遺傳物質(zhì)的下一代測(cè)序已經(jīng)總體上對(duì)生物科學(xué)尤其是醫(yī)學(xué)產(chǎn)生巨大的影響，因?yàn)闇y(cè)序的單位成本隨著越來越快的測(cè)序儀進(jìn)入市場(chǎng)而直線下降。

在我們之前的申請(qǐng)WO 2014/053853、WO 2014/053854、WO2014/167323、WO2014/167324和WO2014/111723中，我們已經(jīng)描述了新的測(cè)序方法，其涉及逐步消化多核苷酸分析物，產(chǎn)生有序的單核苷酸流，優(yōu)選單三磷酸脫氧核糖核苷流，它們中的每一個(gè)都可以被逐一捕獲入微滴流中相應(yīng)的小滴。然后，可以對(duì)每個(gè)小滴進(jìn)行化學(xué)和/或酶法操作，以揭示其原始包含的特定的單核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些化學(xué)和/或酶法操作包括這樣的方法，所述方法包括使用一種或多種兩成分的寡核苷酸探針類型，每種類型被修改以能夠選擇性捕獲組成所述分析物的單核苷酸類型中的一種。典型地，在每種這樣的探針類型中，兩種寡核苷酸成分中的一種包含特征性的熒光團(tuán)，并且在探針的未使用狀態(tài)，由于存在位置鄰近的猝滅劑或自身猝滅性，這些熒光團(tuán)發(fā)熒光的能力保持熄滅(extinguished)。在使用時(shí)，當(dāng)探針已經(jīng)捕獲其相應(yīng)的單核苷酸時(shí)，使得其對(duì)后續(xù)的核酸外切敏感，由此從猝滅劑和/或彼此釋放熒光團(tuán)使得它們能夠自由發(fā)熒光。通過這種方式，可以通過分光鏡方式間接鑒定在每個(gè)小滴中存在的原始單核苷酸。

Fan等人在Nature Reviews Genetics 7(8)632-644(2006)中提供了研發(fā)已經(jīng)允許用于基因分型、拷貝數(shù)測(cè)量、測(cè)序和檢測(cè)雜合性損失、等位基因特異性表達(dá)和甲基化的高度平行的基因組測(cè)定的方法和平臺(tái)的綜合概述。該綜述的圖2a示意性顯示了可環(huán)化探針的使用，其具有與分析物上的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)的上游和下游退火的3’和5’端，由此產(chǎn)生缺口，該缺口隨后被作為該SNP的互補(bǔ)物的核苷酸填充，形成完整的環(huán)形探針，然后其可以在釋放后被擴(kuò)增。然而，與我們的方法不同，在填充過程中捕獲的核苷酸不是直接從分析物本身獲得的。

WO03/080861描述了一種方法，其中在存在當(dāng)核苷酸被釋放時(shí)直接與所述核苷酸連接的核苷酸特異性反應(yīng)標(biāo)記的條件下，使核苷酸分析物進(jìn)行逐步焦磷酸解。這不但與我們使用的方法非常不同，而且在實(shí)踐中，當(dāng)標(biāo)記的核苷酸后續(xù)被檢查(interrogate)時(shí)測(cè)量的熒光信號(hào)可能太弱而使得不能進(jìn)行高于相關(guān)的背景噪聲的可靠的鑒定。

最后，WO94/18218教導(dǎo)了一種DNA測(cè)序方法，其中使分析物進(jìn)行逐步核酸外切，產(chǎn)生單二磷酸核苷酸或一磷酸核苷酸的流，然后在檢測(cè)之前使它們結(jié)合在熒光增強(qiáng)性基質(zhì)中。這不僅是與我們所描述的方法完全不同的方法，而且我們也觀察到所產(chǎn)生的任何信號(hào)將可能太弱而不能被可靠地檢測(cè)和鑒定。

現(xiàn)在我們開發(fā)了在我們之前的專利申請(qǐng)中所述的方法的改進(jìn)版本，其具有這樣的優(yōu)點(diǎn)：能夠使得每種單核苷酸產(chǎn)生多種比之前得到的更加游離的熒光團(tuán)，由此使得高于背景噪聲的相關(guān)的熒光信號(hào)的檢測(cè)更容易。結(jié)果，極大地提高了任何使用該方法的測(cè)序裝置的靈敏性，并且可以極大地縮短準(zhǔn)確測(cè)序大核酸分子(例如，人DNA片段)所花費(fèi)的時(shí)間。并且，檢測(cè)所需要的設(shè)備更簡(jiǎn)單，因此，制造起來更便宜。

