技術(shù)領(lǐng)域

本公開的實(shí)施方案包括核酸擴(kuò)增、核酸操作、遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。本公開的實(shí)施方案的領(lǐng)域涉及包括例如來自一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的基因組或轉(zhuǎn)錄組的擴(kuò)增。

發(fā)明背景

出于對單細(xì)胞異質(zhì)性的巨大興趣，人們最近嘗試?yán)萌蚪M擴(kuò)增和穩(wěn)健性(robustness)進(jìn)行單細(xì)胞基因組測序(Navin等人，2011；Fan等人，2011；Lao等人，2008；Hou等人，2012；Cheng等人，2011；Telenius等人,1992；Zhang等人,2006；Zhang等人,1992)。然而，迄今為止，所使用的方法通常都受限于相對較低的覆蓋率。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是對特定區(qū)域的DNA擴(kuò)增的金標(biāo)準(zhǔn)。依賴于使用隨機(jī)引物的指數(shù)擴(kuò)增，基于PCR的全基因組擴(kuò)增方法引入了強(qiáng)的序列依賴性偏差，因此對整個(gè)基因組均一代表是不理想的。已經(jīng)開發(fā)了多重置換擴(kuò)增(MDA)以克服PCR的這些缺點(diǎn)(Dean等人，2002；Dean等人，2001)，但是MDA仍然顯示有不可忽略的偏差。出于這些原因，對允許精確檢測單個(gè)核苷酸變體(SNV)的單個(gè)體類細(xì)胞全基因組測序還沒有可靠的報(bào)道。

為實(shí)現(xiàn)用于單細(xì)胞的全基因組SNV，并且具有可媲美大量測序的精確度，主要的技術(shù)障礙在于現(xiàn)有技術(shù)中在非線性擴(kuò)增中產(chǎn)生并繁衍的擴(kuò)增錯(cuò)誤。在非線性擴(kuò)增中，聚合酶產(chǎn)生的錯(cuò)誤會(huì)在隨后的循環(huán)中以新合成產(chǎn)物用作模板時(shí)被拷貝。對于常規(guī)PCR擴(kuò)增有成千上萬的模板可用于起始，這些錯(cuò)誤不會(huì)引起任何問題，因?yàn)榫唧w拷貝中的每個(gè)隨機(jī)錯(cuò)誤都由大量的其他獨(dú)立拷貝所稀釋。然而，對于單細(xì)胞擴(kuò)增，情況卻并不相同，因?yàn)橐粋€(gè)細(xì)胞只有每個(gè)獨(dú)特染色體的一份拷貝作為模板。在非線性擴(kuò)增中，第一個(gè)循環(huán)中產(chǎn)生的錯(cuò)誤將被半數(shù)的DNA產(chǎn)物所有，而這些錯(cuò)誤將持續(xù)被以類似的百分比拷貝。最終在測序數(shù)據(jù)中，不能將這些錯(cuò)誤與該單細(xì)胞中真正的雜合子變體相區(qū)分。更重要地，這種假陽性率不能通過簡單地增加測序深度而減少。為了克服該技術(shù)問題，需要進(jìn)行線性擴(kuò)增。當(dāng)擴(kuò)增是線性時(shí)，所有DNA產(chǎn)物都直接由原始模板拷貝而來。因此，擴(kuò)增錯(cuò)誤是獨(dú)立產(chǎn)生的，并可在線性擴(kuò)增產(chǎn)物中稀釋。

發(fā)明簡述

本發(fā)明針對的是用于擴(kuò)增大量核酸的系統(tǒng)、方法和組合物。在具體實(shí)施方案中，所述多種核酸是一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或無細(xì)胞材料的完全或部分基因組或者一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或無細(xì)胞材料的轉(zhuǎn)錄組，例如或表觀基因組，即在二硫化物轉(zhuǎn)化后的基因組中的稀有核酸材料，又例如選定的基因組，即染色質(zhì)沉淀后基因組中的稀有核酸材料。所述基因組或轉(zhuǎn)錄組可以來自單細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞，例如兩個(gè)細(xì)胞、三個(gè)細(xì)胞、四個(gè)細(xì)胞、五個(gè)細(xì)胞等。在其中基因組或轉(zhuǎn)錄組或表觀基因組或基因組的靶向區(qū)來自多個(gè)細(xì)胞的實(shí)施方案中，所述多個(gè)細(xì)胞可以是相同的類型、基因型或表型。在其中核酸源自多個(gè)細(xì)胞的情況下，例如，所述細(xì)胞可來自相同來源或來自相同組織。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞是胎兒細(xì)胞、癌細(xì)胞、疑似癌性細(xì)胞等。無細(xì)胞核酸材料包括存在于血液或其他體液中的核酸。

本公開的實(shí)施方案一般涉及用于擴(kuò)增基因組序列，如單細(xì)胞或任選多細(xì)胞的全基因組的方法和組合物。本公開的實(shí)施方案一般還涉及用于擴(kuò)增部分或全部轉(zhuǎn)錄組，如單細(xì)胞或任選多細(xì)胞的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的方法和組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識到本公開的方法允許從基因組或轉(zhuǎn)錄組中對具體核酸進(jìn)行線性擴(kuò)增，其中本發(fā)明的所得產(chǎn)物是大量擴(kuò)增子(代表部分或全部的各自基因組或轉(zhuǎn)錄組)，且至少在一些情況下線性產(chǎn)生的擴(kuò)增子會(huì)進(jìn)一步以線性或非線性方式(如通過PCR)得到擴(kuò)增。

本公開的實(shí)施方案包括用于在整個(gè)基因組上以高均一性和高保真度對單細(xì)胞(或任選多細(xì)胞)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增的方法。此類方法允許例如拷貝數(shù)變異(CNV)和單核苷酸變異(SNV)的精確檢測，并且任選地例如通過標(biāo)準(zhǔn)高通量測序平臺(tái)或微陣列或基于PCR基因分型按照本發(fā)明的方法來檢測CNV或SNV的存在。

本公開的方法的實(shí)施方案提供兩隊(duì)本領(lǐng)域中當(dāng)前使用的方法的顯著改進(jìn)。例如，通過從覆蓋全基因組的原始單細(xì)胞DNA片段的線性擴(kuò)增(即，從單細(xì)胞DNA模板產(chǎn)生擴(kuò)增子的獨(dú)立拷貝)進(jìn)行SNV檢測的精確度相對于本領(lǐng)域中的方法得到大大提高。線性擴(kuò)增允許對擴(kuò)增錯(cuò)誤的有效過濾，因此實(shí)現(xiàn)例如與用于SNP檢測的大量測序相當(dāng)?shù)木取１疚奶峁┑姆椒ǖ木唧w實(shí)施方案為每個(gè)獨(dú)立拷貝的擴(kuò)增子引入“條形碼”。該條形碼允許確定在基因組上的每個(gè)基因座的假陽性率。

本文提供了可用于對提取自一個(gè)單細(xì)胞的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增的方法，盡管在一些情況下DNA可提取自多于一個(gè)細(xì)胞。因此，至少某些方法允許對一個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行均一的全基因組擴(kuò)增，其允許通過標(biāo)準(zhǔn)高通量測序平臺(tái)精確檢測拷貝數(shù)變異(CNV)和單核苷酸變異(SNV)。

本公開的實(shí)施方案允許使用精確的線性擴(kuò)增方法，其將為一個(gè)且僅一個(gè)細(xì)胞提供精確的SNV檢測。在特定情況下，不需要親緣細(xì)胞來過濾假陽性。本公開的實(shí)施方案對本領(lǐng)域的一個(gè)改進(jìn)在于允許使用組織學(xué)臨床樣品作為待擴(kuò)增核酸的細(xì)胞來源。

本文提供了方法用于通過將不同的DNA片段分離成數(shù)百萬個(gè)小體積反應(yīng)區(qū)室并在無不同擴(kuò)增子之間的干擾和競爭下進(jìn)行擴(kuò)增而消除擴(kuò)增中的偏差。因此，在具體實(shí)施方案中，單個(gè)擴(kuò)增子存在于反應(yīng)孔中用于例如通過PCR而擴(kuò)增。在某些方面，反應(yīng)區(qū)室中的反應(yīng)體積為飛升至納升的體積。

本文提供的方法的實(shí)施方案通過在微流體裝置中分開的反應(yīng)區(qū)室中進(jìn)行每個(gè)DNA片段的擴(kuò)增或通過例如乳化劑產(chǎn)生的分離反應(yīng)液滴而顯著改善均一性。在一些情況下，在具有小至飛升體積的數(shù)千或更多個(gè)反應(yīng)區(qū)室中進(jìn)行各自的擴(kuò)增。在具體方面，擴(kuò)增在每個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)中飽和，非線性擴(kuò)增(測序依賴性PCR偏差或MDA的擴(kuò)增偏差)得到最小化。

