本專利申請要求于2014年5月29日提交的美國臨時專利申請第62/004,335號的權(quán)益，所述臨時專利申請通過引用整體并入本文。

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發(fā)明背景

一些癌癥類型，例如宮頸癌的主要原因是人乳頭瘤病毒(HPV)感染。盡管在諸如化療的治療中取得進(jìn)展，但包括HPV相關(guān)癌癥在內(nèi)的許多癌癥的預(yù)后可能很差。因此，存在對癌癥，特別是HPV相關(guān)癌癥的其他治療的未得到滿足的需求。

發(fā)明概述

本發(fā)明的實(shí)施方案提供了分離的或純化的T細(xì)胞受體(TCR)，其對人乳頭瘤病毒(HPV)16 E7具有抗原特異性。

本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了包含人可變區(qū)和鼠恒定區(qū)的TCR，或TCR的功能變體，其中TCR和功能變體對人乳頭瘤病毒(HPV)16 E7具有抗原特異性。

本發(fā)明還提供了相關(guān)的多肽和蛋白以及相關(guān)的核酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和細(xì)胞群體。本發(fā)明還提供了與本發(fā)明的TCR(包括其功能部分和功能變體)相關(guān)的抗體或其抗原結(jié)合部分以及藥物組合物。

本發(fā)明還提供了檢測哺乳動物中病況的存在的方法以及治療或預(yù)防哺乳動物中的病況的方法，其中病況為癌癥、HPV 16感染或HPV 陽性初癌。本發(fā)明的檢測哺乳動物中病況的存在的方法包括(i)將包含病況的細(xì)胞的樣品與本文所述的本發(fā)明的TCR(包括其功能部分和功能變體)、多肽、蛋白、核酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、宿主細(xì)胞群體、抗體或其抗原結(jié)合部分、或藥物組合物的任何一種相接觸，從而形成復(fù)合物，以及(ii)檢測所述復(fù)合物，其中檢測到復(fù)合物指示哺乳動物中病況的存在，其中所述病況為癌癥、HPV 16感染或HPV陽性初癌。

本發(fā)明的治療或預(yù)防哺乳動物中的病況的方法包括以有效治療或預(yù)防哺乳動物中病況的量向哺乳動物施用本文所述的TCR(包括其功能部分和功能變體)、多肽或蛋白的任何一種，包含編碼本文所述的TCR(包括其功能部分和功能變體)、多肽、蛋白的任何一種的核苷酸序列的任何核酸或重組表達(dá)載體，或包含編碼本文所述的TCR(包括其功能部分和功能變體)、多肽或蛋白的任何一種的重組載體的任何宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞群體，其中所述病況為癌癥、HPV 16感染或HPV陽性初癌。

附圖中幾個視圖的簡述

圖1為顯示在與靶標(biāo)(用HPV 16 E6_29-38肽脈沖刺激的293-A2細(xì)胞、用HPV 16 E7_11-19肽脈沖刺激的293-A2細(xì)胞、用編碼HPV 16 E6的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的624細(xì)胞、用編碼HPV 16 E7的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的624細(xì)胞、SCC152細(xì)胞、SCC90細(xì)胞、CaSki細(xì)胞、Alb細(xì)胞、Panc1細(xì)胞或SiHa細(xì)胞)共培養(yǎng)后，用編碼嵌合抗-HPV 16 E7 TCR(有陰影的柱)的核苷酸序列轉(zhuǎn)導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)分泌的干擾素(IFN)-γ(pg/mL)的柱狀圖。各靶細(xì)胞的HLA-A2和HPV-16 E7表達(dá)顯示在圖1的底部(“+”表示表達(dá)呈陽性，“–”表示表達(dá)呈陰性)。將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(無陰影的柱)用作陰性對照。

圖2A-2R為顯示來自用表1中所示的表達(dá)下述的重組表達(dá)載體之一轉(zhuǎn)導(dǎo)(B-I和K-R)的第一供體(A-I)或第二供體(J-R)的細(xì)胞的百分比的點(diǎn)狀圖：HLA-A2/E7_11-19四聚體⁺/m TRBC^-(左上象限)、HLA-A2/E7_11-19四聚體⁺/m TRBC⁺(右上象限)、HLA-A2/E7_11-19四聚體^-/m TRBC^-(左下象限)和HLA-A2/E7_11-19四聚體^-/m TRBC⁺(右下象限)。各個象限的數(shù)值百分比提供在各點(diǎn)狀圖的上部。將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(A和J)用作陰性對照。

圖3A和3B為顯示在與靶標(biāo)(624、CaSki、SCC90或SCC152細(xì)胞)共培養(yǎng)后，來自用表1中所示的重組表達(dá)載體之一轉(zhuǎn)導(dǎo)的供體1(A)或供體2(B)的效應(yīng)細(xì)胞的IFN-γ分泌的圖。對于各靶細(xì)胞系，有陰影的柱(從左至右)對應(yīng)于用下述載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞：嵌合抗-HPV 16 E7 TCR(α/β)、Cys-修飾的TCR(α/β)、LVL-修飾的TCR(α/β)、LVL-Cys-修飾的TCR(α/β)、嵌合抗-HPV 16 E7 TCR(β/α)、Cys-修飾的TCR(β/α)、LVL-修飾的TCR(β/α)或LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)。將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(無陰影的柱)用作陰性對照。

圖4為顯示在與靶標(biāo)(用HPV 16 E6_29-38肽脈沖刺激的293-A2細(xì)胞、用HPV 16 E7_11-19肽脈沖刺激的293-A2細(xì)胞、用編碼HPV 16 E6的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的624細(xì)胞、用編碼HPV 16 E7的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的624細(xì)胞、SCC152細(xì)胞、SCC90細(xì)胞、CaSki細(xì)胞、Ane細(xì)胞、Alb細(xì)胞、Panc1細(xì)胞或SiHa細(xì)胞)共培養(yǎng)后，用編碼LVL-修飾的TCR(β/α)(SEQ ID NO:37)(有陰影的柱)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL分泌的IFN-γ(pg/mL)的圖。各靶細(xì)胞的HLA-A2和HPV-16 E7表達(dá)顯示在圖4的底部(“+”表示表達(dá)呈陽性，“–”表示表達(dá)呈陰性)。將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(無陰影的柱)用作陰性對照。

圖5為顯示在無抗體(黑色柱)或在存在抗-MHC I類抗體(灰色柱)或抗-MHC II類抗體(無陰影的柱)的情況下，在與靶標(biāo)(624細(xì)胞、SCC90細(xì)胞或CaSki細(xì)胞)共培養(yǎng)后，用編碼LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)(SEQ ID NO:38)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL分泌的IFN-γ(pg/mL)的圖。作為對照，在無抗體或在存在抗-MHC I類抗體或抗-MHC II類抗體的情況下，將PBL用DMF5TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)并與624細(xì)胞共培養(yǎng)，或者用抗-MAGE A3 TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)并與526-CIITA細(xì)胞共培養(yǎng)。

圖6A-6D為顯示以不同的效應(yīng)細(xì)胞：靶標(biāo)比率，與用編碼LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)(SEQ ID NO:38)(正方形)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)的靶細(xì)胞CaSki(A)、SCC90(B)、SCC152(C) 或624細(xì)胞(D)的特異性裂解(％)的圖。將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(圓圈)用作陰性對照。

圖7A和7B為顯示在與用不同濃度的HPV 16 E7_11-19肽(A)或HPV 16 E6_29-38肽(B)脈沖刺激的靶細(xì)胞共培養(yǎng)后，用編碼LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)(SEQ ID NO:38)(有陰影的柱)或抗-HPV 16 E6 TCR DCA2E6(無陰影的柱)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL分泌的IFN-γ(pg/mL)的圖。

圖8A為顯示在與靶標(biāo)(624細(xì)胞、Caski細(xì)胞、SCC90細(xì)胞或SCC152細(xì)胞)共培養(yǎng)后，用編碼LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)(SEQ ID NO:38)(黑色柱)或DCA2E6 TCR(灰色柱)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL分泌的IFN-γ(pg/mL)的圖。將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(無陰影的柱)用作陰性對照。

圖8B為顯示在與靶標(biāo)(用HPV 16 E6_29-38肽脈沖刺激的293-A2靶細(xì)胞、用HPV 16 E7_11-19肽脈沖刺激的293-A2細(xì)胞、SCC152細(xì)胞、SCC90細(xì)胞、CaSki細(xì)胞、Ane細(xì)胞、Alb細(xì)胞、Panc1細(xì)胞或SiHa細(xì)胞)共培養(yǎng)后，用編碼Cys-修飾的TCR(β/α)(黑色柱)或DCA2E6 TCR(灰色柱)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL分泌的IFN-γ(pg/mL)的圖。將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(無陰影的柱)用作陰性對照。

發(fā)明詳述

本發(fā)明的實(shí)施方案提供了分離的或純化的T細(xì)胞受體(TCR)，其對人乳頭瘤病毒(HPV)16 E7具有抗原特異性。

HPV16為最常見的與惡性腫瘤相關(guān)的HPV的亞型。不受特定理論或機(jī)制的束縛，HPV16被認(rèn)為至少部分地通過癌蛋白E7的作用引起癌癥，所述癌蛋白E7通過Rb失活保持癌細(xì)胞在細(xì)胞分裂周期中的活性。HPV 16 E7在癌細(xì)胞中組成型表達(dá)，并且在正常未感染的人組織中不表達(dá)。HPV 16 E7在多種人類癌癥中表達(dá)，所述人類癌癥包括但不限于宮頸癌、口咽癌、肛門癌、肛管癌、直腸肛門癌、陰道癌、外陰癌和陰莖癌。

本發(fā)明的TCR(包括其功能部分和功能變體)可以對任何HPV 16 E7蛋白、多肽或肽具有抗原特異性。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，TCR(包括其功能部分和功能變體)對HPV 16 E7蛋白具有抗原特異性，所述HPV 16 E7蛋白包含SEQ ID NO:1，由SEQ ID NO:1組成或基本上由SEQ ID NO:1組成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，TCR(包括其功能部分和功能變體)對HPV 16 E7_11-19肽具有抗原特異性，所述HPV 16 E7_11-19肽包含YMLDLQPET(SEQ ID NO:2)，由YMLDLQPET(SEQ ID NO:2)組成，或基本上由YMLDLQPET(SEQ ID NO:2)組成。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的TCR(包括其功能部分和功能變體)能夠以主要組織相容性復(fù)合體(MHC)I類依賴性方式識別HPV 16 E7。如本文所用，“MHC I類依賴性方式”意指當(dāng)在MHC I類分子的背景中結(jié)合HPV 16 E7時，TCR(包括其功能部分和功能變體)引發(fā)免疫應(yīng)答。MHC I類分子可以為本領(lǐng)域已知的任何MHC I類分子，例如HLA-A分子。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，MHC I類分子為HLA-A2分子。

本發(fā)明的TCR(包括其功能部分和功能變體)提供許多優(yōu)勢，包括當(dāng)由細(xì)胞表達(dá)時，用于過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移。不受特定理論或機(jī)制的束縛，認(rèn)為因?yàn)镠PV 16 E7由多種癌癥類型的HPV 16感染的細(xì)胞表達(dá)，所以本發(fā)明的TCR(包括其功能部分和功能變體)有利地提供破壞多種類型的HPV 16相關(guān)癌癥的細(xì)胞的能力，并且因此能治療或預(yù)防多種類型的HPV 16相關(guān)的癌癥。另外，不受特定理論或機(jī)制的束縛，認(rèn)為因?yàn)镠PV 16 E7蛋白僅在癌細(xì)胞中表達(dá)，所以本發(fā)明的TCR(包括其功能部分和功能變體)有利地靶向癌細(xì)胞的破壞，同時最小化或消除正常的、非癌性細(xì)胞的破壞，從而降低毒性，例如使毒性最小化或消除毒性。此外，本發(fā)明的TCR(包括其功能部分和功能變體)可以有利地、成功地治療或預(yù)防HPV陽性癌癥，此類癌癥不響應(yīng)于其它治療類型，諸如，例如，單獨(dú)的化療、手術(shù)或輻射。另外，本發(fā)明的TCR(包括其功能部分和功能變體)提供對HPV 16 E7的高度親合識別，這可以有利地提供識別未經(jīng)處理的腫瘤細(xì)胞(例如，未用干擾素(IFN)-γ處理的、未用編碼HPV 16 E7和HLA-A2中的一種或兩種的載體轉(zhuǎn)染的、未用E7_11-19肽脈沖刺激的或它們的組合處理的腫瘤細(xì)胞)的能力。

如本文所用，短語“抗原特異性”意指TCR(包括其功能部分和功能變體)可以以高親合力特異性結(jié)合并免疫識別HPV 16 E7。例如，在與用低濃度的HPV 16 E7肽(例如，約0.05ng/mL至約5ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL或5ng/mL)脈沖刺激的抗原陰性HLA-A2⁺靶細(xì)胞共培養(yǎng)后，如果表達(dá)TCR(包括其功能部分和功能變體)的T細(xì)胞分泌至少約200pg/mL或更多(例如，200pg/mL或更多、300pg/mL或更多、400pg/mL或更多、500pg/mL或更多、600pg/mL或更多、700pg/mL或更多、1000pg/mL或更多、5,000pg/mL或更多、7,000pg/mL或更多、10,000pg/mL或更多或20,000pg/mL或更多)的IFN-γ，則該TCR(或其功能部分或功能變體)可以被認(rèn)為對HPV 16 E7具有“抗原特異性”?？蛇x地或另外地，在與用低濃度的HPV 16 E7肽脈沖刺激的抗原陰性HLA-A2⁺靶細(xì)胞共培養(yǎng)后，如果表達(dá)TCR(包括其功能部分和功能變體)的T細(xì)胞分泌的IFN-γ是未轉(zhuǎn)導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)背景水平的IFN-γ的至少兩倍，則該TCR(或其功能部分或功能變體)可以被認(rèn)為對HPV 16 E7具有“抗原特異性”。在與用較高濃度的HPV 16 E7肽脈沖刺激的抗原陰性HLA-A2⁺靶細(xì)胞共培養(yǎng)后，表達(dá)本發(fā)明的TCR(包括其功能部分和功能變體)的細(xì)胞也可以分泌IFN-γ。

本發(fā)明提供了TCR，其包含兩條多肽(即，多肽鏈)，如TCR的阿爾法(α)鏈、TCR的貝塔(β)鏈、TCR的伽瑪(γ)鏈、TCR的德耳塔(δ)鏈或它們的組合。本發(fā)明TCR的多肽可包含任何氨基酸序列，前提是TCR對HPV 16 E7具有抗原特異性。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，TCR包含兩條多肽鏈，每條多肽鏈包含含有TCR的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)1、CDR2和CDR3的人可變區(qū)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，TCR包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR1(α鏈的CDR1)、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR2(α鏈的CDR2)和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR3(α鏈的CDR3)，所述第二多肽鏈包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1(β鏈的CDR1)、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2(β鏈的CDR2)和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3(β鏈的CDR3)。在這方面，本發(fā)明的TCR可以包含選自SEQ ID NO:3-8的任何一個或多個氨基酸序列。優(yōu)選地，TCR包含SEQ ID NO:3-5或SEQ ID NO:6-8。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，TCR包含SEQ ID NO:3-8的氨基酸序列。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，TCR可以包含含有上文所示的CDR的TCR的可變區(qū)的氨基酸序列。在這方面，TCR可以包含SEQ ID NO:9(人α鏈的可變區(qū))的氨基酸序列；SEQ ID NO:10的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:10的第2位的X為Ala或Gly(β鏈的可變區(qū))；SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10兩者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:10的第2位的X為Ala或Gly；SEQ ID NO:11(人β鏈的可變區(qū))的氨基酸序列；或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11兩者的氨基酸序列。當(dāng)SEQ ID NO:10的第2位的X為Gly時，SEQ ID NO:10對應(yīng)于SEQ ID NO:11。優(yōu)選地，本發(fā)明的TCR包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10兩者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:10的第2位的X為Ala。