因此，按照本發(fā)明的第一方面，提供一種核酸測(cè)序方法，其特征在于，其包括下述步驟：(1)通過核酸的逐步焦磷酸解產(chǎn)生單三磷酸核苷流；(2)通過在存在聚合酶和連接酶的條件下使至少一個(gè)所述單三磷酸核苷與相應(yīng)的探針系統(tǒng)反應(yīng)產(chǎn)生至少一種基本上雙鏈的寡核苷酸使用的探針，所述相應(yīng)的探針系統(tǒng)包含：(a)第一單鏈寡核苷酸，其用處于不可檢測(cè)狀態(tài)的特征性可檢測(cè)元件標(biāo)記，和(b)第二和第三單鏈寡核苷酸，其能夠雜交于第一寡核苷酸上的互補(bǔ)區(qū)；(3)用具有雙鏈核酸外切活性的酶消化所述使用的探針，產(chǎn)生處于可檢測(cè)狀態(tài)的可檢測(cè)元件和單鏈的第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸至少部分是與第一寡核苷酸互補(bǔ)的序列；(4)使第四寡核苷酸與另一個(gè)第一寡核苷酸反應(yīng)，以產(chǎn)生與所述使用的探針相對(duì)應(yīng)的基本上雙鏈的寡核苷酸產(chǎn)物；(5)循環(huán)重復(fù)步驟(3)和(4)，并且(6)檢測(cè)在步驟(3)的每次重復(fù)中釋放的特征性可檢測(cè)元件。

本發(fā)明方法的步驟(1)包括通過焦磷酸解由核酸分析物產(chǎn)生單三磷酸核苷流。用于該步驟的分析物適當(dāng)?shù)厥请p鏈多核苷酸，其長(zhǎng)度原則上不受限制，包括多至在人基因組片段中發(fā)現(xiàn)的多種數(shù)百萬個(gè)核苷酸堿基。然而，典型地，所述多核苷酸將是至少50個(gè)、優(yōu)選至少150個(gè)核苷酸對(duì)長(zhǎng)；適當(dāng)?shù)?，其將大?00個(gè)、大于1000個(gè)核苷酸對(duì)長(zhǎng)，并且在多種情形中，為數(shù)千個(gè)核苷酸對(duì)長(zhǎng)。分析物本身適當(dāng)?shù)厥翘烊粊碓吹腞NA或DNA(例如，來源于植物、動(dòng)物、細(xì)菌或病毒)，盡管所述方法也可以用于對(duì)合成制備的RNA或DNA或全部或部分由在自然中通常遇不到的核苷酸堿基(即除了腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶之外的核苷酸堿基)制成的其它核酸進(jìn)行測(cè)序。這些核苷酸堿基的實(shí)例包括4-乙酰基胞嘧啶核苷、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶核苷、2-O-甲基胞嘧啶核苷、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶核苷、5-羧基甲基氨基-甲基尿嘧啶核苷、二氫尿嘧啶核苷、2-O-甲基假尿嘧啶核苷、2-O-甲基鳥嘌呤核苷、次黃嘌呤核苷、N6-異戊基腺嘌呤核苷、1-甲基腺嘌呤核苷、1-甲基假尿嘧啶核苷、1-甲基鳥嘌呤核苷、1-甲基次黃嘌呤核苷、2,2-二甲基鳥嘌呤核苷、2-甲基腺嘌呤核苷、2-甲基鳥嘌呤核苷、3-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶核苷、N6-甲基腺嘌呤核苷、7-甲基鳥嘌呤核苷、5-甲基氨基甲基尿嘧啶核苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶核苷、5-甲氧基尿嘧啶核苷、5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿嘧啶核苷、5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶核苷、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷-5-氧基乙酸-甲酯、尿嘧啶核苷-5-氧基乙酸、wybutoxosine、wybutosine、假尿嘧啶核苷、queuosine、2-硫胞嘧啶核苷、5-甲基-2-硫尿嘧啶核苷、2-硫尿嘧啶核苷、4-硫尿嘧啶核苷、5-甲基尿嘧啶核苷、2-O-甲基-5-甲基尿嘧啶核苷和2-O-甲基尿嘧啶核苷。在DNA的情形中，所產(chǎn)生的單三磷酸核苷是三磷酸脫氧核糖核苷，而在RNA的情形中，它們是三磷酸核糖核苷。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)包括將分析物連接于基板的第一子步驟。通常，所述基板包括微流體表面、微珠(micro-bead)或可滲透膜；例如，由玻璃或不可降解的聚合物制成的微流體表面、微珠或可滲透膜。優(yōu)選地，所述基板還包括適于接收分析物的表面。有很多可以將分析物連接于這樣的表面的方式，原則上這些中的任一種都可以用于該子步驟。例如，一種方法包括將玻璃表面用官能化的硅烷(如環(huán)氧硅烷、氨基烴基硅烷或巰基硅烷)預(yù)處理。然后可以將這樣產(chǎn)生的反應(yīng)位點(diǎn)用已被修飾包含末端胺、琥珀?；驇€基的分析物的衍生物處理。

