本發(fā)明涉及結合白介素-15并且特別是能夠中和所述蛋白質的活性的抗體及其作為治療劑的用途。

背景技術：

白介素15(IL-15)也稱為MGC9721，是通過各種刺激條件在多種組織(胎盤、骨骼肌、腎、肺、心臟、單核細胞/巨噬細胞)和許多細胞類型(包括單核細胞和巨噬細胞、血液衍生的樹突細胞、上皮和成纖維細胞)中表達的14至15kDa的促炎細胞因子(Fenhiger和Caligiuri，2001，Blood，97(1)：14-32)。

白介素-15調節(jié)T和自然殺傷(NK)細胞活化、存活和增殖。該細胞因子和白介素2(IL-2)共享許多生物活性，與它們共享的受體信號組分(IL-2/15Rβ和IL-2/15Rγc)一致。然而，通過完成IL-15Rαβγ異源三聚體高親和力受體復合物的獨特的私有α-鏈受體提供了IL-15與IL-2的特異性，從而允許根據(jù)配體和表達的高親和力受體的差異反應性(Fenhiger和Caligiuri，2001，同上)。此外，雖然可溶性IL-15能夠直接刺激表達IL-15Rαβγ高親和力受體或低親和力IL-15Rβγ受體的細胞，稱為IL-15順式呈遞的現(xiàn)象，但是暗示IL-15結合IL-15Rα，例如在一種細胞類型的表面，可以與在另一細胞的表面表達的IL-15Rβγ相互作用并通過其刺激，稱為IL-15反式呈遞的現(xiàn)象(Stonier等人，2010，Immunol.Lett.，127：85-92)。由于在循環(huán)中，IL-15也可能優(yōu)先與可溶性IL-15Rα相互作用，這種反式呈遞機制不太可能限于細胞-細胞相互作用(Bergamaschi等人，2012，Blood120：e1-e8)。

已經在幾種病癥中顯示了IL-15表達失調的有害作用，包括例如類風濕性關節(jié)炎、銀屑病和乳糜瀉的自身免疫疾病，以及例如T細胞白血病的惡性腫瘤。特別地，IL-15在人上皮內淋巴細胞中觸發(fā)抗凋亡途徑，其被認為是乳糜瀉相關炎癥和淋巴瘤生成的潛在的新靶標(Malamut等人，2010，J.Clin.Invest.,120(6)：2131-43)。此外，已經發(fā)現(xiàn)，IL-15的表達在人嗜酸性粒細胞性食管炎中增加，并在小鼠中介導相似/相關的發(fā)病機理(Zhu等人，2010，Gastroenterology，139(1)：182-93)。此外，已經發(fā)現(xiàn)，在患有阿爾茨海默病和額顳癡呆的患者中觀察到的增加的促炎活性，IL-15可以用作標志物，因為其水平在那些患者的腦脊液中升高(Rentzos等，2006，J.Geriatr.Psychiatry Neurol.，19(2)：114-7)。

還發(fā)現(xiàn)IL-15在激活移植排斥反應中的先天性免疫細胞，特別是NK和T細胞中(尤其是在同種異體移植的情況下)起重要作用(Ferrari-Lacraz等人，2011，J Immunol.，167(6)：3478-3485)。

IL-15也被認為是肌漿球蛋白，在肌肉和脂肪代謝中起各種作用(Raschke和Eckel，2013，Mediators Inflamm.，320724)。包括IL-15的促炎細胞因子的過量與在創(chuàng)傷、損傷和與癌癥相關的惡病質中觀察到的消耗、高代謝綜合征相關聯(lián)(Martínez-Hernández等人，2012，Oncol Rep.，28(4)：1443-52)。

盡管通常認為通過刺激免疫系統(tǒng)具有抗腫瘤活性，但是除了上述的在乳糜瀉相關淋巴瘤生成中的作用，IL-15還被揭示在某些形式的癌癥中發(fā)揮有害作用，例如急性淋巴細胞白血病和大顆粒淋巴細胞白血病(Cario等人，2007，J Clin Oncol.25(30)：4813-20)。

因此，提供能夠結合IL-15并且中和其生物活性以用于治療應用的有效和特異性抗體將是有益的，特別是用于治療IL-15相關病癥，特別是自身免疫和炎性病癥。

已經公開了完全人單克隆抗IL-15抗體(146B7)(Villadsen等人，2003，J.Clin.Invest.，112：1571-1580)，其不與IL-15競爭結合其IL-15Rα受體，但是有效干擾IL-15受體α、β、γ復合物的組裝。在人銀屑病異種移植模型中，抗體146B7降低了銀屑病的嚴重性。在患有活動性類風濕性關節(jié)炎的患者中使用抗體146B7(也稱為AMG 714)的I-II期劑量遞增試驗中，觀察到疾病活性的改善(Baslund等人，2005，Arthritis&Rheumatism，52(9)：2686-2692)。然而，由于缺乏療效，該程序中斷(Fulmer 2009，T.SciBX 2(36))。

已經公開了阻止IL-15結合IL-15Rα的單克隆小鼠抗IL-15抗體(B-E29)(Bernard等人，2004，J.Biol.Chem.，279(23)：24313-34322)。已經公開了阻止IL-15結合IL-15Rα的完全人抗IL-15抗體(DISC0280)，當直接比較時，比B-E29更有效和高效(Finch等人，2011，Brit.J.Pharmacol.，162：480-490)。雖然DISC0280在體外中和IL-15活性方面非常有效和高效，但其在體內不能這樣做。因此，猜測阻止IL-15與IL-15Rα的結合可能對體內IL-15中和活性是有害的。

盡管現(xiàn)有技術中存在抗IL-15抗體，仍然需要開發(fā)替代的抗IL-15抗體，其與現(xiàn)有技術的抗體相比表現(xiàn)出有利的性質，和/或更高效和/或更容易生產。

本發(fā)明通過提供對源自小鼠B-E29抗體的IL-15特異性的新型人源化抗體來滿足這種需要，其不阻止IL-15與IL-15Rα的結合，可以在體內中和IL-15，并且在結合和中和IL-15方面比146B7抗體更有效和更高效。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要針對結合白介素-15，特別是人IL-15的抗體，其包含源自小鼠抗IL-15抗體的人源化和優(yōu)化的本文所述的可變區(qū)。

本發(fā)明的第一方面提供了分離的結合IL-15的抗體，其包含：

(1)SEQ ID NO：5的重鏈可變區(qū)或其任何變體，其中所述序列的1、2、3、4、5、6、7、8或9個氨基酸被不同的氨基酸取代，和

(2)SEQ ID NO：24的輕鏈可變區(qū)或其任何變體，其中所述序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸被不同的氨基酸取代，

或其抗原結合片段。

本發(fā)明的第二方面涉及編碼所述抗體或其片段的分離的核酸分子。

本發(fā)明的第三和第四方面涉及分別包含所述核酸分子的重組表達載體和包含所述重組載體的宿主細胞。

本發(fā)明的第五方面涉及如本文描述的產生抗體的方法，包括在足以促進所述抗體或其片段表達的條件下培養(yǎng)用表達載體轉化的宿主細胞，表達載體包含編碼所述抗體的核酸序列。

本發(fā)明的第六方面提供了藥物組合物，其包含以下的一種或多種：(i)分離的結合IL-15的抗體或其抗原結合片段，(ii)核酸，(iii)載體和/或(iv)如本文描述的宿主細胞，以及至少一種藥學上可接受的載體。

本發(fā)明的第七方面涉及包含如本文描述的一種或多種抗IL-15抗體的成像組合物或診斷組合物。

本發(fā)明的第八方面是包含一種或多種如本文所述的抗IL-15抗體的試劑盒。

本發(fā)明的第九方面涉及根據(jù)本發(fā)明的抗體或其制劑，其用于預防和/或治療IL-15相關病癥，例如自身免疫性疾病和/或炎性病癥、惡性腫瘤、移植排斥、代謝病癥(例如高代謝病癥)和/或由寄生性、病毒性或細菌性病原體引起的感染性疾病。

第十方面涉及預防和/或治療IL-15相關病癥，例如自身免疫性疾病和/或炎性病癥、惡性腫瘤、移植排斥、遺傳或與創(chuàng)傷、損傷或癌癥相關的代謝病癥(例如高代謝病癥)和/或由寄生性、病毒性或細菌性病原體引起的感染性疾病的方法，包括在有需要的受試者中給藥治療有效量的所述抗體或所述藥物組合物。

從下面的詳細描述中，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將是顯而易見的。

附圖說明

圖1.與比較抗體1B-E29相比，小鼠B-E29的人源化和嵌合變體的可變區(qū)的序列的比對。(A)重鏈可變區(qū)：“cVH1”(SEQ ID NO：32)表示小鼠B-E29抗體的重鏈可變區(qū)；“cVH2”(SEQ ID NO：33)、“cVH3”(SEQ ID NO：34)和“cVH4”(SEQ ID NO：35)是cVH1的變體；“hVH1”是cVH1的人源化形式。(B)輕鏈可變區(qū)：“cVK1”(SEQ ID NO：36)表示小鼠B-E29抗體的輕鏈可變區(qū)；“hVK1”(SEQ ID NO：24)、“hVK2”(SEQ ID NO：37)是cVK1的兩種人源化形式。由Kabat定義的CDR加下劃線，并且對于VH/VL界面和規(guī)范環(huán)結構重要的關鍵殘基加星號(*)。

圖2.通過ELISA測定的抗IL-15抗體與人IL-15的結合的劑量-反應曲線，表示為在450nm的吸光度。本發(fā)明的一種示例性抗IL-15抗體(huB-E29-1)和146B7抗體與人IL-15的結合(A)、各種重組抗IL-15抗體與重組小鼠IL-15的結合(B)或與大鼠IL-15的結合(C)。

圖3.通過ELISA測定的抗IL-15抗體與重組人IL-2的結合。柱表示固定的5μg/ml濃度的測試抗IL-15抗體或陽性對照抗IL-2抗體在450nm處的吸光度的平均重復值。間接標記是單獨的HRP-抗人免疫球蛋白，不存在測試抗體。

圖4.通過ELISA測定的在各種濃度的抗體存在下生物素化的人IL-15與IL-15Rα-Fc的結合的劑量響反曲線，表示為450nm處的吸光度。示出了本發(fā)明的三種示例性抗IL-15抗體的結合，與已知阻斷IL-15結合IL-15Rα的對照抗體的結合以及在不存在抗體或不存在IL-15Rα-Fc時的生物素化的IL-15的結合比較。

圖5.在用媒介物或IL-15/IL-15Rα-Fc復合物，隨后用示例性抗IL-15抗體或對照人IgG1同種型注射的小鼠脾臟中的NK細胞的計數(shù)。結果表示為每組5只動物的平均值±標準偏差。

圖6.huB-E29-2、146B7和對照同種型抗體對三種II型RCD原代細胞系中IL-15誘導的凋亡和STA5磷酸化的預防的影響。將結果標準化為對照條件(培養(yǎng)基，設置為100％)中凋亡細胞的百分比(A)或由IL-15誘導的磷酸化的STAT5細胞內表達的MFI(B)的水平，并表示為從來自三個不同患者的II型RCD IEL細胞系獲得的結果的平均值加標準偏差SD)。

圖7.用兩次每周腹膜內注射100μg huB-E29-2(實心圓)或對照同種型抗體(空心圓)處理兩周的T2b-hIL-15轉基因小鼠中CD3⁺CD8⁺上皮內淋巴細胞(IEL)的計數(shù)。每個符號代表單個小鼠，并繪制組平均值加標準偏差(SD)。統(tǒng)計分析：不成對學生的t測試。

具體實施方式

定義

術語“白介素15”、“白細胞介素-15”、“IL-15”在此指白介素15蛋白，也稱為MGC9721，其是14至15kDa的促炎細胞因子，在人類中由IL-15基因編碼，IL-15基因的序列公開于Hugo Gene Nomenclature Committee ID 5977。未成熟形式的IL-15包含162個氨基酸，其中前29個氨基酸構成信號肽，氨基酸30至48構成前肽。未成熟形式的IL-15可以以UniProtKB登錄號P40933獲得。IL-15蛋白的成熟形式對應于氨基酸Asn 49至Ser 162，其中指定的位置對應于未成熟IL-15氨基酸序列上的氨基酸位置。人成熟IL-15的氨基酸序列對應于SEQ ID NO：1。來自其他物種的未成熟IL-15的氨基酸序列是本領域可獲得的，包括例如小鼠IL-15(UniProtKB登錄號P48346，對應于SEQ ID NO：2的成熟IL-15形式)，大鼠IL-15(UniProtKB登錄號P97604，對應于SEQ ID NO：3的成熟IL-15形式)，恒河猴IL-15(UniProtKB登錄號NP_001038196、XP_001091166、XP_001091289、XP_001091416，對應于SEQ ID NO：4的成熟IL-15形式)和食蟹猴IL-15(來自NCBI登錄號XP_005556036.1的預測序列，對應于SEQ ID NO：4的成熟IL-15形式)。術語“白介素15”還包括由細胞天然表達的白介素15的任何變體或同種型。值得注意的是，已經報道了IL-15的兩種可變剪接的轉錄變體。盡管這兩種同種型產生相同的成熟蛋白，但它們在細胞運輸中不同。

本文提及的術語“抗體”指結合抗原的多肽。這包括完整抗體和任何抗原結合片段。術語“抗體”以其最廣泛的含義使用，并且包括單克隆抗體、多克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體和其他工程抗體，只要保留本發(fā)明的特征性質，特別是結合靶抗原(例如IL-15)以及任選地結合由本發(fā)明的抗體識別的IL-15的相同表位的能力?？贵w及其片段的實例包括可變結構域片段(“Fv”，由抗體的單臂的VH和VL結構域組成)、Fab片段(由VH、VL、CH1和CL結構域組成的單價片段)、Fab₂片段(二價)、Fab3片段(三價)、Fab’片段(具有鉸鏈區(qū)的Fab)、F(ab’)₂片段(包括通過鉸鏈區(qū)處的二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段)、Fd片段(由VH和CH1結構域組成)、rIgG(減少的IgG或半IgG)、雙體、三體、四體、微體、結構域抗體(dAb)、單價抗體、包含多于一種抗體的片段的二價或多價抗體、單一鏈可變片段(ScFv)、雙scFv(雙特異性)和抗體的衍生物，例如二硫鍵穩(wěn)定的Fv片段、包含CDR的肽以及任何上述的表位結合片段(Holliger和Hudson，2005，Nature Biotechnology，23(9)：1126-1136)?？贵w指包含通過二硫鍵互連的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白或其抗原結合片段。每個重鏈包含重鏈可變區(qū)(VH)和重鏈恒定區(qū)(CH)。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(VL)和輕鏈恒定區(qū)(CL)。在哺乳動物中，重鏈可以是分別限定抗體IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的類別的α(α)、δ(δ)、ε(ε)、γ(γ)或μ(μ)。在哺乳動物中，輕鏈可以是λ(λ)或κ(κ)。在哺乳動物中，根據(jù)抗體類型，重鏈恒定區(qū)包含三個免疫球蛋白結構域CH1、CH2和CH3(對于IgA、IgD、IgG)或四個免疫球蛋白結構域CH1、CH2、CH3和CH4(對于IgE和IgM)。輕鏈恒定區(qū)包含一個免疫球蛋白域CL?？贵w可以具有IgA、IgG、IgE、IgD和IgM及其任何亞型的結構?？贵w可以來自任何來源，包括特別是靈長類動物(人和非人靈長類動物)和靈長類動物來源。

