嵌合CH區(qū)的核苷酸序列，其中該編碼VH區(qū)的核苷酸序列和編碼該Ig之CH區(qū)的核苷酸序列系經(jīng)操作上連接一起；及(d)藉由在該宿主細(xì)胞中共表現(xiàn)(a)和(b)之核酸分子，制造該抗體。

在一實(shí)施例中，本發(fā)明系提供一制造雙特異性抗體的方法，其系藉由：(a)以(i)一編碼抗體輕鏈之核酸分子轉(zhuǎn)染一宿主細(xì)胞，其中該核酸分子系包括一編碼包括SEQ ID NO:18之LCVR的核苷酸序列及一編碼Ig之恒定C_L區(qū)的核苷酸序列，其中該編碼抗體之LCVR區(qū)的核苷酸序列系以操作上連接編碼Ig之C_L區(qū)的核苷酸序列；(b)以(i)一編碼該抗體第一重鏈之核酸分子轉(zhuǎn)染步驟(a)之宿主細(xì)胞，該核酸分子系包括一編碼包括SEQ ID NO:10之HCVR的核苷酸序列及一編碼IgG之嵌合C_H區(qū)的核苷酸序列，其中該編碼C_H區(qū)的核苷酸序列系包括編碼SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32之核苷酸序列，其中該編碼HCVR的核苷酸序列系以操作上連接編碼C_H區(qū)的核苷酸序列；及以(ii)一編碼該抗體第二重鏈之核酸分子轉(zhuǎn)染步驟(a)之宿主細(xì)胞，該核酸分子系包括一編碼包括SEQ ID NO:2之HCVR的核苷酸序列及一編碼IgG之嵌合C_H區(qū)的核苷酸序列，其中編碼C_H區(qū)的核苷酸序列系包括編碼SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32之核苷酸序列，其中該編碼HCVR的核苷酸序列系以操作上連接編碼C_H區(qū)的核苷酸序列；及(c)藉由在該宿主細(xì)胞中共表現(xiàn)(a)和(b)之核酸分子，制造此抗體。在某些案例中，此方法進(jìn)一步系包括培養(yǎng)步驟(b)宿主細(xì)胞之步驟，其中此抗體系分泌至細(xì)胞培養(yǎng)基中；并從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離此抗體。

在某些方面，制造雙特異性抗體之方法視需要系包括以編碼能結(jié)合CD20抗原之第二輕鏈的核酸分子轉(zhuǎn)染步驟(a)的宿主細(xì)胞，且該核酸分子系包括一編碼第二輕鏈之VL區(qū)的核苷酸序列和一編碼Ig之恒定CL區(qū)的核苷酸序列，其中該編碼第二輕鏈之VL區(qū)的核苷酸序列和該編碼Ig之CL區(qū)的核苷酸序列系經(jīng)操作上連接一起。

在某些實(shí)施例中，第一重鏈系包括一包含H95R修飾(IMGT外顯子編號(hào)；EU編號(hào)為H435R)的CH3區(qū)。在另外的實(shí)施例中，此第一重鏈區(qū)系包括一另外包含一Y96F修飾(IMGT；EU編號(hào)為Y436F)之CH3區(qū)。在更多的實(shí)施例中，此方法系包括使用蛋白分離此抗體。

本發(fā)明之另一方面系提供一雙特異性抗體，其包括：(a)一第一重鏈，其包含能辨識(shí)和結(jié)合第一目標(biāo)抗原之抗原結(jié)合區(qū)，(b)一第二重鏈，其包含能辨識(shí)和結(jié)合第二目標(biāo)抗原之抗原結(jié)合區(qū)，及(c)能辨識(shí)和結(jié)合第一或第二目標(biāo)抗原之共享的輕鏈抗原結(jié)合區(qū)，其中(a)或(b)之重鏈或(a)和(b)二者系包括重鏈恒定區(qū)(CH)，而該重鏈恒定區(qū)(CH)系包括一含有SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54之氨基酸序列的嵌合絞鏈區(qū)。

在特定的實(shí)施例中，此重鏈恒定區(qū)(CH)系包括SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:32之氨基酸序列。在某些實(shí)施例中，編碼嵌合的CH之核苷酸序列系包括SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33。在其他的實(shí)施例中，此嵌合的CH核苷酸序列系編碼SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、or SEQ ID NO:32之氨基酸序列。又在其他的實(shí)施例中，CH區(qū)之核苷酸序列系包括SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33之編碼氨基酸序列的核苷酸序列。

在特定的方面，此雙特異性抗體系包括一編碼包含SEQ ID NO:35氨基酸序列之輕鏈的核酸分子。在其他方面，此雙特異性抗體系包括一包含SEQ ID NO:34核苷酸序列之輕鏈編碼核酸分子。

在特定的方面，此雙特異性抗體系包括一編碼包含SEQ ID NO:37氨基酸序列之重鏈的核酸分子。在其他方面，此雙特異性抗體系包括一包含SEQ ID NO:36核苷酸序列之重鏈編碼核酸分子。

在特定的方面，此雙特異性抗體系包括一編碼包含SEQ ID NO:40氨基酸序列之重鏈的核酸分子。在其他方面，此雙特異性抗體系包括一包含SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39核苷酸序列之重鏈編碼核酸分子。

在特定的方面，此雙特異性抗體系包括一編碼包含SEQ ID NO:42氨基酸序列之重鏈的核酸分子。在其他方面，此雙特異性抗體系包括一包含SEQ ID NO:41核苷酸序列之重鏈編碼核酸分子。

在特定的方面，此雙特異性抗體系包括一編碼包含SEQ ID NO:44氨基酸序列之重鏈的核酸分子。在其他方面，此雙特異性抗體系包括一包含SEQ ID NO:43核苷酸序列之重鏈編碼核酸分子。

在另外方面，本發(fā)明系提供一治療上有效量之如文中所揭示的抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子。在一相關(guān)的方面，本發(fā)明之特征為組合抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子和第二治療劑之組成物。在一實(shí)施例中，此第二治療劑為任何有利地與抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子組合之試劑?？捎欣嘏c抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子組合之例示性藥劑系詳細(xì)論述于文中的他處。

又在另一方面，本發(fā)明系提供使用本發(fā)明之抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子用于靶向/殺死表現(xiàn)CD20之腫瘤細(xì)胞的治療方法，其中該治療方法系包括將一治療上有效量之包括本發(fā)明抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子的醫(yī)藥組成物投予有此需要之患者。在某些案例中，此雙特異性抗原結(jié)合分子(例如，抗體)系與表現(xiàn)CD20的人類細(xì)胞結(jié)合或與人類B-細(xì)胞結(jié)合。

在另外方面，本發(fā)明系提供雙特異性抗體，其中該抗體：系與表現(xiàn)人類CD3之人類細(xì)胞和表現(xiàn)獼猴CD3之獼猴細(xì)胞結(jié)合；系與人類T-細(xì)胞或獼猴T-細(xì)胞結(jié)合；系以介于1x10^-12M至1x10^-6M之EC₅₀值與CD3-表現(xiàn)的人類T-細(xì)胞結(jié)合；系以介于1x10^-9M至1x10^-8M之EC₅₀值與CD3-表現(xiàn)的人類T-細(xì)胞結(jié)合；系以介于1x10^-12M至1x10^-6M之EC₅₀值與CD20-表現(xiàn)的人類B-細(xì)胞結(jié)合；系以介于1x10^-9M至1x10^-8M之EC₅₀值與CD20-表現(xiàn)的人類B-細(xì)胞結(jié)合；或促進(jìn)T-細(xì)胞媒介的人類B-細(xì)胞毒性，其中該B-細(xì)胞對(duì)于抗-CD20-媒介的細(xì)胞毒性系具阻抗性或難以用抗-CD20-媒介的細(xì)胞毒性治療。

在本發(fā)明各種方法和用途中，以至少約0.01mg/kg的劑量單一投予雙特異性抗體給病患，在雙特異性抗體投予患者后約2天，造成患者中B-細(xì)胞數(shù)目降至可偵測(cè)量以下。在某些案例中，在以至少約0.01mg/kg雙特異性抗體之單一劑量投予患者后至少直到約7天，B-細(xì)胞數(shù)目系維持在可偵測(cè)量以下。

本發(fā)明系包括本發(fā)明之抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子用于靶向/殺死表現(xiàn)CD20之腫瘤細(xì)胞的用途以及于制造醫(yī)藥品供治療與CD20表現(xiàn)相關(guān)或由其所造成的疾病或病癥之用途。在某些案例中，本發(fā)明之雙特異性抗體系用于制造醫(yī)藥品供于患者中治療或改善癌癥，其中該雙特異性抗體系包括一結(jié)合人類CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)，一結(jié)合人類CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)以及一拴住各第一和第二抗原區(qū)之嵌合Fc區(qū)，而此治療或改善癌癥系包括：(a)于患者中抑制腫瘤生長，(b)于患者中媒介B-細(xì)胞裂解，(c)于患者中治療B-細(xì)胞癌癥，(d)于患者中治療CD20表現(xiàn)為陽性的癌癥，或(e)于患者中治療CD20-表現(xiàn)的黑色瘤癌癥。

本發(fā)明亦包括一雙特異性抗體，其系包括一第一抗原結(jié)合區(qū)、一第二抗原結(jié)合區(qū)及一嵌合的重鏈恒定(CH)區(qū)，其中：第一抗原結(jié)合區(qū)系與CD3結(jié)合，第二抗原結(jié)合區(qū)系與CD20結(jié)合，而此嵌合的CH區(qū)，相較于包括野生型CH區(qū)之抗體，系以較高，亦即較強(qiáng)的親和力與人類FcγRIIA和人類FcγRIIB結(jié)合，此雙特異性抗體供用于制造醫(yī)藥品。本發(fā)明系提供一雙特異性抗體，其包括一結(jié)合CD3之第一抗原結(jié)合區(qū)，一結(jié)合CD20之第二抗原結(jié)合區(qū)，以及一嵌合的CH區(qū)，而該嵌合的CH區(qū)與人類FcγRIIA結(jié)合親和力系高于，亦即強(qiáng)于其與人類FcγRIIB結(jié)合，供用于制造醫(yī)藥品。

從確認(rèn)詳細(xì)說明之論述中其他的實(shí)施例將變得顯而易見。

【圖式簡(jiǎn)單說明】

圖1系說明用于嵌合絞鏈區(qū)之結(jié)構(gòu)中的絞鏈氨基酸以及對(duì)應(yīng)的氨基酸編號(hào)規(guī)則。

圖2系代表人類IgG1重鏈恒定區(qū)，包括CH1、絞鏈、CH2和CH3區(qū)之氨基酸序列，如UniProtKB中之IGHG1/Swiss‐Prot登錄號(hào)P01857(SEQ ID NO:45)所述。

圖3系代表人類IgG2重鏈恒定區(qū)，包括CH1、絞鏈、CH2和CH3區(qū)之氨基酸序列，如UniProtKB中之IGHG2/Swiss‐Prot登錄號(hào)P01859(SEQ ID NO:46)所述。

圖4系代表人類IgG4重鏈恒定區(qū)，包括CH1、絞鏈、CH2和CH3區(qū)之氨基酸序列，如UniProtKB中之IGHG4/Swiss‐Prot登錄號(hào)P01861(SEQ ID NO:47)所述。

圖5A和5B：描述有關(guān)Daudi(圖5A)和Raji(圖5B)細(xì)胞在具有野生型或嵌合絞鏈區(qū)C_H之抗體的存在下，缺乏CDC活性之劑量‐反應(yīng)曲線。(「對(duì)照」抗體4＝含野生型IgG1 C_H之雙特異性Ab；抗體1；抗體2；IgG1同型對(duì)照組＝含野生型IgG1 C_H之非特異性Ab)。

圖6A和6B：描述有關(guān)Daudi(圖6A)和Raji(圖6B)細(xì)胞在具有野生型或嵌合絞鏈區(qū)CH之抗體的存在下，缺乏ADDC活性之劑量‐反應(yīng)曲線。(「對(duì)照」抗體4＝含野生型IgG1 CH之雙特異性Ab；抗體1；抗體2；IgG1同型對(duì)照組＝含野生型IgG1 CH之非特異性Ab)。

圖7A-7F系顯示以皮下植入Raji腫瘤細(xì)胞和PBMC(或無PBMC對(duì)照-圖7D)混合物之NSG小鼠，及在腫瘤植入后，投予本發(fā)明之CD3xCD20雙特異性抗體(Ab1)或媒劑或?qū)φ湛贵w并在腫瘤植入同一天開始(第0天)治療，及于研究期間所測(cè)量之隨時(shí)間變化的腫瘤體積(以mm³表示)。圖7A：以媒劑治療并無任何小鼠顯現(xiàn)腫瘤生長抑制；圖7B：以0.4mg/kg對(duì)照Ab5(抗-FelD1Ab)治療，5只小鼠中有1只(1/5)顯現(xiàn)腫瘤生長抑制；圖7C：以0.4mg/kg抗體1(Ab1)治療，5/5小鼠顯現(xiàn)腫瘤生長抑制；圖7D：當(dāng)無PBMC植入及以0.4mg/kg Ab1治療時(shí)，0/5小鼠顯現(xiàn)腫瘤生長抑制；圖7E：以0.04mg/kg Ab1治療，5/5小鼠顯現(xiàn)腫瘤生長抑制；及圖7F：以0.004mg/kg Ab1治療，5/5小鼠顯現(xiàn)腫瘤生長抑制。

圖8A和8B系顯示以皮下植入Raji腫瘤細(xì)胞和PBMC混合物，并以Ab1(CD3xCD20-嵌合Fc)治療的NSG小鼠，相較于媒劑、有或無IgG添加(圖8A)，或以Ab4(CD3xCD20-wtFc)治療，相較于媒劑、有或無IgG添加(圖8B)之隨時(shí)間變化的腫瘤體積(以mm³表示)。在此模型中添加IgG之二種CD3xCD20雙特異性抗體顯示顯著的腫瘤生長抑制。如圖8A中所見，在此實(shí)驗(yàn)中，有或無添加IgG之CD3xCD20-嵌合Fc雙特異性抗體(Ab1)在試驗(yàn)的期間顯現(xiàn)完全的腫瘤生長抑制。

圖9系說明在以CD3xCD20雙特異性抗體治療的NSG小鼠中，已建立的腫瘤在第14天消退(～200-400mm³)。NSG小鼠系在治療前15天，以皮系植入Raji腫瘤細(xì)胞和PBMC，讓腫瘤建立。隨后以0.4mg/kg抗體1(CD3xCD20-嵌合Fc抗體)，或0.4mg/kg對(duì)照Ab5(抗-FelD1Ab)或媒劑對(duì)照組每周一次(第7天，第14天，第21天)治療小鼠。

圖10系說明在CD3xCD20雙特異性抗體治療的NSG小鼠中，已建立的腫瘤在第21天消退(～500-900mm³)。NSG小鼠系在治療前15天，以皮系植入Raji腫瘤細(xì)胞和PBMC，讓腫瘤建立。以0.4mg/kg抗體1(CD3xCD20-嵌合Fc抗體)或0.4mg/kg對(duì)照Ab5(抗-FelD1Ab)每周一次(第7天，第14天，第21天)治療小鼠。

圖11A和11B系藉由在研究第7天測(cè)量獼猴外圍血液中CD20+B-細(xì)胞量或CD3+T-細(xì)胞量之變化，與單特異性抗體給藥(利妥昔單抗)相比，描繪抗體1和抗體4CD3xCD20雙特異性抗體給藥之活體內(nèi)效力。在第0天投予抗體或安慰劑。圖11A：在所有樣本中(安慰劑除外)外圍血液中B-細(xì)胞量在第2天顯著衰竭；圖11B：于經(jīng)雙特異性抗體治療的動(dòng)物外圍血液中在第2天觀察到T-細(xì)胞過渡性喪失并在第4天恢復(fù)到基線量。在安慰劑或利妥昔單抗(Rituxan)組中并無觀察到T-細(xì)胞喪失(基線以下)。

圖12A和12B系藉由在一長期的研究(3個(gè)月)中測(cè)量獼猴外圍血液中CD20+B-細(xì)胞量或CD3+T-細(xì)胞量之變化，描繪抗體1和抗體4CD3xCD20雙特異性抗體給藥之活體內(nèi)效力。在第0天投予1.0mg/kg安慰劑(媒劑)或雙特異性抗體。圖12A：在所有樣本中(安慰劑除外)外圍血液中B-細(xì)胞量在第2天顯著衰竭且在研究期間量持續(xù)衰竭；圖12B：就經(jīng)雙特異性抗體治療的動(dòng)物在第2天觀察到T-細(xì)胞過渡性喪失，然后T-細(xì)胞在第4天恢復(fù)到基線量并維持在大約基線值，如在整個(gè)研究期間(>80天)所測(cè)。在以安慰劑治療的動(dòng)物中并無觀察到T-細(xì)胞過渡性喪失。

圖13A和13B系藉由在一長期的研究(2個(gè)月)中測(cè)量獼猴外圍血液中CD20+B-細(xì)胞量或CD3+T-細(xì)胞量之變化，描繪抗體1和抗體4CD3xCD20雙特異性抗體低劑量給藥之活體內(nèi)效力。在第0天投予0.01mg/kg或0.001mg/kg(1μg/kg)的雙特異性抗體。圖13A：外圍血液中B-細(xì)胞量在第2天顯著衰竭且在研究期間量持續(xù)衰竭，與在經(jīng)高劑量CD3xCD20雙特異性抗體治療的動(dòng)物中所觀察到的相類似(亦參見圖11A或12A)；圖13B：以非常低劑量(1μg/kg)雙特異性抗體治療的動(dòng)物經(jīng)歷了相同的T-細(xì)胞過渡性喪失和恢復(fù)，如同在以較高劑量CD3xCD20雙特異性抗體治療的動(dòng)物中所見到的(亦參見圖11B或12B)。

圖14系顯示經(jīng)CD3xCD20-嵌合Fc抗體1治療的動(dòng)物外圍血液中B細(xì)胞喪失與抗體消失的相關(guān)性。當(dāng)動(dòng)物的血液循環(huán)中抗體暴露(開符號(hào))隨著時(shí)間衰退時(shí)，B-細(xì)胞群族(實(shí)心符號(hào))開始恢復(fù)(例如在動(dòng)物編號(hào)I06881第81天所觀察到的(實(shí)心符號(hào)))。

圖15系顯示經(jīng)CD3xCD20-嵌合Fc抗體2治療的動(dòng)物外圍血液中B細(xì)胞喪失與抗體消失的相關(guān)性。當(dāng)動(dòng)物的血液循環(huán)中抗體暴露(開符號(hào))隨著時(shí)間衰退時(shí)，B-細(xì)胞群族(實(shí)心符號(hào))開始恢復(fù)(例如在動(dòng)物編號(hào)I06876第66天所觀察到的(實(shí)心三角形)，及動(dòng)物編號(hào)I06877第68天所觀察到的(實(shí)心正方形))。

圖16系顯示經(jīng)CD3xCD20-野生型Fc(Ab 4)雙特異性抗體治療的動(dòng)物外圍血液中B細(xì)胞喪失與抗體消失的相關(guān)性。當(dāng)動(dòng)物的血液循環(huán)中抗體暴露(開符號(hào))隨著時(shí)間衰退時(shí)，B-細(xì)胞群族(實(shí)心符號(hào))開始恢復(fù)(例如在動(dòng)物編號(hào)I06870第91天所觀察到的(實(shí)心符號(hào))，及動(dòng)物編號(hào)I06872第64天所觀察到的(實(shí)心正方形))。

圖17A和17B系描述獼猴之脾臟(圖17A)或腸系膜淋巴結(jié)(圖17B)中，以更低劑量(0.01至1.0mg/kg劑量)投予雙特異性組投予CD3xCD20雙特異性抗體，與抗-CD20單特異性抗體相比較，所造成的組織B-細(xì)胞的衰退。此衰減在安慰劑對(duì)照動(dòng)物組的二種組織中并未見到。二種CD3xCD20雙特異性抗體(Ab1和Ab 4)在淋巴器官中造成劑量依賴的B-細(xì)胞衰減，且在劑量等于或大于0.1mg/kg時(shí)，此雙特異性抗體比利妥昔單抗更有效地衰減B-細(xì)胞。

圖18A和18B系說明在一活體外生物分析中CD3xCD20雙特異性抗體引發(fā)人類PBMC(圖18A)或獼猴PBMC(圖18B)之增生，而對(duì)照的抗體5(-▲-；不特定于CD3xCD20)并未顯現(xiàn)活性。

圖19A和19B系說明在一細(xì)胞毒性分析中CD3xCD20-媒介的Raji標(biāo)靶致死。抗體1分別以25.0ρM和9.10ρM之人類(圖19A)和獼猴(圖19B)T細(xì)胞的代表性EC₅₀值媒介了標(biāo)靶細(xì)胞致死?？贵w4分別以15.7ρM和1.73ρM之人類(圖19A)和獼猴(圖19B)T細(xì)胞的代表性EC₅₀值媒介了標(biāo)靶細(xì)胞致死。并未觀察到對(duì)照組(-▲-)之活性。

圖20A和208B系說明CD3xCD20雙特異性抗體藉由天然的T-細(xì)胞，媒介了細(xì)胞死亡。圖20A系顯示在抗體4最高試驗(yàn)濃度時(shí)之代表性FACS散布圖。B16F10.9野生型細(xì)胞系以CFDA-SE標(biāo)定，而B16F10.9/CD20細(xì)胞系以Violet Cell Tracker標(biāo)定。效應(yīng)子細(xì)胞未標(biāo)定。圖20A的第二個(gè)圖系顯示藉由以抗-CD3xCD20治療消除CD20-表現(xiàn)細(xì)胞(四象限的右下)。圖20B系顯示在CD20xCD3抗體，亦即抗體4(野生型Fc)、抗體1(嵌合Fc)或?qū)φ誂b 5和PBMC的存在下48小時(shí)之后，存活的B16F10.9/CD20細(xì)胞比例。存活百分比系藉由將活的細(xì)胞群族中B16F10.9/CD20細(xì)胞與CD20陰性B16F10.9細(xì)胞之百分率作比較所測(cè)定。Ab4和Ab1在混合的細(xì)胞群族中系專一地僅引導(dǎo)人類T細(xì)胞殺死表現(xiàn)CD20的標(biāo)靶細(xì)胞(圖20B)。標(biāo)靶細(xì)胞致死僅在雙特異性抗體的存在下觀察到，其中抗體4(EC₅₀ 12.8ρM)和抗體1(EC₅₀ 19.5ρM)(圖20B)系以劑量-依賴的方式衰減B16F10.9/CD20細(xì)胞。在最高試驗(yàn)劑量時(shí)(10μg/mL)僅有低于5％的CD20-表現(xiàn)細(xì)胞存活。

圖21系顯示在以B16F10.9/CD20細(xì)胞為標(biāo)靶的48-小時(shí)細(xì)胞毒性分析中，來自總CD2+效應(yīng)子細(xì)胞中活化的(CD69+)細(xì)胞百分比，此活性作用系由任一CD20xCD3抗體，亦即抗體4(野生型Fc)或抗體1(嵌合Fc)所引發(fā)。

圖22A和22B系說明CD3xCD20雙特異性抗體經(jīng)由其雙特異性結(jié)合臂引發(fā)T-細(xì)胞與標(biāo)靶細(xì)胞(CD20+細(xì)胞)之群集。效應(yīng)子細(xì)胞系以CFSE染色而CD20+細(xì)胞系以Violet Cell Tracker染色，并以個(gè)別的象限控制。在以不相關(guān)的對(duì)照抗體(對(duì)照抗體5)培養(yǎng)后，在細(xì)胞混合物中并未出現(xiàn)群集(雙重-染色)(圖22A)。在以CD3xCD20雙特異性抗體(Ab 4)培養(yǎng)后，細(xì)胞群集出現(xiàn)，因?yàn)槠淙旧螩FSE和Violet(參見圖22B散布圖上左上象限，如以粗黑方框所標(biāo)出)。

圖23系顯示在以皮下植入Raji腫瘤細(xì)胞和PBMC混合物的NSG小鼠中之腫瘤體積(以mm³表示)研究，其中系將0.4mg/kg,2X/周(i.p)之本發(fā)明CD3xCD20雙特異性抗體(Ab 1)，0.4mg/kg,2X/周(i.p)之不相關(guān)抗體對(duì)照Ab 6，或媒劑與8mg/kg,5X/周(i.p)之抗-CD20抗體利妥昔單抗、5X/周(i.v)之CD19xCD3BiTE作比較(就CD19xCD3BiTE，參見Nagorsen D,等人Pharmacol Ther.2012Dec；136(3):334-42,2012.)。給予帶有已建立腫瘤(～100-500mm3)的小鼠治療。數(shù)據(jù)系以平均值(SEM)來表示并用于ANOVA分析。在此活體內(nèi)模型中，每周i.p.給劑2x之Ab1與5x/周i.v.給劑之CD19xCD3BiTE效力相當(dāng)。

圖24系顯示在以皮下植入Raji/PBMC混合物的NSG小鼠中之腫瘤體積(以mm³表示)研究，類似于圖23，然而提供Ab1、對(duì)照Ab6、利妥昔單抗和媒劑對(duì)照組之ANOVA分析。在抑制已建立的Raji腫瘤上，每周給劑2x之Ab1優(yōu)于利妥昔單抗治療(以8mg/kg；5x/周i.p.給劑)。

