本申請要求于2014年3月30日提交的、題目為“經(jīng)修飾的胞嘧啶多核苷酸寡聚物和方法”、系列號61/972,391的臨時專利申請以及于2015年3月30日提交的、題目為“經(jīng)修飾的胞嘧啶多核苷酸寡聚物和方法”、系列號14/673,494的非臨時專利申請的權(quán)益，其公開內(nèi)容通過援引整體上并入以用于所有目的。
技術(shù)領(lǐng)域：
本文的技術(shù)涉及核酸。
背景技術(shù)：
：多核苷酸用于各種應(yīng)用，例如靶標檢測、診斷應(yīng)用、治療應(yīng)用、核酸測序、法醫(yī)分析和靶標擴增。通常而言，此類應(yīng)用需要與互補多核苷酸鏈以高特異性和敏感性雜交的多核苷酸，特別是當(dāng)靶核酸以有限量可獲得時。已經(jīng)開發(fā)了具有經(jīng)修飾的堿基的核苷酸類似物以包含在多核苷酸中，從而改變核酸雜交、擴增和/或檢測的強度、敏感性和/或特異性。然而，需要新的化學(xué)結(jié)構(gòu)和方法來擴展對于操作和分析核酸可獲得的工具組。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明特別地提供一種能夠提供增強的與鳥嘌呤堿基的堿基配對的新型的非天然存在的胞嘧啶樣經(jīng)修飾的堿基(本文也稱為“經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基”或者簡稱為“經(jīng)修飾的堿基”)、包含此類經(jīng)修飾的堿基的多核苷酸寡聚物及其應(yīng)用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)引入多核苷酸寡聚物時本發(fā)明的經(jīng)修飾的堿基令人驚奇地增加包含其的這些寡聚物(與不含有此類經(jīng)修飾的堿基的寡聚物相比)對于與互補性序列雜交的結(jié)合親合性和特異性。該令人驚奇的發(fā)現(xiàn)允許使用較短的寡聚物或者在寡聚物和其互補靶序列之間的互補性的較短區(qū)。本發(fā)明的經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的進一步優(yōu)點在于它們能夠增強含有其的寡聚物的水溶性。這對于增加聚核酸(PNA)寡聚物的水溶性是尤其有用的，與DNA和RNA的溶解度相比，公知所述聚核酸(PNA)寡聚物是相對水不溶性的。增加的水溶性(除了雜交期間胞嘧啶對諸如鳥嘌呤的互補性堿基的堿基配對親合性的強度增加之外)對于抵消芳香族熒光團和猝滅劑部分的疏水性特征也能是有用的，所述芳香族熒光團和猝滅劑部分的疏水性特征能夠促進經(jīng)標記的多核苷酸寡聚物在水性條件下不想要的沉淀或凝集。此外，根據(jù)用戶的特定需要，本發(fā)明的一個或多個經(jīng)修飾的堿基可位于寡聚物堿基序列中的任意位置。本發(fā)明的多核苷酸寡聚物可以包含任意數(shù)量的經(jīng)修飾的堿基。在本發(fā)明的一些實施方式中，多核苷酸寡聚物包含至少一個經(jīng)修飾的堿基，其中，所述經(jīng)修飾的堿基由下式表示：其中，Z是CH2或O。在本發(fā)明的特定實施方式中，Z是O。上式中所示的經(jīng)修飾的堿基，本文稱為“經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基”或簡稱為“經(jīng)修飾的堿基”。本發(fā)明的多核苷酸寡聚物可以包含任意數(shù)量的脫氧核苷酸部分(moiety)。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物包含至少一個脫氧核糖核苷酸部分。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基與所述多核苷酸寡聚物中的脫氧核糖核苷酸部分共價連接。本發(fā)明的多核苷酸寡聚物還可以包含任意數(shù)量的肽核酸(PNA)部分。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物包含至少一個肽核酸(PNA)部分。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基與所述多核苷酸寡聚物中的肽核酸部分共價連接。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物是PNA/DNA嵌合體，其中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基包括在所述嵌合體的PNA鏈段(segment)中或者DNA鏈段中，或者包括在所述嵌合體的PNA鏈段和DNA鏈段二者中，各鏈段包含此類經(jīng)修飾的堿基。本發(fā)明的多核苷酸可以包含任意數(shù)量的經(jīng)修飾的堿基。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物包含多個經(jīng)修飾的堿基。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物包含至少2個經(jīng)修飾的堿基。當(dāng)多核苷酸寡聚物包含多個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基時，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基可以相同或不同。對于可以將經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基引入多核苷酸寡聚物內(nèi)的何處沒有限制。在本發(fā)明的一些實施方式中，多核苷酸寡聚物在多核苷酸寡聚物的3’端處包含經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物在距離多核苷酸寡聚物的3’端一個堿基處包含經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。本發(fā)明的多核苷酸寡聚物可以包含一種或多種另外的化合物。在本發(fā)明的一些實施方式中，多核苷酸寡聚物包含小溝結(jié)合劑。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物包含嵌入劑。本發(fā)明的優(yōu)選多核苷酸寡聚物是其中，主鏈包含2’-脫氧核糖或核糖的多核苷酸寡聚物。但是，本發(fā)明的多核苷酸寡聚物可以包含一種或多種修飾。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物包含糖修飾。各種糖修飾是有用的。一些非限制性糖修飾包括阿拉伯糖、d-阿拉伯-己糖醇、2-氟阿拉伯糖、木糖、己糖和雙環(huán)糖(bicyclicsugar)。本發(fā)明的多核苷酸寡聚物可以包含一種或多種主鏈修飾。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物包含主鏈修飾。在一些實施方式中，主鏈修飾選自由下述組成的組：經(jīng)修飾的糖磷酸酯主鏈、鎖核酸主鏈、肽主鏈、磷酸三酯主鏈(phosphotriester)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)主鏈、硅氧烷主鏈、羧甲基酯主鏈、乙酰胺酯主鏈、氨基甲酸酯主鏈、硫醚主鏈、橋接亞甲基膦酸酯主鏈、硫代膦酸酯主鏈、甲基膦酸酯主鏈、烷基膦酸酯主鏈、磷酸酯主鏈、烷基硫代膦酸酯主鏈、二硫代膦酸酯主鏈、碳酸酯主鏈、磷酸酯三酯主鏈(phosphatetriesterbackbone)、羧甲基酯主鏈、甲基硫代膦酸酯主鏈、二硫代膦酸酯主鏈、具有對乙氧基鍵的主鏈以及前述任何兩種以上的組合。在本發(fā)明的特定實施方式中，主鏈修飾是經(jīng)修飾的糖磷酸酯主鏈。在本發(fā)明的一些實施方式中，多核苷酸寡聚物包含通過DNA或RNA依賴性聚合酶能夠延伸的3’末端核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸寡聚物可以包含任意有用數(shù)量的核苷酸。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物包含小于30個核苷酸。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物包含約9～約25個核苷酸，即9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸寡聚物可以包含一個或多個可檢測標記。在本發(fā)明的一些實施方式中，多核苷酸寡聚物包含至少一個可檢測標記。可檢測標記不受限制。在一些實施方式中，可檢測標記是熒光團或熒光猝滅劑。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物包含熒光團和熒光猝滅劑。本發(fā)明還提供在雜交方法中使用本發(fā)明的經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的方法。在雜交方法中可以使用本文所述的任何經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。在本發(fā)明的一些實施方式中，提供使本發(fā)明的多核苷酸寡聚物與懷疑在反應(yīng)混合物中存在的核酸靶序列雜交的方法。在一些實施方式中，所述方法包括使包含多核苷酸寡聚物并且懷疑包含靶核酸序列的反應(yīng)混合物在有利于所述多核苷酸寡聚物與在所述反應(yīng)混合物中如果存在的靶核酸序列雜交的條件下溫育的步驟。該方法中使用的多核苷酸寡聚物與懷疑在反應(yīng)混合物中存在的核酸靶序列內(nèi)的序列互補，并且包含至少一個由下式表示的經(jīng)修飾的堿基：其中，Z是CH2或O。在本發(fā)明的特定實施方式中，Z是O。將反應(yīng)混合物溫育，由此在多核苷酸寡聚物與在反應(yīng)混合物中如果存在的靶核酸序列之間形成雙鏈體。在一些實施方式中，所述方法包括檢測在反應(yīng)混合物中所述靶核酸序列的存在或者確認其不存在。作為形成此類雙鏈體的結(jié)果，檢測到在反應(yīng)混合物中存在所述靶核酸序列。作為不形成此類雙鏈體的結(jié)果，確認在反應(yīng)混合物中不存在所述靶核酸序列。在所述方法的一些實施方式中，多核苷酸寡聚物包含選自由可檢測標記、熒光團和熒光猝滅劑組成的組的部分。可檢測標記、熒光團和/或熒光猝滅劑有助于雙鏈體的檢測和/或靶核酸序列的檢測。本發(fā)明還提供包含任意數(shù)量的多核苷酸寡聚物的雙鏈體，所述多核苷酸寡聚物包含本發(fā)明的經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。在本發(fā)明的一些實施方式中，雙鏈體包含至少一個多核苷酸寡聚物和多核苷酸序列。所述至少一個多核苷酸寡聚物包含經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基，以及互補多核苷酸序列的至少4個相鄰堿基互補和雜交的4個以上相鄰堿基。此類雙鏈體可以用本發(fā)明的任何多核苷酸寡聚物形成。在一些實施方式中，具有雙鏈體的多核苷酸寡聚物包含至少一個由下式表示的經(jīng)修飾的堿基其中，Z是CH2或O。在本發(fā)明的特定實施方式中，Z是O。在一些實施方式中，雙鏈體內(nèi)的多核苷酸寡聚物包含選自由可檢測標記、熒光團和熒光猝滅劑組成的組的部分?？蓹z測標記、熒光團和/或熒光猝滅劑有助于雙鏈體的檢測和/或雙鏈體內(nèi)的多核苷酸序列的檢測。在本發(fā)明的一些實施方式中，提供經(jīng)修飾的核苷亞磷酰胺。在本發(fā)明的一些實施方式中，經(jīng)修飾的核苷亞磷酰胺由下式表示：其中，Z是CH2或O；其中，X1和X2分別是相同或不同的保護基，或者X1和X2合起來看是二齒保護基；其中，Y1和Y2獨立地是H或氮保護基，或者Y1和Y2一起是氮保護基；和其中，Q是羥基保護基。在本發(fā)明的特定實施方式中，Z是O。在本發(fā)明的一些實施方式中，提供經(jīng)修飾的肽核酸。在本發(fā)明的一些實施方式中，經(jīng)修飾的肽核酸由下式表示：其中，Z是CH2或O；其中，X1和X2分別是相同或不同的保護基，或者X1和X2合起來看是二齒保護基；其中，Y1和Y2獨立地是H或氮保護基，或者Y1和Y2一起是氮保護基；其中，Q1和Q2獨立地是H或氮保護基，或者Q1和Q2一起是氮保護基；和其中，Q3是H或羧基保護基。在本發(fā)明的一些實施方式中，提供經(jīng)修飾的胞嘧啶核苷。在本發(fā)明的一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶核苷由下式表示：在本發(fā)明的特定實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶核苷由下式表示：在本發(fā)明的一些實施方式中，提供經(jīng)修飾的胞嘧啶核苷酸5’-三磷酸酯。在本發(fā)明的一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶核苷酸5’-三磷酸酯由下式表示：在本發(fā)明的特定實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶核苷酸5’-三磷酸酯由下式表示：本發(fā)明的一些實施方式以正下方的權(quán)利要求形式提出。權(quán)利要求1.一種多核苷酸寡聚物，所述多核苷酸寡聚物包含至少一個經(jīng)修飾的堿基，其中，所述至少一個經(jīng)修飾的堿基由下式表示：其中，Z是CH2或O，并且優(yōu)選的是，Z是O。權(quán)利要求2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物包含多個脫氧核糖核苷酸部分，優(yōu)選的是，至少一個脫氧核糖核苷酸部分。權(quán)利要求3.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸寡聚物，其中，經(jīng)修飾的堿基與所述至少一個脫氧核糖核苷酸部分共價連接。權(quán)利要求4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物包含多個肽核酸部分，優(yōu)選的是，至少一個肽核酸部分。權(quán)利要求5.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述經(jīng)修飾的堿基與所述至少一個肽核酸部分共價連接。權(quán)利要求6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物是PNA/DNA嵌合體。權(quán)利要求7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物包含至少兩個經(jīng)修飾的堿基，并且其中在所述至少兩個經(jīng)修飾的堿基中的Z相同或不同。權(quán)利要求8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物在其3’端處或者在距離其3’端一個堿基處包含所述經(jīng)修飾的堿基。權(quán)利要求9.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物還包含小溝結(jié)合劑或嵌入劑。權(quán)利要求10.如權(quán)利要求1-9中任一項所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物還包含糖修飾；優(yōu)選的是，所述糖修飾選自由阿拉伯糖、d-阿拉伯-己糖醇、2-氟阿拉伯糖、木糖、己糖和雙環(huán)糖組成的組。權(quán)利要求11.如權(quán)利要求1-10中任一項所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物還包含主鏈修飾，優(yōu)選的是，所述主鏈修飾選自由下述組成的組：經(jīng)修飾的糖磷酸酯主鏈、鎖核酸主鏈、肽主鏈、磷酸三酯主鏈、氨基磷酸酯主鏈、硅氧烷主鏈、羧甲基酯主鏈、乙酰胺酯主鏈、氨基甲酸酯主鏈、硫醚主鏈、橋接亞甲基膦酸酯主鏈、硫代膦酸酯主鏈、甲基膦酸酯主鏈、烷基膦酸酯主鏈、磷酸酯主鏈、烷基硫代膦酸酯主鏈、二硫代膦酸酯主鏈、碳酸酯主鏈、磷酸酯三酯主鏈、羧甲基酯主鏈、甲基硫代膦酸酯主鏈、二硫代膦酸酯主鏈、具有對乙氧基鍵的主鏈以及前述任何兩種以上的組合；優(yōu)選的是，所述主鏈修飾是經(jīng)修飾的糖磷酸酯主鏈。權(quán)利要求12.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物還包含通過DNA或RNA依賴性聚合酶能夠延伸的3’末端核苷酸。權(quán)利要求13.如權(quán)利要求1-2中任一項所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物包含小于30個核苷酸，優(yōu)選的是，所述寡核苷酸寡聚物包含約9～約25個核苷酸。權(quán)利要求14.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的多核苷酸寡聚物，其中，所述多核苷酸寡聚物還包含選自由可檢測標記、熒光團和熒光猝滅劑組成的組的部分。權(quán)利要求15.一種使權(quán)利要求1-14中任一項所述的多核苷酸寡聚物與懷疑在反應(yīng)混合物中存在的核酸靶序列雜交的方法，所述方法包括以下步驟：(a)使包含權(quán)利要求1-14中任一項所述的多核苷酸寡聚物并且懷疑包含靶核酸序列的反應(yīng)混合物在有利于所述多核苷酸寡聚物與在反應(yīng)混合物中如果存在的靶核酸序列雜交的條件下溫育；和(b)檢測在反應(yīng)混合物中所述靶核酸序列的存在或者確認其不存在；其中，所述多核苷酸寡聚物與在所述核酸靶序列內(nèi)的序列互補，其中，所述多核苷酸寡聚物包含至少一個經(jīng)修飾的堿基，和其中，所述至少一個經(jīng)修飾的堿基由下式表示：其中，Z是CH2或O，并且優(yōu)選的是，Z是O。權(quán)利要求16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述多核苷酸寡聚物還包含選自由可檢測標記、熒光團和熒光猝滅劑組成的組的部分。權(quán)利要求17.一種雙鏈體，其包含：(i)至少一個權(quán)利要求1-14中任一項所述的多核苷酸寡聚物；和(ii)多核苷酸序列；其中，所述至少一個權(quán)利要求1-14中任一項所述的多核苷酸寡聚物包含與所述多核苷酸序列的至少4個相鄰堿基互補和雜交的4個以上相鄰堿基。權(quán)利要求18.一種由下式表示的經(jīng)修飾的核苷亞磷酰胺：其中，Z是CH2或O，并且優(yōu)選的是，Z是O；其中，X1和X2分別是相同或不同的保護基，或者X1和X2合起來看是二齒保護基；其中，Y1和Y2獨立地是H或氮保護基，或者Y1和Y2一起是氮保護基；和其中，Q是羥基保護基。權(quán)利要求19.一種由下式表示的經(jīng)修飾的肽核酸單體：其中，Z是CH2或O，并且優(yōu)選的是，Z是O；其中，X1和X2分別是相同或不同的保護基，或者X1和X2合起來看是二齒保護基；其中，Y1和Y2獨立地是H或氮保護基，或者Y1和Y2一起是氮保護基；其中，Q1和Q2獨立地是H或氮保護基，或者Q1和Q2一起是氮保護基；和其中，Q3是H或羧基保護基。權(quán)利要求20.一種由下式表示的經(jīng)修飾的胸腺嘧啶核苷：并且優(yōu)選的是，所述經(jīng)修飾的胞嘧啶核苷由下式表示：權(quán)利要求21.一種由下式表示的經(jīng)修飾的胞嘧啶核苷酸5’-三磷酸酯：并且優(yōu)選的是，所述經(jīng)修飾的胞嘧啶核苷酸5’-三磷酸酯由下式表示：在以下描述中提出本發(fā)明的另外特征和優(yōu)點。公開內(nèi)容的這些和其它特征會從以下描述變得更完全地顯而易見，或者能夠通過本文提出的原理的實施而了解。附圖說明圖1示意性地描述由一系列相同序列的多核苷酸寡聚物獲得的解鏈曲線(作為270nm的吸光度(A270)相對于溫度(℃)的一階導(dǎo)數(shù)而繪制)，所述多核苷酸寡聚物為：在多核苷酸寡聚物內(nèi)的不同位置處包含本發(fā)明的1個經(jīng)修飾的堿基(C1或C2)或2個經(jīng)修飾的堿基(C3)的多核苷酸寡聚物18-聚物(“CBP”)，或者包含正常的C堿基(稱為“天然的”)、與互補性DNA多核苷酸12-聚物雜交的多核苷酸寡聚物18-聚物。該圖顯示，本發(fā)明的經(jīng)修飾的胞嘧啶寡聚物與天然的相同序列的DNA寡聚物相比，具有顯著更強的對互補性序列的雜交親合性，并且包含兩個CBP部分(C2)的寡聚物具有最高親合性。另外的細節(jié)提供于實施例5和表4中。圖2A和2B示意性地描述從5’核酸酶PCR反應(yīng)獲得的作為循環(huán)數(shù)(Cn)的函數(shù)的熒光(516nm,FAM(Em))的圖，所述PCR反應(yīng)使用包含1～5個CBP部分的熒光探針，以及僅包含常規(guī)胞嘧啶堿基的正向引物和反向引物。使用以下探針：Pf1-C-1(1個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基)、Pf1-C-2(1個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基)、Pf1-C-3(1個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基)、Pf1-C-4(2個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基)、Pf1-C-5(2個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基；“Pf1-5”)、Pf1-C-6(3個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基；“Pf1-6”)、Pf1-C-7(3個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基；“Pf1-7”)和Pf1-C-8(5個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基；“Pf1-8”)。引物Pf1與經(jīng)修飾的胞嘧啶探針具有相同的核苷酸序列，然而，僅具有天然堿基，即無經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。另外的細節(jié)提供于實施例6和表4中。圖3示意性地描述來自5’核酸酶PCR反應(yīng)的作為循環(huán)數(shù)(Cn)的函數(shù)的熒光(516nm,FAM(Em))的圖，所述PCR反應(yīng)利用各自包含1個CBP部分的正向引物和反向引物使用各種引物延伸溫度(60℃、“60C”；63℃、“63C”；66℃、“66C”；和69℃、“69C”)進行。另外的細節(jié)提供于實施例7和表4中。圖4A和4B示意性地描述來自5’核酸酶PCR反應(yīng)的作為循環(huán)數(shù)(Cn)的函數(shù)的熒光的圖，所述PCR反應(yīng)利用未修飾引物(圖4A)或各自包含1個CBP部分的經(jīng)修飾的胞嘧啶引物(圖4B)和各種退火時間(圖4A：13、16、20、30和45秒；圖4B：8、10、13、16、20、30和45秒)。另外的細節(jié)提供于實施例7和表4中。具體實施方式I.定義在整個本說明書和所附權(quán)利要求中，詞語“包含”和“包括”及其各種變體如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”和“包括(including)”被包含性地解釋。即，這些詞語意指可能包含上下文允許但沒有具體描述的其它要素或整體。說明書中任何語言均不應(yīng)解釋為將任何未要求權(quán)利保護的要素作為實施本文所述發(fā)明的必要特征。正如此文所用的，短語“由……組成”意指包括并且對跟隨在“由……組成”后面的內(nèi)容的限制。因此短語“由……組成”是指需要所列出的要素或者其是強制性的，并且無其它要素可以存在。術(shù)語“基本上由……組成”是指所述組合物、方法或結(jié)構(gòu)可以包含另外的成分、步驟和/或部分，但是只有另外的成分、步驟和/或部分不實質(zhì)上改變所要求保護組合物、方法或結(jié)構(gòu)的基本的新穎特征。除非在本文另有說明或上下文明顯矛盾，描述本發(fā)明的上下文中(特別是在以下的權(quán)利要求書的上下文中)使用的術(shù)語“一個”(“a”，“an”)和“所述”(“the”)和類似的指代被解釋為包括單數(shù)和復(fù)數(shù)。