在具體實(shí)施方案中，所述方法使用的聚合酶具有強(qiáng)的置換強(qiáng)度以及高的與引物-DNA復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，有從一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞線性產(chǎn)生擴(kuò)增子的方法，包括以下步驟：將來自所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的核酸接觸第一大量引物和包含鏈置換活性的聚合酶，所述接觸發(fā)生于0℃至約35℃的溫度范圍條件下，其中所述引物與所述核酸退火，且所述引物通過聚合酶得到延伸，其中所述第一大量引物具有以下特征：a)富含40％-60％的G或富含40％-60％的C；及b)包含限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)，從而產(chǎn)生包含引物退火的核酸模板的混合物；對引物退火的核酸模板進(jìn)行兩輪或多輪延伸、解鏈和退火步驟，由此產(chǎn)生核酸模板、線性產(chǎn)生的半擴(kuò)增子和非線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子的混合物；將所述混合物置于能使全擴(kuò)增子的兩個(gè)末端能夠彼此退火的條件下，從而產(chǎn)生成環(huán)的全擴(kuò)增子；將所述成環(huán)的全擴(kuò)增子接觸限制性內(nèi)切核酸酶，從而使得全擴(kuò)增子不能與第一大量引物或第二大量引物退火，其中第二大量引物富含40％-60％的G或C；以及使第一大量引物或第二大量引物與混合物中剩余的線性產(chǎn)生的半擴(kuò)增子退火并延伸，其中所述退火和延伸在核酸不會(huì)進(jìn)一步解鏈的情況下發(fā)生，由此產(chǎn)生線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包含使線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的方法中所用的聚合酶缺乏外切核酸酶活性。在具體實(shí)施方案中，混合步驟中的接觸發(fā)生于低于60℃的溫度下。在一些情況下，所述方法另外提供了包括從一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞獲得核酸，例如通過裂解細(xì)胞和從細(xì)胞提取合適。在具體實(shí)施方案中，所述核酸包括基因組DNA。在一些情況下，所述核酸包括RNA且所述方法進(jìn)一步包括從RNA產(chǎn)生cDNA的步驟。

在本公開的實(shí)施方式中，可使用特定的引物，至少包括第一或第二大量引物。在具體實(shí)施方案中，第一、第二或二者的引物包含下式：

X_nY_mZ_p，

其中n大于2且X為富含40％-60％的G或富含40％-60％的C，其中Y是任意核苷酸并且m為3-8個(gè)核苷酸，其中當(dāng)X_n是富含G時(shí)Z是G或者當(dāng)X_n是富含C時(shí)Z是C，p是2-4個(gè)核苷酸。在具體情況下，m為5個(gè)核苷酸；p是3個(gè)核苷酸；n是20-40個(gè)核苷酸；n是25-35個(gè)核苷酸；或n是24-28個(gè)核苷酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，聚合酶是Bst大片段或pyrophage 3173聚合酶。在特定情況下，引物退火的核酸模板的延伸步驟在30℃至65℃的溫度范圍內(nèi)發(fā)生。在具體實(shí)施方案中，在引物退火的核酸模板的延伸之后，核酸在至少90℃的溫度下解鏈。在某些情況下，在核酸解鏈后，將核酸冷卻至低于引物解鏈溫度的溫度，并加入可熱滅活的聚合酶。在一些情況下，在加入可熱滅活的聚合酶之后，在低于PCR引物的Tm的溫度和高于PCR引物的Tm的溫度之間，例如在58℃-67℃的溫度進(jìn)行熱循環(huán)。在一些情況下，熱循環(huán)可以包括10-30個(gè)循環(huán)。在具體實(shí)施方案中，對聚合酶進(jìn)行熱滅活，隨后加入限制性內(nèi)切核酸酶。

在一些實(shí)施方案中，對有引物退火的核酸模板進(jìn)行三至十個(gè)連續(xù)的延伸、解鏈和退火步驟。在某些方面，限制性內(nèi)切核酸酶能夠在超過50℃的溫度下消化核酸，例如BtsCI/BseGI。在某些實(shí)施方案中，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)對線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子進(jìn)行擴(kuò)增。在具體實(shí)施方案中，至少大多數(shù)線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子是彼此分開的。在特定方面，至少大多數(shù)線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子各自被置于分開的容器中，例如微孔基底的孔中。在某些實(shí)施方案中，這些孔包含一種或多種擴(kuò)增反應(yīng)試劑。

在具體實(shí)施方案中，對分開包含的擴(kuò)增子進(jìn)行擴(kuò)增，例如進(jìn)行PCR或LAMP。在一些實(shí)施方案中，對線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子經(jīng)受尿嘧啶-DNA-糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶內(nèi)切核酸酶VIII混合物的作用，然后經(jīng)受S1核酸酶或T4聚合酶的作用。在具體實(shí)施方案中，對線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子進(jìn)行測序或進(jìn)行文庫構(gòu)建。在具體實(shí)施方案中，測定一個(gè)或多個(gè)線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子的某個(gè)核苷酸或核苷酸序列，例如代表核酸突變的擴(kuò)增子中突變。在具體實(shí)施方案中，所述突變是疾病相關(guān)突變。在具體實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞來自胎兒、嬰兒、兒童或成人。所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞可以固定于組織學(xué)制備物中。然而，在一些情況下，所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞是新鮮的。所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞可以從具有醫(yī)學(xué)病況或懷疑患醫(yī)學(xué)病況(例如遺傳性疾病)的個(gè)體獲得。在特定情況下，所述醫(yī)學(xué)病況包括癌癥。

在一個(gè)實(shí)施方案中，一種方法測定來自個(gè)體的核酸從而鑒定個(gè)體的醫(yī)學(xué)病況或鑒定個(gè)體具有所述醫(yī)學(xué)病況的風(fēng)險(xiǎn)，包括將通過本公開的方法從個(gè)體樣品所得的線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子的部分或全部序列與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對的步驟。在具體實(shí)施方案中，所述核酸包括基因組DNA。在一些情況下，所述核酸包括從來自樣品的RNA產(chǎn)生的cDNA。標(biāo)準(zhǔn)品可以包含來自個(gè)體正常細(xì)胞的核酸，例如來自一個(gè)或多個(gè)其他個(gè)體的正常細(xì)胞的核酸。在具體實(shí)施方案中，來自個(gè)體樣品中的細(xì)胞中核酸的表達(dá)水平以線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子的數(shù)目表示。在一些情況下，比較步驟包括將來自個(gè)體樣品中的細(xì)胞的至少一些線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子的數(shù)目與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較。在具體實(shí)施方案中，所述至少一些線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子包含一個(gè)或多個(gè)具體基因。在某些實(shí)施方案中，比較步驟包括測定線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子與標(biāo)準(zhǔn)品相比其中一種或多種特定核苷酸是否存在

前文已經(jīng)相當(dāng)廣泛地概述了本發(fā)明的特征和技術(shù)優(yōu)勢，以便可以更好地理解下文對本發(fā)明的詳細(xì)描述。下文將描述形成本發(fā)明權(quán)利要求的主題的本發(fā)明的附加特征和優(yōu)勢。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，所公開的概念和具體實(shí)施方式可以容易地用作修改或設(shè)計(jì)用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的相同目的的其他結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該認(rèn)識到，這樣的等價(jià)的構(gòu)建不脫離如所附權(quán)利要求中闡述的本發(fā)明的精神和范圍。被認(rèn)為是本發(fā)明特征的新穎特征當(dāng)結(jié)合附圖考慮時(shí)，將從下面的描述中更好地得到理解，包括其組織和操作方法，以及進(jìn)一步的目的和優(yōu)點(diǎn)。然而，應(yīng)當(dāng)清楚地理解，每個(gè)附圖僅僅是為了說明和描述的目的，而不旨在作為限制本發(fā)明的定義。

附圖簡述

為了更完全地理解本發(fā)明，參考以下結(jié)合附圖的描述，其中：

圖1示例顯示了一種已知的稱為基于多重退火和成環(huán)的擴(kuò)增循環(huán)(MALBAC)的擴(kuò)增形式。低偏差單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增(WGA)。(左)MALBAC工作流程。將基因組DNA解鏈為單鏈DNA分子后，裂解單細(xì)胞。在附加的PCR擴(kuò)增前進(jìn)行MALBAC預(yù)擴(kuò)增。首先，MALBAC引物隨機(jī)退火于單鏈DNA分子上，并由具有置換活性的聚合酶延伸，產(chǎn)生半擴(kuò)增子。在下一個(gè)循環(huán)中，生成兩端都具有互補(bǔ)序列的單鏈擴(kuò)增子。3'末端在中等溫度下通過形成環(huán)而得到保護(hù)，這防止嵌合體的形成和進(jìn)一步的擴(kuò)增。將上述循環(huán)重復(fù)5次以產(chǎn)生具有重疊基因組覆蓋的擴(kuò)增子，其在兩端都含有通用互補(bǔ)序列用于隨后的PCR擴(kuò)增；

圖2提供了本發(fā)明擴(kuò)增方案的一個(gè)實(shí)施方案的概況。在該方案中，不使用在MALBAC中產(chǎn)生的全擴(kuò)增子用于PCR擴(kuò)增。相反，例如通過消化移除成環(huán)的全擴(kuò)增子的引物序列。之后，可以對于從原始基因組模板線性產(chǎn)生的半擴(kuò)增子線性地再產(chǎn)生全擴(kuò)增子。這種完全線性擴(kuò)增的全擴(kuò)增子用于下列PCR擴(kuò)增，例如；

圖3示出條形碼測序的概況。測序的讀數(shù)是對齊的。有兩種可能的雜合子突變，由紅色和藍(lán)色點(diǎn)(在黑白圖中，它們分別是各欄中左邊和右邊的點(diǎn))表示。在左側(cè)，測序讀數(shù)不具有條形碼，因此得到兩種突變。相比較，右側(cè)的測序讀出具有條形碼α、β、γ和ζ，其代表在線性擴(kuò)增中生成的獨(dú)立DNA拷貝。顯然，相比于由藍(lán)色點(diǎn)標(biāo)記的突變(由具有兩個(gè)不同條形碼的讀數(shù)表示)，由紅色點(diǎn)標(biāo)記的突變是明顯的假陽性(由僅有一個(gè)條形碼的讀數(shù)表示)；

