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發(fā)明背景

特異性抗體用于治療人和其他動(dòng)物的用途是一種強(qiáng)大的工具，其對(duì)于治療許多病況和病癥的非常有效。然而，依然極為需要更有效的靶治療，尤其是具有更高效力和更大治療窗口的靶特異性治療。這些靶特異性治療采用抗體-效應(yīng)模塊綴合物，其中靶向模塊將特異性抗體引向所需的治療部位。這些分子顯示了改進(jìn)的治療指標(biāo)——在臨床環(huán)境中比非靶標(biāo)的抗體更高的效力和/或更低的毒性概貌。然而，此類治療的開發(fā)可能是具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)樵S多因素，包括所述抗體自身的物理和/或結(jié)構(gòu)特性以及連接穩(wěn)定性可能對(duì)疾病靶標(biāo)(例如腫瘤)具有顯著影響，由此降低效力。抗體-效應(yīng)模塊綴合物在循環(huán)中具有高度非特異性結(jié)合和低穩(wěn)定性，其在達(dá)到靶標(biāo)部位前通常會(huì)通過(guò)正常組織清除。此外，具有高藥物載荷的顯著亞群的抗體-效應(yīng)模塊綴合物可生成聚集體，其會(huì)被巨噬細(xì)胞消除，導(dǎo)致較短的半衰期。因此，對(duì)關(guān)鍵流程的控制和改進(jìn)以及預(yù)防并發(fā)癥(如抗體聚集和非特異性抗體介導(dǎo)的毒性)存在增加的需求。

雖然根據(jù)現(xiàn)有方法產(chǎn)生的抗體-效應(yīng)模塊綴合物可能是有效的，但由于使用的綴合化學(xué)通常導(dǎo)致異質(zhì)混合物，因此這種療法的開發(fā)具有挑戰(zhàn)性。例如，由于可用于綴合的抗體中存在許多賴氨酸殘基(～30)這一事實(shí)，因此將效應(yīng)模塊綴合至抗體賴氨酸殘基變得復(fù)雜。由于效應(yīng)模塊綴合于抗體比率(DAR)的最佳數(shù)目對(duì)于最小化抗體的功能喪失低得多(例如約4:1)，賴氨酸綴合通常生成非常異質(zhì)性的概貌。此外，許多賴氨酸位于CDR區(qū)的關(guān)鍵抗原結(jié)合位點(diǎn)且藥物綴合可導(dǎo)致抗體親和力的降低。巰基介導(dǎo)的綴合主要靶向參與鉸鏈二硫鍵的八個(gè)半胱氨酸。然而，預(yù)測(cè)和鑒別八個(gè)半胱氨酸中的哪四個(gè)在不同的制備物中始終綴合仍是困難的。最近，游離半胱氨酸殘基的遺傳工程已能夠?qū)崿F(xiàn)使用基于巰基的化學(xué)進(jìn)行的位點(diǎn)特異性綴合，但這種連接經(jīng)常表現(xiàn)出高度變化的穩(wěn)定性，其接頭經(jīng)歷了與白蛋白和其他含巰基的血清分子的交換反應(yīng)。因此，生成具有限定的綴合位點(diǎn)和穩(wěn)定連接的抗體綴合物的位點(diǎn)特異性綴合策略在使得效應(yīng)模塊綴合同時(shí)將對(duì)抗體結(jié)構(gòu)或功能的不良影響最小化方面是有用的。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供結(jié)合多肽(例如抗體)及其靶向模塊綴合物。在一些實(shí)施方案中，所述綴合物包含在所述結(jié)合多肽的天然或修飾聚糖內(nèi)的位點(diǎn)特異性工程化的靶向-模塊聚糖連接。本發(fā)明還提供編碼抗原結(jié)合多肽的核酸序列、重組表達(dá)載體和用于制備此類抗原結(jié)合多肽的宿主細(xì)胞。還提供了使用本文公開的抗原結(jié)合多肽治療疾病的方法。

因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)修飾聚糖的結(jié)合多肽，所述修飾聚糖包含式(IV)的至少一個(gè)模塊：

其中：

A)Q是NH或O；

B)CON是連接體模塊；

C)X是靶向模塊；

D)Gal是衍生自半乳糖的組件；且

E)Sia是衍生自唾液酸的組件，

其中Sia存在或不存在，且其中所述靶向模塊結(jié)合至細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞選自免疫細(xì)胞、肝細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、血管細(xì)胞、上皮細(xì)胞、或間充質(zhì)細(xì)胞。在又一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞選自B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、或肝癌細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合多肽是由細(xì)胞內(nèi)化的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述由細(xì)胞內(nèi)化的結(jié)合多肽的量大于缺乏被細(xì)胞內(nèi)化的靶向模塊的參考結(jié)合多肽的量。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶向模塊結(jié)合至細(xì)胞上的甘露糖-6-磷酸受體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶向模塊包含甘露糖-6-磷酸(Man 6-P)模塊。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶向模塊結(jié)合至細(xì)胞上的Siglec。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述Siglec是唾液酸粘附素(Siglec-1)、CD22(Siglec-2)、CD33(Siglec-3)、MAG(Siglec-4)、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11、Siglec-12、Siglec-14、或Siglec-15。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶向模塊包含α2,3-、α2,6-、或α2,8-連接的唾液酸殘基。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述靶向模塊包含α2,3-唾液酸乳糖模塊和α2,6-唾液酸乳糖模塊。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶向模塊結(jié)合至C型凝集素受體、半乳凝素、L型凝集素受體或其他糖類受體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述靶向模塊結(jié)合至DEC-205(CD205；淋巴細(xì)胞抗原75)、巨噬細(xì)胞甘露糖受體(MMR；CD206)、Dectin-1、Dectin-2、可由巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的C型凝集素(Mincle)、樹突細(xì)胞特異性ICAM3-抓取非整合素(DC-SIGN、CD209)、DC NK凝集素基團(tuán)受體-1(DNGR-1)、朗格漢斯蛋白(Langerin)(CD207)、凝集素蛋白聚糖(lectican)、去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)、C-凝集素受體樹突細(xì)胞免疫受體(CLEC4A；CLECSF6；DCIR)、巨噬細(xì)胞半乳糖型凝集素(MGL)、DC受體、膠原凝集素、選擇素、NK細(xì)胞受體、多C型凝集素域(CTLD)內(nèi)吞性受體、Reg基團(tuán)(VII型)凝集素、軟骨凝集素、四連接素、多囊蛋白、吸引素(attractin)(ATRN)、嗜酸性粒細(xì)胞主要堿性蛋白(EMBP)、DiGeorge綜合征臨界區(qū)基因2(DGCR2)、血栓調(diào)節(jié)蛋白、Bimlec、基團(tuán)XVI凝集素(SEEC)、或基團(tuán)XVII凝集素(CBCP/Frem1/QBRICK)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，Q是O。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚糖包含如下結(jié)構(gòu)式的至少一個(gè)模塊：

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶向模塊是三價(jià)GalNAc聚糖模塊。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶向模塊是糖肽。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述靶向模塊三-半乳糖基化糖肽，例如乳糖₃-Cys₃Gly₄。

在一個(gè)實(shí)施方案中，存在Sia且所述乳糖₃-Cys₃Gly₄模塊由式V表示：

[式V]。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚糖包含如下結(jié)構(gòu)式的至少一個(gè)模塊：

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚糖包含如下結(jié)構(gòu)式的至少一個(gè)模塊：

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶向模塊是三價(jià)GalNAc聚糖模塊。

在一個(gè)實(shí)施方案中，存在Sia且所述三價(jià)GalNAc聚糖模塊由式VIII表示：

[式VIII]，其中q是1至29的整數(shù)，含本數(shù)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚糖包含至少一個(gè)具有如下結(jié)構(gòu)式的模塊：

其中q是1至29的整數(shù)，含本數(shù)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚糖包含至少一個(gè)具有如下結(jié)構(gòu)式的模塊：

其中q是1至29的整數(shù)，含本數(shù)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述三價(jià)GalNAc聚糖模塊由式VII、式XIII、或式XIV表示：

[式VII]；

[式XIII]；或

[式XIV]。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚糖包含至少一個(gè)選自如下結(jié)構(gòu)式的模塊：

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚糖包含至少一個(gè)選自如下結(jié)構(gòu)式的模塊：

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合多肽包含F(xiàn)c域。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述修飾聚糖經(jīng)所述Fc域的氨基酸位置297處的天冬酰胺殘基而N-連接至該結(jié)合多肽，所述氨基酸位置依據(jù)EU編號(hào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述修飾聚糖經(jīng)所述Fc域的氨基酸位置298處的天冬酰胺殘基而N-連接至該結(jié)合多肽，所述氨基酸位置依據(jù)EU編號(hào)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fc域是人的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合多肽包含CH1域。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述修飾聚糖經(jīng)所述CH1域的氨基酸位置114處的天冬酰胺殘基而N-連接至該結(jié)合多肽，所述氨基酸位置依據(jù)Kabat編號(hào)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接體模塊包括pH敏感性接頭、二硫化物接頭、酶敏感性接頭或其他可切割接頭模塊。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接體模塊包含選自下組的接頭模塊：表2或14所示的接頭模塊。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合多肽是抗體或免疫粘附素。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種制造前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的結(jié)合多肽的方法，該方法包括將式(I)的效應(yīng)模塊與包含氧化聚糖的前體結(jié)合多肽反應(yīng)，所述式(I)為：

NH₂-Q-CON-X

式(I)，

其中：

A)Q是NH或O；

B)CON是連接體模塊；且

C)X是靶向模塊。

在一個(gè)實(shí)施方案中，起始結(jié)合多肽包含如下結(jié)構(gòu)式的至少一個(gè)模塊：

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述起始結(jié)合多肽包含如下結(jié)構(gòu)式的至少一個(gè)模塊：

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述前體結(jié)合多肽包含氧化聚糖，其包含如下結(jié)構(gòu)式的至少一個(gè)模塊：

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述前體結(jié)合多肽包含氧化聚糖，其包含如下結(jié)構(gòu)式的至少一個(gè)模塊：

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含氧化聚糖的前體結(jié)合多肽通過(guò)將包含聚糖的初始結(jié)合多肽與溫和氧化劑反應(yīng)而生成。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述溫和氧化劑是高碘酸鈉。在另一個(gè)實(shí)施方案中，采用不多于1mM的高碘酸鈉。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述溫和氧化劑是半乳糖氧化酶。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制造結(jié)合蛋白的方法包括將如下結(jié)構(gòu)式的效應(yīng)模塊與包含氧化聚糖的前體結(jié)合多肽反應(yīng)：

NH₂-O-CON-X

其中所述氧化聚糖包含如下結(jié)構(gòu)式的至少一個(gè)模塊：

以形成如下結(jié)構(gòu)式的結(jié)合多肽：

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶向模塊是三價(jià)GalNAc聚糖模塊。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述反應(yīng)步驟在包含金屬離子的鹽的存在下進(jìn)行。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述金屬離子是銅離子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述鹽是乙酸銅。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含金屬離子的鹽以至少0.1mM的濃度存在。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含聚糖的結(jié)合多肽包含一個(gè)或兩個(gè)末端唾液酸殘基。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述末端唾液酸殘基通過(guò)用唾液酸轉(zhuǎn)移酶或唾液酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的組合來(lái)處理所述結(jié)合多肽而引入。在一個(gè)實(shí)施方案中，使初始結(jié)合多肽接觸溫和氧化劑從而產(chǎn)生前體結(jié)合多肽或前體結(jié)合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述前體結(jié)合多肽或前體結(jié)合蛋白包含氧化的唾液酸模塊，其包含末端醛。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)修飾聚糖的結(jié)合多肽，所述修飾聚糖包含式(IV)的至少一個(gè)模塊：

其中：

A)Q是NH或O；

B)CON是連接體模塊；且

C)X是乳糖₃-Cys₃Gly₄模塊；

D)Gal是衍生自半乳糖的組件；

E)Sia是衍生自唾液酸的組件，且

其中Sia存在且所述乳糖₃-Cys₃Gly₄模塊由式V表示：

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供組合物，其包含上文所述的結(jié)合多肽及藥學(xué)上可接受的載劑或賦形劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向模塊比結(jié)合多肽的比率等于或大于約4。在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶向模塊比結(jié)合多肽的比率是至少約2。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療對(duì)其有需求的患者的方法，包括施用有效量的所述組合物。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)修飾聚糖的結(jié)合多肽，所述修飾聚糖包含式(IV)的至少一個(gè)模塊：

其中：

A)Q是NH或O；

B)CON是連接體模塊；且

C)X是包含PEG的模塊；

D)Gal是衍生自半乳糖的組件；且

E)Sia是衍生自唾液酸的組件，

其中Sia存在或不存在。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚糖包含至少一個(gè)由式IX或式XI表示的模塊：

[式IX]，其中p具有1至32的值；或

[式XI]，其中p具有1至32的值。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚糖包含至少一個(gè)選自如下結(jié)構(gòu)式的模塊：

其中p具有1至32的值；或

其中p具有1至32的值。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚糖包含至少一個(gè)選自如下結(jié)構(gòu)式的模塊：

其中p具有1至32的值；或

其中p具有1至32的值。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述靶向模塊包含PEG且由式X或式XII表示：

[式X]；或

[式XII]。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚糖包含至少一個(gè)選自如下結(jié)構(gòu)式的模塊：

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚糖包含至少一個(gè)選自如下結(jié)構(gòu)式的模塊：

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述PEG模塊包含單-PEG、雙-PEG、或三-PEG。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述PEG模塊包括3至3.5PEG。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合多肽是抗體或免疫粘附素。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種制造包含至少一個(gè)氧化聚糖的聚乙二醇化結(jié)合多肽的方法，其中該方法包括：(a)將包含至少一個(gè)聚糖的結(jié)合多肽與溫和氧化劑在包含金屬離子的鹽存在下反應(yīng)，以及(b)將氧化的結(jié)合多肽與至少一個(gè)包含PEG的模塊綴合。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述金屬離子是銅離子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述鹽是乙酸銅。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含金屬離子的鹽以至少0.1mM的濃度存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述溫和氧化劑是高碘酸鹽或半乳糖氧化酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)聚糖是修飾聚糖。

在一個(gè)實(shí)施方案中，制造結(jié)合多肽的方法包括：(a)將包含至少一個(gè)修飾聚糖的結(jié)合多肽與溫和氧化劑在包含金屬離子的鹽的存在下反應(yīng)；以及(b)將氧化的結(jié)合多肽與包含PEG的模塊綴合。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述PEG模塊包括單-PEG、雙-PEG、或三-PEG。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)修飾聚糖的結(jié)合多肽，所述修飾聚糖包含式(IV)的至少一個(gè)模塊：

其中：

A)Q是NH或O；

B)CON是連接體模塊；且

C)X是三價(jià)GalNAc聚糖；

D)Gal是衍生自半乳糖的組件；且

E)Sia是衍生自唾液酸的組件；

其中Sia存在或不存在且所述三價(jià)GalNAc聚糖模塊由式VI表示。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白包含選自下組的N-聚糖糖型：G0糖型、G1糖型、和G2糖型。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述N-聚糖糖型選自下組：G1S1糖型、G2S1糖型、G2S2糖型、G1F糖型、G2F糖型、G1S1F糖型、G2S1F糖型、和G2S2F糖型。

附圖簡(jiǎn)述

本發(fā)明的前述內(nèi)容及其他特征和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)如下闡釋性的實(shí)施方案連同附圖的詳細(xì)描述而更完全地得以理解。

圖1(A-C)是抗體藥物綴合物合成的示意圖，其中用肟連接將毒素模塊連接至抗體聚糖的氧化唾液酸殘基。圖1A描繪了在位置Asn297處具有野生型(現(xiàn)存的)糖類和在位置114(依據(jù)Kabat編號(hào))及298(依據(jù)EU編號(hào))處具有工程化的糖基化位點(diǎn)的抗體。圖1B描繪了規(guī)范聚糖結(jié)構(gòu)G1F(左側(cè)，見于圖1A中所示抗體上的位置Asn297處)和G2S1F結(jié)構(gòu)(右側(cè)，見于圖1A中所示抗體上的位置Ala114和Asn298處)。圖1B中所示的聚糖結(jié)構(gòu)具有一些不同的亞基：白色正方形代表GlcNAc，顛倒的白色三角形代表巖藻糖，白色圓圈代表甘露糖，帶陰影的圓圈代表半乳糖，而帶陰影的正立三角形代表唾液酸。圖1C描繪了本發(fā)明的綴合物的制備。在左側(cè)是具有Gal和Sia模塊的初始結(jié)合蛋白。然后用NaIO4氧化，將唾液酸模塊氧化以形成前體結(jié)合蛋白，然后將其與含毒素的模塊反應(yīng)以形成包含式IV的至少一個(gè)模塊的結(jié)合肽。

圖2是考馬斯藍(lán)染色的凝膠，其顯示糖基化突變體的表達(dá)和純化。

圖3描繪了表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其用于評(píng)估αβTCR HEBE1 IgG抗體突變體對(duì)重組人FcγRIIIa(V158&F158)的結(jié)合。

圖4描繪了表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其用于評(píng)估αβTCR HEBE1 IgG抗體突變體對(duì)重組人FcγRI的結(jié)合。

圖5描繪了來(lái)自PBMC的細(xì)胞因子釋放概貌，所述釋放是對(duì)于TNFa、GM-CSF、IFNy和IL10在突變體抗αβTCR抗體的存在下發(fā)生的(第2天)。

圖6描繪了來(lái)自PBMC的細(xì)胞因子釋放概貌，所述釋放是對(duì)于IL6、IL4和IL2在突變體抗αβTCR抗體的存在下發(fā)生的(第2天)。

圖7描繪了來(lái)自PBMC的細(xì)胞因子釋放概貌，所述釋放是對(duì)于TNFa、GM-CSF、IFNy和IL10在突變體抗αβTCR抗體的存在下發(fā)生的(第4天)。

圖8描繪了來(lái)自PBMC的細(xì)胞因子釋放概貌，所述釋放是對(duì)于IL6、IL4和IL2在突變體抗αβTCR抗體的存在下發(fā)生的(第4天)。

圖9(A-B)描繪了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所述實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western印跡(圖9A)和表面等離子體共振(圖9B)研究了2C3突變體的表達(dá)水平。

圖10描繪了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所述實(shí)驗(yàn)研究了PNGase F治療之前和之后2C3突變體的糖基化。

圖11描繪了SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述實(shí)驗(yàn)研究了分離自細(xì)胞培養(yǎng)的2C3突變體上的糖基化位點(diǎn)。

圖12(A-C)描繪了表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其用于評(píng)估修飾的抗CD52對(duì)重組人FcγRIIIa(V158)的結(jié)合。包含F(xiàn)c域中的S298N/Y300S突變的抗CD52用于評(píng)估修飾分子對(duì)CD52肽的結(jié)合(圖12A)、對(duì)FcγRIIIa的結(jié)合(V158，圖12B)、以及對(duì)小鼠FcRn的對(duì)照結(jié)合(圖12C)的效應(yīng)功能。

圖13描繪了表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其研究了2C3突變體的Fc結(jié)合特性。

圖14(A-B)描繪了表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述實(shí)驗(yàn)研究了修飾的抗CD52對(duì)FcγRIIIa(Val158)(如上文所述)和FcγRIIIa(Phe158)二者的結(jié)合。在Fc域中包含S298N/Y300S突變的抗CD52抗體用于評(píng)估修飾分子對(duì)FcγRIIIa(Val158，圖14A)和FcγRIIIa(Phe58，圖14B)的結(jié)合的效應(yīng)功能。

圖15(A-B)描繪了S298N/Y300S突變體和WT 2C3對(duì)照中C1q結(jié)合的分析(圖15A)以及確認(rèn)孔的等同涂覆的Eliza分析(圖15B)。

圖16描繪了等離子體共振實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述實(shí)驗(yàn)測(cè)量了2C3突變體對(duì)CD-52肽741的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。

圖17描繪了等離子體共振實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述實(shí)驗(yàn)比較了WT抗CD-522C3和A114N高糖基化突變體的抗原結(jié)合親和力。

圖18(A-D)描繪了等電聚焦及質(zhì)譜分析電荷表征實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以確定2C3突變體的聚糖含量。

圖19(A-B)描繪了濃度(Octet)和等離子體共振實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述實(shí)驗(yàn)比較了WT抗CD52 2C3和突變體的抗原結(jié)合親和力。

圖20描繪了SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以證明抗TEM1 A114N突變體的額外糖基化。

圖21描繪了A114N抗Her2突變體的SDS-PAGE和疏水相互作用色譜分析的結(jié)果。

圖22描繪了SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以證明PEG經(jīng)氨基氧基連接綴合于2C3A114N突變體。

圖23描繪了LC-MS實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以確定抗TEM1 A114N高糖基化突變體的聚糖含量。

圖24描繪了LC-MS實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以確定野生型HER2抗體和A114N抗Her2高糖基化突變體的聚糖含量。

圖25(A-C)描繪了用于進(jìn)行抗體的位點(diǎn)特異性綴合的示例性方法。

圖26描繪了示例性效應(yīng)模塊的合成：氨基氧基-Cys-MC-VC-PABC-MMAE和氨基氧基-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10。

圖27(A-C)描繪了唾液酸化HER2抗體的表征信息。

圖28(A-D)描繪了氧化唾液酸化抗HER2抗體的表征信息。

圖29描繪了糖綴合物的疏水相互作用色譜，所述糖綴合物用三個(gè)不同的唾液酸化抗體及兩個(gè)不同的氨基氧基基團(tuán)來(lái)制備。

圖30顯示了與用GAM(+)化學(xué)方法制備的AO-MMAE綴合的抗Her2A114糖基化突變體的HIC色譜。

圖31(A-D)描繪了抗HER2糖綴合物與硫醇綴合物的體外效力的比較。

圖32描繪了抗FAP B11糖綴合物和硫醇綴合物的體外效力的比較。

圖33(A-D)描繪了抗HER2糖綴合物和硫醇綴合物在Her2+腫瘤細(xì)胞異種移植模型中的體內(nèi)功效的比較。

圖34描繪了LC-MS實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以確定含有S298N/Y300S突變的突變體抗αβTCR抗體的聚糖含量。

圖35描繪了圓二色性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以確定野生型抗αβTCR抗體的和含有S298N/Y300S突變的突變體抗αβTCR抗體的相對(duì)熱穩(wěn)定性。

圖36描繪了ADC的細(xì)胞增殖測(cè)定法的結(jié)果，所述ADC用帶有A114N高糖基化突變的抗HER抗體和AO-MMAE制備。

圖37是抗體藥物綴合物合成的示意圖，其中用肟連接將靶向模塊連接至抗體聚糖的氧化唾液酸殘基。

圖38是示意圖，其描繪了根據(jù)所描述的方法通過(guò)肟連接將抗體位點(diǎn)特異性綴合至糖肽的示例性方法。

圖39是示意圖，其描繪了通過(guò)天然Fc聚糖中的唾液酸將新聚糖(neoglycan)位點(diǎn)特異性綴合至抗體。

圖40是一系列示例性聚糖，其可用于包括乳糖氨基氧基和雙Man-6-P(bis Man-6-P)(或雙M6P)六甘露糖氨基氧基(對(duì)于氨基氧基綴合)的綴合。

圖41是描繪Man-6-P六甘露糖馬來(lái)酰亞胺的制備的示意圖。

圖42描繪了用兔多克隆抗體進(jìn)行的對(duì)Man-6-P六甘露糖氨基氧基綴合物的SDS-PAGE和MALDI-TOF表征。

圖43描繪了表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估對(duì)照和Man-6-P六甘露糖綴合的兔IgG抗體對(duì)Man-6-P受體的結(jié)合。

圖44描繪了Man-6-P綴合的兔IgG抗體在HepG2和RAW細(xì)胞中的攝取。

圖45描繪了對(duì)照、Man-6-P綴合的、和乳糖綴合的抗體通過(guò)SDS-PAGE和凝集素印跡的表征。

圖46描繪了對(duì)對(duì)照、Man-6-P綴合的、和乳糖綴合的抗體的MALDI-TOF完整蛋白分析的結(jié)果。

圖47描繪了與Man-6-P六甘露糖馬來(lái)酰亞胺綴合(在鉸鏈半胱氨酸處的硫醇綴合)的多克隆抗體的表征，其通過(guò)SDS-PAGE(非還原的和還原的)、凝集素印跡(還原的)、和Man-6-P定量來(lái)進(jìn)行。

圖48描繪了與乳糖馬來(lái)酰亞胺綴合(在鉸鏈半胱氨酸處的硫醇綴合)的多克隆抗體的表征，其通過(guò)SDS-PAGE和半乳糖定量來(lái)進(jìn)行。

圖49描繪了與Man-6-P六甘露糖馬來(lái)酰亞胺綴合(在鉸鏈半胱氨酸處的硫醇綴合)的單克隆抗體的表征，其通過(guò)SDS-PAGE(非還原的和還原的)、和聚糖(雙Man-6-P)定量來(lái)進(jìn)行。

圖50描繪了鉸鏈半胱氨酸多克隆抗體綴合物的大小排阻色譜分析(SEC)的結(jié)果。

圖51描繪了鉸鏈半胱氨酸單克隆抗體綴合物的大小排阻色譜分析(SEC)的結(jié)果。

圖52描繪了唾液酸酶滴定和唾液酸定量的結(jié)果，以確定自NNAS的唾液酸釋放、唾液酸化的NNAS、和去唾液酸化的及半乳糖基化的NNAS抗體的量。

圖53描繪了MALDI-TOF MS分析的結(jié)果，以確定小鼠NNAS抗體和去唾液酸化的和半乳糖基化的NNAS抗體的聚糖結(jié)構(gòu)。

圖54描繪了MALDI-TOF MS分析的結(jié)果，以確定小鼠NNAS抗體和唾液酸化的NNAS抗體的聚糖結(jié)構(gòu)。

圖55描繪了結(jié)合至雙Man-6-P聚糖綴合的(經(jīng)天然Fc聚糖或鉸鏈二硫化物)多克隆和單克隆抗體的Man-6-P受體(CI-MPR)的表征，其用天然PAGE進(jìn)行。

圖56描繪了酶修飾的和糖肽綴合的NNAS抗體的表征，其通過(guò)SDS-PAGE(4-12％NuPAGE；還原的和非還原的)和ECL凝集素印跡(還原的)進(jìn)行。

圖57描繪了NNAS抗體、去唾液酸化的/半乳糖基化的NNAS抗體、和綴合的NNAS抗體中的末端半乳糖定量的結(jié)果，其以mol半乳糖或mol糖肽/mol抗體表示。

圖58描繪了乳糖馬來(lái)酰亞胺的檢查，所述乳糖馬來(lái)酰亞胺用α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶修飾并用20mM NaCl從QAE純化柱洗脫。用MALDI-TOF MS和Dionex HPLC對(duì)所得的洗出液進(jìn)行表征。

圖59(A-B)描繪了綴合有唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺(硫醇反應(yīng))的兔多克隆抗體的表征，其用SDS-PAGE和Dionex HPLC(唾液酸定量)進(jìn)行。

圖60(A-D)描繪了用α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶唾液酸化并用QAE-瓊脂糖柱純化的乳糖馬來(lái)酰亞胺的表征。用Dionex HPLC的分析顯示(圖60A)乳糖基準(zhǔn)(圖60B)α-2,6-唾液酸乳糖基準(zhǔn)；(圖60C)乳糖馬來(lái)酰亞胺基準(zhǔn)；以及(圖60D)洗脫自QAE-瓊脂糖柱的α-2,6-唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺的級(jí)分。

圖61描繪了洗脫自QAE-瓊脂糖柱的α-2,6-唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺的級(jí)分的表征，其用MALDI-TOF MS進(jìn)行。

圖62(A-B)描繪了對(duì)照抗體、α-2,3-唾液酸乳糖聚糖綴合的多克隆抗體、及α-2,6-唾液酸乳糖聚糖綴合的多克隆抗體的表征，其通過(guò)SDS-PAGE和Dionex HPLC進(jìn)行(顯示唾液酸分析的圖)。

圖63描繪了對(duì)照和酶修飾的(去唾液酸化的/半乳糖基化的)NNAS突變抗體的表征，其用SDS-PAGE和凝集素印跡進(jìn)行。

圖64描繪了用多種量的半乳糖氧化酶對(duì)聚乙二醇化的對(duì)照抗體和Gal NNAS通過(guò)還原的和非還原的SDS-PAGE的表征。

圖65描繪了抗體重鏈的估計(jì)的聚乙二醇化的結(jié)果，其來(lái)自先前的用ProteinSimple進(jìn)行的半乳糖氧化酶滴定。

圖66描繪了用相對(duì)抗體多種摩爾過(guò)量(molar excess)的PEG對(duì)聚乙二醇化的對(duì)照抗體及Gal NNAS通過(guò)還原的和非還原的SDS-PAGE的表征。

