本發(fā)明涉及具有提高的細(xì)胞內(nèi)能量水平的重組微生物和使用所述微生物生產(chǎn)l-氨基酸的方法。
背景技術(shù)：
：為了使用微生物生產(chǎn)靶物質(zhì)，主要使用了對靶物質(zhì)特異的方法，例如增強(qiáng)對在靶物質(zhì)的生成中所涉及的酶進(jìn)行編碼的基因的表達(dá)或者移除非必需的基因。例如，通過增強(qiáng)l-氨基酸的生物合成途徑，已經(jīng)研發(fā)了許多能夠以高產(chǎn)率生產(chǎn)目標(biāo)l-氨基酸的有用菌株(例如大腸桿菌)。為了使用微生物以高產(chǎn)率生產(chǎn)有用的靶物質(zhì)，需要生成和維持足夠的能量。為了諸如蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的體內(nèi)生物合成，使用以nadh、nadph和atp(腺苷-5'-三磷酸)形式保存的能量。尤其，atp是將代謝反應(yīng)中產(chǎn)生的化學(xué)能量傳遞到微生物的各種活動(dòng)的一種能量載體。atp主要在微生物的代謝過程中產(chǎn)生。主要的細(xì)胞內(nèi)atp生產(chǎn)途徑是經(jīng)由糖酵解過程發(fā)生的底物水平磷酸化反應(yīng)，或使用在糖酵解過程中積累在nadh等中的還原力并通過電子傳遞鏈生產(chǎn)atp的氧化磷酸化反應(yīng)。所產(chǎn)生的atp在體內(nèi)活動(dòng)中被消耗，例如在生物合成、運(yùn)動(dòng)、信號傳導(dǎo)和細(xì)胞分裂。因此，用于生產(chǎn)有用的靶物質(zhì)的工業(yè)微生物通常表現(xiàn)出高的atp需求。于是，已進(jìn)行許多研究，以在有用的靶物質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)中，通過提高細(xì)胞內(nèi)能量水平來提高生產(chǎn)能力(biotechnoladv(期刊《生物技術(shù)進(jìn)展》)(2009)27:94-101)。鐵是維持微生物體內(nèi)平衡所必需的元素之一，并且大腸桿菌利用多種路徑攝取鐵(molmicrobiol(期刊《分子微生物學(xué)》)(2006)62:120-131)。攝取鐵的一個(gè)路徑是經(jīng)由fhucdb復(fù)合物通道來攝取鐵，所述fhucdb復(fù)合物由fhuc、fhud和fhub蛋白形成。最近，有研究人員揭示了，在細(xì)胞中存在過量l-色氨酸的情況下，調(diào)控參與l-色氨酸生物合成的基因的表達(dá)的trpr蛋白與l-色氨酸形成復(fù)合物，并且反過來，該復(fù)合物結(jié)合到fhucdb操縱子的調(diào)控區(qū)，這表明通過fhucdb蛋白復(fù)合物的鐵攝取和l-色氨酸生物合成之間可能存在相關(guān)性。然而，尚未闡明fhucdb蛋白復(fù)合物在l-色氨酸生物合成中的功能及其對鐵攝取的影響(natchembiol(期刊《自然化學(xué)生物學(xué)》)(2012)8:65-71)。本發(fā)明人已經(jīng)研究了提高atp水平和提高有用的靶物質(zhì)(諸如l-氨基酸)的生產(chǎn)能力的方法，并且他們發(fā)現(xiàn)通過使fhucdb基因缺失而使fhucdb蛋白復(fù)合物的功能被滅活后，可以提高細(xì)胞內(nèi)atp水平，并因此可以提高靶物質(zhì)的生產(chǎn)能力，從而完成本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：技術(shù)問題本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有提高的細(xì)胞內(nèi)atp水平的微生物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供使用具有提高的細(xì)胞內(nèi)atp水平的微生物來生產(chǎn)靶物質(zhì)的方法。技術(shù)方案在一個(gè)方面，本發(fā)明提供具有提高的細(xì)胞內(nèi)atp水平的微生物。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，微生物可以是具有如下特征的微生物：構(gòu)成鐵攝取系統(tǒng)的fhuc蛋白、fhud蛋白和fhub蛋白中的一個(gè)或多個(gè)的活性被滅活，并因此具有與未修飾的菌株相比提高的細(xì)胞內(nèi)atp水平。本說明書中使用的術(shù)語“fhucdb”是鐵攝取系統(tǒng)(fhu系統(tǒng))的一個(gè)組成部分，鐵攝取系統(tǒng)包含排布在一個(gè)操縱子中的fhua、fhuc、fhud和fhub的表達(dá)產(chǎn)物。fhua編碼多功能omp(造骨牛奶蛋白)fhua(79kda)，其中多功能ompfhua起到鐵色素(ferrichrome)離子、噬菌體、細(xì)菌毒素以及抗生素的受體的作用。