圖4示出了線性產(chǎn)生半擴(kuò)增子的實(shí)例。

圖5示出了線性產(chǎn)生全擴(kuò)增子的實(shí)例。

圖6提供了微滴或孔中全基因組擴(kuò)增的實(shí)例。

圖7展示了使用具體酶在引物中移除引物序列。

圖8：早期腫瘤發(fā)展概況。在前體中，可以預(yù)期突變數(shù)目有限。在發(fā)育不良中，可以預(yù)期，與瘤形成相比，細(xì)胞積累了顯著數(shù)量的突變和高程度的基因組異質(zhì)性。

圖9：產(chǎn)率和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的線性關(guān)系。該數(shù)據(jù)表明線性擴(kuò)增的成功。x軸表示預(yù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。y軸表示qPCR測量的擴(kuò)增子產(chǎn)率。線性關(guān)系確認(rèn)達(dá)到了線性擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)步驟按照實(shí)施例1中的描述進(jìn)行。

圖10：該圖表示例顯示了線性擴(kuò)增后的步驟的實(shí)例。線性產(chǎn)生的DNA半擴(kuò)增子或全擴(kuò)增子被分到多個(gè)管中。因此在不同管中擴(kuò)增獨(dú)立的線性拷貝。使用來自各個(gè)管的擴(kuò)增DNA構(gòu)建測序文庫，并用下一代測序儀進(jìn)行測序。下圖示出測序數(shù)據(jù)的快照結(jié)果。可以看到各個(gè)染色體間都有類似的平均覆蓋。該數(shù)據(jù)包括六個(gè)文庫，其由線性擴(kuò)增的擴(kuò)增子分入的16管中的6個(gè)而構(gòu)建。

圖11：下一代測序結(jié)果表明線性擴(kuò)增允許檢測到生殖系/體細(xì)胞突變并鑒定出擴(kuò)增錯(cuò)誤。對其作圖示出了來自測序?qū)嶒?yàn)的讀數(shù)，如圖10中所描述。真突變和假陽性讀數(shù)的典型形式在作圖中表示。右圖中的突變顯示在與已有數(shù)據(jù)庫相比而測序的細(xì)胞中檢測到從頭開始的突變。

發(fā)明詳述

I.定義

如本文所使用的，術(shù)語“半擴(kuò)增子”指代僅在一個(gè)末端由引物序列延伸而生成的多核苷酸。其是全擴(kuò)增子的半產(chǎn)物。

如本文所使用的，術(shù)語“擴(kuò)增子”指代用作PCR反應(yīng)中模板的多核苷酸。

如本文所使用的，術(shù)語“全擴(kuò)增子”指代在兩個(gè)末端都有(彼此不同或互補(bǔ))的引物序列，容易進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

如本文所使用的，術(shù)語“線性擴(kuò)增”表示直接從原始模板拷貝的擴(kuò)增產(chǎn)物，所以DNA產(chǎn)物的增加是線性的。相反，對于非線性擴(kuò)增，產(chǎn)物拷貝自原始模板和拷貝而來的產(chǎn)物二者。例如PCR反應(yīng)就是一種典型的非線性擴(kuò)增，其中產(chǎn)物以指數(shù)形式增加。在特定方面，特定模板的線性擴(kuò)增被限定為大量的模板拷貝中的每份(或大部分)特定模板的拷貝都是由該特定模板直接產(chǎn)生。在特定模板的非線性擴(kuò)增中，模板的拷貝可由特定模板的另一份拷貝產(chǎn)生。

II.通用實(shí)施方案

本公開的實(shí)施方案提供了用于從一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增部分或全部核酸的擴(kuò)增方法。在具體方面，所述核酸是細(xì)胞的部分或全部基因組或者細(xì)胞的部分或全部mRNA，由逆轉(zhuǎn)錄自mRNA的cDNA表示。這些擴(kuò)增方法生成線性產(chǎn)生的半擴(kuò)增子和非線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子，隨后非線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子幾乎都用生物素化的PCR引物轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA，然后通過鏈霉親和素磁珠反應(yīng)提取，或在方法的隨后步驟中有效地從沉淀物中移除(例如通過使其不能由具體一組引物退火)，其后線性產(chǎn)生的半擴(kuò)增子經(jīng)過退火和延伸步驟，而不經(jīng)過解鏈步驟，從而產(chǎn)生線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子。然后任選地解鏈所述線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子并進(jìn)行其他方法，如線性或非線性擴(kuò)增(例如通過PCR)。

根據(jù)本公開的某些方面，反應(yīng)混合物中來自單細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞的DNA由至少一種DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。

根據(jù)一個(gè)方面，單細(xì)胞核酸擴(kuò)增或多個(gè)細(xì)胞核酸擴(kuò)增之前將來自樣品的雙鏈DNA變性至允許引物退火于DNA的單鏈狀態(tài)。隨后，反應(yīng)溫度降低至允許第一種引物3’末端隨機(jī)核苷酸退火至DNA形成雜交雙螺旋的溫度。雜交雙螺旋形成后，在孵育時(shí)期內(nèi)反應(yīng)混合物中存在的或此時(shí)加入的一種或多種DNA聚合酶從第一種引物的3’末端延伸互補(bǔ)DNA鏈。DNA聚合酶可包含或不含5’-3’外切核酸酶活性或鏈置換活性。

圖1示出一種稱為MALBAC的在先技術(shù)方法的概況，本發(fā)明是對其的改進(jìn)。裂解單細(xì)胞，接著將基因組DNA解鏈成單鏈DNA分子。在附加的PCR擴(kuò)增前進(jìn)行MALBAC預(yù)擴(kuò)增。首先，MALBAC引物隨機(jī)退火至單鏈DNA分子上并由具有置換活性的聚合酶進(jìn)行延伸，形成半擴(kuò)增子。在下一個(gè)循環(huán)，生成兩端都有互補(bǔ)序列的單鏈擴(kuò)增子。3'末端在中等溫度下通過形成環(huán)而得到保護(hù)，這防止嵌合體的形成和進(jìn)一步的擴(kuò)增。將上述循環(huán)重復(fù)約(例如)5次以產(chǎn)生具有重疊基因組覆蓋的擴(kuò)增子，其在兩端都含有通用互補(bǔ)序列用于隨后的PCR擴(kuò)增。

本領(lǐng)域的MALBAC預(yù)擴(kuò)增不是完全線性的。在MALBAC預(yù)擴(kuò)增中，半擴(kuò)增子直接拷貝自原始DNA模板，因此其是線性產(chǎn)生的。然而，半擴(kuò)增子在接下來的擴(kuò)增循環(huán)中被用作模板。例如，在第一個(gè)循環(huán)中產(chǎn)生的半擴(kuò)增子被用于接下來的五個(gè)循環(huán)中；在第二個(gè)循環(huán)中產(chǎn)生的半擴(kuò)增子被用于接下來的四個(gè)循環(huán)中，等等。在擴(kuò)增旗艦，如果聚合酶在第一個(gè)循環(huán)中在半擴(kuò)增子中產(chǎn)生錯(cuò)誤，錯(cuò)誤便在接下來的擴(kuò)增循環(huán)中拷貝五次。由于這個(gè)擴(kuò)增錯(cuò)誤占據(jù)最終讀數(shù)中的30％，因此其可能被認(rèn)為是突變。因此，需要測序例如至少三個(gè)親緣細(xì)胞得到精確的單個(gè)核苷酸變體(SNV)結(jié)果。

為了克服這種技術(shù)上產(chǎn)生的變化性，本公開的實(shí)施方案提供了實(shí)現(xiàn)真正的線性預(yù)擴(kuò)增的新過程。因?yàn)榘霐U(kuò)增子是線性產(chǎn)生的，所以使這些半擴(kuò)增子線性地?zé)o失真地拷貝為全擴(kuò)增子是有用的。其實(shí)現(xiàn)后將提供完全線性的擴(kuò)增方案。為了實(shí)現(xiàn)該目的，本公開的實(shí)施方案包括圖2所示的內(nèi)容；預(yù)擴(kuò)增后，不采取(例如)下游PCR擴(kuò)增，可以使用合適的限制酶切割成環(huán)的全擴(kuò)增子中的引物序列區(qū)域。也可以用生物素化的PCR引物將全擴(kuò)增子轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA，然后通過鏈霉親和素磁珠從反應(yīng)中提取。同時(shí)，單鏈的半擴(kuò)增子保持完整。在隨后的步驟中，可以滅活限制酶，并立即由半擴(kuò)增子重新產(chǎn)生新的全擴(kuò)增子以保證線性代表(圖2)?？梢酝ㄟ^一輪或多輪退火和延伸步驟再產(chǎn)生全擴(kuò)增子。或者，半擴(kuò)增子可以有尾巴，并且尾部區(qū)域可以與新的引物雜交以產(chǎn)生全擴(kuò)增子。