圖67描繪了抗體重鏈的估計(jì)的聚乙二醇化的結(jié)果，其來(lái)自先前的用ProteinSimple進(jìn)行的PEG滴定。

圖68是氨基氧基糖肽，乳糖₃-Cys₃Gly₄的結(jié)構(gòu)圖。

圖69(A-B)描繪了用半乳糖氧化酶在不存在乙酸銅的情況下(圖69A)和存在變化量的乙酸銅的條件下(圖69A和圖69B)對(duì)聚乙二醇化的對(duì)照抗體和Gal NNAS通過(guò)還原性SDS-PAGE的表征。

圖70描繪了酶修飾的野生型、A114N、NNAS和A114N/NNAS赫賽汀的表征，其通過(guò)SDS-PAGE(4-12％NuPAGE；還原的和非還原的)和ECL凝集素印跡(還原的)進(jìn)行，連同末端半乳糖定量的結(jié)果，其以mol半乳糖/mol抗體表示。

圖71是表格，其描繪了如用Dionex HPLC測(cè)得的野生型和突變抗體的唾液酸含量(以mol/mol表示)。

圖72描繪了野生型和突變抗體的聚乙二醇化通過(guò)還原的和非還原的SDS-PAGE的表征。

圖73是表格，其描繪了用ProteinSimple估計(jì)的野生型和突變抗體的聚乙二醇化(以mol/mol表示)。

圖74是一系列照片，其描繪了HepG2細(xì)胞對(duì)對(duì)照抗體、酶修飾的(用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)抗體、或綴合的(用乳糖氨基氧基或乳糖馬來(lái)酰亞胺)抗體的攝取的免疫熒光染色。

圖75是示例性的三價(jià)GalNAc聚糖的圖示。

圖76描繪了表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其用于評(píng)估三價(jià)GalNAc聚糖綴合的抗體對(duì)ASGPR亞基H1的結(jié)合。

圖77是用于綴合的含有三價(jià)GalNAc的聚糖和含有三價(jià)半乳糖的糖肽的圖示。

圖78描繪了表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其用于評(píng)估三價(jià)GalNAc聚糖綴合的、和含有三價(jià)半乳糖的糖肽綴合的重組溶酶體酶類對(duì)ASGPR亞基H1的結(jié)合。

圖79(A-D)是其他三價(jià)GalNAc聚糖的圖示。

圖80是高碘酸鹽氧化的重組溶酶體酶rhGAA與過(guò)量的三價(jià)GalNAc聚糖C12(以相對(duì)rhGAA 20、40、80、和200倍摩爾過(guò)量的聚糖)的綴合結(jié)果的圖示。描繪了所得的每rhGAA綴合的聚糖。

圖81描繪了與三價(jià)GalNAc聚糖C12綴合的重組溶酶體酶類的ASGPR結(jié)合，其在Biacore上進(jìn)行。與20(綴合物1)、40、80、和200倍(綴合物4)過(guò)量的聚糖綴合的酶都顯示出對(duì)ASGPR亞基1的強(qiáng)結(jié)合。這些綴合物(綴合物1至4)之間的結(jié)合沒有顯著差異。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供結(jié)合多肽(例如抗體)及其效應(yīng)模塊綴合物(例如靶向模塊綴合物)。在一些實(shí)施方案中，所述綴合物包含位點(diǎn)特異性工程化的藥物-聚糖連接，所述連接位于抗原結(jié)合多肽(如IgG分子)的天然或修飾聚糖內(nèi)。本發(fā)明還提供編碼抗原結(jié)合多肽的核酸、重組表達(dá)載體及用于制備抗原結(jié)合多肽的宿主細(xì)胞。還提供了使用本文公開的抗原結(jié)合多肽來(lái)治療疾病的方法。

I.定義

除本文另有定義外，本文所用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的含義。在存在任何歧義情況下，本文提供的定義優(yōu)先于任何字典或外部定義。除上下文另行需要外，單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù)，且復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包含單數(shù)。除有另行說(shuō)明外，使用的“或”意為“和/或”。使用的術(shù)語(yǔ)“包括(including)”以及其他形式如“包括(includes)”和“包括(included)”，是非限制性的。

通常，本文所述使用的關(guān)于細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)及雜交的術(shù)語(yǔ)表是本領(lǐng)域所熟知且普遍使用的那些。本文提供的方法和技術(shù)通常根據(jù)本領(lǐng)域所熟知的常規(guī)方法以及如本說(shuō)明書全文所引用和討論的各種一般和更具體的文獻(xiàn)所述來(lái)進(jìn)行，另有說(shuō)明的除外。酶促反應(yīng)和純化技術(shù)根據(jù)制造商的說(shuō)明來(lái)進(jìn)行，如本領(lǐng)域通常完成的或如本文所述的那樣。本文所述的與分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)、和藥物及制藥化學(xué)相關(guān)的術(shù)語(yǔ)表以及其實(shí)驗(yàn)室方法和技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知且普遍使用的那些。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、配制、和遞送，及患者的治療。

為使本發(fā)明更易于理解，選擇的術(shù)語(yǔ)定義如下。

術(shù)語(yǔ)“多肽”意指任何聚合的氨基酸鏈且涵蓋天然或人工的蛋白、多肽類似物或蛋白序列變體或其片段，與本文上下文相沖突的除外。多肽可以是單體的或多聚的。對(duì)于抗原多肽，多肽片段任選地含有至少一個(gè)連續(xù)的或非線性的多肽表位。所述至少一個(gè)表位片段的準(zhǔn)確邊界可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)來(lái)確證。多肽片段包含例如至少約5個(gè)連續(xù)氨基酸、至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸、至少約15個(gè)連續(xù)氨基酸、或至少約20個(gè)連續(xù)氨基酸。

術(shù)語(yǔ)“分離蛋白”或“分離多肽”意指是指由于其來(lái)源或衍生來(lái)源與在其天然狀態(tài)下伴隨它的天然相關(guān)組分不相關(guān)的蛋白或多肽；基本上不含來(lái)自相同物種的其它蛋白；由來(lái)自不同物種的細(xì)胞表達(dá)；或不在自然界中形成。因此，在與其天然起源的細(xì)胞不同的細(xì)胞系統(tǒng)中化學(xué)合成或合成的蛋白或多肽是從其天然相關(guān)組分“分離”的。蛋白或多肽也可以通過(guò)使用本領(lǐng)域熟知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)分離從而基本上不含天然相關(guān)組分。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合蛋白”或“結(jié)合多肽”應(yīng)指含有至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的蛋白或多肽(例如抗體或其片段)，所述結(jié)合位點(diǎn)負(fù)責(zé)選擇性結(jié)合至目的靶抗原(例如人抗原)。示例性結(jié)合位點(diǎn)包括抗體可變域、受體的配體結(jié)合位點(diǎn)、或配體的受體結(jié)合位點(diǎn)。在一些方面，結(jié)合蛋白或結(jié)合多肽包含多個(gè)(例如兩個(gè)，三個(gè)，四個(gè)或更多個(gè))結(jié)合位點(diǎn)。在一些方面，所述結(jié)合蛋白或結(jié)合多肽不是治療性的酶。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“天然殘基”應(yīng)指在結(jié)合多肽(例如抗體或其片段)的具體氨基酸位置處天然存在且未經(jīng)人工修飾、引入或改變的氨基酸殘基。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“改變的結(jié)合蛋白”，“改變的結(jié)合多肽”，“修飾的結(jié)合蛋白”或“修飾的結(jié)合多肽”應(yīng)指這樣的結(jié)合多肽和/或結(jié)合蛋白(例如抗體或其片段)，其相對(duì)于天然(即野生型)氨基酸序列包含至少一個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或添加，和/或相對(duì)于天然(即野生型)氨基酸序列在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處包含導(dǎo)致改變的糖基化(例如高糖基化、低糖基化和/或非糖基化)的突變。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“初始結(jié)合多肽”或“初始結(jié)合蛋白”應(yīng)指與溫和氧化劑接觸以分別產(chǎn)生“前體結(jié)合多肽”或“前體結(jié)合蛋白”(參見圖1A-C)的結(jié)合多肽或結(jié)合蛋白。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“前體結(jié)合多肽”或“前體結(jié)合蛋白”應(yīng)指可與本文所述的一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)模塊反應(yīng)的輕度氧化多肽或蛋白。在一些實(shí)施方案中，初始結(jié)合多肽、初始結(jié)合蛋白、前體結(jié)合多肽和/或前體結(jié)合蛋白(例如抗體或其片段)含有至少一個(gè)負(fù)責(zé)選擇性結(jié)合至目的靶抗原(例如人抗原)的結(jié)合位點(diǎn)。示例性結(jié)合位點(diǎn)包括抗體可變域、受體的配體結(jié)合位點(diǎn)、或配體的受體結(jié)合位點(diǎn)。在一些方面，初始結(jié)合多肽、初始結(jié)合蛋白、前體結(jié)合多肽、和/或前體結(jié)合蛋白包含多個(gè)(例如兩個(gè)，三個(gè)，四個(gè)或更多個(gè))結(jié)合位點(diǎn)。在一些方面，初始結(jié)合多肽，初始結(jié)合蛋白，前體結(jié)合多肽、和/或前體結(jié)合蛋白不是治療性的酶。初始結(jié)合多肽、初始結(jié)合蛋白、前體結(jié)合多肽、和/或前體結(jié)合蛋白可以具有野生型序列，或者其可相對(duì)于天然(即野生型)氨基酸序列包含至少一個(gè)氨基酸取代，缺失和/或添加，和/或相對(duì)于天然(即野生型)氨基酸序列在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處包含導(dǎo)致改變的糖基化(例如，高糖基化、低糖基化和/或非糖基化)的突變。

術(shù)語(yǔ)“配體”是指能夠結(jié)合另一種物質(zhì)或被另一種物質(zhì)結(jié)合的任何物質(zhì)。類似地，術(shù)語(yǔ)“抗原”是指針對(duì)其可以產(chǎn)生抗體的任何物質(zhì)。盡管“抗原”通常用于指抗體結(jié)合底物，而當(dāng)提及受體結(jié)合底物時(shí)通常使用“配體”，但是這些術(shù)語(yǔ)彼此不區(qū)分，并且涵蓋寬范圍的重疊化學(xué)實(shí)體。為了免生疑問(wèn)，抗原和配體在本文全文中可互換地使用?？乖?配體可以是肽、多肽、蛋白質(zhì)、適配體、多糖、糖分子、糖類、脂質(zhì)、寡核苷酸、多核苷酸、合成分子、無(wú)機(jī)分子、有機(jī)分子，及其任何組合。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”意指抗體或其抗原結(jié)合片段以至多約1x10^-6M、1x10^-7M、1x10^-8M、1x10^-9M、1x10^-10M、1x10^-11M、1x10^-12M或更低的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合至抗原的能力，和/或以作為其對(duì)非特異性抗原的親和力的至少兩倍高的親和力結(jié)合至抗原的能力。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”是指對(duì)目的抗原(例如腫瘤相關(guān)抗原)具有顯著的已知特異性免疫反應(yīng)活性的物質(zhì)集合(assemblies)(例如完整抗體分子、抗體片段、或其變體)?？贵w和免疫球蛋白包含輕鏈和重鏈，在它們之間具有或不具有鏈間共價(jià)鍵。脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中的基本免疫球蛋白結(jié)構(gòu)是相對(duì)較為了解的。

如下文將更詳細(xì)討論的，通用術(shù)語(yǔ)“抗體”包括可以生物化學(xué)鑒定的五種不同類別的抗體。盡管所有五類抗體都清楚地在本公開的范圍內(nèi)，但是以下討論通常針對(duì)IgG類的免疫球蛋白分子。對(duì)于IgG，免疫球蛋白包含兩條相同的分子量約為23,000道爾頓的輕鏈，以及兩條相同的分子量53,000-70,000的重鏈。四條鏈通過(guò)二硫鍵以“Y”構(gòu)型連接，其中輕鏈從“Y”的開口處開始將重鏈括在內(nèi)并經(jīng)可變域延續(xù)。

免疫球蛋白的輕鏈分類為κ或λ(κ，λ)。每個(gè)重鏈類別可以與κ或λ輕鏈結(jié)合。一般來(lái)說(shuō)，輕鏈和重鏈彼此共價(jià)鍵合，并且當(dāng)免疫球蛋白由雜交瘤、B細(xì)胞、或遺傳工程化的宿主細(xì)胞生成時(shí)，兩條重鏈的“尾部”部分通過(guò)共價(jià)二硫鍵或非共價(jià)鍵相互鍵合。在重鏈中，氨基酸序列從Y構(gòu)型的叉形末端處的N末端延伸到每條鏈底部的C末端。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解的是，重鏈分類為γ、μ、α、δ、或ε(γ、μ、α、δ、ε)，其中有一些亞類(例如γl-γ4)。這種鏈的性質(zhì)決定了抗體的“類別”分別為IgG，IgM，IgA，IgG或IgE。免疫球蛋白同種型亞類(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1等)已得到充分表征并且已知賦予功能特異性化?？紤]到本發(fā)明的內(nèi)容，這些類別和同種型的每一個(gè)的修飾版本對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是容易識(shí)別的，因此其在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

將輕鏈和重鏈二者均劃分為結(jié)構(gòu)和功能同源性區(qū)。術(shù)語(yǔ)“區(qū)”意指免疫球蛋白或抗體鏈的部件或部分，且包括恒定區(qū)或可變區(qū)，以及所述區(qū)域的更多的不連續(xù)的部件或部分。例如，輕鏈可變區(qū)包括“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”，其散布于“框架區(qū)”或“FR”之中，如本文所定義的。

免疫球蛋白重鏈或輕鏈的區(qū)域可以定義為“恒定”(C)區(qū)或“可變”(V)區(qū)，其在“恒定區(qū)”的情況下是基于各種類型成員的區(qū)域內(nèi)相對(duì)缺乏序列變異性，而在“可變區(qū)”的情況下則是基于各種類成員的區(qū)域內(nèi)的顯著變化。術(shù)語(yǔ)“恒定區(qū)”和“可變區(qū)”也可以在功能上使用。就這一點(diǎn)而言，應(yīng)當(dāng)理解免疫球蛋白或抗體的可變區(qū)決定抗原識(shí)別和特異性。相反，免疫球蛋白或抗體的恒定區(qū)賦予重要的效應(yīng)功能，如分泌、經(jīng)胎盤運(yùn)動(dòng)性、Fc受體結(jié)合、補(bǔ)體結(jié)合等。各種免疫球蛋白類別的恒定區(qū)的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是已知的。

免疫球蛋白重鏈和輕鏈的恒定區(qū)和可變區(qū)折疊成結(jié)構(gòu)域。術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”是指包含通過(guò)例如β-折疊片層和/或鏈內(nèi)二硫鍵而穩(wěn)定化的肽環(huán)(例如包含3至4個(gè)肽環(huán))的重鏈或輕鏈的球狀區(qū)域。免疫球蛋白輕鏈上的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可互換地稱為“輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域”，“CL區(qū)”或“CL域”。重鏈上的恒定域(例如鉸鏈，CH1，CH2或CH3域)可互換地稱為“重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域”，“CH”區(qū)結(jié)構(gòu)域或“CH域”。輕鏈上的可變域可互換地稱為“輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域”，“VL區(qū)結(jié)構(gòu)域”或“VL域”。重鏈上的可變域可互換地稱為“重鏈可變區(qū)結(jié)果域”、“VH區(qū)結(jié)構(gòu)域”或“VH域”。

按照慣例，可變恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的編號(hào)隨著它們愈加遠(yuǎn)離免疫球蛋白或抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)或氨基末端而增加。每個(gè)重和輕免疫球蛋白鏈的N末端是可變區(qū)，并且在C末端是恒定區(qū)；CH3和CL域?qū)嶋H上分別包含重鏈和輕鏈的羧基末端。因此，輕鏈免疫球蛋白的域以VL-CL方向排列，而重鏈的域以VH-CH1-鉸鏈-CH2-CH3方向排列。

重鏈恒定區(qū)中的氨基酸位置(包括CH1，鉸鏈，CH2，CH3和CL域中的氨基酸位置)可根據(jù)Kabat索引編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)(參見Kabat等，"Sequences of Proteins of Immunological Interest",U.S.Dept.Health and Human Services,第五版,1991)?；蛘?，可根據(jù)EU索引編號(hào)系統(tǒng)對(duì)抗體氨基酸位置進(jìn)行編號(hào)(參見Kabat等，同上)。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“VH域”包含免疫球蛋白重鏈的氨基末端可變結(jié)構(gòu)域，而術(shù)語(yǔ)“VL域”包含免疫球蛋白輕鏈的氨基末端可變結(jié)構(gòu)域。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“CH1域”包含免疫球蛋白重鏈的第一(大部分氨基末端)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，其例如從Kabat編號(hào)系統(tǒng)中的約位置114-223(EU位置118-215)延伸。CH1域與免疫球蛋白重鏈分子的VH域且氨基末端與鉸鏈區(qū)相鄰，并且不形成免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)的一部分。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“鉸鏈區(qū)”包含將CH1域連接至CH2域的重鏈分子的部分。該鉸鏈區(qū)包含約25個(gè)殘基并且是柔性的，因此允許兩個(gè)N末端抗原結(jié)合區(qū)獨(dú)立移動(dòng)。鉸鏈區(qū)可以細(xì)分為三個(gè)不同的域：上、中、和下鉸鏈域(Roux等，J.Immunol.1998,161:4083)。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“CH2結(jié)構(gòu)域”包含例如從Kabat編號(hào)系統(tǒng)中的約位置244-360(EU位置231-340)延伸的重鏈免疫球蛋白分子的部分。CH2域是獨(dú)特的，因?yàn)樗慌c另一個(gè)域緊密配對(duì)。相反，兩條N-連接的支鏈糖鏈插入完整天然IgG分子的兩個(gè)CH2域之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含來(lái)源于IgG1分子(例如人IgG1分子)的CH2域。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“CH3域”包含重鏈免疫球蛋白分子的部分，其從CH2結(jié)構(gòu)域的N末端延伸約110個(gè)殘基，例如從Kabat編號(hào)系統(tǒng)的約位置361-476(EU位置341-445)。CH3域通常形成抗體的C末端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，另外的域可以自CH3域延伸以形成分子的C-末端部分(例如IgM的μ鏈和IgE的e鏈中的CH4域)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含來(lái)源于IgG1分子(例如人IgG1分子)的CH3域。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“CL域”包含例如從約Kabat位置107A-216延伸的免疫球蛋白輕鏈的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。CL域與VL域相鄰。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的結(jié)合多肽包含來(lái)源于κ輕鏈(例如人κ輕鏈)的CL域。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“Fc區(qū)”定義為開始于緊接在木瓜蛋白酶切割位點(diǎn)上游的鉸鏈區(qū)中且結(jié)束于抗體的C末端的重鏈恒定區(qū)的部分(即IgG中的殘基216，取重鏈恒定區(qū)的第一殘基為114)。因此，完整Fc區(qū)至少包含鉸鏈域、CH2域和CH3域。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“天然Fc”是指包含由抗體消化產(chǎn)生或通過(guò)其它方式產(chǎn)生的非抗原結(jié)合片段的序列的分子，無(wú)論其是單體形式還是多聚體形式，并且可以含有鉸鏈區(qū)。天然Fc的最初免疫球蛋白來(lái)源通常是人來(lái)源的，并且可以是任何免疫球蛋白，例如IgG1和IgG2。天然Fc分子由單體多肽組成，所述單體多肽可通過(guò)共價(jià)(即二硫鍵)和非共價(jià)連結(jié)而連接成二聚體或多聚體形式。根據(jù)其類別(例如IgG、IgA和IgE)或亞類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)，天然Fc分子的單體亞基之間的分子間二硫鍵的數(shù)目范圍為1至4。天然Fc的一個(gè)實(shí)例是由木瓜蛋白酶消化IgG產(chǎn)生的二硫鍵結(jié)合的二聚體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“天然Fc”通用于單體、二聚體和多聚體形式。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“Fc變體”是指從天然Fc修飾但仍包含挽救(salvage)受體FcRn(新生Fc受體)的結(jié)合位點(diǎn)的分子或序列。示例性的Fc變體及其與補(bǔ)救受體的相互作用是本領(lǐng)域已知的。因此，術(shù)語(yǔ)“Fc變體”可以包含從非人天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以被去除的區(qū)域，因?yàn)樗鼈兲峁┝吮景l(fā)明中特征的抗體樣結(jié)合多肽所不需要的結(jié)構(gòu)特征或生物活性。因此，術(shù)語(yǔ)“Fc變體”包含分子或序列，其缺少一個(gè)或多個(gè)天然Fc位點(diǎn)或殘基或其中一個(gè)或多個(gè)Fc位點(diǎn)或殘基經(jīng)修飾從而影響或涉及如下：(1)二硫鍵形成，(2)與所選宿主細(xì)胞的不相容性，(3)在所選宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)的N-末端異質(zhì)性，(4)糖基化，(5)與補(bǔ)體相互作用，(6)結(jié)合至除挽救受體之外的Fc受體，或(7)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“Fc結(jié)構(gòu)域”涵蓋上文定義的天然Fc和Fc變體和序列。與Fc變體和天然Fc分子一樣，術(shù)語(yǔ)“Fc域”包括單體或多聚體形式的分子，無(wú)論其是從完整抗體消化產(chǎn)生還是通過(guò)其它方式產(chǎn)生。

如上所指示的，抗體的可變區(qū)允許其選擇性識(shí)別和特異性結(jié)合抗原上的表位。也就是說(shuō)，抗體的VL域和VH域組合以形成限定三維抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)(Fv)。這種四級(jí)抗體結(jié)構(gòu)形成存在于Y的每個(gè)臂的末端的抗原結(jié)合位點(diǎn)。更具體地，抗原結(jié)合位點(diǎn)由每個(gè)重鏈和輕鏈可變區(qū)上的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)所定義。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合位點(diǎn)”包括特異性結(jié)合(與之發(fā)生免疫反應(yīng))抗原(例如細(xì)胞表面或可溶性抗原)的位點(diǎn)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)包括免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)，由這些可變區(qū)形成的結(jié)合位點(diǎn)決定了抗體的特異性。抗原結(jié)合位點(diǎn)由可變區(qū)形成，所述可變區(qū)在不同抗體中各不相同。本發(fā)明的改變的抗體包含至少一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含提供結(jié)合多肽與所選抗原的結(jié)合的至少兩個(gè)抗原結(jié)合域?？乖Y(jié)合域不需要來(lái)源于相同的免疫球蛋白分子。在這方面，可變區(qū)可以或來(lái)源于可被誘導(dǎo)發(fā)生體液應(yīng)答并產(chǎn)生針對(duì)所需抗原的免疫球蛋白的任何類型的動(dòng)物。如此，結(jié)合多肽的可變區(qū)可以是例如哺乳動(dòng)物來(lái)源的，例如可以是人、小鼠、大鼠、山羊、綿羊、非人靈長(zhǎng)類(例如食蟹猴、獼猴等)、狼、或駱駝科動(dòng)物(例如來(lái)自駱駝，美洲駝和相關(guān)物種)。

在天然存在的抗體中，存在于每個(gè)單體抗體上的六個(gè)CDR是短的、非連續(xù)的氨基酸序列，當(dāng)抗體在水性環(huán)境中呈現(xiàn)其三維構(gòu)型時(shí)，其被特異性定位以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。重和輕可變域的剩余部分在氨基酸序列中顯示出較小的分子間變異性，并被稱為框架區(qū)?？蚣軈^(qū)主要采取β-折疊構(gòu)象，并且CDR形成環(huán)，其連接β-折疊結(jié)構(gòu)，并在一些情況下形成β-折疊結(jié)構(gòu)的一部分。因此，這些框架區(qū)起作用以形成支架，所述支架通過(guò)鏈間非共價(jià)相互作用使六個(gè)CDR以正確的方向定位。由定位的CDR形成的抗原結(jié)合域限定與免疫反應(yīng)性抗原上的表位互補(bǔ)的表面。該互補(bǔ)表面促進(jìn)抗體與免疫反應(yīng)性抗原表位的非共價(jià)結(jié)合。

示例性結(jié)合多肽包括抗體變體。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“抗體變體”包括合成和工程化形式的抗體，其經(jīng)改變從而使其不是天然存在的，例如包含至少兩個(gè)重鏈部分而不是兩個(gè)完整重鏈的抗體(例如缺失型抗體或微型抗體)；經(jīng)改變以結(jié)合至兩種或更多種不同抗原或結(jié)合至單一抗原上的不同表位的多特異性形式(例如雙特異性，三特異性等)的抗體；連接至scFv分子的重鏈分子等。此外，術(shù)語(yǔ)“抗體變體”包括結(jié)合至相同抗原的三個(gè)，四個(gè)或更多個(gè)拷貝的多價(jià)形式的抗體(例如三價(jià)，四價(jià)等抗體)。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“價(jià)”是指多肽中潛在的靶結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量。每個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合一個(gè)靶分子或靶分子上的一個(gè)特異性位點(diǎn)。當(dāng)多肽包含多于一個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，每個(gè)靶結(jié)合位點(diǎn)可特異性結(jié)合相同或不同的分子(例如可結(jié)合至不同配體或不同抗原，或相同抗原上的不同表位)。所述結(jié)合多肽通常具有至少一個(gè)特異性針對(duì)人抗原分子的結(jié)合位點(diǎn)。

術(shù)語(yǔ)“特異性”是指特異性結(jié)合(例如與之發(fā)生免疫反應(yīng))給定靶抗原(例如人靶抗原)的能力。結(jié)合多肽可以是單特異性的并且含有特異性結(jié)合靶標(biāo)的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，或者多肽可以是多特異性的并且含有特異性結(jié)合相同或不同靶標(biāo)的兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合多肽特異性針對(duì)相同靶標(biāo)的兩個(gè)不同(例如非重疊的)部分。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合多肽特異性針對(duì)多于一個(gè)的靶標(biāo)。包含結(jié)合至腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的示例性結(jié)合多肽(例如抗體)是本領(lǐng)域已知的，并且來(lái)自此類抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR可以包含在本發(fā)明表征的抗體中。

術(shù)語(yǔ)“連接模塊”包括能夠?qū)⑿?yīng)模塊連接至本文公開的結(jié)合多肽的模塊。可以對(duì)連接模塊加以選擇使得其是可切割的(例如可酶促切割或pH敏感性的)或不可切割的。示例性的連接模塊示于本文表2中。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“效應(yīng)模塊”包括具有生物或其他功能活性的試劑(例如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類、糖肽，及其片段)。例如，包含與結(jié)合多肽綴合的效應(yīng)模塊的修飾結(jié)合多肽與未綴合的抗體相比具有至少一種額外的功能或特性。例如，細(xì)胞毒性藥物(例如效應(yīng)模塊)與結(jié)合多肽的綴合導(dǎo)致具有藥物細(xì)胞毒性的結(jié)合多肽的形成，作為第二功能(即除了抗原結(jié)合之外)。在另一個(gè)實(shí)例中，第二結(jié)合多肽與結(jié)合多肽的綴合可以賦予額外的結(jié)合特性。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)效應(yīng)模塊是遺傳編碼的治療或診斷蛋白或核酸時(shí)，可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的肽合成或重組DNA方法來(lái)合成或表達(dá)所述效應(yīng)模塊。在另一個(gè)方面，當(dāng)效應(yīng)模塊是非遺傳編碼的肽或藥物模塊時(shí)，所述效應(yīng)模塊可以從天然來(lái)源純化或人工合成而得。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“藥物模塊”包括抗炎，抗癌，抗感染(例如抗真菌，抗細(xì)菌，抗寄生蟲，抗病毒等)和麻醉治療劑。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述藥物模塊是抗癌劑或細(xì)胞毒性劑?？上嗳莸乃幬锬K還可以包括前藥。示例性的效應(yīng)模塊示于本文表1中。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“溫和氧化”是指接受來(lái)自另一物質(zhì)的電子(從而自身被還原)但不非常強(qiáng)烈地吸引那些電子的試劑。溫和氧化劑的實(shí)例包括但不限于高碘酸鹽氧化酶和半乳糖氧化酶。

