本發(fā)明大體上涉及對人vegf-a有異常強的結(jié)合親和力且其還與人vegf-b交叉反應的抗人vegf抗體，具體涉及這些抗體的嵌合和人源化形式。
背景技術：
：血管生成是涉及新血管從已有血管生長的生理過程。這個過程對于生長和發(fā)育以及傷口愈合是至關重要的。然而，它也是惡性腫瘤發(fā)展和諸如增殖性視網(wǎng)膜病、類風濕性關節(jié)炎和牛皮癬的其他非腫瘤相關病狀的基礎(folkmanj.1971；praidoua等人，2010；canavesem等人，2010)。血管內(nèi)皮細胞生長因子(vegf)是由基質(zhì)和腫瘤細胞分泌以及少量由多種其他細胞分泌的蛋白質(zhì)，其在刺激血管生成中起著關鍵作用(ferraran等人，2004)。vegf過量可以導致血管生成相關疾病。例如，沒有充足血液供應的情況下，實體癌就不能生長超過受限的尺寸，表達vegf的癌更能生長和轉(zhuǎn)移(ferraran.2005)?？紤]到這些因素，用諸如用于癌癥治療的貝伐單抗(阿瓦斯汀)(ferraran等人，2005)和用于視網(wǎng)膜病變的雷珠單抗(lucentis)(ciullata等人，2009)的抗vegf單克隆抗體開發(fā)了抗血管生成療法。在過去幾年中已深入研究和應用基于使用貝伐單抗和雷珠單抗的療法(vanmeterme等人，2010；ciullata等人，2009)。美國食品藥品監(jiān)督管理局(fda)批準貝伐單抗聯(lián)合標準化療用于轉(zhuǎn)移性腎癌、成膠質(zhì)細胞瘤、轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌和非小細胞肺癌，以及用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌中。然而，在美國，fda的專家小組現(xiàn)已表示他們在晚期乳腺癌中未看到阿瓦斯汀有足夠益處來值得冒其嚴重的風險。目前在非轉(zhuǎn)移性乳腺癌、腎細胞癌、多形性膠質(zhì)母細胞瘤、卵巢癌、去勢抵抗性前列腺癌、非轉(zhuǎn)移性不能切除的肝癌及轉(zhuǎn)移性或不可切除的局部晚期胰腺癌中也正在進行一些臨床試驗。貝伐單抗也在沒有fda批準的情況下使用，不過是在臨床研究的基礎上，用于治療黃斑變性，黃斑變性也是以視網(wǎng)膜中血管增殖為特征的眼病。雷珠單抗是來源于與貝伐單抗相同的鼠源抗體的fab抗體片段，并已經(jīng)被fda批準用于治療濕性年齡相關性黃斑變性。盡管目前所批準的抗vegf-a抗體的臨床用途產(chǎn)生益處，但仍有關于治療效果、副作用、治療抵抗和治療費用的許多問題有待解決。因此，開發(fā)新的更有效的抗人vegf抗體是必要的。我們現(xiàn)已開發(fā)出新的抗人vegf抗體，其出人意料地對人vegf-a靶標有異常高的結(jié)合親和力并具有與人vegf-b的交叉反應性。即使根據(jù)其氨基酸序列，vegf-b與vegf-a密切相關，但vegf-b血管生成功能具有血管存活所需的有效存活/抗凋亡作用(lix等人，2009)。因此，vegf-b對于維持支撐腫瘤生長的血管的完整性是非常重要的，且對其活動的干擾應該有助于更完全的抗腫瘤治療。技術實現(xiàn)要素：本申請說明了對人vegf-a有異常強的結(jié)合親和力并具有與人vegf-b的交叉反應性的抗人vegf抗體，與本領域的抗人vegf抗體相比，其是抑制vegf誘導培養(yǎng)物中內(nèi)皮細胞增殖的更強的抑制劑。本文所公開的鼠抗人vegf抗體以不超過5×10-12m的kd值結(jié)合人vegf-a，而本文所公開的抗人vegf抗體的一種人源化形式以不超過1.0x10-10m的kd值結(jié)合人vegf-a。此外，本文所公開的小鼠抗人vegf抗體抑制vegf-a誘導的體外huvec內(nèi)皮細胞增殖的ic50值為約11ng/ml，而其人源化形式抑制vegf-a誘導的體外huvec內(nèi)皮細胞增殖的ic50值為約19ng/ml。本發(fā)明的抗人vegf抗體結(jié)合到人vegf-a165(seqidno：1)的三個區(qū)域，包含人vegf-a165(seqidno：1)的氨基酸殘基16至25，45至54和79至92。所有這些區(qū)域參與vegf-a與其受體(vegfr)之間的相互作用。特別是，vegf-a165的氨基酸16至25參與重要的接觸區(qū)域(shalinil等人，2010)。對此，由于人和小鼠vegf之間在包含氨基酸16至25的片段的具有高同源性(fuhg等人，2006)，已經(jīng)指出通過用于獲得抗人vegf單克隆抗體的傳統(tǒng)方法可能很難獲得針對此區(qū)域的單克隆抗體(jinkimk等人，1993)。然而，本發(fā)明所公開的免疫方案的改進出人意料地造成用經(jīng)典方法(kohler等人，1975)獲得了針對此區(qū)域的單克隆抗體。這些單克隆抗體對vegf-a分子有異常高的親和力，還呈現(xiàn)出與人vegf-b(seqidno：2)的交叉反應性。通過根據(jù)治療需要向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康目贵w，本文所公開抗體的人源化形式用于治療vegf相關的血管生成疾病包括癌癥、年齡相關性黃斑變性、類風濕性關節(jié)炎和糖尿病性視網(wǎng)膜病變的用途在本發(fā)明的范圍內(nèi)。附圖說明圖1示出了通過本發(fā)明的小鼠mmca-abi-anti-vegf-a單克隆抗體抑制vegf誘導的huvec細胞培養(yǎng)物有絲分裂，以及通過抗vegf單克隆抗體貝伐單抗(阿瓦斯汀tm)抑制vegf誘導的huvec細胞培養(yǎng)物有絲分裂。實驗過程如實施例5所述。每個點對應6次重復的平均和標準偏差。ic50值用graphpadprism5程序計算。圖2示出了通過本發(fā)明小鼠mmca-abi-anti-vegf-a單克隆抗體的人源化形式抑制vegf誘導的huvec細胞培養(yǎng)物有絲分裂，以及通過抗vegf單克隆抗體貝伐單抗(阿瓦斯汀tm)抑制vegf誘導的huvec細胞培養(yǎng)物有絲分裂。實驗過程如實施例5所述。每個點對應6次重復的平均和標準偏差。ic50值用graphpadprism5程序計算。圖3示出了按以下劑量：1μg/小鼠或25μg/小鼠，一周兩次，共五周，用本發(fā)明的小鼠mmca-abi-anti-vegf-a單克隆抗體以及用本發(fā)明的小鼠mmca-abi-anti-vegf-a單克隆抗體的人源化形式治療后，裸鼠中iib-mel-j腫瘤生長的抑制。此后處死動物，切除腫瘤并稱重。(＊)：根據(jù)非參數(shù)kruskal-wallis檢驗的統(tǒng)計學顯著性。圖4示出了說明裸鼠中iib-mel-j腫瘤生長抑制的腫瘤圖像，以示出本發(fā)明的小鼠mmca-abi-anti-vegf-a單克隆抗體的人源化形式或者抗vegf單克隆抗體貝伐單抗(阿瓦斯汀tm)的劑量作用。圖5示出了按以下劑量：1μg/小鼠或25μg/小鼠，一周兩次，共五周，用本發(fā)明的小鼠mmca-abi-anti-vegf-a單克隆抗體的人源化形式或者貝伐單抗(阿瓦斯汀tm)治療后，裸鼠中iib-mel-j腫瘤生長的抑制。此后處死動物，切除腫瘤并稱重。(＊)：根據(jù)非參數(shù)kruskal-wallis檢驗，相對于對照的統(tǒng)計學顯著性。(＊＊)：根據(jù)非參數(shù)kruskal-wallis檢驗，相對于貝伐單抗治療的統(tǒng)計學顯著性。具體實施方式本發(fā)明的以下說明僅意在舉例說明本發(fā)明的幾個實施方式。然而，不意味著這些所討論的實施方式限制本發(fā)明的范圍，因為在不偏離本發(fā)明范圍的情況下，許多改變和改進對于本領域技術人員而言將是顯而易見的?？s略語以下縮略語將在本發(fā)明的全文中使用：vegf＝血管內(nèi)皮細胞生長因子；vegf-a＝血管內(nèi)皮細胞生長因子變體a；vegf-b＝血管內(nèi)皮細胞生長因子變體b；vegfr＝血管內(nèi)皮細胞生長因子受體；huvec＝人臍靜脈內(nèi)皮細胞；kd＝特定抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)；bsa＝牛血清白蛋白；術語釋義本文所用術語“人vegf”是指165個氨基酸的血管內(nèi)皮細胞生長因子(vegf-a165)(seqidno：1)，以及所述相關血管內(nèi)皮細胞生長因子(leungdw等人，1989，houck，ka等人，1991)和如上所述那些生長因子的等位基因及加工形式(ferraran.1999)。本文所用術語“人vegf-b”是指186個氨基酸的血管內(nèi)皮細胞生長因子變體(vegf-b186)(seqidno：2)，其在病理狀況下的血管存活中起著重要作用(zhangf等人，2009)。本文所用術語“抗體”包括任何以下分子種類：單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體。正?？贵w包括兩條重鏈和兩條輕鏈。每一條重鏈由可變區(qū)和恒定區(qū)組成。每一條重鏈具有兩個區(qū)，恒定區(qū)和可變區(qū)。每一條輕鏈同樣具有恒定區(qū)和可變區(qū)。輕鏈和重鏈的可變區(qū)決定抗原的結(jié)合。