本申請(qǐng)是基于2014年3月31日提交的題為“仿生流體處理的系統(tǒng)和方法”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/972,520并要求其權(quán)利，其通過引用全文納入本文。

關(guān)于聯(lián)邦資助研究/開發(fā)的聲明

本發(fā)明是基于國(guó)立衛(wèi)生研究院提供的1K99HL114719-01A1和HL68130政府資助。政府對(duì)本發(fā)明享有某些權(quán)利。

發(fā)明背景

本發(fā)明通常涉及流體系統(tǒng)，包括微流體裝置、包含這類裝置的系統(tǒng)和使用這類裝置和系統(tǒng)的方法。更具體地，本發(fā)明涉及基于仿生平臺(tái)產(chǎn)生功能性生物材料、物質(zhì)或試劑的裝置、系統(tǒng)和方法。

血小板(PLT)對(duì)于止血、血管發(fā)生和先天免疫而言很重要，且當(dāng)數(shù)目降低至低水平時(shí)，發(fā)生稱作血小板減少癥的病癥，患者處于因出血而死亡的嚴(yán)重風(fēng)險(xiǎn)下。低血小板計(jì)數(shù)的一些原因包括手術(shù)、癌癥、癌癥治療、再生障礙性貧血、毒性化學(xué)品、醇、病毒、感染、懷孕和特發(fā)性免疫血小板減少癥。

治療這類病癥的替代PLT通常完全來源于人供體，但存在由其免疫原性導(dǎo)致的嚴(yán)重臨床問題和膿毒血癥的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。然而，因需要更多PLT輸注所導(dǎo)致的不足(以及近似靜態(tài)的供體池和由于細(xì)菌測(cè)試和惡化產(chǎn)生的短儲(chǔ)藏期)使得健康護(hù)理專業(yè)人員更難以為其患者提供合適的護(hù)理。此外，替代方法(如人工血小板替代品)目前尚不能替代生理血小板產(chǎn)品。

在體內(nèi)，PLT在圖8所示的過程中由祖細(xì)胞(稱為巨核細(xì)胞(MK))生產(chǎn)。在骨髓(BM)中位于血管外，MK將長(zhǎng)、分支的細(xì)胞結(jié)構(gòu)(proPLT(前血小板))延伸至竇狀腺血管內(nèi)，其中其經(jīng)歷剪切速率并將PLT釋放至循環(huán)中。雖然已在體外生長(zhǎng)了功能性人PLT，但迄今為止的細(xì)胞培養(yǎng)方法僅生成約10％proPLT生產(chǎn)且每個(gè)人MK生成10-100個(gè)PLT。相反地，人體中的幾乎所有成年MK都必須各自生產(chǎn)大致1000-10000個(gè)PLT以得到循環(huán)的PLT的數(shù)目。這構(gòu)成了血小板輸注單元離體生產(chǎn)的主要瓶頸。

另外，雖然第二代細(xì)胞培養(yǎng)方法對(duì)PLT是否的生理驅(qū)動(dòng)提供了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，但其無法重建整個(gè)BM微環(huán)境，對(duì)胞外基質(zhì)(ECM)組成、BM剛性、內(nèi)皮細(xì)胞接觸或血管剪切速率具有有限的個(gè)體控制；且未能成功地同步化proPLT生產(chǎn)，導(dǎo)致6-8天時(shí)間中不均勻的PLT釋放。此外，高分辨率活細(xì)胞顯微鏡顯示的不具有在生理相關(guān)條件下解決proPLT延伸和釋放的能力顯著阻礙了鑒定PLT生產(chǎn)的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)以促進(jìn)藥物開發(fā)和建立血小板減少癥的新治療方法的努力。因此，能夠生成臨床上顯著數(shù)目的功能性人PLT的有效、供體不依賴的PLT系統(tǒng)是消除PLT獲得和儲(chǔ)存相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)所必需的，并有助于滿足日益增長(zhǎng)的輸注需要。

基于上述考慮，持續(xù)而明確地需要利用特定平臺(tái)的裝置、系統(tǒng)和方法，該平臺(tái)可再生血管生理學(xué)以精確地反映影響功能性人血小板的有效生產(chǎn)的過程、機(jī)制和條件。這類平臺(tái)將證明，其高度適用于有效地生成人血小板以用于輸注的目的，并且高度適用于建立開發(fā)的臨床前階段中的藥物相互作用和藥物效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過提供能夠產(chǎn)生生理上準(zhǔn)確的模型的系統(tǒng)和方法克服了前述技術(shù)的缺陷，該模型復(fù)制了體內(nèi)所見的條件、環(huán)境、結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)流動(dòng)。如上所述，可采用這類生理模型來生成功能性人血小板和其他生物材料，其將適于輸注處理某些身體狀況，如血小板缺乏病癥如血小板減少癥。本發(fā)明產(chǎn)生的生理模型的其他應(yīng)用可包括藥物開發(fā)，以及藥物和治療評(píng)價(jià)。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種仿生微流體系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括基材，在基材中形成的第一通道，所述第一通道從第一入口向第一出口沿縱向維度延伸并且沿第一橫向維度延伸，和

所述基材中形成的第二通道，所述第二通道從第二入口向第二出口沿縱向維度延伸并且沿第一橫向維度延伸，其中所述第一和第二通道基本平行地沿縱向維度延伸并且被沿著第二橫向維度延伸的柱分隔。該系統(tǒng)還包括在分隔第一通道和第二通道的柱中形成的一系列孔隙(aperture)，其中，該一系列孔隙各自沿著縱向維度的延伸大于沿著第一橫向方向和第二橫向方向的延伸，并且位于基材的第一部分的近側(cè)并從第一通道延伸至第二通道，以產(chǎn)生在第一通道和第二通道之間通過的流體連通路徑。該系統(tǒng)還包括與第一入口連接的第一源，第一源設(shè)置為以第一通道流速向第一通道選擇性導(dǎo)入至少一種第一生物組合物，和與第二入口連接的第二源，第二源設(shè)置為以第二通道流速向第二通道選擇性導(dǎo)入至少一種第二生物組合物，其中第一通道流速和第二通道流速產(chǎn)生差，其設(shè)置成在通道內(nèi)生成預(yù)定范圍內(nèi)的生理剪切速率。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，公開了一種生成血管結(jié)構(gòu)和骨髓中至少一種的生理模型的方法。該方法包括：提供一種仿生微流體系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含基材和基材內(nèi)形成的第一通道，該第一通道從第一入口向第一出口沿縱向維度和第一橫向維度延伸。在基材中形成第二通道，第二通道從第二入口向第二出口沿著縱向維度和第一橫向維度延伸。在基材中形成第三通道，第三通道從第二入口向第三出口沿縱向維度和第一橫向維度延伸，其中第一、第二和第三通道沿著縱向維度基本平行延伸并且沿著第二橫向維度延伸。一系列微通道將第一通道連接至第二通道并將第三通道連接至第一通道，其中這一系列微通道在縱向維度上的延伸大于在第一橫向方向和第二橫向方向上的延伸，并且位于基材的第一部分的近側(cè)，以在基材的第一部分的近側(cè)產(chǎn)生在第一通道和第二通道以及第一通道和第三通道之間通過的流體連通路徑。本發(fā)明還包括使用第一源以第一通道流速向第一通道中導(dǎo)入第一生物組合物，并使用第二源分別以第二通道流速和第三通道流速向第二通道和第三通道中導(dǎo)入第二生物組合物，以在第一、第二和第三通道流速之間產(chǎn)生差，從而在通道內(nèi)產(chǎn)生預(yù)定范圍內(nèi)的生理剪切速率。該方法還包括收獲通過生理剪切速率在微通道近側(cè)生成的目標(biāo)生物物質(zhì)。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了另一種仿生微流體系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括至少一個(gè)基材，和在至少一個(gè)基材上形成的第一腔室，第一腔室基本沿著縱向維度從第一入口向第一出口延伸。該系統(tǒng)還包括在至少一個(gè)基材上形成的第二腔室，第二腔室從第一入口向第一出口沿著縱向維度延伸，其中第一和第二腔室沿著縱向維度基本平行延伸，和沿著橫向維度分隔第一和第二腔室的膜，其中該膜產(chǎn)生在第一腔室和第二腔室之間通過的流體流通通道。該系統(tǒng)還包括設(shè)置成使用相應(yīng)入口選擇性將至少一種生物組合物導(dǎo)入第一腔室和第二腔室的至少一個(gè)源，所述導(dǎo)入以能夠在腔室之間生成生理剪切速率的流速進(jìn)行，該生理剪切速率促進(jìn)產(chǎn)生多個(gè)血小板。

通過以下描述可以清楚地了解本發(fā)明的上述和其他方面和優(yōu)勢(shì)。在以下說明書中，參照構(gòu)成說明書的一部分的附圖，其中以說明性方式顯示了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。這類實(shí)施方式不必然代表本發(fā)明的全部范圍，而是因此對(duì)權(quán)利要求進(jìn)行說明并在本文中解釋本發(fā)明的范圍。

附圖的簡(jiǎn)要說明

在后文中將參考附圖描述本發(fā)明，其中同樣的附圖標(biāo)記表示同樣的元件。

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的方面的示例性仿生微流體系統(tǒng)的示意圖。

圖2A顯示了用骨髓和血管蛋白質(zhì)涂覆的，用于復(fù)制胞外基質(zhì)(ECM)組合物的微流體通道的顯微圖像。

圖2B顯示了在選擇性包埋在藻酸鹽凝膠中的微通道中捕集的巨核細(xì)胞(MK)的顯微圖像，其模擬三維ECM組織和生理骨髓(BM)硬度。

圖2C顯示人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的顯微圖像，其選擇性培養(yǎng)在纖維蛋白原包被的第二通道中以生成功能性血管。

圖2D顯示了用于產(chǎn)生功能性血小板(PLT)的完整系統(tǒng)的圖像。

圖2E顯示根據(jù)本發(fā)明的方面的所述仿生微流體系統(tǒng)內(nèi)模擬的剪切速率分布。

圖2F顯示了多個(gè)輸注速率下剪切速率隨著與第一通道的橫向距離的變化的圖。

圖2G顯示了剪切速率隨著阻斷微通道的數(shù)量的變化的圖。

圖3A顯示了顯示在0和18小時(shí)時(shí)培養(yǎng)的MK的直徑分布。

圖3B顯示了靜態(tài)培養(yǎng)中的MK的顯微圖像，其顯示在純化后6小時(shí)的proPLT生成。

圖3C顯示了在MK捕獲后即刻生理剪切下的proPLT產(chǎn)生的顯微圖。

圖3D顯示了對(duì)比來自靜態(tài)培養(yǎng)的那些在生理剪切下獲得增加的proPLT生產(chǎn)型MK的圖。

圖3E顯示了生理剪切下的proPLT延伸速率。

圖4A顯示了擠壓通過3μm-寬微通道的MK的顯微圖。

圖4B顯示了擠壓通過3μm-寬微通道的MK延伸大片段的顯微圖。

圖4C顯示了proPLT延伸的顯微圖像。

圖4D顯示了沿著proPLT軸在不同位置處的proPLT延伸和切斷事件的顯微圖。

圖4E顯示了PLT產(chǎn)生周期的顯微圖。

圖4F顯示了在生理范圍內(nèi)增加的剪切速率并不增加proPLT延伸速率。

圖4G顯示了顯微圖像，其顯示經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染以表達(dá)GFP-β1微管蛋白的MK顯示出proPLT延伸并且包括在PLT尺寸的末端處形成卷曲的外周微管。

