本發(fā)明涉及含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物、藥劑輸送用載體化合物、制劑、及藥劑輸送系統(tǒng)，詳細(xì)而言，涉及容易到達(dá)波形蛋白、結(jié)蛋白系的蛋白質(zhì)露出的細(xì)胞·部位、并且與N-乙酰葡糖胺糖鏈識(shí)別蛋白的結(jié)合性優(yōu)異的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物、包含該化合物的藥劑輸送用載體化合物、使用了該載體化合物的制劑、及藥劑輸送系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

以往，對(duì)由動(dòng)脈硬化、血栓形成導(dǎo)致的冠狀動(dòng)脈血管狹窄的缺血性心臟病的患者實(shí)施向血管插入球囊、支架而使狹窄部位擴(kuò)張的介入治療。

此時(shí)，球囊、支架在狹窄部分摩擦而使血管內(nèi)皮細(xì)胞剝離，從而帶來(lái)傷害。其結(jié)果，在血管中引起炎癥，或者引起由位于該傷害部位的內(nèi)皮下的平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞的異常增生導(dǎo)致的內(nèi)膜肥厚、新的血栓形成而再次使血管狹窄。因此，必須實(shí)施如下的繁雜且患者負(fù)擔(dān)大的處理：將涂布有用于抗炎癥、防止肥厚、防止血栓等的藥物的緩釋制劑的線圈插入到該部位來(lái)防止再狹窄等。

另外，過度纖維化引起病理性疾病及組織的功能障礙的纖維性疾病等各種纖維性疾病，是由于纖維性組織在組織內(nèi)以異常的形態(tài)蓄積而發(fā)生的。該纖維性組織也會(huì)由于外科手術(shù)、外傷或者除創(chuàng)傷以外的疾病過程而產(chǎn)生，例如也可以舉出肝硬化、肝臟纖維化、腎小球腎炎、肺纖維化、硬皮癥、心肌纖維化、心肌梗塞后的纖維化、發(fā)作后或神經(jīng)退行性疾病(阿爾茨海默病等)后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)纖維化、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(PVR)、再狹窄(血管成形術(shù)后等)及關(guān)節(jié)炎等慢性病癥。

在前述癥狀等的治療(抑制、防止或者恢復(fù))時(shí)，期望能夠向心臟、血管或者纖維化的傷害部位特異性地輸送它們的藥物的簡(jiǎn)便的系統(tǒng)。作為藥物輸送系統(tǒng)，非專利文獻(xiàn)1中記載了作為糖鏈導(dǎo)入藥物傳輸材料的擬糖蛋白(Neoglycoprotein)與脂質(zhì)體的復(fù)合體，另外，非專利文獻(xiàn)2中記載了作為對(duì)肝細(xì)胞特異的基因輸送劑的聚乙烯亞胺與阿拉伯半乳聚糖的復(fù)合體。但是，它們沒有與心臟、血管的傷害部位的特異結(jié)合性。

提出了在如下的藥品的制造中使用轉(zhuǎn)化酶抑制劑(convertase inhibitor)：所述藥品為局部應(yīng)用于創(chuàng)傷或纖維性疾病的部位且用于減少創(chuàng)傷治愈中的斑痕形成、或減少纖維性情況的治療中的纖維化的藥物(參照專利文獻(xiàn)1)。進(jìn)而，關(guān)于藥物輸送劑等，提出了具有與存在于因缺血等而產(chǎn)生疾病的心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、骨格肌成肌細(xì)胞等中的波形蛋白、結(jié)蛋白等特定蛋白質(zhì)的特異性相互作用的化合物，例如N-乙酰葡糖胺類露出、或者借助包覆在膠體顆粒表面的抗生素蛋白(avidin)類而結(jié)合有N-乙酰葡糖胺類的藥物輸送劑(參照專利文獻(xiàn)2及3)。另外，提出了使用如下的藥劑輸送用載體化合物的藥劑輸送系統(tǒng)等：所述藥劑輸送用載體化合物具有對(duì)內(nèi)部具有藥物的脂質(zhì)膜有親和性的第1區(qū)域、和與前述第1區(qū)域結(jié)合而且包含自帶磁性有機(jī)分子的第2區(qū)域(參照專利文獻(xiàn)4)。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本特開2005-535674號(hào)公報(bào)(權(quán)利要求書及其它)