除非在此另外指出，否則在此對數(shù)值范圍的敘述僅僅用作一種速記方法，分別涉及落入范圍內(nèi)的各單獨數(shù)值，各單獨數(shù)值包含在說明書內(nèi)，如同在此個別列舉一樣。范圍在此可以通過從“約”(或“大約”)一個特定值和/或至“約”(或“大約”)另一個特定值來表達。當(dāng)表達此類范圍時，另一實施方式包括從某一特定值和/或到另一特定值。類似的，當(dāng)值通過使用在前的“約”或“大約”被表示為近似值時，應(yīng)該理解，該特定值形成另一實施方式。還應(yīng)當(dāng)理解每個范圍的端點相對于另一個端點以及獨立于另一個端點都是有意義的。還應(yīng)理解的是，本文公開了多個數(shù)值，每一個數(shù)值除其本身數(shù)值外在本文也公開了“約”該特定值。例如，如果公開了數(shù)值“10”,那么還公開了“約10”。還應(yīng)該理解，當(dāng)數(shù)值被公開為“小于或等于該數(shù)值時”，“大于或等于該數(shù)值”以及這些數(shù)值之間的可能范圍也被公開，正如有經(jīng)驗的技術(shù)人員所恰當(dāng)?shù)乩斫獾哪菢印＠?，如果公開了數(shù)值“10”，那么還公開了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。本文所述的所有方法可以任何合適的順序進行，除非本文另有說明或者上下文明顯矛盾。此外，本文描述并且具有大于1個步驟的所有方法可以通過大于1個人或?qū)嶓w進行。因此，一個人或一個實體可以進行方法的步驟(a)，另一人或另一實體可以進行方法的步驟(b)，再一人或再一實體可以進行方法的步驟(c)。任何和所有實例或者此處提供的示例性語言(例如，“如”)的使用都僅僅是為了更好地說明本發(fā)明，除非另外聲明，否則不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。單位、前綴和符號均按照國際單位系統(tǒng)(SI)的接受的形式表示。除非另外說明，否則核酸序列從左向右以5'至3'方向書寫；氨基酸序列從左向右以從氨基至羧基的方向書寫。本文公開的備選要素或?qū)嵤┓绞降姆纸M不應(yīng)解釋為限制。各組成員可被單獨提到或要求保護，或與本文發(fā)現(xiàn)的組的其它成員或其它要素任意組合而被提到或要求保護?？梢灶A(yù)料到，出于方便和/或?qū)＠缘脑?，一組的一個或多個成員可以被包括進一組中或從該組刪除。當(dāng)任何此類包括或刪除發(fā)生時，說明書在本文中被認為含有經(jīng)過改動的組，因此滿足對所附權(quán)利要求書中所用的全部馬庫什組的書面描述。在此使用的標題僅用于組織目的，并不打算用來限制說明書或權(quán)利要求書的范圍，其可以通過整體參考說明書而被包含在內(nèi)。因此，通過參考整個說明書,下面馬上要定義的術(shù)語將得到更加充分的定義。圖解說明是出于描述本發(fā)明優(yōu)選實施方式的目的，而并非意欲將本發(fā)明限制于此。除非另外定義，否則這里使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員通常理解的含義。以下文獻為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本發(fā)明所用的許多術(shù)語的一般定義：Singleton等,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology(2nded.1994)；TheCambridgeDictionaryofScienceandTechnology(Walkered.,1988)；TheGlossaryofGenetics,5thEd.,R.Rieger等(eds.),SpringerVerlag(1991)；和Hale&Marham,TheHarperCollinsDictionaryofBiology(1991)。如本文所用，除非特別指出，以下術(shù)語具有對其所賦予的含義。本文所用術(shù)語“約”是指規(guī)定值的±10％的范圍。例如，短語“約200包括”±200的10％，或從180至220，除非上下文明顯矛盾。本文所用的術(shù)語“擴增”是指通過其生產(chǎn)至少一個靶核酸或其序列互補物的至少部分序列的任何手段，通常以模板依賴性方式，包括但不限于，用于擴增核酸序列的各種技術(shù)，無論是線性的還是指數(shù)性的。擴增方法的非限制性實例包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR、實時PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR(Q-PCR)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、滾環(huán)擴增(RCA)、鏈置換擴增(SDA)、連接酶檢測反應(yīng)(LDR)、多重連接-依賴性探針擴增(MLPA)、連接后Q復(fù)制酶擴增、引物延伸、鏈置換擴增(SDA)、超支化鏈置換擴增、多重置換擴增(MDA)、基于核酸鏈的擴增(NASBA)、兩步多重擴增和數(shù)字擴增等。除了其它來源之外，此類技術(shù)的描述可發(fā)現(xiàn)于：Ausubel等；PCRPrimer:ALaboratoryManual,Diffenbach,Ed.,ColdSpringHarborPress(1995)；TheElectronicProtocolBook,ChangBioscience(2002)；TheNucleicAcidProtocolsHandbook,R.Rapley,ed.,HumanaPress,Totowa,N.J.(2002)；andInnisetal,PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress(1990)。本文所用術(shù)語“擴增條件”或“延伸條件”，在本文可相互替換地使用，是指聚合酶可以向多核苷酸的3'端添加一個或多個核苷酸的條件。此類擴增或延伸條件是本領(lǐng)域公知的，并且例如描述于SambrookandRussell,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEdition,2001,ColdSpringHarborLaboratoryPressandAusubel,etal,CurrentProtocolsinMolecularBiology,1987-2007,JohnWiley&Sons。本文使用的術(shù)語“陣列”或“微陣列”通常是指諸如多核苷酸探針等可雜交陣列元件在基底上的有序排列?！瓣嚵小蓖ǔＪ抢绻押塑账嵝蛄谢蚝塑账嵝蛄?如RNA等)或者由寡核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的空間上或邏輯上有組織的集合。陣列元件可以是寡核苷酸、DNA片段或多核苷酸等。陣列元件可以包括固定在固體支持物上的任何元件，所述支持物能夠與靶序列特異性地結(jié)合，從而可以定性或定量地確定基因表達。高密度寡核苷酸陣列對確定樣品中大量RNA的基因表達譜圖特別有用。陣列元件可以通過合成或生物合成制備。陣列元件可以彼此相同或不同。陣列可以呈現(xiàn)為各種形式，例如，可溶性分子的文庫；連接在樹脂珠、二氧化硅芯片或其它固體支持物的化合物的文庫。根據(jù)陣列上樣品斑點的尺寸，陣列可以是巨陣列或微陣列。巨陣列通常含有約300微米以上的樣品斑點尺寸，并且可以通過凝膠印跡掃描儀而容易地成像。微陣列通常含有小于300微米的斑點尺寸。多孔陣列是包含多個用于容納樣品斑點的腔室的支持物。優(yōu)選的陣列元件是本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物。陣列上的優(yōu)選分子是本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物。在一些實施方式中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物連接至陣列。本文使用的術(shù)語“連接至”或“被連接至”或其語法等效物是指系在(fastenon)、系在一起(fastentogether)、附著至(affixto)、固定至(mountto)、固定在(mounton)、連接至(connectto)或接合(join)?！斑B接”是指連接的動作或被連接的條件。連接可以是直接或間接的。例如部件A可以直接連接至部件B。作為選擇，部件A可以通過首先使部件A連接至部件C然后使部件C連接至部件B而間接連接至部件B。可以使用多于一個中間部件來將部件A連接至部件B。連接可是是永久的、暫時的或持續(xù)一段時間。例如，本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物可以暫時地連接至固體支持物或陣列，持續(xù)本發(fā)明方法或本發(fā)明方法的步驟所需的時間。作為選擇，本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物可以連接至固體支持物或陣列一段延長的時間，例如還在不執(zhí)行本發(fā)明方法或本發(fā)明方法的步驟時。另外，本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物可以永久性地連接至固體支持物或陣列。本文使用的術(shù)語“堿基”是指能夠與互補核苷酸堿基或核苷酸堿基類似物(例如嘌呤、7-脫氮嘌呤或嘧啶)形成沃森-克里克型氫鍵的含氮雜環(huán)部分。典型堿基是天然存在的堿基腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和脲嘧啶。堿基還包括天然存在的堿基的類似物，例如脫氮腺嘌呤、7-脫氮-8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮雜鳥嘌呤、肌苷、水粉蕈素、硝基吡咯、硝基吲哚、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基-嘌呤、次黃嘌呤、5-甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氯-6-氨基嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤等。本文使用的術(shù)語“珠”是指具有“一些圓形外貌或表面的小團塊”，例如球形、圓柱形、橢圓形、卵圓形或圓頂形團塊。本文使用的術(shù)語“生物流體”是指來自宿主的流體，并且包括全血、血清、血漿、尿、眼淚、粘液性腹水、口腔流體、精液、糞便、痰、腦脊液和胎液。生物流體可以包括細胞或缺乏細胞。本文使用的術(shù)語“生物樣品”是指含有核酸或多肽的生物組織或生物流體的樣品。此類樣品通常來自人，但是包括分離自非人靈長類或嚙齒動物(例如小鼠和大鼠)的組織。生物樣品還可以包括諸如外科活組織檢查、細針抽吸活組織檢查的組織切片和尸體解剖樣本、為組織學(xué)目的而獲取的冷凍切片、血液、血漿、血清、痰、糞便、眼淚、粘液、頭發(fā)、皮膚等等。生物樣品還包括外植體和源自患者組織的原代細胞和/或轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)物?！吧飿悠贰边€指來自動物的細胞或細胞群或一定量的組織或流體。最常見的是，生物樣品已經(jīng)從動物移除，但是術(shù)語“生物樣品”還可以指體內(nèi)分析的細胞或組織，即未從動物移除。通常而言，生物樣品”包含來自動物的細胞，但是術(shù)語“生物樣品”還可以指非細胞生物材料，例如血液的非細胞成分、唾液或尿，它們可用于測定多核苷酸或多肽的表達水平。在本發(fā)明中可以使用許多類型的生物樣品，包括但不限于組織的活組織檢查或血液樣品。本文使用的術(shù)語“組織的活組織檢查”是指從動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選靈長類，最優(yōu)選人移除的一定量的組織?！吧飿悠贰焙w獲得其后已經(jīng)以任何方式操作的樣品，例如通過用試劑處理、洗滌、處理以產(chǎn)生核酸樣品(包含適合于進一步操作的核酸的樣品)，或者富含特定細胞群，例如CD4+T淋巴細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞和外周血單個核細胞(PBMC)，等等。術(shù)語“生物樣品”涵蓋臨床樣品，并且還包括培養(yǎng)中的細胞、細胞上清液、組織樣品、器官和骨髓等。本文使用的術(shù)語“提供組織樣品”是指獲得用于本發(fā)明中所述方法的生物樣品。最常見的是，這會通過從受試對象移除細胞樣品而完成，但是還可以通過使用之前分離的細胞(例如通過另一人、在另一時間和/或出于另一目的而分離)，或者通過在體內(nèi)執(zhí)行本發(fā)明的方法而實現(xiàn)。具有治療或結(jié)果史(outcomehistory)的存檔組織會尤其有用。生物樣品還可以源自存有從患者、另一動物或癌細胞系植入的異種移植物腫瘤的動物。本文使用的術(shù)語“互補”是指寡聚物序列彼此雜交并且形成堿基對的能力。堿基對通常通過在反向平行的多核苷酸(寡聚物)鏈中的核苷酸單元之間的氫鍵形成?；パa多核苷酸寡聚物鏈可以以沃森-克里克方式(例如A與T、A與U、C與G)，或者以允許形成雙鏈體的任何其它方式進行堿基配對。探針序列與靶序列的“互補性”百分比是指探針序列與靶序列或者與靶序列的互補物的百分比“同一性”。在確定探針和靶序列之間的“互補性”程度時，“互補性”的程度表達為在探針序列與靶序列的序列或靶序列的序列互補物的之間的百分比同一性，所述靶序列的序列互補物與所述靶序列的序列為最佳比對。示例性的探針是如本文所述的寡核苷酸寡聚物。本文使用的術(shù)語“不同”是指不相同，不具有相同的同一性。本文使用的“雙鏈體”是指通過使互補(或部分互補)的單鏈多核苷酸寡聚物(例如DNA、RNA或PNA)退火(雜交)而形成的雙鏈雜交復(fù)合體。關(guān)于“特異性雜交”，本文使用術(shù)語“雜交(hybridize或hybridization)”，其是使核酸分子(在一些實施方式中，在嚴謹條件下)優(yōu)先與特定核苷酸序列結(jié)合、雙鏈化或退火。術(shù)語“嚴謹條件”是指探針會優(yōu)先與其靶序列雜交，而與其它序列雜交程度較低或根本不雜交的條件。核酸雜交的上下文中的“嚴謹雜交”和“嚴謹雜交洗滌條件”是序列依賴性的，并且在不同環(huán)境參數(shù)下是不同的。核酸雜交的廣泛指南發(fā)現(xiàn)于例如Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbespartI,Ch.2,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,"Elsevier,NY。通常而言，用于過濾器雜交的高嚴謹雜交和洗滌條件選擇成在規(guī)定離子強度和pH下比特定序列的熱熔點(也稱為“熱解鏈溫度”或“Tm”)低約5℃。雜交嚴謹性對緩沖液組合物、溫度和探針長度的依賴性是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見例如Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual(3rded.)Vol.1-3,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborPress,NY)。寡聚物(或多核苷酸寡聚物)與靶序列的雜交程度(也稱為雜交強度)，通過本領(lǐng)域公知的方法確定。優(yōu)選方法是確定給定雜交雙鏈體的Tm。這可以通過使在溶液中所形成的雙鏈體逐漸升溫，并且監(jiān)視雙鏈體的變性(例如借助紫外線的吸光度，其隨著伴隨變性的堿基對的解堆疊(unstack)而增加)而實現(xiàn)。Tm通常定義為一半DNA鏈為單鏈(ssDNA)狀態(tài)下的溫度。Tm取決于各種參數(shù)，例如雜交互補鏈序列的長度、其特異性核苷酸序列、堿基組成和互補鏈的濃度。本文使用的術(shù)語“標記”或“可檢測標記”是指當(dāng)連接至生物分子、核苷、核苷酸或多核苷酸寡聚物時通過合適的檢測手段使此類生物分子、核苷、核苷酸或多核苷酸寡聚物可檢測的部分。示例性標記包括熒光團、發(fā)色團、放射性同位素、自旋標記、酶標記、化學(xué)發(fā)光標記、電致化學(xué)發(fā)光化合物、磁性標簽、微球、膠體金屬、免疫標記、配體和酶等。在一些實施方式中，標記是熒光染料，例如熒光素型或羅丹明型染料。在一些實施方式中，標記選自由下述組成的組：放射性標記、諸如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶等酶、鏈親和素、生物素、由抗體識別的表位和其等效物。當(dāng)例如在擴增反應(yīng)中目的序列與靶序列雜交時關(guān)于在目的核酸中不與相應(yīng)序列中的相應(yīng)核苷酸互補的核苷酸，本文使用“錯配核苷酸”。C的互補物是G，A的互補物是T。換言之，認為目的序列中的“C”與靶序列中的“T”、“C”或“A”錯配。本文使用的術(shù)語“經(jīng)修飾的核苷酸堿基”或“經(jīng)修飾的堿基”是指不具有天然存在的堿基的結(jié)構(gòu)因而是非天然存在的堿基。本文公開的優(yōu)選經(jīng)修飾的堿基例如是經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。本文使用的術(shù)語“經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物”、“經(jīng)修飾的寡核苷酸寡聚物”和“經(jīng)修飾的寡聚物”是指包含至少一個經(jīng)修飾的堿基的本發(fā)明的多核苷酸寡聚物。本文公開的優(yōu)選經(jīng)修飾的堿基例如是經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。術(shù)語“經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物”、“經(jīng)修飾的寡核苷酸寡聚物”和“經(jīng)修飾的寡聚物”，被認為在本文可相互替換地使用，還指多核苷酸寡聚物、寡核苷酸寡聚物或寡聚物的非天然存在的修飾形式的線性聚合物，包括例如，雙鏈或單鏈脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和其α-端基異構(gòu)形式等。本發(fā)明的優(yōu)選經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物是包含經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的多核苷酸寡聚物。經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物可以完全由脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和其類似物組成，或可以包含兩種以上不同單體類型的嵌段或混合物。這些術(shù)語也涵蓋包括DNA和RNA的任何已知堿基類似物(也稱為“寡核苷酸類似物”或“核酸類似物”)的序列。各種參考文獻公開了此類核酸類似物，例如包括：氨基磷酸酯(Beaucage等,Tetrahedron49(10):1925(1993)和其中的參考文獻；Letsinger,J.Org.Chem.35:3800(1970)；Sprinzl等,Eur.J.Biochem.81:579(1977)；Letsinger等,Nucl.AcidsRes.14:3487(1986)；Sawai等,Chem.Lett.805(1984),Letsinger等,J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988)；andPauwels等,ChemicaScripta26:14191986))，硫代膦酸酯(Mag等,核酸sRes.19:1437(1991)；andU.S.PatentNo.5,644,048)，二硫代膦酸酯(phosphorodithioate)(Briu等,J.Am.Chem.Soc.111:2321(1989),O甲基亞磷酰胺(methylphophoroamidite)鍵(參見Eckstein,OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach,OxfordUniversityPress)，以及肽核酸主鏈和鍵(參見Egholm,J.Am.Chem.Soc.114:1895(1992)；Meier等,Chem.Int.Ed.Engl.31:1008(1992)；Nielsen,Nature365:566(1993)；Carlsson等,Nature380:207(1996)，全部都通過援引并入)。其它類似物核酸包括具有下述主鏈的類似物核酸：正電主鏈(positivebackbone)(Denpcy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:6097(1995)；非離子主鏈(美國專利號5,386,023,5,637,684,5,602,240,5,216,141和4,469,863；Kiedrowshi等,Angew.Chem.Intl.Ed.English30:423(1991)；Letsinger等,J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988)；Letsinger等,Nucleoside&Nucleotide13:1597(1994)；第2和3章,ASCSymposiumSeries580,“CarbohydrateModificationsinAntisenseResearch”,Ed.Y.S.SanghuiandP.DanCook；Mesmaeker等,Bioorganic&MedicinalChem.Lett.4:395(1994)；Jeffs等,J.BiomolecularNMR34:17(1994)；TetrahedronLett.37:743(1996))以及非核糖主鏈，包括描述于下述那些：美國專利號5,235,033和5,034,506,第6和7章,ASCSymposiumSeries580,“CarbohydrateModificationsinAntisenseResearch”,Ed.Y.S.SanghuiandP.DanCook.含有一個或多個碳環(huán)糖的核酸也包括在核酸的一個定義內(nèi)(參見Jenkins等,Chem.Soc.Rev.pp169176(1995))。數(shù)種核酸類似物描述于Rawls,C&ENewsJune2,1997，第35頁。所有這些參考文獻在此明確地通過援引并入。在核酸分子的語境下本文使用的術(shù)語“天然存在”是指具有天然存在的核苷酸序列并且即包含天然存在的成分(例如堿基、核苷和核苷酸)的RNA或DNA分子(單鏈或雙鏈)。本文使用的術(shù)語“核苷”是指由經(jīng)由β-糖苷鍵結(jié)合至核糖或脫氧核糖的本文所述類型的含氮堿基組成的分子。核苷的實例包括腺苷、胞苷、胸苷、鳥苷、尿苷和肌苷。通常而言，當(dāng)堿基是A或G時，核糖連接至堿基的N9-位置。當(dāng)堿基是C、T或U時，核糖連接至堿基的N1-位置(KornbergandBaker,DNAReplication,2ndEd.,Freeman,SanFrancisco,Calif.,(1992))。本文使用的術(shù)語“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，作為獨立的單體或者作為多核苷酸內(nèi)的亞單元(subunit)。核苷酸單體例如包括核苷酸5’-單磷酸酯、5’-二磷酸酯、5’-三磷酸酯和3’-單磷酸酯。核苷酸三磷酸酯有時標示為"NTP"、"dNTP"(2'-脫氧戊糖)或"ddNTP"(2',3'-二脫氧戊糖)，以特別指出核糖的結(jié)構(gòu)特征?！昂塑账?’-三磷酸酯”是指在5'位置具有三磷酸酯基團的核苷酸。三磷酸酯基團可以包括對一個或多個磷酸酯氧原子的硫取代，例如α-硫代核苷酸5'-三磷酸酯。核苷酸單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯可以充當(dāng)核酸加工酶的底物，所述核酸加工酶催化核酸或核酸中間體的修飾。