采用堿處理進(jìn)行脂肪酸烷基酯生產(chǎn)的制作方法
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發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及從脂肪酸原料生產(chǎn)脂肪酸烷基酯的方法。根據(jù)本發(fā)明所述的方法中包括拋光反應(yīng)，在該反應(yīng)中堿試劑或堿直接混合入該全酶反應(yīng)混合物中。
背景技術(shù)：
可以將脂肪酸烷基酯在標(biāo)準(zhǔn)的柴油發(fā)動(dòng)機(jī)中用作燃料、生物柴油。生物柴油可以單獨(dú)使用或與石化柴油混合使用。目前因?yàn)槠洵h(huán)境方面的益處，生物柴油已經(jīng)變得更有吸引力。
雖然目前生物柴油主要是化學(xué)產(chǎn)生的(使用例如NaOH和/或甲醇鈉作為催化劑)，但是有幾個(gè)相關(guān)的問題限制了它的發(fā)展，例如由于高含量的游離脂肪酸的油的預(yù)加工、為了在反應(yīng)中的高醇盈余的需求將化學(xué)催化劑從酯和甘油相去除、和在甘油回收方法中去除無機(jī)鹽。
通過使用酯解酶作為催化劑，極大地防止了由化學(xué)催化劑導(dǎo)致的這些劣勢，并且在最近這些年，在生產(chǎn)生物柴油的酯交換中使用脂肪酶引起了人們的興趣。
通過酶生物轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的生物柴油(與化學(xué)轉(zhuǎn)換相比)更加環(huán)保。然而，有非常少的例外，目前酶技術(shù)未用于商業(yè)化規(guī)模的生物柴油生產(chǎn)。
使用液體酶來進(jìn)行脂肪酸烷基酯的酶生產(chǎn)方法描述于例如，WO 2006/072256，Lv等人，方法生化(Process Biochemistry)45(2010)446-450)和WO 2012/098114中。
在生產(chǎn)脂肪酸烷基酯或生物柴油的方法中，將脂肪酸原料與醇(典型地甲醇)反應(yīng)以產(chǎn)生脂肪酸烷基酯和甘油。這些方法包括另外的步驟，例如對脂肪酸烷基酯進(jìn)行堿處理以降低游離脂肪酸的量。在這些加工步驟之前，將包含脂肪酸烷基酯、游離脂肪酸等的油相/疏水相與包含例如水、甘油和過量的醇的一部分的親水相分離。在堿處理之前，油相/疏水相和親水相的分離被認(rèn)為是必須的，主要是因?yàn)椋瑩?jù)信，在堿處理之前沒有相分離，作為生產(chǎn)脂肪酸烷基酯的副產(chǎn)品形成的甘油將包含大量的鹽。這是不理想的，因?yàn)楦视捅旧砭褪怯袃r(jià)值的副產(chǎn)品，其中該甘油被加工成工業(yè)級(jí)甘油。
另外，為了降低醇的蒸發(fā)，在堿處理之前分離油相/疏水相和親水相被認(rèn)為是有優(yōu)勢的，因?yàn)閴A處理是在升高的溫度下進(jìn)行的，該溫度接近醇的沸點(diǎn)。
最后，當(dāng)通過酶生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)脂肪酸烷基酯/生物柴油時(shí)，在堿處理之前的相分離使再使用大量的該酶成為可能，否則該酶在堿處理過程中會(huì)至少部分變性。
然而，在油相/疏水相和親水相的分離過程中，形成了第三個(gè)乳劑相，該乳劑相也包含一些脂肪酸烷基酯或生物柴油。這個(gè)第三相不與油相/疏水相一起被收集。因此，除了帶來技術(shù)挑戰(zhàn)外，該分離步驟也導(dǎo)致了脂肪酸烷基酯或生物柴油的失去。
因此，對生產(chǎn)脂肪酸烷基酯或生物柴油更有效的方法存在需求。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供通過將脂肪酸原料與醇在系統(tǒng)中反應(yīng)來生產(chǎn)脂肪酸烷基酯的方法，該系統(tǒng)包含油相/疏水相和親水相，其中在所述醇/所述親水相存在的情況下，通過用一種或多種堿性試劑進(jìn)行處理，皂/鹽形成自游離脂肪酸。
本發(fā)明也提供生產(chǎn)脂肪酸烷基酯的方法，包括
i)提供包含油相/疏水相和親水相的系統(tǒng)，和
ii)在水和一種或多種酯解酶存在的情況下，將存在于所述油相/疏水相中的脂肪酸原料與醇反應(yīng)；
其中所述一種或多種酯解酶的總量在100至500個(gè)酶單位/g油相/疏水相范圍內(nèi)。
本發(fā)明的方法的優(yōu)勢是，在該方法中失去非常少的產(chǎn)物(即脂肪酸酯/生物柴油)，該方法提供了經(jīng)濟(jì)效益并增加了可持續(xù)性。另一個(gè)優(yōu)勢是，這些方法操作已被極大地簡化了。
在另外的方面，本發(fā)明提供包含至少90％(w/w)脂肪酸烷基酯、從300至400ppm皂、少于0.25％(w/w)游離脂肪酸和少于0.23％(w/w)甘油酯的組合物。
附圖簡要說明
圖1：顯示根據(jù)本發(fā)明所述的方法的示意圖，包括具有高含量脂肪酸酯(FAME相)的油相/疏水相的制備，該脂肪酸酯分離自包含殘余的脂肪酸(甘油/皂相)的甘油、醇和皂/鹽的親水相；皂/脂肪酸鹽的酸化以產(chǎn)生游離脂肪酸，該游離脂肪酸可循環(huán)利用并在酶反應(yīng)中用作脂肪酸原料；以及高等級(jí)/工業(yè)級(jí)甘油的生產(chǎn)。
圖2：顯示本發(fā)明的方法的實(shí)施例。該圖顯示批處理操作裝置的工藝流程圖。在具體的實(shí)施例中，該反應(yīng)系統(tǒng)包括1％水、10％甘油、1.4當(dāng)量MeOH和0.3％酶(脂肪酶)，該系統(tǒng)對應(yīng)于300個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相。也可以將該裝置構(gòu)建為連續(xù)攪拌反應(yīng)釜系統(tǒng)。
已經(jīng)包括了這些圖，僅出于說明性目的，并且不應(yīng)該被理解為限制本發(fā)明。
發(fā)明詳述
定義
生物柴油：短鏈醇的脂肪酸烷基酯(FAAE)、例如脂肪酸甲基酯(FAME)和脂肪酸乙基酯(FAEE)也叫做生物柴油，因?yàn)樗鼈兛梢杂米魇裼偷奶砑觿┗蛱娲?/p>
醇：用于本發(fā)明的方法中的醇優(yōu)選地是具有1至5個(gè)碳原子(C1、C2、C3、C4、或C5)的短鏈醇。
脂肪酸原料：該術(shù)語“脂肪酸原料”在此被定義為以下底物，該底物包含甘油三脂、甘油二酯、甘油單酯、游離脂肪酸或其任意組合。原則上，任何包含脂肪酸的植物或動(dòng)物來源的油和脂肪可以在本發(fā)明的方法中被用作底物來生產(chǎn)脂肪酸烷基酯。
脂肪分解酶
應(yīng)用于本發(fā)明的方法中的一種或多種酯解酶選自脂肪酶，磷酸脂肪酶，角質(zhì)酶，?；D(zhuǎn)移酶或脂肪酶、磷酸脂肪酶、角質(zhì)酶和?；D(zhuǎn)移酶中的一種和多種的混合物。該一種或多種酯解酶選自在EC 3.1.1、EC 3.1.4、和EC 2.3.中的酶。該一種或多種酯解酶也可以是一種或多種脂肪酶的混合物。該一種或多種酯解酶可以包括脂肪酶和磷酸脂肪酶。該一種或多種酯解酶包括EC 3.1.1.3的脂肪酶。該一種或多種酯解酶包括在三-、二-、和單甘油酯上具有活性的脂肪酶。
脂肪酶：合適的酯解酶可以是具有脂肪酶活性的多肽，例如，選自如在WO 88/02775中披露的南極假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶A(CALA)，如在WO 88/02775中披露并示于WO 2008065060的SEQ ID NO:1中的南極假絲酵母(C.antarctica)脂肪酶B(CALB)，在EP 258 068中披露的疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)(之前為柔毛腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosus))脂肪酶，在WO 2000/60063或WO 1995/22615中披露的疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)變體(具體地，示于WO 95/22615的SEQ ID NO:2的位置1-269處的脂肪酶、Hyphozyma sp.脂肪酶(WO 98/018912)、和曼赫根毛霉(曼赫根毛霉)脂肪酶(在WO 2004/099400中的SEQ ID NO:5))，來自產(chǎn)堿假單胞菌或類產(chǎn)堿假單胞菌(EP 218 272)、洋蔥假單胞菌(EP 331 376)、施氏假單胞菌(GB 1,372,034)、螢光假單胞菌、假單胞菌屬物種菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假單胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)的脂肪酶；芽孢桿菌屬脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(達(dá)圖瓦(Dartois)等人，(1993)，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(Biochemica et Biophysica Acta)，1131,253-360)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(WO 91/16422)。也優(yōu)選的是來自以下生物體中任一種的脂肪酶：尖鐮孢、犁頭包蛻膜酶(Absidia reflexa)、犁頭霉、曼赫根毛霉、德氏根霉(oryzae)、黑曲霉、塔賓曲霉、異孢鐮孢、米曲霉、卡門柏青梅、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉和疏棉狀嗜熱絲孢菌，例如，選自在WO 2004/099400中的SEQ ID NOs:1至15中任一個(gè)的脂肪酶。
與本發(fā)明相關(guān)的有用的脂肪酶是與SEQ ID NO:2的成熟多肽、示于WO 95/22615的SEQ ID NO:2的位置1-269處的多肽、或示于WO 2008/065060的SEQ ID NO:1的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至100％序列一致性的脂肪酶。
適合在本發(fā)明的方法中使用的商業(yè)化的脂肪酶制劑包括LIPOZYME CALB L、LIPOZYME(R)TL 100L和CALLERATM TRANS(都能從諾維信公司(Novozymes A/S)獲得)。
具體地有用的脂肪酶可以選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成
(a)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中闡述的氨基酸序列或由其組成的的多肽；
(b)是SEQ ID NO:1或2中闡述的氨基酸序列的子序列的多肽；
(c)與在(a)和(b)中定義的多肽中的任一種具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的多肽。
在(c)中闡釋的脂肪酶可以是在SEQ ID NO:1中闡釋的氨基酸序列的變體，其中該多肽包含以下取代T231R和N233R。
在項(xiàng)目(c)中闡釋的脂肪酶可以具有如下氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQ ID NO:1或2的多肽在多達(dá)40個(gè)氨基酸上有所不同，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40個(gè)。
該脂肪酶可以是親本脂肪酶的變體，該變體具有脂肪酶活性并且與SEQ ID NO:1具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性，并且在對應(yīng)于T231R+N233R和SEQ ID NO:2的D96E、D111A、D254S、G163K、P256T、G91T、G38A、D27R、和N33Q中至少一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))的位置處包括取代。
在另一個(gè)實(shí)施例中，該脂肪酶是如下變體，該變體具有脂肪酶活性并且與SEQ ID NO:1具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性，并且在對應(yīng)于T231R+N233R和SEQ ID NO:2的D96E、D111A、D254S、G163K、P256T、G91T、G38A、D27R、和N33Q中至少一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))的位置處包括取代，這些位置選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：
a)D96E T231R N233R；
b)N33Q D96E T231R N233R；
c)N33Q T231R N233R
d)N33Q D111A T231R N233R；
e)N33Q T231R N233R P256T；
f)N33Q G38A G91T G163K T231R N233R D254S；
g)N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T；
h)D27R N33Q G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T；
i)D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R P256T；
j)D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S；
k)D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T；
l)D96E T231R N233R D254S；
m)T231R N233R D254S P256T；
n)G163K T231R N233R D254S；
o)D27R N33Q G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T；
p)D27R G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T；
q)D96E G163K T231R N233R D254S；
r)D27R G163K T231R N233R D254S；
s)D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S；