圖4H顯示5μM Jasplankinolide(Jas，肌動(dòng)蛋白穩(wěn)定劑)和1mM赤式-9-(3-[2-羥基壬基](EHNA，胞質(zhì)動(dòng)力蛋白抑制劑)抑制剪切誘導(dǎo)的proPLT生產(chǎn)的圖。

圖4I顯示了在生理剪切下藥物誘導(dǎo)的對(duì)proPLT產(chǎn)生的抑制的顯微圖。

圖5A顯示了本發(fā)明產(chǎn)生的PLT顯示出血液PLT的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的圖。

圖5B顯示了在第4天從培養(yǎng)物分離之后并在輸注后2小時(shí)從流出物收集時(shí)，按照本發(fā)明輸注到系統(tǒng)中的GPIX+MK的生物標(biāo)志物表達(dá)、正向/側(cè)向散射和相對(duì)濃度。

圖5C顯示了施加剪切位移GPIX+相對(duì)于靜態(tài)培養(yǎng)上清產(chǎn)生更多PLT尺寸的細(xì)胞的圖。

圖5D顯示了MK在2小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)化成PLT的顯微圖。

圖5E是顯示施加剪切位移相對(duì)于靜態(tài)培養(yǎng)上清產(chǎn)生更多的PLT尺寸的β1微管蛋白+Hoescht-細(xì)胞的示意圖，插圖顯示流出物中游離核的定量。

圖5F是顯微圖像，顯示按照本發(fā)明產(chǎn)生的PLT在超微結(jié)構(gòu)上類似于血液PLT且含有皮層MT卷曲、開放的小管系統(tǒng)、致密的管狀系統(tǒng)、線粒體和特征性分泌顆粒。

圖5G是顯微圖像，其顯示了按照本發(fā)明產(chǎn)生的PLT和PLT中間體在形態(tài)上類似于血液PLT并且顯示相當(dāng)?shù)腗T和肌動(dòng)蛋白表達(dá)。

圖6A顯示了按照本發(fā)明產(chǎn)生的hiPSC-PLT顯示出血液PLT的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的圖。

圖6B是顯微圖像，顯示按照本發(fā)明的hiPSC-MK在超微結(jié)構(gòu)上類似于原代人MK且含有分成小葉的細(xì)胞核、內(nèi)陷的膜系統(tǒng)、糖原貯積、細(xì)胞器和特征性分泌顆粒。

圖6C是顯微圖像，顯示靜態(tài)培養(yǎng)物中的hiPSC-MK在純化后6小時(shí)開始生產(chǎn)proPLT并在18小時(shí)達(dá)到最大proPLT生產(chǎn)。

圖6D是顯微圖像，顯示生理剪切下(約500s^-1)的hiPSC-MK在捕獲后立即開始生產(chǎn)proPLT，并在培養(yǎng)的最初2個(gè)小時(shí)內(nèi)延伸/釋放proPLT。

圖6E是顯示在生理剪切下proPLT生產(chǎn)型hiPSC-MK的百分比在靜態(tài)培養(yǎng)中顯著增加的圖。

圖6F是顯示在生理剪切下的proPLT延伸速率為約19μm/分鐘的圖。

圖6G是顯微圖像，顯示按照本發(fā)明產(chǎn)生的hPLT在超微結(jié)構(gòu)上類似于人血液PLT且含有皮層MT卷曲、開放的小管系統(tǒng)、致密的管狀系統(tǒng)、線粒體和特征性分泌顆粒。

圖6H是顯微圖像，顯示按照本發(fā)明產(chǎn)生的hPLT在形態(tài)上類似于人血液PLT且顯示可比的MT和肌動(dòng)蛋白表達(dá)。

圖6I是顯微圖像，顯示按照本發(fā)明產(chǎn)生的mPLT形成激活的絲狀偽足/板狀偽足并在玻璃表面上鋪展。

圖7顯示活細(xì)胞顯微圖像，顯示T-DM1通過誘導(dǎo)異常的微管蛋白構(gòu)架來抑制MK分化并破壞proPLT形成。

圖8顯示了體內(nèi)PLT產(chǎn)生的圖。

圖9顯示了根據(jù)本發(fā)明的方面的另一個(gè)示例性仿生微流體系統(tǒng)的示意圖。

圖10顯示了使用圖9的系統(tǒng)的PLT產(chǎn)生的示意圖。

圖11A顯示了使用圖9的系統(tǒng)中的一個(gè)流體流動(dòng)實(shí)施方式比較PLT的示意圖。

圖11B顯示了使用圖9的系統(tǒng)中的另一個(gè)流體流動(dòng)實(shí)施方式比較PLT的示意圖。

圖12顯示了根據(jù)本發(fā)明的方面的另一個(gè)仿生微流體系統(tǒng)的示意圖。

圖13是根據(jù)本發(fā)明的方面顯示產(chǎn)生生理模型的過程的步驟的流程圖。

發(fā)明詳述

血小板(PLT)在刺激凝塊形成和血管損傷修復(fù)中起關(guān)鍵作用。低PLT計(jì)數(shù)所致出血導(dǎo)致的發(fā)病和死亡是許多病癥(包括化療和放療、外傷、免疫性血小板減少性紫癜(ITP)、器官移植手術(shù)、嚴(yán)重?zé)齻⒛摱狙Y和遺傳紊亂)所面臨的一項(xiàng)主要臨床問題。雖然其免疫原性和相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)導(dǎo)致了嚴(yán)重的臨床問題，同時(shí)具有高需求量和短儲(chǔ)藏期導(dǎo)致的庫存缺陷，但美國(guó)的PLT輸注總量仍超過1000萬單位/年。

在認(rèn)識(shí)到這種廣泛的需求和風(fēng)險(xiǎn)之后，本發(fā)明描述了能夠復(fù)制在生理中存在的條件、環(huán)境、結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)流動(dòng)的系統(tǒng)和方法。這種系統(tǒng)和方法可用于生成人類生理學(xué)的模型，其然后可用于例如產(chǎn)生功能性人PLT。

PLT生產(chǎn)涉及巨核細(xì)胞(MK)的分化，巨核細(xì)胞位于骨髓(BM)中的竇狀腺血管外并延伸長(zhǎng)且分支的細(xì)胞結(jié)構(gòu)(命名為proPLT)至循環(huán)中，如圖8所示。具體地，proPLT包括通過薄胞質(zhì)橋連接的串聯(lián)陣列中的PLT尺寸的膨脹。在體內(nèi)，它們經(jīng)歷血管剪切并起到作為PLT生產(chǎn)的組裝線的作用。雖然，proPLT的詳細(xì)表征仍不完整，但已經(jīng)在體外和體內(nèi)都鑒定到這些結(jié)構(gòu)。

PLT從proPLT尖端處連續(xù)釋放。該機(jī)制高度依賴于功能為細(xì)胞的分子支柱和主梁的微管蛋白和肌動(dòng)蛋白絲的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。微管(MT)束與proPLT軸平行，且proPLT延長(zhǎng)受在彼此上滑動(dòng)的MT驅(qū)動(dòng)。proPLT成熟期間，在MT遠(yuǎn)端上運(yùn)輸?shù)募?xì)胞器和分泌顆粒沿軌道移動(dòng)，從而被限制于proPLT尖端處。肌動(dòng)蛋白促進(jìn)proPLT分支和PLT端部擴(kuò)增。鼠MK的活細(xì)胞顯微觀察對(duì)該理解至關(guān)重要，但迄今為止的大多數(shù)研究都在體外對(duì)靜態(tài)MK培養(yǎng)物進(jìn)行。

已將促血小板生成素(TPO)鑒定為MK分化的主要調(diào)控因子，且其已被用于在培養(yǎng)物中生產(chǎn)富集的MK群體。在一個(gè)參考例中，已證明從生產(chǎn)proPLT的MK中體外生成的人PLT是功能性的。從那以后，已從多個(gè)來源分化MK，包括胎肝細(xì)胞(FLC)、臍帶血干細(xì)胞(CBSC)、胚胎干細(xì)胞(ESC)和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)。然而，目前的2-D和液體MK培養(yǎng)物的數(shù)量級(jí)不足體內(nèi)每個(gè)MK生成的預(yù)測(cè)約2000個(gè)PLT。最近，已在連續(xù)流體流下應(yīng)用模塊化3-D編織聚酯網(wǎng)格以在培養(yǎng)物中從100萬個(gè)CD34⁺人臍帶血細(xì)胞中生成最多6x10⁶個(gè)PLT/天。雖然表明可以獲得臨床上有用的PLT數(shù)目，但那些3-D灌注生物反應(yīng)器沒有精確再生BM微環(huán)境的流體特性和復(fù)合物結(jié)構(gòu)，且其閉合的模塊化設(shè)計(jì)無法觀察proPLT生產(chǎn)，難以提供對(duì)PLT釋放機(jī)制的理解。或者，已提出使用3-D聚二甲基硅氧烷(PDMS)生物芯片相鄰的ECM包被的基于絲的導(dǎo)管來再生BM竇狀腺并在體外研究MK分化和PLT生產(chǎn)。雖然這類裝置在成熟期間再現(xiàn)了MK遷移，但其無法適用于高分辨率活細(xì)胞顯微分析，并無法再生驅(qū)動(dòng)MK分化所需的內(nèi)皮細(xì)胞接觸。

雖然已在培養(yǎng)物中研究了MK分化，但對(duì)于刺激proPLT生產(chǎn)的條件仍知之甚少，特別是在體內(nèi)中。MK發(fā)現(xiàn)于BM微環(huán)境(niche)中，且一些證據(jù)暗示BM間質(zhì)的細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)和可溶性因子相互作用參與proPLT形成和PLT釋放。實(shí)際上，趨化因子SDF-1和生長(zhǎng)因子FGF-4將MK招募至竇狀腺內(nèi)皮細(xì)胞。胞外基質(zhì)(ECM)蛋白是BM血管微環(huán)境的另一主要組分，且證據(jù)表明通過跨膜糖蛋白(GP)受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控proPLT形成、PLT數(shù)目和大小(在例如巨血小板綜合征、血小板無力癥中所見的缺陷)。膠原IV和玻連蛋白促進(jìn)proPLT生產(chǎn)，其可被針對(duì)其偶聯(lián)整聯(lián)蛋白受體GPIba的抗體抑制。同樣地，纖維蛋白原調(diào)控通過GPIIbllla的PLT釋放和proPLT形成。雖然這些發(fā)現(xiàn)說明了proPLT生產(chǎn)的環(huán)境決定因素，但其受限于簡(jiǎn)化論者(reductionist)方法。因此，整合了BM復(fù)雜性的限定因素的新模型是闡明MK至PLT的生理調(diào)控所需。

在BM中，proPLT經(jīng)歷100至10000s^-1或更具體地500至2500s^-1的壁剪切速率。雖然已研究了持續(xù)血流對(duì)于PLT血栓形成的作用，但令人吃驚的是，剪切力調(diào)控PLT釋放的機(jī)制只受到很少關(guān)注。同時(shí)，在研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)并不代表真實(shí)的生理?xiàng)l件。一些初級(jí)研究在ECM包被的載玻片上采用灌注的MK，其選擇固定/粘附的MK而不區(qū)分ECM接觸激活與剪切?；蛘?，在孵育搖床中向心攪動(dòng)釋放的proPLT，其不再現(xiàn)循環(huán)層狀剪切流，不提供血管剪切速率的精確控制，且不適用于高分辨率活細(xì)胞顯微觀察。雖然存在這些主要限制，但將MK暴露于高剪切速率似乎加速了proPLT生產(chǎn)并在不存在剪切的情況下培養(yǎng)proPLT時(shí)釋放比流體剪切壓力下所維持的更少的PLT。