本文使用的術(shù)語“核苷酸加工酶”是指對核苷酸、寡核苷酸或核酸進行修飾或加工的酶，并且包括但不限于，引物延伸酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、限制性酶、切口酶、修復(fù)酶和連接酶。本文使用的術(shù)語“多個”是指多于1個。例如，多個經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物是指至少兩個經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物、至少三個經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物或者至少四個經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物等。如果本發(fā)明的實施方式包含多于1個經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物，它們也可以稱為第一經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物、第二經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物、第三經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物，等等。本文使用的術(shù)語“多核苷酸寡聚物”、“寡核苷酸寡聚物”和“寡聚物”在本文被認為可相互替換地使用，是指與本發(fā)明的“經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物”、“經(jīng)修飾的寡核苷酸寡聚物”和“經(jīng)修飾的寡聚物”不同的天然存在的核苷酸單體線性聚合物。通常而言，“多核苷酸寡聚物”的核苷單體通過磷酸二酯鍵連接。但是，也可以設(shè)想含有非磷酸二酯鍵的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物?！敖?jīng)修飾的多核苷酸寡聚物”還涵蓋含有一個或多個非天然存在的單體和/或亞單元間鍵的聚合物，例如肽核酸(PNA)，例如含有經(jīng)由非-酰胺主鏈氮而附接有核堿基的酰胺-連接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸亞單元的主鏈的聚合物。參見Nielsen等,Science254:1497-1500(1991))。多核苷酸寡聚物和經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的通常尺寸從數(shù)個單體單元(例如8-40)至數(shù)千個單體單元。只要多核苷酸寡聚物或經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物由字母序列如“ATGCCTG”表示，除非另外指出，其會被理解為核苷酸從左向右為5'→3'順序，并且“A”表示腺嘌呤，“C”表示胞苷，“G”表示鳥苷，“T”表示胸苷，“U”表示尿苷。對于不具有常規(guī)5’和/或3’端的主鏈(例如PNA)，堿基序列就像5’→3’順序一樣提供，從而使所述序列會以反向平行的方式與具有3’→5’取向的互補序列雜交，就如同在普通雙鏈DNA的反向平行互補鏈的情況一樣。當(dāng)單獨使用時，“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指主要或全部由常規(guī)DNA或RNA單體單元(即由A、C、G、T或U堿基取代的脫氧核糖或核糖環(huán))組成、并且通過常規(guī)磷酸酯主鏈部分連接的多核苷酸寡聚物。本文使用的術(shù)語“引物”是指作為起點來合成與靶核酸鏈互補的多核苷酸鏈有效的寡聚物或經(jīng)修飾的寡聚物。例如，用于PCR的引物包括正向引物和反向引物，其中，正向引物含有與靶核酸鏈的區(qū)域互補的序列并且引導(dǎo)互補鏈的合成。反向引物含有與相反鏈互補的序列，并且沿著靶核酸鏈的相反鏈引導(dǎo)合成。本文使用的術(shù)語“探針”是指經(jīng)標記的寡核苷酸或經(jīng)標記的經(jīng)修飾的寡核苷酸，其含有與靶核酸序列的區(qū)域互補的序列，允許探針與靶序列形成雙鏈體，并且生成表明靶序列的區(qū)域的存在的可檢測信號?？蓹z測信號在雜交期間或之后直接或間接生成。在一些應(yīng)用中，例如在5’-核酸酶PCR的引物延伸期間，探針缺乏可延伸的3’羥基，從而防止探針的聚合酶介導(dǎo)的延伸。“引物”或“探針”通常是包含與靶核酸分子的至少6個相鄰核苷酸的序列互補的區(qū)域的寡聚物或經(jīng)修飾的寡聚物，雖然引物和探針可以包含小于6個相鄰核苷酸。在一些實施方式中，提供經(jīng)修飾的寡聚物，其包含與靶核酸分子的6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、10個以上、11個以上、12個以上、13個以上、14個以上、15個以上、16個以上、17個以上、18個以上、19個以上、20個以上、21個以上、22個以上、23個以上、24個以上、25個以上、約50個以上、或至多約100個相鄰核苷酸相同或互補的序列。當(dāng)引物或探針包含與靶核酸分子的至少X個相鄰核苷酸“互補”的區(qū)域時，引物或探針與靶核酸分子的至少X個相鄰核苷酸至少95％互補。在一些實施方式中，引物或探針與靶核酸分子至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互補。優(yōu)選的“引物”或“探針”是包含經(jīng)修飾的堿基、優(yōu)選經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的“引物”或“探針”。本文使用的術(shù)語“保護基”、“保護性基團”或“保護形式”是指官能團(例如磷酸酯基團(phosphategroup)或膦酸酯基團(phosphonategroup))的不穩(wěn)定化學(xué)修飾，以意圖在隨后的化學(xué)反應(yīng)中保留其官能團性和/或獲得化學(xué)選擇性。通過去保護處理(利用用濃氨水處理)而從最終產(chǎn)物除去保護基。在一些實施方式中，磷酸酯和膦酸酯保護基X1和X2獨立地選自用于在自動化亞磷酰胺寡核苷酸合成中保護亞磷酸化試劑(phosphitylatingreagents)的保護基，和/或與自動化亞磷酰胺寡核苷酸合成的條件相容。在特定實施方式中，X1和X2基團獨立地可選地取代苯基，可選地取代烷基(例如氰乙基)，并且可選地取代雜烷基。示例性氨基保護基包括但不限于甲?；⒁阴；?、三氟乙酰基、芐基、芐基-氧羰基(CBZ)、叔丁氧羰基(Boc)、三甲基甲硅烷基(TMS)、2-三甲基甲硅烷基-乙烷磺酰基(SES)、三苯甲基和經(jīng)取代的三苯甲基、烯丙基氧羰基、9-芴基-甲基氧羰基(FMOC)和硝基-藜蘆基氧羰基(NVOC)。示例性的羥基保護基包括其中羥基被乙?；蛲榛哪切缙S基醚和三苯甲基醚以及烷基醚、四氫吡喃基醚、三烷基甲硅烷基醚和烯丙基醚。還參見第1章：ProtectingGroupsinOligonucleotideSynthesisbyEtienneSonveauxinMethodsinMolecularBiology,第26卷,ProtocolsforOligonucleotideConjugates,S.Agrawal(Ed.),HumanaPressInc.,Totowa,NJ(1994)；Greene'sProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,P.WutzandT.Greene(Eds.),Wiley-Interscience,第4版，(2006)；Thomson,S.A.,等,“FmocMediatedSynthesisofPeptideNucleicAcids”,Tetrahedron51:6179-6194(1995)；和“Solid-PhaseSynthesisofPeptideNucleicAcids”,J.PeptideScience3:175-183(1995)；對于此類公開內(nèi)容在此通過援引將其并入。本文使用的術(shù)語“鹽”是指化合物的鹽，例如本文所述的經(jīng)修飾的部分，其用相對無毒的酸或堿制備，這取決于在本文所述的化合物上發(fā)現(xiàn)的具體取代基。當(dāng)本發(fā)明的化合物含有相對酸性的官能性時，堿加成鹽可以通過使此類化合物的中性形式與足夠量的所期望堿(無溶劑(neat)或在合適的惰性溶劑中)接觸而獲得。藥學(xué)上可接受的堿加成鹽的實例包括鈉、鉀、鈣、氨、有機氨或鎂鹽，或者相似的鹽。當(dāng)本發(fā)明的化合物含有相對堿性的官能性時，酸加成鹽可以通過使此類化合物的中性形式與足夠量的所期望酸(無溶劑或在合適的惰性溶劑中)接觸而獲得。藥學(xué)上可接受的酸加成鹽的實例包括衍生自無機酸(鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、一氫碳酸、磷酸、一氫磷酸、二氫磷酸、硫酸、一氫硫酸、氫碘酸或亞磷酸等)的鹽，以及衍生自相對無毒的有機酸(如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富馬酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對-甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸和甲磺酸等)的鹽。還包括的是氨基酸的鹽(例如精氨酸鹽等)和有機酸(如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等)的鹽(參見例如Berge等,1977,“PharmaceuticalSalts”,JournalofPharmaceuticalScience,66:1-19)。本發(fā)明的一些特定化合物同時包含堿性和酸性官能性，其允許化合物轉(zhuǎn)化成堿或酸加成鹽?；衔锏闹行孕问娇梢酝ㄟ^使所述鹽與堿或酸接觸并以常規(guī)方式分離母體化合物而再生?；衔锏哪阁w形式與各種鹽形式的不同之處在于一些物理性質(zhì)，例如在極性溶劑中的溶解度，但是在其它方面，對本發(fā)明的目的而言所述鹽與所述化合物的母體形式是等效的。本文使用的術(shù)語“固體支持物”是指任何不溶性材料，包括顆粒(例如珠)、纖維、塊材(monoliths)、膜、過濾器、塑料帶和陣列等。本文使用的術(shù)語“基本上互補”是指在所討論序列中不超過20％(例如，不超過15％、10％或5％)的核苷酸與靶序列錯配的序列。在一些實施方式中，雜交復(fù)合體的互補鏈具有1、2、3、4、5個以上核苷酸錯配。本文使用的術(shù)語“靶核酸”或“靶核酸分子”是指在一些實施方式中作為用于雜交、擴增等(即，出于檢測目的)的靶標的核酸或多核苷酸寡聚物。在一些實施方式中，靶核酸包含與本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物部分或完全互補的RNA或DNA。本文使用的術(shù)語“靶核酸”、“靶核酸分子”或“靶核苷酸序列”是指靶核酸內(nèi)的序列。靶序列通常可以使用DNA的4種堿基(A、T、G和C)或者RNA的4種堿基(A、U、G和C)描述。II.組合物公開內(nèi)容提供包含一個或多個經(jīng)修飾的堿基的多核苷酸寡聚物(“經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物”)，其展現(xiàn)提高的雜交性質(zhì)，用于雜交反應(yīng)并且作為聚合酶的底物。公開內(nèi)容還涉及此類經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物作為探針和/或引物并且例如在核苷酸陣列中的用途。還提供包含此類經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的組合物、方法和試劑盒(即，套件)。經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物與缺乏此類經(jīng)修飾的堿基的寡聚物相比，提供在經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物和互補多核苷酸序列之間的堿基配對方面的優(yōu)異穩(wěn)定性。在一些實施方式中，本文描述的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包括DNA、RNA、PNA和DNA/PNA嵌合寡聚物。本發(fā)明的經(jīng)修飾的堿基和經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物提供對互補序列的較大雙鏈體穩(wěn)定性，并且當(dāng)在雜交復(fù)合體中存在一個或多個堿基錯配時提高錯配識別。還提供的是含有本發(fā)明的經(jīng)修飾的堿基的核苷和核苷酸。此類核苷可以用作用于合成相應(yīng)的單磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯的前體或者作為酶底物。本發(fā)明的核苷酸可以通過聚合酶介導(dǎo)的引物延伸而引入多核苷酸寡聚物。以下詳細地討論公開內(nèi)容的各種實施方式。雖然討論的具體的實施，應(yīng)該理解的是這樣做僅出于說明目的?？梢允褂闷渌煞趾蜆?gòu)造而無需背離公開內(nèi)容的精神和范圍。A.經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基公開內(nèi)容提供包含一個或多個經(jīng)修飾的堿基的多核苷酸寡聚物，其展現(xiàn)提高的雜交性質(zhì)，用于雜交反應(yīng)并且作為聚合酶的底物。本發(fā)明的經(jīng)修飾的堿基是非天然存在的。本文公開的經(jīng)修飾的堿基包含通過連接體(linker)部分連接至嘧啶環(huán)結(jié)構(gòu)的5-位置的磷酸酯或膦酸酯基團。本發(fā)明的經(jīng)修飾的堿基可以認為是常規(guī)堿基胞嘧啶的類似物。胞嘧啶的5-氫原子被連接體-磷酸酯或連接體-膦酸酯部分替換，如下進一步所示。在本公開內(nèi)容中，經(jīng)修飾的堿基有時表示為經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基(例如CBP或CPP)。本發(fā)明的經(jīng)修飾的堿基可以通常通過下式表示：其中，Z是CH2或O；Y1和Y2獨立地是H或保護基；X1和X2獨立地是H或保護基，或者一起是保護基，并且波形線表示經(jīng)修飾的堿基與寡聚物主鏈連接的點，或者與單體主鏈部分(例如脫氧核糖核苷的核糖環(huán)、脫氧核糖核苷酸的核糖環(huán)或者PNA氨基酸單體的主鏈)連接的點。當(dāng)X1和X2都是保護基時，X1和X2分別可以相同或不同，并且X1和X2合起來看可以是二齒保護基，例如α,α-二甲基-o-亞苯甲基：在本發(fā)明的特定實施方式中，根據(jù)式I的本發(fā)明的經(jīng)修飾的堿基是經(jīng)修飾的堿基，其中，Z是O，并且X1和X2合起來看是α,α-二甲基-o-亞苯甲基：磷酸酯和膦酸酯保護基及其引入方法的進一步說明可發(fā)現(xiàn)于Greene'sProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,P.WutzandT.Greene(Eds.),Wiley-Interscience,第4版,2006，對于該公開內(nèi)容在此通過援引將其并入。通常而言，當(dāng)期望在寡聚物合成期間保護磷酸酯或膦酸酯部分免受損壞或修飾時，如在通過亞磷酰胺法合成多核苷酸寡聚物或者通過肽合成合成PNA寡聚物的情況下，X1和X2是保護基。在含有本發(fā)明的經(jīng)修飾的堿基的多核苷酸寡聚物中，保護基通常在寡聚物用于與互補多核苷酸寡聚物雜交之前除去，以提供增加的堿基配對親合性和水溶性。優(yōu)選的是，只要X1和/或X2以及/或者Y1和/或Y2是保護基時，可以通過氨處理除去保護基。在Z是O的一些實施方式中，經(jīng)修飾的堿基包含磷酸酯(phosphate)部分。在Z是CH2的一些實施方式中，經(jīng)修飾的堿基包含膦酸酯(phosphonate)部分。如下文進一步所述，本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物、亞磷酰胺、經(jīng)修飾的PNA單體、經(jīng)修飾的核苷和經(jīng)修飾的核苷酸包含一個或多個上述經(jīng)修飾的堿基(式I)。B.經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物公開內(nèi)容提供包含一個或多個經(jīng)修飾的堿基的多核苷酸寡聚物，其展現(xiàn)提高的雜交性質(zhì)，用于雜交反應(yīng)并且作為聚合酶的底物。本文將其稱為“經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物”并且是非天然存在的。公開內(nèi)容還涉及此類經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物作為探針和/或引物并且例如在核苷酸陣列中的用途。在一些實施方式中，本文所述的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含根據(jù)以上式(參見式I)的1、2、3、4、5、6個以上經(jīng)修飾的堿基。經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物內(nèi)的經(jīng)修飾的堿基的數(shù)量取決于寡聚物序列中C堿基的數(shù)量和期望的結(jié)合親合性的增加量，如本文所述其可以通過對不同寡聚物構(gòu)建體進行解鏈研究或其它試驗而確定，以確定對于特定應(yīng)用的需要而言什么是最優(yōu)的。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物由下式表示：其中，各Y5獨立地是H、C1-C8烷基，或可選地與Y3組合以形成5～7元環(huán)；其中，各Y4獨立地是O、S或NH；其中，各Y3獨立地是H、F或ORa；其中，各Ra獨立地是H、C1-C8烷基或羥基保護基；其中，各Z獨立地是P(O)OH、P(S)OH或P(O)CH3；其中，n是1-98；其中，Q1和Q2各自獨立地是H、一磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、熒光報道染料或猝滅劑；其中，各B獨立地是腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、二氨基嘌呤，條件是至少一個B是由下式表示的經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基：其中，Z是CH2或O；其中，X1和X2相同或不同，并且分別是H或保護基，或者X1和X2一起是二齒保護基，例如α,α-二甲基-o-亞甲苯基：和其中，Y1和Y2獨立地是H或氮保護基，或者Y1和Y2一起是氮保護基；在一些實施方式中，Y1和Y2是H，X1和X2是H。在一些實施方式中，Z是O。在一些實施方式中，Z是CH2。優(yōu)選的是，只要X1和/或X2以及/或者Y3和/或Y4是保護基時，可以通過氨處理除去保護基。在特定實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物由下式表示：其中，各Y1是H；其中，各Y2是O；其中，各Y3是H；其中，各Ra是H；其中，各Z是P(O)OH；其中，n是1-98；其中，Q1和Q2各自獨立地是H、一磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、熒光報道染料或猝滅劑，優(yōu)選熒光猝滅劑；其中，各B獨立地是腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、二氨基嘌呤，條件是至少一個B是由下式表示的經(jīng)修飾的堿基：其中，Z是O，并且其中X1和X2合起來看是α,α-二甲基-o-亞苯甲基本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物通常包含具有小于100個核苷酸的單鏈多核苷酸或者由其組成，盡管還設(shè)想數(shù)百或數(shù)千以上各堿基的更長序列。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含小于30個核苷酸，優(yōu)選的是，寡核苷酸寡聚物包含約9至約25個核苷酸，即9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含2～約100、2～約50、2～約25、2～約15、5～約50、5～約25、5～約15、約10～約50、約10～約25、約10～約20、約10～約15、約12～約50、約12～約25或約12～約20個核苷酸，或者由其組成。寡聚物可以由其長度稱呼。例如，將15個核苷酸的寡聚物稱為“15聚物”。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物、探針、引物或PNA內(nèi)經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基可以引入的位置不受限制。本文公開的是其中，在各種位置引入經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的多核苷酸寡聚物、探針、引物和PNA。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的1位(例如，參見Pf1-C-1、Pf1-C-4、Pf1-C-6、Pf1-C-8；表4)。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的2位。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的3位(例如，參見Pf1-C-2；表4)。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的4位(例如，參見Pf1-C-3、Pf1-C-4、Pf1-C-5、Pf1-C-6；表4)。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的5位。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的6位(例如，參見C-PNA；表4)。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的7位(例如，參見C1、C3；表4)。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的8位。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的9位(例如，參見Pf1-C-5、Pf1-C-6；表4)。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的10位(例如，參見C2、C3、Pf1-C-7、Pf1-C-8；表4)。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的11位。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的12位。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的13位。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的14位。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的15位(例如，參見Pf1-C-7、Pf1-C-8；表4)。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的16位(例如，參見R1、P1R；表4)。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的17位。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的18位。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的19位(例如，參見F1、P1F；表4)。