因此，本發(fā)明的實(shí)施方案包括從一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞線性擴(kuò)增核酸的方法。所述方法在一些方面由提供的核酸樣品開始，盡管在一些情況下所述核酸必須(例如通過常規(guī)方法)獲自所述細(xì)胞。在擴(kuò)增DNA時(shí)，將從細(xì)胞提取的全部核酸經(jīng)由RNA酶處理。當(dāng)擴(kuò)增(以來自mRNA的cDNA形式的)轉(zhuǎn)錄組時(shí)，將所述全部核酸在mRNA的逆轉(zhuǎn)錄之前經(jīng)由DNA酶處理。來自一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的核酸與第一大量引物接觸且所述細(xì)胞還與包含鏈置換活性的聚合酶接觸；這一步驟例如在溫度范圍0℃至約30℃的條件下發(fā)生。在這一步驟中，引物與核酸退火，且引物通過聚合酶得到延伸。在特定實(shí)施方案中，第一大量引物富含40％-60％的G或富含40％-60％的C并且還包含限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。當(dāng)引物接觸核酸時(shí)，生成包含引物退火的核酸模板的混合物。然后使引物退火的核酸模板進(jìn)行兩輪或多輪的延伸、解鏈和退火步驟，且這些步驟產(chǎn)生核酸模板、線性產(chǎn)生的半擴(kuò)增子和非線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子的混合物。將所述混合物暴露于使得全擴(kuò)增子的兩個(gè)末端能夠彼此退火的條件下，從而產(chǎn)生成環(huán)的全擴(kuò)增子。將所述成環(huán)的全擴(kuò)增子隨后接觸能夠消化成環(huán)的全擴(kuò)增子的退火末端的限制性內(nèi)切核酸酶。這樣做使得全擴(kuò)增子不再能夠由至少某些引物退火，包括第一大量引物或第二批大量引物，其中第二大量引物富含40％-60％的G或C。留在混合物中的線性產(chǎn)生的半擴(kuò)增子可由第一大量引物或第二批大量引物退火并延伸。所述退火和延伸在核酸不會(huì)進(jìn)一步解鏈的情況下發(fā)生，由此產(chǎn)生線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子。在一些情況下，所述線性產(chǎn)生的全擴(kuò)增子被進(jìn)一步擴(kuò)增例如通過線性或者非線性方法，包括例如標(biāo)準(zhǔn)PCR方法。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以實(shí)現(xiàn)用于單細(xì)胞全基因組(或轉(zhuǎn)錄組)擴(kuò)增的第一個(gè)精確線性擴(kuò)增方法。對于單細(xì)胞SNV(例如)檢測通過本創(chuàng)新所達(dá)到的靈敏度和精確度，本公開的方法和組合物可以在生物學(xué)和/或臨床研究和用途中產(chǎn)生廣泛的影響。

在本公開的實(shí)施方案中，提供了能夠有效地移除預(yù)先存在的引物以允許半擴(kuò)增子的有效加尾的方法。如果引物沒有得到有效消化，殘留引物的加尾與半擴(kuò)增子的加尾相競爭導(dǎo)致在隨后步驟中的擴(kuò)增失敗。因此，在特定實(shí)施方案中，提供了預(yù)先存在的引物的有效消化，因此實(shí)現(xiàn)了全擴(kuò)增子的成功產(chǎn)生和擴(kuò)增。

可以使用T4聚合酶或在低于(30℃或更低)的低溫下具有外切核酸酶活性的其它聚合酶和ExoI外切核酸酶或僅消化單鏈DNA的其它外切核酸酶。酶可以被加熱滅活。加尾研究可以用高濃度的C堿基進(jìn)行。在特定實(shí)施方案中，dC加尾的區(qū)域可與GAT5N3G引物雜交而僅產(chǎn)生全擴(kuò)增子。

III.條形碼

盡管圖2的方案示意線性的，在一些實(shí)施方案中，也可能有其中并非所有半擴(kuò)增子都有效拷貝成全擴(kuò)增子的情況，例如在最后幾個(gè)循環(huán)中。作為該方面的結(jié)果，至少在一些情況下，可能有有限數(shù)目的獨(dú)立全擴(kuò)增子。如果該數(shù)目小于(例如)四個(gè)拷貝，則仍然難以區(qū)分真實(shí)突變和擴(kuò)增錯(cuò)誤。在具體方面，需要具有原始模板的足夠數(shù)量獨(dú)立拷貝以稀釋最終讀數(shù)呈現(xiàn)中的擴(kuò)增錯(cuò)誤。為了解決這個(gè)問題，還可以向引物中引入隨機(jī)的“條形碼”(具有可變長度的隨機(jī)DNA序列(例如NNNNN，其中N表示四個(gè)核苷酸的混合物))，其將索引每個(gè)線性擴(kuò)增的半擴(kuò)增子并將每個(gè)全擴(kuò)增子登記到相應(yīng)的半擴(kuò)增子上(圖3)。通過用條形碼對每個(gè)讀數(shù)進(jìn)行索引，可以評估讀數(shù)是否是線性分布的。在有殘留非線性的情況下，可以使用條形碼鑒定擴(kuò)增錯(cuò)誤并改進(jìn)SNV結(jié)果的準(zhǔn)確度，如圖3所示。

IV.本公開方法的示例性應(yīng)用

本公開方法可在研究、臨床和/或其它應(yīng)用中使用。在具體的實(shí)施方案中，本公開的方法被用于例如對個(gè)體的一種或多種療法的診斷和/或預(yù)后和/或監(jiān)測、微生物的宏觀基因組分析和法醫(yī)DNA測試。

在本公開的一個(gè)或多個(gè)方法的應(yīng)用的一個(gè)實(shí)例中，所述方法被用于測定來自個(gè)體的核酸的含量或表達(dá)水平中一種或多種變化；所述變化可以是相對于已知的標(biāo)準(zhǔn)品，例如，如具體核酸的對應(yīng)野生型序列。含量的變化可以包含一個(gè)或多個(gè)相比野生型的核苷酸差異，如置換、刪除、倒置，等等。表達(dá)的變化可包含具體相比于某個(gè)具體的已知或確定的標(biāo)準(zhǔn)的正常表達(dá)水平的上調(diào)或下調(diào)。所述標(biāo)準(zhǔn)品可包含已知基因型和/或表型正常細(xì)胞中的正常核酸含量或表達(dá)水平。

在特定的情況下，要測定的核酸獲自來自個(gè)體的樣品，該個(gè)體患醫(yī)學(xué)病況或懷疑患醫(yī)學(xué)病況或有患醫(yī)學(xué)病況的風(fēng)險(xiǎn)或正在接受針對醫(yī)學(xué)病況的治療。所述樣品可以為任意種類，只要能直接或間接從來自樣品的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中獲得核酸即可。在具體的實(shí)施方案中，核酸獲自來自個(gè)體的樣品中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。所述樣品可以是血液、組織、毛發(fā)、活檢標(biāo)本、尿液、乳頭抽吸物、羊水、面頰刮屑、糞便物、或胚胎。

從所述個(gè)體獲得適當(dāng)?shù)臉悠?，并可由獲得樣品的個(gè)體直接或間接實(shí)行本公開的方法，或者可由另一方或多方實(shí)行所述方法。

A.遺傳檢測

在具體應(yīng)用中，期望的是獲知來自個(gè)體的樣品中的一個(gè)或多個(gè)具體核酸的序列。所述個(gè)體可以是任何年齡。所述個(gè)體可以是進(jìn)行常規(guī)檢測，或處于某一具體期望或醫(yī)學(xué)原因而進(jìn)行測試。所述個(gè)體可能懷疑患某具體醫(yī)學(xué)病況，例如由于具有一種或多種與所述醫(yī)學(xué)病況相關(guān)的癥狀和/或具有與所述醫(yī)學(xué)病況相關(guān)的個(gè)體或家族史。所述個(gè)體可能有患某醫(yī)學(xué)病況的風(fēng)險(xiǎn)，如具有所述醫(yī)學(xué)病況的家族病史或具有所述醫(yī)學(xué)病況的一種或多種已知的風(fēng)險(xiǎn)因素，如高膽固醇之于心臟疾病，吸煙之于多種醫(yī)學(xué)病況，高血壓之于心臟疾病或中風(fēng)，具有與所述醫(yī)學(xué)病況相關(guān)的遺傳標(biāo)志物，等等。

在特定的情況下，所述個(gè)體是胎兒，并且該胎兒可被或不被懷疑具有某一具體核酸序列或核酸表達(dá)相比野生型有變化，這種序列內(nèi)容或表達(dá)變化與醫(yī)學(xué)病況相關(guān)。在一些情況下，盡管所述胎兒可能出于常規(guī)目的需要進(jìn)行測試，但該胎兒由于例如家族史或環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)(即輻射)或高齡妊娠，而具有某一具體醫(yī)學(xué)病況的風(fēng)險(xiǎn)。在那些其中期望從胎兒得知具體序列內(nèi)容或表達(dá)水平的情況下，采集包含一個(gè)或多個(gè)胎兒細(xì)胞的樣品。所述樣品可以來自胎兒的活檢標(biāo)本，盡管在具體情況下，樣品是羊水或母體血液或發(fā)育早期的胚胎。

在本公開的一方面，從懷孕母親獲得羊水并從中分離一個(gè)或多個(gè)胎兒細(xì)胞。所述胎兒細(xì)胞分離可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行，如通過使用胎兒細(xì)胞表面的標(biāo)志物區(qū)分胎兒細(xì)胞和母體細(xì)胞。三種不同類型的胎兒細(xì)胞可存在于母體循環(huán)中：滋養(yǎng)層細(xì)胞、白細(xì)胞和胎兒紅細(xì)胞(有核紅細(xì)胞)。最可能富集的細(xì)胞是胎兒紅細(xì)胞，在某些實(shí)施方案中其可通過尺寸色譜柱鑒定，隨后進(jìn)行CD71-抗體染色或ε球蛋白鏈免疫分型，然后基于熒光強(qiáng)度進(jìn)行掃描或分選而鑒定。