本發(fā)明認(rèn)識(shí)到微流體裝置提供了極佳的平臺(tái)以生成和準(zhǔn)確調(diào)節(jié)動(dòng)態(tài)流體流，并從而模擬血管條件以將化學(xué)信號(hào)遞送至細(xì)胞。已證明將微流體網(wǎng)絡(luò)包埋在裝載細(xì)胞的水凝膠中支持了通過3D支架的可溶性蛋白的有效對(duì)流運(yùn)輸。已生成了活的3D組織接觸，其由瓊脂糖中包封的肝細(xì)胞、使用初級(jí)軟骨細(xì)胞接種的藻酸鈣水凝膠和包埋在3D管狀聚(乙二醇)水凝膠中的內(nèi)皮細(xì)胞組成。因此，該技術(shù)已被應(yīng)用于開發(fā)芯片器官(organs-on-a-chip)，包括肝、腎、腸和肺。此外，已使用芯片微血管系統(tǒng)的新進(jìn)研發(fā)成果體外研究心血管生物學(xué)和病理生理學(xué)。這些研究強(qiáng)調(diào)了模擬物理微環(huán)境和活器官的天然化學(xué)信號(hào)以研究細(xì)胞和生理發(fā)育的重要性。例如，這對(duì)于藥物介導(dǎo)的PLT生產(chǎn)抑制而言特別重要。由于生產(chǎn)proPLT的MK在BM中位于緊靠血管的外側(cè)，與BM的半固體ECM微環(huán)境和循環(huán)的流體微環(huán)境相互作用，仿生微流體生物芯片可實(shí)現(xiàn)模型系統(tǒng)以闡明相關(guān)生理機(jī)制，如負(fù)責(zé)藥物誘導(dǎo)的血小板減少癥的那些。

現(xiàn)在參考圖1，示意圖顯示了本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式所述的仿生系統(tǒng)100的非限制性示例。該系統(tǒng)100包括基材101、第一通道102和第二通道104，各通道經(jīng)設(shè)置以攜帶任何流體介質(zhì)流，其傳輸或由以下組分組成(但不限于此)：例如，顆粒、細(xì)胞、物質(zhì)、微粒、材料、組合物等。在一個(gè)實(shí)施方式中，該系統(tǒng)100和/或基材101可使用細(xì)胞惰性硅基有機(jī)聚合物(如聚二甲基硅氧烷(PDMS))制備。

該第一通道102包含第一通道入口106和第一通道出口108。類似地，該第二通道104包含第二通道入口110和第二通道出口112。該第一通道102和第二通道104沿基本縱向方向延伸，且具有縱向和橫向維度(如同將解釋的那樣)以實(shí)現(xiàn)所需流動(dòng)曲線、速度或速率，例如生理系統(tǒng)中存在的那樣。在一個(gè)方面中，描述通道的縱向130和橫向132維度的尺寸的范圍與解剖學(xué)或生理學(xué)上的結(jié)構(gòu)、組織、構(gòu)造或設(shè)置(如骨髓和血管中的情況)一致。例如，該縱向130維度的范圍可以是1000-30000微米或更具體地1000-3000微米，且該橫向132維度的范圍可以是100-3000微米或更具體地100-300微米，但也可使用其他數(shù)值。在一些方面中，可制備、限定或制造各通道以接收、定位、捕獲或容納例如來自穿過的流體介質(zhì)的顆粒、細(xì)胞、物質(zhì)、微粒、材料、組合物等。

該裝置100還包括分離第一通道102和第二通道104的一系列柱114。柱114的長(zhǎng)軸可設(shè)置為與通道的縱向130維度基本平行，該一系列柱114延伸約等于通道的縱向130維度的距離。柱114可被一系列間隙或微通道116分隔，該微通道116從第一通道102延伸至第二通道104以建立在這些柱114之間通過的部分流體連通路徑。然而，在指代間隙時(shí)，術(shù)語“微通道”并不隱含表示特定寬度。例如，這些間隙可基本大于或小于微米范圍。在一些方面中，柱114和微通道116可具有維度以使顆粒、細(xì)胞、物質(zhì)、微粒、材料、組合物等結(jié)合、粘附或受限于大致在柱114和微通道116附近的區(qū)域。例如，這些柱114的縱向130和橫向132維度的范圍可以是1-200微米，而這些微流體116的縱向130維度(由柱114之間的間隙或分離距離所定義)的范圍可以是0.1-20微米，但也可使用其他數(shù)值。

在一些方面中，可使用與第一入口118偶聯(lián)的第一源建立第一通道102中的第一介質(zhì)流，其中第一介質(zhì)流可通過第一出口120提取。類似地，可使用與第二入口118偶聯(lián)的第二源建立第二通道102中的第二介質(zhì)流，其中第二介質(zhì)流可通過第二出口120提取。然而，由于其間的流體連通可通過第一出口120或第二出口122從第一通道102或第二通道104提取流。在一些構(gòu)造中，第一出口120或第二出口124或兩者可具有排出或捕獲使用第一源或第二源或兩者建立的流的能力。這種能力也可包括從捕獲的流分離所需材料或物質(zhì)如血小板或凝血細(xì)胞的能力。

第一和第二源(圖1未顯示)可包括設(shè)置用于遞送受控流或流體壓力的任何系統(tǒng)，如微流體泵系統(tǒng)，并且包括任意數(shù)量的元件或組件，如流控器、致動(dòng)器等。可使用源、元件和組件的特定構(gòu)造，并利用與第一通道102和第二通道104相關(guān)的幾何維度來控制可持續(xù)任何希望或所需時(shí)間量的流動(dòng)速度或流動(dòng)速率。在一些方面中，可控制第一通道102和第二通道104中的流速以復(fù)制在例如骨髓和血管中所見的生理?xiàng)l件。例如，可控制流速以實(shí)現(xiàn)足夠生成PLT的所需血管剪切速率。

系統(tǒng)100也可包括任何性狀或形式的過濾和阻力元件，其根據(jù)流方向沿著第一和第二流體介質(zhì)各自的通道排布。具體地，可設(shè)計(jì)過濾元件以使其從橫向流體介質(zhì)中捕獲或去除任意類型的碎片、灰塵和其他污染物或不希望的材料、元素或顆粒。另外，可能需要阻力元件來控制流動(dòng)力或減弱流動(dòng)速率的波動(dòng)。在一些構(gòu)造中，如圖1所示，過濾元件126可位于第一入口118和第二入口122近側(cè)以立即捕獲不需要的污染物。然后，流阻元件128可位于過濾元件126的下游，如圖1所示。

在一些實(shí)施方式中，可通過用調(diào)節(jié)血小板產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、肽或骨粉，包括但不限于Cl、CIV、FG、FN、VN、LN、VWF聚-L-賴氨酸、纖維蛋白原、IV型膠原、纖連蛋白、玻連蛋白、層連蛋白、CCL5(RANTES)、S1PR1、SDF-1、和FGF-4、凝膠如瓊脂糖、藻酸鹽，和基質(zhì)膠或溶液如PBS、HBS、DMEM EGM或其他介質(zhì)的任意組合選擇性填充第一通道102來離體重建人骨髓(BM)血管微環(huán)境。或者，在使用蛋白質(zhì)微米/納米沖壓(micro/nano-stamping)將生物芯片粘附于表面載片前，或在使用平行微流體流進(jìn)行微流體裝置組裝后，可將ECM蛋白直接壓制(pattern)在玻璃表面或多孔膜上。輸注期間可通過調(diào)控微流體流流動(dòng)速率來調(diào)節(jié)局部組分濃度，著重于對(duì)齊和3-D排布。

在其他實(shí)施方式中，可通過在37℃和5％CO₂下與內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)來選擇性包被第二通道104，從而實(shí)現(xiàn)重現(xiàn)人BM血管系統(tǒng)。內(nèi)皮細(xì)胞可使用4％甲醛固定，并探測(cè)細(xì)胞生物標(biāo)志物以解析細(xì)胞定位和構(gòu)造?？墒褂脽晒饣虮壬橘|(zhì)(如FITC-葡聚糖)或使用珠灌注內(nèi)皮化BM生物芯片的第二通道104，并通過活細(xì)胞顯微鏡觀察以評(píng)估樣品/細(xì)胞/分子擴(kuò)散和測(cè)定血管通透性。

現(xiàn)在參考圖9，顯示了本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式所述的仿生系統(tǒng)900的另一個(gè)非限制性示例。系統(tǒng)900包括基材902，其中形成與第一或中心通道904，其連同第二和第三通道一起，或側(cè)通道906，其與中心通道904相鄰或在其側(cè)邊。系統(tǒng)900的各通道可經(jīng)設(shè)置以運(yùn)載任意流體介質(zhì)流，其運(yùn)輸或由以下物質(zhì)組成(但不限于此)，例如，顆粒、細(xì)胞、物質(zhì)、微粒、材料、組合物、試劑等。在一些方面中，可使用細(xì)胞惰性硅基有機(jī)聚合物來構(gòu)建系統(tǒng)900和/或基材902，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、COP、COC、PC、PS、PMMA、玻璃和/或任何其他合適材料或其組合。在某些構(gòu)造中，基材902可包括，或組裝自使用合適的技術(shù)和方法調(diào)整和/或組合的可分離、可再密封或可結(jié)合組件，例如，基材的第一部分903和第二部分905。

中心通道904和側(cè)通道906沿著縱向方向908基本平行延伸。在一些優(yōu)選的方面中，限定通道沿著縱向方向908和橫向方向910和912的維度可在與生理結(jié)構(gòu)相一致的范圍內(nèi)。此外，也可能需要某些維度來促進(jìn)細(xì)胞、物質(zhì)、組合物或其他材料在通道內(nèi)沉積，或維持、調(diào)節(jié)或復(fù)制所需的流體流概況、速度、壓力或速率，如與生理系統(tǒng)相關(guān)的那些。在一些設(shè)計(jì)中，中心通道904和側(cè)通道906沿著橫向方向910和912的維度不需要相等，如圖9所示。例如，所有通道的縱向維度914可在1000至30000微米的范圍內(nèi)，而各通道的橫向維度可在10至3000微米的范圍內(nèi)，或更具體地，在10至150微米的范圍內(nèi)。縱向和橫向維度的其他值也是可能的。

通道被一般與縱向908平行排布的柱916分隔，并且延伸與通道的縱向維度914基本相等的距離。柱916可包括任意數(shù)量的孔隙918，其在通道之間產(chǎn)生部分流體連通路徑，該孔隙918根據(jù)需要定型、確定尺寸并排布?？紫?18可以是，例如，開口、裂紋、孔、間隙、微通道等，其在中心通道904與第一和/或第二側(cè)通道906各自之間延伸。例如，孔隙918的縱向和橫向維度的范圍可以是0.1至20微米，雖然也可以是其他值。如圖9所示，孔隙918的縱向維度可大于橫向維度。在一些優(yōu)選的設(shè)計(jì)中，孔隙918一般位于基材的第一部分903的近側(cè)，如圖9所示。為此，孔隙918可針對(duì)基材的第一部分903延伸。這可使得捕獲的MK和/或proPLT，例如，通過有橫向流體介質(zhì)生成的流體壓力或壓力差壓向基材的第一部分903的表面。在基材的第一部分903透明的情況中，可關(guān)于對(duì)proPLT和PLT產(chǎn)生過程成像來實(shí)現(xiàn)改善的分辨率。通過這種方式，孔隙918可經(jīng)排布、成形和定尺寸以優(yōu)化產(chǎn)生，或最大化所需生物物質(zhì)如PLT的產(chǎn)率。