本發(fā)明的TCR還可以包含來源于任何合適的物種，諸如，例如，人或小鼠的恒定區(qū)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，TCR還包含人恒定區(qū)。在這方面，TCR可以包含SEQ ID NO:14(人α鏈的恒定區(qū))、SEQ ID NO:15(人β鏈的恒定區(qū))或SEQ ID NO:14和15兩者的氨基酸序列。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的TCR可以包含可變區(qū)和恒定區(qū)的組合。在這方面，TCR可以包含含有SEQ ID NO:9(人α鏈的可變區(qū))和SEQ ID NO:14(人α鏈的恒定區(qū))兩者的氨基酸序列的α鏈；含有SEQ ID NO:11(人β鏈的可變區(qū))和SEQ ID NO:15(人β鏈的恒定區(qū))兩者的氨基酸序列的β鏈；含有SEQ ID NO:10，其中SEQ ID NO:2的第2位的X為Ala或Gly(β鏈的可變區(qū))和SEQ ID NO:15(人β鏈的恒定區(qū))兩者的氨基酸序列的β鏈；全部SEQ ID NO:9、11、14和15的氨基酸序列；或者全部SEQ ID NO:9、10、14和15的氨基酸序列。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的TCR可以包含TCR的α鏈和TCR的β鏈。本發(fā)明的TCR的α鏈和β鏈各自可以獨(dú)立地包含任何氨基酸序列。在這方面，本發(fā)明的TCR的α鏈可以包含SEQ ID NO:12 的氨基酸序列。這種類型的α鏈可以與TCR的任何β鏈成對。在這方面，本發(fā)明的TCR的β鏈可以包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。因此，本發(fā)明的TCR可以包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:12和13兩者的氨基酸序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的TCR為包含SEQ ID NO:12和13兩者的氨基酸序列的人TCR。

本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了包含人可變區(qū)和鼠恒定區(qū)的嵌合TCR或所述TCR的功能變體，其中所述TCR和功能變體對人乳頭瘤病毒(HPV)16 E7具有抗原特異性。嵌合TCR或其功能變體可以包含如本文關(guān)于本發(fā)明的其它方面所述的任何CDR區(qū)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，嵌合TCR或其功能變體可以包含如本文關(guān)于本發(fā)明的其它方面所述的任何可變區(qū)。

當(dāng)提到本文所述的TCR或TCR的任何成分(例如，互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、可變區(qū)、恒定區(qū)、α鏈和/或β鏈)時，本文使用的術(shù)語“鼠”或“人”意指分別來源于小鼠或人的TCR(或其成分)，即分別源自或同時由小鼠T細(xì)胞或人T細(xì)胞表達(dá)的TCR(或其成分)。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合TCR包含鼠恒定區(qū)。在這方面，TCR可以包含SEQ ID NO:17(鼠α鏈的恒定區(qū))、SEQ ID NO:19(鼠β鏈的恒定區(qū))或SEQ ID NO:17和19兩者的氨基酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的TCR為包含人可變區(qū)和鼠恒定區(qū)兩者的嵌合TCR。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合TCR可以包含可變區(qū)和恒定區(qū)的組合。在這方面，TCR可以包含含有SEQ ID NO:9(人α鏈的可變區(qū))和SEQ ID NO:17(鼠α鏈的恒定區(qū))兩者的氨基酸序列的α鏈；含有SEQ ID NO:11(人β鏈的可變區(qū))和SEQ ID NO:19(鼠β鏈的恒定區(qū))兩者的氨基酸序列的β鏈；含有SEQ ID NO:10，其中SEQ ID NO:10的第2位的X為Ala或Gly(β鏈的可變區(qū))和SEQ ID NO:19(鼠β鏈的恒定區(qū))兩者的氨基酸序列的β鏈；全部SEQ ID NO:9、11、17和19的氨基酸序列；或全部SEQ ID NO:9、10、17和19的氨基酸序列。在實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:20的全長β鏈。在這方面，TCR可以包含全部SEQ ID NO:9、17和20。

包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是本文所述的本發(fā)明的TCR的功能變體。本文使用的術(shù)語“功能變體”是指與親本TCR、多肽或蛋白具有大量的或顯著的序列同一性或相似性的TCR、多肽或蛋白，所述功能變體保留了其中產(chǎn)生變體的TCR、多肽或蛋白的生物活性。功能變體涵蓋，例如，保留了以與親本TCR、多肽或蛋白類似的程度、以與親本TCR、多肽或蛋白相同的程度或以比親本TCR、多肽或蛋白更高的程度特異性結(jié)合HPV 16E7的能力的本文所述的TCR、多肽或蛋白(親本TCR、多肽或蛋白)的那些變體，親本TCR對HPV 16E7具有抗原特異性或親本多肽或蛋白特異性結(jié)合HPV 16E7。關(guān)于親本TCR、多肽或蛋白，功能變體的氨基酸序列與親本TCR、多肽或蛋白的氨基酸序列可以，例如，具有至少約30％、50％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。

功能變體可以，例如，包含具有至少一個保守性氨基酸置換的親本TCR、多肽或蛋白的氨基酸序列。保守性氨基酸置換為本領(lǐng)域已知的，并且包括其中具有某些物理和/或化學(xué)性質(zhì)的一個氨基酸被更換為具有相同化學(xué)或物理性質(zhì)的另一氨基酸的氨基酸置換。例如，保守性氨基酸置換可以為酸性氨基酸置換為另一酸性氨基酸(例如，Asp或Glu)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸置換為具有非極性側(cè)鏈的另一氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)、堿性氨基酸置換為另一堿性氨基酸(Lys、Arg等)、具有極性側(cè)鏈的氨基酸置換為具有極性側(cè)鏈的另一氨基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)等。

可選地或另外地，功能變體可以包含具有至少一個非保守性氨基酸置換的親本TCR、多肽或蛋白的氨基酸序列。在這種情況下，優(yōu)選的是不會干擾或抑制功能變體的生物活性的非保守性氨基酸置換。優(yōu)選地，非保守性氨基酸置換增強(qiáng)功能變體的生物活性，以使得與親本TCR、多肽或蛋白相比，功能變體的生物活性增加。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，功能變體包含在α或β鏈的恒定區(qū)中具有一個、兩個、三個或四個氨基酸置換的本文所述的任何TCR的氨基酸序列。優(yōu)選地，功能變體包含在鼠恒定區(qū)中具有一個、兩個、三個或四個氨基酸置換的本文所述的任何鼠恒定區(qū)的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，與包含未置換的氨基酸序列的親本TCR相比，包含置換的氨基酸序列的TCR(或其功能部分)有利地提供增加的HPV 16 E7⁺靶標(biāo)的識別、增加的宿主細(xì)胞的表達(dá)和增加的抗腫瘤活性中的一種或多種。通常，TCRα和β鏈的鼠恒定區(qū)的置換的氨基酸序列SEQ ID NO:16和18分別與未置換的鼠恒定區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO:17和19的全部或部分相對應(yīng)，其中與SEQ ID NO:17相比，SEQ ID NO:16具有一個、兩個、三個或四個氨基酸置換，并且與SEQ ID NO:19相比，SEQ ID NO:18具有一個氨基酸置換。在這方面，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了包含以下氨基酸序列的TCR功能變體：(a)SEQ ID NO:16(α鏈的恒定區(qū))，其中(i)第48位的X為Thr或Cys；(ii)第112位的X為Ser、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)第114位的X為Met、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；和(iv)第115位的X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；以及(b)SEQ ID NO:18(β鏈的恒定區(qū))，其中第56位的X為Ser或Cys。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，包含SEQ ID NO:16的TCR功能變體不包含SEQ ID NO:17(α鏈的未置換的鼠恒定區(qū))。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，包含SEQ ID NO:18的TCR功能變體不包含SEQ ID NO:19(β鏈的未置換的鼠恒定區(qū))。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，置換的氨基酸序列包括α和β鏈之一或兩者的恒定區(qū)中的半胱氨酸置換，以提供半胱氨酸-置換的TCR。在α和β鏈中的相對的半胱氨酸提供二硫鍵，所述二硫鍵將置換的TCR的α和β鏈的恒定區(qū)彼此連接，并且其不存在于包含未置換的人恒定區(qū)或未置換的鼠恒定區(qū)的TCR中。在這方面，TCR的功能變體是半胱氨酸-置換的嵌合TCR，在該嵌合TCR中，SEQ ID NO:17的天然Thr48和SEQ ID NO:19的天然Ser56之一或兩者可以被Cys置換。優(yōu)選地，SEQ ID NO:17的天然Thr48和SEQ ID NO:19的天然Ser56均被Cys置換。在實(shí)施方案中，半胱氨酸-置換的嵌合TCR包含α鏈恒定區(qū)和β鏈恒定區(qū)，所述α鏈恒定區(qū)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，其中第48位的X為Cys，第112位的X為天然Ser，第114位的X為天然Met，以及第115位的X為天然Gly；所述β鏈恒定區(qū)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，其中第56位的X為Cys。優(yōu)選地，半胱氨酸-置換的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的α鏈恒定區(qū)和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的β鏈恒定區(qū)。本發(fā)明的半胱氨酸-置換的嵌合TCR可以包含除本文所述的任何CDR和/或可變區(qū)之外的置換的恒定區(qū)。在這方面，半胱氨酸-置換的嵌合TCR可以包含以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:3-5和24；(ii)SEQ ID NO:9和24；(iii)SEQ ID NO:6-8和23；(iv)SEQ ID NO:10和23，其中SEQ ID NO:10的第2位的X為Ala或Gly；(v)SEQ ID NO:11和23；(vi)SEQ ID NO:9和16；(vii)SEQ ID NO:10和18；(viii)SEQ ID NO:11和18；(ix)SEQ ID NO:3-5和16；或(x)SEQ ID NO:6-8和18。優(yōu)選地，半胱氨酸-置換的嵌合TCR包含以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:3-8和23-24；(ii)SEQ ID NO:9-10和23-24；(iii)SEQ ID NO:9、11和23-24；(iv)SEQ ID NO:3-8、16和18；(v)SEQ ID NO:9-10、16和18；或(vi)SEQ ID NO:9、11、16和18。在實(shí)施方案中，Cys-置換的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:27的全長β鏈。在這方面，Cys-置換的嵌合TCR可以包含SEQ ID NO:9和24；SEQ ID NO:27；或全部SEQ ID NO:9、24和27。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，置換的氨基酸序列包括用疏水性氨基酸置換α和β鏈之一或兩者的恒定區(qū)的跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域中的一個、兩個或三個氨基酸以提供疏水性氨基酸-置換的TCR(在本文也稱為“LVL-修飾的TCR”)。與TM結(jié)構(gòu)域中沒有疏水性氨基酸置換的TCR相比，TCR的TM結(jié)構(gòu)域中的疏水性氨基酸置換可以增加TCR的TM結(jié)構(gòu)域的疏水性。在這方面，TCR的功能變體為LVL-修飾的嵌合TCR，在該嵌合TCR中，SEQ ID NO:17的天然Ser112、Met114和Gly115中的一個、兩個或三個可以獨(dú)立地被Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp置換；優(yōu)選被Leu、Ile或Val置換。優(yōu)選地，SEQ ID NO:17的全部三個天然Ser112、Met114和Gly115可以獨(dú)立地被Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp置換；優(yōu)選被Leu、Ile或Val置換。在實(shí)施方案中，LVL-修飾的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的α鏈恒定區(qū)，其中第48位的X為天然Thr，第112位的X為Ser、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp，第114位的X為Met、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp，和第115位的X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp，以及含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的β鏈恒定區(qū)，其中包含SEQ ID NO:16的LVL-修飾的嵌合TCR不包含SEQ ID NO:17(α鏈的未置換的鼠恒定區(qū))。優(yōu)選地，LVL-修飾的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的α鏈恒定區(qū)以及含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的β鏈恒定區(qū)。本發(fā)明的LVL-修飾的嵌合TCR可以包含除本文所述的任何CDR和/或可變區(qū)之外的置換的恒定區(qū)。在這方面，LVL-修飾的嵌合TCR可以包含：(i)SEQ ID NO:3-5和21；(ii)SEQ ID NO:9和21；(iii)SEQ ID NO:6-8和19；(iv)SEQ ID NO:10和19，其中SEQ ID NO:10的第2位的X為Ala或Gly；(v)SEQ ID NO:11和19；(vi)SEQ ID NO:9和16；(vii)SEQ ID NO:3-5和16；(x)SEQ ID NO:6-8和18；(viii)SEQ ID NO:10和18；或(ix)SEQ ID NO:11和18。優(yōu)選地，半胱氨酸-置換的嵌合TCR包含以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:3-8、19和21；(ii)SEQ ID NO:9-10、19和21；(iii)SEQ ID NO:9、11、19和21；(iv)SEQ ID NO:3-8、16和18；(v)SEQ ID NO:9-10、16和18；或(vi)SEQ ID NO:9、11、16和18。在實(shí)施方案中，LVL-修飾的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的全長α鏈以及含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的全長β鏈。在這方面，LVL-修飾的嵌合TCR可以包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:20和22兩者。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，置換的氨基酸序列包括在α和β鏈之一或兩者的恒定區(qū)中的半胱氨酸置換與用疏水性氨基酸置換α和β鏈之一或兩者的恒定區(qū)的跨膜(TM)結(jié)構(gòu)域中的一個、兩個或三個氨基酸的組合(在本文也稱為“半胱氨酸-置換的LVL-修飾的TCR”)。在這方面，TCR的功能變體為半胱氨酸-置換的LVL-修飾的嵌合TCR，在該嵌合TCR中，SEQ ID NO:17的天然Thr48被Cys置換；SEQ ID NO:17的天然Ser112、Met114和Gly115中的一個、兩個或三個獨(dú)立地被Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp置換；優(yōu)選被Leu、Ile或Val置換；以及SEQ ID NO:19的天然Ser56被Cys置換。優(yōu)選地，SEQ ID NO:17的全部三個天然Ser112、Met114和Gly115可以獨(dú)立地被Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp置換；優(yōu)選地被Leu、Ile或Val置換。在實(shí)施方案中，半胱氨酸-置換的LVL-修飾的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的α鏈恒定區(qū)，其中第48位的X為Cys，第112位的X為Ser、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp，第114位的X為Met、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp，和第115位的X為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp，以及含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的β鏈恒定區(qū)，其中第56位的X為Cys，其中包含SEQ ID NO:16的半胱氨酸-置換的LVL-修飾的嵌合TCR不包含SEQ ID NO:17(α鏈的未置換的鼠恒定區(qū))。優(yōu)選地，半胱氨酸-置換的LVL-修飾的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的α鏈恒定區(qū)以及含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的β鏈恒定區(qū)。本發(fā)明的半胱氨酸-置換的LVL-修飾的嵌合TCR可以包含除本文所述的任何CDR和/或可變區(qū)之外的置換的恒定區(qū)。在這方面，半胱氨酸-置換的LVL-修飾的嵌合TCR可以包含(i)SEQ ID NO:3-5和25；(ii)SEQ ID NO:9和25；(iii)SEQ ID NO:6-8和23；(iv)SEQ ID NO:10和23,其中SEQ ID NO:10的第2位的X為Ala或Gly；(v)SEQ ID NO:11和23；(vi)SEQ ID NO:3-5和16；(vii)SEQ ID NO:9和16；(viii)SEQ ID NO:6-8和18；(ix)SEQ ID NO:10和18；或(x)SEQ ID NO:11和18。優(yōu)選地，半胱氨酸-置換的LVL-修飾的嵌合TCR包含以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:3-8、23和25；(ii)SEQ ID NO:9-10、23和25；(iii)SEQ ID NO:9、11、23和25；(iv)SEQ ID NO:3-8、16和18；(v)SEQ ID NO:9、10、16和18；或SEQ ID NO:9、11、16和18。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，半胱氨酸-置換的LVL-修飾的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的全長α鏈以及含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的全長β鏈。在這方面，Cys-置換的LVL-修飾的嵌合TCR可以包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:26和27兩者。