在步驟(1)的一個(gè)實(shí)施方案中，將分析物焦磷酸解以產(chǎn)生單三磷酸核苷流，所述單三磷酸核苷流的排序?qū)?yīng)于所述分析物的序列。焦磷酸解可以在20至90℃范圍內(nèi)的溫度，在包含聚合酶的反應(yīng)介質(zhì)的存在下進(jìn)行。優(yōu)選地，其在連續(xù)流動(dòng)的條件下進(jìn)行，使得單三磷酸脫氧核苷隨著它們被釋放而被連續(xù)地從反應(yīng)區(qū)移走。最優(yōu)選地，通過使得包含酶和其它典型的添加劑的含水緩沖介質(zhì)連續(xù)流經(jīng)結(jié)合有分析物的表面來進(jìn)行所述焦磷酸解。

在一個(gè)實(shí)施方案中，使用的酶是這樣的，其能夠使得高保真地且以合理的反應(yīng)速率對(duì)分析物進(jìn)行逐步3’-5’焦磷酸解降解以產(chǎn)生三磷酸核苷流。優(yōu)選地，該降解速率盡可能快，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，落在1至50個(gè)三磷酸核苷/秒的范圍內(nèi)。關(guān)于用于降解多核苷酸的焦磷酸解反應(yīng)的更多信息可以例如在J.Biol.Chem.244(1969)pp.3019-3028中找到。適當(dāng)?shù)?，焦磷酸解降解在存在進(jìn)一步包含焦磷酸陰離子和鎂陽離子(優(yōu)選以毫摩爾濃度計(jì))的介質(zhì)的條件下進(jìn)行。

在本發(fā)明的方法的步驟(2)中，在所述流中的至少一個(gè)單三磷酸核苷、優(yōu)選每個(gè)單三磷酸核苷在存在聚合酶和連接酶的條件下與探針系統(tǒng)反應(yīng)，產(chǎn)生基本上雙鏈的使用的探針。優(yōu)選地，在進(jìn)行該步驟之前，使步驟(1)的包含單三磷酸核苷的產(chǎn)物與焦磷酸酶反應(yīng)，從而將任何殘留的焦磷酸根水解成磷酸根陰離子。

用于該步驟的聚合酶適當(dāng)?shù)剡x自由在所述反應(yīng)條件下基本上不顯示外切或內(nèi)切核酸酶活性的那些聚合酶組成的組。可以有利地使用的聚合酶的實(shí)例包括，但不限于，獲自細(xì)菌如大腸桿菌(Escherichia coli)(例如Klenow片段聚合酶)、水生棲熱菌(Thermus aquaticus)(例如Taq Pol)和嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophilus)、熱速芽孢桿菌(Bacillus caldovelox)和熱堅(jiān)芽孢桿菌(Bacillus caldotenax)的原核pol 1酶或酶衍生物。原則上，在該步驟中可以使用任意適合的連接酶。

步驟(2)中使用的探針系統(tǒng)包含三種成分；(a)第一單鏈寡核苷酸，其用處于不可檢測(cè)狀態(tài)的特征性可檢測(cè)元件標(biāo)記，和(b)第二和第三未標(biāo)記的單鏈寡核苷酸，其能夠雜交于第一寡核苷酸上的互補(bǔ)區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二和第三寡核苷酸是分開的實(shí)體，而在另一個(gè)實(shí)施方案中，它們通過接頭區(qū)的方式彼此連接。在該后一種情形中，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭區(qū)連接第二和第三寡核苷酸的末端；優(yōu)選地，連接第二寡核苷酸的5’端和第三寡核苷酸的3’端。接頭區(qū)原則上可以是任意二價(jià)的基團(tuán)，但是便利地是另一種單鏈或雙鏈的寡核苷酸片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭區(qū)不能基本上雜交于第一寡核苷酸。

選擇第一、第二和第三寡核苷酸，使得在步驟(2)中，第二和第三寡核苷酸可以分別雜交到第一寡核苷酸上的3’側(cè)和5’側(cè)的側(cè)翼區(qū)，它們本身并置在捕獲區(qū)的每一側(cè)，所述捕獲區(qū)包含核苷酸堿基與待檢測(cè)的三磷酸核苷攜帶的核苷酸堿基互補(bǔ)的單核苷酸。這使得該三成分的探針系統(tǒng)對(duì)所述特定的三磷酸核苷有高度選擇性。因此，例如，如果分析物來源于DNA，并且第一、第二和第三寡核苷酸是脫氧核糖核苷酸，則當(dāng)捕獲區(qū)包含的核苷酸攜帶胸腺嘧啶堿基時(shí)，所述捕獲區(qū)將對(duì)三磷酸脫氧腺苷有高度選擇性。在本發(fā)明的一個(gè)有用的實(shí)施方案中，步驟(2)可以在存在多種探針系統(tǒng)類型的條件下進(jìn)行；例如，一種、兩種、三種或四種探針系統(tǒng)類型，它們中的每一種包含具有所尋找的特征為多種不同的核苷酸堿基的不同的捕獲區(qū)和與其連接的不同的可檢測(cè)元件的第一寡核苷酸。