圖25A和25B系說明當(dāng)治療系與hCD20/B16F10.9腫瘤轉(zhuǎn)植同時(shí)開始或跟隨其后時(shí)，在以CD3xCD20雙特異性抗體治療的人源化小鼠中之延遲腫瘤生長。圖25A：將hCD3小鼠以皮下植入hCD20‐轉(zhuǎn)導(dǎo)的B16F10.9黑色素瘤細(xì)胞并同時(shí)以0.004mg/kg或0.4mg/kg抗體1(CD3xCD20‐嵌合Fc抗體)或4mg/kg對(duì)照Ab5(抗‐FelD1Ab)，或媒劑對(duì)照組(i.p.每周2次)治療。圖25B：將hCD3小鼠以皮下植入hCD20/B16F10.9黑色素瘤細(xì)胞并在第10天治療已建立的腫瘤及之后以抗體1(CD3xCD20‐嵌合Fc抗體)或?qū)φ战M治療。小鼠系以i.p.每周二次之0.4mg/kg或4mg/kg Ab1，或0.4mg/kg對(duì)照Ab5(抗‐FelD1Ab)或媒劑對(duì)照組治療。

【實(shí)施方式】

在描述本發(fā)明之前，應(yīng)了解，本發(fā)明不限于所述的特定方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)榇说确椒ê蜅l件可改變。亦應(yīng)了解，文中所用的術(shù)語僅作為描述特定實(shí)施例之目的，且不希望受限，因?yàn)楸景l(fā)明之范圍將僅受限于所附的權(quán)利要求。

除非另有說明，否則所有文中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語系具有如本發(fā)明所屬技術(shù)之一般技術(shù)者所正常理解之相同意義。如文中所用，術(shù)語「大約」當(dāng)用于有關(guān)特定引述的數(shù)值時(shí)，系指該值可從該引述值做不大于1％的變化。例如，如文中所用，「約100」一詞包括99和101及所有介于之間的值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。

雖然在施行或試驗(yàn)本發(fā)明時(shí)可使用任何該等與文中所述的方法和物質(zhì)類似或相當(dāng)者，但較佳的方法和物質(zhì)為目前所述。

定義

「CD3」一詞，如文中所用，系指表現(xiàn)在T細(xì)胞上作為多分子T細(xì)胞受體(TCR)之部分的抗原，且其系由下列四條受體鏈中的二條鏈所形成的同源二聚體或異源二聚體所組成：CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ及CD3-γ。除非明確地指出系來自非人類物種，否則所有關(guān)于文中之蛋白、多肽和蛋白片段希望系指人類版本的各蛋白、多肽和蛋白片段。因此，除非明確地指出系來非人類物種，例如「小鼠CD3」、「猴子CD3」等，否則「CD3」一詞系指人類CD3。

如文中所用，「結(jié)合CD3之抗體」或「抗-CD3抗體」包括特異性辨識(shí)單一CD3亞單元(例如ε、δ、γ或ζ)之抗體及其抗原結(jié)合片段，以及特異性辨識(shí)二個(gè)CD3亞單元之二聚復(fù)合物(例如，γ/ε、δ/ε及ζ/ζCD3二聚體)的抗體及其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明之抗體及抗原結(jié)合片段可與可溶性CD3及/或細(xì)胞表面表現(xiàn)的CD3結(jié)合?？扇苄訡D3包括天然的CD3蛋白以及重組的CD3蛋白變體，例如，缺乏跨膜區(qū)或另外不與細(xì)胞膜結(jié)合之單聚和二聚CD3結(jié)構(gòu)。

如文中所用，「細(xì)胞表面-表現(xiàn)的CD3」一詞，系指一或多個(gè)CD3蛋白，其在活體內(nèi)或活體外系表現(xiàn)在細(xì)胞表面，使得至少一部分的CD3蛋白系暴露于細(xì)胞膜的胞外側(cè)且易接近抗體的抗原結(jié)合部分。「細(xì)胞表面表現(xiàn)的CD3」包括包含在細(xì)胞膜中之功能性T細(xì)胞受體環(huán)境內(nèi)的CD3蛋白?！讣?xì)胞表面表現(xiàn)的CD3」一詞包括表現(xiàn)作為細(xì)胞表面上的同源二聚體或異源二聚體(例如，γ/ε、δ/ε及ζ/ζCD3二聚體)之部分的CD3蛋白?！讣?xì)胞表面表現(xiàn)的CD3」一詞亦包括自我表現(xiàn)，在細(xì)胞表面上無其他CD3鏈類型之CD3鏈(例如，CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ)?！讣?xì)胞表面表現(xiàn)的CD3」可包括或由表現(xiàn)于正常表現(xiàn)CD3蛋白之細(xì)胞表面的CD3蛋白所組成。另外，「細(xì)胞表面表現(xiàn)的CD3」可包括或由表現(xiàn)于正常不會(huì)表現(xiàn)CD3蛋白在其表面上但經(jīng)人工工程化表現(xiàn)CD3在其表面上之細(xì)胞表面的CD3蛋白所組成。

如文中所用，「抗-CD3抗體」一詞，包括帶有單一特異性之單價(jià)抗體，以及包括結(jié)合CD3之第一臂及結(jié)合第二(目標(biāo))抗原之第二臂的雙特異性抗體，其中抗-CD3臂系包括任何如文中表1或表2中所列的HCVR/LCVR或CDR序列?？?CD3雙特異性抗體之實(shí)例系描述于文中之他處。術(shù)語「抗原-結(jié)合分子」包括抗體和抗體之抗原結(jié)合片段，其包括，例如雙特異性抗體?？?CD3雙特異性抗體之實(shí)例亦描述于US 2007/0280945A1中；及2013年9月19日申請(qǐng)的PCT國際申請(qǐng)案號(hào)PCT/US13/60511中，其系以全文引用的方式并入本文中。

除非有說明系來非人類物種(例如「小鼠CD20」，「猴子CD20」等)，否則術(shù)語「CD20」，如文中所用，系指人類CD20蛋白。人類CD20蛋白具有如NCBI參考序列NP_690605.1之氨基酸序列。

如文中所用，「抗-CD20抗體」一詞包括具有單一特異性之單價(jià)抗體，例如Rituxan(利妥昔單抗)，如US 7,879,984所述。例示性抗-CD20抗體亦描述于US 7,879,984和2013年9月19日申請(qǐng)的PCT國際專利申請(qǐng)案號(hào)PCT/US13/60511中，其各自系以引用的方式并入本文中。

術(shù)語「抗體」如文中所用，系指包括至少一個(gè)與特定抗原(例如CD3)專一結(jié)合或相互作用之互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的任何抗原結(jié)合分子或分子復(fù)合物。術(shù)語「抗體」系包括：包含藉由雙硫鍵相連接的四條多肽鏈，二條重(H)鏈和二條輕(L)鏈之免疫球蛋白分子(亦即「全抗體分子」)以及其多聚體(例如IgM)。各重鏈系包括一重鏈可變區(qū)(文中縮寫為HCVR或V_H)及一重鏈恒定區(qū)。此重鏈恒定區(qū)系包括三個(gè)區(qū)，C_H1、C_H2和C_H3。各輕鏈系包括一輕鏈可變區(qū)(文中縮寫為LCVR或V_L)及一輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)系包括一個(gè)區(qū)(C_L1)。V_H和V_L區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分為高變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其間散布著較保守性區(qū)域，稱為架構(gòu)區(qū)(FR)。各V_H和V_L系由三個(gè)CDR和四個(gè)FR所組成，以下列順序由胺基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發(fā)明不同的實(shí)施例中，抗-CD3抗體(或其抗原結(jié)合部分)之FR可與人類生殖系序列相同，或經(jīng)自然或人工修飾。氨基酸共有序列可以二或多個(gè)CDR之并排(side-by-side)分析為基準(zhǔn)來定義。

術(shù)語「抗體」，如文中所用，亦包括全抗體分子之抗原結(jié)合片段。術(shù)語抗體之「抗原結(jié)合部分」、抗體之「抗原結(jié)合片段」等等，如文中所用，包括任何與抗原特異性結(jié)合形成一復(fù)合物之天然生成、酵素制得、合成或基因工程化的多肽或糖蛋白?？贵w之抗原結(jié)合片段可使用任何適合的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如蛋白質(zhì)水解消化作用或涉及編碼抗體可變區(qū)和(視需要)恒定區(qū)之DNA操作和表現(xiàn)的重組基因工程技術(shù)，衍生自例如全抗體分子。此DNA為已知的及/或可容易地從例如市面來源、DNA數(shù)據(jù)庫(包括，例如噬菌體-抗體數(shù)據(jù)庫)取得或可經(jīng)合成。此DNA可用化學(xué)或藉由使用分子生物技術(shù)來定序和操作，例如將一或多個(gè)可變及/或恒定區(qū)排列成適合的組態(tài)，或?qū)朊艽a子，產(chǎn)生半胱胺酸殘基、修飾、增添或刪除氨基酸等。

抗原結(jié)合片段之非限定實(shí)例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模擬抗體高變區(qū)之氨基酸殘基所組成的最小識(shí)別單位(例如分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，例如CDR3勝肽)或限制性FR3-CDR3-FR4勝肽。其他工程化分子，例如區(qū)域特異性抗體、單區(qū)抗體、區(qū)域刪除抗體、嵌合抗體、CDR-嫁接抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體(例如單價(jià)奈米抗體、雙價(jià)奈米抗體等)、小模塊免疫醫(yī)藥(SMIP)及鯊可變IgNAR區(qū)，亦涵蓋在文中所用的「抗原結(jié)合片段」之詞語內(nèi)。

抗體之抗原結(jié)合片段典型地將包括至少一可變區(qū)。可變區(qū)可為任何大小或氨基酸組成之區(qū)域且一般應(yīng)包括與一或多個(gè)架構(gòu)序列相鄰或在其架構(gòu)內(nèi)之CDR。在具有V_L區(qū)與V_H區(qū)結(jié)合之抗原結(jié)合片段中，V_H和V_L區(qū)可以任何適合的排列位于彼此相對(duì)處。例如可變區(qū)可為二聚化并含有V_H-V_H、V_H-V_L或V_L-V_L二聚體。另外，抗體之抗原結(jié)合片段可含有單體V_H或V_L區(qū)。

在特定的實(shí)施例中，抗體之抗原結(jié)合片段可含有至少一個(gè)可變區(qū)與至少一個(gè)恒定片段(Fc)區(qū)共價(jià)連接或另外與一Fc區(qū)拴在一起。術(shù)語「拴在一起」系指經(jīng)由共價(jià)鍵、連接符多肽序列直接連接，將二種組份相結(jié)合，例如可變區(qū)與一恒定區(qū)拴在一起。因此，在特定的實(shí)例中，包括第一和第二抗原結(jié)合區(qū)之可變區(qū)，例如該等結(jié)合CD3和CD20形成一雙特異性抗體者，系經(jīng)由共價(jià)鍵或連接符氨基酸序列各自直接連接(或拴住)，例如(由N-端至C-端)全長或部分C_H1、嵌合絞鏈、C_H2和C_H3區(qū)。在本發(fā)明之抗體的抗原結(jié)合片段內(nèi)可發(fā)現(xiàn)的可變區(qū)和恒定區(qū)之非限定、例示性組態(tài)包括：(i)V_H-C_H1-絞鏈-C_H2-C_H3；(ii)V_H-絞鏈-C_H2-C_H3；(iii)V_H-C_L；(iv)V_L-C_H1-C_H2-C_H3；(v)V_L-C_H2-C_H3；及(vi)V_L-C_L。在任何可變區(qū)和恒定區(qū)之組態(tài)中，包括上列任何的例示性組態(tài)，可變區(qū)和恒定區(qū)可直接彼此相連接或可藉由本發(fā)明之完整或部分的嵌合絞鏈，或藉由完整或部分的C_H1和嵌合絞鏈相連(拴住)。在某些案例中，多肽連接符(例如2至10個(gè)氨基酸)可連接(拴住)可變區(qū)和Fc區(qū)或可包括一帶有完整或部分嵌合絞鏈及/或C_H1之另外的連接鏈。絞鏈區(qū)可由至少上絞鏈和下絞鏈氨基酸所組成，使其在單一多肽分子中于相鄰的可變及/或恒定區(qū)之間產(chǎn)生柔性和半柔性連結(jié)。再者，在本發(fā)明之抗體的抗原結(jié)合片段可包括以非共價(jià)彼此相互連結(jié)及/或與一或多個(gè)單體V_H或V_L區(qū)相連結(jié)(例如以雙硫鍵)之任何上列的可變區(qū)和恒定區(qū)組態(tài)之同源二聚體或異源二聚體(或其他多聚體)。

本發(fā)明之多特異性抗體模式，包括文中所揭示的例示性雙特異性抗體，典型地系包括至少二個(gè)不同的可變區(qū)，其中各可變區(qū)能專一與個(gè)別的抗原結(jié)合。多特異性抗體模式，可使用本項(xiàng)技術(shù)中可取得的習(xí)用技術(shù)來改造，使其適用于本發(fā)明抗體之抗原結(jié)合片段狀況。

本發(fā)明之抗體系經(jīng)修飾以具有降低或無補(bǔ)體-依賴的細(xì)胞毒性(CDC)或抗體-依賴的細(xì)胞媒介之細(xì)胞毒性(ADCC)，如活體外所測(cè)。「補(bǔ)體-依賴的細(xì)胞毒性(CDC)」系指在補(bǔ)體的存在下藉由本發(fā)明之抗體裂解抗原-表現(xiàn)細(xì)胞?！缚贵w-依賴的細(xì)胞媒介之細(xì)胞毒性(ADCC)」系指細(xì)胞媒介的反應(yīng)，其中表現(xiàn)Fc受體(FcR)之非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然的殺手(NK)細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)辨識(shí)出目標(biāo)細(xì)胞上的結(jié)合抗體并據(jù)此導(dǎo)致目標(biāo)細(xì)胞的裂解。CDC和ADCC可使用本項(xiàng)技術(shù)所熟知及可取得的分析來測(cè)量。(參見，例如美國專利第5,500,362號(hào)和第5,821,337號(hào)，及Clynes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：652-656)?？贵w的恒定區(qū)(CH)對(duì)于抗體固定補(bǔ)體和媒介細(xì)胞-依賴的細(xì)胞毒性之能力很重要。因此，抗體之CH可依其是否為抗體媒介細(xì)胞毒性所需為基準(zhǔn)加以選擇。

在本發(fā)明特定的實(shí)施例中，本發(fā)明之雙特異性抗體為人類抗體。術(shù)語「人類抗體」，如文中所用，希望系包括具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明之人類抗體可包括非由人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼之氨基酸殘基(例如藉由隨機(jī)或活體外位點(diǎn)特異性突變所導(dǎo)入之突變或活體內(nèi)體細(xì)胞突變)，例如在CDR中及特別是CDR3。然而，術(shù)語「人類抗體」，如文中所用，不希望包括其中衍生自另外哺乳動(dòng)物物種(例如小鼠)之生殖系的CDR序列已稼接在人類架構(gòu)序列上之抗體。

本發(fā)明之抗體，在某些實(shí)施例中可為重組的人類抗體。術(shù)語「重組的人類抗體」，如文中所用，希望包括由重組方法，例如使用重組的表現(xiàn)載體轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞(進(jìn)一步詳述于下)所制備、表現(xiàn)、產(chǎn)生或分離之所有人類抗體，由重組的組合人類抗體庫(進(jìn)一步詳述于下)分離出之抗體，由經(jīng)轉(zhuǎn)殖人類免疫球蛋白基因之動(dòng)物(例如小鼠)分離出的抗體(參見，例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或由任何其他涉及將人類免疫球蛋白基因序列與DNA序列剪接之方法所制備、表現(xiàn)、產(chǎn)生或分離之抗體。此等重組的人類抗體具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區(qū)和恒定區(qū)。然而，在特定的實(shí)施例中，此等重組的人類抗體系在活體外經(jīng)誘發(fā)突變(或當(dāng)使用以人類Ig序列基因轉(zhuǎn)殖之動(dòng)物時(shí)，為活體內(nèi)體細(xì)胞誘發(fā)突變)，且因此重組抗體之V_H和V_L區(qū)的氨基酸序列(當(dāng)衍生自人類生殖系V_H和V_L序列或與其有關(guān)時(shí))其可能并非天然存在于活體內(nèi)人類抗體生殖系庫中之序列。

人類抗體可以二種與絞鏈異質(zhì)性有關(guān)之形式存在。第一種形式，包括約150-160kDa之安定的四鏈結(jié)構(gòu)之免疫球蛋白分子，其中此二聚體系藉由鏈間重鏈雙硫鍵聚集一起。第二種形式，二聚體并非經(jīng)由雙硫鍵相連接且此約75-80kDa之分子系由共價(jià)偶合的輕鏈和重鏈(半抗體)所組成。這些形式極難分離，即使在親和純化后。

在各種完整的IgG同型中，第二種形式出現(xiàn)的頻率系因(但不限于)與抗體之絞鏈區(qū)同型有關(guān)之結(jié)構(gòu)差異所致。在人類IgG4絞鏈之絞鏈區(qū)中的單一氨基酸取代可顯著地降低第二種形式出現(xiàn)(Angal等人(1993)Molecular Immunology 30：105)至典型地使用人類IgG1絞鏈所觀察到的程度。本發(fā)明系涵蓋在絞鏈區(qū)中具有一或多個(gè)突變之抗體，該突變例如在制造上可能為所希望的，用以改善所欲的抗體形式之產(chǎn)率。

本發(fā)明之抗體可為分離的抗體。「分離的抗體」，如文中所用，系指經(jīng)鑒定并從至少一種其天然環(huán)境之組成份分離及/或回收之抗體。例如，從至少一種生物體，或從組織或細(xì)胞之組成份分離或移出之抗體，其中就本發(fā)明之目的，該存在自然界或?yàn)樽匀划a(chǎn)生的抗體為一「分離的抗體」。分離的抗體亦包括重組細(xì)胞內(nèi)原位抗體。分離的抗體為歷經(jīng)至少一純化或分離步驟之抗體。根據(jù)特定的實(shí)施例，分離的抗體可能實(shí)質(zhì)上無其他細(xì)胞物質(zhì)及/或化學(xué)物。

相較于可從其衍生抗體之對(duì)應(yīng)的生殖系序列，文中所揭示的抗-CD3或抗-CD20可變區(qū)可在重鏈和輕鏈可變區(qū)之架構(gòu)及/或CDR區(qū)中包括一或多個(gè)氨基酸取代、插入及/或刪除。此等突變可藉由將文中所揭示之氨基酸序列與得自，例如公開的抗體序列數(shù)據(jù)庫之生殖系序列相比較，而容易地確定。本發(fā)明包括由任何文中所揭示的氨基酸序列所衍生之抗體及其抗原結(jié)合片段，其中在一或多個(gè)架構(gòu)及/或CDR區(qū)中的一或多個(gè)氨基酸系突變成衍生抗體之生殖系序列的對(duì)應(yīng)殘基，或另一種人類生殖系序列之對(duì)應(yīng)殘基，或?qū)?yīng)生殖系殘基之保守氨基酸取代(此等序列之改變?cè)谖闹泄餐Q為「生殖系突變」)。本項(xiàng)技術(shù)之一般技術(shù)者，由文中所揭示之重鏈和輕鏈可變區(qū)序列開始，可容易地制造許多包括一或多個(gè)個(gè)別的生殖系突變或其組合之抗體和抗原結(jié)合片段。在特定的實(shí)施例中，V_H及/或V_L區(qū)內(nèi)的所有架構(gòu)及/或CDR殘基系突變回到衍生此抗體之原始生殖系序列中所發(fā)現(xiàn)的殘基。在其他實(shí)施例中，僅特定的殘基突變回到原始的生殖系序列，例如僅在FR1的前8個(gè)氨基酸中或FR4的后8個(gè)氨基酸中發(fā)現(xiàn)突變的殘基，或僅在CDR1、CDR2或CDR3內(nèi)發(fā)現(xiàn)突變的殘基。在其他的實(shí)施例中，一或多個(gè)架構(gòu)及/或CDR殘基系突變成不同生殖系序列之對(duì)應(yīng)殘基(亦即與最初衍生抗體之生殖系序列不同的生殖系序列)。再者，本發(fā)明之抗體在架構(gòu)及/或CDR區(qū)內(nèi)可含有任何二或多個(gè)生殖系突變之組合，例如，其中特定的個(gè)別殘基系突變成特定生殖系序列之對(duì)應(yīng)殘基，而與原始生殖系序列不同的其他殘基系維持原樣或突變成不同生殖系序列之對(duì)應(yīng)殘基。一旦得到后，含有一或多個(gè)生殖系突變之抗體和抗原結(jié)合片段可容易地檢測(cè)其一或多種所欲的性質(zhì)，例如改善結(jié)合特異性、增加結(jié)合親和力、改善或增進(jìn)拮抗或促效性生物性質(zhì)(視情況而定)、降低致免疫力等。以此通用方法所得到的抗體和抗原結(jié)合片段系涵蓋在本發(fā)明中。

本發(fā)明亦包括抗-CD3或抗-CD20可變區(qū)，其系包含任何具有一或多個(gè)保守取代之文中所揭示的HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列之變體。例如，本發(fā)明包括抗-CD3抗體，其相對(duì)于文中表1所述之任何HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列，系具有含例如10個(gè)或更少、8個(gè)或更少、6個(gè)或更少、4個(gè)或更少之保守性氨基酸取代的HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列。

術(shù)語「表位」系指與抗體分子可變區(qū)中稱為補(bǔ)位(paratope)的特定抗原結(jié)合位置相互作用之抗原決定位。單一抗原可具有一個(gè)以上的表位。因此，不同的抗體可與抗原上的不同區(qū)域結(jié)合并可具有不同的生物效應(yīng)。表位可為構(gòu)型或線性。構(gòu)型表位系由直鏈多肽鏈不同線段之空間上并列的氨基酸所產(chǎn)生。線性表位系由多肽鏈相鄰的氨基酸殘基所產(chǎn)生。在特定的情況下，表位可包括抗原上的醣類基團(tuán)、磷?；蚧酋；?。

術(shù)語「實(shí)質(zhì)上一致」或「實(shí)質(zhì)上相同」當(dāng)系指核酸或其片段時(shí)，系表示當(dāng)以適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖騽h除與另一核酸(或其互補(bǔ)股)優(yōu)化對(duì)齊時(shí)，以任何熟知的序列相同度算法，例如下文所論述的FASTA、BLAST或Gap來測(cè)量，有至少約95％，及更佳地至少約96％、97％、98％或99％之核苷酸堿基具核苷酸序列相同度。與參照核酸分子具有實(shí)質(zhì)上鑲同度的核酸分子，在特定情況下，可編碼一多肽，其與參照核酸分子所編碼的多肽具有相同或?qū)嵸|(zhì)上類似氨基酸序列。

如應(yīng)用于多肽，術(shù)語「實(shí)質(zhì)上類似」系指二個(gè)勝肽序列，當(dāng)以GAP或BESTFIT程序使用內(nèi)建缺位權(quán)重優(yōu)化對(duì)齊時(shí)，享有至少95％序列相同度，甚佳地至少98％或99％序列相同度。較佳地，不同的殘基位置系相差在保守性氨基酸取代?！副Ｊ匦园被崛〈篂槠渲幸话被釟埢到?jīng)另一帶有類似化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)側(cè)鏈(R基)之氨基酸殘基所取代。一般而言，保守性氨基酸取代實(shí)質(zhì)上不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能特性。在其中彼此有二或多個(gè)保守性取代之不同氨基酸序列的案例中，可調(diào)高序列相同度之百分比或類似程度以修正此保守性取代作用之性質(zhì)。調(diào)整之方法已為熟習(xí)本項(xiàng)技術(shù)者所熟知。參見，例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331。具有類似化學(xué)性質(zhì)之側(cè)鏈的氨基酸基團(tuán)實(shí)例包括(1)脂系側(cè)鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2)脂系-羥基側(cè)鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3)含酰胺側(cè)鏈：天門冬酰胺酸和麩酰胺酸；(4)芳香側(cè)鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)堿性側(cè)鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6)酸性側(cè)鏈：天門冬胺酸和麩胺酸，及(7)含硫側(cè)鏈有半胱胺酸和甲硫胺酸。較佳的保守性氨基酸取代基群有：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天門冬胺酸及天門冬酰胺酸-麩酰胺酸。另外，保守性置換為在Gonnet等人(1992)Science 256：1443-1445所揭示的PAM250對(duì)數(shù)概似矩陣中具有正值之任何變化?！钢卸缺Ｊ匦浴怪脫Q為在PAM250對(duì)數(shù)概似矩陣中具有非負(fù)值之任何變化。

多肽之序列類似性，其亦指序列相同度，典型地系使用序列分析軟件來測(cè)量。蛋白分析軟件使用分配至各種取代、刪除和其他修飾作用(包括保守性氨基酸取代)之類似度量值配出類似的序列。例如，GCG軟件含有例如Gap和Bestfit程序，其可使用內(nèi)定參數(shù)，測(cè)定密切相關(guān)的多肽間，例如來自不同生物物種之同源多肽，或野生型和其突變蛋白間之序列同源性或序列相同度。參見，例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA，利用內(nèi)定或建議參數(shù)，一種GCG Version 6.1內(nèi)的程序，作比較。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查詢序列和搜尋序列間最佳重迭區(qū)之比對(duì)和序列相同度百分比(Pearson(2000)前文)。當(dāng)本發(fā)明序列與含有較大量來自不同生物體的序列數(shù)據(jù)庫作比較時(shí)，另一較佳的算法為使用內(nèi)定參數(shù)之計(jì)算機(jī)程序BLAST，特別是BLASTP或TBLASTN。參見，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402。