專利文獻(xiàn)2：日本特開2007-1923號(hào)公報(bào)(權(quán)利要求書及其它)

專利文獻(xiàn)3：日本特開2009-46413號(hào)公報(bào)(權(quán)利要求書及其它)

專利文獻(xiàn)4：日本特開2013-63926號(hào)公報(bào)(權(quán)利要求書及其它)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：Noboru Yamazaki,Yoshifumi Jigami,Hans-Joachim Gabius,and ShujiKojima,Trends in Glycoscience and Glycotechnology,Vol.13,No.71,pp.319-329(May 2001)

非專利文獻(xiàn)2：M.Nogawa,T.Ishihara,T.Akaike,and A.Maruyama,S.T.P.PharmaSciences,Vol.11,No.1,pp97-102(2001)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的問題

在前述專利文獻(xiàn)1中記載的發(fā)明中，沒有將轉(zhuǎn)化酶抑制劑輸送到預(yù)定部位的方法，使用了向部位直接應(yīng)用、或者在可能的范圍內(nèi)直接送達(dá)的方法(例如肺的創(chuàng)傷治愈的情況下，作為吸入劑使用)。但是，該方法中，由于轉(zhuǎn)化酶抑制劑不是局部應(yīng)用的物質(zhì)，因此成為全身給藥，但轉(zhuǎn)化酶抑制劑的全身給藥是有害的，因此不優(yōu)選。另外，在前述專利文獻(xiàn)2及3中，作為藥物輸送劑，使用了N-乙酰葡糖胺類，但難以到達(dá)波形蛋白、結(jié)蛋白系的N-乙酰葡糖胺識(shí)別蛋白露出的細(xì)胞·部位，另外，即使藥劑到達(dá)，也不與N-乙酰葡糖胺糖鏈識(shí)別蛋白結(jié)合、或者難以結(jié)合等，在性能方面尚未得到滿足。

因此，本發(fā)明的目的在于，提供容易到達(dá)波形蛋白、結(jié)蛋白系的蛋白質(zhì)露出的細(xì)胞·部位、并且與N-乙酰葡糖胺糖鏈識(shí)別蛋白的結(jié)合性優(yōu)異的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物、包含該化合物的藥劑輸送用載體化合物、使用了該藥劑輸送用載體化合物的制劑、及藥劑輸送系統(tǒng)。

用于解決問題的方案

本發(fā)明人為了解決上述問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過將具有N-乙酰葡糖胺糖鏈基的化合物的重均分子量調(diào)整至特定的范圍，能夠解決上述問題，完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物的特征在于，重均分子量在15000～100000的范圍。

本發(fā)明的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物優(yōu)選為聚合物。

本發(fā)明的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物優(yōu)選每1分子中具有27～175個(gè)前述N-乙酰葡糖胺糖鏈基。

本發(fā)明的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物優(yōu)選為生物素化合物。

本發(fā)明的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物優(yōu)選在末端結(jié)合有3-巰基丙酸。

本發(fā)明的藥劑輸送用載體化合物的特征在于，包含前述含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物。

本發(fā)明的制劑的特征在于，前述藥劑輸送用載體化合物負(fù)載治療劑、熒光劑及造影劑中的至少1種藥劑，并且前述N-乙酰葡糖胺糖鏈基在表面露出。

本發(fā)明的藥劑輸送用載體化合物的特征在于，是前述N-乙酰葡糖胺糖鏈基在表面露出的膠體狀顆粒。

本發(fā)明的制劑的特征在于，在前述藥劑輸送用載體化合物的前述膠體狀顆粒中含有治療劑、熒光劑及造影劑中的至少1種藥劑。

本發(fā)明的藥劑輸送系統(tǒng)的特征在于，使前述含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物結(jié)合在治療劑、熒光劑及造影劑中的至少1種藥劑的表面，通過露出在表面的N-乙酰葡糖胺糖鏈基將前述藥劑誘導(dǎo)到目標(biāo)患部區(qū)域。