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基位于多核苷酸當(dāng)以5’→3’方向書寫時的20位(例如，參見Pf1-C-7、Pf1-C-8；表4)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，多核苷酸寡聚物、探針或引物內(nèi)經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的數(shù)量不受限制。本文公開的是包含各種數(shù)量的經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的多核苷酸寡聚物、探針、引物和PNA。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物、探針、引物或PNA包含1個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基(例如，參見C1、C2、F1、R1、Pf1-C-1、Pf1-C-2、Pf1-C-3、P1F、P1R、C-PNA；表4)。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探針或PNA包含2個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基(例如，參見C3、Pf1-C-4、Pf1-C-5；表4)。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探針或PNA包含3個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基(例如，參見Pf1-C-6、Pf1-C-7；表4)。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探針或PNA包含4個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探針或PNA包含5個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基(例如，參見Pf1-C-8；表4)。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物、探針、引物或PNA包含至少1個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探針或PNA包含至少2個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探針或PNA包含至少3個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探針或PNA包含至少4個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探針或PNA包含至少5個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探針或PNA包含至少6個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探針或PNA包含至少7個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探針或PNA包含至少10個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。在一些實施方式中，多核苷酸寡聚物、引物、探針或PNA包含至少20個經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。在一些實施方式中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物連接至固體支持物。在一些實施方式中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物連接至珠。在一些實施方式中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物連接至陣列。在一些實施方式中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物連接至微陣列。1.包含另外的修飾的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物在一些實施方式中，包含本發(fā)明的一個或多個經(jīng)修飾的堿基的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物會進一步包含其它類型的修飾，例如包含經(jīng)修飾的堿基或堿基類似物和/或可檢測標記、熒光和/或化學(xué)發(fā)光猝滅劑和/或小溝結(jié)合劑和/或一個或多個堿基修飾、糖修飾和/或主鏈修飾。雖然在以下段落，為清楚起見單獨地描述經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的另外的修飾，本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到，各個單獨描述的修飾可以與另一個相互組合。例如，經(jīng)進一步修飾的多核苷酸寡聚物包含糖修飾和主鏈修飾。在另一非限制性實例中，經(jīng)進一步修飾的多核苷酸寡聚物包含糖修飾和標記。在另一實例中，經(jīng)進一步修飾的多核苷酸寡聚物包含主鏈修飾和標記。在又一非限制性實例中，經(jīng)進一步修飾的多核苷酸寡聚物包含標記和堿基修飾。(a)包含糖修飾的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物一些實施方式中，本文所述的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含一個或多個經(jīng)修飾的糖部分?？梢允褂酶鞣N糖部分來修飾本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，糖修飾在本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物內(nèi)的位置可以改變，并且不受本文公開內(nèi)容限制。在一些實施方式中，用于修飾本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的糖部分包括但不限于，阿拉伯糖、d-阿拉伯-己糖醇、2-氟阿拉伯糖、木糖、己糖。在一些實施方式中，用于修飾本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的糖部分選自由阿拉伯糖、d-阿拉伯-己糖醇、2-氟阿拉伯糖、木糖和己糖組成的組。在一些實施方式中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包括一個或多個連接有經(jīng)修飾的糖部分的核苷酸。可以使用各種糖部分來連接至?xí)灰氡景l(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物中的核苷酸。在一些實施方式中，連接至核苷酸的糖部分包括2'-取代的糖，例如2'-O-烷基-核糖、2'-氨基-脫氧核糖、2'-氟-脫氧核糖、2'-氟-阿拉伯糖或2'-O-甲氧基乙基-核糖(2'MOE)。在一些實施方式中，連接至核苷酸的糖部分選自由2'-取代的糖例如2'-O-烷基-核糖、2'-氨基-脫氧核糖、2'-氟-脫氧核糖、2'-氟-阿拉伯糖和2'-O-甲氧基乙基-核糖(2'MOE)組成的組。在本發(fā)明的特定實施方式中，連接至核苷酸的糖部分是2'-O-甲氧基乙基-核糖(2'MOE)。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含鎖核酸(“LNA”)糖。LNA糖是雙環(huán)糖，即含有在C-4'和C-2'處的氧原子之間的亞甲基橋。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含一個或多個具有LNA糖的核苷酸。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物含有一個或多個由具有LNA糖部分的核苷酸組成的區(qū)域。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的寡核苷酸寡聚物含有具有LNA糖部分的核苷酸，所述LNA糖部分散布有脫氧核糖核苷酸。參見例如Frieden,M.等(2008)Curr.Pharm.Des.14(11):1138-1142。(b)包含主鏈修飾的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含主鏈修飾。可以將各種主鏈修飾引入經(jīng)修飾的寡核苷酸中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，主鏈修飾在本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物內(nèi)的位置可以改變，并且不受本文公開內(nèi)容限制。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含一個或多個磷酸二酯鍵。在一些實施方式中，核苷酸類似物包含主鏈修飾，例如利用肽核酸(PNA)。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含經(jīng)修飾的鍵，例如磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、羧甲基酯、乙酰胺酯、氨基甲酸酯、硫醚、橋接氨基磷酸酯、橋接亞甲基膦酸酯、硫代膦酸酯、甲基膦酸酯、烷基膦酸酯、磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、二硫代膦酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、羧甲基酯、甲基硫代膦酸酯、二硫代磷酸酯、對乙氧基鍵和它們的組合。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含經(jīng)修飾的鍵，所述經(jīng)修飾的鍵選自由磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、羧甲基酯、乙酰胺酯、氨基甲酸酯、硫醚、橋接氨基磷酸酯、橋接亞甲基膦酸酯、硫代膦酸酯、甲基膦酸酯、烷基膦酸酯、磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、二硫代膦酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、羧甲基酯、甲基硫代膦酸酯、二硫代磷酸酯、對乙氧基鍵和它們的組合組成的組。例如，可以將PNA容易地合成為含有常規(guī)DNA堿基(A、C、T和G)或非常規(guī)堿基，但是PNA單體單元通過聚酰胺主鏈而不是糖-磷酸酯主鏈連接。(c)包含堿基修飾的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含一個或多個非標準堿基(即，除了腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和脲嘧啶之外)?？梢詫⒏鞣N非標準堿基引入經(jīng)修飾的寡核苷酸中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，堿基修飾在本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物內(nèi)的位置可以改變，并且不受本文公開內(nèi)容限制。此類非標準堿基可以服務(wù)許多目的，例如使雜交穩(wěn)定或不穩(wěn)定；促進或抑制探針降解；或作為用于可檢測部分或猝滅劑部分的連接點。經(jīng)修飾的堿基(除了本發(fā)明的經(jīng)修飾的堿基之外)和堿基類似物的許多實例如上所述，是本領(lǐng)域公知的，并且可用于進一步修飾經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的寡聚物包含作為經(jīng)胺修飾的核苷酸(即，已經(jīng)經(jīng)過修飾以含有反應(yīng)性胺基團的核苷酸)的經(jīng)修飾的堿基。本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物可以包含正常堿基或經(jīng)修飾的堿基的任意組合，例如未經(jīng)取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶堿基(例如PPG和PPA)、3-取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶、經(jīng)修飾的嘌呤、經(jīng)修飾的嘧啶、5-取代嘧啶或通用堿基。(d)包含標記的經(jīng)修飾的寡核苷酸寡聚物在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含標記，優(yōu)選可檢測標記。例如，如本文所述，包含可檢測標記的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物用作探針或用作引物。可以將各種標記引入經(jīng)修飾的寡核苷酸中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，標記在本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物內(nèi)的位置可以改變，并且不受本文公開內(nèi)容限制。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含在其序列的一端上的熒光團和/或在其序列另一端上的熒光猝滅劑，從而熒光猝滅劑經(jīng)由能量轉(zhuǎn)移機制(如熒光共振能量轉(zhuǎn)移("FRET"))抑制完整探針(即用作探針的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物)中的熒光團的熒光信號。當(dāng)聚合酶沿著也與探針雜交的模板將引物延伸時，聚合酶的5'-核酸酶活性切割探針(即，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物)，由此允許熒光團從熒光猝滅劑擴散開，從而檢測到熒光信號。該信號隨著各PCR循環(huán)成比例地增加至切割的探針的量，因此成比例地增加至擴增產(chǎn)物(擴增子，靶序列)的量。這允許靶DNA序列的直接檢測和定量。在一些實施方式中，熒光團連接至距離經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的序列的一端至少一個核苷酸位置的堿基，和/或熒光猝滅劑連接至距離經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物另一端至少一個核苷酸位置的堿基。在一些實施方式中，熒光團和/或熒光猝滅劑內(nèi)部地位于經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，熒光團和/或熒光猝滅劑在本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物內(nèi)的位置可以改變，并且不受限制。在一些實施方式中，熒光團和熒光猝滅劑不位于FRET探針的端部。在一些實施方式中，熒光團的發(fā)射光譜與熒光猝滅劑的吸收光譜顯著重疊。但是，當(dāng)猝滅涉及碰撞機制時此類光譜重疊較不重要或不需要，或者所述重疊因例如反應(yīng)條件或探針結(jié)構(gòu)而增加。在一些實施方式中，在FRET探針上(即在用作FRET探針的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物上)使用的標記包括比色和染料或熒光團如AlexaFluor染料，BODIPY染料如BODIPYFL；Cascade藍；Cascade黃；香豆素和其衍生物，例如7-氨基-4-甲基香豆素、氨基香豆素和羥基香豆素；花青染料，例如Cy3和Cy5；曙紅和赤蘚紅；熒光素和其衍生物，例如熒光素異硫氰酸酯；鑭系離子的大環(huán)螯合物，例如量子染料(TM)；Marina藍；奧勒岡綠(OregonGreen)；羅丹明染料，例如羅丹明紅，四甲基羅丹明和羅丹明6G；德克薩斯紅；熒光能量轉(zhuǎn)移染料，例如噻唑橙-溴化乙錠異二聚體；和TOTAB?？捎糜谛揎棻景l(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的有用染料的具體實例包括但不限于以上和以下鑒定的那些：AlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor500.AlexaFluor514、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor610、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700和AlexaFluor750；胺反應(yīng)性BODIPY染料，例如BODIPY493/503、BODIPY530/550、BODIPY558/568、BODIPY564/570、BODIPY576/589、BODIPY581/591、BODIPY630/650、BODIPY650/655、BODIPYFL、BODIPYR6G、BODIPYTMR和BODIPY-TR；Cy3、Cy5、6-FAM、熒光素異硫氰酸酯、HEX、6-JOE、奧勒岡綠488、奧勒岡綠500、奧勒岡綠514、太平洋藍(PacificBlue)、REG、羅丹明綠、羅丹明紅、Renographin、ROX、SYPRO、TAMRA、2‘,4’,5’,7‘四溴砜-熒光素、TET和得克薩斯紅?？捎糜谛揎棻景l(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的熒光團/熒光猝滅劑對(即供體/受體對)的實例包括但不限于熒光素/四甲基羅丹明；IAEDANS/熒光素；EDANS/dabcyl；熒光素/熒光素；BODIPYFL/BODIPYFL；熒光素/QSY7或熒光素/QSY9。當(dāng)供體和受體相同時，在一些實施方式中，可以通過熒光去極化而檢測FRET。熒光團/熒光猝滅劑對(即供體/受體對)的一些特定實例包括但不限于AlexaFluor350/AlexaFluor488；AlexaFluor488/AlexaFluor546；AlexaFluor488/AlexaFluor555；AlexaFluor488/AlexaFluor568；AlexaFluor488/AlexaFluor594；AlexaFluor488/AlexaFluor647；AlexaFluor546/AlexaFluor568；AlexaFluor546/AlexaFluor594；AlexaFluor546/AlexaFluor647；AlexaFluor555/AlexaFluor594；AlexaFluor555/AlexaFluor647；AlexaFluor568/AlexaFluor647；AlexaFluor594/AlexaFluor647；AlexaFluor350/QSY35；AlexaFluor350/dabcyl；AlexaFluor488/QSY35；AlexaFluor488/dabcyl；AlexaFluor488/QSY7或QSY9；AlexaFluor555/QSY7或QSY9；AlexaFluor568/QSY7或QSY9；AlexaFluor568/QSY21；AlexaFluor594/QSY21；和AlexaFluor647/QSY21。在一些實施方式中，對于多個熒光團可以使用相同的猝滅劑，例如，寬光譜猝滅劑，例如IowaBlack(R)猝滅劑(IntegratedDNATechnologies,Coralville,IA)或BlackHole猝滅劑(TM)或(BHQ(TM)；BiosearchTechnologies,Petaluma,CA)因此在本發(fā)明的一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含選自由下述組成的組中的熒光團/熒光猝滅劑對：熒光素/四甲基羅丹明；IAEDANS/熒光素；EDANS/dabcyl；熒光素/熒光素；BODIPYFL/BODIPYFL；熒光素/QSY7熒光素/QSY9,AlexaFluor350/AlexaFluor488；AlexaFluor488/AlexaFluor546；AlexaFluor488/AlexaFluor555；AlexaFluor488/AlexaFluor568；AlexaFluor488/AlexaFluor594；AlexaFluor488/AlexaFluor647；AlexaFluor546/AlexaFluor568；AlexaFluor546/AlexaFluor594；AlexaFluor546/AlexaFluor647；AlexaFluor555/AlexaFluor594；AlexaFluor555/AlexaFluor647；AlexaFluor568/AlexaFluor647；AlexaFluor594/AlexaFluor647；AlexaFluor350/QSY35；AlexaFluor350/dabcyl；AlexaFluor488/QSY35；AlexaFluor488/dabcyl；AlexaFluor488/QSY7或QSY9；AlexaFluor555/QSY7或QSY9；AlexaFluor568/QSY7或QSY9；AlexaFluor568/QSY21；AlexaFluor594/QSY21；和AlexaFluor647/QSY21。在一些實施方式中，例如在同時檢測兩個以上部分的多重反應(yīng)中，各經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物探針可以包含可檢測上不同的熒光團，從而當(dāng)在同一反應(yīng)中同時檢測時可以區(qū)分所述熒光團。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從以上公開的選擇熒光團/熒光猝滅劑和本領(lǐng)域已知的其它熒光團/熒光猝滅劑選擇一組可檢測上不同的熒光團，以用于多重反應(yīng)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，熒光團和/或熒光猝滅劑的選擇以及熒光團和/或熒光猝滅劑在本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物內(nèi)的位置可以改變，并且不受本文公開內(nèi)容限制。(e)包含其它修飾的經(jīng)修飾的寡核苷酸寡聚物在一些實施方式中，本文所述的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物還包含一個或多個懸垂基團(pendantgroup)。各種懸垂基團可用于修飾本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，懸垂基團的選擇和懸垂基團在本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物內(nèi)的位置可以改變，并且不受本文公開內(nèi)容限制。懸垂基團可以是連接至一個或多個內(nèi)部堿基、連接至3'-末端，連接至5'-末端，連接至兩端，或者內(nèi)部地位于經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的一個末端或兩個末端的部分，例如親脂性基團、小溝結(jié)合劑、嵌入劑、螯合劑或交聯(lián)劑。因此，在一些實施方式中連接至經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的懸垂基團是選自由親脂性基團、小溝結(jié)合劑、嵌入劑、螯合劑和交聯(lián)劑組成的組的部分。適于連接此類懸垂基團的方法通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在一些實施方式中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含低分子量的“尾部分”。