一旦分離出胎兒細(xì)胞，即從中提取核酸，例如通過本領(lǐng)域常規(guī)方法。對來自胎兒細(xì)胞核酸使用本公開的方法以產(chǎn)生線性生成的擴(kuò)增子，其覆蓋至少部分、大部分或全部的所述胎兒細(xì)胞的基因組。在線性擴(kuò)增后，可進(jìn)一步擴(kuò)增擴(kuò)增子的一個(gè)或多個(gè)序列，也可對其測序，至少部分測序，或可實(shí)施微陣列技術(shù)。在特定的實(shí)施方案中，例如測定了SNV或CNV，且測定結(jié)果被用于確定相應(yīng)的胎兒是否患具體醫(yī)學(xué)病況或是否懷疑患具體醫(yī)學(xué)病況。在特定情況下，例如可對胎兒進(jìn)行所述醫(yī)學(xué)病況的治療或可對其使用防止或延遲所述醫(yī)學(xué)病況發(fā)病的方法，且這可在子宮內(nèi)和/或分娩后進(jìn)行。

雖然可對胎兒樣品測定SNV或CNV的存在情況(其中任一可為疾病相關(guān)的或?qū)е录膊〉?，在具體實(shí)施方案中對胎兒樣品測定與任意具體醫(yī)學(xué)病況相關(guān)的遺傳突變?？蓽y定的與產(chǎn)前醫(yī)學(xué)病況相關(guān)的基因?qū)嵗ㄒ韵轮械囊粋€(gè)或多個(gè)：ACAD8、ACADSB、ACSF3、C7orf10、IFITM5、MTR、CYP11B1、CYP17A1、GNMT、HPD、TAT、AHCY、AGA、PLOD2、ATP5A1、C12orf65、MARS2、MRPL40、MTFMT、SERPINF1、FARS2、ALPL、TYROBP、GFM1、ACAT1、TFB1M、MRRF、MRPS2、MRPS22、MRPL44、MRPS18A、NARS2、HARS2、SARS2、AARS2、KARS、PLOD3、FBN1、FKBP10、RPGRIP1、RPGR、DFNB31、GPR98、PCDH15、USH1C、CERKL、CDHR1、LCA5、PROM1、TTC8、MFRP、ABHD12CEP290、C8orf37、LEMD3、AIPL1、GUCY2D、CTSK、RP2、IMPG2、PDE6B、RBP3、PRCD、RLBP1、RGR、SAG、FLVCR1、ZNF513、MAK、NDUFB6、TMLHE、ALDOA、PGM1、ENO3、LARS2、ATP7A、ATP7B、TNFRSF11B、LMBRD1、MTRR、FAM123B、FAM20C、ANKH、TGFB1、SOST、TNFRSF11A、CA2、OSTM1、CLCN7、PPIB、TCIRG1、SLC39A13.COL1A2、TNFSF11、SLC34A1、NDUFAF5、FOXRED1、NDUFA2、NDUFA8、NDUFA10、NDUFA11、NDUFA13、NDUFAF3、SP7、NDUFS1、NDUFV3、NUBPL、TTC19、UQCRB、UQCRQ、COX4I1、COX4I2、COX7A1、TACO1、COL3A1、SLC9A3R1、CA4、FSCN2、BCKDHA、GUCA1B、KLHL7、IMPDH1、PRPF6、PRPF31、PRPF8、PRPF3、ROM1、SNRNP200、RP9、APRT、RD3、LRAT、TULP1、CRB1、SPATA7、USH1G、ACACB、BCKDHB、ACACA、TOPORS、PRKCG、NRL、NR2E3、RP1、RHO、BEST1、SEMA4A、RPE65、PRPH2、CNGB1、CNGA1、CRX、RDH12、C2orf71、DHDDS、EYS、IDH3B、MERTK、PDE6A、FAM161A、PDE6G、TYMP(ECGF1)、POLG(POLG1、POLGA)、TK2、DGUOK(dGK)、SURF1、SCO2(SCO1L)、SCO1、COX10、BCS1L、ACADM、HADHA、ALDOB、G6PC(GSD1a)、PAH(PH)、OTC、GAMT、SLC6A8、SLC25A13、CPT2、PDHA1、SLC25A4(ANT1)、C10orf2(TWINKLE)、SDHA、SLC25A15、LRPPRC、GALT、PMM2、ATPAF2(ATP12)、GALE、LPIN1、ATP5E、B4GALT7、ATP8B1(ATPIC、PFIC)、ABCB11(ABC16、PFIC-2、PGY4)、ABCB4(GBD1、MDR2、PFIC-3)、MPV17(SYM1)、TIMM8A(DDP、MTS)、CPS1、NAGS、ACADVL、SLC22A5(OCTN2)、CPT1A(CPT1-L、L-CPT1)、CPT1B、SUCLA2、POLG2(HP55、MTPOLB)、ACADL、SUCLG1、MCEE、GAA、PDSS1(COQ1、TPT)、PDSS2(bA59I9.3)、COQ2(CL640、FLJ26072)、RRM2B(p53R2)、ARG1、SLC25A20(CACT)、MMACHC(cblC)、FAH、MPI、GATM、OPA1、TFAM、TOMM20(MAS20P、TOM20)、NDUFAF4(HRPAP20、C6orf66)、NDUFA1(CI-MWFE、MWFE)、SLC25A3(PHC)、BTD、OPA3(FLJ22187、MGA3)、GYS2、NDUFAF2(B17.2L、MMTN)、HLCS(HCS)、COX15、FASTKD2、NDUFS4、NDUFS6、NDUFS3、MMAA(cblA)、MUT、NDUFV1、MOCS1、NDUFS7(PSST)、TAZ(BTHS、G4.5、XAP-2)、MOCS2、COX6B1(COXG)、HADHB、MCCC1(MCCA)、MCCC2(MCCB)、TSFM(EF-TS、EF-Tsmt)、PUS1、ISCU、AGL、SDHAF1、IVD、GCDH、ADSL、DARS2、RARS2、TMEM70、ETHE1、PC、JAG1、MRPS16、PCCA、PCCB、COQ9、LDHA、PYGL、GALK1、PYGM、PGAM2、TUFM、TRMU、PFKM、GBE1、SLC37A4、GYS1、ETFDH、NDUFS8、CABC1(ADCK3)、ETFA、ETFB、DBT、SLC25A19、MMADHC、PDP1、PDHB、ACAD9、AUH、DLAT、PDHX、ACADS、NDUFS2、FBP1、NDUFAF1(CIA30、CGI65)、YARS2、SUCLG2、TCN2、CBS、PHKB、PHKG2、PHKA1、PHKA2、LIPA、ASL、HPRT1、OCRL、PNP、TSHR、ADA、ARSB、ALDH5A1、PNP、AMT、DECR1、HSD17B10、IYD、IL2RG、MGME1、HMGCL、IQCB1、OTX2、KCNJ13、CABP4、NMNAT1、ALG2、DOLK、ABCD4、ALDH4A1、ALG1、GPR143、UBE3A、ARX、GJB2(CX26、NSRD1)、APC、HTT、IKBKG(NEMO)、DMPK、PTPN11、MECP2、MECP2、RECQL4、ATXN1、ATXN10、RMRP、CDKL5、PLP1、GLA、DMD、RUNX2、PLP1、CHD7、ASS1、AIRE、EIF2B、LDLR、HPRT1、RPS19、LMX1B、COL10A1、CRTAP、LEPRE1、PORCN、ASL、CFTR、ARSA、IDUA、IDS、MYO7A、GLANS、GALC、KRAS、SOS1、RAF1、AR、PTEN、BLM、SLC9A6、HRAS、GJC2(GJA12)、NPC1、NPC2、FMR1、FMR1、PLOD1、COL2A1、COL5A1、COL5A2、ABCA4、FOXG1、TINF2、USH2A、CDH23、CLRN1、CREBBP、ABCA4、POU3F4、NRAS、CHRNA7、FOXF1、MEF2C、DHCR7、RAI1、VHL、TYR(OCAIA)、OCA2(BEY、BEY1、BEY2、EYCL)、TYRP1(b-PROTEIN、CATB、GP75、SLC45A2(AIM-1)、PCDH19、SHOC2、BRAF、MAP2K1、MAP2K2、HEXA、STXBP1、ALDH7A1、SLC2A1、WDR62、MAGEL2、SDHB和FH。

B.癌癥測試

在本公開的一些實(shí)施方案中，對來自患癌癥或懷疑患癌癥或癌癥治療結(jié)果正被監(jiān)測的個(gè)體的樣品實(shí)施本發(fā)明的方法。除了本公開的方法之外，還可以在樣品或類似樣品中運(yùn)行其他診斷或預(yù)后測試。所述樣品可以通過常規(guī)方法獲得，并且可以包括活檢標(biāo)本，其包含似乎是、懷疑是或已知是癌變的細(xì)胞或組織。用于癌癥檢測的示例性的樣品包括血液、尿液、活檢標(biāo)本、糞便物、乳頭抽吸物、臉頰刮屑等。在一些情況下，從具有患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體獲得樣品；該個(gè)體可以有家族和/或個(gè)體史，可能已經(jīng)接觸已知或懷疑會(huì)導(dǎo)致癌癥的環(huán)境條件，可以已知具有與至少一種癌癥類型相關(guān)的遺傳標(biāo)志物，等等。具體類型的活檢標(biāo)本包括皮膚、肺、乳房、結(jié)腸、子宮頸、肝、腎、前列腺的標(biāo)本，等等。