TCR(或其功能變體)、多肽或蛋白可以基本上由本文所述的指定氨基酸序列組成，以使得TCR(或其功能變體)、多肽或蛋白的其它成分，例如，其它氨基酸不會實(shí)質(zhì)上改變TCR(或其功能變體)、多肽或蛋白的生物活性。在這方面，本發(fā)明的TCR(或其功能變體)、多肽或蛋白可以例如基本上由SEQ ID NO:12、13、20、22、26、27、29和30中的任何一個氨基酸序列組成。另外，例如，本發(fā)明的TCR(包括其功能變體)、多肽或蛋白可以基本上由SEQ ID NO:9、10、11、14-19、21、23-25、SEQ ID NO:9和10兩者、SEQ ID NO:9和11兩者、SEQ ID NO:14和15兩者、SEQ ID NO:16和18兩者、SEQ ID NO:17和19兩者、SEQ ID NO:23和24兩者、SEQ ID NO:19和21兩者、或SEQ ID NO:23和25兩者的氨基酸序列組成。此外，本發(fā)明的TCR(包括其功能變體)、多肽或蛋白可以基本上由SEQ ID NO:3(α鏈的CDR1)、SEQ ID NO:4(α鏈的CDR2of)、SEQ ID NO:5(α鏈的CDR3)、SEQ ID NO:6(β鏈的CDR1)、SEQ ID NO:7(β鏈的CDR2)、SEQ ID NO:8(β鏈的CDR3)或它們的任意組合，例如SEQ ID NO:3-5；6-8；或3-8的氨基酸序列組成。

本發(fā)明還提供了包含本文所述的任何TCR(或其功能變體)的功能部分的多肽。本文使用的術(shù)語“多肽”包括寡肽并且是指通過一個或多個肽鍵連接的氨基酸的單鏈。

對于本發(fā)明的多肽，功能部分可以為包含其中產(chǎn)生部分的TCR(或其功能變體)的連續(xù)氨基酸的任何部分，前提是功能部分能特異性結(jié)合HPV 16 E7。當(dāng)結(jié)合TCR(或其功能變體)使用時，術(shù)語“功能部分”是指本發(fā)明TCR(或其功能變體)的任何部分或片段，該部分或片段保留了其中產(chǎn)生部分的TCR(或其功能變體)(親本TCR或其親本功能變體)的生物活性。功能部分涵蓋，例如，保留了以與親本TCR(或其功能變體)類似的程度、以與親本TCR(或其功能變體)相同的程度或以比親本TCR(或其功能變體)更高的程度特異性結(jié)合HPV 16E7(例如，以HLA-A2-依賴性方式)或檢測、治療或預(yù)防癌癥的能力的TCR(或其功能變體)的那些部分。就親本TCR(或其功能變體)而言，功能部分可以包含，例如，親本TCR(或其功能變體)的約10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多。

功能部分可以在該部分的氨基端或羧基端或在兩端處包含另外的氨基酸，所述另外的氨基酸不存在于親本TCR或其功能變體的氨基酸序列。期望另外的氨基酸不干擾功能部分的生物功能，例如，特異性結(jié)合HPV 16 E7；和/或具有檢測癌癥、治療或預(yù)防癌癥的能力等。更期望的是，與親本TCR或其功能變體的生物活性相比，另外的氨基酸增強(qiáng)生物活性。

多肽可以包含本發(fā)明的TCR或其功能變體的α和β鏈中的任一個或兩者的功能部分，如包含本發(fā)明的TCR或其功能變體的α鏈和/或β鏈的可變區(qū)中的CDR1、CDR2和CDR3的一個或多個的功能部分。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，多肽可以包含含有SEQ ID NO:3(α鏈的CDR1)、4(α鏈的CDR2)、5(α鏈的CDR3)、6(β鏈的CDR1)、7(β鏈的CDR2)、8(β鏈的CDR3)或它們的組合的氨基酸序列的功能部分。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽包含含有SEQ ID NO:3-5；6-8；或全部SEQ ID NO:3-8的功能部分。更優(yōu)選地，多肽包含含有全部SEQ ID NO:3-8的氨基酸序列的功能部分。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以包含，例如，含有上文所示的CDR區(qū)的組合的本發(fā)明的TCR或其功能變體的可變區(qū)。在這方面，多肽可以包含SEQ ID NO:9(α鏈的可變區(qū))、SEQ ID NO:10，其中SEQ ID NO:10的第2位的X為Ala或Gly(β鏈的可變區(qū))、SEQ ID NO:11(β鏈的可變區(qū))、SEQ ID NO:9和10兩者、或SEQ ID NO:9和11兩者的氨基酸序列。優(yōu)選地，多肽包含SEQ ID NO:9和10兩者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:10的第2位的X為Ala。

本發(fā)明的多肽還可以包含本文所述的來源于任何合適的物種，諸如，例如，人或小鼠的恒定區(qū)或本文所述的任何置換的恒定區(qū)。在這方面，多肽可以包含SEQ ID NO:14(人α鏈的恒定區(qū))、SEQ ID NO:15(人β鏈的恒定區(qū))、SEQ ID NO:16(如本文關(guān)于本發(fā)明的其它方面所述置換的α鏈的恒定區(qū))、SEQ ID NO:17(鼠α鏈的恒定區(qū))、SEQ ID NO:18(如本文關(guān)于本發(fā)明的其它方面所述置換的β鏈的恒定區(qū))、SEQ ID NO:19(鼠β鏈的恒定區(qū))、SEQ ID NO:21(LVL-修飾的α鏈的恒定區(qū))、SEQ ID NO:23(Cys-置換的β鏈的恒定區(qū))、SEQ ID NO:24(Cys-置換的α鏈的恒定區(qū))、SEQ ID NO:25(Cys-置換的LVL-修飾的α鏈的恒定區(qū))、SEQ ID NO:14和15兩者、SEQ ID NO:16和18兩者、SEQ ID NO:17和19兩者、SEQ ID NO:19和21兩者、SEQ ID NO:23和24兩者、或SEQ ID NO:23和25兩者的氨基酸序列。優(yōu)選地，多肽包含SEQ ID NO:14和15兩者、SEQ ID NO:16和18兩者、SEQ ID NO:17和19兩者、SEQ ID NO:19和21兩者、SEQ ID NO:23和24兩者、或SEQ ID NO:23和25兩者。在實(shí)施方案中，包含SEQ ID NO:9和11之一或兩者的氨基酸序列的多肽是分離的或純化的。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以包含可變區(qū)和恒定區(qū)的組合。在這方面，多肽可以包含SEQ ID NO:9和14兩者、SEQ ID NO:9和16兩者、SEQ ID NO:9和17兩者、SEQ ID NO:9和21兩者、SEQ ID NO:9和24兩者、SEQ ID NO:9和25兩者、SEQ ID NO:10和15兩者、SEQ ID NO:10和18兩者、SEQ ID NO:10和19兩者、SEQ ID NO:10和23兩者、SEQ ID NO:11和15兩者、SEQ ID NO:11和18兩者、SEQ ID NO:11和19兩者、SEQ ID NO:11和23兩者、全部SEQ ID NO:3-5和14、全部SEQ ID NO:3-5和16、全部SEQ ID NO:3-5和17、全部SEQ ID NO:3-5和21、全部SEQ ID NO:3-5和24、全部SEQ ID NO:3-5和25、全部SEQ ID NO:6-8和15、全部SEQ ID NO:6-8和18、全部SEQ ID NO:6-8和19、全部SEQ ID NO:6-8和23、全部SEQ ID NO:3-8和14-15、全部SEQ ID NO:3-8、16和18、全部SEQ ID NO:3-8、17和19、全部SEQ ID NO:3-8、19和21、全部SEQ ID NO:3-8、23和24、全部SEQ ID NO:3-8、23和25、全部SEQ ID NO:9-10和14-15、全部SEQ ID NO:9-10、16和18、全部SEQ ID NO:9-10、17和19、全部SEQ ID NO:9-10、19和21、全部SEQ ID NO:9-10、23和24、全部SEQ ID NO:9-10、23和25、全部SEQ ID NO:9、11和14-15、全部SEQ ID NO:9、11、16和18、全部SEQ ID NO:9、11、17和19、全部SEQ ID NO:9、11、19和21、全部SEQ ID NO:9、11、23和24、或全部SEQ ID NO:9、11、23和25?？梢匀绫疚年P(guān)于本發(fā)明的其它方面所述來置換SEQ ID NO:16和18。在實(shí)施方案中，包含(i)SEQ ID NO:9和14以及(ii)SEQ ID NO:11和15之一或兩者的氨基酸序列的多肽是分離的或純化的。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以包含本文所述的TCR或其功能變體之一的α或β鏈的整個長度。在這方面，本發(fā)明的多肽可以包含以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:12、13、20、22、26、27、29、30中的任一個；(ii)SEQ ID NO:9、24和27；(iii)SEQ ID NO:9、17和20；或(iv)SEQ ID NO:9、10、16和18?？梢匀绫疚年P(guān)于本發(fā)明的其它方面所述來置換SEQ ID NO:16和18。

可選地，本發(fā)明的多肽可以包含本文所述的TCR或其功能變體的α和β鏈。例如，本發(fā)明的多肽可以包含SEQ ID NO:12和13兩者；SEQ ID NO:20和22兩者；SEQ ID NO:26和27兩者；全部SEQ ID NO:9、24和27；全部SEQ ID NO:9、17和20；或全部SEQ ID NO:9、10、16和18的氨基酸序列。優(yōu)選地，多肽包含SEQ ID NO:12和13兩者；SEQ ID NO:20和22兩者；SEQ ID NO:26和27兩者；全部SEQ ID NO:9、24和27；全部SEQ ID NO:9、17和20；或全部SEQ ID NO:9、10、16和18的氨基酸序列?？梢匀绫疚年P(guān)于本發(fā)明的其它方面所述來置換SEQ ID NO:16和18。在實(shí)施方案中，包含SEQ ID NO:12和13之一或兩者的氨基酸序列的多肽是分離的或純化的。

本發(fā)明還提供了包含本文所述的多肽中的至少一種的蛋白?！暗鞍住币庵赴粭l或多條多肽鏈的分子。在實(shí)施方案中，包含(a)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的氨基酸序列之一或兩者，其中SEQ ID NO:10的第2位的X為Gly，或(b)SEQ ID NO:12和13之一或兩者的蛋白是分離的或純化的。

在實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白可以包含含有SEQ ID NO:3-5的氨基酸序列的第一多肽鏈以及含有SEQ ID NO:6-8的氨基酸序列的第二多肽鏈?？蛇x地或另外地，本發(fā)明的蛋白可以包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的第一多肽鏈以及含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的第二多肽鏈，其中(i)SEQ ID NO:10的第2位的X為Ala或Gly，以及(ii)包含SEQ ID NO:9和10的蛋白，其中SEQ ID NO:10的第2位的X為Gly，是分離的或純化的。蛋白可以，例如，包含含有(i)SEQ ID NO:12、(ii)SEQ ID NO:22、(iii)SEQ ID NO:26、(iv)SEQ ID NO:9和16、(v)SEQ ID NO:9和17、或(vi)SEQ ID NO:9和24的氨基酸序列的第一多肽鏈以及含有(i)SEQ ID NO:10和18，或(ii)SEQ ID NO:13、20和27中任一個的氨基酸序列的第二多肽鏈，其中包含SEQ ID NO:12和13的蛋白是分離的或純化的，以及SEQ ID NO:16和18是如本文關(guān)于本發(fā)明的其它方面所述進(jìn)行置換的。在這種情況下，本發(fā)明的蛋白可以為TCR。可選地，如果，例如，蛋白包含含有SEQ ID NO:12和13兩者，SEQ ID NO:20和22兩者，SEQ ID NO:26和27兩者，全部SEQ ID NO:9、10、16和18，全部SEQ ID NO:9、17和20，全部SEQ ID NO:9、24和27的單條多肽鏈，或如果蛋白的第一和/或第二多肽鏈還包含其它氨基酸序列，例如，編碼免疫球蛋白或其部分的氨基酸序列，則本發(fā)明的蛋白可以為融合蛋白。在這方面，本發(fā)明還提供了包含至少一種本文所述的本發(fā)明多肽以及至少一種其它多肽的融合蛋白。其它多肽可以作為融合蛋白的單獨(dú)的多肽存在，或可以以這樣的多肽存在：其與本文所述的本發(fā)明多肽之一框內(nèi)(串聯(lián))表達(dá)。其它多肽可以編碼任何肽分子或蛋白分子或它們的部分，包括但不限于免疫球蛋白，CD3，CD4，CD8，MHC分子，CD1分子，例如，CD1a、CD1b、CD1c、CD1d等。

融合蛋白可以包含一個或多個拷貝的本發(fā)明多肽和/或一個或多個拷貝的其它多肽。例如，融合蛋白可以包含1、2、3、4、5或更多拷貝的本發(fā)明的多肽和/或其它多肽。制備融合蛋白的合適的方法為本領(lǐng)域已知并且包括，例如，重組方法。參見，例如，Choi等,Mol.Biotechnol.31:193-202(2005)。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的TCR(及其功能部分和功能變體)、多肽和蛋白可以被表達(dá)為單個蛋白，其包含連接α鏈和β鏈的接頭肽。在這方面，本發(fā)明的包含SEQ ID NO:12和13兩者，SEQ ID NO:20和22兩者，SEQ ID NO:26和27，全部SEQ ID NO:9、10、16和18，全部SEQ ID NO:9、17和20，全部SEQ ID NO:9、24和27的TCR(及其功能變體和功能部分)、多肽和蛋白還可以包含接頭肽。接頭肽可以有利地促進(jìn)宿主細(xì)胞中重組的TCR(包括其功能部分和功能變體)、多肽和/或蛋白的表達(dá)。接頭肽可以包含任何合適的氨基酸序列。例如，接頭肽可以包含SEQ ID NO:28。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，包含α鏈、β鏈和接頭的蛋白可以包含SEQ ID NO:29(LVL-修飾的嵌合TCR)或SEQ ID NO:30(Cys-置換的LVL-修飾的嵌合TCR)。在宿主細(xì)胞表達(dá)包含接頭肽的構(gòu)建體后，接頭肽可以被切除，從而產(chǎn)生分開的α和β鏈。

本發(fā)明的蛋白可以為包含至少一種本文所述的本發(fā)明多肽的重組抗體。如本文所用，“重組抗體”是指包含至少一種本發(fā)明的多肽和抗體或其部分的多肽鏈的重組(例如，基因工程改造的)蛋白?？贵w或其部分的多肽可以是抗體的重鏈、輕鏈、重鏈或輕鏈的可變區(qū)或恒定區(qū)、單鏈可變片段(scFv)或Fc、Fab或F(ab)₂'片段等?？贵w或其部分的多肽鏈可以作為重組抗體的單獨(dú)的多肽存在?？蛇x地，抗體或其部分的多肽鏈可以以這樣的多肽存在：所述多肽與本發(fā)明的多肽框內(nèi)(串聯(lián))表達(dá)。抗體或其部分的多肽可以為任何抗體或任何抗體片段(包括本文所述的任何抗體和抗體片段)的多肽。

本發(fā)明的TCR、多肽和蛋白(包括其功能變體)可以為任何長度，即可以包含任何數(shù)目的氨基酸，前提是TCR、多肽或蛋白(或其功能變體)保留它們的生物活性，例如，特異性結(jié)合HPV 16 E7；檢測哺乳動物中的癌癥、HPV 16感染或HPV陽性初癌；或治療或預(yù)防哺乳動物中的癌癥、HPV 16感染或HPV陽性初癌等的能力。例如，多肽可以為約50至約5000個氨基酸的長度，如50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多個氨基酸的長度。在這方面，本發(fā)明的多肽也包括寡肽。

本發(fā)明的TCR、多肽和蛋白(包括其功能變體)可以包含代替一個或多個天然存在的氨基酸的合成氨基酸。此類合成氨基酸為本領(lǐng)域已知的，并且包括例如氨基環(huán)己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高絲氨酸、S-乙?；奔谆?半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羥脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基絲氨酸β-羥基苯丙氨酸、苯甘氨酸、α-萘基丙氨酸、環(huán)己基丙氨酸、環(huán)己基甘氨酸、二氫吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸單酰胺、N’-芐基-N’-甲基-賴氨酸、N’,N’-二芐基-賴氨酸、6-羥賴氨酸、鳥氨酸、α-氨基環(huán)戊烷羧酸、α-氨基環(huán)己烷羧酸、α-氨基環(huán)庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,γ-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。