各種“尾部分”可用于進一步修飾本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，“尾部分”的選擇和“尾部分”在本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物內(nèi)的位置可以改變，并且不受本文公開內(nèi)容限制。在一些實施方式中，尾部分連接至經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的3'端或5'端，或者在兩端。尾部分子可以是磷酸根(phosphate)、磷酸酯(phosphateester)、烷基、氨基烷基或親脂性基團。因此，在一些實施方式中，連接至經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的尾部分選自由磷酸根、磷酸酯、烷基、氨基烷基和親脂性基團組成的組。在一些實施方式中，尾部分將嵌入劑、親脂性基團、小溝結(jié)合劑(MGB)、報告基團、螯合劑或交聯(lián)官能性連接至經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物。例如，MGB可以連接至經(jīng)修飾的寡核苷酸寡聚物的任一端或兩端。除此之外或者作為選擇，可以將一個或多個MGB連接在經(jīng)修飾的寡核苷酸寡聚物中的內(nèi)部位置。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，此類選擇可以取決于經(jīng)修飾的寡核苷酸寡聚物的長度。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含非天然比例的原子同位素。在一些實施方式中，對經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物進行放射性標記。合適的放射性標記包括但不限于氚(3H)、碘125(125I)、磷(32P)或碳14(14C)。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物以鹽形式提供。經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物可以以各種鹽形式提供。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的鹽形式可以改變，并且不受本文公開內(nèi)容限制。本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的鹽形式包括但不限于堿加成鹽，例如鈉、鉀、鈣、氨、有機氨或鎂鹽，或者相似的鹽。在一些實施方式中，本文所述的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含堿性和/或酸性官能性。任何可離子化基團的電荷狀態(tài)會取決于環(huán)境pH。例如，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物內(nèi)的磷酸酯基團的非橋接氧原子在酸性pH條件下比在堿性pH條件下會傾向于更多質(zhì)子化。因此，雖然以特定的質(zhì)子化狀態(tài)示出結(jié)構(gòu)(例如完全質(zhì)子化的磷酸酯二酸部分)，在經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物內(nèi)的可離子化基團的真實質(zhì)子化狀態(tài)會取決于諸如溶劑的pH、水含量和鹽濃度等因素。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物擁有不對稱碳原子或雙鍵，例如作為外消旋體、非對映異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體和單獨異構(gòu)體提供，并且它們都旨在包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，雖然常規(guī)DNA和RNA包含核苷酸亞單元的D-立體異構(gòu)體，但是本公開內(nèi)容也涵蓋DNA和RNA的L-立體異構(gòu)體。C.經(jīng)修飾的核苷亞磷酰胺本發(fā)明還提供由下式表示的經(jīng)修飾的核苷亞磷酰胺：其中，Z是CH2或O；其中，X1和X2分別是相同或不同的保護基，或者其中，X1和X2合起來看是二齒保護基；其中，Y1和Y2獨立地是H或氮保護基，或者Y1和Y2一起是氮保護基；和其中，Q是羥基保護基。在一些實施方式中，Z是O。在一些實施方式中，Z是CH2。在本發(fā)明的特定實施方式中，Z是O。在一些實施方式中，Q是三苯甲基、甲氧基三苯甲基(MMT)或二甲氧基三苯甲基(DMT)。優(yōu)選的是，在酸性條件下Q能夠除去。優(yōu)選的是，只要X1和/或X2以及/或者Y1和/或Y2是保護基時，可以通過氨處理除去保護基。在一些實施方式中，X1和X2合起來看是二齒保護基，例如o-亞苯甲基(o-benzylene)、α-甲基-o-亞苯甲基或α,α-二甲基-o-亞苯甲基。在一些實施方式中，Y1和Y2一起是氮保護基。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的核苷亞磷酰胺可以包含任何前述示例性特征的組合。在經(jīng)修飾的核苷亞磷酰胺的一些實施方式中，當(dāng)保護基X1和X2分別來看時，各自可以具有由下式表示的結(jié)構(gòu)：其中，R1和R2獨立地是氫、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6環(huán)烷基或苯基；n和m獨立地是0、1、2、3或4；X是O或NR4；Y是O或S；Z是鍵、O或NR4；各個R3相同或不同并且獨立地是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C6環(huán)烷基、氰基、硝基、鹵素、C1-C6烷氧基、C3-C6環(huán)烷氧基、NR5aR5b或苯基；R4、R5a和R5b各自獨立地是C3-C6環(huán)烷基或苯基。(參見例如WO2000/055179A1)。在經(jīng)修飾的核苷亞磷酰胺的一些實施方式中，X1和X2獨立地具有以下結(jié)構(gòu)：其中，L是鍵、C1-C8亞烷基、C2-C8雜亞烷基、C2-C8亞烯基；并且W是H、氰基、C(O)NRaRb、NO2、N+RaRbRc、C6H4NO2、C6H4Cl、C6H3(NO2)2、C6H2(NO2)3、SO2Rc或S(O)2ORc；Ra和Rb獨立地是H、CF3、C1-C8烷基或C6-C10芳基；和Rc是C1-C8烷基或C6-C10芳基。此類基團是有利的，因為它們能夠通過常規(guī)氨或氫氧化銨處理而除去。在本發(fā)明的特定實施方式中，根據(jù)上式的經(jīng)修飾的核苷亞磷酰胺是經(jīng)修飾的核苷亞磷酰胺，其中，X1和X2獨立地具有以下結(jié)構(gòu)：其中，L是鍵，并且W是H。在一些實施方式中，X1和X2各自分別是新戊?；跗S基基團。本發(fā)明的經(jīng)修飾的核苷氨基磷酸酯(nucleosidephosphoramidate)是非天然存在的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，所述經(jīng)修飾的核苷亞磷酰胺(nucleosidephosphoramidite)用于合成本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物。D.經(jīng)修飾的PNA單體本發(fā)明還提供由下式表示的經(jīng)保護的經(jīng)修飾的PNA單體：其中，Z是CH2或O；其中，X1和X2分是相同或不同的保護基，或者其中，X1和X2合起來看是二齒保護基；其中，Y1和Y2獨立地是H或氮保護基，或者Y1和Y2一起是氮保護基；其中，Q1和Q2獨立地是H或氮保護基，或者其中Q1和Q2一起是氮保護基；和其中，Q3是H或羧基保護基。在經(jīng)修飾的PNA單體的一些實施方式中，Z是O。在一些實施方式中，Z是CH2。在本發(fā)明的特定實施方式中，根據(jù)上式的經(jīng)保護的經(jīng)修飾的PNA單體是經(jīng)保護的經(jīng)修飾的PNA單體，其中，Z是O。在一些實施方式中，Q1是H，Q2是Fmoc，并且Q3是H。優(yōu)選的是，只要X1和/或X2以及/或者Y1和/或Y2是保護基時，可以通過氨處理除去保護基。本發(fā)明的經(jīng)修飾的PNA單體是非天然存在的。E.經(jīng)修飾的核苷和經(jīng)修飾的核苷酸本發(fā)明還提供由下式表示的經(jīng)修飾的核苷：在本發(fā)明的特定實施方式中，經(jīng)修飾的核苷由下式表示：本發(fā)明的經(jīng)修飾的核苷是非天然存在的。它們例如作為任何反應(yīng)中的底物是有用的，無論是化學(xué)還是酶促反應(yīng)，對于所述反應(yīng)而言相應(yīng)的常規(guī)DNA和RNA核苷胞嘧啶是底物。例如，核苷可以通過合適的激酶轉(zhuǎn)化成一磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯。用于制造此類經(jīng)修飾的胞嘧啶核苷的通用步驟提供于例如實施例11中。本公開內(nèi)容還提供由以下實施例12中所示的式NT1和NT2表示的核苷酸。本發(fā)明還提供由下式表示的經(jīng)修飾的核苷酸：在本發(fā)明的特定實施方式中，經(jīng)修飾的胞嘧啶核苷由下式表示：用于制造此類經(jīng)修飾的胞嘧啶核苷酸5’-三磷酸酯的通用步驟提供于例如實施例12中。本發(fā)明的經(jīng)修飾的核苷酸還能夠以與常規(guī)核苷酸相同的方式使用核苷酸轉(zhuǎn)移酶來被引入多核苷酸寡聚物中從而生產(chǎn)經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物。本發(fā)明的經(jīng)修飾的胞嘧啶核苷酸是非天然存在的。在期望使用本發(fā)明的經(jīng)修飾的堿基的任何酶促或合成反應(yīng)中可以使用此類核苷酸代替相應(yīng)的常規(guī)胞苷磷酸酯。例如，包含本發(fā)明的經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的核苷酸5’-三磷酸酯可以通過DNA聚合酶而引入經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物中?？梢赃@樣做以例如增強所得到引物延伸產(chǎn)物的雜交親合性。在非限制性實例中，如下進行其：(a)提供混合物，所述混合物包含模板依賴性DNA聚合酶、本發(fā)明的核苷酸5’-三磷酸酯和可選的一種或多種脫氧核苷酸三磷酸酯(例如dATP、dCTP、dGTP和/或常規(guī)TTP)以及其它緩沖液成分(例如Mg2+和/或Mn2+離子)；和(b)將引物退火至模板DNA或RNA鏈中的互補序列，從而使聚合酶能夠?qū)⒔?jīng)修飾的堿基(即經(jīng)修飾的核苷酸)和其它NTP(如果存在)引入延伸引物中，由此形成包含本發(fā)明的經(jīng)修飾的堿基的多核苷酸寡聚物。對于引物延伸的合適反應(yīng)條件，也參見Kutyavin,I.,Biochemistry47:13666–13673(2008),“UseofBase-ModifiedDuplex-StabilizingDeoxynuleoside5′-TriphosphatestoEnhancetheHybridizationPropertiesofPrimersandProbesinDetectionPolymeraseChainReaction”。F.雙鏈體在一些實施方式中，本發(fā)明提供包含經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物和多核苷酸序列的雙鏈體。在一些實施方式中，本發(fā)明提供包含多個經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物和多核苷酸序列的雙鏈體。在一些實施方式中，本發(fā)明提供包含至少一個經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物和多核苷酸序列的雙鏈體。雖然此類雙鏈體內(nèi)的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物是非天然存在的寡聚物，在一些實施方式中，該雙鏈體內(nèi)的多核苷酸序列是天然存在的多核苷酸序列。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸和多核苷酸序列都是非天然存在的。在本發(fā)明的雙鏈體的一些實施方式中，所述至少一個經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含與所述多核苷酸序列的至少4個相鄰堿基互補和雜交的4個以上相鄰堿基。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，本文所述的任何經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物和如本文所述包含任何另外的修飾的任何經(jīng)修飾的多核苷酸可用于與多核苷酸序列形成雙鏈體。另外，多核苷酸序列不受限制?？梢允褂镁哂信c經(jīng)修飾的多核苷酸具有互補性的至少4個以上相鄰核苷酸的任何多核苷酸。在一些實施方式中，多核苷酸序列包含原核生物核苷酸序列。在一些實施方式中，多核苷酸序列包含真核生物核苷酸序列。在一些實施方式中，多核苷酸序列包含病毒核苷酸序列。在雙鏈體的一些實施方式中，多核苷酸序列比經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物長，即多核苷酸序列比經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含更多的核苷酸。在一些實施方式中，雙鏈體連接至固體支持物。在一些實施方式中，本發(fā)明的雙鏈體連接至珠。在一些實施方式中，本發(fā)明的雙鏈體連接至陣列。在一些實施方式中，本發(fā)明的雙鏈體連接至微陣列。III.方法A.包含經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的合成經(jīng)修飾的多核苷酸、經(jīng)修飾的核苷、經(jīng)修飾的核苷酸和其它部分含有本發(fā)明的經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的寡聚物、核苷、核苷酸和其它部分可以通過任何合適的方法合成，并且通?；瘜W(xué)和/或酶促地合成。本文描述了優(yōu)選方法，例如參見實施例1-4、8、9、11和12。例如，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物可以在實驗室中通過使用亞磷酰胺方法和源自被合適地保護的2'-脫氧核苷(dA、dC、dG和dT)、核糖核苷(A、C、G和U)或經(jīng)化學(xué)修飾的核苷(例如LNA、BNA)等的亞磷酰胺構(gòu)建嵌段通過固相合成來合成。多核苷酸鏈組裝通常以從3'-至5'-末端的方向進行，然后是被稱為“合成循環(huán)”的例行步驟。單個合成循環(huán)的完成導(dǎo)致向生長鏈添加一個核苷酸殘基。HPLC和本領(lǐng)域已知的其它方法用于分離具有所需序列的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物。合成多核苷酸和其類似物的方法已經(jīng)描述于許多出版物中，是公知的，并且除了實施例1-4、8、9、11和12所述方法之外，可使用其來合成本發(fā)明的經(jīng)修飾的部分。參見例如Gait,OligonucleotideSynthesis,IRLPress(1990)，和S.Agrawal,ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs,MethodsinMolecularBiologyVol.20,HumanaPress,Totowa,N.J.(1993)。對于經(jīng)修飾的PNA寡聚物的合成，可以使用本領(lǐng)域公知的常規(guī)肽合成方法(參見例如Nielsen等,Science254:1497-1500(1991))。還可以使用酶促方法，例如由DNA聚合酶介導(dǎo)的引物延伸，或使用合適的激酶將在5’位置的核苷磷酸化。本發(fā)明的說明性多核苷酸寡聚物的各種性質(zhì)在本文的實施例1～12中進一步說明。本文的實施例8～11描述根據(jù)本發(fā)明的數(shù)個示例性PNA寡聚物的合成和表征。B.包含經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的經(jīng)修飾的多核苷酸、經(jīng)修飾的核苷、經(jīng)修飾的核苷酸和其它部分的示例性用途當(dāng)閱讀本公開內(nèi)容時如本領(lǐng)域技術(shù)人員所意識到的，經(jīng)修飾的堿基、經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物、經(jīng)修飾的核苷、經(jīng)修飾的核苷酸和含有其并且在本文描述的其它經(jīng)修飾的部分在核酸加工和操作領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)各種用途。例如，它們用于增強雙鏈體穩(wěn)定性，例如在雜交復(fù)合體(如多核苷酸雙鏈體和三鏈體)中的穩(wěn)定性。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物用作例如在下述中的分子探針：DNA測序、文庫構(gòu)建、陣列、Southern印跡、ASO分析、熒光原位雜交(FISH)、人工基因合成、作為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等的引物、連接測定(例如，用于已知單核苷酸多態(tài)性的檢測)等。以上所列方法是本領(lǐng)域已知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員用本文所述的非天然存在的經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基、用本文所述的非天然存在的經(jīng)修飾的核苷、用本文所述的非天然存在的經(jīng)修飾的核苷酸或者用本文所述的非天然存在的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物取代例如任何這些方法中使用的天然存在的堿基、天然存在的核苷、天然存在的核苷酸或者天然存在的多核苷酸寡聚物沒有困難。在一些實施方式中，包含一個或多個本發(fā)明的經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物提高引物延伸反應(yīng)的效率。由本發(fā)明的經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基提供的附加的雙鏈體穩(wěn)定性允許本領(lǐng)域技術(shù)人員在比用缺乏此類經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的天然存在的多核苷酸寡聚物更高的溫度下執(zhí)行引物延伸。由此，可以減少引物延伸時間和/或變性溫度和退火溫度之間的斜升時間(transitionramptimes)。更高的反應(yīng)溫度對于使靶分子中的潛在有問題的二次結(jié)構(gòu)最小化而言也是有利的，并且可以減少引物二聚體的形成。此外，不受理論限制，據(jù)認為使用更高的反應(yīng)溫度也減少噪音。以下描述本文所述的非天然存在的經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基、非天然存在的經(jīng)修飾的核苷、非天然存在的經(jīng)修飾的核苷酸和非天然存在的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的一些非限制性用途。1.經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物在陣列應(yīng)用中的用途在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物用于包含陣列的應(yīng)用中。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解涉及陣列的許多應(yīng)用。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，涉及連接有本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的陣列的應(yīng)用的選擇可以改變，并且不受本文公開內(nèi)容限制。在一些實施方式中，陣列應(yīng)用例如用于基因表達的雜交或基于陣列的分析。示例性非限制性陣列包括芯片或平臺陣列、珠陣列、液相陣列和“郵政-編碼(zip-code)”陣列等。經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物在與靶核苷酸序列的堿基配對中的優(yōu)異穩(wěn)定性導(dǎo)致相關(guān)序列的識別提高，特別是在單核苷酸水平上，這在雜交或基于陣列的分析中是有利的。諸如硝酸纖維素、玻璃、硅晶片、光學(xué)纖維等適于構(gòu)建陣列的材料是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。因此，在本發(fā)明的一些實施方式中，提供連接有經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的陣列。在本發(fā)明的一些實施方式中，提供連接有多個經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的陣列。在本發(fā)明的一些實施方式中，提供連接有多個不同經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的陣列。所述多個不同經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物可以包含對具有不同序列的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物或經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的不同進一步修飾。2.經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物作為探針的用途在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物是探針。在一些實施方式中，所述探針包含可檢測標記或部分。本文使用的可檢測標記同時包括諸如熒光染料(熒光團)等直接可檢測部分和諸如結(jié)合對的成員等間接可檢測部分。當(dāng)可檢測部分是結(jié)合對的成員時，在一些實施方式中，探針可以通過將探針與結(jié)合至結(jié)合對的第二成員的可檢測標記一起溫育而可檢測。在一些實施方式中，探針未經(jīng)標記，例如當(dāng)探針是例如在微陣列或珠上的捕獲探針時。在一些實施方式中，探針不能例如通過聚合酶而可延伸。在一些實施方式中，探針是可延伸的。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物是FRET探針。FRET探針可以用熒光染料在5'端或者用熒光猝滅劑在3'端進行標記，熒光猝滅劑是當(dāng)化學(xué)基團緊密接近(即連接至相同探針)時吸收(即抑制)來自染料的熒光發(fā)射的化學(xué)基團。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物是5’核酸酶PCR探針、MolecularBeaconTM或ScorpionTM探針。3.經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物在雜交方法中的用途如本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解的，寡核苷酸和核酸與互補經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的雜交在各種應(yīng)用中是有用的。