本發(fā)明涉及抗GPC3抗體和免疫偶聯(lián)物及其使用方法。
背景技術(shù)：
：磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族成員，它是通過糖基磷脂酰肌醇錨連接至細(xì)胞表面的硫酸肝素蛋白聚糖。GPC3已顯示出在超過70％的肝細(xì)胞癌活組織檢查切片中高表達(dá)，但在鄰近的非腫瘤組織中不表達(dá)。GPC3陽性HCC患者的無病存活率顯著低于GPC3陰性HCC患者。本領(lǐng)域需要靶向GPC3以診斷和治療GPC3相關(guān)病癥諸如癌癥的安全且有效的藥劑。本發(fā)明滿足了該需要且提供了其他益處。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供抗GPC3抗體和免疫偶聯(lián)物及其使用方法。在一些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合至GPC3的分離的抗體。在一些實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合至GPC3并且具有一種或多種以下特性：a)結(jié)合至重組人GPC3；b)結(jié)合至重組食蟹猴GPC3；c)結(jié)合至HepG2細(xì)胞表面上的內(nèi)源性GPC3；d)結(jié)合至293細(xì)胞表面上表達(dá)的食蟹猴GPC3；e)結(jié)合至癌細(xì)胞表面上的內(nèi)源性GPC3；f)結(jié)合至肝細(xì)胞癌細(xì)胞表面上的內(nèi)源性GPC3；g)結(jié)合至選自HepG2、Hep3B、Huh7和JHH-7的細(xì)胞系的細(xì)胞表面上的內(nèi)源性GPC3；h)結(jié)合至人GPC3的氨基酸25至137內(nèi)的表位；i)結(jié)合至跨越人GPC3的氨基酸R358/S359處的弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)的表位；j)結(jié)合至全長成熟人GPC3(例如，SEQIDNO:1的氨基酸25至560或氨基酸25至580)，但不結(jié)合至人GPC3的N-末端片段(SEQIDNO:1的氨基酸25至358)或不結(jié)合至人GPC3的C-末端片段(SEQIDNO:1的氨基酸359至560或氨基酸359至580)；k)結(jié)合至人GPC3的氨基酸420至470內(nèi)的表位；l)結(jié)合至人GPC3的氨基酸470至509內(nèi)的表位；m)與抗體7H1競爭結(jié)合至人GPC3；n)與抗體4G7競爭結(jié)合至人GPC3；o)與抗體15G1競爭結(jié)合至人GPC3；和/或p)與抗體4A11競爭結(jié)合至人GPC3。在一些實(shí)施方案中，人GPC3包含SEQIDNO:1的序列(全長GPC3前體)或包含SEQIDNOP:1的氨基酸25至580(全長成熟GPC3)。在一些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合人GPC3的分離的抗體，其中該抗體結(jié)合至選自以下的表位：a)人GPC3的氨基酸25至137內(nèi)的表位；b)跨越人GPC3的氨基酸R358/S359處的弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)的表位；c)人GPC3的氨基酸420至470內(nèi)的表位；和d)人GPC3的氨基酸470至509內(nèi)的表位。在一些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合人GPC3的分離的抗體，其中該抗體結(jié)合至人GPC3的氨基酸25至137內(nèi)的表位。在一些實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合至來自至少一個(gè)物種的GPC3，所述至少一個(gè)物種選自食蟹猴、小鼠和大鼠。在一些實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合至來自食蟹猴、小鼠和大鼠的GPC3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L3和含有SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-H2。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:4的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-H2和含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含(a)與SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)與SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)如(a)中的VH和如(b)中的VL。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含(a)具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的VH序列；(b)具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的VL序列；(c)基于SEQIDNO:2的氨基酸序列的人源化VH；(d)基于SEQIDNO:3的氨基酸序列的人源化VL序列；或(e)如(a)或(c)中的VH和如(b)或(d)中的VL。在一些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合人GPC3的分離的抗體，其中該抗體結(jié)合至跨越人GPC3的氨基酸R358/S359處的弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)的表位。在一些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合人GPC3的分離的抗體，其中該抗體結(jié)合至全長成熟人GPC3，但不結(jié)合至由SEQIDNO:1的氨基酸25至358組成的人GPC3的N-末端片段，并且不結(jié)合至由SEQIDNO:1的氨基酸359至560或氨基酸359至580組成的人GPC3的C-末端片段。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-L3和含有SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-H2。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-H2和含有SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-H3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-L3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含：(a)與SEQIDNO:26的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)與SEQIDNO:27的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)如(a)中的VH和如(b)中的VL。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含：(a)具有SEQIDNO:26的氨基酸序列的VH序列；(b)具有SEQIDNO:27的氨基酸序列的VL序列；(c)基于SEQIDNO:26的氨基酸序列的人源化VH；(d)基于SEQIDNO:27的氨基酸序列的人源化VL序列；或(e)如(a)或(c)中的VH和如(b)或(d)中的VL。在一些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合人GPC3的分離的抗體，其中該抗體結(jié)合至人GPC3的氨基酸420至470內(nèi)的表位。在一些實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合至來自至少一個(gè)物種的GPC3，所述至少一個(gè)物種選自食蟹猴、恒河猴、小鼠和大鼠。在一些實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合至來自食蟹猴、恒河猴、小鼠和大鼠的GPC3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3和含有SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2和含有SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含：(a)與SEQIDNO:18的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)與SEQIDNO:19的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)如(a)中的VH和如(b)中的VL。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含：(a)具有SEQIDNO:18的氨基酸序列的VH序列；(b)具有SEQIDNO:19的氨基酸序列的VL序列；(c)基于SEQIDNO:18的氨基酸序列的人源化VH；(d)基于SEQIDNO:19的氨基酸序列的人源化VL序列；或(e)如(a)或(c)中的VH和如(b)或(d)中的VL。在一些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合人GPC3的分離的抗體，其中該抗體結(jié)合至人GPC3的氨基酸470至509內(nèi)的表位。在一些實(shí)施方案中，該抗體結(jié)合至食蟹猴GPC3。在一些實(shí)施方案中，該抗體不結(jié)合至大鼠GPC3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3和含有SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H2。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1、含有SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H2和含有SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1、含有SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2和含有SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含：(a)與SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VH序列；(b)與SEQIDNO:11的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)如(a)中的VH和如(b)中的VL。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含：(a)具有SEQIDNO:10的氨基酸序列的VH序列；(b)具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的VL序列；(c)基于SEQIDNO:10的氨基酸序列的人源化VH；(d)基于SEQIDNO:11的氨基酸序列的人源化VL序列；或(e)如(a)或(c)中的VH和如(b)或(d)中的VL。在一些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合至GPC3的分離的抗體，其中該抗體包含(a)含有SEQIDNO:4的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L3。在一些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合至GPC3的分離的抗體，其中該抗體包含(a)含有SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。在一些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合至GPC3的分離的抗體，其中該抗體包含(a)含有SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在一些實(shí)施方案中，提供了結(jié)合至GPC3的分離的抗體，其中該抗體包含(a)含有SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-L3。在本文所述的任何實(shí)施方案中，該抗體可以是單克隆抗體。在本文所述的任何實(shí)施方案中，該抗體可以是人、人源化或嵌合抗體。在本文所述的任何實(shí)施方案中，該抗體可以是結(jié)合GPC3的抗體片段。在本文所述的任何實(shí)施方案中，該抗體可以是IgG1、IgG2a或IgG2b抗體。在本文所述的任何實(shí)施方案中，GPC3可以是包含SEQIDNO:1的氨基酸25至580的人GPC3。在一些實(shí)施方案中，提供了編碼本文所述的抗體的分離的核酸。在一些實(shí)施方案中，提供了包含編碼本文所述的抗體的核酸的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，提供了制備抗體的方法，其包括培養(yǎng)包含編碼本文所述的抗體的核酸的宿主細(xì)胞，以制備抗體。在一些實(shí)施方案中，提供了免疫偶聯(lián)物，其包含本文所述的抗體和細(xì)胞毒性劑。在一些實(shí)施方案中，該免疫偶聯(lián)物具有下式Ab-(L-D)p，其中：(a)Ab是根據(jù)權(quán)利要求1至41中任一項(xiàng)所述的抗體；(b)L是接頭；(c)D是細(xì)胞毒性劑；并且(d)p在1-8的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，p在2-5的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞毒性劑選自類美登素(maytansinoid)、卡里奇霉素、吡咯并苯二氮雜卓(pyrrolobenzodiazepine)和奈莫柔比星衍生物。在一些實(shí)施方案中，D是式A的吡咯并苯二氮雜卓：其中虛線表示C1和C2或C2和C3之間任選存在雙鍵；R2獨(dú)立地選自H、OH、＝O、＝CH2、CN、R、OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，并且任選地還選自鹵代或二鹵代，其中RD獨(dú)立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H和鹵代；R6和R9獨(dú)立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和鹵代；R7獨(dú)立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和鹵代；Q獨(dú)立地選自O(shè)、S和NH；R11為H或R或，其中Q為O、SO3M，其中M為金屬陽離子；R和R’各自獨(dú)立地選自任選地取代的C1-8烷基、C3-8雜環(huán)基和C5-20芳基基團(tuán)，并且任選地就基團(tuán)NRR’而言，R和R’連同與其連接的氮原子一起形成任選地取代的4-、5-、6-或7-元雜環(huán)；R12、R16、R19和R17分別如對于R2、R6、R9和R7所定義；R″是C3-12亞烷基基團(tuán)，其鏈可被一個(gè)或多個(gè)任選地被取代的雜原子和/或芳環(huán)打斷；并且X和X’獨(dú)立地選自O(shè)、S和N(H)。在一些實(shí)施方案中，D具有以下結(jié)構(gòu)：其中n為0或1。在一些實(shí)施方案中，D為奈莫柔比星衍生物。在一些實(shí)施方案中，D具有以下結(jié)構(gòu)：在一些實(shí)施方案中，提供了包含本文所述的抗體的免疫偶聯(lián)物，其中該接頭可被蛋白酶裂解。在一些實(shí)施方案中，該接頭是酸不穩(wěn)定的。在一些實(shí)施方案中，該接頭包括腙。在一些實(shí)施方案中，提供了包含本文所述的抗體的免疫偶聯(lián)物，其中該免疫偶聯(lián)物具有選自以下的式：在一些實(shí)施方案中，提供了藥物制劑，其包含本文所述的免疫偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的載體。在一些實(shí)施方案中，提供了藥物制劑，其包含本文所述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。在一些實(shí)施方案中，該藥物制劑還包含另外的治療劑。在一些實(shí)施方案中，提供了治療患有GPC3陽性癌癥的個(gè)體的方法。在一些實(shí)施方案中，方法包括將有效量本文所述的抗體、本文所述的免疫偶聯(lián)物或本文所述的藥物制劑施用于個(gè)體。在一些實(shí)施方案中，該GPC3陽性癌癥是肝癌。在一些實(shí)施方案中，方法還包括將另外的治療劑施用于個(gè)體。在一些實(shí)施方案中，提供了抑制GPC3陽性細(xì)胞增殖的方法。在一些實(shí)施方案中，方法包括在允許抗體或免疫偶聯(lián)物與細(xì)胞表面上的GPC3結(jié)合的條件下，將有效量的本文所述的抗體或本文所述的免疫偶聯(lián)物施用于個(gè)體，從而抑制細(xì)胞的增殖。在一些實(shí)施方案中，該細(xì)胞是肝癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本文所述的抗體偶聯(lián)至標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，該標(biāo)記是正電子發(fā)射體。在一些實(shí)施方案中，該正電子發(fā)射體是89Zr。在一些實(shí)施方案中，提供了檢測生物樣本中的人GPC3的方法。在一些實(shí)施方案中，方法包括在允許抗GPC3抗體與天然存在的人GPC3結(jié)合的條件下，使生物樣本與本文所述的抗GPC3抗體接觸，并檢測生物樣本中抗GPC3抗體和天然存在的人GPC3之間是否形成復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，該生物樣本是肝癌樣本。在一些實(shí)施方案中，提供了檢測GPC3陽性癌癥的方法。在一些實(shí)施方案中，方法包括(i)將標(biāo)記的抗GPC3抗體施用于患有或疑似患有GPC3陽性癌癥的受試者，其中該標(biāo)記的抗GPC3抗體包括本文所述的抗GPC3抗體，以及(ii)檢測受試者中的該標(biāo)記的抗GPC3抗體，其中檢測出該標(biāo)記的抗GPC3抗體指示受試者的GPC3陽性癌癥。在一些實(shí)施方案中，該標(biāo)記的抗GPC3抗體包括偶聯(lián)至正電子發(fā)射體的抗GPC3抗體。在一些實(shí)施方案中，該正電子發(fā)射體是89Zr。附圖簡述圖1示出了正常和患病以及腫瘤組織中GPC3的表達(dá)，如實(shí)施例1所述。圖2示出了正常肝臟、肝癌和患病肝臟中GPC3的表達(dá)，如實(shí)施例1所述。圖3示出了肝細(xì)胞癌的各個(gè)分期和其他肝臟疾病中GPC3的表達(dá)，如實(shí)施例1所述。圖4A-B示出了抗GPC3抗體7H1、4A11、15G1和4G7的(A)輕鏈可變區(qū)序列和(B)重鏈可變區(qū)序列的比對。圖5示出了FACS測定的抗體7H1與293S細(xì)胞、HepG2X1細(xì)胞和表達(dá)GPC3的293S細(xì)胞(293S_GPC3FL)的結(jié)合，如實(shí)施例2所述。圖6示出了人GPC3蛋白序列的某些特征、人GPC3的三個(gè)片段以及Western印跡的示意圖，其示出了抗體7H1與GPC3片段的結(jié)合，如實(shí)施例2所述。圖7示出了FACS測定的抗體7H1和4G7以及對照抗體1G12(SantaCruzBiotechnology)與293S細(xì)胞、表達(dá)GPC3的C-末端片段(Ct_GPC3)的293S細(xì)胞和表達(dá)GPC3的N-末端片段(Nt_GPC3)的293S細(xì)胞的結(jié)合，如實(shí)施例2所述。圖8示出了人GPC3蛋白序列的某些特征和人GPC3的四個(gè)片段的示意圖，如實(shí)施例2所述。圖9示出了FACS測定的抗體4A11和15G1與全長FPC3以及在293S細(xì)胞中表達(dá)的圖8中三個(gè)片段的結(jié)合，如實(shí)施例2所述。圖10示出了抗體15G1和4A11與來自各個(gè)物種的GPC3的結(jié)合，如實(shí)施例2所述。圖11示出了來自人、食蟹猴、恒河猴、小鼠和大鼠的GPC3的比對，如實(shí)施例2所述。圖12示出了(A)馬來酰亞胺乙縮醛PNU-159682抗體-藥物偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)和(B)單甲基二硫化物N10-連接的PBD抗體-藥物偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)，如實(shí)施例5所討論。圖13A-B示出了通過FACS使用抗體4G7、7H1和4A11檢測的(A)HepG2X1細(xì)胞和(B)分離的HepG2X1異種移植瘤細(xì)胞表面上的GPC3的表達(dá)，如實(shí)施例6所述。圖14示出了在使用各種抗體-藥物偶聯(lián)物治療時(shí)HepG2X1異種移植模型中腫瘤體積(mm3)隨時(shí)間推移的變化，如實(shí)施例6所述。圖15A-B示出了通過FACS使用抗體4G7、7H1和4A11檢測的(A)JHH7細(xì)胞和(B)分離的JHH7X1異種移植瘤細(xì)胞表面上的GPC3的表達(dá)，如實(shí)施例7所述。圖16示出了在使用各種抗體-藥物偶聯(lián)物治療時(shí)JHH7異種移植模型中腫瘤體積(mm3)隨時(shí)間推移的變化，如實(shí)施例7所述。具體實(shí)施方式I.定義就本文的目的而言，“受體人框架”是包括來源于人免疫球蛋白框架或人共有序列框架的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)框架或重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如下文所定義。“來源于”人免疫球蛋白框架或人共有序列框架的受體人框架可包含它們的相同氨基酸序列，或可包含氨基酸序列變化。在一些實(shí)施方案中，氨基酸變化的數(shù)量為10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少或2或更少。在一些實(shí)施方案中，VL受體人框架的序列與VL人免疫球蛋白框架序列或人共有序列框架序列相同?！坝H和力”是指分子(例如，抗體)及其結(jié)合配偶體(例如，抗原)的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)之間的非共價(jià)相互作用的合計(jì)強(qiáng)度。除非另外指明，如本文所用，“結(jié)合親和力”是指固有結(jié)合親和力，它反映了結(jié)合對成員(例如，抗體和抗原)之間的1:1相互作用。分子X對其配偶體Y的親和力通?？梢越怆x常數(shù)(Kd)表示。親和力可通過本領(lǐng)域已知的常見方法，包括本文所述的那些方法測定。測量結(jié)合親和力的特定說明性和示例性實(shí)施方案如下文所述。“親和力成熟的”抗體是指，一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)(HVR)具有一個(gè)或多個(gè)改變的抗體，而親本抗體則不具有此類改變，此類改變引起抗體對抗原的親和力的提高。術(shù)語“抗GPC3抗體”和“結(jié)合至GPC3的抗體”是指這樣的抗體，它能夠以足夠的親和力結(jié)合GPC3，使得該抗體能夠用作診斷和/或治療劑來靶向GPC3。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗GPC3抗體與不相關(guān)的非GPC3蛋白結(jié)合的程度小于抗體與GPC3的結(jié)合約10％，如例如通過放射性免疫分析(RIA)所測定。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合至GPC3的抗體具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤5nm、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如，10-9M至10-13M)的解離常數(shù)(Kd)。在某些實(shí)施方案中，抗GPC3抗體結(jié)合至在來自不同物種的GPC3中保守的GPC3的表位。術(shù)語“抗體”在本文中以廣泛的意義使用，并且涵蓋各種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出所需的抗原結(jié)合活性即可?！翱贵w片段”是指除完整抗體之外的分子，它包含完整抗體的一部分，并且結(jié)合完整抗體所結(jié)合的抗原?？贵w片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；以及從抗體片段形成的多特異性抗體?！敖Y(jié)合至”蛋白質(zhì)的限定區(qū)內(nèi)的“表位的抗體”是需要用于結(jié)合至蛋白質(zhì)的該區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)或多個(gè)氨基酸的抗體。在某些實(shí)施方案中，“結(jié)合至”蛋白質(zhì)的限定區(qū)內(nèi)的“表位的抗體”通過缺失或突變分析鑒定，在所述缺失或突變分析中，該蛋白質(zhì)的氨基酸被缺失的或突變，并且抗體與所得的改變的蛋白質(zhì)(例如，包含該表位的改變的蛋白質(zhì))的結(jié)合測定為與未改變的蛋白質(zhì)的結(jié)合的至少20％。在一些實(shí)施方案中，“結(jié)合至”蛋白質(zhì)的限定區(qū)內(nèi)的“表位的抗體”通過缺失或突變分析鑒定，在所述缺失或突變分析中，該蛋白質(zhì)的氨基酸被缺失的或突變，并且抗體與所得的改變的蛋白質(zhì)(例如，包含該表位的改變的蛋白質(zhì))的結(jié)合測定為與未改變的蛋白質(zhì)的結(jié)合的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。示例性缺失(截短)分析如實(shí)施例2所述。在某些實(shí)施方案中，抗體的結(jié)合通過如實(shí)施例2所述的FACS，或通過合適的結(jié)合分析諸如ELISA或表面等離振子共振分析測定?！芭c參考抗體競爭結(jié)合至多肽例如GPC3的抗體”是指在競爭分析中阻斷參考抗體與多肽的結(jié)合50％或更多的抗體，相反，參考抗體在競爭分析中阻斷抗體與多肽的結(jié)合50％或更多。示例性競爭分析是本文實(shí)施例2提供的表位重新分級分析(epitopebinningassay)。在一些實(shí)施方案中，競爭可使用表面等離振子共振分析評估。“跨越氨基酸R358/S359處的弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)的表位”是指包含N-末端至S359的一個(gè)或多個(gè)GPC3氨基酸殘基和C-末端至R358的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的表位。在某些實(shí)施方案中，抗體與此類表位的結(jié)合可通過缺失或突變分析測定，在所述缺失或突變分析中，N-末端至S359的一個(gè)或多個(gè)GPC3氨基酸殘基和/或C-末端至R358的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被缺失或突變，并且抗體與所得的改變的蛋白質(zhì)(例如，包含該表位的改變的蛋白質(zhì))的結(jié)合測定為與未改變的蛋白質(zhì)的結(jié)合的至少20％。在某些實(shí)施方案中，抗體與此類表位的結(jié)合可通過缺失或突變分析測定，在所述缺失或突變分析中，N-末端至S359的一個(gè)或多個(gè)GPC3氨基酸殘基和/或C-末端至R358的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被缺失或突變，并且抗體與所得的改變的蛋白質(zhì)(例如，包含該表位的改變的蛋白質(zhì))的結(jié)合測定為與未改變的蛋白質(zhì)的結(jié)合的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合至跨越氨基酸R358/S359處的弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)的表位的抗體結(jié)合至全長GPC3，但不結(jié)合至以氨基酸殘基R358結(jié)束的GPC3的N-末端片段(例如，人GPC3的氨基酸25至358)，并且不結(jié)合至以氨基酸殘基S359開始的GPC3的C-末端片段(例如，人GPC3的氨基酸359至560或359至580)。術(shù)語“癌癥”和“癌性的”是指或描述了通常特征為細(xì)胞生長/增殖不受調(diào)控的哺乳動物的生理病癥。癌癥的例子包括但不限于惡性腫瘤、肝癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、胚細(xì)胞瘤、惡性毒瘤和白血病。術(shù)語“嵌合”抗體是指這樣的抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分來源于特定的來源或物種，而重鏈和/或輕鏈的其余部分來源于不同的來源或物種。抗體的“種類”是指其重鏈具有的恒定結(jié)構(gòu)域或恒定區(qū)的類型?？贵w有五種主要種類：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且這些種類中的多種還可分為子類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應(yīng)于不同種類免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞毒性劑”是指抑制或妨礙細(xì)胞功能和/或?qū)е录?xì)胞死亡或破壞的物質(zhì)。細(xì)胞毒性劑包括但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化療劑或藥物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素、長春花生物堿(長春新堿、長春堿、依托泊苷)、多柔比星、美法侖、絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔紅霉素或其他插入劑)；生長抑制劑；酶及其片段諸如溶核酶；抗生素；毒素諸如細(xì)菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或變體；以及下文公開的各種抗腫瘤或抗癌劑。“效應(yīng)功能”是指歸因于抗體Fc區(qū)的那些生物活性，其根據(jù)抗體同種型而變化。抗體效應(yīng)功能的例子包括：C1q結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)的下調(diào)；以及B細(xì)胞活化。藥劑例如藥物制劑的“有效量”是指在劑量和必要的時(shí)間段內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)所需的治療或預(yù)防結(jié)果的量。術(shù)語“表位”是指抗體結(jié)合的抗原分子上的特定位點(diǎn)。在本文中，術(shù)語“Fc區(qū)”用于定義包含至少一部分恒定區(qū)的免疫球蛋白重鏈的C-末端區(qū)。該術(shù)語包括天然序列Fc區(qū)和變體Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人IgG重鏈Fc區(qū)從Cys226或從Pro230延伸至重鏈的羧基末端。然而，F(xiàn)c區(qū)的C-末端賴氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非另外指明，F(xiàn)c區(qū)或恒定區(qū)中氨基酸殘基的編號根據(jù)EU編號系統(tǒng)(也稱為EU索引)進(jìn)行，如Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991所述?！翱蚣堋被颉癋R”是指除高變區(qū)(HVR)殘基之外的可變結(jié)構(gòu)域殘基?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的FR通常由四個(gè)FR結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常出現(xiàn)在VH(或VL)的以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。術(shù)語“全長抗體”、“完整抗體”和“全抗體”在本文中可互換使用，是指結(jié)構(gòu)基本上類似于天然抗體結(jié)構(gòu)或重鏈包含如本文定義的Fc區(qū)的抗體。術(shù)語“宿主細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞系”和“宿主細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，是指外源性核酸引入的細(xì)胞，包括此類細(xì)胞的子代。宿主細(xì)胞包括“轉(zhuǎn)化子”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”，其包括初代轉(zhuǎn)化細(xì)胞和及由其起源的子代，不論傳代次數(shù)多少。子代的核酸含量不一定與親代細(xì)胞完全相同，但可包含突變。本文包括這樣的突變子代，其具有的功能或生物活性與在初始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選或選擇的相同?！叭丝贵w”是這樣的抗體，其具有的氨基酸序列對應(yīng)于由人或人細(xì)胞產(chǎn)生的或來源于非人來源的抗體的氨基酸序列，所述非人來源利用人抗體譜或其他人抗體編碼序列。