本發(fā)明涉及一種制備作為甘草素前驅(qū)物質(zhì)的異甘草素的方法

背景技術(shù)：

甘草素是其藥效得到廣泛認(rèn)可的優(yōu)異的中藥，通常從甘草中提取。然而，作為其提取方法，需要對甘草根進(jìn)行熱萃取之后，去掉水解后的糖類(葡萄糖或芹菜塘)，對所獲得的甘草素進(jìn)行反相層析而精制出。因此，從甘草中提取甘草素的成本較高且比較貴重，售價約為1萬日元/g。而且，甘草的種植比較困難，因此甘草的產(chǎn)量趨于減少，導(dǎo)致其價格上漲難以購買。

對此，人們試圖人工合成甘草素。如圖2所示，以往的第一方法為，將p-羥基苯甲醛作為起始原料合成4-羧基肉桂酸，并對其加成1,3-羥基苯而獲得異甘草素(專利文獻(xiàn)1)的方法。但是該方法存在產(chǎn)量低的缺點。對此提出了第二方法，如圖3所示，該方法中，將p-羥基苯甲醛作為起始原料，用MOM試劑保護(hù)p位的羥基，并且用MOM試劑保護(hù)1,3-羥基苯的羥基，并使兩者加成(非專利文獻(xiàn)2)。然而，實際驗證結(jié)果，幾乎在整個(產(chǎn)量或生成物為油狀等)階段需要基于柱層析的精制工藝。而且，在本發(fā)明人等的重新實驗中，擴(kuò)大了實驗規(guī)模后的耦合工藝的產(chǎn)量下降到了42％，而且在最終工藝的從異甘草素轉(zhuǎn)換為甘草素的閉環(huán)反應(yīng)中，原料和目的物成為平衡狀態(tài)，其產(chǎn)率沒有上升。并且，在閉環(huán)反應(yīng)中的原料和目的物的分離比較困難，在最后的層析精制條件下甘草素加尾(tailing)，導(dǎo)致回收率大幅下降。而且，MOM保護(hù)試劑具有致癌性，并且在保護(hù)和脫保護(hù)中需要兩個階段的多余的工藝，因此第二方法在實驗室制備中是有效的，卻不適于量產(chǎn)。

專利文獻(xiàn)1：藥學(xué)學(xué)報Acta Pharmaceutica Sinica 1994，29(11):877～880

非專利文獻(xiàn)2：Hu etc.European Journal of Medical Chemistry，2010，45，3453-3458

技術(shù)實現(xiàn)要素：

對此，本發(fā)明人等根據(jù)在甘草素的量產(chǎn)中不使用層析法、使目的物質(zhì)結(jié)晶、不使用具有致癌性的MOM保護(hù)試劑、在人工將異甘草素轉(zhuǎn)換為甘草素時隨著平衡反應(yīng)其產(chǎn)量無法上升、有機(jī)合成的甘草素不同于天然物同時存在(+)體和(-)體，需要重新進(jìn)行毒性試驗等問題，提供了一種適于甘草素的量產(chǎn)的制備方法。

本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，將異甘草素在以檸檬酸為代表的有機(jī)酸水溶液中培養(yǎng)，則會轉(zhuǎn)換成甘草素(-)體，因此，通過量產(chǎn)異甘草素并將其添加到有機(jī)酸水溶液中進(jìn)行培養(yǎng)，即可將其投藥而獲得甘草素(-)體的藥理效果。其中，將p-烷氧基肉桂酸作為起始原料，并且利用弗里德爾-克拉夫茨反應(yīng)對其耦合p-烷氧基苯，高效地形成三烷氧基異甘草素并使其結(jié)晶化，接著對其進(jìn)行脫保護(hù)而量產(chǎn)異甘草素，并且將異甘草素在有機(jī)酸中培養(yǎng)而使其成為甘草素(-)體，從而獲得甘草素(-)體的藥理效果。

根據(jù)本發(fā)明的方法，通過結(jié)晶方法可以高產(chǎn)量地獲得目的物質(zhì)。并且，由于不使用氣相色譜法(gas chromatography)，因此能夠降低制造成本。