在一些實(shí)施方案中，“效應(yīng)模塊”包含“靶向模塊”。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“靶向模塊”是指結(jié)合至靶分子的效應(yīng)模塊。靶向模塊可以包括但不限于蛋白質(zhì)，核酸，脂質(zhì)，糖類(例如聚糖)，及其組合(例如糖蛋白，糖肽和糖脂)。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“前藥”是指藥物活性劑的前體或衍生物形式，其與母體藥物相比具有較低的活性、反應(yīng)性或易于產(chǎn)生副作用，并且能夠被酶促活化或以其它方式轉(zhuǎn)變?yōu)樵隗w內(nèi)更具活性的形式。與本發(fā)明的組合物相容的前藥包括但不限于含磷酸酯的前藥，含氨基酸的前藥，含硫代磷酸酯的前藥，含硫酸酯的前藥，含肽的前藥，含β-內(nèi)酰胺的前藥，任選取代的含苯氧基乙酰胺的前藥或任選取代的含苯乙酰胺的前藥，5-氟胞嘧啶和可以轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚缘臒o(wú)細(xì)胞毒性藥物的其它5-氟尿苷前藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)所需的藥物模塊或其前藥進(jìn)行化學(xué)修飾，以使該化合物的反應(yīng)更便于制備本發(fā)膜的修飾結(jié)合多肽的目的。藥物模塊還包括本文所述藥物模塊的衍生物、藥學(xué)上可接受的鹽、酯、酰胺和醚。衍生物包括對(duì)本文鑒定的藥物的修飾，其可改進(jìn)或不顯著降低具體藥物的所需治療活性。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“抗癌劑”包括對(duì)贅生細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或增殖有害并可用于減少、抑制或破壞惡性腫瘤的試劑。此類試劑的實(shí)例包括但不限于細(xì)胞抑制劑(cytostatic agent)，烷化劑，抗生素，細(xì)胞毒性核苷，微管蛋白結(jié)合劑，激素，激素拮抗劑，細(xì)胞毒性劑等。細(xì)胞毒劑包括托馬霉素(tomaymycin)衍生物，美登素(maytansine)衍生物，隱球菌素(cryptophycine)衍生物，蒽環(huán)霉素衍生物，二磷酸鹽衍生物，細(xì)霉素衍生物，鏈黑菌素(streptonigrin)衍生物，澳瑞他汀(auristatine)衍生物和多卡霉素(duocarmycin)衍生物。作用于延緩或減慢免疫反應(yīng)性細(xì)胞或惡性細(xì)胞生長(zhǎng)的任何藥劑均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗原”或“靶抗原”是指能夠被結(jié)合多肽的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的分子或分子的一部分。靶抗原可以具有一個(gè)或多個(gè)表位。

術(shù)語(yǔ)“鹽”包括金屬離子。例如，金屬離子包括但不限于通常價(jià)態(tài)的堿金屬(Ia族)例如鋰、鈉和鉀，堿土金屬(IIa族)例如鎂和鈣、過(guò)渡金屬例如銅、鋅、鎳、鐵和錳。金屬的示例性的通常價(jià)態(tài)包括例如鈉(I)，鈣(II)，鎂(II)，鋅(II)，銅(I)和銅(II)。包含金屬離子的示例性鹽包括但不限于乙酸銅(II)(Cu₂(OAc)₄)，乙酸鋅(II)(Zn₂(OAc)₄)，氯化鐵(Fe₃Cl₃)和氯化鈣(CaCl₂)。

II.結(jié)合多肽

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含糖基化域(例如糖基化恒定域)的結(jié)合多肽(例如抗體，抗體片段，抗體變體和融合蛋白)。本文公開的結(jié)合多肽涵蓋任何包含具有N-連接的糖基化位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域的結(jié)合多肽。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合多肽是抗體或其片段或衍生物。來(lái)自任何來(lái)源或物種的任何抗體均可用于本文公開的結(jié)合多肽。合適的抗體包括但不限于人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。

在一些實(shí)施方案中，糖基化域是Fc域。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)EU編號(hào)，糖基化域是N297處的天然糖基化域。

在其他實(shí)施方案中，糖基化域是工程化的糖基化域。Fc域中示例性的工程化糖基化域包含根據(jù)EU編號(hào)氨基酸位置298處的天冬酰胺殘基，和/或根據(jù)EU編號(hào)氨基酸位置300處的絲氨酸或蘇氨酸殘基。

來(lái)自任何免疫球蛋白類別(例如IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)和物種的Fc域均可用于本文公開的結(jié)合多肽中。還可以使用包含來(lái)自不同物種或Ig類別的Fc域的嵌合Fc域。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)c域是人IgG1 Fc域。在人IgG1 Fc域的情況下，Kabat位置298處的野生型氨基酸突變?yōu)樘於０?，以及Kabat位置300處突變?yōu)榻z氨酸或蘇氨酸，導(dǎo)致形成N-連接的糖基化共有位點(diǎn)(即N-X-T/S序列段，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸)。然而，在其他物種和/或Ig類別或同種型的Fc域的情況下，技術(shù)人員會(huì)理解如果存在脯氨酸殘基，則可為必需的是突變Fc結(jié)構(gòu)域的Kabat位置299以再生成N-X-T/S序列段。

在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一個(gè)具有N-連接的糖基化位點(diǎn)的CH1域的結(jié)合多肽(例如抗體，抗體片段，抗體變體和融合蛋白)。根據(jù)Kabat編號(hào)，這種示例性的結(jié)合多肽可以包含例如位置114處的工程化的糖基化位點(diǎn)。

來(lái)自任何免疫球蛋白類別(例如IgM，IgG，IgD，IgA和IgE)和物種的CH1域均可以用于本文公開的結(jié)合多肽。還可以使用包含來(lái)自不同物種或Ig類別的CH1域的部分的嵌合CH1域。在一些實(shí)施方案中，CH1域是人IgG1CH1域。在人IgG1域的情況下，位置114處的野生型氨基酸突變?yōu)樘於０穼?dǎo)致形成N-連接的糖基化共有位點(diǎn)(即N-X-T/S序列段，其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)。然而，在其他物種和/或Ig類別或同種型的其他CH1域情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，可為必需的是突變CH1域的位置115和/或116以生成N-X-T/S序列段。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽可以包含抗體的抗原結(jié)合片段。術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合片段”是指免疫球蛋白或抗體的多肽片段，所述多肽片段結(jié)合抗原或與完整抗體(即與其來(lái)源的完整抗體)競(jìng)爭(zhēng)抗原結(jié)合(即特異性結(jié)合)?？乖Y(jié)合片段可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的重組或生物化學(xué)方法產(chǎn)生。示例性的抗原結(jié)合片段包括Fv、Fab、Fab'和(Fab')2。在示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗原結(jié)合片段是包含至少一個(gè)工程化的糖基化位點(diǎn)的改變的抗原結(jié)合片段。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的改變的抗原結(jié)合片段包含上文所述的改變的VH域。在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的改變的抗原結(jié)合片段包含所述的改變的CH1域。

在示例性實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含單鏈可變區(qū)序列(ScFv)。單鏈可變區(qū)序列包含具有一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的單一多肽，例如通過(guò)柔性接頭與VH域連接的VL域。ScFv分子可以采取VH-接頭-VL方向或VL-接頭-VH方向來(lái)構(gòu)建。連接組成抗原結(jié)合位點(diǎn)的VL和VH域的柔性鉸鏈包含約10至約50個(gè)氨基酸殘基。連接肽是本領(lǐng)域已知的。結(jié)合多肽可以包含至少一個(gè)scFv和/或至少一個(gè)恒定區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽可以包含至少一個(gè)連接至或融合至抗體或片段的scFv，所述抗體或片段包含CH1域(例如在Kabat位置114/EU位置118處包含天冬酰胺殘基的CH1域)和/或CH2域(例如在EU位置298處包含天冬酰胺殘基，和在EU位置300處包含絲氨酸或蘇氨酸殘基的CH2域)。

在一些示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽是通過(guò)將編碼抗體的DNA序列與ScFv分子(例如改變的ScFv分子)融合而產(chǎn)生的多價(jià)(例如四價(jià))抗體。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，將這些序列進(jìn)行組合，從而使得ScFv分子(例如改變的ScFv分子)在其N末端或C末端經(jīng)柔性接頭(例如gly/ser接頭)連接至抗體的Fc片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的四價(jià)抗體可以通過(guò)如下方式制得：將ScFv分子融合至與CH1(例如在Kabat位置114/EU位置118處包含天冬酰胺殘基的CH1域)域融合的連接肽以構(gòu)建ScFv-Fab四價(jià)分子。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽是改變的微型抗體。本發(fā)明的改變的微型抗體是由兩條多肽鏈組成的二聚體分子，每條多肽鏈包含ScFv分子(例如包含上述改變的VH域的改變的ScFv分子)，其通過(guò)連接肽與CH3域或其部分融合。可以通過(guò)使用本領(lǐng)域中描述的方法來(lái)構(gòu)建ScFv組分和連接肽-CH3組分來(lái)制備微抗體(參見例如美國(guó)專利5,837,821或WO 94/09817Al。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以構(gòu)建四價(jià)微型抗體。四價(jià)微型抗體可以與微型抗體相同的方式構(gòu)建，除了兩個(gè)ScFv分子使用柔性接頭連接以外。然后將連接的scFv-scFv構(gòu)建體連接至CH3域。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的結(jié)合多肽包含雙抗體。雙抗體是二聚體四價(jià)分子，每個(gè)所述分子具有類似于scFv分子的多肽，但通常具有連接兩個(gè)可變域的短(少于10個(gè)，例如1-5個(gè))氨基酸殘基接頭，從而使得相同的多肽鏈上的VL和VH域不能相互作用。相反，一條多肽鏈的VL和VH域(分別)與第二條多肽鏈上的VH和VL域相互作用(參見例如WO 02/02781)。本公開的雙抗體包含與CH3域融合的scFv分子。

在其他實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含多特異性或多價(jià)抗體，其包含相同多肽鏈上串聯(lián)的一個(gè)或多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，例如串聯(lián)的可變域(TVD)多肽。示例性的TVD多肽包括美國(guó)專利號(hào)5,989,830中描述的“雙頭”或“雙-Fv”構(gòu)型。在雙-Fv構(gòu)型中，兩個(gè)不同抗體的可變域以串聯(lián)方向在兩條分離的鏈(一條重鏈和一條輕鏈)上表達(dá)，其中一條多肽鏈具有由肽接頭分隔的兩個(gè)串聯(lián)的VH域(VH1-接頭-VH2)，而另一條多肽鏈由通過(guò)肽接頭串聯(lián)連接的互補(bǔ)VL域組成(VL1-接頭-VL2)。在十字架型雙頭構(gòu)型中，兩個(gè)不同抗體的可變域以串聯(lián)方向在兩條分離的多肽鏈(一條重鏈和一條輕鏈)上表達(dá)，其中一條多肽鏈具有由肽接頭分隔的兩個(gè)串聯(lián)的VH域(VH1-接頭-VH2)，而另一條多肽鏈由通過(guò)肽接頭以相反方向串聯(lián)連接的互補(bǔ)VL域組成(VL2-接頭-VL1)。基于“雙-Fv”形式的其他抗體變體包括雙-可變-域IgG(DVD-IgG)雙特異性抗體(參見美國(guó)專利號(hào)7,612,181和TBTI格式(參見US 2010/0226923 A1)。將恒定域添加至雙-Fv的各條鏈(CH1-Fc添加至重鏈而κ或λ恒定域添加至輕鏈)產(chǎn)生了功能性的雙特異性抗體，而不需要額外的修飾(即明顯添加恒定域以增強(qiáng)穩(wěn)定性)。

在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含基于“雙頭”構(gòu)型的交叉型雙重可變域IgG(CODV-IgG)雙特異性抗體(參見US20120251541 A1，其通過(guò)提述以其整體并入本文)。CODV-IgG抗體變體具有一個(gè)多肽鏈(其具有與CL域串聯(lián)連接的VL域(VL1-L1-VL2-L2-CL))和第二多肽鏈(具有以與CH1域相反方向串聯(lián)連接的互補(bǔ)VH域(VH2-L3-VH1-L4-CH1))，其中所述多肽鏈形成交叉型輕鏈-重鏈對(duì)。在一些實(shí)施方案中，所述第二多肽可進(jìn)一步連接至Fc域(VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc)。在一些實(shí)施方案中，接頭L3的長(zhǎng)度至少是接頭L1的兩倍和/或接頭L4的長(zhǎng)度至少是接頭L2的兩倍。例如，L1和L2的長(zhǎng)度可以是1-3個(gè)氨基酸殘基，L3的長(zhǎng)度可以是2-6個(gè)氨基酸殘基，而L4的長(zhǎng)度可以是4-7個(gè)氨基酸殘基。合適的接頭的例子包括單甘氨酸(Gly)殘基；雙甘氨酸(Gly-Gly)；三甘氨酸(Gly-Gly-Gly)；具有4個(gè)甘氨酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly)(SEQ ID NO:40)；具有5個(gè)甘氨酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly)(SEQ ID NO:41)；具有6個(gè)甘氨酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly)(SEQ ID NO:42)；具有7個(gè)甘氨酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly)(SEQ ID NO:43)；具有8個(gè)甘氨酸殘基的肽(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly)(SEQ ID NO:44)。還可以使用氨基酸殘基的其他組合，如肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:45)和肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:46)。

在一些實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含免疫粘附素分子，其包含與抗體恒定區(qū)融合的非抗體結(jié)合區(qū)(例如受體、配體、或細(xì)胞粘附分子)(參見例如Ashkenazi等,Methods,1995 8(2),104-115，其通過(guò)提述以其整體并入本文)。

在一些實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含免疫球蛋白樣域。合適的免疫球蛋白樣域包括但不限于纖連蛋白域(參見例如Koide等(2007),Methods Mol.Biol.352:95-109，其通過(guò)提述以其整體并入本文)、DARPin(參見例如Stumpp等(2008)Drug Discov.Today 13(15-16):695-701，其通過(guò)提述以其整體并入本文)、蛋白A的Z域(參見，Nygren等(2008)FEBS J.275(11):2668-76，其通過(guò)提述以其整體并入本文)、脂鈣蛋白(Lipocalins)(參見，例如Skerra等(2008)FEBS J.275(11):2677-83，其通過(guò)提述以其整體并入本文)、Affilins(參見例如Ebersbach等(2007)J.Mol.Biol.372(1):172-85，其通過(guò)提述以其整體并入本文)、Affitins(參見例如Krehenbrink等(2008).J.Mol.Biol.383(5):1058-68，其通過(guò)提述以其整體并入本文)、Avimers(參見例如Silverman等(2005)Nat.Biotechnol.23(12):1556-61，其通過(guò)提述以其整體并入本文)、Fynomers(參見，例如Grabulovski等(2007)J Biol Chem 282(5):3196-3204，其通過(guò)提述以其整體并入本文)、及Kunitz域肽(參見例如Nixon等(2006)Curr Opin Drug Discov Devel 9(2):261-8，其通過(guò)提述以其整體并入本文)。

III.N-連接的聚糖

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明表征的結(jié)合多肽采用這樣的聚糖，所述聚糖經(jīng)天冬酰胺殘基“N-連接”至結(jié)合多肽的多肽骨架中的糖基化位點(diǎn)。所述糖基化位點(diǎn)可以是天然的或工程化的糖基化位點(diǎn)。另外或作為選擇地，所述聚糖可以是含有一個(gè)或多個(gè)非天然鍵(linkage)的天然聚糖或工程化聚糖(例如修飾聚糖)?！癗-聚糖”或“N-連接的聚糖”經(jīng)N-乙酰葡糖胺殘基附接于蛋白中的天冬酰胺或精氨酸殘基的酰胺氮處。這些“N-連接的糖基化位點(diǎn)”存在于含有例如氨基酸序列天冬酰胺-X-絲氨酸/蘇氨酸的肽一級(jí)結(jié)構(gòu)中，其中X是除脯氨酸和天冬氨酸之外的任意氨基酸殘基。此類N-聚糖充分描述于例如Drickamer K,Taylor ME(2006).Introduction to Glycobiology,第二版中，其通過(guò)提述以其整體并入本文。

在一些實(shí)施方案中，提供了糖工程化的結(jié)合蛋白和/或結(jié)合多肽及制備糖工程化的結(jié)合蛋白和/或結(jié)合多肽的方法。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“糖工程化”是指任何本領(lǐng)域公認(rèn)的用于改變結(jié)合蛋白組合物的糖型概貌以生成“修飾聚糖”的方法。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“G0糖型”，“G1糖型”和“G2糖型”是指分別具有零個(gè)，一個(gè)或兩個(gè)末端半乳糖殘基的N-聚糖糖型。這些術(shù)語(yǔ)包括巖藻糖基化的或包含二等分的N-乙酰葡糖胺殘基的G0、G1和G2糖型。

在一些實(shí)施方案中，G1和G2糖型還包含連接至末端半乳糖殘基的一個(gè)或兩個(gè)的唾液酸殘基，以形成G1S1、G2S1和G2S2糖型。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“G1S1糖型”、“G2S1糖型”和“G2S2糖型”是指這樣的N-聚糖糖型，其具有連接至G1糖型中唯一末端半乳糖殘基的唾液酸殘基，所述末端半乳糖殘基的其中一個(gè)在G2糖型中，或者兩個(gè)末端半乳糖殘基分別都在G2糖型中。這些術(shù)語(yǔ)包括巖藻糖基化的或包含二等分N-乙酰葡糖胺殘基的G1S1、G2S1和G2S2糖型。在一些實(shí)施方案中，G1S1、G2S1和G2S2糖型的唾液酸殘基通過(guò)α-2,6-唾液酸鍵連接至每個(gè)糖型的末端半乳糖殘基，以增強(qiáng)結(jié)合分子的抗炎活性(參見例如Anthony等,PNAS 105:19571-19578,2008)。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“G1F糖型”，“G2F糖型”，“G1S1F糖型”，“G2S1F糖型”和“G2S2F糖型”是指分別經(jīng)巖藻糖基化的“G1糖型”、“G2糖型”、“G1S1糖型”、“G2S1糖型”和“G2S2糖型”。

在一些示例性實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含抗體Fc域的天然糖基化位點(diǎn)。根據(jù)EU編號(hào)，該天然糖基化位點(diǎn)包含F(xiàn)c域的位置297處的野生型天冬酰胺殘基(N297)。位于該位置的天然N-連接的聚糖通常通過(guò)β-糖基酰胺鍵連接至N297側(cè)鏈的氮基團(tuán)。然而，也可以使用其它合適的本領(lǐng)域公認(rèn)的連接/鍵(linkage)。N297N-連接的聚糖可以含有末端甘露糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖或唾液酸。

在其他示例性實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含一個(gè)或多個(gè)工程化的糖基化位點(diǎn)。此類工程化的糖基化位點(diǎn)包含用天冬酰胺殘基對(duì)結(jié)合多肽的多肽骨架中的一個(gè)或多個(gè)野生型氨基酸進(jìn)行的取代，所述天冬酰胺殘基能夠被細(xì)胞的糖基化酶N-糖基化。示例性的工程化的糖基化位點(diǎn)包括引入根據(jù)EU編號(hào)Fc域的氨基酸位置298處的天冬酰胺(298N)，或根據(jù)Kabat編號(hào)CH1域的氨基酸位置114處(根據(jù)EU編號(hào)CH1域的位置118處)的天冬酰胺(114N)。

任何類型的天然存在的或合成的(即非天然的或修飾的)N-連接的聚糖都可以連接至本發(fā)明所表征的結(jié)合多肽的糖基化位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，聚糖包含可以被氧化(例如通過(guò)高碘酸鹽處理或半乳糖氧化酶來(lái)氧化)的糖(例如位于寡糖末端的糖殘基)，以產(chǎn)生適合于與效應(yīng)模塊(例如反應(yīng)性醛基)綴合的基團(tuán)。合適的可氧化糖包括但不限于半乳糖和唾液酸(例如N-乙酰神經(jīng)氨酸)。在一些實(shí)施方案中，聚糖是雙分枝的(biantennary)聚糖。在一些實(shí)施方案中，聚糖是天然存在的哺乳動(dòng)物糖型。

糖基化可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方式實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在能夠進(jìn)行N-連接的糖基化的細(xì)胞中表達(dá)結(jié)合多肽來(lái)實(shí)現(xiàn)糖基化。可以采用任何天然或工程化細(xì)胞(例如原核或真核細(xì)胞(例如CHO或NS0細(xì)胞))。一般而言，采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生糖基化。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的N-聚糖通常稱為復(fù)合的高甘露糖的雜合型N-聚糖(參見例如Drickamer(2006))。這些復(fù)合的N-聚糖具有這樣的結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)通常具有2至6個(gè)外分支，其中唾液酸乳糖胺序列連接至內(nèi)核結(jié)構(gòu)Man₃GlcNAc₂。復(fù)合的N-聚糖具有至少一個(gè)分支，和/或至少兩個(gè)分支的交替的GlcNAc和半乳糖(Gal)殘基，其終止于寡糖，例如：NeuNAc-；NeuAcα2,6GalNAcα1-；NeuAc α2,3 Galβ1,3GalNAcα1-；和NeuAcα2,3/6 Galβ1,4 GlcNAcβ1。此外，硫酸酯可以存在于半乳糖、GalNAc和GlcNAc殘基上。NeuAc可以經(jīng)O-乙?；蚪?jīng)NeuG1(N-羥乙酰神經(jīng)氨酸)置換。復(fù)合的N-聚糖還可具有二等分GlcNAc和核心巖藻糖(Fuc)的鏈內(nèi)取代。

另外或作為選擇地，糖基化可以通過(guò)酶方法在體外實(shí)現(xiàn)或修飾。例如，可以采用一種或多種糖基轉(zhuǎn)移酶將特定的糖殘基添加至結(jié)合多肽的天然或工程化N-聚糖，并且可以采用一種或多種糖苷酶從N-連接的聚糖中除去不需要的糖。這種酶方法是本領(lǐng)域公知的(參見例如WO2007/005786,其通過(guò)提述以其整體并入本文)。

IV.免疫學(xué)效應(yīng)功能和Fc修飾

在一些實(shí)施方案中，結(jié)合多肽可以包含介導(dǎo)一種或多種效應(yīng)功能的抗體恒定區(qū)(例如IgG恒定區(qū)，例如人IgG恒定區(qū)，例如人IgG1或IgG4恒定區(qū))。例如，C1復(fù)合物對(duì)抗體恒定區(qū)的結(jié)合可激活補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體系統(tǒng)的激活在細(xì)胞病原體的調(diào)理作用和裂解中是重要的。補(bǔ)體系統(tǒng)的激活也刺激炎癥響應(yīng)，并且還可能參與自身免疫性超敏反應(yīng)。此外，抗體通過(guò)Fc區(qū)結(jié)合至多種細(xì)胞上的受體(抗體Fc區(qū)上的Fc受體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合至細(xì)胞上的Fc受體(FcR))。存在許多特異性針對(duì)不同類別抗體的Fc受體，所述不同類別的抗體包括IgG(γ受體)，IgE(ε受體)，IgA(α受體)和IgM(μ受體)?？贵w對(duì)細(xì)胞表面上Fc受體的結(jié)合引發(fā)許多重要且多樣的生物反應(yīng)，包括抗體包被的顆粒的吞噬和破壞，免疫復(fù)合體的清除，殺傷細(xì)胞對(duì)抗體包被的靶細(xì)胞的裂解(稱為抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，或ADCC)，炎癥介質(zhì)的釋放，胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)，和免疫球蛋白生產(chǎn)的控制。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合多肽(例如抗體或其抗原結(jié)合片段)結(jié)合至Fc-γ受體。在可選擇的實(shí)施方案中，結(jié)合多肽可以包含缺乏一種或多種效應(yīng)功能(例如ADCC活性)的和/或不能結(jié)合Fcγ受體的恒定區(qū)。

一些實(shí)施方案包括這樣的抗體，所述抗體中一個(gè)或多個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸已缺失或經(jīng)其他方式的改變，以提供所需的生物化學(xué)特征，如與大致相同免疫原性的完整無(wú)改變的抗體相比，降低的或增強(qiáng)的效應(yīng)功能，非共價(jià)二聚化的能力，增加的定位于腫瘤位點(diǎn)的能力，降低的血清半衰期、或增加的血清半衰期。例如，用于本文所述的診斷和治療方法的一些抗體是域缺失型抗體，其包含與免疫球蛋白重鏈相似但缺少一個(gè)或多個(gè)重鏈域的至少一部分的多肽鏈。例如，在一些抗體中，修飾抗體的恒定區(qū)的一個(gè)完整域是缺失的，例如CH2域的全部或部分是缺失的。

在一些其他實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含來(lái)源于不同抗體同種型的恒定區(qū)(例如來(lái)自人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的兩種或更多種的恒定區(qū))。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含嵌合鉸鏈(即包含鉸鏈部分的鉸鏈，所述鉸鏈部分來(lái)源于不同抗體同種型的鉸鏈域，例如IgG4分子的上鉸鏈域和IgG1中間鉸鏈域)。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含來(lái)自人IgG4分子的Fc區(qū)或其部分和所述分子的核心鉸鏈區(qū)中的Ser228Pro突變(EU編號(hào))。

在一些實(shí)施方案中，可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)突變Fc部分以增加或降低效應(yīng)功能。例如，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的缺失或失活(通過(guò)點(diǎn)突變或其他方式)可以降低循環(huán)修飾抗體的Fc受體結(jié)合，由此提高腫瘤定位。在其它情況下，可能符合本發(fā)明的恒定區(qū)修飾緩和補(bǔ)體結(jié)合，并因此降低血清半衰期和綴合的細(xì)胞毒素的非特異性結(jié)合。但是恒定區(qū)的其它修飾可用于修飾二硫鍵或寡糖模塊，其允許由于增加的抗原特異性或柔性而增強(qiáng)定位?？梢匀菀椎厥褂帽娝苤拿庖邔W(xué)技術(shù)測(cè)量和量化所得修飾的生理學(xué)概貌，生物利用度和其他生物化學(xué)效果，例如腫瘤定位，生物分布和血清半衰期，而無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)。

在一些實(shí)施方案中，抗體中采用的Fc域是Fc變體。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“Fc變體”是指相對(duì)于所述Fc域所來(lái)源的野生型Fc域具有至少一個(gè)氨基酸取代的Fc結(jié)構(gòu)域。例如，其中Fc域來(lái)源于人IgG1抗體，所述人IgG1 Fc域的Fc變體相對(duì)于所述Fc域包含至少一個(gè)氨基酸取代。

Fc變體的氨基酸取代可位于Fc域內(nèi)的任何位置(即任何EU慣用氨基酸位置)。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體包含在位于鉸鏈域或其部分中的氨基酸位置處的取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體包含位于CH2域或其部分中的氨基酸位置處的取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體包含位于CH3域或其部分中的氨基酸位置處的取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體包含位于CH4域或其部分中的氨基酸位置處的取代。

結(jié)合多肽可以采用已知賦予效應(yīng)功能和/或FcR結(jié)合的改進(jìn)(例如減少或增強(qiáng))的任何本領(lǐng)域公認(rèn)的Fc變體。所述Fc變體可以包括例如如下國(guó)際PCT公布文件中公開的任一種氨基酸取代：WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2、和WO06/085967A2或美國(guó)專利號(hào)5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；和7,083,784，其各自通過(guò)提述以其整體并入本文。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，結(jié)合多肽可以包含在EU位置268(例如H268D或H268E)處包含氨基酸取代的Fc變體。在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，結(jié)合多肽可以包含EU位置239(例如S239D或S239E)和/或EU位置332(例如I332D或I332Q)處的氨基酸取代。

在一些實(shí)施方案中，結(jié)合多肽可以包含F(xiàn)c變體，其包含改變抗體的抗原非依賴性效應(yīng)功能，特別是結(jié)合多肽的循環(huán)半衰期的氨基酸取代。當(dāng)與缺少這些取代的結(jié)合多肽相比時(shí)，此類結(jié)合多肽顯示出對(duì)FcRn的結(jié)合增加或減少，因此其分別在血清中具有增加或減少的半衰期。預(yù)期具有針對(duì)FcRn改善的親和力的Fc變體具有較長(zhǎng)的血清半衰期，并且此類分子在治療其中需要所施用的抗體有長(zhǎng)半衰期的哺乳動(dòng)物的方法中有用，例如用于治療慢性疾病或病癥。相反，具有降低的FcRn結(jié)合親和力的Fc變體預(yù)期具有較短的半衰期，并且此類分子也可用于例如施用于這樣的哺乳動(dòng)物，所述哺乳動(dòng)物中縮短的循環(huán)時(shí)間可能是有利的，例如用于體內(nèi)診斷成像或用于起始抗體長(zhǎng)時(shí)間存在于循環(huán)中時(shí)具有毒性副作用的情況中。具有降低的FcRn結(jié)合親和力的Fc變體也較不可能穿過(guò)胎盤，因此也可用于治療孕婦的疾病或病癥。此外，可能需要降低的FcRn結(jié)合親和力的其他應(yīng)用包括定位于腦，腎，和/或肝的應(yīng)用。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，改變的結(jié)合多肽(例如抗體或其抗原結(jié)合片段)表現(xiàn)出穿過(guò)來(lái)自脈管系統(tǒng)的腎小球上皮的轉(zhuǎn)運(yùn)降低。在另一個(gè)實(shí)施方案中，改變的結(jié)合多肽(例如抗體或其抗原結(jié)合片段)表現(xiàn)出降低的從腦穿過(guò)血腦屏障(BBB)到血管空間中的轉(zhuǎn)運(yùn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有改變的FcRn結(jié)合的抗體包含F(xiàn)c域，其在Fc域的“FcRn結(jié)合環(huán)”內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。FcRn結(jié)合環(huán)由氨基酸殘基280-299(根據(jù)EU編號(hào))組成。改變FcRn結(jié)合活性的示例性氨基酸取代在國(guó)際PCT公開號(hào)WO05/047327中公開，其通過(guò)提述以其整體并入本文。在一些示例性實(shí)施方案中，結(jié)合多肽(例如抗體或其抗原結(jié)合片段)包含具有一個(gè)或多個(gè)以下取代的Fc域：V284E，H285E，N286D，K290E和S304D(EU編號(hào))。在其他示例性實(shí)施方案中，結(jié)合分子包含具有雙突變H433K/N434F的人Fc域(參見例如美國(guó)專利號(hào)8,163,881)。