人抗體的該定義特別排除了包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。“人共有序列框架”是人免疫球蛋白VL或VH框架序列的選擇中代表最常見氨基酸殘基的框架。一般來講，人免疫球蛋白VL或VH序列的選擇來自可變結(jié)構(gòu)域序列亞組。一般來講，該序列亞組是如Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版,NIHPublication91-3242,BethesdaMD(1991),第1-3卷中所述的亞組。在一個(gè)實(shí)施方案中，對于VL，該亞組是如Kabat等(同上)所述的亞組κI。在一個(gè)實(shí)施方案中，對于VH，該亞組是如Kabat等(同上)所述的亞組III?！叭嗽椿笨贵w是指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體將包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中HVR的全部或基本上全部(例如，CDR)對應(yīng)于非人抗體的那些HVR，并且FR的全部或基本上全部對應(yīng)于人抗體的那些FR。人源化抗體任選地可包含來源于人抗體的抗體恒定區(qū)的至少一部分。抗體例如非人抗體的“人源化形式”是指已經(jīng)歷人源化的抗體。如本文所用，術(shù)語“高變區(qū)”或“HVR”是指序列高變的和/或形成結(jié)構(gòu)確定的環(huán)(“高變環(huán)”)的抗體可變結(jié)構(gòu)域的每個(gè)區(qū)。一般來講，天然四鏈抗體包含六個(gè)HVR；VH中三個(gè)(H1、H2、H3)，和VL中三個(gè)(L1、L2、L3)。HVR通常包含來自高變環(huán)和/或來自“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)的氨基酸殘基，后者的序列變異性最高和/或涉及抗原識別。示例性高變環(huán)出現(xiàn)在氨基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)處。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)出現(xiàn)在L1的氨基酸殘基24-34、L2的氨基酸殘基50-56、L3的氨基酸殘基89-97、H1的氨基酸殘基31-35B、H2的氨基酸殘基50-65和H3的氨基酸殘基95-102。(Kabat等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))。除VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高變環(huán)的氨基酸殘基。CDR還包含“特異性決定殘基”或“SDR”，它是接觸抗原的殘基。SDR包含在CDR的區(qū)域內(nèi)，稱為簡短CDR或a-CDR。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)出現(xiàn)在L1的氨基酸殘基31-34、L2的氨基酸殘基50-55、L3的氨基酸殘基89-96、H1的氨基酸殘基31-35B、H2的氨基酸殘基50-58和H3的氨基酸殘基95-102。(參見Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另外指明，可變結(jié)構(gòu)域中的HVR殘基和其他殘基(例如，F(xiàn)R殘基)在本文中根據(jù)Kabat等(同上)編號?！懊庖吲悸?lián)物”是偶聯(lián)至一個(gè)或多個(gè)異源分子(包括但不限于細(xì)胞毒性劑)的抗體?！皞€(gè)體”或“受試者”是哺乳動物。哺乳動物包括但不限于馴養(yǎng)的動物(例如，奶牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類(例如，人和非人靈長類諸如猴子)、兔和嚙齒類(例如，小鼠和大鼠)。在某些實(shí)施方案中，該個(gè)體或受試者是人。“分離的抗體”是與其天然環(huán)境的組分分離的抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體純化至大于95％或99％的純度，所述純度如通過例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電點(diǎn)聚焦(IEF)、毛細(xì)管電泳)或色譜(例如，離子交換或反相HPLC)所測定。關(guān)于抗體純度評估方法的評述，參見例如Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)?！胺蛛x的核酸”是指與其天然環(huán)境的組分分離的核酸分子。分離的核酸包括包含于細(xì)胞中的核酸分子，該細(xì)胞通常包含核酸分子，但該核酸分子存在于染色體外或不同于天然染色體位置的染色體位置?！熬幋a抗GPC3抗體的分離的核酸”是指編碼抗體重鏈和輕鏈(或其片段)的一種或多種核酸分子，包括單個(gè)載體或單獨(dú)的載體中的此類核酸分子，以及存在于宿主細(xì)胞中的一個(gè)或多個(gè)位置的此類核酸分子。如本文所用，術(shù)語“GPC3”是指GPC3前體蛋白在細(xì)胞中加工產(chǎn)生的任何天然、成熟的GPC3。該術(shù)語包括來自任何脊椎動物來源的GPC3，包括哺乳動物諸如靈長類(例如人和食蟹猴)和嚙齒類(例如，小鼠和大鼠)，除非另外指明。該術(shù)語還包括天然存在的GPC3變體，例如剪接變體或等位基因變體。具有信號序列(信號序列，氨基酸1-24)的示例性人GPC3前體蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。示例性成熟人GPC3的氨基酸序列為SEQIDNO:1的氨基酸25-580。具有信號序列的非限制示例性食蟹猴、恒河猴、小鼠和大鼠GPC3前體蛋白的氨基酸序列分別如SEQIDNO:37至41所示。術(shù)語“GPC3陽性癌癥”是指包括在表面上表達(dá)GPC3的細(xì)胞的癌癥。在一些實(shí)施方案中，GPC3在細(xì)胞表面上的表達(dá)例如使用GPC3的抗體在諸如免疫組織化學(xué)、FACS等的方法中測定。或者，GPC3mRNA表達(dá)被視為與細(xì)胞表面上的GPC3表達(dá)相關(guān)，并且可通過選自原位雜交和RT-PCR(包括定量RT-PCR)的方法測定。術(shù)語“GPC3陽性細(xì)胞”是指在其表面上表達(dá)GPC3的細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語“單克隆抗體”是指從基本上均一的抗體群體獲得的抗體，即組成該群體的單個(gè)抗體是相同的和/或結(jié)合相同的表位，但可能的變體抗體除外，例如包含天然存在的突變或在單克隆抗體制劑的制備期間產(chǎn)生，此類變體通常以微量存在。與多克隆抗體制劑(通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體)相比，單克隆抗體制劑的每個(gè)單克隆抗體針對抗原上的單個(gè)決定簇。因此，修飾語“單克隆”表示從基本上均一的抗體群獲得的抗體的特征，并且不應(yīng)解釋為需要通過任何特定方法制備抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多種技術(shù)制備，包括但不限于雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法以及利用包含人免疫球蛋白基因座的全部或一部分的轉(zhuǎn)基因動物的方法，此類方法和其他制備單克隆抗體的示例性方法如本文所述。“裸抗體”是指未偶聯(lián)至異源部分(例如，細(xì)胞毒性部分)或放射性標(biāo)記的抗體。裸抗體可存在于藥物制劑中?！疤烊豢贵w”是指具有不同結(jié)構(gòu)的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是約150,000道爾頓的異源四聚體糖蛋白，由通過二硫鍵連接的兩個(gè)相同的輕鏈和兩個(gè)相同的重鏈構(gòu)成。從N-末端至C-末端，每個(gè)重鏈具有可變區(qū)(VH)，也稱為可變重鏈結(jié)構(gòu)域或重鏈可變結(jié)構(gòu)域，然后是三個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2和CH3)。相似地，從N-末端至C-末端，每個(gè)輕鏈具有可變區(qū)(VL)，也稱為可變輕鏈結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，然后是恒定輕鏈(CL)結(jié)構(gòu)域?？筛鶕?jù)恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列將抗體的輕鏈指定為兩種類型之一，稱為kappa(κ)和lambda(λ)。術(shù)語“包裝說明書”用于指治療劑產(chǎn)品的商業(yè)包裝中通常包括的說明，其包含關(guān)于適應(yīng)癥、用法、劑量、施用、聯(lián)合治療、禁忌癥和/或涉及此類治療劑產(chǎn)品使用的警告的信息。相對于參考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定義為在對齊序列并引入空位(如果需要的話)，實(shí)現(xiàn)最大序列同一性百分比，并且不考慮作為序列同一性的一部分的任何保守取代之后，與參考多肽序列中的氨基酸殘基相同的候選序列中的氨基酸殘基的百分比?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式實(shí)現(xiàn)比對以確定氨基酸序列同一性百分比的目的，例如使用公開可用的計(jì)算機(jī)軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定用于比對序列的適當(dāng)參數(shù)，包括在待比較序列的全長上實(shí)現(xiàn)最大比對所需的任何算法。然而，就本文的目的而言，％氨基酸序列同一性值使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2生成。ALIGN-2序列比較計(jì)算機(jī)程序由Genentech,Inc.編寫，其源代碼和用戶文件說明已提交至美國版權(quán)局(U.S.CopyrightOffice,WashingtonD.C.,20559)，并以美國版權(quán)注冊No.TXU510087進(jìn)行注冊。ALIGN-2程序可Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,California公開獲得，或可從源代碼編譯。ALIGN-2程序應(yīng)在UNIX操作系統(tǒng)，包括數(shù)字UNIXV4.0D上編譯使用。所有序列比較參數(shù)均由ALIGN-2程序設(shè)定，并且不能改變。在其中使用ALIGN-2進(jìn)行氨基酸序列比較的情況下，給定氨基酸序列A與、和或?qū)o定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可稱為給定氨基酸序列A與、和或?qū)o定氨基酸序列B具有或包含某一％氨基酸序列同一性)如下進(jìn)行計(jì)算：100乘以分?jǐn)?shù)X/Y其中X為序列比對程序ALIGN-2進(jìn)行A和B的比對時(shí)記為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)，并且其中Y為B中的氨基酸殘基總數(shù)。應(yīng)當(dāng)理解，在氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度時(shí)，A與B的％氨基酸序列同一性不等于B與A的％氨基酸序列同一性。除非另外特別指明，本文所用的所有％氨基酸序列同一性值如上文段落所述使用ALIGN-2計(jì)算機(jī)程序獲得。術(shù)語“藥物制劑”是指這樣的制劑，其呈允許其中包含的有效活性成分發(fā)揮生物活性的形式，并且其不包含對施用該制劑的受試者具有無法接受的毒性的另外的組分。“藥學(xué)上可接受的載體”是指藥物制劑中除活性成分之外的成分，它對受試者無毒。藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩(wěn)定劑或防腐劑。如本文所用，“治療”(及其語法變型，諸如“治療”或“治療”)是指嘗試改變待治療個(gè)體的自然進(jìn)程的臨床干預(yù)，并且可出于預(yù)防目的或在臨床病理的過程中進(jìn)行。治療的期望效果包括但不限于預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、減輕癥狀、減少疾病的任何直接或間接病理后果、防止轉(zhuǎn)移、降低疾病進(jìn)展的速率、改善或緩和疾病狀態(tài)以及緩解或改善預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用于延緩疾病的發(fā)展或減緩疾病的進(jìn)展。術(shù)語“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”是指涉及抗體與抗原結(jié)合的抗體重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域(分別為VH和VL)通常具有類似的結(jié)構(gòu)，每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含四個(gè)保守框架區(qū)(FR)和三個(gè)高變區(qū)(HVR)。(參見例如Kindt等KubyImmunology,第6版,W.H.FreemanandCo.,第91頁(2007))。單個(gè)VH或VL結(jié)構(gòu)域可足以賦予抗原結(jié)合特異性。此外，結(jié)合特定抗原的抗體可通過以下方法分離：分別使用結(jié)合抗原的抗體的VH或VL結(jié)構(gòu)域篩選互補(bǔ)VL或VH結(jié)構(gòu)域的文庫。參見例如Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature352:624-628(1991)。如本文所用，術(shù)語“載體”是指能夠使與其所連接的另一種核酸增殖(propagate)的核酸分子。該術(shù)語包括作為自我復(fù)制核酸結(jié)構(gòu)的載體，以及并入到其所引入的宿主細(xì)胞的基因組的載體。某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作地連接的核酸的表達(dá)。此類載體在本文中稱為“表達(dá)載體”?！巴榛笔前?、仲、叔或環(huán)狀碳原子的C1-C18烴。例子為甲基(Me，-CH3)、乙基(Et，-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr，正丙基，-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr，異丙基，-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu，正丁基，-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu，異丁基，-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu，仲丁基，-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu，叔丁基，-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基，-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3。如本文所用，術(shù)語“C1-C8烷基”是指具有1至8個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和烴。代表性“C1-C8烷基”基團(tuán)包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基和-正癸基；而支鏈C1-C8烷基包括但不限于-異丙基、-仲丁基、-異丁基、-叔丁基、-異戊基、2-甲基丁基；不飽和C1-C8烷基包括但不限于-乙烯基、-丙烯基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-異丁基烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己基、2-己基、3-己基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基-、2-戊炔基-、3-甲基-1-丁炔基。C1-C8烷基基團(tuán)可以是未取代的或被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代，所述基團(tuán)包括但不限于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每個(gè)R’獨(dú)立地選自H、-C1-C8烷基和芳基。如本文所用，術(shù)語“C1-C12烷基”是指具有1至12個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和烴。C1-C12烷基基團(tuán)可以是未取代的或被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代，所述基團(tuán)包括但不限于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-SO3R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每個(gè)R’獨(dú)立地選自H、-C1-C8烷基和芳基。如本文所用，術(shù)語“C1-C6烷基”是指具有1至6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和烴。代表性“C1-C6烷基”基團(tuán)包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基和-正己基；而支鏈C1-C6烷基包括但不限于-異丙基、-仲丁基、-異丁基、-叔丁基、-異戊基和2-甲基丁基；不飽和C1-C6烷基包括但不限于-乙烯基、-丙烯基、-1-丁烯基、-2-丁烯基和-異丁基烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己基、2-己基和3-己基。C1-C6烷基基團(tuán)可以是未取代的或被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代，如上文C1-C8烷基基團(tuán)所述。如本文所用，術(shù)語“C1-C4烷基”是指具有1至4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和烴。代表性“C1-C4烷基”基團(tuán)包括但不限于-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基；而支鏈C1-C4烷基包括但不限于-異丙基、-仲丁基、-異丁基、-叔丁基；不飽和C1-C4烷基包括但不限于-乙烯基、-丙烯基、-1-丁烯基、-2-丁烯基和-異丁基烯基。C1-C4烷基基團(tuán)可以是未取代的或被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代，如上文C1-C8烷基基團(tuán)所述?！巴檠趸笔菃为?dú)鍵合到氧的烷基基團(tuán)。示例性烷氧基基團(tuán)包括但不限于甲氧基(-OCH3)和乙氧基(-OCH2CH3)。“C1-C5烷氧基”是具有1至5個(gè)碳原子的烷氧基基團(tuán)。烷氧基基團(tuán)可以是未取代的或被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代，如上文對于烷基基團(tuán)所述?！跋┗笔前⒅?、叔或環(huán)狀碳原子的C2-C18烴，其具有至少一個(gè)不飽和位點(diǎn)，即碳-碳sp2雙鍵。例子包括但不限于：乙烯或乙烯基(-CH＝CH2)、丙烯基(-CH2CH＝CH2)、環(huán)戊烯基(-C5H7)和5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)?！癈2-C8烯基”是包含2至8個(gè)正、仲、叔或環(huán)狀碳原子的烴，其具有至少一個(gè)不飽和位點(diǎn)，即碳-碳sp2雙鍵?！叭不笔前⒅?、叔或環(huán)狀碳原子的C2-C18烴，其具有至少一個(gè)不飽和位點(diǎn)，即碳-碳sp三鍵。例子包括但不限于：乙炔基(-C≡CH)和丙炔基(-CH2C≡CH)。“C2-C8炔基”是包含2至8個(gè)正、仲、叔或環(huán)狀碳原子的烴，其具有至少一個(gè)不飽和位點(diǎn)，即碳-碳sp三鍵?！皝喭榛笔侵妇哂?-18個(gè)碳原子，并且具有兩個(gè)單價(jià)基團(tuán)中心的飽和、支鏈或直鏈或環(huán)狀烴基，其通過從母體烷烴的相同或兩個(gè)不同碳原子移除兩個(gè)氫原子而產(chǎn)生。典型的亞烷基包括但不限于：亞甲基(-CH2-)1,2-乙基(-CH2CH2-)、1,3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等等?！癈1-C10亞烷基”是具有式-(CH2)1-10-的直鏈、飽和烴基。C1-C10亞烷基的例子包括亞甲基、乙烯、丙烯、丁烯、戊烯、己烯、庚烯、辛烯、壬烯和癸烯?！皝喯┗笔侵妇哂?-18個(gè)碳原子，并且具有兩個(gè)單價(jià)基團(tuán)中心的不飽和、支鏈或直鏈或環(huán)狀烴基，其通過從母體烯烴的相同或兩個(gè)不同碳原子移除兩個(gè)氫原子而產(chǎn)生。典型的亞烯基包括但不限于：1,2-乙烯(-CH＝CH-)。“亞炔基”是指具有2-18個(gè)碳原子，并且具有兩個(gè)單價(jià)基團(tuán)中心的不飽和、支鏈或直鏈或環(huán)狀烴基，其通過從母體炔烴的相同或兩個(gè)不同碳原子移除兩個(gè)氫原子而產(chǎn)生。典型的亞炔基包括但不限于：乙炔(-C≡C-)、丙炔基(-CH2C≡C-)和4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)?！胺蓟笔侵柑辑h(huán)芳族基團(tuán)。芳基基團(tuán)的例子包括但不限于苯基、萘基和蒽基。碳環(huán)芳族基團(tuán)或雜環(huán)芳族基團(tuán)可以是未取代的或被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代，所述基團(tuán)包括但不限于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每個(gè)R’獨(dú)立地選自H、-C1-C8烷基和芳基?！癈5-C20芳基”是碳環(huán)芳環(huán)中具有5至20個(gè)碳原子的芳基基團(tuán)。C5-C20芳基基團(tuán)的例子包括但不限于苯基、萘基和蒽基。C5-C20芳基基團(tuán)可以是取代的或未取代的，如上文對于芳基基團(tuán)所述?！癈5-C14芳基”是碳環(huán)芳環(huán)中具有5至14個(gè)碳原子的芳基基團(tuán)。C5-C14芳基基團(tuán)的例子包括但不限于苯基、萘基和蒽基。C5-C14芳基基團(tuán)可以是取代的或未取代的，如上文關(guān)于芳基基團(tuán)所述?！皝喎蓟笔蔷哂袃蓚€(gè)共價(jià)鍵，并且可呈鄰位、間位或?qū)ξ粯?gòu)型的芳基基團(tuán)，如以下結(jié)構(gòu)所示：其中苯基基團(tuán)可以是未取代的或被最多四個(gè)基團(tuán)取代，所述基團(tuán)包括但不限于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每個(gè)R’獨(dú)立地選自H、-C1-C8烷基和芳基?！胺纪榛笔侵高@樣的無環(huán)烷基：其中鍵合到碳原子(通常末端或sp3碳原子)的氫原子中的一個(gè)被芳基取代。典型的芳烷基基團(tuán)包括但不限于芐基、2-苯基乙-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并芐基、2-萘并苯基乙-1-基等等。芳烷基基團(tuán)包含6至20個(gè)碳原子，例如芳烷基基團(tuán)的烷基部分(包括烷基(alkanyl)、烯基或炔基基團(tuán))為1至6個(gè)碳原子，并且芳基部分為5至14個(gè)碳原子?！半s芳烷基”是指這樣的無環(huán)烷基：其中鍵合到碳原子(通常末端或sp3碳原子)的氫原子中的一者被雜芳基取代。典型的雜芳烷基基團(tuán)包括但不限于2-苯并咪唑基甲基、2-呋喃基乙基等等。雜芳烷基基團(tuán)包含6至20個(gè)碳原子，例如雜芳烷基基團(tuán)的烷基部分(包括烷基、烯基或炔基基團(tuán))為1至6個(gè)碳原子，而雜芳基部分為5至14個(gè)碳原子，并且1至3個(gè)雜原子選自N、O、P和S。雜芳烷基基團(tuán)的雜芳基部分可以是具有3至7個(gè)環(huán)成員(2至6個(gè)碳原子的單環(huán)或具有7至10個(gè)環(huán)成員(4至9個(gè)碳原子和1至3個(gè)選自N、O、P和S的雜原子)的雙環(huán)，例如：雙環(huán)[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統(tǒng)?！叭〈耐榛?、“取代的芳基”和“取代的芳烷基”分別指其中一個(gè)或多個(gè)氫原子各自獨(dú)立地被取代基替換的烷基、芳基和芳烷基。典型的取代基包括但不限于-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、＝NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、NC(＝O)R、-C(＝O)R、-C(＝O)NR2、-SO3-、-SO3H、-S(＝O)2R、-OS(＝O)2OR、-S(＝O)2NR、-S(＝O)R、-OP(＝O)(OR)2、-P(＝O)(OR)2、-PO-3、-PO3H2、-C(＝O)R、-C(＝O)X、-C(＝S)R、-CO2R、-CO2-、-C(＝S)OR、-C(＝O)SR、-C(＝S)SR、-C(＝O)NR2、-C(＝S)NR2、-C(＝NR)NR2，其中每個(gè)X獨(dú)立地為鹵素：F、Cl、Br或I；并且每個(gè)R獨(dú)立地為-H、C2-C18烷基、C6-C20芳基、C3-C14雜環(huán)、保護(hù)基團(tuán)或前藥部分。如上所述亞烷基、亞烯基和亞炔基基團(tuán)也可被相似地取代?！半s芳基”和“雜環(huán)”是指其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)原子為雜原子，例如氮、氧和硫的環(huán)系。雜環(huán)基包含3至20個(gè)碳原子和1至3個(gè)選自N、O、P和S的雜原子。雜環(huán)可以是具有3至7個(gè)環(huán)成員(2至6個(gè)碳原子和1至3個(gè)選自N、O、P和S的雜原子)的單環(huán)或具有7至10個(gè)環(huán)成員(4至9個(gè)碳原子和1至3個(gè)選自N、O、P和S的雜原子)的雙環(huán)，例如：雙環(huán)[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統(tǒng)。示例性雜環(huán)描述于例如Paquette,LeoA.,“PrinciplesofModernHeterocyclicChemistry”(W.A.Benjamin,NewYork,1968)，特別是第1、3、4、6、7和9章；“TheChemistryofHeterocyclicCompounds,AseriesofMonographs”(JohnWiley&Sons，NewYork，1950至今)，特別是第13、14、16、19和28卷；以及J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566。雜環(huán)的例子包括例如但不限于吡啶基、二氫吡啶基、四氫吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氫硫代苯基、硫氧化四氫硫代苯基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、噻萘基(thianaphthalenyl)、吲哚基、吲哚烯基、喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯酮基、吡咯啉基、四氫呋喃基、雙四氫呋喃基、四氫吡喃基、雙四氫吡喃基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、八氫異喹啉基、吖辛因基、三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻蒽基、哌喃基、異苯并呋喃基、苯并吡喃基、噸基、酚噁噻基、2H-吡咯基、異噻唑基、異噁唑基、吡嗪基、噠嗪基、吲嗪基、異吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、啡啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、酚噻嗪基、呋吖基、酚噁嗪基、異色滿基、色滿基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、吲哚啉基、異吲哚啉基、奎寧環(huán)基、嗎啉基、噁唑烷基、苯并三唑基、苯并異噁唑基、羥吲哚基、苯并噁唑啉基和靛紅?；＠绲幌抻?，碳鍵合的雜環(huán)鍵合至吡啶的2、3、4、5或6位，噠嗪的3、4、5或6位，嘧啶的2、4、5或6位，吡嗪的2、3、5或6位，呋喃、四氫呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氫吡咯的2、3、4或5位，噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位，異噁唑、吡唑或異噻唑的3、4或5位，氮丙啶的2或3位，吖丁啶的2、3或4位，喹啉的2、3、4、5、6、7或8位或異喹啉的1、3、4、5、6、7或8位。更通常地，碳鍵合的雜環(huán)包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-噠嗪基、4-噠嗪基、5-噠嗪基、6-噠嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。例如但不限于，氮鍵合的雜環(huán)鍵合至氮丙啶、吖丁啶、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啉、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑的1位，異吲哚或異吲哚啉的2位，嗎啉的4位以及咔唑或β-咔啉的9位。更通常地，氮鍵合的雜環(huán)包括1-吖啶基、1-氮雜環(huán)丁二烯基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基和1-哌啶基?！癈3-C8雜環(huán)”是指其中一至四個(gè)環(huán)碳原子被選自O(shè)、S和N的雜原子獨(dú)立地替換的芳族或非芳族C3-C8碳環(huán)。C3-C8雜環(huán)的代表性例子包括但不限于苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基、異喹啉基、吡咯基、苯硫基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、噠嗪基、異噻唑基、異噁唑基和四唑基。C3-C8雜環(huán)可以是未取代的或被最多七個(gè)基團(tuán)取代，所述基團(tuán)包括但不限于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每個(gè)R’獨(dú)立地選自H、-C1-C8烷基和芳基?！癈3-C8雜環(huán)”是指上述定義的C3-C8雜環(huán)基團(tuán)，其中一個(gè)雜環(huán)基團(tuán)的氫原子被鍵替換。C3-C8雜環(huán)可以是未取代的或被最多六個(gè)基團(tuán)取代，所述基團(tuán)包括但不限于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每個(gè)R’獨(dú)立地選自H、-C1-C8烷基和芳基?！癈3-C20雜環(huán)”是指其中一至四個(gè)環(huán)碳原子被選自O(shè)、S和N的雜原子獨(dú)立地替換的芳族或非芳族C3-C8碳環(huán)。C3-C20雜環(huán)可以是未取代的或被最多七個(gè)基團(tuán)取代，所述基團(tuán)包括但不限于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2、-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每個(gè)R’獨(dú)立地選自H、-C1-C8烷基和芳基?！癈3-C20雜環(huán)”是指上述定義的C3-C20雜環(huán)基團(tuán)，其中一個(gè)雜環(huán)基團(tuán)的氫原子被鍵替換?！疤辑h(huán)”意指具有3至7個(gè)碳原子(單環(huán))或7至12個(gè)碳原子(雙環(huán))的飽和的或不飽和的環(huán)。單環(huán)碳環(huán)具有3至6個(gè)環(huán)原子，更通常地5或6個(gè)環(huán)原子。雙環(huán)碳環(huán)具有7至12個(gè)環(huán)原子(例如排列為雙環(huán)[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統(tǒng))或9或10個(gè)環(huán)原子(排列為雙環(huán)[5,6]或[6,6]系統(tǒng))。單環(huán)碳環(huán)的例子包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、1-環(huán)戊-1-烯基、1-環(huán)戊-2-烯基、1-環(huán)戊-3-烯基、環(huán)己基、1-環(huán)己-1-烯基、1-環(huán)己-2-烯基、1-環(huán)己-3-烯基、環(huán)庚基和環(huán)辛基?！癈3-C8碳環(huán)”是3、4、5、6、7或8元飽和或不飽和非芳族碳環(huán)。