本發(fā)明的TCR、多肽和蛋白(包括其功能變體)可以被糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-?；?、經(jīng)由例如二硫橋而環(huán)化，或被轉(zhuǎn)化成酸加成鹽和/或任選地二聚化或聚合或綴合。

本發(fā)明的TCR、多肽和/或蛋白(包括其功能變體)可以通過本領(lǐng)域已知的方法獲得。從頭合成多肽和蛋白的合適的方法描述在諸如Chan等,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2005；Peptide and Protein Drug Analysis,ed.Reid,R.,Marcel Dekker,Inc.,2000；Epitope Mapping,ed.Westwood等,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2000的參考文獻(xiàn)；以及美國專利第5,449,752號中。另外，多肽和蛋白可以利用標(biāo)準(zhǔn)的重組方法使用本文所述的核酸重組產(chǎn)生。參見，例如，Green and Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4^th ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY 2012；以及Ausubel等,Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,NY,1994。此外，本發(fā)明的一些TCR、多肽和蛋白(包括其功能變體)可以分離自和/或純化自諸如植物、細(xì)菌、昆蟲、哺乳動物(如大鼠、人等)的來源。分離和純化的方法為本領(lǐng)域熟知的?？蛇x地，本文所述的TCR、多肽和/或蛋白(包括其功能變體)可以通過諸如Synpep(Dublin,CA)、Peptide Technologies Corp.(Gaithersburg,MD)和Multiple Peptide Systems(San Diego,CA)的公司商業(yè)合成。在這方面，本發(fā)明的TCR(包括其功能變體)、多肽和蛋白可以為合成的、重組的、分離的和/或純化的。

包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的是包含本發(fā)明的TCR、多肽或蛋白(包括它們的任何功能變體)、核酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、宿主細(xì)胞群體或抗體或其抗原結(jié)合部分的任何一種的綴合物，例如，生物綴合物。綴合物以及通常合成綴合物的方法為本領(lǐng)域已知的(參見，例如，Hudecz,F.,Methods Mol.Biol.298:209-223(2005)和Kirin等,Inorg Chem.44(15):5405-5415(2005))。

本發(fā)明的實(shí)施方案提供了包含編碼本文所述的TCR(包括其功能部分和功能變體)、多肽或蛋白的任何一種的核苷酸序列的核酸序列。本文使用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意指DNA或RNA的聚合物，其可為單鏈或雙鏈的，合成的或由天然來源獲得的(例如分離的和/或純化的)，其可以含有天然的、非天然的或改變的核苷酸，以及其可以含有天然的、非天然的或改變的核苷酸間連鍵，如氨基磷酸酯鍵或硫代磷酸酯鍵替代未修飾的寡核苷酸的核苷酸之間存在的磷酸二酯。在實(shí)施方案中，核酸包括互補(bǔ)的DNA(cDNA)。通常優(yōu)選的是核酸不包含任何插入、缺失、倒置和/或置換。然而，在一些情況下，如本文所討論的，包含一個或多個插入、缺失、倒置和/或置換的核酸可能為合適的。

優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸為重組體。如本文所用，術(shù)語“重組體”是指(i)通過將天然或合成的核酸區(qū)段與可以在活細(xì)胞中復(fù)制的核酸分子連接而在活細(xì)胞外構(gòu)建的分子，或(ii)由以上(i)中所述的那些分子的復(fù)制所產(chǎn)生的分子。為了本文的目的，復(fù)制可為體外復(fù)制或體內(nèi)復(fù)制。

可以使用本領(lǐng)域已知的程序基于化學(xué)合成和/或酶促連接反應(yīng)構(gòu)建核酸。參見，例如，Green and Sambrook等，見上文和Ausubel等,見上文。例如，核酸可以使用天然存在的核苷酸或?yàn)樵黾臃肿拥纳锓€(wěn)定性或增加雜交后形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性而設(shè)計(jì)的不同修飾的核苷酸(如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)化學(xué)合成。可以用于生成核酸的修飾的核苷酸的實(shí)例包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基辮苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N⁶-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N⁶-取代的腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辮苷(beta-D-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、懷丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辮苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤?？蛇x地，本發(fā)明的一種或多種核酸可以購自諸如Macromolecular Resources(Fort Collins,CO)和Synthegen(Houston,TX)的公司。

核酸可以包含編碼本文所述的TCR、多肽、蛋白或它們的功能變體的任何一種的任何核苷酸序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，核苷酸序列可以包含以下，由以下組成或基本上由以下組成：SEQ ID NO:31(人的野生型TCR的α鏈，)、SEQ ID NO:32(人的野生型TCR的β鏈)、SEQ ID NO:33(LVL-修飾的嵌合TCR的α鏈)、SEQ ID NO:34(嵌合TCR的β鏈)、SEQ ID NO:35(Cys-置換的LVL-修飾的嵌合TCR的α鏈)、SEQ ID NO:36(Cys-置換的嵌合TCR的β鏈)、SEQ ID NO:31和32兩者、SEQ ID NO:33和34兩者、或SEQ ID NO:35和36兩者。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，核酸包含非天然核苷酸序列。如果核苷酸序列在自然界中不存在，則該核苷酸序列可以被認(rèn)為是“非天然的”。在一些實(shí)施方案中，核苷酸序列可以為密碼子優(yōu)化的。不受特定理論或機(jī)制的束縛，認(rèn)為核苷酸序列的密碼子優(yōu)化增加mRNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯效率。核苷酸序列的密碼子優(yōu)化可以涉及將天然密碼子置換為編碼相同氨基酸，但可以被細(xì)胞內(nèi)更容易獲得的tRNA翻譯的另一密碼子，從而增加翻譯效率。核苷酸序列的優(yōu)化還可以減少干擾翻譯的mRNA的二級結(jié)構(gòu)，從而增加翻譯效率。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，密碼子優(yōu)化的核苷酸序列可以包含以下，由以下組成或基本上由以下組成：SEQ ID NO:33-36、SEQ ID NO:33和34兩者或SEQ ID NO:35和36兩者。

本發(fā)明還提供了核酸，其包含與本文所述的任何核酸的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列或在嚴(yán)緊條件下與本文所述的任何核酸的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。

在嚴(yán)緊條件下雜交的核苷酸序列優(yōu)選在高嚴(yán)緊條件下雜交?！案邍?yán)緊條件”意指核苷酸序列以可檢測地強(qiáng)于非特異性雜交的量與靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)特異性雜交。高嚴(yán)緊條件包括這樣的條件：其區(qū)分具有精確互補(bǔ)序列的多核苷酸，或僅含有少數(shù)分散錯配的多核苷酸與碰巧具有匹配核苷酸序列的一些小區(qū)域(例如，3-10個堿基)的隨機(jī)序列。相比14-17個或更多個堿基的全長互補(bǔ)物，此類小的互補(bǔ)區(qū)域更容易熔解，并且高嚴(yán)緊雜交使得它們易于被區(qū)分。相對高的嚴(yán)緊條件將包括，例如，低鹽和/或高溫條件，如在約50-70℃的溫度下通過約0.02-0.1M NaCl或等同物提供的。此類高嚴(yán)緊條件容許核苷酸序列與模板或靶鏈之間很少(如果有的話)的錯配，并且特別適于檢測任何本發(fā)明TCR(包括其功能部分和功能變體)的表達(dá)。通常應(yīng)理解可以通過加入增加量的甲酰胺使條件更嚴(yán)緊。

本發(fā)明還提供包含與本文所述的任何核酸具有至少約70％或更多，例如，約80％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％同一性的核苷酸序列的核酸。

本發(fā)明的核酸可以摻入至重組表達(dá)載體中。在這方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的任何核酸的重組表達(dá)載體。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，重組表達(dá)載體包含編碼α鏈、β鏈和接頭肽的核苷酸序列。例如，在實(shí)施方案中，重組表達(dá)載體包含含有SEQ ID NO:39(編碼嵌合α和β鏈的SEQ ID NO:20和22(在它們之間具有接頭)，其中編碼β鏈的核苷酸序列位于編碼α鏈的核苷酸序列的5’處)或SEQ ID NO:40(編碼嵌合α和β鏈的SEQ ID NO:26和27(在它們之間具有接頭)，其中編碼β鏈的核苷酸序列位于編碼α鏈的核苷酸序列的5’處)的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列。

為了本文的目的，術(shù)語“重組表達(dá)載體”意指基因修飾的寡核苷酸或多核苷酸構(gòu)建體，當(dāng)構(gòu)建體包含編碼mRNA、蛋白、多肽或肽的核苷酸序列，并且在足以在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)mRNA、蛋白、多肽或肽的條件下將載體與宿主細(xì)胞接觸時，所述基因修飾的寡核苷酸或多核苷酸構(gòu)建體允許該宿主細(xì)胞表達(dá)mRNA、蛋白、多肽或肽。本發(fā)明的載體并非是整個天然存在的。然而，載體的部分可以為天然存在的。本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以包含任何類型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，所述DNA和RNA可為單鏈或雙鏈，合成的或部分由天然來源獲得，并且可以含有天然的、非天然的或改變的核苷酸。重組表達(dá)載體可以包含天然存在的、非天然存在的核苷酸間連鍵或這兩種類型的連鍵。優(yōu)選地，非天然存在的或改變的核苷酸或核苷酸間連鍵不會阻礙載體的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制。

本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以為任何合適的重組表達(dá)載體，并且可被用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染任何合適的宿主細(xì)胞。合適的載體包括設(shè)計(jì)用于繁殖和擴(kuò)增或用于表達(dá)或這兩者的那些載體，如質(zhì)粒和病毒。載體可以選自pUC系列(Fermentas Life Sciences)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,CA)、pET系列(Novagen,Madison,WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)和pEX系列(Clontech,Palo Alto,CA)。也可使用噬菌體載體，如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。植物表達(dá)載體的實(shí)例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。動物表達(dá)載體的實(shí)例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。優(yōu)選地，重組表達(dá)載體為病毒載體，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組表達(dá)載體為MSGV1載體。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組表達(dá)載體包含編碼本文所述的任何TCR(包括其功能部分和功能變體)的α鏈和β鏈的核苷酸序列，其中編碼β鏈的核苷酸序列位于編碼α鏈的核苷酸序列的5’處。在這方面，編碼α鏈的核苷酸序列可以位于編碼β鏈的核苷酸序列的3’處。不受特定理論或機(jī)制的束縛，認(rèn)為相對于編碼β鏈的核苷酸序列位于編碼α鏈的核苷酸序列的3’處，編碼β鏈的核苷酸序列位于編碼α鏈的核苷酸序列的5’處可以提供增加的HPV 16 E7⁺靶標(biāo)的識別、增加的宿主細(xì)胞的表達(dá)和增加的抗腫瘤活性中的任何一種或多種。在次優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼β鏈的核苷酸序列位于編碼α鏈的核苷酸序列的3’處。在這方面，編碼α鏈的核苷酸序列可以位于編碼β鏈的核苷酸序列的5’處。在實(shí)施方案中，包含編碼LVL-修飾的嵌合TCR(其包含本發(fā)明的SEQ ID NO:20和22)的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列的MSGV1載體包含SEQ ID NO:37，其中編碼β鏈的核苷酸序列位于編碼α鏈的核苷酸序列的5’處。在另一實(shí)施方案中，包含編碼Cys-置換的LVL-修飾的嵌合TCR(其包含本發(fā)明的SEQ ID NO:26和27)的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列的MSGV1載體包含SEQ ID NO:38，其中編碼β鏈的核苷酸序列位于編碼α鏈的核苷酸序列的5’處。

本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以使用在例如Green and Sambrook等,見上文以及Ausubel等,見上文中描述的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)行制備?？梢灾苽浜性谠嘶蛘婧怂拗骷?xì)胞中有功能的復(fù)制系統(tǒng)的表達(dá)載體的構(gòu)建體，其為環(huán)狀或線性的。復(fù)制系統(tǒng)可以來源于，例如，ColEl、2μ質(zhì)粒、λ、SV40、牛乳頭瘤病毒等。

期望重組表達(dá)載體包含調(diào)控序列，如轉(zhuǎn)錄和翻譯起始密碼子和終止密碼子，其對待引入載體的宿主細(xì)胞類型(例如細(xì)菌、真菌、植物或動物)為特異的，視情況而定并且考慮載體是否基于DNA或RNA。

重組表達(dá)載體可以包含一個或多個標(biāo)記基因，所述標(biāo)記基因允許對轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇。標(biāo)記基因包括殺菌劑抗性，例如對抗生素、重金屬等的抗性，與營養(yǎng)缺陷型宿主細(xì)胞互補(bǔ)以提供原養(yǎng)型等。本發(fā)明表達(dá)載體的合適標(biāo)記基因包括，例如新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、組氨醇抗性基因、四環(huán)素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因。

重組表達(dá)載體可以包含天然或非天然的啟動子，其可操作地連接至編碼TCR、多肽或蛋白(包括其功能變體)的核苷酸序列或可操作地連接至與編碼TCR、多肽或蛋白(包括其功能變體)的核苷酸序列互補(bǔ)或雜交的核苷酸序列。啟動子的選擇，例如強(qiáng)、弱、可誘導(dǎo)的、組織特異的和發(fā)育特異的，在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力內(nèi)。類似地，核苷酸序列與啟動子的組合也在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力內(nèi)。啟動子可以為非病毒啟動子或病毒啟動子，例如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子、SV40啟動子、RSV啟動子或在鼠干細(xì)胞病毒的長末端重復(fù)序列中存在的啟動子。

本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以被設(shè)計(jì)用于瞬時表達(dá)、用于穩(wěn)定表達(dá)或兩者。另外，可以制備用于組成型表達(dá)或用于誘導(dǎo)型表達(dá)的重組表達(dá)載體。此外，可以制備包含自殺基因的重組表達(dá)載體。

如本文所用，術(shù)語“自殺基因”是指引起表達(dá)自殺基因的細(xì)胞死亡的基因。自殺基因可以為，該基因在細(xì)胞中表達(dá)后賦予對藥劑例如藥物的敏感性，并且當(dāng)細(xì)胞與藥劑接觸或暴露于藥劑時引起細(xì)胞死亡的基因。自殺基因?yàn)楸绢I(lǐng)域已知的(參見，例如，Suicide Gene Therapy:Methods and Reviews,Springer,Caroline J.(Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research,Sutton,Surrey,UK),Humana Press,2004)并且包括，例如，單純性皰疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脫氨酶基因、嘌呤核苷磷酸化酶基因和硝基還原酶基因。

本發(fā)明的另一實(shí)施方案還提供了包含本文所述的任何重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指可以含有本發(fā)明的重組表達(dá)載體的任何類型的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以為真核細(xì)胞，例如，植物、動物、真菌或藻類，或可以為原核細(xì)胞，例如，細(xì)菌或原生動物。宿主細(xì)胞可以為培養(yǎng)的細(xì)胞或原代細(xì)胞，即直接分離自生物體，例如人。宿主細(xì)胞可以為貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞，即懸浮生長的細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞為本領(lǐng)域已知的并且包括，例如，DH5α大腸桿菌細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞、猴VERO細(xì)胞、COS細(xì)胞、HEK293細(xì)胞等。為了擴(kuò)增或復(fù)制重組表達(dá)載體的目的，宿主細(xì)胞優(yōu)選為原核細(xì)胞，例如，DH5α細(xì)胞。為了產(chǎn)生重組的TCR、多肽或蛋白的目的，宿主細(xì)胞優(yōu)選為哺乳動物細(xì)胞。最優(yōu)選地，宿主細(xì)胞為人細(xì)胞。雖然宿主細(xì)胞可以為任何細(xì)胞類型的細(xì)胞，可以源于任何類型的組織，并且可以為任何發(fā)育階段的細(xì)胞，但宿主細(xì)胞優(yōu)選為外周血淋巴細(xì)胞(PBL)或外周血單核細(xì)胞(PBMC)。更優(yōu)選地，宿主細(xì)胞為T細(xì)胞。