雙特異性抗原-結(jié)合分子

本發(fā)明之抗體可為雙特異性或多特異性。多特異性抗體可對(duì)一目標(biāo)多肽之不同的表位具特異性或可含有對(duì)一個(gè)以上的目標(biāo)多肽具特異性之抗原結(jié)合區(qū)。參見，例如Tutt等人,1991,J.Immunol.147：60-69；Kufer等人,2004,Trends Biotechnol.22：238-244。本發(fā)明之抗-CD3xCD2抗體可與另外的功能分子，例如另外的勝肽或蛋白相連結(jié)或共表現(xiàn)。例如，抗體或其片段可與一或多個(gè)其他的分子實(shí)體，例如另外的抗體或抗體片段功能性連接(例如以化學(xué)偶合、基因融合、非共價(jià)連結(jié)或其他)，產(chǎn)生帶有另外的結(jié)合特異性之雙特異性或多特異性抗體。

因此，本發(fā)明系包括雙特異性抗體，其中免疫球蛋白之一臂系與人類CD3結(jié)合，而免疫球蛋白之另一臂系對(duì)一目標(biāo)抗原具特異性。與CD3雙特異性抗體之另一臂結(jié)合的目標(biāo)抗原可為任何表現(xiàn)在細(xì)胞、組織、器官、微生物或病毒上或在其鄰近地區(qū)之抗原，而對(duì)抗此抗原的標(biāo)靶免疫反應(yīng)為所欲的。CD3-結(jié)合臂可包括如文中表1所列之任何HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列。

在其中抗體的一臂系與CD3結(jié)合而另一臂系與目標(biāo)抗原結(jié)合之本發(fā)明雙特異性抗體的情況下，此目標(biāo)抗原可為一腫瘤相關(guān)的抗原。特異性腫瘤-相關(guān)抗原之非限定實(shí)例包括，例如AFP、ALK、BAGE蛋白、BIRC5(survivin)、BIRC7、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8(caspase-8)、CALR、CCR5、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD30、CD40、CDK4、CEA、CTLA4、cyclin-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如，GAGE-1、-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3)、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGE蛋白(例如MAGE-1、-2、-3、-4、-6和-12)、MART-1、間皮素(mesothelin)、ML-IAP、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1、Steap-2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Thompson-nouvelle抗原(Tn)、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶及uroplakin-3。

在其中抗體的一臂系與CD3結(jié)合而另一臂系與目標(biāo)抗原結(jié)合之本發(fā)明雙特異性抗體的情況下，此目標(biāo)抗原可為一感染性疾病-相關(guān)的抗原。感染性疾病-相關(guān)的抗原之非限定實(shí)例包括，例如表現(xiàn)在病毒顆粒表面上，或優(yōu)先表現(xiàn)在經(jīng)病毒感染的細(xì)胞上之抗原，其中該病毒系由下列組成之群中選出：HIV、肝炎(A、B或C)、皰疹病毒(例如HSV-1、HSV-2、CMV、HAV-6、VZV、埃-巴病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黃病毒、伊科病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒疹、冠狀病毒、呼吸道融合瘤病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、德國麻疹病毒、微小病毒、牛痘病毒、HTLV、登革熱病毒、乳突病毒、軟疣病毒、小兒麻痹病毒、狂犬病病毒、JC病毒及蟲媒病毒性腦炎病毒。另一種選擇，目標(biāo)抗原可為表現(xiàn)在細(xì)菌表面，或優(yōu)先表現(xiàn)在經(jīng)細(xì)菌感染的細(xì)胞上之抗原，其中該細(xì)菌系由下列組成之群中選出：衣原體(chlamydia)、立克次體(rickettsia)、分枝桿菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎雙球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)、淋病球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假單胞菌(pseudomonas)、退伍軍人菌(legionella)、白喉菌(diphtheria)、沙門氏菌(salmonella)、桿菌(bacilli)、霍亂菌(cholera)、破傷風(fēng)菌(tetanus)、肉毒桿菌(botulism)、炭疽病菌(anthrax)、瘟疫菌(plague)、鉤端螺旋體(leptospira)及萊姆病菌(Lyme disease bacteria)。在特定的實(shí)施例中，此目標(biāo)抗原可為表現(xiàn)在真菌表面，或優(yōu)先表現(xiàn)在經(jīng)真菌感染的細(xì)胞上之抗原，其中該真菌系由下列組成之群中選出：念珠菌(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新型隱球菌(Crytococcus neoformans)、麹菌(Aspergillus)(煙曲霉菌(fumigatus)、黑曲菌(niger)等)、毛霉目(毛霉屬(mucor)、犁頭霉屬(absidia)、根霉屬(rhizopus)等)、申克氏孢子絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。在特定的實(shí)施例中，此目標(biāo)抗原可為表現(xiàn)在寄生蟲表面，或優(yōu)先表現(xiàn)在經(jīng)寄生蟲感染的細(xì)胞上之抗原，其中該寄生蟲系由下列組成之群中選出：痢疾阿米巴原蟲(Entamoeba histolytica)、結(jié)腸小袋絳蟲(Balantidium coli)、福氏耐格里變形蟲(Naegleriafowleri)、棘阿米巴原蟲(Acanthamoeba sp.)、梨型鞭毛蟲(Giardia lambia)、隱孢子蟲(Cryptosporidium sp.)、陰道毛滴蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、果氏巴貝蟲(Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、枯西氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、弓漿蟲(Toxoplasma gondii)、巴西鼠鉤蟲(Nippostrongylus brasiliensis)、狐絳蟲(Taenia crassiceps)及馬來血絲蟲(Brugia malayi)。特異性病原-相關(guān)抗原之非限定實(shí)例包括，例如HIV gp120、HIV CD4、B型肝炎糖蛋白L、B型肝炎糖蛋白M、B型肝炎糖蛋白S、C型肝炎E1、C型肝炎E2、肝細(xì)胞特異性蛋白、單純皰疹病毒gB、巨細(xì)胞病毒gB及HTLV胞膜蛋白。

根據(jù)特定例示性實(shí)施例，本發(fā)明包括專一與CD3和CD20結(jié)合之雙特異性抗原結(jié)合分子。此等分子在文中可稱為，例如「抗-CD3/抗-CD20」或「抗-CD3/CD20」，或「抗-CD3xCD20」或「CD3xCD20」雙特異性分子，或其他類似術(shù)語。

如文中所用，「抗原結(jié)合分子」一詞系指與特定抗原專一結(jié)合之包括或包含至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)單獨(dú)或與一或多個(gè)另外的CDR及/或架構(gòu)區(qū)(FR)組合之蛋白、多肽或分子復(fù)合物。在特定的實(shí)施例中，抗原結(jié)合分子為一抗體或抗體之片段，如該等術(shù)語于文中他處所定義。

如文中所用，「雙特異性抗原結(jié)合分子」一詞系指包括至少一第一抗原結(jié)合區(qū)和一第二抗原結(jié)合區(qū)之蛋白、多肽或分子復(fù)合物。與特定抗原專一結(jié)合之雙特異性抗原結(jié)合分子內(nèi)的各抗原結(jié)合區(qū)系包括至少單獨(dú)一個(gè)CDR或與一或多個(gè)另外的CDR及/或FR組合。在本發(fā)明內(nèi)文中，第一抗原結(jié)合區(qū)系與第一抗原(例如CD3)專一結(jié)合，而第二抗原結(jié)合區(qū)系與第二，不同的抗原(例如CD20)專一結(jié)合。

在本發(fā)明特定的例示性實(shí)施例中，此雙特異性抗原結(jié)合分子為一雙特異性抗體。雙特異性抗體之各抗原結(jié)合區(qū)系包括一重鏈可變區(qū)(HCVR)和一輕鏈可變區(qū)(LCVR)。就包括第一和第二抗原結(jié)合區(qū)之雙特異性抗原結(jié)合分子(例如雙特異性抗體)之情況，第一抗原結(jié)合區(qū)的CDR可以前綴「A1」來定名，而第二抗原結(jié)合區(qū)之CDR可以前綴「A2」來定名。因此，第一抗原結(jié)合區(qū)之CDR在文中可稱為A1-HCDR1、A1-HCDR2及A1-HCDR3；而第二抗原結(jié)合區(qū)之CDR在文中可稱為A2-HCDR1、A2-HCDR2及A2-HCDR3。

第一抗原結(jié)合區(qū)和第二抗原結(jié)合區(qū)可直接或間接彼此相連形成本發(fā)明之雙特異性抗原結(jié)合分子(亦即雙特異性ScFv)，進(jìn)一步與Fc區(qū)結(jié)合。另一種選擇，第一抗原結(jié)合區(qū)和第二抗原結(jié)合區(qū)可各自與個(gè)別的Fc區(qū)連接。本發(fā)明之雙特異性抗原結(jié)合分子典型地將包括二個(gè)Fc區(qū)，其為個(gè)別抗體重鏈之各個(gè)別部份。除了在C_H3區(qū)具有一突變用來幫助或使異源二聚體(亦即雙特異性)分子容易純化外，第一和第二Fc區(qū)可為相同的序列。

本發(fā)明包括包含第一C_H3區(qū)及第二Ig C_H3區(qū)之雙特異性抗原結(jié)合分子，其中第一和第二Ig C_H3區(qū)至少有一氨基酸互不相同，且相較于無此胺基差異之雙特異性抗體，其中至少一氨基酸之差異降低了雙特異性抗體與蛋白A之結(jié)合。在一實(shí)施例中，第一Ig C_H3區(qū)結(jié)合蛋白A而第二Ig C_H3區(qū)含有降低或消除蛋白A結(jié)合之突變，例如H435R修飾(EU編號(hào)；IMGT外顯子編號(hào)為H95R)。第二C_H3可進(jìn)一步包括Y436F修飾(EU編號(hào)；IMGT為Y96F)。在第二C_H3中可發(fā)現(xiàn)的另外修飾作用，就IgG1 C_H3區(qū)之情況而言系包括：EU編號(hào)D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I(IMGT為D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I)；及就IgG4 C_H3區(qū)之情況為EU編號(hào)Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I(IMGT為Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I)。

其他雙特異性抗體格式或技術(shù)可用來制造本發(fā)明之雙特異性抗原結(jié)合分子。例如具有第一抗原結(jié)合特異性之抗體或其片段可與一或多個(gè)其他的分子實(shí)體，例如具有第二抗原結(jié)合特異性之另外的抗體或抗體片段功能性連接(例如以化學(xué)偶合、基因融合、非共價(jià)連結(jié)或其他)，產(chǎn)生一特異性抗原結(jié)合分子?？捎糜诒景l(fā)明內(nèi)文中之特定例示性雙特異性模式包括(不限于)，例如scFv-為基礎(chǔ)或雙抗體雙特異性模式、IgG-scFv融合、雙可變區(qū)(DVD)-Ig、細(xì)胞雜交瘤(Quadroma)、knobs-into-holes、共同輕鏈(例如帶有knobs-into-holes之共同輕鏈等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、白胺酸拉鏈、Duobody、IgG1/IgG2、雙作用Fab(DAF)-IgG和Mab²雙專一模式(參見，例如Klein等人2012,mAbs 4:6,1-11及文中所引述的參考文獻(xiàn)，作為前述模式之審視)。

在本發(fā)明之雙特異性抗原結(jié)合分子的情況下，相較于無改變所欲功能之特定嵌合版本的Fc區(qū)，此Fc區(qū)可包括一或多個(gè)氨基酸變化(例如插入、刪除或取代)。例如，本發(fā)明系包括在Fc區(qū)中包含一或多個(gè)修飾，造成經(jīng)修飾的Fc區(qū)在Fc和FcRn之間具有修飾的結(jié)合交互作用(例如促進(jìn)或減少)之雙特異性抗原結(jié)合分子。在一實(shí)施例中，此雙特異性抗原結(jié)合分子系包括C_H2或C_H3區(qū)中之修飾，其中該修飾增加了酸性環(huán)境中Fc區(qū)對(duì)FcRn之親和力(例如在其中pH范圍從約5.5至約6.0的核內(nèi)體中)。此等Fc修飾之非限定實(shí)例包括，例如位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)之修飾；或位置428及/或433(例如L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如H/F或Y)之修飾；或位置250及/或428之修飾；或位置307或308(例如308F、V308F)和434之修飾。在一實(shí)施例中，此修飾包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修飾；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修飾；250Q和428L修飾(例如T250Q和M428L)；及307及/或308修飾(例如308F或308P)。

序列變體

相較于可從其衍生個(gè)別的抗原結(jié)合區(qū)之對(duì)應(yīng)的生殖系序列，本發(fā)明之抗體和雙特異性抗原結(jié)合分子可在重鏈和輕鏈可變區(qū)之架構(gòu)及/或CDR區(qū)中包括一或多個(gè)氨基酸取代、插入及/或刪除。此等突變可藉由將文中所揭示之氨基酸序列與得自，例如公開的抗體序列數(shù)據(jù)庫之生殖系序列相比較，加以容易地確定。本發(fā)明之抗原結(jié)合分子可包括由任何文中所揭示的例示氨基酸序列所衍生之抗原結(jié)合區(qū)，其中在一或多個(gè)架構(gòu)及/或CDR區(qū)中的一或多個(gè)氨基酸系突變成從其衍生抗體之生殖系序列的對(duì)應(yīng)殘基，或另一種人類生殖系序列之對(duì)應(yīng)殘基，或?qū)?yīng)生殖系殘基之保守氨基酸取代(此等序列之改變?cè)谖闹泄餐Q為「生殖系突變」)。本項(xiàng)技術(shù)之一般技術(shù)者，由文中所揭示之重鏈和輕鏈可變區(qū)序列開始，可容易地制造許多包括一或多個(gè)個(gè)別的生殖系突變或其組合之抗體和抗原結(jié)合片段。在特定的實(shí)施例中，V_H及/或V_L區(qū)內(nèi)的所有架構(gòu)及/或CDR殘基系突變回到從其衍生此抗原結(jié)合區(qū)之原始生殖系序列中所發(fā)現(xiàn)的殘基。在其他實(shí)施例中，僅特定的殘基突變回到原始的生殖系序列，例如僅在FR1的前8個(gè)氨基酸中或FR4的后8個(gè)氨基酸中發(fā)現(xiàn)突變的殘基，或僅在CDR1、CDR2或CDR3內(nèi)發(fā)現(xiàn)突變的殘基。在其他的實(shí)施例中，一或多個(gè)架構(gòu)及/或CDR殘基系突變成不同生殖系序列之對(duì)應(yīng)殘基(亦即與最初從其衍生抗原結(jié)合區(qū)之生殖系序列不同的生殖系序列)。再者，本發(fā)明之抗原結(jié)合區(qū)在架構(gòu)及/或CDR區(qū)內(nèi)可含有任何二或多個(gè)生殖系突變之組合，例如，其中特定的個(gè)別殘基系突變成特定生殖系序列之對(duì)應(yīng)殘基，而與原始生殖系序列不同的其他殘基系維持原樣或突變成不同生殖系序列之對(duì)應(yīng)殘基。一旦得到后，含有一或多個(gè)生殖系突變之抗原結(jié)合區(qū)可容易地檢測(cè)其一或多種所欲的性質(zhì)，例如改善結(jié)合特異性、增加結(jié)合親和力、改善或增進(jìn)拮抗或促效性生物性質(zhì)(視情況而定)、降低致免疫力等。以此通用方法所得到之包括一或多個(gè)抗原結(jié)合區(qū)的雙特異性抗原結(jié)合分子系涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。

本發(fā)明亦包括抗原結(jié)合分子，其中一或二個(gè)抗原結(jié)合區(qū)系包含任何具有一或多個(gè)保守取代之文中所揭示的HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列的變體。例如，本發(fā)明系包括包含抗原結(jié)合區(qū)之抗原結(jié)合分子，其具有相對(duì)于文中所揭示的任何HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列，系帶有例如10個(gè)或更少、8個(gè)或更少、6個(gè)或更少、4個(gè)或更少之保守性氨基酸取代的HCVR、LCVR及/或CDR氨基酸序列?！副Ｊ匦园被崛〈篂槠渲幸话被釟埢到?jīng)另一帶有類似化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)側(cè)鏈(R基)之氨基酸殘基所取代。一般而言，保守性氨基酸取代實(shí)質(zhì)上并不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能特性。具有類似化學(xué)性質(zhì)之側(cè)鏈的氨基酸基團(tuán)實(shí)例包括(1)脂系側(cè)鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2)脂系-羥基側(cè)鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3)含酰胺側(cè)鏈：天門冬酰胺酸和麩酰胺酸；(4)芳香側(cè)鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5)堿性側(cè)鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6)酸性側(cè)鏈：天門冬胺酸和麩胺酸，及(7)含硫側(cè)鏈有半胱胺酸和甲硫胺酸。較佳的保守性氨基酸取代基群有：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天門冬胺酸及天門冬酰胺酸-麩酰胺酸。另外，保守性置換為在Gonnet等人(1992)Science 256：1443-1445所揭示的PAM250對(duì)數(shù)概似矩陣中具有正值之任何變化?！钢卸缺Ｊ匦浴怪脫Q為在PAM250對(duì)數(shù)概似矩陣中具有非負(fù)值之任何變化。

多肽之序列類似性，其亦稱為序列相同度，可使用序列分析軟件來測(cè)量。蛋白分析軟件使用分配至各種取代、刪除和其他修飾作用(包括保守性氨基酸取代)之類似性度量值配出類似的序列。例如，GCG軟件含有例如Gap和Bestfit程序，其可以內(nèi)定參數(shù)用于測(cè)定密切相關(guān)的多肽間，例如來自不同生物物種之同源多肽，或介于野生型和其突變蛋白之序列同源性或序列相同度。參見，例如GCG Version 6.1。多肽序列亦可使用FASTA，利用內(nèi)定或建議參數(shù)，GCG Version 6.1內(nèi)的程序來作比較。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查詢序列和搜尋序列間最佳重迭區(qū)之比對(duì)和序列相同度百分比(Pearson(2000)前文)。當(dāng)本發(fā)明序列與含有較大量來自不同物種的序列數(shù)據(jù)庫作比較時(shí)，另一較佳的算法為使用內(nèi)定參數(shù)之計(jì)算機(jī)程序BLAST，特別是BLASTP或TBLASTN。參見，例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-402)。

pH-依賴結(jié)合

本發(fā)明包括具有pH-依賴結(jié)合特性之抗-CD3/抗-CD20抗體雙特異性抗原結(jié)合分子。例如，本發(fā)明之抗-CD3抗體在酸性pH時(shí)，相較于中性pH，可能出現(xiàn)與CD3結(jié)合降低。另外，本發(fā)明之抗-CD3抗體在酸性pH時(shí)，相較于中性pH，可能出現(xiàn)與CD3結(jié)合增加?！杆嵝詐H」一詞系包括低于約6.2之pH值，例如約6.0、5.95、5,9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更低。如文中所用，「中性pH」一詞系指約7.0至約7.4之pH。「中性pH」一詞系包括約7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35和7.4之pH值。

在特定的情況下，「相較于中性pH，在酸性pH時(shí).....結(jié)合降低」系藉由在酸性pH時(shí)抗體與其抗原結(jié)合之K_D值和在中性pH時(shí)抗體與其抗原結(jié)合之K_D值的比率(或反之亦然)來表示。例如，抗體或其抗原結(jié)合片段在酸性pH時(shí)，相較于中性pH，就本發(fā)明之目的，若抗體或其抗原結(jié)合片段出現(xiàn)約3或更大之酸性/中性K_D比率，可能被視為出現(xiàn)與CD3結(jié)合降低。在特定的例示性實(shí)施例中，本發(fā)明之抗體或其抗原結(jié)合片段的酸性/中性K_D比率可為約3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0.25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0或更大。

具有pH-依賴結(jié)合特性之抗體可，例如藉由在酸性pH時(shí)，相較于中性pH，針對(duì)與特定抗原之結(jié)合降低(或提高)，篩選一抗體群組來取得。另外，氨基酸層級(jí)之抗原結(jié)合區(qū)的修飾作用可能產(chǎn)生具有pH-依賴結(jié)合特性之抗體。例如，藉由將一或多個(gè)抗原結(jié)合區(qū)的氨基酸(例如在CDR內(nèi))以組胺酸殘基取代，可得到相對(duì)于中性pH，在酸性pH時(shí)具有抗原結(jié)合降低之抗體。

Fc受體結(jié)合

系提供包括一嵌合的Fc區(qū)之本發(fā)明抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子及抗體，該嵌合的Fc區(qū)，例如系衍生自不同IgG同型及具有有關(guān)Fc受體結(jié)合和活化之獨(dú)特性質(zhì)的Ig重鏈之絞鏈-CH2-CH3恒定區(qū)。本發(fā)明之特定的Fc區(qū)系經(jīng)工程化以包括一嵌合的絞鏈。

術(shù)語「嵌合的」如文中所用，系指由不同來源之部份所組成?！盖逗系鞍住挂辉~包括第一氨基酸蛋白連接第二氨基酸蛋白，其并非天然正常地連接。氨基酸序列一般可以個(gè)別的蛋白存在或以不同的排列存在相同的蛋白上，并以新的排列共同聚集于一融合多肽中。嵌合蛋白可藉由各種本項(xiàng)技術(shù)已知的方法來制造，例如藉由化學(xué)合成或藉由制造一編碼此嵌合蛋白(以所欲的排列)之氨基酸的多核苷酸。例示的嵌合蛋白包括連接IgG之重鏈區(qū)的嵌合絞鏈序列，以及經(jīng)工程化用以制造本發(fā)明之人類抗體和抗原結(jié)合蛋白的融合蛋白。

文中所揭示的嵌合蛋白系設(shè)計(jì)用來最小化接合點(diǎn)中致免疫表位的產(chǎn)生，例如相較于野生型IgG Fc區(qū)。本發(fā)明之工程化蛋白因此具有降低的致免疫性，并對(duì)Fc受體展現(xiàn)降低的結(jié)合，以及不會(huì)降低對(duì)效應(yīng)子功能。

術(shù)語「絞鏈」如文中所用，希望系包括連接免疫球蛋白之C_H1區(qū)C端與C_H2區(qū)N-端之連續(xù)的氨基酸殘基區(qū)。由C_H2外顯子所編碼之C_H2區(qū)N-端的數(shù)個(gè)氨基酸，亦視為「下絞鏈」之部份。不受限于理論，IgG1、IgG2和IgG4之絞鏈區(qū)的氨基酸經(jīng)定性為包括由不同絞鏈外顯子所編碼之12-15個(gè)連續(xù)氨基酸，及數(shù)個(gè)C_H2區(qū)之N端氨基酸(由C_H2外顯子所編碼)(Brekke,O.H.,等人Immunology Today 16(2):85-90(1995))。在另一方面，IgG3系包括由四個(gè)部份所組成之絞鏈區(qū)：1個(gè)與IgG1之絞鏈區(qū)相似的上絞鏈部份及3個(gè)IgG3特有的相同氨基酸重復(fù)之部份。

術(shù)語「嵌合絞鏈」如文中所用，希望系包括一包含衍生自一Ig分子之絞鏈區(qū)的第一氨基酸序列和衍生自不同種類或亞類Ig分子之絞鏈區(qū)的第二氨基酸序列。本發(fā)明之例示性嵌合絞鏈包括一衍生自人類IgG1絞鏈區(qū)或人類IgG4絞鏈區(qū)之第一氨基酸序列或「上絞鏈」，及一衍生自人類IgG2絞鏈區(qū)之第二氨基酸序列或「下絞鏈」。在特定的實(shí)施例中，第一或「上絞鏈」序列系包括來自EU編號(hào)之位置216至227的氨基酸殘基。在某些實(shí)施例中，此第二或「下絞鏈」序列系包括來自EU編號(hào)之位置228至236的氨基酸殘基。

就本揭示文之目的，「上絞鏈」區(qū)希望系包括EU編號(hào)之位置216至227的氨基酸殘基(Kabat編號(hào)為位置226至240之氨基酸殘基)(參見圖1)?！赶陆g鏈」區(qū)希望系包括EU編號(hào)之位置228至236的氨基酸殘基(Kabat編號(hào)為位置241至2499之氨基酸殘基)(參見圖1)。

為了本發(fā)明施行者之方便，在本揭示文中，人類IgG1、IgG2和IgG4之絞鏈區(qū)的氨基酸在本文中已藉由Kabat之EU編號(hào)系統(tǒng)標(biāo)出(Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological interest.第5版.US Department of Health and Human Services,NIH publication No.91-3242(1991))，亦稱為「EU編號(hào)」或「EU索引」，如根據(jù)Scientific Chart,the international ImMunoGeneTics informationhttp://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html最近更新，創(chuàng)立：200年5月17日，最近更新2013年1月10日。

就人類IgG1、IgG2和IgG4絞鏈氨基酸之EU編號(hào)和IMGT獨(dú)特區(qū)域編號(hào)，IMGT外顯子編號(hào)，以及Kabat編號(hào)慣例(亦參見Kabat,E.A.等人,1991,前文)之間的對(duì)應(yīng)性系描述于下表A至F中：