兩條鏈中的可變區(qū)通常含有三個稱為互補決定區(qū)(cdr)的可變環(huán)狀結(jié)構(gòu)。該三個cdr插入在稱為構(gòu)架區(qū)(fr)的側(cè)翼片段之間。fr比cdr明顯更加保守?？贵w根據(jù)它們重鏈的結(jié)構(gòu)分為不同同種型。有五種稱為iga、igd、ige、igg和igm的主要抗體同種型。本文所用術語“抗原結(jié)合片段”是指結(jié)合指定抗原但不包括完整抗體的抗體片段。本領域公知的一些但非全部抗原結(jié)合片段的實例為：fab、f(ab′)2、fv和scfv。在某些實施方式中，抗原結(jié)合片段可以包括一個或多個cdr，其來自與一種或多種人抗體的fr組合的特異性抗體?！癴ab”是指結(jié)合抗原的抗體片段且其由每個重鏈和每個輕鏈的一個恒定域和一個可變域組成。在實驗設置中，可以通過用木瓜蛋白酶消化抗體而產(chǎn)生fab片段?！癴(ab′)2”是指能通過用在鉸鏈抗體區(qū)下方切開的胃蛋白酶消化抗體而獲得的抗體片段?！癴v”是指抗體承載完整抗原結(jié)合位點的最小片段且其由結(jié)合到相同抗體重鏈可變區(qū)的輕鏈可變區(qū)組成?！皊cfv”是指由肽接頭連接的兩個fv片段組成的工程分子(huston，j.s.等人，1988)。本文所用術語“表位”是指抗原中結(jié)合抗體的特殊區(qū)域。本文所用術語“癌”是指涉及導致惡性腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的失控的細胞分裂的醫(yī)學病癥。本文所用術語“血管生成”是指涉及新血管從已有血管生長的生理過程。本文所用短語“與過度血管生成相關的疾病”是指由血管生成異常增加引起的醫(yī)學病癥。對其靶標抗原具有高親和力的治療性單克隆抗體單克隆抗體對其靶標抗原的親和力是針對治療性能需要考慮的重要因素(harmsbd等人，2012；lippowms等人，2007；zhouy等人，2012)。更高親和力的抗體可能能夠用更低的劑量來達到期望的臨床效果。更低的劑量可以允許更方便的施用途徑以及減少注射量，其可以轉(zhuǎn)變?yōu)楦偷漠a(chǎn)品成本。被報道為高親和力的抗體kd通常在納摩爾范圍內(nèi)(griffithsad等人，1994；dehaardhj等人，1999)，偶爾在亞納摩爾范圍內(nèi)(vaughantj等人，1996)。特別是，公知的抗vegf治療性單克隆抗體阿瓦斯汀tm(貝伐單抗)的kd在納摩爾范圍內(nèi)(presta，l.g.等人，1997)。很少有描述kd在皮摩爾范圍內(nèi)的單克隆抗體的報道，且它們?nèi)慷际怯梅浅Ｒ?guī)技術獲得的(yangw等人，1995；rathanaswamip等人，2005；zhaoq等人，2011；pichinuke等人，2012)。本發(fā)明提供抗vegf單克隆抗體，其鼠源形式以約5.0pm的kd值結(jié)合人vegf-a165(seqidno：1)，其一種人源化形式以約100pm的kd值結(jié)合人vegf-a165(seqidno：1)。-本發(fā)明的鼠抗vegf單克隆抗體和人源化形式兩者同樣具有與人vegf-b(seqidno：2)的交叉反應性。-本發(fā)明單克隆抗體的鼠源形式以約11ng/ml的ic50(比相同試驗中貝伐單抗的ic50低5倍)中和huvec增殖試驗中的vegf-a，本發(fā)明抗體的人源化形式以約19ng/ml(比相同試驗中貝伐單抗的ic50低3倍)的濃度中和該vegf-a。-本發(fā)明的鼠抗vegf單克隆抗體和人源化形式兩者的特征均為具有比貝伐單抗更優(yōu)的體內(nèi)抗腫瘤活性。這并不是顯而易見的結(jié)果，因為眾多因素決定體內(nèi)的抗腫瘤活性(rudnicksi等人，2009；beckmanra等人，2007；covelldg等人，1986；thurbergm等人，2007；jainrk等人，1990；liangw等人，2006)。因此，具有較高親和力以及同時具有較高的體內(nèi)生物活性(諸如本文所公開的那一種)的抗體的發(fā)現(xiàn)是高度不可預測的。本文所公開的是稱為mmca-ab1-anti-vegf-a(小鼠單克隆抗體a-ab1-anti-vegf-a)的親本小鼠抗體、用于其生產(chǎn)的稱為mmca-ab1-anti-vegf-a克隆的抗體的細胞系(雜交瘤細胞)、稱為hmca-abi-vegf-a的mmca-ab1-anti-vegf-a的人源化形式(人源化單克隆抗體a-ab1-anti-vegf-a)和mmca-ab1-anti-vegf-a的工程化微形式。如下文所討論的，親本抗體mmca-ab1-anti-vegf-a大體上用kohler的方法(kohlerg等人，1975)但采用如實施例1中所述的獨特的免疫方案而獲得。為了選擇產(chǎn)生高生物學效率的抗人vegf-a抗體的細胞克隆，使用huvec增殖試驗(關于此試驗的技術說明見實施例5)。產(chǎn)生最具活性抗體的細胞克隆(雜交瘤細胞)是上文提到的mmca-ab1-anti-vegf-a克隆。令我們驚奇的是，用biacoret100傳感器測量時(關于此試驗的技術說明見實施例2)，由這種細胞克隆產(chǎn)生的單克隆抗體對人vegf-a165(seqidno：1)血管生成因子具有異常高的親和力(kd在pm范圍內(nèi))。mmca-ab1-anti-vegf-a的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為：重鏈可變區(qū)：qvkllesgpelkkpgetvkisckasgytftnfgmnwvkqapgkglkwmgwintntgeptyvddfkgrfafsletsassaylqisnlnnedtatyfcaryygstsvwyfdvwgagttvtvss(seqidno：3)輕鏈可變區(qū)：elvmtqtpsslsaslgdrvtitcrasqdifnylnwyqqkpdgpiklliyyssrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnldrediatyfcqqgftlpwtfgggtkleikr(seqidno：4)cdr區(qū)以下劃線標注(關于測序的技術說明見實施例6)表位分析表明mmca-ab1-anti-vegf-a結(jié)合vegf-a165(seqidno：1)氨基酸序列的以下三個片段：1：hhevvkfmdvyqrsych(vegf-a165的氨基酸11至27)2：yifkpscvplmr(vegf-a165的氨基酸44至56)3：qimrikphqgqhig(vegf-a165的氨基酸79至92)(關于表位作圖的技術說明見實施例3)有下劃線的是被描述為對于vegf-a與其受體vegfr-2的結(jié)合很關鍵的氨基酸(kibaa等人，2003)。據(jù)此，mmca-ab1-anti-vegf-a是唯一稱為能夠阻斷vegf-a與其受體vegfr-2之間緊密相互作用的所有三個點的單克隆抗體。這可以至少部分解釋與本領域已知的抗vegf抗體相比，在生物試驗中mmca-ab1-anti-vegf-a具有抑制vegf-a的高效率。例如，mmca-ab1-anti-vegf-a顯示出比貝伐單抗更大程度地抑制huvec增殖的能力(見實施例5)。另外，在抑制腫瘤生長方面，在試驗劑量上，本發(fā)明的抗體被證明比貝伐單抗更有效(見實施例10)。值得一提的是，所有試驗抗體均無明顯的中和小鼠vegf的活性(見實施例1)，該事實使得其抗腫瘤活性之間的比較有意義。在其抑制裸鼠中人腫瘤生長的效率方面，已將對小鼠vegf具有中和活性的其他抗vegf抗體和不與小鼠vegf-a交叉反應的貝伐單抗(見美國專利8,101,177和美國專利8,034,905)進行了比較。因此，在人體中與貝伐單抗相比時，這些研究并不足以預測這些抗體的相對效率。對此，關于基質(zhì)小鼠vegf對人腫瘤異種種植物生長的影響的說明性討論可以在liang等人的研究中找到(liang，w.c.等人，″cross-speciesvascularendothelialgrowthfactor(vegf)-blockingantibodiescompletelyinhibitthegrowthofhumantumorxenograftsandmeasurethecontributionofstromalvegf，″j.biol.chem.281(2)：951-961(2006))。如上文所討論的，mmca-ab1-anti-vegf-a在體內(nèi)抗腫瘤試驗方面的這種優(yōu)良性能并非顯而易見，因為高親和力(或者甚至體外uvec試驗中對vegf-a活性的高抑制)不一定與體內(nèi)抗腫瘤活性的高度增強相關，在體內(nèi)許多其他因素可以影響活性。如下文(實施例7)所述，獲得了親本抗體mmca-ab1-anti-vegf-a的超級人源化形式。為此，將mmca-ab1-anti-vegf-a的cdr之間的構(gòu)架區(qū)替換為從人生殖細胞系的igg基因獲得的最同源的構(gòu)架區(qū)(tanp等人，2002)。這種方法引入了最少的小鼠氨基酸殘基，以避免人治療期間的免疫反應性。