如本文所用的術語“可變結構域”(輕鏈(VL)的可變結構域、重鏈(VH)的可變結構域)是指直接參與將抗體結合到抗原的輕鏈和重鏈結構域的一對的每個?？勺冚p鏈和重鏈結構域具有相同的一般結構，每個結構域包含四個構架(“FW”)區(qū)，其序列是廣泛保守的，通過稱為“互補決定區(qū)”或“CDR”的三個“高變區(qū)”連接。構架區(qū)采用β-折疊構象，并且CDR可形成連接β-折疊結構的環(huán)。每條鏈中的CDR通過構架區(qū)保持在其三維結構中，并與來自另一條鏈的CDR一起形成抗原結合位點。術語“抗體的抗原結合部分”在用于本文時是指負責抗原結合的抗體的氨基酸殘基?？贵w的抗原結合部分包含來自“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基?！皹嫾堋被颉癋W”區(qū)是除了本文定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變結構域區(qū)。因此，抗體的輕鏈和重鏈可變結構域包含N末端至C末端：結構域FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3和FW4。CDR和FW區(qū)的殘基通常按照Kabat等人的標準定義(Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，Publication No.91-3242)編號。該編號系統(tǒng)用于本說明書中，除非另有說明。Kabat殘基命名并不總是直接對應于氨基酸殘基的線性編號。實際的線性氨基酸序列可以包含比在嚴格的Kabat編號中更少或額外的氨基酸，對應于基本可變結構域結構的構架或互補決定區(qū)(CDR)的結構組分的縮短或插入。可以通過抗體序列中的同源性殘基與“標準”Kabat編號序列的比對來確定給定抗體的殘基的正確Kabat編號。根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)，重鏈可變結構域的CDR位于殘基31-35(CDR-H1)、殘基50-65(CDR-H2)和殘基95-102(CDR-H3)。根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)，輕鏈可變結構域的CDR位于殘基24-34(CDR-L1)、殘基50-56(CDR-L2)和殘基89-97(CDR-L3)。

在本申請中，除非另有說明，對于所有人免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變結構域，編號是根據(jù)“Kabat編號系統(tǒng)”(Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，公開號91-3242)。

在本申請中，除非另有說明，對于所有人免疫球蛋白重鏈恒定結構域，編號是根據(jù)“EU編號系統(tǒng)”(Edelman等人，1969，Proc Natl Acad Sci，63(1)：78-85)。

本文使用的術語“單克隆抗體”是指從基本上同源的抗體群獲得的抗體，即包含群體的單個抗體是相同的，除了可能以少量存在的可能的天然存在的突變。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個抗原位點。修飾語“單克隆”表示抗體從基本上同源的抗體群獲得的特征，并且不應解釋為需要通過任何特定方法產生抗體。

術語“嵌合抗體”通常是指包含來自一個來源或物種的可變區(qū)和源自不同來源或物種的恒定區(qū)的至少一部分的抗體，通常通過重組DNA技術制備。嵌合抗體的典型實例包括包含小鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。如本文所定義的，該術語還包括包含第一人抗體的至少一個CDR和第二人抗體的恒定區(qū)的至少一部分的抗體。其還包括包含第一人抗體的重鏈CDR1、CDR2和CDR3以及第二人抗體的輕鏈CDR1、CDR2和CDR3的抗體。

術語“人源化抗體”指來自非人物種的抗體，其具有來自所述非人物種的一個或多個互補決定區(qū)(CDR)和來自人免疫球蛋白分子的構架區(qū)。人源化抗體可任選地進一步包含來源于CDR所來源的非人物種的一個或多個構架殘基。

術語“人抗體”或“完全人抗體”是指這樣的抗體，其中重鏈和輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)都是人源的，或與人源序列基本上相同，但不一定來自相同的抗體。

術語“分離的抗體”是指已經從其天然環(huán)境的組分中分離的抗體。例如，如通過本領域的方法確定的，分離的抗體已純化至大于95％或99％的純度(參見例如Flatman等人，2007，J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，848：79-87)，包括電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦、毛細管電泳)或色譜(例如離子交換或反相HPLC(高效液相色譜))方法。

術語“多核苷酸”或“核酸分子”是指包含核苷酸的聚合物。核酸分子的實例包括DNA、RNA、鎖核酸(LNA)、互補DNA(cDNA)。

“多肽”理解為包括通過正?；蛐揎椀碾逆I彼此連接的至少兩個氨基酸的肽、寡肽、寡聚物或蛋白質，例如在等排肽的情況下。多肽可以由除遺傳密碼定義的20種氨基酸以外的氨基酸組成。多肽可同樣由通過天然過程(例如翻譯后成熟過程或通過化學過程)修飾的氨基酸組成，這是本領域技術人員熟知的。這些修飾在文獻中充分詳述。這些修飾可以出現(xiàn)在多肽的任何位置：在肽骨架中、在側鏈中或甚至在羧基或氨基末端。例如，多肽修飾被理解為包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價固定、血紅素的共價固定、核苷酸或核苷酸衍生物的共價固定、脂質或脂質衍生物的共價固定、磷脂酰肌醇的共價固定、共價或非共價交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、半胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲?；ⅵ?羧化、包括聚乙二醇化的糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解過程、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、seneloylation、硫酸化、氨基酸添加，如精氨酰化或泛素化。這些修飾在文獻(Proteins Structure and Molecular Properties(1993)2nd Ed.，TE Creighton，New York；Post-translational Covalent Modifications of Proteins(1983)BC Johnson，Ed.，Academic Press，New York；Seifter et al.(1990)Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors，Meth.Enzymol.182：626-646和Rattan et al.，(1992)Protein Synthesis：Post-translational Modifications and Aging，Ann NY Acad Sci，663：48-62)中詳述。

“分離的多核苷酸”或“分離的多肽”應理解為從人體分離或通過技術方法產生的如先前定義的多核苷酸或多肽。

術語“變體”可以應用于多核苷酸和/或多肽。例如，本文提及的肽或多肽的變體是指與參考肽序列基本上同源的肽或多肽，但其具有與參考序列不同的氨基酸序列，因為一個或多個氨基酸缺失、插入和/或取代。基本上同源是指與參考肽序列相同的變體氨基酸序列，除了少數(shù)氨基酸的缺失、插入和/或取代之外，例如，1、2、3、4、5或6個氨基酸?；旧贤词侵概c參考氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的變體氨基酸序列。變體核酸序列可以是與參考核苷酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列。兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的同一性可以通過目視檢查和/或數(shù)學計算確定，或者通過使用用于序列比較的已知計算機程序(例如，Clustal package version 1.83)比較序列信息來更容易地確定。變體可以包含具有至少一個保守取代的氨基酸的序列，這意味著給定的氨基酸殘基被具有相似的生理化學特性的殘基取代。保守取代的實例包括一個脂肪族殘基對另一個脂肪族殘基的取代，例如Ile、Val、Leu或Ala彼此的取代，或一個極性殘基對另一個的取代，例如Lys和Arg之間的取代；Glu和Asp之間的取代；或Gln和Asn之間的取代。其他這樣的保守取代，例如具有相似疏水性特征的整個區(qū)域的取代是公知的(Kyte，等人，1982，J.Mol.Biol.，157：105-131)。例如，“保守氨基酸取代”可以涉及天然氨基酸殘基用非天然殘基的取代，使得對該位置的氨基酸殘基的極性或電荷幾乎沒有影響?；蛘?，原始多肽中存在的一個或多個氨基酸的取代不是保守的，其可產生與參考抗體相比具有改變的性質的變體。期望的氨基酸取代(無論是保守的還是非保守的)可以由本領域技術人員在需要這樣的取代時確定。術語“變體”還包括與參考肽序列基本上同源的肽或多肽，但其具有不同于參考序列的氨基酸序列，因為一個或多個氨基酸已經被氨基酸類似物化學修飾或取代。該術語還包括糖基化多肽。

術語“表位”包括能夠與抗體特異性結合的任何多肽決定簇。在某些實施方案中，表位決定簇包括分子的化學活性表面基團，例如氨基酸、糖側鏈、磷?；蚧酋；?，并且在某些實施方案中，可具有特定的三維結構特征和/或特異性電荷特征。表位是由抗體結合的抗原的區(qū)域。

如本文所用，術語抗體與靶抗原的“結合”或“結合”是指所述抗體與所述靶抗原(例如IL-15)或所述靶抗原的片段(包含由所述抗體識別的表位)至少暫時相互作用或相關聯(lián)。如本文所使用的，結合IL-15的抗體也稱為抗IL-15抗體。

當應用于抗體時，術語“選擇性結合”、“特異性結合”、“特異性”表示抗體優(yōu)先識別和/或結合靶多肽或表位，即以比任何其它抗原或表位更高的親和力，即與靶多肽的結合可以與對其他抗原的非特異性結合相區(qū)別?？贵w的結合親和力可以由本領域普通技術人員容易地確定，例如通過平衡透析、平衡結合、表面等離子體共振或光譜學(例如使用熒光測定)。特別地，當使用表面等離子體共振(SPR)技術時，生物分子結合事件引起表面層的折射率的變化，其中結合配偶體之一被固定，其被檢測為表達為響應單位(RU)的表面等離子體共振信號的變化。通過測量抗體與其靶抗原的實時結合動力學，SPR技術可以確定抗體與其靶標之間的結合有多快(以ka或kon結合常數(shù)測量)，其結合有多強(以kd或koff解離常數(shù)測量)。可以通過測定其平衡解離常數(shù)KD定量測定抗體對其靶標的親和力，KD定義為KD＝kd/ka，其中ka是結合速率(kon)，kd是解離速率(koff)(Murphy等人，2006，Curr Protoc Protein Sci，Chapter 19：Unit19.14)?？梢越煞N抗體之間的親和力和/或結合性質的比較，而不實際確定每種抗體的KD值，但是基于與KD成比例的結合的定量測量(例如通過ELISA或FACS分析)或親和力的定量測量或親和力的推斷(例如在功能測定或體外或體內測定中)。

術語抗體的“阻斷”或“中和”活性是指其抑制其靶標活性的能力?？贵w的中和活性可以通過體外測定或體內測定或功能測定來確定。應用于結合IL-15的抗體，該術語指抗體通常中和IL-15活性的能力，其可對應于例如活化T細胞、天然殺傷細胞、天然殺傷T細胞和B淋巴細胞或任何其它表達異源三聚體IL-15Rαβγ或異源二聚體IL-15Rβγ受體的細胞的IL-15誘導的增殖和/或存活的抑制(Finch等，2011，Br J Pharmacol.162：480-90)，由抗IgM或CD40配體刺激的B淋巴細胞引起的IL-15誘導的免疫球蛋白合成的抑制(Litinskiy等，2012，Nat Immunol.，3：822-9)，IL-15誘導的人中性粒細胞的活化的抑制(Rathhé和Girard，2004，J Leukoc Biol.，76：162-8)，和IL-15誘導的從巨噬細胞、樹突細胞或上皮細胞產生促炎細胞因子的抑制(Nanayakkara等，2013，Am J Clin Nutr.，98：1123-35)。特別地，抗IL-15抗體的中和活性可以通過測量它們抑制細胞系(例如Kit225或M-07e細胞)的IL-15誘導的增殖和/或存活的能力來評估，如實例部分中所述。由于IL-15可以直接且單獨作用于表達異源三聚體IL-15Rαβγ或異源二聚體IL-15Rβγ受體(順式信號轉導)的細胞，或當已經與IL-15Rα受體結合時(反式信號轉導)(Stonier等人，2010，同上)，結合IL-15的抗體可以中和IL-15的順式和反式呈遞之一或兩者?？贵w的“效力”可以表示為在給定抗原濃度下產生半最大效應的抗體/抗原結合片段的濃度。例如，抗體的“效果”可以是其靶標的活性的抑制或中和。在這種情況下，產生半數(shù)最大抑制的抗體濃度可以稱為IC₅₀，其以mol/l或M給出。如果結合是測量的抗體的“效果”，例如在ELISA測定中，這種抗體的半數(shù)最大結合容量(BC₅₀)可以表示為在給定抗原濃度下產生半數(shù)最大信號的抗體的濃度，其以mol/l或M給出。效力通常受親和性影響，直到在給定的抗原濃度下，親和力超過這樣的親和力，該親和力的進一步改善將不再增強抗原的結合(所謂的效力上限)。應用于針對IL-15的抗體，效力可以例如通過測量在抗體存在下細胞系(諸如Kit 225或M-07e細胞)的IL-15誘導的增殖和/或存活的IC₅₀值或結合來自不同來源或物種的IL-15的BC₅₀值來確定。

如本文所用的術語“效應子功能”包括由抗體Fc區(qū)與Fc受體或配體的相互作用產生的生物化學事件。效應子功能包括FcγR介導的效應子功能，例如ADCC(抗體依賴性細胞介導的細胞毒性)和ADCP(抗體依賴性細胞介導的吞噬作用)，和補體介導的效應子功能，例如CDC(補體依賴性細胞毒性)。可以通過改變(即增強或降低，優(yōu)選增強)抗體對效應分子(例如Fc受體或補體成分)的親和力來改變抗體的效應子功能?？贵wFc區(qū)與Fc受體或配體的結合親和力可以通過修飾效應分子結合位點而改變。還可能的是，針對效應分子的抗體上的結合位點的改變來改變相互作用的幾何形狀，而不顯著改變總體結合親和力，使得效應子機制無效，如在非生產性結合中。還可以通過修飾不直接參與效應分子結合但另外參與效應子功能的性能的位點來改變效應子功能。通過改變抗體的效應子功能，可以控制免疫應答的各個方面，例如，增強或抑制免疫系統(tǒng)的各種反應，在診斷和治療中可能具有有益效果。