并且，即使直接投藥異甘草素，其也能夠在體內(nèi)轉(zhuǎn)換成甘草素(-)體，但是，優(yōu)選通過在以檸檬酸為代表的有機(jī)酸水溶液中進(jìn)行培養(yǎng)而轉(zhuǎn)換成甘草素(-)體。根據(jù)日本專利公報第5611394號，甘草素(-)體的藥理效果如下：在甘草素為10μg/ml時，針對人肝臟癌細(xì)胞SMMC7721顯示為96.08，針對人胃低分化腺癌BGC-823顯示為73.76，針對人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60顯示為64.40，針對人肺癌細(xì)胞A549則稍低、顯示為35.06，其均超過阿霉素對癌細(xì)胞的抑制效果。

[表2]

表2.甘草素(liquiritigenin)對癌細(xì)胞的抑制作用

[表3]

表3.阿霉素(adriamycin)對癌細(xì)胞的抑制作用

并且，根據(jù)本發(fā)明，在進(jìn)行有機(jī)合成時，甘草素(+)體和(-)體不會同時存在，因此能夠有效地利用產(chǎn)量高的異甘草素。并且，通過在人體有益的有機(jī)酸，尤其是在以檸檬酸為主要成分的有機(jī)酸水溶液中進(jìn)行培養(yǎng)即可獲得上述藥理效果較高的甘草素(-)體，因此，與進(jìn)行有機(jī)合成的情況相比，甘草素(-)體的產(chǎn)量增加。并且，由于不像有機(jī)合成時那樣同時存在甘草素(+)體，因此無需進(jìn)行毒性試驗。

本發(fā)明的反應(yīng)式如圖1所示，第一步為耦合反應(yīng)(A)，從式(I)所示的p-烷氧基肉桂酸和式(II)所示的p-二烷氧基苯(dialkoxy benzene)合成式(III)所示的三烷氧基異甘草素，并去掉保護(hù)基而合成異甘草素。在式(I)、式(II)以及式(III)中的RO優(yōu)選是R為甲基、乙基或丁基的烷氧基，通常使用容易得到的R為甲基的甲氧基。反應(yīng)如下：第一，對式(I)所示的p-烷氧基肉桂酸添加鹵化劑進(jìn)行鹵化，對其添加式(II)所示的p-烷氧基苯，接著在有觸媒(金屬鹵化物，例如氯化鋁等)存在的狀態(tài)下對規(guī)定的芳香環(huán)的氫進(jìn)行親電子取代，獲得式(IIIa)所示的三烷氧基異甘草素。第二，在反應(yīng)式(B)中，若去掉該保護(hù)基，則獲得式(IV)所示的目的物即異甘草素。通過閉環(huán)反應(yīng)(C)，式(IV)所示的異甘草素轉(zhuǎn)換成式(V)所示的甘草素，但是，由于獲得(+)體和(-)體，因而需要通過手性拆分分離兩者。在此，從甘草獲得的甘草素為(-)體，因而可以使用異甘草素的異構(gòu)酶從異甘草素獲得甘草素(-)體，但是優(yōu)選在有機(jī)酸水溶液中進(jìn)行培養(yǎng)而獲得甘草素(-)體。

作為p-烷氧基肉桂酸優(yōu)選使用p-甲氧基肉桂酸，但是也可以使用p-乙氧基肉桂酸、p-丁氧基肉桂酸。在下面的實施例中，主要對由式(Ia)所示的p-甲氧基肉桂酸和式(IIa)所示的1,3-二甲氧基苯合成式(IIIa)所示的三甲氧基異甘草素，并去掉保護(hù)基而合成異甘草素的方法進(jìn)行說明。

附圖說明

圖1是表示本發(fā)明所涉及的異甘草素的制備例的反應(yīng)圖，其中圖1(A)是表示第一反應(yīng)的反應(yīng)圖，圖1(B)是表示第二反應(yīng)的反應(yīng)圖。

圖2是表示以往第一方法的甘草素的制備例的反應(yīng)圖。

圖3是表示以往第二方法的甘草素的制備例的反應(yīng)圖。

具體實施方式

以下，根據(jù)實施例說明本發(fā)明的具體例。

(實施例1)

[化1]