代表性C3-C8碳環(huán)包括但不限于-環(huán)丙基、-環(huán)丁基、-環(huán)戊基、-環(huán)戊二烯基、-環(huán)己基、-環(huán)己烯基、-1,3-環(huán)己二烯基、-1,4-環(huán)己二烯基、-環(huán)庚基、-1,3-環(huán)庚二烯基-、-1,3,5-環(huán)庚三烯基、-環(huán)辛基和-環(huán)辛二烯基。C3-C8碳環(huán)基團(tuán)可以是未取代的或被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代，所述基團(tuán)包括但不限于-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR’、-C(O)NH2、-C(O)NHR’、-C(O)N(R’)2-NHC(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)R’、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R’)、-N(R’)2和-CN；其中每個(gè)R’獨(dú)立地選自H、-C1-C8烷基和芳基?！癈3-C8碳環(huán)”是指上述定義的C3-C8碳環(huán)基團(tuán)，其中一個(gè)碳環(huán)基團(tuán)的氫原子被鍵替換?！敖宇^”是指包含將抗體共價(jià)連接至藥物部分的共價(jià)鍵或原子鏈的化學(xué)部分。在各個(gè)實(shí)施方案中，接頭包括二價(jià)基團(tuán)，諸如烷基二基、芳基二基、雜芳基二基，諸如以下的部分：-(CR2)nO(CR2)n-、烷氧基的重復(fù)單元(例如聚氧乙烯、PEG、聚亞甲基氧基)和烷基氨基的重復(fù)單元(例如聚亞乙基氨基、JeffamineTM)；以及二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。在各個(gè)實(shí)施方案中，接頭可包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，諸如纈氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和高賴氨酸。術(shù)語“手性”是指具有鏡像配偶體的不可重疊性質(zhì)的分子，而術(shù)語“非手性”是指可與其鏡像配偶體重疊的分子。術(shù)語“立體異構(gòu)體”是指具有相同的化學(xué)組成，但就原子或基團(tuán)的空間排列而言不同的化合物。“非對映體”是指具有兩個(gè)或更多個(gè)手性中心，且分子彼此不互為鏡像的立體異構(gòu)體。非對映體具有不同的物理性質(zhì)，例如熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、光譜性質(zhì)和反應(yīng)性。非對映體的混合物可以高拆分分析程序，諸如電泳和色譜分析。“對映體”是指彼此互為不可重疊的鏡像的化合物的兩個(gè)立體異構(gòu)體。本文所用的立體化學(xué)定義和慣例一般符合S.P.Parker編,McGraw-HillDictionaryofChemicalTerms(1984)McGraw-HillBookCompany,NewYork；和Eliel,E.和Wilen,S.,StereochemistryofOrganicCompounds(1994)JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork。多種有機(jī)化合物以光學(xué)活性形式存在，即它們能夠旋轉(zhuǎn)平面偏振光的平面。在描述光學(xué)活性化合物時(shí)，前綴D和L或R和S用于表示分子關(guān)于其手性中心的絕對構(gòu)型。采用前綴d和l或(+)和(-)表示平面偏振光被化合物旋轉(zhuǎn)的符號，其中(-)或1意指該化合物是左旋的。具有前綴(+)或d的化合物是右旋的。對于給定化學(xué)結(jié)構(gòu)，這些立體異構(gòu)體是相同的，不同的是它們彼此互為鏡像。特定的立體異構(gòu)體也可稱為對映體，并且此類異構(gòu)體的混合物通常稱為對映體混合物。對映體的50:50混合物稱為外消旋的混合物或外消旋物，它們可出現(xiàn)于化學(xué)反應(yīng)或過程中無立體選擇性或立體特異性的情況下。術(shù)語“外消旋的混合物”和“外消旋物”是指兩種無光學(xué)活性的對映體物質(zhì)的等摩爾混合物。“離去基團(tuán)”是指能夠被另一個(gè)官能團(tuán)取代的官能團(tuán)。某些離去基團(tuán)是本領(lǐng)域熟知的，并且例子包括但不限于鹵化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)、甲基磺酰基(甲磺?；?、對甲苯磺酰基(甲苯磺?；?、三氟甲基磺?；?三氟甲磺酸酯)和三氟甲基磺酸酯。術(shù)語“保護(hù)基團(tuán)”是指通常用于與化合物上的其他官能團(tuán)反應(yīng)、阻斷或保護(hù)特定官能團(tuán)的取代基。例如，“氨基保護(hù)基團(tuán)”是連接至氨基基團(tuán)、阻斷或保護(hù)化合物中的氨基官能團(tuán)的取代基。合適的氨基保護(hù)基團(tuán)包括但不限于乙?；⑷阴；?、叔丁氧羰基(BOC)、芐氧羰基(CBZ)和9-芴基亞甲基氧基羰基(Fmoc)。對于保護(hù)基團(tuán)及其用途的一般說明，參見T.W.Greene,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,JohnWiley&Sons,NewYork,1991或后續(xù)版本。II.組合物和方法在一個(gè)方面，本發(fā)明部分基于結(jié)合至GPC3的抗體和包含此類抗體的免疫偶聯(lián)物。本發(fā)明的抗體和免疫偶聯(lián)物用于例如GPC3陽性癌癥的診斷或治療。A.示例性抗GPC3抗體本文提供了結(jié)合至GPC3的分離的抗體。示例性天然存在的具有信號序列(氨基酸1-24)的人GPC3前體蛋白序列提供于SEQIDNO:1，并且對應(yīng)的成熟GPC3蛋白序列對應(yīng)于SEQIDNO:1的氨基酸25-580。在某些實(shí)施方案中，抗GPC3抗體具有以下特性中的至少一種或多種的任何組合：a)結(jié)合至重組人GPC3；b)結(jié)合至重組食蟹猴GPC3；c)結(jié)合至HepG2細(xì)胞表面上的內(nèi)源性GPC3；d)結(jié)合至293細(xì)胞表面上表達(dá)的食蟹猴GPC3；e)結(jié)合至癌細(xì)胞表面上的內(nèi)源性GPC3；f)結(jié)合至肝細(xì)胞癌細(xì)胞表面上的內(nèi)源性GPC3；g)結(jié)合至選自HepG2、Hep3B、Huh7和JHH-7的細(xì)胞系的細(xì)胞表面上的內(nèi)源性GPC3；h)結(jié)合至人GPC3的氨基酸25至137內(nèi)的表位；i)結(jié)合至跨越人GPC3的氨基酸R358/S359處的弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)的表位；j)結(jié)合至全長成熟人GPC3(例如，SEQIDNO:1的氨基酸25至560或氨基酸25至580)，但不結(jié)合至人GPC3的N-末端片段(SEQIDNO:1的氨基酸25至358)或不結(jié)合至人GPC3的C-末端片段(SEQIDNO:1的氨基酸359至560(不含GPI連接)或氨基酸359至580(含GPI連接))k)結(jié)合至人GPC3的氨基酸420至470內(nèi)的表位；l)結(jié)合至人GPC3的氨基酸470至509內(nèi)的表位；m)與抗體7H1競爭結(jié)合人GPC3；n)與抗體4G7競爭結(jié)合人GPC3；o)與抗體15G1競爭結(jié)合人GPC3；和/或p)與抗體4A11競爭結(jié)合人GPC3。在一些實(shí)施方案中，抗體的特性如本文所述，例如下文實(shí)例測定。在一些實(shí)施方案中，表位結(jié)合使用例如如實(shí)例2所述的缺失(截短)分析測定。在一些實(shí)施方案中，表位結(jié)合通過例如如實(shí)例2所述的FACS，或通過合適的結(jié)合分析諸如ELISA或表面等離振子共振分析測定。作為非限制性例子，在一些實(shí)施方案中，全長GPC3或GPC3片段在細(xì)胞(諸如293細(xì)胞)的表面上表達(dá)，并且通過FACS檢測結(jié)合至細(xì)胞表面上的GPC3的抗體?？贵w7H1和其他實(shí)施方案本文提供的某些實(shí)施方案部分基于抗體7H1的開發(fā)，該抗體結(jié)合至人GPC3的氨基酸25至137內(nèi)的表位。在一些實(shí)施方案中，本文提供的抗體結(jié)合至人GPC3的氨基酸25至137內(nèi)的表位。在一些此類實(shí)施方案中，本文提供的抗體包含抗體7H1的一個(gè)或多個(gè)HVR序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)HVR的抗GPC3抗體，所述HVR選自(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VHHVR序列的抗體，所述VHHVR選自(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L3和含有SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-H2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含(a)含有SEQIDNO:4的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VLHVR序列的抗體，所述VLHVR選自(a)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含(a)含有SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的抗體包含(a)含有至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VHHVR序列的VH結(jié)構(gòu)域，所述VHHVR選自(i)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含選自SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VLHVR序列的VL結(jié)構(gòu)域，所述VLHVR選自(i)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供這樣的抗體，其包含(a)含有SEQIDNO:4的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L3。在任何上述實(shí)施方案中，抗GPC3抗體是人源化的。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗GPC3抗體包含如任何上述實(shí)施方案所述的HVR，還包含人受體框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有序列框架。在某些實(shí)施方案中，該人受體框架是人VLκI共有序列(VLKI)框架和/或VH框架VH1。在某些實(shí)施方案中，該人受體框架是人VLκI共有序列(VLKI)框架和/或包含以下突變中的任一者的VH框架VH1。在另一個(gè)方面，抗GPC3抗體包含與SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)序列。在某些實(shí)施方案中，與SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相對于參考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列的抗GPC3抗體保持結(jié)合至GPC3的能力。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:2中取代、插入和/或缺失總共1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:2中取代、插入和/或缺失總共1至5個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，取代、插入或缺失出現(xiàn)在HVR外部的區(qū)域(即，F(xiàn)R)。任選地，抗GPC3抗體包含SEQIDNO:2的VH序列，包括該序列的翻譯后修飾。在具體實(shí)施方案中，VH包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)HVR，所述HVR選自：(a)包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個(gè)方面，提供了抗GPC3抗體，其中該抗體包含與SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)。在某些實(shí)施方案中，與SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相對于參考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列的抗GPC3抗體保持結(jié)合至GPC3的能力。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:3中取代、插入和/或缺失總共1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:3中取代、插入和/或缺失總共1至5個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，取代、插入或缺失出現(xiàn)在HVR外部的區(qū)域(即，在FR中)。任選地，抗GPC3抗體包含SEQIDNO:3的VL序列，包括該序列的翻譯后修飾。在具體實(shí)施方案中，該VL包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)HVR，所述HVR選自(a)包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，提供了抗GPC3抗體，其中該抗體包含如上文提供的任何實(shí)施方案所述的VH，和如上文提供的任何實(shí)施方案所述的VL。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含分別SEQIDNO:2和SEQIDNO:3中的VH和VL序列，包括那些序列的翻譯后修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗GPC3抗體包括人源化形式的抗體，所述抗體包含分別SEQIDNO:2和SEQIDNO:3中的VH和VL序列。在另一個(gè)方面，本文提供了結(jié)合至與本文提供的抗GPC3抗體相同的表位的抗體。例如，在某些實(shí)施方案中，提供了這樣的抗體，其結(jié)合至與包含分別SEQIDNO:2的VH序列和SEQIDNO:3的VL序列的抗GPC3抗體相同的表位。本文提供了包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含如圖4B所述根據(jù)Kabat編號的HVR1-LC、HVR2-LC和HVR3-LC序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含如圖4A所述根據(jù)Kabat編號的HVR1-HC、HVR2-HC和HVR3-HC序列。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有HVR1-LC、HVR2-LC和/或HVR3-LC序列，和如圖4B所述的FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC和/或FR4-LC序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有HVR1-HC、HVR2-HC和/或HVR3-HC序列，和如圖4A所述的FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC和/或FR4-HC序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，根據(jù)任何上述實(shí)施方案的抗GPC3抗體是單克隆抗體，包括人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗GPC3抗體是抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙抗體或F(ab’)2片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體為基本上全長抗體，例如IgG1抗體、IgG2a抗體或本文定義的其他抗體種類或同種型。在另一個(gè)方面，根據(jù)任何上述實(shí)施方案的抗GPC3抗體可包括如下文所述的任何單獨(dú)或組合特征。抗體4A11和其他實(shí)施方案本文提供的某些實(shí)施方案部分基于抗體4A11的開發(fā)，該抗體結(jié)合至人GPC3的氨基酸470至509內(nèi)的表位。在一些實(shí)施方案中，本文提供的抗體結(jié)合至人GPC3的氨基酸470至509內(nèi)的表位。在一些此類實(shí)施方案中，本文提供的抗體包含抗體4A11的一個(gè)或多個(gè)HVR序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)HVR的抗GPC3抗體，所述HVR選自(a)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VHHVR序列的抗體，所述VHHVR選自(a)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3和含有SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含(a)含有SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VLHVR序列的抗體，所述VLHVR選自(a)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含(a)含有SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的抗體包含(a)含有至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VHHVR序列的VH結(jié)構(gòu)域，所述VHHVR選自(i)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含選自SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)含有至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VLHVR序列的VL結(jié)構(gòu)域，所述VLHVR選自(i)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供這樣的抗體，其包含(a)含有SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。在任何上述實(shí)施方案中，抗GPC3抗體是人源化的。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗GPC3抗體包含如任何上述實(shí)施方案所述的HVR，并且還包含人受體框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有序列框架。在某些實(shí)施方案中，該人受體框架是人VLκI共有序列(VLKI)框架和/或VH框架VH1。在某些實(shí)施方案中，該人受體框架是人VLκI共有序列(VLKI)框架和/或包含以下突變中的任一者的VH框架VH1。在另一個(gè)方面，抗GPC3抗體包含與SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)序列。在某些實(shí)施方案中，與SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相對于參考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列的抗GPC3抗體保持結(jié)合至GPC3的能力。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:10中取代、插入和/或缺失總共1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:10中取代、插入和/或缺失總共1至5個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，取代、插入或缺失出現(xiàn)在HVR外部的區(qū)域(即，F(xiàn)R)。任選地，抗GPC3抗體包含SEQIDNO:10的VH序列，包括該序列的翻譯后修飾。在具體實(shí)施方案中，VH包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)HVR，所述HVR選自：(a)包含SEQIDNO:12的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQIDNO:13的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQIDNO:14的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個(gè)方面，提供了抗GPC3抗體，其中該抗體包含與SEQIDNO:11的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)。在某些實(shí)施方案中，與SEQIDNO:11的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相對于參考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列的抗GPC3抗體保持結(jié)合至GPC3的能力。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:11中取代、插入和/或缺失總共1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:11中取代、插入和/或缺失總共1至5個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，取代、插入或缺失出現(xiàn)在HVR外部的區(qū)域(即，F(xiàn)R)。任選地，抗GPC3抗體包含SEQIDNO:11的VL序列，包括該序列的翻譯后修飾。在具體實(shí)施方案中，該VL包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)HVR，所述HVR選自(a)包含SEQIDNO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:17的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，提供了抗GPC3抗體，其中該抗體包含如上文提供的任何實(shí)施方案所述的VH，和如上文提供的任何實(shí)施方案所述的VL。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含分別SEQIDNO:10和SEQIDNO:11中的VH和VL序列，包括那些序列的翻譯后修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗GPC3抗體包括人源化形式的抗體，所述抗體包含分別SEQIDNO:10和SEQIDNO:11中的VH和VL序列。在另一個(gè)方面，本文提供了結(jié)合至與本文提供的抗GPC3抗體相同的表位的抗體。例如，在某些實(shí)施方案中，提供了這樣的抗體，其結(jié)合至與包含分別SEQIDNO:10的VH序列和SEQIDNO:11的VL序列的抗GPC3抗體相同的表位。本文提供了包括輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含如圖4B所述根據(jù)Kabat編號的HVR1-LC、HVR2-LC和HVR3-LC序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含如圖4A所述根據(jù)Kabat編號的HVR1-HC、HVR2-HC和HVR3-HC序列。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有HVR1-LC、HVR2-LC和/或HVR3-LC序列，和如圖4B所述的FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC和/或FR4-LC序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有HVR1-HC、HVR2-HC和/或HVR3-HC序列，和如圖4A所述的FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC和/或FR4-HC序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，根據(jù)任何上述實(shí)施方案的抗GPC3抗體是單克隆抗體，包括人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗GPC3抗體是抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙抗體或F(ab’)2片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體為基本上全長抗體，例如IgG1抗體、IgG2a抗體或本文定義的其他抗體種類或同種型。在另一個(gè)方面，根據(jù)任何上述實(shí)施方案的抗GPC3抗體可包括下文所述的任何單獨(dú)或組合特征?？贵w15G1和其他實(shí)施方案本文提供的某些實(shí)施方案部分基于抗體15G1的開發(fā)，該抗體結(jié)合至人GPC3的氨基酸420至470內(nèi)的表位。在一些實(shí)施方案中，本文提供的抗體結(jié)合至人GPC3的氨基酸420至470內(nèi)的表位。在一些此類實(shí)施方案中，本文提供的抗體包含抗體15G1的一個(gè)或多個(gè)HVR序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)HVR的抗GPC3抗體，所述HVR選自(a)包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VHHVR序列的抗體，所述VHHVR選自(a)包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-H3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-L3和含有SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-H2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含(a)含有SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VLHVR序列的抗體，所述VLHVR選自(a)包含SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含(a)含有SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的抗體包含(a)含有至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VHHVR序列的VH結(jié)構(gòu)域，所述VHHVR選自(i)包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含選自SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)含有至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VLHVR序列的VL結(jié)構(gòu)域，所述VLHVR選自(i)包含SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供這樣的抗體，其包含(a)含有SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-L3。在任何上述實(shí)施方案中，抗GPC3抗體是人源化的。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗GPC3抗體包含如任何上述實(shí)施方案所述的HVR，還包含人受體框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有序列框架。在某些實(shí)施方案中，該人受體框架是人VLκI共有序列(VLKI)框架和/或VH框架VH1。在某些實(shí)施方案中，該人受體框架是人VLκI共有序列(VLKI)框架和/或包含以下突變中的任一者的VH框架VH1。在另一個(gè)方面，抗GPC3抗體包含與SEQIDNO:26的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)序列。在某些實(shí)施方案中，與SEQIDNO:26的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相對于參考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列的抗GPC3抗體保持結(jié)合至GPC3的能力。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:26中取代、插入和/或缺失總共1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:26中取代、插入和/或缺失總共1至5個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，取代、插入或缺失出現(xiàn)在HVR外部的區(qū)域(即，F(xiàn)R)。任選地，抗GPC3抗體包含SEQIDNO:26的VH序列，包括該序列的翻譯后修飾。在具體實(shí)施方案中，VH包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)HVR，所述HVR選自：(a)包含SEQIDNO:28的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQIDNO:29的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQIDNO:30的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個(gè)方面，提供了抗GPC3抗體，其中該抗體包含與SEQIDNO:27的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)。在某些實(shí)施方案中，與SEQIDNO:27的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相對于參考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列的抗GPC3抗體保持結(jié)合至GPC3的能力。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:27中取代、插入和/或缺失總共1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:27中取代、插入和/或缺失總共1至5個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，取代、插入或缺失出現(xiàn)在HVR外部的區(qū)域(即，F(xiàn)R)。任選地，抗GPC3抗體包含SEQIDNO:27的VL序列，包括該序列的翻譯后修飾。在具體實(shí)施方案中，該VL包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)HVR，所述HVR選自(a)包含SEQIDNO:31的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:32的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:33的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，提供了抗GPC3抗體，其中該抗體包含如上文提供的任何實(shí)施方案所述的VH，和如上文提供的任何實(shí)施方案所述的VL。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含分別SEQIDNO:26和SEQIDNO:27中的VH和VL序列，包括那些序列的翻譯后修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗GPC3抗體包括包含分別SEQIDNO:26和SEQIDNO:27中的VH和VL序列的抗體的人源化形式。在另一個(gè)方面，本文提供了結(jié)合至與本文提供的抗GPC3抗體相同的表位的抗體。例如，在某些實(shí)施方案中，提供了這樣的抗體，其結(jié)合至與包含分別SEQIDNO:26的VH序列和SEQIDNO:27的VL序列的抗GPC3抗體相同的表位。本文提供了包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含如圖4B所述根據(jù)Kabat編號的HVR1-LC、HVR2-LC和HVR3-LC序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含如圖4A所述根據(jù)Kabat編號的HVR1-HC、HVR2-HC和HVR3-HC序列。