在具體實(shí)施方案中，對來自個(gè)體的待測樣品實(shí)施本公開的方法以測定其中序列內(nèi)容相比于已知樣品的變化，或測定某一序列表達(dá)水平相比于正常水平的變化(如一個(gè)或多個(gè)基因的上調(diào)或下調(diào))。在一些情況下，由本公開的方法產(chǎn)生的擴(kuò)增子的數(shù)量所代表的一個(gè)或多個(gè)特定基因的表達(dá)水平指示存在癌癥或者患癌風(fēng)險(xiǎn)情況或?qū)Π┌Y治療的成功與否。

可測定的與具體癌癥相關(guān)基因的實(shí)例包括APC、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、MUTYH(MYH)、RECQL4、TP53(LFS1、P53)、PTEN、RUNX1、TPMT、VHL、EPCAM(TACSTD1)、ERBB2(HER2/neu)、ALK、RET、EGFR、MET、IGH、ROS1、BRAF、NPM1、JAK2、MPL、AKT1(AKT)、PIK3CA、FLT3、IgVH、CEBPA、MAX、KIT、KRAS、NF1、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、TMEM127、BMPR1A、SMAD4、STK11、BRCA1、BRCA2、CDH1、PALB2、CDKN1C、FH、FLCN、GPC3、PALB2、WTL、CDC73、MEN1、PRKAR1A、ATM、NBN、NF2、PHOX2B、PTCH1、SUFU和/或UGT1A1。

V.樣品處理和來自本發(fā)明細(xì)胞的核酸

可以通過任何適當(dāng)?shù)氖侄蝸韽挠帽竟_方法進(jìn)行測試的個(gè)體獲得一種或多種樣品。在某些實(shí)施方式中，可在提取核酸前對樣品進(jìn)行處理。在提取核酸時(shí)樣品可以是新鮮的，或在提取核酸時(shí)樣品可能經(jīng)過固定或其他處理技術(shù)的處理。

樣品可以是任何種類的。在其中一個(gè)或多個(gè)目的細(xì)胞與其他細(xì)胞混在一起的實(shí)施方案中，可基于所期望的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的獨(dú)特特征，如細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白質(zhì)，分離一個(gè)或多個(gè)目的細(xì)胞。在其中基于細(xì)胞標(biāo)志物而分離胎兒細(xì)胞的實(shí)施方案中，細(xì)胞標(biāo)志物可以為CD71或ε球蛋白鏈，等等，在其中基于癌癥標(biāo)志物而分離癌細(xì)胞的實(shí)施方案中，細(xì)胞標(biāo)志物可以為ER/PR、Her-2/neu、EGFR、KRAS、BRAF、PDFGR、UGT1A1等(Bigbee W,Herberman RB.Tumor markers and immunodiagnosis.In:Bast RC Jr.,Kufe DW,Pollock RE,等人,editors.Cancer Medicine.6th ed.Hamilton,Ontario,Canada:BC Decker Inc.,2003.)。

可將細(xì)胞在有表面活性劑(即Trion-X100，tweet-20，NP-40等)和蛋白酶(即蛋白激酶K)的裂解緩沖液中孵育而裂解所分離的細(xì)胞。還可通過堿性溶液(即去垢劑十二烷基硫酸鈉(C12H25SO4Na)和強(qiáng)堿如氫氧化鈉)裂解細(xì)胞，這將導(dǎo)致雙鏈DNA的變性。堿性溶液通過乙酸鉀或乙酸鈉中和。

VI.本發(fā)明的試劑盒

本文描述的任意組合物或類似物可以包含在試劑盒中。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，一種或多種用于擴(kuò)增核酸的方法的反應(yīng)劑可包含于試劑盒中。這些反應(yīng)劑可包括酶、緩沖液、核苷酸、鹽、引物等等。試劑盒組分在合適的容器形式中提供。

這些試劑盒的一些組分可以在水媒介物中或以凍干形式進(jìn)行包裝。試劑盒的容器形式通常包括至少一個(gè)小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他容器形式，其中置有組分，并優(yōu)選被合適地分裝。試劑盒中有超過一種組分時(shí)，該試劑盒通常含有第二、第三或其他附加的容器，其中附加組分可分開置于這些容器中。然而，組分的多種組合可包含于小瓶中。本發(fā)明的試劑盒還典型地包括用于將這些組分包含在密閉容器中用于商業(yè)銷售的方式。所述容器可包括注塑或吹塑成型的塑料容器，其中留存有所期望的小瓶。

當(dāng)所述試劑盒的組分是以一種和/或多種液體溶液提供時(shí)，所述液體溶液是水溶液，其中滅菌水溶液尤其有用。在一些情況下，所述容器形式自身可以是注射器、吸頭和/或其它類似裝置，或可以是具有用于進(jìn)行所期望的反應(yīng)的多個(gè)區(qū)室的基底。

所述試劑盒的一些組分可以以干粉提供。當(dāng)反應(yīng)劑和/或組分以干粉提供時(shí)，可以通過加入合適的溶劑來重構(gòu)所述粉末。可以預(yù)見的是，所述溶劑也可在其他容器形式中提供。這些試劑盒還可包含第二種容器形式，用于包含滅菌的可接受緩沖液和/或其他稀釋劑。

在特定實(shí)施方案中，反應(yīng)劑和材料包括用于擴(kuò)增期望序列的引物、核苷酸、合適的緩沖液或緩沖反應(yīng)劑、鹽等等，且在一些情況下，所述反應(yīng)劑包括用于分離具體的期望細(xì)胞的裝置或反應(yīng)劑。

在具體實(shí)施方案中，試劑盒中有一種或多種裝置適用于從個(gè)體提取一種或多種樣品。該裝置可以是針筒、細(xì)針頭、手術(shù)刀等等。

實(shí)施例

包括以下實(shí)施例以說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚的是，在那些根據(jù)本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的代表性技術(shù)的實(shí)施例中公開的那些技術(shù)在本發(fā)明的實(shí)踐中能很好的起作用，并且因此可被認(rèn)為組成優(yōu)選的實(shí)踐形式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開應(yīng)當(dāng)清楚的是，在公開的特定實(shí)施方案中可進(jìn)行多種變化且仍然獲得相似或類似的結(jié)果而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。

實(shí)施例1

從組織樣品中分離完整的單細(xì)胞

使用商業(yè)化冷凍切片機(jī)制備組織學(xué)組織切片。制備100-200μm厚的多聚甲醛固定的固體組織的切片。用激光微切顯微鏡(Leica，MMI等)從組織切片中切割出目的的細(xì)胞。使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞解離操作流程將個(gè)體細(xì)胞從微切組織切片中解離出來。將完整的單細(xì)胞收集到各自的管子中。在3至5μl的裂解緩沖液(30mM Tris-Cl PH 7.8，2mM EDTA，20mM KCl，0.2％Triton X-100，12μg/ml Qiagen蛋白酶)中裂解所述個(gè)體細(xì)胞并將其加入PCR管的邊上，離心下來。然后熱裂解所捕獲的細(xì)胞，在PCR儀上使用如下溫度程序：50℃2小時(shí)，75℃20分鐘，80℃5分鐘。

線性產(chǎn)生半擴(kuò)增子的多重循環(huán)(圖4)

在第一輪擴(kuò)增中，一對準(zhǔn)簡并引物用于在整個(gè)基因組DNA起始重疊的擴(kuò)增子。所述引物被記為NG、NT引物，如下：

NG引物5'-GTGAGTGATGGTTGAGGATGAGTGGTNNNNNGGG-3'(SEQ ID NO：1)

NT引物5'-GTGAGTGATGGTTGAGGATGAGTGGTNNNNNTTT-3'(SEQ ID NO：2)

將以下緩沖液加到PCR管中并用于第一次擴(kuò)增：6.0μl ThermoPol緩沖液(NEB)，1.0μl的dNTP(10mM)，26μl的H₂O(經(jīng)UV處理)和0.3μl的NG和NT引物(100μΜ)。

將PCR緩沖液加入到含有裂解的單細(xì)胞的PCR管后，將樣品在94℃下加熱1-2分鐘，以使DNA變性成單鏈DNA。立即將樣品加入冰中使其淬滅并至約0℃的溫度，在此期間發(fā)生引物退火。然后將0.6μl的聚合酶Bst大片段的混合物加入到PCR管中。在PCR儀上運(yùn)行下列溫度循環(huán)。在第二次和隨后的循環(huán)中，將PCR管接著轉(zhuǎn)移到冰上以淬滅反應(yīng)，并起始新的引物引發(fā)。將新鮮聚合酶混合物加入到PCR管中并在PCR儀上運(yùn)行以下循環(huán)以產(chǎn)生擴(kuò)增子。

步驟1：10℃-45秒

步驟2：20℃-45秒

步驟3：30℃-45秒

步驟4：40℃-30秒

步驟5：55℃-30秒

重復(fù)步驟1-5，4次

步驟6：65℃-60秒

步驟7：95℃-20秒

步驟8：冰上淬滅并重新添加聚合酶

重復(fù)步驟1-8，N次

4℃–∞

重復(fù)次數(shù)N可根據(jù)條件進(jìn)行調(diào)整。在某些實(shí)施方案中，N為3。

全擴(kuò)增子的雙鏈轉(zhuǎn)換

來自上述程序的產(chǎn)物是全擴(kuò)增子和半擴(kuò)增子的混合物。將0.3μl的100μΜ PCR引物加入反應(yīng)中并進(jìn)行以下熱循環(huán)過程(例如：58℃20秒-70℃-10秒，重復(fù)30次)，以將全擴(kuò)增子轉(zhuǎn)化成雙鏈的DNA，而單鏈半擴(kuò)增子保持不變。在上述雙鏈轉(zhuǎn)換后。