例如，包含本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的雜交雙鏈體的形成可以作為雙鏈體的可檢測信號或特征方面的變化的結(jié)果而直接檢測，例如在原位雜交(FISH)技術(shù)中那樣。因此本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物可以作為未經(jīng)標記或經(jīng)標記探針而提供，以促進此類檢測。雙鏈體還可以進行固相或電泳分離，例如以區(qū)分真實信號與背景。在一些實施方式中，作為與互補靶序列雜交的結(jié)果，雜交的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物以某種方式化學(xué)改變。例如，在引物延伸過程(例如PCR)中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物可以稱為“經(jīng)修飾的引物”。此類經(jīng)修飾的引物可以延伸而形成引物延伸產(chǎn)物，其可以充當(dāng)下一PCR循環(huán)的模板。在5’-核酸酶反應(yīng)中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物可以稱為“經(jīng)修飾的寡聚物探針”。此類經(jīng)修飾的寡聚物探針可以通過DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)的外切核酸酶活性而被切割，從而產(chǎn)生能夠通過熒光或其它手段檢測的切割片段。在此類應(yīng)用中，引物的延伸或探針的切割是本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物通過與互補核酸序列雜交而形成雙鏈體的證據(jù)。此外，可以將反應(yīng)條件調(diào)整為確定最合適條件，該最合適條件將用于特定應(yīng)用的雜交最大化。具體而言，反應(yīng)溫度通常選擇成接近、稍微低于或有時稍微高于用于其靶標的寡聚物的Tm。如果反應(yīng)溫度過高，寡聚物會不與其靶序列雜交，并且引物延伸或探針切割的效率會降低。本發(fā)明還提供在雜交方法中使用包含本發(fā)明的經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的多核苷酸寡聚物(本文有時也稱為“經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物”)的方法。在雜交方法中可以使用本文所述的任何經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基。在本發(fā)明的一些實施方式中，提供使包含經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的多核苷酸寡聚物與懷疑在反應(yīng)混合物中存在的核酸靶序列雜交的方法。在一些實施方式中，所述方法包括使包含經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物并且懷疑包含靶核酸序列的反應(yīng)混合物在有利于經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物與在反應(yīng)混合物中如果存在的靶核酸序列雜交的條件下溫育的步驟。該方法中使用的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物與懷疑在反應(yīng)混合物中存在的核酸靶序列內(nèi)的序列互補，并且包含至少一個由下式表示的經(jīng)修飾的堿基：其中，Z是CH2或O。在本發(fā)明的特定實施方式中，該方法中使用的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物與懷疑在反應(yīng)混合物中存在的核酸靶序列內(nèi)的序列互補，并且包含至少一個由下式表示的經(jīng)修飾的堿基：其中，Z是O。將反應(yīng)混合物溫育，由此在經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物與在反應(yīng)混合物中如果存在的靶核酸序列之間形成雙鏈體。在一些實施方式中，所述方法包括檢測在反應(yīng)混合物中所述靶核酸序列的存在或者確認其不存在。作為形成此類雙鏈體的結(jié)果，檢測到在反應(yīng)混合物中存在所述靶核酸序列。作為不形成此類雙鏈體的結(jié)果，確認在反應(yīng)混合物中不存在所述靶核酸序列。在所述方法的一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物包含選自由可檢測標記、熒光團和熒光猝滅劑組成的組的部分。可檢測標記、熒光團和/或熒光猝滅劑有助于雙鏈體的檢測和/或靶核酸序列的檢測。在一些實施方式中，反應(yīng)混合物包含生物樣品。在一些實施方式中，反應(yīng)混合物包含由生物樣品制備的核酸樣品。由生物樣品制備核酸樣品是本領(lǐng)域公知的。本發(fā)明提供檢測生物樣品中的靶核酸的方法。在一些實施方式中，該方法包括下述步驟：(a)使生物樣品的靶核酸與包含經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物接觸，其中，所述靶核酸與所述經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物特異性雜交，和(b)檢測在所述靶核酸與所述經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物之間的雙鏈體形成。在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種方法，其包括下述步驟：(a)提供懷疑含有靶核酸的核酸樣品；(b)提供包含經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物和與所述靶核酸互補的核苷酸序列；和(c)將所述核酸樣品與所述經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物在允許于所述靶核酸與所述經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物之間形成雙鏈體的雜交條件下組合。在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種方法，其包括下述步驟：(a)將(i)懷疑含有靶核酸的核酸樣品以及(ii)包含經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基和與所述靶核酸互補的核苷酸序列的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物在允許于所述靶核酸與所述經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物之間形成雙鏈體的雜交條件下組合；和(b)檢測在所述靶核酸與所述經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物之間的雙鏈體形成。在一些實施方式中，本發(fā)明提供一種方法，其包括下述步驟：(a)將(i)懷疑含有靶核酸的核酸樣品以及(ii)包含經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基和與所述靶核酸互補的核苷酸序列的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物在允許于所述靶核酸與所述經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物之間形成雙鏈體的雜交條件下組合；和(b)確認在所述核酸樣品中不存在所述靶核酸。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，雜交和檢測樣品中靶核酸的存在或者確認其不存在的方法可以使用任何靶核酸進行，只要可以獲得所述靶標的一些信息從而可以制備具有與所述靶核酸互補的至少4個相鄰互補核苷酸的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物。4.經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物作為引物的用途在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物是引物。本文使用的引物有時被稱為經(jīng)修飾的引物，是能夠與靶序列特異性雜交并且能夠在一端(通常是3’端)通過模板依賴性DNA或RNA聚合酶延伸的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物。在模板、聚合酶和合適的緩沖液和試劑的存在下，經(jīng)修飾的引物可以延伸以形成與靶序列互補的經(jīng)修飾的引物延伸產(chǎn)物(也稱為延伸引物)。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的引物包含標記，或者一個或多個聚合用前體(例如核苷三磷酸酯)可以包含標記。經(jīng)修飾的引物延伸產(chǎn)物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多技術(shù)中的任一種檢測。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的引物未經(jīng)標記。在一些實施方式中，使用經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物作為擴增用引物。5.經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物對于擴增的應(yīng)用在一些實施方式中，在擴增反應(yīng)中使用經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，其中，可以使用本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的擴增反應(yīng)不受限制。擴增的示例性非限制性實例包括聚合酶鏈反應(yīng)(“PCR”)、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR、實時PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR(Q-PCR)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、滾環(huán)擴增(RCA)或鏈置換擴增(SDA)。因此，在一些實施方式中提供用于擴增的方法。在一些實施方式中該方法包括下述步驟：(a)將經(jīng)修飾的多核苷酸引物退火至靶序列；和(b)將所述經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物延伸以形成經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物延伸產(chǎn)物。在用于擴增的方法的一些實施方式中，所述經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物連接至固體支持物。在用于擴增的方法的一些實施方式中，所述經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物連接至珠。在用于擴增的方法的一些實施方式中，所述經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物連接至陣列。在用于擴增的方法的一些實施方式中，所述經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物連接至微陣列。許多擴增反應(yīng)，例如PCR，利用反復(fù)引物(reiterativeprimer)依賴性聚合。在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物是下述引物，其能夠與靶核酸序列雜交，并且一旦雜交，能夠利用靶核酸序列作為模板，通過聚合酶(在核苷酸底物，例如核苷酸三磷酸酯的存在下)延伸。聚合酶包括但不限于DNA和RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等。對利用不同聚合酶的聚合有利的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。擴增反應(yīng)優(yōu)選在自動熱循環(huán)儀中進行以便于在期望溫度下進行一定的溫育時間。在一些實施方式中，擴增包括以下順次步驟的至少一個循環(huán)：將至少一個引物(即經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物)與至少一個靶核酸中的互補或基本上互補序列一起退火；使用聚合酶以模板依賴性方式合成核苷酸的至少一條鏈；和將新形成的核酸雙鏈體變性以分開所述鏈。所述循環(huán)可以重復(fù)或者可以不重復(fù)。擴增可以包含熱循環(huán)，或可以等溫地進行。在一些實施方式中，擴增包括在約90℃～約100℃下開始變性約1～約10分鐘，然后循環(huán)，所述循環(huán)包括在約55℃～約75℃下退火約1秒～約30秒，在約55℃～約75℃下延伸約5秒～約60秒，并且在90℃～約100℃下變性約1秒～約30秒。還可以使用其它次數(shù)和過程。例如，引物退火和延伸可以在一個溫度下在同一步驟中執(zhí)行。在一些實施方式中，循環(huán)執(zhí)行至少5次、至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次、至少35次、至少40次或至少45次。特定循環(huán)次數(shù)和溫度會取決于正在擴增的特定核酸序列，并且可以容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。6.經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物在治療應(yīng)用中的用途在一些實施方式中，經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物在治療應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)用途。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，其中，可以使用本發(fā)明的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的治療應(yīng)用不受限制。治療應(yīng)用的示例性非限制性實例包括使用經(jīng)修飾的多核苷酸作為與RNA結(jié)合的反義寡聚物或siRNA，使用經(jīng)修飾的多核苷酸作為與DNA結(jié)合的反義寡核苷酸，使用經(jīng)修飾的多核苷酸作為適體，使用經(jīng)修飾的多核苷酸作為誘餌，或者使用經(jīng)修飾的多核苷酸作為與蛋白質(zhì)結(jié)合的CpG寡聚物。經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物已經(jīng)可用于調(diào)節(jié)基因表達和用于反義基因療法。IV.試劑盒為了用于診斷、研究和以上提出的治療應(yīng)用，本發(fā)明還提供試劑盒。在診斷和研究應(yīng)用中，此類試劑盒可以包括任何以下物質(zhì)或其全部：一種或多種經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基、一種或多種包含經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物、一種或多種包含經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的經(jīng)修飾的核苷、一種或多種包含經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的經(jīng)修飾的核苷酸、一種或多種包含經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的改性PNA；一種或多種包含經(jīng)修飾的胞嘧啶堿基的經(jīng)修飾的部分、一種或多種檢驗試劑、一種或多種緩沖液，等等。治療產(chǎn)品可以包括無菌鹽水或另一藥學(xué)上可接受的乳液或懸浮基質(zhì)?？蛇x地是，所述試劑盒包括描述制造和/或使用本文所述的經(jīng)修飾的部分的說明書手冊。通常而言，除了說明書手冊之外的這些成分在一個或多個容器中提供。在一些實施方式中，本發(fā)明提供包含本文所述的經(jīng)修飾的部分的試劑盒。在一些實施方式中，本發(fā)明提供包含本文所述的經(jīng)修飾的多核苷酸寡聚物的試劑盒。在一些實施方式中，試劑盒還包含至少一種聚合酶，例如熱穩(wěn)定的聚合酶。在一些實施方式中，試劑盒還包含dNTP。在一些實施方式中，試劑盒還包含引物和/或探針。在一些實施方式中，本發(fā)明提供包含用于實施本發(fā)明方法的組合物的試劑盒，所述本發(fā)明方法包括但不限于，處理核酸樣品，執(zhí)行酶促反應(yīng)，執(zhí)行雜交，形成雙鏈體等，如本文所述。說明書材料可以含有用于實施本發(fā)明方法的指導(dǎo)(即方法)。所述說明書可以以各種形成存在于題述試劑盒中，在所述試劑盒中可以存在一種或多種形式的說明書。雖然說明書材料通常包含書面材料或打印材料，但是它們不限于此。本發(fā)明設(shè)想能夠儲存此類說明書并且使其與終端用戶通訊的任何介質(zhì)。此類材料包括但不限于電子儲存介質(zhì)(例如磁盤、磁帶、盒式磁帶、芯片)和光學(xué)介質(zhì)(例如，CDROM)等等。此類介質(zhì)可以包括提供此類說明書材料的網(wǎng)址地址。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會意識到的，可以根據(jù)本發(fā)明制備各種試劑盒和成分，這取決于試劑盒的有意用戶和用戶的特定需要。本發(fā)明的另外的試劑盒實施方式包括可選的功能組分，其允許本領(lǐng)域技術(shù)人員執(zhí)行本文所述的任一方法變體。在此描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，包括發(fā)明人所知道的實施本發(fā)明的最佳模式。當(dāng)然，在閱讀前述說明書時，對這些優(yōu)選實施方式的等效的改變、變化、改動和替換對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說將是明顯的。本發(fā)明人希望本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)使用等效的這些改變、變化、改動和替換，并且本發(fā)明人期望本發(fā)明以不同于此處具體描述的那樣的方式來實行。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認識到，可以改變、改動或調(diào)整各種非關(guān)鍵參數(shù)以便產(chǎn)生相似的結(jié)果。因此，至少可適用的法律允許，本發(fā)明包括附加的權(quán)利要求書中所述的主題的所有改動和等效物。此外，除非在本文中另有說明或與上下文明顯矛盾，本發(fā)明包括上述要素以其所有可能變化的任何組合。雖然本發(fā)明的各個要素在本文被描述為含有多個實施方式，應(yīng)該理解的是，除非另有說明，本發(fā)明給定要素的各個實施方式能夠與本發(fā)明的其它要素的各個實施方式能夠一起使用，并且各個此類使用旨在形成本發(fā)明的不同實施方式。本文引用的所引用專利、專利申請和科技文獻在此通過整體援引而并入,其程度與每個出版物、專利或?qū)＠暾埻ㄟ^援引具體而單獨指明地并入相同。本文引入的任何參考文獻與本說明書的具體教導(dǎo)之間的任何矛盾應(yīng)以有利于后者的方式得到解決。類似地，如果本領(lǐng)域理解的對詞語或短語的定義與本說明書的具體教導(dǎo)的詞語或短語的定義存在任何沖突，應(yīng)以有利于后者的方式得到解決。如從以上公開內(nèi)容而意識到的，本發(fā)明具有各種應(yīng)用。本發(fā)明通過下述的實施例進一步描述，但這些實施例僅是說明性的，并不旨在以任何方式限制本發(fā)明的定義和范圍。V.實施例通用方法和推薦提供以下實施例來說明本文所述的發(fā)明，但不對其造成限制。在氬氣(Ar)下進行所有空氣和水分敏感性反應(yīng)。除非另外指出，從商業(yè)來源獲得無水溶劑和試劑。快速色譜在230-400目硅膠(VWR)上執(zhí)行。1HNMR光譜于20℃在Bruker400光譜儀上運行，并且相對于對于1H的標準物Me4Si和對于31P的標準物H3PO4以ppm報道。熔點使用Mel-Temp熔點設(shè)備在開放毛細管中確定，并且未經(jīng)校正。紫外-可見光吸收光譜在CaryVarian分光光度計上在200-400-nm范圍中記錄。薄層色譜在硅膠60F-254鋁背襯的TLC板(EMReagents)上執(zhí)行。HPLC分析在配備有四元泵(quaternarypump)、自動取樣器和二極管陣列檢測器的Agilent1100儀器上進行，并且除非另外指出，監(jiān)視270nm處的吸光度。寡核苷酸合成在MerMade12DNA合成儀(BioAutomation)上執(zhí)行。使用標準亞磷酰胺合成循環(huán)，對于經(jīng)修飾的亞磷酰胺，耦合時間增加至360秒。對于所有解鏈試驗，各寡核苷酸的濃度為1uM，緩沖液濃度為3mMMgCl2、15mMKCl、25mMHEPES，pH8。在室溫下在濃氨水中進行從固體支持物的切割和去保護24小時。除非本文另外指出，本發(fā)明的實施會利用為本領(lǐng)域技能內(nèi)的細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、病毒學(xué)、重組DNA等等的常規(guī)技術(shù)。此類技術(shù)在文獻中充分解釋。參見例如Sambrook,Fritsch,andManiatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition(1989),OligonucleotideSynthesis(M.J.GaitEd.,1984),AnimalCellCulture(R.I.Freshney,Ed.,1987),theseriesMethodsInEnzymology(AcademicPress,Inc.)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.M.MillerandM.P.Caloseds.1987),CurrentProtocolsIiMolecularBiology(F.M.Ausubel,R.Brent,R.E.Kingston,D.D.Moore,J.G.Siedman,J.A.Smith,andK.Struhl,eds.,1987)。在以下具體實施例中，相關(guān)反應(yīng)方案按照實施例。實施例1.DMT-CBP亞磷酰胺(M6)的合成實施例1描述用于制備經(jīng)修飾的胞嘧啶3’-亞磷酰胺單體M6的受保護形式的合成步驟，所述經(jīng)修飾的胞嘧啶3’-亞磷酰胺單體M6的受保護形式包含與嘧啶5-位碳通過1-丁炔基連接體連接的經(jīng)保護磷酸酯部分(本文將該經(jīng)修飾的堿基有時稱為“CBP”)。M6的5’-羥基受DMT基團保護，磷酸酯部分的兩個羥基受新戊酰基氧芐基基團保護。4-新戊酰基氧芐基醇(化合物M1)。在室溫下在氬氣氣氛下向在含有三乙胺(10.43mL,75mmol)的無水THF(50mL)中的4-羥基苯甲醇(6.21g,50mmol)的攪拌溶液逐滴添加特戊酰氯(6.79mL,55mmol)。攪拌60分鐘后，將反應(yīng)混合物用水(0.2mL)猝滅并靜置過夜。然后用EtOAc(～400mL)稀釋并用飽和NaHCO3(3x100mL)和鹽水(100mL)洗滌。然后在Na2SO4上干燥、過濾和濃縮。