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有HVR1-LC、HVR2-LC和/或HVR3-LC序列，和如圖4B所述的FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC和/或FR4-LC序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有HVR1-HC、HVR2-HC和/或HVR3-HC序列，和如圖4A所述的FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC和/或FR4-HC序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，根據(jù)任何上述實(shí)施方案的抗GPC3抗體是單克隆抗體，包括人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗GPC3抗體是抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙抗體或F(ab’)2片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體為基本上全長抗體，例如IgG1抗體、IgG2a抗體或如本文定義的其他抗體種類或同種型。在另一個(gè)方面，根據(jù)任何上述實(shí)施方案的抗GPC3抗體可包括下文所述的任何單獨(dú)或組合特征?？贵w4G7和其他實(shí)施方案本文提供的某些實(shí)施方案部分基于抗體4G7的開發(fā)，該抗體結(jié)合至全長人GPC3，但不結(jié)合至人GPC3的N-末端片段或C-末端片段，暗示其結(jié)合至跨越人GPC3的氨基酸R358/S359處的弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)的表位。在一些實(shí)施方案中，本文提供的抗體結(jié)合至全長成熟人GPC3，但不結(jié)合至人GPC3的N-末端片段(SEQIDNO:1的氨基酸25至358)，并且不結(jié)合至人GPC3的C-末端片段(SEQIDNO:1的氨基酸359至560(不含GPI連接)或氨基酸359至580(含GPI連接))。在一些實(shí)施方案中，本文提供的抗體結(jié)合至跨越人GPC3的氨基酸R358/S359處的弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)的表位。在一些此類實(shí)施方案中，本文提供的抗體包含抗體4G7的一個(gè)或多個(gè)HVR序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)HVR的抗GPC3抗體，所述HVR選自(a)包含SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VHHVR序列的抗體，所述VHHVR選自(a)包含SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含含有SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3和含有SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含(a)含有SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VLHVR序列的抗體，所述VLHVR選自(a)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含(a)含有SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的抗體包含(a)含有至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VHHVR序列的VH結(jié)構(gòu)域，所述VHHVR選自(i)包含SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含選自SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)含有至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)VLHVR序列的VL結(jié)構(gòu)域，所述VLHVR選自(i)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供這樣的抗體，其包含(a)含有SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2；(c)含有SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3；(d)含有SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1；(e)含有SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)含有SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在任何上述實(shí)施方案中，抗GPC3抗體是人源化的。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗GPC3抗體包含如任何上述實(shí)施方案所述的HVR，并且還包含人受體框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有序列框架。在某些實(shí)施方案中，該人受體框架是人VLκI共有序列(VLKI)框架和/或VH框架VH1。在某些實(shí)施方案中，該人受體框架是人VLκI共有序列(VLKI)框架和/或包含以下突變中的任一者的VH框架VH1。在另一個(gè)方面，抗GPC3抗體包含與SEQIDNO:18的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)序列。在某些實(shí)施方案中，與SEQIDNO:18的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列包含相對于參考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列的抗GPC3抗體保持結(jié)合至GPC3的能力。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:18中取代、插入和/或缺失總共1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:18中取代、插入和/或缺失總共1至5個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，取代、插入或缺失出現(xiàn)在HVR外部的區(qū)域(即，F(xiàn)R)。任選地，抗GPC3抗體包含SEQIDNO:18的VH序列，包括該序列的翻譯后修飾。在具體實(shí)施方案中，VH包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)HVR，所述HVR選自：(a)包含SEQIDNO:20的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQIDNO:21的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個(gè)方面，提供了抗GPC3抗體，其中該抗體包含與SEQIDNO:19的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)。在某些實(shí)施方案中，與SEQIDNO:19的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列包含相對于參考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列的抗GPC3抗體保持結(jié)合至GPC3的能力。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:19中取代、插入和/或缺失總共1至10個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，在SEQIDNO:19中取代、插入和/或缺失總共1至5個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，取代、插入或缺失出現(xiàn)在HVR外部的區(qū)域(即，F(xiàn)R)。任選地，抗GPC3抗體包含SEQIDNO:19的VL序列，包括該序列的翻譯后修飾。在具體實(shí)施方案中，該VL包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)HVR，所述HVR選自(a)包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQIDNO:25的氨基酸序列的HVR-L3。在另一個(gè)方面，提供了抗GPC3抗體，其中該抗體包含如上文提供的任何實(shí)施方案所述的VH，和如上文提供的任何實(shí)施方案所述的VL。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體包含分別SEQIDNO:18和SEQIDNO:19中的VH和VL序列，包括那些序列的翻譯后修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗GPC3抗體包括人源化形式的抗體，所述抗體包含分別SEQIDNO:18和SEQIDNO:19中的VH和VL序列。在另一個(gè)方面，本文提供了結(jié)合至與本文提供的抗GPC3抗體相同的表位的抗體。例如，在某些實(shí)施方案中，提供了這樣的抗體，其結(jié)合至與包含分別SEQIDNO:18的VH序列和SEQIDNO:19的VL序列的抗GPC3抗體相同的表位。本文提供了包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體，所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域如圖4B所述包含根據(jù)Kabat編號的HVR1-LC、HVR2-LC和HVR3-LC序列，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含如圖4A所述根據(jù)Kabat編號的HVR1-HC、HVR2-HC和HVR3-HC序列。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有HVR1-LC、HVR2-LC和/或HVR3-LC序列，和如圖4B所述的FR1-LC、FR2-LC、FR3-LC和/或FR4-LC序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，該抗體包含含有HVR1-HC、HVR2-HC和/或HVR3-HC序列，和如圖4A所述的FR1-HC、FR2-HC、FR3-HC和/或FR4-HC序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，根據(jù)任何上述實(shí)施方案的抗GPC3抗體是單克隆抗體，包括人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗GPC3抗體是抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙抗體或F(ab’)2片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體為基本上全長抗體，例如IgG1抗體、IgG2a抗體或本文定義的其他抗體種類或同種型。在另一個(gè)方面，根據(jù)任何上述實(shí)施方案的抗GPC3抗體可包括下文所述的任何單獨(dú)或組合特征。1.抗體親和力在某些實(shí)施方案中，本文提供的抗體具有≤1μM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤5nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM的解離常數(shù)(Kd)，并且任選地≥10-13M。(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在一個(gè)實(shí)施方案中，Kd通過放射性標(biāo)記抗原結(jié)合分析(RIA)測定，該分析使用所關(guān)注抗體的Fab型及其抗原進(jìn)行，如以下分析所述。Fab對抗原的溶液結(jié)合親和力通過如下方法測定：在存在一個(gè)滴定系列的未標(biāo)記的抗原的情況下，用最小濃度的(125I)標(biāo)記抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗體涂覆的平板捕獲結(jié)合的抗原(參見例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。為建立分析條件，用5μg/ml于50mM碳酸鈉(pH9.6)中的捕獲抗Fab抗體(CappelLabs)涂布多孔板(ThermoScientific)過夜，隨后用2％(w/v)于PBS中的牛血清白蛋白在室溫(大約23℃)下阻斷二至五小時(shí)。在非吸附板(Nunc#269620)中，將100pM或26pM[125I]-抗原與系列稀釋所關(guān)注的Fab混合(例如，與抗VEGF抗體Fab-12的評估一致，Presta等,CancerRes.57:4593-4599(1997))。然后溫育所關(guān)注的Fab過夜；然而，該溫育可繼續(xù)更長的時(shí)間段(例如，約65小時(shí))以確保達(dá)到平衡。然后，將混合物轉(zhuǎn)移到捕獲板，在室溫下溫育(例如，一小時(shí))。然后移除溶液，用0.1％于PBS中的聚山梨酸酯20洗滌板八次。當(dāng)板干燥時(shí)，加入150μl/孔閃爍體(MICROSCINT-20TM；Packard)，將板于TOPCOUNTTMγ計(jì)數(shù)器(Packard)上計(jì)數(shù)十分鐘。選擇得到小于或等于最大結(jié)合的20％每個(gè)Fab濃度用于競爭性結(jié)合分析。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，使用-2000或-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)通過表面等離振子共振分析測定Kd，該測定以約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)使用固定化抗原CM5芯片在25℃下進(jìn)行。簡而言之，根據(jù)供應(yīng)商的說明使用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基葡聚糖生物傳感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。用10mM乙酸鈉pH4.8將抗原稀釋為5μg/ml(約0.2μM)，然后以5μl/分鐘的流速注射，以實(shí)現(xiàn)大約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)的結(jié)合蛋白質(zhì)。在抗原注射后，注射1M乙醇胺以阻斷未反應(yīng)的基團(tuán)。對于動力學(xué)測定，將兩倍系列稀釋的Fab(0.78nM至500nM)與0.05％聚山梨酸酯20(TWEEN-20TM)表面活性劑(PBST)在25℃下以大約25μl/min的流速一起注入PBS。締合速率(kon)和解離速率(koff)使用簡單一對一Langmuir結(jié)合模型(評估軟件3.2版)，通過同時(shí)擬合締合和解離傳感圖來計(jì)算。平衡解離常數(shù)(Kd)以koff/kon的比率計(jì)算。參見例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果上述表面等離振子共振分析的結(jié)合速率超過106M-1s-1，則可使用熒光淬滅技術(shù)測定結(jié)合速率，該技術(shù)在抗原濃度增加的情況下，在25℃下測定20nM于PBS(pH7.2)中的抗抗原抗體(Fab形式)的熒光發(fā)射強(qiáng)度的增加或減少(激發(fā)＝295nm；發(fā)射＝340nm，16nm帶通)，如在分光儀，諸如配備截流的分光光度計(jì)(AvivInstruments)或具有攪拌比色皿的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度計(jì)(ThermoSpectronic)中所測定。2.抗體片段在某些實(shí)施方案中，本文提供的抗體是抗體片段。抗體片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段，以及下文所述的其他片段。對于某些抗體片段的評述，參見Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。對于scFv片段的評述，參見例如Pluckthün,ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore編,(Springer-Verlag,NewYork),第269-315頁(1994)；還可參見WO93/16185；以及美國專利No.5,571,894和5,587,458。關(guān)于包含挽救受體(salvagereceptor)結(jié)合表位殘基并且體內(nèi)半衰期增加的Fab和F(ab’)2片段的討論，參見美國專利No.5,869,046。雙抗體是具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)可以是二價(jià)的或雙特異性的。參見例如EP404,097；WO1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗體和四抗體也在Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)中有所描述。單結(jié)構(gòu)域抗體是包含抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或一部分或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的全部或一部分的抗體片段。在某些實(shí)施方案中，單結(jié)構(gòu)域抗體是人單結(jié)構(gòu)域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見例如美國專利No.6,248,516B1)?？贵w片段可通過各種技術(shù)，包括但不限于完整抗體的蛋白水解消化，以及通過重組宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)產(chǎn)生，如本文所述。3.嵌合和人源化抗體在某些實(shí)施方案中，本文提供的抗體是嵌合抗體。某些嵌合抗體描述在例如美國專利No.4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一個(gè)例子中，嵌合抗體包含非人可變區(qū)(例如，來源于小鼠、大鼠、倉鼠、兔，或非人靈長類諸如猴子的可變區(qū))和人恒定區(qū)。在另一個(gè)例子中，嵌合抗體是“類型轉(zhuǎn)換”抗體，其中所述類型或子類型從親本抗體的類型改變。嵌合抗體包括它們的抗原結(jié)合片段。在某些實(shí)施方案中，嵌合抗體是人源化抗體。通常，使非人抗體人源化以減少對人的免疫原性，同時(shí)保持親本非人抗體的特異性和親和力。一般來講，人源化抗體包含一個(gè)或多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中HVR例如CDR(或它們的部分)來源于非人抗體，F(xiàn)R(或它們的部分)來源于人抗體序列。人源化抗體任選地還包含人恒定區(qū)的至少一部分。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體中的一些FR殘基被來自非人抗體(例如，HVR殘基所來源的抗體)的對應(yīng)殘基取代，例如以恢復(fù)或改善抗體特異性或親和力。人源化抗體及其制備方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中評述，并且在例如Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美國專利No.5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等,Methods36:43-60(2005)(描述“FR改組”)；以及Osbourn等,Methods36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改組的“定向選擇”方法)中進(jìn)一步描述?？捎糜谌嗽椿娜丝蚣軈^(qū)包括但不限于：使用“最佳擬合”方法選擇的框架區(qū)(參見例如Sims等J.Immunol.151:2296(1993))；來源于輕鏈或重鏈可變區(qū)的特定亞組的人抗體的共有序列的框架區(qū)(參見例如Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(體細(xì)胞突變)框架區(qū)或人種系框架區(qū)(參見例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及來源于FR文庫篩選的框架區(qū)(參見例如Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。4.人抗體在某些實(shí)施方案中，本文提供的抗體是人抗體。人抗體可使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)制備。人抗體通常如vanDijk和vandeWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中所述。人抗體可通過將免疫原施用于轉(zhuǎn)基因動物來制備，該轉(zhuǎn)基因動物被修飾為響應(yīng)于抗原激發(fā)而產(chǎn)生完整人抗體或具有人可變區(qū)的完整抗體。此類動物通常包含人免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其代替了內(nèi)源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色體外或隨機(jī)整合進(jìn)動物的染色體。在此類轉(zhuǎn)基因小鼠中，內(nèi)源性免疫球蛋白基因座通常是失活的。對于從轉(zhuǎn)基因動物獲取人抗體的方法的評述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。還可參見例如描述XENOMOUSETM技術(shù)的美國專利No.6,075,181和6,150,584；描述技術(shù)的美國專利No.5,770,429；描述K-M技術(shù)的美國專利No.7,041,870以及描述技術(shù)的美國專利申請公開No.US2007/0061900。來自由此類動物產(chǎn)生的完整抗體的人可變區(qū)還可例如通過與不同的人恒定區(qū)組合來修飾。人抗體還可通過基于雜交瘤的方法制備。用于產(chǎn)生人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤(heteromyeloma)細(xì)胞系已有所描述(參見例如KozborJ.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,第51-63頁(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)；和Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))。通過人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備的人抗體還在Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中有所描述。另外的方法包括例如美國專利No.7,189,826(描述從雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生單克隆人IgM抗體)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人雜交瘤)中描述的那些方法。人雜交瘤技術(shù)(三源雜交瘤(Trioma)技術(shù))還在Vollmers和Brandlein,HistologyandHistopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)中有所描述。人抗體也可通過分離從人來源噬菌體展示文庫選擇的Fv克隆可變結(jié)構(gòu)域序列制備。然后，此類可變結(jié)構(gòu)域序列可與所需的人恒定結(jié)構(gòu)域組合。從抗體文庫選擇人抗體的技術(shù)在下文進(jìn)行描述。5.文庫來源的抗體本發(fā)明的抗體可通過針對具有所需的一種或多種活性的抗體篩選組合文庫來分離。例如，用于制備噬菌體展示文庫，以及篩選此類文庫中具有所需結(jié)合特性的抗體的多種方法是本領(lǐng)域已知的。此類方法在例如Hoogenboom等,MethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等編,HumanPress,Totowa,NJ,2001)中評述，并且在例如McCafferty等,Nature348:552-554；Clackson等,Nature352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,MethodsinMolecularBiology248:161-175(Lo編,HumanPress,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；和Lee等,J.Immunol.Methods284(1-2):119-132(2004)中進(jìn)一步描述。在某些噬菌體展示方法中，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)單獨(dú)克隆VH和VL基因庫，并隨機(jī)重組于噬菌體文庫中，然后可從該文庫篩選抗原結(jié)合噬菌體，如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述。噬菌體通常展示抗體片段，所述抗體片段為單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段。來自免疫來源的文庫提供了對免疫原的高親和力抗體，而不需要構(gòu)建雜交瘤?；蛘撸煽寺√烊粠?例如，從人克隆)，從而在無需任何免疫的情況下，得到一系列非自體以及自體抗原的單獨(dú)來源抗體，如Griffiths等,EMBOJ,12:725-734(1993)中所述。最終，天然文庫也可使用PCR引物通過從干細(xì)胞克隆未重排的V基因片段合成制備，所述PCR引物包含編碼高變CDR3區(qū)并且實(shí)現(xiàn)體外重排的隨機(jī)序列，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)中所述。描述人抗體噬菌體文庫的專利公開包括例如：美國專利No.5,750,373以及美國專利公開No.2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。從人抗體文庫分離的抗體或抗體片段在本文中被認(rèn)為是人抗體或人抗體片段。6.多特異性抗體在某些實(shí)施方案中，本文提供的抗體是多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體是具有對至少兩個(gè)不同位點(diǎn)的結(jié)合特異性的單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，一種結(jié)合特異性是對GPC3，另一種是對任何其他抗原。在某些實(shí)施方案中，一種結(jié)合特異性是對GPC3，另一種是對CD3。參見例如美國專利No.5,821,337。在某些實(shí)施方案中，雙特異性抗體可結(jié)合至GPC3的兩個(gè)不同表位。雙特異性抗體也可用于將細(xì)胞毒性劑定位至表達(dá)GPC3的細(xì)胞。雙特異性抗體可以全長抗體或抗體片段制備。用于制備多特異性抗體的技術(shù)包括但不限于：具有不同特異性的兩個(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表達(dá)(參見Milstein和Cuello,Nature305:537(1983)、WO93/08829和Traunecker等,EMBOJ.10:3655(1991))，和“結(jié)-入-穴”(knob-in-hole)工程化(參見，例如美國專利No.5,731,168)。多特異性抗體也可通過以下方法制備：工程化靜電導(dǎo)向效應(yīng)以制備抗體Fc-異二聚體分子(WO2009/089004A1)；使兩個(gè)或更多個(gè)抗體或片段交聯(lián)(參見例如美國專利No.4,676,980和Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體(參見例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))：使用“雙抗體”技術(shù)制備雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及制備三特異性抗體，如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所述。本文還包括具有三個(gè)或更多個(gè)功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的工程化抗體，包括“八臂(Octopus)抗體”(參見例如US2006/0025576A1)。本文的抗體或片段還包括包含結(jié)合至GPC3以及另一個(gè)不同的抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的“雙作用FAb”或“DAF”(參見例如US2008/0069820)。7.抗體變體在某些實(shí)施方案中，設(shè)想了本文提供的抗體的氨基酸序列變體。例如，期望改善抗體的結(jié)合親和力和/或其他生物性質(zhì)。抗體的氨基酸序列變體可通過將適當(dāng)?shù)男揎椧刖幋a抗體的核苷酸序列，或通過肽合成制備。此類修飾包括例如抗體的氨基酸序列內(nèi)殘基的缺失和/或插入和/或取代?？蓪θ笔?、插入和取代進(jìn)行任何組合，以獲得最終構(gòu)建體，前提條件是最終構(gòu)建體具有所需特性，例如抗原結(jié)合。a)取代、插入和缺失變體在某些實(shí)施方案中，提供了具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的抗體變體。所關(guān)注的取代誘變位點(diǎn)包括HVR和FR。保守取代如表1的標(biāo)題“優(yōu)選的取代”下所示。表1的標(biāo)題“示例性取代”下提供了更多的基本變化，并且如下文結(jié)合氨基酸側(cè)鏈類型進(jìn)一步描述。氨基酸取代可引入所關(guān)注的抗體，并篩選該產(chǎn)物的所需活性，例如保持/改善的抗原結(jié)合、減少的免疫原性或改善的ADCC或CDC。表1氨基酸可根據(jù)常見側(cè)鏈的性質(zhì)分組：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)堿性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。非保守取代需要將這些類型之一的成員交換為另一種類型。一種類型的取代變體涉及取代親本抗體的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基(例如人源化或人抗體)。一般來講，所得的被選擇用于進(jìn)一步研究的變體相對于親本抗體具有某些生物學(xué)性質(zhì)的修改(例如，改善)(例如，親和力增加、免疫原性減少)和/或基本上保持親本抗體的某些生物學(xué)性質(zhì)。示例性取代變體是親和力成熟抗體，它可以例如使用基于噬菌體展示的親和力成熟技術(shù)，諸如本文所述的那些技術(shù)便利地生成。簡而言之，使一個(gè)或多個(gè)HVR殘基突變，在噬菌體上展示變體抗體，并篩選特定的生物活性(例如，結(jié)合親和力)?？稍贖VR中作出改變(例如，取代)，例如以改善抗體親和力。此類改變可在HVR“熱點(diǎn)”，即在體細(xì)胞成熟過程期間經(jīng)歷高頻突變的密碼子編碼的殘基(參見例如Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)中作出，并測試所得的變體VH或VL的結(jié)合親和力。通過從次級文庫構(gòu)建和再選擇進(jìn)行親和力成熟在例如Hoogenboom等,MethodsinMolecularBiology178:1-37(O’Brien等編,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中有所描述。在親和力成熟的一些實(shí)施方案中，通過多種方法(例如，易錯(cuò)PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變)中的任何一種將多樣性引入針對成熟選擇的可變基因。然后創(chuàng)建次級文庫。然后篩選文庫，以鑒定具有所需親和力的任何抗體變體。引入多樣性的另一種方法涉及HVR定向方法，其中隨機(jī)化多個(gè)HVR殘基(例如，每次4-6個(gè)殘基)?？梢岳缡褂帽彼釖呙枵T變或建模特異性地鑒定涉及抗原結(jié)合的HVR殘基。具體地講，通常靶向CDR-H3和CDR-L3。在某些實(shí)施方案中，取代、插入或缺失可出現(xiàn)在一個(gè)或多個(gè)HVR內(nèi)，只要此類改變不會基本上降低抗體結(jié)合抗原的能力。例如，可在HVR中作出不會基本上降低結(jié)合親和力的保守改變(如，本文提供的保守取代)。此類改變可在HVR“熱點(diǎn)”或SDR的外部。在上文提供的變體VH和VL序列的某些實(shí)施方案中，每個(gè)HVR是未改變的，或包含不超過一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氨基酸取代。