在其他實(shí)施方案中，用于本文所述的診斷和治療方法的結(jié)合多肽具有恒定區(qū)，例如IgG1或IgG4重鏈恒定區(qū)，其經(jīng)改變以減少或消除糖基化。例如，結(jié)合多肽(例如抗體或其抗原結(jié)合片段)還可以包含F(xiàn)c變體，所述Fc變體包含改變抗體Fc的糖基化的氨基酸取代。例如，所述Fc變體可以具有降低的糖基化(例如N-或O-連接的糖基化)。在示例性實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體包含通常存在于氨基酸位置297(EU編號(hào))處的N-連接的聚糖的降低的糖基化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體在糖基化基序附近或內(nèi)部具有氨基酸取代，例如含有氨基酸序列NXT或NXS的N-連接的糖基化基序。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述抗體包含在氨基酸位置228或299(EU編號(hào))處具有氨基酸取代的Fc變體。在更具體的實(shí)施方案中，所述抗體包含IgG1或IgG4恒定區(qū)，所述IgG1或IgG4恒定區(qū)包含S228P和T299A突變(EU編號(hào))。

賦予減少或改變的糖基化的示例性氨基酸取代公開于國(guó)際PCT公布No.WO05/018572中，其通過(guò)提及其整體并入本文。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合多肽經(jīng)修飾以消除糖基化。此類結(jié)合多肽可以稱為“非糖基化的(agly)”結(jié)合多肽(例如“非糖基化的(agly)”抗體)。不受理論的束縛，據(jù)信“非糖基化的”結(jié)合多肽可能在體內(nèi)具有改進(jìn)的安全性和穩(wěn)定性概貌。非糖基化的結(jié)合多肽可以是其任何同種型或亞類，例如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。在一些實(shí)施方案中，非糖基化的結(jié)合多肽包含缺乏Fc效應(yīng)功能的IgG4抗體的非糖基化的Fc區(qū)，由此消除了對(duì)表達(dá)IL-6的正常重要器官的Fc介導(dǎo)的毒性潛在可能性。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合多肽包含改變的聚糖。例如，抗體可以在Fc區(qū)的Asn297處的N-聚糖上具有減少數(shù)目的巖藻糖殘基，即是去巖藻糖基化的(afucosylated)。無(wú)巖藻糖基化的增加NK細(xì)胞上的FcγRII結(jié)合并強(qiáng)力地增加ADCC。已經(jīng)顯示包含抗IL-6scFv和抗CD3scFv的雙抗體誘導(dǎo)通過(guò)ADCC對(duì)表達(dá)IL-6的細(xì)胞的殺傷。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，無(wú)巖藻糖基化的抗IL-6抗體用于靶向和殺傷表達(dá)IL-6的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽可以在Fc區(qū)的Asn297的N-聚糖上具有改變的數(shù)目的唾液酸殘基。許多本領(lǐng)域公認(rèn)的方法可用于制備“非糖基化”抗體或具有改變的聚糖的抗體。例如，具有修飾的糖基化途徑(例如糖基轉(zhuǎn)移酶缺失)的遺傳工程化的宿主細(xì)胞(例如修飾的酵母，例如畢赤酵母(Picchia)，或CHO細(xì)胞)可以用于產(chǎn)生這樣的抗體。

V.效應(yīng)模塊

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽包含效應(yīng)模塊(例如靶向模塊)。通常，這些效應(yīng)模塊綴合(直接或通過(guò)接頭模塊)至結(jié)合多肽上的N-連接的聚糖，(例如連接至CH2域的N298(EU編號(hào))和/或CH1域的N114(Kabat編號(hào))的N-連接的聚糖)。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合多肽是包含在Kabat位置114(EU位置118)處具有聚糖的兩個(gè)CH1域的全長(zhǎng)抗體，其中兩個(gè)聚糖都綴合至一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)模塊。

可以將任何效應(yīng)模塊添加至本文公開的結(jié)合多肽。效應(yīng)模塊可將非天然功能添加至改變的抗體或其片段，而不顯著改變結(jié)合多肽的固有活性。在一些示例性實(shí)施方案中，效應(yīng)模塊是靶向模塊(例如糖肽或新聚糖)。本公開的修飾結(jié)合多肽(例如抗體)可以包含一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)模塊，其可以是相同或不同的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，效應(yīng)模塊可以是式(I)：

H₂N-Q-CON-X

式(I)

其中：

A)Q是NH或O；且

B)CON是連接體模塊；且

C)X是效應(yīng)模塊(例如本文定義的靶向模塊)。

所述連接體模塊將治療劑連接至H₂N-Q-。連接體模塊可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的合適組分的至少一個(gè)，其包括例如亞烷基組分，聚乙二醇組分，聚(甘氨酸)組分，聚(噁唑啉)組分，羰基組分，衍生自半胱氨酰胺的組分，衍生自與瓜氨酸綴合的纈氨酸的組分，和衍生自4-氨基芐基氨基甲酸酯的組分，或其任何組合。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，式(I)的效應(yīng)模塊可以是式(Ia)：

H₂N-Q-CH₂-C(O)-Z-X

式(Ia)，

其中：

A)Q是NH或O；且

B)Z是-Cys-(MC)_a-(VC)_b-(PABC)_c-(C₁₆H₃₂O₈C₂H₄)_f，

其中

i.Cys是半胱氨酰氨衍生的組分；

ii.MC是衍生自馬來(lái)酰亞胺的組分；

iii.VC是衍生自與瓜氨酸偶聯(lián)的纈氨酸的組分；

iv.PABC是衍生自4-氨基芐基氨基甲酸酯的組分；

v.X是效應(yīng)模塊(例如本文定義的靶向模塊)；

vi.a是0或1；

vii.b是0或1；

viii.c是0或1；且

ix.f是0或1。

“衍生自半胱氨酰氨的組分”是與H₂N-Q-CH₂-C(O)-附接的點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，“衍生自半胱氨酰氨的組分”可以指具有如下結(jié)構(gòu)的效應(yīng)模塊的一個(gè)或多個(gè)部分：

在一個(gè)實(shí)施方案中，效應(yīng)模塊的“Cys”組分可以包括一個(gè)此種部分。例如，如下結(jié)構(gòu)顯示了具有一個(gè)此種部分的效應(yīng)模塊(其中“Cys”組分用虛線框標(biāo)示)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，效應(yīng)模塊的“Cys”組分可以包括一個(gè)或多個(gè)此種部分。例如，如下模塊含有兩個(gè)此種部分：

從該結(jié)構(gòu)可以看出，每個(gè)“Cys”組分帶有一個(gè)-(MC)_a-(VC)_b-(PABC)_c-(C₁₆H₃₂O₈C₂H₄)_f-X基團(tuán)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，短語(yǔ)“衍生自馬來(lái)酰亞胺的組分”可以指具有如下結(jié)構(gòu)的效應(yīng)模塊的任何部分：

其中d是2-5的整數(shù)。效應(yīng)模塊中的任何Cys-(MC)_a-(VC)_b-(PABC)_c-(C₁₆H₃₂O₈C₂H₄)_f-X基團(tuán)中包含的MC組分的數(shù)目用下標(biāo)“a”表示且可以是0或1。在一個(gè)實(shí)施方案中，a是1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，a或b是0。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將“Cys”組分經(jīng)“Cys”組分中的硫原子連接至“MC”組分，如以下結(jié)構(gòu)中虛線框所標(biāo)示：

在一個(gè)實(shí)施方案中，短語(yǔ)“衍生自與瓜氨酸偶聯(lián)的纈氨酸的組分”可以指具有如下結(jié)構(gòu)的效應(yīng)模塊的任何部分：

效應(yīng)模塊中任何Cys-(MC)_a-(VC)_b-(PABC)_c-(C₁₆H₃₂O₈C₂H₄)_f-X基團(tuán)中包含的VC組分的數(shù)目用下標(biāo)“b”表示且可以是0或1。在一個(gè)實(shí)施方案中，b是1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，b是0。

在一個(gè)實(shí)施方案中，短語(yǔ)“衍生自4-氨基芐基氨基甲酸酯的組分”可以指具有如下結(jié)構(gòu)的效應(yīng)模塊的任何部分：

效應(yīng)模塊中任何Cys-(MC)_a-(VC)_b-(PABC)_c-(C₁₆H₃₂O₈C₂H₄)_f-X基團(tuán)中包含的PABC組分的數(shù)目用下標(biāo)“c”表示且可以是0或1。在一個(gè)實(shí)施方案中，c是1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，c是0。

在一個(gè)實(shí)施方案中，“C₁₆H₃₂O₈C₂H₄”是指如下結(jié)構(gòu)：

效應(yīng)模塊中任何Cys-(MC)_a-(VC)_b-(PABC)_c-(C₁₆H₃₂O₈C₂H₄)_f-X基團(tuán)中包含的C₁₆H₃₂O₈單元的數(shù)目用下標(biāo)“f”表示，在一個(gè)實(shí)施方案中，f是1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，f是0。

在一個(gè)實(shí)施方案中，a是1，b是1，c是1，且f是0。

a)治療性效應(yīng)模塊

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽可以綴合至包含治療劑的效應(yīng)模塊，例如藥物模塊(或其前藥)或放射性標(biāo)記的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療劑是細(xì)胞毒素。示例性的細(xì)胞毒性治療劑示于本文表1中。

表1.示例性的細(xì)胞毒性治療劑

其它示例性藥物模塊包括抗炎，抗癌，抗感染(例如抗真菌，抗細(xì)菌，抗寄生蟲，抗病毒等)和麻醉治療劑。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，藥物模塊是抗癌劑。示例性的抗癌劑包括但不限于細(xì)胞抑制劑，酶抑制劑，基因調(diào)節(jié)劑，細(xì)胞毒性核苷，微管蛋白結(jié)合劑或微管蛋白抑制劑，蛋白酶體抑制劑，激素和激素拮抗劑，抗血管生成劑等。示例性的細(xì)胞抑制性抗癌劑包括烷化劑，例如蒽環(huán)類藥物(例如阿霉素，卡利霉素，環(huán)孢菌素A，氯喹，甲基葉酸(methopterin)，光輝霉素(mithramycin)，泊非霉素(porfiromycin)，鏈黑菌素，泊非霉素，蒽二酮類(anthracenediones)，和氮丙啶類)。其它細(xì)胞靜止性抗癌劑包括DNA合成抑制劑(例如甲氨蝶呤和二氯甲氨蝶呤，3-氨基-1,2,4-苯并三嗪1,4-二氧化物，氨基喋呤，胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷，5-氟-5'-脫氧尿苷，5-氟尿嘧啶，更昔洛韋，羥基脲，放線菌素-D和絲裂霉素C)，DNA嵌入劑或交聯(lián)劑(例如博來(lái)霉素(bleomycin)，卡鉑，卡莫司汀(carmustine,)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，環(huán)磷酰胺，順-二氯二氨基鉑(II)(順鉑)，美法侖，米托蒽醌，和奧沙利鉑)，和DNA-RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑(例如放線菌素D，柔紅霉素(daunorubicin,)，多柔比星，高三尖杉酯堿和伊達(dá)比星)。與本發(fā)明相容的其它示例性細(xì)胞抑制劑包括安莎霉素苯醌類，醌型衍生物(例如喹諾酮，染料木素，細(xì)菌素(bactacyclin))，白消安，異環(huán)磷酰胺，氮芥，三亞胺醌類(triaziquone)，地吖醌(diaziquone)，卡波醌(carbazilquinone)，吲哚醌EO9(indoloquinone EO9)，二氮雜環(huán)丙烯基-苯醌甲基DZQ，三乙烯基磷酰胺，和亞硝基脲化合物(例如卡莫司汀，洛莫司汀，司莫司汀)。

示例性的細(xì)胞毒性核苷抗癌劑包括但不限于：腺苷阿拉伯糖苷，阿糖胞苷，胞嘧啶阿拉伯糖苷，5-氟尿嘧啶，氟達(dá)拉濱，氟尿苷，替加氟(ftorafur)和6-巰基嘌呤。示例性抗癌微管蛋白結(jié)合劑包括但不限于：紫杉烷類(例如帕利他賽，多西他賽，紫杉烷(taxane))，諾考達(dá)唑，根霉素，多拉司他汀類(dolastatins)(例如多拉司他汀-10，-11或-15)，秋水仙素和類秋水仙素(例如ZD6126)，考布他汀(combretastatins)(例如考布他汀A-4，AVE-6032)和長(zhǎng)春花生物堿類(例如長(zhǎng)春花堿，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春瑞濱(navelbine))。示例性的抗癌激素和激素拮抗劑包括但不限于：皮質(zhì)類固醇(例如潑尼松)，孕激素(例如羥孕酮或甲羥孕酮(medroprogesterone))，雌激素(例如二乙基己烯雌酚)，抗雌激素(例如他莫昔芬)，雄激素(例如睪酮)，芳香化酶抑制劑(例如氨魯米特(aminogluthetimide))，17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格爾德霉素，4-氨基-1,8-萘二甲酰亞胺，芹菜素，布雷菲德菌素A，西咪替丁，二氯亞甲基-二膦酸，亮丙瑞林(leuprorelin)，促黃體生成激素釋放激素，皮斐松-a(pifithrin-a)，雷帕霉素，性激素結(jié)合球蛋白，和毒胡蘿卜素。示例性的抗癌、抗血管生成化合物包括但不限于：血管他汀K1-3，DL-a-二氟甲基-鳥氨酸，內(nèi)皮抑制素，煙曲霉素，染料木黃酮，米諾環(huán)素，十字孢堿和(±)-沙利度胺。

示例性的抗癌酶抑制劑包括但不限于：S(+)-喜樹堿，姜黃素，(-)-魚藤素，5,6-二氯苯并咪唑1-β-D-呋喃核糖苷(5,6-diCH1orobenz-imidazole 1-β-D-ribofuranoside)，依托泊苷，福美坦，福司曲星，牛奶樹堿(hispidin)，2-亞氨基-1-咪唑啉乙酸(2-imino-l-imidazolidineacetic acid)(環(huán)肌氨酸)，美維諾林(mevinolin)，曲古抑菌素A(trichostatin A)，酪氨酸磷酸化抑制劑AG 34，和酪氨酸磷酸化抑制劑AG 879。

示例性的抗癌基因調(diào)節(jié)劑包括但不限于：5-氮雜-2'-脫氧胞苷，5-氮雜胞苷，膽鈣化醇(維生素D3)，4-羥基他莫昔芬，褪黑激素，米非司酮，雷洛昔芬，反式視黃醛(維生素A醛)，視黃酸，維生素A酸，9-順-視黃酸，13-順-視黃酸，視黃醇(維生素A)，他莫昔芬，和曲格列酮。

其它類別的抗癌劑包括但不限于：蝶啶族藥物，二炔類(diynenes)和鬼臼毒素類。這些類別的特別有用的成員包括例如甲基葉酸，鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物，如依托泊苷或磷酸依托泊苷，異長(zhǎng)春堿(leurosidine)，長(zhǎng)春地辛，環(huán)長(zhǎng)春堿等。

與本文教導(dǎo)相容的其它抗癌劑包括澳瑞他汀類(auristatins)(例如澳瑞他汀E和單甲基澳瑞他汀E)，格爾德霉素，卡奇霉素，短桿菌肽D，類美登素類(maytansanoids)(例如美登素)，新制癌菌素，拓?fù)涮婵?topotecan)，紫杉烷，細(xì)胞松弛素B，溴化乙錠，依米丁，替尼泊苷(tenoposide)，秋水仙素，二羥基蒽二酮，米托蒽醌，普魯卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛爾，嘌呤霉素及其類似物或同系物。

與本文教導(dǎo)相容的其它抗癌劑包括托馬霉素衍生物，美登素衍生物，隱球菌素衍生物，蒽環(huán)霉素衍生物，二磷酸鹽衍生物，細(xì)霉素衍生物，鏈黑菌素衍生物，澳瑞他汀衍生物和多卡霉素衍生物。

可以用作藥物模塊的另一類相容的抗癌劑是可以有效地針對(duì)腫瘤或免疫反應(yīng)性細(xì)胞的放射增敏藥物。這種藥物模塊增強(qiáng)對(duì)電離輻射的敏感性，由此增加放射治療的功效。不受理論的束縛，用放射增敏藥物模塊修飾并被腫瘤細(xì)胞內(nèi)化的抗體將放射增敏劑遞送至更靠近放射增敏作用最大的核。失去放射增敏劑模塊的抗體會(huì)從血液中快速清除，將剩余的放射增敏劑定位在靶腫瘤中，并在正常組織中提供最小的攝取。在從血液中清除后，可以通過(guò)特異性地指向腫瘤的外部束輻射、直接植入腫瘤中的放射性、或使用相同修飾抗體的全身放射免疫療法來(lái)施用輔助放射治療。

在一個(gè)實(shí)施方案中，治療劑包括具有能夠在核DNA中引起多鏈斷裂的導(dǎo)致細(xì)胞死亡的高能電離輻射的放射性核素或放射性標(biāo)記。示例性的高能放射性核素包括：⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹¹¹In、¹⁰⁵Rh、¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re和¹⁸⁸Re。這些同位素通常產(chǎn)生具有短路徑長(zhǎng)度的高能α-或β-粒子。此類放射性核素殺死與它們非常接近的細(xì)胞，例如綴合物已經(jīng)附著或已經(jīng)進(jìn)入的腫瘤細(xì)胞。它們對(duì)非定位的細(xì)胞幾乎沒有或沒有影響，并且基本上是非免疫原性的?；蛘?，高能同位素可以通過(guò)其它穩(wěn)定同位素的熱輻射產(chǎn)生，例如在硼中子俘獲療法中那樣(Guan等,PNAS,95:13206-10,1998)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，治療劑選自MMAE、MMAF、和PEG8-Do110。

示例性的治療性效應(yīng)模塊包括如下結(jié)構(gòu)：

在一個(gè)實(shí)施方案中，效應(yīng)模塊選自：

在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)模塊含有多于一個(gè)治療劑。這些多個(gè)治療劑可以是相同的或不同的。

b)診斷性效應(yīng)模塊

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽綴合至包含診斷劑的效應(yīng)模塊。在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷劑是可檢測(cè)的小分子標(biāo)記，例如生物素，熒光團(tuán)，發(fā)色團(tuán)，自旋共振探針或放射性標(biāo)記。示例性熒光團(tuán)包括熒光染料(例如熒光素，羅丹明等)和其它發(fā)光分子(例如魯米那(luminal))。熒光團(tuán)可以是對(duì)環(huán)境敏感的，使得其在位置接近于修飾的結(jié)合多肽中的一個(gè)或多個(gè)殘基時(shí)其熒光變化，所述結(jié)合多肽在結(jié)合底物(例如丹磺酰基探針)時(shí)經(jīng)歷結(jié)構(gòu)變化。示例性的放射性標(biāo)記物包括含有具有一個(gè)或多個(gè)低敏性核的原子(¹³C、¹⁵N、²H、¹²⁵I、¹²⁴I、¹²³I、⁹⁹Tc、⁴³K、⁵²Fe、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、¹¹¹In等)的小分子。放射性核素可以是例如γ，光子或正電子發(fā)射放射性核素，其半衰期適于在施用和定位于成像部位之間運(yùn)行的時(shí)間之后允許活性或檢測(cè)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷劑是多肽。示例性診斷多肽包括具有熒光或顯色活性的酶，所述活性例如切割形成作為產(chǎn)物的熒光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)的底物(即報(bào)告蛋白，如熒光素酶)的能力。其他診斷蛋白可以具有內(nèi)在的熒光或顯色活性(例如來(lái)自生物發(fā)光海洋生物的綠色，紅色和黃色熒光生物發(fā)光水母發(fā)光蛋白)，或者它們可以包含含有一個(gè)或多個(gè)低能放射性核(¹³C、¹⁵N、²H、¹²⁵I、¹²⁴I、¹²³I、⁹⁹Tc、⁴³K、⁵²Fe、⁶⁴Cu、⁶⁸Ga、¹¹¹In等)的蛋白。

關(guān)于與本發(fā)明相連的放射性標(biāo)記的綴合物的使用，本發(fā)明的結(jié)合多肽可以是直接標(biāo)記的(例如通過(guò)碘化標(biāo)記)或可以通過(guò)使用螯合劑間接標(biāo)記。如本文所用的，短語(yǔ)“間接標(biāo)記”和“間接標(biāo)記方法”都是指螯合劑共價(jià)連接至結(jié)合多肽，并且至少一個(gè)放射性核素與螯合劑結(jié)合。此類螯合劑通常稱為雙功能螯合劑，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)合多肽和放射性同位素二者。示例性螯合劑包括1-異硫氰酸芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(“MX-DTPA”)和環(huán)己基二亞乙基三胺五乙酸(“CHX-DTPA”)衍生物。其它螯合劑包括P-DOTA和EDTA衍生物。用于間接標(biāo)記的示例性放射性核素包括111In和90Y。大多數(shù)成像研究使用5mCi 111In標(biāo)記的抗體，因?yàn)樵搫┝颗c較低劑量相比既安全并且具有增加的成像效率，其中最佳成像發(fā)生在抗體施用后3至6天。參見例如Murray,(1985),J.Nuc.Med.26:3328和Carraguillo等(1985),J.Nuc.Med.26:67。用于直接標(biāo)記的示例性放射性核素是131I。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，根據(jù)所選擇的要綴合的試劑，也可以組裝非放射性綴合物。

在一些實(shí)施方案中，診斷性效應(yīng)模塊是FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)探針。FRET已經(jīng)用于多種診斷應(yīng)用，包括癌癥診斷。FRET探針可以包含連接FRET探針的供體和受體模塊的可切割接頭(酶敏感性或pH接頭)，其中切割導(dǎo)致增強(qiáng)的熒光(包括近紅外光)(參見例如A.Cobos-Correa等Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12activity in pulmonary inflammation,Nature Chemical Biology(2009),5(9),628-63；S.Gehrig等Spatially Resolved Monitoring of Neutrophil Elastase Activity with Ratiometric Fluorescent Reporters(2012)Angew.Chem.Int.Ed.,51,6258-6261)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，效應(yīng)模塊選自：

c)官能化的效應(yīng)模塊

在一些實(shí)施方案中，可以將效應(yīng)模塊官能化，以含有除效應(yīng)模塊本身之外的一個(gè)或多個(gè)額外的基團(tuán)。例如，效應(yīng)模塊可以含有在特定條件下從結(jié)合多肽釋放效應(yīng)模塊的可切割接頭。在示例性實(shí)施方案中，效應(yīng)模塊可以包含可被細(xì)胞酶切割和/或pH敏感性接頭。另外地或作為選擇地，效應(yīng)模塊可以含有當(dāng)被吸收到細(xì)胞中時(shí)被細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽切割的二硫鍵。示例性的二硫化物和pH敏感性接頭提供如下：

在其他實(shí)施例中，效應(yīng)模塊可以包含親水性和生物相容性模塊，例如聚(甘氨酸)，聚(噁唑啉)，和/或PEG模塊。示例性結(jié)構(gòu)(“Y”)提供如下：

在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)模塊含有氨基氧基，其促進(jìn)經(jīng)穩(wěn)定肟連接與結(jié)合多肽的綴合。含有氨基氧基基團(tuán)的示例性效應(yīng)模塊示于本文表2中。

表2.示例性的氨基氧基效應(yīng)模塊(其中X可以是任何接頭，Y是任何間隔基，并且其中X和/或Y是任選的)

在其他實(shí)施方案中，效應(yīng)模塊含有酰肼和/或N-烷基化的肼基團(tuán)以促進(jìn)經(jīng)穩(wěn)定腙連接對(duì)結(jié)合多肽的綴合。含有氨基氧基基團(tuán)的示例性效應(yīng)模塊示于本文表14中。

表14.示例性的腙和/或酰肼效應(yīng)模塊

d)靶向模塊

在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)模塊包含特異性結(jié)合至一個(gè)或多個(gè)靶分子的靶向模塊?？梢允褂萌魏晤愋偷陌邢蚰K，包括但不限于蛋白質(zhì)，核酸，脂質(zhì)，糖類(例如聚糖)，及其組合(例如糖蛋白，糖肽和糖脂)。在一些實(shí)施方案中，靶向模塊是糖類或糖肽。在一些實(shí)施方案中，靶向模塊是聚糖。靶向模塊可以是天然或非天然存在的分子。適于綴合的靶向模塊可以包括含有氨基氧基接頭的那些(參見例如圖40和41)。

本發(fā)明中描述的靶向模塊可以在體外或體內(nèi)結(jié)合至任何類型的細(xì)胞，包括但不限于動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)，植物或昆蟲細(xì)胞。細(xì)胞可以是內(nèi)胚層，中胚層或外胚層起源的，并且可以包括任何細(xì)胞類型。在一些實(shí)施方案中，靶向模塊結(jié)合至細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，促進(jìn)結(jié)合多肽向靶細(xì)胞的遞送，例如提高細(xì)胞靶向和/或攝取。示例性靶細(xì)胞包括但不限于免疫細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞如B細(xì)胞，T細(xì)胞，天然殺傷(NK)細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或樹突細(xì)胞)，肝臟細(xì)胞(例如肝細(xì)胞或非實(shí)質(zhì)細(xì)胞如肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，Kupffer細(xì)胞或肝星狀細(xì)胞)，腫瘤細(xì)胞(例如任何惡性或良性細(xì)胞，包括肝癌細(xì)胞，肺癌細(xì)胞，肉瘤細(xì)胞，白血病細(xì)胞，或淋巴瘤細(xì)胞)，血管細(xì)胞(例如主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞或肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞)，上皮細(xì)胞(例如簡(jiǎn)單鱗狀上皮細(xì)胞，簡(jiǎn)單柱狀上皮細(xì)胞，假?gòu)?fù)層柱狀上皮細(xì)胞，或分層鱗狀上皮細(xì)胞)，或間充質(zhì)細(xì)胞(例如淋巴和循環(huán)系統(tǒng)的細(xì)胞、骨和軟骨細(xì)胞)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，包含一個(gè)或多個(gè)靶向模塊的結(jié)合多肽是由細(xì)胞內(nèi)化的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含一個(gè)或多個(gè)由細(xì)胞內(nèi)化的靶向模塊的結(jié)合多肽的量大于缺乏由細(xì)胞內(nèi)化的靶向模塊的參考結(jié)合多肽的量。

在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向模塊結(jié)合至靶細(xì)胞上的受體。例如，靶向模塊可以包含結(jié)合至細(xì)胞上的甘露糖-6-磷酸受體的甘露糖-6-磷酸模塊。在其他示例性實(shí)施方案中，靶向模塊結(jié)合靶細(xì)胞上的Siglec。示例性Siglec包括唾液酸粘附素(Siglec-1)、CD22(Siglec-2)、CD33(Siglec-3)、MAG(Siglec-4)、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11、Siglec-12、Siglec-14、或Siglec-15。在其他實(shí)施方案中，靶向模塊包含α2,3-，α2,6-或α2,8-連接的唾液酸殘基。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述靶向模塊包含α2,3-唾液酸乳糖模塊或α2,6-唾液酸乳糖模塊。其它示例性受體包括凝集素受體，其包括但不限于C型凝集素受體，半乳凝素，和L型凝集素受體。示例性的凝集素受體包括：DEC-205(CD205；淋巴細(xì)胞抗原75)、巨噬細(xì)胞甘露糖受體(MMR；CD206)、Dectin-1、Dectin-2、巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)的C型凝集素(Mincle)、樹突細(xì)胞特異性ICAM3-抓取非整合素(DC-SIGN、CD209)、DC NK凝集素基團(tuán)受體-1(DNGR-1)、朗格漢斯蛋白(Langerin)(CD207)、凝集素蛋白聚糖(lectican)、去唾液酸糖蛋白受體、C-凝集素受體樹突細(xì)胞免疫受體(CLEC4A；CLECSF6；DCIR)、巨噬細(xì)胞半乳糖型凝集素(MGL)、DC受體、膠原凝集素、選擇素、NK細(xì)胞受體、多C型凝集素域(CTLD)內(nèi)吞性受體、Reg基團(tuán)(VII型)凝集素、軟骨凝集素、四連接素、多囊蛋白、吸引素(ATRN)、嗜酸性粒細(xì)胞主要堿性蛋白(EMBP)、DiGeorge綜合征臨界區(qū)基因2(DGCR2)、血栓調(diào)節(jié)蛋白、Bimlec、基團(tuán)XVI凝集素(SEEC)、和基團(tuán)XVII凝集素(CBCP/Frem1/QBRICK)。