如圖9所示，中心通道904包括第一通道入口，或中心通道入口920，和第一通道出口，或中心通道出口922。側(cè)通道906可共用第二通道入口，或側(cè)通道入口924，并且包括分開的第二和第三通道出口，或側(cè)通道出口926。在側(cè)通道入口924的近側(cè)，系統(tǒng)900的各側(cè)通道906包括延伸部分，或端口928。在某些操作模式中，延伸部分，或端口928可對(duì)各相應(yīng)的側(cè)通道906起額外流體入口或出口的作用，為系統(tǒng)900提供增加的靈活性，如下文所述。

系統(tǒng)900還可具有過濾能力，其可采用任何形狀或形式，并且設(shè)置成捕獲或吸收來自橫向流體的任何類型的碎片、灰塵和任何其他污染物，同時(shí)允許其中含有的細(xì)胞、試劑或其他所需材料，如MK流動(dòng)。在圖9所示的非限制性構(gòu)造中，過濾元件930可位于側(cè)通道入口924的近側(cè)。另外，系統(tǒng)900還可包括流控制能力，其可采用多種形狀或形式，并且設(shè)計(jì)成控制流動(dòng)力或減弱流動(dòng)速率的波動(dòng)。在圖9所示的非限制性構(gòu)造中，流阻元件932可位于道入口920和924的近側(cè)。

如圖1所述，可制備通道、柱916和孔隙918，使得顆粒、細(xì)胞、物質(zhì)、微粒、材料、組合物等可結(jié)合、粘附或者限于通道內(nèi)的任何區(qū)域或在柱916和孔隙918附近，并且由此允許從孔隙918的近側(cè)區(qū)域獲得任何所需或目標(biāo)生物物質(zhì)。用于預(yù)涂覆通道和/或柱916和/或孔隙918的組合物、材料或試劑的非限制性示例可包括但不限于牛血清白蛋白、血纖維蛋白、纖連蛋白、層連蛋白、IV型膠原、I型膠原、聚-L-賴氨酸、玻連蛋白、CCL5、S1PR1、SDF-1、FGF-4、和其他胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)血小板產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。在一些方面中，這種涂覆可在系統(tǒng)900制造步驟期間，或通過流過通道的流體介質(zhì)流的后續(xù)輸注來進(jìn)行。另外，通道可接種細(xì)胞或其他生物組合物和材料，包括但不限于人或非人內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。具體地，為了復(fù)制或模擬三維胞外基質(zhì)組織和生理骨髓硬度，可在水凝膠溶液中輸注細(xì)胞，其隨后可聚合。水凝膠溶液可包括，但不限于，藻酸鹽、基質(zhì)膠和瓊脂糖，其然后可根據(jù)需要選擇性包埋在任何通道中。

參考圖10，其顯示了操作系統(tǒng)900的示例性模式，顯示生成所需或目標(biāo)生物物質(zhì)，如血液PLT的示例性過程1000。具體地，在步驟1002處通過中心通道入口920提供第一生物材料或組合物。這種生物材料可包括其中含有的用于生成PLT的細(xì)胞，如MK。然后，在步驟1004處，生物材料的至少一些部分可粘附至一般處于柱916和孔隙918周圍的區(qū)域，如上所述。例如，MK可在孔隙918近側(cè)被捕獲。在步驟1006處，可利用流速、速度、剪切速率，或通道中的壓力差來生成目標(biāo)生物物質(zhì)。例如，隨著MK橫向延伸的proPLT在孔918周圍捕獲，或過濾通過孔隙918，并隨后轉(zhuǎn)化成PLT。在步驟1008處，產(chǎn)生的目標(biāo)生物物質(zhì)由流體介質(zhì)運(yùn)載并且可從流出物收集并分離用于隨后使用。在步驟1010處，可進(jìn)行收集后處理。例如，步驟1010可包括在FDA-批準(zhǔn)的儲(chǔ)存介質(zhì)中透析生物反應(yīng)器衍生的血小板，如血小板添加同業(yè)，如由Haemonetics，COBE Spectra，Trima Accel生產(chǎn)的等等。例如，可使用動(dòng)態(tài)透析系統(tǒng)，例如，可使用通過0.75mm，0.65μ mPES管腔(如斯派實(shí)驗(yàn)室(Spectrum Labs)所制)的低剪切的連續(xù)流。此外，在步驟1010處的收集后處理包括在人輸注之前輻射血小板產(chǎn)品的過程，如FDA所要求的那樣。因此，可用可輸注到人患者中的介質(zhì)來替代培養(yǎng)基。

系統(tǒng)900的獨(dú)特設(shè)計(jì)特征在于，通過利用所述的入口、出口和延伸部分，或端口928，其作為額外流體入口或出口，可選擇性地，并且以雙向方式輸注介質(zhì)。即，介質(zhì)、細(xì)胞、或任何材料、組合物或物質(zhì)可通過正向或反向流體流分開或同時(shí)導(dǎo)入任何或全部通道中。因此，除了對(duì)2個(gè)側(cè)通道906的增加的PLT收獲效率以外，例如，系統(tǒng)900也允許獨(dú)立控制各通道，促進(jìn)不同操作條件，如介質(zhì)、細(xì)胞、涂覆劑、材料、剪切速率、流體流動(dòng)方向等的頭對(duì)頭比較。圖11A和11B顯示了用于產(chǎn)生PLT的示例性流體流實(shí)施方式，從而MK可導(dǎo)入中心通道904(圖11A)或者，各或兩個(gè)側(cè)通道906(圖11B)。

現(xiàn)在參考圖12，顯示了本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式所述的仿生系統(tǒng)1200的另一個(gè)非限制性示例。系統(tǒng)1200包括基材1202。例如，可使用細(xì)胞惰性硅基有機(jī)聚合物來構(gòu)建基材1202，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、COP、COC、PC、PS、PMMA、玻璃和/或任何其他合適材料或其組合。如圖12所示，基材1202包括其中形成的第一腔室1204和第二腔室1206，其中腔室被多孔膜1208分開。

在一些應(yīng)用中，系統(tǒng)1200可能需要組裝或分解，例如，單獨(dú)制備第一腔室1204、第二腔室1206或多孔膜1208。這樣，系統(tǒng)1200可包括第二基材(圖12中未顯示)，其中第一腔室1204在第一基材1202中形成，并且第二腔室1206在第二基材中形成。這樣，系統(tǒng)1200可包括允許第一腔室1204和第二1206以可去除方式耦合的其他特征。例如，系統(tǒng)1200可包括促進(jìn)第一腔室1204、第二腔室1206和多孔膜1208之間的流體密封破裂或恢復(fù)的元件或要素。

第一腔室1204和第二腔室1206可以任一所需方式成形并確定大小，根據(jù)所需的應(yīng)用選擇縱向和橫向維度。例如，為了產(chǎn)生具有所需產(chǎn)率的目標(biāo)生物物質(zhì)，如PLT，可優(yōu)化腔室的維度來控制流速、速度概況、剪切速率、剪切應(yīng)力或腔室之間的壓力差。如圖12的實(shí)施例所示，第一腔室1204和第二腔室1206可沿著縱向基本平行延伸。例如，腔室可包括范圍為1000至30000微米的縱向維度，和范圍為10至300微米的橫向維度，雖然其他值也是可能的。

在一些構(gòu)造中，可在第一腔室1204的上表面中納入開口以允許氣體轉(zhuǎn)移進(jìn)出系統(tǒng)1200。這樣，可在第一腔室1204近側(cè)層疊疏水性透氣膜以防止物質(zhì)通過開口逃逸。在這種實(shí)施方式中，系統(tǒng)1200然后包括疏水性透氣膜、第一腔室1204、多孔膜1208、和第二腔室1206，其任選地使用，例如，可再密封片固定器夾在一起，各腔室在分開的基材中形成，如上所述。

多孔膜1208可以是在第一腔室1204和第二腔室1206之間產(chǎn)生部分流體交流通道的任何元件。例如，多孔膜1208可以是具有設(shè)置于其中的孔、孔隙或微通道的網(wǎng)格或薄膜。多孔膜1208可根據(jù)具體應(yīng)用塑成、成形并確定尺寸。例如，可使用材料，如聚碳酸酯材料、PDMS、COP、COC、PC、PS、或PMMA來構(gòu)建多孔膜1208。另外，多孔膜1208可包括范圍為1至100毫米的側(cè)向和橫向尺寸，并且厚度范圍為0.1至30微米，并且更具體地為8至12微米，雖然其他尺寸也是可能的。在一些設(shè)計(jì)中，多孔膜1208可在系統(tǒng)1200的單獨(dú)腔室的尺寸上延伸。具體地，多孔膜1208可經(jīng)設(shè)置以具有大表面積用于捕獲所需的生物材料、細(xì)胞等，其具有支持多個(gè)同時(shí)proPLT產(chǎn)生過程的能力，如下所述，因此導(dǎo)致增加的PLT產(chǎn)率。

可選擇多孔膜1208的合適孔直徑，使得可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞，如MK的最大捕獲。例如，多孔膜1208可具有范圍為0.1至20微米，并且更具體直徑為5至8微米的孔。在一些方面中，可準(zhǔn)備多孔膜1208以包含特定材料、化學(xué)物或試劑。例如，多孔膜1208可包括調(diào)節(jié)血小板產(chǎn)生的肽或蛋白質(zhì)，如聚-L-賴氨酸、血纖維蛋白、IV型膠原蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、層連蛋白、CCL5(RANTES)、S1PR1、SDF-1、FGF-4等。

如圖12所示，第一腔室1204包括入口1210和出口1212，并且類似地，第二腔室1206包括入口1214和出口1216。在一些方面中，可通過相應(yīng)腔室入口輸出使用各種化學(xué)物、試劑或材料，使用一個(gè)或多個(gè)源，或通過在相應(yīng)基材中孵育單獨(dú)層來單獨(dú)準(zhǔn)備腔室。在其他方面中，準(zhǔn)備可通過第一腔室1204和第二腔室1206的輸注來平行進(jìn)行。即，含有化學(xué)物、試劑或材料的流體可通過兩個(gè)入口導(dǎo)入并通過兩個(gè)出口收集，使得層狀流并不混合。

用于系統(tǒng)1200的化學(xué)物、試劑或材料的非限制性示例可包括牛血清白蛋白(例如，1-10％)、纖維蛋白原、纖連蛋白、層連蛋白、IV型膠原、I型膠原、和其他胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)血小板產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。另外，可用細(xì)胞接種一個(gè)或兩個(gè)腔室通過灌輸它們通過或使單個(gè)層在相關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)物中孵育來復(fù)制骨髓和血管組成。這些包括，但不限于，人和小鼠內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等。此外，為了對(duì)三維胞外基質(zhì)組織和生理骨髓硬度進(jìn)行建模，可在水凝膠溶液中輸注細(xì)胞，該水凝膠溶液包括但不限于，藻酸鹽，和瓊脂糖，其可在系統(tǒng)120內(nèi)聚合。

系統(tǒng)1200也可具有過濾能力，其可采用任何形狀或形式，并且經(jīng)設(shè)置以捕獲或吸收來自橫向流體的任何類型的碎片、灰塵和任何其他污染物。在一些方面中，過濾器允許細(xì)胞、試劑或其他所需材料，如MK通過。另外，系統(tǒng)1200還可具有流控制能力，其可采用多種形狀或形式，并且經(jīng)設(shè)計(jì)以控制流動(dòng)力或減弱流動(dòng)速率的波動(dòng)。此外，系統(tǒng)120也可包括設(shè)置成建立、維持或排出流過系統(tǒng)1200的任何介質(zhì)流的任何系統(tǒng)、裝置、來源或設(shè)備。根據(jù)需要，這可包括能夠通過以一定流速向系統(tǒng)1200的腔室中導(dǎo)入生物組合物來復(fù)制生理?xiàng)l件的一個(gè)或多個(gè)源，該速率能夠在腔室之間在預(yù)定范圍內(nèi)生成生理剪切，其中預(yù)定范圍可以是100s^-1至10,000s^-1。