用于鑒定可靶向誘變的抗體的殘基或區(qū)的有用方法稱為“丙氨酸掃描誘變”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在該方法中，鑒定殘基或靶標(biāo)殘基組(例如，帶電荷的殘基，諸如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替換，以確定是否影響抗體與抗原的相互作用?？稍陲@示出對初始取代的功能敏感性的氨基酸位置引入另外的取代。作為另外一種選擇或除此之外，使用抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)鑒定抗體和抗原之間的接觸點(diǎn)。此類接觸殘基和相鄰殘基可作為取代的候選物靶向或消除?？珊Y選變體以確定其是否包含所需的性質(zhì)。氨基酸序列插入包括長度在一個(gè)殘基至包含一百個(gè)或更多個(gè)殘基的多肽的范圍內(nèi)氨基和/或羧基末端融合，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫胺?；鶜埢目贵w?？贵w分子的其他插入變體包括抗體的N或C末端融合至酶(例如ADEPT)或多肽，所述酶或多肽延長了抗體的血清半衰期。b)糖基化變體在某些實(shí)施方案中，改變本文提供的抗體以增加或減少抗體糖基化的程度?？贵w中糖基化位點(diǎn)的添加或缺失可通過改變氨基酸序列，以形成或移除一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)便利地實(shí)現(xiàn)。在抗體包含F(xiàn)c區(qū)的情況下，可改變其連接的糖類。哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的天然抗體通常包含通常N-末端連接至Fc區(qū)的CH2結(jié)構(gòu)域的Asn297的支鏈、雙觸角寡糖。參見例如Wright等TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可包括各種糖類，例如甘露糖、N-乙?；咸烟前?GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在雙觸角寡糖結(jié)構(gòu)的“桿”中連接至GlcNAc的鹽藻糖。在一些實(shí)施方案中，可對本發(fā)明的抗體中的寡糖作出修飾，以形成具有某些改善性質(zhì)的抗體變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了具有缺乏連接(直接或間接)至Fc區(qū)的鹽藻糖的糖類結(jié)構(gòu)的抗體變體。例如，此類抗體中鹽藻糖的量可為1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。鹽藻糖的量通過相對于連接至Asn297的全部糖結(jié)構(gòu)(例如復(fù)合物、雜合物和高甘露糖結(jié)構(gòu))的總和計(jì)算Asn297處糖鏈內(nèi)鹽藻糖的平均量來測定，如MALDI-TOF質(zhì)譜分析所測定，如例如WO2008/077546所述。Asn297是指位于Fc區(qū)中約297位(Fc區(qū)殘基的Eu編號)的天冬酰胺殘基；然而，由于抗體的微小序列變化，Asn297也可位于297位上游或下游約±3個(gè)氨基酸，即在294和300位之間。此類鹽藻糖基化變體可具有改善的ADCC功能。參見例如美國專利公開No.US2003/0157108(Presta,L.)、US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo.,Ltd)。涉及“去鹽藻糖基化”或“鹽藻糖缺陷的”抗體變體的專利公開的例子包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能夠產(chǎn)生去鹽藻糖基化抗體的細(xì)胞系的例子包括蛋白質(zhì)鹽藻糖基化缺陷Lec13CHO細(xì)胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美國專利申請NoUS2003/0157108A1,Presta,L；以及WO2004/056312A1，Adams等，尤其是實(shí)例11)，以及敲除細(xì)胞系，諸如α-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因FUT8敲除CHO細(xì)胞(參見例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；以及WO2003/085107)?？贵w變體還具有等分寡糖，例如其中連接至抗體的Fc區(qū)的雙觸角寡糖被GlcNAc等分。此類抗體變體可具有低鹽藻糖基化程度和/或改善的ADCC功能。此類抗體變體的例子在例如WO2003/011878(Jean-Mairet等)；美國專利No.6,602,684(Umana等)；和US2005/0123546(Umana等)中有所描述。還提供了寡糖中的至少一個(gè)半乳糖殘基連接至Fc區(qū)的抗體變體。此類抗體變體可具有改善的CDC功能。此類抗體變體在例如WO1997/30087(Patel等)；WO1998/58964(Raju,S.)；和WO1999/22764(Raju,S.)中有所描述。c)Fc區(qū)變體在某些實(shí)施方案中，可將一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾引入本文提供的抗體的Fc區(qū)，從而生成Fc區(qū)變體。Fc區(qū)變體可包含在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置包含氨基酸修飾(例如取代)的人Fc區(qū)序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū))。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)想了具有一些但非全部效應(yīng)功能的抗體變體，這些效應(yīng)功能使該抗體成為某些應(yīng)用的期望候選物，在這些應(yīng)用中體內(nèi)抗體的半衰期是重要的，但某些效應(yīng)功能(諸如補(bǔ)體和ADCC)是不必要的或有毒的?？蛇M(jìn)行體外和/或體內(nèi)細(xì)胞毒性分析，以確認(rèn)CDC和/或ADCC活性減少/耗盡。例如，可進(jìn)行Fc受體(FcR)結(jié)合分析，以確認(rèn)抗體缺乏FcγR結(jié)合能力(從而可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn結(jié)合能力。介導(dǎo)ADCC的原代細(xì)胞即NK細(xì)胞表達(dá)Fc僅(RIII，而單核細(xì)胞表達(dá)Fc(RI、Fc(RII和Fc(RIII。造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)匯總于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)第464頁上的表3。評估所關(guān)注的分子的ADCC活性的體外分析的非限制性例子在美國專利No.5,500,362(參見例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中有所描述?；蛘?，可利用非放射性分析方法(參見例如，用于流式細(xì)胞術(shù)的ACTITM非放射性細(xì)胞毒性分析(CellTechnology,Inc.MountainView,CA)；和CytoTox非放射性細(xì)胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。對于此類分析的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和自然殺傷(NK)細(xì)胞。作為另外一種選擇或除此之外，所關(guān)注的分子的ADCC活性可在體內(nèi)例如動物模型中評估，諸如Clynes等Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95:652-656(1998)中所公開。還可進(jìn)行C1q結(jié)合分析，以確認(rèn)抗體不能結(jié)合C1q，從而缺乏CDC活性。參見例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c結(jié)合ELISA。為評估補(bǔ)體活化，可進(jìn)行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。FcRn結(jié)合和體內(nèi)清除/半衰期測定也可使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行(參見例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。效應(yīng)功能降低的抗體包括具有一個(gè)或多個(gè)Fc區(qū)殘基238、265、269、270、297、327和329的取代的那些抗體(美國專利No.6,737,056)。此類Fc突變體包括具有在氨基酸位置265、269、270、297和327中的兩者或更多者處的取代的Fc突變體，包括殘基265和297取代為丙氨酸的所謂的“DANA”Fc突變體(美國專利No.7,332,581)。描述了與FcR結(jié)合改善或消除的某些抗體變體。(參見例如美國專利No.6,737,056；WO2004/056312和Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。在某些實(shí)施方案中，抗體變體包含具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的Fc區(qū)，該取代改善了ADCC，例如Fc區(qū)的位置298、333和/或334處(殘基的EU編號)的取代。在一些實(shí)施方案中，對Fc區(qū)作出改變，從而使C1q結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)發(fā)生改變(即，改善或消除)，例如如美國專利No.6,194,551、WO99/51642和Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。半衰期延長和與新生兒Fc受體(FcRn)結(jié)合改善的抗體，負(fù)責(zé)母體IgG至胎兒的轉(zhuǎn)移(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))，該抗體在US2005/0014934A1(Hinton等)中有所描述。這些抗體包含在其中具有一個(gè)或多個(gè)取代的Fc區(qū)，所述取代改善了Fc區(qū)與FcRn的結(jié)合。此類Fc變體包括在Fc區(qū)殘基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一者或多者處具有取代的那些變體，例如Fc區(qū)殘基434的取代(美國專利No.7,371,826)。還可參見Duncan&Winter,Nature322:738-40(1988)；美國專利No.5,648,260；美國專利No.5,624,821；和WO94/29351關(guān)于Fc區(qū)變體的其他例子。d)半胱氨酸工程化抗體變體在某些實(shí)施方案中，期望形成半胱氨酸工程化抗體，例如“thioMAb”，其中抗體的一個(gè)或多個(gè)殘基被半胱氨酸殘基取代。在特定實(shí)施方案中，取代的殘基出現(xiàn)在抗體的可及位點(diǎn)。通過用半胱氨酸取代這些殘基，從而將反應(yīng)性硫醇基團(tuán)定位于抗體的可及位點(diǎn)，并且該活性硫醇基團(tuán)可用于將抗體偶聯(lián)到其他部分，諸如藥物部分或接頭-藥物部分，以形成免疫偶聯(lián)物，如本文進(jìn)一步描述。在某些實(shí)施方案中，以下殘基中的任一者或多者可被半胱氨酸取代：輕鏈的V205(Kabat編號)；重鏈的A118(EU編號)；和重鏈Fc區(qū)的S400(EU編號)。半胱氨酸工程化抗體可以如例如美國專利No.7,521,541所述生成。e)抗體衍生物在某些實(shí)施方案中，本文提供的抗體可進(jìn)一步修飾為包含本領(lǐng)域已知的且易得的另外非蛋白質(zhì)部分。適用于衍生化抗體的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物非限制性例子包括但不限于：聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊環(huán)、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或無規(guī)共聚物)以及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇以及它們的混合物。聚乙二醇丙醛由于在水中的穩(wěn)定性，在制備中可具有優(yōu)勢。聚合物可具有任何分子量，并且可以是支鏈的或非支鏈的。連接至抗體的聚合物數(shù)量可變化，如果連接超過一個(gè)聚合物，則該聚合物可以是相同的或不同的分子。一般來講，用于衍生化的聚合物的數(shù)量和/或類型可根據(jù)考慮因素確定，所述考慮因素包括但不限于待改善的抗體的特定性質(zhì)或功能，無論該抗體衍生物是否用于在確定條件下的治療等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了可通過暴露至輻射而選擇性加熱的抗體和非蛋白質(zhì)部分的偶聯(lián)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該非蛋白質(zhì)部分是碳納米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。輻射可具有任何波長，并且包括但不限于不傷害正常細(xì)胞，但加熱非蛋白質(zhì)部分達(dá)到殺死鄰近抗體-非蛋白質(zhì)部分的細(xì)胞的溫度的波長。B.重組方法和組合物抗體可使用例如美國專利No.4,816,567所述的重組方法和組合物制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了編碼本文所述的抗GPC3抗體的分離的核酸。此類核酸可編碼組成抗體的VL的氨基酸序列和/或組成抗體的VH的氨基酸序列(例如，抗體的輕鏈和/或重鏈)。在另外的實(shí)施方案中，提供了包含此類核酸的一個(gè)或多個(gè)載體(例如，表達(dá)載體)。在另外的實(shí)施方案中，提供了包含此類核酸的宿主細(xì)胞。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含(例如，轉(zhuǎn)化有)：(1)包含如下核酸的載體，所述核酸編碼組成抗體的VL的氨基酸序列和組成抗體的VH的氨基酸序列，或(2)包含如下核酸的第一載體，所述核酸編碼組成抗體的VL的氨基酸序列；以及包含如下核酸的第二載體，所述核酸編碼組成抗體的VH的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞(例如，Y0、NS0、Sp20細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了抗GPC3抗體的制備方法，其中該方法包括在適于抗體表達(dá)的條件下，培養(yǎng)包含編碼上述抗體的核酸的宿主細(xì)胞，以及任選地從宿主細(xì)胞(或宿主細(xì)胞培養(yǎng)基)回收抗體。對于抗GPC3抗體的重組制備，分離編碼抗體，例如上述抗體的核酸，并插入一個(gè)或多個(gè)載體，用于在宿主細(xì)胞中進(jìn)行進(jìn)一步克隆和/或表達(dá)。此類核酸可易于使用常規(guī)工序分離和測序(例如，通過使用能夠特異性結(jié)合編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。適用于抗體編碼載體的克隆或表達(dá)的宿主細(xì)胞包括本文所述的原核或真核細(xì)胞。例如，抗體可在細(xì)菌中制備，特別是不需要糖基化和Fc效應(yīng)功能時(shí)。對于抗體片段和多肽在細(xì)菌中的表達(dá)，參見例如美國專利No.5,648,237、5,789,199和5,840,523。(還可參見Charlton,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo,編,HumanaPress,Totowa,NJ,2003),第245-254頁，描述在大腸桿菌中表達(dá)抗體片段)在表達(dá)后，該抗體可從細(xì)菌細(xì)胞漿料(paste)中以可溶性級分分離，并且可進(jìn)一步純化。除原核生物之外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母也是抗體編碼載體的合適克隆或表達(dá)宿主，包括糖基化途徑被“人源化”，導(dǎo)致產(chǎn)生部分或完全人糖基化型式的抗體的真菌和酵母菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。對于糖基化抗體表達(dá)的合適宿主細(xì)胞還來源于多細(xì)胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲細(xì)胞。已鑒定多種棒狀病毒菌株，它們可與昆蟲細(xì)胞一起使用，特別是用于草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可用作宿主。參見例如美國專利No.5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述用于在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生抗體的PLANTIBODIESTM技術(shù))。脊椎動物細(xì)胞也可用作宿主。例如，可使用適于在懸浮液中生長的哺乳動物細(xì)胞系。可用的哺乳動物宿主細(xì)胞系的其他例子是由SV40(COS-7)轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系；人胚腎細(xì)胞系(例如Graham等,J.GenVirol.36:59(1977)描述的293或293細(xì)胞)；幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)；小鼠塞爾托利氏細(xì)胞(例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)描述的TM4細(xì)胞)；猴腎細(xì)胞(CV1)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA)；犬腎細(xì)胞(MDCK)；buffalo大鼠肝細(xì)胞(BRL3A)；人肺細(xì)胞(W138)；人肝細(xì)胞(HepG2)；小鼠乳腺瘤(MMT060562)；TRI細(xì)胞，如例如Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)所述；MRC5細(xì)胞；以及FS4細(xì)胞。其他可用的哺乳動物宿主細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，包括DHFR-CHO細(xì)胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；和骨髓瘤細(xì)胞系諸如Y0、NS0和Sp2/0。對于適用于抗體測試的某些哺乳動物宿主細(xì)胞系的評述，參見例如Yazaki和Wu,MethodsinMolecularBiology,第248卷(B.K.C.Lo編,HumanaPress,Totowa,NJ),第255-268頁(2003)。C.分析可通過本領(lǐng)域已知的各種分析鑒定、篩選或表征本文提供的抗GPC3抗體的物理/化學(xué)性質(zhì)和/或生物活性。在一個(gè)方面，例如通過已知的方法諸如ELISA、FACS或Western印跡測試本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合活性。在另一個(gè)方面，可使用競爭分析鑒定與本文所述的任何抗體競爭結(jié)合至GPC3的抗體。在某些實(shí)施方案中，此類競爭抗體結(jié)合至與本文所述的抗體所結(jié)合相同的表位(例如，線性或構(gòu)象性表位)。Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols,”MethodsinMolecularBiology第66卷(HumanaPress,Totowa,NJ)提供了繪制抗體結(jié)合的表位的詳細(xì)示例性方法。在示例性競爭分析中，使固定化GPC3在包含結(jié)合至GPC3的第一標(biāo)記抗體(例如，本文所述的任何抗體)和第二未標(biāo)記抗體的溶液中溫育，測試第二未標(biāo)記抗體與第一抗體競爭結(jié)合至GPC3的能力。第二抗體可存在于雜交瘤上清液中。作為對照，固定化GPC3在包含第一標(biāo)記抗體，但不包含第二未標(biāo)記抗體的溶液中溫育。在允許第一抗體結(jié)合GPC3的條件下溫育后，移除過量的未結(jié)合抗體，并測定與固定化GPC3締合的標(biāo)記的量。如果測試樣本中與固定化GPC3締合的標(biāo)記的量相對于對照樣本基本上減少，則表明第二抗體與第一抗體競爭結(jié)合至GPC3。參見Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual第14章(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY)。D.免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還提供包含本文的偶聯(lián)至一種或多種細(xì)胞毒性劑的抗GPC3抗體的免疫偶聯(lián)物，所述細(xì)胞毒性劑諸如化療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如，細(xì)菌、真菌、植物或動物來源的蛋白質(zhì)毒素、酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性偶聯(lián)物)。免疫偶聯(lián)物允許藥物部分靶向遞送至腫瘤，并且在一些實(shí)施方案中積聚在細(xì)胞內(nèi)，其中未偶聯(lián)藥物的全身施用可產(chǎn)生正常細(xì)胞不可接受的毒性水平(PolakisP.(2005)CurrentOpinioninPharmacology5:382-387)。抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)是靶向化療分子，其通過使有效的細(xì)胞毒性藥物靶向抗原表達(dá)腫瘤細(xì)胞來組合抗體和細(xì)胞毒性藥物二者的性質(zhì)(Teicher,B.A.(2009)CurrentCancerDrugTargets9:982-1004)，從而通過功效最大化和脫靶毒性最小化來提高治療指數(shù)(Carter,P.J.和SenterP.D.(2008)TheCancerJour.14(3):154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41:98-107)。本發(fā)明的ADC化合物包括具有抗癌活性的那些化合物。在一些實(shí)施方案中，該ADC化合物包括偶聯(lián)即共價(jià)連接至藥物部分的抗體。在一些實(shí)施方案中，該抗體通過接頭共價(jià)連接至藥物部分。本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)將有效劑量的藥物選擇性遞送至腫瘤組織，據(jù)此在提高治療指數(shù)(“治療窗”)的同時(shí)，可實(shí)現(xiàn)更大的選擇性，即更低的有效劑量?？贵w-藥物偶聯(lián)物(ADC)的藥物部分(D)可包括具有細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制效應(yīng)的任何化合物、部分或基團(tuán)。藥物部分可通過各種機(jī)制賦予細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制效應(yīng)，所述機(jī)制包括但不限于微管蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合或嵌入以及RNA聚合酶、蛋白質(zhì)合成和/或拓?fù)洚悩?gòu)酶的抑制。示例性藥物部分包括但不限于類美登素、卡里奇霉素、吡咯并苯二氮雜卓(PBD)、奈莫柔比星及其衍生物、PNU-159682、蒽環(huán)、倍癌霉素、長春花生物堿、紫杉烷、單端孢霉烯、CC1065、喜樹堿、依利萘法德及其具有細(xì)胞毒性活性的立體異構(gòu)體、同電子排列體、類似物和衍生物。此類免疫偶聯(lián)物的非限制性例子在下文進(jìn)一步詳細(xì)討論。1.示例性抗體-藥物偶聯(lián)物抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)化合物的示例性實(shí)施方案包含靶向腫瘤細(xì)胞的抗體(Ab)、藥物部分(D)以及連接Ab和D的接頭部分(L)。在一些實(shí)施方案中，抗體通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，諸如賴氨酸和/或半胱氨酸連接至接頭部分(L)。示例性ADC具有式I：Ab-(L-D)pI其中p為1至約20。在一些實(shí)施方案中，可偶聯(lián)至抗體的藥物部分的數(shù)量受到游離半胱氨酸殘基的數(shù)量的限制。在一些實(shí)施方案中，通過本文所述的方法將游離半胱氨酸殘基引入抗體氨基酸序列。式I的示例性ADC包括但不限于具有1、2、3或4個(gè)工程化半胱氨酸氨基酸的抗體(Lyon,R.等(2012)MethodsinEnzym.502:123-138)。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)游離半胱氨酸殘基已存在于抗體中，無需進(jìn)行工程化，在這種情況下，現(xiàn)有的游離半胱氨酸殘基可用于將抗體偶聯(lián)至藥物。在一些實(shí)施方案中，將抗體暴露于還原條件，然后偶聯(lián)抗體，以生成一個(gè)或多個(gè)游離半胱氨酸殘基。a)示例性接頭“接頭”(L)是可用于將一個(gè)或多個(gè)藥物部分(D)連接至抗體(Ab)，形成式I的抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)的雙官能或多官能部分。在一些實(shí)施方案中，抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)可使用具有反應(yīng)性官能團(tuán)的接頭制備，所述反應(yīng)性官能團(tuán)用于共價(jià)連接至藥物和抗體。例如，在一些實(shí)施方案中，抗體(Ab)的半胱氨酸硫醇可與接頭的反應(yīng)性官能團(tuán)或藥物-接頭中間體形成化學(xué)鍵，以制備ADC。在一個(gè)方面，接頭具有的官能團(tuán)能夠與抗體上存在的游離半胱氨酸反應(yīng)形成共價(jià)鍵。非限制示例性的此類反應(yīng)性官能團(tuán)包括馬來酰亞胺、鹵代乙酰胺、α-鹵代乙酰基、活性酯諸如琥珀酰亞胺酯、4-硝基苯酯、五氟苯酯、四氟苯酯、酸酐、酰氯、磺酰氯、異氰酸酯和異硫氰酸酯。參見例如，Klussman等(2004),BioconjugateChemistry15(4):765-773的第766頁偶聯(lián)方法和本文的實(shí)例。在一些實(shí)施方案中，接頭具有能夠與抗體上存在的親電基團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán)。示例性的此類親電基團(tuán)包括但不限于醛和酮羰基基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，接頭的反應(yīng)性官能團(tuán)的雜原子可與抗體上的親電基團(tuán)反應(yīng)，并且形成連接至抗體單元的共價(jià)鍵。非限制示例性的此類反應(yīng)性官能團(tuán)包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。接頭可包含一種或多種接頭組分。示例性接頭組分包括6-馬來酰亞胺己酰基(“MC”)、馬來酰亞胺丙?；?“MP”)、對氨基芐氧羰基(“PAB”)、N-琥珀酰亞胺4-(2-吡啶基硫)戊酸酯(“SPP”)和4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(“MCC”)。各種接頭組分是本領(lǐng)域已知的，它們中的一些在下文有所描述。接頭可以是有助于藥物釋放的“可裂解接頭”。非限制示例性可裂解接頭包括酸不穩(wěn)定接頭(例如，包含腙)、蛋白酶敏感(例如，肽酶敏感)接頭、光不穩(wěn)定接頭或含二硫鍵的接頭(Chari等,CancerResearch52:127-131(1992)；US5208020)。在一些實(shí)施方案中，接頭組分包括將抗體連接至另一個(gè)接頭組分或藥物部分的“拉伸單元(stretcherunit)”。非限制示例性拉伸單元如下所示(其中波浪線表示共價(jià)連接至抗體、藥物或另外的接頭組分的位點(diǎn))：在一些實(shí)施方案中，接頭組分包括直接或通過拉伸單元和/或氨基酸單元將抗體連接至藥物部分的“間隔基”單元。間隔基單元可以是“自我犧牲的(self-immolative)”或“非自我犧牲的(non-self-immolative)”。“非自我犧牲的”間隔基單元是其中ADC裂解時(shí)部分或全部間隔基單元保持結(jié)合至藥物部分的間隔基單元。非自我犧牲的間隔基單元的例子包括但不限于甘氨酸間隔基單元和甘氨酸-甘氨酸間隔基單元。在一些實(shí)施方案中，通過腫瘤細(xì)胞相關(guān)蛋白酶對包含甘氨酸-甘氨酸間隔基單元的ADC進(jìn)行酶裂解，使得從ADC的其余部分釋放甘氨酸-甘氨酸-藥物部分。在一些此類實(shí)施方案中，甘氨酸-甘氨酸-藥物部分在腫瘤細(xì)胞中經(jīng)受水解步驟，從而從藥物部分裂解下甘氨酸-甘氨酸間隔基單元。“自我犧牲的”間隔基單元允許釋放藥物部分。在某些實(shí)施方案中，接頭的間隔基單元包括對氨基芐基單元。在一些此類實(shí)施方案中，對氨基芐醇通過酰胺鍵連接至氨基酸單元，并且在芐醇和藥物之間形成氨基甲酸酯、氨基甲酸甲酯或碳酸酯(Hamann等(2005)ExpertOpin.Ther.Patents(2005)15:1087-1103)。在一些實(shí)施方案中，該間隔基單元是對氨基芐氧羰基(PAB)。在一些實(shí)施方案中，包含自我犧牲的接頭的ADC具有以下結(jié)構(gòu)：其中Q為-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、鹵代、硝基或氰基；m為在0至4范圍內(nèi)的整數(shù)；并且p在1至約20的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，p在1至10、1至7、1至5或1至4的范圍內(nèi)。自我犧牲的間隔基的其他例子包括但不限于電子類似于PAB基團(tuán)的芳族化合物，諸如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物(美國專利No.7,375,078；Hay等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)和鄰或?qū)Π被S基乙縮醛。在一些實(shí)施方案中，可使用在酰胺鍵水解時(shí)發(fā)生環(huán)化的間隔基，諸如取代的和未取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等(1995)ChemistryBiology2:223)、適當(dāng)取代的雙環(huán)[2.2.1]和雙環(huán)[2.2.2]環(huán)系(Storm等(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等(1990)J.Org.Chem.55:5867)。藥物與甘氨酸殘基的α-碳連接是可用于ADC的自我犧牲的間隔基的另一個(gè)例子(Kingsbury等(1984)J.Med.Chem.27:1447)。在一些實(shí)施方案中，接頭L可以是樹枝狀型接頭，用于通過支化、多官能接頭部分將超過一個(gè)藥物部分共價(jià)連接至抗體(Sun等(2002)Bioorganic&MedicinalChemistryLetters12:2213-2215；Sun等(2003)Bioorganic&MedicinalChemistry11:1761-1768)。樹枝狀接頭可提高藥物與抗體的摩爾比，即載量，這與ADC的效能相關(guān)。因此，在抗體僅具有一個(gè)反應(yīng)性半胱氨酸硫醇基團(tuán)的情況下，大量藥物部分可通過樹枝狀接頭連接。在一些實(shí)施方案中，接頭被調(diào)節(jié)溶解度和/或反應(yīng)性的基團(tuán)取代。作為非限制性例子，帶電荷的取代基諸如磺酸根(-SO3-)或銨可提高接頭試劑的水溶解度，并且促進(jìn)接頭試劑與抗體和/或藥物部分的偶聯(lián)反應(yīng)，或促進(jìn)Ab-L(抗體-接頭中間體)與D，或D-L(藥物-接頭中間體)與Ab的偶聯(lián)反應(yīng)，這取決于用于制備ADC的合成路線。在一些實(shí)施方案中，接頭的一部分連接至抗體，并且接頭的一部分連接至藥物，然后Ab-(接頭部分)a連接至藥物-(接頭部分)b，形成式I的ADC。在一些此類實(shí)施方案中，抗體包含超過一個(gè)(接頭部分)a取代基，使得超過一個(gè)藥物連接至式I的ADC中的抗體。