PCR引物：GTGAGTGATGGTTGAGGATGAGTGGT(SEQ ID NO：4)

全擴(kuò)增子的限制性消化

來自上述熱循環(huán)的產(chǎn)物包括線性擴(kuò)增的半擴(kuò)增子和非線性擴(kuò)增的全擴(kuò)增子。將溫度加熱至94℃，持續(xù)30秒以解鏈雙鏈DNA產(chǎn)物，然后保持在50℃。在50℃，全擴(kuò)增子將由于5’末端序列與3’末端序列的互補(bǔ)形成成環(huán)的，而半擴(kuò)增子以單鏈DNA存在。引物序列整合有GGATG序列基序，可被限制性內(nèi)切核酸酶BtsCI識別并切割DNA。其結(jié)果是，全擴(kuò)增子一半以上的引物序列被刪除，因此，經(jīng)消化的DNA產(chǎn)物在下游PCR反應(yīng)中不再被擴(kuò)增。消化后將溫度升高至72℃至80℃的范圍以滅活限制酶。

線性產(chǎn)生全擴(kuò)增子(圖5)

在上述消化后，將樣品在94℃加熱20秒以使DNA變性為單鏈DNA。立即將樣品加入冰中淬滅并達(dá)到約0℃的溫度，此期間發(fā)生引物退火。此后重新加入聚合酶并實(shí)行下面的熱循環(huán)，從擴(kuò)增的半擴(kuò)增子線性再現(xiàn)全擴(kuò)增子。也可將所述半擴(kuò)增子分到多個(gè)管中并繼續(xù)進(jìn)行以下的多個(gè)退火步驟，以形成擴(kuò)增子。擴(kuò)增子的線性產(chǎn)率示于圖9。

步驟1：10℃-45秒

步驟2：20℃-45秒

步驟3：30℃-45秒

步驟4：40℃-30秒

步驟5：55℃-30秒

重復(fù)步驟1-5，4次

步驟6：65℃-60秒

備選地，也可將半擴(kuò)增子分到多個(gè)管中，并繼續(xù)進(jìn)行以下實(shí)施例的包括消化、加尾和延伸步驟，以形成擴(kuò)增子：

用T4聚合酶和ExoI核酸酶的組合消化預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，如下：加入0.4μl ExoI，在25℃消化30分鐘，然后添加0.4μl T4聚合酶，在25℃消化150分鐘。在80℃對酶進(jìn)行進(jìn)行20分鐘的熱滅活，隨后進(jìn)入加尾程序。

10X TdT反應(yīng)緩沖液由0.35μl的TdT緩沖液、0.4μl 100mM的dCTP、0.1μl TdT末端轉(zhuǎn)移酶及2.75μl H2O構(gòu)成。將TdT混合物加入樣品，混勻并使用以下溫度進(jìn)行加尾反應(yīng)：37℃15分鐘，72℃15分鐘。

加尾后，添加下述延伸緩沖液(1.5μl 10X Thermopol，1.25μl的dNTP(各10μM)，1.25ul 10μM GAT21 5n3G和12μl H2O)。充分混合反應(yīng)后，把樣品置于模塊上95℃加熱1min，將溫度降至50℃，保持至少20s；添加0.4μl的deepvent DNA聚合酶或其他聚合酶，混勻并進(jìn)行以下循環(huán)：

步驟1：50℃45秒

步驟2：72℃45秒

重復(fù)步驟1至2，10次

實(shí)施例2

使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行擴(kuò)增子的單管或多管擴(kuò)增

制備以下反應(yīng)緩沖液，并加入維持于冰上的PCR管中。

3.0μl ThermoPol緩沖液(NEB)

1.0μl dNTP(10mM)

26μl H₂O(經(jīng)UV處理)

0.1μl引物(100μM)(5’-GTGAGTGATGGTTGAGGATGAGTG-3’；SEQ ID NO:5)

可將擴(kuò)增緩沖液分到多個(gè)管中。線性擴(kuò)增產(chǎn)物將被分到各管中(圖10)。用如下標(biāo)準(zhǔn)PCR程序?qū)嵭袛U(kuò)增，以生成1-2μg的DNA材料。

94℃-20秒

58℃-20秒

65℃-1分鐘

72℃-1分鐘

重復(fù)上述循環(huán)20次

72℃-5分鐘

4℃–∞

在第二輪擴(kuò)增后，可以用Qiagen柱純化DNA，并儲(chǔ)存以用于下一程序以移除DNA擴(kuò)增子的引物末端。

擴(kuò)增子產(chǎn)物可以用于全基因組或定向(例如，外顯子組和基因面板的任何列表)測序/重測序和基因分型方法，包括Sanger測序，下一代測序和微陣列等。下一代測序的結(jié)果示于圖10和圖11。

實(shí)施例3

微滴/微孔中全基因組單一片段擴(kuò)增

從實(shí)施例1中所得線性擴(kuò)增的擴(kuò)增子覆蓋了單細(xì)胞DNA的全基因組，并可用作以下程序的起始材料(見圖6)。

可如下使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他擴(kuò)增方法。

將產(chǎn)物分成千萬個(gè)皮升級微滴/微孔或飛升級微滴/微孔。可使用商業(yè)可用的基于微流體的液滴乳化劑或者有皮升或飛升孔的微流體設(shè)備。通過在各反應(yīng)微滴/微孔中達(dá)到擴(kuò)增飽和(或通過可用的引物或dNTP限制擴(kuò)增)將單個(gè)DNA片段擴(kuò)增到類似的水平。

可如下使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他形成大規(guī)模個(gè)體反應(yīng)的方法。

可以在1千萬個(gè)微滴/微孔中的每個(gè)中實(shí)行PCR反應(yīng)以擴(kuò)增單個(gè)擴(kuò)增子。

94℃-20秒

58℃-20秒

65℃-1分鐘

72℃-1分鐘

重復(fù)上述循環(huán)20次

72℃-5分鐘

4℃–∞

從每個(gè)微滴/微孔中收集DNA產(chǎn)物并使用商業(yè)純化柱或乙醇沉淀進(jìn)行純化。

實(shí)施例4

移除擴(kuò)增子中引物序列

可以用以下尿嘧啶引物對從實(shí)施例II收集的完全擴(kuò)增的DNA再擴(kuò)增6個(gè)循環(huán)(見例如圖7)：

5'-GTGAGTGATGGTTGAGGATGAGTGGU-3'(SEQ ID NO：3)

擴(kuò)增后，使用DNA純化柱純化DNA產(chǎn)物。尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶裂解酶內(nèi)切核酸酶VIII的混合物用于移除引物序列中的U堿基。UDG催化尿嘧啶基團(tuán)的切除，而內(nèi)切核酸酶VIII移除非嘧啶堿基。

用DNA純化柱純化所述有缺口的DNA。用Zn++離子作為催化離子的S1核酸酶在切口位點(diǎn)切開單鏈DNA。由此，在DNA的兩個(gè)末端的原始引物序列都被移除。

T4聚合酶也可用于移除引物序列。酶會(huì)找到缺口并在缺口位點(diǎn)從3’至5’進(jìn)行消化。移除頂鏈后，酶將移除3’突出，即底鏈。

用DNA純化柱純化DNA產(chǎn)物。該DNA將可以直接用于文庫構(gòu)建進(jìn)行下一代測序?qū)嶒?yàn)。

實(shí)施例5

大量微滴/微孔中分開進(jìn)行單細(xì)胞DNA片段的PCR擴(kuò)增

可以覆蓋單細(xì)胞DNA的全基因組的PCR擴(kuò)增子作為起始材料。

可如下使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他擴(kuò)增方法。

將產(chǎn)物分成千萬個(gè)皮升級微滴/微孔或飛升級微滴/微孔?？墒褂蒙虡I(yè)可用的基于微流體的液滴乳化劑或者有皮升或飛升的孔的微流體設(shè)備。通過在各反應(yīng)微滴/微孔中達(dá)到擴(kuò)增飽和(或通過可用的引物或dNTP限制擴(kuò)增)將單個(gè)DNA片段擴(kuò)增到類似的水平。

可以在1千萬個(gè)微滴/微孔中的每個(gè)中實(shí)行PCR反應(yīng)以擴(kuò)增單個(gè)擴(kuò)增子。

94℃-20秒

58℃-20秒

65℃-1分鐘

72℃-1分鐘

重復(fù)上述循環(huán)20次

72℃-5分鐘

4℃–∞

從每個(gè)微滴/微孔中收集DNA產(chǎn)物并使用商業(yè)純化柱或乙醇沉淀進(jìn)行純化。

實(shí)施例6

大量微滴/微孔中分開進(jìn)行單細(xì)胞DNA片段的SDA

鏈置換擴(kuò)增(SDA)用于形成單個(gè)片段。然而，與正常SDA反應(yīng)相比，擴(kuò)增時(shí)間最小化為10至30分鐘。這將避免超分支(hyperbranch)的形成和超支化單鏈DNA引起的擴(kuò)增偏差。

