本發(fā)明總體上涉及檢測在樣品中不存在或存在微生物的領域。方法典型地依賴于測量存在于樣品中的微生物酶活性(如果有的話)，并且可以涉及能夠使用核酸擴增技術(如聚合酶鏈式反應)進行的此類方法。本發(fā)明的方法因此使得能夠確定在樣品(如未經(jīng)純化的血液、血液培養(yǎng)物和其他體液)中不存在和存在微生物病原體。本發(fā)明還涉及用于在此類方法中使用的試劑，并且涉及包含可用于進行這些方法的此類試劑的測試試劑盒。發(fā)明背景測量與細胞活力相關的某些分子的存在和水平在許多背景下是重要的。例如，測量哺乳動物細胞中的ATP水平對于生長分析和毒物學目的而言是有用的。培養(yǎng)方法可以用于檢測少量的細菌，但是此類技術需要幾天完成，尤其是當試圖檢測少量的細菌時并且還有當檢測生長較慢的微生物時。檢測作為活力指示劑的腺苷酸激酶也已經(jīng)被提出(SquirrellDJ,MurphyMJ,LeslieRL,GreenJCD:AcomparisonofATPandadenylatekinaseasbacterialcellmarkers:correlationwithagarplatecounts。WO96/002665描述了用于確定存在于樣品中的微生物和/或其細胞內(nèi)材料的存在和/或量的方法，其特征在于通過以下來估計樣品中的腺苷酸激酶的量：將它與腺苷二磷酸(ADP)混合，確定從該ADP由樣品產(chǎn)生的腺苷三磷酸(ATP)的量，并且將如此產(chǎn)生的ATP的量與腺苷酸激酶的存在/或量以及微生物和/或其細胞內(nèi)材料相關聯(lián)，其中ADP向ATP的轉化在足以允許ADP向ATP最大轉化的摩爾濃度的鎂離子的存在下進行。在WO2009/007719中，連接酶(特別是NAD依賴性連接酶)被披露為樣品中存在(有活力的)微生物的有用指示劑。連接酶是催化核酸分子連接的酶。根據(jù)涉及的連接酶，連接反應需要ATP或NAD+作為輔助因子。在本公開內(nèi)容中，NAD依賴性連接酶活性的使用被用作樣品中存在(有活力的)微生物的指示劑。WO2011/130584描述了用于基于DNA或RNA聚合酶的檢測來檢測有活力的微生物的方法，在該方法中使樣品與充當微生物聚合酶底物的核酸底物接觸，在適于聚合酶活性的條件下從完整微生物進行孵育，并且使用核酸擴增技術(如定量聚合酶鏈式反應)來確定任何所得核酸產(chǎn)物。此類測定已被稱為“ETGA測定”，其中ETGA代表酶模板生成和擴增(EnzymaticTemplateGenerationandAmplification)。ETGA測定針對粗樣品中的有活力的微生物的一個問題是在微生物外存在由宿主(例如人類)細胞和死的微生物導致的污染聚合酶活性。ETGA測定無法將微生物聚合酶活性與宿主或死的微生物的聚合酶活性區(qū)別開來。申請人的共同未決申請WO2010/119270描述了用于去除完整微生物外的酶活性(在這種情況下是DNA連接酶)的方法，并且此方法也可以用于去除污染核酸聚合酶活性。發(fā)明描述然而，在WO2010/119270中使用的用于去除污染活性的條件包括在高pH(pH11左右)下孵育20min。盡管有用，但是發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些條件對特定細菌菌株(如H.influenzae的某些臨床菌株)是有害的。已進一步發(fā)現(xiàn)，用高pH處理不會在所有情況下去除樣品(如血液培養(yǎng)物)中的所有外微生物核酸酶活性，并且這種核酸酶活性通過降解在測試中使用的核酸底物可以對測定具有有害影響。核酸擴增測定可以包括內(nèi)部對照探針以監(jiān)測擴增反應的正確運行(參見例如WO2013/103744，在其中這被應用于類似于WO2011/130584的DNA聚合酶測定)。然而，這種內(nèi)部對照被添加為核酸擴增試劑混合物的一部分并且不會檢測先前的核酸酶活性。在WO2011/130584中描述的方法的另外的問題是在檢測酵母(如C.albicans和C.glabrata)方面相對缺乏敏感性。在快速測試中，本領域一直專注于檢測微生物的存在而非確定其不存在。所謂“確定其不存在”，申請人并不意指樣品一定是無菌的，而是可以具有足夠低以至于對實際目的而言陰性的生物負載。例如，血液培養(yǎng)物通常取自疑似患有血流感染的患者，這些血流感染可以與敗血癥(一種如果不治療的話可迅速致命的病癥)相關。對于臨床微生物實驗室而言常規(guī)的是，將此類標本孵育至少五天后再報告陰性結果，在此期間這些患者通常服用廣譜抗生素。典型地，多達90％的此類患者是陰性的，并且因此大量患者接受持續(xù)5天的對其病癥而言沒有必要的抗生素治療。用于確定陰性結果的更快方法(相對于五天血液培養(yǎng))在降低不必要的抗生素治療的成本方面會具有重要價值，并且就降低C.difficile感染風險、抗生素毒性以及降低抗微生物抗性的增加率而言提供健康益處。發(fā)明人已經(jīng)著眼于優(yōu)化樣品中不存在或存在微生物的確定而針對現(xiàn)有ETGA測定設計并測試了一系列改進。本發(fā)明的基礎因此是檢測樣品中不存在或存在微生物的方法，其包括：(a)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子接觸，(b)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(c)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物。本文呈現(xiàn)了這種基本測定形式的多種發(fā)展。因此，在第一方面中，本發(fā)明提供了檢測樣品中不存在或存在微生物的方法，該方法包括：(a)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子接觸，(b)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(c)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物，其特征在于該核酸分子被修飾以保護它免受核酸酶活性。在本發(fā)明的背景下，核酸分子被預修飾以保護它免受核酸酶活性，即核酸分子被修飾以使它在步驟(a)與樣品接觸之前保護它免受核酸酶活性。發(fā)明人已經(jīng)確定保護底物核酸分子免受核酸酶活性在本發(fā)明測定的背景下是有利的。更特別地，如本文所示的，向本發(fā)明的方法中摻入受保護的核酸分子改進檢測的敏感性。任何適合的手段都可以用于保護核酸分子免受核酸酶活性。非限制性實例包括向核酸分子中摻入甲基化、末端修飾(如保護3’和/或5’端)以及摻入合成核苷酸。在一些具體實施方案中，合成核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸和/或鎖核酸核苷酸。優(yōu)選地，合成核苷酸是硫代磷酸酯核苷酸。在某些實施方案中，合成核苷酸替代核酸分子中的至少一個核苷酸,多至所有核苷酸。發(fā)明人已經(jīng)進一步確定，與先前ETGA測定相比，增加反應中核酸分子的濃度可以導致改進的結果。因此，在一個另外的方面中，本發(fā)明提供了檢測樣品中不存在或存在微生物的方法，該方法包括：(a)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子接觸，(b)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(c)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物，其特征在于將該核酸分子以至少2nM但小于50nM的濃度添加至該樣品中。先前，在此類測定中，已經(jīng)以1nM的濃度利用核酸底物。發(fā)明人已經(jīng)確定，將此濃度增加到小于50nM(如2nM、5nM、7.5nM或10nM)導致改進的檢測敏感性。在50nM下或高于50nM，改進的敏感性喪失，這是由于由測定造成的假陽性增加。如本文所述的濃度典型地是用于裂解微生物(如果存在于樣品中的話)的裂解混合物中的濃度。因此，使樣品與底物核酸分子接觸的步驟(a)典型地涉及在裂解微生物(如果存在于樣品中的話)的裂解混合物中添加底物。本文提供了裂解試劑/混合物的另外的細節(jié)。發(fā)明人還已經(jīng)進一步確定，增加反應中游離核苷酸的濃度進一步用于改進測定敏感性。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括向樣品中添加濃度多于50μM(如55至300μM、或60至250μM、或75至200μM，特別是至少100μM)的脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)。在一些實施方案中，可以在步驟(a)和/或步驟(b)中添加dNTP。如本文所述的濃度典型地是用于裂解微生物(如果存在于樣品中的話)的裂解混合物中的濃度。因此，使樣品與底物核酸分子接觸的步驟(a)典型地涉及在裂解微生物(如果存在于樣品中的話)的裂解混合物中添加底物，其中該裂解混合物含有dNTP。本文提供了裂解試劑/混合物的另外的細節(jié)。如上文所討論的，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，雖然在WO2010/119270中采用的用于去除污染活性的高pH條件是有用的，但這些條件對特定細菌菌株(如H.influenzae的某些臨床菌株)可以是有害的。因此，在一個另外的方面中，本發(fā)明提供了檢測樣品中不存在或存在微生物的方法，該樣品含有核酸修飾活性的非微生物來源，該方法包括：(a)在高pH條件下將該樣品處理不多于8分鐘，以抑制核酸修飾活性的該非微生物來源(同時不影響該樣品中微生物的核酸修飾活性)，(b)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子接觸，(c)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(d)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物。高pH條件的持續(xù)時間小于20分鐘并且可以不多于10、9、8、7、6或5分鐘并且可以在5、6、7、8、9或10分鐘左右。在一些又另外的實施方案中，將處理進行介于2至15分鐘左右，如5分鐘左右。所謂“左右”意指加或減30秒。任何適合的試劑都可以添加至樣品中以提供高pH條件。在一些特定實施方案中，高pH條件包括使樣品與堿接觸。在一些特定實施方案中，使用NaOH或Na2CO3。在一些具體實施方案中，NaOH或Na2CO3的濃度在5mM左右或更大。高pH條件典型地抑制核酸修飾酶(包括來自非微生物來源如哺乳動物細胞的ATP依賴性連接酶和聚合酶)的活性，但并不抑制微生物連接酶或聚合酶的活性。這可能是由于微生物酶對這些條件的耐受性更大和/或由于在方法中應用的裂解條件有差別，以保證只有非微生物酶暴露于高pH條件。高pH通常是至少10左右(如10、11、12、13或14左右)的pH。低pH通常是小于或等于4左右(如4、3、2、或1左右)的pH。所謂“左右”意指所述值任一側的0.5的pH單位。改變樣品的pH可以使用任何適合的手段來實現(xiàn)，如本領域技術人員應容易理解的。微生物酶(如聚合酶和連接酶)可以耐受極端pH，而哺乳動物連接酶在相同pH條件可被失活。這允許選擇性地檢測含有哺乳動物細胞和微生物細胞兩者的樣品中的微生物連接酶。在一些具體實施方案中，抑制來自哺乳動物細胞的非微生物核酸修飾活性(如ATP依賴性連接酶)的活性但不抑制核酸修飾活性的微生物來源(如微生物連接酶)的活性的條件包括用氫氧化鈉(NaOH)或碳酸鈉(Na2CO3)處理樣品。如本文所示的，此類試劑可以容易地用于將樣品的pH增至高pH，因此使哺乳動物連接酶活性失活同時保留微生物(真菌和細菌)連接酶具有活性。技術人員可以應用適當試劑的適合濃度和體積。然而，在某些實施方案中，NaOH是至少5mM左右的NaOH。在一些實施方案中，堿濃度不多于10mM，如5、6、7、8、9或10mM。在一些另外的實施方案中，pH在12左右以使哺乳動物核酸修飾活性(如聚合酶和/或ATP依賴性連接酶活性)失活，而不使微生物核酸修飾活性(如聚合酶和/或連接酶活性)失活。在一些具體實施方案中，pH條件可以增至至少11左右、或至少11.2。這種處理可以導致樣品中的微生物裂解，并且因此使得核酸修飾活性(例如聚合酶和/或連接酶)釋放到樣品中。這允許檢測樣品中源自微生物的核酸修飾活性(例如聚合酶和/或連接酶)，而無需單獨的細胞裂解步驟。在這些條件下，哺乳動物連接酶(如血液ATP依賴性連接酶)被失活。然而，這些方法典型地包括用于裂解樣品中的微生物的單獨步驟，如在下文更加詳細地討論的。在一些實施方案中，通過添加試劑降低pH來使高pH條件下的處理停止。適合的試劑包括緩沖液和/或酸。在一些具體實施方案中，緩沖液包括Tris-HCl緩沖液(例如pH7.2或8)。另一些適合的用于降低pH的試劑包括酸，如鹽酸(HCl)和硫酸(H2SO4)?？梢詫⑦@些(以及其他)酸摻入緩沖液中，如本領域技術人員應容易理解的?？梢詫⑦@些步驟并入上文指出的方法的步驟(a)中。在一些具體實施方案中，在介于15至30攝氏度左右(意指加或減0.5度)的溫度下進行步驟(a)。在某些實施方案中，在室溫下進行步驟(a)?？梢栽谶@些溫度下進行本文描述的整個方法。在這些方法的更特別的敘述中，本發(fā)明進一步提供了檢測樣品中不存在或存在微生物的方法，該樣品含有核酸修飾活性的非微生物來源，該方法包括：(i)用裂解該樣品中的非微生物(如果存在的話)但不裂解該樣品中的微生物的試劑孵育該樣品(ii)任選地將該經(jīng)裂解的細胞材料與該樣品中的完整微生物(如果有的話)分離(iii)使該樣品中的(分離的)完整微生物(如果有的話)與高pH試劑接觸并孵育不多于5分鐘，以抑制核酸修飾活性的非微生物來源(同時不影響該樣品中微生物的核酸修飾活性)(iv)添加降pH試劑，以使高pH下的孵育停止(v)將該樣品中的微生物(如果存在的話)與pH修飾試劑分離(vi)裂解任何分離的微生物(vi)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子接觸，(vii)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(viii)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物。步驟(ii)是任選步驟，因為在一些實施方案中，無需將經(jīng)裂解的細胞材料與完整微生物分離。這是因為在任何情況下步驟(iii)用于抑制在經(jīng)裂解的細胞材料中存在的核酸修飾活性。所謂“經(jīng)裂解的細胞材料”意指非微生物的裂解產(chǎn)物。這包括經(jīng)裂解的細胞的細胞膜和細胞內(nèi)內(nèi)容物。更特別地，所述方法可以包括以下步驟：(i)用裂解該樣品中的非微生物(如果存在的話)但不裂解該樣品中的微生物的試劑孵育該樣品(ii)將該樣品離心，以形成含有該樣品中的微生物(如果存在的話)的沉淀(iii)從該沉淀中去除上清液(iv)將該沉淀重懸于高pH試劑中并孵育不多于8分鐘，以抑制核酸修飾活性的該非微生物來源(同時不影響該樣品中微生物的核酸修飾活性)(v)添加降pH試劑，以使高pH下的孵育停止(vi)將該樣品第二次離心，以形成含有該樣品中的微生物(如果存在的話)的沉淀(vi)從該沉淀中去除上清液(vii)裂解該沉淀中的任何微生物(viii)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子接觸，(ix)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(x)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物。在一些具體實施方案中，在15與30攝氏度之間的溫度下分別進行步驟(iii)或(iv)、或進行整個方法?？商娲?，可以在室溫下分別進行步驟(iii)或(iv)、或進行整個方法。裂解非微生物(特別是哺乳動物細胞，如果存在于樣品中的話)而不裂解樣品中的微生物的試劑可以是任何適合的試劑。在一些實施方案中，試劑可以包括表面活性劑或去污劑，如非離子型去污劑。適合的實例包括聚乙二醇脫水山梨醇單月桂酸酯(Tween20)，例如5％w/v的聚乙二醇脫水山梨醇單月桂酸酯(Tween20)。