fhua對fe3+-鐵色素是特異的，并且起到配體特異性門控通道的作用(proteinsci(期刊《蛋白質(zhì)科學(xué)》)7,1636-1638)。fhu系統(tǒng)的其他蛋白質(zhì)(即fhud、fhuc和fhub)對于鐵攝取系統(tǒng)的功能來說也是必需的。周質(zhì)蛋白fhud、膜結(jié)合蛋白fhuc和fhub形成fhucdb復(fù)合物，fhucdb復(fù)合物起到將鐵色素和其他fe3+-氧肟酸鹽化合物(fe3+-氣桿菌素(aerobactin)，fe3+-糞生素(coprogen))穿過細(xì)胞質(zhì)膜從周質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中的功能(jbacteriol(期刊《細(xì)菌學(xué)雜志》)169,3844-3849)。經(jīng)由fhucdb復(fù)合物攝取鐵會(huì)消耗一分子atp，并且蛋白質(zhì)復(fù)合物tonb-exbb-exbd為這種鐵攝取過程提供能量(febslett(期刊《歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)》)274,85-88)。fhuc編碼29kda的膜結(jié)合蛋白，并且與fhud和fhub一起形成鐵攝取的通道。fhuc可以具有序列號5的氨基酸序列，并且具體地，fhuc可以由序列號1的核苷酸序列編碼。fhud編碼31kda的膜結(jié)合蛋白，并與fhuc和fhub一起形成鐵攝取的通道。fhud可以具有序列號6的氨基酸序列，并且具體地，fhud可以由序列號2的核苷酸序列編碼。fhub編碼41kda的膜結(jié)合蛋白，并與fhuc和fhub一起形成鐵攝取通道。fhub可以具有序列號7的氨基酸序列，并且具體地，fhub可以由序列號3的核苷酸序列編碼。具體地，盡管蛋白質(zhì)具有相同的活性，但是在不同個(gè)體的氨基酸序列之間可存在較小的差異。因此，fuhc、fhud和fhub可分別具有序列號5、6和7，但不限于此。也就是說，本發(fā)明中的fuhc，fhud和fhub可以是具有通過在上述氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位置處的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列的變體，并且它們可以分別具有與序列號5、6和7的氨基酸序列的同源性為70％或更高、80％或更高、90％或更高、或者95％或更高的序列。此外，基于密碼子簡并性，在核苷酸序列中，可以通過對待表達(dá)上述蛋白質(zhì)的生物體中優(yōu)選的密碼子加以考慮而在編碼區(qū)中進(jìn)行各種修飾，但不改變由編碼區(qū)表達(dá)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。上述核苷酸序列僅作為通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備的各種核苷酸序列的實(shí)例提供，但不限于此。本說明書中使用的術(shù)語“同源性”指的是將對蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因的氨基酸序列或核苷酸序列的兩條序列對齊以使兩條序列在特定比較區(qū)域最大限度地一致后所呈現(xiàn)的堿基或氨基酸殘基之間的相似程度。如果同源性足夠高，則相應(yīng)基因的表達(dá)產(chǎn)物可以具有相同或相似的活性。序列相似的百分?jǐn)?shù)可以使用已知的序列比較程序來確定，例如blast(ncbi(美國國立生物信息中心))、clcmainworkbench(clcbio公司)、megaligntm(dnastar公司)等。本說明書中使用的術(shù)語“微生物”指的是具有生產(chǎn)有用的靶物質(zhì)(如l-氨基酸)的能力的原核微生物或真核微生物。例如，具有提高的細(xì)胞內(nèi)atp濃度的微生物可以是埃希氏菌(escherichia)屬、歐文氏菌(erwinia)屬、沙雷氏菌(serratia)屬、普羅威登斯菌(providencia)屬、棒狀桿菌(corynebacteria)屬、假單胞菌(pseudomonas)屬、鉤端螺旋體(leptospira)屬、沙門氏菌(salmonellar)屬、短桿菌(brevibacteria)屬、hypomononas屬、色桿菌(chromobacterium)屬或諾卡氏菌(norcardia)屬或?qū)儆谡婢蚪湍妇奈⑸?。具體地，微生物可以是埃希氏菌屬微生物，并且更具體地，微生物可以是大腸桿菌。本說明書中使用的術(shù)語“未修飾的菌株”指的是未通過分子生物學(xué)技術(shù)(例如突變或重組)進(jìn)行修飾的微生物。具體地，未修飾的菌株是指在通過修飾而提高細(xì)胞內(nèi)atp水平之前的微生物，其中所述修飾是指通過使構(gòu)成鐵攝取系統(tǒng)和fhucdb復(fù)合物的fhuc、fhud和fhub中的一種或多種被滅活來使細(xì)胞內(nèi)atp消耗降低。