t)D27R G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T；
u)D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T:
v)D27R D96E G163K T231R N233R D254S；
w)D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T；
x)D27R G38A D96E G163K T231R N233R D254S P256T。
例如，在WO 2015/049370中提供了這些親本脂肪酶的有用變體。
脂肪酶活性：
在本發(fā)明的上下文中，可以使用三丁酸酯作為底物將該酯解活性確定為脂肪酶單位(LU)。該方法基于在該酶的作用下三丁酸的水解，并且將在水解過程中維持pH恒定的堿的消耗記錄為時(shí)間的函數(shù)。
根據(jù)本發(fā)明，一個(gè)脂肪酶單位(LU)可以被定義為，在標(biāo)準(zhǔn)條件(即在30℃；pH 7.0；具有0.1％(w/v)阿拉伯膠作為乳化劑和0.16M三丁酸作為底物)下，每分鐘釋放1微摩爾的可滴定丁酸的酶量。
可替代地，酯解活性可以被確定為長鏈脂肪酶單位(LCLU)，使用底物pNP-Palmitate(C:16)，當(dāng)在pH 8.0在30℃下孵育時(shí)，該脂肪酶水解該酯鍵并釋放pNP，其中pNP是黃色的并能在405nm處被檢測到。
磷酸脂肪酶：
所述一種或多種酯解酶可以包括具有磷酸脂肪酶活性的多肽，優(yōu)選地磷酸脂肪酶A1、磷酸脂肪酶A2、磷酸脂肪酶B、磷酸脂肪酶C、磷酸脂肪酶D、溶血-磷酸脂肪酶活性、和/或其任何組合。在本發(fā)明的方法中，所述一種或多種酯解酶可以是磷酸脂肪酶，例如，單一磷酸脂肪酶，如A1、A2、B、C、或D；兩種或更多種磷酸脂肪酶，如，兩種磷酸脂肪酶(包括但不限于，A型和B型兩者、A1型和A2型兩者、A1型和B型兩者、A2型和B型兩者、A1型和C型兩者、A2型和C型兩者)或兩種或更多種相同類型的磷酸脂肪酶。
所述一種或多種酯解酶可以是具有磷酸脂肪酶活性以及具有?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽，例如，選自如下這些多肽中的多肽，這些多肽披露于WO 2003/100044、WO 2004/064537、WO 2005/066347、WO 2008/019069、WO 2009/002480、和WO 2009/081094中。例如可以通過在WO 2004/064537中描述的測定確定酰基轉(zhuǎn)移酶活性。
該磷酸脂肪酶可以選自披露于WO 2008/036863和WO 20003/2758中的多肽。合適的磷酸脂肪酶制劑是PURIFINE(R)(可以從范恩尼姆公司(Verenium)獲得)和LECITASE(R)ULTRA(可以從諾維信公司獲得)。具有?；D(zhuǎn)移酶活性的酶和商業(yè)化的酶制劑LYSOMAX(R)OIL(可以從丹尼斯克公司(Danisco A/S)獲得)一樣是可獲得的。
角質(zhì)酶：該一種或多種酯解酶可以包括具有角質(zhì)酶活性的多肽。例如該角質(zhì)酶可以選自披露于WO 2001/92502中的多肽，具體地披露于實(shí)例2中的特異腐質(zhì)霉角質(zhì)酶變體。
優(yōu)選地，所述一種或多種酯解酶是與之前提到的脂肪酶、磷酸脂肪酶、角質(zhì)酶、和?；D(zhuǎn)移酶中的任一種具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％一致性的酶。
在一個(gè)實(shí)施例中，所述一種或多種酯解酶與WO 95/22615的SEQ ID NO:2的位置1-269處示出的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少或甚至至少99％一致性。
酶源和配制品：在本發(fā)明的方法中使用的一種或多種酯解酶可以源自或可獲得自在此提到的來源中的任一種。術(shù)語“源自”在本上下文中表示酶可以從天然存在所述酶的生物體分離，即酶的氨基酸序列的身份(identity)與天然酶相同。術(shù)語“源自”還表示酶可以在宿主生物體中重組產(chǎn)生，其中重組產(chǎn)生的酶具有與天然酶相同的身份，或具有修飾的氨基酸序列，例如，缺失、插入和/或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸，即，重組產(chǎn)生的酶是天然氨基酸序列的突變體和/或片段。天然酶的意義中包含天然變體。此外，術(shù)語“源自”包括通過例如肽合成而合成產(chǎn)生的酶。術(shù)語“源自”還包括已經(jīng)通過例如糖基化、磷酸化等在體內(nèi)或體外修飾的酶。在這個(gè)上下文中的術(shù)語“可獲得的”意指該酶與天然酶具有相同的氨基酸序列。該術(shù)語涵蓋已經(jīng)從生物體分離的酶(在該生物體中，該酶天然地存在，或在該生物體中，該酶在相同類型的或其他類型的生物體中重組地表達(dá))，或通過例如肽合成而合成產(chǎn)生的酶。對于重組產(chǎn)生的酶，該術(shù)語“可獲得的”和“源自”指酶的身份而不是重組產(chǎn)生酶的宿主生物體的身份。
相應(yīng)地，可以通過使用任何合適的技術(shù)從微生物獲得所述一種或多種酯解酶。例如，酶制劑可通過發(fā)酵合適的微生物和之后通過本領(lǐng)域公知的方法從所得的發(fā)酵液或微生物分離酶制劑而獲得。該酶還可以通過使用重組DNA技術(shù)而獲得。這種方法通常包括培養(yǎng)用重組DNA載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，該載體包含編碼所討論的酶的DNA序列，并且DNA序列與合適的表達(dá)信號(hào)可操作地連接，使其能在允許酶表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中表達(dá)該酶，并從培養(yǎng)物回收該酶。還可將DNA序列摻入宿主細(xì)胞的基因組中。DNA序列可以是基因組、cDNA或合成來源，或它們的任何組合，并且可以按照本領(lǐng)域公知的方法分離或合成。
該一種或多種酯解酶可以應(yīng)用于任何合適的配制品中，例如，如凍干粉末或在水性溶液中。
序列一致性：
兩個(gè)氨基酸序列之間或者兩個(gè)核苷酸序列之間的關(guān)聯(lián)度通過參數(shù)“序列一致性”來描述。
出于本發(fā)明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48:443-453)來確定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性，該算法如EMBOSS軟件包(EMBOSS：歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，賴斯(Rice)等人，2000，遺傳學(xué)趨勢(Trends Genet.)16:276-277)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德爾(Needle)程序所實(shí)施的。所使用的參數(shù)是空位開放罰分10，空位延伸罰分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作百分比同一性并且是如下計(jì)算的：
(一致的殘基X 100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))
方法設(shè)計(jì)
本發(fā)明提供了，在包含油相/疏水相和親水相的系統(tǒng)/反應(yīng)系統(tǒng)中，在水和一種或多種酯解酶存在的情況下，通過將脂肪酸原料與醇反應(yīng)來生產(chǎn)脂肪酸烷基酯的方法。所述脂肪酸原料(包括任何甘油三脂、甘油二酯、甘油單酯、游離脂肪酸或包含在脂肪酸原料中的其任何組合)與所述醇的反應(yīng)產(chǎn)生脂肪酸烷基酯/生物柴油和甘油。隨著反應(yīng)進(jìn)行，脂肪酸烷基酯積累在油相/疏水相中。
本發(fā)明的諸位發(fā)明人已經(jīng)觀察到，在脂肪酸烷基酯/生物柴油通過脂肪酸原料的酶生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的方法中，即使在沒有有效地將油相/疏水相從親水相分離的情況下進(jìn)行堿處理，得到的甘油的鹽侵意外地低并且該甘油具有足夠低含量的鹽以便容易地加工成高質(zhì)量或工業(yè)級(jí)甘油，例如通過中和或鹽化。
因此，在根據(jù)本發(fā)明所述的方法中，在對脂肪酸酯/生物柴油進(jìn)行任何進(jìn)一步的加工(例如用堿試劑處理以去除游離脂肪酸)之前，脂肪酸烷基酯/生物柴油是在如下條件下產(chǎn)生的，在該條件下將包含脂肪酸酯/生物柴油的油相/疏水相從親水相的分離是可以避免的。這提供了大量的顯著益處：首先，有可能設(shè)計(jì)生產(chǎn)脂肪酸并且最終是精制產(chǎn)物(包括生物柴油和甘油)的方法，該方法步驟更少、步驟成本更低、方法時(shí)間更短并具有更高的容量。還有，因?yàn)橄喾蛛x發(fā)生在堿處理之后，有可能使用升高的溫度，該溫度能使這些相更快的分離。
本發(fā)明的諸位發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)了，在堿處理之后，根據(jù)本發(fā)明所述的方法產(chǎn)生脂肪酸烷基酯/生物柴油相或組合物，該脂肪酸烷基酯/生物柴油相或組合物具有降低的含量的游離脂肪酸的皂或鹽，這使得隨后的后續(xù)洗滌步驟成本更低。
最后，由于非常少的脂肪酸烷基酯陷在皂乳劑中并且沒有脂肪酸烷基酯陷在酶乳劑相中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法給出更高的產(chǎn)率。
在本發(fā)明的一個(gè)主要的方面，在所述醇/所述疏水相的存在下，通過用一種或多種堿試劑處理，可以實(shí)現(xiàn)在油相/疏水相中的皂/鹽游離脂肪酸的形成。因此，該方法包含，在允許游離脂肪酸的皂/鹽形成的條件下，將脂肪酸烷基酯、游離脂肪酸、水、醇和甘油以及一種或多種酯解酶與一種或多種堿試劑接觸。
根據(jù)這一方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)脂肪酸烷基酯的方法，該方法包含
i)在包含油相/疏水相和親水相的反應(yīng)系統(tǒng)中，在水和一種或多種酯解酶存在的情況下，將脂肪酸原料與醇反應(yīng)來生產(chǎn)脂肪酸烷基酯和甘油；和
j)在將油相/疏水相從親水相分離之前，通過用一種或多種堿試劑進(jìn)行處理，去除或降低游離脂肪酸的量以形成游離脂肪酸的皂/鹽；例如當(dāng)在所述反應(yīng)系統(tǒng)中仍有油相/疏水相和親水相時(shí)。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法可進(jìn)一步包括
i)提供系統(tǒng)，例如反應(yīng)系統(tǒng)，該反應(yīng)系統(tǒng)包含所述油相/疏水相和所述親水相，
ii)在水和一種或多種酯解酶存在的情況下，將存在于所述油相/疏水相中的脂肪酸原料與醇反應(yīng)以產(chǎn)生所述脂肪酸烷基酯、游離脂肪酸和甘油。
根據(jù)一些實(shí)施例，該方法包括將在步驟ii)中產(chǎn)生的所述游離脂肪酸的皂/鹽與脂肪酸酯和一種或多種酯解酶分離，例如通過將脂肪酸烷基酯與包含所述皂/鹽的親水相和該一種或多種酯解酶分離。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供生產(chǎn)脂肪酸烷基酯的方法，該方法包括
i)提供系統(tǒng)，例如反應(yīng)系統(tǒng)，該反應(yīng)系統(tǒng)包含油相/疏水相和親水相，
ii)在水和一種或多種酯解酶存在的情況下，將存在于所述油相/疏水相中的脂肪酸原料與醇反應(yīng)以產(chǎn)生所述脂肪酸烷基酯；
iii)將在所述油相/疏水相中的游離脂肪酸與一種或多種堿試劑反應(yīng)；和
iv)將所述脂肪酸烷基酯與所述親水相分離
在另外的實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法包括
i)提供反應(yīng)系統(tǒng)，該反應(yīng)系統(tǒng)具有包含脂肪酸原料的油相/疏水相，和包含醇、水和一種或多種酯解酶的親水相；
ii)在所述水和所述一種或多種酯解酶存在的情況下，將脂肪酸原料與醇反應(yīng)以產(chǎn)生游離脂肪酸、甘油、和脂肪酸烷基酯；
iii)添加一種或多種堿試劑到該反應(yīng)系統(tǒng)中以允許在步驟ii)中產(chǎn)生的游離脂肪酸的皂/鹽的形成；并且
iv)將脂肪酸烷基酯與脂肪酸的皂/鹽和一種或多種酯解酶分離。
在本發(fā)明的方法中使用的一種或多種酯解酶可以具體地選自脂肪酶、磷酸脂肪酶、角質(zhì)酶及其混合物。
具體地優(yōu)選的是，所述一種或多種酯解酶中至少一種是脂肪酶，并且任選地，一種或多種脂肪酶與一種或多種磷酸脂肪酶和/或一種或多種角質(zhì)酶組合使用。如技術(shù)人員將理解的那樣，當(dāng)該脂肪酸原料包含以磷酸酯的形式出現(xiàn)的雜質(zhì)時(shí)，將磷酸脂肪酶與其他酯解酶(例如脂肪酶和角質(zhì)酶)組合使用是有意義的。一種或多種脂肪酶與一種或多種磷酸脂肪酶的組合使用導(dǎo)致組合的酯交換和磷酸酯的降低(脫膠)并且因此產(chǎn)生磷減少的脂肪酸烷基酯。
這種產(chǎn)生磷減少的脂肪酸烷基酯的方法披露于WO 2006/133698中，該方法包括，將醇、包含甘油三脂和/或脂肪酸的底物與一種或多種酯解酶(包括脂肪酶、角質(zhì)酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶)，和一種或多種磷酸脂肪酶和水混合，將WO 2006/133698的內(nèi)容通過引用以其全文結(jié)合在此。