試劑可以包括皂苷，例如5％w/v的皂苷。試劑可以包括金屬鹵化物鹽，如氯化鈉，例如8.5g/l的。試劑可以包括所有三種組分的混合物?？梢詫悠放c試劑在適合的條件下混合，以保證裂解非微生物(特別是哺乳動物細胞，如果存在于樣品中的話)而不(或不顯著)裂解微生物(如果存在于樣品中的話)?？梢詫悠繁┞队谠噭┏掷m(xù)介于5至30分鐘左右(如5、10、15、20、25或30分鐘)的時間?？梢栽谌魏芜m合的溫度下(例如在15與30攝氏度之間或在室溫下)進行此步驟。在使用的情況下，可以通過任何適合的方法將經(jīng)裂解的細胞材料與樣品中的完整微生物(如果有的話)分離。它可以例如依賴于親和純化的形式，如基于(多克隆)抗體的方法。在一些實施方案中，它可以依賴于過濾。分離可以依賴于將樣品離心，以形成含有微生物(如果存在于樣品中的話)的沉淀?？梢园慈魏芜m合的速度進行樣品的離心并且進行任何適合的持續(xù)時間。例如，可以按3000與10000g之間(如7000g或7300g左右)的速度離心樣品?？梢詫悠冯x心適合的時間段，以保證成功裂解非微生物(特別是哺乳動物細胞，如果存在于樣品中的話)而不或不顯著裂解樣品中的微生物。這可以結合離心速度進行確定。時間段可以介于1至30分鐘左右，如1、2、3、4、5、10、15、20、25或30分鐘。可以在任何適合的溫度下(例如在15與30攝氏度之間或在室溫下)進行此步驟。分離后，可以棄去經(jīng)裂解的細胞材料(以上清液的形式)并保留非裂解的細胞(例如作為沉淀)。關于更一般性的方法，上文提供的討論在這里比照適用。因此，在一些實施方案中，高pH試劑包括NaOH或Na2CO3。在一些實施方案中，高pH試劑的濃度在5mM左右或更大。在某些實施方案中，降pH試劑包括緩沖液或酸，如Tris-HCl緩沖液。在一些具體實施方案中，緩沖液可以是pH7.2或8緩沖液。暴露于pH修飾劑后，將樣品中的任何微生物從pH修飾條件中分離。這可以通過第二次離心樣品以形成含有微生物(如果存在于樣品中的話)的沉淀，隨后從沉淀中去除上清液來實現(xiàn)。適合的離心條件是上文討論的。該方法然后需要裂解任何分離的微生物，以允許檢測核酸修飾活性。這可以通過添加裂解混合物實現(xiàn)。裂解混合物在本發(fā)明的方法中是普遍性有用的。裂解混合物可以包括用以保證有效裂解微生物而不會不利地影響細胞內(nèi)的核酸修飾活性的組分的具體混合物。組分可以選自載體/血清蛋白(如BSA)、表面活性劑/去污劑、金屬鹵化物鹽、緩沖液、螯合劑等。在其基本形式中，本發(fā)明的裂解混合物可以包括以下組分：1.表面活性劑/去污劑2.血清蛋白，如白蛋白(例如BSA)3.緩沖液4.核苷酸，如dNTP5.核酸分子(在本發(fā)明的測定中充當?shù)孜?。在下表1中列出了適合的裂解混合物并且形成本發(fā)明的一個單獨方面：表1.裂解混合物組分列出了每種組分的示例性濃度，但是可以如本領域技術人員應容易理解地那樣進行修改。裂解也可以需要破碎細胞。例如，可以與物理和/或酶促手段組合使用裂解混合物破碎細胞。在一些實施方案中，物理破碎應用破碎儀。破碎儀可以摻入珠粒如玻璃珠粒，以裂解細胞。適合的裝置是可商購的并且包括由ScientificIndustries,Inc制造的DisruptorGenie。在一些實施方案中，酶促破碎可以需要使用選自溶葡球菌酶、溶菌酶和/或溶細胞酶的試劑。如表1中所指示的，使樣品與充當樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子接觸的步驟可以包括向裂解混合物中添加該核酸分子。然后在適于核酸修飾活性的條件下孵育樣品。這可以涉及在核酸修飾活性的最適溫度下進行孵育。例如，可以在介于15至40攝氏度左右(如37攝氏度左右)的溫度下孵育樣品。這可以持續(xù)任何適合的時間段，例如5與60分鐘之間，如5、10、15、20、25或30分鐘左右。這之后，可以在修飾的核酸分子檢測步驟之前使核酸修飾活性失活。這可以通過將溫度升高例如至高于60攝氏度(如95攝氏度)的溫度持續(xù)適合的時間段來實現(xiàn)。這可以是相對較短的時間段，如1、2、3、4、5、10、15或更多分鐘?？梢酝ㄟ^如本文討論的任何適合的方法特異性確定不存在或存在由于核酸修飾活性對底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在微生物。優(yōu)選方法是基于核酸擴增的并且可以允許對樣品中的核酸修飾活性(并且因此對微生物)進行定量。發(fā)明人還已經(jīng)研究了在ETGA方法的背景下使用內(nèi)部陽性對照(IPC)分子。特別地，本發(fā)明可以依賴于包含底物核酸分子與IPC，這樣使得該IPC暴露于相同的條件。他們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，樣品中的殘余核酸酶活性可影響添加至樣品(特別地是裂解混合物中的，如本文所定義的)中的底物。因此，保護IPC免受核酸酶活性影響有優(yōu)勢。因此，本發(fā)明還提供了檢測(液體)樣品中不存在或存在微生物的方法，該樣品潛在地含有核酸酶活性的非微生物來源，該方法包括：(i)用裂解該樣品中的非微生物(如果存在的話)但不裂解該樣品中的微生物的試劑孵育該樣品(ii)將該經(jīng)裂解的細胞材料與該樣品中的完整微生物(如果有的話)分離和/或使該經(jīng)裂解的細胞材料失活(iii)分離和/或失活后，裂解任何微生物(iv)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子連同內(nèi)部陽性對照(IPC)核酸分子接觸，(v)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(vi)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物，其特征在于該IPC核酸分子被修飾以保護它免受核酸酶活性。步驟(ii)中的分離是任選步驟，因為在一些實施方案中，無需將經(jīng)裂解的細胞材料與完整微生物分離。在一些實施方案中，進行使在經(jīng)裂解的細胞材料中存在的核酸修飾活性失活的替代性或另外的步驟?？梢詰萌绫疚乃懻摰娜魏芜m合的失活技術。例如，失活可以是經(jīng)裂解的細胞材料中的核酸修飾活性和/或核酸酶活性的失活。失活可以使用任何適合的手段實現(xiàn)，例如如本文所討論的高pH處理。微生物保持完整的事實可以保護它們免受失活處理的影響。類似地，本發(fā)明還提供了檢測(液體)樣品中不存在或存在微生物的方法，該樣品潛在地含有核酸酶活性的非微生物來源，該方法包括：(a)將該樣品離心，以形成含有該樣品中的微生物(如果存在的話)的沉淀(b)從該沉淀中去除上清液(c)裂解該沉淀中的任何微生物(d)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子連同內(nèi)部陽性對照(IPC)核酸分子接觸，(e)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(f)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物，其特征在于該IPC核酸分子被修飾以保護它免受核酸酶活性影響。受保護的IPC在使用受保護的底物分子的背景下是特別有利的。因此，在一些實施方案中，(底物)核酸分子也被修飾以保護它免受核酸酶活性影響。這保證兩種核酸分子都受保護并經(jīng)受相同的條件。任何適合的手段都可以用于保護核酸分子免受核酸酶活性影響。非限制性實例包括向核酸分子中摻入甲基化、末端修飾(如保護3’和/或5’端)以及摻入合成核苷酸。在一些具體實施方案中，合成核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸和/或鎖核酸核苷酸。優(yōu)選地，合成核苷酸是硫代磷酸酯核苷酸。在某些實施方案中，合成核苷酸替代核酸分子中的至少一個核苷酸,多至所有核苷酸。在一些具體實施方案中，以相同方式修飾IPC和底物核酸分子。這是著眼于提供盡可能相等的免受核酸酶活性影響的保護。在本發(fā)明的背景下，如果IPC被修飾以保護它免受核酸酶活性影響，則IPC被預修飾以保護它免受核酸酶活性影響，即IPC被修飾以使它與樣品接觸之前保護它免受核酸酶活性影響。本發(fā)明還考慮了使用IPC來監(jiān)測樣品中的潛在污染核酸酶活性。因此，本發(fā)明還提供了檢測(液體)樣品中不存在或存在微生物的方法，該樣品潛在地含有核酸酶活性的非微生物來源，該方法包括：(i)用裂解該樣品中的非微生物(如果存在的話)但不裂解該樣品中的微生物的試劑孵育該樣品(ii)將該經(jīng)裂解的細胞材料與該樣品中的完整微生物(如果有的話)分離和/或使該經(jīng)裂解的細胞材料失活(iii)分離和/或失活后，裂解任何微生物(iv)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子連同內(nèi)部陽性對照(IPC)核酸分子接觸，(v)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(vi)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物，其特征在于該IPC核酸分子易受核酸酶活性影響并且用于鑒定沉淀中的污染核酸酶活性。步驟(ii)中的分離是任選步驟，因為在一些實施方案中，無需將經(jīng)裂解的細胞材料與完整微生物分離。在一些實施方案中，進行使在經(jīng)裂解的細胞材料中存在的核酸修飾活性失活的替代性或另外的步驟?？梢詰萌绫疚乃懻摰娜魏芜m合的失活技術。例如，失活可以是經(jīng)裂解的細胞材料中的核酸修飾活性和/或核酸酶活性的失活。失活可以使用任何適合的手段實現(xiàn)，例如如本文所討論的高pH處理。微生物保持完整的事實可以保護它們免受失活處理的影響。類似地，進一步提供了檢測(液體)樣品中不存在或存在微生物的方法，該樣品潛在地含有核酸酶活性的非微生物來源，該方法包括：(a)將該樣品離心，以形成含有該樣品中的微生物(如果存在的話)的沉淀(b)從該沉淀中去除上清液(c)裂解該沉淀中的任何微生物(d)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子連同內(nèi)部陽性對照(IPC)核酸分子接觸，(e)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(f)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物，其特征在于該IPC核酸分子易受核酸酶活性影響并且用于鑒定該沉淀中的污染核酸酶活性。典型地，一起進行步驟(iii)和(iv)或(c)和(d)。在一些具體實施方案中，在本發(fā)明的方法中使用的(底物)核酸分子至少部分是雙鏈的并且在互補鏈中包含尿嘧啶殘基，并且特異性確定不存在或存在修飾的核酸分子的步驟包括向樣品中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)，以降解互補鏈中的尿嘧啶殘基。在某些實施方案中，部分雙鏈的(底物)核酸分子的第一鏈包含合成核苷酸(例如硫代磷酸酯核苷酸)(或由其組成)，并且第二(互補)鏈包含尿嘧啶殘基和任選地合成核苷酸(例如硫代磷酸酯核苷酸)(或由其組成)。優(yōu)選地，雙鏈區(qū)域涵蓋第一和第二(互補)鏈的3’端區(qū)域。優(yōu)選地，雙鏈區(qū)域是至少5、至少10、至少15、至少20或至少25個核苷酸；任選地，雙鏈區(qū)域不多于50個核苷酸。可以使用不受保護的(或標準)dNTP通過樣品中的微生物的聚合酶活性在如本文所描述的孵育步驟期間延伸第一鏈，以形成包含不受保護的(或標準)核苷酸的經(jīng)延伸的第一鏈。這個步驟依賴于使用第二鏈作為模板(第一與第二鏈之間的互補區(qū)的上游)。孵育步驟后，可以通過向樣品中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)來降解第二(互補)鏈，留下作為單鏈分子的包含合成核苷酸和不受保護的核苷酸的經(jīng)延伸的第一鏈。降解第二鏈后，可以在擴增步驟中對(底物)核酸分子的經(jīng)延伸的第一鏈進行檢測。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用如上文描述的部分雙鏈的(底物)核酸分子改進樣品中微生物的檢測。在某些實施方案中，IPC核酸分子包含與核酸分子相同的引物結合位點，這樣使得存在引物結合競爭(在該方法的步驟(vi)或(f)中)。在一些另外的實施方案中，添加結合至核酸分子內(nèi)的靶探針序列上的核酸探針(在步驟(vi)或(f)中)。典型地，探針結合至核酸分子的有義鏈上。在一些其他實施方案中，分別在步驟(vi)或(f)中添加結合至IPC核酸分子內(nèi)的靶探針序列上的另外的核酸探針。在一些具體實施方案中，核酸探針不結合至IPC核酸分子上并且另外的核酸探針不結合至核酸分子上?？梢詷擞浐怂崽结樅?或另外的核酸探針。優(yōu)選地，將它們進行不同的標記。在一些具體實施方案中，核酸分子的互補鏈在3’端包含修飾以防止延伸。這種修飾可以包括摻入不可延伸核苷酸。在一些具體實施方案中，不可延伸核苷酸是雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTP)，如雙脫氧胞苷。在IPC易受核酸酶活性影響的方法中，(底物)核酸分子可以被修飾以保護它免受核酸酶活性影響。適合的修飾在本文進行了討論并且可以選自摻入甲基化、保護3’和/或5’端、摻入合成核苷酸。合成核苷酸的實例包括硫代磷酸酯核苷酸和/或鎖核酸核苷酸。優(yōu)選地，合成核苷酸是硫代磷酸酯核苷酸?；緶y定形式的各種發(fā)展可以有利地進行組合，以產(chǎn)生特別具特異性和敏感性的方法。因此，本發(fā)明進一步提供了檢測樣品中不存在或存在微生物的方法，該樣品含有核酸修飾活性的非微生物來源，該方法包括：(i)用裂解該樣品中的非微生物(如果存在的話)但不裂解該樣品中的微生物的試劑孵育該樣品(ii)任選地將該經(jīng)裂解的細胞材料與該樣品中的完整微生物(如果有的話)分離(iii)使該樣品中的(分離的)完整微生物(如果有的話)與高pH試劑接觸并孵育不多于5分鐘，以抑制核酸修飾活性的該非微生物來源(同時不影響該樣品中微生物的核酸修飾活性)(iv)添加降pH試劑，以使高pH下的孵育停止(v)將該樣品中的微生物(如果存在的話)與pH修飾試劑分離(vi)裂解任何分離的微生物(vii)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子接觸，(viii)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(ix)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物，其中該核酸分子被修飾以保護它免受核酸酶活性影響。步驟(ii)是任選步驟，因為在一些實施方案中，無需將經(jīng)裂解的細胞材料與完整微生物分離。這是因為在任何情況下步驟(iii)用于抑制在經(jīng)裂解的細胞材料中存在的核酸修飾活性。類似地，本發(fā)明進一步提供了檢測樣品中不存在或存在微生物的方法，該樣品含有核酸修飾活性的非微生物來源，該方法包括：(a)用裂解該樣品中的非微生物(如果存在的話)但不裂解該樣品中的微生物的試劑孵育該樣品(b)將該樣品離心，以形成含有該樣品中的微生物(如果存在的話)的沉淀(c)從該沉淀中去除上清液(d)將該沉淀重懸于高pH試劑中并孵育不多于5分鐘，以抑制核酸修飾活性的該非微生物來源(同時不影響該樣品中微生物的核酸修飾活性)(e)添加降pH試劑，以使高pH下的孵育停止(f)將該樣品第二次離心，以形成含有該樣品中的微生物(如果存在的話)的沉淀(g)從該沉淀中去除上清液(h)裂解該沉淀中的任何微生物(i)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子接觸，(j)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(k)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物，其中該核酸分子被修飾以保護它免受核酸酶活性影響。因此，這些方法代表本文描述的其他方法的組合。因此，所有相關實施方案比照適用這種總體方法。