加入新置換酶(Phi29)，并將反應(yīng)分成1千萬個(gè)皮升級微滴/微孔或者飛升級微滴/微孔?？墒褂蒙虡I(yè)可用的基于微流體的液滴乳化劑或有皮升或飛升的孔的微流體設(shè)備。

可在30度下繼續(xù)進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增(SDA)以在各個(gè)微滴/微孔中擴(kuò)增單個(gè)DNA片段。大多數(shù)個(gè)體微滴/微孔中沒有DNA片段，或DNA片段數(shù)量有限。延長SDA的實(shí)行時(shí)間(12小時(shí))以達(dá)到飽和。

通過在分開的孔中擴(kuò)增單個(gè)片段，該反應(yīng)避免了片段的干擾和競爭。通過在每個(gè)反應(yīng)微滴/微孔中達(dá)到擴(kuò)增的飽和(或通過可用的引物或dNTP限制擴(kuò)增)將單個(gè)DNA片段擴(kuò)增到類似的水平。

從每個(gè)微滴/微孔中收集DNA產(chǎn)物并使用商業(yè)純化柱或乙醇沉淀進(jìn)行純化。

可如下使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他擴(kuò)增方法?？梢匀绫疚乃鍪褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他形成大規(guī)模單個(gè)反應(yīng)的方法。

實(shí)施例7

大量微滴/微孔中分開進(jìn)行單細(xì)胞RNA片段的PCR擴(kuò)增

可用通過單細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄物的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA作為起始材料。

可如下使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他擴(kuò)增方法。

將產(chǎn)物分成千萬個(gè)皮升級微滴/微孔或飛升級微滴/微孔。可使用商業(yè)可用的基于微流體的液滴乳化劑或有皮升或飛升的孔的微流體設(shè)備。通過在各反應(yīng)微滴/微孔中達(dá)到擴(kuò)增飽和(或通過可用的引物或dNTP限制擴(kuò)增)將單個(gè)DNA片段擴(kuò)增到類似的水平。

可以在1千萬個(gè)微滴/微孔的每個(gè)當(dāng)中實(shí)行單個(gè)擴(kuò)增子的PCR反應(yīng)。

94℃-20秒

58℃-20秒

65℃-1分鐘

72℃-1分鐘

重復(fù)上述循環(huán)20次

72℃-5分鐘

4℃–∞

從每個(gè)微滴/微孔中收集DNA產(chǎn)物并使用商業(yè)純化柱或乙醇沉淀進(jìn)行純化。

實(shí)施例8

用于人類癌癥樣品的方法

可使用本實(shí)施方案的方法和組合物用于表征腫瘤發(fā)生的復(fù)雜的演變過程。與實(shí)體癌的大規(guī)模測序的努力相比，可將測序研究的前沿推向能夠在例如臨床環(huán)境中得到恢復(fù)的腫瘤最早期。這僅在有單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增測定時(shí)變得合理，該測定允許得到上文描述的準(zhǔn)確的SNV結(jié)果和使用臨床樣品進(jìn)行有效的單細(xì)胞分離測定法。

從臨床組織樣品分離單細(xì)胞

為了對臨床樣品應(yīng)用所述新穎的單細(xì)胞分析，可以利用有效方法對目的的細(xì)胞進(jìn)行分離。例如可通過酶解獲得組織樣本的單細(xì)胞懸浮液。然而，這樣會(huì)失去解離細(xì)胞附近的信息。另一種可獲得形態(tài)學(xué)信息的方法是顯微激光解剖。然而，就激光顯微解剖的可用性，其不能保證得到一個(gè)完整的單細(xì)胞。為了從目的組織結(jié)構(gòu)中獲得完整的細(xì)胞，可以在研究中結(jié)合所述兩種測定?？芍苽?00微米厚的組織切片并從解剖的組織中切割單個(gè)組織單元(即單個(gè)腺體、管道等)。本節(jié)的。通過這樣做，可以保證有完整的單細(xì)胞在解剖組織中。下一步可應(yīng)用酶解離。可以通過明場顯微鏡成像記錄整個(gè)消化過程。

早期腫瘤發(fā)展中的基因組異質(zhì)性

考慮到組織中有成千上萬個(gè)細(xì)胞，因此器官中的某個(gè)細(xì)胞隨機(jī)地進(jìn)行驅(qū)動(dòng)突變很可能并不奇怪。考慮到基因組是三十億個(gè)堿基的集合，在第一個(gè)驅(qū)動(dòng)突變后，此細(xì)胞極少會(huì)獲得第二個(gè)驅(qū)動(dòng)突變。事實(shí)上，在獲得第一個(gè)驅(qū)動(dòng)突變后(PanIN中的Kras)，細(xì)胞可逃避正常的分化并開始增殖和重編程。在擴(kuò)大后，這群異常的前體細(xì)胞可遇到內(nèi)部和外部的危機(jī)，即端粒危機(jī)、免疫攻擊和缺氧。其結(jié)果是，人們可以預(yù)料到增加的細(xì)胞死亡和減緩的增殖。該階段的存在可以表現(xiàn)為發(fā)育不良，這可能是癌癥發(fā)展的關(guān)鍵階段。發(fā)育不良可存活多年，積累高度的基因組異質(zhì)性。

隨著對腫瘤的全基因組測序，在不同類型的成人癌癥(Stratton，2011)中腫瘤細(xì)胞通常積累1000-10000個(gè)體細(xì)胞突變。該數(shù)字設(shè)定了前體細(xì)胞發(fā)展成癌癥所必須的突變數(shù)量范圍。因此，預(yù)期成千上萬的突變在發(fā)育不良細(xì)胞的潛伏期積累。爭議在于僅當(dāng)大量前體細(xì)胞已經(jīng)獲得廣泛突變時(shí)，其中某個(gè)細(xì)胞可以經(jīng)過下一輪重要的驅(qū)動(dòng)突變。一旦發(fā)生，可預(yù)期該細(xì)胞會(huì)得到相比其他巨大細(xì)胞的增殖優(yōu)勢并形成大得多的克隆性擴(kuò)張；該增殖期對應(yīng)腫瘤形成的時(shí)期(圖8)。面對各種類型的危機(jī)，發(fā)育不良和腫瘤形成可能有多重時(shí)期且其要在一個(gè)腫瘤中共存。然而，由于細(xì)胞群體越來越大，克隆性演化加速并最終導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化。

根據(jù)上述早期癌癥發(fā)展的景象，我們希望在發(fā)育不良時(shí)期見到高度基因組異質(zhì)性。在腫瘤性細(xì)胞之間異質(zhì)性可能較少。通過對比發(fā)育不良和腫瘤形成之間的突變，我們能找到導(dǎo)致此轉(zhuǎn)化的潛在突變。

在胰腺癌的情況下，Kras、p16、p53和SMAD4基本上是最顯著的驅(qū)動(dòng)突變。人們普遍認(rèn)為，Kras基因突變是第一驅(qū)動(dòng)突變，因?yàn)樗l(fā)生于90％以上的胰腺癌中。即使在低級別PanIN-1A的病變中亦包括Kras基因突變。當(dāng)腫瘤性本質(zhì)還沒有明確建立時(shí)，被記為PanIN/L-1A。該級別對應(yīng)可以臨床樣本中采集的最早期的PanIN病變。由于細(xì)胞稀少，所以可使用單細(xì)胞全基因組測序揭示低級別PanIN/L-1A中的基因組抑制性。從PanIN-1A至PanIN-2期，可獲得其他關(guān)鍵突變?nèi)鏿16、p53或SMAD4，此時(shí)預(yù)期的是腫瘤的發(fā)展。

基因組異質(zhì)性的早期階段還將包括由于端粒危機(jī)或其他壓力造成的非整倍體。這種染色體異常已在結(jié)直腸癌和乳腺癌腺瘤中被廣泛觀察到。通過復(fù)制或刪除大的染色體片段，非整倍體可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，或者備選地對細(xì)胞施壓朝向重編程方向進(jìn)行。顯然非整倍體會(huì)影響進(jìn)化動(dòng)力學(xué)，如果這些刪除發(fā)生在有關(guān)鍵腫瘤抑制子基因的區(qū)域，其還可起到驅(qū)動(dòng)作用導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化。非整倍體是否起到導(dǎo)致腫瘤形成的驅(qū)動(dòng)作用或只是起到支持作用以增加發(fā)育不良細(xì)胞的存活，這一點(diǎn)將在本研究中得到解決。

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雖然已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明及其優(yōu)勢，但是應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對此進(jìn)行各種變化、替換和改變。此外，本申請的范圍不旨在受限于說明書中描述的過程、機(jī)器、制作、物質(zhì)組成、方式、方法和步驟的具體實(shí)施方案。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員從本發(fā)明的公開內(nèi)容中將容易地理解，根據(jù)本發(fā)明可使用目前存在或以后會(huì)開發(fā)的過程、機(jī)器、制作、物質(zhì)組成、方式、方法或步驟實(shí)行基本上與本文描述的對應(yīng)實(shí)施方案相同的功能或?qū)崿F(xiàn)基本上相同的結(jié)果。因此，所附權(quán)利要求旨在將這些過程、機(jī)器、制作、物質(zhì)組成、方式、方法或步驟包括在其范圍內(nèi)。

序列表

<110> Zong, Chenghang

<120> 單細(xì)胞全基因組線性擴(kuò)增法

<130> BAYM.P0124WO

<140> UNKNOWN

<141> 2015-05-05

<150> 61/989,002

<151> 2014-05-06

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(31)

<223> n是a, c, g,或t

<400> 1

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