本發(fā)明的藥劑輸送系統(tǒng)的特征在于，使表面結(jié)合有前述含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物的膠體狀顆粒中含有治療劑、熒光劑及造影劑中的至少1種藥劑，通過露出在表面的N-乙酰葡糖胺糖鏈基將前述膠體狀顆粒中的前述藥劑誘導(dǎo)到目標(biāo)患部區(qū)域。

發(fā)明的效果

根據(jù)本發(fā)明，能夠提供容易到達(dá)波形蛋白、結(jié)蛋白系的蛋白質(zhì)露出的細(xì)胞·部位、并且與N-乙酰葡糖胺糖鏈識(shí)別蛋白的結(jié)合性優(yōu)異的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物、包含該化合物的藥劑輸送用載體化合物、使用了該藥劑輸送用載體化合物的制劑、及藥劑輸送系統(tǒng)。

附圖說明

圖1為評(píng)價(jià)比較例2的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物與固定于金表面的波形蛋白的結(jié)合的傳感圖。

圖2為評(píng)價(jià)比較例3的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物與固定于金表面的波形蛋白的結(jié)合的傳感圖。

圖3為評(píng)價(jià)實(shí)施例1的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物與固定于金表面的波形蛋白的結(jié)合的傳感圖。

圖4為評(píng)價(jià)比較例4的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物與固定于金表面的波形蛋白的結(jié)合的傳感圖。

圖5為示出基于FITC標(biāo)記了的比較例1的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物的HeLa細(xì)胞的染色度的圖。

圖6為示出基于FITC標(biāo)記了的比較例2的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物的HeLa細(xì)胞的染色度的圖。

圖7為示出基于FITC標(biāo)記了的比較例3的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物的HeLa細(xì)胞的染色度的圖。

圖8為示出基于FITC標(biāo)記了的實(shí)施例1的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物的HeLa細(xì)胞的染色度的圖。

圖9為示出基于FITC標(biāo)記了的比較例4的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物的HeLa細(xì)胞的染色度的圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物是具有如下特征的化合物：重均分子量在15000～100000的范圍，具有N-乙酰葡糖胺糖鏈基。若重均分子量小于15000，則對(duì)波形蛋白、結(jié)蛋白等N-乙酰葡糖胺識(shí)別蛋白結(jié)合性低。另外，若超過100000，則向期望的細(xì)胞·部位的藥劑到達(dá)率降低。從合成性、收率及藥劑到達(dá)率的方面出發(fā)，前述重均分子量?jī)?yōu)選在16000～50000的范圍、更優(yōu)選在16500～40000的范圍、進(jìn)一步優(yōu)選在17000～30000的范圍。需要說明的是，作為以往的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物，使用在N-乙酰葡糖胺末端結(jié)合有殼二糖的乙烯基系樹脂(例如專利文獻(xiàn)2的實(shí)施例1)，其重均分子量為120000左右。另外，還使用了將由殼二糖和生物素結(jié)合而得到的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物(分子量700左右)結(jié)合到載體上而得到的藥物輸送劑的膠體(例如專利文獻(xiàn)3的實(shí)施例13)。

作為本發(fā)明的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物中的N-乙酰葡糖胺糖鏈基，例如可以舉出N-乙酰葡糖胺基、結(jié)合有2～6個(gè)N-乙酰葡糖胺基的殼聚糖基、即殼二糖基、殼三糖基、殼四糖基、殼五糖基、殼六糖基。其中，優(yōu)選N-乙酰葡糖胺基及殼二糖基、更優(yōu)選殼二糖基。

作為N-乙酰葡糖胺糖鏈基的具體例，可舉出殼二糖基的化學(xué)式，但本發(fā)明不限定于此。

本發(fā)明的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物優(yōu)選每1分子中具有27～175個(gè)前述N-乙酰葡糖胺糖鏈基、更優(yōu)選為29～88個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選為30～70個(gè)、特別優(yōu)選為30～50個(gè)。