為了使酶量(該酶在堿處理中失去)最小化，本發(fā)明的諸位發(fā)明人還能夠減少在生產(chǎn)脂肪酸烷基酯的方法中使用的酶量。因此，所述一種或多種酯解酶的量優(yōu)選地在100至500個(gè)酶單位/g油相/疏水相的范圍內(nèi)，例如在100至490個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至480個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至475個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至450個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至425個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至400個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至375個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至350個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至325個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至300個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至500個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至490個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至480個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至475個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至450個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至425個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至400個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至375個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至350個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至325個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至300個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至490個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至480個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至475個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至450個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至425個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至400個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至375個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至350個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至325個(gè)酶單位/g油相/疏水相、或例如200至300個(gè)酶單位/g油相/疏水相范圍內(nèi)。
相應(yīng)地，本發(fā)明的方法可以包括
i)提供包含油相/疏水相和親水相的系統(tǒng)，和
ii)在水和一種或多種酯解酶存在的情況下，將存在于所述油相/疏水相中的脂肪酸原料與與醇反應(yīng)；
其中，所述一種或多種酯解酶的總量在100至500個(gè)酶單位/g油相/疏水相的范圍內(nèi)，例如在100至490個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至480個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至475個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至450個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至425個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至400個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至375個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至350個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至325個(gè)酶單位/g油相/疏水相、100至300個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至500個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至490個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至480個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至475個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至450個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至425個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至400個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至375個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至350個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至325個(gè)酶單位/g油相/疏水相、150至300個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至490個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至480個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至475個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至450個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至425個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至400個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至375個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至350個(gè)酶單位/g油相/疏水相、200至325個(gè)酶單位/g油相/疏水相、或例如200至300個(gè)酶單位/g油相/疏水相范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，其中所述一種或多種酯解酶選自脂肪酶，例如在SEQ ID NO:1中闡述的脂肪酶，應(yīng)被理解的是以脂肪酶單位提供酶的量。因此，當(dāng)優(yōu)選脂肪酶時(shí)，酯解酶的量優(yōu)選地在100至500個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相的范圍內(nèi)，例如在100至490個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、100至480個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、100至475個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、100至450個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、100至425個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、100至400個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、100至375個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、100至350個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、100至325個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、100至300個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、150至500個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、150至490個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、150至480個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、150至475個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、150至450個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、150至425個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、150至400個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、150至375個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、150至350個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、150至325個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、150至300個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、200至490個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、200至480個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、200至475個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、200至450個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、200至425個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、200至400個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、200至375個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、200至350個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、200至325個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相、或例如200至300個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的其他實(shí)施例，其中所述一種或多種酯解酶選自脂肪酶，例如在SEQ ID NO:2和子序列中闡述的該脂肪酶和如在上文披露的其變體，以長鏈脂肪酶單位(LCLU)提供酶的量。在此類實(shí)施例中，酯解酶的量優(yōu)選地在100至500個(gè)脂肪酶單位/g油相/疏水相的范圍內(nèi)，例如在100至490LCLU/g油相/疏水相、100至480LCLU/g油相/疏水相、100至475LCLU/g油相/疏水相、100至450LCLU/g油相/疏水相、100至425LCLU/g油相/疏水相、100至400LCLU/g油相/疏水相、100至375LCLU/g油相/疏水相、100至350LCLU/g油相/疏水相、100至325LCLU/g油相/疏水相、100至300LCLU/g油相/疏水相、150至500LCLU/g油相/疏水相、150至490LCLU/g油相/疏水相、150至480LCLU/g油相/疏水相、150至475LCLU/g油相/疏水相、150至450LCLU/g油相/疏水相、150至425LCLU/g油相/疏水相、150至400LCLU/g油相/疏水相、150至375LCLU/g油相/疏水相、150至350LCLU/g油相/疏水相、150至325LCLU/g油相/疏水相、150至300LCLU/g油相/疏水相、200至490LCLU/g油相/疏水相、200至480LCLU/g油相/疏水相、200至475LCLU/g油相/疏水相、200至450LCLU/g油相/疏水相、200至425LCLU/g油相/疏水相、200至400LCLU/g油相/疏水相、200至375LCLU/g油相/疏水相、200至350LCLU/g油相/疏水相、200至325LCLU/g油相/疏水相、或例如200至300LCLU/g油相/疏水相范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述一種或多種酯解酶的量優(yōu)選地在0.005-5g酶蛋白質(zhì)(EP)/kg油相/疏水相或脂肪酸原料范圍內(nèi)，例如在0.005-2.5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-1g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.75g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.25g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