(關于超級人源化過程的技術說明見實施例7)mmca-ab1-anti-vegf-a的超級人源化形式(稱為hmca-ab1-anti-vegf-a)的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的序列是：重鏈可變區(qū)：qvqlvqsgselkkpgasvkvsckasgytftnfgmnwvroapgqglewmgwintntgeptyvddfkgrfvfsldtsvstaylqisslkaedtavyycaryygstsvwyfdvwgrgtlvtvss(seqidno：5)輕鏈可變區(qū)：diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasodifnylnwyqqkpgkapklliyyssrlhsgvpsrfsgsgsgtdftftisslqpediatyycqqgftlpwtfgqgtkveikr(seqidno：6)cdr區(qū)以下劃線標注作為其親本抗體，hmca-ab1-anti-vegf-a顯示出比貝伐單抗更大程度地抑制huvec增殖的能力(見實施例9)。另外，作為其親本抗體，hmca-ab1-anti-vegf-a顯示出比貝伐單抗更大程度地抑制體內(nèi)腫瘤生長的能力(見實施例10)。在某些實施方式中，本文提供抗體和抗原結(jié)合片段，其包括如seqidno：5-6中所示的nimca-ab1-anti-vegf-a的cdr序列(seqidno：7-12)。在某些實施例中，本文提供的抗體結(jié)合vegf-a165(seqidno：i)的親和力比貝伐單抗結(jié)合vegf-a165的親和力更大。例如，在某些實施例中，本文提供的抗體結(jié)合vegf-a165的kd為約100pm，在其他實施例中kd為約5pm。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本文提供的抗體抑制huvec增殖的效率比貝伐單抗更高。例如，在某些實施例中，本文提供的抗體抑制huvec增殖的id50為約19ng/ml，在另一實施例中id50為約11ng/ml。因此，本文提供的抗體可用于治療與血管生成增加相關的各種醫(yī)學病癥。例如，抗體可用于治療癌癥，通過抑制生長腫瘤的血管的增殖從而抑制腫瘤生長。已經(jīng)在體內(nèi)(實施例10)證實了本文提供的抗體的抗腫瘤效率。在某些實施例中，本文提供的抗體抑制腫瘤生長的水平比貝伐單抗更高。在使用異種移植小鼠腫瘤模型的體內(nèi)實驗中，mmca-ab1-anti-vegf-a和hmca-ab1-anti-vegf-a比貝伐單抗更有效地抑制腫瘤生長。因此，在某些實施例中，本文提供的抗體可以以與貝伐單抗類似的劑量使用以實現(xiàn)更好的抗腫瘤效果，或以較低的劑量使用，以避免有效性相似時的次級不良副作用。本文公開的抗體可用于治療由vegf過量表達引起的過度血管生成而引起的醫(yī)學病癥。作為眼部疾病和幾種腫瘤疾病的這些病癥的實例包括濕性amd和糖尿病性視網(wǎng)膜病變(crawfordtn等人，2009；albinia等人，2012)?？捎帽疚墓_的抗體治療的癌癥病癥包括但不限于惡性腫瘤、母細胞瘤、肉瘤、生殖細胞腫瘤、或血液或淋巴惡性腫瘤，諸如白血病、淋巴瘤或多發(fā)性骨髓瘤。更具體地說，可使用本文公開的抗體治療的癌性病癥和腫瘤類型包括但不限于鱗狀細胞癌、肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌(nsclc)、肺腺癌或肺鱗狀細胞癌)、腹膜癌、肝癌(例如肝細胞癌/肝細胞瘤)、胃竇或胃癌(例如胃腸癌)、胰腺癌、腦腫瘤(例如成膠質(zhì)細胞瘤/多形性成膠質(zhì)細胞瘤(gbm)、非成膠質(zhì)細胞瘤腦腫瘤或腦膜瘤)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤(例如室管膜瘤、星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤或混合型神經(jīng)膠質(zhì)瘤諸如少突星形細胞瘤)、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(例如肝母細胞瘤、肝細胞癌/肝細胞瘤或肝癌)、膀胱癌(例如尿路上皮癌)、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎或腎臟癌(例如腎桿狀瘤)、前列腺癌、外陰癌、陰莖癌、肛門癌(例如肛門鱗狀細胞癌)、甲狀腺癌、頭頸癌(例如鼻咽癌)、皮膚癌(例如黑色素瘤或鱗狀細胞癌)、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、軟骨肉瘤、軟組織肉瘤(例如橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、卡波西肉瘤)、類癌、眼癌(例如視網(wǎng)膜母細胞瘤)、間皮瘤、淋巴細胞性/淋巴細胞白血病(例如t細胞譜系和b細胞前體譜系的急性淋巴細胞性/淋巴細胞白血病(all)、慢性淋巴細胞/淋巴細胞性白血病(cll)、急性骨髓性/成髓細胞白血病(aml)(包括肥大細胞白血病)、慢性骨髓性/髓細胞/成髓細胞白血病(cml)、毛細胞白血病(hcl)，霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、慢性骨髓單核細胞性白血病(cmml)、濾泡性淋巴瘤(fl)、彌漫性大b細胞淋巴瘤(dlbcl)、套細胞淋巴瘤(mcl)、伯基特淋巴瘤(bl)、蕈樣肉芽腫病、塞扎里綜合征、皮膚t細胞淋巴瘤、肥大細胞腫瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、腎母細胞瘤、孤立性漿細胞瘤、骨髓增生異常綜合征、慢性和非慢性骨髓增生性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、垂體腺瘤、前庭神經(jīng)鞘瘤、原始神經(jīng)外胚層腫瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭狀瘤、真性紅血細胞增多癥、血小板增多癥、特發(fā)性骨髓纖維化，以及兒科癌癥，例如兒科肉瘤(例如成神經(jīng)細胞瘤、橫紋肌肉瘤和和骨肉瘤)。此外，腫瘤可以是惡性的(例如癌癥)或良性的(例如增生、囊腫、假性囊腫、錯構(gòu)瘤和良性腫瘤)?？捎杀疚乃龅目贵w和抗原結(jié)合片段治療的其他病癥包括炎性病癥，諸如類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、硬皮病、慢性阻塞性肺病和哮喘。在其他非治療性實施例中，抗體或抗原結(jié)合片段可用于各種體外或體內(nèi)診斷或檢測應用。本文公開的抗體可單獨施用或與一種或多種另外的治療劑組合施用。例如，本文公開的抗體或抗原結(jié)合片段可與化療、放射療法和癌癥手術組合施用。此外，本文公開的抗體或抗原結(jié)合片段可以與由化療或其他治療劑引起的并發(fā)癥的治療組合施用。在某些實施例中，本文公開的抗體或抗原結(jié)合片段可作為相同藥物組合物的部分施用。在某些實施例中，與本文公開的抗體或抗原結(jié)合片段連接的偶聯(lián)物可包含一種或多種意圖改變抗體或抗原結(jié)合片段的一種或多種藥代動力學(pk)性質(zhì)的試劑，例如聚乙二醇(peg)以增加半衰期。在某些實施例中，提供了包含本文公開的抗體與一種或多種細胞因子組合的組合物。細胞因子的實例包括但不限于淋巴因子、單核因子、人生長激素、n-甲硫氨?；松L激素、牛生長激素、甲狀旁腺激素、甲狀腺素、胰島素、胰島素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(fsh)、促甲狀腺激素(tsh)、促黃體生成激素(lh)、肝生長因子、成纖維細胞生長因子、催乳素、胎盤催乳素、腫瘤壞死因子α和β、米勒管抑制物質(zhì)、小鼠促性腺激素相關肽、抑制素、活化素、整合素、血小板生成素(tpo)、神經(jīng)生長因子如ngf-β、血小板生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子如tgf-α和tgf-β、胰島素樣生長因子i和ii、促紅血細胞生成素(epo)、骨誘導因子、干擾素(諸如干擾素-α，-β和-γ)、集落刺激因子(諸如巨噬細胞-csf、粒細胞巨噬細胞csf和粒細胞-csf)、白血細胞介素(諸如il-1、il-1α、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11和il-12)、腫瘤壞死因子(諸如tnf-α和tnf-β)以及其他多肽因子。本文公開的抗體或抗原結(jié)合片段可與任何細胞因子(包括上文所列的任何細胞因子)組合提供和/或施用。在某些實施例中，提供的組合物包含與一種或多種化療劑連接或組合的本文所公開的抗體或抗原結(jié)合片段?；焺┑膶嵗ǖ幌抻赼lt-110、amn-107(尼洛替尼)、氨柔比星、arq-197、阿曲生坦(xinlay.rtm.)