表A：IgG1絞鏈編號(hào)

表B：IgG1 C‐區(qū)絞鏈編號(hào)

表C：IgG2絞鏈編號(hào)

表D：IgG2 C‐區(qū)絞鏈編號(hào)

表E：IgG4絞鏈編號(hào)

表F：IgG4 C‐區(qū)絞鏈編號(hào)

由外顯子剪接所形成的氨基酸系如括號(hào)中所示。

-系指無對(duì)應(yīng)的編號(hào)提出

--系指在此位置為對(duì)應(yīng)的氨基酸

^a根據(jù)最近更新的IMGT Scientific Chart編號(hào)

^b根據(jù)如Kabat,EA,等人1991中所提出的EU索引編號(hào)

亦參見，例如Lefranc,M.-P.等人,Devel Comp Immunol,29,185-203(2005)；及Edelman,G.M.等人PNAS USA,63:78-85(1969)。

術(shù)語「結(jié)合」就抗體、Ig、抗體結(jié)合片段或含F(xiàn)c蛋白與例如預(yù)先確定的抗原或與FcγR結(jié)合之情況，典型地系指最少二個(gè)實(shí)體或分子結(jié)構(gòu)之間的相互作用或結(jié)合，例如抗體-抗原相互作用或含F(xiàn)c-蛋白對(duì)FcγR。

例如，結(jié)合親和力，當(dāng)例如以表面電漿共振(SPR)技術(shù)于BIAcore3000儀器中使用抗原或作為配體及以抗體、Ig、抗體結(jié)合片段或含F(xiàn)c蛋白作為分析物(或抗配體)來測(cè)定時(shí)，典型地系相當(dāng)于約10^-7M或更低，例如約10^-8M或更低，例如約10^-9M或更低之K_D值。因此，抗體或其他結(jié)合蛋白與預(yù)先決定的抗原或受體系以相當(dāng)于比其與非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)結(jié)合之親和力低至少10倍，例如低至少100倍，例如低至少1,000倍，例如低至少100,000倍之K_D值結(jié)合。

術(shù)語「K_D」(M)，如文中所用，系指特定的抗體-抗原相互作用之裂解平衡常數(shù)，或抗體、Ig、抗體結(jié)合片段或含F(xiàn)c蛋白與FcγR之裂解平衡常數(shù)。K_D和結(jié)合親和力之間具有逆相關(guān)性，因此較小的K_D值，較高的，亦即較強(qiáng)的親和力。因此，術(shù)語「較高的親和力」或「較強(qiáng)的親和力」系關(guān)于較高形成相互作用的能力且因此為較小的K_D值，而反之，術(shù)語「較低的親和力」或「較弱的親和力」系關(guān)于較低形成相互作用的能力且因此為較大的K_D值。在某些情況下，特定分子(例如抗體)與其相互作用的伙伴分子(例如受體X)之較高的結(jié)合親和力(或K_D)，相較于此分子(例如抗體)與另外的伙伴分子(例如受體Y)之結(jié)合親和力，可以較大K_D值(較低或較弱親和力)除以較小K_D(較高或較強(qiáng)親和力)所測(cè)定的結(jié)合比率來表示，或例如以大于5-倍或10-倍的結(jié)合親和力來表示，視情況而定。

術(shù)語「K_d」(sec-1或1/s)，如文中所用，系指特定的抗體-抗原交互作用之裂解速率常數(shù)，或抗體、Ig、抗體結(jié)合片段或含F(xiàn)c蛋白與FcγR之裂解速率常數(shù)。

術(shù)語「K_a」(M-1x sec-1或1/M)，如文中所用，系指特定的抗體-抗原交互作用之結(jié)合速率常數(shù)，或抗體、Ig、抗體結(jié)合片段或含F(xiàn)c蛋白與FcγR之結(jié)合速率常數(shù)。

術(shù)語「K_A」(M-1或1/M)，如文中所用，系指特定的抗體-抗原交互作用之結(jié)合平衡常數(shù)，或抗體、Ig、抗體結(jié)合片段或含F(xiàn)c蛋白與FcγR之結(jié)合平衡常數(shù)。結(jié)合平衡常數(shù)系由k_a除以k_d所得來。

術(shù)語「EC50」或「EC₅₀」，如文中所用，系指半數(shù)最大有效濃度，其包括引發(fā)基線至一特定暴露時(shí)間后最大量間之半數(shù)反應(yīng)的抗體濃度。EC₅₀基本上系代表其中觀察到50％之其最大效用的抗體濃度。因此，隨著EC₅₀或半數(shù)最大有效濃度值增加，會(huì)觀察到結(jié)合降低。

在一實(shí)施例中，結(jié)合降低可定義為：能與半數(shù)最大量之目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合的EC₅₀抗體濃度增加。

在某些實(shí)施例中，細(xì)胞毒性活性，例如ADCC或CDC降低，可定義為能裂解半數(shù)最大量目標(biāo)細(xì)胞之EC₅₀抗體濃度增加。細(xì)胞毒性測(cè)定為細(xì)胞毒性百分比，或裂解百分比其為在一鈣黃綠素(calcein)釋放分析中觀察到裂解的總細(xì)胞群族之分量。細(xì)胞毒性百分比可如實(shí)例6中所述來測(cè)量。

在其他的實(shí)施例中，增生降低可定義為使半數(shù)最大量目標(biāo)細(xì)胞增生之EC₅₀抗體濃度增加。

「效應(yīng)子功能」一詞，如文中所用，希望系包括由含F(xiàn)c-蛋白因與FcγR結(jié)合所賦予的功能性能力。不受限于理論，F(xiàn)c/FcγR復(fù)合物之形成招募了各種效應(yīng)子細(xì)胞至結(jié)合抗原的位置，典型地在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生種種的訊號(hào)傳遞事件及重要的后續(xù)免疫反應(yīng)。

本發(fā)明之含嵌合Fc抗原結(jié)合蛋白及抗體，相較于對(duì)應(yīng)的含野生型Fc抗原結(jié)合蛋白或抗體，展現(xiàn)改變或降低的效應(yīng)子功能，參見，例如2014年8月7日公開的PCT公開案號(hào)WO 2014/121087，其系以全文引用的方式并入。

在某些實(shí)施例中，降低或改變的效應(yīng)子功能為一細(xì)胞毒性效應(yīng)子功能，例如細(xì)胞毒性、補(bǔ)體-依賴細(xì)胞毒性(CDC)或抗體-依賴細(xì)胞毒性(ADCC)。在一實(shí)施例中，此降低或改變的效應(yīng)子功能為補(bǔ)體-依賴細(xì)胞毒性(CDC)。在另外的實(shí)施例中，此降低或改變的效應(yīng)子功能為抗體-依賴細(xì)胞毒性。在其他的實(shí)施例中，此降低或改變的效應(yīng)子功能為目標(biāo)細(xì)胞之細(xì)胞增生。

數(shù)種抗體效應(yīng)子功能至少部份系由在特定免疫球蛋白的恒定區(qū)中(特別是CH2和CH3區(qū))與抗體的Fc區(qū)結(jié)合之Fc受體(FcRs)所媒介。有許多對(duì)不同種類的免疫球蛋白，亦即IgG、IgE、IgA、IgM和IgD具特異性之Fc受體。人類IgG Fc受體家族系分成三組：FcγRI(CD64)，其能以高親和力與IgG結(jié)合，F(xiàn)cγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)二者為低親和力受體。各FcγR亞類系由二或三個(gè)基因所編碼，及替代的RNA剪接導(dǎo)致多重轉(zhuǎn)錄，因此有廣泛多樣性FcγR同型存在(例如FcγRIA(CD64；FCGR1A)，F(xiàn)cγRIB(CD64；FCRG1B)，F(xiàn)cγRIIA(CD32A；FCGR2A)，F(xiàn)cγRIIB(CD32B；FCGR2B)，F(xiàn)cγRIIC(CD32C；FCGR2C)，F(xiàn)cγRIIIA(CD16a；FCGR3A)和FcγRIIIB(CD16b；FCGR3B))。另外，F(xiàn)cRn或新生兒Fc受體(亦稱為Fc受體轉(zhuǎn)運(yùn)子,α或FCGRT)能經(jīng)由胎盤將IgG抗體從母體轉(zhuǎn)移到胎兒。再者，F(xiàn)c受體系表現(xiàn)在各種細(xì)胞，包括，例如B細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞及特定的淋巴細(xì)胞。例如，U937細(xì)胞，一種人類單核細(xì)胞株系表現(xiàn)FcγRI和FcγRIIA二者(參見，例如Jones,等人J Immunol135(5):3348-53(1985)；及Brooks,等人J Exp Med 170:1369-85(1989年10月))。文中所指的各受體，包括任何已知功能形式的受體，其包括轉(zhuǎn)錄變體、同型和多形物。

Ig Fc與其受體結(jié)合將這些效應(yīng)子細(xì)胞帶到結(jié)合抗原的位置，最后產(chǎn)生各種訊號(hào)傳遞和免疫反應(yīng)，包括B細(xì)胞活化、發(fā)炎反應(yīng)、細(xì)胞毒性反應(yīng)和吞噬細(xì)胞反應(yīng)。如此一來，Ig Fc與其受體之降低或改變的結(jié)合可能造成效應(yīng)子功能降低。

「抗體-依賴的細(xì)胞吞噬作用」或「ADCP」一詞系關(guān)于藉由吞噬目標(biāo)細(xì)胞而非引發(fā)細(xì)胞毒性來消除(或殺死)目標(biāo)細(xì)胞之效應(yīng)子功能。ADCP可能為活體內(nèi)殺死腫瘤標(biāo)之一重要的機(jī)制。ADCP可藉由雙色熒光流式細(xì)胞儀方法來測(cè)量，例如利用，例如PKH2(綠色熒光染劑)及藻紅素-接合的(紅色)單株抗體對(duì)抗不同的細(xì)胞表面表面蛋白，用以分化受檢測(cè)細(xì)胞之方法，從而測(cè)定吞噬細(xì)胞活性及吞噬作用的速率。ADCP測(cè)量已為本項(xiàng)技術(shù)所熟知。相對(duì)于FcγRIIB選擇性FcγRIIA活化之治療策略可能增進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬活性(Richards,JO,等人2008Mol Cancer Ther 7(8):2517-27)。本發(fā)明之含嵌合的Fc區(qū)抗原結(jié)合蛋白和抗體系結(jié)合及活化人類FcγRIIA。在特定的情況下，本發(fā)明之抗原結(jié)合蛋白和抗體系以高于此抗體結(jié)合FcγRIIB之親和力與人類FcγRIIA結(jié)合。在某些實(shí)施例中，此抗體展現(xiàn)對(duì)人類FcγRIIA之親和力系比此抗體與人類FcγRIIB之結(jié)合親和力強(qiáng)約5-倍，此親和力值系以K_D表示。在其他的實(shí)施例中，此抗體展現(xiàn)對(duì)人類FcγRIIA之親和力系比此抗體與人類FcγRIIB之結(jié)合親和力強(qiáng)約6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-、14-、15-、16-、17-、18-、19-或20-倍。

抗體和雙特異性抗原結(jié)合分子之生物特性

本發(fā)明系包括與人類CD3和CD20結(jié)合之抗體及其抗原結(jié)合片段。例如，本發(fā)明包括以低于約60nM之EC₅₀值與Jurkat細(xì)胞(CD3+)和Raji細(xì)胞(CD20+)結(jié)合之抗-CD3xCD20抗體，如藉由活體外結(jié)合分析，例如使用文中實(shí)例3所定義的分析模式(例如評(píng)估抗-CD3xCD20抗體與Jurkat細(xì)胞或Raji細(xì)胞之結(jié)合)或?qū)嵸|(zhì)上類似的分析所測(cè)量。在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明之抗體或抗原結(jié)合片段，如藉由活體外結(jié)合分析，例如使用文中實(shí)例4所定義的分析模式或?qū)嵸|(zhì)上類似的分析所測(cè)量，系以低于約75nM，低于約70nM，低于約65nM，低于約60nM，低于約50nM，低于約40nM，低于約30nM，或低于約25nM之EC₅₀值與細(xì)胞(例如Jurkat細(xì)胞及/或Raji細(xì)胞)表面的CD3或CD20結(jié)合。

本發(fā)明包括能同時(shí)結(jié)合人類CD3和人類CD20之雙特異性抗原結(jié)合分子(例如，雙特異性抗體)。根據(jù)特定的實(shí)施例，本發(fā)明之雙特異性抗原結(jié)合分子系專一與表現(xiàn)CD3及/或CD20之細(xì)胞相互作用。雙特異性抗原結(jié)合分子與表現(xiàn)CD3及/或CD20之細(xì)胞結(jié)合的程度可藉由熒光活化的細(xì)胞分類(FACS)，如文中實(shí)例中所示來評(píng)估。例如，本發(fā)明系包括專一結(jié)合表現(xiàn)CD3之人類T-細(xì)胞株(例如Jurkat)、表現(xiàn)CD20之人類B細(xì)胞株(例如Raji)及靈長類T細(xì)胞(例如獼猴外圍血液?jiǎn)魏思?xì)胞[PBMC])之雙特異性抗原結(jié)合分子。本發(fā)明系包括，如使用實(shí)例4中所述的FACS分析或?qū)嵸|(zhì)上類似的分析所測(cè)量，以從約8.74x10^-6至約5.99x10^-8或更低之EC₅₀值與任何前述細(xì)胞及細(xì)胞株結(jié)合之雙特異性抗原結(jié)合分子。

本發(fā)明亦包括與人類CD3結(jié)合及引發(fā)T-細(xì)胞媒介的殺死腫瘤細(xì)胞之抗體及其抗原結(jié)合片段。例如，本發(fā)明系包括抗-CD3xCD20抗體，其如活體外T-細(xì)胞媒介的殺死腫瘤細(xì)胞分析，例如使用文中實(shí)例5中所定義的分析模式(例如在抗-CD3抗體的存在下評(píng)估Raji腫瘤細(xì)胞被人類PBMC殺死之程度)或?qū)嵸|(zhì)上類似的分析所測(cè)量，系以低于約60pM之EC₅₀值引發(fā)T-細(xì)胞媒介的殺死腫瘤細(xì)胞。在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明之抗體或抗原結(jié)合片段，如活體外T-細(xì)胞媒介的殺死腫瘤細(xì)胞分析，例如使用文中實(shí)例5中所定義的分析模式或?qū)嵸|(zhì)上類似的分析所測(cè)量，系以低于約56pM，低于約50pM，低于約45pM，低于約40pM，低于約35pM，低于約30pM，低于約25pM，低于約20pM，低于約15pM，低于約10pM，低于約5pM，或低于約1pM之EC₅₀值引發(fā)T-細(xì)胞媒介的殺死腫瘤細(xì)胞(例如PBMC-媒介的殺死Raji細(xì)胞)。

本發(fā)明亦包括與人類CD3/CD20結(jié)合及引發(fā)補(bǔ)體-依賴的細(xì)胞毒性(CDC)之抗體及其抗原結(jié)合片段，雖然比具有野生型IgG Fc區(qū)之抗體在程度上效低。例如，本發(fā)明包括，如活體外T-細(xì)胞媒介的腫瘤細(xì)胞致死分析，例如使用文中實(shí)例6中所定義的分析模式(例如，在補(bǔ)體及抗-CD3xCD20抗體的存在下，評(píng)估殺死目標(biāo)細(xì)胞(Raji或Daudi)的程度)或?qū)嵸|(zhì)上類似的分析所測(cè)量，以低于約50％之細(xì)胞毒性百分比(％細(xì)胞毒性或％系胞裂解)引發(fā)CDC殺死Raji或Daudi(CD20-表現(xiàn))細(xì)胞之抗-CD3xCD20抗體。在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明之抗體及抗原結(jié)合片段，如活體外補(bǔ)體-媒介的細(xì)胞致死分析，例如使用文中實(shí)例6中所定義的分析模式或?qū)嵸|(zhì)上類似的分析所測(cè)量，系以低于約45％，低于約40％，低于約35％，低于約30％，低于約25％，低于約20％，低于約15％，低于約10％，低于約5％，低于約1％之細(xì)胞毒性百分比，低于背景細(xì)胞毒性或無可偵測(cè)的細(xì)胞毒性，引發(fā)CDC細(xì)胞致死(例如補(bǔ)體-媒介的殺死Raji或Daudi細(xì)胞)。

本發(fā)明亦包括與人類CD3/CD20結(jié)合，而相較于具有野生型IgG Fc區(qū)的抗體，不會(huì)顯著引發(fā)抗體-依賴的細(xì)胞媒介細(xì)胞毒性(ADCC)之抗體及其抗原結(jié)合片段。例如，本發(fā)明系包括，如活體外NK細(xì)胞媒介的細(xì)胞致死分析，例如使用文中實(shí)例7中所定義的分析模式(例如，在NK細(xì)胞及抗-CD3xCD20抗體的存在下，評(píng)估目標(biāo)細(xì)胞致死(Raji或Daudi)的程度)或?qū)嵸|(zhì)上類似的分析所測(cè)量，帶有低于約20％的細(xì)胞毒性百分比(％細(xì)胞毒性或％系胞裂解)不具有可感知?dú)⑺繰aji或Daudi(CD20-表現(xiàn))細(xì)胞的抗-CD3xCD20抗體。實(shí)質(zhì)上類似的分析可包括NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞或其他FcγRIII-表現(xiàn)細(xì)胞，包括表現(xiàn)變體FcγRIII之細(xì)胞的存在。在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明之抗體或抗原結(jié)合片段，如活體外FcγRIII-媒介的腫瘤細(xì)胞致死分析，例如使用文中實(shí)例7中所定義的分析模式或?qū)嵸|(zhì)上類似的分析所測(cè)量，不具有可偵測(cè)的ADCC活性(例如，NK細(xì)胞或FcγRIII-媒介的殺死Raji或Daudi細(xì)胞)，帶有低于約30％，低于約25％，低于約20％，低于約15％，低于約10％，低于約5％，低于約1％之細(xì)胞毒性百分比，低于背景細(xì)胞毒性或無可偵測(cè)的細(xì)胞毒性。

根據(jù)特定的實(shí)施例，本發(fā)明系包括，如表面電漿子共振，例如使用文中實(shí)例8所定義的分析模式所測(cè)量，以低于約23.5μM之K_D值與人類FcγRIIA(例如在25℃)結(jié)合之抗體及抗體之抗原結(jié)合片段。在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明之抗體或抗原結(jié)合片段，如以表面電漿子共振，例如使用文中實(shí)例8所定義的分析模式(例如，mAb-捕捉或抗原捕捉模式)或?qū)嵸|(zhì)上類似的分析所測(cè)量，系以低于約20.5μM，低于約20μM，低于約19.3μM，低于約18μM，低于約17μM，低于約16μM，低于約15μM，低于約10μM，低于約9μM，低于約8μM，低于約7μM，低于約6μM，低于約5μM，低于約4μM，低于約3μM，低于約2μM，低于約1μM，低于約900nM，低于約800nM，或低于約700nM之K_D值與FcγRIIA結(jié)合。

根據(jù)特定的實(shí)施例，本發(fā)明系包括，如表面電漿子共振，例如使用文中實(shí)例8所定義的分析模式所測(cè)量，以低于約233μM之K_D與人類FcγRIIB結(jié)合(例如于25℃)之抗體及抗體的抗原結(jié)合片段。在特定的實(shí)施例中，在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明之抗體或抗原結(jié)合片段，如表面電漿子共振，例如使用文中實(shí)例8所定義的分析模式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉模式)或?qū)嵸|(zhì)上類似的分析所測(cè)量，系以低于約200μM，低于約190μM，低于約180μM，低于約170μM，低于約160μM，低于約150μM，低于約140μM，低于約130μM，低于約125μM，低于約123μM，低于約120μM，低于約110μM，低于約100μM，低于約90μM，低于約80μM，低于約70μM，低于約60μM，低于約50μM，或低于約40μM之K_D值與FcγRIIB結(jié)合。

本發(fā)明亦包括，如表面電漿子共振于25℃或37℃，例如使用文中實(shí)例9所定義的分析模式或?qū)嵸|(zhì)上類似的分析所測(cè)量，系以大于約8天的裂解半衰期(t1/2)與CD3xCD20結(jié)合之抗體及其抗原結(jié)合片段。在特定的實(shí)施例中，此抗體，如表面電漿子共振于25℃或37℃，例如使用文中實(shí)例9所定義的分析模式(例如mAb-捕捉或抗原-捕捉模式)或?qū)嵸|(zhì)上類似的分析所測(cè)量，系具有大于約5天，大于約6天，大于約7天，大于約8天，大于約9天，大于約10天，大于約11天，大于約12天，大于約13天，大于約14天，大于約15天，或大于約20天之t1/2。

本發(fā)明亦包括，在一或多個(gè)由下列組成之群中選出的分析中不具有實(shí)質(zhì)活性之抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子：(a)活體外引發(fā)PBMC增生；(b)CDC細(xì)胞毒性(參見，例如文中實(shí)例6)；(d)ADCC(參見，例如文中實(shí)例7)。

本發(fā)明亦包括，在一或多個(gè)由下列組成之群中選出的分析中具有實(shí)質(zhì)活性之抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子：(a)在獼猴中去除B-細(xì)胞(例如，CD45+/CD20+B-細(xì)胞)(參見，例如文中實(shí)例10和11)；(b)在免疫缺陷小鼠模型中降低B-細(xì)胞腫瘤體積(例如Raji腫瘤體積)(參見，例如實(shí)例12A)；及(c)在帶有已建立腫瘤的小鼠模型中消退腫瘤(參見，例如實(shí)例12B)。

本發(fā)明包括能于一患者中去除B細(xì)胞之抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子(參見，例如實(shí)例10)。例如，根據(jù)特定的實(shí)施例，系提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子，其中系將雙特異性抗原結(jié)合分子單一投予一患者(例如以約1mg/kg，約0.9mg/kg，約0.8mg/kg，約0.7mg/kg，約0.6mg/kg，約0.5mg/kg，約0.4mg/kg，約0.3mg/kg，約0.2mg/kg，約0.1mg/kg，約0.08mg/kg，約0.06mg/kg，約0.04mg/kg，約0.03mg/kg，約0.02mg/kg，約0.01mg/kg或更低的劑量)，使此患者之B細(xì)胞數(shù)目下降(例如由此患者所采集的血液樣本中)至可偵測(cè)量以下。在特定的實(shí)施例中，單一投予約0.1mg/kg劑量之抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子，系在將雙特異性抗原結(jié)合分子投予此患者后約第7天、約第6天、約第5天、約第4天、約第3天、約第2天、約第1天，使此患者之B系胞數(shù)目下降至可偵測(cè)量以下。根據(jù)特定的實(shí)施例，單一投予約0.01mg/kg劑量之本發(fā)明抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子，在投予后，直到至少約7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天或更多天，使此B系胞數(shù)目仍在可偵測(cè)量以下。如文中所用，「可偵測(cè)量以下」一詞系指從患者抽取的血液樣本中，使用標(biāo)準(zhǔn)的B細(xì)胞偵測(cè)分析，例如文中實(shí)例10中所述之B細(xì)胞標(biāo)記的FACS分析，無直接或間接偵測(cè)到B細(xì)胞。

本發(fā)明亦提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子，當(dāng)投予一患者，其造成不超過一次過渡性T細(xì)胞降低。例如，提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子，當(dāng)以約0.01mg/kg，或約0.1mg/kg，或約1mg/kg之劑量投予一患者時(shí)，在投予后第1天造成T細(xì)胞數(shù)目下降，但其中每微升血液之T細(xì)胞數(shù)目在之后的時(shí)間點(diǎn)即回復(fù)(例如在投予后約第2天、第4天、第7天、第14天、第28天或之后)。例如，本發(fā)明系提供抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子，其中在投予約0.01mg/kg，或約0.1mg/kg，或約1mg/k劑量之抗原結(jié)合分子至一患者后約第4天至約第7天，如使用標(biāo)準(zhǔn)的T-細(xì)胞偵測(cè)分析，例如文中實(shí)例10中所述，用于T-細(xì)胞標(biāo)記之FACS分析所測(cè)，從該患者抽出的每微升血液之T細(xì)胞，系等于或大于投予雙特異性抗原結(jié)合分子之前由該患者抽出的每微升血液之T細(xì)胞數(shù)目。

表位定位及相關(guān)技術(shù)

與本發(fā)明抗原結(jié)合分子結(jié)合之CD3上或CD20上的表位可由3或多個(gè)(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個(gè)或更多)CD3蛋白之氨基酸的單一連續(xù)序列所組成。另外，表位可由多數(shù)個(gè)CD3或CD20之非連續(xù)氨基酸(或氨基酸序列)所組成。本發(fā)明之抗體可與包含在單一CD3鏈(例如CD3-ε、CD3-δ或CD3-γ)內(nèi)的氨基酸相互作用，或可與二或多條不同CD3鏈上的氨基酸相互作用。術(shù)語「表位」，如文中所用，系指與抗體分子可變區(qū)中稱為補(bǔ)位(paratope)的特定抗原結(jié)合位置相互作用之抗原決定位。單一抗原可具有一個(gè)以上的表位。因此，不同的抗體可與抗原的不同區(qū)域結(jié)合并可具有不同的生物效應(yīng)。表位可為構(gòu)型或線性。構(gòu)型表位系由直鏈多肽鏈不同線段之空間上并列的氨基酸所產(chǎn)生。線性表位系由多肽鏈相鄰的氨基酸殘基所產(chǎn)生。在特定的情況下，表位可包括抗原上的醣類基團(tuán)、磷?；鶊F(tuán)或磺?；鶊F(tuán)。