將10g的4-甲氧基肉桂酸(式(Ia))溶解于含有0.25mL的二甲基甲酰胺的50mL的無水甲叉二氯中，并在室溫下，以不產(chǎn)生氣泡的方式滴入草酰氯10分鐘且共計滴入9.6mL。接著，在室溫下攪拌兩個小時后，在減壓下去除溶劑。對所獲得的殘渣添加7.4mL的1，3-二甲氧基苯(1，3-Dimethoxybenzene)(式(IIa))和200mL的無水乙醚，并且在冰浴中，緩慢添加粉末化的觸媒無水三氯鋁15分鐘且共計添加了22.4g。接著，在室溫下放置一晚之后，將內(nèi)容物投放于冰上(500g)，添加6M鹽酸10mL，等冰溶解后，用乙酸乙酯(300mL)提取4次。然后，用無水硫酸鈉干燥提取液之后，在減壓下進(jìn)行濃縮，用乙醚-己烷混合液使殘渣結(jié)晶化，從而得到14.2g的目的物(式(IIIa))結(jié)晶。產(chǎn)量85％¹H-NMR(CDCl3)δ7.73(1H，d，J＝8.1Hz)，7.64(1H，d，J＝15.1Hz)，7.54(2H，d，J＝7.7Hz)，7.38(1H，d，J＝15.1Hz)，6.90(2H，d，J＝7.7Hz)，6.55(1H，brd，J＝8.1Hz)，6.49(1H，brs)，3.89(3H，s)，3.85(3H，s)，3.83(3H，s)。

[化2]

將上述生成物3g溶解于60mL的氯甲烷中，并在0℃下滴入1MBB_r3氯甲烷溶液。接著，使其升溫至室溫后，攪拌兩天。添加含有羅謝爾鹽34g的冰冷水700mL和甲醇350mL，并在室溫下攪拌一晚。對所獲得的黃色溶液用乙酸乙酯提取兩次，用1M羅謝爾鹽-飽和鹽水進(jìn)行清洗之后，用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥、濃縮。用乙醚-己烷使殘渣結(jié)晶化，從而得到1.95g的目的物(式(IV))。并且，對其母液進(jìn)行濃縮之后，再次用乙醚-己烷使其結(jié)晶化，從而得到0.59g的目的物第二晶。累計產(chǎn)量98％¹H-NMR(acetone-d6)δ13.5(1H，s)，8.10(1H，d，J＝8.3Hz)，7.82(1H，d，J＝15.4Hz)，7.74(1H，d，J＝15.4Hz)，7.72(2H，d，J＝8.2Hz)，6.90(2H，d，J＝8.2Hz)，6.44(1H，dd，J＝8.3and1.7Hz)，6.34(1H，d，J＝1.7Hz)。

在日本食品分析中心對上述目的物(異甘草素)進(jìn)行了急性毒性試驗，其結(jié)果確認(rèn)到其沒有毒性。

(實施例2)

[化3]

將200mg的原料(式(IV))添加到將pH值調(diào)整為2以上且4左右的檸檬酸水溶液中，進(jìn)行攪拌，使其充分分散后，在常溫下放置一晚。對其懸浮液進(jìn)行濃縮，并用乙醚使其結(jié)晶化，從而獲得粗結(jié)晶(式(V))。其分析值如下，且轉(zhuǎn)換為甘草素(-)。

1H-NMR(DMSO-d6)δ9.65(1H，brs)，7.58(1H，m)，7.27(2H，m)，6.74(2H，m)，6.45(1H，m)，6.28(1H，m)，5.39(1H，brd，J＝11.6Hz)，3.65(1H，brt，J＝15.0Hz)，2.58(1H，brd，J＝15.7Hz)。

(實施例3)

以難消化糊精、N-乙酰氨基葡萄糖、糊精、幾丁寡糖、殼寡糖、乳酸、抗壞血酸(維生素C)為主要成分的清涼飲料500ml(株式會社國際MEDICAL研究所銷售)的pH值為3.9。對其添加作為甘草素的異甘草素(下述日本專利第5611394號的說明書中記載的表2“甘草素對癌細(xì)胞的抑制作用”中所示出的用量(針對老鼠的有效量)的大約100～2000倍)，形成了用于增強(qiáng)免疫的附錄。

根據(jù)專利公報第5611394的表2明確可知，甘草素(-)體的藥理效果如下：甘草素為10μg/ml時，針對人肝臟癌細(xì)胞SMMC7721顯示為96.08，針對人胃低分化腺癌BGC-823顯示為73.76，針對人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60顯示為64.40，針對人肺癌細(xì)胞A549則稍低、顯示為35.06。