、av-299、azd1152、azd2171、batabulin、bio-111、bio-140、骨化三醇、cc8490、西侖吉肽、達沙替尼、decatanib、dn-101、edotecarin、enzastaurin、埃羅替尼、依維莫司、gimatecan、棉酚(例如棉酚乙酸鹽)、gsk461364、gsk690693、il13-pe38qqr、ino1001、ipdr、ipilimumab、krx-0402、lep-etu、ionafarnib、甲硫蒽酮、ly317615、mk-0457、mln8054、neuradiab、洛拉曲克、奧利美生、奧法木單抗、on0910.na、奧戈伏單抗、帕尼單抗、帕唑帕尼、pha-739358、r-763、rta744、魯比替康、sdx102、他侖帕奈、坦羅莫司、替米利芬、漢防己甲素、ticilimumab、tki-258、tlk286、他比特定、凡德他尼、vitespan、xr311、扎木單抗、131-i-tm-601和唑來膦酸鹽、組氨瑞林、氮雜胞苷、右丙亞胺、阿來組單抗、來那度胺、吉妥單抗、酮康唑、氮芥、替伊莫單抗、地西他濱、六甲三聚氰胺、貝沙羅汀、托西莫單抗、三氧化二砷、editronate、環(huán)孢菌素、edwina-天冬酰胺酶、鍶89、羅米地辛(fk-228)、ads-100380、cg-781、cg-1521、imt504、imt506、imt507、sb-556629、chlamydocin、伏立諾他、依托泊苷、吉西他濱、多柔比星、5′-脫氧-5-氟尿苷、長春新堿、替莫唑胺、喜樹堿、伊立替康、奧沙利鉑、他莫昔芬、阿那曲唑、己烯雌酚、貝伐單抗、亮丙瑞林、舒尼替尼、甲羥孕酮、雷洛昔芬、比卡魯胺、氟他胺、氨磷汀、nvp-laq824、辛二?；锂惲u肟酸、丙戊酸、曲古抑菌素a、fk-228、su11248、bay43-9006、krn951、氨魯米特、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、天冬酰胺酶、卡介苗(bcg)疫苗、博來霉素、布舍瑞林、白消安(1，4-丁二醇二甲磺酸鹽)、沙鉑、卡鉑、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、氯膦酸鹽、環(huán)磷酰胺、環(huán)丙孕酮、阿糖胞苷、達卡巴嗪、放線菌素d、柔紅霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟達拉濱、氟氫可的松、氟甲睪酮、氟他胺、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、伊馬替尼、甲酰四氫葉酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、甲二氯二乙胺、美法侖、巰嘌呤、美司鈉、甲氨蝶呤、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼魯米特、奧曲肽、edotreotide、奧沙利鉑、帕米膦酸鹽、噴司他丁、普卡霉素、卟吩姆、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈脲佐菌素、替尼泊苷、睪酮、沙利度胺、沙利度胺聯(lián)合地塞米松、硫鳥嘌呤、噻替派、維甲酸、長春地辛、全反式視黃酸、或13-順式-視黃酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌莫司汀、六甲蜜胺、氟尿苷、5-脫氧尿苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、6-巰嘌呤、脫氧助間型霉素、骨化三醇、戊柔比星、光輝霉素、長春堿、長春瑞濱、拓撲替康、razoxin、馬立馬司他、col-3、新伐司他、bms-275291、角鯊胺、內(nèi)皮抑素、su5416、su6668、emd121974、白血細胞介素-12、ev1862、血管抑制素、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺內(nèi)酯、非那雄胺、西咪替丁、曲妥珠單抗、地尼、白介素、吉非替尼、bortezimib、紫杉醇、多西紫杉醇、epithiloneb、bms-247550、bms-310705、屈洛昔芬(3-羥基他莫昔芬)、4-羥基他莫昔芬、pipendoxifene、era-923、阿佐昔芬、氟維司群、acolbifene、拉索昔芬、艾多昔芬、tse-424、hmr-3339、zk186619、拓撲替康、ptk787/zk222584、vx-745、pd184352、ly294002、ly292223、ly292696、ly293684、ly293646、渥曼青霉素、bay-43-9006、zm336372、l-779450、黃酮吡啶酚、ucn-01、雷帕霉素、依維莫司。在某些實施例中，本文提供的抗體與聚乙二醇化或非聚乙二醇化干擾素α-2a、聚乙二醇化或非聚乙二醇化干擾素α-2b、聚乙二醇化或非聚乙二醇化干擾素α-2c、聚乙二醇化或非聚乙二醇化干擾素αn-1、聚乙二醇化或非聚乙二醇化干擾素αn-3、以及聚乙二醇化、非聚乙二醇化復合干擾素或白蛋白-干擾素-α中的一種或多種組合。包含止吐藥的組合物可用于預防或治療惡心、化療的常見副作用。因此，在某些實施例中，提供了包含本文提供的抗體的組合物，該抗體與一種或多種抗癌劑以及一種或多種止吐藥連接或組合，包括但不限于casopitant、netupitant、帕洛諾司瓊、阿瑞吡坦、苯海拉明、羥嗪、甲氧氯普胺、勞拉西泮、阿普唑侖、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、丙氯拉嗪、格拉司瓊、昂丹司瓊、多拉司瓊和托烷司瓊。癌癥治療的其他副作用包括紅血細胞和白血細胞缺乏。因此，提供了包含本文提供的抗體的組合物，該抗體與治療紅血細胞和/或白血細胞缺乏的試劑諸如g-csf、聚乙二醇化g-csf、gm-csf、促紅血細胞生成素以及聚乙二醇化促紅血細胞生成素連接或組合。在某些實施例中，提供了包含本文提供的抗體的組合物，該抗體與一種或多種抗高血壓劑諸如利尿劑、腎上腺素能受體拮抗劑、腎上腺素能受體激動劑、鈣通道阻斷劑、ace抑制劑、血管緊張素ii受體拮抗劑、醛固酮拮抗劑、血管擴張劑或中樞作用腎上腺素能藥物組合。在某些實施例中，本文公開的抗體可作為包含一種或多種生理上可耐受組分的藥物組合物的部分施用。因此，在某些實施例中，本文提供了此類組合物和配制此類組合物的方法。包含本文公開的一種或多種抗體和一種或多種生理上可耐受組分的組合物可用于治療與血管生成增加相關的疾病。用于本文公開的藥物組合物的生理上可耐受組分的實例為：藥學可接受液體、凝膠或固體載體、稀釋劑、佐劑、賦形劑、輔助物質(zhì)以及本領域已知的其他組分或其組合。合適組分的實例為：抗氧化劑、填充劑、粘合劑、崩解劑、緩沖劑、防腐劑、潤滑劑、調(diào)味劑、增稠劑、著色劑或乳化劑。合適的抗氧化劑的實例為：甲硫氨酸、抗壞血酸、edta、硫代硫酸鈉、鉑、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巰基乙酸、硫代山梨醇、丁基羥基茴香醚、丁基化羥基甲苯以及沒食子酸丙酯。合適的載體的實例為：水性載體如生理氯化鈉、林格氏溶液、等滲右旋糖注射液、無菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液、非水性載體(諸如植物來源的不揮發(fā)油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油)、抑菌或抑真菌濃度的抗微生物劑、等滲劑(諸如氯化鈉或右旋糖)、緩沖劑(諸如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖劑)、抗氧化劑(諸如硫酸氫鈉)、局部麻醉劑(諸如鹽酸普魯卡因)、懸浮和分散劑(諸如鈉羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮)、乳化劑(諸如聚山梨醇酯80(tween-80))、多價螯合劑或螯合劑(諸如edta(乙二胺四乙酸)或egta(乙二醇四乙酸))、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸?？蓪⒂米鬏d體的抗微生物劑加入多劑量容器中的藥物組合物中，藥物組合物包括苯酚或甲酚、汞制劑、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯和丙酯、硫柳汞、苯扎氯銨和芐索氯銨。合適的賦形劑可包括例如水、鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。合適的無毒輔助物質(zhì)可包括，例如，潤濕劑或乳化劑、ph緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、或試劑(諸如乙酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或環(huán)糊精)。本文所用術語“治療有效量”或“有效劑量”是指有效治療疾病或病癥的藥物劑量或濃度。例如、關于本文公開的抗體用于治療癌癥的用途，治療有效量是抗體或抗原結(jié)合片段的劑量或濃度，其能夠消除全部或部分腫瘤、抑制或減緩腫瘤生長、抑制介導癌性病癥的細胞的生長或增殖、抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、改善與腫瘤或癌性病癥相關的任何癥狀或標記、預防或延遲腫瘤或癌性病癥的發(fā)展或其某種組合。本文提供的抗體或抗原結(jié)合片段的有效劑量可使用本領域公知的方法確定。