本發(fā)明的結(jié)合多肽可用于通過(guò)靶向糖類受體(例如甘露糖6-磷酸受體，甘露糖受體和去唾液酸糖蛋白受體)從多種疾病中的肝臟中除去有毒化合物和有害物質(zhì)。請(qǐng)參見：Ganesan,L.P.等:Rapid and Efficient Clearance of Blood-borne Virus by Liver Sinusoidal Endothelium.PLoS Pathogens 2011,9:1；和Monnier,V.M.等:Glucosepane:a poorly understood advanced glycation end product of growing importance for diabetes and its complications.Clin Chem Lab Med 2014；52:21。

本發(fā)明的結(jié)合多肽還可以用于通過(guò)靶向一種或多種不同的細(xì)胞受體而靶向腫瘤細(xì)胞，所述細(xì)胞受體包括但不限于：糖受體，去唾液酸糖蛋白受體和/或Siglecs。請(qǐng)參見Chen,W.C.等:In vivo targeting of B-cell lymphoma with glycan ligands of CD22.Blood 2010,115:4778；Chen,W.C.等:Targeting B lymphoma with nanoparticles bearing glycan ligands of CD22.Leuk Lymphoma 2012,53:208；Hatakeyama,S.等:Targeted drug delivery to tumor vasculature by a carbohydrate mimetic peptide.PNAS,2011,108:19587；Hong,F.等:β-Glucan Functions as an Adjuvant for Monoclonal Antibody Immunotherapy by Recruiting Tumoricidal Granulocytes as Killer Cells.Cancer Res.2003,23:9023；Kawasakia,N.等:Targeted delivery of lipid antigen to macrophages via the CD169/sialoadhesin endocytic pathway induces robust invariant natural killer T cell activation.PNAS 2013,110:7826；和Medina,S.H.等:N-acetylgalactosamine-functionalized dendrimers as hepatic cancer cell-targeted carriers.Biomaterials 2011,32:4118。

本發(fā)明的結(jié)合肽還可以用于通過(guò)多種受體來(lái)用于調(diào)節(jié)免疫響應(yīng)，所述受體包括但不限于糖受體，DC-SIGN，和/或Siglec。請(qǐng)參見：Anthony,R.M.等:Recapitulation of IVIG Anti-Inflammatory Activity with a Recombinant IgG Fc.Science 2008,320:373；Anthony,R.M.等:Identification of a receptor required for the anti-inflammatory activity of IVIG.PNAS 2008,105:19571；Kaneko,Y.等:Anti-Inflammatory Activity of Immunoglobulin G Resulting from Fc Sialylation.Science 2006,313:670；和Mattner,J.等:Exogenous and endogenous glycolipid antigens activate NKT cells during microbial infections.Nature 2005,434:525。

在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向模塊是糖肽。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，靶向模塊是三半乳糖基化的糖肽。例如乳糖₃-Cys₃Gly₄(示于如下式V中)：

[式V]。

在一些實(shí)施方案中，靶向模塊可以由式VII表示：

[式VII]。

在一些實(shí)施方案中，式(I)的效應(yīng)模塊的連接體模塊包含間隔基，其包括但不限于C_2-30烷基或1至32的PEG。在一些實(shí)施方案中，基于近似長(zhǎng)度來(lái)選擇效應(yīng)模塊的連接體模塊(圖79)。適當(dāng)?shù)拈g隔基長(zhǎng)度包括但不限于和

在一些實(shí)施方案中，式(I)的效應(yīng)模塊可以由式VIII表示：

[式VIII]，

其中q是1至29的整數(shù)(含本數(shù))。例如q可為6、8、10、11、12、16、18、或22。在示例的實(shí)施方案中，式VIII的效應(yīng)模塊可以由下式表示：

[式XIII]或

[式XIV]。

在其他實(shí)施方案中，式(I)的效應(yīng)模塊可以由式IX表示：

[式IX]，

其中p具有1-32的值。例如p可為2、4、6、8、11、12、或24。在示例的實(shí)施方案中，式IX的效應(yīng)模塊可以由式X表示：

[式X]。

在其他實(shí)施方案中，式(I)的效應(yīng)模塊可以由式XI表示：

[式XI]，

其中p具有1-32的值。例如p可為2、4、6、8、11、12、或24。在示例的實(shí)施方案中，式XI的效應(yīng)模塊可以由式XII表示：

[式XII]。

e)PEG模塊

在其他方面，效應(yīng)模塊是包含聚(乙二醇)(PEG、PEO或POE)的模塊。PEG是環(huán)氧乙烷的低聚物或聚合物，并且具有化學(xué)結(jié)構(gòu)H-(O-CH2-CH2)n-OH，其中括號(hào)中的元件重復(fù)。聚乙二醇化(或PEG化)是其中PEG聚合物鏈連接至另一分子(例如結(jié)合多肽)的過(guò)程，所述另一分子從而被描述為聚乙二醇化的(或PEG化的)。聚乙二醇化可用于降低免疫原性和抗原性以及增加其連接的分子的流體動(dòng)力學(xué)尺寸(溶液中的尺寸)，降低腎清除率和延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間。聚乙二醇化也可以使分子更易溶于水。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，PEG模塊可以包含單-PEG，雙-PEG或三-PEG。在另一個(gè)實(shí)施方案中，PEG模塊包含3至3.5個(gè)PEG。

VI.效應(yīng)模塊與結(jié)合多肽的綴合

在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)模塊綴合(直接或間接地)至改變的結(jié)合多肽的氧化聚糖(例如氧化的N-連接的聚糖)，(例如抗體CH1域的N114處的工程化聚糖或抗體F域的N297處的天然聚糖)。術(shù)語(yǔ)“氧化聚糖”是指聚糖上的醇取代基已被氧化，提供了羰基取代基。羰基取代基可以與合適的氮親核試劑反應(yīng)以形成碳-氮雙鍵。例如，羰基與氨基氧基或肼基的反應(yīng)會(huì)分別形成肟或肼。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述羰基取代基是醛。合適的氧化聚糖包括氧化半乳糖和氧化唾液酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，式(II)的修飾多肽可以是式(II)：

Ab(Gal-C(O)H)_x(Gal-Sia-C(O)H)_y

式(II)，

其中

A)Q是抗體或本文定義的其他結(jié)合多肽；

B)Gal是衍生自半乳糖的組分；

C)Sia是衍生自唾液酸的組分；

D)x是0-5；且

E)y是0-5，

其中x和y至少一個(gè)不為0。

可以使用任何本領(lǐng)域公認(rèn)的化學(xué)方法將效應(yīng)模塊(例如包含接頭模塊的效應(yīng)模塊)綴合至聚糖(參見例如Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques.Academic Press(1996)，其以其整體并入本文)。在一些實(shí)施方案中，聚糖的糖殘基(例如唾液酸或半乳糖殘基)首先被氧化(例如用高碘酸鈉處理唾液酸或用半乳糖氧化酶處理半乳糖)以生成反應(yīng)性醛基。該醛基與效應(yīng)模塊氨基氧基或肼基反應(yīng)，分別形成肟或腙接頭。采用該一般反應(yīng)策略的示例性方法闡述于實(shí)施例10至15中。

在一些實(shí)施方案中，結(jié)合多肽的天然或工程化聚糖首先在體外用糖基轉(zhuǎn)移酶預(yù)處理，以提供具有適當(dāng)反應(yīng)性的末端糖殘基。例如可以首先使用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(Gal T)和唾液酸轉(zhuǎn)移酶(Sial T)的組合來(lái)實(shí)現(xiàn)唾液酸化。在一些實(shí)施方案中，缺少半乳糖(G0F或G0)或僅含有一個(gè)半乳糖(G1F或G1)的雙分枝聚糖可以轉(zhuǎn)化為適于綴合的高階半乳糖基化或唾液酸化的結(jié)構(gòu)(G1F、G1、G2F、G2、G1S1F、G1S1、G2S1F、G2S1、G2S2F、或G2S2)。

用于產(chǎn)生唾液酸化的糖綴合物的示例性綴合策略示于圖25C中。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，使用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(Gal T)和唾液酸轉(zhuǎn)移酶(Sial T)的組合將唾液酸殘基酶促地和位點(diǎn)特異性地引入抗體的聚糖(例如Asn-297處的天然聚糖)。然后將引入的唾液酸殘基用低濃度的高碘酸鈉氧化，以產(chǎn)生適合與接頭反應(yīng)的反應(yīng)性唾液酸醛(例如氨基氧基接頭)，以生成抗體-效應(yīng)模塊綴合物(例如肟-連接的抗體-效應(yīng)模塊綴合物)。通過(guò)用體外重塑來(lái)控制聚糖的數(shù)量和唾液酸殘基的數(shù)量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以精確控制抗體-效應(yīng)模塊綴合物的藥物-抗體比率(DAR)。例如，如果將～1個(gè)唾液酸加到每條重鏈的單個(gè)雙分枝聚糖(A1F)上，可以均勻地獲得DAR為2的抗體或結(jié)合多肽。

VII.修飾的結(jié)合多肽

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了作為綴合效應(yīng)模塊的產(chǎn)物的修飾多肽綴合(直接或通過(guò)接頭模塊)至一個(gè)或多個(gè)氧化聚糖(例如氧化的N-連接聚糖)改變的結(jié)合多肽(例如抗體CH1域的N114處的工程化聚糖或抗體F域的N297處的天然聚糖)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽可以是式(III)：

Ab(Gal-C(H)＝N-Q-CON-X)_x(Gal-Sia-C(H)＝N-Q-CON-X)_y

式(III)，

其中：

A)Ab是如本文定義的抗體；

B)Q是NH或O；

C)CON是如本文定義的連接體模塊；

D)X是如本文定義的靶向模塊；

E)Gal是衍生自半乳糖的組件；

F)Sia是衍生自唾液酸的組件；

G)x是0-5；且

H)y是0-5，

其中x和y至少一個(gè)不為0。

在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽可以是式(III)可以是式(IIIa)：

Ab(Gal-C(H)＝N-Q-CH₂-C(O)-Z-X)_x(Gal-Sia-C(H)＝N-Q-CH₂-C(O)-Z-X)_y

式(IIIa)，

其中：

A)Ab是抗體；

B)Q是NH或O；

C)Z是Cys-(MC)_a-(VC)_b-(PABC)_c-(C₁₆H₃₂O₈C₂H₄)_f-，其中

i.Cys是衍生自半胱氨酰氨的組分；

ii.MC是衍生自馬來(lái)酰亞胺的組分；

iii.VC是衍生自與瓜氨酸偶聯(lián)的纈氨酸的組分；

iv.PABC是衍生自4-氨基芐基氨基甲酸酯的組分；

v.X是效應(yīng)模塊(例如如本文所定義的靶向模塊)；

vi.a是0或1；

vii.b是0或1；

viii.c是0或1；且

ix.f是0或1；

D)X是如本文定義的治療劑；

E)Gal是衍生自半乳糖的組件；

F)Sia是衍生自唾液酸的組件；

G)x是0-5；且

H)y是0-5，

其中x和y至少一個(gè)不為0。

應(yīng)當(dāng)理解，式(III)不意欲暗示抗體、Gal取代基、和Gal-Sia取代基以鏈樣方式連接。相反，當(dāng)存在這樣的取代基時(shí)，抗體直接連接至每個(gè)取代基。例如，其中x為1且y為2的式(III)的結(jié)合多肽可以具有如下所示的排布：

式(III)

式(III)中的CON取代基及其中的組件如式(I)針對(duì)效應(yīng)模塊所描述的那樣。

在一個(gè)實(shí)施方案中，Q是NH。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Q是O。

在一個(gè)實(shí)施方案中，x是0。

式(III)的抗體Ab可以是如本文所述的任何合適的抗體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了制備式(III)的結(jié)合多肽的方法，所述方法包括使式(I)的效應(yīng)模塊：

NH₂-Q-CON-X

式(I)，

其中：

A)Q是NH或O；

B)CON是連接體模塊；且

C)X是效應(yīng)模塊(例如本文所定義的靶向模塊)；

與式(II)的修飾抗體進(jìn)行反應(yīng)

Ab(OXG)_r

式(II)

其中

A)OXG是氧化聚糖；且

B)r選0至4；

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了制備式(III)的結(jié)合多肽的方法，所述方法包括使式(I)的效應(yīng)模塊：

NH₂-Q-CON-X

式(I)

其中：

A)Q是NH或O；

B)CON是連接體模塊；且

C)X是效應(yīng)模塊(例如本文所定義的靶向模塊)；

與式(IIa)的修飾抗體進(jìn)行反應(yīng)

Ab(Gal-C(O)H)_x(Gal-Sia-C(O)H)_y

式(IIa)，

其中

A)Ab是如本文定義的抗體；

B)Gal是衍生自半乳糖的組件；

C)Sia是衍生自唾液酸的組件；

D)x是0-5；且

E)y是0-5，

其中x和y至少一個(gè)不為0。

VII.用修飾抗體治療的方法

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療或診斷對(duì)其有需要的患者的方法，其包括施用有效量的本文公開的結(jié)合多肽。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，提供了用于在需要這種治療的哺乳動(dòng)物受試者中診斷和/或治療病癥(例如腫瘤性病癥)的試劑盒和方法。在一些示例性實(shí)施方案中，所述受試者是人。

本發(fā)明的結(jié)合多肽可用于許多不同的應(yīng)用中。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，主題結(jié)合多肽可用于減少或消除具有由結(jié)合多肽的結(jié)合域識(shí)別的表位的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，主題結(jié)合多肽在降低循環(huán)中的可溶性抗原的濃度或消除循環(huán)中的可溶性抗原方面是有效的。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合多肽可以減小腫瘤尺寸，抑制腫瘤生長(zhǎng)和/或延長(zhǎng)荷瘤動(dòng)物的存活時(shí)間。因此，本發(fā)明還涉及通過(guò)向這樣的人或動(dòng)物施用有效的、非毒性量的修飾抗體來(lái)治療人或其他動(dòng)物中的腫瘤的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定修飾的結(jié)合多肽的何種有效無(wú)毒量可用于治療惡性腫瘤的目的。例如修飾抗體或其一個(gè)或多個(gè)片段的治療活性量可根據(jù)如下因素而變化：例如疾病階段(例如I期對(duì)比IV期)，年齡，性別，醫(yī)學(xué)并發(fā)癥(例如免疫抑制的病況或疾病)和受試者的體重，以及修飾的抗體在受試者中引發(fā)期望的響應(yīng)的能力?？梢哉{(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳治療響應(yīng)。例如，可以每天施用若干分開的劑量，或者可以按照治療緊急情況所指示按比例減少劑量。

一般而言，本發(fā)明中提供的組合物可用于預(yù)防性或治療性地治療任何包含抗原標(biāo)記物的腫瘤，所述抗原標(biāo)記物允許通過(guò)修飾的抗體靶向癌細(xì)胞。

VIII.施用修飾抗體或其片段的方法

制備本發(fā)明的結(jié)合多肽和將其施用與受試者的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的或容易確定的。本發(fā)明的結(jié)合多肽的施用途徑可以是口服，腸胃外，吸入或局部施用。本文所用的術(shù)語(yǔ)腸胃外包括靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，直腸或陰道給藥。雖然所有這些給藥形式被清楚地預(yù)期在本發(fā)明的范圍內(nèi)，但是用于施用的形式會(huì)是用于注射的溶液，特別是用于靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)注射或滴注的溶液。通常，用于注射的合適的藥物組合物可以包含緩沖液(例如乙酸鹽，磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液)，表面活性劑(例如聚山梨酸酯)，任選的穩(wěn)定劑(例如人白蛋白)等。然而，在可與本文的教導(dǎo)兼容的其他方法中，可將修飾的抗體直接遞送到不良細(xì)胞群體的部位，由此增加患病組織對(duì)于治療劑的暴露。

在一個(gè)實(shí)施方案中，施用的結(jié)合多肽是式(III)的結(jié)合多肽：

Ab(Gal-C(H)＝N-Q-CON-X)_x(Gal-Sia-C(H)＝N-Q-CON-X)_y

式(III)，

其中：

A)Ab是如本文定義的抗體；

B)Q是NH或O；

C)CON是如本文定義的連接體模塊；

D)X是效應(yīng)模塊(例如本文定義的靶向模塊)；

E)Gal是衍生自半乳糖的組件；

F)Sia是衍生自唾液酸的組件；

G)x是0-5；且

H)y是0-5，

其中x和y至少一個(gè)不為0。

腸胃外施用的制備物包括無(wú)菌水溶液或非水溶液，懸浮液和乳液。非水溶劑的實(shí)例是丙二醇，聚乙二醇，植物油(如橄欖油)，和可注射的有機(jī)酯類如油酸乙酯。水性載劑包括水，醇/水溶液，乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。在本發(fā)明的組合物和方法中，藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于0.01-0.1M，例如0.05M磷酸鹽緩沖液或0.8％鹽水。其他常用的胃腸外介質(zhì)包括磷酸鈉溶液，林格氏右旋糖(Ringer's dextrose)，右旋糖和氯化鈉，乳酸林格氏液(lactated Ringer's)或固定油。靜脈內(nèi)介質(zhì)包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，電解質(zhì)補(bǔ)充劑，例如基于林格氏右旋糖的那些，等等。還可以存在防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑，抗氧化劑，螯合劑和惰性氣體等。更具體地，適于注射用途的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液(其中水可溶)或分散液和用于臨時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。在這種情況下，組合物必須是無(wú)菌的，并且應(yīng)當(dāng)具有流動(dòng)性到易于注射的程度。它在制造和儲(chǔ)存條件下應(yīng)該是穩(wěn)定的，并且通常在防止微生物(例如細(xì)菌和真菌)的污染作用的條件下保存。載體可以是含有例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散介質(zhì)?？梢岳缤ㄟ^(guò)使用包衣/涂層如卵磷脂，(在分散液的情況下)通過(guò)維持所需的粒徑和通過(guò)使用表面活性劑來(lái)保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。

防止微生物的作用可以通過(guò)各種抗菌劑和抗真菌劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如對(duì)羥基苯甲酸酯類(parabens)，氯丁醇，苯酚，抗壞血酸，硫柳汞(thimerosal)等實(shí)現(xiàn)。在許多情況下，其包括等張劑，例如組合物中的糖，多元醇，如甘露醇，山梨醇或氯化鈉。可以通過(guò)在組合物中包含延遲吸收的制劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來(lái)實(shí)現(xiàn)可注射組合物的延長(zhǎng)吸收。

在任何情況下，可通過(guò)將所需量的活性化合物(例如修飾的結(jié)合多肽本身或與其它活性劑組合)在適當(dāng)溶劑中的溶液連同本文列舉的成分的一種或組合進(jìn)行合并來(lái)制備無(wú)菌注射溶液，如所需要的那樣，隨后過(guò)濾滅菌。通常，通過(guò)將活性化合物摻入無(wú)菌介質(zhì)中來(lái)制備分散液，所述無(wú)菌介質(zhì)含有基礎(chǔ)/堿性分散基質(zhì)和來(lái)自上文列舉的那些的所需其它成分。對(duì)于用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末而言，示例性的制備方法包括真空干燥和冷凍干燥，其從之前無(wú)菌過(guò)濾的溶液產(chǎn)出活性成分加任何額外的所需成分的粉末。將注射用制備物進(jìn)行加工，裝入容器如安瓿，袋，瓶，注射器或小瓶中，并根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法在無(wú)菌條件下密封。此外，制備物可以以試劑盒的形式包裝和出售，如在共同未決的U.S.S.N.09/259,337和U.S.S.N.09/259,338中所述的那些，其各自通過(guò)提述并入本文。這種制品通常具有標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書，表明相關(guān)組合物可用于治療患有或傾向于患有自身免疫病癥或腫瘤性病癥的受試者。

用于治療上述病況的本發(fā)明組合物的有效劑量根據(jù)許多不同因素而變化，包括施用方式，靶位點(diǎn)，患者的生理狀態(tài)，患者是人還是動(dòng)物，施用的其它藥物，以及治療是預(yù)防性還是治療性的。通?；颊呤侨?，但是也可以治療非人哺乳動(dòng)物，包括轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法滴定治療劑量，以優(yōu)化安全性和效力。

對(duì)于用結(jié)合多肽進(jìn)行被動(dòng)免疫而言，劑量范圍可以是例如約0.0001至100mg/kg，更通常為0.01至5mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg，2mg/kg等)的宿主體重。例如劑量可以是1mg/kg體重或10mg/kg體重，或是范圍為1-10mg/kg，例如至少1mg/kg。介于上述范圍之間的劑量也意圖在本發(fā)明的范圍內(nèi)。受試者可以每天，每隔一天(on alternative days)，每周或根據(jù)通過(guò)經(jīng)驗(yàn)分析確定的任何其他時(shí)間安排來(lái)施用這樣的劑量。示例性的治療需要在延長(zhǎng)的時(shí)間(例如至少6個(gè)月)以多劑施用。另外的示例性治療方案需要每?jī)芍芤淮位蛎吭乱淮位蛎?至6個(gè)月一次施用。示例性劑量方案包括連續(xù)天的1-10mg/kg或15mg/kg，每隔一天30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，同時(shí)施用具有不同結(jié)合特異性的兩種或更多種單克隆抗體，在這種情況下施用的每種抗體的劑量落在指示的范圍內(nèi)。

本發(fā)明的結(jié)合多肽可以在多種情況下施用。單次劑量之間的間隔可以是每周，每月或每年。間隔也可以是不規(guī)則的，如通過(guò)測(cè)量患者中修飾的結(jié)合多肽或抗原的血液水平所指示的那樣。在一些方法中，調(diào)節(jié)劑量以實(shí)現(xiàn)1-1000μg/ml的血漿修飾結(jié)合多肽濃度，在一些方法中濃度為25-300μg/ml?；蛘?，結(jié)合多肽可以作為持續(xù)釋放制劑施用，在這種情況下需要較低頻率的施用。對(duì)于抗體而言，劑量和頻率根據(jù)患者中抗體的半衰期而變化。一般來(lái)說(shuō)，人源化抗體顯示出最長(zhǎng)的半衰期，然后是嵌合抗體和非人抗體。

施用的劑量和頻率可以根據(jù)治療是預(yù)防性的還是治療性的而變化。在預(yù)防性應(yīng)用中，將含有本抗體或其混合物的組合物施用于尚未處于疾病狀態(tài)的患者以增強(qiáng)患者的抵抗性。這樣的量被定義為“預(yù)防有效劑量”。在該用途中，精確的量還取決于患者的健康狀況和一般免疫力，但通常范圍為每劑0.1至25mg，特別是每劑0.5至2.5mg。相對(duì)低的劑量以相對(duì)不頻繁的間隔在長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)施用。一些患者在其余生中繼續(xù)接受治療。在治療應(yīng)用中，有時(shí)需要相對(duì)較短的間隔的相對(duì)較高的劑量(例如，每劑約1至400mg/kg的抗體，5至25mg的劑量更常用于放射免疫綴合物和更高劑量的細(xì)胞毒素-藥物修飾的抗體)，直到疾病的進(jìn)展降低或終止，或者直到患者顯示出疾病癥狀的部分或完全改善。此后，可以對(duì)患者施用預(yù)防方案。

本發(fā)明的結(jié)合多肽可以任選地與能有效治療需要治療的病癥或病癥的其它試劑(例如預(yù)防性或治療性的)組合施用。本發(fā)明的90Y標(biāo)記的修飾抗體的有效單一治療劑量(即治療有效量)的范圍為約5至約75mCi，例如約10至約40mCi。¹³¹I修飾的抗體的有效單一治療非骨髓消融(ablative)劑量范圍為約5至約70mCi，或約5至約40mCi。¹³¹I標(biāo)記的抗體的有效單一治療消融劑量(即可能需要自體骨髓移植)范圍為約30至約600mCi，例如約50至小于約500mCi。在與嵌合抗體相的聯(lián)合中，由于相對(duì)于鼠抗體更長(zhǎng)的循環(huán)半衰期，碘-131標(biāo)記的嵌合抗體的有效單一治療非骨髓消融劑量范圍為約5至約40mCi，例如小于約30mCi。例如¹¹¹In標(biāo)記的成像標(biāo)準(zhǔn)通常小于約5mCi。

雖然結(jié)合多肽可以如上文所述施用，但必須強(qiáng)調(diào)的是，在其它實(shí)施方案中，結(jié)合可以作為一線治療施用于健康患者。在這樣的實(shí)施方案中，結(jié)合多肽可以施用于具有正?；蚱骄t骨髓儲(chǔ)備的患者和/或施用于沒有經(jīng)歷過(guò)和沒有正在經(jīng)歷的患者。如本文所用的，修飾的抗體或其片段與輔助治療的聯(lián)合或組合施用是指所述治療和公開的抗體的序貫的，同時(shí)的(simultaneous)，同延的(coextensive)，并行的(concurrent)，相伴的(concomitant)，或同期的(contemporaneous)施用或應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，組合治療方案的各種組分的施用或應(yīng)用可以進(jìn)行時(shí)間安排以增強(qiáng)治療的整體有效性。例如，化療劑可以在標(biāo)準(zhǔn)的眾所周知的治療療程中施用，隨后在幾周內(nèi)進(jìn)行本發(fā)明的放射免疫綴合物治療。相反地，細(xì)胞毒素相關(guān)結(jié)合多肽可以靜脈內(nèi)施用，然后進(jìn)行腫瘤局部外部束輻射。在其他實(shí)施方案中，修飾的結(jié)合多肽可以與一種或多種所選擇的化療劑在單次診所拜訪中同時(shí)施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員(例如經(jīng)驗(yàn)豐富的腫瘤學(xué)家)會(huì)容易地能夠基于所選擇的輔助療法和本說(shuō)明書的教導(dǎo)來(lái)識(shí)別有效的組合治療方案而無(wú)需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。

在這方面，應(yīng)當(dāng)理解，結(jié)合多肽和化療劑的組合可以以對(duì)患者提供治療益處的任何順序和任何時(shí)間范圍內(nèi)施用。也就是說(shuō)，化療劑和結(jié)合多肽可以以任何順序或同時(shí)施用。在選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合多肽會(huì)施用于既往經(jīng)歷過(guò)化療的患者。在其它實(shí)施方案中，結(jié)合多肽和化療治療是基本上同時(shí)或并行施用的。例如，可以在經(jīng)歷化療過(guò)程的同時(shí)給予患者結(jié)合多肽。在一些實(shí)施方案中，修飾的抗體在任何化療劑或治療的一年內(nèi)施用。在其它實(shí)施方案中，結(jié)合多肽在任何化療劑或治療的10、8、6、4或2個(gè)月內(nèi)施用。在其它實(shí)施方案中，結(jié)合多肽在任何化療劑或治療的4、3、2或1周內(nèi)施用。在其它實(shí)施方案中，結(jié)合多肽將在所選擇的化療劑或治療的5、4、3、2或1天內(nèi)施用。還應(yīng)理解的是，兩種試劑或治療可在約幾小時(shí)或幾分鐘內(nèi)(即基本上同時(shí))施用于患者。

還應(yīng)理解的是，本發(fā)明的結(jié)合多肽可以與消除，降低，抑制或控制贅生性細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)的任何化療劑或制劑聯(lián)合或組合使用(例如以提供組合的治療方案)。與本發(fā)明相容的示例性化療劑包括烷化劑，長(zhǎng)春花生物堿類(例如長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春花堿)，甲基芐肼，甲氨蝶呤和潑尼松。四藥組合MOPP(mechlethamine(氮芥)、長(zhǎng)春新堿(Oncovin)、甲基芐肼和潑尼松)在治療各種類型的淋巴瘤中非常有效。在MOPP耐藥的患者中，可以使用ABVD(例如阿霉素、博來(lái)霉素、長(zhǎng)春花堿和達(dá)卡巴嗪)，ChIVPP(CH1orambucil(苯丁酸氮芥)、長(zhǎng)春花堿、甲基芐肼和潑尼松)，CABS(洛莫司汀，多柔比星，博來(lái)霉素和鏈唑霉素)，MOPP加ABVD，MOPP加ABV(多柔比星、博來(lái)霉素和長(zhǎng)春花堿)或BCVPP(卡莫司汀、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春花堿、甲基芐肼和潑尼松)組合。Arnold S.Freedman和Lee M.Nadler,Malignant Lymphomas,in HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 1774-1788(Kurt J.Isselbacher等編,第13版.1994)和V.T.DeVita等,(1997)及其中引用的參考文獻(xiàn)用于標(biāo)準(zhǔn)給藥和時(shí)間安排。這些治療可以不改變地使用，或根據(jù)具體患者的需要，與本文所述的本發(fā)明的一種或多種結(jié)合多肽組合使用。