也就是說，未修飾的菌株是指重組微生物的來源微生物。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，可以使上述微生物的fhuc、fhud和fhub中的一種或多種被滅活，也可以使fhuc、fhud和fhub的組合被滅活，并且具體地，可以使fhuc、fhud和fhub均被滅活。本說明書中使用的術(shù)語“滅活”是指通過如下方式使相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性被消除或弱化：由于編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)的基因的部分或全部的缺失、取代或插入而引起的突變；修飾表達(dá)調(diào)控序列以減少基因的表達(dá)；修飾染色體基因序列以弱化或消除蛋白質(zhì)的活性；或它們的組合。具體地，編碼蛋白質(zhì)的基因的部分或全部的缺失可以通過如下方式來進(jìn)行：經(jīng)由細(xì)菌染色體插入載體，將編碼染色體中的內(nèi)源性靶蛋白的基因替換成其部分序列缺失的多核苷酸或標(biāo)記基因。此外，可以使用諸如化學(xué)品或紫外線的誘變劑來誘導(dǎo)突變，從而獲得具有相應(yīng)基因缺失的突變體，但不限于此。本說明書中使用的術(shù)語“表達(dá)調(diào)控序列”，即調(diào)控基因表達(dá)的核苷酸序列，是指能夠提高或降低個(gè)體中特定基因的表達(dá)的片段，并且可以包括啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列，但不限于此。具體地，用于引起基因表達(dá)降低的表達(dá)調(diào)控序列的修飾可以通過如下方式來進(jìn)行：通過核苷酸序列的缺失、插入、保守性或非保守性取代或其組合來在表達(dá)調(diào)控序列中誘導(dǎo)突變，以進(jìn)一步弱化表達(dá)調(diào)控序列的活性，或者用具有較弱活性的表達(dá)調(diào)控序列進(jìn)行替換，但不限于此。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，與未修飾的菌株相比，微生物可以是具有提高的靶物質(zhì)的生產(chǎn)能力的埃希氏菌屬微生物。在本發(fā)明的埃希氏菌屬微生物中，構(gòu)成fhucdb復(fù)合物的一種或多種蛋白質(zhì)可以被滅活以使鐵攝取途徑失活，因此伴隨經(jīng)由該途徑的鐵攝取的atp消耗降低。結(jié)果，與未修飾的菌株相比，埃希氏菌屬微生物具有提高的細(xì)胞內(nèi)atp水平，因此微生物具有提高的靶物質(zhì)生產(chǎn)能力。本說明書中使用的術(shù)語“具有提高的生產(chǎn)能力的微生物”是指與在修飾之前的親本細(xì)胞或未修飾的菌株相比，具有提高的靶物質(zhì)生產(chǎn)能力的微生物。本說明書中使用的術(shù)語“靶物質(zhì)”包括通過提高微生物的細(xì)胞內(nèi)atp水平來提高生產(chǎn)量的物質(zhì)，但不限于此。靶物質(zhì)可以具體地是l-氨基酸，更具體地，l-蘇氨酸或l-色氨酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，微生物可以是具有l(wèi)-色氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌，其中其fhuc、fhud和fhub中的一種或多種被滅活，并且與未修飾的菌株相比，具有提高的細(xì)胞內(nèi)atp水平。具有l(wèi)-色氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌可以通過如下方式來獲得：提高l-色氨酸操縱子基因的表達(dá)；解除最終產(chǎn)物l-色氨酸的反饋抑制；或解除l-色氨酸操縱子基因?qū)D(zhuǎn)錄水平的抑制和減弱，但不限于此。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，微生物可以是具有l(wèi)-蘇氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌，其中其fhuc、fhud和fhub中的一種或多種被滅活，并且與未修飾的菌株相比，具有提高的細(xì)胞內(nèi)atp水平。具有l(wèi)-蘇氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌可以通過如下方式來獲得：提高l-蘇氨酸操縱子基因的表達(dá)；解除最終產(chǎn)物l-蘇氨酸的反饋抑制或解除l-蘇氨酸操縱子基因?qū)D(zhuǎn)錄水平的抑制和減弱，但不限于此。另一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)l-氨基酸的方法，所述方法包括如下步驟：培養(yǎng)具有提高的細(xì)胞內(nèi)atp水平的埃希氏菌屬微生物；以及從所獲得的微生物的培養(yǎng)液中分離l-氨基酸。