本項(xiàng)技術(shù)之一般技術(shù)者已知的各種技術(shù)皆可用于測(cè)定抗體之抗原結(jié)合區(qū)是否與多肽或蛋白內(nèi)的「一或多個(gè)氨基酸交互作用」。例示的技術(shù)包括，例如習(xí)用的交叉阻斷分析，例如描述于Antibodies,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中，丙胺酸掃描突變分析、勝肽墨點(diǎn)分析(Reineke(2004),Methods Mol Biol 248：443-463)及勝肽裂解分析。此外，可使用例如表位切除、表位萃取及抗原之化學(xué)修飾等方法(Tomer(2000)Protein Science9：487-496)?？捎糜诒孀R(shí)多肽內(nèi)與抗體之抗原結(jié)合區(qū)相互作用之氨基酸的另外方法系以質(zhì)譜偵測(cè)氫/氘交換。一般而言，氫/氘交換方法系包括以氘標(biāo)定所指的蛋白，接著讓抗體與氘標(biāo)定的蛋白結(jié)合。接著，將蛋白/抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)置于水中，讓除了受抗體保護(hù)的殘基(其仍為氘標(biāo)定)以外的所有殘基發(fā)生氫-氘交換。裂解抗體后，將目標(biāo)蛋白以蛋白酶裂解并以質(zhì)譜分析，藉此找出氘標(biāo)定殘基，其系相當(dāng)于與抗體交互作用之特定氨基酸。參見，例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen and Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A?？乖?抗體復(fù)合物之X-光晶體學(xué)亦可用于表位定位之目的。

本發(fā)明進(jìn)一步系包括與任何文中所述之特定例示性抗體相同之表位結(jié)合的抗-CD3抗體(例如，包括如文中表1所述之任何胺基序的抗體)。同樣的，本發(fā)明亦包括與任何文中所述之特定例示性抗體(例如，包括如文中表1所述之任何胺基序的抗體)競(jìng)爭(zhēng)與CD3結(jié)合之抗-CD3抗體。

本發(fā)明亦包括雙特異性抗原結(jié)合分子，其系包含專一與人類CD3結(jié)合之第一抗原結(jié)合區(qū)，及專一與人類CD20結(jié)合之第二抗原結(jié)合區(qū)，其中第一抗原結(jié)合區(qū)系與任何文中所述之特定例示性CD3-專一抗原結(jié)合區(qū)相同之CD3上的表位結(jié)合，及/或其中第二抗原結(jié)合區(qū)系與任何文中所述之特定例示性CD20-專一抗原結(jié)合區(qū)相同之CD20上的表位結(jié)合。

同樣地，本發(fā)明亦包括雙特異性抗原結(jié)合分子，其包含專一與人類CD3結(jié)合之第一抗原結(jié)合區(qū)，及專一與人類CD20結(jié)合之第二抗原結(jié)合區(qū)，其中第一抗原結(jié)合區(qū)系與任何文中所述之特定例示性CD3-專一抗原結(jié)合區(qū)競(jìng)爭(zhēng)與CD3之結(jié)合，及/或其中第二抗原結(jié)合區(qū)系與任何文中所述之特定例示性CD20-專一抗原結(jié)合區(qū)競(jìng)爭(zhēng)與CD20之結(jié)合。

在一方面，本發(fā)明系包括其中第一抗原結(jié)合區(qū)系與參照的抗原結(jié)合區(qū)競(jìng)爭(zhēng)與人類CD3結(jié)合之雙特異性抗體，其系包括三個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3)及三個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3)，其中(i)A1-HCDR1系包括SEQ ID NO：12之氨基酸列；(ii)A1-HCDR2系包括SEQ ID NO：14之氨基酸列；(iii)A1-HCDR3系包括SEQ ID NO：16之氨基酸列；(iv)A1-LCDR1系包括SEQ ID NO：20之氨基酸列；(v)A1-LCDR2系包括SEQ ID NO：22之氨基酸列；及(vi)A1-LCDR3系包括SEQ ID NO：24之氨基酸列。在某些案例中，雙特異性抗體系包括與參照抗原結(jié)合區(qū)競(jìng)爭(zhēng)和人類CD3結(jié)合之第一抗原結(jié)合區(qū)，其系包括(i)SEQ ID NO：10之重鏈可變區(qū)(HCVR)氨基酸序列，及(ii)SEQ ID NO：18之輕鏈可變區(qū)(LCVR)氨基酸序列。

在另外方面，本發(fā)明系包括其中第二抗原結(jié)合區(qū)系與參照的抗原結(jié)合區(qū)競(jìng)爭(zhēng)與人類CD20結(jié)合之雙特異性抗體，其系包括三個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3)及三個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3)，其中(i)A2-HCDR1系包括SEQ ID NO：4之氨基酸序列；(ii)A2-HCDR2系包括SEQ ID NO：6之氨基酸序列；(iii)A2-HCDR3系包括SEQ ID NO：8；(iv)A2-LCDR1系包括SEQ ID NO：20之氨基酸序列；(v)A2-LCDR2系包括SEQ ID NO：22之氨基酸序列；及(vi)A2-LCDR3系包括SEQ ID NO：24之氨基酸序列。在某些案例中，雙特異性抗體系包括與參照抗原結(jié)合區(qū)競(jìng)爭(zhēng)和人類CD20結(jié)合之第二抗原結(jié)合區(qū)，其系包括(i)包含SEQ ID NO：2氨基酸序列之重鏈可變區(qū)(HCVR)，及(ii)包含SEQ ID NO：18氨基酸序列之輕鏈可變區(qū)(LCVR)。

在另外方面，本發(fā)明系包括一具有與參照的抗原結(jié)合蛋白競(jìng)爭(zhēng)與人類CD3結(jié)合之第一抗原結(jié)合區(qū)的雙特異性抗體，該第一抗原結(jié)合區(qū)系包括(i)一包含SEQ ID NO：10氨基酸序列之重鏈可變區(qū)(HCVR)，及(ii)一包含SEQ ID NO：18氨基酸序列之輕鏈可變區(qū)(LCVR)；并具有與參照的抗原結(jié)合蛋白競(jìng)爭(zhēng)與人類CD20結(jié)合之第二抗原結(jié)合區(qū)，其系包括(iii)一包含SEQ ID NO：2氨基酸序列之重鏈可變區(qū)(HCVR)，及一包含SEQ ID NO：18氨基酸序列之輕鏈可變區(qū)(LCVR)。

藉由使用本項(xiàng)技術(shù)中已知的習(xí)用方法，可容易地測(cè)定特定的抗原結(jié)合分子(例如抗體)或其抗原結(jié)合區(qū)是否與本發(fā)明之參照抗原結(jié)合分子相同的表位結(jié)合或是與其競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。例如，測(cè)定試驗(yàn)抗體是否與如同本發(fā)明參照的雙特異性抗原結(jié)合分子之CD3(或CD20)上的相同表位結(jié)合，首先系讓參照的雙特異性分子與CD3蛋白(或CD20蛋白)結(jié)合。接著，評(píng)估試驗(yàn)抗體與CD3(或CD20)分子結(jié)合之能力。若試驗(yàn)抗體在與參照的雙特異性抗原結(jié)合分子飽和結(jié)合后，能與CD3(或CD20)結(jié)合，則其可結(jié)論出，該試驗(yàn)抗體系與不同于參照的雙特異性抗原結(jié)合分子的CD3(或CD20)表位結(jié)合。另一方面，若試驗(yàn)抗體在與參照的雙特異性抗原結(jié)合分子飽和結(jié)合后，不能與CD3(或CD20)分子結(jié)合，則試驗(yàn)抗體可能與和本發(fā)明之參照的雙特異性抗原結(jié)合分子結(jié)合的表位相同之CD3(或CD20)表位結(jié)合。然后可進(jìn)行另外例行的實(shí)驗(yàn)(例如勝肽突變和結(jié)合分析)，以確定所觀察到無試驗(yàn)抗體結(jié)合事實(shí)上是否系由于與和參照的雙特異性抗原結(jié)合分子相同的表位結(jié)合所致，或是否系因立體阻斷(或另外的現(xiàn)象)造成無觀察到結(jié)合。此類實(shí)驗(yàn)可使用ELISA、RIA、Biacore、流式細(xì)胞儀或本項(xiàng)技術(shù)中可取得的任何其他量性或質(zhì)性抗體-結(jié)合分析來進(jìn)行。依照本發(fā)明特定的實(shí)施例，如于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析中所測(cè)，若例如一1-、5-、10-、20-或100-倍過量的抗原結(jié)合蛋白抑制另一抗體之結(jié)合至少50％，但較佳地75％、90％或甚至99％，則二種抗原結(jié)合蛋白系與相同(或重迭)的表位結(jié)合(參見，例如Junghans等人,Cancer Res.1990 50：1495-1502)。另外，若基本上降低或消除一抗原結(jié)合蛋白之結(jié)合的抗原中所有的氨基酸突變，系降低或消除另一種抗原結(jié)合蛋白之結(jié)合，則二種抗原結(jié)合蛋白被認(rèn)為系與相同的表位結(jié)合。若僅一亞群的氨基酸突變降低或消除一抗原結(jié)合蛋白之結(jié)合或消除另一種抗原結(jié)合蛋白之結(jié)合，則二種抗原結(jié)合蛋白被認(rèn)為具有「重迭的表位」。

為了測(cè)定一抗體或其抗原結(jié)合區(qū)是否與參照的抗原結(jié)合分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，系以二個(gè)方向進(jìn)行上述結(jié)合方法：第一個(gè)方向：讓參照的抗原結(jié)合分子在飽和的條件下與CD3蛋白(或CD20蛋白)結(jié)合，接著評(píng)估試驗(yàn)抗體與CD3(或CD20)分子之結(jié)合。第二個(gè)方向：讓試驗(yàn)抗體在飽和的條件下與CD3(或CD20)分子結(jié)合，接著評(píng)估參照的抗原結(jié)合分子與CD3(或CD20)分子之結(jié)合。若在二個(gè)方向中，僅有第一(飽和)抗原結(jié)合分子能與CD3(或CD20)分子結(jié)合，則結(jié)論出試驗(yàn)抗體和參照的抗原結(jié)合分子系競(jìng)爭(zhēng)與CD3(或CD20)結(jié)合。本項(xiàng)技術(shù)之一般技術(shù)者應(yīng)了解，與參照的抗原結(jié)合分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合之抗體可能不一定系與參照抗體相同之表位結(jié)合，但可能藉由與重迭或相鄰的表位結(jié)合，在立體上阻斷參照抗體之結(jié)合。

制備抗原結(jié)合區(qū)及建構(gòu)雙特異性分子

對(duì)特定抗原具特異性之抗原結(jié)合區(qū)可藉由任何本項(xiàng)技術(shù)中已知的抗體生產(chǎn)技術(shù)來制備。一旦獲得后，對(duì)二種不同抗原(例如CD3和CD20)具特異性之二種不同的抗原結(jié)合區(qū)可以相對(duì)彼此適合的排列使用習(xí)用方法，產(chǎn)生本發(fā)明之雙特異性抗原結(jié)合分子。(可用于建構(gòu)本發(fā)明雙特異性抗原結(jié)合分子之例示的雙特異性抗體模式之論述系提供于文中他處)。在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明之多特異性抗原結(jié)合分子的一或多個(gè)個(gè)別組份(例如重鏈和輕鏈)系衍生自嵌合、人源化或全人類抗體。制造此等抗體之方法已為本項(xiàng)技術(shù)所熟知。例如，可使用VELOCIMMUNE^TM技術(shù)制備一或多條本發(fā)明雙特異性抗原結(jié)合分子之重鏈及/或輕鏈。使用VELOCIMMUNE^TM技術(shù)(或任何其他人類抗體生產(chǎn)技術(shù))，起初先分離對(duì)特定抗原(例如CD3或CD20)具高親和力之具有人類可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的嵌合抗體。將抗體定性并就所欲的性質(zhì)來選擇，包括親和力、選擇性、表位等。以所欲的人類恒定區(qū)置換小鼠恒定區(qū)產(chǎn)生本發(fā)明全人類抗體，及/或輕鏈其可并入本發(fā)明之雙特異性抗原結(jié)合分子中。

基因工程動(dòng)物可用于制造人類雙特異性抗原結(jié)合分子。例如，可使用不能重排和表現(xiàn)內(nèi)生性小鼠免疫球蛋白輕鏈可變序列之基因改造小鼠，其中小鼠僅表現(xiàn)一或二個(gè)由人類免疫球蛋白序列操作上在內(nèi)生性小鼠κ基因座連接小鼠κ輕鏈恒定基因所編碼的人類輕鏈可變區(qū)。此基因改造小鼠可用于制造包括鏈接相同輕鏈之二種不同重鏈的全人類雙特異性抗原結(jié)合分子，該輕鏈系包括衍生自二種不同人類輕鏈可變區(qū)基因片段其中一種之可變區(qū)。(參見，例如US 2011/0195454就此工程化小鼠詳細(xì)論述及將其用于制造雙特異性抗原結(jié)合分子)。

生物等效性

本發(fā)明系涵蓋具有與文中所揭示的例示分子不同但保留與CD3及/或CD20結(jié)合能力之氨基酸序列的抗原結(jié)合分子。此等變體分子，當(dāng)與親代序列相比較時(shí)，可包括一或多個(gè)氨基酸之添加、刪除或取代，但具有與所述的雙特異性抗原結(jié)合分子實(shí)質(zhì)上相當(dāng)之生物活性。

本發(fā)明系包括與文中所述的任何例示性抗原結(jié)合分子為生物等效之抗原結(jié)合分子。二種抗原結(jié)合蛋白或抗體，若例如其為醫(yī)藥同等物或醫(yī)藥替代品，當(dāng)于類似的實(shí)驗(yàn)條件下以單一劑量或多劑量之相同的莫耳劑量投予時(shí)，其吸收速率和程度并無顯示顯著的差異，則系視為生物等效的。某些抗原結(jié)合蛋白若其吸收程度相當(dāng)?shù)俏账俾什煌瑧?yīng)可視為等效物或醫(yī)藥替代品，且仍可視為生物等效，因?yàn)榇说任账俾噬系牟町悶楣室獾牟⒎从吃跇?biāo)示上，對(duì)于達(dá)到例如長期使用之有效體藥濃度并非必要的，且就特定藥物產(chǎn)品的研究上被視為無醫(yī)療上的顯著性。

在一實(shí)施例中，二種抗原結(jié)合蛋白若在其安全性、純度及效力上不具有臨床上有意義的差異，則為生物等效的。

在一實(shí)施例中，若相較于無此變更之持續(xù)治療，病患可在參照產(chǎn)品和生物產(chǎn)品間作一或多次變更而無預(yù)期的有害效應(yīng)之風(fēng)險(xiǎn)增加(包括臨床上致免疫性之明顯改變或效用減低)，則二種抗原結(jié)合蛋白為生物等效的。

在一實(shí)施例中，若二種抗原結(jié)合蛋白系藉由共同的機(jī)制或作用機(jī)制作用于癥狀或所用癥狀，而達(dá)到此等機(jī)制已知的程度，則二者系為生物等效的。

生物等效性可藉由活體內(nèi)和活體外方法來驗(yàn)證。生物等效性測(cè)量包括，例如(a)人類或其他哺乳動(dòng)物之活體內(nèi)試驗(yàn)，其中系測(cè)量血液、血漿、血清或其他生物體液中隨時(shí)間變化之抗體或其代謝物濃度；(b)與人類活體內(nèi)生物可利用性數(shù)據(jù)有相互關(guān)系及可合理預(yù)測(cè)此數(shù)據(jù)之活體外試驗(yàn)；(c)人類或其他哺乳動(dòng)物之活體內(nèi)試驗(yàn)，其中系測(cè)量隨時(shí)間變化之抗體(或其目標(biāo))的適當(dāng)急性藥理效用；及(d)已建立抗原結(jié)合蛋白之安全性、效力或生物可利用性或生物等效性之良好對(duì)照的臨床試驗(yàn)。

文中所述之例示性雙特異性抗原結(jié)合分子的生物等效變體可藉由，例如制造各種殘基或序列之取代，或刪除生物活性不需要的末端或內(nèi)部殘基或序列來建構(gòu)。例如，生物活性不需要的半胱胺酸殘基可刪除或以其他的氨基酸置換，以防止因變性而形成不必要或不正確的分子內(nèi)雙硫橋。在其他內(nèi)容中，生物等效的抗原結(jié)合蛋白可包括文中所述之例示性雙特異性抗原結(jié)合分子的變體，其系包含修飾分子之糖基化特性的氨基酸改變，例如消除或移除糖基化之突變。

物種選擇性和物種交叉反應(yīng)

根據(jù)本發(fā)明特定的實(shí)施例，系提供與人類CD3結(jié)合但不與其他物種CD3結(jié)合之抗原結(jié)合分子。亦提供與人類CD20結(jié)合但不與其他物種CD20結(jié)合之抗原結(jié)合分子。本發(fā)明亦包括與人類CD3及來自一或多種非人類物種之CD3結(jié)合的抗原結(jié)合分子；及/或與人類CD20及來自一或多種非人類物種之CD20結(jié)合的抗原結(jié)合分子。

根據(jù)本發(fā)明特定的例示性實(shí)施例，系提供與人類CD3及/或人類CD20結(jié)合，以及可或不可與(視情況而定)一或多種小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、獼猴、絨猴、恒河猴或黑猩猩CD3及/或CD20結(jié)合之抗原結(jié)合分子。例如，在本發(fā)明特定的例示性實(shí)施例中，系提供包括與人類CD3和獼猴CD3結(jié)合之第一抗原結(jié)合區(qū)及專一與人類CD20結(jié)合之第二抗原結(jié)合區(qū)的雙特異性抗原結(jié)合分子。

免疫接合物

本發(fā)明涵蓋與療效成份，例如細(xì)胞毒素、化療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素接合之抗原結(jié)合分子(免疫接合物)。細(xì)胞毒性劑包括任何對(duì)細(xì)胞有害之試劑。用于形成免疫接合物之適合的細(xì)胞毒性劑及化療劑實(shí)例已為本項(xiàng)技術(shù)所知(參見，例如WO 05/103081)。

治療調(diào)配物及給藥

如文中所用，術(shù)語「有效量」和「治療上有效量」系指活性治療劑之量，在無過份的有害副作用，例如毒性、刺激性或過敏反應(yīng)下，足以產(chǎn)生所欲的治療反應(yīng)。特定的「有效量」明顯地將依此等因子，例如所欲治療之特定癥狀、病患的生理狀況和所欲治療的動(dòng)物種類、治療持續(xù)時(shí)間、同時(shí)治療(若有)之性質(zhì)和所用的特定調(diào)配物以及化合物結(jié)構(gòu)或其衍生物而不同。在此情況下，若其造成下列一或多項(xiàng)(但不限)，則此量應(yīng)視為治療上有效的：(a)抑制腫瘤生長(例如，B-細(xì)胞癌癥)；及(b)反轉(zhuǎn)或安定B-細(xì)胞癌癥。

投予病患之抗原結(jié)合分子的劑量可依照病患的年齡和體型大小、標(biāo)的疾病、癥狀、給藥路徑及其類似因素而不同。較佳的劑量典型地系根據(jù)體重或體表面積來計(jì)算。當(dāng)本發(fā)明之雙特異性抗原結(jié)合分子系用于成人病患之治療目的時(shí)，有利的一般可以靜脈給予約0.01至約20毫克/kg體重，更佳地約0.02至約7，約0.03至約5，或約0.05至約3毫克/kg體重之單一劑量的本發(fā)明雙特異性抗原結(jié)合分子。依照癥狀之嚴(yán)重度，治療之頻率和治療持續(xù)時(shí)間可調(diào)整。給予雙特異性抗原結(jié)合分子之有效劑量和時(shí)程可依經(jīng)驗(yàn)來決定；例如可以定期評(píng)估來監(jiān)看病患進(jìn)步，并據(jù)此調(diào)整劑量。再者，物種間劑量之衡量可使用本項(xiàng)技術(shù)熟知的方法來進(jìn)行(例如Mordenti等人,1991,Pharmaceut.Res.8：1351)。

各種的遞送系統(tǒng)已為所知并可用于投予本發(fā)明之醫(yī)藥組成物，例如包膠之微脂體、微粒、微膠囊、能表現(xiàn)突變病毒之重組細(xì)胞、受體媒介的內(nèi)吞作用(參見，例如Wu等人(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。導(dǎo)入方法包括(但不限于)皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服路徑。組成物可以任何方便的路徑，例如以輸注或團(tuán)注、以經(jīng)由上皮或黏膜層(例如口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收來給藥，并可與其他生物活性劑共同給藥。給藥可為全身性或局部的。.

本發(fā)明之醫(yī)藥組成物可以標(biāo)準(zhǔn)針或注射器由皮下或靜脈內(nèi)來遞送。此外，就皮下遞送而言，筆型遞送裝置可容易地用于遞送本發(fā)明之醫(yī)藥組成物。此筆型遞送裝置可為重復(fù)使用型或拋棄型?？芍貜?fù)使用的筆型遞送裝置一般系利用含有醫(yī)藥組成物之可更換補(bǔ)充匣。一旦匣內(nèi)的所有醫(yī)藥組成物投予后而補(bǔ)充匣變空，此空匣可容易丟棄并更換新的含醫(yī)藥組成物之補(bǔ)充匣。然后此筆型遞送裝置便可再使用。在拋棄型筆型遞送裝置中無可置換的補(bǔ)充匣。取而代之的，拋棄型筆型遞送裝置系預(yù)先填充醫(yī)藥組成物收藏在裝置內(nèi)的儲(chǔ)槽中。一但醫(yī)藥組成物的儲(chǔ)槽變空，整個(gè)裝置便可丟棄。

許多可重復(fù)使用的筆型和自動(dòng)注射器遞送裝置已應(yīng)用于皮下遞送本發(fā)明之醫(yī)藥組成物。實(shí)例包括(但不限于)AUTOPEN^TM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONIC^TM筆(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25^TM筆、HUMALOG^TM筆、HUMALIN 70/30^TM筆(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPEN^TMI,II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIOR^TM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BD^TM筆(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPEN^TM、OPTIPEN PRO^TM、OPTIPEN STARLET^TM和OPTICLIK^TM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，僅提出一些。用于皮下遞送本發(fā)明醫(yī)藥組成物之拋棄型筆型遞送裝置之實(shí)例包括(但不限于)SOLOSTAR^TM筆(sanofi-aventis)、FLEXPEN^TM(Novo Nordisk)及KWIKPEN^TM(Eli Lilly)、SURECLICK^TM自動(dòng)注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLET^TM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)及HUMIRA^TM筆(Abbott Labs,Abbott Park IL)，僅提出一些。

在特定的情況下，醫(yī)藥組成物可以控制釋放系統(tǒng)來遞送。在一實(shí)施例中，可使用幫浦(參見Langer,前文；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另外的實(shí)施例中，可使用聚合物質(zhì)；參見Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。又在另外的實(shí)施例中，控制釋放系統(tǒng)可放置在靠近組成物的目標(biāo)處，因此僅需要全身劑量之一部分(參見，例如Goodson,1984,in Medical Applications of Controlled Release,前文,第2冊(cè),pp.115-138)。其他的控制釋放系統(tǒng)系論述于Langer,1990,Science 249：1527-1533之評(píng)論中。

可注射的制備物可包括用于靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)及肌肉內(nèi)注射、點(diǎn)滴輸注等之劑型。這些可注射制備物可由公開已知的方法來制備。例如，可注射制備物可，例如藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化于注射上習(xí)用的無菌水性媒劑或油性媒劑中來制備。注射用之水性媒劑有，例如生理食鹽水、含葡萄糖之等張溶液和其他佐劑等，其可與適合的增溶劑例如醇(例如乙醇)、多醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子接口活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油之聚環(huán)氧乙烷(50莫耳)加合物)]等組合使用。油性媒劑，可使用芝麻油、大豆油等，其可與增溶劑例如苯甲酸苯甲基酯、苯甲醇等組合使用。由此所制備的注射液較佳地系填充于適當(dāng)?shù)陌财恐小?/p>

有利地，上述之口服或非經(jīng)腸用途之醫(yī)藥組成物系制備成適合活性成份劑量之單位劑型。此等單位劑量之劑型包括，例如錠劑、片劑、膠囊、注射劑(安瓶)、栓劑等。所含的前述抗體之量一般每單位劑量之劑型為約5至約500毫克；特別是注射形式，較佳的前述抗體系含有約5至約100毫而其他劑型為約10至約250毫克。

抗原結(jié)合分子之治療用途

本發(fā)明系包括：包含于一有此需要之患者中投予包括專一與CD3和目標(biāo)抗原(例如CD20)結(jié)合之抗-CD3抗體或雙特異性抗原結(jié)合分子的治療組成物之方法。此治療組成物可包括任何文中所揭示之抗體或雙特異性抗原結(jié)合分子以及醫(yī)藥上可接受之載劑或稀釋劑。如文中所用，「有此需要之患者」一詞系指具有一或多種癌癥之癥候或適應(yīng)癥之人類或非人類動(dòng)物(例如表現(xiàn)腫瘤或患有任何下文所指的癌癥之患者)，或另外可從抑制或降低CD20活性或去除CD20+B細(xì)胞或消退CD20+B細(xì)胞腫瘤而得利者。