在本發(fā)明的情況中有用的其他方案包括使用單一烷化劑例如環(huán)磷酰胺或苯丁酸氮芥，或組合如CVP(環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿和潑尼松)，CHOP(CVP和多柔比星)，C-MOPP(環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿，潑尼松和甲基芐肼)，CAP-BOP(CHOP加甲基芐肼和博來(lái)霉素)，m-BACOD(CHOP加甲氨蝶呤、博來(lái)霉素和甲酰四氫葉酸)，ProMACE-MOPP(潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷和甲酰四氫葉酸加標(biāo)準(zhǔn)MOPP)，ProMACE-CytaBOM(潑尼松、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、阿糖胞苷、博來(lái)霉素、長(zhǎng)春新堿、甲氨蝶呤和甲酰四氫葉酸)和MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、固定劑量潑尼松、博來(lái)霉素和甲酰四氫葉酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地確定這些方案中的每一個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)劑量和時(shí)間安排。CHOP還與博來(lái)霉素、甲氨蝶呤、甲基芐肼、氮芥、阿糖胞苷和依托泊苷組合。其它相容的化療劑包括但不限于2-氯脫氧腺苷(2-CDA)，2'-脫氧助間型霉素和氟達(dá)拉濱。

對(duì)于未能實(shí)現(xiàn)緩解的或是復(fù)發(fā)的中級(jí)和高級(jí)NHL(非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma))患者，使用挽救治療。挽救治療采用單獨(dú)或組合給予的藥物，如胞嘧啶阿拉伯糖苷、卡鉑、順鉑、依托泊苷和異環(huán)磷酰胺。在復(fù)發(fā)或侵襲性形式的某些腫瘤病癥中，經(jīng)常使用以下方案：IMVP-16(異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)，MIME(甲基-gag、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)，DHAP(地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑)，ESHAP(依托泊苷、甲潑尼龍(methylpredisolone)、HD阿糖胞苷、順鉑)，CEPP(B)(環(huán)磷酰胺、依托泊苷、甲基芐肼、潑尼松和博來(lái)霉素)和CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松)，其各自按照眾所周知的給藥速率和時(shí)間表使用。

用于與本發(fā)明的修飾抗體組合使用的化療劑的量可以根據(jù)受試者而變化或可根據(jù)本領(lǐng)域所知的知識(shí)來(lái)施用。參見例如Bruce A Chabner等,Antineoplastic Agents,in GOODMAN&GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287((Joel G.Hardman等編,第9版.1996)。

如前所述，本發(fā)明的結(jié)合多肽，其免疫反應(yīng)性片段或重組體可以以藥學(xué)有效量施用，用于哺乳動(dòng)物病癥的體內(nèi)治療。在這方面，應(yīng)當(dāng)理解，所公開的結(jié)合多肽會(huì)被配制以便于施用和促進(jìn)活性劑的穩(wěn)定性。

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的非毒性無(wú)菌載劑，如生理鹽水、無(wú)毒緩沖劑、防腐劑等等。出于本申請(qǐng)的目的，綴合或未綴合有治療劑的修飾的結(jié)合多肽、其免疫反應(yīng)性片段或重組體的藥學(xué)有效量，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是指足以達(dá)到對(duì)抗原的有效結(jié)合并達(dá)到有益效果的量，例如緩解疾病或病癥的癥狀或檢測(cè)到物質(zhì)或細(xì)胞。對(duì)于腫瘤細(xì)胞的情況而言，修飾的結(jié)合多肽可以與贅生性細(xì)胞或免疫反應(yīng)性細(xì)胞上所選擇的免疫反應(yīng)性抗原相互作用，并導(dǎo)致這些細(xì)胞的死亡增加。當(dāng)然，本發(fā)明的藥物組合物可以以單劑量或多劑量施用，以提供藥學(xué)上有效量的修飾的結(jié)合多肽。

根據(jù)本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的結(jié)合多肽可以根據(jù)上述治療方法以足以產(chǎn)生治療或預(yù)防效果的量施用于人或其它動(dòng)物。本發(fā)明的結(jié)合多肽可以以常規(guī)劑型施用于這樣的人或其它動(dòng)物，所述常規(guī)劑型根據(jù)已知技術(shù)通過(guò)將本發(fā)明的抗體與常規(guī)藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合而制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，藥學(xué)上可接受的載劑或稀釋劑的形式和特性由與其組合的活性成分的量、施用途徑和其它公知的變量決定。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)理解，包含本發(fā)明中描述的一種或多種類型的結(jié)合多肽的混合物可以被證明是特別有效的。

IX.結(jié)合多肽的表達(dá)

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼本文公開的結(jié)合多肽的多核苷酸。還提供了制備結(jié)合多肽的方法，其包括表達(dá)這些多核苷酸。

編碼本文公開的結(jié)合多肽的多核苷酸通常被插入表達(dá)載體中用于引入宿主細(xì)胞中，所述宿主細(xì)胞可用于產(chǎn)生所需量的要求保護(hù)的抗體或其片段。因此，在一些方面，本發(fā)明提供了包含本文公開的多核苷酸的表達(dá)載體和包含這些載體和多核苷酸的宿主細(xì)胞。

出于說(shuō)明書和權(quán)利要求的目的，本文所用的術(shù)語(yǔ)“載體”或“表達(dá)載體”是指這樣的載體，其根據(jù)本發(fā)明用作導(dǎo)入細(xì)胞中并表達(dá)所需基因的載體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，這樣的載體可以容易地選自下組：質(zhì)粒，噬菌體，病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。通常，與本發(fā)明相容的載體會(huì)包含選擇標(biāo)記，促進(jìn)所需基因的克隆的適當(dāng)限制性位點(diǎn)和進(jìn)入真核或原核細(xì)胞中和/或在其中復(fù)制的能力。

出于本發(fā)明的目的，可以采用許多表達(dá)載體系統(tǒng)。例如，一類載體利用源自動(dòng)物病毒如牛乳頭瘤病毒，多瘤病毒，腺病毒，痘苗病毒，桿狀病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其他的涉及使用具有內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)的多順?lè)醋酉到y(tǒng)。此外，可以通過(guò)引入允許選擇轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的一種或多種標(biāo)記物來(lái)選擇將DNA整合到其染色體中的細(xì)胞。標(biāo)記物可以提供對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主的原養(yǎng)(prototrophy)、殺生物劑抗性(例如抗生素)或?qū)χ亟饘倮玢~的抗性。選擇性標(biāo)記基因可以直接連接至待表達(dá)的DNA序列，或通過(guò)共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入相同的細(xì)胞中。還可能需要另外的元件用于mRNA的最佳合成。這些元件可以包括信號(hào)序列，剪接信號(hào)，以及轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和終止信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，將克隆的可變區(qū)基因連同如上所述合成的重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因(如人基因)一起插入表達(dá)載體中。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明中表征的結(jié)合多肽可以使用多順?lè)醋訕?gòu)建體表達(dá)。在這樣的表達(dá)系統(tǒng)中，可以從單個(gè)多順?lè)醋訕?gòu)建體產(chǎn)生多種感興趣的基因產(chǎn)物，如抗體的重鏈和輕鏈。這些系統(tǒng)有利地使用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)在真核宿主細(xì)胞中提供相對(duì)高水平的多肽。相兼容的IRES序列公開于美國(guó)專利號(hào)6,193,980，其通過(guò)提述并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，此類表達(dá)系統(tǒng)可以用于有效地產(chǎn)生本申請(qǐng)中公開的全部范圍的多肽。

更通常地，一旦制備了編碼抗體或其片段的載體或DNA序列，就可以將表達(dá)載體引入合適的宿主細(xì)胞中。也就是說(shuō)，可以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種技術(shù)將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞。這些包括但不限于轉(zhuǎn)染(包括電泳和電穿孔)，原生質(zhì)體融合，磷酸鈣沉淀，具有包膜DNA的細(xì)胞融合，顯微注射和用完整病毒感染。參見Ridgway,A.A.G."Mammalian Expression Vectors"Chapter 24.2,pp.470-472Vectors,Rodriguez and Denhardt,Eds.(Butterworths,Boston,Mass.1988)。使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在適于產(chǎn)生輕鏈和重鏈的條件下生長(zhǎng)，并測(cè)定其重鏈和/或輕鏈蛋白質(zhì)合成。示例性測(cè)定技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，放射免疫測(cè)定(RIA)或熒光激活細(xì)胞分選儀分析(FACS)，免疫組化等。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”應(yīng)廣義地用于指將DNA引入受體宿主細(xì)胞，其改變基因型并因此導(dǎo)致受體細(xì)胞的改變。

與之類似地，“宿主細(xì)胞”是指已經(jīng)用載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，所述載體使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建并編碼至少一個(gè)異源基因。除另有說(shuō)明外，在從重組宿主分離多肽的過(guò)程的描述中，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用以表示抗體的來(lái)源。換言之，從“細(xì)胞”回收多肽可以意指從離心沉淀(spun down)的全細(xì)胞或從包含培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物回收。

在一個(gè)實(shí)施方案中，用于抗體表達(dá)的宿主細(xì)胞系是哺乳動(dòng)物來(lái)源的；本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定最適合于在其中表達(dá)所需基因產(chǎn)物的具體宿主細(xì)胞系。示例性的宿主細(xì)胞系包括但不限于DG44和DUXB11(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系，DHFR減)，HELA(人子宮頸癌)，CVI(猴腎細(xì)胞系)，COS(CVI與SV40T抗原的衍生物)，R1610(中國(guó)倉(cāng)鼠成纖維細(xì)胞)，BALBC/3T3(小鼠成纖維細(xì)胞)，HAK1(倉(cāng)鼠腎系)，SP2/O(小鼠骨髓瘤)，BFA-1c1BPT(牛內(nèi)皮細(xì)胞)，RAJI(人淋巴細(xì)胞)，293(人腎臟)。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞系提供由其表達(dá)的抗體的改變的糖基化，例如非巖藻糖基化(例如PER.C6.RTM.(Crucell)或敲除FUT8的CHO細(xì)胞系(Potelligent.RTM.Cells)(Biowa,Princeton,N.J.))。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用NS0細(xì)胞。宿主細(xì)胞系通常可從商業(yè)服務(wù)機(jī)構(gòu)，美國(guó)組織培養(yǎng)物保藏中心(American Tissue Culture Collection)或從公開的文獻(xiàn)獲得。

體外生產(chǎn)允許按比例放大以產(chǎn)生大量的所需多肽。組織培養(yǎng)條件下的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且包括均質(zhì)懸浮培養(yǎng)，例如在氣升式反應(yīng)器或連續(xù)攪拌反應(yīng)器中，或是固定或包埋的細(xì)胞培養(yǎng)，例如在中空纖維，微膠囊中，在瓊脂糖微珠或陶瓷盒上。如有必要和/或需要，多肽溶液可以通過(guò)常規(guī)色譜方法來(lái)純化，例如凝膠過(guò)濾，離子交換色譜，DEAE-纖維素色譜和/或(免疫)親和色譜。

編碼結(jié)合多肽的一個(gè)或多個(gè)基因也可以在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，例如細(xì)菌或酵母或植物細(xì)胞。在這方面，應(yīng)當(dāng)理解，各種單細(xì)胞非哺乳動(dòng)物微生物例如細(xì)菌也可以加以轉(zhuǎn)化；即能夠在培養(yǎng)或發(fā)酵中生長(zhǎng)的那些。對(duì)轉(zhuǎn)化敏感的細(xì)菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌屬(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)，例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌屬(Pneumococcus)；鏈球菌屬(Streptococcus)和流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)。還應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)在細(xì)菌中表達(dá)時(shí)，多肽可以成為包涵體的一部分。多肽必須加以分離、純化，然后組裝成功能分子。

除原核生物外，也可以使用真核微生物。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常見的面包酵母是真核微生物中最常用的，盡管許多其它菌株通常是可用的。為了在酵母屬中表達(dá)，質(zhì)粒YRp7(例如Stinchcomb等,Nature,282:39(1979)；Kingsman等,Gene,7:141(1979)；Tschemper等,Gene,10:157(1980))是通常使用的。該質(zhì)粒已經(jīng)含有TRP1基因，其為缺乏在色氨酸中的生長(zhǎng)能力的酵母突變株提供選擇標(biāo)記，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones,Genetics,85:12(1977))。然后，作為酵母宿主細(xì)胞基因組特征的trp1損傷的存在提供了用于檢測(cè)轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境，其通過(guò)在缺乏色氨酸的條件下的生長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行。

實(shí)施例

本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，這些實(shí)施例不應(yīng)被解釋為進(jìn)一步的限制。在本申請(qǐng)中引用的序列表、附圖和所有參考文獻(xiàn)，專利和公開的專利申請(qǐng)的內(nèi)容通過(guò)提述明確地并入本文。

實(shí)施例1.2C3抗CD-52高糖基化抗體突變體的設(shè)計(jì)、制備和表征

在抗CD-52抗體2C3的重鏈中設(shè)計(jì)了多個(gè)高糖基化突變，目的是將大基團(tuán)添加至相互作用界面(例如FcRn結(jié)合位點(diǎn)以調(diào)節(jié)抗體藥代動(dòng)力學(xué))，用于通過(guò)改變其與FcγR的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)抗體的效應(yīng)功能，或引入用于效應(yīng)模塊綴合的新型交聯(lián)位點(diǎn)亞序列化學(xué)修飾，包括但不限于藥物、毒素、細(xì)胞毒性劑、放射性核苷酸等。高糖基化2C3突變體列于表3中。

表3.高糖基化的2C3抗CD-52突變體

1A.2C3抗CD-52抗體高糖基化突變體的生成

通過(guò)誘變PCR將基于Kabat編號(hào)系統(tǒng)指定的A114N突變(相當(dāng)于EU位置118)引入2C3的CH1域。為了產(chǎn)生全長(zhǎng)抗體，通過(guò)連接非依賴性克隆(LIC)將VH域加突變的A114N殘基插入編碼抗體CH域1-3的pENTR-LIC-IgG1載體中。通過(guò)使用QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA,USA)的定點(diǎn)誘變，將所有其它突變引入pENTR-LIC-IgG1。通過(guò)LIC將WT 2C3VH克隆到突變的載體中。通過(guò)Gateway克隆將全長(zhǎng)突變體克隆到pCEP4(-E+I)Dest表達(dá)載體中?；贓U編號(hào)系統(tǒng)來(lái)指定Fc突變。通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)證實(shí)突變。WT 2C3重鏈和輕鏈和突變的2C3重鏈的氨基酸序列示于表4中。突變的氨基酸用陰影表示，并且通過(guò)突變生成的共有糖基化靶位點(diǎn)用下劃線表示。

表4.2C3抗CD-52抗體的氨基酸序列

將突變體和WT對(duì)照轉(zhuǎn)染至6孔板形式的HEK293-EBNA細(xì)胞中。如圖9A所示，通過(guò)SDS-PAGE和Western印跡分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平為～0.1μg/ml。還在Biacore上通過(guò)蛋白A捕獲測(cè)量了條件培養(yǎng)基中突變體的表達(dá)。在注入固定化的蛋白A后6分鐘使用解離反應(yīng)來(lái)測(cè)定濃度。使用在培養(yǎng)基中從90μg/mL至1.5ng/mL連續(xù)稀釋的CHO產(chǎn)生的WT 2C3作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)使用4參數(shù)擬合的校準(zhǔn)曲線將濃度計(jì)算降至～0.2μg/mL。如圖9B所示，相對(duì)表達(dá)水平低，并且通常與Western印跡結(jié)果相一致。

1B.高糖基化的驗(yàn)證

為了確定是否通過(guò)突變引入了額外的糖基化位點(diǎn)，用通用的非糖基化酶PNGase F處理2C3突變體和野生型蛋白，并通過(guò)SDS-PAGE和Western印跡分析蛋白質(zhì)樣品。如圖10所示，只有A114N突變體具有增加的表觀分子量，表明存在額外的N-連接的糖類。

產(chǎn)生了小規(guī)模抗體制備物以純化2C3突變體，用于進(jìn)一步驗(yàn)證糖基化位點(diǎn)引入。如圖11所示，通過(guò)SDS-PAGE證實(shí)，僅有A114N突變體具有引入的額外的糖基化位點(diǎn)。

1C.2C3抗CD-52突變體的結(jié)合特性

用Biacore來(lái)比較純化的蛋白質(zhì)的結(jié)合特性。將小鼠和SEC純化的人FcRn-HPC4通過(guò)胺綴合固定在CM5芯片上。將每種抗體稀釋至200、50和10nM，并注射在固定化的Fc受體上。納入Campath，CHO產(chǎn)生的WT 2C3和DEPC處理的Campath作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。如圖13所示，Y436S突變體顯示出對(duì)人FcRn結(jié)合的約2倍降低。有趣的是，該突變體對(duì)小鼠FcRn的結(jié)合不受影響。沒有其他2C3突變對(duì)人或小鼠FcRn結(jié)合有任何重大的影響。

用Biacore來(lái)比較純化蛋白的抗原結(jié)合特性，其使用CD-52肽741 Biacore結(jié)合測(cè)定法來(lái)進(jìn)行。將CD-52肽741和對(duì)照肽777固定至CM5芯片?？贵w在HBS-EP中從60至0.2nM連續(xù)稀釋2倍，并一式兩份注射3分鐘，然后在緩沖液中以50μL/分鐘的流速解離5分鐘。納入GLD52批次17200-084作為對(duì)照。表面用1個(gè)脈沖的40mM HCl再生成。使用1:1結(jié)合模型來(lái)擬合7.5至0.2nM曲線。如圖16所示，在該測(cè)定中A114N突變體具有略低的CD-52結(jié)合親和力，而NGT突變體具有略高于其余突變體的親和力。用從較大規(guī)模制備物純化的蛋白來(lái)重復(fù)CD-52肽741Biacore結(jié)合測(cè)定。如圖17所示，A114N突變體表現(xiàn)出與WT2C3相當(dāng)?shù)腃D-52肽結(jié)合。

1D.A114N突變體的電荷表征

進(jìn)行等電聚焦(IEF)以表征2C3突變體的電荷。純化的蛋白在固定化的pH梯度(pH3-10)丙烯酰胺(IPG)凝膠上運(yùn)行。如圖18A所示，發(fā)現(xiàn)A114N具有更多的負(fù)電荷，可能是由于唾液酸殘基所致。完整的MS數(shù)據(jù)證實(shí)了在A114N突變體上的具有唾液酸的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。相比之下，WT 2C3顯示具有G0F和G1F作為主要的糖基化種類(分別為圖18C和18D)。

實(shí)施例2.數(shù)種抗體骨架中高糖基化突變體的制備

除了2C3抗CD-52抗體之外，在幾個(gè)其他抗體骨架中進(jìn)行了A114N突變的工程化改造以證實(shí)可以將獨(dú)特的高糖基化位點(diǎn)引入無(wú)關(guān)的重鏈可變區(qū)序列中。高糖基化的抗TEM1、抗FAP和抗Her2突變體列于表5中。

表5.一些無(wú)關(guān)的抗體骨架中設(shè)計(jì)的A114N和/或S298N突變體

2A.抗TEM1和抗FAP抗體高糖基化突變體的生成

通過(guò)誘變PCR將基于Kabat編號(hào)系統(tǒng)指定的A114N突變引入抗TEM1和抗FAP的CH1域。為了產(chǎn)生全長(zhǎng)抗體，通過(guò)連接非依賴性克隆(LIC)將突變的VH加上殘基114插入編碼抗體CH域1-3的pENTR-LIC-IgG1載體中。然后通過(guò)Gateway克隆將全長(zhǎng)突變體克隆至pCEP4(-E+I)Dest表達(dá)載體中。通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)突變?？筎EM1野生型和突變的重鏈和輕鏈的氨基酸序列示于表6中。突變的氨基酸用陰影表示，并且通過(guò)突變產(chǎn)生的共有糖基化靶位點(diǎn)通過(guò)劃線表示。

表6.抗TEM1和抗FAP抗體的氨基酸序列

將突變體和野生型對(duì)照以三燒瓶(triple flask)形式轉(zhuǎn)染至HEK293-EBNA細(xì)胞中，并在HiTrap蛋白A柱(GE Healthcare Biosciences，Pittsburgh，PA，USA)上純化。如通過(guò)A280在NanoDrop分光光度計(jì)上分析的，抗FAP A114N和抗FAP A114C的表達(dá)分別為約3μg/ml和約1μg/ml?？筎EM1 A114N的表達(dá)約為0.04μg/ml。

2B.高糖基化的驗(yàn)證

為了證實(shí)額外的糖基化位點(diǎn)被引入了A114N突變體中，在還原性SDS-PAGE上用野生型對(duì)照蛋白分析來(lái)自A114N突變體的純化蛋白。一個(gè)額外的糖基化位點(diǎn)會(huì)增加2000-3000道爾頓的重鏈分子量。如圖20所示，SDS-PAGE表明抗FAP和抗TEM1 A114N突變體重鏈條帶具有增加的表觀分子量，這與成功引入至兩個(gè)抗體的額外糖基化位點(diǎn)一致。

2C.抗Her2抗體高糖基化突變體的生成

通過(guò)連接非依賴性克隆生成Her-2 A114N、Her-2 A114N/NNAS和WT Her-2抗體。合成赫賽汀的VH域(WT或帶有A114N突變)，并用兩個(gè)LIC相容的引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為了獲得全長(zhǎng)抗體，將擴(kuò)增的VH插入片段(WT或A114N)克隆至編碼CH 1-3域的兩個(gè)pENTR載體，即pENTR-LIC-IgG1 WT和pENTR-LIC-IgG1 NNAS中，產(chǎn)生三個(gè)全長(zhǎng)突變體(A114N，NNAS，A114N/NNAS)和WT對(duì)照作為pENTR上的進(jìn)入克隆。通過(guò)Gateway克隆將這些突變體克隆至pCEP4(-E+I)Dest表達(dá)載體中。通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)突變?？笻er-2野生型和突變的重鏈和輕鏈的氨基酸序列示于表7中。突變的氨基酸以陰影表示，并且通過(guò)突變產(chǎn)生的共有糖基化靶位點(diǎn)以下劃線表示。

表7.抗Her-2抗體的氨基酸序列

2D.A114N抗Her2抗體高糖基化突變體的表達(dá)

將A114N抗Her2和野生型構(gòu)建體用Lipofectamine-2000(試劑與DNA的比例為2.5:1)和XtremeGene HP(試劑與DNA的比例為3:1)轉(zhuǎn)染至12個(gè)三燒瓶中的HEK293-EBNA細(xì)胞中。來(lái)自第3天條件培養(yǎng)基(CM)的等分試樣的Octet測(cè)量顯示，Lipofectamine-2000和XtremeGene HP二者在6個(gè)燒瓶中的蛋白表達(dá)是一致的。如表8所示，XtremeGene HP的總轉(zhuǎn)染效率高出了約30％。對(duì)于兩種轉(zhuǎn)染條件將第3天收集的條件培養(yǎng)基匯集在一起，并通過(guò)蛋白A柱純化。Octet測(cè)量顯示，在含血清的模擬培養(yǎng)基中1.8ug/ml抗體，而在無(wú)血清模擬培養(yǎng)基中顯示為0ug/ml l。

表8.A114N抗Her2高糖基化突變體表達(dá)

從第6天收集條件培養(yǎng)基，并針對(duì)每種轉(zhuǎn)染條件分別進(jìn)行純化。兩種洗脫物分別緩沖液交換至PBS，pH 7.2中，并使用Amicon-4(50kD截留)柱濃縮～15倍。與第3天CM相比，第6天CM顯示更高的表達(dá)水平。如表8所示，從第6天條件培養(yǎng)基產(chǎn)生總共3mg赫賽汀A114N 15.59mg/ml(來(lái)自Lipofectamine轉(zhuǎn)染)和6mg赫賽汀A114N 16.86mg/ml(來(lái)自XtremeGene HP轉(zhuǎn)染)用于其他的下游應(yīng)用，如抗體-藥物綴合。

2E.A114N抗Her2突變體的SDS-PAGE和HIC分析

在綴合之前，通過(guò)SDS-PAGE和HIC(疏水相互作用色譜)來(lái)表征純化的A114N赫賽汀。如圖21所示，確定純化的A114N赫賽汀的質(zhì)量為適于進(jìn)一步的下游應(yīng)用。

2F.與工程化的糖基化的綴合

已證明了：a)在抗TEM1上的Kabat位置114(EU位置118)位點(diǎn)處引入了糖基化位點(diǎn)；b)A114N突變體通過(guò)還原SDS-PAGE在重鏈上具有高糖基化；和c)通過(guò)完整LC/MS發(fā)現(xiàn)A114N高糖基化突變體具有復(fù)合糖類結(jié)構(gòu)，包括末端唾液酸和半乳糖，其對(duì)于SAM和GAM綴合是理想的。為了證實(shí)工程化的糖基化位點(diǎn)適于綴合，通過(guò)氨基氧基化學(xué)方法將抗TEM1 A114N與5kDa PEG綴合。如圖22所示，PEG通過(guò)氨基氧基連接成功地綴合至抗TEM1 A114N。還在抗FAP和抗CD-52 2C3骨架上成功制備了該突變體(未示出)。這些數(shù)據(jù)表明N114處的糖基化位點(diǎn)可用于效應(yīng)模塊的綴合。

實(shí)施例3：S298N/Y300S Fc突變體的產(chǎn)生

設(shè)計(jì)并產(chǎn)生了工程化Fc變體，其中在EU位置Ser 298處引入了新的糖基化位點(diǎn)，其相鄰于天然存在的Asn297位點(diǎn)。在Asn297處的糖基化是維持的或是通過(guò)突變而消除。突變和所需的糖基化結(jié)果列于表9。

表9.多種抗體變體的糖基化狀態(tài)

3A.H66 αβ-TCR抗體改變的糖基化變體的生成

使用pENTR_LIC_IgG1模板，通過(guò)Quikchange對(duì)αβT細(xì)胞受體抗體克隆#66的重鏈進(jìn)行突變。用LIC引物擴(kuò)增HEBE1δab IgG1#66的VH域，然后通過(guò)LIC將其克隆到突變或野生型pENTR_LIC_IgG1中以產(chǎn)生全長(zhǎng)突變體或野生型抗體。用DraIII/XhoI雙重消化來(lái)驗(yàn)證亞克隆，在成功的克隆中產(chǎn)生大約1250bp大小的插入片段。然后通過(guò)Gateway克隆將那些全長(zhǎng)突變體克隆至表達(dá)載體pCEP4(-E+I)Dest中。通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)證實(shí)突變。WT H66抗αβTCR重鏈和輕鏈和突變的H66重鏈的氨基酸序列示于表10中。突變的氨基酸以陰影表示，并且通過(guò)突變產(chǎn)生的共有糖基化靶位點(diǎn)以下劃線表示。

表10.H66抗αβTCR抗體的氨基酸序列

將突變體、野生型和兩個(gè)非糖基化的對(duì)照(pCEP4中的HEBE1 Agly IgG4和HEBE1δab IgG1)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至三重?zé)恐械腍EK293-EBNA細(xì)胞中，用于表達(dá)。使用多通道蠕動(dòng)泵用1ml HiTrap蛋白A柱(GE)從160ml條件培養(yǎng)基(CM)純化蛋白質(zhì)。在4-20％Tris-甘氨酸還原的和非還原的SDS-PAGE凝膠上分析5微克的每種所得上清液(參見圖2)。非糖基化突變體(N297Q，T299A和非糖基化對(duì)照)的重鏈進(jìn)一步遷移(箭頭)，與這些抗體中聚糖的損失相一致。然而，工程化的糖基化抗體(NSY，STY，SY，δab和wt對(duì)照，箭頭)的重鏈與野生型對(duì)照相似地遷移。該結(jié)果與EU位置298處的工程化糖基化位點(diǎn)的存在相一致。SEC-HPLC分析表明所有突變體表達(dá)為單體。

3B.通過(guò)LC-MS的糖基化分析

將工程化的H66 IgG1 Fc變體用20mM DTT在37℃部分還原30分鐘。然后在與QSTAR qq TOF雜交系統(tǒng)(Applied Biosystems)綴合的Agilent 1100毛細(xì)管HPLC系統(tǒng)上通過(guò)毛細(xì)管LC/MS分析樣品。在Analyst QS 1.1(Applied Bisoystem)中使用具有基線校正和計(jì)算機(jī)建模的貝葉斯蛋白重建用于數(shù)據(jù)分析。在S298N/T299A/Y300S H66抗體突變體中，在氨基酸298處觀察到一個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中雙分枝和三分枝復(fù)合型聚糖被檢測(cè)為除G0F、G1F和G2F之外的主要種類(參見圖34)。這種改變的糖基化譜是一致的，其將糖基化轉(zhuǎn)移到N298處，而不是在N297處的野生型糖基化位點(diǎn)。