本說明書中使用的術(shù)語“具有提高的細(xì)胞內(nèi)atp水平的埃希氏菌屬微生物”與上文所描述的相同。在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式的生產(chǎn)l-氨基酸的方法中，具有l(wèi)-氨基酸生產(chǎn)能力的微生物的培養(yǎng)可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件來進(jìn)行。培養(yǎng)過程可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所選擇的微生物容易地調(diào)整。培過程的實(shí)例包括間歇式、連續(xù)式和補(bǔ)料分批式，但不限于此。用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基必須滿足培養(yǎng)特定微生物的要求。在文獻(xiàn)(美國細(xì)菌學(xué)會(huì)(americansocietyforbacteriology)的“manualofmethodsforgeneralbacteriology(普通細(xì)菌學(xué)方法手冊)”，washingtond.c.(華盛頓)，usa(美國)，1981)中描述了用于各種微生物的培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基包含各種碳源、氮源和微量元素成分。碳源包括碳水化合物，諸如葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉和纖維素；脂質(zhì)，諸如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，諸如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸；醇，諸如甘油和乙醇；和有機(jī)酸，諸如乙酸。這些碳源可以單獨(dú)使用或組合使用，但不限于此。氮源包括有機(jī)氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麥芽提取物、玉米漿(csl)和豆粉；以及無機(jī)氮源，例如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。這些氮源可以單獨(dú)使用或組合使用，但不限于此。另外，培養(yǎng)基可以包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和其相應(yīng)的含鈉鹽作為磷源，但不限于此。此外，培養(yǎng)基可以包含金屬，諸如硫酸鎂或硫酸鐵。此外，也可以添加氨基酸、維生素和適當(dāng)?shù)那绑w。此外，為了將培養(yǎng)物維持在需氧條件下，可以將氧氣或含氧氣體(例如空氣)注入培養(yǎng)液中。培養(yǎng)物的溫度通?？梢詾?0℃-45℃，具體為25℃-40℃?？梢岳^續(xù)培養(yǎng)，直至l-氨基酸(諸如l-蘇氨酸或l-色氨酸)的產(chǎn)量達(dá)到所期望水平，并且具體地，培養(yǎng)時(shí)間可以為10小時(shí)-100小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式的生產(chǎn)l-氨基酸的方法可以包括從由此獲得的微生物的培養(yǎng)液中進(jìn)一步分離l-氨基酸。l-氨基酸的分離可以根據(jù)培養(yǎng)本發(fā)明的微生物的方法(例如間歇式、連續(xù)式和補(bǔ)料分批式)通過本領(lǐng)域已知的適當(dāng)方法來從微生物的培養(yǎng)液中純化或回收所需的l-氨基酸，但不限于此。有益效果通過根據(jù)本發(fā)明的與未修飾的菌株相比具有提高的細(xì)胞內(nèi)atp濃度的埃希氏菌屬微生物以及使用其制備靶物質(zhì)的方法，較高的細(xì)胞內(nèi)atp濃度會(huì)增強(qiáng)基因表達(dá)、生物合成、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)?，從而能夠有效地生產(chǎn)有用的靶物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、l-氨基酸等。