本發(fā)明之抗體及雙特異性抗原結(jié)合分子(及包括彼等之治療組成物)可用于，其中包括，治療其中刺激、活化及/或以免疫反應(yīng)為目標(biāo)應(yīng)為有利的疾病或病癥。特言之，本發(fā)明之抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子可用于治療、預(yù)防及/或改善任何與CD20表現(xiàn)或活性或CD20+B細(xì)胞增生有關(guān)或由其所媒介之疾病或病癥。達(dá)成本發(fā)明治療方法之作用機(jī)制系包括在效應(yīng)子細(xì)胞的存在下殺死表現(xiàn)CD20之細(xì)胞，例如，藉由細(xì)胞凋亡、吞噬作用或藉由二或多種這些機(jī)制的組合或類似的細(xì)胞毒性機(jī)制。可使用本發(fā)明之雙特異性抗原結(jié)合分子抑制或殺死之CD20表現(xiàn)細(xì)胞包括，例如致腫瘤B細(xì)胞。

降低腫瘤負(fù)荷或腫瘤消退包括在患者中一或多個(gè)腫瘤之部分或完全消失。請(qǐng)了解，腫瘤消退代表趨向較低的腫瘤負(fù)荷或較低的疾病嚴(yán)重狀態(tài)之傾向。如此一來，消退為逐漸減弱性消除體內(nèi)可測(cè)量的惡性腫瘤。降低腫瘤發(fā)展包括部分或完全抑制或壓抑另外或新的腫瘤生長。

本發(fā)明之抗原結(jié)合分子可用于瞄準(zhǔn)及治療，例如發(fā)生于腦及腦膜、口咽、肺及支氣管樹、胃腸道、男性和女性生殖道、肌肉、骨骼、皮膚和附屬件、結(jié)締組織、脾、免疫系統(tǒng)、造血細(xì)胞和骨髓、肝及泌尿道和特定的感官器官例如眼睛之原生及/或轉(zhuǎn)移腫瘤。在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明之雙特異性抗原結(jié)合分子可用于治療一或多種下列癌癥：腎細(xì)胞癌、胰臟癌、乳癌、頭和頸癌、前列腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌(例如帶有MET增幅之胃癌)、惡性間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、滑液肉瘤、甲狀腺癌或黑色素瘤。根據(jù)特定的例示性實(shí)施例，本發(fā)明之雙特異性抗原結(jié)合分子可用于治療B細(xì)胞癌(例如何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤[NHL]、前軀B細(xì)胞淋巴母細(xì)胞白血病/淋巴瘤、成熟B細(xì)胞腫瘤、B細(xì)胞慢性淋巴性白血病/小淋巴性淋巴瘤、B細(xì)胞前淋巴性白血病、淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤、被套細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、皮膚濾泡中心淋巴瘤、外圍區(qū)域B細(xì)胞淋巴瘤、毛狀細(xì)胞白血病、彌漫性大型B細(xì)胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、漿細(xì)胞瘤、漿細(xì)胞骨髓瘤、移植后淋巴增生病癥、華氏(Waldenstrom′s)巨球蛋白血癥及間變性大細(xì)胞淋巴瘤)。

本發(fā)明之抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子系以足以在患者中降低腫瘤負(fù)荷，產(chǎn)生腫瘤消退、抑制腫瘤生長或降低腫瘤發(fā)展之量來給藥。在本發(fā)明某些例示的實(shí)施例中，投予的量系介于約0.001mg/kg至約1mg/kg之間。在其他的實(shí)施例中，投予的量為約0.4mg/kg。在其他的實(shí)施例中，投予的量為約0.04mg/kg。又在其他的實(shí)施例中，投予的量為約0.004mg/kg。

根據(jù)本發(fā)明特定的實(shí)施例，此抗原結(jié)合分子可用于治療患有B-細(xì)胞淋巴瘤(例如NHL)，對(duì)單獨(dú)的抗-CD20治療具阻抗性或不完全反應(yīng)(例如，對(duì)利妥昔單抗具抗性)之病患。根據(jù)本發(fā)明之其他相關(guān)的實(shí)施例，系提供包括將如文中所述的抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子投予患有以抗-CD20治療難以治療之B-細(xì)胞淋巴瘤(例如NHL)的病患(例如，患有利妥昔單抗難以治療之腫瘤或復(fù)發(fā)性或難治的B-細(xì)胞淋巴瘤之病患)之方法。本項(xiàng)技術(shù)中已知的分析/診斷方法，例如腫瘤掃描等，可用于確認(rèn)病患是否隱藏有對(duì)單獨(dú)的抗-CD20治療具阻抗性或不完全反應(yīng)或難以治療之腫瘤。

本發(fā)明亦包括于一患者中治療殘余癌之方法。如文中所用，術(shù)語「殘余癌」系指以抗癌療法治療后，在一患者中存在或持續(xù)留有一或多個(gè)癌細(xì)胞。

根據(jù)特定方面，本發(fā)明系提供治療與CD20表現(xiàn)有關(guān)的疾病或病癥(例如B細(xì)胞淋巴瘤)之方法，其包括在一患者已接受抗-CD20單一治療后，將一或多種文中他處所述的雙特異性抗原結(jié)合分子投予該患者(例如，在投予包括抗-CD20抗體如利妥昔單抗之醫(yī)藥組成物之后)。例如，本發(fā)明系包括治療B細(xì)胞淋巴瘤之方法，其包括在一病患已接受抗-CD20單一治療(例如，利妥昔單抗治療或其同等性治療)后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周、2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月、8個(gè)月、1年或更久，將抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子投予該患者。

組合治療及調(diào)配物

本發(fā)明系提供包括將包含文中所述之任何例示性抗體和雙特異性抗原結(jié)合分子之醫(yī)藥組成物與一或多種另外的治療劑組合給藥之方法?？膳c本發(fā)明之抗原結(jié)合分子組合或組合給藥之例示性另外的治療劑包括，例如EGFR拮抗劑(例如抗-EGFR抗體[例如，西妥昔單抗(cetuximab)或帕尼單抗(panitumumab)]或EGFR之小分子抑制劑[例如，吉非替尼(gefitinib)或厄洛替尼(erlotinib)])，另外的EGFR家族成員之拮抗劑，例如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4(例如抗-ErbB2、抗-ErbB3或抗-ErbB4抗體或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性之小分子抑制劑)，EGFRvIII之拮抗劑(例如專一與EGFRvIII結(jié)合之抗體)，cMET拮抗劑(例如抗-cMET抗體)，IGF1R拮抗劑(例如抗-IGF1R抗體)，B-raf抑制劑(例如威羅菲尼(vemurafenib)、索拉非尼(sorafenib)、GDC-0879、PLX-4720)，PDGFR-α抑制劑(例如抗-PDGFR-α抗體)，PDGFR-β抑制劑(例如抗-PDGFR-β抗體)，VEGF拮抗劑(例如VEGF-Trap，參見例如US 7,087,411(文中亦稱為「VEGF-抑制融合蛋白」)、抗-VEGF抗體(例如貝伐單抗(bevacizumab))、VEGF受體之小分子激酶抑制劑(例如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib))、DLL4拮抗劑(例如揭示于US 2009/0142354中之抗-DLL4抗體)、Ang2拮抗劑(例如揭示于US 2011/0027286中之抗-Ang2抗體，例如H1H685P)、FOLH1拮抗劑(例如抗-FOLH1抗體)、PRLR拮抗劑(例如抗-PRLR抗體)、STEAP1或STEAP2拮抗劑(例如抗-STEAP1抗體或抗-STEAP2抗體)、TMPRSS2拮抗劑(例如抗-TMPRSS2抗體)、MSLN拮抗劑(例如抗-MSLN抗體)、CA9拮抗劑(例如抗-CA9抗體)、尿溶蛋白(uroplakin)拮抗劑(例如抗-尿溶蛋白抗體)、抗-CTLA4抗體(例如，伊匹單抗(ipilimumab)(MDX-010))、單價(jià)CD20拮抗劑(例如單價(jià)抗-CD20抗體，如利妥昔單抗)等。

可有利地與本發(fā)明之抗原結(jié)合分子組合之其他試劑包括免疫活化劑或抑制劑。特定的免疫活化劑或抑制劑為細(xì)胞激素活化劑或抑制劑，包括小分子化合物以及與細(xì)胞激素，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18或其個(gè)別受體結(jié)合之抗體。本發(fā)明之醫(yī)藥組成物(例如包括如文中所揭示的抗-CD3/抗-CD20雙特異性抗原結(jié)合分子之醫(yī)藥組成物)亦可作為包括一或多個(gè)治療組合之療法的部份來給藥，而該治療組合系選自「ICE」：異磷酰胺(ifosfamide)(例如，)、卡鉑(carboplatin)(例如，)、依托泊苷(etoposide)(例如，VP-16)；「DHAP」：地塞米松(dexamethasone)(例如，)、阿糖胞苷(cytarabine)(例如，阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、ara-C)、順鉑(cisplatin)(例如，)；及「ESHAP」：依托泊苷(例如，VP-16)、甲潑尼龍(methylprednisolone)(例如，)、高劑量阿糖胞苷、順鉑(例如，)。

本發(fā)明亦包括包含文中所提及之任何抗原結(jié)合分子與一或多種下列抑制劑之治療組合：VEGF、Ang2、DLL4、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFRvIII、cMet、IGF1R、B-raf、PDGFR-α、PDGFR-β、FOLH1、PRLR、STEAP1、STEAP2、TMPRSS2、MSLN、CA9、uroplakin或任何前述的細(xì)胞激素，其中該抑制劑為一適配體、反義分子、核糖酵素、siRNA、肽體、奈米抗體或抗體片段(例如Fab片段；F(ab')₂片段；Fd片段；Fv片段；scFv；dAb片段；或其他工程化分子，例如二抗體、三抗體、四抗體、微小抗體和最小識(shí)別單元)。本發(fā)明之抗原結(jié)合分子亦可與抗病毒劑、抗生素、鎮(zhèn)痛劑、皮質(zhì)類固醇及/或NSAID組合給藥及/或共調(diào)配。本發(fā)明之抗原結(jié)合分子亦可作為同時(shí)包括放射線治療及/或習(xí)用化療之治療療法的部分來給藥。

另外的治療活性組份可在投予本發(fā)明抗原結(jié)合分子之前、同時(shí)或之后不久給藥(就本揭示文之目的，此等給藥療法系被視為本發(fā)明之抗原結(jié)合分子與另外的治療活性組份「組合」給藥)。

本發(fā)明系包括其中本發(fā)明之抗原結(jié)合分子系與一或多種如文中他處所述之另外的治療活性組份共調(diào)配之醫(yī)藥組成物。

給藥療法

根據(jù)本發(fā)明特定的實(shí)施例，可于一定義的時(shí)程將多劑量的抗原結(jié)合分子(例如抗-CD3抗體或?qū)Ｒ慌cCD20和CD3結(jié)合之雙特異性抗原結(jié)合分子)投予一患者。根據(jù)本發(fā)明此方面之方法系包括先后將多劑量之本發(fā)明抗原結(jié)合分子投予一患者。如文中所用，「先后給藥」系指各劑量之抗原結(jié)合分子系于不同的時(shí)間點(diǎn)投予該患者，例如以預(yù)計(jì)的間隔隔開之不同日(例如小時(shí)、日、周或月)。本發(fā)明系包括，包含將一單一起始劑量之抗原結(jié)合分子先后投予病患，接著一或多個(gè)第二劑量之抗原結(jié)合分子及視需要接著一或多個(gè)第三劑量之抗原結(jié)合分子之方法。

術(shù)語「起始劑量」、「第二劑量」和「第三劑量」系指投予本發(fā)明抗原結(jié)合分子之暫時(shí)順序。因此，「起始劑量」為治療療法開始時(shí)所投予之劑量(亦稱為「基線」劑量)；「第二劑量」為在起始劑量之后所投予之劑量；而「第三劑量」為在第二劑量之后所投予之劑量。起始、第二和第三劑量皆可含有相同量之抗原結(jié)合分子，但就給藥的頻率而言，一般可彼此不同。在特定的實(shí)施例中，然而，包含在起始、第二及/或第三劑量中之抗原結(jié)合分子之量，在治療期間可互不相同(例如，若適當(dāng)，經(jīng)上調(diào)或下調(diào))。在特定的實(shí)施例中，系在治療療法開始時(shí)投予二或多個(gè)(例如2、3、4或5個(gè))劑量作為「承載劑量」，接著以較低頻率為基礎(chǔ)，投予后續(xù)劑量(例如「維持劑量」)。

在本發(fā)明一例示性的實(shí)施例中，各第二及/或第三劑量系緊接前面劑量之后的1至26周(例如1、1¹/₂、2、2¹/₂、3、3¹/₂、4、4¹/₂、5、5¹/₂、6、6¹/₂、7、7₁/²、8、8¹/₂、9、9¹/₂、10、10¹/₂、11、11¹/₂、12、12¹/₂、13、13¹/₂、14、14¹/₂、15、15¹/₂、16、16¹/₂、17、17¹/₂、18、18¹/₂、19、19¹/₂、20、20¹/₂、21、21¹/₂、22、22¹/₂、23、23¹/₂、24、24¹/₂、25、25¹/₂、26、26¹/₂或更久)給藥?！妇o接前面劑量」一詞，如文中所用，系指在一多重給藥之順序中，抗原結(jié)合分子之劑量，在每個(gè)相鄰接的劑量給藥之前系以無插入劑量之順序給藥。

根據(jù)本發(fā)明此方面之方法可包括將任何數(shù)目之第二及/或第三劑量之抗原結(jié)合分子(例如抗-CD3抗體或?qū)Ｒ慌cCD20和CD3結(jié)合之雙特異性抗原結(jié)合分子)，投予一病患。例如，在特定的實(shí)施例中，僅將一單一第二劑量投予該病患。在其他實(shí)施例中，系將二或多個(gè)(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第二劑量投予該病患。同樣地，在特定的實(shí)施例中，僅將一單一第三劑量投予該病患。在其他實(shí)施例中，系將二或多個(gè)(例如2、3、4、5、6、7、8或更多)第三劑量投予該病患。

在涉及多重第二劑量之實(shí)施例中，各第二劑量可與其他第二劑量相同的頻率來給藥。例如，各第二劑量可在緊接前面劑量后1至2周，投予該病患。同樣地，在涉及多重第三劑量之實(shí)施例中，各第三劑量可與其他第三劑量相同的頻率來給藥。例如，各第三劑量可在緊接前面劑量后2至4周，投予該病患。另外，投予病患之第二及/或第三劑量的頻率，在治療療法期間可不同。在治療期間，給藥頻率亦可依照個(gè)別病患之需求在臨床檢查后由醫(yī)師做調(diào)整。

抗體之診斷用途

本發(fā)明之抗-CD3xCD20抗體亦可用于偵測(cè)及/或測(cè)量樣本中之CD3或CD3-表現(xiàn)細(xì)胞，例如供作診斷目的。例如抗-CD3xCD20抗體或其片段可用于診斷特征為CD3異常表現(xiàn)(例如過度表現(xiàn)，表現(xiàn)不足，無表現(xiàn)等)之癥狀或疾病。CD3之例示性診斷分析可包括，例如將得自病患的樣本與本發(fā)明之抗-CD3xCD20抗體接觸，其中該抗體系以可偵測(cè)的標(biāo)記或受體分子標(biāo)定。另外，未標(biāo)定的抗-CD3xCD20抗體可與本身經(jīng)可偵測(cè)標(biāo)記標(biāo)定之第二抗體組合用于診斷用途?？蓚蓽y(cè)標(biāo)記或報(bào)導(dǎo)子分子可為放射性同位素，例如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I；熒光或化學(xué)熒光基團(tuán)，例如熒光素異硫氰酸酯或羅丹明(rhodamine)；或酵素例如堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶、辣根過氧化酶或熒光素酶(luciferase)?？捎糜趥蓽y(cè)或測(cè)量樣本之CD3的特定例示分析包括酵素連結(jié)免疫吸附法(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)及熒光活化細(xì)胞分類(FACS)。

本發(fā)明之抗-CD3xCD20抗體可用于偵測(cè)及/或測(cè)量樣本中之CD20或CD20-表現(xiàn)細(xì)胞，或診斷特征為CD20異常表現(xiàn)(例如，過度表現(xiàn)、低度表現(xiàn)或缺乏表現(xiàn)等)之癥狀或疾病，以此類推。

根據(jù)本發(fā)明可用于CD3或CD20診斷分析之樣本系包括含有可偵測(cè)量之CD3及/或CD20蛋白或其片段，其系在正常或病理?xiàng)l件下由病患所得來之任何組織或液體樣本。一般而言，起初系測(cè)量得自健康病患(例如未患有與異常CD3或CD20量或活性有關(guān)的疾病或癥狀之病患)之特定樣本中CD3或CD20的量，建立一基線或標(biāo)準(zhǔn)的CD3或CD20量。然后可將此CD3或CD20之基線量分別與得自疑似患有CD3-或CD20-相關(guān)疾病或癥狀之個(gè)體的樣本中所測(cè)量之CD3或CD20量作比較。

實(shí)例

提出下列實(shí)例以提供本項(xiàng)技術(shù)之一般技術(shù)者如何制造及使用本發(fā)明方法和組合物之完整揭示和說明，但不希望限制發(fā)明者所認(rèn)為之發(fā)明范圍。雖已盡力確保所用的相關(guān)數(shù)字(例如量、溫度等)之正確性，但仍應(yīng)考慮某些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另有指出，否則份數(shù)系為重量之份數(shù)，分子量為平均分子量，溫度系以攝氏度數(shù)表示，而壓力系為或接近大氣壓。

實(shí)例1.產(chǎn)生抗-CD3和抗-CD20抗體

已知有數(shù)種分離抗-CD3或抗-CD20抗體之方法。用于下列實(shí)例之全人類抗-CD3抗體，系如US 2007/0280945A1中所述，直接由未與骨髓瘤細(xì)胞融合之抗原-陽性的B細(xì)胞分離。

另外的抗-CD3抗體之實(shí)例可用于此方法中，且此等抗體之說明和此等抗-CD3抗體之生物特性系描述于2013年9月19日申請(qǐng)的PCT國際申請(qǐng)案號(hào)PCT/US13/60511中，其系以全文引用的方式并入本文中。例示的抗-CD20抗體和此等抗-CD20抗體之生物性質(zhì)系描述于US 7,879,984和2013年9月19日申請(qǐng)的PCT國際申請(qǐng)案號(hào)PCT/US13/60511中，其各自系以引用的方式并入本文中。

抗-CD20抗體及制造用于建構(gòu)本實(shí)例之雙特異性抗體的方法系描述于US 7,879,984中。

用于建構(gòu)雙特異性抗體之抗-CD3抗原結(jié)合臂和抗-CD20結(jié)合臂的重鏈和輕鏈可變區(qū)及CDR之氨基酸序列標(biāo)識(shí)符系列于表1中。對(duì)應(yīng)的核酸序列標(biāo)識(shí)符系列于表2中。

表1：氨基酸序列標(biāo)識(shí)符(SEQ ID NO)

表2：核酸序列標(biāo)識(shí)符(SEQ ID NO)

實(shí)例2.產(chǎn)生結(jié)合CD3和CD20的雙特異性抗體

以上述序列使用標(biāo)準(zhǔn)方法建構(gòu)包括抗-CD3-專一結(jié)合區(qū)和抗-CD20-專一結(jié)合區(qū)之雙特異性抗體，其中系將來自抗-CD3抗體之重鏈和同源輕鏈與來自抗-CD20抗體的重鏈組合。

就此，依照本實(shí)例所制造的雙特異性抗體系包括二個(gè)個(gè)別的抗原結(jié)合區(qū)(亦即結(jié)合臂)。第一抗原結(jié)合區(qū)系包括衍生自抗-CD20抗體("CD20-VH")之重鏈可變區(qū)，與衍生自抗-CD3抗體的輕鏈可變區(qū)("CD3-VL")配對(duì)。CD20-VH/CD3-VL配對(duì)制造出一個(gè)專一辨識(shí)CD20之抗原結(jié)合區(qū)。第二抗原結(jié)合區(qū)系包括衍生自抗-CD3抗體(「CD3-VH」)之重鏈可變區(qū)，與衍生自抗-CD3抗體的輕鏈可變區(qū)(「CD3-VL」)配對(duì)。此CD3-VH/CD3-VL配對(duì)制造出一個(gè)專一辨識(shí)CD3之抗原結(jié)合區(qū)。在此實(shí)例中所制造的所有雙特異性抗體系使用相同的CD20-VH并命名為「CD20-VH-A」。

各重鏈之野生型重鏈恒定區(qū)(CH)系藉由重組技術(shù)以一嵌合的CH置換。一結(jié)合臂(例如抗-CD3結(jié)合臂)之CH系在CH的CH3區(qū)含有一突變，其促進(jìn)分離此雙特異性分子。

依照此實(shí)例所制造的各種雙特異性抗體的組份部分匯整系列于表3和表4中。

表3：氨基酸序列標(biāo)識(shí)符

表4：核酸序列標(biāo)識(shí)符

表5和6系列出帶有此實(shí)例雙特異性抗體之其對(duì)應(yīng)CDR的各種重鏈可變區(qū)(表5)和輕鏈可變區(qū)(表6)之氨基酸序列標(biāo)識(shí)符。

表5：重鏈氨基酸序列標(biāo)識(shí)符

表6：輕鏈氨基酸序列標(biāo)識(shí)符

另外，表7和8系列出編碼帶有此實(shí)例雙特異性抗體之其對(duì)應(yīng)CDR的各種重鏈可變區(qū)(表7)、重鏈恒定區(qū)和輕鏈可變區(qū)(表8)之核苷酸序列標(biāo)識(shí)符。

表7：重鏈核酸序列標(biāo)識(shí)符

表8：輕鏈核酸序列標(biāo)識(shí)符

除了上述的雙特異性抗體外，在下列實(shí)例中所列的特定實(shí)驗(yàn)亦使用下列對(duì)照抗體：

對(duì)照抗體1：如中所US 4,361,549述，抗人類T-細(xì)胞表面抗原之單株抗體「OKT-3」并可得自雜交瘤CRL-8001(American Type Culture Collection,Manassas,VA).