3C.用Biacore得到的αβTCR抗體突變體對(duì)人FcγRIIIa和FcγRI的結(jié)合特性

用Biacore來(lái)評(píng)估與重組人FcγRIIIa(V158&F158)和FcγRI的結(jié)合。CM5芯片的所有四個(gè)流動(dòng)池通過(guò)Biacore提供的標(biāo)準(zhǔn)胺綴合程序用抗HPC4抗體加以固定。將抗HPC4抗體在10mM乙酸鈉pH 5.0中稀釋至50μg/mL用于偶聯(lián)反應(yīng)，并以5μL/分鐘注射25分鐘。將大約12,000RU的抗體固定至芯片表面。將重組人FcγRIIIa-V158和FcγRIIIa-F158在結(jié)合緩沖液(含有1mM CaCl₂的HBS-P)中稀釋至0.6μg/mL，并以5μL/分鐘分別注射至流動(dòng)池2和4中3分鐘以捕獲抗HPC4芯片上的300-400RU受體。為了區(qū)分低結(jié)合劑，在抗HPC4表面上捕獲比在該測(cè)定中通常使用的多三倍的rhFcγRIIIa。流動(dòng)池1和3用作參比對(duì)照。將每種抗體在結(jié)合緩沖液中稀釋至200nM，并于所有四個(gè)流動(dòng)池注射4分鐘，然后在緩沖液中解離5分鐘。用10mM EDTA在HBS-EP緩沖液中以20μL/分鐘將表面再生3分鐘。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖3中。

Biacore也用于比較FcγRI結(jié)合。使用Zeba脫鹽柱將抗四His抗體進(jìn)行緩沖液交換至10mM乙酸鈉pH 4.0中，并在用于胺綴合的乙酸鹽緩沖液中稀釋至25μg/mL。在以5μL/分鐘注射20分鐘后，用～9000RU的抗四-His抗體固定CM5芯片的兩個(gè)流動(dòng)池。如在前的實(shí)驗(yàn)中一樣，將多出10倍的FcγRI捕獲至抗四-His表面，以比較具有弱結(jié)合的樣品。將重組人FcγRI在HBS-EP結(jié)合緩沖液中稀釋10μg/mL，并以5μL/分鐘的速度注射至流動(dòng)池2中1分鐘，以將～1000RU受體捕獲至抗四-His芯片。在捕獲的受體和對(duì)照表面上以30μL/分鐘注射單一濃度的100nM抗體3分鐘。隨后，監(jiān)測(cè)解離三分鐘。然后以20μL/分鐘的10mM甘氨酸pH 2.5的兩次30秒注射來(lái)再生表面。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖4中。

這些結(jié)果證明糖工程化的突變體對(duì)FcγRIIIa或FcγRI的結(jié)合顯著降低。H66S298N/T299A/Y300S尤其幾乎完全消除了對(duì)兩種受體的結(jié)合。選擇該突變體用于更詳細(xì)的分析。

3D.使用圓二色性(CD)進(jìn)行的穩(wěn)定性表征

通過(guò)Far-UV CD熱熔解實(shí)驗(yàn)來(lái)監(jiān)測(cè)S298N/T299A/Y300S抗體突變體的穩(wěn)定性，其中監(jiān)測(cè)216nm和222nm處的CD信號(hào)，其隨著溫度升高導(dǎo)致抗體解折疊(變性)。

通過(guò)熱電散熱器(peltier)(Jasco型AWC100)控制溫度，并且其以1℃/分鐘的速率從25增加至89℃。在Jasco 815分光光度計(jì)上以約0.5mg/mL的蛋白質(zhì)濃度在具有10mm路徑長(zhǎng)度的石英比色皿(Hellma，Inc)中的PBS緩沖液中收集CD光譜。掃描速度為50nm/分鐘，且數(shù)據(jù)間距(data pitch)為0.5nm。使用2.5nm的帶寬，及介質(zhì)的靈敏度設(shè)置。從210-260nm收集CD信號(hào)和HT電壓，數(shù)據(jù)間隔為0.5nm，溫度間隔為1℃，每個(gè)樣品進(jìn)行四次重復(fù)掃描。結(jié)果表明δAB H66和S298N/T299A/Y300S H66突變體都具有相似的熱行為并且具有大約相同的降解起始溫度(約63℃)(圖35)，這進(jìn)一步表明它們具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性。

實(shí)施例4：Fc工程化突變體的功能性分析

通過(guò)PBMC增殖測(cè)定和細(xì)胞因子釋放測(cè)定來(lái)評(píng)估Fc-工程化的突變體。在PBMC增殖測(cè)定中，將人PBMC與增加的濃度的治療性抗體一起培養(yǎng)72小時(shí)，加入³H-胸苷并在18小時(shí)后收獲細(xì)胞。對(duì)于T細(xì)胞消耗/細(xì)胞因子釋放測(cè)定，將人PBMC與增加的濃度的治療性抗體一起培養(yǎng)，并每天分析細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活力(Vi-Cell，Beckman Coulter)至第7天。同樣收獲細(xì)胞上清液，儲(chǔ)藏于-20℃并在8-叢細(xì)胞因子面板(Bio-Rad)上分析。

將正常供體PBMC解凍并在如下條件下處理(均在含有補(bǔ)體的培養(yǎng)基中)：未處理的；BMA031，moIgG2b 10ug/ml；OKT3，moIgG2a 10ug/ml；H66，huIgG1δAB 10ug/ml、1ug/ml和0.1ug/ml；H66，huIgG1 S298N/T299A/Y300S 10ug/ml、1ug/ml和0.1ug/ml。

在第2天(D2)和第4天(D4)收集細(xì)胞因子用于Bioplex分析(IL2、IL4、IL6、IL8、IL10、GM-CSF、IFNg、TNFa)。在D4對(duì)細(xì)胞進(jìn)行CD4、CD8、CD25和abTCR表達(dá)的染色。

如圖5-8所示的結(jié)果表明，H66S298N/T299A/Y300S在所進(jìn)行的所有基于細(xì)胞的測(cè)定中表現(xiàn)得與H66δAB相似，顯示出CD25表達(dá)的最小T細(xì)胞激活，對(duì)abTCR的結(jié)合(具有與δAB稍微不同的動(dòng)力學(xué))，以及在D2和D4時(shí)間點(diǎn)的最小細(xì)胞因子釋放。因此，S298N/T299A/Y300S突變體與δAB突變一樣有效地消除效應(yīng)功能。

實(shí)施例5：抗CD52抗體骨架中工程化Fc變體的制備與表征

除了H66抗αβTCR抗體外，還在抗CD52抗體骨架(克隆2C3)中進(jìn)行了S298N/Y300S突變的工程化。然后檢查該突變體以確定在S298N/Y300S H66抗αTCR抗體中觀察到的效應(yīng)功能調(diào)節(jié)是否與另一抗體骨架中的一致。

5A.2C3抗CD52抗體改變的糖基化變體的生成

首先，使用pENTR_LIC_IgG1通過(guò)快速變化誘變制備S298N/Y300S 2C3變體DNA，并通過(guò)LIC將WT 2C3 VH克隆至突變載體中。使用Gateway技術(shù)將全長(zhǎng)突變體克隆至pCEP4(-E+I)Dest表達(dá)載體中。隨后通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)突變，并且序列示于表11中。突變的氨基酸以陰影表示，并且通過(guò)突變產(chǎn)生的共有糖基化靶位點(diǎn)以下劃線表示。然后將突變體轉(zhuǎn)染至6孔板形式的HEK293-EBNA細(xì)胞中，并從條件培養(yǎng)基純化蛋白質(zhì)?？笴D52 2C3野生型抗體作為對(duì)照平行產(chǎn)生。使用SD-PAGE和Western印跡分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平為0.1μg/mL(圖9A)。突變體在純條件培養(yǎng)基中的表達(dá)也通過(guò)Biacore上的蛋白A捕獲來(lái)測(cè)量。在固定化的蛋白A注射6分鐘后使用解離響應(yīng)來(lái)測(cè)定濃度。使用在培養(yǎng)基中從90μg/mL至1.5ng/mL連續(xù)稀釋的CHO產(chǎn)生的WT 2C3作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)使用4-參數(shù)擬合的校準(zhǔn)曲線計(jì)算約0.2μg/mL內(nèi)的濃度。相對(duì)表達(dá)水平低并且通常與Western印跡數(shù)據(jù)一致(圖9B)。

表11.抗CD52克隆2C3抗體序列

5B.用PNGaseF進(jìn)行的糖基化分析

為了評(píng)價(jià)通過(guò)突變引入的額外的糖基化位點(diǎn)，用PNGase F將富集的S298N/Y300S突變體去糖基化。去糖基化沒有表現(xiàn)出分子量的任何明顯變化，這指示沒有額外的糖類存在(圖10)。進(jìn)行小規(guī)模制備以純化這些突變體用于進(jìn)一步表征，并且結(jié)果再次證實(shí)在S298N/Y300S突變體上不存在額外的糖類(圖11)。

5C.用Biacore得到的2C3抗CD52抗體突變體對(duì)人FcγRIIIa的結(jié)合特性

Biacore還用于表征純化的抗體的抗原結(jié)合，F(xiàn)cγRIII，和結(jié)合特性(參見圖12、13和14)。S298N/Y300S 2C3變體與CD52肽緊密結(jié)合，并且結(jié)合傳感圖與野生型對(duì)照無(wú)法區(qū)分，表明該突變不影響其抗原結(jié)合(圖12A)。

為了測(cè)定Fc效應(yīng)功能，在結(jié)合研究中使用FcγRIII受體(Val158)。將突變體和野生型對(duì)照抗體稀釋至200nM，并注射至HPC4標(biāo)簽捕獲的FcγRIIIa。對(duì)于S298N/Y300S突變體幾乎檢測(cè)不到FcγRIII結(jié)合，其指示該變體失去效應(yīng)功能(圖12B和圖14A)。為了進(jìn)一步測(cè)定Fc效應(yīng)功能，F(xiàn)cγRIII受體(Phe158)也用于結(jié)合研究。將突變體和野生型對(duì)照抗體稀釋至200nM，并注射至HPC4標(biāo)簽捕獲的FcγRIIIa。對(duì)于S298N/Y300S突變體，幾乎檢測(cè)不到FcγRIII結(jié)合，這指示Phe158變體的效應(yīng)功能喪失(圖14B)。最后，使用Biacore比較純化蛋白的FcRn結(jié)合性質(zhì)。將小鼠和SEC純化的人FcRn-HPC4通過(guò)胺偶聯(lián)固定至CM5芯片。將每種抗體稀釋至200、50和10nM，并注射到受體上。納入Campath，CHO產(chǎn)生的WT 2C3，和DEPC處理的Campath作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。這些數(shù)據(jù)顯示突變體以與野生型抗體對(duì)照相同的親和力結(jié)合至人和鼠FcRn受體二者，并且其可能在其循環(huán)半衰期或其它藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)方面沒有改變。(參見圖12C，圖13A和B)。因此，S298N/Y300S突變通常適用于抗體，以減少或消除不需要的Fc效應(yīng)功能，例如通過(guò)人Fcγ受體的銜接。

實(shí)施例6：S298N/Y300S突變體中的循環(huán)免疫復(fù)合體檢測(cè)

還使用針對(duì)S298N/Y300S突變體和WT對(duì)照的C1q結(jié)合測(cè)定來(lái)研究了循環(huán)免疫復(fù)合體檢測(cè)。用濃度范圍為10-0.001μg/ml的100μl的2倍連續(xù)稀釋于包被緩沖液(0.1M NaCHO₃pH 9.2)中的2C3Ab將高結(jié)合的Costar 96孔板在4℃包被過(guò)夜。ELISA分析顯示與WT相比，S298N/Y300S突變體的C1q結(jié)合降低(圖15A)。抗Fab Ab與包被的2C3Ab的結(jié)合證實(shí)了孔的等同包被(圖15B)。

實(shí)施例7：用等電點(diǎn)聚焦對(duì)S298N/Y300S突變體的分離和分析

運(yùn)行pH 3-10等電聚焦(IEF)凝膠以表征S298N/Y300S突變體。發(fā)現(xiàn)S298/Y300S具有更多的負(fù)電荷，因此，可能唾液酸分子更多(圖18A)。完整的MS顯示S298N/Y300S突變體和WT 2C3具有G0F和G1F作為主要的糖基化種類(分別為圖18B和D)。

實(shí)施例8：S298N/Y300S的抗原結(jié)合親和力

用Biacore來(lái)比較已經(jīng)從較小(圖16)和較大(圖17)規(guī)模表達(dá)制備和純化的WT抗CD52 2C3 Ab和S298N/Y300S突變體的抗原結(jié)合親和力。獲得了固定有CD52肽741和對(duì)照肽777的CM5芯片?？贵w在HBS-EP中從60至0.2nM連續(xù)稀釋2倍，然后在芯片表面注射3分鐘，隨后在緩沖液中以50μl/分鐘的流速解離5分鐘。然后用40mM HCl的脈沖再生表面。這些分析一式兩份進(jìn)行，并證明S298N/Y300S突變體和WT 2C3抗體顯示出相當(dāng)?shù)腃D52肽結(jié)合。

設(shè)計(jì)培養(yǎng)基篩選平臺(tái)以在純化之前測(cè)試功能性結(jié)合性質(zhì)，以篩選在小規(guī)模轉(zhuǎn)染期間產(chǎn)生的抗體。使用Octet(圖19A)來(lái)進(jìn)行這些測(cè)試以確定濃度和使用的蛋白A生物傳感器和GLD52標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品在HBS-Ep中稀釋至7.5和2nM，用于使用Biacore進(jìn)行的CD52結(jié)合比較(圖19B)。肽結(jié)合測(cè)定的結(jié)果顯示S298N/Y300S突變體和WT 2C3抗體都具有相當(dāng)?shù)腃D52肽結(jié)合。此外，這些分析表明Octet和Biacore在預(yù)測(cè)來(lái)自小規(guī)模轉(zhuǎn)染的抗體的抗原結(jié)合方面運(yùn)行良好。

實(shí)施例9：其他抗體骨架中的S298N/Y300S、S298N/T299A/Y300S和N297Q/S298N/Y300S改變的糖基化突變體的制備

除了抗αβ-TCR抗體和2C3抗CD-52抗體之外，還在其他抗體骨架中工程化了S298/Y300S、S298N/T299A/Y300S、和N297Q/S298N/Y300S突變，以證實(shí)可以將其他的串聯(lián)糖基化位點(diǎn)引入不相關(guān)的重鏈可變域序列。擇一地糖基化的抗CD-52 12G6和抗Her2突變體在表12和13中列出。突變的氨基酸以陰影表示，并且通過(guò)突變產(chǎn)生的共有糖基化靶位點(diǎn)以下劃線表示。

表12：抗CD52克隆12G6抗體序列

表13：抗Her2抗體序列

實(shí)施例10：含有反應(yīng)性聚糖模塊的改變的抗體的生成

為了生成含有能夠與衍生的效應(yīng)模塊反應(yīng)的含有聚糖模塊的抗體，使用糖基轉(zhuǎn)移酶和相關(guān)的糖核苷酸供體首先在體外將抗HER抗體糖基化。例如，為了引入唾液酸殘基，首先用β-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶將供體抗體進(jìn)行半乳糖基化，然后根據(jù)Kaneko等(Kaneko,Y.,Nimmerjahn,F.,and Ravetch,J.V.(2006)anti-inflammatory activity of immunoglobulin G resulting from Fc sialylation.Science 313,670-3)的方法用α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶將其唾液酸化。使用β-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(50mU/mg，Sigma)和α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(5ug/mg,R&D系統(tǒng))與供體糖核苷酸底物、UDP-半乳糖(10mM)和CMP-唾液酸(10mM)在含有5mM MnCl₂的50mM MES緩沖液(pH 6.5)中于一鍋合成步驟中進(jìn)行反應(yīng)。將含有5mg/ml抗HER2抗體的反應(yīng)混合物在37℃溫育48小時(shí)。使用全甲基化聚糖(其通過(guò)PNGase F從抗體釋放)的MALDI-TOF MS分析，用Dionex HPLC的唾液酸含量分析，以及用SNA(一種特異性針對(duì)α2,6-唾液酸的凝集素)的凝集素印跡，來(lái)驗(yàn)證唾液酸化。

通過(guò)PNGase F處理唾液酸化的抗HER2抗體而釋放的聚糖的MALDI-TOF分析表明，天然聚糖已經(jīng)主要由單唾液酸化的雙分枝結(jié)構(gòu)A1F(圖27A)以及少量的雙唾液酸化的種類完全重塑。用較高量的α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理抗體產(chǎn)生了更均質(zhì)的A1F糖型的群體，表明酶活性或聚糖定位可以防止完全唾液酸化。唾液酸含量確定為每mol抗體～2mol，這與作為主要糖型種類的A1F聚糖一致(圖27B)。用SAN凝集素，特異性針對(duì)α2,6-連接的唾液酸的歐洲接骨木(Sambucus nigra)凝集素進(jìn)行的凝集素印跡證實(shí)了唾液酸以α2,6-連接的構(gòu)型存在(圖27C)。

總之，雖然天然蛋白聚糖有點(diǎn)異質(zhì)性，通過(guò)半乳糖基和唾液酸轉(zhuǎn)移酶重塑產(chǎn)生具有單唾液酸化但完全半乳糖基化的雙分枝聚糖(A1F)的幾乎均質(zhì)的抗體。在每個(gè)分枝的聚糖上的兩個(gè)半乳糖受體上僅引入～1個(gè)唾液酸可能是由于來(lái)自聚糖的一個(gè)半乳糖的有限的可及性(accessibility)，其通常被埋在抗體中，或是由于聚糖與蛋白表面的非共價(jià)相互作用。

實(shí)施例11：含有反應(yīng)性聚糖模塊的改變的抗體的氧化

一旦唾液酸化得以驗(yàn)證，則研究用不同濃度的高碘酸鹽(0.25至2mM)對(duì)唾液酸化的抗HER2抗體的過(guò)程內(nèi)的氧化。將唾液酸化的抗體首先緩沖液交換至含有5mM EDTA的25mM Tris-HCl(pH7.5)中，然后用PBS緩沖液進(jìn)行緩沖液交換。然后將緩沖的抗體混合物施加至用PBS緩沖液預(yù)平衡過(guò)的蛋白A Sepharose柱。在用15個(gè)柱體積的PBS、15個(gè)柱體積的含有5mM EDTA的PBS、和30個(gè)柱體積的PBS洗滌柱之后，然后用25mM檸檬酸磷酸鹽緩沖液(pH 2.9)對(duì)其進(jìn)行洗脫。立即用磷酸氫鹽緩沖液中和洗脫液，并使用來(lái)自Millipore的Amicon ultra濃縮抗體。純化后，然后在冰上在黑暗中用100mM乙酸鈉緩沖液(pH 5.6)中的高碘酸鈉(Sigma)將唾液酸化的抗HER2抗體氧化30分鐘，并在冰上用3％甘油淬滅反應(yīng)15分鐘。通過(guò)超過(guò)50kDa Amicons的5輪超濾，將產(chǎn)物脫鹽并交換至100mM乙酸鈉中(pH 5.6)。圖28A顯示了用不同量的高碘酸鹽滴定的唾液酸化抗體的唾液酸含量分析。在高于0.5mM的高碘酸鹽濃度處實(shí)現(xiàn)了唾液酸殘基的完全氧化。事實(shí)上，低至0.5mM的高碘酸鹽濃度足以完全氧化引入的唾液酸。因此，選擇1mM濃度的高碘酸鹽用于供藥物綴合的唾液酸化抗體的氧化。

氧化可對(duì)抗體的完整性具有不利影響。例如，已知包含位于Fc CH3區(qū)中靠近FcRn結(jié)合位點(diǎn)的甲硫氨酸殘基(包括Met-252和Met-428)的氧化影響FcRn結(jié)合，這對(duì)于延長(zhǎng)抗體血清半衰期是至關(guān)重要的(Wang,W.,等(2011)Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibody.Mol Immunol 48,860-6)。因此，為了檢驗(yàn)高碘酸鹽氧化對(duì)于對(duì)FcRn相互作用關(guān)鍵的甲硫氨酸殘基(例如Met-252)的潛在副作用，通過(guò)胰蛋白酶肽消化的LC/MS分析確定了唾液酸化抗體的氧化狀態(tài)。該分析顯示在用1mM高碘酸鹽處理唾液酸化的曲妥珠單抗后Met-252的～30％氧化和Met-428的<10％氧化。為了確定這種程度的甲硫氨酸氧化對(duì)FcRn結(jié)合的影響，使用表面等離子共振(BIACORE)評(píng)估了每種抗體的FcRn結(jié)合動(dòng)力學(xué)。該分析揭示了與FcRn結(jié)合的微小損失(對(duì)小鼠和人FcRn為12％和26％減少，分別參見圖28B和28C)相關(guān)的氧化狀態(tài)。值得注意的是，據(jù)報(bào)道，人FcRn的Ka的～25％的減少對(duì)人FcRn轉(zhuǎn)基因小鼠的血清半衰期沒有影響，因?yàn)槊總€(gè)抗體上的單個(gè)完整FcRn位點(diǎn)足以提供功能性，和PK優(yōu)勢(shì)(Wang等，Id)。

總之，這些數(shù)據(jù)表明，通過(guò)唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理引入高碘酸鹽敏感的唾液酸殘基允許使用濃度低得多的高碘酸鹽，導(dǎo)致對(duì)抗體-FcRn相互作用和抗體完整性的最小副作用，如通過(guò)聚集評(píng)估的那樣(<1％)。因此，唾液酸化抗體的使用提供了更寬的氧化條件窗口以供使用，允許可再生地生成活性糖綴合物而不影響血清半衰期。

也可以使用半乳糖氧化酶特異性地氧化高糖基化抗體突變體中的半乳糖，以生成用于綴合的醛基。為了證實(shí)這種方法，將A114N抗TEM1抗體濃縮至13-20mg/ml，然后用溶于PBS中的20mU/mg唾液酸酶在37℃處理6小時(shí)。然后用半乳糖氧化酶(“GAO”)將脫鹽產(chǎn)物氧化，首先用5ug GAO/mg蛋白在37℃過(guò)夜，然后加入2ug GAO/mg蛋白并再溫育5小時(shí)。加入乙酸鈉以將pH調(diào)節(jié)至5.6(0.1v/v,pH5.6)，并加入DMSO以達(dá)到16％的最終反應(yīng)濃度，在綴合前加入。類似地用唾液酸酶(20mU/mg)將高糖基化突變體A114N抗HER抗體(15mg/ml)去唾液酸化，并在37℃于單一反應(yīng)中用5ug GAO/mg蛋白氧化過(guò)夜。

實(shí)施例12：反應(yīng)性效應(yīng)模塊的合成

為了促進(jìn)與醛衍生的抗體糖型的綴合，用氨基氧基-胱胺酰胺來(lái)衍生候選藥物效應(yīng)模塊(例如單甲基澳瑞他汀E(MMAE)和多拉司他汀10(Dol10))從而含有與具有醛特異反應(yīng)性的官能團(tuán)(例如氨基氧基-cys)。

簡(jiǎn)言之，為了生成氨基氧基-胱胺作為起始原料，將S-三苯甲基-L-半胱氨酰胺(362mg，1mmol)添加至t-BOC-氨基氧基乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(289mg，1mmol)的3mL的DMF溶液。3小時(shí)后反應(yīng)完成，如HPLC分析所證實(shí)。隨后將反應(yīng)混合物用30ml的二氯甲烷稀釋，并用0.1M碳酸氫鈉溶液(2×20mL)、水(2×20mL)和鹽水(2×20mL)洗滌。將溶液用無(wú)水硫酸鈉干燥、過(guò)濾并濃縮至干燥。向該干燥的殘余物添加3mL的TFA，然后添加150μL的三乙基硅烷。將所得溶液從叔丁基甲基醚沉淀，并重復(fù)該過(guò)程三次。過(guò)濾后，將殘余物在減壓條件下干燥，得到205mg的灰白色(off white)固體(67％產(chǎn)率)。該化合物無(wú)需進(jìn)一步純化即用于下一步驟。

為了產(chǎn)生氨基氧基衍生的MMAE(氨基氧基-Cys-MC-VC-PABC-MMAE)，將30.1mg的氨基氧基-胱胺(0.098mmol，2當(dāng)量)與64.6mg的MC-VC-PABC-MMAE(0.049mmol)和100μL的三乙胺組合于3mL的DMF中。根據(jù)HPLC分析在反應(yīng)完成之時(shí)將所得的反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?5分鐘。通過(guò)制備型HPLC純化化合物，得到45mg(62％)的所需產(chǎn)物，其為灰白色固體。反相HPLC分析表明化合物的純度>96％。ESI計(jì)算值C73H116N14O18S(MH)+1509.8501；實(shí)測(cè)值，m/z 1509.8469。

為了產(chǎn)生氨基氧基衍生的Dol10(氨基氧基-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10)，將7.4mg(0.024mmol，3當(dāng)量)的氨基氧基-胱胺，12mg(0.008mmol)的MC-VC-PABC-PEG8-Dol10和30μL三乙胺組合于3mL的DMF中。根據(jù)HPLC分析，反應(yīng)在15分鐘內(nèi)完成。制備型HPLC純化得到6.2mg(46％)的所需產(chǎn)物，其為灰白色固體。反相HPLC分析表明化合物的純度>96％。ESI計(jì)算值C80H124N16O19S2(MH)⁺1678.0664；實(shí)測(cè)值，m/z 1678.0613。

實(shí)施例13：反應(yīng)性效應(yīng)模塊的唾液酸介導(dǎo)的(SAM)綴合

脫鹽后，將實(shí)施例11的藥物-接頭與實(shí)施例10的氧化的唾液酸化抗體用75％DMSO(0.167v/v)以25mM的濃度組合，以獲得24:1的藥物-接頭與抗體的摩爾比和5mg/ml的最終抗體濃度。將混合物在室溫溫育過(guò)夜。使用BioBeads清除未合并的藥物-接頭和任何游離藥物。使用PD-10柱將產(chǎn)物緩沖液交換至組氨酸-吐溫緩沖液中并進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。測(cè)定內(nèi)毒素水平，并且在體內(nèi)研究中達(dá)到小于0.1EU/mg ADC。

圖29A-C顯示了糖綴合至AO-MMAE的不同唾液酸化抗體(實(shí)施例11的抗FAP B11和G11以及抗HER2抗體)的疏水相互作用色譜(HIC)。唾液酸化的HER2抗體還與藥物-接頭，AO-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10綴合(圖29D)。該分析揭示，每個(gè)抗體主要存在一個(gè)或兩個(gè)藥物綴合物，藥物對(duì)抗體比率(DAR)為1.3-1.9。與MMAE糖綴合物(圖29C)相比，Dol10糖綴合物(圖29D)的增加的保留時(shí)間可能是由于Dol10的更大的疏水性。

還使用與兩種不同藥物-接頭(AO-MMAE或AO-PEG8-Dol10)綴合的抗HER抗體以30mg的規(guī)模進(jìn)行了LC-MS分析。該分析顯示綴合后的類似的DAR值，其為1.7和1.5，這與HIC分析相當(dāng)。大小排阻色譜法(SEC)在這些綴合物中顯示了非常低水平(1％)的聚集體。

實(shí)施例14：反應(yīng)性效應(yīng)模塊的半乳糖介導(dǎo)的(GAM)綴合

將實(shí)施例11中所述的用半乳糖氧化酶在A114N抗TEM1高糖基化突變體抗體上產(chǎn)生的半乳糖醛與24摩爾過(guò)量的氨基氧基-MC-VC-PABC-MMAE藥物-接頭在抗體上通過(guò)在25℃溫育過(guò)夜而綴合，產(chǎn)生DAR為1.72的ADC綴合物。

向如實(shí)施例11所述制備的半乳糖氧化酶處理的抗HER抗體添加十分之一反應(yīng)體積的1M乙酸鈉，pH5.6，以將pH調(diào)節(jié)至5.6，并添加DMSO以使終濃度為14％，然后添加24當(dāng)量氨基氧基MC-VC-PABC-MMAE藥物接頭。將反應(yīng)在室溫溫育過(guò)夜。用Biobeads清除游離藥物和藥物-接頭，并用SEC交換產(chǎn)物緩沖液(65％產(chǎn)率)。通過(guò)HIC分析產(chǎn)物綴合物。如圖30所示，AO-MMAE綴合至～60％的分子。

實(shí)施例15：體外ADC細(xì)胞增殖測(cè)定

還將抗HER和抗FAP糖綴合物分子的體外活性與含有經(jīng)硫醇鍵連接至相同供體抗體的鉸鏈區(qū)半胱氨酸的相同藥物模塊的相應(yīng)硫醇綴合物進(jìn)行比較。硫醇綴合物含有的每個(gè)抗體(DAR)的藥物數(shù)量是糖綴合物的約兩倍?；诹虼嫉木Y合如Stefano等(Methods in Molecular Biology 2013，in press)所述進(jìn)行。然后使用Her2+SK-BR-3和Her2-MDA-MB-231細(xì)胞系來(lái)評(píng)估每個(gè)ADC的相對(duì)效力。該分析的結(jié)果示于下表15中