本發(fā)明的化合物明確地設(shè)想了，但不限于使用以下接頭試劑制備的ADC：雙-馬來酰亞胺-三氧乙二醇(BMPEO)、N-(β-馬來酰亞胺丙氧基)-N-羥基琥珀酰亞胺酯(BMPS)、N-(ε-馬來酰亞胺己酰氧基)琥珀酰亞胺酯(EMCS)、N-[γ-馬來酰亞胺丁酰氧基]琥珀酰亞胺酯(GMBS)、1,6-己烷-雙-乙烯基砜(HBVS)、琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧基-(6-胺基己酸酯)(LC-SMCC)、間馬來酰亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、4-(4-N-馬來酰亞胺苯基)丁酰肼(MPBH)、3-(溴乙酰胺基)丙酸琥珀酰亞胺酯(SBAP)、碘乙酸琥珀酰亞胺酯(SIA)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸琥珀酰亞胺酯(SIAB)、N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亞胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)、4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)、4-(對馬來酰亞胺苯基)丁酸琥珀酰亞胺酯(SMPB)、琥珀酰亞胺基6-[(β-馬來酰亞胺丙酰胺基)己酸酯](SMPH)、亞氨基硫烷(IT)、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及(4-乙烯基砜)苯甲酸琥珀酰亞胺酯(SVSB)，并且包括雙-馬來酰亞胺試劑：二硫代雙馬來酰亞胺乙烷(DTME)、1,4-雙馬來酰亞胺丁烷(BMB)、1,4-雙馬來酰亞胺基-2,3-二羥基丁烷(BMDB)、雙馬來酰亞胺己烷(BMH)、雙馬來酰亞胺乙烷(BMOE)、BM(PEG)2(如下所示)和BM(PEG)3(如下所示)；亞氨基酯的雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙-疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲?；?己二胺)、雙-重氮衍生物(諸如雙-(對重氮苯甲?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)和雙-活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在一些實(shí)施方案中，雙馬來酰亞胺試劑允許抗體中半胱氨酸的硫醇基團(tuán)連接至含硫醇藥物部分、接頭或接頭-藥物中間體。與硫醇基團(tuán)反應(yīng)的其他官能團(tuán)包括但不限于碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、異氰酸酯和異硫氰酸酯。某些可用的接頭試劑可從各種商業(yè)來源獲得，諸如PierceBiotechnology,Inc.(Rockford,IL)、MolecularBiosciencesInc.(Boulder,CO)，或根據(jù)本領(lǐng)域描述的工序合成；例如Dubowchik等(1997)TetrahedronLetters,38:5257-60；Walker,M.A.(1995)J.Org.Chem.60:5352-5355；Frisch等(1996)BioconjugateChem.7:180-186；US6214345；WO02/088172；US2003130189；US2003096743；WO03/026577；WO03/043583；和WO04/032828。碳-14-標(biāo)記的1-異硫氰芐基-3-甲基二乙烯三胺戊乙酸(MX-DTPA)是放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的示例性螯合劑。參見例如WO94/11026。b)示例性藥物部分(1)美登素和類美登素在一些實(shí)施方案中，免疫偶聯(lián)物包含偶聯(lián)至一個(gè)或多個(gè)類美登素分子的抗體。類美登素是美登素的衍生物，是有絲分裂抑制劑，通過抑制微管蛋白聚合發(fā)揮作用。美登素首先從非洲東部灌木齒葉美登木(Maytenusserrata)分離(美國專利No.3896111)。隨后發(fā)現(xiàn)，某些微生物也可產(chǎn)生類美登素，諸如美登醇和C-3美登醇酯(美國專利No.4,151,042)。合成類美登素例如在美國專利No.4,137,230、4,248,870、4,256,746、4,260,608、4,265,814、4,294,757、4,307,016、4,308,268、4,308,269、4,309,428、4,313,946、4,315,929、4,317,821、4,322,348、4,331,598、4,361,650、4,364,866、4,424,219、4,450,254、4,362,663和4,371,533中有所公開。在抗體-藥物偶聯(lián)物中，類美登素藥物部分是有吸引力的藥物部分，因?yàn)樗鼈儯?i)相對容易通過發(fā)酵或發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)修飾或衍生化制備，(ii)適合利用官能團(tuán)衍生化，所述官能團(tuán)適用于通過非二硫鍵接頭偶聯(lián)至抗體，(iii)在血漿中穩(wěn)定，并且(iv)對多種腫瘤細(xì)胞系有效。適于用作類美登素藥物部分的某些類美登素是本領(lǐng)域已知的，并且可根據(jù)已知的方法從天然來源分離，或使用基因工程技術(shù)制備(參見例如Yu等(2002)PNAS99:7968-7973)。類美登素也可根據(jù)已知的方法合成制備。示例性類美登素藥物部分包括但不限于具有修飾的芳環(huán)的那些類美登素，所述修飾的芳環(huán)諸如：C-19-脫氯(美國專利No.4256746)(例如，通過安絲菌素P2的氫化鋁鋰還原制備)；C-20-羥基(或C-20-脫甲基)+/-C-19-脫氯(美國專利No.4361650和4307016)(例如，通過使用鏈霉菌(Streptomyces)或放線菌(Actinomyces)脫甲基化或使用LAH脫氯制備)；和C-20-脫甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-脫氯(美國專利No.4,294,757)(例如，通過使用?；弱；苽?以及在芳環(huán)的其他位置具有修飾的那些。示例性類美登素藥物部分還包括具有修飾的那些類美登素，所述修飾諸如：C-9-SH(美國專利No.4424219)(例如，通過美登醇與H2S或P2S5的反應(yīng)制備)；C-14-烷氧基甲基(脫甲氧基/CH2OR)(US4331598)；C-14-羥甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國專利No.4450254)(例如，從諾卡氏菌(Nocardia)制備)；C-15-羥基/酰氧基(US4364866)(例如，通過鏈霉菌轉(zhuǎn)化美登醇制備)；C-15-甲氧基(美國專利No.4313946和4315929)(例如，從滑桃樹(Trewianudlflora)分離)；C-18-N-脫甲基(美國專利No.4362663和4322348)(例如，通過鏈霉菌使美登醇脫甲基化制備)；和4,5-脫氧(US4371533)(例如，通過美登醇的三氯化鈦/LAH還原制備)。類美登素化合物上的多個(gè)位置可用作鍵合位置。例如，酯鍵可使用常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)通過與羥基基團(tuán)反應(yīng)來形成。在一些實(shí)施方案中，該反應(yīng)可發(fā)生在具有羥基基團(tuán)的C-3位置、被羥甲基修飾的C-14位置、被羥基基團(tuán)修飾的C-15位置以及具有羥基基團(tuán)的C-20位置。在一些實(shí)施方案中，鍵合在美登醇或美登醇類似物的C-3位置形成。類美登素藥物部分包含具有以下結(jié)構(gòu)的那些類美登素：其中波浪線表示類美登素藥物部分的硫原子與ADC的接頭的共價(jià)連接。每個(gè)R可獨(dú)立地為H或C1-C6烷基。將酰胺基團(tuán)連接至硫原子的亞烷基鏈可以是甲基、乙基或丙基，即m為1、2或3(US633410；US5208020；Chari等(1992)CancerRes.52:127-131；Liu等(1996)Proc.Natl.Acad.SciUSA93:8618-8623)。設(shè)想了本發(fā)明的ADC的類美登素藥物部分的所有立體異構(gòu)體，即手性碳的R和S構(gòu)型的任何組合(US7276497；US6913748；US6441163；US633410(RE39151)；US5208020；Widdison等(2006)J.Med.Chem.49:4392-4408，這些文獻(xiàn)全文以引用方式并入)。在一些實(shí)施方案中，類美登素藥物部分具有以下立體化學(xué)結(jié)構(gòu)：類美登素藥物部分的示例性實(shí)施方案包括但不限于具有以下結(jié)構(gòu)的DM1、DM3和DM4：其中波浪線表示藥物的硫原子與抗體-藥物偶聯(lián)物的接頭(L)的共價(jià)連接。其他示例性類美登素抗體-藥物偶聯(lián)物具有以下結(jié)構(gòu)和縮寫(其中Ab為抗體，p為1至約20。在一些實(shí)施方案中，p為1至10，p為1至7，p為1至5或p為1至4)：其中DM1通過BMPEO接頭連接至抗體的硫醇基團(tuán)的示例性抗體-藥物偶聯(lián)物具有以下結(jié)構(gòu)和縮寫：其中Ab為抗體；n為0、1或2；并且p為1至約20。在一些實(shí)施方案中，p為1至10，p為1至7，p為1至5或p為1至4。包含類美登素的免疫偶聯(lián)物、其制備方法及其治療用途在例如美國專利No.5,208,020和5,416,064、US2005/0276812A1和歐洲專利EP0425235B1中有所公開，這些專利的公開內(nèi)容據(jù)此明確地以引用方式并入。還可參見Liu等Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996)；和Chari等CancerResearch52:127-131(1992)。在一些實(shí)施方案中，抗體-類美登素偶聯(lián)物可通過將抗體化學(xué)連接至類美登素分子而無需顯著消除抗體或類美登素分子的生物活性來制備。參見例如美國專利No.5,208,020(該專利的公開內(nèi)容據(jù)此明確地以引用方式并入)。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)抗體分子具有平均3-4個(gè)偶聯(lián)的類美登素分子的ADC顯示出增加靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性，但不會對抗體的功能或溶解度造成負(fù)面影響的功效。在一些情況下，預(yù)期即使一分子毒素/抗體相對于使用裸抗體也可增加細(xì)胞毒性。用于制備抗體-類美登素偶聯(lián)物的示例性連接基團(tuán)包括例如本文所述的那些連接基團(tuán)，以及美國專利No.5208020；歐洲專利EP0425235B1；Chari等CancerResearch52:127-131(1992)；US2005/0276812A1；和US2005/016993A1公開的那些連接基團(tuán)，這些專利的公開內(nèi)容據(jù)此明確地以引用方式并入。(2)卡里奇霉素在一些實(shí)施方案中，免疫偶聯(lián)物包含偶聯(lián)至一個(gè)或多個(gè)卡里奇霉素分子的抗體。亞皮摩爾濃度的卡里奇霉素家族抗生素及其類似物能夠使雙鏈DNA斷裂(Hinman等,(1993)CancerResearch53:3336-3342；Lode等,(1998)CancerResearch58:2925-2928)?？ɡ锲婷顾鼐哂屑?xì)胞內(nèi)作用位點(diǎn)，但在某些情況下，不容易跨過原生質(zhì)膜。因此，這些試劑通過抗體介導(dǎo)的內(nèi)化作用攝入細(xì)胞，在一些實(shí)施方案中，可大大增加其細(xì)胞毒性效應(yīng)。使用卡里奇霉素藥物部分制備抗體-藥物偶聯(lián)物的非限制示例性方法在例如US5712374、US5714586、US5739116和US5767285中有所描述。(4)吡咯并苯二氮雜卓在一些實(shí)施方案中，ADC包含吡咯并苯二氮雜卓(PBD)。在一些實(shí)施方案中，PDB二聚體識別并結(jié)合特定的DNA序列。天然產(chǎn)物氨茴霉素PBD在1965年首次報(bào)道(Leimgruber等,(1965)J.Am.Chem.Soc.,87:5793-5795；Leimgruber等,(1965)J.Am.Chem.Soc.,87:5791-5793)。從那時(shí)起，報(bào)道了多種天然存在的PBD和類似物(Thurston等,(1994)Chem.Rev.1994,433-465)，包括三環(huán)PBD支架的二聚體(US6884799；US7049311；US7067511；US7265105；US7511032；US7528126；US7557099)。不打算受任何具體理論的束縛，據(jù)信二聚體結(jié)構(gòu)賦予對于等螺旋性的適當(dāng)三維形狀，具有B型DNA的小溝，導(dǎo)致在結(jié)合位點(diǎn)形成滑動配合(snugfit)(Kohn,InAntibioticsIII.Springer-Verlag,NewYork,第3-11頁(1975)；Hurley和Needham-VanDevanter,(1986)Acc.Chem.Res.,19:230-237)。具有C2芳基取代基的二聚體PBD化合物已顯示出可用作細(xì)胞毒性劑(Hartley等(2010)CancerRes.70(17):6849-6858；Antonow(2010)J.Med.Chem.53(7):2927-2941；Howard等(2009)BioorganicandMed.Chem.Letters19(22):6463-6466)。在一些實(shí)施方案中，通過用氮保護(hù)基團(tuán)在N10位置保護(hù)PBD化合物，可將PBD化合物用作前藥，所述氮保護(hù)基團(tuán)在體內(nèi)是可移除的(WO00/12507、WO2005/023814)。PBD二聚體已偶聯(lián)至抗體，并且所得的ADC顯示出具有抗癌性質(zhì)(US2010/0203007)。PBD二聚體上的非限制示例性鍵合位點(diǎn)包括五元吡咯并環(huán)，PBD單元之間的固定件以及N10-C11亞胺基團(tuán)(WO2009/016516、US2009/304710、US2010/047257、US2009/036431、US2011/0256157、WO2011/130598)。ADC的非限制示例性PBD二聚體組分具有式A：及其鹽和溶劑化物，其中：波浪線表示與接頭的共價(jià)連接位點(diǎn)；虛線表示C1和C2或C2和C3之間任選存在的雙鍵；R2獨(dú)立地選自H、OH、＝O、＝CH2、CN、R、OR、＝CH-RD、＝C(RD)2、O-SO2-R、CO2R和COR，并且任選地還選自鹵代或二鹵代，其中RD獨(dú)立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H和鹵代；R6和R9獨(dú)立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和鹵代；R7獨(dú)立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和鹵代；Q獨(dú)立地選自O(shè)、S和NH；R11為H或R或，其中Q為O、SO3M，其中M為金屬陽離子；R和R’各自獨(dú)立地選自任選地取代的C1-8烷基、C1-12烷基、C3-8雜環(huán)基、C3-20雜環(huán)和C5-20芳基基團(tuán)，并且任選地就基團(tuán)NRR’而言，R和R’連同與其連接的氮原子一起形成任選地取代的4-、5-、6-或7-元雜環(huán)；R12、R16、R19和R17分別如R2、R6、R9和R7所定義；R″是C3-12亞烷基基團(tuán)，該鏈被一個(gè)或多個(gè)雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)和/或芳環(huán)(例如，苯或吡啶)打斷，所述環(huán)任選地被取代；并且X和X’獨(dú)立地選自O(shè)、S和N(H)。在一些實(shí)施方案中，R和R’各自獨(dú)立地選自任選地取代的C1-12烷基、C3-20雜環(huán)和C5-20芳基基團(tuán)，并且任選地與基團(tuán)NRR’相關(guān)，R和R’連同與其連接的氮原子一起形成任選地取代的4-、5-、6-或7-元雜環(huán)。在一些實(shí)施方案中，R9和R19為H。在一些實(shí)施方案中，R6和R16為H。在一些實(shí)施方案中，R7和R17均為OR7A，其中R7A為任選地取代的C1-4烷基。在一些實(shí)施方案中，R7A為Me。在一些實(shí)施方案中，R7A為Ch2Ph，其中Ph為苯基基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，X為O。在一些實(shí)施方案中，R11為H。在一些實(shí)施方案中，在每個(gè)單體單元中在C2和C3之間存在雙鍵。在一些實(shí)施方案中，R2和R12獨(dú)立地選自H和R。在一些實(shí)施方案中，R2和R12獨(dú)立地為R。在一些實(shí)施方案中，R2和R12獨(dú)立地為任選取代的C5-20芳基或C5-7芳基或C8-10芳基。在一些實(shí)施方案中，R2和R12獨(dú)立地為任選取代的苯基、噻吩基、萘基、吡啶基、喹啉基或異喹啉基。在一些實(shí)施方案中，R2和R12獨(dú)立地選自＝O、＝CH2、＝CH-RD和＝C(RD)2。在一些實(shí)施方案中，R2和R12各自為＝CH2。在一些實(shí)施方案中，R2和R12各自為H。在一些實(shí)施方案中，R2和R12各自為＝O。在一些實(shí)施方案中，R2和R12各自為＝CF2。在一些實(shí)施方案中，R2和/或R12獨(dú)立地為＝C(RD)2。在一些實(shí)施方案中，R2和/或R12獨(dú)立地為＝CH-RD。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)R2和/或R12為＝CH-RD時(shí)，每個(gè)基團(tuán)可獨(dú)立地具有下文所示的構(gòu)型：在一些實(shí)施方案中，＝CH-RD呈構(gòu)型(I)。在一些實(shí)施方案中，R″為C3亞烷基基團(tuán)或C5亞烷基基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，ADC的示例性PBD二聚體組分具有式A(I)的結(jié)構(gòu)：其中n為0或1。在一些實(shí)施方案中，ADC的示例性PBD二聚體組分具有式A(II)的結(jié)構(gòu)：其中n為0或1。在一些實(shí)施方案中，ADC的示例性PBD二聚體組分具有式A(III)的結(jié)構(gòu)：其中RE和RE”各自獨(dú)立地選自H或RD，其中RD如上文所定義；并且其中n為0或1。在一些實(shí)施方案中，n為0。在一些實(shí)施方案中，n為1。在一些實(shí)施方案中，RE和/或RE”為H。在一些實(shí)施方案中，RE和RE”為H。在一些實(shí)施方案中，RE和/或RE”為RD，其中RD為任選地取代的C1-12烷基。在一些實(shí)施方案中，RE和/或RE”為RD，其中RD為甲基。在一些實(shí)施方案中，ADC的示例性PBD二聚體組分具有式A(IV)的結(jié)構(gòu)：其中Ar1和Ar2各自獨(dú)立地為任選取代的C5-20芳基，其中Ar1和Ar2可以相同或不同；并且其中n為0或1。在一些實(shí)施方案中，ADC的示例性PBD二聚體組分具有式A(V)的結(jié)構(gòu)：其中Ar1和Ar2各自獨(dú)立地為任選取代的C5-20芳基，其中Ar1和Ar2可以相同或不同；并且其中n為0或1。在一些實(shí)施方案中，Ar1和Ar2各自獨(dú)立地選自任選取代的苯基、呋喃基、苯硫基和吡啶基。在一些實(shí)施方案中，Ar1和Ar2各自獨(dú)立地為任選取代的苯基。在一些實(shí)施方案中，Ar1和Ar2各自獨(dú)立地為任選取代的噻吩-2-基和噻吩-3-基。在一些實(shí)施方案中，Ar1和Ar2各自獨(dú)立地為任選取代的喹啉基或異喹啉基。喹啉基或異喹啉基基團(tuán)可通過任何可用的環(huán)位置鍵合到PBD核。例如，喹啉基可以為喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基和喹啉-8-基。在一些實(shí)施方案中，喹啉基選自喹啉-3-基和喹啉-6-基。異喹啉基可以為異喹啉-1-基、異喹啉-3-基、異喹啉-4基、異喹啉-5-基、異喹啉-6-基、異喹啉-7-基和異喹啉-8-基。在一些實(shí)施方案中，異喹啉基選自異喹啉-3-基和異喹啉-6-基。ADC的另外的非限制示例性PBD二聚體組分具有式B：及其鹽和溶劑化物，其中：波浪線表示與接頭的共價(jià)連接位點(diǎn)；連接到OH的波浪線表示S或R構(gòu)型；RV1和RV2獨(dú)立地選自H、甲基、乙基和苯基(所述苯基可任選地被氟代取代，尤其是在4位置)以及C5-6雜環(huán)基；其中RV1和RV2可以相同或不同；并且n為0或1。在一些實(shí)施方案中，RV1和RV2獨(dú)立地選自H、苯基和4-氟苯基。在一些實(shí)施方案中，接頭可連接在PBD二聚體藥物部分的各個(gè)位點(diǎn)之一，包括B環(huán)的N10亞胺、C環(huán)的C-2內(nèi)/外位置或連接A環(huán)的栓系單元(參見以下結(jié)構(gòu)C(I)和C(II))。ADC的非限制示例性PBD二聚體組分包括式C(I)和C(II)：式C(I)和C(II)以其N10-C11亞胺形式顯示。示例性PBD藥物部分還包括甲醇胺以及受保護(hù)的甲醇胺形式，如下表中所示：其中：X為CH2(n＝1至5)、N或O；Z和Z’獨(dú)立地選自O(shè)R和NR2，其中R為含有1至5個(gè)碳原子的伯、仲或叔烷基鏈；R1、R’1、R2和R’2各自獨(dú)立地選自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括取代的芳基)、C5-20雜芳基基團(tuán)、–NH2、-NHMe、-OH和-SH，其中在一些實(shí)施方案中，烷基、烯基和炔基鏈包含最多5個(gè)碳原子；R3和R’3獨(dú)立地選自H、OR、NHR和NR2，其中R為含有1至5個(gè)碳原子的伯、仲或叔烷基鏈；R4和R’4獨(dú)立地選自H、Me和OMe；R5選自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括被鹵代、硝基、氰基、烷氧基、烷基、雜環(huán)基取代的芳基)和C5-20雜芳基基團(tuán)，其中在一些實(shí)施方案中，烷基、烯基和炔基鏈包含最多5個(gè)碳原子；R11為H、C1-C8烷基或保護(hù)基團(tuán)(例如，乙酰基、三氟乙?；?、叔丁氧羰基(BOC)、芐氧羰基(CBZ)和9-芴基亞甲基氧基羰基(Fmoc)或包含自我犧牲單元的部分例如纈氨酸-瓜氨酸-PAB)；R12為H、C1-C8烷基或保護(hù)基團(tuán)；其中R1、R’1、R2、R’2、R5或R12之一的氫或A環(huán)之間的–OCH2CH2(X)nCH2CH2O-間隔基的氫被連接到ADC的接頭的鍵取代。ADC的示例性PDB二聚體部分包括但不限于(波浪線表示與接頭的共價(jià)連接位點(diǎn))：PBD二聚體；包含PBD二聚體的另外的非限制示例性ADC可通過將單甲基二硫化物N10-連接的PBD(下文所示)偶聯(lián)到以下抗體而制備：以產(chǎn)生單甲基二硫化物N10-連接的PBD抗體-藥物偶聯(lián)物：PBD二聚體-馬來酰亞胺-乙縮醛的接頭是酸不穩(wěn)定的。PBD二聚體和包含PBD二聚體的ADC可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備。參見例如WO2009/016516、US2009/304710、US2010/047257、US2009/036431、US2011/0256157、WO2011/130598。(5)蒽環(huán)類在一些實(shí)施方案中，ADC包含蒽環(huán)。蒽環(huán)類是表現(xiàn)出細(xì)胞毒性活性的抗生素化合物。雖然不希望受任何特定理論的束縛，但是研究已表明蒽環(huán)類可通過許多不同的機(jī)理發(fā)揮作用來殺死細(xì)胞，這些機(jī)理包括：1)藥物分子插入細(xì)胞DNA，從而抑制DNA依賴性核酸合成；2)藥物產(chǎn)生自由基，其然后與細(xì)胞大分子反應(yīng)而導(dǎo)致對細(xì)胞的損傷，和/或3)藥物分子與細(xì)胞膜的相互作用(參見例如C.Peterson等,“TransportAndStorageOfAnthracyclineInExperimentalSystemsAndHumanLeukemia”,AnthracyclineAntibioticsInCancerTherapy；N.R.Bachur,“FreeRadicalDamage”同上，第97-102頁)。由于它們的細(xì)胞毒性的潛力，蒽環(huán)類已用于治療許多癌癥，例如白血病、乳腺癌、肺癌、卵巢腺癌和肉瘤(參見例如P.H-Wiernik,Anthracycline:CurrentStatusAndNewDevelopments第11頁)。非限制示例性蒽環(huán)類包括多柔比星、表柔比星、伊達(dá)比星、正定霉素、奈莫柔比星及其衍生物。已制備了柔紅霉素和多柔比星的免疫偶聯(lián)物和前藥并進(jìn)行了研究(Kratz等(2006)CurrentMed.Chem.13:477-523；Jeffrey等(2006)Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362；Torgov等(2005)Bioconj.Chem.16:717-721；Nagy等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834；Dubowchik等(2002)Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532；King等(2002)J.Med.Chem.45:4336-4343；EP0328147；US6630579)?？贵w-藥物偶聯(lián)物BR96-多柔比星與腫瘤相關(guān)抗原Lewis-Y特異性反應(yīng)，并且已在I和II期研究中進(jìn)行了評估(Saleh等(2000)J.Clin.Oncology18:2282-2292；Ajani等(2000)CancerJour.6:78-81；Tolcher等(1999)J.Clin.Oncology17:478-484)。PNU-159682是奈莫柔比星的強(qiáng)效代謝物(或衍生物)(Quintieri等(2005)ClinicalCancerResearch11(4):1608-1617)。奈莫柔比星是多柔比星的半合成類似物，在多柔比星的糖苷氨基上具有2-甲氧基嗎啉代基團(tuán)，并且已進(jìn)行了臨床評估(Grandi等(1990)CancerTreat.Rev.17:133；Ripamonti等(1992)Brit.J.Cancer65:703)，包括肝細(xì)胞癌II/III期試驗(yàn)(Sun等(2003)ProceedingsoftheAmericanSocietyforClinicalOncology22,摘要1448；Quintieri(2003)ProceedingsoftheAmericanAssociationofCancerResearch,44:第1版,摘要4649；Pacciarini等(2006)Jour.Clin.Oncology24:14116)。包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物的非限制示例性ADC以式Ia示出：其中R1為氫原子、羥基或甲氧基基團(tuán)并且R2為C1-C5烷氧基基團(tuán)或其藥學(xué)上可接受的鹽；L1和Z一起為如本文所述的接頭(L)；T為如本文所述的抗體(Ab)；并且m為1至約20。在一些實(shí)施方案中，m為1至10、1至7、1至5或1至4。在一些實(shí)施方案中，R1和R2均為甲氧基(-OMe)。包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物的另一非限制示例性ADC以式Ib示出：其中R1為氫原子、羥基或甲氧基基團(tuán)并且R2為C1-C5烷氧基基團(tuán)或其藥學(xué)上可接受的鹽；L2和Z一起為如本文所述的接頭(L)；T為如本文所述的抗體(Ab)；并且m為1至約20。在一些實(shí)施方案中，m為1至10、1至7、1至5或1至4。在一些實(shí)施方案中，R1和R2均為甲氧基(-OMe)。在一些實(shí)施方案中，含奈莫柔比星的ADC的奈莫柔比星組分為PNU-159682。在一些此類實(shí)施方案中，ADC的藥物部分可具有以下結(jié)構(gòu)之一：其中波浪線表示與接頭(L)的連接。包括PNU-159682的蒽環(huán)類可通過若干連接位點(diǎn)和多種接頭(US2011/0076287、WO2009/099741、US2010/0034837、WO2010/009124)(包括本文所述的接頭)偶聯(lián)至抗體。包含奈莫柔比星和接頭的示例性ADC包括但不限于：PNU-159682馬來酰亞胺乙縮醛-Ab；PNU-159682-馬來酰亞胺-Ab。PNU-159682馬來酰亞胺乙縮醛-Ab的接頭為酸不穩(wěn)定的。(6)其他藥物部分藥物部分還包括格爾德霉素(Mandler等(2000)J.Nat.CancerInst.92(19):1573-1581；Mandler等(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters10:1025-1028；Mandler等(2002)BioconjugateChem.13:786-791)；以及酶活性毒素及其片段，包括但不限于白喉A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)蛋白、香石竹(dianthin)蛋白、美洲商陸(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制劑、麻風(fēng)樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥阜草(sapaonariaofficinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孢菌毒烯(tricothecene)。參見例如WO93/21232。藥物部分還包括具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切酶)。在某些實(shí)施方案中，免疫偶聯(lián)物可包含高放射性原子。多種放射性同位素可用于制備放射偶聯(lián)的抗體。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和LU的放射性同位素。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)將免疫偶聯(lián)物用于檢測時(shí)，其可包含放射性原子以用于閃爍掃描研究(scintigraphicstudy)，例如Tc99或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像，MRI)的自旋標(biāo)記物，例如鋯-89、碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。鋯-89可與各種金屬螯合劑絡(luò)合并且偶聯(lián)于抗體例如以用于PET成像(WO2011/056983)。放射性標(biāo)記或其他標(biāo)記可以已知方式并入免疫偶聯(lián)物中。例如，肽可經(jīng)生物合成或使用包含例如一個(gè)或多個(gè)氟-19原子來替代一個(gè)或多個(gè)氫的合適的氨基酸前體化學(xué)合成。在一些實(shí)施方案中，例如Tc99、I123、Re186、Re188和In111的標(biāo)記可經(jīng)由抗體中的半胱氨酸殘基來連接。在一些實(shí)施方案中，釔-90可經(jīng)由抗體的賴氨酸殘基連接。在一些實(shí)施方案中，IODOGEN方法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57可用于將碘-123并入。"MonoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphy"(Chatal,CRCPress1989)描述了某些其他方法。在某些實(shí)施方案中，免疫偶聯(lián)物可包含偶聯(lián)到前藥活化酶的抗體。在一些此類實(shí)施方案中，前藥活化酶將前藥(例如，肽基化療劑，參見WO81/01145)轉(zhuǎn)化成活性藥物，諸如抗癌藥物。此類免疫偶聯(lián)物在一些實(shí)施方案中可用于抗體依賴性酶介導(dǎo)前藥療法(“ADEPT”)?？膳悸?lián)于抗體的酶包括但不限于堿性磷酸酶，其適用于將含磷酸酯的前藥轉(zhuǎn)化成游離藥物；芳基硫酸酯酶，其適用于將含硫酸酯的前藥轉(zhuǎn)化成游離藥物；胞嘧啶脫氨酶，其適用于將無毒5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化成抗癌藥物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，例如沙雷氏菌(serratia)蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、羧基肽酶和組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B和L)，其適用于將含肽前藥轉(zhuǎn)化成游離藥物；D-丙氨酰基羧基肽酶，其適用于轉(zhuǎn)化含有D-氨基酸取代基的前藥；碳水化合物裂解酶，例如β-半乳糖苷酶(galactosidase)和神經(jīng)氨酸酶，其適用于將糖基化前藥轉(zhuǎn)化成游離藥物；β-內(nèi)酰胺酶，其適用于將用β-內(nèi)酰胺衍生化的藥物轉(zhuǎn)化成游離藥物；和青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶和青霉素G酰胺酶，其適用于將在其胺氮處分別用苯氧乙酰基或苯基乙?；苌乃幬镛D(zhuǎn)化成游離藥物。在一些實(shí)施方案中，酶可通過本領(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)共價(jià)鍵合到抗體。參見例如Neuberger等,Nature312:604-608(1984)。c)藥物負(fù)載量藥物負(fù)載量由p，即式I分子中每個(gè)抗體的藥物部分的平均數(shù)表示。藥物負(fù)載量可在每個(gè)抗體1至20個(gè)藥物部分(D)的范圍內(nèi)。式I的ADC包括偶聯(lián)有一定范圍(1至20個(gè))的藥物部分的抗體的集合。由偶聯(lián)反應(yīng)獲得的ADC制劑中每個(gè)抗體的藥物部分的平均數(shù)可通過例如質(zhì)譜法、ELISA分析和HPLC的常規(guī)手段表征。還可測定根據(jù)p的ADC定量分布。