術語“藥學上可接受的”是指由不是生物學或其它方面不期望的材料構成的載體。

術語“載體”是指存在于藥物制劑中而不是活性劑的任何組分，并且因此包括稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、填充劑、著色劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、防腐劑等。

如本文所用，“治療”和“治療”等通常是指獲得期望的藥理學和生理學效果。該效果在預防或部分預防其疾病、癥狀或病癥方面可以是預防性的，和/或在部分或完全治愈疾病、病癥、癥狀或歸因于該疾病的不良作用方面可以是治療性的。本文所用的術語“治療”涵蓋哺乳動物，特別是人的疾病的任何治療，并且包括：(a)預防疾病在可能易患疾病但尚未診斷為例如基于家族史的受試者中發(fā)生；(b)抑制疾病，即阻止其發(fā)展；或(c)緩解疾病，即，使疾病和/或其癥狀或病癥消退，例如改善或修復損傷。例如，治療乳糜瀉包括預防、減少或甚至消除疾病或病癥的癥狀，例如部分或完全緩解腹痛、腹瀉、非預期的體重減輕、吸收不良綜合征和腸粘膜異常，例如絨毛萎縮、糜爛、潰瘍和由正?；虍惓Ｉ掀攘馨图毎慕櫋?/p>

術語“IL-15相關的疾病和/或病癥”包括特征在于IL-15的過表達和/或細胞或器官的增加的水平和/或異常IL-15表達和/或細胞或器官的IL-15變體的異常表達的疾病和病癥。這樣的疾病和病癥包括例如自身免疫性疾病和/或炎性病癥，例如具有促炎性IL-15相關成分的病癥和惡性腫瘤。

術語“自身免疫性疾病和/或炎性病癥”在本文中通常定義為由受試者身體對正常存在于體內的物質和組織的異常免疫應答所引起的疾病或病癥，以及可能涉及或可能不涉及免疫系統(tǒng)的炎癥異常。自身免疫性疾病和炎性疾病的非限制性實例主要包括類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、乳糜瀉，特別是頑固性乳糜瀉、結節(jié)病、炎性腸病(例如潰瘍性結腸炎、克羅恩病)、丙型肝炎疾病、多發(fā)性硬化、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、硬化性膽管炎、膽道閉鎖、斑禿、移植排斥反應、中樞神經系統(tǒng)的炎癥性疾病和嗜酸性粒細胞性食管炎。

術語“惡性腫瘤”主要包括T細胞白血病，例如皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)(例如蕈樣真菌病、Sezary綜合征)、顆粒淋巴細胞的淋巴細胞增殖性病癥(LDGL)、大顆粒淋巴細胞白血病和急性淋巴細胞白血病(ALL)，而且還包括前B細胞白血病、骨肉瘤、尤文肉瘤、橫紋肌肉瘤、黑色素瘤、小細胞肺癌、腎細胞癌、成膠質細胞瘤、成神經細胞瘤和間皮瘤。

術語“由寄生性、病毒性或細菌性病原體引起的感染性疾病”主要包括肉芽腫性感染(例如結核病、利什曼病、血吸蟲病和巨細胞病毒感染)和漢坦病毒感染(例如具有腎綜合征和漢坦病毒肺綜合征的漢坦病毒出血熱)。

術語“中樞神經系統(tǒng)(CNS)的炎性疾病”涉及特征為CNS炎癥的病癥，特別是淀粉樣蛋白相關病癥。這些疾病的非限制性實例是阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓舞蹈病。

術語“代謝疾病”主要涵蓋糖尿病、肌肉營養(yǎng)不良和高代謝病癥。

術語“高代謝疾病”主要涵蓋遺傳病癥，例如鐮狀細胞病或獲得性高代謝病癥，例如與創(chuàng)傷、感染或癌癥相關性惡病質有關的病癥。

本文使用的術語“受試者”是指哺乳動物。例如，本發(fā)明考慮的哺乳動物包括人、靈長類動物、馴養(yǎng)動物，如牛、綿羊、豬、馬、實驗室嚙齒動物等。

根據(jù)本發(fā)明的治療或方法的術語“功效”可以基于響應于根據(jù)本發(fā)明的用途或方法的疾病或病癥過程中的變化來測量。例如，根據(jù)本發(fā)明的治療或方法的功效可以通過其對疾病的體征或癥狀的影響來測量。當患者經歷部分或全部緩解或減少不需要的疾病癥狀時，實現(xiàn)響應。

如本文所用的術語“有效量”是指在給藥所述抗體的受試者中引起疾病的癥狀的可檢測的減輕的根據(jù)本發(fā)明的至少一種抗體或其藥物制劑的量。

抗IL-15抗體

結合IL-15的抗體的一般特征

在第一方面，本發(fā)明提供了結合IL-15(特別是人IL-15)或IL-15的片段的抗體或其抗原結合片段，并且包含如本文所述的抗體的至少一個重鏈可變區(qū)和/或至少一個輕鏈可變區(qū)。

在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了結合IL-15的分離的抗體，更特別地是對IL-15(特別是人IL-15)特異性的抗體或其抗原結合片段，其包含至少一個重鏈可變區(qū)和至少一個輕鏈可變區(qū)以及任選地恒定區(qū)的至少一個片段，如本文所述。

通常，根據(jù)本發(fā)明的抗體的抗原結合片段包含所述抗體的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3和FW4。

在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體的抗原結合片段包含SEQ ID NO：5的氨基酸26至111或其變體和/或SEQ ID NO：24的氨基酸24至102或其變體。

根據(jù)本發(fā)明的抗體或其片段結合的蛋白質可以是任何物種的IL-15蛋白質。

根據(jù)本發(fā)明的抗體通常對人IL-15表現(xiàn)出高特異性。然而，取決于不同物種的IL-15同源物之間的序列同一性程度，給定的抗體或抗原結合片段可以顯示與來自至少一種其它物種的IL-15的交叉反應性，例如，猴(例如食蟹猴、恒河猴)、小鼠、大鼠、狨猴、狗和/或兔。對于針對人IL-15的抗體，在某些情況下，例如當在特定疾病的動物模型中測試抗體或用于進行毒理學、安全性和劑量研究時，可能需要與其它哺乳動物形式的IL-15的某種水平的交叉反應性。

在具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其片段優(yōu)先結合人IL-15。

在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段顯示與人IL-15、食蟹猴IL-15和恒河猴IL-15的交叉反應性。

在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段顯示與大鼠IL-15和/或小鼠IL-15沒有交叉反應性。

在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體及其片段對于人IL-15的結合親和力(例如與KD值負相關)比其對非人IL-15(例如小鼠或大鼠IL-15)的結合親和力高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍。

在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其片段優(yōu)先結合IL-15，并且任選地另外顯示與其它與IL-15具有同源性的蛋白質(例如IL-2，特別是人IL-2(SEQ ID NO：38))的弱結合或幾乎沒有結合(即可忽略或不可檢測的結合)。

在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體及其片段對IL-15的定量結合比其對IL-2的定量結合高至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍。

結合親和力和/或定量結合可以通過本領域已知的任何方法測量，包括平衡透析、平衡結合、凝膠過濾、ELISA、表面等離子體共振或光譜學(例如使用熒光測定)(Jiang等人，BMC Pharmacology 2010，10:10)，并且可以表示為例如結合速率、解離速率、平衡解離常數(shù)(KD)、平衡常數(shù)(K eq)或本領域中使用的任何其它術語。

在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體及其抗原結合片段以等于或低于100nM，特別是低于10nM，更特別是低于10nM、更特別是低于1nM、或低于0.5nM、或低于0.1nM、或低于0.01nM、或低于0.005nM的平衡解離常數(shù)(KD)特異性結合人IL-15。

在一個具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段抑制IL-15活性，并且任選地另外表現(xiàn)出對與IL-15具有同源性的其他蛋白質(例如IL-2)的弱抑制活性或幾乎沒有抑制活性(即可忽略或不可檢測的活性)。

抗體阻斷或中和其靶蛋白的活性的能力可以通過如本文定義的它的效力來評價，其本身例如通過IC₅₀值反映。通常，抗體的中和活性可以通過體外測定法測定，例如用于在所述抗體存在下測量細胞系(例如Kit 225或M-07e細胞)的IL-15誘導的增殖和/或存活的抑制水平的測定法，如實例部分所述。

在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體及其抗原結合片段具有等于或低于200nM、特別是低于100nM，特別是低于50nM、低于30nM、低于20nM、更特別地低于10nM、低于8nM、低于7nM、低于5nM、低于4nM、低于3nM、低于2nM、低于1nM、低于0.5nM、低于0.2nM、低于0.1nM、低于0.05nM或低于0.03nM的IC₅₀，用于抑制IL-15活性，例如細胞系(例如Kit 225或M-07e細胞)的IL-15誘導的增殖和/或存活，如實例部分所述。

應當理解，本文描述的根據(jù)本發(fā)明的抗體或其片段的任何變體能夠結合IL-15并任選地中和IL-15活性。在一個具體實施方案中，相比于所述變體衍生的親本抗體或片段，此類變體可顯示與IL-15相同或甚至更高的結合親和力和/或相同或甚至更高的效力和/或相同或更高的物種選擇性和/或相同或更高的對IL-15的選擇性和/或具有相同或更高的中和效力。

在另一個具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段基本上不阻止IL-15與IL-15Rα的結合，即在根據(jù)本發(fā)明的抗體存在下IL-15與IL-15Rα的結合的抑制是可忽略的或不可檢測的。

根據(jù)本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體和進一步改造的抗體，只要保留本發(fā)明的抗體的特征性質，特別是結合靶抗原，更具體地結合與由本發(fā)明的抗體識別的IL-15的相同表位的能力，以及任選地中和IL-15活性的能力。

在本發(fā)明的一個具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其結合IL-15的抗原結合片段是單克隆抗體。

在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其結合IL-15的抗原結合片段是人源化抗體。

在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其結合IL-15的抗原結合片段是重組抗體。

根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其結合IL-15的抗原結合片段的特征在于它們的部分與靶蛋白相互作用，特別是通過它們的可變區(qū)，可變區(qū)通常包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)。

關于它們的可變區(qū)的抗IL-15抗體的特征

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及結合IL-15的分離的抗體，其包含：

(1)SEQ ID NO：5的重鏈可變區(qū)或其任何變體，其中所述序列的1、2、3、4、5、6、7、8或9個氨基酸被不同的氨基酸取代，和

(2)SEQ ID NO：24的輕鏈可變區(qū)或其任何變體，其中所述序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸被不同的氨基酸取代；

或其抗原結合片段。

在具體實施方案中，本發(fā)明涉及結合IL-15的分離的抗體，其包含：

(1)SEQ ID NO：5的重鏈可變區(qū)或與SEQ ID NO：5具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的任何變體，和

(2)SEQ ID NO：24的輕鏈可變區(qū)或與SEQ ID NO：24具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的任何變體；

或其抗原結合片段。

在一個更具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體包含：

(1)與SEQ ID NO：5具有至少96％同一性的重鏈可變區(qū)，和

(2)與SEQ ID NO：24具有至少98％同一性的輕鏈可變區(qū)，

或其抗原結合片段。

在另一個更具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體包含：

(1)與SEQ ID NO：5具有至少97％同一性的重鏈可變區(qū)，和

(2)與SEQ ID NO：24具有至少99％同一性的輕鏈可變區(qū)

或其抗原結合片段。

在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，SEQ ID NO：5的所述變體具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，除了至少一個(具體地，1、2、3、4或5個)氨基酸被不同的氨基酸取代：

(i)重鏈可變構架區(qū)內的位置H3處的精氨酸(R)(VH RH3)、位置H5處的甲硫氨酸(M)(VH MH5)、位置H6處的丙氨酸(A)(VH AH6)、位置H49處的丙氨酸(A)(VH AH49)，和/或

(ii)重鏈CDR2內的位置H61處的天冬氨酸(D)(VH DH61)、位置H62處的絲氨酸(S)(VH SH62)，和/或

(iii)重鏈CDR3內的位置H98處的甲硫氨酸(M)(VH MH98)、位置H100C處的色氨酸(W)(VH WH100C)、位置H100E的甲硫氨酸(M)(VH MH100E)。

在另一個實施方案中，SEQ ID NO：5的所述變體具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，除了：

(i)VH RH3被谷氨酰胺(Q)取代，和/或VH MH5被纈氨酸(V)取代，和/或VH AH6被谷氨酸(E)取代，和/或VH AH49被絲氨酸(S)取代，和/或

(ii)VH DH61被谷氨酸(E)取代，和/或VH SH62被蘇氨酸(T)取代，和/或

(iii)VH MH98被亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、異亮氨酸(I)或丙氨酸(A)取代，和/或VH WH100C被酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)或丙氨酸(A)取代，和/或VH MH100E被亮氨酸(L)，苯丙氨酸(F)或異亮氨酸(I)取代。

在本發(fā)明的一個實施方案中，SEQ ID NO：24的所述變體具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列，除了至少一個(具體地，1、2、3或4個)氨基酸被不同的氨基酸取代：

(i)輕鏈可變構架區(qū)內的位置L36處的酪氨酸(Y)(VL YL36)、位置L46處的亮氨酸(L)(VL LL46)，和/或

(ii)輕鏈CDR3內的位置L91處的天冬氨酸(D)(VL DL91)、位置L92處的絲氨酸(S)(VL SL92)。

在另一個實施方案中，SEQ ID NO：24的所述變體具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列，除了：

(i)VL YL36被苯丙氨酸(F)取代，和/或VL LL46被精氨酸(R)取代，和/或

(ii)VL DL91被谷氨酸(E)取代，和/或VL SL92被蘇氨酸(T)取代。

在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段包含：

(1)SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，除了：

(i)VH RH3被谷氨酰胺(Q)取代，和/或VH MH5被纈氨酸(V)取代，和/或VH AH6被谷氨酸(E)取代，和/或

(ii)VH SH62被蘇氨酸(T)取代，和/或

(iii)VH WH100C被酪氨酸(Y)取代，和

(2)SEQ ID NO：24的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。

在一個更具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段包含：

(i)選自以下序列的重鏈可變區(qū)：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23，和

(ii)選自以下序列的輕鏈可變區(qū)：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29。

在一個更具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：6的重鏈可變區(qū)。

在一個更具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：24的輕鏈可變區(qū)。

根據(jù)本發(fā)明的抗體的具體實例包括表1中所列的那些。

表1

在一個更具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段包含：

(1)選自以下序列的的重鏈可變區(qū)：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：21，和

(2)SEQ ID NO：24的輕鏈可變區(qū)。

仍更具體地，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：5的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO：24的輕鏈可變區(qū)。

仍更具體地，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：6的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO：24的輕鏈可變區(qū)。

仍更具體地，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：12的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO：24的輕鏈可變區(qū)。