如圖12所示，可在陣列中組裝系統(tǒng)1200的多個(gè)拷貝以產(chǎn)生仿生裝置或系統(tǒng)，系統(tǒng)1200的各拷貝獨(dú)立運(yùn)行或連接至其他拷貝。這種方法可提供使PLT生產(chǎn)過程平行化的方便高效方式。例如，一個(gè)系統(tǒng)1200的入口和/或出口可連接至第二系統(tǒng)1200的入口和/或出口等。在一些設(shè)計(jì)中，可設(shè)計(jì)入口，使得生物材料如MK可使用一個(gè)或多個(gè)源隨機(jī)或者同時(shí)導(dǎo)入并分布到各系統(tǒng)1200中。另外，來自各系統(tǒng)1200的出口可連接至單一主通道，其允許從陣列中的各系統(tǒng)1200收集到含有目標(biāo)生物物質(zhì)如proPLT和PLT的流出物的單容器中。

例如，對(duì)于50毫米×75毫米的多孔膜1208，可在單仿生裝置上合并超過160個(gè)系統(tǒng)1200。考慮到各系統(tǒng)的孔數(shù)為1.2x10⁸左右，這表明各裝置能夠捕獲大概2x10¹⁰個(gè)細(xì)胞，其代表了對(duì)于產(chǎn)生足夠數(shù)量的用于體內(nèi)(動(dòng)物和人)測(cè)試和輸注PLT而言足夠高的值。

系統(tǒng)1200包括幾個(gè)優(yōu)勢(shì)，包括用確定的ECM蛋白質(zhì)特定涂覆位于多孔膜1208上的孔的第一表面，和不用這些蛋白質(zhì)或用其他ECM蛋白質(zhì)涂覆孔的第二表面，確保MK可在第一表面上停留接觸其感興趣蛋白質(zhì)，同時(shí)proPLT延伸并且它們釋放的PLT互相接觸的能力。另外，所述的系統(tǒng)1200設(shè)計(jì)促進(jìn)了從不同材料構(gòu)造的各種多孔膜1208的清潔或交換，并且有不同孔徑，根據(jù)具體應(yīng)用的需要。

根據(jù)本發(fā)明的方面的系統(tǒng)100、900和1200通過復(fù)制人生理中的維度、環(huán)境和條件來提供復(fù)制或重復(fù)在人生理中所見的生理?xiàng)l件的平臺(tái)。例如，經(jīng)歷受控環(huán)境和流動(dòng)條件的由緊密隔開的柱分隔的微流體通道，參考圖1所述，提供了復(fù)制人BM的實(shí)際生理模型。通過控制MK捕獲、BM硬度、ECM組成、微通道尺寸、血液動(dòng)力學(xué)血管剪切、和內(nèi)皮細(xì)胞接觸，使用系統(tǒng)100、900和1200，可產(chǎn)生功能性PLT。

參考圖13，顯示了用于產(chǎn)生生理模型的過程1300的步驟，其中模型可包括骨髓和血管結(jié)構(gòu)中的至少一種。在過程模塊1302中，可將任意數(shù)量的生物組合物導(dǎo)入所述提供的仿生微流體系統(tǒng)中，例如，參考圖1、9和12。在一些實(shí)施方式中，過程模塊1302可包括使用第一源以第一流速向提供的系統(tǒng)的第一通道或腔室中導(dǎo)入第一生物組合物，并且使用第二源以第二流速向提供的系統(tǒng)的腔室或第二通道中導(dǎo)入第二生物組合物。在其他實(shí)施方式中，可以第三流速使用第二或第三源向系統(tǒng)的第三通道或腔室中導(dǎo)入第二或第三生物組合物。如上所述，可使用源和流的任意組合用生物組合物準(zhǔn)備、處理和/或輸注各通道或腔室，其中各生物組合物可包括半固體、固體、液體、細(xì)胞等，或其組合。

在過程模塊1304中，可控制流速以在通道和腔室之間產(chǎn)生所需的差。在一些方面中，控制這種流速可能在促進(jìn)產(chǎn)生血小板的與定范圍內(nèi)生成生理剪切速率。例如，這種預(yù)定范圍可以是100s^-1至10,000s^-1，并且更具體為500s^-1至2500s^-1。在一些方面中，可逆轉(zhuǎn)血流的相應(yīng)方向，如參考圖11所述。然后，在過程模塊1306中，可從流出物收獲產(chǎn)生的目標(biāo)物質(zhì)，例如，在提供的仿生微流體系統(tǒng)中設(shè)置的微通道的近側(cè)。如上所述，這類目標(biāo)生物物質(zhì)可包括血小板。在一些方面中，流出物可在過程模塊1306處經(jīng)過多個(gè)加工步驟以從流出物中提取目標(biāo)生物物質(zhì)。

下文詳細(xì)描述了本發(fā)明中使用的材料和方法的其他實(shí)施例。應(yīng)理解，實(shí)施例僅提供用于說明目的，并非旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。事實(shí)上，除本文所述和顯示的那些以外的各種修飾，如血腦屏障的應(yīng)用或分隔介質(zhì)間的分子擴(kuò)散是可能的。例如，描述了具體實(shí)施方式，包括維度、構(gòu)造、材料、細(xì)胞類型、流動(dòng)介質(zhì)和流速，制造方法和配方，以及成像、處理和分析方法等。然而，將理解也可使用實(shí)施方式并且其仍然落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

實(shí)施例

微流體裝置設(shè)計(jì)和制造

可使用軟性平版印刷來制造微流體裝置。如圖1的實(shí)施例所示，該裝置包含含有無源濾器的兩個(gè)通道(用于捕獲氣泡和灰塵)以及后續(xù)的流體阻礙器(用于減弱操作期間產(chǎn)生的流動(dòng)速率波動(dòng))。這些通道合并到1300微米長(zhǎng)、130微米寬和30微米深的矩形區(qū)域中，其被相隔3微米的一系列柱(10微米寬和90微米長(zhǎng))分離。為確保細(xì)胞培養(yǎng)期間有效的氣體交換并支持高分辨率活細(xì)胞顯微觀察，可由與玻璃載玻片結(jié)合的細(xì)胞惰性硅基有機(jī)聚合物構(gòu)建微流體裝置。

使用AutoCAD中的AutoDesk軟件來設(shè)計(jì)需要的2D圖案并打印在光刻鉻掩模(photolithography chrome mask)上。使用SU-83025光刻膠(麥克羅化學(xué)公司(Michrochem)，馬薩諸塞州牛頓市)旋涂硅晶片(大學(xué)晶片公司(University Wafers)，馬薩諸塞州波士頓)至30微米薄膜厚度(勞瑞爾科技公司(Laurell Technologies)，賓夕法尼亞州北威爾士)，65℃烘烤1分鐘并95℃烘烤5分鐘，并通過鉻掩模暴露于UV光(約10mJ cm^-2)30秒。通過將基材浸入丙二醇單甲醚乙酸酯中7分鐘來除去未結(jié)合的SU-8光刻膠。將聚二甲基硅氧烷(PDMS)倒在硅晶片的有圖案的一側(cè)上、脫氣并65℃下交聯(lián)約12小時(shí)。固化后，對(duì)PDMS層脫模并使用0.75mm直徑活檢鉆鉆出入口和出口孔。通過將PDMS板粘結(jié)于玻璃蓋片((#1.5，0.17x22x50mm，道康寧公司，比利時(shí)瑟內(nèi)夫)隨后用氧氣等離子體(PlasmaPrep 2，加拉儀器公司(GaLa Instrumente GmbH)，德國(guó)巴德施瓦爾巴赫)處理來密封通道。使用配備27號(hào)針的1mL注射器(BD公司(Beckton Dickinson)，新澤西州富蘭克林湖市)經(jīng)由PE/2導(dǎo)管(科學(xué)商品公司(Scientific Commodities)，亞利桑那州哈瓦蘇湖城)將樣品注入微流體裝置。通過注射器泵(PHD 2000，哈佛設(shè)備公司(Harvard Apparatus)，馬薩諸塞州霍利斯頓)控制液體的流動(dòng)速率。

微流體裝置操作

使用0.22μm過濾的10％BSA溶液(密理博公司(Millipore)，馬薩諸塞州比爾里卡)對(duì)裝置包被30分鐘以防止細(xì)胞直接接觸玻璃。參考圖1，使用雙注射器微流體泵(哈佛設(shè)備公司，馬薩諸塞州霍利斯頓)以12.5μL/小時(shí)的速率分別在第一入口118和第二入口122中輸注原代MK和培養(yǎng)基。當(dāng)?shù)谝怀隹?20關(guān)閉時(shí)，兩種輸入溶液都重定向至第二出口124，導(dǎo)致原代MK捕獲。

胞外基質(zhì)組成模型(2D)

通過使用若丹明偶聯(lián)的纖維蛋白原(1mg/mL)或纖連蛋白(50μg/mL，細(xì)胞骨架公司(Cytoskeleon Inc.)，科羅拉多州丹佛市)對(duì)通道灌注30分鐘來使用胞外基質(zhì)蛋白選擇性包被微流體裝置。通過兩個(gè)入口平行灌注樣品并通過兩個(gè)出口收集，使層狀流體流不混合。裝置使用1x PBS清洗并使用0.22μm過濾的(密理博公司，馬薩諸塞州比爾里卡)10％BSA溶液(羅氏公司(Roche)，加利福尼亞州南舊金山)包被30分鐘以包被任何剩余暴露的玻璃。

BM剛性建模(3D)

將原代MK重懸于培養(yǎng)基中平均分子量為150-250kD的1％無菌藻酸鹽(Pronova SLG100，F(xiàn)MC生物聚合物，挪威)中并跨微流體裝置(圖1中的第一入口118，第二出口124)直至MK被捕獲。隨后使用1xPBS選擇性灌注第二通道以從該通道中除去藻酸鹽。為制備均勻的藻酸鹽凝膠，將30mM納米顆粒碳酸鈣(mkNANO公司，加拿大)用作鈣源并溶解于60mM緩慢水解的D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)，密蘇里州圣路易斯)，其在溶液中釋放鈣(參見綜述Khavari等，NJP 2013)。沿第二通道灌注碳酸鈣懸浮液直至第一通道中保留的藻酸鹽溶液聚合(約20分鐘)。隨后使用1x PBS選擇性清洗第二通道并使用培養(yǎng)基替換。為測(cè)定藻酸鹽凝膠的機(jī)械性能，制備0.25％、0.5％、1.0％和2.0％藻酸鹽凝膠并在37℃下通過流變學(xué)測(cè)量其頻率依賴的剪切模量(Ares G2TA儀器公司(TA instruments)，特拉華州紐卡斯?fàn)?。

竇狀腺血管接觸建模(3D)

使用上文所述50μg/mL纖連蛋白(細(xì)胞骨架公司，科羅拉多州丹佛市)和10％BSA(羅氏公司，加利福尼亞州南舊金山)選擇性包被微流體裝置，并轉(zhuǎn)移至37℃、5％CO₂孵育器中。將EBM培養(yǎng)基中10,000,000HUVEC/mL(隆薩公司(Lonza)，瑞士巴塞爾)以12.5uL/小時(shí)接種于纖連蛋白包被的通道上并允許其在3小時(shí)的時(shí)間內(nèi)粘附于該表面上。使用無細(xì)胞EBM培養(yǎng)基替代入口樣品并通過通道灌注直至HUVEC實(shí)現(xiàn)融合(2-8天)。使用5μM CellTracker Red和1μtg/mL Hoescht 33342(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亞州卡爾斯巴德)對(duì)細(xì)胞染色45分鐘，在新鮮培養(yǎng)基中清洗或在4％甲醛中固定并通過共聚焦熒光顯微鏡觀察。