典型地，第一寡核苷酸多至150個(gè)核苷酸長(zhǎng)，優(yōu)選為20-100個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二寡核苷酸比第一寡核苷酸的互補(bǔ)性3’側(cè)側(cè)翼區(qū)長(zhǎng)多至10個(gè)、優(yōu)選1-5個(gè)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在第一寡核苷酸的3’端與在第二寡核苷酸上與其相反的核苷酸之間存在單個(gè)核苷酸錯(cuò)配，以防止所述三磷酸核苷在這一點(diǎn)上被聚合酶捕獲。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第三寡核苷酸的3’端包含耐受核酸外切降解的元件，以確保步驟(3)中產(chǎn)生的第四寡核苷酸本身不被接著消化掉。例如，這可以通過在該特定末端處或接近該特定末端處結(jié)合一個(gè)或多個(gè)硫代磷酸酯鍵、G-四聯(lián)體、硼酸化的核苷酸、倒置的dT或ddT、C3間隔臂或磷酸基團(tuán)而實(shí)現(xiàn)。

第一寡核苷酸的特征在于其被其本身獨(dú)特類型的一種或多種可檢測(cè)元件多重標(biāo)記，并且這些可檢測(cè)元件在探針系統(tǒng)處在未使用狀態(tài)時(shí)基本上是不可檢測(cè)的。適當(dāng)?shù)?，這些可可檢測(cè)元件是適于在發(fā)生光學(xué)事件后被檢測(cè)到的元件。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可可檢測(cè)元件包括熒光團(tuán)，并且每個(gè)未使用的第一寡核苷酸在設(shè)計(jì)檢測(cè)所述熒光團(tuán)的那些波長(zhǎng)處基本上不發(fā)熒光。因此，盡管熒光團(tuán)可能呈現(xiàn)跨電磁譜的一個(gè)寬的部分的整體的、低水平的背景熒光，但是通常將存在熒光強(qiáng)度處于最大值的一個(gè)或少數(shù)特定波長(zhǎng)或波長(zhǎng)封套(envelopes)。在熒光團(tuán)被特征性檢測(cè)的這些最大值中的一個(gè)或多個(gè)處，熒光基本上不應(yīng)該發(fā)生。在本專利的語境中，術(shù)語‘基本上不發(fā)熒光’或等效用詞意為，與第一寡核苷酸連接的熒光團(tuán)總數(shù)在相關(guān)特征波長(zhǎng)或波長(zhǎng)封套處的熒光強(qiáng)度小于相等數(shù)量的自由熒光團(tuán)的相應(yīng)熒光強(qiáng)度的25％；優(yōu)選小于10％；更優(yōu)選小于1％并且最優(yōu)選小于0.1％。

原則上，任何方法可以用于保證在第一寡核苷酸的未使用狀態(tài)下，熒光團(tuán)基本不發(fā)熒光。一種方式是在與其緊鄰處額外地連接猝滅劑。另一種是基于這樣的觀察，即當(dāng)多個(gè)熒光團(tuán)彼此緊鄰地連接于第一寡核苷酸時(shí)，它們傾向于彼此充分猝滅，以致可以在不需要猝滅劑的情況下實(shí)現(xiàn)前一段所述的標(biāo)準(zhǔn)。在本專利的語境中，什么構(gòu)成熒光團(tuán)之間或熒光團(tuán)與猝滅劑之間的‘緊鄰’將取決于使用的特定熒光團(tuán)和猝滅劑并且可能取決于第一寡核苷酸的結(jié)構(gòu)特征。因此，意在表示，應(yīng)該根據(jù)所需結(jié)果而不是各種元件的任何特定結(jié)構(gòu)布置來理解該術(shù)語。然而，并且僅為了提供例證，要指出的是，當(dāng)相鄰的熒光團(tuán)或相鄰的熒光團(tuán)和猝滅劑被分開對(duì)應(yīng)于特征距離(通常小于5nm)的距離時(shí)，通常將實(shí)現(xiàn)充分的猝滅。

適當(dāng)?shù)?，第一寡核苷酸用至?個(gè)、優(yōu)選多至20個(gè)熒光團(tuán)標(biāo)記。為了獲得最大的優(yōu)勢(shì)，優(yōu)選的是，第一寡核苷酸被標(biāo)記以至少2個(gè)、優(yōu)選至少3個(gè)熒光團(tuán)。因此，本文中特別地設(shè)想由這些最大值和最小值的任意排列構(gòu)成的范圍。如果使用猝滅劑，同樣優(yōu)選的是，第一寡核苷酸用多至20個(gè)，優(yōu)選多至10個(gè)并且最優(yōu)選多至5個(gè)猝滅劑標(biāo)記。