在一些情況下，可通過例如反相HPLC或電泳的手段從具有其他藥物負(fù)載量的ADC分離、純化和表征其中p為某一數(shù)值的均質(zhì)ADC。對于一些抗體-藥物偶聯(lián)物，p可受限于抗體上連接位點(diǎn)的數(shù)目。例如，當(dāng)連接為如以上某些示例性實(shí)施方案中的半胱氨酸硫醇時(shí)，抗體可僅具有一個(gè)或若干個(gè)半胱氨酸硫醇基團(tuán)，或可僅具有一個(gè)或若干個(gè)可借以連接接頭的具有足夠反應(yīng)性的硫醇基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，較高藥物負(fù)載量(例如p>5)可導(dǎo)致某些抗體-藥物偶聯(lián)物的聚集、不溶、毒性或細(xì)胞滲透性損失。在某些實(shí)施方案中，ADC的平均藥物負(fù)載量在1至約8、約2至約6或約3至約5的范圍內(nèi)。實(shí)際上，已顯示對于某些ADC，每個(gè)抗體的藥物部分的最佳比率可小于8，并且可為約2至約5(US7498298)。在某些實(shí)施方案中，使少于理論最大值的藥物部分在偶聯(lián)反應(yīng)期間偶聯(lián)至抗體?？贵w可含有例如不與如下論述的藥物-接頭中間體或接頭試劑反應(yīng)的賴氨酸殘基。一般而言，抗體不含有許多可連接到藥物部分的游離和反應(yīng)性半胱氨酸硫醇基團(tuán)；實(shí)際上，抗體中的大多數(shù)半胱氨酸硫醇?xì)埢远驑蛐问酱嬖凇Ｔ谀承?shí)施方案中，抗體可用諸如二硫蘇糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)的還原劑在部分或完全還原條件下還原以產(chǎn)生反應(yīng)性半胱氨酸硫醇基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，使抗體經(jīng)受變性條件以顯示反應(yīng)性親核基團(tuán)，例如賴氨酸或半胱氨酸。ADC的負(fù)載量(藥物/抗體比率)可以不同方式并且例如通過以下方面加以控制：(i)限制藥物-接頭中間體或接頭試劑相對于抗體的摩爾過量，(ii)限制偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)間或溫度，和(iii)部分或限制用于半胱氨酸硫醇改性的還原性條件。應(yīng)當(dāng)理解當(dāng)多于一個(gè)親核基團(tuán)與藥物-接頭中間體或接頭試劑反應(yīng)時(shí)，則所得產(chǎn)物為分布有一個(gè)或多個(gè)連接至抗體的藥物部分的ADC化合物的混合物。每個(gè)抗體的藥物的平均數(shù)可通過對抗體具有特異性并且對藥物具有特異性的雙重ELISA抗體分析從混合物計(jì)算?？赏ㄟ^質(zhì)譜法鑒別混合物中的個(gè)別ADC分子并且通過HPLC(例如疏水性相互作用色譜法)分離(參見例如McDonagh等(2006)Prot.Engr.Design&Selection19(7):299-307；Hamblett等(2004)Clin.CancerRes.10:7063-7070；Hamblett,K.J.等“Effectofdrugloadingonthepharmacology,pharmacokinetics,andtoxicityofananti-CD30antibody-drugconjugate,”文摘號624,AmericanAssociationforCancerResearch,2004年年度會議,2004年3月27-31日,ProceedingsoftheAACR,第45卷,2004年3月；Alley,S.C.等“Controllingthelocationofdrugattachmentinantibody-drugconjugates,”文摘號627,AmericanAssociationforCancerResearch,2004年年度會議,2004年3月27-31日,ProceedingsoftheAACR,第45卷,2004年3月)。在某些實(shí)施方案中，具有單一負(fù)載量值的均質(zhì)ADC可通過電泳或色譜法從偶聯(lián)混合物分離。d)某些制備免疫偶聯(lián)物的方法式I的ADC可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)、條件和試劑，通過若干途徑制備，包括：(1)使抗體的親核基團(tuán)與二價(jià)接頭試劑反應(yīng)以經(jīng)共價(jià)鍵形成Ab-L，隨后與藥物部分D反應(yīng)；和(2)使藥物部分的親核基團(tuán)與二價(jià)接頭試劑反應(yīng)以經(jīng)共價(jià)鍵形成D-L，隨后與抗體的親核基團(tuán)反應(yīng)?？贵w上的親核基團(tuán)包括但不限于：(i)N末端胺基團(tuán)，(ii)側(cè)鏈胺基團(tuán)，例如賴氨酸，(iii)側(cè)鏈硫醇基團(tuán)，例如半胱氨酸，和(iv)糖羥基或氨基基團(tuán)(在抗體經(jīng)糖基化的情況下)。氨、硫醇和羥基基團(tuán)具有親核性并且能夠與包括以下的接頭部分和接頭試劑上的親電子基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯和酸鹵化物；(ii)烷基和苯甲基鹵化物，例如鹵代乙酰胺；和(iii)醛、酮、羧基和馬來酰亞胺基團(tuán)。某些抗體具有可還原性鏈間二硫化物，即半胱氨酸橋?？赏ㄟ^用例如DTT(二硫蘇糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)的還原劑處理以使抗體完全或部分還原來使抗體具有用于與接頭試劑偶聯(lián)的反應(yīng)性。各半胱氨酸橋因此將在理論上形成兩個(gè)反應(yīng)性硫醇親核體。另外的親核基團(tuán)可通過修飾賴氨酸殘基，例如通過使賴氨酸殘基與2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷(特勞特氏試劑(Traut'sreagent))反應(yīng)，從而使得胺轉(zhuǎn)化成硫醇，而引入抗體中。反應(yīng)性硫醇基團(tuán)也可通過引入一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)半胱氨酸殘基而引入抗體中(例如通過制備包含一個(gè)或多個(gè)非天然半胱氨酸氨基酸殘基的變體抗體來實(shí)現(xiàn))。本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物也可通過抗體上的親電子基團(tuán)(諸如醛或酮羰基基團(tuán))與接頭試劑或藥物上的親核基團(tuán)之間的反應(yīng)來產(chǎn)生。接頭試劑上的適用親核基團(tuán)包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、胺苯硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾抗體以引入能夠與接頭試劑或藥物上的親核取代基反應(yīng)的親電子部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，糖基化抗體的糖可例如用過碘酸鹽氧化試劑氧化以形成可與接頭試劑或藥物部分的胺基團(tuán)反應(yīng)的醛或酮基團(tuán)。所得的亞胺希夫堿(Schiffbase)基團(tuán)可形成穩(wěn)定鍵，或可例如通過硼氫化物試劑還原以形成穩(wěn)定胺鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖基化抗體的碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉的反應(yīng)可在抗體中產(chǎn)生可與藥物上的適當(dāng)基團(tuán)反應(yīng)的羰基(醛和酮)基團(tuán)(Hermanson,BioconjugateTechniques)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，含有N末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的抗體可與偏高碘酸鈉反應(yīng)，從而產(chǎn)生醛來替代第一氨基酸(Geoghegan&Stroh,(1992)BioconjugateChem.3:138-146；US5362852)?？墒惯@種醛與藥物部分或接頭親核體反應(yīng)。藥物部分上的示例性親核基團(tuán)包括但不限于：胺、硫醇、羥基、酰肼、肟、肼、胺苯硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基團(tuán)，其能夠與包括以下的接頭部分和接頭試劑上的親電子基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯和酸鹵化物；(ii)烷基和苯甲基鹵化物，例如鹵代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和馬來酰亞胺基團(tuán)?？捎糜谥苽銩DC的非限制示例性交聯(lián)劑試劑在本文中描述于標(biāo)題為“示例性接頭”的章節(jié)中。使用此類交聯(lián)劑試劑來連接兩個(gè)部分(包括蛋白質(zhì)部分和化學(xué)部分)的方法在本領(lǐng)域是已知的。在一些實(shí)施方案中，可例如通過重組技術(shù)或肽合成來制備包含抗體和細(xì)胞毒性劑的融合蛋白。重組DNA分子可包含編碼偶聯(lián)物的抗體和細(xì)胞毒性部分的區(qū)域，所述區(qū)域彼此鄰近或由編碼不破壞偶聯(lián)物的所需特性的接頭肽的區(qū)域分開。在又一個(gè)實(shí)施方案中，抗體可偶聯(lián)至"受體"(諸如鏈霉親和素)以用于腫瘤預(yù)靶向中，其中向患者施用抗體-受體偶聯(lián)物，隨后使用清除劑從循環(huán)中移除未結(jié)合的偶聯(lián)物，接著施用偶聯(lián)于細(xì)胞毒性劑(例如藥物或放射性核苷酸)的"配體"(例如，抗生物素蛋白)。E.用于診斷和檢測的方法和組合物在某些實(shí)施方案中，本文提供的任何抗GPC3抗體都適用于檢測生物樣本中GPC3的存在。如本文所用的術(shù)語"檢測"涵蓋定量或定性檢測。"生物樣本"包括例如細(xì)胞或組織(例如，活檢材料，包括癌性或潛在癌性皮膚淋巴組織，例如淋巴細(xì)胞、淋巴母細(xì)胞、單核細(xì)胞、骨髓單核細(xì)胞以及它們的混合物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種用于診斷或檢測方法的抗GPC3抗體。在另一個(gè)方面，提供一種檢測生物樣本中GPC3的存在的方法。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括使生物樣本與如本文所述的抗GPC3抗體在允許所述抗GPC3抗體結(jié)合GPC3的條件下接觸，和檢測在所述抗GPC3抗體與所述生物樣本中的GPC3之間是否形成復(fù)合物。這樣的方法可以是體外或體內(nèi)方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗GPC3抗體用于選擇適于用抗GPC3抗體進(jìn)行的療法的受試者，例如當(dāng)GPC3為用于選擇患者的生物標(biāo)記物時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物樣本為細(xì)胞或組織。在另一個(gè)實(shí)施方案中，例如出于診斷、預(yù)測或分級癌癥，確定適當(dāng)?shù)寞煶蹋虮O(jiān)測癌癥對療法的反應(yīng)的目的，在體內(nèi)使用抗GPC3抗體例如通過體內(nèi)成像來檢測受試者中的GPC3陽性癌癥。本領(lǐng)域已知的一種用于體內(nèi)檢測的方法為免疫正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)(免疫PET)，如例如在vanDongen等,TheOncologist12:1379-1389(2007)和Verel等,J.Nucl.Med.44:1271-1281(2003)中所述。在此類實(shí)施方案中，提供一種用于檢測受試者中的GPC3陽性癌癥的方法，所述方法包括向患有或疑似患有GPC3陽性癌癥的個(gè)體施用經(jīng)標(biāo)記的抗GPC3抗體，和檢測所述受試者中所述經(jīng)標(biāo)記的抗GPC3抗體，其中檢測出所述經(jīng)標(biāo)記的抗GPC3抗體指示所述受試者中的GPC3陽性癌癥。在某些此類實(shí)施方案中，經(jīng)標(biāo)記的抗GPC3抗體包括偶聯(lián)于例如68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr和124I的正電子發(fā)射體的抗GPC3抗體。在具體實(shí)施方案中，正電子發(fā)射體為89Zr。在另外的實(shí)施方案中，診斷或檢測方法包括使固定于基質(zhì)的第一抗GPC3抗體與待測試GPC3的存在的生物樣本接觸，使所述基質(zhì)暴露于第二抗GPC3抗體，和檢測所述第二抗GPC3是否結(jié)合至所述第一抗GPC3抗體與所述生物樣本中的GPC3之間的復(fù)合物?；|(zhì)可以是任何支撐性介質(zhì)，例如玻璃、金屬、陶瓷、聚合珠粒、載片、芯片和其他基質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，生物樣本包包括細(xì)胞或組織。在某些實(shí)施方案中，第一或第二抗GPC3抗體為本文所述的任何抗體?？筛鶕?jù)上述實(shí)施方案中的任一個(gè)診斷或檢測的示例性病癥包括但不限于GPC3陽性癌癥，例如GPC3陽性肝癌、GPC3陽性肝細(xì)胞癌、GPC3陽性胰腺癌、GPC3陽性肺癌、GPC3陽性結(jié)腸癌、GPC3陽性乳腺癌、GPC3陽性前列腺癌、GPC3陽性白血病和GPC3陽性淋巴瘤。在一些實(shí)施方案中，GPC陽性癌癥為肝癌。在一些實(shí)施方案中，GPC陽性癌癥為肝細(xì)胞癌。在一些實(shí)施方案中，GPC3陽性癌癥為得到大于“0”的抗GPC3免疫組織化學(xué)(IHC)或原位雜交(ISH)評分的癌癥，其對應(yīng)于>90％的腫瘤細(xì)胞中非常弱的染色或無染色。在另一個(gè)實(shí)施方案中，GPC3陽性癌癥在1+、2+或3+級下表達(dá)GPC3。在一些實(shí)施方案中，GPC3陽性癌癥為根據(jù)檢測GPC3mRNA的逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)分析，表達(dá)GPC3的癌癥。在一些實(shí)施方案中，RT-PCR為定量RT-PCR。在某些實(shí)施方案中，提供經(jīng)標(biāo)記的抗GPC3抗體。標(biāo)記包括但不限于直接檢測的標(biāo)記或部分(例如熒光標(biāo)記、發(fā)色標(biāo)記、電子密集標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記和放射性標(biāo)記)以及例如通過酶促反應(yīng)或分子相互作用間接檢測的部分，例如酶或配體。示例性標(biāo)記包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I、熒光團(tuán)(例如稀土螯合物或熒光素及其衍生物)、若丹明及其衍生物、丹?；?、傘形酮、熒光素酶(例如螢火蟲熒光素酶和細(xì)菌熒光素酶(美國專利No.4,737,456))、熒光素、2,3-二氫呔嗪二酮、辣根過氧化酶(HRP)、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、與采用過氧化氫以氧化染料前體的酶(例如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)偶合的雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶(uricase)和黃嘌呤氧化酶)、生物素/抗生物素蛋白、自旋標(biāo)記、噬菌體標(biāo)記、穩(wěn)定自由基等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記為正電子發(fā)射體。正電子發(fā)射體包括但不限于68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr和124I。在具體實(shí)施方案中，正電子發(fā)射體為89Zr。F.藥物制劑如本文所述的抗GPC3抗體或免疫偶聯(lián)物的藥物制劑是通過混合具有所需純度的此類抗體或免疫偶聯(lián)物與一種或多種任選的藥學(xué)上可接受的載體(Remington'sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.編(1980))以凍干制劑或水溶液形式來制備。藥學(xué)上可接受的載體通常在所用劑量和濃度下對接受者無毒，并且包括但不限于：緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨；芐索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子，例如鈉；金屬絡(luò)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)；和/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性藥學(xué)上可接受的載體進(jìn)一步包括間質(zhì)藥物分散劑，例如可溶性中性-活性透明質(zhì)酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明質(zhì)酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(BaxterInternational,Inc.)。某些示例性sHASEGP(包括rHuPH20)和使用方法在美國專利公布No.2005/0260186和2006/0104968中有所描述。在一個(gè)方面，sHASEGP與一種或多種另外的葡糖胺聚糖酶諸如軟骨素酶組合。示例性凍干抗體或免疫偶聯(lián)物制劑在美國專利No.6,267,958中有所描述。水性抗體或免疫偶聯(lián)物制劑包括美國專利No.6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后述制劑包含組氨酸-乙酸鹽緩沖劑。本文的制劑也可含有多于一種為所治療的特定適應(yīng)癥所必需的活性成分，優(yōu)選為具有不會不利地影響彼此的互補(bǔ)活性的那些活性成分?；钚猿煞挚砂裨诶缤ㄟ^凝聚技術(shù)或通過界面聚合所制備的微囊中，例如分別于膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米囊)中或于巨乳液中的羥甲基纖維素或明膠-微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊。此類技術(shù)公開于Remington'sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.編(1980)。可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的適合例子包括含有抗體或免疫偶聯(lián)物的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)呈成型物品例如薄膜或微囊的形式。欲用于體內(nèi)施用的制劑通常是無菌的。無菌性可易于例如通過經(jīng)無菌過濾膜過濾來實(shí)現(xiàn)。G.治療方法和組合物本文提供的任何抗GPC3抗體或免疫偶聯(lián)物可用在例如治療方法的方法中。在一方面，本文提供的抗GPC3抗體或免疫偶聯(lián)物用于抑制GPC3陽性細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括在允許所述抗GPC3抗體或免疫偶聯(lián)物結(jié)合該細(xì)胞的表面上的GPC3的條件下使所述細(xì)胞暴露于所述抗GPC3抗體或免疫偶聯(lián)物，從而抑制所述細(xì)胞的增殖。在某些實(shí)施方案中，所述方法為體外或體內(nèi)方法。在另外的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為淋巴細(xì)胞、淋巴母細(xì)胞、單核細(xì)胞或骨髓單核細(xì)胞?？墒褂每蓮腜romega(Madison,WI)購得的CellTiter-GloTM發(fā)光細(xì)胞活力分析來分析體外細(xì)胞增殖的抑制。該分析基于對所存在的ATP的定量來測定培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)，ATP為具有代謝活性的細(xì)胞的指示。參見Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88，美國專利No.6602677。分析可以96或384孔形式進(jìn)行，從而使得可經(jīng)受自動高通量篩選(HTS)。參見Cree等(1995)AntiCancerDrugs6:398-404。分析程序涉及向培養(yǎng)細(xì)胞中直接添加單一試劑(CellTiter-試劑)。這導(dǎo)致細(xì)胞溶解和生成通過熒光素酶反應(yīng)所產(chǎn)生的發(fā)光信號。發(fā)光信號與存在的ATP的量成比例，存在的ATP的量與培養(yǎng)物中存在的活細(xì)胞數(shù)成正比。數(shù)據(jù)可由光度計(jì)或CCD相機(jī)成像裝置記錄。發(fā)光輸出表示為相對光單位(RLU)。在另一個(gè)方面，提供一種用作藥劑的抗GPC3抗體或免疫偶聯(lián)物。在另外的方面，提供一種用于治療方法的抗GPC3抗體或免疫偶聯(lián)物。在某些實(shí)施方案中，提供一種用于治療GPC3陽性癌癥的抗GPC3抗體或免疫偶聯(lián)物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于治療患有GPC3陽性癌癥的個(gè)體的方法中的抗GPC3抗體或免疫偶聯(lián)物，所述方法包括向所述個(gè)體施用有效量的所述抗GPC3抗體或免疫偶聯(lián)物。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括向個(gè)體施用有效量的至少一種例如如下所述的另外治療劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供抗GPC3抗體或免疫偶聯(lián)物用于制造或制備藥劑的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥劑用于治療GPC3陽性癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥劑用于治療GPC3陽性癌癥的方法，所述方法包括向患有GPC3陽性癌癥的個(gè)體施用有效量的所述藥劑。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括向個(gè)體施用有效量的至少一種例如如下所述的另外治療劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于治療GPC3陽性癌癥的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括向患有此GPC3陽性癌癥的個(gè)體施用有效量的抗GPC3抗體或免疫偶聯(lián)物。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括向個(gè)體施用有效量的至少一種如下所述的另外治療劑。根據(jù)上述實(shí)施方案中任一個(gè)的GPC3陽性癌癥可以為例如GPC3陽性肝癌、GPC3陽性肝細(xì)胞癌、GPC陽性胰腺癌、GPC陽性肺癌、GPC陽性結(jié)腸癌、GPC陽性乳腺癌、GPC陽性前列腺癌、GPC陽性白血病或GPC陽性淋巴瘤。在一些實(shí)施方案中，GPC3陽性癌癥為得到大于“0”的抗GPC3免疫組織化學(xué)(IHC)或原位雜交(ISH)評分的癌癥，其對應(yīng)于>90％的腫瘤細(xì)胞中非常弱的染色或無染色。在另一個(gè)實(shí)施方案中，GPC3陽性癌癥在1+、2+或3+級下表達(dá)GPC3。在一些實(shí)施方案中，GPC3陽性癌癥為根據(jù)檢測GPC3mRNA的逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)分析，表達(dá)GPC3的癌癥。在一些實(shí)施方案中，RT-PCR為定量RT-PCR。根據(jù)上述實(shí)施方案中任一個(gè)的“個(gè)體”可以是人。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含本文提供的任何抗GPC3抗體或免疫偶聯(lián)物的例如用于任何上述治療方法中的藥物制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑包含本文提供的任何抗GPC3抗體或免疫偶聯(lián)物和藥學(xué)上可接受的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑包含本文提供的任何抗GPC3抗體或免疫偶聯(lián)物和至少一種例如如下所述的另外治療劑。本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物可單獨(dú)或與其他藥劑聯(lián)合用于療法中。例如，本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物可與至少一種另外治療劑共同施用。上述此類聯(lián)合療法涵蓋聯(lián)合施用(其中將兩種或更多種治療劑包含在相同或單獨(dú)的制劑中)和單獨(dú)施用，在此情況下，本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物的施用可在另外的治療劑和/或佐劑的施用之前、同時(shí)和/或之后進(jìn)行。本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物也可以與放射療法聯(lián)合使用。本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物(和任何另外的治療劑)可通過任何合適的手段施用，包括腸胃外、肺內(nèi)和鼻內(nèi)，以及在期望局部治療時(shí)，病灶內(nèi)施用。腸胃外輸注包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用。給藥可以通過任何合適的途徑進(jìn)行，例如，通過注射，例如靜脈內(nèi)或皮下注射，部分地取決于所述施用是短暫的還是長時(shí)的。本文考慮了包括但不限于在各種時(shí)間點(diǎn)的單次或多次施用、推注施用和脈沖輸注的各種給藥計(jì)劃。本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物將以符合良好醫(yī)療實(shí)踐的方式配制、給藥和施用。在此情形下的考慮因素包括所治療的具體病癥、所治療的具體哺乳動物、各個(gè)患者的臨床病狀、病癥的原因、藥劑遞送部位、施用方法、施用計(jì)劃和醫(yī)學(xué)從業(yè)者已知的其他因素。抗體或免疫偶聯(lián)物無需但任選地與一種或多種目前用于預(yù)防或治療所述病癥的藥劑一起配制。此類其他藥劑的有效量取決于制劑中存在的抗體或免疫偶聯(lián)物的量、病癥或治療的類型以及上文論述的其他因素。這些藥劑通常以與如本文所述相同的劑量和用如本文所述的施用途徑，或以本文所述的劑量的約1％至99％，或以憑經(jīng)驗(yàn)/臨床上確定為適當(dāng)?shù)娜魏蝿┝坎⑶彝ㄟ^憑經(jīng)驗(yàn)/臨床上確定為適當(dāng)?shù)娜魏瓮緩竭M(jìn)行使用。對于預(yù)防或治療疾病，本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物(當(dāng)單獨(dú)或與一種或多種其他另外的治療劑聯(lián)合使用時(shí))的適當(dāng)劑量將取決于待治療疾病的類型、抗體或免疫偶聯(lián)物的類型、疾病的嚴(yán)重性和病程、施用抗體或免疫偶聯(lián)物是出于預(yù)防目的還是治療目的、先前療法、患者的臨床病史和對抗體或免疫偶聯(lián)物的反應(yīng)、以及主治醫(yī)師的判斷?？贵w或免疫偶聯(lián)物適合一次性或歷經(jīng)一系列治療施用于患者。取決于疾病的類型和嚴(yán)重性，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗體或免疫偶聯(lián)物可為用于向患者施用的初始候選劑量，無論例如通過一次或多次單獨(dú)施用還是通過連續(xù)輸注。根據(jù)上文提及的因素，一種典型的每日劑量可能在約1μg/kg至100mg/kg或更多的范圍內(nèi)。對于歷經(jīng)數(shù)天或更長時(shí)間的重復(fù)施用，依據(jù)病狀，治療將通常持續(xù)直至出現(xiàn)所需的疾病癥狀抑制為止?？贵w或免疫偶聯(lián)物的一種示例性劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg的范圍內(nèi)。因此，可向患者施用約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一種或多種劑量(或其任何組合)。此類劑量可間歇施用，例如每周或每三周一次(例如以使患者接受約兩劑至約二十劑，或例如約六劑抗體)。最初可施用較高的負(fù)荷劑量，接著施用一種或多種較低劑量。然而，其他劑量方案可能適用。此療法的進(jìn)展易于通過常規(guī)技術(shù)和分析加以監(jiān)測。應(yīng)理解任何以上制劑或治療方法都可使用本發(fā)明的免疫偶聯(lián)物和抗GPC3抗體兩者進(jìn)行。H.制品在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種含有適用于治療、預(yù)防和/或診斷上述病癥的材料的制品。該制品包括容器和在該容器上或與該容器相伴的標(biāo)簽或包裝說明書。適合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、靜脈內(nèi)溶液袋等。容器可由諸如玻璃或塑料的多種材料形成。容器容納單獨(dú)的或與有效治療、預(yù)防和/或診斷病癥的另一組合物組合的組合物并且可具有無菌進(jìn)入孔(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿的塞的靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶)。組合物中的至少一種活性劑為本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物。標(biāo)簽或包裝說明書指示組合物用于治療所選病狀。此外，制品可包括(a)其中含有組合物的第一容器，其中所述組合物包含本發(fā)明的抗體或免疫偶聯(lián)物；和(b)其中含有組合物的第二容器，其中所述組合物包含另一種細(xì)胞毒性劑或另外的治療劑。本發(fā)明的該實(shí)施方案中的制品可進(jìn)一步包括指示組合物可用于治療特定病狀的包裝說明書。作為另外一種選擇或除此之外，制品可進(jìn)一步包括第二(或第三)容器，其包含藥學(xué)上可接受的緩沖劑，諸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)或右旋糖溶液。其可進(jìn)一步包括從商業(yè)和使用者觀點(diǎn)看來合乎需要的其他材料，包括其他緩沖劑、稀釋劑、過濾器、針和注射器。III.實(shí)施例以下是本發(fā)明的方法和組合物的實(shí)例。應(yīng)當(dāng)理解，鑒于上文提供的一般說明，可以實(shí)踐各種其他實(shí)施方案。實(shí)施例1：人GPC3表達(dá)使用包含基因表達(dá)信息的專利數(shù)據(jù)庫(GeneLogicInc.,Gaithersburg,MD)分析人GPC3基因表達(dá)。數(shù)據(jù)庫的圖形分析使用微陣列特征查看器進(jìn)行。圖1是各種組織中人GPC3基因表達(dá)的圖示。y-軸的比例尺表示基于雜交信號強(qiáng)度的基因表達(dá)水平。點(diǎn)出現(xiàn)在從每個(gè)所列出的組織名稱延伸的線的左側(cè)和右側(cè)。出現(xiàn)在線左側(cè)的點(diǎn)表示正常組織中的基因表達(dá)，并且出現(xiàn)在線右側(cè)的點(diǎn)表示腫瘤和患病組織中的基因表達(dá)。圖1示出了某些腫瘤或患病組織相對于其正常對應(yīng)物的GPC3基因表達(dá)增加。例如，GPC3在肝臟腫瘤和患病組織中基本上過表達(dá)。圖2示出，GPC3在肝細(xì)胞癌中基本上過表達(dá)，并且在肝硬化中稍微過表達(dá)。在正常肝臟或各種其他肝臟疾病中，GPC3均未過表達(dá)。GPC3的表達(dá)還通過來自不同分期的肝細(xì)胞癌的cDNA樣本和其他肝臟疾病的樣本的qPCR測定，所述其他肝臟疾病包括肝硬化、脂肪變性、肝炎、慢性肝炎和肝腺瘤(OriGene,Rockville,MD)。GPC3表達(dá)歸一化為RPL19。如圖3所示，GPC3在IV期肝細(xì)胞癌樣本中高表達(dá)。GPC3也在一種慢性肝炎樣本中高表達(dá)。使用該分析未在多種正常人組織中檢測到顯著的GPC3表達(dá)，所述正常人組織包括腎上腺、腦、子宮頸、結(jié)腸、附睪、食道、脂肪、心臟、小腸、顱內(nèi)動脈、腎臟、肝臟、肺、淋巴結(jié)、淋巴細(xì)胞、乳腺、肌肉、鼻粘膜、視神經(jīng)、卵巢、輸卵管、胰腺、心包膜、垂體、胎盤、前列腺、直腸、視網(wǎng)膜、精囊、皮膚、脊髓、脾、胃、睪丸、胸腺、甲狀腺、舌、扁桃體、氣管、輸尿管、膀胱、子宮、懸雍垂、陰道和腔靜脈。實(shí)施例2：單克隆抗體生成A.GPC3胞外結(jié)構(gòu)域免疫和抗體表征針對人(hu)GPC3的單克隆抗體使用以下程序通過用融合至C-末端Flag(RADYKDDDDK)(在哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá))的重組huGPC3胞外結(jié)構(gòu)域(ECD，1-547位氨基酸)免疫五只Balb/c小鼠來制備。擴(kuò)大陽性克隆，并通過ELISA、FACS和免疫組織化學(xué)(IHC)再篩選與huGPC3、cynoGPC3和HepG2細(xì)胞的結(jié)合。選擇十三個(gè)抗體并純化，包括抗體7H1和4G7?？