附圖說明圖1顯示了與未修飾的菌株相比的根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式的大腸桿菌的細(xì)胞內(nèi)atp水平；圖2顯示了與未修飾的菌株相比的根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式的具有l(wèi)-色氨酸生產(chǎn)能力的野生型來源的大腸桿菌的細(xì)胞內(nèi)atp水平；圖3顯示了與未修飾的菌株相比的根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式的具有l(wèi)-蘇氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌的細(xì)胞內(nèi)atp水平；圖4顯示了與未修飾的菌株相比的根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式的具有l(wèi)-色氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌的細(xì)胞內(nèi)atp水平；圖5顯示了與未修飾的菌株相比的根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式的具有l(wèi)-蘇氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌的l-蘇氨酸生產(chǎn)能力；和圖6顯示了與未修飾的菌株相比的根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式的具有l(wèi)-色氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌的l-色氨酸生產(chǎn)能力。具體實(shí)施方式下文中，將參考一些實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，這些實(shí)施例僅僅用于說明性目的，并且本發(fā)明的范圍不意圖受這些實(shí)施例限制。實(shí)施例1：具有由fhuc、fhud和fhub基因編碼的、被滅活的蛋白質(zhì)的野生型大腸桿菌w3110的制備在該實(shí)施例中，通過同源重組，分別使野生型大腸桿菌w3110(39936tm)的fhuc、fhud和fhub基因缺失。待被缺失的fhuc、fhud和fhub基因分別具有序列號1、2和3的核苷酸序列，并且這些基因以序列號4的操縱子的形式存在。為了使fhuc、fhud和fhub缺失，采用了使用由datsenkoka等開發(fā)的lambdared重組酶的一步滅活方法(onestepinactivation)(procnatlacadsciusa.(美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào))，(2000)97：6640-6645)。使用pucprmfmloxc的氯霉素基因作為確認(rèn)在基因中的插入的標(biāo)記物(韓國專利申請第2009-0075549號)，其中pucprmfmloxc的氯霉素基因是通過將rmf啟動(dòng)子連接到puc19(newenglandbiolabs(紐英倫生物技術(shù))(usa(美國)))并連接從pacyc184(newenglandbiolab)獲得的突變的loxp-cmr-loxp盒來制備的。首先，使用pucprmfmloxc作為模板，并利用序列號8和9、10和11、12和13以及8和13的引物組合，進(jìn)行含30個(gè)循環(huán)的初級(primary)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(下文中稱為“pcr”)，從而獲得約1.2kb的pcr產(chǎn)物△fhuc1st、△fhud1st、△fhub1st和△fhucdb1st，其中，上述序列號8和9、10和11、12和13以及8和13具有fhuc和fhub基因的一部分和pucprmfmloxc基因的氯霉素抗性基因的部分序列，且每個(gè)循環(huán)包含在94℃下變性30秒、在55℃下退火30秒和在72℃下延伸1分鐘。此后，將通過pcr獲得的1.2kb的pcr產(chǎn)物△fhuc1st、△fhud1st、△fhub1st和△fhucdb1st在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，然后洗脫并用作二級(secondary)pcr的模板。使用洗脫的初級pcr產(chǎn)物作為模板，并利用序列號14和15、16和17、18和19、14和19的引物組合，進(jìn)行含30個(gè)循環(huán)的二級pcr，從而獲得約1.3kb的pcr產(chǎn)物，即△fhuc、△fhud、△fhub和△fhucdb，其中，上述序列號14和15、16和17、18和19、14和19包含在初級pcr中獲得的pcr產(chǎn)物的5'和3'區(qū)域的20bp的核苷酸序列，其中每個(gè)循環(huán)包含在94℃下變性30秒、在55℃下退火30秒和在72℃下延伸1分鐘。將由此獲得的pcr產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，然后洗脫，并用于重組。根據(jù)datsenkoka等人開發(fā)的一步滅活方法(procnatlacadsciusa.