就熒光團(tuán)自身而言，它們?cè)瓌t上可以從本領(lǐng)域中常規(guī)使用的那些中的任一種中選擇，其包括但不限于呫噸結(jié)構(gòu)部分例如熒光素，羅丹明和它們的衍生物比如熒光素異硫氰酸酯，羅丹明B等；香豆素結(jié)構(gòu)部分(例如羥基-、甲基-和氨基香豆素)和花青結(jié)構(gòu)部分比如Cy2、Cy3、Cy5和Cy7。具體實(shí)例包括從以下常規(guī)使用的染料衍生的熒光團(tuán)：Alexa染料、花青染料、Atto Tec染料和羅丹明染料。實(shí)例還包括：Atto 633(ATTO-TEC GmbH)、德克薩斯紅^TM(Texas Red^TM)、Atto 740(ATTO-TEC GmbH)、Rose Bengal、Alexa Fluor^TM 750 C₅-馬來酰亞胺(Invitrogen)，Alexa Fluor^TM 532C₂-馬來酰亞胺(Invitrogen)和羅丹明紅C₂-馬來酰亞胺和羅丹明綠以及亞磷酰胺染料比如Quasar 570。備選地，可以使用量子點(diǎn)或近紅外染料如由LI-COR Biosciences提供的那些。熒光團(tuán)通常使用本領(lǐng)域已知的化學(xué)方法經(jīng)核苷酸堿基連接于第一寡核苷酸。

合適的猝滅劑包括通過共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)機(jī)制起作用的那些?？缮藤彽目梢耘c以上提及的熒光團(tuán)聯(lián)合使用的猝滅劑的實(shí)例包括但不限于DDQ-1，Dabcyl，Eclipse，Iowa Black FQ和RQ，IR Dye-QC1，BHQ-0，BHQ-1、-2和-3以及QSY-7和-21。

在一個(gè)實(shí)施方案中，第二和第三寡核苷酸不用可檢測(cè)元件標(biāo)記。

步驟(2)適當(dāng)?shù)赝ㄟ^將所述流中的每個(gè)單三磷酸核苷與一種或多種上述探針系統(tǒng)在20至80℃范圍內(nèi)的溫度接觸而進(jìn)行。

本發(fā)明的方法的步驟(2)的產(chǎn)物，如上文提及，是基本上雙鏈的使用的探針，其組成鏈分別是第一寡核苷酸和互補(bǔ)的第四寡核苷酸，當(dāng)以其5’-3’方向讀取時(shí)，其包含第二寡核苷酸，然后是來源于單三磷酸核苷的核苷酸，并且最后是第三寡核苷酸。如果第二和第三寡核苷酸之前已經(jīng)通過接頭區(qū)連接在一起，那么容易明顯可見，第四寡核苷酸將包含高度耐受核酸外切的封閉的環(huán)鏈。

在步驟(3)中，所使用的探針用酶在30-100℃范圍內(nèi)的溫度處理。在該步驟中，在該過程中，來源于第一寡核苷酸的所使用的探針的鏈被消化成其組成核苷酸(一磷酸脫氧核糖核苷或一磷酸核糖核苷，可以根據(jù)具體情況而定)，將可檢測(cè)元件彼此分開，并且由此使得它們成為未被猝滅的并且因此是可檢測(cè)的。因此，如果可檢測(cè)元件是在第一寡核苷酸中已被猝滅成不可檢測(cè)狀態(tài)的熒光團(tuán)，則步驟(3)將從彼此和任意的猝滅劑釋放熒光團(tuán)，由此使得它們發(fā)熒光。隨著消化過程發(fā)生，由此觀察者觀察到熒光信號(hào)的快速增長(zhǎng)，原因在于產(chǎn)生了單核苷酸級(jí)聯(lián)。然后，該熒光的特征間接反映被相關(guān)的探針系統(tǒng)最初捕獲的單三磷酸核苷的性質(zhì)。

可以用于步驟(3)的酶包括外切核酸酶或表現(xiàn)出3’-5’核酸外切活性的聚合酶。這種種類的酶包括Q5，Q5熱啟動(dòng)(Hot Start)，Phusion，Phusion HS，Phusion II，Phusion II HS，DNA酶I(無RNA酶)，外切核酸酶I或III(ex大腸桿菌(E.coli))，外切核酸酶T，外切核酸酶V(RecBCD)，λ外切核酸酶，微球菌核酸酶，綠豆核酸酶(Mung Bean Nuclease)，核酸酶BAL-31，RecJ_f，T5外切核酸酶和T7外切核酸酶。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(3)的最后，將反應(yīng)混合物在相對(duì)高和相對(duì)低的溫度之間循環(huán)，以從第四寡核苷酸中去除任何來自第一寡核苷酸的留下的剩余的寡核苷酸片段并且允許新的第二和第三寡核苷酸退火。

在步驟(4)中，使現(xiàn)在以單鏈形式存在的第四寡核苷酸與另一個(gè)第一寡核苷酸分子雜交，由此產(chǎn)生新的基本上雙鏈的寡核苷酸產(chǎn)物，該雙鏈的寡核苷酸產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于，即，具有與使用的探針相同的化學(xué)和物理結(jié)構(gòu)。然后，重復(fù)步驟(3)將該產(chǎn)物消化，由此釋放處于可檢測(cè)狀態(tài)的其他可檢測(cè)元件并且同樣再次再生第四寡核苷酸。然后，按照步驟(5)，允許步驟(3)和(4)以循環(huán)方式繼續(xù)，使得來自游離的可檢測(cè)元件的信號(hào)(例如，熒光信號(hào))進(jìn)一步富集；原則上，直到已經(jīng)消耗基本上全部的第一寡核苷酸。結(jié)果，觀察者觀察到比之前獲得的大得多的熒光信號(hào)富集。