血管剪切速率建模(3D)

使用微流體裝置內(nèi)的流體動(dòng)力學(xué)計(jì)算機(jī)模型預(yù)測(cè)施加于MK上的剪切應(yīng)力。使用有限元方法軟件(COMSOL)來求解納維-斯托克斯(Navier-Stokes)方程。不可壓縮流體的穩(wěn)態(tài)納維-斯托克斯流體方程是：

其中ρ是流體密度，是流動(dòng)速度，p是壓力，μ是流體粘度且是f作用于流體上的體力。在復(fù)制微流體裝置的精確維度的三維計(jì)算機(jī)域中對(duì)方程(1)求解。假定該裝置中的流體具有水的粘度和密度(分別為0.001Pa s和1000kg/m3)。在通道壁處假定沒有滑動(dòng)邊界條件。輸注流動(dòng)速率的范圍是12.5-200μL/小時(shí)。使用三角網(wǎng)格(其在裂紋處更精細(xì))來使域離散化。該模型含有315，317自由度。在251，101和415，309自由度之間發(fā)現(xiàn)網(wǎng)格獨(dú)立性，如同剪切速率之間獲得小于10％的差異所確認(rèn)的那樣。使用UMFPACK線性系統(tǒng)解算器獲得穩(wěn)態(tài)解。

原代小鼠巨核細(xì)胞培養(yǎng)物

小鼠FLC收集自WT CD1小鼠(查爾斯河實(shí)驗(yàn)室(Charles River Laboratories)，馬薩諸塞州威爾明頓)并培養(yǎng)MK。

電子顯微分析

使用含1.25％多聚甲醛、0.03％苦味酸、2.5％戊二醛的0.1-M二甲砷酸鹽緩沖液(pH 7.4)對(duì)巨核細(xì)胞輸入物和生物反應(yīng)器流出物固定1小時(shí)，使用1％四氧化鋨進(jìn)行后固定，通過一系列醇進(jìn)行脫水，使用環(huán)氧丙烷浸透，并包埋在環(huán)氧樹脂中。對(duì)超薄切片染色并以80kV的加速電壓使用Tecnai G2 Spirit BioTwin電子顯微鏡(俄勒岡州希爾巴羅)檢查。使用先進(jìn)顯微鏡技術(shù)(AMT)2-K帶電偶聯(lián)裝置顯微鏡記錄圖像，其中使用AMT數(shù)字獲取和分析軟件(先進(jìn)顯微鏡技術(shù)公司(Advanced Microscopy Techniques)，馬薩諸塞州丹弗斯市)。

免疫熒光顯微分析

純化并探測(cè)巨核細(xì)胞、釋放的proPLT或生物反應(yīng)器流出物。將樣品與5μM CellTracker Green(英杰公司，加利福尼亞州卡爾斯巴德)孵育45分鐘，在新鮮培養(yǎng)基中清洗并通過活細(xì)胞熒光顯微鏡觀察，或者在4％甲醛中固定并離心至聚-L-賴氨酸(1μg/mL)包被的玻片上。對(duì)于細(xì)胞骨架組分的分析，對(duì)樣品使用0.5％曲通-X-100通透化，并在免疫熒光封閉緩沖液(含0.5g BSA、0.25ml 10％疊氮化鈉、5ml FCS的50ml 1×PBS)中封閉過夜，之后進(jìn)行抗體標(biāo)記(55)。為描繪微管細(xì)胞骨架，將樣品與針對(duì)小鼠或人β1-微管蛋白的兔多克隆一抗孵育。為描繪肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，將樣品與Alexa 568鬼筆環(huán)肽(英杰公司，加利福尼亞州卡爾斯巴德)孵育。使用1μg/mL Hoescht 33342(英杰公司，加利福尼亞州卡爾斯巴德)標(biāo)記細(xì)胞核。為校正背景熒光和非特異性抗體標(biāo)記，將載玻片與二抗單獨(dú)孵育，并相應(yīng)調(diào)節(jié)所有圖像。使用配備10x(數(shù)值孔徑，0.30)Plan-Neofluar空氣和63x(數(shù)值孔徑，1.4)Plan-ApoChromat油浸物鏡的Zeiss Axiovert 200(卡爾蔡司公司(Carl Zeiss)，紐約州索恩伍德)檢查樣品，并使用CCD照相機(jī)(濱松光子學(xué)公司(Hamamatsu Photonics)，馬薩諸塞州波士頓)獲取圖像。使用Metamorph 7.7.2.0版圖像分析軟件(分子裝置公司(Molecular Devices)，美國(guó)加利福尼亞州日照谷)和ImageJ 1.47p版軟件(NIH，http：//rsb.info.nih.gov.ezp-prod1.hul.harvard.edu/ij/)分析圖像。

細(xì)胞尺寸和多態(tài)性測(cè)定

對(duì)細(xì)胞單個(gè)地使用閾值進(jìn)行選擇并使用研究者編碼的軟件(列于下文)在ImageJ中進(jìn)行高含量胞質(zhì)面積和周長(zhǎng)測(cè)量。通過手動(dòng)觀察所有樣品來確認(rèn)分析，并將未正確選擇的細(xì)胞剔除出分析。從面積測(cè)量中計(jì)算MK直徑以說明非圓形細(xì)胞。對(duì)各條件計(jì)數(shù)超過2000個(gè)細(xì)胞，并對(duì)至少三個(gè)獨(dú)立樣品進(jìn)行MK面積和流出物組分的分析。使用成對(duì)樣品的雙尾斯氏t檢驗(yàn)建立統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。

活細(xì)胞顯微分析

對(duì)于剪切培養(yǎng)物，將MK加載至‘裸’微流體裝置(僅BSA包被)上，并在2小時(shí)時(shí)間內(nèi)使輸注速率逐步倍增，從12.5μL/小時(shí)至200μL/小時(shí)。對(duì)于靜態(tài)培養(yǎng)物，將分離的MK抽吸至腔體中并培養(yǎng)24小時(shí)，該腔體通過將3％BSA包被的玻璃玻片安裝在具有1cm孔的10mm培養(yǎng)皿上來形成。將靜態(tài)和剪切培養(yǎng)物都在37℃和5％CO₂下維持并使用配備10x(數(shù)值孔徑，0.30)Plan-Neofluar空氣物鏡的Zeiss Axiovert 200(卡爾蔡司公司，紐約州索恩伍德)檢查。以2秒(剪切培養(yǎng)物)或20分鐘(靜態(tài)培養(yǎng)物)間隔使用CCD照相機(jī)(濱松光子學(xué)公司，馬薩諸塞州波士頓)獲取微分干涉相襯(DIC)圖像。使用Metamorph 7.7.2.0版圖像分析軟件(分子裝置公司，美國(guó)加利福尼亞州日照谷)和ImageJ軟件1.47p版分析圖像。對(duì)來自至少三個(gè)獨(dú)立樣品的超過200個(gè)MK手動(dòng)測(cè)定proPLT延伸速率。對(duì)于PLT鋪展實(shí)驗(yàn)，2小時(shí)后從微流體裝置中收集流出物并抽吸入未包被的靜態(tài)培養(yǎng)物腔體中，如上文所述。通過重力沉降允許PLT接觸玻璃并在5分鐘時(shí)間內(nèi)以5秒間隔捕獲鋪展。

GFP-β1微管蛋白逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)染

將Dendra2融合的β1微管蛋白克隆至pMSCV質(zhì)粒。將HEK 293細(xì)胞包裝細(xì)胞在附加有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中培養(yǎng)至30-50％融合。使用pMSCV載體中編碼與Dendra2融合的β1微管蛋白、gag/pol和2μg vsvG的DNA質(zhì)粒進(jìn)行HEK 293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。第二天更換培養(yǎng)基后，將細(xì)胞孵育72小時(shí)以進(jìn)行病毒生產(chǎn)。通過0.22μm濾器(密理博公司，馬薩諸塞州比爾里卡)過濾上清液并將等分試樣儲(chǔ)存于-80℃。在培養(yǎng)的第二天，從上文所述胎肝培養(yǎng)物中分離的MK重懸于含有10％FBS、8μg/mL聚凝胺(西格瑪公司)和逆轉(zhuǎn)錄上清液的DMEM中。將樣品轉(zhuǎn)移至6孔板，25℃下800xg離心90分鐘并隨后在37℃下孵育90分鐘。孵育后，通過離心并重懸于含有10％FBS和TPO的新鮮DMEM中來清洗MK。允許MK成熟直至培養(yǎng)的第4天，隨后通過BSA梯度分離，如前文所述。

流式細(xì)胞術(shù)

從靜態(tài)MK培養(yǎng)物或生物反應(yīng)器流出物的釋放的proPLT組分中收集血小板并在靜止?fàn)顟B(tài)下檢查。使用針對(duì)CD42a或CD41/61的FITC偶聯(lián)的抗體(安福萊特分析公司(Emfret Analytics)，德國(guó)艾貝爾斯塔特)探測(cè)樣品并在FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD公司)上運(yùn)行。當(dāng)PLT通過檢測(cè)器時(shí)通過其特有的正向和側(cè)向散射來進(jìn)行門選，并在扣除FITC偶聯(lián)的IgG抗體特異性對(duì)照(安福萊特分析公司)后計(jì)算其總熒光強(qiáng)度。通過將流出物收集期間的凈GP IX+PLT生產(chǎn)除以凈GP IX+MK消耗來測(cè)定PLT產(chǎn)率，并對(duì)至少三個(gè)獨(dú)立樣品進(jìn)行。結(jié)果與GP IIbIIIa+細(xì)胞相同。

圖像分析

使用ImageJ和Adobe Photoshop CS3(Adobe系統(tǒng)公司(Adobe Systems)，加利福尼亞州圣何塞)分析Metamorph中獲取的數(shù)字圖像。分界線明確地區(qū)分單獨(dú)的不同圖像，或相同圖像的單獨(dú)區(qū)域。沒有對(duì)圖像內(nèi)的特定特征進(jìn)行增強(qiáng)、遮蔽、移動(dòng)、移除或?qū)耄覍?duì)亮度、對(duì)比度和色平衡的調(diào)節(jié)線性地應(yīng)用于整個(gè)圖像。

人BM的微流體裝置模型生理特性

為重現(xiàn)生理?xiàng)l件，分別使用纖維蛋白原和纖連蛋白選擇性包被各通道以再生血管微環(huán)境和BM的ECM組成(如圖2A所示)。通過跨微流體裝置流動(dòng)，沿第一通道輸注的原代MK在各柱之間被依次捕獲并將proPLT延伸至第二通道(如圖2B所示)，再現(xiàn)了生理proPLT延伸。為對(duì)3D ECM組織和生理BM剛性(250Pa)進(jìn)行建模，在微流體裝置中聚合的1％藻酸鹽溶液中輸注MK，將MK選擇性包埋在第一通道內(nèi)的藻酸鹽凝膠中并保留第二通道中的血管流。藻酸鹽不抑制proPLT生產(chǎn)，并可控制MK與第二通道的距離。

沿第二通道選擇性接種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，并生長(zhǎng)至融合以生產(chǎn)功能性血管(如圖2C所示)。此外，通過10x-150x放大、高分辨率活細(xì)胞顯微鏡監(jiān)測(cè)MK表現(xiàn)，并從流出物中收集釋放的PLT。圖2D顯示完整的系統(tǒng)，顯示運(yùn)行。表征層狀流體剪切速率(如圖2E所示)，并使用兩個(gè)微流體泵嚴(yán)格控制(一個(gè)用于第一通道且一個(gè)用于第二通道)。裝置內(nèi)的剪切速率與輸注速率呈線性正比例并經(jīng)調(diào)節(jié)以跨生理范圍(500-2500s^-1)。雖然空微通道連接部處的剪切速率隨著與第一通道的距離而增加(如圖2F所示)，但在MK捕獲后，流體被重定向至下一個(gè)可用的間隙從而使MK在這些位點(diǎn)處持續(xù)經(jīng)歷生理(760至780s^-1)剪切速率(如圖2G所示)。