例如，可通過確定以特定劑量施用后，受試者被治療的腫瘤是否收縮、停止生長或生長更慢來確定有效劑量。在某些實施例中，本文提供的抗體可以以約0.01μg/小鼠至約100μg/小鼠的治療有效劑量施用。給定劑量可以以各種時間間隔施用，例如每天一次、每天兩次或更多次、每周兩次或更多次、每周一次、每兩周一次、每三周一次、每月一次或每兩個或多個月一次。在某些實施例中，可在治療過程中改變施用劑量。例如，在某些實施例中，初始施用劑量可以高于隨后的施用劑量。在某些實施例中，施用劑量可根據(jù)受試者的反應在治療過程中變化。可調(diào)整劑量方案以提供最優(yōu)的期望反應(例如治療反應)。例如，可施用單一劑量，或者可隨時間施用若干分次劑量。包含本文公開的抗體并且在某些實施例中與化療劑組合的藥物組合物可通過本領域公知的方法制備。本文公開的抗體和抗原結(jié)合片段可通過本領域已知的任何途徑施用，諸如腸胃外(例如皮下、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)，包括靜脈內(nèi)輸注、肌內(nèi)或真皮內(nèi)注射)或非腸胃外(例如口服、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、舌下、直腸或局部)途徑。在抗體通過注射施用的實施例中，可注射的藥物組合物可以以任何常規(guī)形式制備，例如液體溶液、懸浮液、乳液，或適于產(chǎn)生液體溶液、懸浮液或乳液的固體形式。用于注射的制劑可包括待注射的無菌溶液、在使用前待與溶劑混合的無菌干燥可溶性產(chǎn)品諸如凍干粉末(包括皮下片劑)、待注射的無菌懸浮液、在使用前待與載體混合的無菌干燥不溶性產(chǎn)品、以及無菌乳液。溶液可以是水性或非水性的。在某些實施例中，通過將本文公開的抗體或抗原結(jié)合片段溶解在合適的溶劑中來制備無菌凍干粉末。由粉末制備的溶劑可含有改善粉末或重構(gòu)溶液的穩(wěn)定性或其他藥理學成分的賦形劑?？墒褂玫馁x形劑包括但不限于水、右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合適的試劑。溶劑可含有緩沖劑，例如檸檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀或本領域技術人員已知的其他此類緩沖劑，在一個實施例中，約為中性ph。隨后無菌過濾溶液，然后在本領域技術人員已知的標準條件下凍干，提供所需的制劑。在一個實施例中，將所得溶液等分放入管形瓶中用于凍干。每個管形瓶可含有單一劑量或多劑量的抗vegf抗體或其組合物。以注射用水重構(gòu)凍干粉末提供用于腸胃外施用的制劑。在一個實施例中，為了重構(gòu)將凍干粉末加入無菌水或其他液態(tài)合適載體中。精確量取決于給予的選定的治療，并且可以由經(jīng)驗確定。-在某些實施例中，提供了用于生產(chǎn)本文公開的抗體的系統(tǒng)和方法。本發(fā)明的小鼠抗體mmca-abi-anti-vegf-a可以通過使用本領域公知的標準技術(例如參見birchjr等人，1985)，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)生成mmca-ab1-anti-vegf-a的細胞克隆(雜交瘤)而產(chǎn)生。可選擇地，可以使用表達系統(tǒng)。編碼本發(fā)明的親本小鼠單克隆抗體的dna，可以從生產(chǎn)細胞分離或體外合成，插入克隆載體，并使用標準程序引入到合適的宿主細胞或細菌中(daviessl.2009，卷6，153-173)。本文公開的小鼠親本抗體的非天然形式(例如嵌合抗體、人源化抗體或單鏈抗體)可以使用本領域公知的方法來制備(morrisonsl等人，1984；neubergerms等人，1984；takedas等人，1985)。表達系統(tǒng)也可用于生產(chǎn)本文公開的小鼠親本單克隆抗體的不同抗體衍生物。這些表達系統(tǒng)包括編碼抗體的多核苷酸、包含這些多核苷酸的載體以及包含這些載體的宿主細胞。編碼本文公開的抗體的多核苷酸可使用本領域公知的方法分離或合成，并將其插入到可復制載體中用于擴增或克隆。編碼抗體的輕鏈可變區(qū)(vl)和重鏈可變區(qū)(vh)的多核苷酸可從單個載體表達，或者它們可以使用兩個單獨的載體表達，隨后在體外組裝。在某些實施例中，它們可在相同細胞內(nèi)由兩個單獨的載體共表達并在細胞內(nèi)組裝。合適的載體可含有一種或多種調(diào)節(jié)序列的各種構(gòu)型，例如啟動子、增強子或轉(zhuǎn)錄起始序列，以及編碼表型選擇標記的基因。具有用于表達本文公開的抗體的合適主鏈的載體是本領域已知的(例如參見daviessl等人，2009)。在某些實施例中，載體可含有編碼人igg免疫球蛋白的重鏈(ch)和輕鏈(cl)的恒定區(qū)的多核苷酸序列?？蛇x擇地，載體可僅表達抗體的vh和vl鏈，其中所表達的多肽包含fv片段而不是完整抗體?？蓪⑤d體插入到合適的宿主細胞中用于擴增或表達多核苷酸序列。宿主細胞可在本領域已知的多種培養(yǎng)基諸如極限必需培養(yǎng)基(mem)(sigma)、rpmi-1640(sigma)、dulbecco改良eagle培養(yǎng)基(dmem)(sigma)和ham′sf10(sigma)中培養(yǎng)用于生產(chǎn)抗體。培養(yǎng)基中可補充多種試劑，例如激素、生長因子、鹽，緩沖劑、核苷酸、抗生素、微量元素、葡萄糖或其他能量源。培養(yǎng)條件如溫度和ph可使用本領域公知的參數(shù)進行調(diào)節(jié)。表達后，本文提供的一種或多種抗體可使用本領域公知的方法純化(例如參見vijayalakshmima.1998)。本文公開的抗體可包含用于特異性輸送至腫瘤位置的偶聯(lián)物。提供以下實施例以更好地舉例說明所要求保護的發(fā)明且并不應被解釋為限制本發(fā)明的范圍。下述所有具體組合物、物質(zhì)和方法全部或部分地落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些具體組合物、物質(zhì)和方法并不旨在限制本發(fā)明，而僅旨在說明落入本發(fā)明范圍內(nèi)的具體實施方式。本領域一名技術人員可以在沒有實施本發(fā)明的能力下且不脫離本發(fā)明范圍開發(fā)等同組合物、物質(zhì)和方法。應當理解本文中所述的程序可以在不脫離本發(fā)明范圍的前提下進行多種改變。發(fā)明人旨在將這樣的改變包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例實施例1：抗vegf單克隆抗體的產(chǎn)生：通常根據(jù)kohler方法產(chǎn)生單克隆抗體(kohlerg等人，1975)。然而，免疫方案較獨特。簡而言之，在10個月的周期內(nèi)，每月一次給4周大的balb/c雌性小鼠注射在氫氧化鋁溶液(alu，pierce)中與陽離子化bsa(bsaandedcconjugationkits，pierce，france)偶聯(lián)的人重組vegf165(seqidno：i)。收集淋巴細胞并將其通過用聚乙二醇(peg1500，bdh)處理與骨髓瘤細胞融合。之后，在hat培養(yǎng)基(次黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶，σ)中接種并培養(yǎng)雜交瘤細胞。針對不含bsa的vegf-a采用直接elisa檢測特定抗體的存在。使用有限稀釋法選擇抗人vegf抗體產(chǎn)生的克隆。之后，為了選擇產(chǎn)生具有較高親和力的抗人vegf-a抗體的克隆細胞，利用huvec增殖試驗。利用這種方法分離出若干候選雜交瘤并將其冷凍。進一步研究其中之一名為mmca-ab1-anti-vegf-a的克隆。此種mmca-ab1-anti-vegf-a雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體被命名為mmca-ab1-anti-vegf-a(簡稱為小鼠ab1抗體)。通過標準技術(vijayalakshmima.1998)對此抗體進行純化，包括使用g蛋白瓊脂糖柱(hitrapproteinghp.geheaithcare)的親和力層析法。如由elisa和表面等離子體共振所測得，本發(fā)明的小鼠ab1抗體及其衍生物未發(fā)生交叉反應或中和小鼠vegf-a。實施例2：復合物mmc-ab1-anti-vegf-a/vegf-a165的解離速率常數(shù)(kd)的測定本發(fā)明的經(jīng)純化的小鼠單克隆抗體mmc-ab1-anti-vegf-a與vegf-a165(seqidno：1)蛋白之間的親和力通過表面等離子共振(spr)來測定。通過用biacoret100評估軟件擬合1：1相互作用模型的動力學分析來分別測定復合物mmc-ab1-anti-vegf-a/vegf-a165的親和力常數(shù)ka與解離常數(shù)kd。結(jié)果如表1所示。表1.mmca-ab1-anti-vegf-a/vegf-a165相互作用的動力學參數(shù)這一結(jié)果表明本發(fā)明的mmca-ab1-anti-vegf-a單克隆抗體對人vegf-a具有異常高的親和力(在pm范圍內(nèi))。