然后，并且在步驟(6)中，檢測(cè)在步驟(3)的多次重復(fù)中釋放的可檢測(cè)元件，并且確定與單三磷酸核苷連接的核苷酸堿基的性質(zhì)。通過對(duì)在步驟(1)中產(chǎn)生的流中的所有單三磷酸核苷有條理地進(jìn)行本發(fā)明的方法，可以產(chǎn)生并分析特征為原始核酸分析物的序列的數(shù)據(jù)。這樣做的方法是本領(lǐng)域中公知的；例如熒光可以使用調(diào)至各種熒光團(tuán)的特征熒光波長(zhǎng)或波長(zhǎng)封套的光檢測(cè)器或等效裝置來檢測(cè)。這相應(yīng)導(dǎo)致光檢測(cè)器產(chǎn)生可以使用已知的算法在計(jì)算機(jī)中處理和分析的特征性電信號(hào)。在一個(gè)實(shí)施方案中，允許在步驟(5)與(6)之間經(jīng)過一段時(shí)間，以確保處于可檢測(cè)狀態(tài)的可檢測(cè)元件的數(shù)量已經(jīng)增加至最大值。

在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法完全或部分以微滴流進(jìn)行，至少它們中的一些包含單三磷酸核苷；適當(dāng)?shù)厥怯行虻牧?。這種方法可以例如始于將步驟(1)中產(chǎn)生的三磷酸核苷逐一插入到維持在可混溶的載體溶劑(如烴或硅油)中的含水微滴的相應(yīng)的流中以幫助保持排序。有利地，這可以通過在焦磷酸解反應(yīng)區(qū)的下游直接產(chǎn)生微滴而實(shí)現(xiàn)；例如，通過使得反應(yīng)介質(zhì)從合適尺寸的微滴頭出來到流動(dòng)的溶劑流中。備選地，可以有規(guī)則且順序地將來自步驟(1)的小等分試樣的反應(yīng)介質(zhì)注射入溶劑中懸浮的已存在的含水微滴流中。如果采用后一方式，各微滴可以適當(dāng)?shù)睾幸粋€(gè)或多個(gè)探針系統(tǒng)的各種組分連同實(shí)現(xiàn)步驟(2)至(5)所需的酶和任何其他試劑(例如緩沖劑)。在另一種方法中，可以使得在前一實(shí)施方案中產(chǎn)生的微滴隨后與這種已存在的微滴流合并，從而實(shí)現(xiàn)類似的結(jié)果。在這些微滴方法中，步驟(6)則優(yōu)選包括檢查各小滴以鑒定釋放的可檢測(cè)元件并且因此鑒定其原始包含的三磷酸核苷的性質(zhì)。

為了避免給定微滴包含多于一種三磷酸核苷的風(fēng)險(xiǎn)，優(yōu)選在步驟(1)中以使得各填充的微滴間隔以1至20個(gè)、優(yōu)選2至10個(gè)空微滴的速率釋放每個(gè)三磷酸核苷。之后，使得溶劑中填充和未填充的微滴的流沿流動(dòng)路徑(適當(dāng)?shù)貫槲⒘黧w流動(dòng)路徑)，以使得微滴保持離散狀態(tài)并且沒有機(jī)會(huì)彼此合并的速率和方式流動(dòng)。適當(dāng)?shù)?，使用的微滴具有小?00微米，優(yōu)選小于50微米，更優(yōu)選地小于20微米，并且甚至更優(yōu)選小于15微米的有限的直徑。所有其直徑中，最優(yōu)選的是在2至20微米范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，微滴經(jīng)過整個(gè)系統(tǒng)的流速在50至3000個(gè)微滴/秒的范圍內(nèi)，優(yōu)選為100至2000個(gè)微滴/秒。

按照本發(fā)明的第二方面，提供一種探針系統(tǒng)，其特征在于，所述探針系統(tǒng)包括：(a)第一單鏈寡核苷酸，其用一種或多種處于不可檢測(cè)狀態(tài)的熒光團(tuán)標(biāo)記，和(b)第二和第三未標(biāo)記的單鏈寡核苷酸，它們能夠分別雜交到第一寡核苷酸上的互補(bǔ)的3’側(cè)和5’側(cè)的側(cè)翼區(qū)，它們并置在單核苷酸捕獲區(qū)的每一側(cè)，第二寡核苷酸的長(zhǎng)度比所述3’側(cè)的側(cè)翼區(qū)長(zhǎng)至少一個(gè)核苷酸。