對(duì)照抗體2：抗體「SP34」反應(yīng)性抗人類T淋巴細(xì)胞上T3復(fù)合物之ε鏈，可得自BD Pharmagen，型號(hào)55052。

對(duì)照抗體3：抗-CD20治療抗體，如US 5,736,137中所揭示，具有(利妥昔單抗)之重鏈和輕鏈序列。

對(duì)照抗體4：亦稱為CD3xCD20抗體-野生型Fc(wtFc)，此抗體系類似上述方法所制造，具有一包括SEQ ID NO：2/18之HCVR/LCVR氨基酸序列對(duì)的抗-CD20臂(SEQ ID NO：4-6-8-20-22-24之HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列)，及野生型IgG1 CH區(qū)(SEQ ID NO：45)；及一包括SEQ ID NO：10/18之HCVR/LCVR氨基酸序列對(duì)的抗-CD3臂(SEQ ID NO：12-14-16-20-22-24之HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列)，及在CH3區(qū)帶有2個(gè)氨基酸修飾使其容易分離之野生型IgG1 CH區(qū)(SEQ ID NO：48)。CD3xCD20抗體-wtFc(抗體4)可指具有野生型IgG1 Fc區(qū)之相配的對(duì)照抗體(亦即與本發(fā)明CD3xCD20-嵌合Fc抗體之抗原結(jié)合區(qū)相配)，作為與具有不同F(xiàn)c區(qū)序列或結(jié)構(gòu)之抗體相比較抗體效應(yīng)子功能，或其他性質(zhì)之目的。

對(duì)照抗體5：抗-FelD1單株抗體系與貓抗原結(jié)合，對(duì)人類CD20或CD3無交叉反應(yīng)性。此IgG1非特異性抗體對(duì)照系藉由如2013年11月7日申請(qǐng)的PCT公開案號(hào)WO2013/166236所述之方法所得來。

對(duì)照抗體6：抗-FelD1抗原結(jié)合區(qū)，如PCT公開案號(hào)WO2013/166236中所述，如文中所述經(jīng)工程化以含有一嵌合的IgG4 Fc區(qū)，類似Ab 1。對(duì)照Ab 6對(duì)于人類CD20或CD3無交叉反應(yīng)性，但具有類似Ab 1的效應(yīng)子功能。

實(shí)例3.嵌合的重鏈結(jié)構(gòu)

產(chǎn)生嵌合重鏈，例如嵌合的CH IgG4(SEQ ID NO：26)和嵌合的CH IgG1(SEQ ID NO：30)，系使用標(biāo)準(zhǔn)的選殖技術(shù)來進(jìn)行。首先，經(jīng)由一2-步驟PCR增幅程序產(chǎn)生嵌合的IgG4 CH。使用含有野生型hIgG4 CH DNA之起始載體結(jié)構(gòu)pR001，使用CH區(qū)分別側(cè)接P1-P2和P3-P4的引子對(duì)，增幅二個(gè)PCR片段，片段1和2。參見下表9。引子將所欲的IgG2下絞鏈序列(其編碼SEQ ID NO：52)和側(cè)接的限制位置二者導(dǎo)入此等片段。然后使用PCR引子P2和P4連接這二個(gè)片段。將所產(chǎn)生的序列經(jīng)由Xho1-Not1限制位置插入pR001，產(chǎn)生含有嵌合IgG4 CH(其具有一IgG2下絞鏈序列)之載體結(jié)構(gòu)pR002。使用引子P10和P11確認(rèn)此序列。

此外，經(jīng)由多步驟PCR增幅產(chǎn)生嵌合的IgG1 CH。使用引子P2和P5(參見下表9)從模板pR85503(其含有一野生型人類IgG1 CH DNA)產(chǎn)生片段1a。以引子P6和P8使用pR002(含有嵌合的IgG4 CH DNA)作為模板，增幅片段2a。使用引子P7和P9從模板pR003(野生型hIgG1 CH DNA；SEQ ID NO：45)制造片段3。使用引子P2和P8連接片段1a和2a，其產(chǎn)生了片段4。使用引子P6和P9連接片段2a和3，產(chǎn)生了片段5。然后使用引子P2和P9將片段4和5融合。將所產(chǎn)生的序列經(jīng)由Xho1-Not1限制位置插入pR001，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)pR004，其具有一帶有IgG2下絞鏈和IgG4 CH2區(qū)之IgG1恒定區(qū)。使用引子P10和P11確認(rèn)此序列。

表9：用于PCR產(chǎn)生嵌合C_H核酸結(jié)構(gòu)之引子

實(shí)例4.相較于單特異性抗體，CD20x CD3雙特異性抗體選擇性結(jié)合Jurkat、Raji和猴子T-細(xì)胞

將CD3xCD20抗體-wtFc(對(duì)照抗體4)與單特異性對(duì)照抗體，如實(shí)例2中所述，經(jīng)由FACS結(jié)合法，比較其結(jié)合Jurkat(CD3+、CD20-人類T-細(xì)胞株)、Raji(CD3-、CD20+人類B-細(xì)胞株)或獼猴PBMC(「mkT細(xì)胞」)之能力。

使用下列方法得到FACS數(shù)據(jù)：將每孔2x10⁵個(gè)細(xì)胞以連續(xù)稀釋的抗體于冰上培養(yǎng)30min。培養(yǎng)后，清洗細(xì)胞及加入適當(dāng)?shù)亩?jí)(Jurkat、RAJI細(xì)胞)或二級(jí)抗體混合液(用于獼猴PBMC)并另再培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)后，清洗細(xì)胞，再懸浮于含1％BSA之冷的PBS中并以流式細(xì)胞儀于BD FACS Canto II上分析。將Jurkat和Raji細(xì)胞以側(cè)散射和前散射閘控，而獼猴T細(xì)胞亦閘控CD2+CD4+群族。使用Prism軟件以使用4-參數(shù)非線性回歸分析所計(jì)算的值測(cè)定細(xì)胞結(jié)合滴定之EC₅₀。結(jié)果系如表10所示。

表10.單特異性與CD3xCD20雙特異性抗體之EC50結(jié)合值(莫耳)

(+)EC₅₀值未測(cè)定，但有觀察到結(jié)合；NB無結(jié)合；NT未測(cè)試

如表10所示，試驗(yàn)抗體的分格，依照其特異性，在各中細(xì)胞株上顯現(xiàn)一范圍的結(jié)合親和力。雙特異性對(duì)照抗體4顯示與人類和獼猴目標(biāo)細(xì)胞之結(jié)合能力。對(duì)照抗體4包括與本發(fā)明抗體1和抗體2相同的抗-CD3xCD20可變區(qū)，然而卻具有野生型IgG1 CH區(qū)?？?CD3對(duì)照1(OKT3)、抗-CD3對(duì)照2(SP34)和抗-CD20對(duì)照3分別與Jurkat、獼猴T細(xì)胞和RAJI結(jié)合。

實(shí)例5.帶有野生型CH之CD20x CD3雙特異性抗體在活化的T-細(xì)胞存在下引發(fā)對(duì)Raji細(xì)胞的細(xì)胞毒性

以一活體外細(xì)胞毒性分析檢測(cè)CD20x CD3雙特異性抗體重新引導(dǎo)T-細(xì)胞媒介殺死CD20-表現(xiàn)的Raji細(xì)胞之能力。此外，亦研究雙特異性和親代抗-CD3抗體二者經(jīng)由Fc/FcR相互作用殺死U937細(xì)胞之能力。

鈣黃綠素致死分析系使用下列方法來進(jìn)行：分別于ficoll-Plaque上或經(jīng)由Lympholyte哺乳動(dòng)物細(xì)胞分離液分離人類和獼猴PBMC。將分離的PBMC于數(shù)天的期間內(nèi)以含有重組的人類IL-2(30U/ml)和T-細(xì)胞活化的微珠之培養(yǎng)基活化(抗-CD3/CD28用于人類PBMC，抗-CD2/CD3/CD28用于獼猴PBMC)。

將目標(biāo)細(xì)胞(Raji用于CD20媒介的致死而U937用于FcR媒介的致死)以鈣黃綠素標(biāo)定，并以活化的T細(xì)胞在10:1效應(yīng)子：目標(biāo)比率使用抗體的3-倍連續(xù)稀釋液于37℃培養(yǎng)3小時(shí)的時(shí)間。培養(yǎng)后，將培養(yǎng)盤離心并將上清液轉(zhuǎn)置于半透明黑色底部澄清的測(cè)定盤中進(jìn)行熒光分析。使用Prism測(cè)定EC₅₀，其系定義為引發(fā)50％細(xì)胞毒性之雙特異性抗體的莫耳濃度。使用4-參數(shù)非線性回歸分析計(jì)算數(shù)值。結(jié)果系匯整于表10中。

表11.CD20x CD3-引發(fā)對(duì)Raji和U937細(xì)胞之細(xì)胞毒性的EC₅₀值

(*)數(shù)據(jù)為3次或更多次獨(dú)立分析之平均值。無(*)之?dāng)?shù)據(jù)為1或2次獨(dú)立分析之代表值/平均值。NA＝無活性

如表11所示，含有人類-特異性和獼猴交叉反應(yīng)性抗-CD3臂及野生型IgG1 CH區(qū)之雙特異性CD20xCD3抗體，在人類活化的T細(xì)胞之存在下能專一重新引導(dǎo)對(duì)Raji細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在獼猴活化的T細(xì)胞之存在下，當(dāng)其與具有活化獼猴T細(xì)胞之抗-CD3臂的對(duì)照Ab 4雙特異性抗體培養(yǎng)時(shí)，殺死了Raji。雙特異性抗體以及對(duì)照Ab1(抗-CD3mAb)二者在U937Fc/FcR依賴的致死分析中顯現(xiàn)活性。此活性應(yīng)可藉由于反應(yīng)中加入阻斷非特異性人類IgG來加以阻斷(數(shù)據(jù)未顯示)。

實(shí)例6.包括嵌合的CH區(qū)之CD20x CD3雙特異性抗體在一CDC分析中顯現(xiàn)降低的效應(yīng)子功能

將帶有嵌合CH區(qū)之CD20xCD3雙特異性抗體(抗體1和抗體2)，如上文實(shí)例2中所述，工程化以改變或降低效應(yīng)子功能。相較于包括同型IgG1之野生型(wt)重鏈恒定區(qū)的抗體(對(duì)照Ab 4)，CH區(qū)的取代可能阻礙Ig Fc與其受體結(jié)合之能力。因此，訊號(hào)傳遞和免疫反應(yīng)，例如B細(xì)胞活化或吞噬作用，可能改變。檢測(cè)CH區(qū)中的氨基酸修飾對(duì)于補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)(在此實(shí)例中)及抗體-依賴的細(xì)胞媒介細(xì)胞毒性(ADCC)效應(yīng)子功能(參見實(shí)例7)之效應(yīng)。

為了檢測(cè)抗體1和抗體2對(duì)CDC效應(yīng)子功能之效應(yīng)，系在5％人類血清補(bǔ)充劑的存在下將CD20-表現(xiàn)Raji(目標(biāo))細(xì)胞(5000/孔)或Daudi細(xì)胞植入測(cè)定盤中。將抗體1、抗體2和對(duì)照抗體的連續(xù)稀釋液，以100nM開始，于37℃加到細(xì)胞中歷經(jīng)4h。使用CytoTox Glo^TM套組(Promega)測(cè)定目標(biāo)細(xì)胞裂解并計(jì)算細(xì)胞毒性百分比。

使用下列方程式計(jì)算細(xì)胞毒性百分比：

細(xì)胞毒性％＝((L_S-L_SR)/(L_MR-L_SR))*100％其中L_SR為基線發(fā)光而L_MR為經(jīng)毛地黃皂苷(digitonin)裂解之細(xì)胞所釋放的最大鈣黃綠素。細(xì)胞毒性之EC₅₀系使用Prism軟件(GraphPad)來測(cè)定。數(shù)值系使用4-參數(shù)非線性回歸分析來計(jì)算并如表1表12以及圖5A和5B所示。

相較于具有wt重鏈恒定區(qū)之對(duì)應(yīng)抗體，抗體1和體2對(duì)抗Daudi和Raji細(xì)胞之CDC活性顯著地減低。參見表12和圖5A/B。觀察到抗體1對(duì)抗Raji細(xì)胞之某些CDC活性，然而，整體的結(jié)果顯示，嵌合的抗體在提升效應(yīng)子反應(yīng)上比wt IgG1 Fc對(duì)照抗體更弱。

表12：包括嵌合CH區(qū)之CD20xCD3雙特異性抗體在測(cè)量效應(yīng)子功能之CDC分析中展現(xiàn)降低的活性

NA：無活性

實(shí)例7.包括嵌合CH區(qū)之CD3xCD20雙特異性抗體在ADCC分析中顯現(xiàn)降低的效應(yīng)子功能

為了檢測(cè)抗體1和抗體2與帶有野生型CH區(qū)(及相同可變區(qū))之雙特異性抗體對(duì)ADCC效應(yīng)子功能之效應(yīng)，系將新鮮分離的非刺激CD56‐陽性NK細(xì)胞或經(jīng)工程化表現(xiàn)FcγRIIIA之較高親和力V等位基因的NK92細(xì)胞在嵌合CH‐抗體(抗體1和抗體2)及wt‐CH對(duì)照抗體(對(duì)照抗體4)的存在下，置入含鈣黃綠素‐標(biāo)定的CD20‐陽性Raji或Daudi細(xì)胞的盤中。監(jiān)測(cè)從目標(biāo)細(xì)胞釋放的鈣黃綠素及測(cè)定細(xì)胞毒性百分比。如上文CDC分析所述，計(jì)算細(xì)胞毒性百分比和EC₅₀。結(jié)果系如表13及圖6A和6B中所示。

嵌合的CH抗體、抗體1和抗體2并無媒介對(duì)抗Raji或Daudi細(xì)胞之ADCC活性(表13)。

表13：包括嵌合CH區(qū)之CD3x CD20雙特異性抗體在測(cè)量效應(yīng)子功能之ADCC分析中展現(xiàn)降低的活性

NA：無或性；#：背景細(xì)胞毒性～20％

實(shí)例8.嵌合抗體之表面電漿子共振衍生的結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)常數(shù)

使用表面電漿共振(SPR)(Biacore)技術(shù)分析具有嵌合恒定重鏈區(qū)之抗‐CD3x抗‐CD20雙特異性抗體，抗體1和抗體2，用以測(cè)定其與人類和獼猴Fcγ受體之動(dòng)力學(xué)結(jié)合參數(shù)。以類似的方式檢測(cè)同型對(duì)照組，亦即wt‐IgG1同型對(duì)照組和wt‐IgG4 CPPC同型對(duì)照組。

簡(jiǎn)言之，SPR實(shí)驗(yàn)系于25℃在Biacore T200儀器上運(yùn)用一涂覆羧甲基葡聚醣(CM‐5)芯片來進(jìn)行。使用標(biāo)準(zhǔn)的胺‐偶合化學(xué)將小鼠的單株抗‐五‐組胺酸抗體(GE Healthcare)固定在CM‐5感應(yīng)芯片之表面上。將His‐標(biāo)記的人類或猴子FcγR蛋白之140RU‐376RU捕捉至抗‐五‐組胺酸‐偶合CM‐5芯片并于捕捉的蛋白上以20μl/min注射抗體儲(chǔ)存液歷時(shí)2.5min。監(jiān)測(cè)mAb結(jié)合反應(yīng)，及，就低親和力受體，計(jì)算穩(wěn)態(tài)的結(jié)合平衡。藉由處理數(shù)據(jù)及使用Scrubber 2.0曲線擬合軟件與1:1結(jié)合模型擬合，測(cè)定動(dòng)力結(jié)合(k_a)和裂解(k_d)速率常數(shù)。從動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)計(jì)算結(jié)合裂解平衡常數(shù)(K_D)和裂解半衰期(t_1/2)：K_D(M)＝k_d/k_a；及t_1/2(min)＝(ln2/(60*k_d)。

表14：野生型(wt)和嵌合重鏈抗體之動(dòng)力學(xué)結(jié)合參數(shù)

NB：無偵測(cè)到結(jié)合

如表14中的結(jié)果所示，相較于具有野生型(wt)hIgG1或hIgG4‐CPPC CH區(qū)之抗體，在SPR分析中抗體1和抗體2雙特異性抗體并未顯示與人類FcγRI結(jié)合。相較于帶有wt hIgG1或hIgG4‐CPPC Fc序列之抗體，本發(fā)明之嵌合重鏈雙特異性抗體對(duì)數(shù)種低親和力人類FcRγ受體亦展現(xiàn)微弱至無結(jié)合(例如對(duì)人類FcRγIIA、FcRγIIB微弱結(jié)合，而對(duì)人類FcRγI、FcRγIIIA或FcRγIIIB則未偵測(cè)到結(jié)合)(下表15)。

表15：對(duì)野生型(wt)和嵌合重鏈抗體之穩(wěn)態(tài)平衡結(jié)合

NB：無偵測(cè)到結(jié)合

實(shí)例9.嵌合抗體的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)

抗體1和抗體2之毒理動(dòng)力學(xué)性質(zhì)系藉由從接受單一30-分鐘IV輸注的雄性獼猴得到血液樣本(3只動(dòng)物/治療組)，接著12周的觀察期來評(píng)估。用于血清中總藥物濃度之毒理動(dòng)力學(xué)分析的血液樣本系于給劑前和給劑后5分鐘和5、24、48、72和168小時(shí)，以及第14、21、35、49、66和84天所收集。將所得到的樣本以直接的酵素結(jié)合免疫吸附分析(ELISA)分析，用以測(cè)定Ab 1或Ab 2之總藥物濃度。使用非隔室分析(Phoenix WinNonLin)評(píng)估受試品項(xiàng)之毒理動(dòng)力學(xué)，以測(cè)定藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果系如表16所示(AUC＝濃度與時(shí)間曲線下面積；C_max＝實(shí)測(cè)的血清中最大濃度)。

表16：?jiǎn)我混o脈內(nèi)輸注獼猴后，獼猴血清中嵌合抗體之藥物動(dòng)力學(xué)樣貌

在獼猴中1.0mg/kg之Ab1和Ab2的單一靜脈給劑后，觀察到平均高峰濃度(C_max)分別為33.4和26.0μg/mL，及平均AUC_0-168h值分別為100和61.1天*ug/mL。表觀最終半衰期預(yù)估系介于這二個(gè)分子之8.14-14.0天。數(shù)據(jù)顯示，在所有的動(dòng)物中就大多數(shù)12周觀察期維持連續(xù)暴露于Ab1和Ab2且在各治療組中為相當(dāng)?shù)?。受試的品?xiàng)并無觀察到表觀的致免疫性。Ab1和Ab2整體藥物動(dòng)力學(xué)樣貌為給劑于獼猴之典型的單株抗體。

實(shí)例10.CD3xCD20雙特異性抗體可用比單特異性抗體更低的劑量在獼猴中去除CD20+B-細(xì)胞

就測(cè)定抗體1和對(duì)照抗體4CD3xCD20雙特異性抗體給藥之活體內(nèi)效力，系在給予抗-CD3xCD20雙特異性抗體后，經(jīng)由FACS檢測(cè)獼猴外圍血液CD20+B-細(xì)胞量的變化，與單特異性抗-CD20抗體(對(duì)照Ab 3)相比較。此研究系在編成8個(gè)給劑組，每個(gè)給劑組3只動(dòng)物之雄性獼猴(長尾獼猴(Macaca fascicularis))中如下進(jìn)行：第1組為安慰劑組(媒劑對(duì)照給藥)；第2組接受30mg/kg之單特異性抗體(對(duì)照Ab 3；rituxan)(猴子中30mg/kg相當(dāng)于375mg/m²之人類劑量，其被認(rèn)為是最大臨床劑量)；第3組為0.01mg/kg之雙特異性CD3xCD20對(duì)照抗體4；第4組-0.1mg/kg之抗體4；第5組-1mg/kg之抗體4；第6組-0.01mg/kg之抗體1；第7組-0.1mg/kg之抗體1；及第8組-1mg/kg之抗體1。在給劑動(dòng)物前第-7和-4天抽血?？贵w藥物或媒劑(安慰劑)之劑量系經(jīng)由i.v.輸注來給藥，并于給劑后第2、4和7天抽血。以FACS就B細(xì)胞(CD20；表17)和T細(xì)胞(CD3，參見下文)標(biāo)記分析血液樣本并測(cè)定這些細(xì)胞類型的絕對(duì)數(shù)。

簡(jiǎn)言之，將100μl的血液以1.5ml RBC裂解緩沖液于Eppendorf試管中培養(yǎng)3分鐘。將細(xì)胞以0.4xg離心5分鐘，以FACS清洗液(PBS+3％FBS)清洗2x并于室溫以Fc阻斷試劑阻斷10分鐘。然后將細(xì)胞于4℃以直接接合hCD45和CD20熒光試劑的抗體培養(yǎng)30分鐘。使用由CD45熒光染劑和側(cè)散射特性(SSC)界定(CD45brightSSCdim)所組成之異源性閘控策略先進(jìn)行B細(xì)胞子群(CD20)或T細(xì)胞子群(CD3)的定量測(cè)定，描繪白血液細(xì)胞(WBC)群族。然后經(jīng)由使用適當(dāng)熒光標(biāo)定的抗體(CD20APC-Cy7)鑒別B細(xì)胞群族。染色后，清洗細(xì)胞二次，之后以FACSCanto細(xì)胞儀獲得FACS，并以FlowJo軟件分析。結(jié)果系如表17以及圖11A和11B所示。

表17：治療后獼猴外圍血液之循環(huán)的CD45、CD20陽性細(xì)胞數(shù)目

如表17和圖11A中所示，以第1個(gè)測(cè)量的時(shí)間點(diǎn)(第2天)，給予CD3xCD20雙特異性抗體和抗-CD20單特異性抗體造成循環(huán)的B-細(xì)胞減少至基線量。此減少在安慰劑對(duì)照動(dòng)物組中并未看到。在雙特異性抗體之1mg/kg給劑后，雙特異性組中B細(xì)胞去除維持1周，在0.01和0.10mg/kg劑量的雙特異性組同樣維持B細(xì)胞去除。

在此實(shí)驗(yàn)中亦以熒光標(biāo)定的抗-CD3抗體監(jiān)測(cè)T-細(xì)胞(CD3+)量。在雙特異性抗體組(Ab4和Ab1；所有劑量)中于給劑后第2天觀察到過渡性喪失循環(huán)的T-細(xì)胞。在媒劑(安慰劑)對(duì)照和對(duì)照Ab3(Rituxan)組中于測(cè)量的時(shí)間點(diǎn)并未觀察到T細(xì)胞喪失。在雙特異性抗體組中在第4天的時(shí)間點(diǎn)T-細(xì)胞量回到基線量，并維持在基線量直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束(參見圖11B)。

抗體1和抗體4CD3xCD20雙特異性抗體之活體內(nèi)效力系以一長期(3個(gè)月)研究于獼猴外圍血液中測(cè)量CD20+B-細(xì)胞量或CD3+T-細(xì)胞量之變化，類似上述研究。在第0天投予1.0mg/kg之安慰劑(媒劑)或雙特異性抗體。于二個(gè)雙特異性抗體組中，外圍血液中B-細(xì)胞量在第2天顯著減少，且在所有的樣本中(安慰劑除外)，于整個(gè)研究期內(nèi)量維持減少(參見圖12A)。于雙特異性組中，第2天觀察到過渡性T-細(xì)胞喪失，然后在第4天回復(fù)到基線量，且就經(jīng)雙特異性抗體治療的動(dòng)物，如整個(gè)研究(>80天)中所測(cè)，系維持大約的基線(圖12B)。在以安慰劑治療的動(dòng)物中并無觀察到過渡性T-細(xì)胞喪失。

就進(jìn)一步測(cè)量低劑量給藥之抗體1和抗體4CD3xCD20雙特異性抗體的活體內(nèi)效力，系以一長期(2個(gè)月)研究于獼猴外圍血液中測(cè)量CD20+B-細(xì)胞量或CD3+T-細(xì)胞量之變化，類似上述實(shí)驗(yàn)。在第0天投予0.01mg/kg或0.001mg/kg(1μg/kg)之雙特異性抗體。就二個(gè)CD3xCD20組，外圍血液中B-細(xì)胞量在第2天顯著減少，且于整個(gè)研究期內(nèi)量維持減少(參見圖13A)，與高劑量CD3xCD20雙特異性抗體治療的動(dòng)物中所觀察到的相類似(參見表17和圖11A或12A)。以非常低劑量(1μg/kg)的雙特異性抗體治療的動(dòng)物，如同以較高劑量CD3xCD20雙特異性抗體治療的動(dòng)物中所見到的，歷經(jīng)相同的過渡性T-細(xì)胞喪失及恢復(fù)(參見圖13B與圖11B或12B相比)。

如在上述研究中所觀察到的B-細(xì)胞喪失系與經(jīng)CD3xCD20-嵌合Fc抗體1治療的動(dòng)物之外圍血液中循環(huán)抗體的喪失相關(guān)(參見圖14)。當(dāng)動(dòng)物循環(huán)中的抗體暴露隨時(shí)間減少，B-細(xì)胞群族開始恢復(fù)(例如在動(dòng)物編號(hào)I06881中第81天所觀察到的)。

B-細(xì)胞喪失與外圍血液中循環(huán)抗體喪失之相關(guān)性亦在經(jīng)CD3xCD20-嵌合Fc抗體2治療的動(dòng)物中可看到(參見圖15)，當(dāng)動(dòng)物循環(huán)中的抗體暴露隨時(shí)間減少，則B細(xì)胞群族開始恢復(fù)，如在動(dòng)物編號(hào)I06876中第66天，及在動(dòng)物編號(hào)I06877中第68天所觀察到的。類似的相關(guān)性在經(jīng)CD3xCD20-wtFc(Ab 4)雙特異性抗體治療的動(dòng)物中亦可看到(參見圖16)。當(dāng)動(dòng)物循環(huán)中的抗體暴露隨時(shí)間減少，B細(xì)胞群族開始恢復(fù)(參見圖16，如在動(dòng)物編號(hào)I06870中第91天，及在動(dòng)物編號(hào)I06872中第64天所觀察到)。

實(shí)例11.CD3xCD20雙特異性抗體可用比單特異性抗體更低的劑量減少獼猴淋巴樣組織中CD20+B-細(xì)胞

投予抗-CD3xCD20雙特異性抗體(抗體1或抗體4)后，經(jīng)由FACS檢測(cè)獼猴淋巴樣組織中CD20+B-細(xì)胞量的變化，與單特異性抗-CD20抗體(對(duì)照Ab 3-Rituxan)相比較。此研究系在編成8個(gè)給劑組，每個(gè)給劑組3只動(dòng)物之雄性獼猴(Macaca fascicularis)中如下進(jìn)行，系類似上文實(shí)例10之1-8組中所述?？贵w藥物或媒劑之劑量系經(jīng)由i.v.輸注來給藥，及于給劑后第7天將動(dòng)物安樂死并收集組織。就白血液細(xì)胞(CD45+)和特別是B細(xì)胞(CD20+)、標(biāo)記以FACS分析組織樣本，然后測(cè)定B細(xì)胞的體積％。

經(jīng)由使用適當(dāng)熒光標(biāo)定的抗體(CD20APC-Cy7)鑒別B細(xì)胞群族并類似上述實(shí)例10之方法獲得FACS。結(jié)果系如表18以及圖17A和17B所示。

表18：在治療后猴子腸系膜淋巴結(jié)和脾臟中CD20陽性細(xì)胞之百分比

如表18和圖17A中所示，投予CD3xCD20雙特異性抗體，相較于抗-CD20單特異性抗體，就雙特異性組以低很多的劑量(0.01至1.0mg/kg劑量)造成脾臟中組織B細(xì)胞減少。此減少在安慰劑對(duì)照動(dòng)物組中并未看到。