.1g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.075g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.05g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.025g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.01g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.01-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.02-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.03-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.04-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.05-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.06-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.07-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.08-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.09-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.1-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.2-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.3-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.4-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.5-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.6-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.7-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.8-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.9-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、1-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、2-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、3-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、4-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.01-4g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.02-3g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.03-2g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.04-1g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.05-0.9g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.06-0.8g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.07-0.7g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.08-0.6g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.09-0.5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.1-0.4g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.1-0.3g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料范圍內(nèi)，或例如在0.1-0.25g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的上述方面的一些實(shí)施例中，將所述脂肪酸原料或任何甘油三脂、甘油二酯、甘油單酯、游離脂肪酸或包含在其中的任何其組合，與所述醇反應(yīng)，以至于該油相/疏水相包含脂肪酸烷基酯和游離脂肪酸或基本上由其組成。
本發(fā)明的方法優(yōu)選地包含，將脂肪酸原料與所述醇反應(yīng)，直到至少60％(w/w)(例如至少65％(w/w)、至少70％(w/w)、至少75％(w/w)、至少80％(w/w)、至少85％(w/w)、至少90％(w/w)，或例如至少95％(w/w))的脂肪酸乙?；鶊F(tuán)和/或在所述脂肪酸原料中的游離脂肪酸已經(jīng)被轉(zhuǎn)換成脂肪酸烷基酯。
在本發(fā)明的具體的實(shí)施例中，水的量對應(yīng)于0.5％至5.0％(w/w)的所述油相/疏水相，例如0.5％至4.0％(w/w)的所述油相/疏水相，0.5％至3.75％、0.5％至3.5％、0.5％至3.25％、0.5％至3.0％、0.5％至2.75％、0.5％至2.5％、0.5％至2.25％、0.5％至2.0％、0.5％至1.9％、0.5％至1.8.％、0.5％至1.75％、0.75％至2.0％、0.75％至1.8％、0.75％至1.75％、0.75％至1.5％、1.0％至2.0％、1.0％至1.9％、1.0％至1.8％、或例如1.0％至1.5％(w/w)的所述油相/疏水相。如技術(shù)人員將理解的那樣，在該方法中分別添加水的需求取決于在脂肪酸原料中水的量。
在另外的實(shí)施例中，該方法包括，通過脂肪酸原料的反應(yīng)和任選地通過甘油的另外的添加，將在所述親水相中的甘油的量增加至2％(w/w)至30％(w/w)，優(yōu)選地從2％(w/w)至20％(w/w)，例如相對于該油相/疏水相從2％(w/w)至20％(w/w)。
仍然在另外的實(shí)施例中，添加該醇以達(dá)到如下量，該量相對于該油相/疏水相在12％(w/w)至34％(w/w)的范圍內(nèi)，例如相對于該油相/疏水相在17％(w/w)至34％(w/w)的范圍內(nèi)，或例如相對于該油相/疏水相在12％(w/w)至24％(w/w)的范圍內(nèi)。當(dāng)該醇是甲醇時(shí)，優(yōu)選相對于該油相/疏水相范圍為12％(w/w)至24％(w/w)，但是當(dāng)該醇是乙醇時(shí)，優(yōu)選相對于該油相/疏水相范圍為17％(w/w)至34％(w/w)。
可以將該脂肪酸原料與所述醇在如下溫度下反應(yīng)，該溫度在32℃至45℃范圍內(nèi)，優(yōu)選地在32℃至40℃范圍內(nèi)。如技術(shù)人員將理解的那樣，溫度上限取決于在該方法中采用的一種或多種酯解酶的親熱性。
本發(fā)明的方法可以包括，將所述脂肪酸原料與所述醇反應(yīng)持續(xù)16-50小時(shí)，例如持續(xù)24-50小時(shí)，例如持續(xù)30-50小時(shí)、持續(xù)30-45小時(shí)、持續(xù)35-50小時(shí)、持續(xù)35-45小時(shí)、持續(xù)38-42小時(shí)，優(yōu)選地持續(xù)35-40小時(shí)。
如技術(shù)人員將理解的那樣，本發(fā)明的方法能以分批模式或以連續(xù)模式進(jìn)行。在連續(xù)模式方法中，這兩個(gè)相，該油相/疏水相和該親水相，可以分別逆流處理。小杉町(Kosugi)等人(1990)，生物技術(shù)與生物工程(Biotechnology&Bioengineering)，第36卷，617-622，描述了通過固定化脂肪酶來水解植物油的連續(xù)的逆流方法。
在該方法中使用的醇可以是C1-C5醇，優(yōu)選乙醇或甲醇。目前甲醇是最優(yōu)選的。
可以滴加和/或連續(xù)地添加所述醇。能以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)或更多個(gè)步驟滴加該醇。
將被理解的是，在本發(fā)明的方法中使用的所述一種或多種酯解酶中至少一種可以是液體酶。
具體地，所述一種或多種酯解酶可以選自脂肪酶、磷酸脂肪酶、角質(zhì)酶及其混合物。
根據(jù)一些實(shí)施例，優(yōu)選的是，所述一種或多種酯解酶是一種或多種脂肪酶。根據(jù)其他實(shí)施例，使用脂肪酶和磷酸脂肪酶的混合物。如果要求對脂肪酸原料脫膠，這種組合可以是具體地優(yōu)選的。
具體地，該脂肪酸原料可以源自以下各項(xiàng)中的一種或多種：海藻油、卡諾拉油(canola oil)、椰子油(coconut oil)、蓖麻油、椰子油(coconut oil)、椰子干油(copra oil)、玉米油(corn oil)、酒糟玉米油(corn oil)、玉米油(corn oil)游離脂肪酸餾出物、棉花籽油、亞麻油、魚油、葡萄籽油、大麻油、麻風(fēng)果油、荷荷巴油、芥子油、卡諾拉油(canola oil)、棕櫚油、棕櫚硬脂、棕櫚油精、棕櫚仁油、花生油、菜籽油、米糠油、紅花油、大豆油、向日葵油、妥爾油、來自鹽生植物和/或動(dòng)物脂肪的油(包括來自豬、牛和羊的油脂，豬油，雞脂肪，魚油，棕櫚油游離脂肪酸餾出物，大豆油游離脂肪酸餾出物，皂原料脂肪酸材料，黃色油脂，和棕色油脂或其任何組合)。
根據(jù)其他實(shí)施例，該脂肪酸原料可以選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：海藻油、蓖麻油、椰子油(椰子干油)、玉米油、棉花籽油、亞麻油、魚油、葡萄籽油、大麻油、麻風(fēng)果油、荷荷巴油、芥子油、卡諾拉油、棕櫚油、棕櫚硬脂、棕櫚油精、棕櫚仁油、花生油、菜籽油、米糠油、紅花油、大豆油、向日葵油、妥爾油、和來自鹽生植物的油、或其任何組合。
該脂肪酸原料可以選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：動(dòng)物脂肪，包括來自豬、牛和羊的油脂，豬油，雞脂肪，魚油，或其任何組合。
該脂肪酸原料可以是粗的、精制的、漂白的、除臭的、脫膠的、或其任何組合。
食品質(zhì)量的油和脂肪是昂貴的，并且因此來自它們的加工的廢物和副產(chǎn)品以及非食品級(jí)的油和脂肪已經(jīng)成為對于脂肪酸烷基酯而言具有日益增加的吸引力的原料。皂原料是在煉油廠中獲得的油的級(jí)分，通過用堿處理該油來將游離脂肪酸轉(zhuǎn)換到皂(例如，鈉皂)上。除了這些皂之外，該皂原料通常還包括甘油酯的級(jí)分。酸性油是來自煉油廠的副產(chǎn)品，是通過將皂原料酸化來使這些皂溶解而產(chǎn)生的。酸性油主要包含游離脂肪酸(FFA)和?；视?。餾出物(如棕櫚脂肪酸餾出物(PFAD))是油精煉的副產(chǎn)品，來自用于將游離脂肪酸從該油中消除的蒸餾方法。
該原料可以是油或脂肪精煉的中間產(chǎn)品、廢品或副產(chǎn)品，該原料選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：皂原料；酸性油；脂肪酸餾出物，例如PFAD、大豆脂肪酸餾出物、菜籽脂肪酸餾出物、米糠脂肪酸餾出物、家禽脂肪酸餾出物、牛油脂脂肪酸餾出物，等；來自脫膠的樹膠；來自魚油Ω-3脂肪酸衍生物的產(chǎn)生的副產(chǎn)品；脂肪陷阱油脂(fat trap grease)；黃色油脂、和棕色油脂、游離脂肪酸(如油酸)；或通過物理分離獲得的油的級(jí)分；或其任何組合。
在實(shí)施例中，使用高剪切混合器或空化器將在該系統(tǒng)中的溶液相(例如該油相/疏水相和該親水相)進(jìn)行混合。
在其他的實(shí)施例中，在添加所述一種或多種酯解酶之前，將堿試劑或堿，例如NaOH和/或KOH，添加到所述系統(tǒng)中。具體地，以對應(yīng)于200ppm或更少的量，優(yōu)選地以在10-100ppm范圍內(nèi)的量，添加堿試劑或堿。在該方法中在這個(gè)階段添加堿試劑或堿的主要目的是中和在該油中的痕量的礦物質(zhì)酸。
在另外的實(shí)施例中，所述油相/疏水相包含脂肪酸烷基酯、游離脂肪酸和任選地未反應(yīng)的脂肪酸原料；并且所述親水相包含甘油、醇、水和所述一種或多種酯解酶。
在另外的實(shí)施例中，所述親水相構(gòu)成從5％至50％、10％至50％、20％至50％、20％至45％、或甚至20％至40％的該反應(yīng)系統(tǒng)(反應(yīng)物混合物)(w/w)，并且甘油構(gòu)成30％至85％(w/w)、40％至85％(w/w)、45％至85％(w/w)、50％至85％(w/w)或甚至60％至80％(w/w)的該親水相。
在其他實(shí)施例中，甘油構(gòu)成30％至70％(w/w)、35％至70％(w/w)、40％至70％(w/w)或甚至45％至70％(w/w)的該親水相。
隨著該方法進(jìn)行，在該甘油-水相中，甘油的量可以增加至超過理想水平。因此，將該親水相的部分與包含脂肪酸烷基酯的油相/疏水相分離可以是有優(yōu)勢的，并且例如在本發(fā)明的方法中再使用該分離的部分。如技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的那樣，為了再使用這些酶，可以通過潷水器、凝結(jié)器、旋風(fēng)分離器或渦流分離器、沉降器或通過離心將該親水相的部分與該脂肪相分離。再使用該親水相的該部分提供了另外的優(yōu)勢，因?yàn)檫@也將導(dǎo)致這些酯解酶中的至少部分的再循環(huán)。當(dāng)把該親水相該部分返回到該反應(yīng)器中時(shí)，可以添加新鮮液體脂肪酶以將脂肪酶活性維持在理想水平并且可以添加醇(例如甲醇)。
因此，在一些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法包括
i)在所述脂肪酸原料與所述醇的反應(yīng)過程中或當(dāng)所述反應(yīng)已經(jīng)終止時(shí)，將所述甘油/所述親水相的至少一部分從該系統(tǒng)去除；和