在本發(fā)明的第一方面的第一實(shí)施方案中，第二和第三寡核苷酸通過接頭區(qū)連接，所述接頭區(qū)通常是單鏈或雙鏈寡核苷酸區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在第一寡核苷酸的3’端的核苷酸是與在第二寡核苷酸中的相對(duì)應(yīng)的核苷酸的錯(cuò)配。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第三寡核苷酸在其3’端包含耐受核酸外切降解的元件。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，熒光團(tuán)位于第一寡核苷酸的5’側(cè)翼區(qū)，所述第一寡核苷酸也可以包含猝滅劑。

上文所述的方法和探針系統(tǒng)可以有利地用于在測(cè)序裝置中，并且考慮所述裝置在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

現(xiàn)在將參考以下實(shí)施例以多個(gè)方面說明本發(fā)明。

實(shí)施例1-探針系統(tǒng)的制備和使用

制備單鏈的第一寡核苷酸1，其具有下述核苷酸序列：

5′TCGTGCCTCATCGAACATGACGAGGXXQXXGGTTTGTGGT3′

其中A，C，G和T表示攜帶DNA的相關(guān)特征性核苷酸堿基的核苷酸；X表示使用常規(guī)的胺連接化學(xué)用Atto 655染料標(biāo)記的脫氧胸苷核苷酸(T)，并且Q表示用BHQ-2猝滅劑標(biāo)記的脫氧胸苷核苷酸。其還包含捕獲區(qū)(A核苷酸)，所述捕獲區(qū)對(duì)捕獲三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)混合物中的三磷酸脫氧胸苷核苷酸(dTTPs)具有選擇性。

還制備另一種單鏈的寡核苷酸2，其包含：(1)第二寡核苷酸區(qū)，其具有與第一寡核苷酸的3’端互補(bǔ)且具有單個(gè)堿基錯(cuò)配的序列；(2)第三寡核苷酸區(qū)，其具有與第一寡核苷酸的5’端互補(bǔ)的序列，和(3)一個(gè)76個(gè)堿基對(duì)的單鏈接頭區(qū)。其具有下述核苷酸序列：

5′PCATGTTCGATGAGGCACGATAGATGTACGCTTTGACATACGCTTTGACAATACTTGAGCAGTCGGCAGATATAGGATGTTGCAAGCTCCGTGAGTCCCACAAACCAAAAACCTCG3′

其中，另外地，P表示5’磷酸基團(tuán)。

然后制備包含探針系統(tǒng)的反應(yīng)混合物。其具有與來源于下述配方的組成相對(duì)應(yīng)的組成：

56uL 5x緩沖液，pH 7.5

28uL寡核苷酸1，100nM

28uL寡核苷酸2，10nM

2.8uL dNTPs(包括dTTP)的混合物，10nM

0.4U Phusion II熱啟動(dòng)聚合酶(外切核酸酶)

1.6U Bst大片段聚合酶

20U大腸桿菌連接酶

4U熱穩(wěn)定性無機(jī)焦磷酸酶

加水至280uL

其中5x緩沖液包含下述混合物：

200uL三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Trizma hydrochloride)，1M，pH 7.5

13.75uL MgCl₂水溶液，1M

2.5uL二硫蘇糖醇，1M

50uL Triton X-100表面活性劑(10％)

20uL煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，100uM

166.67uL KCl

加水至1mL

然后，通過將混合物在37℃溫育50分鐘，然后將溫度升高至70℃再溫育50分鐘而進(jìn)行dTTPs的捕獲和寡核苷酸2與寡核苷酸1連接形成閉環(huán)的使用的探針。然后，將反應(yīng)混合物用Helium-Neon激光器的633nm光線照射，并且在使用的探針的核酸外切與再生的循環(huán)開始時(shí)，使用攝像機(jī)檢測(cè)產(chǎn)生的Atto 655染料的特征性熒光。

監(jiān)測(cè)在存在和不存在反應(yīng)混合物的dNTP成分的條件下的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的增長(zhǎng)，并且將結(jié)果圖示在圖1中。由其可以看出，所述探針系統(tǒng)有效地捕獲dTTPs，并且本發(fā)明的方法的循環(huán)性質(zhì)導(dǎo)致熒光信號(hào)的快速增長(zhǎng)。相反，在不存在dNTPs的比較實(shí)驗(yàn)中，寡核苷酸1上的Atto 655染料沒有表現(xiàn)出任何明顯程度的熒光。

實(shí)施例2-使用探針系統(tǒng)的小滴微流體方法

圖2示意性顯示微流體測(cè)序裝置，其中使得分別包含單核苷酸堿基的多個(gè)微滴與上文所述的上述類型的探針系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)。