實施例3：繪制被mmca-ab1-anti-vegf-a識別的vegf-a165的表位。通過lcsciences(huston，texas)采用其peptarraytm系統(tǒng)繪制被mmca-ab1-anti-vegf-a識別的vegf-a165的表位。根據(jù)vegf165序列(seqidno：1)合成重疊肽。條件：結(jié)合緩沖液：ixpbs，ph7.0；洗滌緩沖液：含有0.05％tween-20和0.05％tritonx-100的ixpbs，ph7.0。結(jié)合條件：mmc-ab1-anti-vegf-a在結(jié)合緩沖液中的濃度為1μg/ml，25℃，1小時。檢測條件：山羊抗鼠iggcy5偶聯(lián)物在結(jié)合緩沖液中的濃度為10ng/ml，25℃，30分鐘。在635nm通道，在pmt700下掃描。分析結(jié)果顯示mmc-ab1-anti-vegf-a與以下三種vegf-a165(seqidno：1)域的主接觸點：1：hhevvkfmdvyqrsych(vegf-a165的氨基酸11至27)2：yifkpscvplmr(vegf-a165的氨基酸44至56)3：qimrikphqgqhig(vegf-a165的氨基酸79至92)有下劃線的是被描述為對于vegf-a與其受體vegfr-2的結(jié)合很關鍵的氨基酸(kibaa等人，2003)。實施例4：mmca-ab1-anti-vegf-a與人vegf-b186(seqidno：2)的交叉反應性。將mmca-ab1-anti-vegf-a(6.30-0.18μm)注射到固定化血管內(nèi)皮細胞生長因子抗原b(vegf-b186)(4000ru)。通過用biacoret100評估軟件擬合1∶1相互作用模型的動力學分析來分別測定ka與kd。動力學參數(shù)與常數(shù)如表2所示。表2.mmca-ab1-anti-vegf-a與vegf-b186之間相互作用的動力學參數(shù)。ka(1/ms)kd(1/s)kd(1/m)ka(m)32.80±0.06x1045.71±0.02x10-31.8x10-75.6x106結(jié)果表明與其對vegf-a的親和力相比，mmca-ab1-anti-vegf-a能夠以低親和力與vegf-b186交叉反應。實施例5：mmca-ab1-anti-vegf-a對vegf-a誘導的培養(yǎng)基中人臍靜脈內(nèi)皮細胞(huvec)增殖的中和活性。將huvec細胞以2500細胞/孔的密度接種在96孔板中，其中含有50μl補充了10％fcs和50μg/ml慶大霉素的m199培養(yǎng)基。2小時后，將含有rpmi培養(yǎng)基中25μl經(jīng)純化的mmca-ab1-anti-vegf-a與m199完全培養(yǎng)基中75μl含有vegf(20ng/ml)的100μl溶液添加到每個孔中。經(jīng)24小時溫育后，添加25μl含有2,5μci/ml甲基-[3h]-胸苷的m199完全培養(yǎng)基，再繼續(xù)溫育48小時。之后，添加50μl6m氯酸胍終止反應。經(jīng)3次凍融循環(huán)完成細胞破裂，在whatman-gfc過濾器中收集dna并測量其放射活性。圖1示出了本發(fā)明的mmca-ab1-anti-vegf-a單克隆抗體的中和能力與本領域的抗vegf單克隆抗體貝伐單抗(zondorsd等人，2004)的中和能力的比較圖。實施例6：mmca-ab1-anti-vegf-a的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)序列為了獲得編碼mmca-ab1-anti-vegf-a的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的基因序列，通過trizol(gibco)方法從產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞中提取全部rna。采用隨機引物(invitrogen)使用逆轉(zhuǎn)錄酶(promega)合成cdna。如所述擴增fab區(qū)的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)(sastryl.1989)。用于擴增重鏈可變區(qū)(5′末端)的引物：cpv1.5′-aggt(c/g)(c/a)a(g/a)ct(g/t)ctcgagtc(t/a)gg-3′cpv2.5′-aggtccagctgctcgagtctgg-3′cpv3.5′-aggtccagctgctcgagtcagg-3′cpv4.5′-aggtccagcttctcgagtctgg-3′cpv5.5′-aggtccagcttctcgagtcagg-3′cpv6.5′-aggtccaactgctcgagtctgg-3′cpv7.5′-aggtccaactgctcgagtcagg-3′cpv8.5′-aggtccaacttctcgagtctgg-3′cpv9.5′-aggtccaacttctcgagtcagg-3′cpv10.5′-aggtcgaacttctcgagtc(t/a)gg-3′用于擴增重鏈可變區(qū)(3′末端)的引物：5′-aggctttactagtacaatccctgggcacaatt-3′用于擴增輕鏈可變區(qū)(5′末端)的引物：clv1.5′-ccagttccgagctcgtgctcacccagtctcca-3′clv2.5′-ccagttccgagctccagatgacccagtctcca-3′clv3.5′-ccagatgtgagctcgtgatgacccagactcca-3′clv4.5′-ccagatgtgagctcgtcatgacccagtctcca-3′clv5.5′-ccagttccgagctcgtgatgacacagtctcca-3′用于擴增輕鏈可變區(qū)(3′末端)的引物：5′-gcgccgtctagaattaacactcattcctgttgaa-3′將所得產(chǎn)物克隆至pcomb3載體(barbas，c.f.1991)并測序。推導出的本發(fā)明的小鼠抗vegfab1單克隆抗體的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列結(jié)果如下：重鏈可變區(qū)qvkllesgpelkkpgetvkisckasgytftnfgmnwvkoapgkglkwmgwintntgeptyvddfkgrfafsletsassaylqisnlnnedtatyfcaryygstsvwyfdvwgagttvtvss(seqidno：3)輕鏈可變區(qū)elvmtqtpsslsaslgdrvtitcrasodifnylnwyqqkpdgpiklliyyssrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnldrediatyfcqqgftlpwtfgggtkleikr(seqidno：4)注意：cdr區(qū)以下劃線標注。實施例7：mmca-ab1-anti-vegf-a的人源化針對mmca-ab1-anti-vegf-a的人源化，將cdr之間的構(gòu)架區(qū)替換為從人生殖細胞系的igg基因獲得的最同源構(gòu)架區(qū)(tanp等人，2002)。該方法引入最少的小鼠氨基酸殘基，以避免人治療期間的免疫反應性。同源性研究所使用的數(shù)據(jù)庫為imgt(www.imgt.org)。所設計的含有編碼mmca-ab1-anti-vegf-a的cdr和人生殖細胞系的igg基因構(gòu)架區(qū)以及分泌信號的基因通過商業(yè)合成服務(genscriptcorporation，www.genscript.com)來合成。將對應于人源化重鏈可變區(qū)的合成基因插入到pfuse-chig-hgi載體(invivogen)的ecori與nhel位點中，將對應于人源化輕鏈可變區(qū)的合成基因插入到pfuse2-clig-hk載體(invivogen)的btseii與bsiwi位點中。這兩個載體均提供完整人igg重鏈(pfuse-chig-hgi)和人igg輕鏈(pfuse2-clig-hk)所必需的人恒定區(qū)，以獲得人源化抗體。此外，使用lipofectamine2000(invitrogen)將質(zhì)粒pfuse-chig-hgi-p和pfuse2-clig-hk-p共轉(zhuǎn)染到nso細胞中。選擇表達抗vegf抗體活性的細胞克隆，將其中之一用于抗體產(chǎn)生，并且使用本領域已知方法來提純。mmca-ab1-anti-vegf-a的人源化形式的重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)序列如下：重鏈可變區(qū)：qvqlvqsgselkkpgasvkvsckasgytftnfgmnwvroapgqglewmgwintntgeptyvddfkgrfvfsldtsvstaylqisslkaedtavyycaryygstsvwyfdvwgrgtlvtvss(seqidno：5)輕鏈可變區(qū)：diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasodifnylnwyqqkpgkapklliyyssrlhsgvpsrfsgsgsgtdftftisslopediatyycqqgftlpwtfgggtkveikr(seqidno：6)注意：cdr區(qū)用下劃線標注。