為了本文的目的，T細(xì)胞可為任何T細(xì)胞，如培養(yǎng)的T細(xì)胞，例如原代T細(xì)胞或來自培養(yǎng)的T細(xì)胞系的T細(xì)胞，例如Jurkat、SupTl等，或從哺乳動物獲得的T細(xì)胞。如果從哺乳動物獲得，則T細(xì)胞可從許多來源獲得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴結(jié)、胸腺或其它組織或液體。T細(xì)胞也可被富集或純化。優(yōu)選地，T細(xì)胞為人T細(xì)胞。更優(yōu)選地，T細(xì)胞為分離自人的T細(xì)胞。T細(xì)胞可以為任何類型的T細(xì)胞并且可以為任何發(fā)育階段的T細(xì)胞，包括但不限于CD4⁺/CD8⁺雙陽性T細(xì)胞、CD4⁺輔助性T細(xì)胞，例如Th₁和Th₂細(xì)胞、CD4⁺T細(xì)胞、CD8⁺T細(xì)胞(例如，細(xì)胞毒性T細(xì)胞)、腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TIL)、記憶性T細(xì)胞(例如，中心記憶性T細(xì)胞和效應(yīng)記憶性T細(xì)胞)、初始T細(xì)胞等。

本發(fā)明還提供了包含至少一種本文所述的宿主細(xì)胞的細(xì)胞群體。細(xì)胞群體可以為異質(zhì)群體，除了至少一種不包含任何重組表達(dá)載體的其它細(xì)胞，例如宿主細(xì)胞(例如T細(xì)胞)，或T細(xì)胞之外的細(xì)胞，例如B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、腦細(xì)胞等之外，所述異質(zhì)群體還包含含有所述的任何重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞?？蛇x地，細(xì)胞群體可為大體上同質(zhì)的群體，其中所述群體主要包含含有重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞(例如，基本上由其組成)。群體也可為克隆細(xì)胞群體，其中群體的所有細(xì)胞為包含重組表達(dá)載體的單個宿主細(xì)胞的克隆，以使得群體的所有細(xì)胞包含重組表達(dá)載體。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，細(xì)胞群體為克隆群體，所述克隆群體包含含有如本文所述的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，群體中細(xì)胞的數(shù)目可以快速地?cái)U(kuò)增。T細(xì)胞數(shù)目的擴(kuò)增可以通過如例如，美國專利8,034,334；美國專利8,383,099；美國專利申請公開號2012/0244133；Dudley等,J.Immunother.,26:332-42(2003)；以及Riddell等,J.Immunol.Methods,128:189-201(1990)中所述的本領(lǐng)域已知的許多方法的任一個來實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明還提供了抗體或其抗原結(jié)合部分，其能特異性結(jié)合本文所述的任何TCR的功能部分(或其功能變體)。優(yōu)選地，功能部分能特異性結(jié)合癌癥抗原，例如，功能部分包含SEQ ID NO:3(α鏈的CDR1)、4(α鏈的CDR2)、5(α鏈的CDR3)、6(β鏈的CDR1)、7(β鏈的CDR2)、8(β鏈的CDR3)、SEQ ID NO:9(α鏈的可變區(qū))、SEQ ID NO:10(β鏈的可變區(qū))、SEQ ID NO:11(β鏈的可變區(qū))或它們的組合，例如，3-5；6-8；3-8；9；10；11；9-10；或9和11的氨基酸序列。更優(yōu)選地，功能部分包含SEQ ID NO:3-8；SEQ ID NO:9和10；或SEQ ID NO:9和11的氨基酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分能結(jié)合由全部6個CDR(α鏈的CDR1-3和β鏈的CDR1-3)形成的表位。抗體可以為本領(lǐng)域已知的任何類型的免疫球蛋白。例如，抗體可以為任何同種型的抗體，例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等?？贵w可以為單克隆或多克隆的?？贵w可以為天然存在的抗體，例如，分離和/或純化自哺乳動物(例如，小鼠、兔、山羊、馬、雞、倉鼠、人等)的抗體?？蛇x地，抗體可以為基因工程改造的抗體，例如，人源化抗體或嵌合抗體?？贵w可以為單體形式或聚合形式。另外，抗體可以對本發(fā)明TCR(或其功能變體)的功能部分具有任何水平的親和力或親合力。期望抗體對本發(fā)明的TCR的功能部分(或其功能變體)為特異的，以使得與其它肽或蛋白存在最小的交叉反應(yīng)。

測試抗體結(jié)合本發(fā)明TCR的任何功能部分或功能變體的能力的方法為本領(lǐng)域已知的并且包括任何抗體-抗原結(jié)合測定，諸如，例如，放射性免疫測定(RIA)、ELISA、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀和競爭性抑制測定(參見，例如Janeway等,下文和美國專利申請公開號2002/0197266A1)。

制備抗體的合適的方法為本領(lǐng)域已知的。例如，標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤方法描述在，例如，and Milstein,Eur.J.Immunol.,5,511-519(1976),Harlow and Lane(eds.),Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press(1988)以及C.A.Janeway等(eds.),Immunobiology,8^th Ed.,Garland Publishing,New York,NY(2011))中。可選地，其它方法，如EBV-雜交瘤方法(Haskard and Archer,J.Immunol.Methods,74(2),361-67(1984)以及Roder等,Methods Enzymol.,121,140-67(1986))和噬菌體載體表達(dá)系統(tǒng)(參見，例如，Huse等,Science,246,1275-81(1989))為本領(lǐng)域已知的。此外，在非人動物中產(chǎn)生抗體的方法描述在，例如，美國專利5,545,806、5,569,825和5,714,352以及美國專利公開號2002/0197266A1中。

此外，噬菌體展示可用于生成本發(fā)明的抗體。在這方面，編碼抗體的抗原結(jié)合可變(V)結(jié)構(gòu)域的噬菌體文庫可以使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)生成(參見，例如，Green and Sambrook等(eds.),Molecular Cloning,A Laboratory Manual,4^th Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2012))。選擇編碼具有期望特異性的可變區(qū)的噬菌體來特異性結(jié)合期望抗原，并重建包含選定的可變結(jié)構(gòu)域的完整或部分抗體。將編碼重建抗體的核酸序列引入合適的細(xì)胞系，諸如用于雜交瘤產(chǎn)生的骨髓瘤細(xì)胞，以使得細(xì)胞分泌具有單克隆抗體特性的抗體(參見，例如，Janeway等,見上文,Huse等,見上文和美國專利6,265,150)。

抗體可以通過針對特定的重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因而轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生。此類方法為本領(lǐng)域已知的并且描述在，例如美國專利5,545,806和5,569,825以及Janeway等,見上文中。

生成人源化抗體的方法為本領(lǐng)域熟知的并且詳細(xì)描述在例如Janeway等,見上文，美國專利5,225,539、5,585,089和5,693,761，歐洲專利第0239400B1號以及英國專利第2188638號中。人源化抗體也可以使用，例如，美國專利5,639,641和Pedersen等,J.Mol.Biol.,235,959-973(1994)中所述的抗體表面重塑技術(shù)生成。

本發(fā)明還提供了本文所述的任何抗體的抗原結(jié)合部分?？乖Y(jié)合部分可以為具有至少一個抗原結(jié)合位點(diǎn)的任何部分，如Fab、F(ab')₂、dsFv、sFv、雙抗體和三鏈抗體。

可以使用常規(guī)的重組DNA技術(shù)方法(參見，如，Janeway等，見上文)生成單鏈可變區(qū)片段(sFv)抗體片段，其由截短的Fab片段組成，所述截短的Fab片段包含經(jīng)由合成肽連接至抗體輕鏈的V結(jié)構(gòu)域的抗體重鏈的可變(V)結(jié)構(gòu)域。類似地，二硫化物穩(wěn)定的可變區(qū)片段(dsFv)可以通過重組DNA技術(shù)制備(參見，例如，Reiter等,Protein Engineering,7,697-704(1994))。然而，本發(fā)明的抗體片段不限于這些示例性的抗體片段類型。

另外，抗體或其抗原結(jié)合部分可修飾為包含可檢測標(biāo)記，諸如，例如放射性同位素、熒光團(tuán)(例如異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE))、酶(例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶)和元素顆粒(例如金顆粒)。

本發(fā)明的TCR、多肽、蛋白(包括其功能變體)、核酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞(包括其群體)和抗體(包括其抗原結(jié)合部分)可以是分離的和/或純化的。本文使用的術(shù)語“分離的”意指已經(jīng)脫離其天然環(huán)境。本文使用的術(shù)語“純化的”意指純度已經(jīng)增加，其中“純度”為相對術(shù)語，并且不一定解釋為絕對純度。例如，純度可以為至少約50％，可以大于60％、70％、80％、90％、95％或可以為100％。

本發(fā)明的TCR、多肽、蛋白(包括其功能變體)、核酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞(包括其群體)和抗體(包括其抗原結(jié)合部分)，在下文中其全部被統(tǒng)稱為“本發(fā)明的TCR物質(zhì)”，可以被配制成組合物，如藥物組合物。在這方面，本發(fā)明提供了包含本文所述的TCR、多肽、蛋白、功能部分、功能變體、核酸、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞(包括其群體)和抗體(包括其抗原結(jié)合部分)的任何一種以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。含有任何本發(fā)明的TCR物質(zhì)的本發(fā)明的藥物組合物可以包含多于一種本發(fā)明的TCR物質(zhì)，例如，多肽和核酸，或兩種或更多種不同的TCR(包括其功能部分和功能變體)?？蛇x地，藥物組合物可以包含與另一藥物活性劑或藥物如化學(xué)治療劑，例如天冬酰胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、柔紅霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔單抗(rituximab)、長春堿、長春新堿等組合的本發(fā)明的TCR物質(zhì)。

優(yōu)選地，載體為藥學(xué)上可接受的載體。關(guān)于藥物組合物，載體可以為常規(guī)地用于考慮中的本發(fā)明的具體TCR物質(zhì)的那些中的任何一種。此類藥學(xué)上可接受的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且公眾容易獲得。優(yōu)選的是在使用條件下無有害的副作用或毒性的藥學(xué)上可接受的載體。

載體的選擇將部分由本發(fā)明的具體TCR物質(zhì)以及用于施用本發(fā)明TCR物質(zhì)的具體方法來確定。因此，存在本發(fā)明的藥物組合物的多種合適的制劑。合適的制劑可以包括任何用于口服、腸胃外、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)或腹膜內(nèi)施用的那些制劑。可以使用多于一種途徑來施用本發(fā)明的TCR物質(zhì)，并且在某些情況下，特定的途徑可以提供比另一途徑更直接且更有效的應(yīng)答。

優(yōu)選地，本發(fā)明的TCR物質(zhì)通過注射例如靜脈內(nèi)施用。當(dāng)本發(fā)明的TCR物質(zhì)為表達(dá)本發(fā)明的TCR(或其功能變體)的宿主細(xì)胞時，用于注射的細(xì)胞的藥學(xué)上可接受的載體可以包括任何等滲載體，諸如，例如，生理鹽水(約0.90％w/v的NaCl水溶液、約300mOsm/L的NaCl水溶液或約9.0g NaCl/L水)、NORMOSOL R電解質(zhì)溶液(Abbott, Chicago,IL)、PLASMA-LYTE A(Baxter,Deerfield,IL)、約5％葡萄糖水溶液或林格氏乳酸鹽水溶液。在實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的載體補(bǔ)充有人血清白蛋白。

為了本發(fā)明的目的，施用的本發(fā)明TCR物質(zhì)的量或劑量(例如，本發(fā)明的TCR物質(zhì)為一種或多種細(xì)胞時的細(xì)胞的數(shù)目)應(yīng)足以在合理的時間范圍內(nèi)引起受試者或動物的例如治療性或預(yù)防性響應(yīng)。例如，本發(fā)明的TCR物質(zhì)的劑量應(yīng)在從施用時起約2小時或更久，例如12小時至24小時或更久時間的時段內(nèi)足以結(jié)合癌癥抗原或檢測、治療或預(yù)防癌癥。在某些實(shí)施方案中，時間段甚至可以更久。劑量將由本發(fā)明的具體TCR物質(zhì)的功效和動物(例如人)的狀況以及待治療的動物(例如人)的體重來確定。

用于確定施用劑量的許多測定為本領(lǐng)域已知的。為了本發(fā)明的目的，測定可用于確定待施用于哺乳動物的起始劑量，所述測定包括，將給定劑量的表達(dá)本發(fā)明TCR(或其功能變體或功能部分)、多肽或蛋白的T細(xì)胞施用于一組哺乳動物中的哺乳動物(各自被給予不同劑量的T細(xì)胞)后，比較靶細(xì)胞裂解或由此類T細(xì)胞分泌的IFN-γ所達(dá)到的程度。在施用某劑量后，靶細(xì)胞裂解或IFN-γ分泌所達(dá)到的程度可以通過本領(lǐng)域已知的方法測定。

本發(fā)明TCR物質(zhì)的劑量也通過可能伴隨本發(fā)明具體TCR物質(zhì)的施用的任何不利副作用的存在、性質(zhì)和程度來確定。通常，主治醫(yī)師決定治療每個個體患者的本發(fā)明TCR物質(zhì)的劑量，這考慮到多種因素，如年齡、體重、一般健康、飲食、性別、待施用的本發(fā)明TCR物質(zhì)、施用途徑以及治療病況的嚴(yán)重程度。在本發(fā)明的TCR物質(zhì)為細(xì)胞群體的實(shí)施方案中，每次輸注施用的細(xì)胞數(shù)目可以例如從約1×10⁶至約1×10¹²個細(xì)胞或更多變化。在某些實(shí)施方案中，可以施用少于1x 10⁶個細(xì)胞。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)容易地理解本發(fā)明的TCR物質(zhì)可以以許多方式進(jìn)行修飾，以使得本發(fā)明TCR物質(zhì)的治療性或預(yù)防性功效通過修飾增加。例如，本發(fā)明的TCR物質(zhì)可以直接地或通過橋間接地綴合于靶向部分。將化合物，例如本發(fā)明的TCR物質(zhì)綴合于靶向部分的實(shí)踐為本領(lǐng)域已知的。參見，例如，Wadwa等,J.Drug Targeting 3:111(1995)和美國專利5,087,616。本文使用的術(shù)語“靶向部分”是指這樣的任何分子或試劑：其特異性識別并結(jié)合細(xì)胞表面受體，以使得靶向部分定向遞送本發(fā)明TCR物質(zhì)至其表面表達(dá)受體的細(xì)胞群體。靶向部分包括但不限于抗體或其片段、肽、激素、生長因子、細(xì)胞因子以及能結(jié)合于細(xì)胞表面受體(例如，上皮生長因子受體(EGFR)、T細(xì)胞受體(TCR)、B-細(xì)胞受體(BCR)、CD28、血小板來源的生長因子受體(PDGF)、煙堿乙酰膽堿受體(nAChR)等)的任何其它天然或非天然的配體。本文使用的術(shù)語“橋”是指將本發(fā)明的TCR物質(zhì)連接于靶向部分的任何試劑或分子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員意識到，本發(fā)明的TCR物質(zhì)上對本發(fā)明TCR物質(zhì)的功能并非必需的位點(diǎn)是附接橋和/或靶向部分的理想位點(diǎn)，前提是一旦附接到本發(fā)明的TCR物質(zhì)，所述橋和/或靶向部分不會干擾本發(fā)明TCR物質(zhì)的功能，即結(jié)合HPV 16 E7；或檢測、治療或預(yù)防癌癥、HPV 16感染或HPV陽性初癌的能力。