如表18和圖17B中所示，投予CD3xCD20雙特異性抗體，相較于抗-CD20單特異性抗體，就雙特異性組以低很多的劑量(0.01至1.0mg/kg劑量)造成腸系膜淋巴結(jié)中組織B細(xì)胞減少，其中0.1mg/kg劑量和1mg/kg劑量的雙特異性抗體比單特異性組產(chǎn)生更有效的B細(xì)胞減少。此減少在安慰劑對(duì)照動(dòng)物組中并未看到。在CD20之免疫組織化學(xué)染色時(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)，在單特異性-治療(30mg/kg)的淋巴結(jié)中偵測(cè)到殘余的B-細(xì)胞。從0.1至1.0mg/kg雙特異性抗-CD3xCD20抗體治療組所收集的組織中并未偵測(cè)到殘余的B細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了Ab1和Ab1具有比Ab3更強(qiáng)殺死B細(xì)胞之深度。

實(shí)例12.以CD3x CD20雙特異性抗體治療腫瘤

A.以CD20x CD3雙特異性抗體治療，抑制了NSG小鼠中Raji腫瘤生長

就評(píng)估選擇的抗‐CD3xCD20雙特異性抗體對(duì)降低Raji腫瘤生長的效力，系將購自Jackson Laboratories(Bar Harbor,Maine,USA)之NSG小鼠(NOD/LtSz‐scid/IL2Rγ^null小鼠)以皮下共同植入2x10⁶個(gè)Raji腫瘤細(xì)胞和5x10⁵個(gè)人類PBMC(第0天)。在同一天，以抗體1或?qū)φ湛贵w5(不相關(guān)標(biāo)靶之IgG1抗體)或?qū)φ彰絼┲?.4、0.04或0.004mg/kg腹膜內(nèi)劑量治療每只小鼠(每組治療組N＝5只小鼠)。由第0天開始，以藥物或媒劑之腹膜內(nèi)劑量每周二次治療小鼠進(jìn)行至其余的研究天數(shù)。使用光標(biāo)尺每周測(cè)量腫瘤大小2次，且腫瘤體積系計(jì)算為體積＝(長x寬²)/2。利用GraphPad軟件Prism 5.0(MacIntosh Version)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

藉由雙因子ANOVA以杜凱氏多重比較事后測(cè)驗(yàn)(Tukey’s multiple comparisons post-test)測(cè)定統(tǒng)計(jì)顯著性。將各讀值之?dāng)?shù)據(jù)于治療組間交叉比較。p<0.05之閥值視為統(tǒng)計(jì)上顯著的。

結(jié)果系顯示在圖7A‐7F中。這些結(jié)果顯示抗體1(CD3xCD20‐嵌合Fc)以共同植入人類免疫細(xì)胞之小鼠中Raji腫瘤為標(biāo)靶，造成在受試劑量時(shí)完全抑制腫瘤生長(圖7C：0.4mg/kg Ab1；圖7E：0.04mg/kg Ab1；圖7F：0.004mg/kg Ab1)。此實(shí)例驗(yàn)證了，在腫瘤植入時(shí)開始以CD3xCD20雙特異性抗體1治療對(duì)于抑制腫瘤生長為有效的。相對(duì)于對(duì)照組，在給予0.4、0.04或0.004mg/kg劑量的抗體1小鼠中，Raji腫瘤生長直到植入后23天仍完全受到抑制。于研究期間，在抗體1或?qū)φ湛贵w中皆未觀察到對(duì)小鼠體重有顯著的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。

以一類似的NSG小鼠模型(如上述)進(jìn)一步試驗(yàn)CD3xCD20雙特異性抗體的抗腫瘤效應(yīng)，然而各NSG小鼠系在第-1天給劑1mg小鼠IgG(mIgG2a Fc)，之后每周一次。結(jié)果系如圖8A-8B所示。

此實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了，在腫瘤植入時(shí)開始，在循環(huán)IgG的存在下以受試的雙特異性Ab劑量之CD3xCD20雙特異性抗體1(CD3xCD20-嵌合Fc)或CD3xCD20雙特異性抗體4(CD3xCD20-wtFc)治療對(duì)于抑制腫瘤生長為有效的(圖8A-8B)。如圖8A所見，于本實(shí)驗(yàn)中抗體1(CD3xCD20-嵌合Fc雙特異性抗體)在有或無IgG1補(bǔ)充劑時(shí)，于受試的期間內(nèi)展現(xiàn)完全的腫瘤抑制。

B.以CD3xCD20雙特異性抗體治療在NSG小鼠中縮小了已建立的腫瘤

評(píng)估選擇的抗-CD3xCD20雙特異性抗體在NSG小鼠(NOD/LtSz-scid/IL2Rγ^null小鼠)中降低已建立腫瘤之效力。NSG小鼠系購自Jackson Laboratories(Bar Harbor,Maine,USA)并以皮下共同植入HLA-相合的Raji腫瘤細(xì)胞(2x10⁶)和人類PBMC(5x10⁵)(第-15天)。在治療前讓腫瘤于宿主中建立15天。在給藥的前一天(第-1天)，小鼠各給劑5mg mIgG2a Fc之補(bǔ)充劑。隨后將小鼠在實(shí)驗(yàn)期間以每周一次每只小鼠給劑5mg的mIgG2a Fc(第7天、第14天等)。在給藥前根據(jù)腫瘤大小將小鼠分成2個(gè)實(shí)驗(yàn)組：第1組：～200-400mm³或第2組：～500-900mm³。

藥物治療后，于第0、3、6、10、14、17、21和28天監(jiān)測(cè)各小鼠腫瘤大小并記錄。每周二次使用光標(biāo)尺測(cè)量腫瘤大小，并計(jì)算腫瘤體積為體積＝(長x寬²)/2。亦以觸知測(cè)定腫瘤的存在。利用GraphPad軟件Prism 5.0(MacIntosh Version)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將來自各讀出值之?dāng)?shù)據(jù)于治療組中交叉比較。結(jié)果系如圖9和10中所示。

a.第1組：～200-400mm³腫瘤。在第0天開始，以所試劑量之藥物或媒劑每周

一次(亦即第7天、第14天等)如下治療各4或5只小鼠的數(shù)個(gè)小組：

i.對(duì)照：?jiǎn)为?dú)的媒劑

ii.對(duì)照抗體5，0.4mg/kg

iii.抗體1(CD20xCD3-嵌合Fc),0.4mg/kg

b.第2組：～500-900mm³腫瘤。在第0天開始，以所試劑量之藥物或媒劑每周

一次(亦即第7天、第14天等)如下治療各4只小鼠的數(shù)個(gè)小組：

i.對(duì)照抗體5，0.4mg/kg

ii.抗體1(CD20xCD3-嵌合Fc),0.4mg/kg

在投予0.4mg/kg抗體1(CD20xCD3-嵌合Fc)的小鼠于14天腫瘤完全消退。參見圖9。

在帶有較大已建立腫瘤之模型中(亦即，第2組，～500-900mm³)，抗體1(CD20xCD3-嵌合Fc)治療(0.4mg/kg)在第21天所觀察的腫瘤完全消除。參見圖10，其驗(yàn)證了Ab1在治療帶有體積大于0.5cm及高達(dá)0.9cm之大淋巴瘤塊(亦即CD20表現(xiàn)陽性之腫瘤)小鼠中的效用。

實(shí)例13.CD3xCD20雙特異性抗體在活體外引發(fā)PBMC增生

選擇的CD20xCD3雙特異性抗體及對(duì)照組結(jié)構(gòu)刺激外圍血液?jiǎn)魏思?xì)胞(PBMC)及引發(fā)增生作用之能力系使用ATP催化的定量分析(CellTiter)來評(píng)估。PBMC之活化造成細(xì)胞激素釋放，其驅(qū)動(dòng)細(xì)胞增生。

使用下列方法得到增生數(shù)據(jù)：將人類或獼猴衍生的PBMC(5x10⁵/孔)以3-倍連續(xù)稀釋之抗-CD3xCD20或?qū)φ湛贵w及市售的抗-CD28抗體(人類：200ng/mL，獼猴：500ng/mL)于37℃培養(yǎng)72h。使用Cell Titer定量細(xì)胞并使用VICTOR X5多標(biāo)定盤式判讀儀(PerkinElmer)測(cè)量作為細(xì)胞存活讀數(shù)之發(fā)光量，用以偵測(cè)活細(xì)胞。細(xì)胞存活(刺激與未刺激細(xì)胞之誘發(fā)倍率)系藉由將刺激細(xì)胞的發(fā)光除以未刺激細(xì)胞的基線發(fā)光并使用Prism軟件作圖來測(cè)定。結(jié)果系匯整于表19以及圖18A和18B中。

表19.由抗-CD3x CD20雙特異性抗體引發(fā)的人類和獼猴PBMC增生之EC₅₀

數(shù)據(jù)為3或多個(gè)獨(dú)立分析之中位數(shù)。NA＝無活性。

如表19和圖18A-18B中所示，本發(fā)明之二種CD20x CD3雙特異性抗體引發(fā)了人類或獼猴PBMC之增生?？贵w1以大約相等的效力引發(fā)人類和獼猴二者PBMC之增生。對(duì)照Ab5不具有活性。

實(shí)例14.CD20x CD3雙特異性在活體外藉由活化的T-細(xì)胞媒介細(xì)胞致死

分別于ficoll-Plaque上或使用淋巴溶解素哺乳動(dòng)物細(xì)胞分離液(Lympholyte Mammal cell separation media)分離人類或獼猴PBMC。將分離的PBMC(1x10⁶個(gè)細(xì)胞/mL人類PBMC或5x10⁶個(gè)細(xì)胞/mL獼猴PBMC)，于含有重組的人類IL-2(30U/mL用于人類PBMC，100U/mL用于獼猴PBMC)及T細(xì)胞活化微珠(抗-CD3/CD28用于人類PBMC，抗-CD2/CD3/CD28用于獼猴PBMC)之完全培養(yǎng)基(RPMI補(bǔ)充10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、292μg/mL L-麩酰胺酸)分別活化7和21天。將CD20表現(xiàn)的Raji細(xì)胞(2x10⁶個(gè)細(xì)胞/mL)于37℃以8μM鈣黃綠素-AM標(biāo)定30分鐘并以培養(yǎng)基沖洗3次。將鈣黃綠素-標(biāo)定的標(biāo)靶細(xì)胞(10,000-20,000個(gè)細(xì)胞/孔)于37℃置入200μL含有活化T細(xì)胞(效應(yīng)子/標(biāo)靶細(xì)胞比率10:1)及抗體1、Ab 4或?qū)φ誂b 5之連續(xù)稀釋液(人類濃渡范圍：2nM至0.00003nM；獼猴濃度范圍：6.6nM至0.002pM)完全培養(yǎng)基中2小時(shí)。培養(yǎng)后，將培養(yǎng)盤離心并將上清液轉(zhuǎn)置于半透明黑色底部澄清的盤中進(jìn)行熒光分析。使用下列方程式計(jì)算細(xì)胞毒性百分比：

細(xì)胞毒性％＝((FS-FSR)/(FMR-FSR))*100％,

其中FS為從試驗(yàn)孔槽釋放出的鈣黃綠素，F(xiàn)SR為自發(fā)性鈣黃綠素釋放而FMR為經(jīng)Triton-X裂解的細(xì)胞所釋出之最大鈣黃綠素。

使用Prism軟件測(cè)定細(xì)胞存活的之EC₅₀(ATP催化性定量分析)。細(xì)胞裂解(細(xì)胞毒性)系藉由鈣黃綠素釋放作為最大釋放的分?jǐn)?shù)所測(cè)量。將所觀察的釋放與最大釋放相比，計(jì)算細(xì)胞毒性百分比并測(cè)定EC₅₀值。結(jié)果系如表20及圖19A(人類T-細(xì)胞)和19B(猴子T-細(xì)胞)中所示。

表20.CD3xCD20-引發(fā)對(duì)Raji細(xì)胞的細(xì)胞毒性之EC₅₀值

NA＝無活性；NT＝未測(cè)試

如表20中所示，抗體1分別以25.0ρM和9.10ρM對(duì)人類(圖19A)和獼猴(圖19B)T細(xì)胞之帶表性EC₅₀值媒介了目標(biāo)細(xì)胞致死?？贵w4分別以15.7pM和1.73pM對(duì)人類(圖19A)和獼猴(圖19B)T細(xì)胞之代表性EC₅₀值媒介了目標(biāo)細(xì)胞致死。對(duì)照組未觀察到活性。

為了以流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)帶有CD20的標(biāo)靶細(xì)胞之特異性致死，系將B16F10.9親代鼠科骨髓瘤細(xì)胞(不會(huì)表現(xiàn)CD20)及經(jīng)工程化穩(wěn)定表現(xiàn)人類CD20之B16F10.9細(xì)胞(B16F10.9/CD20)分別以1μM的熒光追蹤染劑羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)和Violet Cell Tracker標(biāo)定。標(biāo)定后，將細(xì)胞以1:1比率混合，并于37℃放置隔夜。個(gè)別地，將人類PBMC以1x10⁶個(gè)細(xì)胞/mL置入補(bǔ)充的RPMI培養(yǎng)基并于37℃培養(yǎng)至隔夜，藉由去除黏附的巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和某些單核細(xì)胞來豐富淋巴細(xì)胞。隔天，將標(biāo)靶細(xì)胞與去除黏附細(xì)胞的天然PBMC(效應(yīng)子/標(biāo)靶細(xì)胞4:1比率)及試驗(yàn)的CD3xCD20雙特異性抗體或IgG1對(duì)照抗體5的連續(xù)稀釋液(濃度范圍：66.7nM至0.25ρM)于37℃共培養(yǎng)48小時(shí)。使用無酵素細(xì)胞裂解緩沖液從細(xì)胞培養(yǎng)皿移出細(xì)胞，并以FACS分析。就FACS分析，系將細(xì)胞以死/活far red cell tracker(Invitrogen)染色。就評(píng)估致死之特異性，系將細(xì)胞閘控在活的Violet和CFDA-SE標(biāo)定的族群上。記錄各族群的百分比如下用于計(jì)算調(diào)整的存活：調(diào)整的存活＝(R1/R2)*100，其中R1＝[(B16F10.9/CD20)/旁觀細(xì)胞(B16F10.9)]*100在無抗體之下，及R2＝相同的比率但在試驗(yàn)抗體的存在下。

表21.在B16F10.9/CD20細(xì)胞中標(biāo)靶-特異性致死之EC₅₀值

NA＝無活性。

CD3xCD20-嵌合Fc(抗體1)和CD3xCD20-wtFc(抗體4)二者在細(xì)胞的混合群族中特異性引導(dǎo)人類T細(xì)胞僅殺死表現(xiàn)CD20之標(biāo)靶細(xì)胞(圖20A-B)。僅在雙特異性抗體的存在下觀察到標(biāo)靶細(xì)胞致死，其中B16F10.9/CD20細(xì)胞系以劑量依賴的方式被抗體1(EC₅₀ 19.5ρM)和抗體4(EC₅₀ 12.8ρM)去除(圖20B)。低于5％的CD20-表現(xiàn)細(xì)胞在受試的最高劑量(10μg/mL)時(shí)仍存活(圖20B)。就對(duì)照Ab5，一種IgG1對(duì)照抗體，在親代B16F10.9細(xì)胞群族或B16F10.9/CD20群組為觀察到死亡證據(jù)。

實(shí)例15.在20小時(shí)FACS的活體外分析中CD3xCD20雙特異性抗體上調(diào)了T細(xì)胞上之早期活化標(biāo)記CD69

CD69+為其中一種指出T細(xì)胞已被活化之最早可誘發(fā)的細(xì)胞表面標(biāo)記。T-細(xì)胞活化可藉由檢驗(yàn)上調(diào)的特定細(xì)胞表面標(biāo)記，例如CD69來測(cè)定。

CD3xCD20雙特異性抗體上調(diào)全血中人類或獼猴T細(xì)胞上之早期活化標(biāo)記CD69的能力系藉由20小時(shí)活體外FACS分析來測(cè)定。簡(jiǎn)言之，藉由將新鮮分離的人類或獼猴全血于平底96孔盤以5-倍(人類)或10-倍(獼猴)的抗體1、抗體4或?qū)φ誂b 5之連續(xù)稀釋液(濃度范圍50nM至0.0006nM)于RPMI+L-麩酰胺酸中在37℃培養(yǎng)20小時(shí)，來評(píng)估T細(xì)胞活化。培養(yǎng)后，將培養(yǎng)盤以1000rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘并移除血漿。就測(cè)量T細(xì)胞上CD69上調(diào)，系將含直接接合CD2和CD69之抗體，以及CD45、CD4、CD8，和CD19(人類)或CD16(獼猴)之混合液，于4℃直接加到血液中歷時(shí)30分鐘。依照制造商的說明以1.5mL PharmLyse緩沖液溶離紅血球。清洗細(xì)胞二次，懸浮于200μL冷的PBS+1％FBS中，并以流式細(xì)胞儀使用BD FACSCanto細(xì)胞計(jì)數(shù)器分析。以首先閘控在能生存的小CD45+淋巴細(xì)胞，然后閘控在CD19-/CD2+/CD4+T細(xì)胞(人類)或CD16-/CD2+/CD4+T細(xì)胞(獼猴)，鑒別CD4+T細(xì)胞。

記錄總CD2+效應(yīng)子細(xì)胞中活化的(CD69+)T細(xì)胞百分比。參見表22以及圖21。結(jié)果顯示，如早期活化標(biāo)記CD69所偵測(cè)，CD3xCD20雙特異性抗體顯著地活化T細(xì)胞。

表22.B16F10.9/CD20細(xì)胞中標(biāo)靶-特異性致死之EC₅₀值

NA＝無活性

實(shí)例16.CD3xCD20雙特異性抗體引發(fā)T細(xì)胞與標(biāo)靶細(xì)胞群聚

使用細(xì)胞群聚模式測(cè)定CD3xCD20雙特異性抗體系經(jīng)由其雙特異性結(jié)合臂橋接T-細(xì)胞與標(biāo)靶細(xì)胞(CD20+細(xì)胞)。將效應(yīng)子細(xì)胞以CFSE預(yù)先染色，及以Violet Cell Tracker將CD20+細(xì)胞預(yù)先染色24小時(shí)，并以不相關(guān)的對(duì)照抗體(對(duì)照抗體5，不相關(guān)IgG1同型抗體)培養(yǎng)后閘控分開四象限。參見圖22A，其系描繪對(duì)于以不相關(guān)抗體治療的細(xì)胞混合物中無群聚(雙重-染色)。以CD3xCD20雙特異性抗體培養(yǎng)后，由于染上CFSE和Violet二者，則出現(xiàn)細(xì)胞群聚(參見圖22B，在散射圖之左上方象限以粗黑方框標(biāo)出)。

實(shí)例17.CD3+細(xì)胞上Tim-3和PD-1標(biāo)記之抑制表現(xiàn)

T細(xì)胞功能障礙或衰竭系發(fā)生在帶有腫瘤之宿主中。已鑒別出Tim-3和PD-1受體為慢性疾病狀態(tài)中T細(xì)胞衰竭的標(biāo)記。根據(jù)研究人員Sakuishi,K.等人(J.Exp.Med.207(10):2187-2194,2010)，Tim-3和PD-1陽性(Tim-3+PD-1+TIL)之腫瘤浸潤的淋巴細(xì)胞(TIL)，如無法增生和產(chǎn)生IL-2、TNF和IFN-γ所定義，具有最嚴(yán)重的衰竭表型。

由以皮下共植入HLA-相合Raji腫瘤細(xì)胞和人類PBMC之NSG小鼠的血液和腫瘤中萃取CD3-陽性細(xì)胞-參見上文實(shí)例12B。簡(jiǎn)言之，在治療前讓腫瘤在宿主中建立15天-然后將小鼠以腫瘤大小為基礎(chǔ)分成二個(gè)治療組(參見實(shí)例12B)。從各研究組在第9天由經(jīng)治療(雙特異性Ab)和未經(jīng)治療的小鼠中萃取血液，亦即第1組～200-400mm³或第2組～500-900mm³。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)將具有達(dá)到1500mm³腫瘤未經(jīng)治療的小鼠安樂死并將這些腫瘤進(jìn)行PD1和Tim-3表現(xiàn)之檢測(cè)。

就循環(huán)的T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，系選擇可存活的CD45+CD3+T細(xì)胞比率使用Tim-3或PD-1之直接標(biāo)定抗體(可購自Biolegend)進(jìn)行標(biāo)記鑒定。Tim-3+PD-1+細(xì)胞在未治療動(dòng)物血液中循環(huán)T細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)比率。然而，在經(jīng)CD20xCD3雙特異性抗體(Ab 1)治療的動(dòng)物血液中T細(xì)胞則展現(xiàn)較低的Tim-3+PD-1+細(xì)胞比率。

將來自未治療宿主的腫瘤細(xì)胞分離并就存活性染色。就存活的單一細(xì)胞進(jìn)行FACS分析，用以挑選出CD45+CD3+細(xì)胞比率，然后檢測(cè)其Tim-3或PD-1表現(xiàn)。

吾等已發(fā)現(xiàn)，在實(shí)例12B所述的實(shí)驗(yàn)期間，抑制的受體Tim-3和PD-1系表現(xiàn)在未經(jīng)治療小鼠之NSG B細(xì)胞淋巴瘤的CD3+TIL上，而Tim-3+PD-1+細(xì)胞在T細(xì)胞浸潤腫瘤占優(yōu)勢(shì)比率。

實(shí)例18.于帶有已建立Raji腫瘤之NSG小鼠中以CD3xCD20雙特異性抗體治療比抗-CD20+抗體更有效

評(píng)估選擇的抗-CD3xCD20雙特異性抗體在降低NSG小鼠中已建立腫瘤之效力。將NSG小鼠(NOD/LtSz-scid/IL2Rγ^null小鼠；Jackson Laboratories)以皮下共植入Raji腫瘤細(xì)胞(2x10⁶)和人類PBMC(5x10⁵)(于第-14天)(類似上文中實(shí)例12B)。

在抑制已建立Raji腫瘤上，CD20xCD3雙特異性Ab1(以0.4mg/kg；2x/周i.p.給劑)系與CD19xCD3BiTE(以0.5mg/kg；5x/周i.v.給劑)(圖23)相當(dāng)?shù)珒?yōu)于利妥昔單抗治療(以8mg/kg；5x/周i.p.給劑)(圖24)，因此驗(yàn)證了Ab1在治療患有體積大于0.5cm之大淋巴瘤塊的動(dòng)物為效的。

實(shí)例19.以CD3xCD20雙特異性抗體治療CD20+黑色素瘤

研究人員已測(cè)定出，在病患中特定的黑色素癌亞群，例如CD20+黑色素腫瘤細(xì)胞，可代表腫瘤起始特癥及較高的疾病再發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(Pinc等人Mol Ther.20(5):1056-1062,2012,epub 2012Feb 21)。CD20xCD3雙特異性抗體Ab1展現(xiàn)對(duì)抗表現(xiàn)CD20之B16F10.9腫瘤細(xì)胞的有效活性，因?yàn)槠湓诿庖?適當(dāng)?shù)男∈笾酗@著地延緩hCD20-轉(zhuǎn)導(dǎo)的B16F10.9(B16F10.9/CD20)腫瘤生長。

CD3之人源化小鼠(人源化CD3γε小鼠)系于CD20位置人源化，使得小鼠表現(xiàn)二種人源化蛋白。將人源化CD3/CD20小鼠以皮下植入2x10⁵個(gè)經(jīng)人類CD20轉(zhuǎn)導(dǎo)的B16F10.9黑色素瘤腫瘤細(xì)胞(K.Peters/Charles Lin；Duke University)。在第0天開始(腫瘤移植當(dāng)天)，將小鼠以每周2次腹膜內(nèi)之媒劑(PBS；n＝5)、0.4mg/kg對(duì)照Ab5(抗不相關(guān)抗原之抗體；n＝5)、0.4mg/kg的Ab1(N＝5)或0.004mg/kg Ab1(n＝5)治療。所測(cè)量的腫瘤體積系如圖25A中所示。當(dāng)腫瘤達(dá)到大于1500mm³體積時(shí)，將小鼠安樂死。如圖25A所示，當(dāng)治療系與腫瘤移植同時(shí)開始時(shí)，以Ab1治療延緩了腫瘤生長。

在一分開的實(shí)驗(yàn)中，亦檢測(cè)Ab1抑制已建立腫瘤之腫瘤生長的能力(圖25B)。將人源化CD3/CD20小鼠以皮下植入2x10⁵個(gè)表現(xiàn)人類CD20之B16F10.9黑色素瘤腫瘤細(xì)胞。在腫瘤移植后的第10天，將小鼠以腫瘤大小為基礎(chǔ)隨機(jī)化并分成下列治療組，每組5只小鼠：媒劑(PBS)、4mg/kg對(duì)照Ab5(抗不相關(guān)抗原之對(duì)照抗體)、4mg/kg的Ab1或0.4mg/kg Ab1。所有的小鼠系以1周2次i.p.治療。當(dāng)腫瘤達(dá)到大于1500mm³體積時(shí)，將小鼠安樂死。如圖25B所示，以Ab1治療延緩了腫瘤已建立腫瘤的生長，其驗(yàn)證了Ab1展現(xiàn)對(duì)抗表現(xiàn)CD20之B16F10.9黑色素瘤細(xì)胞地有效活性。

本發(fā)明并不希望被限制于文中所述的特定實(shí)施例之范圍中。實(shí)際上，由前述說明及伴隨的圖示，各種本發(fā)明之修改對(duì)于熟習(xí)本項(xiàng)技術(shù)者將變得顯而易見。此等修改系希望落在所附的權(quán)利要求內(nèi)。