仍更具體地，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：21的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO：24的輕鏈可變區(qū)。

關于它們的恒定區(qū)的抗IL-15抗體的特征

對應于抗體的恒定區(qū)的部分任選地包含在根據(jù)本發(fā)明的結合IL-15的分離的抗體或其抗原結合片段中。

根據(jù)所提出的抗體功能，特別是可能需要的效應子功能，抗體的恒定區(qū)可存在或不存在于根據(jù)本發(fā)明的抗體內。

通常，當存在于根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段內時，重鏈恒定區(qū)或其部分可以來自任何抗體同種型。例如，重鏈恒定區(qū)或其部分可以是選自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(例如IgA1、IgA2)、IgD、IgE、IgM(例如IgM1、IgM2)的抗體的重鏈恒定區(qū)或其部分。特別地，它可以是IgG(更具體地為IgG1)的恒定區(qū)或其部分。

特別地，當抗體分子用于治療用途并且需要抗體效應子功能時，可以使用人IgG恒定區(qū)結構域，特別是IgG1和IgG3同種型?；蛘?，當抗體分子用于治療目的并且不需要抗體效應子功能時(例如，僅用于阻斷IL-15活性)，可以使用IgG2和IgG4同種型。

當存在于根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段內時，輕鏈恒定區(qū)或其部分可以來自任何輕鏈的恒定區(qū)。例如，輕鏈恒定區(qū)或其部分可以來自κ或λ輕鏈。

在本發(fā)明的特定方面，IL-15的抗體或其抗原結合片段包含(i)至少一條重鏈，其包含本文所述的可變區(qū)和來自IgG抗體(具體地IgG1，更具體地是同種型G1m3)的恒定區(qū)或其部分，和(ii)至少一條輕鏈，其包含如本文所述的可變區(qū)和來自κ(具體地同種異型Km3)輕鏈的恒定區(qū)或其部分，同種異型G1m3的恒定區(qū)的氨基酸序列是SEQ ID NO：30。同種異型Km3的恒定區(qū)的氨基酸序列是SEQ ID NO：31。

本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段具有至少一個抗原結合位點，例如，一個或兩個抗原結合位點。

在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的分離的抗體及其抗原結合片段是糖基化的。通常，單糖(如N-乙酰葡糖胺、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖、唾液酸等)在抗體上的單個糖基化位點處組裝成寡糖。

包含輔助分子的綴合物

在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明的分離的抗體或其抗原結合片段任選地與輔助分子綴合，并且在本文中也稱為“綴合的抗體”或“綴合的抗體片段”。

輔助分子可以直接或經由合適長度的間隔物與抗體或抗體片段綴合，例如如Kellogg等人(2011，Bioconjug Chem，22：717-27)描述的。

在特別適用于治療目的的一個實施方案中，輔助分子可以是治療性效應基團，例如細胞毒性(例如細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素或其片段)、細胞生長抑制劑或免疫調節(jié)劑，包括放射性基團(即包含放射性核苷或放射性同位素的基團)或小分子。

在另一個實施方案中，輔助分子包含抗體的抗原結合片段，當與根據(jù)本發(fā)明的抗體或抗體片段綴合時，形成雙特異性抗體。特別地，所述雙特異性抗體可以針對IL-15的兩種不同的表位(因此定義雙原位旁抗體)。

根據(jù)本發(fā)明的綴合抗體和綴合的抗體片段可以將藥物在體內靶向至疾病部位(例如炎癥或腫瘤部位)，使得綴合的輔助分子可以對疾病部位具有治療效果。

在特別適用于診斷目的的可選實施方案中，輔助分子可以是例如標記基團，包括放射性同位素(例如3H、14C、32P、35S、125I)、發(fā)色標記物(例如，可以用于將底物轉化為可檢測的顏色的酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶)或熒光化合物(例如綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白))、光譜標記(例如熒光標記(如熒光素及其衍生物，如FITC、德克薩斯紅、花青染料、光青色、羅丹明或呈現(xiàn)可見顏色的標記)、包括熒光素的發(fā)光標記，可由對標記特異性的其他化合物開發(fā)并允許容易檢測和定量的親和標記或用于標準ELISA的任何其他標簽。

編碼本發(fā)明的多肽的核酸

根據(jù)另一個實施方案，提供了編碼根據(jù)本發(fā)明的抗體或其抗原結合片段的分離的核酸分子。

根據(jù)本發(fā)明的分離的核酸可以是例如天然DNA或RNA或重組或合成的DNA、RNA或LNA或包含單獨或組合的根據(jù)本發(fā)明的任何核酸分子的重組核酸分子。在一個具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子是cDNA。

在一個具體的實施方案中，提供了包含以下的一種或多種的分離的核酸：

(1)編碼SEQ ID NO：5的重鏈可變區(qū)或其任何變體或其抗原結合片段的核酸序列，其中所述序列的1、2、3、4、5、6、7、8或9個氨基酸被不同的氨基酸取代，和

(2)編碼SEQ ID NO：24的輕鏈可變區(qū)或其任何變體或其抗原結合片段的核酸序列，其中所述序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸被不同的氨基酸取代。

在一個具體的實施方案中，提供了包含以下的一種或多種的分離的核酸：

(1)編碼SEQ ID NO：5的重鏈可變區(qū)、或與SEQ ID NO：5具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的任何變體、或其抗原結合片段的核酸序列，和

(2)編碼SEQ ID NO：24的輕鏈可變區(qū)、或與SEQ ID NO：24具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的任何變體、或其抗原結合片段的核酸序列。

在一個具體的實施方案中，提供了包含以下的一種或多種的分離的核酸：

(1)編碼選自以下序列的重鏈可變區(qū)或其抗原結合片段的核酸序列：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23，

(2)編碼選自以下序列的輕鏈可變區(qū)或其抗原結合片段的核酸序列：SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29。

在一個更具體的實施方案中，本發(fā)明提供了包含以下的一種或多種的分離的核酸：

(1)編碼選自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：21的重鏈可變區(qū)的核酸序列，和

(2)編碼SEQ ID NO：24的輕鏈可變區(qū)的核酸序列。

用于生產和純化本本發(fā)明的多肽的載體和宿主細胞

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的重組表達載體，其中載體任選地包含表達控制序列，其允許在原核或真核宿主細胞中表達所編碼的多肽，可操作地連接到所述核酸分子。

可以使用許多表達系統(tǒng)，包括但不限于染色體、附加體和衍生的病毒。更具體地，所使用的重組載體可以來自細菌質粒、轉座子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體元件、病毒，例如桿狀病毒、乳頭瘤病毒(例如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、狐痘病毒、偽狂犬病病毒、逆轉錄病毒。這些重組載體同樣可以是粘?；蚴删Ｑ苌铩?/p>

核酸序列可以通過本領域技術人員熟知的方法插入在重組載體中，例如描述于MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Sambrook等人，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001。

重組載體可以包括控制多核苷酸表達的調節(jié)的核苷酸序列以及允許本發(fā)明的多核苷酸的表達和轉錄以及本發(fā)明的多肽的翻譯的核苷酸序列，這些序列根據(jù)所使用的宿主細胞選擇。

因此，例如，可以將合適的分泌信號整合到重組載體中，使得由本發(fā)明的核酸分子編碼的多肽將被導向內質網(wǎng)的腔、導向膜上的周質空間或導向細胞外環(huán)境。合適的分泌信號的選擇可以促進隨后的蛋白質純化。

在另一個實施方案中，提供了包含根據(jù)本發(fā)明的重組載體的宿主細胞。

重組載體在宿主細胞中的引入可以根據(jù)本領域技術人員熟知的方法進行，例如描述于BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Davis等人，2nd ed.，McGraw-Hill Professional Publishing 1995，和MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，例如通過磷酸鈣轉染、通過DEAE葡聚糖轉染、轉染、顯微注射、通過陽離子脂質的轉染、電穿孔、轉導或感染。

宿主細胞可以是例如細菌細胞(如大腸桿菌或鏈霉菌)、真菌細胞(如曲霉屬和酵母(如酵母屬))、昆蟲細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、C127小鼠細胞系、敘利亞倉鼠細胞的BHK細胞系、人胚腎293(HEK 293)細胞。在一個具體的實施方案中，宿主細胞是CHO細胞或HEK 293細胞。

宿主細胞可用于例如表達本發(fā)明的多肽。在通過標準方法純化后，本發(fā)明的多肽可以用于下文所述的方法。

例如，當使用分泌重組蛋白的表達系統(tǒng)時，可以首先使用市售的蛋白濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮培養(yǎng)基。在濃縮步驟之后，濃縮物可以應用于純化基質，例如凝膠過濾基質?？蛇x地，可以使用陰離子交換和/或親和樹脂。基質可以是丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或通常用于蛋白質純化的其它類型?？蛇x地，可以采用陽離子交換步驟。最后，可以使用采用疏水性RP-HPLC介質的一個或多個反相高效液相色譜(RP-HPLC)步驟以進一步純化抗體或其片段。以各種組合的一些或所有前述純化步驟是公知的，并且可以用于提供基本上均質的重組蛋白。

細菌培養(yǎng)物中產生的重組蛋白可以通過初始破碎宿主細胞、離心、從細胞團塊中提取(如果是不溶性多肽)、或從上清液中提取(如果是可溶性多肽)，然后是一個或多個濃縮、鹽析、離子交換、親和純化或體積排阻色譜步驟。微生物細胞可以通過任何方便的方法破碎，包括凍融循環(huán)、超聲處理、機械破碎或使用細胞裂解劑。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于產生能夠表達根據(jù)本發(fā)明的多肽的細胞的方法，包括用重組表達載體或根據(jù)本發(fā)明的核酸來遺傳改造細胞。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于產生根據(jù)本發(fā)明的抗體或其片段的方法，包括在足以促進所述多肽表達的條件下培養(yǎng)用表達載體轉化的宿主細胞，表達載體包含編碼所述抗體或其片段的核酸序列。然后根據(jù)使用的表達系統(tǒng)從培養(yǎng)基或細胞提取物中回收本發(fā)明的抗體或其片段。如本領域技術人員已知的，純化重組蛋白的方法將根據(jù)諸如所用的宿主細胞的類型和重組蛋白是否如上所述分泌到培養(yǎng)基中的因素而變化。

組合物

本發(fā)明提供了作為用于治療患者，優(yōu)選哺乳動物患者，最優(yōu)選患有醫(yī)學病癥，特別是IL-15相關疾病或病癥(例如自身免疫疾病和/或炎性病癥、惡性腫瘤、移植排斥、代謝病癥和/或由寄生性、病毒性或細菌性病原體引起的感染性疾病)的患者的組合物和方法的藥物或治療劑?？蛇x地，本發(fā)明提供了用于預防醫(yī)學病癥的方法，特別是IL-15相關疾病或病癥，例如自身免疫性疾病和/或炎性病癥、惡性腫瘤、移植排斥、代謝病癥和/或由寄生性、病毒性或細菌性病原體引起的感染性疾病。

在一個實施方案中，提供了包含以下的一種或多種的藥物組合物：(i)根據(jù)本發(fā)明的結合IL-15的抗體或其抗原結合片段，(ii)根據(jù)本發(fā)明的核酸，(iii)根據(jù)本發(fā)明的載體，和/或(iv)根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞，和至少一種藥學上可接受的載體。

本發(fā)明的藥物組合物可以包含本文所述任何形式的一種或多種結合IL-15的抗體或其抗原結合片段。

本發(fā)明的組合物還可包含一種或多種藥學上可接受的另外的成分，例如明礬、穩(wěn)定劑、抗微生物劑、緩沖劑、著色劑、調味劑、佐劑等。

本發(fā)明的化合物與常規(guī)使用的佐劑、載體、稀釋劑或賦形劑一起可以制成藥物組合物及其單位劑量的形式，并且這種形式可以以固體形式使用，例如片劑或填充膠囊、冷凍干燥形式或液體(例如溶液、懸浮液、乳液、酏劑或填充有該液體的膠囊)，全部用于口服使用，或用于胃腸外(包括皮下)使用的無菌注射溶液形式。這樣的藥物組合物和其單位劑型可以包含常規(guī)比例的成分，具有或不具有另外的活性化合物或成分，并且這種單位劑型可以含有與待使用的預期日劑量范圍相當?shù)娜魏魏线m的有效量的活性成分。

本發(fā)明的組合物可以是液體制劑，包括但不限于水性或油性懸浮液、溶液、乳液、糖漿和酏劑。適于口服給藥的液體形式可包括含有緩沖劑、懸浮劑和分散劑、著色劑、調味劑等的合適的水性或非水性媒介物。組合物還可以配制為干品，用于在使用前用水或其它合適的媒介物重構。這種液體制劑可以含有添加劑，包括但不限于懸浮劑、乳化劑、非水性媒介物和防腐劑。懸浮劑包括但不限于山梨糖醇漿、甲基纖維素、葡萄糖/糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠和氫化食用脂肪。乳化劑包括但不限于卵磷脂、脫水山梨糖醇單油酸酯和阿拉伯膠。非水性媒介物包括但不限于食用油、杏仁油、分餾的椰子油、油性酯、丙二醇和乙醇。防腐劑包括但不限于對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯和山梨酸。其它材料以及加工技術等在Remington's The Science and Practice of Pharmacy，第22版，2012，Pharmaceutical Press and the University of the Sciences，Philadelphia College of Pharmacy的第5部分中闡述，其通過引用并入本文。

本發(fā)明的固體組合物可以是以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式。例如，用于口服給藥的片劑和膠囊可以含有常規(guī)賦形劑，包括但不限于粘合劑、填充劑、潤滑劑、崩解劑和潤濕劑。粘合劑包括但不限于糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃蓍膠、淀粉粘液和聚乙烯吡咯烷酮。填充劑包括但不限于乳糖、糖、微晶纖維素、玉米淀粉、磷酸鈣和山梨醇。潤滑劑包括但不限于硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石、聚乙二醇和二氧化硅。崩解劑包括但不限于馬鈴薯淀粉和淀粉羥乙酸鈉。潤濕劑包括但不限于月桂基硫酸鈉。片劑可根據(jù)本領域熟知的方法包被。

可注射組合物通常基于可注射的無菌鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水或本領域已知的其它可注射載體。

本發(fā)明的組合物還可以配制為包含水性或非水性媒介物的透皮制劑，包括但不限于霜劑、軟膏、洗劑、糊劑、藥膏、貼劑或膜。

本發(fā)明的組合物也可以配制成用于腸胃外給藥，包括但不限于通過注射或連續(xù)輸注。用于注射的制劑可以是在油性或水性媒介物中的懸浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制劑，包括但不限于懸浮劑、穩(wěn)定劑和分散劑。組合物還可以以粉末形式提供，用于用合適的媒介物重建，包括但不限于無菌、無熱原的水。