贵w7H1的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列分別如SEQIDNO:2和3所示?？贵w4G7的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列分別如SEQIDNO:26和27所示。參見圖4A-B。通過IHC發(fā)現(xiàn)，抗體7H1與肝癌組織微陣列、JHH細(xì)胞、HepG2細(xì)胞以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GPC3的細(xì)胞強(qiáng)烈反應(yīng)，并且通過FACS發(fā)現(xiàn)，抗體7H1和4G7均與表達(dá)GPC3的HepG2X1細(xì)胞和293S細(xì)胞強(qiáng)烈反應(yīng)。圖5示出了抗體7H1的示例性FACS數(shù)據(jù)。抗體7H1還通過Western印跡檢測了人、食蟹獼猴、大鼠和小鼠GPC3。使用競爭分析進(jìn)行抗GPC3抗體的表位分倉(Epitopebinning)。使用OctetRED384儀器(ForteBio)以10μg/ml將生物素?；腉PC3捕獲于鏈親和素生物傳感器上持續(xù)600秒。通過加入10μg/ml600秒使第一抗體的結(jié)合達(dá)到飽和。將相同的生物傳感器浸入5μg/ml的競爭抗體，并測定結(jié)合600秒。在存在飽和量的第一抗體的情況下，第二抗體結(jié)合失敗表明兩個(gè)抗體處于相同的表位倉；在存在飽和量的第一抗體的情況下，第二抗體結(jié)合成功表明兩個(gè)抗體處于不同的表位倉。使用抗體7H1作為第一飽和抗體。后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用抗體4G7作為第一飽和抗體進(jìn)行?？贵w7H1和4G7存在于不同的表位倉。制備人GPC3的C-末端截短構(gòu)建體，以進(jìn)一步精制抗體7H1和4G7的表位。制備三種不同的C-末端截短，包括人GPC3的氨基酸25至137、人GPC3的氨基酸25至247和人GPC3的氨基酸25至358。三種C-末端截短中的每種均包含GPCN-末端信號序列(SS)和C-末端糖磷脂酰肌醇錨(GPI連接)。參見圖6。通過FACS發(fā)現(xiàn)，抗體7H1結(jié)合至在293S細(xì)胞表面上瞬時(shí)表達(dá)的全部三個(gè)構(gòu)建體，并且通過Western印跡發(fā)現(xiàn)，結(jié)合至全部三個(gè)構(gòu)建體。參見圖6。通過FACS未顯示抗體4G7與人GPC3的N-末端(氨基酸25-358)或C-末端(氨基酸359-560)片段顯著結(jié)合，暗示4G7的表位可跨越人GPC3的氨基酸R358/S359處的弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)。參見圖7(SantaCruzBiotechnology抗體1G12產(chǎn)生為人GPC3的氨基酸511-580，用作C-末端片段結(jié)合的陽性對照)?？贵w7H1轉(zhuǎn)型為具有人A118C半胱氨酸工程化的IgG1和Igκ恒定區(qū)的嵌合抗體(SEQIDNO:42和43)。B.GPC3截短的胞外結(jié)構(gòu)域免疫和抗體表征針對人GPC3的胞外結(jié)構(gòu)域的C-末端部分的單克隆抗體通過用編碼具有GPCN-末端信號序列(SS)和C-末端糖磷脂酰肌醇錨(GPI連接)的huGPC3氨基酸359至560的DNA免疫五只Balb/c小鼠來制備。小鼠通過每周一次水動力尾靜脈(HTV)注射50μgDNA和2.5μg小鼠GM-CSF持續(xù)7周來免疫。通過FACS從血漿篩選表達(dá)與免疫所用相同的huGPC(aa359-560)構(gòu)建體的293細(xì)胞的結(jié)合。在融合后，通過ELISA篩選十種表達(dá)結(jié)合人GPC3胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸1至560)的抗體的雜交瘤，并且通過FACS篩選表達(dá)結(jié)合huGPC(aa359-560)(在293細(xì)胞上表達(dá))的抗體的雜交瘤。使用人IgG1A118C半胱氨酸工程化的重鏈和Igκ輕鏈恒定區(qū)克隆三種抗體，包括抗體4A11和15G1?？贵w4A11的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列分別如SEQIDNO:10和11所示?？贵w15G1的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列分別如SEQIDNO:18和19所示。參見圖4A-B。制備huGPC(aa359-589)的C-末端截短構(gòu)建體，以進(jìn)一步精制抗體4A11和15G1的表位。制備三種不同的N-末端截短，包括人GPC3的氨基酸359至420、人GPC3的氨基酸359至470和人GPC3的氨基酸359至509。三種C-末端截短中的每種均包含HSVN-末端信號序列(SS)和gD序列(SEQIDNO:41)和C-末端糖磷脂酰肌醇錨(GPI連接)。參見圖8。huGPC截短構(gòu)建體在293細(xì)胞的表面上表達(dá)，并通過FACS測定抗體結(jié)合。使用抗gD作為陽性對照。使用載體轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞作為陰性對照。抗體4A11結(jié)合huGPC(aa359-559)和huGPC(aa359-509)，但不結(jié)合huGPC(aa359-470)或huGPC(aa359-420)，表明其結(jié)合至人GPC的氨基酸470至509內(nèi)的表位。參見圖9?？贵w15G1結(jié)合huGPC(aa359-559)、huGPC(aa359-509)和huGPC(aa359-470)，但不結(jié)合huGPC(aa359-420)，表明其結(jié)合至人GPC的氨基酸420至470內(nèi)的表位。參見圖9。通過FACS測試抗體15G1和4A11與293細(xì)胞表面上表達(dá)的全長N-末端gD標(biāo)記的食蟹猴GPC3和全長N-末端gD標(biāo)記的大鼠GPC3的結(jié)合。兩種抗體均結(jié)合至食蟹猴GPC3。15G1還結(jié)合至大鼠GPC3，而4A11則不結(jié)合。參見圖10。如圖11所示，15G1表位在人、食蟹猴、恒河猴、小鼠和大鼠GPC3之間是高度保守的，而4A11表位則包含一些序列變異，特別是靈長類和嚙齒類GPC3之間的序列變異。7H1表位在人、食蟹猴、恒河猴、小鼠和大鼠GPC3之間也是高度保守的，如上文所討論，通過Western印跡抗體7H1檢測人、食蟹猴、大鼠和小鼠GPC3。實(shí)施例3：單克隆抗體的內(nèi)化作用分析抗體7H1、4G7、15G1和4A11在Hep3B.2.1-7、HepG2和JHH7細(xì)胞中的內(nèi)化作用。在37℃下在2小時(shí)和20小時(shí)時(shí)，測定抗體內(nèi)化作用。在37℃下使細(xì)胞與4μg/ml抗體溫育2或20小時(shí)，或在4℃下溫育一小時(shí)。然后用PBS洗滌細(xì)胞，用4％多聚甲醛固定，并在37℃下用0.05％皂草苷透化5分鐘。然后使細(xì)胞與抗LAMPI抗體(SigmaAldrich)(作為溶酶體標(biāo)記物)在室溫下溫育一小時(shí)，洗滌，然后與抗人Cy3和抗兔Alexa488在室溫下溫育一小時(shí)。洗滌細(xì)胞，然后用封固劑封固。根據(jù)強(qiáng)度對染色進(jìn)行目測定量。在2小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，很少觀察到抗體的內(nèi)化作用。在20小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，在每個(gè)細(xì)胞系中抗體進(jìn)入溶酶體的內(nèi)化作用程度匯總于表2中。表2：抗體內(nèi)化到溶酶體中細(xì)胞系7H14A1115G14G7HepG2+/-++++++JHH7++++++++/-Hep3B.2.1-7----在20小時(shí)，N-末端結(jié)合抗體7H1顯示出與C-末端結(jié)合抗體4A11和15G1不同的內(nèi)化作用特征。預(yù)測抗體4G7結(jié)合至跨越氨基酸R358/S359處的弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)的表位，該抗體顯示出與其他抗體不同的內(nèi)化作用特征。實(shí)施例4：GPC3表達(dá)細(xì)胞系對游離的奈莫柔比星衍生物和游離的吡咯并苯二氮雜卓的靈敏度如下所述，測試各種GPC3表達(dá)細(xì)胞系對游離的奈莫柔比星衍生物PNU-159682(具有如下結(jié)構(gòu))：或游離的吡咯并苯二氮雜卓SG-2057(具有如下結(jié)構(gòu))：的靈敏度。在96孔透明底板(PerkinElmerLifeSciences)的50μl正常生長培養(yǎng)基中，在存在PNU-159682或SG-2057的情況下，使用細(xì)胞(以1000個(gè)細(xì)胞/孔接種)評估增殖。在二十四小時(shí)后，向一式三份的孔再加入50μl含系列稀釋藥物的培養(yǎng)基。在3或5天后，使用CellTiter-GloII(PromegaCorp.)和EnVision2101多標(biāo)記讀數(shù)器(PerkinElmer)測定細(xì)胞數(shù)量。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果匯總于表3中。表3：細(xì)胞系對PNU-159682和SG-2057的敏感性細(xì)胞系PNU-159682EC50SG-2057EC50293S22pM56pM293_GPC319pM34pMPC351pM122pMHep3B.2.1-742pM474pMHuh729pM147pMHepG229pM29pMJHH738pM135pMJHH531pM105pM如表3中所示，所測試的所有細(xì)胞系均對兩種藥物敏感。實(shí)施例5：抗GPC3抗體藥物偶聯(lián)物的產(chǎn)生對于較大規(guī)模的抗體產(chǎn)生，在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生抗體。將編碼VL和VH的載體轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞，并通過蛋白A親和色譜從細(xì)胞培養(yǎng)基純化IgG。通過將具有重鏈A118C突變(7H1硫代-HCA118C、4A11硫代-HCA118C、15G1硫代-HCA118C)的嵌合7H1、4A11或15G1(人IgG1/κ)偶聯(lián)至藥物接頭部分馬來酰亞胺乙縮醛PNU-159682(參見圖12A)或單甲基二硫醚N10連接的PBD(參見圖12B)，來產(chǎn)生抗GPC3抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)。在初始分離時(shí)，抗體中的工程化的半胱氨酸殘基以與細(xì)胞的硫醇(例如，谷胱甘肽)形成的混合二硫化物而存在，因此不可用于偶聯(lián)。這些抗體的部分還原(例如，使用DTT)、純化并使用脫氫抗壞血酸(DHAA)再氧化得到具有游離的半胱氨酸巰基基團(tuán)的抗體，半胱氨酸巰基基團(tuán)可用于偶聯(lián)，如上文例如Junutula等(2008)Nat.Biotechnol.26:925-932和US2011/0301334所述。簡而言之，使抗體與藥物接頭部分組合，以允許藥物接頭部分與抗體的游離的半胱氨酸殘基偶聯(lián)。在幾小時(shí)后，純化ADC。測定每個(gè)ADC的載藥量(每個(gè)抗體的藥物部分平均數(shù))，并且對于PBD偶聯(lián)物，該載藥量在1.4-1.8之間，而對于PNU偶聯(lián)物，在1.4-1.8之間。實(shí)施例6：抗GPC3抗體藥物偶聯(lián)物在HepG2X1細(xì)胞系異種移植模型中的功效使用人HepG2X1移植移植模型研究抗GPC3ADC的功效。在每只雌性C.B-17SCID小鼠(CharlesRiverLaboratories；Hollister,CA)的側(cè)腹區(qū)域皮下接種一千萬個(gè)HepG2X1細(xì)胞。當(dāng)異種移植瘤達(dá)到100-300mm3的平均腫瘤體積(稱為第0天)，將動物隨機(jī)分組，每組7-10只小鼠，并接受圖13所示劑量的單次靜脈注射ADC。在整個(gè)研究過程中每周測定小鼠的腫瘤和體重1-2次。當(dāng)體重減少為初始體重的>20％時(shí)，立即對小鼠執(zhí)行安樂死。在腫瘤達(dá)到3000mm3或顯示即將發(fā)生潰瘍的征兆出現(xiàn)之前，對所有動物執(zhí)行安樂死?？贵w的存在通過注射后1、7和14天的藥代動力學(xué)滲出確認(rèn)。使用抗體4G7、7H1和4A11通過FACS確認(rèn)HepG2X1細(xì)胞表面上和從移植小鼠分離的HepG2X1腫瘤的GPC3表達(dá)。參見圖13A-B。如圖14所示，顯著腫瘤生長抑制通過7H1-二硫化物-PBD(7.98mg/kg)和4A11-二硫化物-PBD(7.51mg/kg)二者實(shí)現(xiàn)。在該實(shí)驗(yàn)中，PNU偶聯(lián)物(7H1-乙縮醛-PNU和4A11-乙縮醛-PNU)的效力較低。實(shí)施例7：抗GPC3抗體藥物偶聯(lián)物在JHH7細(xì)胞系移植模型中的功效使用人JHH7移植模型研究抗GPC3ADC的功效。在每只雌性NCR裸鼠(Taconic；CambridgeCity,IN)的側(cè)腹區(qū)域皮下接種三百萬個(gè)JHH7細(xì)胞。當(dāng)移植瘤達(dá)到100-300mm3的平均腫瘤體積(稱為第0天)，將動物隨機(jī)分組，每組7-10只小鼠，并接受圖13所示劑量的單次靜脈注射ADC。在整個(gè)研究中每周測定小鼠的腫瘤和體重1-2次。當(dāng)體重減少為初始體重的>20％時(shí)，立即對小鼠執(zhí)行安樂死。在腫瘤達(dá)到3000mm3或顯示即將發(fā)生潰瘍的征兆出現(xiàn)之前，對所有動物執(zhí)行安樂死?？贵w的存在通過注射后1、4和14天的藥代動力學(xué)滲出確認(rèn)。使用抗體4G7、7H1和4A11通過FACS確認(rèn)JHH7細(xì)胞表面上和從異種移植小鼠分離的JHH7腫瘤的GPC3表達(dá)。參見圖15A-B。如圖16所示，顯著腫瘤生長抑制通過7H1-二硫化物-PBD(7.98mg/kg)和4A11-二硫化物-PBD(7.51mg/kg)二者實(shí)現(xiàn)。在該實(shí)驗(yàn)中，PNU偶聯(lián)物(7H1-乙縮醛-PNU和4A11-乙縮醛-PNU)的效力較低。雖然為了清晰理解，上述發(fā)明通過以實(shí)例說明和舉例詳細(xì)進(jìn)行了描述，但這些描述和例子不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范圍。本文所有引入的專利和科學(xué)文獻(xiàn)的公開內(nèi)容全文以引用方式明確地并入。序列表格序列表<110>基因泰克公司（GENENTECH,INC.）<120>抗GPC3抗體和免疫偶聯(lián)物發(fā)明領(lǐng)域<130>01146-0034-00PCT<150>US62/001,868<151>2014-05-22<160>48<170>PatentIn3.5版<210>1<211>580<212>PRT<213>智人<400>1MetAlaGlyThrValArgThrAlaCysLeuValValAlaMetLeuLeu151015SerLeuAspPheProGlyGlnAlaGlnProProProProProProAsp202530AlaThrCysHisGlnValArgSerPhePheGlnArgLeuGlnProGly354045LeuLysTrpValProGluThrProValProGlySerAspLeuGlnVal505560CysLeuProLysGlyProThrCysCysSerArgLysMetGluGluLys65707580TyrGlnLeuThrAlaArgLeuAsnMetGluGlnLeuLeuGlnSerAla859095SerMetGluLeuLysPheLeuIleIleGlnAsnAlaAlaValPheGln100105110GluAlaPheGluIleValValArgHisAlaLysAsnTyrThrAsnAla115120125MetPheLysAsnAsnTyrProSerLeuThrProGlnAlaPheGluPhe130135140ValGlyGluPhePheThrAspValSerLeuTyrIleLeuGlySerAsp145150155160IleAsnValAspAspMetValAsnGluLeuPheAspSerLeuPhePro165170175ValIleTyrThrGlnLeuMetAsnProGlyLeuProAspSerAlaLeu180185190AspIleAsnGluCysLeuArgGlyAlaArgArgAspLeuLysValPhe195200205GlyAsnPheProLysLeuIleMetThrGlnValSerLysSerLeuGln210215220ValThrArgIlePheLeuGlnAlaLeuAsnLeuGlyIleGluValIle225230235240AsnThrThrAspHisLeuLysPheSerLysAspCysGlyArgMetLeu245250255ThrArgMetTrpTyrCysSerTyrCysGlnGlyLeuMetMetValLys260265270ProCysGlyGlyTyrCysAsnValValMetGlnGlyCysMetAlaGly275280285ValValGluIleAspLysTyrTrpArgGluTyrIleLeuSerLeuGlu290295300GluLeuValAsnGlyMetTyrArgIleTyrAspMetGluAsnValLeu305310315320LeuGlyLeuPheSerThrIleHisAspSerIleGlnTyrValGlnLys325330335AsnAlaGlyLysLeuThrThrThrIleGlyLysLeuCysAlaHisSer340345350GlnGlnArgGlnTyrArgSerAlaTyrTyrProGluAspLeuPheIle355360365AspLysLysValLeuLysValAlaHisValGluHisGluGluThrLeu370375380SerSerArgArgArgGluLeuIleGlnLysLeuLysSerPheIleSer385390395400PheTyrSerAlaLeuProGlyTyrIleCysSerHisSerProValAla405410415GluAsnAspThrLeuCysTrpAsnGlyGlnGluLeuValGluArgTyr420425430SerGlnLysAlaAlaArgAsnGlyMetLysAsnGlnPheAsnLeuHis435440445GluLeuLysMetLysGlyProGluProValValSerGlnIleIleAsp450455460LysLeuLysHisIleAsnGlnLeuLeuArgThrMetSerMetProLys465470475480GlyArgValLeuAspLysAsnLeuAspGluGluGlyPheGluSerGly485490495AspCysGlyAspAspGluAspGluCysIleGlyGlySerGlyAspGly500505510MetIleLysValLysAsnGlnLeuArgPheLeuAlaGluLeuAlaTyr515520525AspLeuAspValAspAspAlaProGlyAsnSerGlnGlnAlaThrPro530535540LysAspAsnGluIleSerThrPheHisAsnLeuGlyAsnValHisSer545550555560ProLeuLysLeuLeuThrSerMetAlaIleSerValValCysPhePhe565570575PheLeuValHis580<210>2<211>120<212>PRT<213>小家鼠<400>2GlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysIleSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAspTyr202530TyrIleAsnTrpValLysGlnLysProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTrpIleTyrProGlySerGlyHisThrGluCysAsnGluThrPhe505560LysGlyLysAlaThrLeuThrValAspThrSerSerSerThrAlaTyr65707580MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspThrAlaValTyrPheCys859095ThrArgGlyTyrTyrAlaProMetGlyTyrPheAspTyrTrpGlyGln100105110GlyThrThrLeuThrValSerSer115120<210>3<211>107<212>PRT<213>小家鼠<400>3AspIleGlnMetThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerLeuGly151015GluArgValSerLeuThrCysArgAlaSerGlnGluIleSerGlyTyr202530LeuSerTrpLeuGlnGlnLysProAspGlyThrIleLysArgLeuIle354045TyrAlaAlaSerThrLeuAspSerGlyValProLysArgPheSerGly505560SerArgSerGlySerAspTyrSerLeuThrIleSerGlyLeuGluSer65707580GluAspPheAlaAspTyrTyrCysLeuGlnTyrAlaSerTyrProTyr859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLys100105<210>4<211>5<212>PRT<213>小家鼠<400>4AspTyrTyrIleAsn15<210>5<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>5TrpIleTyrProGlySerGlyHisThrGluCysAsnGluThrPheLys151015Gly<210>6<211>11<212>PRT<213>小家鼠<400>6GlyTyrTyrAlaProMetGlyTyrPheAspTyr1510<210>7<211>11<212>PRT<213>小家鼠<400>7ArgAlaSerGlnGluIleSerGlyTyrLeuSer1510<210>8<211>7<212>PRT<213>小家鼠<400>8AlaAlaSerThrLeuAspSer15<210>9<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>9LeuGlnTyrAlaSerTyrProTyrThr15<210>10<211>113<212>PRT<213>小家鼠<400>10GluValGlnLeuGlnGlnSerAlaAlaGluLeuAlaArgProGlyAla151015SerValArgMetSerCysArgThrSerGlyTyrThrPheThrThrTyr202530ThrIleHisTrpMetLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyTyrIleAsnProAsnGlyGlyTyrThrGluTyrAsnGlnLysPhe505560ArgAspArgThrThrLeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCys859095ThrArgAsnPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrLeuThrValSer100105110Ser<210>11<211>107<212>PRT<213>小家鼠<400>11AspIleValMetThrGlnSerProSerSerMetTyrAlaSerLeuGly151015GluArgValThrIleThrCysLysAlaSerGlnAspIleAsnSerTyr202530LeuSerTrpPheGlnGlnLysProGlyLysSerProLysThrLeuIle354045TyrArgValAsnArgLeuValAspGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyGlnAspTyrSerLeuThrIleSerSerLeuGluTyr65707580GluAspValGlyIleTyrTyrCysLeuGlnTyrAspGluPheProLeu859095ThrLeuGlyAlaGlyThrLysLeuGluLeuLys100105<210>12<211>5<212>PRT<213>小家鼠<400>12ThrTyrThrIleHis15<210>13<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>13TyrIleAsnProAsnGlyGlyTyrThrGluTyrAsnGlnLysPheArg151015Asp<210>14<211>4<212>PRT<213>小家鼠<400>14AsnPheAspTyr1<210>15<211>11<212>PRT<213>小家鼠<400>15LysAlaSerGlnAspIleAsnSerTyrLeuSer1510<210>16<211>7<212>PRT<213>小家鼠<400>16ArgValAsnArgLeuValAsp15<210>17<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>17LeuGlnTyrAspGluPheProLeuThr15<210>18<211>114<212>PRT<213>小家鼠<400>18GluValGlnLeuLeuGluThrGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerArgGlyLeuSerCysGluGlySerGlyPheThrPheSerGlyPhe202530TrpMetSerTrpValArgGlnThrProGlyLysThrLeuGluTrpIle354045GlyAspIleAsnSerAspGlySerSerIleAsnTyrAlaProSerIle505560LysAspArgPheThrIlePheArgAspAsnAspLysSerIleLeuTyr65707580LeuGlnMetThrAsnValArgSerGluAspThrGlyThrTyrPheCys859095ValThrThrTyrGlyAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrLeuThrVal100105110SerSer<210>19<211>107<212>PRT<213>小家鼠<400>19AspIleValMetThrGlnSerGlnLysPheMetSerThrSerValGly151015AspArgValSerValThrCysLysAlaSerGlnAsnValGlySerHis202530ValGlyTrpTyrGlnGlnLysSerGlyGlnSerProLysAlaLeuIle354045TyrSerAlaSerAsnArgTyrIleGlyValProAspArgPheThrGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerAsnValGlnSer65707580GluAspLeuAlaGluTyrPheCysGlnGlnTyrHisIleTyrProTyr859095ThrPheGlyGlyGlyThrArgLeuGluIleLys100105<210>20<211>5<212>PRT<213>小家鼠<400>20GlyPheTrpMetSer15<210>21<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>21AspIleAsnSerAspGlySerSerIleAsnTyrAlaProSerIleLys151015Asp<210>22<211>5<212>PRT<213>小家鼠<400>22ThrTyrGlyAspTyr15<210>23<211>11<212>PRT<213>小家鼠<400>23LysAlaSerGlnAsnValGlySerHisValGly1510<210>24<211>7<212>PRT<213>小家鼠<400>24SerAlaSerAsnArgTyrIle15<210>25<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>25GlnGlnTyrHisIleTyrProTyrThr15<210>26<211>117<212>PRT<213>小家鼠<400>26GluValGlnLeuGlnGlnSerGlyThrValLeuAlaArgProGlyAla151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TrpValHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyAlaIleTyrProGlyAsnIleAspAlaSerTyrAsnGlnLysPhe505560LysGlyLysAlaLysLeuThrAlaValThrSerThrSerThrAlaTyr65707580MetGluLeuSerSerLeuThrAsnGluAspSerAlaValTyrTyrCys859095SerTyrAspTyrAspAlaTrpPheValTyrTrpGlyGlnGlyThrLeu100105110ValThrValSerAla115<210>27<211>107<212>PRT<213>小家鼠<400>27AspIleGlnMetThrGlnSerHisLysPheMetSerThrSerValGly151015AspArgValSerIleThrCysLysAlaSerGlnAspValSerThrAla202530ValAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnSerProThrLeuLeuIle354045TyrSerAlaSerTyrArgTyrThrGlyValProAspArgPheThrGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrPheThrIleSerSerValGlnAla65707580GluAspLeuAlaValTyrTyrCysGlnGlnHisTyrPheThrProArg859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluLeuLys100105<210>28<211>5<212>PRT<213>小家鼠<400>28SerTyrTrpValHis15<210>29<211>17<212>PRT<213>小家鼠<400>29AlaIleTyrProGlyAsnIleAspAlaSerTyrAsnGlnLysPheLys151015Gly<210>30<211>8<212>PRT<213>小家鼠<400>30AspTyrAspAlaTrpPheValTyr15<210>31<211>11<212>PRT<213>小家鼠<400>31LysAlaSerGlnAspValSerThrAlaValAla1510<210>32<211>7<212>PRT<213>小家鼠<400>32SerAlaSerTyrArgTyrThr15<210>33<211>9<212>PRT<213>小家鼠<400>33GlnGlnHisTyrPheThrProArgThr15<210>34<211>106<212>PRT<213>人工序列<220><223>V205C半胱氨酸工程化輕鏈恒定區(qū)(Igκ)<400>34ThrValAlaAlaProSerValPheIlePheProProSerAspGluGln151015LeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyr202530ProArgGluAlaLysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGlnSer354045GlyAsnSerGlnGluSerValThrGluGlnAspSerLysAspSerThr505560TyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLys65707580HisLysValTyrAlaCysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSerPro859095CysThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys100105<210>35<211>330<212>PRT<213>人工序列<220><223>A118C半胱氨酸工程化重鏈恒定區(qū)(IgG1)<400>35CysSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLys151015SerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyr202530PheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSer354045GlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSer505560LeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThr65707580TyrIleCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLys859095LysValGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCys100105110ProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro115120125LysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCys1301351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