對(duì)于本發(fā)明的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物，為了與波形蛋白、結(jié)蛋白等N-乙酰葡糖胺識(shí)別蛋白作用而具有N-乙酰葡糖胺糖鏈基，可以通過對(duì)根據(jù)目的適宜選擇的化合物導(dǎo)入N-乙酰葡糖胺糖鏈基而獲得。本發(fā)明的化合物更優(yōu)選為使具有N-乙酰葡糖胺糖鏈基的單體聚合而得到的聚合物、使N-乙酰葡糖胺與聚合物等高分子化合物結(jié)合而得到的化合物。本發(fā)明的化合物優(yōu)選為聚合物。

本發(fā)明的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物從與載體的吸附性的觀點(diǎn)出發(fā)，也可以具有疏水性基團(tuán)。

對(duì)含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物的制造方法不作特別限定。例如作為使前述具有N-乙酰葡糖胺糖鏈基的單體聚合而得到的聚合物的制造方法，可以舉出使在N-乙酰葡糖胺糖鏈的還原末端結(jié)合苯乙烯化合物等具有疏水性基團(tuán)的化合物而得到的單體聚合的方法等。作為更詳細(xì)的制造方法，可以舉出如下方法等：將作為具有疏水性基團(tuán)的化合物的乙烯基芐胺的氨基用殼二糖還原性地氨基化，由此得到導(dǎo)入了N-乙酰葡糖胺基的苯乙烯系單體之后，使該單體聚合，從而制造。另外，作為在前述高分子化合物上結(jié)合有N-乙酰葡糖胺的化合物的制造方法，可以舉出在N-乙酰葡糖胺糖鏈的還原末端與作為陽(yáng)離子性聚合物的聚乙烯亞胺、聚-L-賴氨酸等具有疏水性基團(tuán)的聚合物化合物結(jié)合的方法等。

此處，對(duì)使N-乙酰葡糖胺糖鏈與化合物結(jié)合的方法不作特別限定，例如可以通過還原氨基化法將具有氨基的化合物的氨基與N-乙酰葡糖胺糖鏈的還原末端結(jié)合。另外，也可以用羧基取代N-乙酰葡糖胺糖鏈的羥基，通過1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)偶聯(lián)法等與具有氨基的化合物的氨基結(jié)合。

另外，對(duì)將前述單體聚合的方法沒有特別限定，例如可以通過活性自由基聚合法、利用鏈轉(zhuǎn)移劑的聚合法等來(lái)獲得。作為具體例，可以將作為N-乙酰葡糖胺糖鏈的殼二糖和作為具有疏水性基團(tuán)的化合物的乙烯基芐基鄰苯二甲酰亞胺以摩爾比計(jì)1：1的比例混合而制造單體，在DMF、DMSO或水等溶液中進(jìn)行自由基聚合來(lái)獲得聚[N-對(duì)乙烯基芐基-O-2-乙酰胺-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2-乙酰胺-2-脫氧-β-D-葡糖酰胺](poly[N-p-vinylbenzyl-O-2-acetoamid-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-a cetoamide-2-deoxy-β-D-gluconamide])(PVGlcNAc)。使用了鏈轉(zhuǎn)移劑的聚合法中，通過在聚合時(shí)改變巰基丙酸等鏈轉(zhuǎn)移劑相對(duì)于單體的混合比進(jìn)行聚合，能夠制造分子量被控制的聚合物。

本發(fā)明的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物可以為含N-乙酰葡糖胺糖鏈基生物素化合物。含N-乙酰葡糖胺糖鏈基生物素化合物的制造可以如下進(jìn)行：將含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物用弱酸進(jìn)行處理而制作醛基，使具有肼基的生物素反應(yīng)。

〔藥劑輸送用載體化合物〕

本發(fā)明的藥劑輸送用載體化合物包含本發(fā)明的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物。本發(fā)明的藥劑輸送用載體化合物可以僅由前述含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物構(gòu)成，也可以使前述含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物結(jié)合在藥劑輸送中使用的載體等其它材料例如膠體狀顆粒的表面。作為膠體狀顆粒，例如可以舉出金、鉑、銀、磁體、陶瓷等金屬或無(wú)機(jī)顆粒、源自聚乙二醇、聚苯乙烯、丙烯酸系樹脂、聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚羥基烷酸酯、聚乙醇酸、改性聚乙烯基醇、酪蛋白、改性淀粉及纖維素、蛋白質(zhì)等合成物或天然物的樹脂顆粒、脂質(zhì)體等。對(duì)使含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物結(jié)合在該膠體狀顆粒的表面的方法不作特別限定。例如，在膠體狀顆粒為金顆粒的情況下，可以通過將硫醇基導(dǎo)入到含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物，共價(jià)鍵合至金膠體表面來(lái)結(jié)合。另外，將在聚乳酸的情況下，可以通過將使含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物溶解而得到的溶液與聚乳酸混合，將含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物包覆在聚乳酸顆粒的表面來(lái)結(jié)合。進(jìn)而在脂質(zhì)體的情況下，可以通過將在含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物中導(dǎo)入有烷基的化合物包覆在脂質(zhì)體表面來(lái)結(jié)合。