本發(fā)明的組合物還可以配制成長效制劑，其可以通過植入或通過肌內注射給藥。組合物可以用合適的聚合物或疏水材料(例如在可接受的油中的乳液)、離子交換樹脂或作為微溶衍生物(例如微溶鹽)配制。

本發(fā)明的化合物還可以以緩釋形式或從緩釋藥物遞送系統(tǒng)給藥。代表性緩釋材料的描述也可以在Remington's Pharmaceutical Sciences中的并入材料中找到。

可注射制劑特別適于給藥根據(jù)本發(fā)明的組合物。

在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含如本文所述的結合IL-15的抗體或其抗原結合片段的成像組合物或診斷組合物。

根據(jù)本發(fā)明的成像組合物或診斷組合物可用于檢測與自身免疫性疾病和/或炎性病癥、惡性腫瘤、移植排斥、代謝病癥和/或由寄生性、病毒性或細菌性病原體引起的感染性疾病相關的升高的IL-15水平。

組合

根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的結合IL-15的抗體或其抗原結合片段可以單獨給藥或與用于預防和/或治療自身免疫性疾病和/或炎癥紊亂、惡性腫瘤、移植排斥、代謝狀況和/或由寄生性、病毒性或細菌性病原體引起的感染性疾病的助劑聯(lián)合給藥，例如包括生物制劑、小分子和疫苗的免疫調節(jié)藥物。

可選地，根據(jù)本發(fā)明的針對IL-15的抗體或其抗原結合片段可以與用于治療癌癥的助劑一起給藥或聯(lián)合給藥，例如抗癌藥物，例如細胞毒性藥物、酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼(Gleevec/Glivec)或吉非替尼(Iressa)，和治療性抗體，如曲妥珠單抗(Herceptin)或抗CD20抗體利妥昔單抗(Rituxan)。

本發(fā)明包括給藥針對IL-15的抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其片段在用于預防和/或治療IL-15相關的疾病或病癥的其它治療方案或助劑之前、同時或順序地以治療有效量給藥于個體，IL-15相關的疾病或病癥例如自身免疫疾病和/或炎性病癥、惡性腫瘤、移植排斥、代謝病癥和/或由寄生性、病毒性或細菌性病原體引起的感染性疾病。與所述助劑同時給藥的根據(jù)本發(fā)明的IL-15的抗體或其抗原結合片段可以以相同或不同的組合物和相同或不同的給藥途徑給藥。

在一個具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段可以與降低腸炎癥和/或保護腸粘膜和/或降低谷蛋白的免疫反應性和/或改變腸道菌群的化合物聯(lián)合給藥，以治療患有乳糜瀉的受試者。

在一個具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段可以與降低腸炎癥和/或保護腸粘膜和/或降低谷蛋白的免疫反應性和/或改變腸道菌群的化合物聯(lián)合給藥，以治療患有頑固性乳糜瀉的受試者。

給藥模式

本發(fā)明的組合物可以以任何方式給藥，包括但不限于口服、胃腸外、舌下、經皮、直腸、經粘膜、局部、經吸入、經頰或鼻內給藥或膀胱或其組合。

胃腸外給藥包括但不限于靜脈內、動脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、腦內和關節(jié)內。本發(fā)明的組合物還可以以植入物的形式給藥，其允許組合物的緩慢釋放以及緩慢控制的靜脈輸液。

在具體實施方案中，全身或局部給藥根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段。

在具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段通過皮下或靜脈內途徑給藥。

作為單個或多個劑量給予個體的劑量將根據(jù)多種因素而變化，包括藥代動力學性質、患者狀況和特征(性別、年齡、體重、健康、大小)、癥狀程度、同時進行的治療、治療頻率和所需的效果。

通常，藥學活性抗體的治療有效量為0.5mg/kg至高達50mg/kg體重劑量。如果方案是連續(xù)輸注，其可以在0.250mg/kg至13mg/kg體重的范圍內。

患者

在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的患者是患有IL-15相關的疾病或病癥的患者，例如自身免疫疾病和/或炎性病癥，包括類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、乳糜瀉(如頑固性乳糜瀉)、結節(jié)病、炎性腸病(例如潰瘍性結腸炎、克羅恩病)、丙型肝炎誘導的肝病、多發(fā)性硬化、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、硬化性膽管炎、膽道閉鎖、斑禿、移植排斥反應、中樞神經系統(tǒng)的炎性疾病和嗜酸性粒細胞性食管炎和代謝病癥(例如高代謝病癥)。

在具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的患者是患有乳糜瀉的患者。

在具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的患者是患有頑固性乳糜瀉的患者。

在具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的患者是患有嗜酸性粒細胞性食管炎的患者。

在具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的患者是患有自身免疫性肝炎的患者。

在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的患者是患有惡性腫瘤的患者，惡性腫瘤包括T-細胞白血病，例如皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)(例如蕈樣真菌病、Sezary綜合征)、顆粒淋巴細胞淋巴增生性病癥(LDGL)、大顆粒淋巴細胞性白血病和急性淋巴細胞性白血病(ALL)、前B細胞白血病、骨肉瘤、尤文肉瘤、橫紋肌肉瘤、黑色素瘤、小細胞肺癌、腎細胞癌、成膠質細胞瘤、成神經細胞瘤和間皮瘤。

在一個具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的患者是患有大顆粒淋巴細胞性白血病的患者。

在一個具體的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的患者是患有急性淋巴細胞性白血病的患者。

在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的患者是患有移植排斥的患者。

在具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的患者是患有由寄生性、病毒性或細菌性病原體引起的感染性疾病的患者。

在一個具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的患者是患有由漢坦病毒(Hantaan病毒)引起的傳染病的患者，例如具有腎病綜合征和/或漢坦病毒肺綜合征的漢坦病毒出血熱。

在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的患者是患有高代謝病癥的患者，包括鐮狀細胞病和癌癥相關的惡病質。

在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的患者是患有中樞神經系統(tǒng)的炎性疾病的患者。

在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的患者是患有淀粉樣蛋白相關病癥(例如阿爾茨海默氏病)的患者。

根據(jù)本發(fā)明的用途和方法

根據(jù)本發(fā)明的結合IL-15的抗體或其抗原結合片段、核酸、載體、宿主細胞、組合物用于診斷、預防或治療與升高的IL-15水平和/或升高的IL-15活性相關、由其引起或伴隨的疾病。

在一個實施方案中，提供了用作藥物的根據(jù)本發(fā)明的IL-15的抗體或其抗原結合片段。

另一個實施方案提供了根據(jù)本發(fā)明的抗體或其片段，其用于預防和/或治療IL-15相關疾病或病癥，例如自身免疫性疾病和/或炎性病癥，特別是類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、乳糜瀉(例如頑固性乳糜瀉)、結節(jié)病、炎性腸病(例如潰瘍性結腸炎、克羅恩病)、丙型肝炎誘導的肝病、多發(fā)性硬化、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、硬化性膽管炎、膽道閉鎖、斑禿、移植排斥反應、中樞神經系統(tǒng)的炎性疾病和嗜酸性粒細胞性食管炎。

另一個實施方案提供了用于預防和/或治療惡性腫瘤的根據(jù)本發(fā)明的抗體或其片段，特別是T細胞白血病(如皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)(例如蕈樣肉芽腫病、Sezary綜合征)、顆粒淋巴細胞的淋巴增殖性病癥(LDGL)、大顆粒淋巴細胞白血病和急性淋巴細胞性白血病(ALL))、前B細胞白血病、骨肉瘤、尤文肉瘤、橫紋肌肉瘤、黑色素瘤、小細胞肺癌、腎細胞癌、膠質母細胞瘤、成神經細胞瘤和間皮瘤。

另一個實施方案提供了根據(jù)本發(fā)明的抗體或其片段，其用于預防和/或治療移植排斥、代謝病癥(例如高代謝病癥)和/或由寄生性、病毒性或細菌性病原體引起的感染性疾病。

在一個實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段在制備用于預防和/或治療IL-15相關的疾病或病癥的藥物組合物中的用途，例如自身免疫疾病和/或炎性病癥，特別是類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、乳糜瀉(例如頑固性乳糜瀉)、結節(jié)病、炎性腸病(例如潰瘍性結腸炎、克羅恩病)、丙型肝炎誘導的肝病、多發(fā)性硬化、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、硬化性膽管炎、膽道閉鎖、斑禿、中樞神經系統(tǒng)的炎性疾病和嗜酸性粒細胞性食管炎。

在一個具體實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段在制備用于預防和/或治療乳糜瀉(特別是頑固性乳糜瀉)的藥物組合物中的用途。

在一個具體的實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段在制備用于預防和/或治療嗜酸性粒細胞性食管炎的藥物組合物中的用途。

在一個具體的實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段在制備用于預防和/或治療自身免疫性肝炎的藥物組合物中的用途。

在一個實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段在制備用于預防和/或治療惡性腫瘤的藥物組合物中的用途，特別是T細胞白血病(例如急性淋巴細胞性白血病、大顆粒淋巴細胞性白血病、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)(例如蕈樣真菌病、Sezary綜合征)和顆粒淋巴細胞的淋巴增生性病癥(LDGL))、前B細胞白血病、骨肉瘤、尤文肉瘤、橫紋肌肉瘤、小細胞肺癌、腎細胞癌、成膠質細胞瘤、成神經細胞瘤和/或間皮瘤。

在另一個實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段在制備用于預防和/或治療大顆粒淋巴細胞性白血病的藥物組合物中的用途。

在一個備選實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段在制備用于預防和/或治療急性淋巴細胞白血病的藥物組合物中的用途。

在一個具體實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段在制備用于預防和/或治療移植排斥、代謝病癥和/或由寄生性、病毒性或細菌性病原體引起的感染性疾病的藥物組合物中的用途。

在一個具體實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段用于制備用于預防和/或治療漢坦病毒感染的藥物組合物中的用途。

在一個具體實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段在制備用于預防和/或治療中樞神經系統(tǒng)的炎性疾病的藥物組合物中的用途。

在一個具體實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段在制備用于預防和/或治療阿爾茨海默病的藥物組合物中的用途。

在另一個實施方案中，提供了用于預防和/或治療IL-15相關的疾病或病癥的方法，例如自身免疫疾病和/或炎性病癥，特別是類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、乳糜瀉(特別是頑固性乳糜瀉)、結節(jié)病、炎性腸病(例如潰瘍性結腸炎、克羅恩病)、丙型肝炎誘導的肝臟疾病、多發(fā)性硬化、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、硬化性膽管炎、膽道閉鎖、斑禿、中樞神經系統(tǒng)的炎性疾病和嗜酸性粒細胞性食管炎，包括向有需要的受試者給藥治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段。

在一個具體的實施方案中，提供了預防和/或治療乳糜瀉的方法，包括向有需要的受試者給藥治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段。

在可選實施方案中，提供了預防和/或治療惡性腫瘤的方法，特別是T細胞白血病(例如急性淋巴細胞性白血病、大顆粒淋巴細胞性白血病、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)(例如蕈樣真菌病、Sezary綜合征)和顆粒淋巴細胞的淋巴增殖性疾病(LDGL))、前B細胞白血病、骨肉瘤、尤文肉瘤、橫紋肌肉瘤、黑色素瘤、小細胞肺癌、腎細胞癌、膠質母細胞瘤、神經母細胞瘤和/或間皮瘤，包括向有需要的受試者給藥治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段。

在一個具體實施方案中，提供了預防和/或治療大顆粒淋巴細胞白血病的方法，包括向有需要的受試者給藥治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段。

在另一個實施方案中，提供了用于預防和/或治療移植排斥、代謝病癥和/或由寄生性、病毒性或細菌性病原體引起的感染性疾病的方法，包括向有需要的受試者給藥治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段。

在一個可選實施方案中，提供了檢測生物樣品中的IL-15的方法，包括使來自受試者的生物樣品與根據(jù)本發(fā)明的IL-15抗體或其抗原結合片段接觸。

如本文所用，“生物樣品”是指從受試者獲得的細胞、組織樣品或細胞組分(例如細胞膜或細胞組分)，特別是來自疑似或患有自身免疫疾病和/或炎性病癥、惡性腫瘤、移植排斥、代謝病癥和/或由寄生性、病毒性或細菌性病原體引起的感染性疾病、或處于發(fā)展此類病癥的高風險中的受試者。

生物樣品的實例包括血液、血清、血漿、腦脊液、滑液和包括從所述組織分離的細胞的組織樣品。組織樣品包括福爾馬林固定或冷凍的組織切片。

可以使用用于檢測和分析IL-15的任何合適的方法，包括本領域已知的診斷測定技術，例如競爭性結合測定、直接或間接夾心測定和在非均相或均相中進行的免疫沉淀測定。

在具體實施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測生物樣品中IL-15蛋白的存在和/或濃度的離體方法，包括以下步驟：

(i)提供來自受試者的生物樣品，

(ii)在足以通過抗原抗體相互作用將存在于所述生物樣品中的IL-15蛋白與所述至少一種抗體或其片段結合的條件下，使所述生物樣品與根據(jù)本發(fā)明的至少一種抗體或其抗原結合片段反應；和

(iii)檢測與步驟(ii)中形成的抗原-抗體復合物的水平成比例的信號，

其中所述信號的強度與生物樣品中的IL-15蛋白的濃度相關。

更具體地，提供了預后或診斷與來自受試者的生物樣品的升高的IL-15水平相關的自身免疫性疾病和/或炎性病癥、惡性腫瘤、移植排斥、代謝病癥和/或由寄生性、病毒性或細菌性病原體引起的感染性疾病的離體方法，包括以下步驟：

(a)提供來自受試者的生物樣品；

(b)使所述生物樣品與固體基質接觸，其中根據(jù)本發(fā)明的至少一種抗體或其片段結合至固體基質，其中在足以將存在于所述生物流體樣品中的II-15蛋白通過抗原-抗體相互作用結合到所述至少一種抗體或其片段的條件下進行所述接觸；

(c)從所述固體基質的表面除去任何未結合的IL-15蛋白；

(d)檢測與結合到所述固體基質的抗原-抗體復合物的水平成比例的信號，

(e)將在步驟(d)中檢測的信號水平與在相同條件下用陰性對照檢測的信號水平進行比較，

其中在受試者樣品中檢測到的高于陰性對照中檢測到的信號水平的信號水平指示與自身免疫性疾病和/或炎性病癥、惡性腫瘤、移植排斥、代謝病癥和/或由寄生性、病毒性或細菌性病原體引起的感染性疾病相關的升高的IL-15水平。