，(2000)97:6640-6645)用pkd46載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌w3110被制備成感受態(tài)后，通過引入由初級pcr和二級pcr獲得的1.3kb的基因片段來進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在含有氯霉素的lb培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌株，并且選擇具有氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化體。由所選菌株獲得的基因組作為模板，并利用序列號20和21的引物來進(jìn)行pcr后，確認(rèn)到所擴(kuò)增的大小分別為大約4.4kb、大約4.3kb、大約3.3kb和大約1.6kb，從而確認(rèn)fhuc、fhud和fhub已單獨(dú)或全部缺失。在從由此獲得的具有氯霉素抗性的初級重組菌株去除pkd46后，引入pjw168載體(gene(期刊《基因》),(2000)247,255-264)，以從菌株中去除氯霉素標(biāo)記基因(gene,(2000)247,255-264)。使用序列號20和21的引物對最終獲得的菌株進(jìn)行pcr后，獲得了約3.4kb、約3.3kb、約2.2kb和約0.6kb的pcr產(chǎn)物，從而確認(rèn)fhuc、fhud和fhub基因已單獨(dú)或全部缺失，并分別命名為大腸桿菌w3110_δfhuc、w3110_δfhud、w3110_δfhub和w3110_δfhucdb。實(shí)施例2：在由野生型大腸桿菌獲得的、缺失fhuc、fhud和fhub基因的大腸桿菌中測定細(xì)胞內(nèi)atp水平在該實(shí)施例中，利用實(shí)施例1中所制備的菌株而測量實(shí)際的細(xì)胞內(nèi)atp水平。為此，采用kiyotakay.hara等研發(fā)的、使用熒光素酶的“細(xì)胞atp合成能力的定量測定方法(anefficientmethodforquantitativedeterminationofcellularatpsyntheticactivity)”(jbiomscre(生物分子篩選雜志),(2006)第11卷,no.3,第310-17頁)。簡言之，在含有葡萄糖的lb液體培養(yǎng)基中，分別對實(shí)施例1中所使用的大腸桿菌w3110(未修飾的菌株)和通過基因缺失而獲得的大腸桿菌w3110_δfhucdb進(jìn)行過夜培養(yǎng)。在培養(yǎng)后，通過離心分離而除去上清液，并用100mmtris-cl(ph7.5)洗滌所獲得的菌體，然后用pb緩沖液(可滲透緩沖液：40％[v/v]葡萄糖，0.8％[v/v]tritonx-100)處理30分鐘以使細(xì)胞內(nèi)atp滲出至細(xì)胞外。接著，通過離心分離而除去上清液，并向細(xì)胞中加入熒光素作為熒光素酶底物后，使細(xì)胞反應(yīng)10分鐘。使用發(fā)光計(jì)測量熒光素酶的顯色程度以定量測定atp水平。在圖1中給出該結(jié)果。圖1示出三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。如圖1中所示，可確認(rèn)：與未修飾的菌株大腸桿菌w3110相比，在實(shí)施例1中制備的大腸桿菌w3110_δfhuc、w3110_δfhud、w3110_δfhub和w3110_δfhucdb中的細(xì)胞內(nèi)atp水平得到提高，其中由野生型大腸桿菌獲得的fhuc、fhud和fhub分別單獨(dú)缺失或全部缺失。實(shí)施例3：由fhuc、fhud和fhub基因編碼的蛋白質(zhì)被滅活的、由野生型獲得的l-色氨酸生產(chǎn)菌株的制備和細(xì)胞內(nèi)atp水平的測量在該實(shí)施例中，通過實(shí)施例1中的同源重組而使由野生型獲得的大腸桿菌w3110trpδ2/pcl-dtrp_att-trpedcba菌株(生產(chǎn)l-色氨酸的菌株)(韓國專利公開第10-2013-0082121號)的fhuc、fhud和fhub基因分別單獨(dú)缺失或全部缺失，以制備w3110trpδ2_δfhuc/pcl-dtrp_att-trpedcba、w3110trpδ2_δfhud/pcl-dtrp_att-trpedcba、w3110trpδ2_δfhub/pcl-dtrp_att-trpedcba和w3110trpδ2_δfhucdb/pcl-dtrp_att-trpedcba菌株。在由此制得的這些菌株中，采用與實(shí)施例2中相同的方式測量細(xì)胞內(nèi)atp水平，并且在圖2中給出該結(jié)果。如圖2中所示，可確認(rèn)：與未修飾的菌株和對照組菌株相比，在通過使源于野生型的l-色氨酸生產(chǎn)菌株的fhuc、fhud和fhub基因分別單獨(dú)缺失或全部缺失來制備的菌株中的細(xì)胞內(nèi)atp水平得到提高。