例如，關于核酸被修飾的一些其他實施方案，修飾可以選自摻入甲基化、保護3’和/或5’端、摻入合成核苷酸。合成核苷酸可以包括硫代磷酸酯核苷酸和/或鎖核酸核苷酸。優(yōu)選地，合成核苷酸是硫代磷酸酯核苷酸。在一些特定實施方案中，將核酸分子以至少2nM且小于50nM(例如2nM至25nM、5nM至15nM、或7.5至12.5nM)(如2nM、5nM、7.5nM或10nM)的濃度添加至樣品中。核酸分子可以被包括在該方法的步驟(vi)或(h)中使用的裂解混合物中(即指定濃度是裂解混合物中的濃度)。因此，在一些實施方案中，可以分別將步驟(vi)和(vii)或(h)和(i)有效地組合為單個步驟。裂解混合物可以是如在表1中所指定的或如在本公開內(nèi)容的其他地方所討論的。該方法可以類似地包括向樣品中添加濃度多于50μM、優(yōu)選至少100μM(如55至300μM、或60至250μM、或75至200μM)的脫氧核糖核苷酸三磷酸。同樣地，dNTP可以被包括在該方法的步驟(vi)或(h)中使用的裂解混合物中(即指定濃度是裂解混合物中的濃度)。因此，在一些實施方案中，可以分別將步驟(vi)和(vii)或(h)和(i)有效地組合為單個步驟。如在上文更加詳細地討論的，高pH試劑可以是或包括NaOH或Na2CO3。在一些具體實施方案中，高pH試劑的濃度在5mM左右或更大。降pH試劑可以包括緩沖液或酸，如Tris-HCl緩沖液(例如pH7.2或8)。在一些具體實施方案中，在15與30攝氏度之間的溫度下進行步驟(iii)或(d)，或在室溫下進行。在一些實施方案中，可以在15與30攝氏度之間的溫度下或在室溫下進行該方法的每個和/或所有步驟。在利用核酸擴增步驟(如PCR)的情況下，那些步驟將需要在如本文詳細描述的和技術人員所理解的適當溫度下進行。在一些具體實施方案中，可以應用核酸酶敏感性IPC。因此，步驟(vii)或(i)可以分別包括使樣品與充當樣品中微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子連同內(nèi)部陽性對照(IPC)核酸分子接觸，其中該IPC核酸分子易受核酸酶活性影響并且用于鑒定沉淀中的污染核酸酶活性?？商娲?，可以應用核酸酶耐受性IPC。因此，步驟(vii)或(i)可以分別包括使樣品與充當樣品中微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子連同內(nèi)部陽性對照(IPC)核酸分子接觸，其中該IPC核酸分子被修飾以保護它免受核酸酶活性影響。適合的修飾在本文進行了更加詳細地討論并且可以選自摻入甲基化、保護3’和/或5’端、摻入合成核苷酸。合成核苷酸可以是或包括硫代磷酸酯核苷酸和/或鎖核酸核苷酸。優(yōu)選地，合成核苷酸是硫代磷酸酯核苷酸。如果兩種分子都被修飾，則優(yōu)選的是以相同或類似方式修飾它們，這樣使得核酸酶耐受性是可比的。這允許IPC發(fā)揮最有用的比較物角色，以確定核酸酶活性對底物分子的影響。如已經(jīng)提及的，在一些實施方案中，一起進行步驟(vi)和(vii)或(h)和(i)。這里，核酸分子連同裂解試劑被添加至樣品中，以形成裂解混合物。如本文進一步詳細地討論的，該討論比照適用，可以通過多種方法(包括通過測序或核酸擴增)來檢測修飾的核酸分子的檢測。在一些具體實施方案中，步驟(ix)或(k)分別包括核酸擴增步驟?？梢詰萌魏芜m合的核酸分子。在一些實施方案中，核酸分子摻入了尿嘧啶殘基。在一些具體實施方案中，核酸分子至少部分是雙鏈的并且在互補鏈中包含尿嘧啶殘基。在此類實施方案中，所述方法(并且特別是相應方法的步驟(ix)或(k))可以包括向樣品中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)，以降解互補鏈中的尿嘧啶殘基。在一些另外的實施方案中，核酸分子的互補鏈在3’端包含修飾以防止延伸。所謂“延伸”意指添加另外的核苷酸?？梢詰萌魏芜m合的修飾。在一些具體實施方案中，修飾是或包括摻入不可延伸核苷酸。可以應用任何適合的不可延伸核苷酸。例如，不可延伸核苷酸可以是或包括雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTP)，如雙脫氧胞苷。在某些實施方案中，IPC核酸分子包含與核酸分子相同的引物結合位點，這樣使得在檢測修飾的核酸分子的步驟期間(在步驟(ix)或(k)中)存在引物結合競爭。如本文所討論的，存在多種可供使用的擴增技術，其中的許多依賴于探針(如水解或發(fā)夾探針)。因此，在一些實施方案中，所述方法包括使用探針，特別是在步驟(ix)或(k)中。在一些具體實施方案中，在該方法的步驟(ix)或(k)中添加核酸探針。這種探針結合至核酸分子(的有義鏈)內(nèi)的靶探針序列上。所謂“結合”意指在應用于所述方法的條件下雜交，如本領域技術人員應容易理解的。在一些實施方案中，利用結合至IPC核酸分子內(nèi)的靶探針序列上的另外的核酸探針，例如在步驟(ix)或(k)中添加。在一些具體實施方案中，核酸探針不結合至IPC核酸分子上并且另外的核酸探針不結合至(底物)核酸分子上。可以使用本領域已知的技術和工具(如在線設計工具)將探針和核酸分子(IPC或底物)設計成避免不想要的交叉雜交?？梢詷擞浐怂崽结樅?或另外的核酸探針。在一些具體實施方案中，不同地標記核酸探針和另外的核酸探針。例如，可以用具有不同的最大發(fā)射波長的熒光團標記它們。適合的標記對可以由本領域技術人員容易地進行選擇，例如FAM和德克薩斯紅可以被用作不同的標記。根據(jù)本發(fā)明的所有方面，核酸修飾活性可以是可用于指示微生物活力的任何活性。核酸修飾活性是由微生物提供的酶促活性。實例包括聚合酶和/或連接酶活性。優(yōu)選地，核酸修飾活性是聚合酶活性。聚合酶活性可以包括DNA和/或RNA聚合酶活性。優(yōu)選地，聚合酶活性是DNA和/或RNA聚合酶活性。連接酶活性可以是ATP或NAD依賴性的?？商娲?，可以測量與活力相關的其他核酸修飾活性，如磷酸酶、激酶和/或核酸酶活性。優(yōu)選地，核酸修飾活性對底物核酸分子的作用產(chǎn)生經(jīng)延伸的核酸分子。在本文詳細地描述了適合的底物分子。也可以參考WO2011/130584、WO2010/119270和WO2009/007719(將其相關公開結合在此)，在其中披露了可用于檢測核酸修飾活性的適合的底物分子。在磷酸酶活性的情況下，適合的核酸分子披露于WO2006/123154中，將其公開通過引用并入本文。用于在本發(fā)明的方法中使用的以及被包括在本發(fā)明的試劑盒中的底物核酸分子必須具有使得NAD依賴性連接酶能夠作用于該分子以產(chǎn)生可檢測的連接的(新穎)核酸分子的序列和結構。在下文的實驗部分更加詳細地描述了用于在本發(fā)明中使用的適合的底物核酸分子。因此，底物可以由以下分子構成：ASUaggcgucggugacaaacggccagcguuguugucucu-DDC(3’末端是雙脫氧-C)(SEQIDNO:6)S1Gccgatatcggacaacggccgaactgggaaggcgagactgaccgaccgataagctagaacagagagacaacaac(SEQIDNO:7)這是在反義鏈中摻入尿嘧啶殘基的底物核酸分子的一個實例。核酸分子是部分雙鏈的并且在互補鏈中包含尿嘧啶殘基。這允許延伸后尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)降解互補鏈中的尿嘧啶殘基，并且因此阻止底物分子在不存在延伸的情況下(即在樣品中不存在核酸修飾活性的情況下)被非特異性地擴增。在一些另外的實施方案中，核酸分子的互補鏈在3’端包含修飾以防止延伸。所謂“延伸”意指添加另外的核苷酸?？梢詰萌魏芜m合的修飾。在一些具體實施方案中，修飾是或包括摻入不可延伸核苷酸?？梢詰萌魏芜m合的不可延伸核苷酸。例如，不可延伸核苷酸可以是或包括雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTP)，如SEDIDNO:6中所示的雙脫氧胞苷。應當指出，可以在本發(fā)明中利用這些序列的變體。例如，可以添加另外的側翼序列?？梢詰锰娲詃dNTP。變體序列可以與SEQIDNO6和7所列的底物核酸分子的核苷酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％核苷酸序列同一性。適當時核酸分子可以摻入合成核苷酸類似物，或可以是例如基于RNA或PNA的，或其混合物。在本文描述了例如用以保護免受核酸酶活性影響的適合的修飾。在某些實施方案中，可以例如使用熒光標記、或FRET對標記它們，以有助于檢測。在本文描述了適合的檢測方法。因此，(底物)核酸分子包括能夠通過核酸修飾活性被作用以產(chǎn)生(新的可檢測的)核酸分子的任何天然核酸和天然或合成類似物。在一些具體實施方案中，可以將底物延伸和/或連接。在一些實施方案中，可以應用核酸底物分子的組合，以允許檢測聚合酶和連接酶活性。優(yōu)選地，相對于核酸修飾活性(由微生物提供)，核酸底物過量地，并且特別是大摩爾過量地存在于樣品中。這是相對于現(xiàn)有技術方法的重要技術區(qū)別。因為新的經(jīng)延伸的或連接的核酸分子被檢測，所以只有在樣品中存在此分子對于檢測方法有效地工作而言是重要的。因此，如果其他核酸分子(如來自待檢測的微生物或來自哺乳動物或其他例如可以在待測試的樣品中發(fā)現(xiàn)的來源)存在于樣品中，它對本發(fā)明的方法不是有害的。在一些實施方案中，底物和/或引物可以摻入可彼此堿基配對的互補的非天然存在的分子，以避免非特異性地檢測基因組DNA。作為一個實例，適當時可以將pyDAD和puADA摻入引物和底物分子中(Sismour等人,NucleicAcidsResearch,2004,Vol.32,No.2:728-735)。也如本文所討論的，本發(fā)明的方法可以摻入IPC分子。根據(jù)方法要求，可以應用任何適合的IPC。作為一個實例，在本發(fā)明中可以使用以下IPC：gccgatatcggacaacggccgaactgggaaggcgagatcagcaggccacacgttaaagacagagagacaacaacgctggccgtttgtcaccgacgccta(SEQIDNO:3)在本發(fā)明的所有方法中，特異性確定不存在或存在修飾的核酸分子可以包括核酸擴增步驟、基本上由其組成或由其組成。這用于使得本發(fā)明的方法最大限度地敏感。此類擴增技術在本領域是公知的，并且包括方法如PCR、NASBA(Compton,1991)、3SR(Fahy等人,1991)、滾環(huán)復制、轉錄介導的擴增(TMA)、鏈置換擴增(SDA)(ClinicalChemistry45:777-784,1999)、描述于US6261846(通過引用結合在本文)中的DNA寡聚體自組裝過程、連接酶鏈式反應(LCR)(Barringer等人,1990)、靶多核苷酸序列的選擇性擴增(US6410276)、隨機引發(fā)的PCR(WO90/06995)、共有序列引發(fā)的PCR(US4437975)、侵入物(invader)技術、鏈置換技術以及切口置換擴增(WO2004/067726)。以上列表并不旨在是窮盡性的。可以使用任何核酸擴增技術，只要適當?shù)暮怂岙a(chǎn)物被特異性地擴增即可。類似地，在一些實施方案中，可以應用基于測序的方法學，以包括下一代測序平臺范圍的任何平臺。通過使用對待檢測的修飾的核酸分子的序列有特異性的擴增引物來實現(xiàn)擴增。為了提供對核酸分子的特異性，可以對與序列的適合區(qū)域對應的引物結合位點進行選擇。熟悉技術的讀者應理解，除引物結合位點之外，核酸分子還可以包括檢測由樣品中的修飾活性產(chǎn)生的新核酸分子所需的序列，例如RNA聚合酶結合位點或啟動子序列可以為恒溫擴增技術(如NASBA、3SR和TMA)所需。例如，一個或多個引物結合位點可以橋聯(lián)底物核酸分子的連接/延伸邊界，這樣使得只有已經(jīng)發(fā)生連接/延伸才產(chǎn)生擴增產(chǎn)物?？商娲?，引物可以結合在連接/延伸邊界的任一側，并且指導跨邊界進行擴增，這樣使得只有形成連接/延伸核酸分子才(以指數(shù)方式)產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。引物和底物核酸分子可以被設計成避免(例如樣品中基因組DNA的)非特異性擴增。在下文的實驗部分列出了用于在本發(fā)明的方法中使用的適合引物。它們包括包含SEQIDNO:4和/或5、基本上由其組成或由其組成的引物。這些引物形成本發(fā)明的一個單獨方面。應當指出，可以在本發(fā)明中利用這些序列的變體。特別地，可以根據(jù)需要添加另外的序列特異性側翼序列，例如以改進結合特異性。變體序列可以與在實驗部分中列出的引物的核苷酸序列有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％核苷酸序列同一性。適當時引物可以摻入合成核苷酸類似物，或可以是例如基于RNA或PNA的，或其混合物。取決于所應用的檢測模式，可以例如用熒光標記和/或FRET對標記引物?？梢岳锰结?，其也可以根據(jù)需要進行標記。因此，在某些方面中，使用核酸擴增技術進行本發(fā)明的方法，以檢測作為核酸修飾活性對底物核酸分子作用的直接結果產(chǎn)生的修飾的核酸分子，其指示在樣品中存在微生物。在某些實施方案中，所使用的技術選自PCR、NASBA、3SR、TMA、SDA以及DNA寡聚體自組裝?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法(例如像凝膠電泳)檢測擴增產(chǎn)物，但是在一些實施方案中使用實時或末端檢測方法來進行。在本領域已知許多用于實時或末端檢測擴增反應產(chǎn)物的技術。這些包括使用嵌入式熒光染料(如SYBRGreenI)(Sambrook和Russell,MolecularCloning-ALaboratoryManual,第三版)，這允許基于所產(chǎn)生的熒光的量來估計擴增DNA的產(chǎn)量。許多實時檢測方法產(chǎn)生可以進行連續(xù)監(jiān)測的熒光讀出；一些具體實例包括分子信標和熒光共振能量轉移探針。實時和末端技術是有利的，因為它們將反應保持在“單管(singletube)”中。這意味著為了獲得結果無需下游分析，使得更快速地獲得結果。此外，將反應保持在“單管”環(huán)境中降低了交叉污染的風險并且允許從本發(fā)明的方法進行定量輸出。在本發(fā)明的健康和安全問題是最重要的背景下(如在檢測例如患者樣品中的潛在微生物感染中)，這是特別重要的。可以使用系統(tǒng)(AppliedBiosystems)完成對PCR反應的實時和末端定量，參見Holland等人；Detectionofspecificpolymerasechainreactionproductbyutilisingthe5'-3'exonucleaseactivityofThermusaquaticusDNApolymerase；Proc.Natl.Acad.Sci.USA88,7276-7280(1991)，Gelmini等人Quantitativepolymerasechainreaction-basedhomogeneousassaywithflurogenicprobestomeasureC-Erb-2oncogeneamplification.Clin.Chem.43,752-758(1997)和Livak等人Towardsfullyautomatedgenomewidepolymorphismscreening.Nat.Genet.9,341-342(19995)(通過引用結合在本文)。這種類型的探針可以統(tǒng)稱為水解探針。還提供了用于在實時或末端檢測中使用的適合的水解/Taqman探針?？梢岳缡褂孟挛脑敿毭枋龅臉擞泴μ结樳M行適當標記。在分子信標系統(tǒng)中，參見Tyagi&Kramer.Molecularbeacons-probesthatfluoresceuponhybridization.Nat.Biotechnol.14,303-308(1996)和Tyagi等人Multicolormolecularbeaconsforallelediscrimination.Nat.Biotechnol.16,49-53(1998)(通過引用結合在本文)，信標是具有內(nèi)部淬滅熒光團的發(fā)夾形狀的探針，當結合至其靶標時其熒光團的熒光被恢復。這些探針可以稱為發(fā)夾探針。