實施例8：mmc-ab1-anti-vegf-a/vegf-a165的復合人源化形式的解離速率常數(shù)(kd)的測定通過表面等離子共振(spr)測定人源化形式的mmca-ab1-anti-vegf-a與vegf-a165(seqidno：1)之間的親和力。通過用biacoret100評估軟件擬合1∶1相互作用模型的動力學分析來分別測定親和力常數(shù)ka與解離常數(shù)kd。結(jié)果如表3所示。表3.人源化mmc-ab1-anti-vegf-a/vegf-a165的相互作用的動力學參數(shù)。ka(1/ms)kd(1/s)kd(1/m)ka(m)3.83±0.03x1064.21±0.02x10-41.09x10-109.24x105實施例9：在培養(yǎng)基中人源化mmca-ab1-anti-vegf-a對vegf-a誘導的huvec增殖的中和活性。將huvec細胞以2500細胞/孔的密度接種在96孔板中，其中含有50μl補充了10％fcs和50μg/ml慶大霉素的m199培養(yǎng)基。2小時后，將含有rpmi培養(yǎng)基中25μl經(jīng)純化的mmca-ab1-anti-vegf-a的與m199完全培養(yǎng)基中75μl含有vegf(20ng/ml)的100μl溶液添加到每個孔中。經(jīng)24小時溫育后，添加25μl含有2,5μci/ml甲基-[3h]-胸苷的m199完全培養(yǎng)基，再繼續(xù)溫育48小時。之后，添加50μl6m氯酸胍終止反應。經(jīng)3次凍融循環(huán)完成細胞破裂，在whatman-gfc過濾器中收集dna并測量其放射活性。圖2示出了在培養(yǎng)基中人源化mmca-ab1-anti-vegf-a對vegf-a誘導的huvec增殖的中和能力與本領域的抗vegf單克隆抗體貝伐單抗的中和能力的比較圖。實施例10：抗vegf抗體的體內(nèi)活性使用iib-mel-j細胞(guerra，l.等人，characterizationofiib-mel-j：anewandhighlyheterogeneoushumanmelanomacellline.pigmentcellres，1989.2(6)：p.504-9)來研究裸鼠中的腫瘤生長抑制。將iib-mel-j細胞在補充有10％fbs、5g/ml胰島素和50μg/ml慶大霉素的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使細胞在5％co2中、于37℃下生長至匯合，將其收集、計數(shù)、清洗并以50x106細胞/ml濃度重懸浮在無菌matrigel中。通過將5x106iib-mel-j細胞注射到小鼠的背側(cè)以在4-6周齡裸swiss鼠中建立異種種植物。6天后可觸摸到腫瘤，將小鼠隨機分成10組(n＝10)，每一組用pbs(對照組)或用三種不同濃度的不同抗體的pbs溶液進行如下腹腔內(nèi)注射，一周兩次：a組，用0.1mlpbs注射小鼠；b組，用0.1mlab1抗體以1μg/小鼠的劑量注射小鼠；c組，用0.1mlab1抗體以25μg/小鼠的劑量注射小鼠；d組，用0.1ml人源化形式的ab1抗體以1μg/小鼠的劑量注射小鼠；e組，用0.1ml人源化形式的ab1抗體以25μg/小鼠的劑量注射小鼠；f組，用0.1ml人源化形式的貝伐單抗(阿瓦斯汀tm)以1μg/小鼠的劑量注射小鼠，以及g組，用0.1ml阿瓦斯汀tm抗體以25μg/小鼠的劑量注射小鼠。通過用測徑器測量長度和寬度，然后用以下公式來估算體積來跟蹤腫瘤生長：1/2長度×寬度2。在第40天處死動物，切除腫瘤并稱重。結(jié)果表明，相較于注射pbs的小鼠，當ab1與人源化形式的ab1抗體兩者均以所有試驗劑量給小鼠施用時，均顯著抑制腫瘤生長(p＜0.001)(圖3)。另一方面，在這兩種試驗劑量下，經(jīng)過40天治療后，用ab1和人源化ab1抗體治療的動物腫瘤比用貝伐單抗治療的腫瘤平均更小(圖4)。人源化形式的ab1與貝伐單抗之間的比較如圖5中所示。在25μg/小鼠劑量下，這兩個抗體之間的差異在統(tǒng)計學上是顯著的(p＜0.001)。值得一提的是，所有試驗抗體均無明顯的中和小鼠vegf的活性(liangw，wux，pealefvetal，cross-speciesvascularendothelialgrowthfactor(vegf)-blockingantibodiescompletelyinhibitthegrowthofhumantumorxenograftsandmeasurethecontributionofstromalvegf.jbc281：951-961(2006)和實施例1)，該事實使得其抗腫瘤活性之間的比較有意義。序列seqidnos：12seqidno：1長度：165類型：prt生物：智人公開信息：數(shù)據(jù)庫入藏號：genebankaaa35789數(shù)據(jù)庫登記日：1993-04-27序列：1apmaegggqnhhevvkfmdvyqrsychpietlvdifqeypdeieyifkpscvplmrcggccndeglecvpteesnitmqimrikphqgqhigemsflqhnkcecrpkkdrarqenpcgpcserrkhlfvqdpqtckcsckntdsrckarqlelnertcrcdkprrseqidno：2長度：186類型：prt生物：智人公布信息：數(shù)據(jù)庫入藏號：genebankaac50721.1數(shù)據(jù)庫登記日：1996-08-12序列：2pvsqpdapghqrkvvswidvytratcqprevvvpltvelmgtvakqlvpscvtvqrcggccpddglecvptgqhqvrmqilmirypssqlgemsleehsqcecrpkkkdsavkpdraatphhrpqprsvpgwdsapgappadithptpapgpsahaapsttsaltpgpaaaaadaaassvakggaseqidno：3長度：121類型：prt生物：小家鼠其他信息：抗體重鏈可變區(qū)序列：3qvkllesgpelkkpgetvkisckasgytftnfgmnwvkqapgkglkwmgwintntgeptyvddfkgrfafsletsassaylqisnlnnedtatyfcaryygstsvwyfdvwgagttvtvssseqidno：4長度：108類型：prt生物：小家鼠其他信息：抗vegf輕鏈可變區(qū)序列：4elvmtqtpsslsaslgdrvtitcrasqdifnylnwyqqkpdgpiklliyyssrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnldrediatyfcqqgftlpwtfgggtkleikrseqidno：5長度：121類型：prt生物：人工序列其他信息：重組抗vegf重鏈可變區(qū)序列：5qvqlvqsgselkkpgasvkvsckasgytftnfgmnwvrqapgqglewmgwintntgeptyvddfkgrfvfsldtsvstaylqisslkaedtavyycaryygstsvwyfdvwgrgtlvtvssseqidno：6長度：108類型：prt生物：人工序列其他信息：重組抗vegf抗體輕可變區(qū)序列：6diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdifnylnwyqqkpgkapklliyyssrlhsgvpsrfsgsgsgtdftftisslqpediatyycqqgftlpwtfgqgtkveikrseqidno：7長度：10類型：prt生物：小家鼠其他信息：cdr區(qū)。seqidno：3的亞序列序列：7gytftnfgmnseqidno：8長度：17類型：prt生物：小家鼠其他信息：cdr區(qū)。seqidno：3的亞序列序列：8wtntntgeptyvddfkgseqidno：9長度：12類型：prt生物：小家鼠其他信息：cdr區(qū)。seqidno：3的亞序列序列：9yygstsvwyfdvseqidno：10長度：11信號：prt生物：小家鼠其他信息：cdr區(qū)。seqidno：4的亞序列序列：10rasqdifnylnseqidno：11長度：6類型：prt生物：小家鼠其他信息：cdr區(qū)。seqidno：4的亞序列序列：11yssrlhseqidno：12長度：9類型：prt生物：小家鼠其他信息：cdr區(qū)。seqidno：4的亞序列序列：12qqgftlpwtsequencelisting<110>科學和技術研究全國委員會（科尼特）帕布·卡薩拉實驗室有限公司鮑迪,艾伯特托<120>對人vegf-a有異常強的結(jié)合親和力并具有與人vegf-b的交叉反應性的抗人vegf抗體<150>us14/267,504<151>2014-05-01<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>165<212>prt<213>homosapiens<300><308>genebankaaa35789<309>1993-04-27<313>(1)..