血管剪切觸發(fā)proPLT生產(chǎn)、生理延伸和釋放

體內(nèi)BM MK以血液流動(dòng)的方向延伸proPLT并將PLT、proPLT、大的細(xì)胞質(zhì)片段(prePLT)和甚至整個(gè)MK釋放至竇狀腺血管中，其可在肺微血管床中捕獲，或在循環(huán)中成熟。為測(cè)定生理剪切對(duì)PLT生產(chǎn)的影響，在培養(yǎng)第4天分離小鼠胎肝培養(yǎng)物來源(mFLC)的MK并在輸注入微流體裝置前通過尺寸和多倍性表征(如圖3A所示)。

體外生產(chǎn)可輸注PLT的主要挑戰(zhàn)之一是鑒定觸發(fā)proPLT生產(chǎn)的因子。在靜態(tài)條件下，MK在分離后約6小時(shí)開始生產(chǎn)proPLT，并在18小時(shí)時(shí)達(dá)到最大proPLT生產(chǎn)(如圖3B所示)。相比之下，生理剪切下(如圖3C所示，約500s^-1)的MK在捕獲的數(shù)秒內(nèi)開始生產(chǎn)proPLT，在培養(yǎng)的最初2個(gè)小時(shí)內(nèi)達(dá)到最大proPLT生產(chǎn)和生物芯片飽和。生理剪切下的MK生成較少、較長(zhǎng)的proPLT，其相對(duì)于靜態(tài)培養(yǎng)物的高度支化程度較低。剪切培養(yǎng)中的proPLT均勻地延伸至下通道內(nèi)并以相對(duì)血管通道壁流動(dòng)的方向排布，再現(xiàn)了生理proPLT生產(chǎn)。生理剪切下生產(chǎn)proPLT的MK百分比是靜態(tài)培養(yǎng)物的兩倍，其比例為約90％(如圖3D所示)。

生成用于輸注的臨床數(shù)目的PLT的另一個(gè)主要挑戰(zhàn)是體外培養(yǎng)以顯著低于體內(nèi)的速率延伸proPLT。在我們的微流體裝置中應(yīng)用生理剪切將proPLT延伸提高至高于靜態(tài)培養(yǎng)物對(duì)照一個(gè)數(shù)量級(jí)(至大約30μm/分鐘，如圖3E所示)，其符合活小鼠中活體顯微研究的proPLT延伸速率生理預(yù)測(cè)并支持增加的體外proPLT生產(chǎn)。

在人和小鼠中的早期組織學(xué)研究預(yù)測(cè)可擠壓全MK以及MK片段通過BM血管內(nèi)血管內(nèi)皮中的間隙或穿孔以在肺循環(huán)床(pulmonary circulatory bed)中捕獲。最近在血液中發(fā)現(xiàn)了稱為prePLT的大PLT中間體，并且將mBM和FLC來源的MK和prePLT靜脈輸注至小鼠中在體內(nèi)生成了PLT。在目前的研究中，常規(guī)地觀察到100um+直徑MK擠壓通過3μm(如圖4A所示)和1.5μm間隙，或延伸大MK片段(如圖4B所示)，支持血管PLT生產(chǎn)的模型。此外，切斷事件(abscission event)通常由高分辨率活細(xì)胞顯微鏡捕獲并發(fā)生在沿proPLT軸的可變位置處，釋放prePLT大小的中間體(3-10μm直徑)和PLT(1.5-3μm直徑)(如圖4C和圖4D所示)。每次切斷后，所得proPLT末端在尖端形成新的PLT大小的膨脹，其隨后被延伸和釋放，重復(fù)該循環(huán)(如圖4E所示)。

當(dāng)剪切速率保持恒定時(shí)，proPLT延伸速率在沿軸的不同位置處變化，預(yù)測(cè)存在一種受調(diào)控的細(xì)胞骨架驅(qū)動(dòng)的proPLT延長(zhǎng)機(jī)制(如圖4C所示)。在生理范圍內(nèi)提高微流體剪切速率不影響培養(yǎng)物中proPLT延伸速率中值或proPLT延伸速率的分布(如圖4F所示)，且經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染以表達(dá)GFP-β1的MK中的proPLT凸出由外周微管(MT)組成，該外周微管在PLT尺寸的末端處形成螺旋(如圖4G所示)。proPLT達(dá)到超過5mm的長(zhǎng)度并在體外耐受最高1000s^-1的剪切力；其從活體顯微觀察中重現(xiàn)了proPLT生產(chǎn)的生理示例，并顯示剪切未導(dǎo)致切斷事件。為確認(rèn)剪切誘導(dǎo)的proPLT延伸是細(xì)胞骨架驅(qū)動(dòng)的，在微流體裝置中進(jìn)行輸注之前，將MK與5μM Jasplankinolide(Jas，肌動(dòng)蛋白穩(wěn)定劑)或1mM赤式-9-(3-[2-羥基壬基](EHNA，胞質(zhì)動(dòng)力蛋白抑制劑)孵育。在靜態(tài)和生理剪切條件下，Jas和EHNA都抑制剪切誘導(dǎo)的proPLT生產(chǎn)(如圖4H和圖4I所示)和PLT釋放。

衍生的PLT表現(xiàn)血液PLT的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)

PLT是直徑為約1-3μm的無核盤狀細(xì)胞，其在表面上表達(dá)生物標(biāo)志物GP IX和IIbIIIa，并且以環(huán)繞基于肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的6-8個(gè)MT的皮質(zhì)MT螺旋為特征。為確定PLT產(chǎn)率，培養(yǎng)第四天在我們的微流體裝置中進(jìn)行輸注之前緊接通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量糖蛋白(GP)IX+mFLC-MK的相對(duì)濃度和正向/側(cè)向散射和生物標(biāo)志物表達(dá)(如圖5A所示)。在輸注后2小時(shí)收集流出物并與mFLC-MK輸入物比較(如圖5B所示)。輸入的MK和流出的PLT都在其表面上表達(dá)GP IX和IIbIIIa，并顯示特征性正向/側(cè)向散射。在相對(duì)于培養(yǎng)第五天分離的靜態(tài)培養(yǎng)物上清液，剪切的應(yīng)用使得流出物的細(xì)胞組成朝向更多PLT尺寸的GPIX+細(xì)胞變化(如圖5C所示)。85±1％的MK在2小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)化為PLT，其符合我們的proPLT生產(chǎn)百分比的定量(圖3D)并與靜態(tài)培養(yǎng)物相比顯著改進(jìn)(圖5D)。在我們的微流體裝置中在2小時(shí)內(nèi)持續(xù)輸注約500s^-1剪切生成了約21個(gè)PLT/MK并形成超過現(xiàn)有培養(yǎng)方法的PLT生產(chǎn)速率，現(xiàn)有培養(yǎng)方法在長(zhǎng)得多的時(shí)間(6-8天)內(nèi)生成類似的PLT數(shù)目。

為定量我們的產(chǎn)品的形態(tài)組成(morphological composition)，對(duì)來自我們的微流體裝置的流出物探測(cè)β1微管蛋白(PLT特異性微管蛋白同種型)和Hoescht(細(xì)胞核染料)，并通過免疫熒光顯微鏡進(jìn)行分析。根據(jù)其形態(tài)和尺寸揀選細(xì)胞，并將其與靜態(tài)MK培養(yǎng)物上清液比較。剪切的應(yīng)用使得流出物的細(xì)胞組成朝向更多PLT尺寸的B1微管蛋白+Hoescht細(xì)胞變化(如圖5E所示)，其符合流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)(圖5C)并形成在組成上更類似于全血中PLT中間體的分布的產(chǎn)物。流出物中游離細(xì)胞核的定量確認(rèn)了相對(duì)于靜態(tài)培養(yǎng)物增加的微流體裝置介導(dǎo)的PLT生產(chǎn)并確定PLT產(chǎn)率為約20±12個(gè)PLT/MK，其符合流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)。

靜止的PLT含有特征性的表面膜內(nèi)陷(其形成開放的小管系統(tǒng))，閉合的殘留內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的通道網(wǎng)絡(luò)(其形成致密的微管系統(tǒng))，細(xì)胞器，特化的分泌顆粒，并且在與玻璃接觸激活后會(huì)變平/鋪展。微流體裝置生成的PLT無法通過薄片透射電子顯微鏡在超微結(jié)構(gòu)上與小鼠血液PLT區(qū)分開；并且含有皮層MT螺旋、開放的小管系統(tǒng)、致密的微管系統(tǒng)、線粒體、α顆粒和致密顆粒(如圖5F所示)。微流體裝置生成的PLT和PLT中間體通過免疫熒光顯微鏡顯示與小鼠血液PLT相比可比的MT和肌動(dòng)蛋白組成(如圖5G所示)，并在與玻璃接觸激活后正常鋪展，形成絲狀偽足和板狀偽足。

將微流體裝置應(yīng)用于人PLT生產(chǎn)

為生成人PLT，使用hiPSC衍生的MK代替我們的微流體裝置中的mFLC-MK，其提供了實(shí)際上用于輸注的無限制MK來源。hiPSC-MK在培養(yǎng)第15天分離，前提是其達(dá)到20-60μm的最大直徑(如圖6A所示)，并且在超微結(jié)構(gòu)上類似于原代人MK(如圖6B所示)。在靜態(tài)培養(yǎng)物下，hiPSC-MK在分離后約6小時(shí)開始生產(chǎn)proPLT，并在18小時(shí)時(shí)達(dá)到最大proPLT生產(chǎn)(如圖6C所示)。相比之下，生理剪切下(約500s^-1)的hiPSC-MK在捕獲后立即開始生產(chǎn)proPLT，并在培養(yǎng)的最初2個(gè)小時(shí)內(nèi)延伸/釋放proPLT(如圖6D所示)。剪切下的生產(chǎn)proPLT的hiPSC-MK的百分比增加至約90％，顯著超過靜態(tài)培養(yǎng)物(約10％)(如圖6E所示)。

proPLT延伸速率略低于mFLC-MK對(duì)照(約19μm/分鐘對(duì)比30μm/分鐘)(如圖6F所示)且更接近生理對(duì)照。微流體裝置生成的PLT顯示正向和側(cè)向散射，和人血液PLT的表面生物標(biāo)志物表達(dá)特征，其無法通過薄片透射電子顯微鏡在超微結(jié)構(gòu)上與人血液PLT區(qū)分開(如圖6G所示)，通過免疫熒光顯微鏡顯示與人血液PLT相比可比的MT和肌動(dòng)蛋白表達(dá)(如圖6H所示)，在與玻璃接觸激活后正常鋪展，并形成絲狀偽足和板狀偽足(如圖6I所示)?？傊?，這些結(jié)果顯示可將hiPSC-MK應(yīng)用于我們的仿生微流體裝置以生成潛在無限數(shù)目的功能性人PLT。

將微流體裝置應(yīng)用于藥物開發(fā)