在本發(fā)明中有用的適合的探針被列出為SEQIDNO:1和2?？梢該饺氡景l(fā)明方法中的另外的基于實時熒光的系統(tǒng)是Scorpion系統(tǒng)，參見Whitcombe等人的DetectionofPCRproductsusingself-probingampliconsandfluorescenceNatureBiotechnology17,804-807(1999年8月1日)。本領域技術人員公知且可商購的另外的實時或末端檢測技術包括技術、引物技術、DzyNA引物(Todd等人,ClinicalChemistry46:5,625-630(2000))或PlexorTMqPCR和qRT-PCR系統(tǒng)。因此，在本發(fā)明的一些另外的方面中，使用實時或末端技術檢測核酸擴增產(chǎn)物。在本發(fā)明的一些具體實施方案中，實時技術由使用以下項中的任一種組成：水解探針(系統(tǒng))、FRET探針(系統(tǒng))、發(fā)夾引物(系統(tǒng))、發(fā)夾探針(分子信標系統(tǒng))、摻入引物的發(fā)夾探針(探針系統(tǒng))、摻入DNA酶(DNAzyme)的互補序列和可切割的熒光DNA酶底物的引物(DzYNA)、PlexorqPCR以及寡核苷酸阻斷系統(tǒng)?？梢詫U增產(chǎn)物進行定量，以給出樣品中微生物核酸修飾活性的近似值，并且因此給出樣品中微生物的水平。因此，“不存在或存在”旨在涵蓋對樣品中微生物的水平進行定量。在某些實施方案中，反應混合物將含有以下全部；測試的樣品、底物核酸分子、任選地除允許實時或末端檢測擴增產(chǎn)物所需的試劑之外，擴增修飾的核酸分子所需的試劑、緩沖液和酶。因此，核酸修飾活性(來自一種或多種感興趣的細菌細胞或微生物)的整個檢測方法可以發(fā)生在單一反應中，具有定量輸出，并且無需任何中間洗滌步驟。使用“單管”反應是有利的，因為為了獲得結果無需下游分析，使得更快速地獲得結果。此外，將反應保持在“單管”環(huán)境中降低了交叉污染的風險并且允許從本發(fā)明的方法進行定量輸出。并且，單管反應更易于自動化，例如在高通量背景下?？商娲兀景l(fā)明的方法可以按逐步方式進行。因此，在第一步中，首先可以需要制備處于適合在本發(fā)明方法中使用的形式的樣品。例如，如本文所討論的，可需要選擇性細胞裂解或增加細胞通透性。如本文所描述的，俘獲特定核酸修飾活性(如聚合酶或連接酶)也可以是希望的?？梢砸种破渌怂嵝揎椈钚?的來源)(如核酸酶活性)等。在擴增步驟之前，本發(fā)明方法的步驟可以不包括在高于40℃、高于50℃、高于60℃、高于70℃、高于80℃、高于90℃或高于95℃的溫度下進行的步驟?？商娲?，本發(fā)明的方法可以不包括在高于40℃、高于50℃、高于60℃、高于70℃、高于80℃、高于90℃或高于95℃的溫度下進行的任何步驟。在擴增步驟之前，本發(fā)明方法的步驟可以在10與50攝氏度之間、15與45攝氏度之間、20與40攝氏度之間、25與40攝氏度之間、30與40攝氏度之間、25與35攝氏度之間、或15與30攝氏度之間的溫度下進行，任選地擴增步驟之前的方法步驟可以在室溫下進行。可替代地，本發(fā)明方法的步驟可以全部在10與50攝氏度之間、15與45攝氏度之間、20與40攝氏度之間、25與40攝氏度之間、30與40攝氏度之間、25與35攝氏度之間、或15與30攝氏度之間的溫度下進行，任選地所有方法步驟可以在室溫下進行。本發(fā)明的方法可以包括使樣品中的核酸酶活性失活的步驟?？商娲?，本發(fā)明的方法不包括使樣品中的核酸酶活性失活的步驟。如果進行的話，使核酸酶活性失活的步驟發(fā)生在孵育步驟之后且在特異性確定不存在或存在修飾的核酸分子(例如通過擴增)的步驟之前。在本發(fā)明的背景下，“樣品”被定義為包括任何這樣的樣品，在其中希望的是測試表達核酸修飾活性的微生物(如真菌(例如酵母)或細菌)的存在。因此，樣品可以包括臨床樣品(如血液樣品)、基本上由其組成或由其組成。本發(fā)明的方法特別適用于快速確定陰性血液培養(yǎng)物。因此，樣品可以包括來自疑似患有血流感染、或針對血流感染進行篩選的患者的血液培養(yǎng)物樣品。樣品可以是任何適合體積(如1至10ml，優(yōu)選1ml)的血液培養(yǎng)物樣品。可替代地，樣品可以是或包含例如體外測定系統(tǒng)。樣品可以包括飲料或食物樣品或其制劑、或藥物或化妝品(如個人護理產(chǎn)品，包括洗發(fā)劑、護發(fā)素、保濕劑等)、基本上由其組成或由其組成，全部這些均按照規(guī)定針對微生物污染進行測試。例如，樣品可以包括組織或細胞、基本上由其組成或由其組成，并且可以包括痰液或血液樣品或血小板樣品、基本上由其組成或由其組成。另外，本發(fā)明的方法和試劑盒可以用于監(jiān)測表面污染，例如像正在準備食物的地點中。污染通過微生物核酸修飾活性的存在來指示。污染可以來自任何微生物來源，特別是細菌或真菌(例如酵母)污染。此外，本發(fā)明還可用于監(jiān)測環(huán)境條件，如水供應、廢水、海洋環(huán)境等。本發(fā)明還可用于監(jiān)測發(fā)酵過程中和大氣采樣中(可以評估醫(yī)院、工業(yè)設施中或生物防護應用中的細菌或孢子含量)的細菌生長。除針對不存在或存在微生物對樣品進行篩選之外，本發(fā)明的方法還具有多種應用。因此，在一個另外的方面中，本發(fā)明提供了如本文所描述的方法用于篩選對針對微生物的試劑的微生物耐受性的用途。該方法可以涉及使含有感興趣微生物的樣品暴露于該試劑并且然后進行本發(fā)明的方法以確定該微生物是否具有耐受性的步驟。如果微生物具有耐受性，則將檢測到修飾的核酸分子。典型地，使用良好表征的樣品(如感興趣微生物的培養(yǎng)的臨床分離株)進行此類方法。類似地，本發(fā)明提供了如本文所描述的方法用于篩選候選試劑的用途，所述候選試劑可以能夠殺死一種或多種微生物或阻止其生長。這種方法可以涉及使含有微生物的樣品暴露于該試劑并且然后進行本發(fā)明的方法。如果該試劑是有效殺死劑，則將檢測不到(或檢測到減少的)修飾的核酸。典型地，使用良好表征的樣品(如感興趣微生物的培養(yǎng)的臨床分離物)進行此類方法。所述方法可以作為時間過程實驗來進行，以確定該試劑是否能夠阻止該微生物的生長(即使無法殺死)。可以在不存在該試劑的情況下運行平行反應，以確定微生物在不存在該試劑的情況下的生長。這提供了該試劑就生長抑制活性而言的有效性的比較。進一步地，本發(fā)明提供了如本文所描述的方法用于診斷受試者的感染、或與微生物的存在相關的疾病的用途。在這種背景下，“樣品”將通常是臨床樣品。將使用的樣品將取決于將測試的病癥?？梢允褂玫⒉恢荚谙拗票景l(fā)明的典型樣品包括取自患者、最優(yōu)選人類患者的全血、血清、血漿、血小板以及尿液樣本等。在一個優(yōu)選實施方案中，測試將是在從受試者取出的樣品上進行的體外測試。在一個另外的實施方案中，上述診斷方法可以另外包括從受試者獲得樣品的步驟。從受試者獲得適合樣品的方法在本領域是公知的。可替代地，該方法可以以已經(jīng)在單獨程序中從患者體內(nèi)分離的樣品開始進行。所述診斷方法將最優(yōu)選地在來自人的樣品上進行，但是本發(fā)明的方法對許多動物而言可以具有診斷實用性。本發(fā)明的診斷方法可以用于補充任何已經(jīng)可供使用的診斷技術，潛在地作為確認初步診斷的方法?？商娲?，所述方法可以憑其本身的實力被用作初步診斷方法，因為所述方法提供快速且方便的診斷手段。此外，由于其固有敏感性，本發(fā)明的診斷方法僅需要最少的樣品，從而避免不必要的侵入性手術。并且，根據(jù)本發(fā)明的方法，還可以有效地測試大而非濃縮的樣品。因此，除檢測樣品中的污染生物體之外，本發(fā)明的方法還具有多種應用。上文提供的關于本發(fā)明的各個方面的描述比照適用于本發(fā)明的其他方面，并且出于簡明性的原因不再重復。例如，可以對本發(fā)明的每種方法并入適合的對照。在一些具體實施方案中，微生物是病原性微生物，如病原性細菌。細菌可以是能夠引起受試者、優(yōu)選人類受試者感染或疾病的任何細菌。在一個實施方案中，細菌包括Staphylococcus物種(特別是Staphylococcusaureus并且優(yōu)選甲氧西林耐受性菌株)、Enterococcus物種、Streptococcus物種、Mycobacterium物種(特別是Mycobacteriumtuberculosis)、Vibrio物種(特別是Vibriocholerae)、Salmonella和/或Escherichiacoli等中的任何一種或多種，或基本上由其組成或由其組成。在某些實施方案中，細菌可以包括Clostridium物種并且特別是C.difficile、基本上由其組成或由其組成。C.difficile是抗生素相關腹瀉和結腸炎(一種主要影響老年患者伴有其他基礎疾病的保健相關的腸道感染)的主要病因。可以對Candida物種(如C.albicans,、C.parapsilosis和C.glabrata)進行檢測?？梢詫ryptococcus物種(如C.neoformans)進行檢測?？梢允褂帽景l(fā)明檢測(存在或不存在)真菌血癥(如念珠菌血癥)。在某些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的這些另外的方面，在該方法中被測試的分子(針對耐受性或治療感染的能力或對細胞的毒性)是抗微生物化合物。在化合物篩選方法中，可以對任何分子進行測試。實例包括抗微生物劑、核酸分子(包括siRNA(dsRNA)分子和反義分子)、小分子、抗體及其所有衍生物(包括例如Fab片段、可變區(qū)片段和單域抗體，只要它們保留結合親和力即可)等。該方法可以在高通量背景下進行，以在短時間段內(nèi)對大量分子進行篩選。在一個實施方案中，抗微生物劑可以取自兩種主要類型的抗微生物劑，即抗生素(由微生物產(chǎn)生的天然物質)和化療劑(化學合成的)，或者可以是二者的雜合體，如半合成抗生素(一種后續(xù)修飾的天然產(chǎn)生的抗生素)或合成抗生素(天然抗生素的合成版本)。在本發(fā)明的方法中得到陽性結果后，就殺死細菌或細菌細胞或待測試的其他適合微生物或阻止其生長的能力而言，可以針對以下至少一種或多種特性對適合的候選抗微生物劑進行測試：(1)該試劑對于受試者而言應該是無毒的并且沒有不良副作用，(2)該試劑對于受試者而言應該是非變應性的，(3)該試劑不應消除受試者的天然菌群，(4)該試劑應該是穩(wěn)定的，(5)該試劑應該優(yōu)選是便宜且易于獲得/易于制備的；以及(6)該試劑應該是足夠有效的，使得不會產(chǎn)生病原體耐受性(至任何可評估的程度)。這種特征可以根據(jù)上文描述的方法進行測試。在一個實施方案中，可以針對治療感染的能力和/或針對其的耐受性對多種適合的抗微生物劑的組合進行測試。可以針對耐受性并且或許也可以針對其治療某些感染的新能力對其進行測試的抗生素或其衍生物可以選自下組(通過舉例提供但不限于)；β-內(nèi)酰胺類如青霉素(特別是青霉素G或V)和頭孢菌素如頭孢噻吩、半合成青霉素(如氨芐西林、甲氧西林和阿莫西林)、優(yōu)選與半合成青霉素制劑結合使用的克拉維酸(例如像克拉莫西(clavamox)或安滅菌(augmentin))，單酰胺菌素如氨曲南，羧基青霉烯類(carboxypenem)(如亞胺培南)，氨基糖苷類如鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素和慶大霉素，糖肽類如萬古霉素、林可霉素和克林霉素，大環(huán)內(nèi)酯類如紅霉素和竹桃霉素，多肽類如多粘菌素和桿菌肽，多烯類如兩性霉素和制霉菌素，利福霉素類如利福平，四環(huán)素類如四環(huán)素，半合成四環(huán)素類如多西環(huán)素、氯四環(huán)素、氯霉素，喹諾酮類如萘啶酮酸和氟喹諾酮以及競爭性抑制劑如磺胺類(例如甘特里辛和甲氧芐胺嘧啶)。也可以利用頭孢曲松和/或呋喃西林。仍進一步地，本發(fā)明提供了如本文所描述的方法用于檢測含有血小板的樣品中存在微生物污染的用途。在此類方面中，這些方法可以并入以下子步驟：(i)在保留微生物細胞完整的條件下裂解血小板。這主要允許在測試核酸修飾活性的存在之前選擇性濃縮微生物。因此，可以在測試之前去除由哺乳動物細胞提供的核酸修飾活性(ii)濃縮微生物(例如通過離心以產(chǎn)生含有細菌細胞的沉淀)(iii)裂解微生物或處理以增加微生物的通透性以釋放核酸修飾活性。本發(fā)明還涉及在進行本發(fā)明方法中有用的試劑盒。因此，提供了用于進行如本文所描述的方法的試劑盒，該試劑盒包含：(a)至少一種充當樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子，其中該至少一種核酸分子至少部分是雙鏈的并且在互補鏈中包含尿嘧啶殘基，其特征在于該核酸分子被修飾以保護它免受核酸酶活性影響(b)至少一種內(nèi)部陽性對照(IPC)核酸分子，其包含與核酸分子相同的引物結合位點，這樣使得在含有該核酸分子和該IPC兩者的核酸擴增反應中存在引物結合競爭。試劑盒可以摻入進行本發(fā)明方法所需的任何組分。因此，本發(fā)明方法的所有討論比照適用。在本發(fā)明的背景下，核酸分子被預修飾以保護它免受核酸酶活性影響。在一些實施方案中，試劑盒進一步包含結合至核酸分子(的有義鏈)內(nèi)的靶探針序列上的核酸探針。試劑盒可以進一步包含結合至IPC核酸分子內(nèi)的靶探針序列上的另外的核酸探針。在某些實施方案中，核酸探針不結合至IPC核酸分子上并且另外的核酸探針不結合至核酸分子上?？梢詷擞浐怂崽结樅?或另外的核酸探針。在一些具體實施方案中，不同地標記核酸探針和另外的核酸探針。例如，可以用具有不同的最大發(fā)射波長的熒光團標記它們。適合的標記對可以由本領域技術人員容易地進行選擇，例如FAM和德克薩斯紅可以被用作不同的標記。在一些另外的實施方案中，核酸分子的互補鏈在3’端包含修飾以防止延伸。所謂“延伸”意指添加另外的核苷酸?？梢詰萌魏芜m合的修飾。在一些具體實施方案中，修飾是或包括摻入不可延伸核苷酸?？梢詰萌魏芜m合的不可延伸核苷酸。例如，不可延伸核苷酸可以是或包括雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTP)，如雙脫氧胞苷。在一些另外的實施方案中，IPC被修飾以保護它免受核酸酶活性影響。在本發(fā)明的背景下，IPC被預修飾以保護它免受核酸酶活性影響。適合的修飾在本文進行了更加詳細地討論并且可以選自摻入甲基化、保護3’和/或5’端、摻入合成核苷酸。合成核苷酸可以是或包括硫代磷酸酯核苷酸和/或鎖核酸核苷酸。優(yōu)選地，合成核苷酸是硫代磷酸酯核苷酸。如果兩種分子都被修飾，則優(yōu)選的是以相同或類似方式修飾它們，這樣使得核酸酶耐受性是可比的。這允許IPC發(fā)揮最有用的比較物角色，以確定核酸酶活性對底物分子的影響。在一些另外的實施方案中，試劑盒進一步包含高pH試劑。高pH試劑可以是或包括NaOH或Na2CO3。在一些具體實施方案中，高pH試劑的濃度在5mM左右或更大。試劑盒可以進一步包含降pH劑。降pH試劑可以包括緩沖液或酸，如Tris-HCl緩沖液(例如pH7.2或8)。試劑盒可以摻入進行反應的適合載體。有利地，這樣的載體可以包括多孔板，例如像48或96孔板。這樣的載體允許在相對小的體積中進行檢測方法-因此有助于擴大規(guī)模和最小化所需的樣品體積。試劑盒典型地包含適合的說明書。這些說明書允許使用本發(fā)明的試劑盒可靠地進行本發(fā)明的方法?？梢栽谝韵戮幪栱椫羞M一步定義本發(fā)明：一種檢測樣品中不存在或存在微生物的方法，該方法包括：(a)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子接觸，(b)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(c)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物，其特征在于該核酸分子被修飾以保護它免受核酸酶活性影響。2.如項1所述的方法，其中該修飾選自摻入甲基化、保護3’和/或5’端和摻入合成核苷酸。3.如項2所述的方法，其中合成核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸和/或鎖核酸核苷酸。4.