預(yù)期本發(fā)明的藥物組合物、TCR(包括其功能變體)、多肽、蛋白、核酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞或細(xì)胞群體可以用于治療或預(yù)防癌癥、HPV 16感染或HPV陽性初癌的方法中。不受特定理論的束縛，認(rèn)為本發(fā)明的TCR(及其功能變體)能特異性結(jié)合HPV 16 E7，以使得當(dāng)由細(xì)胞表達(dá)時，TCR(或相關(guān)的本發(fā)明多肽或蛋白及其功能變體)能夠介導(dǎo)針對表達(dá)HPV 16 E7的靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答。在這方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防哺乳動物中病況的方法，其包括以有效治療或預(yù)防哺乳動物中病況的量向哺乳動物施用本文所述的藥物組合物、TCR(及其功能變體)、多肽或蛋白的任何一種，包含編碼本文所述的TCR(及其功能變體)、多肽、蛋白的任何一種的核苷酸序列的任何核酸或重組表達(dá)載體，或包含編碼本文所述的TCR(及其功能變體)、多肽或蛋白的任何一種的重組載體的任何宿主細(xì)胞或細(xì)胞群體，其中所述病況為癌癥、HPV 16感染或HPV陽性初癌。

本文使用的術(shù)語“治療”和“預(yù)防”以及源自于此的詞匯不一定意味著100％或完全治療或預(yù)防。相反，存在不同程度的治療或預(yù)防，其被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)為具有潛在的益處或治療效果。在這方面，本發(fā)明方法可以提供任何量或任何水平的治療或預(yù)防哺乳動物的病況。此外，本發(fā)明方法提供的治療或預(yù)防可以包括正在治療或預(yù)防的病況例如癌癥的一種或多種狀況或癥狀的治療或預(yù)防。例如，治療或預(yù)防可以包括促進(jìn)腫瘤的消退。另外，為了本文的目的，“預(yù)防”可以涵蓋延遲病況或其癥狀或狀況的發(fā)作。

還提供了檢測哺乳動物中病況的存在的方法。所述方法包括(i)將包含來自哺乳動物的一種或多種細(xì)胞的樣品與本文所述的本發(fā)明TCR(及其功能變體)、多肽、蛋白、核酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、細(xì)胞群體、抗體或其抗原結(jié)合部分、或藥物組合物的任何一種相接觸，從而形成復(fù)合物，以及檢測所述復(fù)合物，其中檢測到復(fù)合物指示哺乳動物中病況的存在，其中所述病況為癌癥、HPV 16感染或HPV陽性初癌。

關(guān)于本發(fā)明的檢測哺乳動物中病況的方法，細(xì)胞的樣品可為包含全細(xì)胞其裂解物、或全細(xì)胞裂解物的一部分，例如細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)部分、全蛋白部分或核酸部分的樣品。

為了本發(fā)明檢測方法的目的，接觸可以在相對于哺乳動物的體外或體內(nèi)發(fā)生。優(yōu)選地，接觸為體外的。

另外，復(fù)合物的檢測可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)行。例如，本文所述的本發(fā)明TCR(及其功能變體)、多肽、蛋白、核酸、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、細(xì)胞群體、或抗體或其抗原結(jié)合部分可以用可檢測標(biāo)記，諸如，例如放射性同位素、熒光團(tuán)(例如異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE))、酶(例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶)和元素顆粒(例如，金顆粒)進(jìn)行標(biāo)記。

為了本發(fā)明方法的目的，其中施用宿主細(xì)胞或細(xì)胞群體時，所述細(xì)胞可為與哺乳動物同種異體或哺乳動物自體的細(xì)胞。優(yōu)選地，細(xì)胞為哺乳動物自體的。

關(guān)于本發(fā)明方法，癌癥可為任何癌癥，包括急性淋巴細(xì)胞性癌癥、急性骨髓性白血病、腺泡狀橫紋肌肉瘤、骨癌、腦癌、乳腺癌、肛門癌、肛管癌或直腸肛門癌、眼癌、肝內(nèi)膽管癌、關(guān)節(jié)癌、頸癌、膽囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、陰道癌、外陰癌、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性骨髓性癌癥、結(jié)腸癌、食管癌、宮頸癌、胃腸道類癌腫瘤、膠質(zhì)瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌、惡性間皮瘤、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、陰莖癌、胰腺癌、腹膜癌、網(wǎng)膜癌和腸系膜癌、咽癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、輸尿管癌和膀胱癌。優(yōu)選的癌癥為宮頸癌、口咽癌、肛門癌、肛管癌、直腸肛門癌、陰道癌、外陰癌或陰莖癌的任何一種。特別優(yōu)選的癌癥為HPV 16陽性癌癥。雖然最常見的與HPV 16感染相關(guān)的癌癥包括宮頸癌、口咽癌、肛門癌、肛管癌、直腸肛門癌、陰道癌、外陰癌和陰莖癌，但本發(fā)明方法可以用于治療任何HPV 16陽性癌癥，包括在其它解剖區(qū)出現(xiàn)的那些癌癥。

本發(fā)明方法提及的哺乳動物可為任何哺乳動物。如本文所用，術(shù)語“哺乳動物”是指任何哺乳動物，包括但不限于嚙齒目的哺乳動物，如小鼠和倉鼠，以及兔形目的哺乳動物，如兔。優(yōu)選的是哺乳動物來自食肉目，包括貓科動物(貓)和犬科動物(犬)。更優(yōu)選的是哺乳動物來自偶蹄目，包括?？苿游?牛)和豬科動物(豬)、或奇蹄目，包括馬科動物(馬)。最優(yōu)選的是哺乳動物為靈長目、猿(Ceboids)目或猴(Simoids)目(猴)或類人猿亞目(人和猿)的哺乳動物。特別優(yōu)選的哺乳動物為人。

以下實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但當(dāng)然不應(yīng)理解為以任何方式限制其范圍。

實(shí)施例1

本實(shí)施例顯示從瘤形成物中分離人抗-HPV 16 E7 TCR。

從十四名患者獲得來自HPV 16-陽性宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)II/III的淋巴細(xì)胞樣品?；颊呦惹耙呀?jīng)接受了靶向HPV 16 E7的多次疫苗。使用如先前所述的快速擴(kuò)增方案(REP)(Dudley等,J.Immunother.26:332-42(2003)和Riddell等,J.Immunol.Methods 128:189-201(1990))擴(kuò)增宮頸浸潤淋巴細(xì)胞(CIL)的數(shù)目。簡言之，將TIL與經(jīng)輻射的(40Gy)同種異體外周血單核細(xì)胞“飼養(yǎng)”細(xì)胞在具有30ng/mL抗CD3抗體和6000IU/mL IL-2的完全培養(yǎng)基(CM)中培養(yǎng)。在與用gp100肽、重疊11個氨基酸殘基且橫跨HPV 16 E6的全長的15-mer E6肽庫、重疊11個氨基酸殘基且橫跨HPV 16 E7的全長的15-mer E7肽庫、或OKT3脈沖刺激的自體的樹突細(xì)胞(DC)共培養(yǎng)后，通過測量干擾素(IFN)-γ的分泌來篩選擴(kuò)增數(shù)目的CIL的HPV 16 E7的反應(yīng)性。一名患者(5048)的CD8⁺CIL被鑒定為具有HPV 16 E7反應(yīng)性。還發(fā)現(xiàn)患者5048表達(dá)HLA-A*02:01。

HLA-A*02:01/E7_11-19的四聚體被用于確定靶向表位HPV 16 E7_11-19的來自患者5048的T細(xì)胞的存在。使用磁珠分離利用抗-PE抗體分離四聚體-結(jié)合的細(xì)胞并且進(jìn)行有限稀釋克隆。篩選四聚體結(jié)合的T細(xì)胞克隆并且鑒定高度結(jié)合的克隆。

分離結(jié)合HLA-A2/E7_11-19四聚體的克隆的TCR的α和β鏈的可變區(qū)，并且使用5’cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)測序。包含編碼野生型人α鏈的可變區(qū)(其包含SEQ ID NO:9)的cDNA的核苷酸序列獲得自TRAV1-2*01/TRAJ7*01。包含編碼野生型人β鏈的可變區(qū)(其包含SEQ ID NO:11)的cDNA的核苷酸序列獲得自TRBV5-6*01/TRBJ2-1/TRBD2。

實(shí)施例2

本實(shí)施例顯示經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)包含人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的嵌合抗-HPV 16 E7 TCR的外周血T細(xì)胞，表現(xiàn)出HLA-A2/E7_11-19四聚體的CD8-獨(dú)立性結(jié)合并且識別HLA-A2⁺HPV-16⁺腫瘤系。

如下制備包含核苷酸序列的MSGV1重組表達(dá)載體，所述核苷酸序列編碼含有來源于實(shí)施例1的野生型人TCR的人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的嵌合抗-HPV 16 E7 TCR。重組表達(dá)載體中的核苷酸序列編碼實(shí)施例1的TCR的α鏈的可變區(qū)和β鏈的可變區(qū)，除了在β鏈(前導(dǎo)序列)的可變區(qū)的第2位，丙氨酸置換天然甘氨酸，以便在重組表達(dá)載體中提供NcoI限制位點(diǎn)和Kozak序列。將編碼α和β鏈的鼠恒定區(qū)的核苷酸序列(分別為SEQ ID NO:17和19)插入載體來代替各自的人恒定區(qū)以提供編碼嵌合TCR的核苷酸序列。編碼小核糖核酸病毒2A肽(SEQ ID NO:28)的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列位于α鏈與β鏈之間。編碼嵌合α和β鏈以及接頭的核苷酸序列對于在人組織中的表達(dá)為密碼子優(yōu)化的。

用來自編碼嵌合TCR的MSGV1重組表達(dá)載體或編碼完全的鼠抗-HPV 16 E7 TCR的載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)外周血細(xì)胞。將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞用作陰性對照。將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞用抗-CD8和抗-TRBC(小鼠恒定區(qū))抗體標(biāo)記并且通過流式細(xì)胞術(shù)測試與HLA-A2/E7_11-19四聚體的結(jié)合。未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(CD8⁺和CD8^-兩者)和轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)在先前實(shí)驗(yàn)中鑒定的對照小鼠抗-HPV 16 E7 TCR的細(xì)胞(CD8⁺和CD8^-兩者)不結(jié)合四聚體。用嵌合HPV-16 E7 TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8⁺和CD8^-細(xì)胞結(jié)合四聚體。因此，用嵌合TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL以CD8-獨(dú)立性方式結(jié)合HLA-A2/E7_11-19四聚體。還觀察到，約50％的轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)嵌合TCR的β鏈的T細(xì)胞不結(jié)合四聚體。

在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，用具有大約50％的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的編碼嵌合TCR的MSGV1重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞(PBL)。通過熒光-激活的細(xì)胞分選(FACS)測量HLA-A2/E7_11-19四聚體結(jié)合，并且在刺激之后第8天發(fā)現(xiàn)25％的細(xì)胞結(jié)合四聚體。在刺激之后，將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞與靶標(biāo)(用HPV 16 E6_29-38肽(對照)脈沖刺激的293-A2細(xì)胞、用HPV 16 E7_11-19肽脈沖刺激的293-A2細(xì)胞、用編碼HPV 16 E6的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的624細(xì)胞、用編碼HPV 16 E7的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的624細(xì)胞、SCC152細(xì)胞、SCC90細(xì)胞、CaSki細(xì)胞、Alb細(xì)胞、Panc1細(xì)胞或SiHa細(xì)胞)共培養(yǎng)10天。將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞用作對照。測量IFN-γ。結(jié)果顯示在圖1中。如圖1所示，用編碼嵌合TCR的MSGV1重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL以HLA-A2-限制性方式特異性識別HPV 16 E7-陽性腫瘤細(xì)胞系和其它HLA-A2⁺HPV16 E7⁺靶標(biāo)。用第二供體的細(xì)胞獲得的結(jié)果是類似的。

實(shí)施例3

本實(shí)施例顯示制備包含人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的嵌合抗-HPV 16 E7 TCR的方法，其中TCR的α鏈的恒定區(qū)的跨膜(TM)區(qū)中的三個天然氨基酸殘基各自被疏水性氨基酸殘基置換。

如下制備編碼包含人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的嵌合TCR的核苷酸序列，其中TCR的α鏈的恒定區(qū)的跨膜(TM)區(qū)中的三個天然氨基酸殘基各自被疏水性氨基酸殘基置換。將編碼實(shí)施例2的嵌合TCR的α和β鏈的核苷酸序列克隆成單核苷酸序列，其中編碼β鏈的核苷酸序列位于編碼α鏈的核苷酸序列的5’處并且編碼小核糖核酸病毒2A肽(SEQ ID NO:28)的核苷酸序列位于α與β鏈之間。關(guān)于野生型α鏈小鼠恒定區(qū)SEQ ID NO:17，α鏈的TM區(qū)中的三個天然的氨基酸殘基(即，分別為在第112、114和115位的Ser、Met和Gly)分別被Leu、Ile和Val置換。組合的核苷酸序列對于在人組織中的表達(dá)為密碼子優(yōu)化的以提供載體插入物(SEQ ID NO:39)。將載體插入物克隆至MSGV1表達(dá)載體中，從而產(chǎn)生SEQ ID NO:37。載體編碼的TCR包含α鏈和β鏈，所述α鏈包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述β鏈包含含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列(“LVL-修飾的TCR”或“LVL TCR”)。

實(shí)施例4

本實(shí)施例顯示制備包含人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的嵌合抗-HPV 16 E7 TCR的方法，其中在β和α鏈中的天然氨基酸殘基各自被半胱氨酸殘基置換。

如下修飾實(shí)施例2的TCR以在α和β鏈各自的恒定區(qū)中包含Cys置換。將編碼實(shí)施例2的TCR的α鏈的恒定區(qū)(氨基酸SEQ ID NO:17)的核苷酸序列修飾以用Cys置換第48位的天然Thr。將編碼實(shí)施例2的TCR的β鏈的恒定區(qū)(SEQ ID NO:19)的核苷酸序列修飾以用Cys置換第56位的天然Ser。將編碼α和β鏈的核苷酸序列克隆成單核苷酸序列，其中編碼β鏈的核苷酸序列位于編碼α鏈的核苷酸序列的5’處并且編碼小核糖核酸病毒2A肽(SEQ ID NO:28)的核苷酸序列位于α與β鏈之間。組合的核苷酸序列對于在人組織中的表達(dá)為密碼子優(yōu)化的以提供載體插入物。將載體插入物克隆至MSGV1表達(dá)載體中。由載體編碼的TCR包含α鏈和β鏈，所述α鏈包含含有SEQ ID NO:9和24的氨基酸序列，所述β鏈包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列(“Cys-修飾的TCR”或“Cys TCR”)。

如下對實(shí)施例3的TCR(LVL-修飾的TCR)進(jìn)一步修飾以在α和β鏈各自的恒定區(qū)中包含Cys置換。將編碼實(shí)施例3的LVL-修飾的TCR的α鏈的恒定區(qū)(氨基酸SEQ ID NO:21)的核苷酸序列修飾以用Cys置換第48位的天然Thr。將編碼實(shí)施例3的LVL-修飾的TCR的β鏈的恒定區(qū)(SEQ ID NO:19)的核苷酸序列修飾以用Cys置換第56位的天然Ser。將編碼α和β鏈的核苷酸序列克隆成單核苷酸序列，其中編碼β鏈的核苷酸序列位于編碼α鏈的核苷酸序列的5’處并且編碼小核糖核酸病毒2A肽(SEQ ID NO:28)的核苷酸序列位于α與β鏈之間。組合的核苷酸序列對于在人組織中的表達(dá)為密碼子優(yōu)化的以提供載體插入物(SEQ ID NO:40)。將載體插入物克隆至MSGV1表達(dá)載體中，從而產(chǎn)生SEQ ID NO:38。由載體編碼的TCR包含α鏈和β鏈，所述α鏈包含含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列，所述β鏈包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列(“LVL-Cys-修飾的TCR”或“LVL-Cys TCR”)。

實(shí)施例5

本實(shí)施例顯示編碼實(shí)施例2的嵌合抗-HPV 16 E7 TCR的重組表達(dá)載體的修飾改善HPV 16 E7_11-19四聚體的結(jié)合并且改善HPV 16⁺腫瘤細(xì)胞系的識別。