實(shí)施例4：確認(rèn)由fhuc、fhud和fhub基因編碼的蛋白質(zhì)被滅活的、由野生型獲得的l-色氨酸生產(chǎn)菌株的效價(jià)使用葡萄糖作為碳源，對如實(shí)施例3所述的作為由野生型獲得的l-色氨酸生產(chǎn)菌株的w3110trpδ2/pcl-dtrp_att-trpedcba和通過使fhuc、fhud和fhub基因分別單獨(dú)缺失或全部缺失而所制得的具有提高的細(xì)胞內(nèi)atp水平的菌株進(jìn)行效價(jià)測定(titration)。分別按白金環(huán)的一次鉤取量，將每個(gè)菌株接種在lb固體培養(yǎng)基上，并在37℃下在培養(yǎng)器中進(jìn)行過夜培養(yǎng)，然后分別按白金環(huán)的一次鉤取量接種到25ml的含有表1的組分的含葡萄糖的效價(jià)培養(yǎng)基中。然后，在37℃下和200rpm下在培養(yǎng)器中培養(yǎng)48小時(shí)。在表2中給出該結(jié)果。所有結(jié)果均表示三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。[表1]組分濃度(每升)葡萄糖60gk2hpo41g(nh4)2so415gnacl1gmgso4·h2o1g檸檬酸鈉5g酵母提取物2gcaco340gl-苯丙氨酸0.15gl-酪氨酸0.1gph6.8[表2]*48小時(shí)后的測量值如表2中所示，可確認(rèn)：與未修飾的菌株trpδ2/pcl-dtrp_att-trpedcba相比，通過使野生型l-色氨酸生產(chǎn)菌株w3110trpδ2/pcl-dtrp_att-trpedcba中的fhuc、fhud和fhub基因分別單獨(dú)缺失或全部缺失而制得的具有提高的細(xì)胞內(nèi)atp水平的菌株(實(shí)施例3)使l-色氨酸生產(chǎn)量提高了最高約63％。鑒于圖2中確認(rèn)的細(xì)胞內(nèi)atp水平，這些結(jié)果表明，通過提高細(xì)胞內(nèi)atp水平來提高了菌株的l-色氨酸生產(chǎn)能力。實(shí)施例5：由fhuc、fhud和fhub基因編碼的蛋白質(zhì)被滅活的l-蘇氨酸生產(chǎn)菌株和l-色氨酸生產(chǎn)菌株的制備在該實(shí)施例中，通過實(shí)施例1所述的同源重組，分別使作為l-色氨酸生產(chǎn)菌株的大腸桿菌kccm10812p(韓國授權(quán)專利第0792095號)和l-蘇氨酸生產(chǎn)菌株kccm10541p(韓國授權(quán)專利第0576342號)的fhuc、fhud和fhub基因缺失。作為具有l(wèi)-色氨酸生產(chǎn)能力的未修飾的菌株，大腸桿菌kccm10812p是由具有l(wèi)-苯丙氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌變體(kfcc10066)獲得的菌株，并且是具有l(wèi)-色氨酸生產(chǎn)能力的重組大腸桿菌菌株，其特征在于染色體的色氨酸營養(yǎng)缺陷性被解除，phea、trpr、mtr和tnaab基因被減弱，并且arog和trpe基因被修飾。此外，作為具有l(wèi)-蘇氨酸生產(chǎn)能力的未修飾的菌株，大腸桿菌kccm10541p是由大腸桿菌kfcc10718(韓國專利公開第1992-0008365號)獲得的菌株，并且是具有如下特征的大腸桿菌：對l-甲硫氨酸類似物的抗性、甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷性、對l-蘇氨酸類似物的抗性、異亮氨酸滲漏(leaky)缺陷性、對l-賴氨酸類似物的抗性、對α-氨基丁酸的抗性和l-蘇氨酸產(chǎn)生能力。以與實(shí)施例1中相同的方式，分別在大腸桿菌kccm10812p和大腸桿菌kccm10541p中使待被缺失的fhuc、fhud和fhub基因缺失，從而制備得到l-蘇氨酸生產(chǎn)菌株kccm10541p_δfhucdb和l-色氨酸生產(chǎn)菌株kccm10812p_δfhucdb。實(shí)施例6：在由fhuc、fhud和fhub基因編碼的蛋白質(zhì)被滅活的l-蘇氨酸生產(chǎn)菌株和l-色氨酸生產(chǎn)菌株中測量atp水平在該實(shí)施例中，利用實(shí)施例5中所制得的菌株測量實(shí)際的細(xì)胞內(nèi)atp水平。以與實(shí)施例2中相同的方式測量細(xì)胞內(nèi)atp水平。在圖3和4中給出其結(jié)果。圖3和圖4示出三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。使用缺失ysa和ydas基因的l-蘇氨酸生產(chǎn)菌株(大腸桿菌kccm10541p_△ysa△ydas)和l-色氨酸生產(chǎn)菌株(大腸桿菌kccm10812p_△ysa△ydas)(韓國授權(quán)專利第1327093號)作為對照組，已知缺失ysa和ydas的l-蘇氨酸生產(chǎn)菌株(大腸桿菌kccm10541p_△ysa△ydas)和l-色氨酸生產(chǎn)菌株(大腸桿菌kccm10812p_△ysa△ydas)具有比實(shí)施例5中使用的未修飾的菌株大腸桿菌kccm10812p和大腸桿菌kccm10541p更高的細(xì)胞內(nèi)atp水平。