ii)在如以上權(quán)利要求任一項(xiàng)中所定義的方法中，將該方法與另外的脂肪酸原料組合，其中該方法與該甘油/所述親水相去除的該方法是相同的或不同的。
根據(jù)一些實(shí)施例，去除30％至80％(w/w)的所述甘油/所述親水相，例如30％至70％(w/w)、例如40％至60％(w/w)或45％至55％(w/w)的所述甘油/所述親水相。
仍然在另外的實(shí)施例中，將所述油相/疏水相和所述親水相經(jīng)受堿處理以形成所述游離脂肪酸的皂/鹽。
在根據(jù)本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的是，促進(jìn)包含F(xiàn)FA的皂原料級(jí)分的分離，在該處理之前，用堿試劑或堿(優(yōu)選地NaOH或KOH或其混合物)處理發(fā)生時(shí)該油相和親水相很少分離或沒有分離。因此，在本發(fā)明的這些實(shí)施例中，油相/疏水相和所述親水相都經(jīng)受堿處理以形成存在于油相/疏水相中的游離脂肪酸的至少一部分的皂/脂肪酸鹽。然而，這不排除，在用堿試劑處理前，親水相降低，例如當(dāng)為了與如上披露的另外的脂肪酸原料組合，去除該甘油/該親水相的部分時(shí)。具體地，在用堿試劑處理前，該親水相可以降低30％至80％(w/w)，例如降低30％至70％(w/w)、例如降低40％至60％(w/w)或降低45％至55％(w/w)。
可以將該堿試劑/堿作為在水中的1-6N溶液添加，例如2-9N溶液、3-9N溶液、4-9N溶液、5-9N溶液、6-9N溶液、7-9N溶液、8-9N溶液，例如3-6N溶液、4-6N溶液或5-6N溶液。在一些實(shí)施例中，優(yōu)選6-9N溶液，因?yàn)檫@將非常少的另外的水引入該系統(tǒng)。
在一些實(shí)施例中，所述堿的量在游離脂肪酸的量的1.0-2.0摩爾當(dāng)量范圍內(nèi)，例如在游離脂肪酸的量的1.05-1,30摩爾當(dāng)量或例如1.05-1.25摩爾當(dāng)量的范圍內(nèi)。
可以在如下溫度下進(jìn)行堿處理，該溫度在35℃至85℃范圍內(nèi)，例如在35℃至80℃、例如35℃至75℃、35℃至70℃、35℃至60℃、35℃至50℃、35℃至45℃、35℃至40℃、40℃至80℃、例如40℃至75℃、40℃至70℃、40℃至60℃、40℃至50℃、40℃至45℃、45℃至80℃、例如45℃至75℃、45℃至70℃、45℃至60℃、或例如45℃至50℃范圍內(nèi)。
一般來說，在盡可能低的溫度下或遠(yuǎn)低于使用的醇的沸點(diǎn)下操作是有優(yōu)勢的，例如在35℃至45℃時(shí)，不需要或只需要很少的另外的加熱。因此，優(yōu)選地在如下溫度下進(jìn)行堿處理，該溫度在35℃至45℃范圍內(nèi)，例如在36℃至45℃范圍內(nèi)，例如在37℃至45℃、38℃至45℃、39℃至45℃或40℃至45℃范圍內(nèi)。技術(shù)人員將理解的是，該溫度上限主要通過醇的沸點(diǎn)來進(jìn)行定義，并進(jìn)一步取決于存在于該系統(tǒng)中的醇的量和安裝在該生產(chǎn)裝置上的洗滌系統(tǒng)的效率。
所述堿處理的持續(xù)時(shí)間可以是從5分鐘至2小時(shí)，例如從7分鐘至2小時(shí)、10分鐘至2小時(shí)、15分鐘至2小時(shí)、30分鐘至2小時(shí)、例如從30分鐘至1,5小時(shí)或例如從30分鐘至1小時(shí)。具體地，當(dāng)操作連續(xù)的系統(tǒng)時(shí)，熟練的短的持續(xù)時(shí)間，例如幾分鐘，是可能的。
在本發(fā)明的另外的實(shí)施例中，將所述堿試劑/堿作為非水性溶液添加。具體地，將該堿試劑/堿溶解在醇(例如甲醇)中。
根據(jù)其他的實(shí)施例，所述堿試劑是甲醇鈉或甲醇鉀或這兩者的混合物。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法可以進(jìn)一步包括如下步驟，在該步驟中將所述脂肪酸烷基酯與所述皂/脂肪酸鹽分離。當(dāng)在根據(jù)本發(fā)明所述的方法中進(jìn)行時(shí)脂肪酸烷基酯與該皂/脂肪酸鹽的分離是具體地有效的。這主要是因?yàn)椋趯χ舅狨?生物柴油進(jìn)行任何進(jìn)一步的加工(例如用堿試劑處理以去除游離脂肪酸)之前，將包含脂肪酸酯/生物柴油的油相/疏水相從親水相的分離是可以避免的。結(jié)果，將烷基酯相從甘油/皂相分離是快速的并且沒有形成或很少形成包含脂肪酸酯/生物柴油、甘油和酶的第三種酶乳劑相，并且在該方法中很少失去產(chǎn)物(脂肪酸酯/生物柴油)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，通過使用大量的或大體積的甘油可以提供另外的優(yōu)勢，這在將皂/脂肪酸鹽從脂肪酸酯/生物柴油中萃取出來中是有效的。
可以通過重力沉降、傾析和/或離心將該脂肪酸烷基酯從所述皂/脂肪酸鹽中分離。
在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，在如下條件下并使用如下量的堿試劑進(jìn)行用所述一種或多種堿試劑進(jìn)行的處理，這些條件和堿試劑的量允許在油相/疏水相中的所述游離脂肪酸的量減少到少于2％(w/w)，例如少于1.5％(w/w)、少于1％(w/w)、少于0.75％(w/w)、少于0,5％(w/w)、或例如少于0.25％(w/w)。
根據(jù)本發(fā)明的另外的實(shí)施例，該方法包括將包含脂肪?；サ慕M合物與所述皂/脂肪?；}分離，其中在所述組合物中的游離脂肪酸的含量低于2％(w/w)，例如低于1.5％(w/w)、低于1％(w/w)、低于0.75％(w/w)、低于0,5％(w/w)、或例如低于0.25％(w/w)和/或在所述組合物中甘油酯(優(yōu)選地表達(dá)為“結(jié)合甘油”；即，結(jié)合在甘油酯中的甘油)的含量低于2％(w/w)，例如低于1.5％(w/w)、低于1％(w/w)、低于0.75％(w/w)、低于0,5％(w/w)、或例如低于0.23％(w/w)。
優(yōu)選地，該方法包括將包含脂肪酰基酯的組合物與所述皂/脂肪?；}分離，其中在所述組合物中的游離脂肪酸的含量低于0.25％(w/w)和/或在所述組合物中甘油酯(優(yōu)選地表達(dá)為“結(jié)合甘油”；即，結(jié)合在甘油酯中的甘油)的含量低于0.23％(w/w)。因此，根據(jù)這些實(shí)施例，本發(fā)明的產(chǎn)品優(yōu)選地是不需要另外的精煉的、滿足生物柴油指定要求的產(chǎn)品。
在另外的實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法包括將油相/疏水相與親水相分離以提供如下組合物，該組合物包含至少90％(w/w)脂肪酸烷基酯、從300至400ppm皂、少于0.25％(w/w)游離脂肪酸和少于0.23％(w/w)甘油酯(優(yōu)選地表達(dá)為“結(jié)合甘油”；即，結(jié)合在甘油酯中的甘油)。
可以將所述皂/脂肪酸鹽經(jīng)受酸化以產(chǎn)生游離脂肪酸，例如通過將該皂/脂肪酸鹽與HCl、H3PO4和/或H2SO4接觸。目前，H2SO4和也可能的H3PO4是優(yōu)選的，因?yàn)榈玫降柠}容易沉淀，并且因此可以容易地從該甘油分離以提供有價(jià)值的高等級(jí)/工業(yè)級(jí)甘油產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明所述的方法的示意圖，該示意圖包含工業(yè)級(jí)甘油的產(chǎn)生，該產(chǎn)生示于圖1中。
如技術(shù)人員將理解的那樣，通過所述皂/脂肪酸鹽的酸化產(chǎn)生的游離脂肪酸，可以在如上披露的根據(jù)本發(fā)明所述的方法中用作脂肪酸原料。
通過所述皂/脂肪酸鹽的酸化產(chǎn)生的游離脂肪酸的量可以在0.5％至3％(w/w)的所述原料的范圍內(nèi)，例如從1％至2％(w/w)的所述原料的范圍內(nèi)。
在具體的實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的任一項(xiàng)所述的方法包括如下步驟
i)提供包含油相/疏水相和親水相的反應(yīng)系統(tǒng)；例如如下反應(yīng)系統(tǒng)，其中該油相/疏水相包含脂肪酸原料(該脂肪酸原料含有游離的和/或甘油酯結(jié)合的脂肪酸)，并且該親水相包含水、一種或多種酯解酶、和任選地甘油；
ii)將醇，例如C1-C5醇，優(yōu)選地乙醇或甲醇，滴加或連續(xù)地添加至所述反應(yīng)系統(tǒng)以達(dá)到如下量，該量相對于該油相/疏水相在14％至24％(w/w)的范圍內(nèi)；
iii)將該脂肪酸原料和該一種或多種酯解酶經(jīng)受如下條件，這些條件允許所述游離和/或甘油酯結(jié)合的脂肪酸的酯交換以提供包含脂肪酸烷基酯的組合物；
iv)將所述組合物與堿試劑/堿在如下條件下接觸，這些條件允許從在該組合物中的殘余的游離脂肪酸形成脂肪酸鹽/皂；并且
V)將該脂肪酸烷基酯與脂肪酸鹽/皂分離。
在另外的實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法包括
i)提供包含所述油相/疏水相和所述親水相的系統(tǒng)，
ii)在水和一種或多種酯解酶存在的情況下，將存在于所述油相/疏水相中的脂肪酸原料與醇反應(yīng)以產(chǎn)生所述脂肪酸烷基酯和所述游離脂肪酸。
iii)將該油相/疏水相和親水相經(jīng)受堿處理以形成存在于該油相/疏水相中的游離脂肪酸的皂/脂肪酸鹽
iv)將脂肪酸烷基酯與包含所述皂/脂肪酸鹽的親水相分離
v)將所述親水相經(jīng)受酸化，例如通過添加H2SO4或H3PO4。
具體地，可以將所述皂/脂肪酸鹽進(jìn)行中和/經(jīng)受酸化，例如通過添加H2SO4或H3PO4，以形成鹽，例如Na2SO4或K2SO4，該鹽沉淀在甘油中。
在另外的步驟中，該方法優(yōu)選地包含將沉淀的鹽從該甘油分離，例如通過過濾。
為了提供高等級(jí)或工業(yè)級(jí)甘油，該方法可以進(jìn)一步包含干燥所述甘油，以從該甘油中去除例如水和醇，例如甲醇。
具體地，可以純化該甘油，例如通過干燥和/或去除醇，和/或通過過濾以產(chǎn)生如下組合物，其中在該組合物中，甘油的含量高于95％(w/w)，例如高于97％(w/w)、高于97.5％(w/w)、高于98％(w/w)、高于98.5％(w/w)、高于99％(w/w)、高于99.5％(w/w)、高于99.75％(w/w)、高于99.8％(w/w)或高于99.9％(w/w)。
另外地，根據(jù)這些實(shí)施例，可以在相對于該油相/疏水相對應(yīng)于2％至30％(w/w)或10％至12％(w/w)的甘油的量、相對于該油相/疏水相對應(yīng)于1.5％至5.0％(w/w)或1.5％至2.0％(w/w)的水的量和相對于該油相/疏水相在14％至24％(w/w)范圍內(nèi)的醇(例如甲醇)的量存在下，將所述脂肪酸原料與醇反應(yīng)。
可以經(jīng)1至30小時(shí)時(shí)間段添加該醇，例如經(jīng)1至20小時(shí)時(shí)間段，例如16小時(shí)時(shí)間段。
在某些具體的實(shí)施例中，所述脂肪酸原料包含玉米油或者酒糟玉米油或主要由其組成。
在另外的方面，本發(fā)明提供制造脂肪酸烷基酯的方法，該方法包括將脂肪酸原料與酯解酶接觸；該酯解酶選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成
(a)包含在SEQ ID NO:2中闡述的氨基酸序列或由其組成的多肽；
(b)是SEQ ID NO:2中闡述的氨基酸序列的子序列的多肽；
(c)與在(a)和(b)中定義的多肽中的任一種具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的多肽。
在項(xiàng)目(c)中闡釋的脂肪酶可以具有如下氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQ ID NO:2的多肽在多達(dá)40個(gè)氨基酸上有所不同，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40個(gè)。
該脂肪酶可以是親本脂肪酶的變體，該變體具有脂肪酶活性并且與SEQ ID NO:1具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性，并且在對應(yīng)于T231R+N233R和SEQ ID NO:2的D96E、D111A、D254S、G163K、P256T、G91T、G38A、D27R、和N33Q中至少一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))的位置處包括取代。
在另一個(gè)實(shí)施例中，該脂肪酶是如下變體，該變體具有脂肪酶活性并且與SEQ ID NO:1具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性，并且在對應(yīng)于T231R+N233R和SEQ ID NO:2的D96E、D111A、D254S、G163K、P256T、G91T、G38A、D27R、和N33Q中至少一個(gè)或多個(gè)(例如，若干個(gè))的位置處包括取代，這些位置選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：
a)D96E T231R N233R；
b)N33Q D96E T231R N233R；
c)N33Q T231R N233R；
d)N33Q D111A T231R N233R；
e)N33Q T231R N233R P256T；
f)N33Q G38A G91T G163K T231R N233R D254S；
g)N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T；
h)D27R N33Q G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T；
i)D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R P256T；
j)D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S；
k)D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T；
l)D96E T231R N233R D254S；
m)T231R N233R D254S P256T；
n)G163K T231R N233R D254S；