在用乙酸乙酯/己烷(4:6)洗脫的硅膠柱(4x20cm)上使用快速色譜分離出產(chǎn)物(TLC:Rf～0.4，在乙酸乙酯/己烷(4:6)中)。匯集純級分，將其濃縮和真空干燥，以提供7.75g(74％)的無色油。1HNMR(DMSO-d6):δ7.35(d,2H,J＝8.6Hz),7.04(d,2H,J＝8.6Hz),5.22(t,1H),4.50(d,2H),1.31(s,9H)?；衔颩2.在氬氣下將化合物M1(參見下文：7.79g,37.4mmol)溶解在含有N,N-二異丙基乙基胺(8.14mL,46.8mmol)的無水THF(50mL)中，將所獲得溶液在冰水浴中冷卻至0℃。在攪拌和冷卻的情況下利用注射器用5分鐘時間逐滴添加二氯二異丙基亞磷酰胺(3.46mL,18.8mmol)。使反應(yīng)混合物升溫至室溫，并攪拌過夜。通過過濾除去沉淀的鹽，在真空中濃縮濾出液。將殘留物溶解在乙酸乙酯(～150mL)中，用5％NaHCO3(3x50mL)洗滌然后用鹽水(50mL)洗滌。分離有機層，將其在Na2SO4上干燥，過濾和濃縮。在硅膠柱(4x20cm)上使用快速色譜分離出產(chǎn)物(TLC:Rf～0.6，在乙酸乙酯/己烷/三乙胺(20:80:2)中)，所述硅膠柱(4x20cm)從己烷/三乙胺(100:2)加載，并且用乙酸酯/己烷/三乙胺(20:80:2)洗脫。匯集純級分，將其濃縮以提供8.1g(79％)的無色油。1HNMR(DMSO-d6):δ7.37(d,4H,J＝8.6Hz),7.07(d,4H,J＝8.6Hz),4.76–4.63(m,4H),3.70–3.61(m,2H),1.30(s,18H),1.16(d,12H,J＝6.8Hz).31PNMR(DMSO-d6):δ147.30。化合物M3.在氬氣氣氛下將3-丁炔-1-醇(1.18mL,15.0mmol)和化合物M2(參見下文；8.1g,14.8mmol)溶解在無水THF中。立即添加5-(乙硫基)-1H-四唑(66mL,0.25M，在乙腈中)的溶液，并且將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時。添加叔丁基氫過氧化物溶液(4.0mL，5-6M，在癸烷中)，并且將所述混合物攪拌另外2小時。然后在真空下除去溶劑，并將殘留物溶解在乙酸乙酯(200mL)中，用飽和NaHCO3(3x50mL)洗滌，并用鹽水(50mL)洗滌。將有機相在Na2SO4上干燥，過濾并濃縮。使用在己烷中階梯性梯度為20–50％的乙酸乙酯在硅膠上通過快速色譜分離出產(chǎn)物(TLC:Rf～0.35，在乙酸乙酯/己烷(1:1)中)。獲得非晶態(tài)固體5.3g(67％)。1HNMR(DMSO-d6):δ7.42(d,4H,J＝8.6Hz),7.11(d,4H,J＝8.6Hz),5.07(d,4H,J＝8.2Hz),4.07–4.01(m,2H),2.93(t,1H,J＝2.6Hz),2.56–2.52(m,2H),1.31(s,18H).31PNMR(DMSO-d6):δ-1.2。5’-DMT-N4-DIBF-5-I-dC(化合物M4).通過與無水吡啶(3x20mL)共蒸發(fā)而使5-碘-2’-脫氧胞苷(1.06g,3mmol)無水，并將其懸浮在無水MeOH(10mL)中。在氬氣氣氛下添加N,N-二異丁基甲酰胺二甲基縮醛(810mg,3.9mmol)，并且在室溫下攪拌反應(yīng)混合物。在約1小時內(nèi)使懸浮液轉(zhuǎn)變?yōu)槌吻迦芤?。此時HPLC分析揭示起始核苷的完全消失。將反應(yīng)混合物用水(0.1mL)猝滅，并且將溶劑在真空中蒸發(fā)。將殘留物與無水吡啶(3x20mL)共蒸發(fā)，溶解在無水吡啶(20mL)中并用DMT-Cl處理成固體。將混合物在室溫下攪拌過夜。蒸發(fā)掉溶劑，將殘留物用TEA:MeOH(10mL,(1:10))處理并再次蒸發(fā)。將殘留物溶解在乙酸乙酯(150mL)中，用10％檸檬酸、5％NaHCO3和鹽水依次洗滌。分離有機層，將其在Na2SO4上干燥，并且過濾。使用在乙酸乙酯中階梯性梯度為0–20％的丙酮洗脫的快速色譜分離出產(chǎn)物(TLC:Rf～0.3，在乙酸乙酯/丙酮(8:2)中)。獲得白色泡沫(1.81g,76％)。1HNMR(DMSO-d6):δ8.63(s,1H),8.14(s,1H),7.42–7.20(m,9H),6.92–6.89(m,4H),6.11(t,1H),5.29(d,1H),4.23–4.18(m,1H),3.96–3.93(m,1H),3.74(s,6H),3.45–3.41(m,2H),3.33–3.29(m,2H),3.22–3.19(m,2H),2.32–1.93(m,4H),0.93–0.85(m,12H)?；衔颩5.將794mg(1.0mmol)的化合物M4(參見上文)和化合物M3(上文；637mg,1.2mmol)與Pd(PPh3)4(116mg,0.1mmol)、碘化亞銅(I)(38mg,0.2mmol)在配備有磁力攪拌棒的圓底燒瓶中合并。將燒瓶排空并用氬氣填充，用隔板(septum)和氬氣氣球密封。使用注射器通過隔板添加N,N-二甲基甲酰胺(10mL)和三乙胺(697μL,5mmol)，并且將混合物在Ar氣氛下在環(huán)境溫度下攪拌。反應(yīng)的進展使用C18RPHPLC或TLC控制，監(jiān)視起始核苷的消失。12～72小時后，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(150mL)稀釋，并用0.1MNa2EDTA(2x50mL)、飽和NaHCO3水溶液(3x50mL)和鹽水(50mL)洗滌。分離有機層，將其在Na2SO4上干燥，并且濃縮成油。在硅膠柱(3x20cm)上通過快速色譜分離出反應(yīng)產(chǎn)物(TLC:Rf～0.35，在乙酸乙酯/丙酮(8:2)中)，所述硅膠柱(3x20cm)從乙酸乙酯加載并且用在乙酸乙酯中階梯性梯度為0–20％的丙酮洗脫。獲得淺黃色玻璃狀固體(834mg,70％)。1HNMR(DMSO-d6):δ8.61(s,1H),8.04(s,1H),7.42–7.18(m,13H),7.08–7.04(m,4H),6.91–6.86(m,4H),6.12(t,1H),5.33(d,1H),5.03(d,4H),4.31–4.26(m,1H),3.99–3.89(m,3H),3.71(s,6H),3.33–3.22(m,5H),3.13–3.09(m,1H),2.57–2.52(m,2H),2.33–2.07(m,3H),1.96–1.86(m,1H),1.29(s,18H),0.84(d,12H)。31PNMR(DMSO-d6):δ-1.3?；衔颩6.在氬氣下向保持在0℃的在含有N,N-二異丙基乙基胺(348μL,2.0mmol)的無水CH2Cl2(10mL)中的化合物M5(上文；814mg)的攪拌溶液逐滴添加2-氰基乙基N,N-二異丙基氯亞磷酰胺(159μL,0.71mmol)。使反應(yīng)混合物升溫至室溫，并在30分鐘后添加甲醇(0.1mL)。然后將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(150mL)稀釋并用5％NaHCO3水溶液(3x50mL)和鹽水(50mL)洗滌。分離有機層，將其在Na2SO4上干燥，并且濃縮成油。將產(chǎn)物在硅膠柱(3x15cm)上使用快速色譜純化，所述硅膠柱(3x15cm)從乙酸乙酯/己烷/三乙胺(50:50:2)加載，并且用在己烷/三乙胺(100:2)中階梯性梯度為50–100％的乙酸乙酯洗脫。獲得奶油狀泡沫(803mg,85％)。31PNMR(DMSO-d6):δ147.47,147.23,-1.29。實施例2.DMT-CBP亞磷酰胺(M11)的合成實施例2描述用于制備經(jīng)修飾的胞嘧啶3’-亞磷酰胺單體M11的受保護形式的合成步驟，所述經(jīng)修飾的胞嘧啶3’-亞磷酰胺單體M11的受保護形式包含與嘧啶5-位碳通過1-丁炔基連接體連接的經(jīng)保護的磷酸酯部分(本文將該經(jīng)修飾的堿基有時稱為“CBP”)。M11的5’-羥基受DMT基團保護，磷酸酯部分的兩個羥基受α,α-二甲基-o-亞苯甲基保護基而不是實施例1中使用的新戊?；跗S基保護基保護。2-(羥基-1-甲基-乙基)-苯酚(化合物M7).該化合物按照以下文獻中所述的方法合成：Johnsson,R.,Mani,K.,Cheng,F.,Ellervik,U.(2006)J.Org.Chem.,第71卷，第3444-3451頁.化合物M8.在氬氣下將化合物M7(上文；3.42g,22.5mmol)溶解在無水THF(50mL)中，在丙酮-干冰浴中將所獲得溶液冷卻至-20℃。在攪拌和冷卻下逐滴添加二氯二異丙基亞磷酰胺(5.0g,24.7mmol)，然后添加N,N-二異丙基乙基胺(9.80mL,56.3mmol)。使反應(yīng)混合物升溫至室溫，并攪拌1小時。然后將其用乙酸乙酯(～150mL)稀釋并用5％NaHCO3水溶液(3x50mL)洗滌，然后用鹽水(50mL)洗滌。分離有機層，將其在Na2SO4上干燥，過濾和濃縮。在用己烷/三乙胺(100:2)洗脫的硅膠柱(4x20cm)上使用快速色譜分離出產(chǎn)物(TLC:Rf～0.85，在己烷/三乙胺(100:2)中)。匯集純級分，將其濃縮以提供5.58g(88％)的無色油，其在-20℃儲存時固化。1HNMR(DMSO-d6):δ7.23–7.13(m,2H),6.97–6.82(m,2H),3.67–3.54(m,2H),1.69(s,3H),1.56(s,3H),1.19–1.14(m,12H).31PNMR(DMSO-d6):δ130.75?；衔颩9.在氬氣氣氛下將3-丁炔-1-醇(1.50mL,18.9mmol)和化合物M8(5.58g,19.8mmol)溶解在無水乙腈(50mL)中。立即添加5-(乙硫基)-1H-四唑(87mL,0.25M，在乙腈中)的溶液，并且將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時。添加叔丁基氫過氧化物溶液(5.0mL,5-6M，在癸烷中)，并且將所述混合物攪拌另外2小時。然后在真空下除去溶劑，并將殘留物溶解在乙酸乙酯(200mL)中，用飽和NaHCO3(3x50mL)洗滌，并用鹽水(50mL)洗滌。將有機相在Na2SO4上干燥，過濾并濃縮。使用在己烷中階梯性梯度為30–50％的乙酸乙酯在硅膠上通過快速色譜分離出產(chǎn)物(TLC:Rf～0.33，在乙酸乙酯/己烷(1:1)中)。獲得無色油4.79g(91％)。1HNMR(DMSO-d6):δ7.45–7.35(m,2H),7.25–7.13(m,2H),4.13–4.05(m,2H),2.85(t,1H,J＝2.7Hz),2.55–2.49(m,2H),1.79(s,3H),1.73(s,3H).31PNMR(DMSO-d6):δ-12.45?；衔颩10.用2.38g(3.0mmol)的化合物M4和化合物M9(1.04g,3.9mmol)開始，按照對于化合物M5所述的步驟，合成該化合物。在硅膠柱(4x20cm)上通過快速色譜分離出反應(yīng)產(chǎn)物(TLC:Rf～0.3，在乙酸乙酯/丙酮(8:2)中)，所述硅膠柱(4x20cm)從乙酸乙酯加載并且用在乙酸乙酯中階梯性梯度為0–20％的丙酮洗脫。獲得淺褐色泡沫(2.27g,81％)。1HNMR(DMSO-d6):δ8.62(s,1H),8.00(s,1H),7.42–7.03(m,13H),6.91–6.86(m,4H),6.12(t,1H),5.34(d,1H),4.30–4.25(m,1H),3.99–3.90(m,3H),3.71(s,6H),3.34–3.22(m,5H),3.14–3.09(m,1H),2.56–2.50(m,4H),2.33–2.08(m,3H),1.97–1.90(m,1H),1.72(s,3H),1.69(s,3H),0.89–0.81(m,12H).31PNMR(DMSO-d6):δ-12.57?；衔颩11.用2.24g(2.4mmol)化合物M10開始，按照對于化合物M6所述的步驟，合成亞磷酰胺化合物M11。將產(chǎn)物在硅膠柱(4x20cm)上使用快速色譜純化，所述硅膠柱(4x20cm)從乙酸乙酯/己烷/三乙胺(60:40:2)加載，并且用在己烷/三乙胺(100:2)中階梯性梯度為60–100％的乙酸乙酯洗脫。獲得奶油狀泡沫(2.38g,87％)。31PNMR(DMSO-d6):δ147.44,147.15,-12.58。實施例3.CBP-PNA(M18)的合成實施例3描述用于制備經(jīng)修飾的胞嘧啶PNA單體M18的受保護形式的合成步驟，所述經(jīng)修飾的胞嘧啶PNA單體M18的受保護形式包含與PNA單體主鏈連接的CBP部分。單體包含受α,α-二甲基-o-亞苯甲基保護基保護的磷酸酯部分、Fmoc-保護的氨基和游離羧基，以用于通過PNA肽偶聯(lián)法引入多核苷酸寡聚物中?；衔颩12.化合物M12根據(jù)文獻方法(J.Org.Chem.,2008,73,p.3807-3816)制備。化合物M13.在氬氣下將5-碘胞嘧啶(5.10g,21.5mmol)溶解在125mL的無水DMF中，并且將溶液冷卻至0℃，然后添加NaH(95％,0.544g,21.5mmol)。在環(huán)境溫度下攪拌1小時后，溶液變澄清，并且4小時后形成沉淀。用2分鐘逐滴添加溴代乙酸乙酯(2.38mL,21.5mmol)，使反應(yīng)混合物繼續(xù)在環(huán)境溫度下過夜。在高度真空下通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，并且向殘留油添加100mL水。通過過濾、干燥和從乙醇重結(jié)晶收集固化殘留物，從而產(chǎn)生5.19g(75％)的產(chǎn)物。1HNMR(DMSO-d6):δ1.18(t,3H),4.12(q,2H),4.44(s,2H),6.65(s,1H),7.83(s,1H),8.09(s,1H)。化合物M14.將化合物M13(上文；5.11g,15.8mmol)懸浮在250mL的無水THF中，并且向溶液添加DMAP(193mg,1.6mmol)、三乙胺(4.40mL,31.6mmol)、Boc2O(7.59g,34.8mmol)。在環(huán)境溫度下攪拌6小時后，添加另外的1.5gBoc2O，將反應(yīng)混合物加熱2小時至60℃，然后使其在環(huán)境溫度下攪拌過夜。通過在真空下蒸發(fā)除去溶劑，在用在己烷中階梯性梯度為30–50％的乙酸乙酯洗脫的硅膠柱(5x18cm)上通過快速色譜分離出反應(yīng)產(chǎn)物，從而產(chǎn)生5.49g(66％)。1HNMR(DMSO-d6):δ1.21(t,3H),1.42(s,18H),4.18(q,2H),4.72(s,2H),8.69(s,1H)?；衔颩15.將化合物M14(上文；5.46g,10.4mmol)溶解在90mL的THF中，并冷卻至0℃。用20分鐘向攪拌中的THF溶液經(jīng)由加料漏斗逐滴添加30mL的2.5MNaOH溶液。45分鐘后，將反應(yīng)混合物倒入含有150mL的1MNaHSO4和150mL的乙酸乙酯的分液漏斗中。將混合物搖晃，并且分離出有機層。用乙酸乙酯(2X100mL)提取水性層，將合并的有機層在Na2SO4上干燥。在真空下除去溶劑，將殘留物(5.54g)用于下一步驟，而無需進一步純化或表征?；衔颩16.在氬氣下在配備有磁力攪拌棒的圓底燒瓶中將來自之前步驟的化合物M15(10.4mmol)和化合物M9(上文；2.77g,10.4mmol)溶解在100mL無水DMSO中，并且添加Pd(PPh3)4(1.12g,1.04mmol)、碘化亞銅(I)(199mg,1.04mmol)和三乙胺(7.5mL,52mmol)。將溶液加熱至65℃，并且在65℃下攪拌4小時。將反應(yīng)混合物用二氯甲烷(300mL)稀釋，在空氣中在環(huán)境溫度下攪拌30分鐘，然后將混合物用水(300mL)、0.1MNa2EDTA(2x250mL)、水(250mL)和鹽水(250mL)洗滌。分離有機層，將其在Na2SO4上干燥，過濾，并且濃縮成油。在用在乙腈中階梯性梯度為1–4％的水洗脫的硅膠柱(7x18cm)上通過快速色譜分離出反應(yīng)產(chǎn)物，從而產(chǎn)生3.97g,(60％，對于2個步驟)。1HNMR(DMSO-d6):δ1.37(s,9H),1.42(s,9H),1.73(s,3H),1.79(s,3H),4.05-4.12(m,4H),4.63(d,2H),7.12-7.44(m,5H)?；衔颩17.在氬氣下將化合物M16(上文；1.91g,3.0mmol)和化合物M12(上文；1.05g,2.7mmol)溶解在40mL無水DMF中，并且將所獲得溶液冷卻至0℃。添加DIEA(1.60mL,9mmol)，然后添加HATU(1.43g,3.8mmol)，在0℃下攪拌10分鐘后，使混合物升溫至環(huán)境溫度，并且在環(huán)境溫度下攪拌1.75小時。將反應(yīng)混合物用二氯甲烷(200mL)稀釋，并且用1MHCl(200mL)、水(2X150mL)和鹽水(150mL)洗滌。分離有機層，將其在Na2SO4上干燥，過濾，并且濃縮成油。在用在二氯甲烷中階梯性梯度為1–4％的甲醇洗脫的硅膠柱(5x18cm)上通過快速色譜分離出反應(yīng)產(chǎn)物，從而產(chǎn)生1.32g,(48％)。1HNMR(DMSO-d6):δ1.39(s,18H),1.72(s,3H),1.77(s,3H),2.72(t,2H),3.18-3.49(m,4H),4.09-4.42(m,5H),4.59-4.97(m,5H),5.19-5.33(m,2H),5.8-6.1(m,1H),7.12-7.20(m.2H),7.31-7.43(m,7H),7.64-7.74(m,3H),7.88-7.90(m,2H)?；衔颩18.將化合物M17(上文；1.25g,1.25mmol)溶解在25ml氯仿中，并且在氬氣下添加乙酸(1.5mL)、4-甲基嗎啉(0.75mL)和Pd(PPh3)4(145mg,0.13mmol)。將反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度下攪拌5小時。將反應(yīng)混合物用二氯甲烷(150mL)稀釋，并且用1MNaHSO4和鹽水洗滌。分離有機層，將其在Na2SO4上干燥，過濾，并且濃縮成油。在用在二氯甲烷中階梯性梯度為2–10％的甲醇洗脫的硅膠柱(3x15cm)上通過快速色譜分離出反應(yīng)產(chǎn)物，從而產(chǎn)生0.788g(65％)。1HNMR(DMSO-d6):δ1.39(s,18H),1.72(s,3H),1.77(s,3H),2.52(m,2H),3.18-3.49(m,4H),4.09-4.42(m,4H),4.59-4.97(m,4H),5.19-5.33(m,2H),5.8-6.1(m,1H),7.12-7.20(m.2H),7.31-7.43(m,7H),7.64-7.74(m,3H),7.88-7.90(m,2H).實施例4.DMT-CPP-1亞磷酰胺(M24)的合成實施例4描述用于制備經(jīng)修飾的胞嘧啶3’-亞磷酰胺單體M24的受保護形式的合成步驟，所述經(jīng)修飾的胞嘧啶3’-亞磷酰胺單體M24的受保護形式包含其磷原子與嘧啶5-位碳通過1-戊炔基連接體連接的經(jīng)保護的膦酸酯(即，Z是CH2)(本文將該經(jīng)修飾的堿基有時稱為“CPP”)。該實施例說明制造包含膦酸酯部分的經(jīng)保護的核苷亞磷酰胺的方法。2-(羥基-1-甲基-乙基-苯酚(化合物M20＝以上M7).該化合物按照以下所述的方法合成：Johnsson,R.,Mani,K.,Cheng,F.,Ellervik,U.(2006)J.Org.Chem.,v.71,pp.3444-3451?；衔颩21.將配有空氣冷凝器的100-mL圓底燒瓶填充以5-氯-1-戊炔(15.0mL,0.14mol)和亞磷酸三乙酯(25.7mL,0.15mol)。將燒瓶的內(nèi)容物加熱回流(120℃礦物油浴)。回流間歇性地繼續(xù)2周，該段時間期間沸騰溫度逐漸升高至180℃。此時通過31PNMR在反應(yīng)混合物中僅可檢測出痕量的亞磷酸三乙酯。中斷加熱，并且將混合物冷卻至環(huán)境溫度，并且在～1mm,Hg真空蒸餾。收集在91–92℃/～1mm下沸騰的級分，提供14.0g(48％)無色液體。1HNMR(DMSO-d6):δ4.04–3.93(m,4H,),2.82(t,1H),2.26(dt,2H),1.85–1.74(m,2H),1.69–1.58(m,2H),1.23(t,6H).31PNMR(DMSO-d6):δ31.20)?；衔颩22.在Ar氣氛下在室溫下將化合物M20(上文；2.04g,10.0mmol)溶解在溴代三甲基硅烷(3.96mL,30.0mmol)中，并且在50-mL圓底燒瓶中保持密封過夜。在減壓下除去揮發(fā)物，并且在高度真空中將殘留物干燥半小時。將燒瓶的內(nèi)容物溶解在含有N,N-二甲基甲酰胺(0.1mL)的無水二氯甲烷(10mL)中，并在氬氣下冷卻至-20℃。在攪拌下將溶液用草酰氯(3.43mL,40.0mmol)逐滴處理。使反應(yīng)混合物升溫至室溫，并攪拌2小時。然后將其在減壓下蒸發(fā)，并且將殘留物在高度真空中干燥1小時。將殘留的淺黃色固體溶解在無水二氯甲烷(5.0mL)中，并且將所獲得溶液冷卻至-20℃。在攪拌下逐滴添加在含有N,N-二異丙基乙基胺(6.96mL,40.0mmol)的二氯甲烷(5mL)中的化合物M6(上文；1.52g,10.0mmol)的溶液。使反應(yīng)混合物升溫至環(huán)境溫度，攪拌過夜，然后用乙酸乙酯(150mL)稀釋。將所獲得溶液用5％NaHCO3(3x50mL)和鹽水(50mL)洗滌。分離有機層，將其在Na2SO4上干燥，過濾和濃縮。使用在己烷中階梯性梯度為20–80％的乙酸乙酯在硅膠上通過快速色譜分離出產(chǎn)物(TLC:Rf～0.2，在乙酸乙酯/己烷(1:1)中，或者Rf～0.6，在乙酸乙酯中)。產(chǎn)率：2.05g(78％；略帶色的油)。1HNMR(DMSO-d6):δ7.43–7.35(m,2H),7.23–7.13(m,2H),2.79(t,1H),2.24(bt,2H),1.99–1.89(m,2H),1.73(ds,6H),1.68–1.57(m,2H).31PNMR(DMSO-d6):δ22.34?；衔颩23.將化合物M4(上文)與Pd(PPh3)4、碘化亞銅(I)在配備有磁力攪拌棒的圓底燒瓶中合并。將所述燒瓶排空并用氬氣填充，用隔板和氬氣氣球密封。使用注射器通過隔板添加化合物M22(上文)和三乙胺的溶液，并且將混合物在Ar氣氛下在環(huán)境溫度下攪拌。15小時后，將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋，并用0.1MNa2EDTA、飽和NaHCO3水溶液(3X50mL)和鹽水(50mL)洗滌。分離有機層，將其在Na2SO4上干燥，并且濃縮成油。在硅膠上通過快速色譜分離出反應(yīng)產(chǎn)物?；衔颩24.向保持在0℃下的在含有N,N-二異丙基乙基胺的無水CH2Cl2中的化合物M23(上文)的攪拌溶液，在氬氣下逐滴添加2-氰基乙基N,N-。使反應(yīng)混合物升溫至室溫，并在30分鐘后添加甲醇。將反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋，并且用5％NaHCO3水溶液和鹽水洗滌。分離有機層，將其在Na2SO4上干燥，并且濃縮成油。在硅膠柱上使用快速色譜對產(chǎn)物M24純化。實施例5.CBP取代的寡聚物雜交實施例5描述下述試驗，所述試驗中，當(dāng)各自與互補12聚物DNA寡聚物(“短互補物”)或互補18聚物DNA寡聚物(“長互補物”)雜交時，將包含1個或2個CBP部分的18聚物DNA寡聚物(具有去保護的磷酸酯基團)的親合性與僅包含常規(guī)A、C、G和T核苷酸的相應(yīng)18聚物DNA寡聚物的雜交親合性比較。如圖1(經(jīng)修飾的寡聚物和未經(jīng)修飾的寡聚物與短互補物的雜交)中的解鏈曲線數(shù)據(jù)所示，并且如表1和2中所總結(jié)的，觀察到包含2個CBP部分的經(jīng)修飾的寡聚物具有的Tm，實質(zhì)上大于對于未經(jīng)修飾的18-聚物和包含單個CBP部分的18聚物的雜交所觀察到的Tm值。包含單個CBP部分的寡聚物的Tm值，實質(zhì)上高于用未取代寡聚物觀察到的Tm值，當(dāng)與互補12聚物雜交時傳達穩(wěn)定化為2.2℃和2.8℃，當(dāng)與互補18聚物雜交時穩(wěn)定化為1.9℃和2.0℃(參見表1和2)。對于經(jīng)雙修飾的C3寡聚物分別與互補12聚物和18聚物雜交觀察到的Tm值為4.6℃和3.6℃，表明各經(jīng)修飾的堿基取代的單獨穩(wěn)定化效果在該實施例中幾乎是累加的。表征包含CBP取代的寡聚物的雜交，并且將其與僅包含常規(guī)胞嘧啶堿基的未經(jīng)修飾的寡聚物的雜交性質(zhì)比較。