一種檢測樣品中不存在或存在微生物的方法，該方法包括：(a)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子接觸，(b)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(c)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物，其特征在于將該核酸分子以至少2nM但小于50nM的濃度添加至該樣品中。5.如項4所述的方法，其中步驟(a)和/或(b)包括向該樣品中添加濃度為至少100μM的脫氧核糖核苷酸三磷酸。6.一種檢測樣品中不存在或存在微生物的方法，該樣品含有核酸修飾活性的非微生物來源，該方法包括：(a)在高pH條件下將該樣品處理不多于5分鐘，以抑制核酸修飾活性的非微生物來源(同時不影響該樣品中微生物的核酸修飾活性)，(b)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子接觸，(c)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(d)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物。7.如項6所述的方法，其中高pH條件包括使該樣品與NaOH或Na2CO3接觸。8.如項7所述的方法，其中NaOH或Na2CO3的濃度為5mM左右或更大。9.如項6至8中任一項所述的方法，其中通過添加試劑降低pH來使高pH條件下的該處理停止。10.如項9所述的方法，其中通過添加緩沖液或酸降低pH。11.如項10所述的方法，其中該緩沖液包括Tris-HCl緩沖液(例如pH7.2或8)。12.如項6至11中任一項所述的方法，其中步驟(a)在15與30攝氏度之間的溫度下進行。13.如項6至12中任一項所述的方法，其中步驟(a)在室溫下進行。14.如項1至13中任一項所述的方法，其中該方法在15與30攝氏度之間的溫度下進行。15.如項1至14中任一項所述的方法，其中該方法在室溫下進行。16.一種檢測樣品中不存在或存在微生物的方法，該樣品含有核酸修飾活性的非微生物來源，該方法包括：(a)(i)用裂解該樣品中的非微生物(如果存在的話)但不裂解該樣品中的微生物的試劑孵育該樣品(ii)任選地將經(jīng)裂解的細胞材料與該樣品中的完整微生物(如果有的話)分離(iii)使該樣品中的(分離的)完整微生物(如果有的話)與高pH試劑接觸并孵育不多于5分鐘，以抑制核酸修飾活性的非微生物來源(同時不影響該樣品中微生物的核酸修飾活性)(iv)添加降pH試劑，以使高pH下的孵育停止(v)將該樣品中的微生物(如果存在的話)與pH修飾試劑分離(vi)裂解任何分離的微生物(vi)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子接觸，(vii)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(viii)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物?；?b)(i)用裂解該樣品中的非微生物(如果存在的話)但不裂解該樣品中的微生物的試劑孵育該樣品(ii)將該樣品離心，以形成含有該樣品中的微生物(如果存在的話)的沉淀(iii)從該沉淀中去除上清液(iv)將該沉淀重懸于高pH試劑中并孵育不多于8分鐘，以抑制核酸修飾活性的非微生物來源(同時不影響該樣品中微生物的核酸修飾活性)(v)添加降pH試劑，以使高pH下的孵育停止(vi)將該樣品第二次離心，以形成含有該樣品中的微生物(如果存在的話)的沉淀(vi)從該沉淀中去除上清液(vii)裂解該沉淀中的任何微生物(viii)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子接觸，(ix)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(x)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物。17.如項16所述的方法，其中該高pH試劑包括NaOH或Na2CO3。18.如項16或17所述的方法，其中該高pH試劑的濃度為5mM左右或更大。19.如項16至18中任一項所述的方法，其中該降pH試劑包括緩沖液或酸。20.如項19所述的方法，其中該緩沖液包括Tris-HCl緩沖液(pH7.2或8)21.如項16至20中任一項所述的方法，其中步驟(a)(iii)或(b)(iv)在15與30攝氏度之間的溫度下進行。22.如項16至21中任一項所述的方法，其中步驟(a)(iii)或(b)(iv)在室溫下進行。23.如項16至22中任一項所述的方法，其中該方法在15與30攝氏度之間的溫度下進行。24.如項16至23中任一項所述的方法，其中該方法在室溫下進行。25.一種檢測(液體)樣品中不存在或存在微生物的方法，該樣品潛在地含有核酸酶活性的非微生物來源，該方法包括：(i)用裂解該樣品中的非微生物(如果存在的話)但不裂解該樣品中的微生物的試劑孵育該樣品(ii)將該經(jīng)裂解的細胞材料與該樣品中的完整微生物(如果有的話)分離和/或使經(jīng)裂解的細胞材料失活(iii)分離和/或失活后，裂解任何微生物(iv)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子連同內(nèi)部陽性對照(IPC)核酸分子接觸，(v)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(vi)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物，其特征在于該IPC核酸分子被修飾以保護它免受核酸酶活性影響或(a)將該樣品離心，以形成含有該樣品中的微生物(如果存在的話)的沉淀(b)從該沉淀中去除上清液(c)裂解該沉淀中的任何微生物(d)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子連同內(nèi)部陽性對照(IPC)核酸分子接觸，(e)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(f)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物，其特征在于該IPC核酸分子被修飾以保護它免受核酸酶活性影響。26.如項25所述的方法，其中該核酸分子被修飾以保護它免受核酸酶活性影響。27.如項25或26所述的方法，其中該修飾選自摻入甲基化、保護3’和/或5’端、摻入合成核苷酸。28.如項27所述的方法，其中合成核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸和/或鎖核酸核苷酸。29.一種檢測(液體)樣品中不存在或存在微生物的方法，該樣品潛在地含有核酸酶活性的非微生物來源，該方法包括：(i)用裂解該樣品中的非微生物(如果存在的話)但不裂解該樣品中的微生物的試劑孵育該樣品(ii)將該經(jīng)裂解的細胞材料與該樣品中的完整微生物(如果有的話)分離和/或使該經(jīng)裂解的細胞材料失活(iii)分離和/或失活后，裂解任何微生物(iv)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子連同內(nèi)部陽性對照(IPC)核酸分子接觸，(v)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(vi)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物，其特征在于該IPC核酸分子易受核酸酶活性影響并且用于鑒定該沉淀中的污染核酸酶活性?；?a)將該樣品離心，以形成含有該樣品中的微生物(如果存在的話)的沉淀(b)從該沉淀中去除上清液(c)裂解該沉淀中的任何微生物(d)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子連同內(nèi)部陽性對照(IPC)核酸分子接觸，(e)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(f)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物，其特征在于該IPC核酸分子易受核酸酶活性影響并且用于鑒定該沉淀中的污染核酸酶活性。30.如項25至29中任一項所述的方法，其中分別一起進行步驟(iii)和(iv)或(c)和(d)。31.如項30所述的方法，其中將該核酸分子連同裂解試劑添加至該樣品中。32.如項1至31中任一項所述的方法，其中特異性確定不存在或存在該修飾的核酸分子包括核酸擴增步驟。33.如項32所述的方法，其中該核酸分子至少部分是雙鏈的并且在互補鏈中包含尿嘧啶殘基，并且特異性確定不存在或存在該修飾的核酸分子的步驟包括向該樣品中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)，以降解該互補鏈中的尿嘧啶殘基。34.如項25至33中任一項所述的方法，其中該IPC核酸分子包含與核酸分子相同的引物結合位點，這樣使得在步驟(f)中存在引物結合競爭。35.如項25至34中任一項所述的方法，其中在步驟(f)中添加結合至該核酸分子(的有義鏈)內(nèi)的靶探針序列上的核酸探針。36.如項25至35中任一項所述的方法，其中在步驟(f)中添加結合至該IPC核酸分子內(nèi)的靶探針序列上的另外的核酸探針。37.如項36所述的方法，其中該核酸探針不結合至該IPC核酸分子上并且該另外的核酸探針不結合至該核酸分子上。38.如項35至37中任一項所述的方法，其中對該核酸探針進行標記。39.如項35至38中任一項所述的方法，其中對該另外的核酸探針進行標記。40.如項38或39所述的方法，其中對該核酸探針和另外的核酸探針進行不同的標記41.如項33所述的方法，其中該核酸分子的互補鏈在3’端包含修飾以防止延伸。42.如項41所述的方法，其中該修飾包括摻入不可延伸核苷酸。43.如項42所述的方法，其中該不可延伸核苷酸是雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTP)。44.如項43所述的方法，其中該ddNTP是雙脫氧胞苷。45.如項29至44中任一項所述的方法，其中該核酸分子被修飾以保護它免受核酸酶活性影響。46.如項45所述的方法，其中該修飾選自摻入甲基化、保護3’和/或5’端、摻入合成核苷酸。47.如項46所述的方法，其中合成核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸和/或鎖核酸核苷酸。48.一種檢測樣品中不存在或存在微生物的方法，該樣品含有核酸修飾活性的非微生物來源，該方法包括：(i)用裂解該樣品中的非微生物(如果存在的話)但不裂解該樣品中的微生物的試劑孵育該樣品(ii)任選地將該經(jīng)裂解的細胞材料與該樣品中的完整微生物(如果有的話)分離(iii)使該樣品中的(分離的)完整微生物(如果有的話)與高pH試劑接觸并孵育不多于5分鐘，以抑制核酸修飾活性的非微生物來源(同時不影響該樣品中微生物的核酸修飾活性)(iv)添加降pH試劑，以使高pH下的孵育停止(v)將該樣品中的微生物(如果存在的話)與pH修飾試劑分離(vi)裂解任何分離的微生物(vii)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子接觸，(viii)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(ix)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物，其中該核酸分子被修飾以保護它免受核酸酶活性影響?；?a)用裂解該樣品中的非微生物(如果存在的話)但不裂解該樣品中的微生物的試劑孵育該樣品(b)將該樣品離心，以形成含有該樣品中的微生物(如果存在的話)的沉淀(c)從該沉淀中去除上清液(d)將該沉淀重懸于高pH試劑中并孵育不多于8分鐘，以抑制核酸修飾活性的該非微生物來源(同時不影響該樣品中微生物的核酸修飾活性)(e)添加降pH試劑，以使高pH下的孵育停止(f)將該樣品第二次離心，以形成含有該樣品中的微生物(如果存在的話)的沉淀(g)從該沉淀中去除上清液(h)裂解該沉淀中的任何微生物(i)使該樣品與充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子接觸，(j)在適于核酸修飾活性的條件下孵育如此接觸的樣品；以及(k)特異性確定不存在或存在由于該核酸修飾活性對該底物核酸分子的作用得到的經(jīng)修飾的核酸分子，以指示不存在或存在該微生物，其中該核酸分子被修飾以保護它免受核酸酶活性影響。49.如項48所述的方法，其中該修飾選自摻入甲基化、保護3’和/或5’端、摻入合成核苷酸。50.如項49所述的方法，其中合成核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸和/或鎖核酸核苷酸。51.如項48至50中任一項所述的方法，其特征還在于將該核酸分子以至少2nM且小于50nM的濃度添加至該樣品中。52.如項48至51中任一項所述的方法，其中步驟(vii)或(i)分別包括向該樣品中添加濃度為至少100μM的脫氧核糖核苷酸三磷酸。53.如項48至52中任一項所述的方法，其中該高pH試劑包括NaOH或Na2CO3。54.如項48至53中任一項所述的方法，其中該高pH試劑的濃度為5mM左右或更大。55.如項48至54中任一項所述的方法，其中該降pH試劑包括緩沖液或酸。56.如項55所述的方法，其中該緩沖液包括Tris-HCl緩沖液(pH7.2或8)57.如項48至56中任一項所述的方法，其中步驟(iv)或(d)分別在15與30攝氏度之間的溫度下進行。58.如項48至57中任一項所述的方法，其中步驟(iv)或(d)分別在室溫下進行。59.如項48至58中任一項所述的方法，其中該方法在15與30攝氏度之間的溫度下進行。60.如項48至59中任一項所述的方法，其中該方法在室溫下進行。61如項48至60中任一項所述的方法，其中步驟(vi)或(i)分別包括使該樣品與充當該樣品中微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子連同內(nèi)部陽性對照(IPC)核酸分子接觸，其中該IPC核酸分子易受核酸酶活性影響并且用于鑒定該沉淀中的污染核酸酶活性。62.如項48至60中任一項所述的方法，其中步驟(vi)或(i)分別包括使該樣品與充當該樣品中微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子連同內(nèi)部陽性對照(IPC)核酸分子接觸，其中該IPC核酸分子被修飾以保護它免受核酸酶活性影響。63.如項62所述的方法，其中該修飾選自摻入甲基化、保護3’和/或5’端、摻入合成核苷酸。64.如項63所述的方法，其中合成核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸和/或鎖核酸核苷酸。65.如項48至64中任一項所述的方法，其中分別一起進行步驟(vi)和(vii)或(h)和(i)。66.如項65所述的方法，其中將該核酸分子連同裂解試劑添加至該樣品中。67.如項48至66中任一項所述的方法，其中步驟(xi)或(k)分別包括核酸擴增步驟。68.如項48至67中任一項所述的方法，其中該核酸分子至少部分是雙鏈的并且在互補鏈中包含尿嘧啶殘基，并且步驟(k)包括向該樣品中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)，以降解該互補鏈中的尿嘧啶殘基。69.如項64至68中任一項所述的方法，其中該IPC核酸分子包含與核酸分子相同的引物結合位點，這樣使得分別在步驟(xi)或(k)中存在引物結合競爭。70.如項48至69中任一項所述的方法，其中在(xi)或(k)中分別添加結合至該核酸分子(的有義鏈)內(nèi)的靶探針序列上的核酸探針。71.如項70所述的方法，其中在步驟(xi)或(k)中分別添加結合至該IPC核酸分子內(nèi)的靶探針序列上的另外的核酸探針。72.如項71所述的方法，其中該核酸探針不結合至該IPC核酸分子上并且該另外的核酸探針不結合至該核酸分子上。73.如項70至72中任一項所述的方法，其中對該核酸探針進行標記。74.如項71至73中任一項所述的方法，其中對該另外的核酸探針進行標記。