o)D27R N33Q G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T；
p)D27R G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T；
q)D96E G163K T231R N233R D254S；
r)D27R G163K T231R N233R D254S；
s)D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S；
t)D27R G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T；
u)D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T；
v)D27R D96E G163K T231R N233R D254S；
w)D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T；
x)D27R G38A D96E G163K T231R N233R D254S P256T。
在具體的實(shí)施例中，該方法包括將所述脂肪酸原料與如下量的脂肪酶接觸，該量優(yōu)選地在0.005-5g酶蛋白(EP)/kg脂肪酸原料的范圍內(nèi)，例如在0.005-2.5g EP/kg脂肪酸原料、0.005-1g EP/kg脂肪酸原料、0.005-0.75g EP/kg脂肪酸原料、0.005-0.5g EP/kg脂肪酸原料、0.005-0.25g EP/kg脂肪酸原料、0.005-0.1g EP/kg脂肪酸原料、0.005-0.075g EP/kg脂肪酸原料、0.005-0.05g EP/kg脂肪酸原料、0.005-0.025g EP/kg脂肪酸原料、0.005-0.01g EP/kg脂肪酸原料、0.01-5g EP/kg脂肪酸原料、0.02-5g EP/kg脂肪酸原料、0.03-5g EP/kg脂肪酸原料、0.04-5g EP/kg脂肪酸原料、0.05-5g EP/kg脂肪酸原料、0.06-5g EP/kg脂肪酸原料、0.07-5g EP/kg脂肪酸原料、0.08-5g EP/kg脂肪酸原料、0.09-5g EP/kg脂肪酸原料、0.1-5g EP/kg脂肪酸原料、0.2-5g EP/kg脂肪酸原料、0.3-5g EP/kg脂肪酸原料、0.4-5g EP/kg脂肪酸原料、0.5-5g EP/kg脂肪酸原料、0.6-5g EP/kg脂肪酸原料、0.7-5g EP/kg脂肪酸原料、0.8-5g EP/kg脂肪酸原料、0.9-5g EP/kg脂肪酸原料、1-5g EP/kg脂肪酸原料、2-5g EP/kg脂肪酸原料、3-5g EP/kg脂肪酸原料、4-5g EP/kg脂肪酸原料、0.01-4g EP/kg脂肪酸原料、0.02-3g EP/kg脂肪酸原料、0.03-2g EP/kg脂肪酸原料、0.04-1g EP/kg脂肪酸原料、0.05-0.9g EP/kg脂肪酸原料、0.06-0.8g EP/kg脂肪酸原料、0.07-0.7g EP/kg脂肪酸原料、0.08-0.6g EP/kg脂肪酸原料、0.09-0.5g EP/kg脂肪酸原料、0.1-0.4g EP/kg脂肪酸原料、0.1-0.3g EP/kg脂肪酸原料、或例如0.1-0.25g EP/kg脂肪酸原料的范圍內(nèi)。
脂肪酸烷基酯組合物及其用途
脂肪酸烷基酯用于廣泛范圍的產(chǎn)品中并作為合成中間體使用。他們的工業(yè)化應(yīng)用中的一些包括用作潤滑劑、塑化劑、防銹劑、鉆井和切削油、和用于合成超級(jí)酰胺和脂肪醇的起始材料。某些本發(fā)明的實(shí)施例具體地涉及燃料。由于與石油基燃料在十六烷數(shù)目、能含量、粘度和相變上的相似性，短鏈醇的脂肪酸烷基酯是無毒的、可生物降解的并且是石油基燃料極好的全部或部分的替代。
本發(fā)明的另一方面關(guān)于如下組合物，該組合物包含至少90％(w/w)脂肪酸烷基酯、從300至400ppm皂、少于0.25％(w/w)游離脂肪酸和少于0.23％(w/w)甘油酯(優(yōu)選地表達(dá)為“結(jié)合甘油”；即，結(jié)合在甘油酯中的甘油)。在游離脂肪酸和甘油酯方面，該產(chǎn)品滿足生物柴油的指定要求。例如這些規(guī)格要求是由ASTM國際(ASTM International)(針對生物柴油的規(guī)格(specification for biodiesel)(B100)-ASTM 6751)(在http://www.astm.org/Standards/可得到)提供的。與在來自之前已知的方法的產(chǎn)品中的皂含量相比，皂的含量低5-10x；通過過濾可以將該含量去除或降低至可接受的水平。具體地，所述組合物可以是通過以上披露的程序可獲得的組合物。
在一些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的組合物通過如下方法是可獲得的，其中所述脂肪酸原料包含玉米油或主要由其組成，并且所述堿試劑是KOH。諸位發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用玉米油(corn oil)作為原料時(shí)，該方法提供如下產(chǎn)品，該產(chǎn)品典型地不需要進(jìn)一步加工或純化，并且?guī)缀跏菬o色。
在其他方面，根據(jù)本發(fā)明所述的組合物可以潛在地通過本領(lǐng)域已知的方法(例如蒸餾(包括快速蒸發(fā)、氣提、和除臭)；相分離；萃??；和干燥))進(jìn)行精煉或純化。這種精煉的目的可以是從該組合物中去除或回收以上提及的組分中的一種或多種。實(shí)例包括但不限于用于去除水的干燥。因此，可以不用進(jìn)一步精煉或通過一種或多種方法精煉應(yīng)用該粗反應(yīng)物混合物(組合物)。
本發(fā)明的另外的方面提供包含甘油的組合物，所述組合物是可以通過根據(jù)本發(fā)明所述的方法獲得的，其中通過將皂/脂肪酸鹽與H3PO4和/或H2SO4接觸，將所述皂/脂肪酸鹽經(jīng)受酸化以產(chǎn)生游離脂肪酸和鹽，例如Na2SO4或K2SO4。如上提及的，用這些酸對皂/脂肪酸鹽進(jìn)行酸化導(dǎo)致如下鹽的形成，這些鹽容易沉淀，并且因此可以容易地從該甘油分離以提供有價(jià)值的高等級(jí)/工業(yè)級(jí)甘油產(chǎn)品。如在圖1制備高等級(jí)/工業(yè)級(jí)乙醇的方法中所示，可以通過過濾或其他方法去除所述鹽。該方法可進(jìn)一步包括干燥和/或降低在所述甘油中醇(例如甲醇)的量。根據(jù)本發(fā)明的可獲得的組合物可以具有如下甘油含量，該含量高于97％(w/w)，例如高于97.5％(w/w)、高于98％(w/w)、高于98.5％(w/w)、高于99％(w/w)、高于99.5％(w/w)、高于99.75％(w/w)、高于99.8％(w/w)或高于99.9％(w/w)。
項(xiàng)目
本發(fā)明進(jìn)一步披露于以下項(xiàng)目的任一項(xiàng)中并由其定義：
1.生產(chǎn)脂肪酸烷基酯的方法，該方法包括：在包含油相/疏水相和親水相的反應(yīng)系統(tǒng)中，在一種或多種酯解酶存在的情況下，將脂肪酸原料與醇反應(yīng)來生產(chǎn)脂肪酸烷基酯和甘油，其中在所述醇/所述親水相存在的情況下，通過用一種或多種堿性試劑進(jìn)行處理，皂/鹽形成自在油相/疏水相中的游離脂肪酸。
2.生產(chǎn)脂肪酸烷基酯的方法，該方法包括：在包含油相/疏水相和親水相的反應(yīng)系統(tǒng)中，在水和一種或多種酯解酶存在的情況下，將脂肪酸原料與醇反應(yīng)來生產(chǎn)脂肪酸烷基酯和甘油；并且在將油相/疏水相從親水相分離之前，通過用一種或多種堿試劑進(jìn)行處理，去除或降低游離脂肪酸的量以形成游離脂肪酸的皂/鹽。
3.根據(jù)項(xiàng)目1或2所述的方法，包括
i)提供包含所述油相/疏水相和所述親水相的系統(tǒng)，
ii)在水和一種或多種酯解酶存在的情況下，將存在于所述油相/疏水相中的脂肪酸原料與醇反應(yīng)以產(chǎn)生所述脂肪酸烷基酯、游離脂肪酸和甘油。
4.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，包含將脂肪酸烷基酯與包含所述皂/鹽和該一種或多種酯解酶的親水相分離。
5.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該一種或多種酯解酶選自脂肪酶、磷酸脂肪酶、角質(zhì)酶及其混合物。
6.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，包括
i)提供反應(yīng)系統(tǒng)，該反應(yīng)系統(tǒng)具有包含脂肪酸原料的油相/疏水相，和包含醇、水和一種或多種酯解酶的親水相；
ii)在所述水和所述一種或多種酯解酶存在的情況下，將脂肪酸原料與醇反應(yīng)以產(chǎn)生游離脂肪酸、甘油、和脂肪酸烷基酯；
iii)添加一種或多種堿試劑到該反應(yīng)系統(tǒng)中以允許在步驟ii)中產(chǎn)生的游離脂肪酸的皂/鹽的形成；并且
iv)將脂肪酸烷基酯與脂肪酸的皂/鹽和一種或多種酯解酶分離。
7.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中該一種或多種酯解酶是一種或多種脂肪酶，任選地與一種或多種磷酸脂肪酶和/或一種或多種角質(zhì)酶組合。
8.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述一種或多種酯解酶的總量在0.005-5g酶蛋白質(zhì)(EP)/kg油相/疏水相或脂肪酸原料范圍內(nèi)，例如在0.005-2.5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-1g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.75g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.25g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.1g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.075g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.05g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.025g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.01g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.01-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.02-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.03-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.04-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.05-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.06-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.07-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.08-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.09-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.1-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.2-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.3-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.4-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.5-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.6-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.7-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.8-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.9-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、1-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、2-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、3-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、4-5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.01-4g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.02-3g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.03-2g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.04-1g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.05-0.9g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.06-0.8g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.07-0.7g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.08-0.6g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.09-0.5g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.1-0.4g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.1-0.3g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料范圍內(nèi)，或例如在0.1-0.25g EP/kg油相/疏水相或脂肪酸原料范圍內(nèi)。