寡聚物C1和C2包含1個CBP部分，寡聚物C3包含2個CBP部分。寡聚物序列如下所示：C15’-TTTAGA(CBP)TTCTTGGATTT-3’(SEQIDNO:1)C25’-TTTAGACTT(CBP)TTGGATTT-3’(SEQIDNO:2)C35’-TTTAGA(CBP)TT(CBP)TTGGATTT-3’(SEQIDNO:3)短互補物和長互補物的序列如下所示：短互補物5’-TCCAAGAAGTCT-3’(SEQIDNO:4)長互補物5’-AAATCCAAGAAGTCTAAA-3”(SEQIDNO:5)沿著其3’→5’方向，短互補物和長互補物的序列分別讀作3’-TCTGAAGAACCT-5’和3’-AAATCTGAAGAACCTAAA-5’(顯示勝過(better)與C1、C2和C3互補的互補區(qū))。Tm數(shù)據(jù)使用標準解鏈條件(1uM的各寡核苷酸、3mMMgCl2、15mMKCl、25mMHEPES，pH8)獲得，并且記錄相對于溫度(℃)的270nm下吸光度。圖1顯示對于與上述短互補物序列雜交的寡聚物C1、C2和C3觀察到的解鏈曲線(繪制成270nm下吸光度相對于溫度(℃)的一階導(dǎo)數(shù))。從圖1中的數(shù)據(jù)計算出的Tm值在表1中列表如下：表1與短互補物序列雜交ΔTm是Tm(經(jīng)修飾的寡聚物)-Tm(未經(jīng)取代寡聚物)NA＝不適用。以與以上解釋相同的方式，對于寡聚物與長互補物的雜交也記錄解鏈曲線，并且所獲得的Tm值在表2中列表如下：表2與長互補物序列雜交寡聚物Tm(℃)ΔTm(℃)未經(jīng)取代54.2NAC156.11.9C256.22.0C357.83.6ΔTm是Tm(經(jīng)修飾的寡聚物)-Tm(未經(jīng)取代寡聚物)NA＝不適用。實施例6.經(jīng)修飾的探針在5’-核酸酶PCR中的性能在實施例6中，使用包含本發(fā)明的0、1、2、3或5個經(jīng)修飾的(CBP)堿基的可切割猝滅熒光探針進行5’-核酸酶PCR反應(yīng)。圖2A和2B中顯示的PCR曲線說明，所有包含CBP部分的寡聚物都有效地充當(dāng)檢測探針。此外，包含CBP部分的寡聚物與未經(jīng)修飾的寡聚物相比，具有更大的對互補寡聚物序列的親合性，允許較高的PCR延伸溫度和較短PCR循環(huán)次數(shù)。評價包含1～5個CBP取代的5’-核酸酶PCR探針。使用人基因組DNAβ-球蛋白管家基因作為靶標。在StratageneMx3005P儀器上進行PCR，每個反應(yīng)測試三次。使用以下PCR方法：擴增子長度-96bp，10,000個拷貝/反應(yīng)；引物濃度–200nM；探針濃度–200nM；第一次變性為在95℃下60秒循環(huán)：退火–在68℃下延伸30秒；在95℃下變性8秒正向引物和反向引物具有以下序列：F15’-AATTCCTGAAGCTGACAG(CBP)A-3’(SEQIDNO:6)R15’-AAATAGCCTCCAGGC(CBP)A-3’(SEQIDNO:7)寡聚物探針具有以下序列：表3在圖2A和2B中示出作為循環(huán)數(shù)量的函數(shù)的PCR熒光曲線?？梢钥闯觯谡麄€寡聚物的一個或多個位置的CBP取代，即使接近5’端，不影響所述探針被聚合酶的5’-核酸酶活性進行5’切割的效率(3’端處的修飾未顯示，這是因為其對5’-核酸酶切割無效果)。此外，包含本發(fā)明的經(jīng)修飾的堿基而不是常規(guī)胞嘧啶堿基的探針與不包含經(jīng)修飾的堿基的探針相比，通常具有更高的對互補靶序列的結(jié)合親合性。實施例7.5’核酸酶PCR探針的性能實施例7描述以下研究，在所述研究中，使用不含有CBP部分的一對正向引物和反向引物(引物P2F和P2R)或者含有1個CBP部分的一對正向引物和反向引物(P1F和P1R)進行5’核酸酶PCR反應(yīng)。圖3顯示利用一系列不同延伸溫度的使用經(jīng)修飾的引物P1F和P1R獲得的PCR曲線?？梢钥闯觯?0℃和63℃的延伸溫度時所述引物表現(xiàn)良好，但是在66℃時PCR效率降低，并且在69℃時不可檢測。這些結(jié)果證明本發(fā)明的經(jīng)修飾的寡聚物是如何能夠表征以確定最佳PCR條件，以及是否應(yīng)該對引物、探針或者需要時的反應(yīng)條件進行進一步修改。也對實施例7中的經(jīng)修飾的寡聚物在不同退火時間相對于未經(jīng)修飾的引物的性能進行評價。圖4A和4B中顯示所獲得的PCR曲線?？梢钥闯觯?jīng)修飾的引物有效地表現(xiàn)為PCR中的聚合酶底物。還將包含CBP部分的寡聚物評價為5’-核酸酶PCR引物。在該研究中，正向引物和反向引物在接近3’端包含單個CBP取代，序列如下：P1F5’-AATTCCTGAAGCTGACAG(CBP)A-3’(SEQIDNO:16)P1R5’-AAATAGCCTCCAGGC(CBP)A-3’(SEQIDNO:17)在一個研究中，在以下條件下使用4種不同的延伸溫度進行5’-核酸酶PCR反應(yīng)：靶標：10,000個拷貝/反應(yīng)；引物濃度–200nM；探針濃度–200nM；第一次變性為在95℃下60秒循環(huán)：退火–在60、63、66或69℃下延伸30秒；在95℃下變性8秒。在圖3中示出作為循環(huán)數(shù)量的函數(shù)的PCR熒光曲線?？梢钥闯?，在60℃和63℃的延伸溫度時所述引物表現(xiàn)良好，但是在66℃時PCR效率降低，并且在69℃時不存在。這些結(jié)果證明本發(fā)明的經(jīng)修飾的寡聚物是如何能夠表征以確定最佳PCR條件，以及需要時是否應(yīng)該進行進一步修改。在第二研究中，使以上經(jīng)修飾的引物以各種不同的退火時間進行5’-核酸酶PCR，并且將結(jié)果與使用相應(yīng)的未經(jīng)修飾的引物獲得的結(jié)果比較，所述未經(jīng)修飾的引物的序列如下所示：P2F5’-AATTCCTGAAGCTGACAGCA-3’(SEQIDNO:18)P2R5’-AAATAGCCTCCAGGCCA-3’(SEQIDNO:19)具體而言，未經(jīng)修飾的正向引物和反向引物以5種不同的退火時間(13、16、20、30和45秒–參見圖4A)進行評價，并且以上所示出的經(jīng)CBP修飾的引物P1F和P1R以7種不同的退火時間(8、10、13、16、20、30和45秒–參見圖4B)進行評價。結(jié)果證明，除了增加雜交親合性之外，所述引物對于DNA聚合酶的引物延伸活性而言是良好的底物。這些結(jié)果證明，對于所述經(jīng)修飾的引物而言，在較短的退火時間時不存在檢測到的“降低(slow-down)”的效果。對于經(jīng)修飾的和未經(jīng)修飾的引物而言，在適當(dāng)?shù)偷耐嘶饻囟认?，擴增曲線閾值循環(huán)(Ct)和EPR對于天然引物是相同的。實施例8.包含CBP部分的PNA寡聚物的合成實施例8提供使用Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂制備包含經(jīng)修飾的和/或未經(jīng)經(jīng)修飾的堿基的PNA寡聚物的合成方法。PNA合成使用來自AppliedBiosystems的Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂(0.16mmol/g)手動進行。經(jīng)Fmoc-保護的單體和HATU獲自PolyOrg,Inc。溶劑獲自EMD。哌啶、TFA、DIEA和間甲酚來自Aldrich。使用之前將樹脂在DCM中膨脹至少2小時，然后用DCM(5x)和DMF(5x)洗滌。合成方法：去保護：在DMF中的20％哌啶，2x5分鐘洗滌：DMF(5x),DMF/DCM(1:1)(5x)預(yù)活化：HATU(4當(dāng)量),DIEA(4.5eq),PNA-單體(1當(dāng)量),DMF,3分鐘偶聯(lián)：30分鐘洗滌：DMF/DCM(1:1)(5x)加帽：5％Ac2O/5％DIEA,10分鐘洗滌：DMF(5x)在室溫下用TFA/間甲酚(9:1)進行90分鐘從固體支持物的切割，然后在Et2O中沉淀。通過離心收集固體，并且重復(fù)Et2O洗滌/離心2次。通過反相HPLC進行純化后，通過ESI(+)質(zhì)譜將PNA表征。實施例9.PNA-DNA嵌合體的合成實施例9提供可以制造PNA-DNA嵌合寡聚物的通用方法，其中，將包含本發(fā)明的經(jīng)修飾的堿基的PNA單體借助于核苷亞磷酰胺或者經(jīng)修飾的PNA單體引入。如之前所報道的(Petraccone等,J.Am.Chem.Soc.,2005,16125-16223)，使用經(jīng)Fmoc保護的PNA單體和核苷亞磷酰胺，經(jīng)由固相策略合成PNA寡聚物和DNA-PNA嵌合體。使用N-Fmoc甘氨酸官能化的Tentagel-OH樹脂與第一PNA單元反應(yīng)，然后與5’-O-DMT-3’-O-(2-氰基乙基)亞磷酰胺鳥苷、胸苷、腺苷和胞苷單元反應(yīng)，從而獲得嵌合體。使嵌合體從固體支持物脫離，并且在55℃用濃氨水去保護12-16小時。將溶液蒸發(fā)以除去氨，并且經(jīng)由制備型反相HPLC分離出產(chǎn)物。實施例10.經(jīng)CBP修飾的PNA與DNA的雜交實施例10描述以下試驗，在所述試驗中，對于已經(jīng)通過實施例8的方法制造并且包含CBP部分的PNA寡聚物確定解鏈溫度。C-PNA與靶DNA的雙鏈體具有47℃的Tm，與之相對，對照雙鏈體具有38.4℃的Tm。這些結(jié)果顯示，與對照DNA寡聚物觀察到的Tm值相比，含有CBP的PNA寡聚物具有較高的Tm值，因此具有較高的結(jié)合親合性。制備具有CBP取代的PNA寡聚物，并將其對互補靶DNA序列的雜交親合性(Tm)與相應(yīng)的未經(jīng)修飾的對照DNA寡聚物的雜交親合性(Tm)進行比較。使用標準解鏈條件(1uM的各寡聚物、3mMMgCl2、15mMKCl、25mMHEPES，pH8)獲得Tm數(shù)據(jù)。使用以下序列：C-PNA5’-CGATACBPTGC-3’(SEQIDNO:20)對照DNA5’-CGATACTGC-3’(SEQIDNO:21)靶DNA5’-TTTGCAGTATCGTTT-3’(SEQIDNO:22)C-PNA與靶DNA的雙鏈體具有47℃的Tm，與之相對，對照雙鏈體具有38.4℃的Tm。因此，經(jīng)修飾的PNA顯示，對于與互補DNA鏈雜交而言，相對于與相應(yīng)的DNA寡聚物(缺乏任何堿基修飾)與相同互補DNA鏈雜交觀察到的Tm，Tm提高約8.6℃。實施例11：核苷合成的通用方法化合物NS1說明包含經(jīng)修飾的堿基的經(jīng)修飾的核苷，所述經(jīng)修飾的堿基含有膦酸酯部分。經(jīng)由Pd(PPh3)4和碘化亞銅(I)催化的偶聯(lián)，然后用25％氨水除去保護基，化合物NS1與化合物M23類似地制備?；衔颪S2說明包含經(jīng)修飾的堿基的經(jīng)修飾的核苷，所述經(jīng)修飾的堿基含有磷酸酯部分。經(jīng)由Pd(PPh3)4和碘化亞銅(I)催化的偶聯(lián)，然后用25％氨水除去保護基，化合物NS2與化合物M23類似地制備。實施例12:合成核苷酸5’-三磷酸酯的通用方法NT1和NT2三磷酸酯從相應(yīng)的5’-DMTr衍生物M23和M5通過下述過程合成：將3’-羥基乙?；缓蟪?’-DMTr基團，并使用Hollenstein所述的方法(HollensteinM.,SynthesisofDeoxynuleosideTriphosphatesthatIncludeProline,Urea,orSulfonamideGroupsandTheirPolymeraseIncorporationintoDNA,Chem.Eur.J.2012,18,13320–13330)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的三磷酸酯?；衔颪T1說明包含經(jīng)修飾的堿基的經(jīng)修飾的核苷酸5’-三磷酸酯，所述經(jīng)修飾的堿基含有磷酸酯部分。化合物NT2說明包含經(jīng)修飾的堿基的經(jīng)修飾的核苷酸5’-三磷酸酯，所述經(jīng)修飾的堿基含有膦酸酯部分。實施例13:序列的合并表以下表4提供如上所述本文制備和使用的序列的合并表。表4序列的合并表雖然以上提供各種實施例和其它信息來解釋權(quán)利要求范圍內(nèi)的各方面，但是基于此類實施例的特定特征和排列不應(yīng)該暗指對權(quán)利要求的限制，因為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用這些實施例來推導(dǎo)各種實施方案。此外，盡管已經(jīng)可以用對結(jié)構(gòu)特征、條件或用途的實例特定的語言描述一些主題，但是應(yīng)該理解的是，權(quán)利要求中限定的主題不必限于其。序列表<110>賽沛<120>經(jīng)修飾的胞嘧啶多核苷酸寡聚物和方法<130>R2097-00376<150>61/972,391<151>2014-03-30<160>22<170>PatentIn版本3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:C1序列<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(7)..(7)<223>CBP部分<400>1tttagacttcttggattt18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:C2序列<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(10)..(10)<223>CBP部分<400>2tttagacttcttggattt18<210>3<211>18<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:C3序列<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(7)..(7)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(10)..(10)<223>CBP部分<400>3tttagacttcttggattt18<210>4<211>12<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:短互補物序列<400>4tccaagaagtct12<210>5<211>18<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:長互補物序列<400>5aaatccaagaagtctaaa18<210>6<211>20<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:F1序列<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(19)..(19)<223>CBP部分<400>6aattcctgaagctgacagca20<210>7<211>17<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:R1序列<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(16)..(16)<223>CBP部分<400>7aaatagcctccaggcca17<210>8<211>22<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:Pf1-C-1序列<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(1)..(1)<223>FAM部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(1)..(1)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(22)..(22)<223>BHQ1部分<400>8ctccgtggccttagctgtgctc22<210>9<211>22<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:Pf1-C-2序列<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(1)..(1)<223>FAM部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(3)..(3)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(22)..(22)<223>BHQ1部分<400>9ctccgtggccttagctgtgctc22<210>10<211>22<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:Pf1-C-3序列<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(1)..(1)<223>FAM部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(4)..(4)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(22)..(22)<223>BHQ1部分<400>10ctccgtggccttagctgtgctc22<210>11<211>22<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:Pf1-C-4序列<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(1)..(1)<223>FAM部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(1)..(1)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(4)..(4)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(22)..(22)<223>BHQ1部分<400>11ctccgtggccttagctgtgctc22<210>12<211>22<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:Pf1-C-5序列<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(1)..(1)<223>FAM部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(4)..(4)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(9)..(9)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(22)..(22)<223>BHQ1部分<400>12ctccgtggccttagctgtgctc22<210>13<211>22<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:Pf1-C-6序列<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(1)..(1)<223>FAM部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(1)..(1)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(4)..(4)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(9)..(9)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(22)..(22)<223>BHQ1部分<400>13ctccgtggccttagctgtgctc22<210>14<211>22<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:Pf1-C-7序列<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(1)..(1)<223>FAM部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(10)..(10)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(15)..(15)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(20)..(20)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(22)..(22)<223>BHQ1部分<400>14ctccgtggccttagctgtgctc22<210>15<211>22<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:Pf1-C-8序列<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(1)..(1)<223>FAM部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(1)..(1)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(4)..(4)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(10)..(10)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(15)..(15)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(20)..(20)<223>CBP部分<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(22)..(22)<223>BHQ1部分<400>15ctccgtggccttagctgtgctc22<210>16<211>20<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:P1F序列<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(19)..(19)<223>CBP部分<400>16aattcctgaagctgacagca20<210>17<211>17<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:P1R序列<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(16)..(16)<223>CBP部分<400>17aaatagcctccaggcca17<210>18<211>20<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:P2F序列<400>18aattcctgaagctgacagca20<210>19<211>17<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:P2R序列<400>19aaatagcctccaggcca17<210>20<211>9<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:C-PNA序列<220><221>經(jīng)修飾的_堿基<222>(6)..(6)<223>CBP部分<400>20cgatactgc9<210>21<211>9<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:對照DNA序列<400>21cgatactgc9<210>22<211>15<212>DNA<213>人工<220><223>人工序列的描述:靶DNA序列<400>22tttgcagtatcgttt15當(dāng)前第1頁1 2 3