試劑盒

本發(fā)明的一個方面涉及試劑盒，其包含根據(jù)本發(fā)明的至少一種抗體或其抗原結合片段、和/或編碼所述抗體或其片段的至少一種核酸、和/或包含所述核酸的至少一種重組載體、和/或根據(jù)本發(fā)明的至少一種宿主細胞、以及任選的說明材料。

在具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包含待偶聯(lián)或已偶聯(lián)至固體基質的根據(jù)本發(fā)明的至少一種抗體或其抗原結合片段。

適合于本發(fā)明的固體基質的實例包括適合于進行根據(jù)本發(fā)明的免疫測定或方法的任何固相支持物，例如由以下材料形成或涂覆有玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、硝化纖維素、石英、陶瓷、葡聚糖或其他材料的珠子、微粒、納米顆粒、管、織物或板、膜、載玻片、孔。例如，固體基質是微量滴定孔的形式，例如96孔微量滴定板。

根據(jù)本發(fā)明的抗體或其片段在根據(jù)本發(fā)明的試劑盒中的固體基質上的固定可以通過吸附或化學偶聯(lián)到固相支持物上來進行?？梢允褂帽绢I域中已知的用于將蛋白質或肽固定至固體支持物的任何方法。根據(jù)本發(fā)明的抗體或其片段可以通過諸如通過酰胺或酯鍵的共價結合或吸附的技術與固體基質共價或非共價結合?？梢允褂媒Y合對(例如生物素和抗生物素蛋白或抗體和抗原)結合肽。在肽固定到固體基質上之后，固體基質可以用封閉溶液(含有封閉蛋白，如牛血清白蛋白)孵育，以減少測試樣品中抗體對支持物表面的非特異性吸附。根據(jù)一個方面，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其片段可以直接在本發(fā)明的試劑盒的固體基質上合成。

根據(jù)一個實施方案，當試劑盒包含根據(jù)本發(fā)明的至少一種抗體或其片段或其組合以用于偶聯(lián)到作為固相支持物的固體基質時，試劑盒還任選地包含偶聯(lián)試劑和/或固體基質，用于進行免疫測定。

根據(jù)另一個實施方案，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒還包含至少一種沖洗試劑，用于在檢測之前洗滌未結合的材料，以避免背景噪聲檢測。典型的沖洗試劑包括本領域已知的標準緩沖液。

本文引用的參考文獻通過引用整體并入本文。本發(fā)明的范圍不限于本文描述的具體實施方案，其旨在作為本發(fā)明的個別方面的單一說明，并且功能上等同的方法和組分在本發(fā)明的范圍內。實際上，除了本文所示和所述的那些之外，本發(fā)明的各種修改對于本領域技術人員來說從前面的描述和附圖將變得顯而易見。這樣的修改旨在落入所附權利要求的范圍內。

已經描述了本發(fā)明，通過說明而非限制的方式給出以下實例。

實例

實例1.根據(jù)本發(fā)明的抗IL-15抗體的產生和分離

1.小鼠B-E29的產生和測序

根據(jù)本發(fā)明的抗體衍生自也在Bernard等人，2004，同上(在本文中稱為比較抗體1)中描述的市售的小鼠B-E29抗體。簡言之，對人IL-15特異性的小鼠單克隆抗體最初通過用在大腸桿菌中制備的重組人IL-15(Peprotech 200-15)免疫BALB/c小鼠產生。將來自免疫小鼠的脾與X6.3.AG.8653小鼠骨髓瘤細胞系融合并且使用常規(guī)技術產生雜交瘤。使用ELISA技術篩選雜交瘤上清液中IL-15結合抗體的存在，隨后進行克隆稀釋和同種型測定。使用該方法選擇IgG1(重鏈)κ(輕鏈)同種型的小鼠抗IL-15單克隆抗體B-E29以及其它抗IL-15抗體。然而，當測定用重組IL-15刺激的Kit 225T細胞的增殖的抑制時，只有B-E29抗體能夠阻斷這種活性，因此B-E29中和IL-15的生物活性，而其他抗IL-15抗體不能(數(shù)據(jù)未示出)。

使用標準方案對小鼠B-E29抗體的重鏈的可變結構域和輕鏈的可變結構域進行測序。簡言之，使用常規(guī)RNA提取和純化方案從B-E29雜交瘤細胞沉淀提取信使RNA(mRNA)。通過用寡(dT)引物逆轉錄從RNA產生cDNA。通過PCR反應擴增單克隆抗體DNA的VH和VL區(qū)。將VH和VL產物克隆到Invitrogen測序載體pCR2.1中并轉化到TOP10細胞中，并通過PCR篩選陽性轉化體。挑取選擇的菌落并通過測序分析。小鼠B-E29抗體的重鏈(VH)的可變結構域的氨基酸序列提供為SEQ ID NO：32。小鼠B-E29抗體的輕κ鏈(VL)的可變結構域的氨基酸序列提供為SEQ ID NO：36。

2.衍生自小鼠B-E29的抗IL-15抗體的人源化

使用來自IMGT(免疫球蛋白或抗體的國際免疫遺傳信息系統(tǒng))和Kabat的抗體編號系統(tǒng)，鑒定了B-E29小鼠抗體的構架和CDR。使用BLAST搜索算法來搜索人IgG序列的在線數(shù)據(jù)庫以與小鼠結構域進行比較，并且人可變結構域構架選自前100個BLAST結果。這些基于構架同源性、維持關鍵構架殘基和規(guī)范環(huán)結構的組合而減少。構建了幾種人源化、嵌合和組合抗體，其中一些在位于小鼠VH區(qū)的N末端部分中的不尋常殘基上具有突變，目的是選擇“最佳”人VH和VL鏈以形成這樣的抗體：與小鼠B-E29抗體(比較抗體1)相比，保持或增加它們與IL-15的結合能力以及保持或增加其產生的效率。

圖1(A)中示出了小鼠B-E29的重鏈可變結構域的不同人源化和嵌合變體的氨基酸序列的比對。

圖1(B)中示出了小鼠B-E29的輕鏈可變結構域的不同人源化和嵌合變體的氨基酸序列的比對。

每個上述變體的VH結構域與SEQ ID NO：30的人IgG1同種型恒定結構域(同種異型G1m3)序列在框內合成。

每個上述變體的VL結構域與SEQ ID NO：31的人Igκ同種型恒定結構域(同種異型Km3)序列在框內合成。

將重鏈和輕鏈編碼序列克隆到pVITRO-DHFR3載體骨架中用于抗體產生。將質粒共轉染到懸浮適應的CHO(中國倉鼠卵巢)細胞(CHO-S細胞，Invitrogen，UK)中。7天后，收獲培養(yǎng)物上清液，并使用Amersham Biosciences AKTA色譜系統(tǒng)和HiTrap Protein A柱純化抗體。

組合cVH3：cVK1和cVH4：cVK1未導致足夠的抗體產生以進一步測試。在ELISA測定中，組合cVH1：cVK1、hVH1：cVK1、cVH1：hVK1顯示與人IL-15類似的結合，優(yōu)于用hVH1：hVK2和cVH1：hVK2觀察到的結果(數(shù)據(jù)未示出)。

這些結果證明，在所測試的變體中，hVH1和hVK1是形成可以有效產生并結合IL-15的抗體的良好候選物。因此，它們被用作進一步優(yōu)化的起始材料。

3.人源化抗IL-15抗體的優(yōu)化

優(yōu)化包括改變hVH1(本文也稱為“huVH1”)和hVK1(本文也稱為“huVL1”)的CDR和/或構架內的一些氨基酸或氨基酸基序，其可能導致抗體的化學不穩(wěn)定性或聚集，以及與小鼠B-E29抗體(比較抗體1)相比保持或增加其產生的效率。該策略允許產生包含上表1中所示的VH/VL區(qū)的huVH1/huVL1抗體的變體。

表1中所示的每個變體的VH結構域與SEQ ID NO：30的人IgG1同種型恒定結構域(同種異型G1m3)序列在框內合成。

表1中所示的每個變體的VL結構域與SEQ ID NO：31的人Igκ同種型恒定結構域(同種異型Km3)序列在框內合成。

在瞬時CHO系統(tǒng)中產生重組抗體，并進一步作為培養(yǎng)上清液或在通過蛋白-A FPLC柱純化后進行測試。

實例2.根據(jù)本發(fā)明的各種抗IL-15抗體對IL-15的結合效力

在ELISA測定中測試了根據(jù)本發(fā)明的一些抗體結合板結合的重組人或猴IL-15的能力。在相同的表達系統(tǒng)中產生現(xiàn)有技術的完全人抗體(WO 03/017935中描述的146B7，本文稱為比較抗體2)，純化并用作對照。

Maxisorp板在碳酸鹽包被緩沖液中在37℃下以100ng/孔的重組人IL-15(Prospec目錄號CYT230)或恒河猴IL-15(MyBiosource目錄號MBS948894)包被2小時。由于恒河猴和食蟹猴IL-15的公開序列是相同的，這種重組IL-15蛋白被稱為獼猴IL-15。測試的人IL-15重組蛋白具有與SEQ ID NO：1中提供的序列相同的序列，但是在N-末端位置處具有另外的甲硫氨酸，這通常用于在大腸桿菌中表達重組蛋白。在酵母中產生測試的重組獼猴IL-15，并且其具有與SEQ ID NO：4中提供的序列相同的序列，但具有另外的N-末端His標簽。

然后將板用2％正常山羊血清在37℃下封閉30分鐘，并用PBS-Tween(PBS中的0.05％Tween-20，v/v)洗滌6次。將測試抗體以PBS-Tween中的各種稀釋度一式三份加入板中，并將板在室溫下溫和搖動孵育2小時。然后將板用PBS-Tween洗滌6次，并將與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的適當稀釋度的山羊抗人IgG抗體(Millipore目錄號AP309P)加入板中，并在室溫下?lián)u動1小時。然后將板用PBS-Tween洗滌6次并與TMB底物孵育。通過加入1M H₂SO₄終止反應并在450nm讀數(shù)。使用Graphpad Prism軟件繪制并分析吸光度對濃度的劑量反應曲線，以確定半數(shù)最大結合濃度(BC₅₀)。以摩爾濃度表示的BC₅₀值由對于所有抗體使用150kDa分子量值的ng/ml濃度外推。

表2中顯示了對于B-E29的幾種人源化變體以及用作對照的完全人146B7抗體獲得的代表性BC₅₀值。

表2

NT:未測試

如表2所示，雖然根據(jù)本發(fā)明的一些抗體變體具有彼此相當?shù)慕Y合活性，但其它抗體變體顯示出與人IL-15的改善的結合(例如huB-E29-10和huB-E29-24)。圖2A示出代表性人源化B-E29變體(huB-E29-1)不僅顯示出比146B7抗體更好的結合人IL-15的效力，而且顯示更高的最大信號，表明結合IL-15的功效改善。這種改善的結合人IL-15的能力在實例3、表3中進一步證實。

在測試與獼猴IL-15的結合的情況下，結合人IL-15的根據(jù)本發(fā)明的所有抗體變體也以略高的效力結合獼猴IL-15。

實例3.人IL-15與一些根據(jù)本發(fā)明的抗IL-15抗體的結合動力學和親和力

通過表面等離子體共振(SPR)測定根據(jù)本發(fā)明的三種人源化B-E29抗體變體對重組人IL-15的結合速率(ka)、解離速率(kd)和平衡解離常數(shù)(K_D)。

使用標準胺偶聯(lián)將人IL-15(Prospec目錄號CYT230)固定在CM5芯片(GE Healthcare)上，并將120μl磷酸鹽緩沖鹽水中的各種濃度的抗體以40μl/ml的流速注射。在Biacore 3000裝置(GE Healthcare)上以300秒的解離期分析結合動力學。減去參考信號和0nM抗體濃度信號，并使用1:1(Langmuir)結合模型擬合數(shù)據(jù)。

表3

RU:相對單位

盡管所有比較的人源化B-E29抗體的結合速率(ka，結合速率)是相似的，但huB-E29-2的解離速率(kd，解離速率)更慢，導致更低的平衡解離常數(shù)K_D(表3)。146B7抗體也顯示出低的K_D，類似于所報道的(Villadsen等人，2003，J.Clin.Invest.112：1571-1580)。然而，通過146B7在人IL-15包被的芯片上的結合給出的最大(Rmax)信號比用三種人源化B-E29抗體變體觀察到的最大(Rmax)信號低得多。該結果類似于實例2中通過ELISA觀察到的結果，并表明與146B7抗體相比，這三種人源化B-E29抗體變體具有改善的與人IL-15結合的能力。

實例4.根據(jù)本發(fā)明的一些抗IL-15抗體的物種特異性

在ELISA測定中測試根據(jù)本發(fā)明的抗體結合板結合的重組小鼠或大鼠IL-15的能力。

Maxisorp板在碳酸鹽包被緩沖液中以100ng/孔用重組小鼠IL-15(R&D Systems目錄號447-ML)或大鼠IL-15(Sigma目錄號SRP4172)在37℃下包被2小時。測試的IL-15重組蛋白具有與SEQ ID NO：2(小鼠IL-15)和SEQ ID NO：3(大鼠IL-15)中提供的序列相同的序列，但在N-末端位置具有額外的甲硫氨酸，通常用于在大腸桿菌中表達重組蛋白。

然后將板用2％正常山羊血清在37℃下封閉30分鐘，并用PBS-Tween(PBS中的0.05％Tween-20，v/v)洗滌6次。將測試抗體以PBS-Tween中的各種稀釋度一式三份加入板中，并將板在室溫下溫和搖動孵育2小時。作為陽性對照，在相同濃度下測試兔抗小鼠IL-15(Acris目錄號AP01124PU-S)或兔抗大鼠IL-15(Biovision目錄號5172)抗體。然后將板用PBS-Tween洗滌6次，并加入適當稀釋的用于人源化抗體的HRP-綴合的山羊抗人IgG抗體(Millipore目錄號AP309P)或用于陽性對照的山羊抗兔IgG抗體(Sigma目錄號.A4416)，并將板在室溫下?lián)u動1小時。然后將板用PBS-Tween洗滌6次并用TMB底物孵育。通過加入1M H₂SO₄終止反應并在450nm讀數(shù)。使用Graphpad Prism軟件繪制吸光度對濃度的劑量反應曲線。

如圖2B和圖2C所示，B-E29的測試的人源化變體在測試的濃度下都沒有顯示與小鼠或大鼠IL-15的顯著結合，而用陽性對照觀察到良好的結合。

實例5.根據(jù)本發(fā)明的一些抗IL-15抗體的選擇性

由于IL-2是序列同源性最接近IL-15的細胞因子，并且IL-2和IL-15共有兩個共同的受體鏈(IL-2/IL-15Rβ鏈和共同的γc鏈)，通過ELIS評估本發(fā)明的抗IL-15抗體與IL-2的結合。