血小板減少癥會(huì)突然并通常無意間發(fā)生，潛在地導(dǎo)致大量出血和死亡。已證明抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答導(dǎo)致血小板減少癥。此外，血小板減少癥可由多種藥物觸發(fā)，包括癌癥藥物，例如達(dá)沙替尼。動(dòng)物模型通常是人中藥物安全性和功效的較差預(yù)測(cè)物，而臨床研究是耗時(shí)、昂貴且潛在有害的。設(shè)計(jì)為模擬人BM的微流體裝置代表了具有重大臨床重要性的創(chuàng)新領(lǐng)域，提供有效和實(shí)際的平臺(tái)來研究多種藥物對(duì)于BM和MK生物學(xué)的影響。

通常通過使用流式細(xì)胞術(shù)的輸注研究來測(cè)量PLT存活率和清除率。然而，proPLT生產(chǎn)的速率和程度的定量不適用于該方法，且需要直接觀察以確定血小板生成在哪個(gè)階段受到影響。相反地，本發(fā)明的微流體系統(tǒng)的應(yīng)用提供了以研究藥物對(duì)PLT生產(chǎn)的影響的重要平臺(tái)，這會(huì)促進(jìn)鑒定PLT生產(chǎn)的新調(diào)控因子并闡明臨床上重要的藥物誘導(dǎo)的血小板減少癥的機(jī)制。

作為概念驗(yàn)證，使用了高含量活細(xì)胞顯微鏡來鑒定曲妥珠單抗安木坦興(trastuzumab emtansine，T-DM1)表達(dá)GFP·Pl微管蛋白(活細(xì)胞顯微術(shù))影響PLT生產(chǎn)的機(jī)制，該T-DM1是一種目前用于乳腺癌的臨床研發(fā)中的抗體藥物偶聯(lián)物。這些研究表明T-DM1通過誘導(dǎo)異常的微管蛋白組織來抑制MK分化并破壞proPLT形成(如圖7所示)。確定治療劑(如T-DM1)影響MK成熟和proPLT生產(chǎn)的通路可產(chǎn)生體內(nèi)調(diào)控PLT生產(chǎn)和控制藥物誘導(dǎo)的血小板減少癥的策略。

本發(fā)明的方法利用一種全新的微流體設(shè)計(jì)來離體再現(xiàn)人BM和血管生理學(xué)，并生成用于輸注的功能性人PLT的替代性來源。雖然臨床上想要滿足日益增長(zhǎng)的輸注需要并規(guī)避目前與血小板獲取和儲(chǔ)存相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，但用于治療應(yīng)用的供體非依賴性PLT的研發(fā)過程中一直存在兩個(gè)主要的數(shù)量障礙：(1)生成足夠數(shù)目(約3x10⁸)的人MK以支持一個(gè)PLT輸注單元(約3x10¹¹個(gè)PLT)的生產(chǎn)，以及(2)每個(gè)MK生成生理數(shù)目的功能性人PLT(約10³-10⁴)。人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物(hESC)和更近期的人誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞培養(yǎng)物(hiPSC)的開發(fā)提供了潛在無限的祖細(xì)胞來源，其可在體外分化為人MK以解決第一個(gè)數(shù)量障礙。實(shí)際上，由于PLT是無核的，可在輸注前輻照PLT微流體裝置來源的單元，解決了來源于hESC或hiPSC的細(xì)胞產(chǎn)品可能是致癌或致畸形的問題。

研究PLT生產(chǎn)的環(huán)境驅(qū)動(dòng)因子的嘗試受到簡(jiǎn)化論者方法的限制，且2D液體培養(yǎng)物的主要限制是其無法形成3D BM組成和硬度、proPLT延伸的定向和靜脈內(nèi)皮的接近度(proximity)。同樣地，雖然進(jìn)入竇狀腺血管的生產(chǎn)proPLT的MK經(jīng)歷500至2500s^-1的壁剪切速率，通過在ECM包被的載玻片上輸注MK來塑造血管流的嘗試選擇了固定/粘合的MK，并且無法區(qū)分ECM接觸激活與剪切?；蛘?，在孵育搖床中向心攪動(dòng)釋放的proPLT，其不再現(xiàn)BM血管中的層狀剪切流，不提供血管剪切速率的精確控制，且不適用于高分辨率活細(xì)胞顯微觀察。然而，雖然存在這些限制，但將MK暴露于高剪切速率(1800s^-1)加速了proPLT生產(chǎn)，并且與在約0.5Pa流體剪切壓力下維持2小時(shí)的proPLT相比，不存在剪切的情況下培養(yǎng)的proPLT釋放更少的PLT。此外，多光子活體顯微技術(shù)的最新進(jìn)展提供了提高的體內(nèi)proPLT生產(chǎn)分辨率并確認(rèn)血管流對(duì)于proPLT延伸和PLT釋放的重要性。雖然這些研究提供了體內(nèi)proPLT生產(chǎn)的生理學(xué)上精確的示例，但微環(huán)境的受限的控制和較差的分辨率阻止了BM微環(huán)境如何幫助PLT釋放的進(jìn)一步研究。

證明細(xì)胞-細(xì)胞接觸、胞外基質(zhì)(ECM)組成和硬度、血管剪切速率、pO₂/pH、可溶性因子相互作用和溫度有助于proPLT形成和PLT釋放的越來越多的證據(jù)表明，在3D微流體培養(yǎng)形態(tài)內(nèi)再生BM和血管微環(huán)境是實(shí)現(xiàn)臨床上重要的功能性人PLT數(shù)目所必需的。實(shí)際上，已在連續(xù)流體流下應(yīng)用模塊化3D編織聚酯網(wǎng)格以在培養(yǎng)物中從1x10⁶個(gè)CD34⁺人臍帶血細(xì)胞中生成最多6x10⁶個(gè)PLT/天。雖然表明可以獲得臨床上有用的培養(yǎng)物來源的人PLT數(shù)目，但那些3D灌注生物反應(yīng)器沒有精確地再生BM微環(huán)境的流體特性和復(fù)合物結(jié)構(gòu)，且其閉合的模塊化設(shè)計(jì)無法直接觀察proPLT生產(chǎn)，難以提供對(duì)PLT釋放機(jī)制的理解?；蛘?，已提出使用3D PDMS生物芯片相鄰的ECM包被的基于絲的導(dǎo)管來再生BM竇狀腺并在體外研究MK分化和PLT生產(chǎn)。雖然能夠在成熟期間再現(xiàn)了MK遷移，但該設(shè)計(jì)無法適用于高分辨率活細(xì)胞顯微分析，并無法再生驅(qū)動(dòng)MK分化所需的內(nèi)皮細(xì)胞接觸。

相比之下，本發(fā)明的微流體裝置設(shè)計(jì)提供了完整解決方案，允許PLT釋放時(shí)間的顯著改進(jìn)和總PLT產(chǎn)率的增加。此外，在微流體裝置內(nèi)應(yīng)用血管剪切速率誘導(dǎo)proPLT生產(chǎn)并再現(xiàn)生理proPLT延伸和釋放。此外，在生理流動(dòng)條件下，MK能夠擠壓通過小間隙以進(jìn)入循環(huán)并釋放prePLT中間體。在本發(fā)明的微流體裝置中持續(xù)輸注MK生成的產(chǎn)物達(dá)到了生理PLT濃度并表現(xiàn)血液PLT的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)。最后，PLT微流體裝置可應(yīng)用于人MK培養(yǎng)物以生產(chǎn)功能性人PLT。雖然每個(gè)MK的PLT產(chǎn)率低于理論預(yù)測(cè)值，但MK培養(yǎng)物將大MK片段(prePLT、proPLT)以及MK自身常規(guī)性釋放至流出物通道內(nèi)的觀察表明，實(shí)際的PLT數(shù)目依賴于在支持性微環(huán)境(如肺和循環(huán)血液)中PLT中間體向PLT的進(jìn)一步分化。實(shí)際上，在將mFLC來源的proPLT輸注至小鼠時(shí)，其在12-24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)被迅速轉(zhuǎn)化為PLT。有趣的是，雖然該研究中CMFDA標(biāo)記的PLT在血液中容易檢測(cè)，但prePLT中間體并非如此，表明其可能在肺的微循環(huán)中捕獲。同樣地，在將mFLC和BM來源的MK輸注至小鼠中時(shí)，其幾乎都定位至肺并在最初的兩個(gè)小時(shí)內(nèi)釋放PLT。在這兩種情況下，幾乎可以確定血管剪切速率、血液中的可溶因子相互作用和內(nèi)皮細(xì)胞接觸調(diào)控該過程，且對(duì)這些組織中的局部微環(huán)境如何幫助末端PLT生產(chǎn)進(jìn)行檢驗(yàn)保證了進(jìn)一步研究。

通過在單個(gè)微流體系統(tǒng)中合并BM生理學(xué)的主要元素(包括3D ECM組成和硬度、細(xì)胞-細(xì)胞接觸、血管剪切速率、pO₂/pH、可溶性因子相互作用和溫度)，本發(fā)明的方法提供了前所未見的對(duì)離體微環(huán)境的控制和用于藥物開發(fā)的仿生平臺(tái)。此外，高分辨率活細(xì)胞顯微鏡的支持允許在培養(yǎng)期間直接觀察細(xì)胞并對(duì)較差表征的生理過程提供了窗口。最后，通過鏡像復(fù)制(mirror)中央通道各側(cè)上的流出物通道、延長(zhǎng)裝置以支持較多數(shù)目的柱并將多個(gè)單元平行定位在較大的微流體裝置基質(zhì)內(nèi)，可容易地?cái)U(kuò)大微流體裝置設(shè)計(jì)的規(guī)模。在較長(zhǎng)的裝置中持續(xù)收獲hiPSC-MK可導(dǎo)致臨床上重要的PLT數(shù)量以進(jìn)行例如PLT功能的傳統(tǒng)集合度測(cè)定，以及在免疫抑制的小鼠中進(jìn)行體內(nèi)異源-輸注研究以測(cè)量PLT計(jì)數(shù)的增加，每次研究需要約10⁸個(gè)PLT。

總之，本發(fā)明顯示了一種系統(tǒng)和方法以再現(xiàn)人BM和竇狀腺血管，用于在適用于高分辨率成像的方法中生成人血小板。本發(fā)明的仿生微流體系統(tǒng)可使用PDMS、玻璃和任何其他合適材料制造，并且包括多個(gè)微流體通道和腔室構(gòu)造，其設(shè)計(jì)為模擬實(shí)際生理?xiàng)l件，如流速、剪切速率、壓力差等。那樣，可用ECM和人內(nèi)皮細(xì)胞，以及其他與生理系統(tǒng)一致的生物試劑或材料選擇性涂覆本文所述的微流體系統(tǒng)的通道或腔室。在所述的一些操作形式中，可依次捕獲沿著本文詳述的微流體系統(tǒng)的不同通道輸注的圓形或proPLT生產(chǎn)型MK，并且使血小板產(chǎn)生proPLT延伸到隨后釋放PLT來收獲的相鄰?fù)ǖ乐?。可通過可控的生理剪切速率和調(diào)節(jié)的微環(huán)境來刺激或優(yōu)化這種過程，并且可從流出物中收集進(jìn)入流體流的釋放的PLT，該過程能夠使用例如高分辨率顯微術(shù)來觀察。

上文所述多種構(gòu)造僅是示例而不旨在限制本發(fā)明的范圍。本文所述各種構(gòu)造的變化形式對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言顯而易見，這類變化形式在本發(fā)明的范圍內(nèi)。具體而言，可選擇一個(gè)或多個(gè)上述構(gòu)造的特征以建立替代性構(gòu)造，其包含上文未明確描述的特征子組合。此外，可選擇并合并一個(gè)或多個(gè)上述構(gòu)造的特征以建立替代性構(gòu)造，其包含上文未明確描述的特征組合。在通讀本發(fā)明后，適用于這類組合和子組合的特征對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見。本文和權(quán)利要求中所述主題旨在覆蓋和包括技術(shù)中的所有適當(dāng)變化。