75.如項74所述的方法，其中對該核酸探針和另外的核酸探針進行不同的標記。76.如項68至75中任一項所述的方法，其中該核酸分子的互補鏈在3’端包含修飾以防止延伸。77.如項76所述的方法，其中該修飾包括摻入不可延伸核苷酸。78.如項77所述的方法，其中該不可延伸核苷酸是雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTP)。79.如項78所述的方法，其中該ddNTP是雙脫氧胞苷。80.如項1至79中任一項所述的方法，其中該核酸修飾活性包括聚合酶活性。81.根據(jù)項1至80中任一項所述的方法用于篩選對針對微生物的試劑的微生物耐受性的用途。82.根據(jù)項1至80中任一項所述的方法用于篩選可以能夠殺死一種或多種微生物或阻止其生長的候選試劑的用途。83.根據(jù)項1至80中任一項所述的方法用于診斷受試者的感染、或與微生物的存在相關的疾病的用途。84.根據(jù)項1至80中任一項所述的方法用于檢測含有血小板的樣品中存在微生物污染的用途。85.一種用于進行根據(jù)項1至84中任一項所述的方法的試劑盒，該試劑盒包含：(a)至少一種充當該樣品中的微生物的核酸修飾活性的底物的核酸分子，其中該至少一種核酸分子至少部分是雙鏈的并且在互補鏈中包含尿嘧啶殘基，其特征在于該核酸分子被修飾以保護它免受核酸酶活性影響(b)至少一種內(nèi)部陽性對照(IPC)核酸分子，其包含與該核酸分子相同的引物結合位點，這樣使得在含有該核酸分子和該IPC兩者的核酸擴增反應中存在引物結合競爭。86.如項85所述的試劑盒，其中該試劑盒進一步包含結合至該核酸分子(的有義鏈)內(nèi)的靶探針序列上的核酸探針。87.如項85或86所述的試劑盒，其中該試劑盒進一步包含結合至該IPC核酸分子內(nèi)的靶探針序列上的另外的核酸探針。88.如項86或87所述的試劑盒，其中該核酸探針不結合至該IPC核酸分子上并且該另外的核酸探針不結合至該核酸分子上。89.如項86至88中任一項所述的試劑盒，其中對該核酸探針進行標記。90.如項87至89中任一項所述的試劑盒，其中對該另外的核酸探針進行標記。91.如項87至90中任一項所述的試劑盒，其中對該核酸探針和另外的核酸探針進行不同的標記。92.如項85至91中任一項所述的試劑盒，其中該核酸分子的互補鏈在3’端包含修飾以防止延伸。93.如項92所述的試劑盒，其中該修飾包括摻入不可延伸核苷酸。94.如項93所述的試劑盒，其中該不可延伸核苷酸是雙脫氧核苷酸三磷酸(ddNTP)。95.如項94所述的試劑盒，其中該ddNTP是雙脫氧胞苷。96.如項85至95中任一項所述的試劑盒，其中該IPC被修飾以保護它免受核酸酶活性影響。97.如項96所述的試劑盒，其中該修飾選自摻入甲基化、保護3’和/或5’端、摻入合成核苷酸。98.如項97所述的試劑盒，其中合成核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸和/或鎖核酸核苷酸。99.如項85至98中任一項所述的試劑盒，其中該試劑盒進一步包含高pH試劑。100.如項99所述的試劑盒，其中該高pH試劑包括NaOH或Na2CO3。101.如項99或100所述的試劑盒，其中該高pH試劑的濃度為5mM左右或更大。102.如項85至101中任一項所述的試劑盒，該試劑盒進一步包含降pH劑。103.如項102所述的試劑盒，其中該降pH試劑包括緩沖液或酸。104.如項103所述的試劑盒，其中該緩沖液包括Tris-HCl緩沖液(pH7.2或8)。附圖描述圖1.通過增加dNTP和底物濃度改進微生物的ETGA檢測。每個圖表都示出了在針對一系列相關微生物的ETGA檢測實驗中對ETGA靶底物(FAM通道)的檢測獲得的ct值。在所有情況下，陰性血液培養(yǎng)物對照>39.9ct單位，陰性試劑陰性對照>40ct單位，并且陽性試劑對照<20ct單位。圖2.與陰性對照樣品相比，通過在微生物裂解混合物(LM)或PCR主混合物(mastermix，MM)中僅添加IPCDNA制備的血液培養(yǎng)物樣品中的IPC分子的檢測。將一定數(shù)量的IPCDNA添加至LM中，以提供與當添加至MM中時相同的ct值。數(shù)據(jù)顯示，當添加至LM中時而非當添加至MM中時，與陰性對照(無血液)相比，在陰性血液培養(yǎng)物樣品中的IPC分子的檢測(在40個循環(huán)的PCR反應中)完全損失。圖3.由向LM而非MM中添加IPC導致的背景增加。在圖表上標繪的數(shù)據(jù)示出了使用已經(jīng)將IPC添加至LM(菱形)和MM(方形)中的方案相對于針對血液培養(yǎng)物樣品獲得的總活菌計數(shù)(TVC)的FAM通道(檢測ETGA底物)中的ct值。對于每個PCR反應，與在MM中的相比，添加至LM中的IPC的量為50x。與在MM中使用標準濃度的IPC相比，當在LM中使用50x正常濃度的IPC時，測量到的背景更高。在不含有任何添加的細菌的血液培養(yǎng)物樣品中，通過ETGA測試程序用MM(藍色虛線)或LM(綠色點劃線)中的IPC測量背景水平。圖4.ETGA測試背景降低并且改進測試敏感性。曲線圖示出了來自在血液培養(yǎng)物中的系列稀釋的C.albicans上進行的ETGA測試的在qPCR反應中在FAM通道中檢測到的熒光。qPCR反應含有能夠檢測修飾的ETGA底物的FAM標記的探針，所以擴增指示微生物的存在。圖4a示出了使用標準底物和IPC寡聚物進行的一組ETGA測試的結果。圖4b示出了使用PTO底物和IPC從完全相同的樣品中獲得的結果。注意圖4b中的背景低得多，并且可以在測試中檢測到更低數(shù)目的酵母細胞。圖5.通過使用PTO寡聚物改進酵母檢測。曲線圖示出了與使用PTO寡聚物的ETGA測試相比，使用標準寡聚物的ETGA測試中的酵母(C.albicans)檢測的敏感性。圖6.通過ETGA檢測較不強壯(robust)的微生物。圖表示出了H.influenzae的纖弱(delicate)菌株的檢測如何被ETGA測試程序影響。在不同階段，將S.aureus和H.influenzae(105cfu)的純培養(yǎng)物添加至一般測試方案(10mL)中。數(shù)據(jù)顯示，當在NaOH重懸步驟之前添加微生物時，檢測是顯著降低的。圖7.控制對NaOH的暴露以改進H.influenzae的檢測。曲線圖示出了與標準程序相比，在ETGA測試程序中控制含有105cfuH.influenzae的培養(yǎng)樣品向NaOH暴露的時間量的效果。在沒有血液的BacT/ALERT培養(yǎng)液中的H.influenzae的懸浮液上進行針對10mL的一般方案；重懸于NaOH中并孵育0、0.5、2.5和5min之后，在離心之前添加1mL200mMTris-HCl[pH7.2]。圖8.用pH降低步驟改進1mlETGA方案。用原始1ml程序(基于1mLNaOH中的重懸液)和含有pH降低步驟的程序(重懸于0.75mLNaOH中，5min孵育，0.5mL試劑C)對含有：A)無加入、B)H.influenzae(105cfu)、C)H.influenzae(104cfu)、D)S.aureus(105cfu)、E)S.aureus(104cfu)的血液培養(yǎng)物樣品進行測試。更低的ct值指示更強烈地檢測到微生物。圖9A-C.加入了E.coli的血液培養(yǎng)液樣品和陽性對照(Pol(+))的CognitorMinus結果。示出了(A)實驗2、(B)實驗3和(C)實驗4的在進行或不進行95℃步驟的情況下，在時間0、2和20小時分析的CognitorMinus樣品的數(shù)據(jù)。實驗1的數(shù)據(jù)未示出，因為僅在時間0小時通過QPCR對樣品進行了分析。圖10.相對于經(jīng)對數(shù)轉化的總cfu值標繪的加入了E.coli的血液培養(yǎng)液樣品(n＝4)的ct值。在95℃(+)或95℃(-)數(shù)據(jù)集內(nèi)標繪每個時間點(0小時、2小時和20小時)的趨勢線。這里未示出陽性對照的數(shù)據(jù)。圖11A-B.使用(A)未修飾的寡核苷酸裂解混合物或(B)硫代磷酸酯寡核苷酸裂解混合物處理的95℃(+)和95℃(-)樣品的在時間0、2和20小時的加入了E.coli的血液培養(yǎng)液樣品和陽性對照(Pol+ve)的ct值。示出的數(shù)據(jù)來自單個實驗(n＝1)。圖12A-E.加入了(A)E.coli、(B)S.aureus和(C)C.albicans的血液培養(yǎng)液樣品、(D)陽性對照(PC和(E)無加入對照(NSC)的CognitorMinus結果。相對于樣品儲存持續(xù)時間標繪了來自三個重復實驗(n＝3)的ct值。標繪了每個樣品集的趨勢線：PTO95℃(+)；PTO95℃(-)；UMO95℃(+)；和UMO95℃(-)。僅示出了NSC樣品的UMOLM數(shù)據(jù)，因為由于擴增不充分大部分PTOLM樣品產(chǎn)生了‘無Ct’。實驗部分將相對于以下非限制性實施例理解本發(fā)明：實施例1-ETGA測試修改方法-一般方案對于每個樣品，將1mL血液培養(yǎng)物(添加或未添加微生物，具有或不具有血液)與0.333mL試劑A(5％w/v皂苷，5％w/vTween20，8.5g/L氯化鈉)在1.5mL微量離心管中混合并在室溫下孵育15min。將每個樣品以7300g離心3min，然后倒掉上清液并且將管的邊緣在干凈的實驗室薄紙上輕觸。然后將每個沉淀重懸于0.75mL試劑B(5mMNaOH)中并孵育5min，然后通過添加0.5mL試劑C(1.32g/L硫酸銨，0.49g/L七水硫酸鎂，0.75g/L氯化鉀，20mMTris-HCl，pH8.0)使pH降低。孵育之后，將樣品再次離心并且通過倒掉去除上清液。將剩余的沉淀重懸于0.5mL試劑C中并立即轉移到含有玻璃珠混合物(0.1mm和0.5mm玻璃珠；分別由CamBio目錄13118-400和13116-400供應)的新管中。進行另外的離心以用玻璃珠沉淀任何懸浮的細胞，并且再次去除并棄去上清液。將50μL含有ETGA底物(LM；含有比率為7:2:1的試劑L1、L2、L3，參見表1)的微生物裂解混合物添加至玻璃珠中并以2800rpm放置入DisruptorGenie(ScientificIndustries,Inc.)細胞破碎儀中6min以裂解微生物細胞。破碎之后，將樣品置于37℃加熱塊中并孵育20min，并且然后轉移到另一個95℃的加熱塊中并孵育5min。孵育之后，將樣品冷卻至室溫同時制備PCR試劑。冷卻之后，將3μL樣品上清液添加至SmartCyclerPCR管(Cepheid)中的27μL的PCR主混合物(MM；含有通用Taq聚合酶PCR主混合物(Roche-目錄04902343001)、ETGA底物的引物、內(nèi)部陽性對照–IPC–DNA、ETGA底物的FAM標記的探針、IPC的德克薩斯紅標記的探針和(1.2ul)UDG酶(Bioline–目錄號BIO-27044))中。將樣品置于SmartCyclerPCR中并使其經(jīng)受以下反應條件；1個循環(huán)；40℃10min，50℃10min，95℃5min40-50個循環(huán)：95℃5sec，61℃20sec，72℃20sec。貫穿整個反應在SmartCycler的德克薩斯紅和FAM激發(fā)/檢測通道中實時監(jiān)測擴增。表1.裂解混合物組分PCR反應組分的序列如下；Fam標記的探針(一種分子信標)：FAM-cgctgcgaccgaccgataagctagaacaggcagcg-BHQ1(SEQIDNO:1)德克薩斯紅標記的探針(一種分子信標)：TxR-cgcgatcagcaggccacacgttaaagacatcgcg-BHQ2(SEQIDNO:2)IPCgccgatatcggacaacggccgaactgggaaggcgagatcagcaggccacacgttaaagacagagagacaacaacgctggccgtttgtcaccgacgccta(SEQIDNO:3)正向引物ccgatatcggacaacggccgaactgg(SEQIDNO:4)反向引物taggcgtcggtgacaaacggccagc(SEQIDNO:5)底物組分是；ASuaggcgucggugacaaacggccagcguuguugucucu-DDC(3’末端是雙脫氧-C)(SEQIDNO:6)S1gccgatatcggacaacggccgaactgggaaggcgagactgaccgaccgataagctagaacagagagacaacaac(SEQIDNO:7)結果與討論1-增加底物濃度通過將LM中的ETGA底物的量增加為10倍(從0.001μM到0.01μM)并且將dNTP的量增加為2倍(從50μM到100μM)來修改一般方案。底物和dNTP的量增加使得能夠改進對C.albicans(圖1a)、E.coli(圖1b)、S.aureus(圖1c)、E.faecalis(圖1d)、P.Aeruginosa(圖1e)、或H.Influenzae的2種不同菌株(包括纖弱臨床菌株)(圖1f和圖1g)的檢測。數(shù)據(jù)示于圖1中。結果與討論2-通過修飾寡核苷酸組分改進ETGA測試敏感性并降低背景核酸酶活性的證明與ETGA底物分子同時添加IPC分子被認為是對原始方案的改進。如果在LM中添加IPC，IPC將經(jīng)受與ETGA底物完全相同的測試條件并且因此提供更準確的測試對照。例如，可能負面地影響底物分子(如可以消化底物的核酸酶活性)的條件也將影響IPC。如果之后添加IPC(例如在MM中)，它將不經(jīng)受相同的條件并且可以導致數(shù)據(jù)的錯誤解釋。如果與ETGA底物同時添加IPC，則能夠測量測試條件對核酸模板的影響幅度。為了對其進行示例，圖2顯示測試條件對ETGA底物的檢測可以具有負面影響；當在LM中而非在MM中添加可比量的IPCDNA時，發(fā)現(xiàn)與陰性對照樣品(沒有血液)相比，檢測血液培養(yǎng)物標本中的IPC的能力的確會損失。當在MM中使用IPC時，沒有看到相同的檢測損失。當添加在LM中時IPC的損失歸因于在ETGA方案的37℃孵育步驟期間可以已經(jīng)具有活性的核酸酶。核酸酶最可能源自血液標本。清楚的是，如果IPC分子在測試期間被損失，則ETGA底物分子也可被損失。ETGA底物分子在陽性血液培養(yǎng)物樣品中的損失將顯然導致檢測敏感性降低或潛在地導致假陰性結果，但是通過向LM中添加IPC，將可以確定(并且可能定量)疑似有的核酸酶活性并且據(jù)此解釋結果。觀察到IPC量下降(如通過與陰性試劑對照相比ct值增加所見的)的樣品可以被報告為‘未分辨的’而非‘陰性的’，因此指示樣品經(jīng)受核酸酶活性并且事實上可能是陽性的。向LM中添加IPC分子能夠改進ETGA測試。然而，取決于在臨床標本中有多經(jīng)常發(fā)現(xiàn)核酸酶活性，這能夠提高未分辨結果的總體數(shù)量，使得由于高感知失敗率，該測試對于潛在用戶較不具吸引力(并且因此解釋為什么最初將IPC添加至MM而非LM中)。測試顯示，IPC分子能夠被添加至LM中的測試中并且通過將濃度增加為20-50倍仍在假定核酸酶活性的存在下被檢測到，但是即使在陰性血液培養(yǎng)物樣品中仍檢測到高背景水平(圖3)。在這種情況下，背景可能是由于在檢測PCR反應中產(chǎn)生干擾的部分消化的寡核苷酸的存在造成的。顯然地，高背景水平可以降低測試的敏感性，尤其是當試圖檢測非常低數(shù)量的細菌時。雖然增加LM中IPC的量可以被認為是解決由于核酸酶活性損失靶DNA分子的問題的方案，但是它僅掩蓋該問題，并且如前所述的可以造成較高的背景水平。增加污染核酸酶活性低的樣品中IPC分子的量也可以通過增加檢測PCR中反應組分的競爭而降低測試敏感性，從而降低該測試檢測靶底物的能力。需要解決推定核酸酶問題的更好方案。保護ETGA底物和IPC免受核酸酶活性影響基于IPC分子應該被包括在LM中并且核酸酶活性可對ETGA測試具有有害影響的假設，嘗試保護DNA靶(IPC和ETGA底物)免受核酸酶降解。可以通過各種手段、通過修飾(例如甲基化、末端修飾)或在合成寡核苷酸的合成期間使用非標準核苷酸(例如鎖核酸、硫代磷酸酯核苷酸)來保護DNA免受核酸酶活性影響。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與細菌相比，ETGA測試對酵母較不敏感。出現(xiàn)這種情況的原因未知，但是可能是由于以下原因的組合，如，與細菌酶相比細胞中真菌酶的體外活性或絕對量的差異，或對抑制劑的敏感性。