9.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟ii)包括將脂肪酸原料與所述醇反應(yīng)，直到至少60％(w/w)(例如至少65％(w/w)、至少70％(w/w)、至少75％(w/w)、至少80％(w/w)、至少85％(w/w)、至少90％(w/w)，或例如至少95％(w/w))的脂肪酸?；蛟谒鲋舅嵩现械挠坞x脂肪酸已經(jīng)被轉(zhuǎn)換成脂肪酸烷基酯。10.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中水的量對應(yīng)于0.5％至5.0％(w/w)的所述油相/疏水相，例如0.5％至4.0％(w/w)的所述油相/疏水相、0.5％至3.0％(w/w)的所述油相/疏水相、0.5％至2.5％(w/w)的所述油相/疏水相或例如0.5％至2.0％(w/w)的所述油相/疏水相。
11.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，該方法包括，通過脂肪酸原料的反應(yīng)和任選地通過甘油的另外的添加，將在所述親水相中的甘油的量增加至2％至30％(w/w)，優(yōu)選地從2％至20％(w/w)，例如相對于該油相/疏水相從2％至20％(w/w)。
12.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中添加該醇以達(dá)到如下量，該量相對于該油相/疏水相在12％至34％(w/w)的范圍內(nèi)，例如相對于該油相/疏水相在17％至34％(w/w)的范圍內(nèi)，或例如相對于該油相/疏水相在12％至24％(w/w)的范圍內(nèi)。
13.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中將該脂肪酸原料與所述醇在如下溫度下反應(yīng)，其中該溫度在32℃至45℃的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在32℃至40℃的范圍內(nèi)。
14.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法包括，將所述脂肪酸原料與所述醇反應(yīng)持續(xù)16-50小時(shí)，例如持續(xù)24-50小時(shí)，例如持續(xù)30-50小時(shí)、持續(xù)30-45小時(shí)、持續(xù)35-50小時(shí)、持續(xù)35-45小時(shí)、持續(xù)38-42小時(shí)，優(yōu)選地持續(xù)35-40小時(shí)。
15.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法以分批模式或以連續(xù)模式進(jìn)行。
16.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述醇是C1-C5醇，優(yōu)選乙醇或甲醇。
17.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中滴加或連續(xù)地添加所述醇。
18.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述一種或多種酯解酶中至少一種是液體酶。
19.根據(jù)以上項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的方法，其中該脂肪酸原料源自以下各項(xiàng)中的一種或多種：海藻油、卡諾拉油(canola oil)、椰子油(coconut oil)、蓖麻油、椰子油(coconut oil)、椰子干油(copra oil)、玉米油(corn oil)、酒糟玉米油(corn oil)、棉花籽油、亞麻油、魚油、葡萄籽油、大麻油、麻風(fēng)果油、荷荷巴油、芥子油、卡諾拉油(canola oil)、棕櫚油、棕櫚硬脂、棕櫚油精、棕櫚仁油、花生油、菜籽油、米糠油、紅花油、大豆油、向日葵油、妥爾油、來自鹽生植物和/或動(dòng)物脂肪的油(包括來自豬、牛和羊的油脂，豬油，雞脂肪，魚油，棕櫚油游離脂肪酸餾出物，大豆油游離脂肪酸餾出物，皂原料脂肪酸材料，黃色油脂，和棕色油脂或其任何組合)。
20.根據(jù)以上項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用高剪切混合器或空化器將在該系統(tǒng)/反應(yīng)系統(tǒng)中的溶液相進(jìn)行混合。
21.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中在添加所述一種或多種酯解酶之前，將堿試劑或堿，例如NaOH和/或KOH，添加到所述系統(tǒng)中。
22.根據(jù)項(xiàng)目21所述的方法，其中以對應(yīng)于200ppm或更少的量，優(yōu)選地以在10-100ppm范圍內(nèi)的量，添加堿試劑或堿。
23.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中
所述油相/疏水相包含脂肪酸烷基酯、游離脂肪酸和任選地未反應(yīng)的脂肪酸原料；并且
所述親水相包含甘油、醇、水和該一種或多種酯解酶。
24.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中
所述親水相構(gòu)成從5％至50％、10％至50％、20％至50％、20％至45％、或甚至20％至40％的該系統(tǒng)/反應(yīng)系統(tǒng)(w/w)，并且
甘油構(gòu)成30％至85％(w/w)、40％至85％(w/w)、45％至85％(w/w)、50％至85％(w/w)或甚至60％至80％(w/w)的該親水相。
25.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中甘油構(gòu)成30％至80％(w/w)、30％至70％(w/w)、35％至70％(w/w)、40％至70％(w/w)或甚至45％至70％(w/w)的該親水相。
26.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，包含
i)在所述脂肪酸原料與所述醇的反應(yīng)過程中或當(dāng)所述反應(yīng)已經(jīng)終止時(shí)，將所述甘油/所述親水相的至少一部分從該系統(tǒng)/反應(yīng)系統(tǒng)去除；并且
ii)在如以上項(xiàng)目中任一項(xiàng)所定義的方法中，將該方法與另外的脂肪酸原料組合，其中該方法與該甘油/所述親水相去除的方法是相同的或不同的。
27.根據(jù)項(xiàng)目26所述的方法，其中去除30％至70％(w/w)的所述甘油/所述親水相，例如40％至60％(w/w)或45％至55％(w/w)的所述甘油/所述親水相。
28.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述油相/疏水相和所述親水相經(jīng)受堿處理以形成所述游離脂肪酸的皂/鹽。
29.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中將該油相/疏水相和所述親水相經(jīng)受堿處理以形成存在于油相/疏水相中的游離脂肪酸的至少一部分的皂/脂肪酸鹽。
30.根據(jù)項(xiàng)目28至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述堿處理包含將油相/疏水相和所述親水相與選自KOH或NaOH或其混合物的堿試劑或堿接觸。
31.根據(jù)項(xiàng)目28至30中任一項(xiàng)所述的方法，其中將該堿試劑/堿作為在水中的1-6N溶液添加，例如2-9N溶液、3-9N溶液、4-9N溶液、5-9N溶液、6-9N溶液、7-9N溶液、8-9N溶液，例如3-6N溶液、4-6N溶液或5-6N溶液。
32.根據(jù)項(xiàng)目28至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述堿的量在游離脂肪酸的量的1.0-2.0摩爾當(dāng)量范圍內(nèi)，例如在游離脂肪酸的量的1.05-1,30摩爾當(dāng)量或例如1.05-1.25摩爾當(dāng)量的范圍內(nèi)。
33.根據(jù)項(xiàng)目28至32中任一項(xiàng)所述的方法，其中在如下溫度下進(jìn)行所述堿處理，其中該溫度在35℃至85℃的范圍內(nèi)，例如在35℃至80℃的范圍內(nèi)。
34.根據(jù)項(xiàng)目28至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述堿處理的持續(xù)時(shí)間是從30秒至2小時(shí)，例如從30秒至1小時(shí)、從30秒至30分鐘、從1至30分鐘、從2-30分鐘、從3-30分鐘、從5分鐘至2小時(shí)，例如從7分鐘至2小時(shí)、10分鐘至2小時(shí)、15分鐘至2小時(shí)、30分鐘至2小時(shí)，例如從30分鐘至1,5小時(shí)或例如從30分鐘至1小時(shí)。
35.根據(jù)項(xiàng)目28至34中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述堿試劑/堿作為非水性溶液添加。
36.根據(jù)項(xiàng)目28至35中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述堿試劑/堿溶解在醇、例如甲醇中。
37.根據(jù)項(xiàng)目28至34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述堿試劑是甲醇鈉或甲醇鉀或這兩者的混合物。
38.根據(jù)項(xiàng)目28至37中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述脂肪酸烷基酯與所述皂/脂肪酸鹽分離。
39.根據(jù)項(xiàng)目28至38中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過重力沉降、傾析和/或離心將所述脂肪酸烷基酯與所述皂/脂肪酸鹽分離。
40.根據(jù)項(xiàng)目28至39中任一項(xiàng)所述的方法，其中在如下條件下并使用如下量的堿試劑進(jìn)行用所述一種或多種堿試劑進(jìn)行的處理，這些條件和堿試劑的量允許在油相/疏水相中的所述游離脂肪酸的量減少到少于2％(w/w)，例如少于1.5％(w/w)、少于1％(w/w)、少于0.75％(w/w)、少于0,5％(w/w)、或例如少于0.25％(w/w)。41.根據(jù)項(xiàng)目28至39中任一項(xiàng)所述的方法，該方法包括將包含脂肪?；サ慕M合物與所述皂/脂肪?；}分離，其中在所述組合物中的游離脂肪酸的含量低于0.25％(w/w)和/或在所述組合物中甘油酯的含量低于0.23％(w/w)。
42.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，該方法包括將包含脂肪?；サ慕M合物與所述皂/脂肪?；}分離，其中在所述組合物中的游離脂肪酸的含量低于2％(w/w)，例如低于1.5％(w/w)、低于1％(w/w)、低于0.75％(w/w)、低于0,5％(w/w)、或例如低于0.25％(w/w)和/或在所述組合物中甘油酯(優(yōu)選地表達(dá)為“結(jié)合甘油”；即，結(jié)合在甘油酯中的甘油)的含量低于2％(w/w)，例如低于1.5％(w/w)、低于1％(w/w)、低于0.75％(w/w)、低于0,5％(w/w)、或例如低于0.23％(w/w)。
43.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，該方法包括將包含脂肪?；サ慕M合物與所述皂/脂肪?；}分離，其中在所述組合物中的游離脂肪酸的含量低于0.25％(w/w)和/或在所述組合物中甘油酯(優(yōu)選地表達(dá)為“結(jié)合甘油”；即，結(jié)合在甘油酯中的甘油)的含量低于0.23％(w/w)。因此，根據(jù)這些實(shí)施例，本發(fā)明的產(chǎn)品優(yōu)選地是不需要另外的精煉的、滿足生物柴油指定要求的產(chǎn)品。
44.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，該方法包括將油相/疏水相與親水相分離以提供如下組合物，該組合物包含至少90％(w/w)脂肪酸烷基酯、從300至400ppm皂、少于0.25％(w/w)游離脂肪酸和少于0.23％(w/w)甘油酯。45.根據(jù)項(xiàng)目28至44中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述皂/脂肪酸鹽經(jīng)受酸化以產(chǎn)生游離脂肪酸，例如通過將該皂/脂肪酸鹽與HCl、H3PO4和/或H2SO4接觸。
46.根據(jù)項(xiàng)目41至45中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過所述皂/脂肪酸鹽的酸化產(chǎn)生的游離脂肪酸可以在根據(jù)以上項(xiàng)目中任一項(xiàng)所述的方法中用作脂肪酸原料。
47.根據(jù)項(xiàng)目41至46中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過所述皂/脂肪酸鹽的酸化產(chǎn)生的游離脂肪酸的量在0.5％至3％(w/w)的所述原料的范圍內(nèi)，例如從1％至2％(w/w)的所述原料。
48.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，包括如下步驟
i)提供包含油相/疏水相和親水相的反應(yīng)系統(tǒng)；例如如下反應(yīng)系統(tǒng)，其中該油相/疏水相包含脂肪酸原料(該脂肪酸原料含有游離的和/或甘油酯結(jié)合的脂肪酸)，并且該親水相包含水、一種或多種酯解酶、和任選地甘油；
ii)將醇，例如C1-C5醇，優(yōu)選地乙醇或甲醇，滴加或連續(xù)地添加至所述反應(yīng)系統(tǒng)以達(dá)到如下量，該量相對于該油相/疏水相在14％至24％(w/w)的范圍內(nèi)；