用表1中所示的重組表達(dá)載體之一轉(zhuǎn)導(dǎo)來自兩名供體的PBL。

表1

在刺激之后第8天，使用抗-HPV 16 E7_11-19四聚體和抗-小鼠(m)TRBC抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)測試來自兩名正常供體的轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL的HPV 16 E7_11-19四聚體的結(jié)合。將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞用作陰性對照。結(jié)果顯示在圖2A-2R中。在以上各圖中給出了各個象限中檢測到的染色細(xì)胞的百分比。如圖2A-2R中所示，與用其中α鏈位于β鏈的5’處的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞相比，用其中β鏈位于α鏈的5’處的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞顯示出改善的四聚體結(jié)合。也如圖2A-2R所示，與用實(shí)施例2的TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞相比，用Cys-修飾的TCR、LVL-修飾的TCR或LVL-Cys-修飾的TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞各自顯示出改善的四聚體結(jié)合。

在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，在刺激之后，將轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞與624細(xì)胞、CaSki細(xì)胞、Scc90細(xì)胞或Scc152細(xì)胞共培養(yǎng)11天，并且測量IFN-γ分泌。將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞用作陰性對照。結(jié)果顯示在圖3A和3B中。如圖3A和3B所示，與用實(shí)施例2的TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞相比，用Cys-修飾的TCR、LVL-修飾的TCR或LVL-Cys-修飾的TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞各自顯示出改善的HPV 16⁺腫瘤系的識別。也如圖3A-3B所示，與用其中α鏈位于β鏈的5’處的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞相比，用其中β鏈位于α鏈的5’處的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞通常顯示出改善的HPV 16⁺腫瘤系的識別。

如通過流式細(xì)胞術(shù)所測量的，與用其中α鏈位于β鏈的5’處的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞相比，用其中β鏈位于α鏈的5’處的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞還顯示出改善的表達(dá)。

實(shí)施例6

本實(shí)施例顯示用編碼LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞顯示出HPV-16 E7_11-19四聚體的CD8-獨(dú)立性結(jié)合。

用編碼實(shí)施例4的LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)的MSGV1重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)外周血細(xì)胞。將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞用抗-CD8、抗-TRBC(小鼠恒定區(qū))抗體和HLA-A2/E7_11-19四聚體標(biāo)記并且通過流式細(xì)胞術(shù)分析。來自兩個供體的CD8⁺轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞和CD8^-轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞均結(jié)合四聚體，這顯示出CD8-獨(dú)立性結(jié)合。

實(shí)施例7

本實(shí)施例顯示經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)LVL-修飾的TCR(β/α)的外周血T細(xì)胞特異性識別HPV 16 E7_11-19肽和HPV 16⁺腫瘤細(xì)胞系。

用編碼實(shí)施例3的LVL-修飾的TCR(β/α)(SEQ ID NO:37)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)PBL。使用如先前所述的快速擴(kuò)增方案(REP)(Dudley等,J.Immunother.26:332-42(2003)和Riddell等,J.Immunol.Methods 128:189-201(1990))進(jìn)行細(xì)胞數(shù)目的快速擴(kuò)增。簡言之，將TIL與經(jīng)輻射的(40Gy)同種異體外周血單核細(xì)胞“飼養(yǎng)”細(xì)胞在具有30ng/mL抗CD3抗體和6000IU/mL IL-2的完全培養(yǎng)基(CM)中培養(yǎng)。將擴(kuò)增的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞與靶標(biāo)(用HPV 16 E6_29-38肽(對照)脈沖刺激的293-A2細(xì)胞、用HPV 16 E7_11-19肽脈沖刺激的293-A2細(xì)胞、用編碼HPV 16 E6的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的624細(xì)胞、用編碼HPV 16 E7的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的624細(xì)胞、SCC152細(xì)胞、SCC90細(xì)胞、CaSki細(xì)胞、Alb細(xì)胞、Panc1細(xì)胞、Ane細(xì)胞或SiHa細(xì)胞)共培養(yǎng)。測量IFN-γ。結(jié)果顯示在圖4中。如圖4中所示，用編碼LVL-修飾的TCR(β/α)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL以HLA-A2-限制性方式特異性識別HPV 16 E7-陽性腫瘤細(xì)胞系和其它HLA-A2⁺HPV16 E7⁺靶標(biāo)。用第二供體的細(xì)胞獲得的結(jié)果是類似的。

實(shí)施例8

本實(shí)施例顯示經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)的外周血T細(xì)胞特異性識別HPV 16⁺腫瘤細(xì)胞系以及該識別被抗-MHC I類抗體阻斷。本實(shí)施例還顯示這些轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞特異性殺傷HPV 16⁺HLA-A2⁺腫瘤細(xì)胞系。

用編碼LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)(SEQ ID NO:38)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)PBL。使用如實(shí)施例7所述的REP進(jìn)行細(xì)胞數(shù)目的快速擴(kuò)增。在無抗體(黑色柱)或在存在抗-MHC I類抗體(灰色柱)或抗-MHC II類抗體(無陰影的柱)的情況下，將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞與靶標(biāo)(624細(xì)胞、SCC90細(xì)胞或CaSki細(xì)胞)共培養(yǎng)。作為對照，在無抗體或在存在抗-MHC I類抗體或抗-MHC II類抗體的情況下，將PBL用DMF5TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)并與624細(xì)胞共培養(yǎng)或者用抗-MAGE A3 TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)并與526-CIITA細(xì)胞共培養(yǎng)。測量IFN-γ。結(jié)果顯示在圖5中。如圖5中所示，經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)的外周血T細(xì)胞特異性識別HPV 16⁺腫瘤細(xì)胞系并且該識別被抗-MHC I類抗體阻斷。

在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞與靶標(biāo)(CaSki細(xì)胞、SCC90細(xì)胞、SCC152細(xì)胞或624細(xì)胞)以不同效應(yīng)細(xì)胞：靶標(biāo)比率共培養(yǎng)。將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞用作陰性對照。結(jié)果顯示在圖6A-6D中。如圖6A-6D中所示，用編碼LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)(SEQ ID NO:38)的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的PBL顯示出HPV 16⁺HLA-A2⁺腫瘤系的特異性殺傷。

實(shí)施例9

本實(shí)施例顯示經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)的外周血T細(xì)胞具有與抗-HPV 16 E6 TCR DCA2E6類似的功能親合力。本實(shí)施例還顯示在與除了SCC90細(xì)胞之外的CaSki和SCC152細(xì)胞共培養(yǎng)后，與用DCA2E6 TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞相比，經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)的外周血T細(xì)胞顯示出更多的IFN-γ產(chǎn)生。

用編碼LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)(SEQ ID NO:38)或DCA2E6的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)PBL。將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞與用無肽或濃度為1μM至1pM的HPV 16 E7_11-19肽或HPV 16 E6_29-38肽脈沖刺激的T2細(xì)胞共培養(yǎng)。測量IFN-γ。結(jié)果顯示在圖7A和7B中。如圖7A和7B所示，經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)的PBL具有與抗-HPV 16 E6 TCR DCA2E6類似的功能親合力。用來自第二供體的細(xì)胞獲得的結(jié)果是類似的。

在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，PBL被轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)(SEQ ID NO:38)或DCA2E6。將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞用作陰性對照。將細(xì)胞與靶標(biāo)(624細(xì)胞、Caski細(xì)胞、SCC90細(xì)胞或SCC152細(xì)胞)共培養(yǎng)。測量IFN-γ。結(jié)果顯示在圖8A中。如圖8A所示，在與除了SCC90細(xì)胞之外的CaSki和SCC152細(xì)胞共培養(yǎng)后，與用DCA2E6 TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞相比，經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)LVL-Cys-修飾的TCR(β/α)的外周血T細(xì)胞顯示出更多的IFN-γ產(chǎn)生。

在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，PBL被轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)Cys-修飾的TCR(β/α)(SEQ ID NO:9、24和27)或DCA2E6。將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞用作陰性對照。將細(xì)胞與靶標(biāo)(用HPV 16 E6_29-38肽(對照)脈沖刺激的293-A2細(xì)胞、用HPV16 E7_11-19肽脈沖刺激的293-A2細(xì)胞、SCC152細(xì)胞、SCC90細(xì)胞、CaSki細(xì)胞、Alb細(xì)胞、Ane細(xì)胞、Panc1細(xì)胞或SiHa細(xì)胞)共培養(yǎng)。測量IFN-γ。結(jié)果顯示在圖8B中。如圖8B所示，在與除了SCC90細(xì)胞之外的CaSki和SCC152細(xì)胞共培養(yǎng)后，與用DCA2E6 TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞相比，經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)Cys-修飾的TCR(β/α)的外周血T細(xì)胞顯示出更多的IFN-γ產(chǎn)生。

本文引用的所有參考文獻(xiàn)，包括出版物、專利申請和專利在此通過引用并入，其程度如同每份參考文獻(xiàn)單獨(dú)地和具體地表示為通過引用并入并且在本文以其整體示出。

在描述本發(fā)明的上下文中(特別是在以下權(quán)利要求的上下文中)使用的術(shù)語“一個/一種”和“所述”和“至少一種/一個”以及類似的指示物應(yīng)被解釋為覆蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)兩者，除非本文另外指出或與上下文明顯矛盾。術(shù)語“至少一種/一個”之后一項(xiàng)或多項(xiàng)列表(例如，“A和B中的至少一種/一個”)的使用應(yīng)被解釋為意指選自列出的項(xiàng)中的一項(xiàng)(A或B)或兩個或更多個列出的項(xiàng)的組合(A和B)，除非本文另外指出或與上下文明顯矛盾。術(shù)語“包含”、“具有”、“包括”和“含有”應(yīng)被解釋為開放式的術(shù)語(即意指“包括，但不限于”)，除非另外指明。本文數(shù)值的范圍的描述僅旨在用作分別提及屬于范圍內(nèi)的每個單獨(dú)數(shù)值的速記法，除非本文另外指出，并且每個單獨(dú)的數(shù)值均并入說明書中如同其被單獨(dú)的列舉出一樣。本文所述的所有方法可以以任何合適的順序進(jìn)行，除非本文另外指出或與上下文明顯矛盾。本文提供的任何和所有的實(shí)例或示例性語言(例如，“諸如”)的使用僅僅意圖更好地闡明本發(fā)明，并且不會對以其它方式要求保護(hù)的本發(fā)明范圍構(gòu)成限制。不應(yīng)將本說明書中的語言解釋為表明任何未要求保護(hù)的組分對實(shí)施本發(fā)明是必要的。

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案在本文中描述，包括發(fā)明人已知的實(shí)施該發(fā)明的最佳模式。對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，閱讀上述說明后這些優(yōu)選的實(shí)施方案中的改變可以是顯而易見的。發(fā)明人期望熟練的技術(shù)人員酌情利用這些改變，并且發(fā)明人意欲以不同于本文具體描述的方式實(shí)施該發(fā)明。因此，在適用法律允許的情況下，本發(fā)明包括在所附的權(quán)利要求中所引用主題的所有修改和等同物。此外，在其所有可能的改變中上述要素的任何組合涵蓋于本發(fā)明中，除非本文另外說明或上下文中明顯矛盾。

序列表

<110> 美國衛(wèi)生和人力服務(wù)部

<120> 抗人乳頭瘤病毒16 E7的T細(xì)胞受體

<130> 720940

<150> US 62/004335

<151> 2014-05-29

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp

35 40 45

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr

50 55 60

Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu

65 70 75 80

Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln

85 90 95

Lys Pro

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr

1 5

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

Thr Ser Gly Phe Asn Gly

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 4

Asn Val Leu Asp Gly Leu

1 5

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

Ala Ser Val Asp Gly Asn Asn Arg Leu Ala

1 5 10

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 6

Ser Gly His Asp Thr

1 5

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu

1 5

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

Ala Ser Ser Leu Gly Trp Arg Gly Gly Arg Tyr Asn Glu Gln Phe

1 5 10 15

<210> 9

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 9

Met Trp Gly Val Phe Leu Leu Tyr Val Ser Met Lys Met Gly Gly Thr

1 5 10 15

Thr Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly

20 25 30

Ala Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly

35 40 45

Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser

50 55 60

Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe

65 70 75 80

Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln

85 90 95

Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Ser Val Asp Gly Asn Asn

100 105 110

Arg Leu Ala Phe Gly Lys Gly Asn Gln Val Val Val Ile Pro

115 120 125

<210> 10

<211> 135

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa為Ala或Gly

<400> 10

Met Xaa Pro Gly Leu Leu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Gly Leu Val Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys

20 25 30

Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Lys Ser Gly His

35 40 45

Asp Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe

50 55 60

Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Phe Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn

85 90 95

Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Leu Gly Trp Arg Gly Gly Arg Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro

115 120 125

Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

130 135

<210> 11

<211> 135

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 11

Met Gly Pro Gly Leu Leu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Gly Leu Val Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys

20 25 30

Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Lys Ser Gly His

35 40 45

Asp Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe

50 55 60

Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Phe Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn

85 90 95

Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Leu Gly Trp Arg Gly Gly Arg Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro

115 120 125

Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

130 135

<210> 12

<211> 267

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

Met Trp Gly Val Phe Leu Leu Tyr Val Ser Met Lys Met Gly Gly Thr

1 5 10 15

Thr Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly

20 25 30

Ala Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly

35 40 45

Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser

50 55 60

Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe

65 70 75 80

Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln

85 90 95

Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Ser Val Asp Gly Asn Asn

100 105 110

Arg Leu Ala Phe Gly Lys Gly Asn Gln Val Val Val Ile Pro Asn Ile

115 120 125

Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser

130 135 140

Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val

145 150 155 160

Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu

165 170 175

Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser

180 185 190

Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile

195 200 205

Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys

210 215 220

Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn

225 230 235 240

Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe

245 250 255

Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

260 265

<210> 13

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

Met Gly Pro Gly Leu Leu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Gly Leu Val Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys

20 25 30

Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Lys Ser Gly His

35 40 45

Asp Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe

50 55 60

Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Phe Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn

85 90 95

Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Leu Gly Trp Arg Gly Gly Arg Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro

115 120 125

Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro

130 135 140

Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln

145 150 155 160

Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val

165 170 175

Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser

180 185 190

Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg

195 200 205

Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn

210 215 220

Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu

225 230 235 240

Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val

245 250 255

Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser

260 265 270

Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu

275 280 285

Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met

290 295 300

Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305 310

<210> 14

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 14

Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys

1 5 10 15

Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr

20 25 30

Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr

35 40 45

Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala

50 55 60

Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser

65 70 75 80

Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp

85 90 95

Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe

100 105 110

Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala

115 120 125

Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135 140

<210> 15

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 15

Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys

50 55 60

Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu

65 70 75 80

Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys

85 90 95

Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp

100 105 110

Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg

115 120 125

Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser

130 135 140

Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala

145 150 155 160

Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp

165 170 175

Ser Arg Gly

<210> 16

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (48)..(48)

<223> Xaa為Thr或Cys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (112)..(112)

<223> Xaa為Ser、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (114)..(114)

<223> Xaa為Met、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (115)..(115)

<223> Xaa為Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp

<400> 16

Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg

1 5 10 15

Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile

20 25 30

Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Xaa

35 40 45

Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala

50 55 60

Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr

65 70 75 80

Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr

85 90 95

Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Xaa

100 105 110

Val Xaa Xaa Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu

115 120 125

Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135

<210> 17

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 17

Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg

1 5 10 15

Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile

20 25 30

Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr

35 40 45

Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala

50 55 60

Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr

65 70 75 80

Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr

85 90 95

Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser

100 105 110

Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu

115 120 125

Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135

<210> 18

<211> 173

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (57)..(57)

<223> Xaa為Ser或Cys

<400> 18

Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Xaa Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys

50 55 60

Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala

65 70 75 80

Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe

85 90 95

His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro

100 105 110

Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly

115 120 125

Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu

130 135 140

Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser

145 150 155 160

Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser

165 170

<210> 19

<211> 173

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 19

Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys

50 55 60

Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala

65 70 75 80

Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe

85 90 95

His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro

100 105 110

Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly

115 120 125

Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu

130 135 140

Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser

145 150 155 160

Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser

165 170

<210> 20

<211> 308

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 20

Met Ala Pro Gly Leu Leu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

Gly Leu Val Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys

20 25 30

Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Lys Ser Gly His

35 40 45

Asp Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe

50 55 60

Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Phe Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn

85 90 95

Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Leu Gly Trp Arg Gly Gly Arg Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro

115 120 125

Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro

130 135 140

Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln

145 150 155 160

Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val

165 170 175

Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser

180 185 190

Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser

195 200 205

Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His

210 215 220

Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp

225 230 235 240

Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala

245 250 255

Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly

260 265 270

Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr

275 280 285

Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys

290 295 300

Arg Lys Asn Ser

305

<210> 21

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 21

Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg

1 5 10 15

Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile

20 25 30

Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr

35 40 45

Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala

50 55 60

Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr

65 70 75 80

Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr

85 90 95

Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu

100 105 110

Val Ile Val Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu

115 120 125

Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135

<210> 22

<211> 263

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 22

Met Trp Gly Val Phe Leu Leu Tyr Val Ser Met Lys Met Gly Gly Thr

1 5 10 15

Thr Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly

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Ala Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly

35 40 45

Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser

50 55 60

Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe

65 70 75 80

Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln

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Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Ser Val Asp Gly Asn Asn

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Arg Leu Ala Phe Gly Lys Gly Asn Gln Val Val Val Ile Pro Asn Ile

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Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val

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Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu

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Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser

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Val Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met

245 250 255

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260

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 23

Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys

50 55 60

Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala

65 70 75 80

Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe

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100 105 110

Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly

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Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu

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Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser

145 150 155 160

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 24

Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg

1 5 10 15

Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile

20 25 30

Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys

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Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala

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65 70 75 80

Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr

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Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser

100 105 110

Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu

115 120 125

Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

130 135

<210> 25

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 25

Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg

1 5 10 15

Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile

20 25 30

Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys

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Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala

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130 135

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<211> 263

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 26

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Thr Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly

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Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser

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65 70 75 80

Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln

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Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Ser Val Asp Gly Asn Asn

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Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

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<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 27

Met Ala Pro Gly Leu Leu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala

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<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 28

Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys

1 5 10 15

Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 29

<211> 598

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 29

Met Ala Pro Gly Leu Leu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala

1 5 10 15

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180 185 190

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<211> 598

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 30

Met Ala Pro Gly Leu Leu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala

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20 25 30

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195 200 205

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Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys

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Arg Lys Asn Ser Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe

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Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met

325 330 335

Trp Gly Val Phe Leu Leu Tyr Val Ser Met Lys Met Gly Gly Thr Thr

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Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu

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Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu

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Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Met

420 425 430

Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Ser Val Asp Gly Asn Asn Arg

435 440 445

Leu Ala Phe Gly Lys Gly Asn Gln Val Val Val Ile Pro Asn Ile Gln

450 455 460

Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp

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Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro

485 490 495

Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp

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Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile Val

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Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr

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Leu Arg Leu Trp Ser Ser

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<210> 31

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成的

<400> 31

atgtggggag ttttccttct ttatgtttcc atgaagatgg gaggcactac aggacaaaac 60

attgaccagc ccactgagat gacagctacg gaaggtgcca ttgtccagat caactgcacg 120

taccagacat ctgggttcaa cgggctgttc tggtaccagc aacatgctgg cgaagcaccc 180

acatttctgt cttacaatgt tctggatggt ttggaggaga aaggtcgttt ttcttcattc 240

cttagtcggt ctaaagggta cagttacctc cttttgaagg agctccagat gaaagactct 300

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caagtggtgg tcataccaaa tatccagaac cctgaccctg ccgtgtacca gctgagagac 420

tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta ttcaccgatt ttgattctca aacaaatgtg 480

tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc acagacaaaa ctgtgctaga catgaggtct 540

atggacttca agagcaacag tgctgtggcc tggagcaaca aatctgactt tgcatgtgca 600

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ctgtcagtga ttgggttccg aatcctcctc ctgaaagtgg ccgggtttaa tctgctcatg 780

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<210> 32

<211> 945

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 32

atgggccccg ggctcctctg ctgggcactg ctttgtctcc tgggagcagg cttagtggac 60

gctggagtca cccaaagtcc cacacacctg atcaaaacga gaggacagca agtgactctg 120

agatgctctc ctaagtctgg gcatgacact gtgtcctggt accaacaggc cctgggtcag 180

gggccccagt ttatctttca gtattatgag gaggaagaga gacagagagg caacttccct 240

gatcgattct caggtcacca gttccctaac tatagctctg agctgaatgt gaacgccttg 300

ttgctggggg actcggccct ctatctctgt gccagcagct tgggatggcg ggggggccgt 360

tacaatgagc agttcttcgg gccagggaca cggctcaccg tgctagagga cctgaaaaac 420

gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 480

aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttctaccccg accacgtgga gctgagctgg 540

tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacag acccgcagcc cctcaaggag 600

cagcccgccc tcaatgactc cagatactgc ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 660

ttctggcaga acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 720

aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cctgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 780

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<210> 33

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 33

atgtggggtg tcttcctttt gtacgtcagc atgaagatgg gaggcactac tgggcaaaac 60

atagatcagc ctaccgaaat gactgctacc gagggagcca ttgtccaaat caactgcacc 120

tatcagacta gcggcttcaa tggactcttc tggtaccaac agcatgcggg cgaagcacct 180

accttcttgt cctataatgt cttggatggt ctcgaagaga aaggcagatt ctccagtttc 240

ctcagccgga gcaagggata ctcatatctt ctcctgaaag agcttcagat gaaggattct 300

gcatcctatc tctgtgcttc agtcgatggc aataaccgac tcgcctttgg aaaagggaat 360

caagtggtcg tcataccgaa tattcagaac cccgaaccag ccgtatatca gttgaaggac 420

ccaagatctc aggatagtac actctgtttg tttacggact ttgactcaca aatcaacgtc 480

ccgaagacta tggaaagtgg tacgttcatc acagataaga cggttctgga catgaaggct 540

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cttaccgaga agtcttttga gaccgatatg aatctcaact tccagaatct gctggtgatc 720

gttctgcgga tcctgcttct gaaggttgca ggattcaatc ttcttatgac tctccggctc 780

tggtcttcat gataa 795

<210> 34

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成的

<400> 34

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cgctgcagtc ctaagtcagg ccatgacaca gtttcctggt atcaacaggc tctggggcag 180

ggccctcagt tcattttcca atattacgag gaagaggaac gccaacgcgg taatttcccc 240

gatcggttct ctgggcacca gttcccaaac tactcaagtg agttgaacgt aaatgctctc 300

ctcctcggag actccgccct ctacttgtgt gccagttctc ttggttggcg gggcggccga 360

tacaatgaac aattttttgg acctggtact cggctgaccg tgctagagga cctgcgcaac 420

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aaagctacgc tcgtgtgttt ggctcggggc ttcttcccag accacgtaga actttcctgg 540

tgggtcaatg gaaaggaggt tcattccgga gtgtccactg atccccaagc gtacaaggaa 600

tccaactata gctactgtct ctcatctcgg ctccgggtga gtgcgacatt ctggcataat 660

cctcggaacc actttcgatg ccaagtgcag tttcatgggt tgagcgagga agacaagtgg 720

cccgagggca gtcctaaacc agtcactcaa aacataagcg ccgaggcatg gggtagagcc 780

gattgtggga ttactagcgc ttcataccaa caaggggtat tgagcgctac aattctttac 840

gaaattctcc tcggcaaggc gacgctctac gccgtactgg tgtctactct cgtggttatg 900

gcaatggtga aacggaaaaa cagc 924

<210> 35

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

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<210> 36

<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 36

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<212> DNA

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<220>

<223> 合成的

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<220>

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taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag 5040

ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa 5100

ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcgc 5160

aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc ccggccacgg ggcctgccac 5220

catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg cgagcccgat cttccccatc 5280

ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg gcgccggtga tgccggccac 5340

gatgcgtccg gcgtagaggc gattagtcca atttgttaaa gacaggatat cagtggtcca 5400

ggctctagtt ttgactcaac aatatcacca gctgaagcct atagagtacg agccatagat 5460

aaaataaaag attttattta gtctccagaa aaagggggga atgaaagacc ccacctgtag 5520

gtttggcaag ctagcttaag taacgccatt ttgcaaggca tggaaaatac ataactgaga 5580

atagagaagt tcagatcaag gttaggaaca gagagacagc agaatatggg ccaaacagga 5640

tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc 5700

ggtcccgccc tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt tccagggtgc cccaaggacc 5760

tgaaatgacc ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt cgcttctcgc ttctgttcgc 5820

gcgcttctgc tccccgagct caataaaaga gcccacaacc cctcactcgg cgcgccagtc 5880

ctccgataga ctgcgtcgcc cgggtacccg tattcccaat aaagcctctt gctgtttgca 5940

tccgaatcgt ggactcgctg atccttggga gggtctcctc agattgattg actgcccacc 6000

tcgggggtct ttcatttgga ggttccaccg agatttggag acccctgccc agggaccacc 6060

gacccccccg ccgggaggta agctggccag cggtcgtttc gtgtctgtct ctgtctttgt 6120

gcgtgtttgt gccggcatct aatgtttgcg cctgcgtctg tactagttag ctaactagct 6180

ctgtatctgg cggacccgtg gtggaactga cgagttcgga acacccggcc gcaaccctgg 6240

gagacgtccc agggacttcg ggggccgttt ttgtggcccg acctgagtcc taaaatcccg 6300

atcgtttagg actctttggt gcacccccct tagaggaggg atatgtggtt ctggtaggag 6360

acgagaacct aaaacagttc ccgcctccgt ctgaattttt gctttcggtt tgggaccgaa 6420

gccgcgccgc gcgtcttgtc tgctgcagca tcgttctgtg ttgtctctgt ctgactgtgt 6480

ttctgtattt gtctgaaaat atgggcccgg gctagcctgt taccactccc ttaagtttga 6540

ccttaggtca ctggaaagat gtcgagcgga tcgctcacaa ccagtcggta gatgtcaaga 6600

agagacgttg ggttaccttc tgctctgcag aatggccaac ctttaacgtc ggatggccgc 6660

gagacggcac ctttaaccga gacctcatca cccaggttaa gatcaaggtc ttttcacctg 6720

gcccgcatgg acacccagac caggtcccct acatcgtgac ctgggaagcc ttggcttttg 6780

acccccctcc ctgggtcaag ccctttgtac accctaagcc tccgcctcct cttcctccat 6840

ccgccccgtc tctccccctt gaacctcctc gttcgacccc gcctcgatcc tccctttatc 6900

cagccctcac tccttctcta ggcgccccca tatggccata tgagatctta tatggggcac 6960

ccccgcccct tgtaaacttc cctgaccctg acatgacaag agttactaac agcccctctc 7020

tccaagctca cttacaggct ctctacttag tccagcacga agtctggaga cctctggcgg 7080

cagcctacca agaacaactg gaccgaccgg tggtacctca cccttaccga gtcggcgaca 7140

cagtgtgggt ccgccgacac cagactaaga acctagaacc tcgctggaaa ggaccttaca 7200

cagtcctgct gaccaccccc accgccctca aagtagacgg catcgcagct tggatacacg 7260

ccgcccacgt gaaggctgcc gaccccgggg gtggaccatc ctctagaccg 7310

<210> 39

<211> 1800

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 39

atggccccgg ggcttttgtg ttgggccttg ctttgtttgc ttggggcagg cttggtggat 60

gctggagtca cacagtcacc cacacacctc attaaaacca ggggacaaca agtcactctg 120

cgctgcagtc ctaagtcagg ccatgacaca gtttcctggt atcaacaggc tctggggcag 180

ggccctcagt tcattttcca atattacgag gaagaggaac gccaacgcgg taatttcccc 240

gatcggttct ctgggcacca gttcccaaac tactcaagtg agttgaacgt aaatgctctc 300

ctcctcggag actccgccct ctacttgtgt gccagttctc ttggttggcg gggcggccga 360

tacaatgaac aattttttgg acctggtact cggctgaccg tgctagagga cctgcgcaac 420

gtcaccccac caaaggtcag tttgtttgag ccatcaaagg cggagatcgc caacaaacag 480

aaagctacgc tcgtgtgttt ggctcggggc ttcttcccag accacgtaga actttcctgg 540

tgggtcaatg gaaaggaggt tcattccgga gtgtccactg atccccaagc gtacaaggaa 600

tccaactata gctactgtct ctcatctcgg ctccgggtga gtgcgacatt ctggcataat 660

cctcggaacc actttcgatg ccaagtgcag tttcatgggt tgagcgagga agacaagtgg 720

cccgagggca gtcctaaacc agtcactcaa aacataagcg ccgaggcatg gggtagagcc 780

gattgtggga ttactagcgc ttcataccaa caaggggtat tgagcgctac aattctttac 840

gaaattctcc tcggcaaggc gacgctctac gccgtactgg tgtctactct cgtggttatg 900

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agtttgctta agcaagccgg agatgtggag gaaaatcctg gaccgatgtg gggtgtcttc 1020

cttttgtacg tcagcatgaa gatgggaggc actactgggc aaaacataga tcagcctacc 1080

gaaatgactg ctaccgaggg agccattgtc caaatcaact gcacctatca gactagcggc 1140

ttcaatggac tcttctggta ccaacagcat gcgggcgaag cacctacctt cttgtcctat 1200

aatgtcttgg atggtctcga agagaaaggc agattctcca gtttcctcag ccggagcaag 1260

ggatactcat atcttctcct gaaagagctt cagatgaagg attctgcatc ctatctctgt 1320

gcttcagtcg atggcaataa ccgactcgcc tttggaaaag ggaatcaagt ggtcgtcata 1380

ccgaatattc agaaccccga accagccgta tatcagttga aggacccaag atctcaggat 1440

agtacactct gtttgtttac ggactttgac tcacaaatca acgtcccgaa gactatggaa 1500

agtggtacgt tcatcacaga taagacggtt ctggacatga aggctatgga ctcaaagagc 1560

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<220>

<223> 合成的

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cgctgcagtc ctaagtcagg ccatgacaca gtttcctggt atcaacaggc tctggggcag 180

ggccctcagt tcattttcca atattacgag gaagaggaac gccaacgcgg taatttcccc 240

gatcggttct ctgggcacca gttcccaaac tactcaagtg agttgaacgt aaatgctctc 300

ctcctcggag actccgccct ctacttgtgt gccagttctc ttggttggcg gggcggccga 360

tacaatgaac aattttttgg acctggtact cggctgaccg tgctagagga cctgcgcaac 420

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tgggtcaatg gaaaggaggt tcattccgga gtgtgcactg atccccaagc gtacaaggaa 600

tccaactata gctactgtct ctcatctcgg ctccgggtga gtgcgacatt ctggcataat 660

cctcggaacc actttcgatg ccaagtgcag tttcatgggt tgagcgagga agacaagtgg 720

cccgagggca gtcctaaacc agtcactcaa aacataagcg ccgaggcatg gggtagagcc 780

gattgtggga ttactagcgc ttcataccaa caaggggtat tgagcgctac aattctttac 840

gaaattctcc tcggcaaggc gacgctctac gccgtactgg tgtctactct cgtggttatg 900

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agtttgctta agcaagccgg agatgtggag gaaaatcctg gaccgatgtg gggtgtcttc 1020

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gaaatgactg ctaccgaggg agccattgtc caaatcaact gcacctatca gactagcggc 1140

ttcaatggac tcttctggta ccaacagcat gcgggcgaag cacctacctt cttgtcctat 1200

aatgtcttgg atggtctcga agagaaaggc agattctcca gtttcctcag ccggagcaag 1260

ggatactcat atcttctcct gaaagagctt cagatgaagg attctgcatc ctatctctgt 1320

gcttcagtcg atggcaataa ccgactcgcc tttggaaaag ggaatcaagt ggtcgtcata 1380

ccgaatattc agaaccccga accagccgta tatcagttga aggacccaag atctcaggat 1440

agtacactct gtttgtttac ggactttgac tcacaaatca acgtcccgaa gactatggaa 1500

agtggtacgt tcatcacaga taagtgcgtt ctggacatga aggctatgga ctcaaagagc 1560

aacggggcaa ttgcttggtc caaccagaca agctttacct gtcaggacat ttttaaggag 1620

actaatgcta cttatccctc cagcgacgtt ccgtgtgatg cgactcttac cgagaagtct 1680

tttgagaccg atatgaatct caacttccag aatctgctgg tgatcgttct gcggatcctg 1740

cttctgaagg ttgcaggatt caatcttctt atgactctcc ggctctggtc ttcatgataa 1800