PTO寡聚物在ETGA測試中的用途的證實將一般方案中的LM中的標準ETGA底物和IPC寡聚物用具有相同核苷酸序列的硫代磷酸酯寡聚物(PTO)替代。將PTO修飾的ETGA底物以0.01μM添加至LM中并且將PTO修飾的IPC以足以在50個循環(huán)的PCR反應中達到37-41的ct值的量進行添加。使用原始ETGA測試方案，用標準寡聚物并用PTO修飾的寡聚物對血液培養(yǎng)物中的系列稀釋的酵母細胞(105、104、103和0cfu/ml)進行測試。在完全相同的摻料血液培養(yǎng)物中運行兩個測試(圖4)。數(shù)據(jù)顯示，用標準寡聚物進行的ETGA測試產(chǎn)生了包括高背景水平(這可以已經(jīng)妨礙了低水平酵母細胞的檢測)的結果，而用PTO修飾的寡聚物獲得的結果并未遭受同樣的影響。事實上結果顯示，PTO寡聚物將相同培養(yǎng)標本上的總體背景降至不可檢測的水平，因此允許降低qPCR反應中的閾值水平并且潛在地增加ETGA測試的敏感性。注意當使用標準寡聚物時，由于檢測到的背景熒光的量，將閾值水平設為50個單位，但是當使用PTO寡聚物時，能夠將閾值水平降至10個單位或更低(如果需要的話)。與使用標準寡聚物時相比，在PCR反應中稍后檢測到PTO寡聚物，但是PTOqPCR反應卻能夠運行更久(50個而非40個循環(huán))，因為背景水平是如此之低。這種背景減少的結果意味著能夠用PTO寡聚物檢測到更低水平的微生物負載(在這個實施例中，低至103cfu/ml)，這是先前在使用標準寡聚物時檢測不到的。在一項另外的實驗中，在ETGA測試中使用底物分子(MWG-Eurofins)的核酸酶耐受性PTO版本。將系列稀釋的酵母過夜培養(yǎng)物用于對血液培養(yǎng)物進行人工摻料(然后將血液培養(yǎng)物的樣品涂布在SDA上，以確認總活菌計數(shù))。然后通過使用標準寡聚物的ETGA測試和使用PTO寡聚物的ETGA測試對每個懸浮液進行測試。通過使用PTO大大改進了酵母檢測的敏感性。注意PTO結果被標繪在與標準測試不同的y-軸上，這是由于PCR循環(huán)的數(shù)量不同。虛線指示陰性對照(沒有任何微生物的血液培養(yǎng)物)的Ct值。來自這個實驗的數(shù)據(jù)顯示，PTO底物被示出將酵母檢測(圖5)改進了1000倍，并且此外，它沒有展現(xiàn)出提高背景水平的效應。PTO底物能夠用于增加ETGA測試的敏感性的發(fā)現(xiàn)是非常顯著的。實施例2-減少ETGA測試中的假陰性測試結果一般方案對于10mL標本對于每個樣品，將10mL血液培養(yǎng)物(添加或未添加微生物，具有或不具有血液)與3.33mL試劑A(5％w/v皂苷，5％w/vTween20，8.5g/L氯化鈉)在15mLFalcon管中混合并在室溫下孵育15min。將每個樣品以3600g離心8min，然后倒掉上清液并且將管的邊緣在干凈的實驗室薄紙上輕觸。然后將每個沉淀重懸于5mL試劑B(5mMNaOH)中并孵育5min。孵育之后，將樣品再次離心并且通過倒掉去除上清液。將剩余的沉淀重懸于1mL試劑C(1.32g/L硫酸銨，0.49g/L七水硫酸鎂，0.75g/L氯化鉀，20mMTris-HCl，pH8.0)中并立即轉移到1.5mL含有玻璃珠混合物的微量離心管中。以7300xg另外離心3min以用玻璃珠沉淀任何懸浮的細胞，并且再次去除并棄去上清液。將50μL微生物裂解混合物(LM；含有ETGA底物，參見以上實施例1中的表1)添加至玻璃珠中并以2800rpm放置在DisruptorGenie細胞破碎儀中6min以裂解微生物細胞。破碎之后，將樣品置于37℃加熱塊中并孵育20min，然后轉移到另一個95℃的加熱塊中并孵育5min。孵育之后，將樣品冷卻至室溫同時制備PCR試劑。冷卻之后，將3μL樣品上清液添加至SmartCyclerPCR管(Cepheid)中的27μL的PCR主混合物(MM；含有通用Taq聚合酶PCR主混合物、ETGA底物的引物、內(nèi)部陽性對照–IPC–DNA、ETGA底物的FAM標記的探針、IPC的德克薩斯紅標記的探針和UDG酶)中。將樣品置于SmartCyclerPCR中并使其經(jīng)受以下反應條件；1個循環(huán)；40℃10min，50℃10min，95℃5min40-50個循環(huán)：95℃5sec，61℃20sec，72℃20sec。貫穿整個反應在SmartCycler的德克薩斯紅和FAM激發(fā)/檢測通道中實時監(jiān)測擴增。對于1mL標本對于每個樣品，將1mL血液培養(yǎng)物與0.333mL試劑A(5％w/v皂苷，5％w/vTween20，8.5g/L氯化鈉)在1.5mL微量離心管中混合并在室溫下孵育15min。將每個樣品以7300g離心3min，然后倒掉上清液并且將管的邊緣在干凈的實驗室薄紙上輕觸。然后將每個沉淀重懸于1mL試劑B(5mMNaOH)中并孵育5min。孵育之后，將樣品再次離心并且通過倒掉去除上清液。將剩余的沉淀重懸于0.5mL試劑C(1.32g/L硫酸銨，0.49g/L七水硫酸鎂，0.75g/L氯化鉀，20mMTris-HCl，pH8.0)中并立即轉移到含有玻璃珠混合物的新管中。進行另外的離心以用玻璃珠沉淀任何懸浮的細胞，并且再次去除并棄去上清液。然后如先前針對10mL方案所描述的進行微生物裂解和PCR檢測。PCR反應組分和底物按照以上實施例1.背景被鑒定為Haemophilusinfluenzae的單個臨床微生物分離株在臨床性能評價期間在ETGA測試中給出了假陰性結果。在BiomerieuxBact/ALERT血液培養(yǎng)基中通過標準自動化血液培養(yǎng)對該微生物進行了檢測。當將培養(yǎng)的微生物細胞摻料添加至ETGA測試的不同階段中時，發(fā)現(xiàn)僅當在NaOH洗滌步驟(試劑B)之后添加時檢測到H.influenzae菌株。發(fā)現(xiàn)其他更強壯的細菌物種當從開始添加至測試中時是可檢測到的(參見圖6)。結果指示，H.influenzae的菌株對NaOH洗滌步驟(或直到并包括NaOH洗滌步驟的步驟組合)特別敏感。這種結果并非在所有H.influenzae菌株中都是典型的，并且迄今僅與此菌株相關。該分離株被用作用以開發(fā)在檢測較不強壯的微生物方面更好的新的ETGA程序的模式‘弱’生物體。在NaOH中進行孵育是ETGA方案中必須進行的必要步驟，以使游離聚合酶失活、減少污染物并減少背景。因此嘗試減少NaOH的損害效應而不會有害地影響測試結果。不可以降低NaOH的濃度，因為這不會去除足夠的污染材料，從而導致測試失敗。結果-減少樣品向NaOH的暴露在一般10mL方案中，注意離心樣品所花的時間將樣品向NaOH的暴露總時間增加了8min。縮短時間長度可以通過中和堿，或至少在最佳孵育時間段之后通過向NaOH中添加1mL的200mMTris-HCl緩沖液(pH7.2)降低樣品的pH來實現(xiàn)和控制。在取自BacT/ALERTSA瓶(沒有添加血液)的培養(yǎng)基中的H.influenzae懸浮液上進行10mL標本的一般方案。結果表明，中和NaOH(或顯著降低其pH)導致更低的ct值(來自相同的樣品)并且因此改進檢測敏感性(參見圖7)。數(shù)據(jù)還表明，更短的孵育時間將是更好的，但是短孵育時間不允許充分地去除污染物以使得PCR擴增可靠，導致反應失敗或高背景水平和假陽性結果。NaOH處理之后降低樣品的pH能夠潛在地通過添加任何適合的緩沖液或酸來實現(xiàn)。降低pH的優(yōu)選方法將是使用試劑C(Tris-HCl緩沖液，pH8)，因為該試劑已經(jīng)被用于測試中。結果–一種優(yōu)選的實施方案，1mLH.influenzae和S.aureus兩者在1mL標本的一般方案中的檢測都能夠通過用更復雜的步驟替代原始NaOH步驟來改進，所述更復雜的步驟由重懸于0.75mLNaOH中、在室溫下孵育5min、然后添加0.5mL試劑C以降低pH組成。圖8中總結的結果顯示，與原始1mL方案相比，當使用pH降低方案時來自在所有含微生物樣品上的ETGA測試的ct值更低，表明pH降低方案改進了檢測。實施例3–95℃的重要性和PTO底物的用途的分析目的在這個實施例中示出的工作的目的是評估95℃步驟對CognitorMinus測試的性能的影響。使用加入了細菌的血液培養(yǎng)液樣品進行具有或不具有95℃步驟的CognitorMinus測試，以比較以下特征：·獲得的Ct值·完成樣品制備后在不同時間點通過QPCR測量的ETGA模板DNA的穩(wěn)定性·與硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸(PTO)ETGA底物對照，當裂解混合物(LM)含有未修飾的寡核苷酸(UMO)ETGA底物時，獲得的Ct值和ETGA模板DNA的穩(wěn)定性。介紹CognitorMinus測試中的早期步驟旨在裂解血細胞并洗掉血液來源的蛋白質(如DNA聚合酶)，這將產(chǎn)生非微生物來源的ETGA模板DNA和可以消化微生物來源的ETGA模板DNA的核酸酶。然后通過添加裂解混合物(LM)和珠磨裂解任何的所得完整微生物。微生物裂解和ETGA反應后，樣品含有微生物蛋白質、LM組分、新合成的ETGA模板DNA和殘余血細胞蛋白質的混合物。95℃步驟旨在使所有蛋白質變性以保護ETGA模板DNA和內(nèi)部處理對照(IPC)DNA免于被核酸酶消化，這樣使得其能夠通過QPCR被成功地檢測到。為了評估95℃步驟的重要性，使用加入了細菌的血液培養(yǎng)物進行具有或不具有95℃步驟的CognitorMinus測試。在三個時間點通過QPCR對樣品進行分析：樣品制備之后即刻；在室溫下2小時之后；和在4℃另外18小時之后。目的在于比較獲得的Ct值和Ct值跨三個時間點的一致性作為ETGA模板DNA穩(wěn)定性的指標。使用含有UMOETGA底物的LM進行一項另外的實驗，以測試所得ETGA模板DNA的穩(wěn)定性是否與含有PTOETGA底物的LM的不同。材料與方法所使用的試劑試劑A-5％(w/v)皂苷、5％(v/v)Tween20和146mM氯化鈉試劑B-5mM氫氧化鈉。試劑C-10mM硫酸銨、2mM七水硫酸鎂、10mM氯化鉀和20mMTris-HCl[pH8.0]。裂解混合物(LM)，由L1、L2、L3、dNTP、PTO-IPC原液構成：·L1(252mL，在360mLLM中)-1.46％(w/v)BSA、0.15％(v/v)TritonX100和0.15％(v/v)Tween20；·L2(36mL，在360mLLM中)-100mM硫酸銨、20mM七水硫酸鎂、100mM氯化鉀和200mMTris-HCl[pH8.0]；·L3(36mL，在360mLLM中)-0.1μMPTO-AS寡聚物、0.1μMPTO-S1寡核苷酸、20mMTris-HCl[pH8.5]、10mM氯化鉀和10μMEDTA；·10mMdNTP(3.6mL，在360mLLM中)·PTO-IPC原液(約180μL，在360mLLM中)*注意：濃度可變·H2O(約32.22mL，在360mLLM中)方法1：在加入了E.coli的血液培養(yǎng)液上的具有和不具有95℃步驟的CognitorMinus測試使Escherichiacoli(25922TM)在營養(yǎng)培養(yǎng)液中在37℃下生長18小時。用E.coli將BacT/ALERTSA血液培養(yǎng)液(山羊血)接種至大約1x107cfu/mL、1x106cfu/mL、1x105cfu/mL、1x104cfu/mL和1x103cfu/mL。制備兩組1ml樣品，用于具有或不具有95℃步驟的測試。制備總活菌計數(shù)(TVC)板以確認cfu/mL值。還制備了兩組僅血液培養(yǎng)液‘無加入’對照(NSC)、陽性對照(僅培養(yǎng)液加DNA聚合酶)和陰性對照(僅培養(yǎng)液)，給出了總共16個樣品(參見表2)。向每個1mL樣品中添加330μL試劑A并通過將管倒置五次進行混合。將樣品在室溫下(大約19℃)孵育15分鐘并且然后以7300RCF離心3分鐘。離心后，將上清液傾入臨床廢物容器中，并且將開口管在無菌薄紙上印跡。通過槍頭混合將每個沉淀重懸于750μL試劑B中并在室溫下孵育5分鐘。接著，將500μL試劑C添加至每個樣品中并通過將管倒置三次進行混合。將樣品以7300RCF離心3分鐘。將所得上清液傾入臨床廢物容器中，并且將開口管在無菌薄紙上印跡。通過槍頭混合將每個沉淀重懸于500μL試劑C中，轉移到含有玻璃珠(0.1mm和0.5mm玻璃珠)的珠磨管中，并以7300RCF離心3分鐘。離心后，通過移液管將上清液轉移到廢物中。將50μLLM添加至每個樣品中，并且將另外10μL的DNA聚合酶溶液添加至陽性對照樣品中。然后將樣品放置到DisruptorGenie中并以2800rpm運行6min。珠磨之后，將樣品轉移到37℃的加熱塊組中并孵育20分鐘。37℃微生物裂解(ETGA)步驟后，將95℃(-)樣品(樣品9-16)即刻送至QPCR設置，而將95℃(+)樣品(樣品1-8)在QPCR設置之前在95℃下孵育5分鐘。立即通過QPCR對兩組樣品進行分析。在室溫下(大約19℃)2小時之后再次通過QPCR對相同樣品進行分析，并且在4℃下另外18小時之后再次進行分析。將這個實驗重復四次，以允許對結果進行統(tǒng)計分析。表2–測試樣品95℃(+)樣品95℃(-)樣品1.E.coli1x107cfu/mL9.E.coli1x107cfu/mL2.E.coli1x106cfu/mL10.E.coli1x106cfu/mL3.E.coli1x105cfu/mL11.E.coli1x105cfu/mL4.E.coli1x104cfu/mL12.E.coli1x104cfu/mL5.E.coli1x103cfu/mL13.E.coli1x103cfu/mL6.僅血液培養(yǎng)液(NSC)14.僅血液培養(yǎng)液(NSC)7.陽性對照(Pol+ve)15.陽性對照(Pol+ve)8.陰性對照(Pol-ve)16.僅培養(yǎng)液(Pol-ve)NSC：無加入對照方法2：PTOETGA底物對比UMOETGA底物用E.coli將BacT/ALERT血液培養(yǎng)液SA接種至大約1x107cfu/mL和1x104cfu/mL。制備四組1ml樣品，以比較使用和不使用PTO、具有和不具有95℃步驟的CognitorMinus測試結果。制備TVC板以確認cfu/mL值。還制備了NSC和陽性對照(參見表3)。根據(jù)在上文的“方法1”中描述的一般方案處理所有樣品。37℃微生物裂解(ETGA)步驟后，將95℃(-)樣品(樣品9-16)即刻送至QPCR設置，而將95℃(+)樣品(樣品1-8)在QPCR設置之前在95℃下孵育5分鐘。立即通過QPCR對兩組樣品進行分析。在室溫下2小時之后通過QPCR對相同樣品進行分析，并且在4℃下另外18小時后再次進行分析。表3–測試樣品95℃(+)樣品95℃(-)樣品1.E.coli1x107cfu/mL：UMOLM9.E.coli1x107cfu/mL：UMOLM2.E.coli1x107cfu/mL：PTOLM10.E.coli1x107cfu/mL：PTOLM3.E.coli1x104cfu/mL：UMOLM11.E.coli1x104cfu/mL：UMOLM4.E.coli1x104cfu/mL：PTOLM12.E.coli1x104cfu/mL：PTOLM5.僅血液培養(yǎng)液(NSC)：UMOLM13.僅血液培養(yǎng)液(NSC)：UMOLM6.僅血液培養(yǎng)液(NSC)：PTOLM14.僅血液培養(yǎng)液(NSC)：PTOLM7.陽性對照(Pol+ve)：UMOLM15.陽性對照(Pol+ve)：UMOLM8.陽性對照(Pol+ve)：PTOLM16.陽性對照(Pol+ve)：PTOLMNSC：無加入對照，UMO：未修飾的寡核苷酸，PTO：硫代磷酸酯寡核苷酸，LM：裂解混合物結果與討論結果1：除去95℃步驟改進了ETGAQPCR信號并且信號隨時間不減少在圖9A-C中示出了樣品制備(n＝3)后在時間0、2和20小時用或不用95℃步驟處理的樣品的結果。在單獨的實驗內(nèi)，對于所有加入了E.coli的血液培養(yǎng)液稀釋物和陽性對照而言，除去95℃步驟導致Ct值減小(ETGA信號增加)(圖9A-C)。在時間0、2和20小時針對相同樣品獲得的Ct值跨三個重復實驗是高度一致的，其中95℃(+)樣品的最大ΔCt值范圍從0.07Ct單位至1.07Ct單位(平均最大ΔCt值為0.30Ct單位)，95℃(-)樣品的最大ΔCt值范圍從0.03Ct單位至0.58Ct單位(平均最大ΔCt值為0.38Ct單位)。