表15.糖綴合物和硫醇綴合物的EC₅₀比較

標(biāo)注:*通過(guò)LC-MS確定的DAR；**通過(guò)HIC確定的DAR

圖31(A-D)顯示了抗HER糖綴合物與其對(duì)應(yīng)的硫醇綴合物的體外效力的比較。將綴合物暴露于表達(dá)Her2抗原的(SK-BR-3)細(xì)胞(圖31A和C)或非表達(dá)(MDA-MB-231)細(xì)胞(圖31B和D)72小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞活力。ADC含有連接至聚糖(“糖”)或通過(guò)常規(guī)化學(xué)連接至鉸鏈區(qū)半胱氨酸(“硫醇”)的MMAE或PEG8-Dol10。如圖31A和C所示，與糖綴合物相比，觀察到硫醇綴合物的EC₅₀降低約2倍，這與前者中比后者的2倍更高的DAR一致。用高達(dá)100ug/ml的任何抗體的Her2-細(xì)胞系沒有觀察到毒性。

在用針對(duì)腫瘤抗原(FAP)的抗體制備的ADC的細(xì)胞增殖中也觀察到類似的趨勢(shì)，所述腫瘤抗原在包括結(jié)腸癌、胰腺癌和乳腺癌的上皮癌中由反應(yīng)性基質(zhì)成纖維細(xì)胞高度表達(dá)(Teicher,B.A.(2009)Antibody-drug conjugate targets.Curr Cancer Drug Targets 9,982-1004)。通過(guò)將氨基氧基MMAE藥物-接頭或馬來(lái)酰亞胺MMAE藥物-接頭與聚糖或硫醇基團(tuán)綴合，再次制備這些綴合物。這些綴合物的細(xì)胞增殖測(cè)定顯示，與圖32中描述的相同的缺乏FAP表達(dá)的細(xì)胞相比，硫醇綴合物的EC₅₀對(duì)于用人FAP轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞具有約100倍高的效力，其顯示了抗FAP B11糖綴合物和硫醇綴合物的體外效力的比較。在綴合物暴露于用或不用FAP抗原轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞后測(cè)定細(xì)胞活力。ADC含有連接至聚糖(“糖”)或通過(guò)常規(guī)化學(xué)連接至鉸鏈區(qū)半胱氨酸(“硫醇”)的MMAE。注意，與糖綴合物相比，硫醇的約低2倍的EC₅₀與每個(gè)抗體遞送的藥物的相對(duì)量一致，假設(shè)表達(dá)抗原的CHO細(xì)胞中靶結(jié)合和內(nèi)化的效率相似。平行地，測(cè)定如之前所述的DAR為1.5的抗FAP(B11)ADC的糖綴合物，并顯示出比對(duì)比物硫醇綴合物約2倍高的EC₅₀(DAR 3.3)。

如圖36所示，當(dāng)在表達(dá)SK-BR-3的細(xì)胞或MDA-MB-231細(xì)胞上測(cè)定時(shí)，如實(shí)施例14所述，在用具有A114N高糖基化突變的抗HER抗體和AO-MMAE制備的ADC的細(xì)胞增殖測(cè)定中觀察到了類似的趨勢(shì)。A114N糖綴合物清楚地顯示了針對(duì)Her2表達(dá)細(xì)胞系相對(duì)于非表達(dá)系的增強(qiáng)的細(xì)胞毒性。與用相同抗體制備的SialT糖綴合物相比的相對(duì)毒性與該制備物的較低載藥量是一致的。

還對(duì)ADC進(jìn)行了細(xì)胞增殖測(cè)定，所述ADC用具有A114N高糖基化突變的抗TEM1抗體和如實(shí)施例14中所述制備的AO-MMAE來(lái)制備。用TEM1表達(dá)細(xì)胞系SJSA-1和A673觀察到了與非表達(dá)的MDA-MB-231系相比更高的毒性。與具有相同抗體的常規(guī)硫醇綴合物相比，毒性水平與該制備物的載藥量(DAR)保持一致。

總之，藥物通過(guò)聚糖與可切割接頭的位點(diǎn)特異性綴合產(chǎn)生具有毒性和體外效力的ADC，其等同于常規(guī)的基于硫醇的綴合物，如使用不同的抗體和不同的藥物-接頭所證明的那樣。此外，低于2mM高碘酸鹽，藥物綴合的水平與唾液酸的減少相關(guān)。增加高碘酸鹽濃度高于2mM幾乎沒有益處，如從唾液酸向氧化形式的完全轉(zhuǎn)化所預(yù)期的。然而，在所有條件下，每個(gè)抗體的藥物數(shù)量略低于唾液酸含量，指示一些氧化的唾液酸可能類似地不可用于偶聯(lián)，這是由于被埋入或者以其他方式因藥物-接頭的體量產(chǎn)生的位阻所致。

實(shí)施例16：抗體藥物綴合物的體內(nèi)表征

還在Her2+腫瘤細(xì)胞異種移植模型中評(píng)估了抗HER糖綴合物的效力，并與具有～2倍更高的DAR的硫醇綴合物比較物進(jìn)行比較。將SK-OV-3Her2+腫瘤細(xì)胞植入Beige/SCID小鼠，在開始治療之前允許其建立～150mm³的腫瘤。在第38、45、52和59天通過(guò)尾部血管注射3或10mg/kg劑量的ADC。每組～10只小鼠。測(cè)量不同組中小鼠的腫瘤體積并記錄其存活。基于Kaplan-Meier方法繪制存活曲線。

圖33(A-D)顯示了Her2+腫瘤細(xì)胞異種移植模型中抗HER糖綴合物和硫醇綴合物的體內(nèi)效力的比較。用具有～2倍更高的DAR的含有糖綴合物或硫醇綴合物比較物的MMAE(圖33A和B)和PEG8-Dol10(圖33C和D)給予植入有SK-OV-3Her2+腫瘤細(xì)胞的Beige/SCID小鼠。MMAE綴合物的腫瘤生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)顯示于圖33A中。在這種情況下，糖綴合物顯示出比裸抗體單獨(dú)(黑色)顯著更高的效力，但其效力小于具有～2倍更高的DAR的硫醇綴合物比較物(綠色)。MMAE糖綴合物顯示出顯著的腫瘤消退和～20天的腫瘤生長(zhǎng)延遲(圖33A)和從第一劑量開始的存活時(shí)間的～2倍的增加(圖33B)。硫醇MMAE綴合物在相同的ADC劑量(10mg/kg)處顯示接近完全腫瘤抑制。

還在相同的Her2+腫瘤細(xì)胞異種移植物模型中確定了PEG8-Dol10糖綴合物(“Glyco Dol10”)和具有～2倍更高的DAR(“Thiol Dol10”)的硫醇綴合物比較物的體內(nèi)效力。兩種綴合物均顯示出比前文所述的MMAE綴合物更低的效力。然而，10mg/kg的氨基氧基-PEG8-Dol10糖綴合物(“Glyco Dol10”)在第一次施用后顯示出15天的腫瘤生長(zhǎng)延遲(圖33C)，以及～20天的存活期增加(1.7倍)(圖33D)。硫醇綴合物在相同劑量下更有效，顯示出存活率的2倍增加。在較低劑量(3mg/kg)處，硫醇綴合物顯示比10mg/kg的糖綴合物更低的效力。該劑量對(duì)應(yīng)于80umol PEG8-Dol10藥物/kg劑量，相比于對(duì)糖綴合物為110umol PEG8-Dol10藥物/kg劑量。

這些數(shù)據(jù)表明藥物對(duì)抗體聚糖的唾液酸的位點(diǎn)特異性綴合產(chǎn)生作用的分子，所述分子具有與經(jīng)基于硫醇化學(xué)方法產(chǎn)生的ADC相當(dāng)?shù)男ЯΑＤ撤N程度上較低的體內(nèi)效力可能源于每種抗體通過(guò)每種抗體結(jié)合的抗原的內(nèi)化而攜帶至腫瘤細(xì)胞中的較少數(shù)量的藥物。盡管我們沒有將這些糖綴合物與相同DAR的硫醇綴合物進(jìn)行比較，但在代表相當(dāng)?shù)氖┯盟幬锼降膬煞NADC的不同劑量處觀察到的效力顯示，糖綴合物具有與它們的硫醇對(duì)應(yīng)物相當(dāng)?shù)膬?nèi)在效力，指示在該位點(diǎn)處綴合沒有有害影響。此外，僅多引入了28％的藥物的10mg/kg劑量的Dol10糖綴合物提供了相比于硫醇綴合物(3mg/kg)2倍的存活率增加，表明這些綴合物甚至可以在相同的DAR處提供優(yōu)越的效力。鑒于在天然聚糖處的唾液酸摻入的明顯限制，可以通過(guò)許多不同的策略實(shí)現(xiàn)更高的載藥量，包括使用分枝的藥物接頭或引入額外的糖基化位點(diǎn)并使用相同的方法。

實(shí)施例17：靶向模塊的綴合

圖37顯示了用于將靶向模塊綴合至現(xiàn)有糖類或工程化的糖基化位點(diǎn)的整體方案。這種綴合可以通過(guò)將新聚糖、糖肽或其他靶向模塊附接至氧化的唾液酸化抗體來(lái)進(jìn)行(圖38和39)。適合綴合的模塊可以包括含有氨基氧基接頭的那些(圖40和41)。

實(shí)施例18：天然Fc聚糖中經(jīng)唾液酸的綴合

將Man-6-P六甘露糖氨基氧基綴合至特異性靶向Man-6-P受體的多克隆抗體或單克隆抗體。兔多克隆抗體與Man-6-P六甘露糖氨基氧基的綴合的SDS-PAGE和MALDI-TOF MS分析顯示于圖42中。圖43描繪了用于評(píng)估對(duì)照和Man-6-P六甘露糖綴合的兔多克隆IgG抗體對(duì)陽(yáng)離子依賴性Man-6-P受體(CI-MPR)的結(jié)合的表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。這種綴合抗體的體外分析證明了其被HepG2(人肝臟肝細(xì)胞癌)和RAW(小鼠鼠白血病)細(xì)胞系(圖44)二者的攝取增加。培養(yǎng)物用抗兔-Alexa 488抗體染色，用DAPI復(fù)染。

通過(guò)SDS-PAGE和凝集素印跡進(jìn)一步測(cè)試了與Man-6-P或乳糖氨基氧基模塊綴合的抗體，并與未綴合的抗體進(jìn)行比較(圖45)。對(duì)照和綴合的抗體的MALDI-TOF完整蛋白分析證明綴合物的每個(gè)抗體具有約兩個(gè)聚糖模塊，而對(duì)照抗體則沒有聚糖模塊(圖46)。

實(shí)施例19：抗體中經(jīng)唾液酸對(duì)鉸鏈半胱氨酸殘基的綴合

將Man-6-P六甘露糖馬來(lái)酰亞胺(圖41)綴合至多克隆抗體或單克隆抗體。

通過(guò)SDS-PAGE，凝集素印跡和Man-6-P定量檢驗(yàn)了多克隆抗體與Man-6-P六甘露糖馬來(lái)酰亞胺通過(guò)鉸鏈半胱氨酸的綴合(以確定每個(gè)抗體綴合的聚糖數(shù)目)(圖47)。還通過(guò)使用SDS-PAGE檢驗(yàn)了多克隆抗體與乳糖馬來(lái)酰亞胺的綴合，并且對(duì)照抗體、綴合的抗體和濾液的半乳糖定量顯示于圖48中。在鉸鏈半胱氨酸綴合的多克隆抗體中通過(guò)大小排阻色譜(SEC)幾乎觀察不到增加的聚集(圖50)。

還通過(guò)SDS-PAGE和聚糖定量檢驗(yàn)了單克隆抗體與Man-6-P六甘露糖馬來(lái)酰亞胺通過(guò)鉸鏈半胱氨酸的綴合(以確定每個(gè)抗體所綴合的聚糖數(shù)目)(圖49)。在鉸鏈半胱氨酸綴合的多克隆抗體中通過(guò)大小排阻層析(SEC)幾乎觀察不到增加的聚集(圖51)。

Man-6-P受體(CI-MPR)通過(guò)天然Fc聚糖或鉸鏈二硫化物對(duì)雙Man-6-P六甘露糖綴合的多克隆和單克隆抗體的結(jié)合也通過(guò)在非變性(native)PAGE上的凝膠遷移來(lái)證明(圖55)。

實(shí)施例20：完全半乳糖基化的單克隆抗體的制備和三半乳糖基化的糖肽對(duì)唾液酸化抗體的綴合

用唾液酸酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶修飾具有STY突變(NNAS)的小鼠單克隆抗體突變體，用于制備主要天然的三半乳糖基化聚糖(每個(gè)抗體2個(gè)聚糖)。也用唾液酸轉(zhuǎn)移酶唾液酸化了相同的突變體，并使用SAM方法將其與含有糖肽的三價(jià)半乳糖綴合(圖68)。測(cè)驗(yàn)了酶修飾抗體的唾液酸含量(圖52)。此外，檢查了從對(duì)照和去唾液酸化/半乳糖基化(圖53)NNAS釋放的聚糖以及從對(duì)照和唾液酸化(圖54)NNAS釋放的聚糖的MALDI-TOF分析。酶修飾和綴合的NNAS的SDS-PAGE(4-12％NuPAGE)和凝集素印跡示于(圖56)。還測(cè)量了對(duì)照NNAS抗體、去唾液酸化/半乳糖基化NNAS抗體和糖肽綴合的NNAS抗體的末端半乳糖定量(圖57)。

實(shí)施例21：用化學(xué)酶方法制備α2,3唾液酸化的乳糖馬來(lái)酰亞胺以及隨后經(jīng)鉸鏈二硫化物綴合至非免疫兔IgG

糖類結(jié)合蛋白(包括Siglec蛋白)能夠更有效地結(jié)合至具有較大唾液酸密度的區(qū)域。因此，給定抗體上的單唾液酸化聚糖可不提供足夠的唾液酸密度以促進(jìn)對(duì)其它Siglec蛋白的結(jié)合。因此，研究了用于引入多個(gè)拷貝的唾液酸化聚糖的鉸鏈二硫化物綴合方法。為了制備用于綴合的唾液酸化聚糖，將乳糖馬來(lái)酰亞胺(5mg)在體外用來(lái)自美人魚發(fā)光桿菌(Photobacterium damsela)的α2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶在Tris2緩沖液(pH7.5)中于37℃唾液酸化2小時(shí)。將對(duì)照聚糖在無(wú)唾液酸轉(zhuǎn)移酶情況下溫育并與原聚糖相比較。MALDI-TOF MS分析顯示，在37℃于Tris緩沖液(pH7.5)中將沒有酶的乳糖馬來(lái)酰亞胺溫育2小時(shí)沒有改變分子的預(yù)期分子量，這表明所檢驗(yàn)的條件不導(dǎo)致馬來(lái)酰亞胺水解。用α2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶修飾的聚糖的MALDI-TOF和Dionex HPLC分析指示存在唾液酸乳糖，盡管其不是主峰(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，使用QAE-瓊脂糖柱額外純化了唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺，并隨后使用MALDI-TOF和Dionex HPLC分析了每個(gè)級(jí)分。這些分析指示，唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺作為主要種類存在于來(lái)自QAE柱的20mM NaCl洗脫液中(圖58)。使用樣品的唾液酸定量分析評(píng)估了純化的唾液酸化聚糖的量，其指示了～1.8mg唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺的回收。

使用硫醇-馬來(lái)酰亞胺化學(xué)方法測(cè)試了兔多克隆抗體與該唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺的隨后的綴合。將兔IgG抗體(1mg)用TCEP以4摩爾過(guò)量(相對(duì)于抗體)在37℃還原2小時(shí)，然后在室溫與24摩爾過(guò)量的唾液酸乳糖綴合1小時(shí)。然后將綴合物緩沖液交換至PBS中，用于在SDS-PAGE上分析(圖59A)。還使用Dionex HPLC進(jìn)行了唾液酸定量(圖59B)。將等分試樣的對(duì)照和硫醇綴合物在37℃用或不用唾液酸酶(1U/mg)處理過(guò)夜，然后通過(guò)過(guò)濾(10kDa MWCO)回收上清液。測(cè)量了上清液的唾液酸含量，并與未用唾液酸酶處理的樣品進(jìn)行比較。每個(gè)抗體約綴合有4個(gè)α2,3唾液酸乳糖模塊。

實(shí)施例22：通過(guò)將乳糖馬來(lái)酰亞胺唾液酸化制備α2,6唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺和通過(guò)產(chǎn)生高唾液酸化的α2,3-或α2,6-連接將其綴合至兔多克隆抗體的鉸鏈二硫化物

還研究了多個(gè)拷貝的α2,6-唾液酸化的聚糖與兔多克隆抗體的鉸鏈二硫化物的綴合。由于α2,3唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺是使用化學(xué)酶方法(參見上文，實(shí)施例21)成功產(chǎn)生的，所以使用類似的方法來(lái)產(chǎn)生α2,6唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺(包括使用不同的唾液酸轉(zhuǎn)移酶的實(shí)驗(yàn)方案小改動(dòng))。為了制備用于綴合的α2,6唾液酸化聚糖，將乳糖馬來(lái)酰亞胺(～5mg)用0.5U來(lái)自美人魚發(fā)光桿菌的細(xì)菌α2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶在Tris緩沖液(pH 8)中于37℃體外唾液酸化1小時(shí)。酶促反應(yīng)后，將產(chǎn)物應(yīng)用于QAE-瓊脂糖柱。用10份1ml 2mM Tris(pH8)，5份1ml的含20mM NaCl的Tris緩沖液，和5份1ml含70mM NaCl的Tris緩沖液洗滌柱。使用Dionex HPLC以及乳糖和α2,6唾液酸乳糖標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)來(lái)自每一份的等分試樣進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)品和一個(gè)洗脫級(jí)分的寡糖概貌如圖60(A-D)所示。還通過(guò)MALDI-TOF進(jìn)行分析和確認(rèn)了含有α2,6唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺的級(jí)分。其中一個(gè)級(jí)分中的聚糖示于圖61中。

然后使用唾液酸定量分析來(lái)評(píng)估了純化的α2,6唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺的量，其指示～1.5mg的唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺的回收。一旦制備了聚糖，使用硫醇化學(xué)方法測(cè)試抗體與α2,6唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺或α2,3唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺的綴合。將兔多克隆IgG抗體(1mg)進(jìn)行緩沖液交換并用TCEP以4摩爾過(guò)量(相對(duì)于抗體)在37℃還原2小時(shí)。然后將還原的抗體分成兩半：一部分綴合至24摩爾過(guò)量的α2,6唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺，另一部分綴合至α2,3唾液酸乳糖馬來(lái)酰亞胺，在室溫下綴合1小時(shí)。將兩種綴合物緩沖液交換至PBS中然后進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖62A)和使用Dionex HPLC進(jìn)行唾液酸定量(圖62B)。用唾液酸定量來(lái)估計(jì)綴合的聚糖數(shù)目。將對(duì)照抗體和硫醇綴合的抗體的等分試樣在37℃用或不用唾液酸酶(1U/mg)處理過(guò)夜，然后通過(guò)過(guò)濾(10kDa MWCO)回收上清液。測(cè)量上清液的唾液酸含量，并與不用唾液酸酶處理的樣品(對(duì)照)進(jìn)行比較。分析表明，通過(guò)這種方法約有7個(gè)聚糖(α2,3-或α2,6-唾液酸乳糖聚糖)綴合至多克隆抗體。

實(shí)施例23：用GAM化學(xué)方法進(jìn)行的NNAS的聚乙二醇化

將小鼠NNAS(S298N/T299A/Y300S)突變體單克隆抗體半乳糖基化和去唾液酸化，生成Gal NNAS單克隆抗體且沒有任何蛋白酶降解。用半乳糖氧化酶(GAO)修飾該抗體以產(chǎn)生半乳糖醛。然后將半乳糖醛與2或5kDa的氨基氧基聚乙二醇(PEG)綴合。圖63描述了使用SDS-PAGE和凝集素印跡的對(duì)對(duì)照和酶修飾的(脫鹽/半乳糖基化)NNAS突變體抗體的表征。圖64描述了通過(guò)還原性SDS-PAGE用不同量的半乳糖氧化酶對(duì)對(duì)照抗體和Gal NNAS的聚乙二醇化的表征。這些結(jié)果表明，Gal NNAS可以用顯著量的單、雙和三PEG綴合的每個(gè)重鏈來(lái)有效地聚乙二醇化。圖66描述了通過(guò)還原性SDS-PAGE對(duì)對(duì)照抗體和具有相對(duì)于抗體各種摩爾過(guò)量的PEG的Gal NNAS的聚乙二醇化的表征。表征抗體的聚乙二醇化的蛋白簡(jiǎn)單掃描(Protein Simple scan)證明，每個(gè)重鏈綴合約1.5-1.7個(gè)PEG模塊(或每個(gè)抗體約3-3.4個(gè)PEG)(圖65和67)。

實(shí)施例24：使用GAM化學(xué)方法進(jìn)行的NNAS的聚乙二醇化

用50mU/mg半乳糖基轉(zhuǎn)移酶將NNAS抗體半乳糖基化，隨后在50mM MES緩沖液(pH 6.5)中用1U/mg唾液酸酶去唾液酸化。然后在存在或不存在0.5mM乙酸銅的情況下用半乳糖氧化酶(57mU/mg)/過(guò)氧化氫酶處理去唾液酸化的胎球蛋白和NNAS以及半乳糖基化的NNAS，然后與25摩爾過(guò)量的5kDa氨基氧基PEG綴合(圖69A)。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在0、0.02、0.1和0.5mM乙酸銅的存在下，用半乳糖氧化酶(57mU/mg)/過(guò)氧化氫酶處理半乳糖基化的NNAS，然后與25摩爾過(guò)量的5kDa氨基氧基PEG綴合(圖69B)。在乙酸銅存在下用半乳糖氧化酶氧化的抗體顯示出比在沒有乙酸銅的情況下與半乳糖氧化酶反應(yīng)的相同抗體更高程度的聚乙二醇化。當(dāng)在含有高于0.1mM的濃度的硫酸銅的反應(yīng)中進(jìn)行綴合時(shí)，觀察到了顯著更高水平的聚乙二醇化。

實(shí)施例25：用唾液酸酶/半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)野生型和突變體赫賽汀的修飾

野生型和突變體(A114N、NNAS和A114N/NNAS)赫賽汀抗體用50mU/mg半乳糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行酶促修飾，隨后在50mM MES緩沖液(pH 6.5)中用1U/mg唾液酸酶將其去唾液酸化。使用SDS-PAGE(還原的和非還原的)、用ECL(對(duì)于末端半乳糖特異的植物凝集素)的凝集素印跡、和使用通過(guò)半乳糖苷酶釋放的半乳糖的Dionex HPLC分析的末端半乳糖定量來(lái)分析修飾的抗體(圖70)。使用NNAS和NNAS/A114N雙突變體獲得了含有大約三至九個(gè)末端半乳糖的酶修飾抗體，顯示出比野生型和A114N突變體更高的末端半乳糖水平。

實(shí)施例26：使用SAM綴合方法對(duì)野生型和突變體抗體的聚乙二醇化

野生型和(A114N、NNAS和A114N/NNAS)赫賽汀抗體用唾液酸介導(dǎo)(SAM)的綴合來(lái)聚乙二醇化?？贵w隨后用2mM高碘酸鹽氧化。緩沖液交換后，用25摩爾過(guò)量的5kDa氨基氧基PEG將氧化抗體聚乙二醇化。使用Dionex HPLC(圖71)測(cè)量了野生型和突變體抗體的唾液酸含量。然后使用還原的和非還原的SDS-PAGE分析了聚乙二醇化的抗體(圖72)。此外，通過(guò)使用ProteinSimple分析掃描的凝膠估計(jì)了聚乙二醇化(PAR，每個(gè)抗體的PEG數(shù)目)(圖73)。NNAS、A114N和A114N/NNAS突變體都顯示出比野生型赫賽汀抗體(1.4)更高的PAR(2.7-4.6)。

實(shí)施例27：用含半乳糖的聚糖配體對(duì)糖工程化的抗體的攝入的研究

多克隆抗體用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(Gal轉(zhuǎn)移酶)酶促修飾，綴合至乳糖氨基氧基(Gal-Glc至297：綴合至來(lái)自唾液酸化抗體的Asn-297的聚糖中的唾液酸)，或綴合至乳糖馬來(lái)酰亞胺(Gal-Glc至鉸鏈：綴合至鉸鏈二硫化物中的半胱氨酸)。然后將對(duì)照、修飾的或綴合的抗體與HepG2細(xì)胞(表達(dá)ASGPR的肝細(xì)胞系)在37℃溫育1-2小時(shí)，然后使用免疫熒光染色測(cè)量了攝取的抗體(圖74)。結(jié)果顯示酶修飾或乳糖綴合的抗體的HepG2細(xì)胞攝取增加。

實(shí)施例28：三價(jià)GalNAc聚糖對(duì)赫賽汀的綴合

將赫賽汀(抗Her2)唾液酸化并使用SAM綴合方法將其綴合至三價(jià)GalNAc聚糖(圖75)以靶向ASGPR。隨后使用表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)(Biacore)來(lái)評(píng)估這些三價(jià)GalNAc聚糖綴合抗體對(duì)ASGPR亞基H1的結(jié)合(圖76)。

實(shí)施例29：三價(jià)GalNAc聚糖與含有糖肽的三價(jià)半乳糖對(duì)重組溶酶體酶的綴合

使用SAM綴合方法將重組溶酶體酶與三價(jià)GalNAc聚糖或含有糖肽的三價(jià)半乳糖(圖77)綴合以靶向ASGPR。隨后使用表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)(Biacore)評(píng)估了這些三價(jià)GalNAc聚糖綴合的酶和含有糖肽的三價(jià)半乳糖綴合的酶對(duì)ASGPR亞基H1的結(jié)合(圖78)。結(jié)果出顯示三價(jià)GalNAc聚糖綴合的重組溶酶體酶的強(qiáng)ASGPR結(jié)合。圖79(A-D)顯示出許多示例性的三價(jià)GalNAc模塊。顯示了沒有間隔基、間隔基、1kDa(約)間隔基，以及間隔基和1kDa(約)間隔基兩者的實(shí)施例。還將第二重組溶酶體酶(rhGAA)與三價(jià)GalNAc聚糖C12綴合。圖80顯示了描述高碘酸氧化的重組溶酶體酶rhGAA與過(guò)量三價(jià)GalNAc聚糖C12的綴合結(jié)果的圖。所得的每個(gè)GAA綴合的聚糖以相對(duì)rhGAA 20、40、80和200倍摩爾過(guò)量的聚糖來(lái)描述。圖81描繪了在Biacore上與三價(jià)GalNAc聚糖C12綴合的重組溶酶體酶的ASGPR結(jié)合。與20(綴合物1)、40、80和200倍(綴合物4)過(guò)量的聚糖綴合的酶都顯示出對(duì)ASGPR亞基1的強(qiáng)結(jié)合。綴合物(綴合物1至4)之間在結(jié)合上沒有顯著差異。

序列表

<110> 建新公司(GENZYME CORPORATION)

<120> 靶向模塊的位點(diǎn)特異性糖工程化

<130> 566622: SA9-148PC

<140>

<141>

<150> 62/061,556

<151> 2014-10-08

<150> 61/955,682

<151> 2014-03-19

<160> 46

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

<400> 1

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly

85 90 95

Thr His Leu His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 2

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

<400> 2

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Trp

20 25 30

Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Thr Pro Val Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

115 120 125

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

180 185 190

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

340 345 350

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

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Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

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<210> 3

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

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Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Gly Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Pro Val Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser Asn Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

115 120 125

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

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Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

145 150 155 160

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

165 170 175

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180 185 190

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

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Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

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260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

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Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

340 345 350

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 4

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Pro Val Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

115 120 125

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

130 135 140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

145 150 155 160

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

180 185 190

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

195 200 205

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

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Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

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<212> PRT

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<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

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Gly Lys

450

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<213> 人工序列

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<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

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Gly Lys

450

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<211> 450

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<220>

<221> 來(lái)源

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<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

<400> 23

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<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

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<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

<400> 25

Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Gly Lys

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<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

<400> 26

Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Gly Lys

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<210> 27

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

<400> 27

Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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450

<210> 28

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

<400> 28

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<210> 29

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

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<210> 32

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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<211> 444

<212> PRT

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<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

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<210> 34

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

<400> 34

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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<210> 35

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<220>

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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<210> 36

<211> 214

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<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

<400> 36

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<210> 37

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<220>

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<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

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450

<210> 38

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成多肽"

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

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<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成肽"

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1

<210> 40

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋="人工序列描述: 合成肽"

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Gly Gly Gly Gly

1

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

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Gly Gly Gly Gly Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

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Gly Gly Gly Gly Gly Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

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<213> 人工序列

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<221> 來(lái)源

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<221> 來(lái)源

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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