Maxisorp板在碳酸鹽包被緩沖液中以100ng/孔的SEQ ID NO：38的重組人IL-2(R&D Systems目錄號202-IL-010)在37℃包被2小時。然后將板用2％正常山羊血清在37℃下封閉30分鐘，并用PBS-Tween(PBS中的0.05％Tween-20，v/v)洗滌4次。將測試抗體或陽性對照生物素化的抗體(抗IL-2Novus Bio目錄號NBP1-43491)以PBS-Tween中的5μg/ml一式兩份加入到板中，將板在室溫下溫和搖動2小時。然后將板用PBS-Tween洗滌4次，并且將適當稀釋的綴合有辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗人IgG抗體(Millipore目錄號AP309P)(用于測試抗體)或鏈霉親和素-HRP(用于陽性對照抗體)加入到板中并在室溫下?lián)u動1小時。然后將板用PBS-Tween洗滌4次，并用TMB(3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺)底物孵育。通過加入1M H₂SO₄終止反應并在450nm讀數(shù)。

圖3顯示，在測試的5μg/ml濃度下，根據(jù)本發(fā)明的測試的抗IL-15抗體都不結合人IL-2，而陽性對照抗體顯示強結合。

實例6.通過根據(jù)本發(fā)明的一些抗IL-15抗體抑制細胞系中可溶性IL-15誘導的增殖/存活

測試根據(jù)本發(fā)明的抗體的抑制IL-15誘導的Kit 225或M-07e細胞增殖/存活的能力(Finch等人，2011，同上)。

Kit 225細胞系從患有T細胞慢性淋巴細胞白血病的患者建立(Hori等人，1987，Blood，70：1069-1072)。Kit 225細胞表達IL-15受體的3條鏈(IL-15Rα、IL-15Rβ和IL-15Rγ)(Mortier等人，2006，J.Biol.Chem.,281：1612-1619)。M-07e細胞系從具有急性巨核細胞白血病的6個月大的女孩的外周血建立(Brizzi等，1990，Br J Haematol.，76：203-239)。M-07e細胞僅表達IL-15受體的IL-15Rβ和IL-15Rγ鏈(Meazza等人，1998，Int.J.Cancer，78：189-95)。

培養(yǎng)Kit 225細胞(Hori等人，1987，Blood，70(4)：1069-1072)和M-07e細胞(Leibniz-Institute DSMZ)，并保持在補充有10mM Hepes、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、10％熱滅活的胎牛血清(FBS，PAA)和200U/ml的SEQ ID NO:38的人IL-2(R&D Systems目錄號202-IL)的RPMI 1640培養(yǎng)基中。在實驗前一天，將細胞在不含IL-2的相同培養(yǎng)基中饑餓24小時。之后，在測試抗體以及重組人IL-15(R&D systems目錄號247-IL)或重組猴IL-15(My Biosource目錄號MBS948894)的各種稀釋度的存在下，在96孔板中每孔加入5×10⁴個細胞一式三份，每孔的終濃度1ng/ml，總體積為100μl培養(yǎng)基。如上所述，因為恒河猴和食蟹猴IL-15的公開序列是相同的，這種重組IL-15蛋白被稱為獼猴IL-15。

將細胞培養(yǎng)物在37℃、5％CO₂下保持48小時，然后向每個孔中分配100μl的Titerglo溶液(其測量ATP消耗，Promega)，并通過劇烈移液混合內容物。在讀數(shù)前，將板在室溫下孵育15-20分鐘。在平板讀數(shù)器中讀取發(fā)光信號作為細胞存活的測量。使用Graphpad Prism軟件，繪制針對抗體濃度的校正值，并使用對數(shù)抑制劑對響應(三個參數(shù))確定半數(shù)最大抑制濃度(IC₅₀)。以摩爾濃度表示的IC₅₀值用ng/ml的濃度外推，對于所有抗體使用150kDa分子量值。

表4

NT:未測試

如表4所示，測試的三種人源化B-E29抗體變體與146B7能夠抑制M-07e和Kit 225細胞的IL-15誘導的增殖/存活。人源化huB-E29-2在效力上優(yōu)于M-07e細胞以及Kit 225細胞中的所有其他測試抗體。

實例7.通過根據(jù)本發(fā)明的一些抗IL-15抗體抑制細胞系中的反式IL-15誘導的增殖/存活

測試了根據(jù)本發(fā)明的一些抗體抑制人IL-15誘導的M-07e細胞(僅表達IL-15Rβγ)增殖/存活的能力，其中在結合固定在塑料上的IL-15Rα-Fc構建物之后呈遞IL-15。該實驗設置模擬文獻中描述的IL-15的反式呈遞，并且對于IL-15的生物學似乎很重要(Stonier等人，2010，同上)。

將來自96孔板的孔在37℃下在100μlPBS中用1μg重組人IL-15Rα-Fc嵌合體(R&D Systems目錄號7194-IR-050)包被2小時。吸去孔的內容物，然后每孔加入150μl補充有10mM Hepes、100IU/ml青霉素、100μg ml鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、10％熱滅活的胎牛血清(FBS，PAA)的RPMI 1640培養(yǎng)基(稱為培養(yǎng)基)，并將板在37℃孵育30分鐘。吸去孔中的內容物，然后加入100μl的300ng/ml的人IL-15(R&D Systems)溶液，將板在37℃下孵育1小時。吸出孔的內容物，然后使用200μl培養(yǎng)基兩次以洗滌未結合的IL-15。將各種濃度的測試抗體一式三份加入每個孔中，然后加入5×10⁴M-07e細胞(在不含細胞因子的培養(yǎng)基中過夜)。適當?shù)卦O計對照孔以確保在不存在IL-15Rα-Fc的情況下IL-15在該系統(tǒng)中不誘導增殖/存活，并且在不存在IL-15時IL-15Rα-Fc不誘導增殖/存活。

將細胞培養(yǎng)物在37℃、5％CO₂下保持48小時，然后向每個孔中分配100μl的Titerglo溶液(其測量ATP消耗，Promega)，并通過劇烈移液混合內容物。在讀數(shù)前，將板在室溫下孵育15-20分鐘。在平板讀數(shù)器中讀取發(fā)光信號作為細胞存活的測量。使用Graphpad Prism軟件，繪制針對抗體濃度的校正值，并使用對數(shù)抑制劑對響應(三個參數(shù))測定半數(shù)最大抑制濃度(IC₅₀)。以摩爾濃度表示的IC₅₀值用ng/ml的濃度外推，對于所有抗體使用150kDa分子量值。

表5

如表5所示，所有測試的人源化B-E29抗體變體以相似的效力抑制人IL-15向M-07e細胞的反式呈遞。

實例8：根據(jù)本發(fā)明的一些抗IL-15抗體對人IL-15與IL-15Rα的結合沒有干擾

根據(jù)Finch等人描述的方法測試根據(jù)本發(fā)明的抗體抑制生物素化的人IL-15與板結合的IL-15-Rα-Fc重組構建體(R&D Systems)結合的能力。(Finch等人，2011，同上)。

通過在4℃下孵育16小時，將濃度為600pM的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的白介素-15Rα-Fc包被在MaxiSorp 96孔板上。用PBS洗滌孔并用含有3％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS封閉2小時，并再次用PBS洗滌。將抗體和對照(包括已知阻斷IL-15結合IL-15Rα的抗體，R&D Systems目錄號NF150)在含有0.1％(w/v)BSA的PBS中稀釋，并加入到IL-15Rα-Fc包被的測定孔。加入終濃度為100pM的生物素化的人IL-15(R&D Systems目錄號NF150)，將測定板孵育1小時。然后將板用含有0.1％(v/v)Tween 20的PBS洗滌三次，隨后加入最佳稀釋的鏈霉親和素-過氧化物酶。孵育30分鐘后，將板用含有0.1％(v/v)Tween 20的PBS洗滌7次，加入過氧化物酶底物。一旦反應完成并用H₂SO₄終止，在450nm發(fā)射波長下測量吸光度。

圖4顯示陽性對照抗體能夠以劑量依賴方式抑制生物素化的人IL-15與IL-15-Rα-Fc的結合，而抗IL-15抗體huB-E29-2、huB-E29-10和huB-E29-24不能，直到150μg ml的最高測試劑量。相反，基于Bernard等人，2004同上的觀察，單克隆小鼠抗IL-15抗體B-E29(比較抗體1)防止IL-15結合IL-15Rα。

實例9：根據(jù)本發(fā)明的一些抗IL-15抗體的人IL-15的體內中和

小鼠細胞響應人IL-15，這允許測試根據(jù)本發(fā)明的抗IL-15抗體的IL-15的體內功能抑制，即使那些抗體不識別小鼠IL-15，如實例4所示。注入小鼠的白介素-15可以誘導脾臟中各種淋巴細胞亞群(如自然殺傷(NK)細胞)的增殖和積累。然而，IL-15本身具有較差的活性，可能是由于其非常短的半衰期，并且與IL-15Rα結合的IL-15的穩(wěn)定復合物在體內更有效。

測試本發(fā)明的示例性抗體抑制C57BL/6雄性小鼠的脾臟中IL-15/IL-15Rα-Fc復合物誘導的NK細胞積累的能力(Finch等人，2011，同上)。在連續(xù)三天中，用1μg人IL-15(Prospec)和3.6μg人IL-15Rα-Fc(R&D Systems)的混合物注射5只小鼠的組，在實驗的第一天和第二天，分別用100μg和62μg的測試抗體和對照注射。最后一次注射后一天，收獲脾臟，計數(shù)脾細胞，通過流式細胞術分析NK細胞，并定義為CD45⁺NK1.1⁺CD3^-細胞。

如圖5所示，注射IL-15/IL-15Rα-Fc復合物在小鼠脾臟中誘導強烈的NK細胞積累，其可以通過用本發(fā)明的示例性huB-E29-2、huB-E29-10和huB-E29-24抗體而不是對照人IgG1同種型抗體處理而被完全抑制。

實例10：根據(jù)本發(fā)明的抗IL-15抗體的表位作圖

通過使用化學連接的支架上的肽(CLIPS)技術分析所述抗體與設計為表示IL-15的線性表位和不連續(xù)表位的結構化肽的庫的結合，進行本發(fā)明的抗IL-15抗體的表位作圖(Pepscan Presto Bv，Lelystad，The Netherlands)。CLIPS技術(Timmermann等人，2007，J.Mol.Recognit.，20,283-99)允許將肽結構化成單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)、片狀折疊、螺旋狀折疊及其組合。結構肽固定在陣列上。在基于PEPSCAN的陣列ELISA中測試抗體與每種合成肽的結合。使用電荷耦合器件照相機測量每個肽的信號，定量并從處理的整個陣列的結果確定哪些肽被最好地識別。肽內的氨基酸取代可以允許確定更關鍵的結合殘基。

使用該技術發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗體huB-E29-2、huB-E29-10和huB-E29-24全部優(yōu)先結合到含有序列⁶¹DTVENLIILANN⁷²(SEQ ID NO：43)的肽段的線性和限制性肽。該觀察結果與對比較抗體1B-E29(Bernard等，2004，同上)報道的相似。使用單個氨基酸取代，發(fā)現(xiàn)對于本發(fā)明的抗體huB-E29-2、huB-E29-10和huB-E29-24抗體與IL-15的結合最重要的殘基是D61、E64、I68和N71。

比較抗體1的特征在于分別如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40所示的VL和VH。根據(jù)Bernard et al.，2004，supra，B-E29通過結合至L66和I67殘基影響IL-15與IL-15Rα的結合，這對于本發(fā)明的抗體huB-E29-2、huB-E29-10和huB-E29-24的結合并不關鍵。另一方面，仍然根據(jù)Bernard等人，殘基E64、N65和I68對于通過B-E29防止IL-15與IL-15Rβ的結合是重要的，并且這三個殘基中的兩個(E64和I68)被發(fā)現(xiàn)對huB-E29-2、huB-E29-10和huB-E29-24抗體結合IL-15是關鍵的。防止IL-15結合IL-15Rβ鏈對于阻斷IL-15信號傳導是重要的。因此，雖然huB-E29-2、huB-E29-10和huB-E29-24抗體與原始B-E29抗體共享重疊表位，但是結構差異可以解釋不同的作用模式，其是防止IL-15結合IL-15Rα的能力的喪失，如本申請(實例8)所示，同時保留阻斷IL-15介導的信號傳導的能力。

還觀察到，與huB-E29-2抗體相比，本發(fā)明的抗體huB-E29-10和huB-E29-24對SEQ ID NO：43的肽段內的取代顯示較低的耐受性，這意味著信號損失更頻繁，這可能與它們對IL-15的較低親和力有關，如本申請(實例3)所示。

最后，比較抗體2 146B7在所測試的任何肽陣列上沒有顯示超越背景的任何可靠的結合，因此可能識別IL-15上的復合/不連續(xù)表位(Villadsen等，2003，J.Clin.Invest.，112：1571-1580)。氨基酸誘變，報道IL-15的殘基D8和Q108對于146B7的結合是必需的，沒有對該抗體識別的表位的進一步描述。在當前實例中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)符合該發(fā)現(xiàn)，表明146B7的非線性表位明顯不同于本發(fā)明的抗體huB-E29-2、huB-E29-10和huB-E29-24所識別的。

使用結晶學(Lowe等人，2010，J.Mol.Biol.，406，第160-175頁)測定由DISC0280抗IL-15抗體(比較抗體3)識別的表位。DISC0280抗體的特征在于分別如SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42所示的VL CDR3和VH CDR3。如從比較抗體B-E29和DISC0280競爭IL-15結合的事實所預期的(Finch等人，2010，J Mol Biol.，406(1)，第160-175頁)，在DISC0280表位和由本發(fā)明的huB-E29-2、huB-E29-10和huB-E29-24抗體識別的表位之間發(fā)現(xiàn)類似的殘基(即E64和N71)。然而，描述了具有IL-15殘基(K41、E46、Q48、L52、E53和E89)的DISC0280的其它氫鍵。因此，DISC0280和本發(fā)明的抗體huB-E29-2、huB-E29-10和huB-E29-24具有重疊但不同的表位。此外，發(fā)現(xiàn)對于huB-E29-2、huB-E29-10和huB-E29-24與IL-15的結合最重要的兩個殘基不是DISC0280表位的一部分：D61和I68。