iii)將該脂肪酸原料和該一種或多種酯解酶經(jīng)受如下條件，這些條件允許所述游離和/或甘油酯結(jié)合的脂肪酸的酯交換以提供包含脂肪酸烷基酯的組合物；
iv)將所述組合物與堿試劑/堿在如下條件下接觸，這些條件允許從在該組合物中的殘余的游離脂肪酸形成脂肪酸鹽/皂；并且
V)將該脂肪酸烷基酯與脂肪酸鹽/皂分離。
49.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，包括
i)提供包含所述油相/疏水相和所述親水相的系統(tǒng)，
ii)在水和一種或多種酯解酶存在的情況下，將存在于所述油相/疏水相中的脂肪酸原料與醇反應(yīng)以產(chǎn)生所述脂肪酸烷基酯和所述游離脂肪酸。
iii)將該油相/疏水相和親水相經(jīng)受堿處理以形成存在于該油相/疏水相中的游離脂肪酸的皂/脂肪酸鹽
iv)將脂肪酸烷基酯與包含所述皂/脂肪酸鹽的親水相分離
v)將所述親水相經(jīng)受酸化，例如通過添加H2SO4。
50.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述皂/脂肪酸鹽進(jìn)行中和/經(jīng)受酸化，例如通過添加H2SO4或H3PO4，以形成鹽，例如Na2SO4或K2SO4，該鹽沉淀在甘油中。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，包含將沉淀的鹽從該甘油分離，例如通過過濾。
52.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，包含干燥所述甘油，以從該甘油中去除例如水和醇，例如甲醇。
53.根據(jù)項(xiàng)目50至52中任一項(xiàng)所述的方法，其中純化該甘油，例如通過干燥和/或去除醇，和/或通過過濾以產(chǎn)生如下組合物，其中在該組合物中，甘油的含量高于95％(w/w)，例如高于97％(w/w)、高于97.5％(w/w)、高于98％(w/w)、高于98.5％(w/w)、高于99％(w/w)、高于99.5％(w/w)、高于99.75％(w/w)、高于99.8％(w/w)或高于99.9％(w/w)。47.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中在相對于該油相/疏水相對應(yīng)于2％至30％(w/w)的甘油的量、相對于該油相/疏水相對應(yīng)于1.5％至5.0％(w/w)的水的量和相對于該油相/疏水相在14％至24％(w/w)范圍內(nèi)的醇(例如甲醇)的量存在下，將所述脂肪酸原料與醇反應(yīng)。
54.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中經(jīng)1至30小時(shí)時(shí)間段添加所述醇，例如經(jīng)1至20小時(shí)時(shí)間段，例如經(jīng)16小時(shí)時(shí)間段。
55.根據(jù)以上項(xiàng)目中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脂肪酸原料包含玉米油或者酒糟玉米油或主要由其組成。
56.包含至少90％(w/w)脂肪酸烷基酯、從300至400ppm皂、少于0.25％(w/w)游離脂肪酸和少于0.23％(w/w)甘油酯的組合物。
57.根據(jù)項(xiàng)目50所述的組合物，所述組合物是通過根據(jù)項(xiàng)目1至55中任一項(xiàng)所述的方法可獲得的。
58.根據(jù)項(xiàng)目55至57中任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物通過如下方法是可獲得的，其中所述脂肪酸原料包含玉米油或主要由其組成，并且所述堿試劑是KOH。
59.包含甘油的組合物，所述組合物是可以通過在項(xiàng)目1至46中任一項(xiàng)定義的方法獲得的，其中通過將皂/脂肪酸鹽與H3PO4和/或H2SO4接觸，將所述皂/脂肪酸鹽經(jīng)受酸化以產(chǎn)生游離脂肪酸和鹽，例如Na2SO4或K2SO4。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的組合物，其中該方法包含將該鹽從該甘油分離，例如通過過濾。
61.根據(jù)權(quán)利要求59或60所述的組合物，其中該方法包括干燥和/或降低在所述甘油中醇、例如甲醇的量。56.根據(jù)項(xiàng)目55所述的組合物，其中該甘油的含量高于95％(w/w)，例如高于97％(w/w)、高于97.5％(w/w)、高于98％(w/w)、高于98.5％(w/w)、高于99％(w/w)、高于99.5％(w/w)、高于99.75％(w/w)、高于99.8％(w/w)或高于99.9％(w/w)。
通過以下實(shí)例進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行描述，但不應(yīng)將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)例1
每克油使用低劑量的300LU液體脂肪酶(SEQ ID NO:1)，使用酒糟玉米油(corn oil)的酯交換產(chǎn)生脂肪酸甲基酯(FAME)。
在該實(shí)驗(yàn)中，甘油和水濃度是變化的(參見表1)。
表1：
*％w/w基于油的劑量
使用100ml方玻璃燒瓶作為反應(yīng)器并且使用的程序如下：
添加32g油后，添加100ppm溶解在脫礦質(zhì)水中的NaOH。將該混合物在35℃和250rpm下混合10分鐘，接著添加甘油和液體脂肪酶。通過添加0,70g甲醇啟動(dòng)該反應(yīng)，接著經(jīng)16小時(shí)連續(xù)的配量4,17g甲醇。
在35℃和250rpm下，在英諾華(Innova)培養(yǎng)箱中進(jìn)行該反應(yīng)。每批次反應(yīng)時(shí)間是24小時(shí)。
通過氣相色譜對在油相/疏水相中的脂肪酸甲基酯的產(chǎn)率進(jìn)行定量并通過NaOH滴定法測量游離脂肪酸的含量。
表2：
最高的產(chǎn)率表示為總FAME并且通過添加10％甘油和1.5％-2.0％水(w/w的油)實(shí)現(xiàn)最低的可能的游離脂肪酸含量。
實(shí)例2
每克油使用低劑量的300LU液體脂肪酶，使用酒糟玉米油的酯交換產(chǎn)生脂肪酸甲基酯(FAME)。在35℃和530rpm下，在1L攪拌過的夾套玻璃反應(yīng)器中，經(jīng)24小時(shí)進(jìn)行這些酶反應(yīng)。
使用的該程序如下：
將700g的油添加到1.7g 1N NaOH和8.75g的脫礦質(zhì)水中。將該混合物在35℃和530rpm混合10分鐘，接著每克油添加70.0g甘油和300LU液體脂肪酶(SEQ ID NO:1)。通過添加19.2g甲醇啟動(dòng)該反應(yīng)，接著經(jīng)16小時(shí)連續(xù)的配量115.0g甲醇。
通過氣相色譜對在油相/疏水相中的脂肪酸甲基酯的產(chǎn)率和結(jié)合甘油的含量進(jìn)行定量并通過NaOH滴定法測量游離脂肪酸的含量。
表3：
在530rpm下，將該混合物加熱至60℃并經(jīng)3分鐘連續(xù)地添加28ml的3N KOH。然后將溫度升至82℃持續(xù)2小時(shí)。在1小時(shí)和2小時(shí)后取出該混合物的樣品并在2000rpm下離心10分鐘，并分析油相/疏水相用于脂肪酸甲基酯、游離脂肪酸和結(jié)合甘油的含量。
表4：
關(guān)閉加熱和攪動(dòng)并在油相/疏水相中測量脂肪酸甲基酯、游離脂肪酸、結(jié)合甘油和皂的含量前將該混合物靜置1小時(shí)。
表5：
實(shí)例3
將SEQ ID NO:2的脂肪酶用于大規(guī)模試驗(yàn)中，以測試針對生物柴油的應(yīng)用。使用在SEQ ID NO:1中闡述的脂肪酶，將該酶在兩個(gè)水平的劑量上使用并與標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)相比較。生產(chǎn)在10,000gal反應(yīng)器中進(jìn)行并針對每個(gè)系列的測試制作四個(gè)批次。批次編號(hào)一，添加具有181LCLU/g活性的30gal的配制的酶；對應(yīng)于17mg酶蛋白/100g油。在下面的批次B、C、和D中不添加額外的酶。在第一個(gè)10小時(shí)期間，以如下量添加甲醇，該量能維持甲醇在該重相中的濃度為大約15％。這一添加對應(yīng)于在批次A中的1.5摩爾當(dāng)量的脂肪酸且在連續(xù)批次中略減少一點(diǎn)(大約1.2當(dāng)量)。在所有的批次后，停止混合并靜置該重相至釜的底部，用于在下一個(gè)批次中再懸浮。僅從批次B，在反應(yīng)后從該釜的底部排出大約650gal的重相并靜置。使用SEQ ID NO:2的脂肪酶，對于這些試驗(yàn)而言，維持更高的溫度以利用這種酶更高的耐熱性。
表6添加第一個(gè)30gal酶(SEQ ID NO:2)
表7添加20gal酶(SEQ ID NO:2)
表8 50gal SEQ ID NO:1對照，在批次B、C、和D添加5gal
序列表
<110> 諾維信A/S（Novozymes A/S）
<120> 采用堿處理進(jìn)行脂肪酸烷基酯生產(chǎn)
<130> 12920-WO-PCT
<160> 2
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 269
<212> PRT
<213> 疏棉狀嗜熱絲孢菌
<400> 1
Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr
20 25 30
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp
35 40 45
Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr
50 55 60
Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe
65 70 75 80
Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp
85 90 95
Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly
100 105 110
Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val
115 120 125
Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly
130 135 140
His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg
145 150 155 160
Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val
165 170 175
Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr
180 185 190
Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro
195 200 205
Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser
210 215 220
Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly
225 230 235 240
Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro
245 250 255
Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu
260 265
<210> 2
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂肪酶變體
<400> 2
Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Arg Ala Pro Ala Gly Thr
20 25 30
Asn Ile Thr Cys Thr Ala Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp
35 40 45
Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr
50 55 60
Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe
65 70 75 80
Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Glu
85 90 95
Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Ala Gly
100 105 110
Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val
115 120 125
Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly
130 135 140
His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg
145 150 155 160
Gly Asn Lys Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val
165 170 175
Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr
180 185 190
Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro
195 200 205
Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser
210 215 220
Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly
225 230 235 240
Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Ser Ile Thr
245 250 255
Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu
260 265
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