對(duì)于膠體狀顆粒的粒徑，質(zhì)均粒徑優(yōu)選在5～800nm的范圍。若該粒徑小于5nm，則難以使含N-乙酰葡糖胺基化合物結(jié)合，未附加有N-乙酰葡糖胺基的顆粒在機(jī)體中會(huì)迅速被排出，因此不優(yōu)選。另外，若粒徑超過800nm，則會(huì)通過吞噬細(xì)胞等作為機(jī)體中的異物而排除，因此不優(yōu)選。從N-乙酰葡糖胺基對(duì)顆粒表面的負(fù)荷性及藥劑輸送性的方面出發(fā)，優(yōu)選在7～500nm、特別優(yōu)選在10～300nm的范圍。通過將粒徑控制在該范圍內(nèi)，從而選擇性地有效地僅到達(dá)在血管傷害部位的細(xì)胞間產(chǎn)生的間隙、在血管內(nèi)露出的平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞或部位，變得容易進(jìn)入到細(xì)胞·部位。

〔制劑〕

本發(fā)明的制劑的特征在于，前述藥劑輸送用載體化合物負(fù)載治療劑、熒光劑及造影劑中的至少1種藥劑，并且，前述N-乙酰葡糖胺糖鏈基露出至表面。另外，本發(fā)明的又一制劑的特征在于，前述藥劑輸送用載體化合物為N-乙酰葡糖胺糖鏈基露出至表面的膠體狀顆粒，在前述膠體狀顆粒中含有治療劑、熒光劑及造影劑中的至少1種藥劑。若給藥所述本發(fā)明的制劑，則通過血液循環(huán)到達(dá)露出有波形蛋白、結(jié)蛋白等N-乙酰葡糖胺糖鏈識(shí)別蛋白的細(xì)胞·部位。這樣，藥劑輸送用載體化合物的N-乙酰葡糖胺糖鏈基與N-乙酰葡糖胺糖鏈識(shí)別蛋白相互作用從而吸引接近，附著于該細(xì)胞上或侵入至該細(xì)胞。之后，前述藥劑從制劑中滲出而釋放，被吸收到細(xì)胞中，產(chǎn)生發(fā)生熒光或造影而表現(xiàn)藥效。

熒光劑例如可以舉出異硫氰酸熒光素(FITC)、活細(xì)胞染色用色素Calcein-AM(株式會(huì)社同人化學(xué)研究所制；商品名)。造影劑例如可以舉出核磁共振圖像診斷用釓化合物。治療劑例如可以舉出血管內(nèi)皮細(xì)胞增生促進(jìn)劑、血管平滑肌細(xì)胞增生抑制劑、抗炎癥劑、抗癌劑、抗風(fēng)濕劑。

〔藥劑輸送系統(tǒng)〕

本發(fā)明的藥劑輸送系統(tǒng)的特征在于，使本發(fā)明的化合物結(jié)合在熒光劑、造影劑及治療劑中的至少1種藥劑的表面，通過露出至表面的N-乙酰葡糖胺糖鏈基將前述藥劑誘導(dǎo)到患部區(qū)域。另外，本發(fā)明的又一藥劑輸送系統(tǒng)的特征在于，使表面結(jié)合有本發(fā)明的化合物的膠體狀顆粒中含有治療劑、熒光劑及造影劑中的至少1種藥劑，通過露出至表面的N-乙酰葡糖胺糖鏈基將前述膠體狀顆粒中的前述藥劑誘導(dǎo)到目標(biāo)患部區(qū)域。