實例11：根據(jù)本發(fā)明的抗IL-15抗體在來自頑固性乳糜瀉患者的細胞系中的效果

在體外評估本發(fā)明的抗體huB-E29-2和比較抗體146B7對預防由重組人IL-15誘導的II型頑固性乳糜瀉(RCD)患者原代上皮內淋巴細胞(IEL)細胞系的細胞凋亡和活化的影響。通過用Annexin V和碘化丙啶(PI)染色細胞并通過流式細胞術測量來分析凋亡細胞的百分比。也通過流式細胞術技術，磷酸化STAT5蛋白(pSTAT5)的表達用于測量IL-15對原代IEL細胞系的活化及其通過抗IL-15抗體的抑制。

本發(fā)明的人源化抗IL-15抗體huB-E29-2在體外有效抑制來自三個不同患者的II型RCD原代IEL細胞系中IL-15誘導的細胞凋亡的預防(圖6)，對于測試的三種細胞系之一(HAM_RAC)計算的半數(shù)最大抑制濃度(IC₅₀)為2.36nM。當以計算的濃度使用以在HAM_RAC細胞系中產生80％凋亡抑制時，該抗體還在所有測試的II型RCD患者原代IEL細胞系中抑制IL-15誘導的STAT5磷酸化。最后，在相同的濃度下，huB-E29-2比完全人抗IL-15抗體146B7更有效地抑制II型RCD患者原代IEL細胞中的IL-15誘導的細胞凋亡的預防和STAT5磷酸化(圖6)。

實例12：根據(jù)本發(fā)明的抗IL-15抗體在作為用于難治性乳糜瀉的模型的人IL-15的轉基因小鼠中的效果

在T3b(腸細胞特異性啟動子(IL-15TgE小鼠；Ohta等人，2002，J.Immunol.169(1)，460-468)的控制下過表達人IL-15的轉基因小鼠顯示異常和大規(guī)模積累的上皮內淋巴細胞(IEL)。已經假設該模型概括了人類頑固性乳糜瀉的一些特征(Malamut等人，2010，同上)?？笽L-15抗體AMG 714具有與本文所述的146B7抗體相同的序列并且以前被鑒定為HuMaxIL-15(Villadsen等，2003，J Clin Invest，112(10)：1571-80；Lebrec等al，2013，J Immunol.，191(11)：5551-8)，當對這些小鼠給藥時，通過促進IEL凋亡，能夠逆轉IEL的積累(Malamut等人，2010，同上)。

將本發(fā)明的抗IL-15抗體huB-E29-2或對照同種型抗體IgG1以100μg的劑量每周兩次腹膜內給藥于T3b-hIL-15轉基因小鼠組。在兩周治療后，計數(shù)CD3⁺CD8⁺IEL并使用標準流式細胞術技術分析(Malamut等人，2010，同上)。觀察到當與對照抗體相比時，huB-E29-2治療導致CD3⁺CD8⁺IEL的統(tǒng)計學顯著減少(圖7)。

實例13：抗IL-15抗體在過敏原誘導的嗜酸性粒細胞性食管炎模型中的作用

對于IL-15受體的IL-15Rα鏈遺傳缺陷的小鼠在鼻孔滴注曲霉菌后對嗜酸性粒細胞性食管炎的誘導有抗性(Zhu等人，2010，同上)。將結合和中和小鼠IL-15的抗體(如克隆AIO.3(eBiosciences))給藥于用煙曲霉攻擊的小鼠，以測試抗IL-15抗體的活性，用于治療嗜酸性粒細胞性食管炎。在研究的第0、2、4、7、9、11、14、16和18天，用煙曲霉制劑鼻內給藥小鼠組。在不同的時間點用適當劑量的中和抗小鼠IL-15抗體或對照同種型抗體處理動物。作為陽性對照，用地塞米松處理小鼠。在研究的第19天，處理和染色每只小鼠的食道，并且通過顯微鏡測量嗜酸性浸潤。此外，進行支氣管肺泡灌洗以測量氣道中炎性細胞的浸潤。

實例14：根據(jù)本發(fā)明的抗IL-15抗體對非人靈長類動物中的循環(huán)NK細胞數(shù)的影響

在食蟹猴中給藥抗IL-15抗體顯示在兩周的期間內誘導循環(huán)NK細胞數(shù)量的減少(Lebrec等人，2013，J Immunol，191(11)，5551-5558)。不同的抗體顯示出不同的效果：能夠在體內誘導NK細胞減少的抗IL-15Hu714MuXHu抗體的最小劑量為0.1mg/kg，而能夠在體內誘導NK細胞減少的具有與本文描述的146B7抗體相同的序列的抗IL-15AMG 714抗體的最小劑量(Villadsen等，2003，J Clin Invest，112(10)：1571-80；Lebrec等，2013，J Immunol，191(11)：5551-8)為150mg/kg。

在食蟹猴體內測試本發(fā)明的抗IL-15抗體調節(jié)循環(huán)NK細胞數(shù)的能力。通過靜脈內途徑對食蟹猴給藥范圍為0.1mg/kg至10mg/kg的各種劑量的所述抗體，并且使用應用于給藥前和研究時的第1、3、5、8、14和21天的血液樣品的流式細胞術技術評價NK細胞的循環(huán)數(shù)目。非人靈長類動物中循環(huán)NK細胞數(shù)的調節(jié)可以限定抗IL-15抗體在體內的藥理學活性的標記，因此可以有利地用于限定患者的最佳劑量。

序列表

人成熟IL-15

SEQ ID NO:1

NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

小鼠成熟IL-15

SEQ ID NO:2

NWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTS

大鼠成熟IL-15

SEQ ID NO:3

NWIDVRYDLEKIESLIQFIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVIESGCKECEELEERNFTEFLQSFIHIVQMFINTS

恒河猴/食蟹猴成熟IL-15

SEQ ID NO:4

NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISHESGDTDIHDTVENLIILANNILSSNGNITESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

huVH1

SEQ ID NO:5

EVRLMASGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSMITGGWAMDYWGQGTLVTVSS

huVH2

SEQ ID NO:6

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSMITGGWAMDYWGQGTLVTVSS

huVH3

SEQ ID NO:7

EVRLMASGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISRGGDYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSMITGGWAMDYWGQGTLVTVSS

huVH4

SEQ ID NO:8

EVRLMASGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSLITGGWAMDYWGQGTLVTVSS

huVH5

SEQ ID NO:9

EVRLMASGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSFITGGWAMDYWGQGTLVTVSS

huVH6

SEQ ID NO:10

EVRLMASGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSIITGGWAMDYWGQGTLVTVSS

huVH7

SEQ ID NO:11

EVRLMASGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSAITGGWAMDYWGQGTLVTVSS

huVH8

SEQ ID NO:12

EVRLMASGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSMITGGYAMDYWGQGTLVTVSS

huVH9

SEQ ID NO:13

EVRLMASGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSMITGGFAMDYWGQGTLVTVSS

huVH10

SEQ ID NO:14

EVRLMASGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSMITGGAAMDYWGQGTLVTVSS

huVH11

SEQ ID NO:15

EVRLMASGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSMITGGWALDYWGQGTLVTVSS

huVH12

SEQ ID NO:16

EVRLMASGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSMITGGWAFDYWGQGTLVTVSS

huVH13

SEQ ID NO:17

EVRLMASGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSMITGGWAIDYWGQGTLVTVSS

huVH14

SEQ ID NO:18

EVRLMASGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSMITGGWAMDYWGQGTLVTVSS

huVH15

SEQ ID NO:19

EVRLMASGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSMITGGWAMDYWGQGTLVTVSS

huVH16

SEQ ID NO:20

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSFITGGYAFDYWGQGTLVTVSS

huVH18

SEQ ID NO:21

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSMITGGYAMDYWGQGTLVTVSS

huVH20

SEQ ID NO:22

EVRLMASGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSFITGGYAMDYWGQGTLVTVSS

huVH21

SEQ ID NO:23

EVRLMASGGGLVQPGGSLRLSCAASEFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVATISRGGDYTYYPESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRVSFITGGYAMDYWGQGTLVTVSS

huVL1

SEQ ID NO:24

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVDITGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVFNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQDSFVPYTFGQGTKLEIK

huVL2

SEQ ID NO:25

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVDITGNTYLEWFQQRPGQSPRLLIYKVFNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQDSFVPYTFGQGTKLEIK

huVL3

SEQ ID NO:26

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVDITGNTYLEWYQQRPGQSPRRLIYKVFNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQDSFVPYTFGQGTKLEIK

huVL4

SEQ ID NO:27

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVDITGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVFNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQESFVPYTFGQGTKLEIK

huVL5

SEQ ID NO:28

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVDITGNTYLEWYQQRPGQSPRLLIYKVFNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQDTFVPYTFGQGTKLEIK

huVL6

SEQ ID NO:29

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVDITGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYKVFNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQESFVPYTFGQGTKLEIK

重鏈的IgG1m3恒定區(qū)

SEQ ID NO:30

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

輕鏈的IgKm3恒定區(qū)

SEQ ID NO:31

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

cVH1(來自小鼠B-E29的重鏈的可變區(qū))

SEQ ID NO:32

EVRLMASGGGLVKPGGSLKLSCAASEFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATISRGGDYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTALYYCARRVSMITGGWAMDYWGQGTSVTVSS

cVH2

SEQ ID NO:33

EVRLLASGGGLVKPGGSLKLSCAASEFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATISRGGDYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTALYYCARRVSMITGGWAMDYWGQGTSVTVSS

cVH3

SEQ ID NO:34

EVQLLASGGGLVKPGGSLKLSCAASEFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATISRGGDYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTALYYCARRVSMITGGWAMDYWGQGTSVTVSS

cVH4

SEQ ID NO:35

EVRLMESGGGLVKPGGSLKLSCAASEFTFSNYAMSWVRQTPEKRLEWVATISRGGDYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTALYYCARRVSMITGGWAMDYWGQGTSVTVSS

cVK1

SEQ ID NO:36

DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVDITGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVFNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYYCFQDSFVPYTFGGGTKLEIK

hVK2

SEQ ID NO:37

EVVMTQSPATLSLSPGERATLSCRSSQSIVDITGNTYLEWYQQKPGQAPRLLIYKVFNRFSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCFQDSFVPYTFGQGTKLEIK

人IL-2

SEQ ID NO:38

MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT

VL-146B7

SEQ ID NO:39

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQRYGSSHTFGQGTKLEIS

VH-146B7

SEQ ID NO:40

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKVSGYFFTTYWIGWVRQMPGKGLEYMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGNWNCFDYWGQGTLVTVSS

VL CDR3 DISC0280

Kabat位置:89,90,91,92,93,94,95,95A,95B,96,97

SEQ ID NO:41

AWYDRELSEWV

VH CDR3 DISC0280

Kabat positions:95,96,97,98,99,100,100a,100b,100c,100d,100e,100f,100g,101,102

SEQ ID NO:42

DPAAWPLQQSLAWFDP

IL-15肽片段

SEQ ID NO:43

DTVENLIILANN

序列表

<110> 克里普索生物科技公司

<120> 抗 IL-15的抗體

<130> P1792PC00

<150> EP 14175361.6

<151> 2014-07-02

<160> 43

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 114

<212> PRT

<213> 人

<400> 1

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1 5 10 15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

20 25 30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

35 40 45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

50 55 60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65 70 75 80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

85 90 95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

100 105 110

Thr Ser

<210> 2

<211> 114

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 2

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1 5 10 15

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20 25 30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

35 40 45

Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg

50 55 60

Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val

65 70 75 80

Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe

85 90 95

Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

100 105 110

Thr Ser

<210> 3

<211> 114

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 3

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1 5 10 15

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20 25 30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

35 40 45

Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg

50 55 60

Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val

65 70 75 80

Ile Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Arg Asn Phe

85 90 95

Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

100 105 110

Thr Ser

<210> 4

<211> 114

<212> PRT

<213> 恒河猴/食蟹猴

<400> 4

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1 5 10 15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

20 25 30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

35 40 45

Val Ile Ser His Glu Ser Gly Asp Thr Asp Ile His Asp Thr Val Glu

50 55 60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ile Leu Ser Ser Asn Gly Asn Ile

65 70 75 80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

85 90 95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

100 105 110

Thr Ser

<210> 5

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huVH1

<400> 5

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 6

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

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<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 12

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huVH10

<400> 14

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 15

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<213> 人工序列

<220>

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huVH13

<400> 17

Glu Val Arg Leu Met Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huVH14

<400> 18

Glu Val Arg Leu Met Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

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115 120

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huVH15

<400> 19

Glu Val Arg Leu Met Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

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<210> 20

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huVH16

<400> 20

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

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115 120

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<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huVH18

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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<210> 22

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huVH20

<400> 22

Glu Val Arg Leu Met Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

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65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 23

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huVH21

<400> 23

Glu Val Arg Leu Met Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huVL1

<400> 24

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

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100 105 110

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<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huVL2

<400> 25

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

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65 70 75 80

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100 105 110

<210> 26

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huVL3

<400> 26

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

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65 70 75 80

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<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huVL4

<400> 27

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65 70 75 80

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100 105 110

<210> 28

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huVL5

<400> 28

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Asp Ile

20 25 30

Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

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65 70 75 80

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100 105 110

<210> 29

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> huVL6

<400> 29

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Asp Ile

20 25 30

Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Phe Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Ser Phe Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 30

<211> 330

<212> PRT

<213> 人

<400> 30

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 31

<211> 107

<212> PRT

<213> 人

<400> 31

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 32

<211> 122

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 32

Glu Val Arg Leu Met Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Asp Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Val Ser Met Ile Thr Gly Gly Trp Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 33

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cVH2

<400> 33

Glu Val Arg Leu Leu Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Asp Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Val Ser Met Ile Thr Gly Gly Trp Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 34

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cVH3

<400> 34

Glu Val Gln Leu Leu Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Asp Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Val Ser Met Ile Thr Gly Gly Trp Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 35

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cVH4

<400> 35

Glu Val Arg Leu Met Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Asp Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Val Ser Met Ile Thr Gly Gly Trp Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 36

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> cVK1

<400> 36

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Asp Ile

20 25 30

Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Phe Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys Phe Gln Asp

85 90 95

Ser Phe Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 37

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hVK2

<400> 37

Glu Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Asp Ile

20 25 30

Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Phe Asn Arg Phe Ser Gly Ile Pro

50 55 60

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Asp

85 90 95

Ser Phe Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 38

<211> 153

<212> PRT

<213> 人

<400> 38

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

145 150

<210> 39

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL-146B7

<400> 39

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Gly Ser Ser His

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ser

100 105

<210> 40

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH-146B7

<400> 40

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Phe Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Asn Trp Asn Cys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 41

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR3 DISC0280

<400> 41

Ala Trp Tyr Asp Arg Glu Leu Ser Glu Trp Val

1 5 10

<210> 42

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR3 DISC0280

<400> 42

Asp Pro Ala Ala Trp Pro Leu Gln Gln Ser Leu Ala Trp Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 43

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-15 肽片段

<400> 43

Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn

1 5 10