使得包含通過對(duì)源于人DNA的100個(gè)核苷酸堿基的多核苷酸分析物進(jìn)行逐步焦磷酸解獲得的單三磷酸核苷酸流的水性介質(zhì)1流過由PDMS聚合物制成的十微米直徑的微流體管。焦磷酸解反應(yīng)自身通過以下方式進(jìn)行：在72℃，使含有Taq Pol和具有2毫摩爾/升濃度的焦磷酸鈉和氯化鎂中的每種的溶液的水性緩沖的(pH 7.5)反應(yīng)介質(zhì)流通過之前已經(jīng)通過琥珀酰基橋?qū)⒎治鑫镞B接于其上的玻璃微珠。微珠下游的1中單核苷酸的順序?qū)?yīng)于分析物的序列。1從小滴頭2中出來進(jìn)入第一室3，在那里，其與一個(gè)以上不可混溶的輕硅油流4接觸。選擇這些流的速度以避免湍流混合并且用以產(chǎn)生懸浮在油中的水性球形小滴5，其各自具有大約八微米的直徑。通常，調(diào)節(jié)速率以使得在相鄰的填充的小滴之間有10個(gè)空的小滴。隨后，使5的流沿具有相同直徑的第二微流體管前進(jìn)至第二室6，第二個(gè)五微米水性球形小滴7的流通過第二小滴頭8也進(jìn)入第二室6中。使得小滴5和7以連續(xù)的方式合并，從而形成直徑約九微米的放大的水性小滴9。7中的每個(gè)含有焦磷酸酶用以破壞存在于每個(gè)5中的任何殘留的焦磷酸根陰離子。

然后9的流以相同速率前進(jìn)，通過微流體管道，進(jìn)入第三室10，在那里，這些小滴與通過相應(yīng)小滴頭12同樣進(jìn)入其中的第三個(gè)五微米水性球形小滴11的流相接觸。9中的每個(gè)在室6和10之間移動(dòng)所需的時(shí)間為大約2分鐘。

隨后使得小滴9和11在10中合并，從而產(chǎn)生小滴13(直徑大約十微米)。11中的每個(gè)包含嗜溫連接酶(表現(xiàn)出3’-5’雙鏈外切核酸酶活性的嗜熱聚合酶)和包含四對(duì)與實(shí)施例1中所述的那些相似的單鏈寡核苷酸的探針系統(tǒng)。每種第一寡核苷酸是40個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并且具有特征為DNA的四種特征性核苷酸堿基類型(即A，T，G和C)的不同的第20個(gè)核苷酸(從5’端測(cè)量)。每種第一寡核苷酸還用彼此緊鄰的多種熒光團(tuán)和猝滅劑標(biāo)記，以使得在它們結(jié)合在一起的狀態(tài)下，它們基本上不發(fā)熒光，并且當(dāng)被釋放時(shí)，它們?cè)谒鼈兯鶃碓吹牡谝还押塑账崽赜械牟ㄩL(zhǎng)發(fā)熒光。所述四種不同的第二寡核苷酸各自的長(zhǎng)度為115個(gè)核苷酸堿基，在其兩端具有與第一寡核苷酸的第20個(gè)堿基側(cè)連的區(qū)域互補(bǔ)的不同的終止序列，并且具有常見的76個(gè)堿基對(duì)的接頭區(qū)。

然后，使這樣形成的合并的微滴13的流在37℃溫育30分鐘，然后在70℃溫育30分鐘。在這一時(shí)間結(jié)束時(shí)，將13轉(zhuǎn)移到檢測(cè)系統(tǒng)14中。

檢測(cè)系統(tǒng)(未顯示)通常包括其中用來自激光器的入射光檢查每個(gè)小滴的檢測(cè)窗口。然后，該光的作用使每個(gè)小滴中的釋放的熒光團(tuán)以原始結(jié)合在捕獲分子中的單核苷酸堿基特有的方式發(fā)熒光(或者，如果小滴原始是空的，則基本上完全沒有熒光)。然后，在上文提及的四種熒光團(tuán)的四種特征波長(zhǎng)檢測(cè)存在或不存在該熒光。由此，當(dāng)小滴依次被檢查時(shí)，可以有效地讀取原始多核苷酸分析物中的核苷酸堿基的序列。

序列表

<110> 貝斯4創(chuàng)新公司

<120> 單核苷酸檢測(cè)方法

<130> P61091WO

<150> GB1412977.9

<151> 2014-07-22

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸1

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> 用Atto 655染料標(biāo)記的脫氧胸苷核苷酸(T)

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> 用Atto 655染料標(biāo)記的脫氧胸苷核苷酸(T)

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> 用BHQ-2猝滅劑標(biāo)記的脫氧胸苷核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> 用Atto 655染料標(biāo)記的脫氧胸苷核苷酸(T)

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> 用Atto 655染料標(biāo)記的脫氧胸苷核苷酸(T)

<400> 1

tcgtgcctca tcgaacatga cgaggttttt ggtttgtggt 40

<210> 2

<211> 115

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸2

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 連接到胞嘧啶的5'磷酸基團(tuán)

<400> 2

catgttcgat gaggcacgat agatgtacgc tttgacatac gctttgacaa tacttgagca 60

gtcggcagat ataggatgtt gcaagctccg tgagtcccac aaaccaaaaa cctcg 115