如圖3和4中所示，與未修飾的菌株和對照菌株相比，通過使l-蘇氨酸生產(chǎn)菌株和l-色氨酸生產(chǎn)菌株的fhuc、fhud和fhub缺失而制備的如實(shí)施例5所述的菌株表現(xiàn)出提高的細(xì)胞內(nèi)atp水平。實(shí)施例7：確認(rèn)由fhuc、fhud和fhub基因編碼的蛋白質(zhì)的功能被滅活的l-蘇氨酸生產(chǎn)菌株的效價(jià)(titer)使用葡萄糖作為碳源，對通過使作為l-蘇氨酸生產(chǎn)微生物的大腸桿菌kccm10541p(韓國授權(quán)專利第0576342號)的fhuc、fhud和fhub基因缺失而制備得到的具有提高的細(xì)胞內(nèi)atp水平的菌株(實(shí)施例5)進(jìn)行效價(jià)測定(titration)。使用缺失ysa和ydas基因的l-蘇氨酸生產(chǎn)菌株(大腸桿菌kccm10541p_△ysa△ydas)作為對照組，來比較效價(jià)測定結(jié)果。在33℃下在培養(yǎng)器中，將每個(gè)菌株接種在lb固體培養(yǎng)基上并進(jìn)行過夜培養(yǎng)，然后按白金環(huán)的一次鉤取量分別接種到含有表1的組分且含葡萄糖的25ml效價(jià)培養(yǎng)基中后，在33℃下和200rpm下在培養(yǎng)器中培養(yǎng)50小時(shí)。在表4和圖5中給出其結(jié)果。所有結(jié)果均表示三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。[表3]組分濃度(每升)葡萄糖70gkh2po42g(nh4)2so425gmgso4·h2o1gfeso4·h2o5mgmnso4·h2o5mg酵母提取物2gcaco330g[表4]*30小時(shí)后的測量值**50小時(shí)后的測量值如表4中所示，可確認(rèn)：根據(jù)本發(fā)明制備的l-蘇氨酸生產(chǎn)大腸桿菌重組菌株表現(xiàn)出與未修飾的菌株相似的生理活性，并且與未修飾的菌株相比，l-蘇氨酸產(chǎn)量提高了約9％。鑒于圖2中確認(rèn)的細(xì)胞內(nèi)atp水平，這些結(jié)果表明，通過提高細(xì)胞內(nèi)atp水平來提高了菌株的l-蘇氨酸生產(chǎn)能力。實(shí)施例8：確認(rèn)由fhuc、fhud和fhub基因編碼的蛋白質(zhì)被滅活的l-色氨酸生產(chǎn)菌株效價(jià)使用葡萄糖作為碳源，對通過使作為l-色氨酸生產(chǎn)微生物的大腸桿菌kccm10812p(韓國授權(quán)專利第0792095號)中的fhuc、fhud和fhub基因缺失而制備得到的具有提高的細(xì)胞內(nèi)atp水平的菌株(實(shí)施例5)進(jìn)行效價(jià)測定(titration)。使用缺失ysa和ydas基因的l-色氨酸生產(chǎn)菌株(大腸桿菌kccm10812p_△ysa△ydas)作為對照組，來以與實(shí)施例4中相同的方式測定效價(jià)。在表5和圖6中給出該效價(jià)測定結(jié)果。所有結(jié)果均表示三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。[表5]*33小時(shí)后的測量值**48小時(shí)后的測量值如表5中所示，可確認(rèn)：根據(jù)本發(fā)明制備的l-色氨酸生產(chǎn)大腸桿菌重組菌株表現(xiàn)出與未修飾的菌株相似的生理活性，并且與未修飾的菌株相比，l-色氨酸產(chǎn)量提高了約30％。鑒于圖3中確認(rèn)的細(xì)胞內(nèi)atp水平，這些結(jié)果表明，通過提高細(xì)胞內(nèi)atp水平來提高了菌株的l-色氨酸生產(chǎn)能力。根據(jù)本發(fā)明的重組菌株ca04-2801(kccm10812p_△fhucdb)于2013年11月15日被保藏于作為國際保藏機(jī)構(gòu)的韓國微生物保藏中心(koreanculturecenterofmicroorganisms)，保藏號為kccm11474p。基于上述描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本發(fā)明可以以不同的具體形式實(shí)現(xiàn)，而不改變其技術(shù)精神或必要特征。因此，應(yīng)當(dāng)理解，上述實(shí)施方式在所有方面都不是限制性的，而是示例性的。本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求限定，而不是由前述的詳細(xì)說明限定，因此落入權(quán)利要求的含義和范圍內(nèi)以及其等同物內(nèi)的所有改變和修改均旨在包含于本發(fā)明的范圍中。序列目錄freetext(自由文本)附件的序列目錄中示出本說明書中所記載的序列號1至序列號21的序列。當(dāng)前第1頁12