(165)<400>1alaprometalagluglyglyglyglnasnhishisgluvalvallys151015phemetaspvaltyrglnargsertyrcyshisproilegluthrleu202530valaspilepheglnglutyrproaspgluileglutyrilephelys354045prosercysvalproleumetargcysglyglycyscysasnaspglu505560glyleuglucysvalprothrglugluserasnilethrmetglnile65707580metargilelysprohisglnglyglnhisileglyglumetserphe859095leuglnhisasnlyscysglucysargprolyslysaspargalaarg100105110glngluasnprocysglyprocyssergluargarglyshisleuphe115120125valglnaspproglnthrcyslyscyssercyslysasnthraspser130135140argcyslysalaargglnleugluleuasngluargthrcysargcys145150155160asplysproargarg165<210>2<211>185<212>prt<213>homosapiens<300><308>genebankaac50721.1<309>1996-08-12<313>(1)..(185)<400>2provalserglnproaspalaproglyhisglnarglysvalvalser151015trpileaspvaltyrthrargalathrcysglnproarggluvalval202530valproleuthrvalgluleumetglythrvalalalysglnleuval354045prosercysvalthrvalglnargcysglyglycyscysproaspasp505560glyleuglucysvalprothrglyglnhisglnvalargmetglnile65707580leumetileargtyrproserserglnleuglyglumetserleuglu859095gluhisserglncysglucysargprolyslyslysaspseralaval100105110lysproaspargalaalathrprohishisargproglnproargser115120125valproglytrpaspseralaproglyalaproproalaaspilethr130135140hisprothrproalaproglyproseralahisalaalaproserthr145150155160thrseralaleuthrproglyproalaalaalaalaalaaspalaala165170175alaserservalalalysglyglyala180185<210>3<211>121<212>prt<213>musmusculus<220><221>misc_feature<223>抗體重鏈可變區(qū)<400>3glnvallysleuleugluserglyprogluleulyslysproglyglu151015thrvallysilesercyslysalaserglytyrthrphethrasnphe202530glymetasntrpvallysglnalaproglylysglyleulystrpmet354045glytrpileasnthrasnthrglygluprothrtyrvalaspaspphe505560lysglyargphealapheserleugluthrseralaserseralatyr65707580leuglnileserasnleuasnasngluaspthralathrtyrphecys859095alaargtyrtyrglyserthrservaltrptyrpheaspvaltrpgly100105110alaglythrthrvalthrvalserser115120<210>4<211>108<212>prt<213>musmusculus<220><221>misc_feature<223>抗vegf輕鏈可變區(qū)<400>4gluleuvalmetthrglnthrproserserleuseralaserleugly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspilepheasntyr202530leuasntrptyrglnglnlysproaspglyproilelysleuleuile354045tyrtyrserserargleuhisserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythrasptyrserleuthrileserasnleuasparg65707580gluaspilealathrtyrphecysglnglnglyphethrleuprotrp859095thrpheglyglyglythrlysleugluilelysarg100105<210>5<211>121<212>prt<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>重組抗vegf重鏈可變區(qū)<400>5glnvalglnleuvalglnserglysergluleulyslysproglyala151015servallysvalsercyslysalaserglytyrthrphethrasnphe202530glymetasntrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glytrpileasnthrasnthrglygluprothrtyrvalaspaspphe505560lysglyargphevalpheserleuaspthrservalserthralatyr65707580leuglnileserserleulysalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargtyrtyrglyserthrservaltrptyrpheaspvaltrpgly100105110argglythrleuvalthrvalserser115120<210>6<211>108<212>prt<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>重組抗vegf抗體輕可變區(qū)<400>6aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspilepheasntyr202530leuasntrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrtyrserserargleuhisserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrphethrileserserleuglnpro65707580gluaspilealathrtyrtyrcysglnglnglyphethrleuprotrp859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelysarg100105<210>7<211>10<212>prt<213>musmusculus<220><221>misc_feature<223>cdr區(qū)，seqidno:3的亞序列<400>7glytyrthrphethrasnpheglymetasn1510<210>8<211>17<212>prt<213>musmusculus<220><221>misc_feature<223>cdr區(qū)，seqidno:3的亞序列<400>8trpthrasnthrasnthrglygluprothrtyrvalaspaspphelys151015gly<210>9<211>12<212>prt<213>musmusculus<220><221>misc_feature<223>cdr區(qū)，seqidno:3的亞序列<400>9tyrtyrglyserthrservaltrptyrpheaspval1510<210>10<211>11<212>prt<213>musmusculus<220><221>misc_feature<223>cdr區(qū)，seqidno:4的亞序列<400>10argalaserglnaspilepheasntyrleuasn1510<210>11<211>6<212>prt<213>musmusculus<220><221>misc_feature<223>cdr區(qū)，seqidno:4的亞序列<400>11tyrserserargleuhis15<210>12<211>9<212>prt<213>musmusculus<220><221>misc_feature<223>cdr區(qū)，seqidno:4的亞序列<400>12glnglnglyphethrleuprotrpthr15當前第1頁12