本發(fā)明的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物、藥劑輸送用載體化合物、使用了該藥劑輸送用載體化合物的藥劑、及藥劑輸送系統(tǒng)由于與以往的藥劑輸送系統(tǒng)相比能夠使藥劑有效地到達(dá)期望的細(xì)胞·部位(波形蛋白、結(jié)蛋白系的蛋白質(zhì)露出的細(xì)胞·部位)，因此能夠以比迄今為止的藥劑輸送系統(tǒng)中使用的藥劑量少的量有效地使藥劑到達(dá)期望部位，結(jié)果能夠得到高的藥劑效果。因此，本發(fā)明的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物、藥劑輸送用載體化合物、制劑、及藥劑輸送系統(tǒng)對(duì)醫(yī)療領(lǐng)域、特別是對(duì)檢查·診斷·治療是有效的。

實(shí)施例

以下，用實(shí)施例更詳細(xì)地對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明不限定于這些實(shí)施例。

(單體的制作)

將殼二糖(0.5g)溶解于甲醇(20mL)，添加1.425g的碘。滴加4％KOH直至碘的褐色消失。然后，用二乙醚再結(jié)晶后，將結(jié)晶物溶解于水，通過離子交換樹脂(Amberlite IR-120)對(duì)殼二糖酸(chitobionic acid，)進(jìn)行純化。使用WSC(水溶性碳二亞胺)使殼二糖酸縮合于乙烯基芐胺中。用氯仿將所制作的單體沉淀純化。然后，將沉淀物溶解于水，進(jìn)行凍干。

[比較例1：含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物(PV-GlcNAc；重均分子量9，300)的制作]

在上述得到的單體0.185mmol中混合0.00185mmol的3-巰基丙酸(MPA)、及最終濃度成為0.5％的量的偶氮二異丁腈(AIBN)，溶解于500μL的二甲基亞砜(DMSO)。將該溶液在65℃的油浴中進(jìn)行18小時(shí)培養(yǎng)而進(jìn)行聚合。18小時(shí)后，溶解于水中，進(jìn)行一晝夜的透析。透析后，進(jìn)行凍干。

[比較例2：含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物(PV-GlcNAc；重均分子量11000)的制作]

在上述得到的單體0.185mmol中混合0.0009mmol的MPA、及最終濃度成為0.5％的量的AIBN，溶解于500μL的DMSO。將該溶液在65℃的油浴中進(jìn)行18小時(shí)培養(yǎng)而進(jìn)行聚合。18小時(shí)后，溶解于水中，進(jìn)行一晝夜的透析。透析后，進(jìn)行凍干。

[比較例3：含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物(PV-GlcNAc；重均分子量14000)的制作]

在上述得到的單體0.185mmol中混合0.00037mmol的MPA、及最終濃度成為0.5％的量的AIBN，溶解于500μL的DMSO。將該溶液在65℃的油浴中進(jìn)行18小時(shí)培養(yǎng)而進(jìn)行聚合。18小時(shí)后，溶解于水中，進(jìn)行一晝夜的透析。透析后，進(jìn)行凍干。

[實(shí)施例1：含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物(PV-GlcNAc；重均分子量17000)的制作]

在上述得到的單體0.185mmol中混合0.000185mmol的MPA、及最終濃度成為0.5％的量的AIBN，溶解于500μL的DMSO。將該溶液在65℃的油浴中進(jìn)行18小時(shí)培養(yǎng)而進(jìn)行聚合。18小時(shí)后，溶解于水中，進(jìn)行一晝夜的透析。透析后，進(jìn)行凍干。

[比較例4：含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物(PV-GlcNAc；重均分子量120000)的制作]

在上述得到的單體0.185mmol中以最終濃度成為0.5％的量混合AIBN，溶解于500μL的DMSO。將該溶液在65℃的油浴中進(jìn)行18小時(shí)培養(yǎng)而進(jìn)行聚合。18小時(shí)后，溶解于水中，進(jìn)行一晝夜的透析。透析后，進(jìn)行凍干。

將各種物性值的測(cè)定方法及各特性的評(píng)價(jià)方法示于以下。將所得結(jié)果示于表1。

(1)與N-乙酰葡糖胺糖鏈識(shí)別蛋白(波形蛋白)的相互作用

將波形蛋白的N-乙酰葡糖胺結(jié)合域的重組蛋白固定在傳感器芯片上，使用GE Healthcare公司制BIACORE-J，通過表面等離子共振分析研究含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物對(duì)波形蛋白的相互作用。由所得到的傳感圖，觀察傳感圖，通過目視比較傳感圖的最大的值，對(duì)相互作用的程度進(jìn)行相對(duì)的判斷。

(2)解離常數(shù)(K_D(M))

準(zhǔn)備含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物的5種濃度系列(0.5μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml這5種)，用GE Healthcare公司制BIACORE-J對(duì)固定于金表面的波形蛋白與所準(zhǔn)備的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物的結(jié)合(分子間相互作用)進(jìn)行研究。由各濃度的傳感圖的結(jié)果算出含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物的解離常數(shù)。將比較例2、比較例3、實(shí)施例1及比較例4的含N-乙酰葡糖胺糖鏈化合物的傳感圖的結(jié)果分別示于圖1～4(關(guān)于比較例3，未測(cè)定0.5μg/ml)。縱軸表示共振單位，橫軸表示時(shí)間(秒)。這些圖示出各濃度的化合物對(duì)波形蛋白的反應(yīng)性。隨著變成高濃度，反應(yīng)性上升。自使含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物與波形蛋白反應(yīng)起直至120秒(比較例為60秒)，表示與波形蛋白的結(jié)合，120秒(比較例為60秒)以后表示含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物自波形蛋白的解離。由這些反應(yīng)經(jīng)過算出解離常數(shù)。需要說明的是，關(guān)于比較例2，0.5μg/ml幾乎沒有變化，自解離常數(shù)的計(jì)算排除。

(3)與FITC-PV-GlcNAc的相互作用

使進(jìn)行了FITC標(biāo)記的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物(FITC-PV-GlcNA c)以4μg/mL在5×10⁵cells/mL的HeLa細(xì)胞懸浮液500μL中反應(yīng)。反應(yīng)在4℃下進(jìn)行30分鐘。然后，進(jìn)行離心，再懸浮于PBS中，對(duì)其細(xì)胞染色，用流式細(xì)胞儀(GUAVAeasyCyte、Millipre公司制)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)基于FI TC-PV-GlcNAc的HeLa細(xì)胞的染色進(jìn)行研究。將比較例1、比較例2、比較例3、實(shí)施例1及比較例4的含N-乙酰葡糖胺糖鏈化合物的流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果分別示于圖5～9?？v軸表示細(xì)胞數(shù)，橫軸表示熒光強(qiáng)度。涂滿的直方圖是作為陰性對(duì)照使FITC-PV-MA作用的情況，中空的直方圖表示與FITC-PV-GlcNAc反應(yīng)的HeLa細(xì)胞群。

(4)重均分子量

用高速GPC裝置(TOSOH CORPORATION制、HLC-8220GPC)，在以下條件下測(cè)定各材料的重均分子量。在色譜柱使用TSKgelG6000PWxL-CP+G5000PWxL-CP+3000PWxL-CP、洗脫液為200mM硝酸鈉/乙腈＝80/20下進(jìn)行。在流量為1mL/分鐘、檢測(cè)器為RI檢測(cè)器、柱溫度為40℃下進(jìn)行。分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線用普魯蘭多糖(Pullulan)來(lái)制作。

[表1]

表中的“-”表示無(wú)法測(cè)定。

由這些結(jié)果可知，實(shí)施例的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物與N-乙酰葡糖胺糖鏈識(shí)別蛋白的相互作用優(yōu)異，另外，容易到達(dá)HeLa細(xì)胞中的N-乙酰葡糖胺糖鏈識(shí)別蛋白。由此可知，通過使用了本發(fā)明的含N-乙酰葡糖胺糖鏈基化合物的藥劑輸送劑載體，能使藥劑選擇性地到達(dá)期望的細(xì)胞及部位。另外可知，通過使用了本發(fā)明的化合物的藥劑輸送系統(tǒng)，能使藥劑有效地到達(dá)期望的細(xì)胞·部位。