所有NSC和陰性對照都產(chǎn)生了大于40的Ct值或者完全沒有QPCR擴增(數(shù)據(jù)未示出)。圖10示出了一起標繪的加入了E.coli的血液培養(yǎng)液樣品的所有數(shù)據(jù)，并且若干趨勢是明顯的。首先，與95℃(-)樣品相比95℃(+)樣品獲得的Ct值之間的差異明顯，其中95℃(-)樣品的Ct值大約為1.0Ct單位減小。其次，對于95℃(+)和95℃(-)兩種樣品而言，在不同時間點獲得的Ct值之間差異極小。然而，當除去95℃步驟時，隨著儲存時間增加Ct值有小的降低，這由圖10中的趨勢線是顯而易見的并且在實驗3(圖9B)中更顯著。進行線性建模(使用R)，以確定在針對進行或不進行95℃步驟和在不同時間點的加入了E.coli的血液培養(yǎng)液系列稀釋獲得的Ct值之間是否存在統(tǒng)計學顯著差異。表4示出了針對不同比較獲得的p-值。使用來自所有四個實驗的數(shù)據(jù)的95℃(+)樣品與95℃(-)樣品的Ct值比較產(chǎn)生了高度顯著的p-值(p<0.001)，無論來自單獨時間點的數(shù)據(jù)還是來自所有時間點的數(shù)據(jù)被包括在分析中。使用來自所有四個實驗的數(shù)據(jù)的在95℃(+)或95℃(-)數(shù)據(jù)集內(nèi)的不同時間點的Ct值比較產(chǎn)生了非顯著p-值(p>0.05)。在相同實驗內(nèi)的時間點比較對于所有數(shù)據(jù)集而言產(chǎn)生了非顯著p-值(p>0.05)，實驗3(T3)中的95℃(-)數(shù)據(jù)集除外，它的p-值為0.016。這個顯著性p-值可能是由于Ct值隨時間減小更顯著，在這個特定實驗中觀察到了這種現(xiàn)象。表4-用以比較加入了E.coli的血液培養(yǎng)物系列稀釋在不同時間點和進行或不進行95℃步驟的Ct值標準曲線的線性模型(使用R)。所分析的數(shù)據(jù)比較P-值顯著性所有數(shù)據(jù)95℃(+)對比95℃(-)<2x10-16***時間0H：T1-T4數(shù)據(jù)95℃(+)對比95℃(-)4.82x10-8***時間2H：T2-T4數(shù)據(jù)95℃(+)對比95℃(-)1.31x10-8***時間20H：T2-T4數(shù)據(jù)95℃(+)對比95℃(-)1.47x10-10***95℃(+)：T1-T4數(shù)據(jù)時間0.730-95℃(-)：T1-T4數(shù)據(jù)時間0.094-95℃(+)：僅T2數(shù)據(jù)時間0.896-95℃(-)：僅T2數(shù)據(jù)時間0.657-95℃(+)：僅T3數(shù)據(jù)時間0.956-95℃(-)：僅T3數(shù)據(jù)時間0.016*95℃(+)：僅T4數(shù)據(jù)時間0.769-95℃(-)：僅T4數(shù)據(jù)時間0.061-顯著性代碼：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。-：不顯著。T：實驗。結果2：當使用PTOLM而非UMOLM時，跨不同時間點的CognitorMinus結果更一致圖11A-B示出了用和不用95℃步驟、使用UMOLM(圖11A)或PTOLM(圖11B)處理的加入了E.coli的血液培養(yǎng)液樣品(1x107cfu/mL和1x104cfu/mL)和陽性對照獲得的Ct值。這里示出的數(shù)據(jù)來自單個實驗。使用UMOLM的NSC的Ct值全部比針對加入了1x103cfu/mLE.coli的血液培養(yǎng)液樣品獲得的Ct值高至少5Ct單位，而PTOLMNSCCt值全部大于42.0Ct單位或者完全沒有QPCR擴增(數(shù)據(jù)未示出)。結果表明，UMOLM樣品的Ct值平均比PTOLM樣品的Ct值低10.2Ct單位。當除去95℃步驟時，與PTOLM樣品的Ct值相比，UMOLM樣品的Ct值減小也更大。最重要的是，就ETGA模板DNA穩(wěn)定性而言，與PTOLM樣品的Ct值相比，針對UMOLM樣品獲得的Ct值跨不同時間點顯著地更不一致。在UMOLM95℃(+)數(shù)據(jù)集中加入了E.coli的血液培養(yǎng)液樣品的Ct值從2小時到20小時增加了大約1.0Ct單位，而對應的陽性對照示出了0.24Ct單位的Ct值減小。這指示，盡管存在95℃步驟的蛋白質變性效應，當存在細菌和/或宿主血細胞時，ETGA模板DNA的核酸酶消化仍可在樣品中發(fā)生，但是不會在僅添加了DNA聚合酶的陽性對照中發(fā)生。當除去95℃步驟時，UMOLM樣品的Ct值隨樣品儲存時間的增加而降低。這指示，在不存在蛋白質變性的情況下，連續(xù)的ETGA模板生成可以勝過核酸酶消化的任何增加，因而使得ETGAQPCR信號增加。PTOLM數(shù)據(jù)(圖11B)表明，針對95℃(+)和95℃(-)兩種樣品，Ct值跨所有時間點是高度一致的。這些數(shù)據(jù)指示，37℃ETGA反應后。由PTO底物DNA形成的ETGA模板DNA更耐受由核酸酶降解和/或另外的ETGA模板DNA生成造成的變化?？偨Y這里示出的數(shù)據(jù)表明，當除去95℃步驟時，ETGA模板DNA檢測得到了改進。此外，在不存在95℃步驟的情況下，ETGAQPCR信號不會隨樣品儲存時間的增加而劣化。PTOLM與UMOLM的比較指示，ETGA模板DNA的高穩(wěn)定性依賴于PTOETGA底物DNA的使用。這里示出的所有數(shù)據(jù)都支持從CognitorMinus測試中除去95℃步驟。值得注意的是，測試的敏感性增加可以增加檢測到背景信號(血液來源的ETGA信號)的機會；然而，優(yōu)化其他因素(如血液裂解/洗滌性能)和解釋QPCR結果應該消除其影響。實施例4–95℃的重要性和PTO底物的用途的分析：主面板微生物目的在此報告中呈現(xiàn)的工作的目的在于：1.比較所有主面板微生物(primarypanelmicroorganisms)(E.coli；S.aureus；和C.albicans)的進行和不進行95℃步驟的CognitorMinus結果2.確認實施例3關于硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸(PTO)LM和未修飾的寡核苷酸(UMO)LM之間的比較的發(fā)現(xiàn)3.測試延長的樣品儲存持續(xù)時間(長達72小時)對每種主面板微生物的使用PTOLM和UMOLM的QPCR結果的影響介紹CognitorMinus測試中的早期步驟旨在裂解血細胞并洗掉血液來源的蛋白質(如DNA聚合酶)，這將產(chǎn)生非微生物來源的ETGA模板DNA和可以消化微生物來源的ETGA模板DNA的核酸酶。這個過程不應該傷害存在于血液樣品中的任何微生物。然后通過添加裂解混合物(LM)和珠磨裂解分離的完整微生物。微生物裂解和ETGA反應之后，樣品含有微生物蛋白質、LM組分、新合成的ETGA模板DNA和殘余血細胞蛋白質的混合物。在當前CognitorMinus測試方案中，95℃步驟旨在使所有蛋白質變性以保護ETGA模板DNA和內(nèi)部處理對照(IPC)DNA免于被核酸酶消化，這樣使得其可以通過QPCR被成功地檢測到。95℃步驟也使DNA聚合酶失活，從而淬滅ETGA反應。然而，由于將95℃步驟并入該方案中，用于在LM中形成ETGA底物(和IPC)的UMO已經(jīng)被具有核酸酶耐受性的PTO替代。雖然形成ETGA模板的ETGA延伸鏈構建自標準dNTP，但是它所退火的PTO底物DNA可賦予免于被核酸酶消化的保護。歸因于除去95℃步驟的益處，如方案簡化和運行測試所需的時間減少，重新評價95℃步驟的必要性被認為是重要的。為了評估95℃步驟的重要性，使用加入了微生物的血液培養(yǎng)液進行具有或不具有95℃步驟的CognitorMinus測試。在五個時間點通過QPCR對樣品進行分析：樣品制備之后即刻；在室溫下(大約19℃)儲存2小時之后；以及在4℃下儲存24小時、48小時和72小時之后。獲得的Ct值和Ct值跨五個時間點的一致性用于使用PTOLM或UMOLM評估95℃步驟對每種主面板微生物的CognitorMinus測試性能和樣品穩(wěn)定性的影響。材料與方法關于試劑細節(jié)，參見實施例3。使Escherichiacoli(25922TM)、Staphylococcusaureus(25923TM)和Candidaalbicans(10231TM)在液體培養(yǎng)基中(E.Coli和S.Aureus在營養(yǎng)培養(yǎng)液中；并且C.Albicans在沙保培養(yǎng)基中)在37℃下生長大約18小時。分別用E.coli、S.aureus和C.albicans將BacT/ALERTSA血液培養(yǎng)液(山羊血；參見表6)接種至大約1x104cfu/mL、1x104cfu/mL和1x105cfu/mL。制備四組1ml樣品，用于針對PTOLM和UMOLM的具有或不具有95℃步驟的測試。還制備了僅血液培養(yǎng)液‘無加入’對照(NSC)和陽性對照(僅培養(yǎng)液加DNA聚合酶(PC))，給出了總共20個樣品(參見表5)。制備總活菌計數(shù)(TVC)板以確認cfu/mL值(參見表7)和陰性血液培養(yǎng)液。向每個1mL樣品中添加330μL試劑A并通過將管倒置五次進行混合。將樣品在室溫下(大約19℃)孵育15分鐘然后以7300RCF離心3分鐘。離心后，將上清液傾入臨床廢物容器中，并且將開口管在無菌薄紙上印跡。通過槍頭混合將每個沉淀重懸于750μL試劑B中并在室溫下孵育5分鐘。然后，將500μL試劑C添加至每個樣品中并通過將管倒置三次進行混合。將樣品以7300RCF離心3分鐘。將所得上清液傾入臨床廢物容器中，并且將開口管在無菌薄紙上印跡。通過槍頭混合將每個沉淀重懸于500μL試劑C中，轉移到含有玻璃珠(0.1mm和0.5mm玻璃珠)的珠磨管中，并以7300RCF離心3分鐘。離心后，通過移液管將上清液轉移到廢物中。將50μLLM添加至每個樣品中，并且將另外10μL的DNA聚合酶溶液添加至陽性對照樣品中。然后將樣品放置到DisruptorGenie中并以2800rpm運行6min。珠磨之后，將樣品轉移到37℃的加熱塊組中并孵育20分鐘。37℃微生物裂解(ETGA)步驟后，將95℃(-)樣品(樣品11-20)即刻送至QPCR設置，而將95℃(+)樣品(樣品1-10)在QPCR設置之前在95℃下孵育5分鐘。立即通過QPCR對兩組樣品進行分析。在室溫下2小時之后通過QPCR再次對相同樣品進行分析，并且在4℃下儲存24小時、48小時和72小時之后再次進行分析。將這個實驗重復三次，以允許對結果進行統(tǒng)計分析。表5–測試樣品95℃(+)樣品95℃(-)樣品1.E.coli1x104cfu/mL：PTOLM11.E.coli1x104cfu/mL：PTOLM2.S.aureus1x104cfu/mL：PTOLM12.S.aureus1x104cfu/mL：PTOLM3.C.albicans1x105cfu/mL：PTOLM13.C.albicans1x105cfu/mL：PTOLM4.PC：PTOLM14.PC：PTOLM5.NSC：PTOLM15.NSC：PTOLM6.E.coli1x104cfu/mL：UMOLM16.E.coli1x104cfu/mL：UMOLM7.S.aureus1x104cfu/mL：UMOLM17.S.aureus1x104cfu/mL：UMOLM8.C.albicans1x105cfu/mL：UMOLM18.C.albicans1x105cfu/mL：UMOLM9.PC：UMOLM19.PC：UMOLM10.NSC：UMOLM20.NSC：UMOLMPC：陽性對照，NSC：無加入對照，UMO：未修飾的寡核苷酸，PTO：硫代磷酸酯寡核苷酸，LM：裂解混合物表6–材料試劑供應商批號有效期山羊血(重復1)TCSBioscience3011200027/04/2015山羊血(重復2)TCSBioscience3021090025/05/2015山羊血(重復3)TCSBioscience3025530008/06/2015表7-微生物TVC微生物實驗1TVC(總cfu)實驗2TVC(總cfu)實驗3TVC(總cfu)E.coli7,20010,20028,200S.aureus4,20023,00023,200C.albicans271,000191,000246,000結果與討論在圖12A-E中示出了在時間0、2、24、48和72小時(n＝3)用或不用95℃步驟、使用PTOLM或UMOLM處理的樣品的結果。除去95℃步驟改進了ETGAQPCR信號對于PTOLM和UMOLM兩者而言，所有未用95℃步驟處理的加入了微生物的血液培養(yǎng)液樣品和陽性對照樣品都產(chǎn)生了比用95℃步驟處理的對應樣品更低的Ct值(更強的ETGA信號)。E.coli、S.aureus和C.albicans以及陽性對照的PTOLM樣品在‘0小時’的平均ΔCt值(95℃(+)減95℃(-))分別是0.98Ct單位、1.41Ct單位、0.12Ct單位和1.21Ct單位。E.coli、S.aureus和C.albicans以及陽性對照的UMOLM樣品在‘0小時’的平均ΔCt值(95℃(+)減95℃(-))分別是3.91Ct單位、4.10Ct單位、5.36Ct單位和1.20Ct單位。大多數(shù)用PTOLM處理的NSC樣品由于低QPCR擴增都沒有產(chǎn)生Ct值，并且因此在圖12A-E中未示出此數(shù)據(jù)。然而，與95℃(+)樣品相比，95℃(-)樣品的Ct值擴增充分的發(fā)生率更高(7/15的Ct值，相比于2/15的Ct值沒有儲存持續(xù)時間明顯趨勢；并且所有NSCPTOLMCt值都在42.0Ct單位與45.0Ct單位之間)。用UMOLM處理的NSC樣品在‘0小時’產(chǎn)生了平均比未進行95℃步驟低0.42Ct單位的Ct值。未用95℃步驟處理的NSC樣品的這種QPCR信號增加預期給出針對陽性樣品觀察到的信號的普遍增加。當使用PTOLM而非UMOLM時，跨不同時間點的CognitorMinus結果更一致在PTOLM數(shù)據(jù)集內(nèi)，所有加入了微生物的血液培養(yǎng)液樣品和陽性對照樣品跨72小時儲存期都產(chǎn)生了高度一致的Ct值，無論樣品是否用95℃步驟進行了處理。在UMOLM95℃(+)數(shù)據(jù)集內(nèi)，E.coli、S.aureus和陽性對照樣品跨72小時儲存期產(chǎn)生了相當一致的Ct值，而C.albicans和NSC樣品示出的Ct值隨時間增加(ETGA信號減少)。C.albicans和NSC樣品的這種Ct值增加可能是由于當起始濃度較低時核酸酶活性對ETGA模板DNA濃度的影響較大，如通過這些樣品在‘0小時’的Ct值較高所指示的。UMOLM95℃(-)樣品示出的Ct值隨時間通常降低(ETGAQPCR信號增加)，C.albicans和NSC樣品除外，其Ct值跨72小時的時間是高度一致的。這指示，對于未用95℃步驟(蛋白質變性)處理的E.coli、S.aureus和陽性對照樣品而言，ETGA反應的繼續(xù)導致QPCR信號增加，勝過了任何核酸酶活性。然而，在核酸酶降解效應看起來更顯著的C.albicans和NSC樣品中，連續(xù)的ETGA反應可以抵消這種降解以提供隨時間更穩(wěn)定的QPCR信號。結果的統(tǒng)計分析進行線性建模(使用R)，以確定在針對用或不用95℃步驟處理在不同時間點獲得的PTOLM和UMOLM樣品Ct值之間是否存在統(tǒng)計學顯著差異。對于每個數(shù)據(jù)集(例如E.coli用PTOLM數(shù)據(jù)集)，相對于以下解釋變量及其相互作用對‘Ct’建模：‘Log10cfu’、‘時間’、和‘95℃步驟’。以逐步方式將非顯著(p>0.05)相互作用和變量從模型中去除，導致模型簡化。然而，如果非顯著變量的任何相互作用是顯著的(p<0.05)，則不從模型中去除它們。因此，每個數(shù)據(jù)集的最終模型僅含有顯著相互作用、顯著變量、和形成顯著相互作用的非顯著變量。在表8中示出了每個變量和相互作用的顯著性代碼(顯著性代碼是基于每個相互作用或在模型簡化點(如果從模型從最終模型中去除)時變量的p-值)。表8-使用線性建模(在R中)的每個解釋變量及其相互作用的p-值的顯著性代碼顯著性代碼：***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，～p<0.1，NS-不顯著。95℃步驟對使用PTOLM和UMOLM的所有微生物和陽性對照的Ct值都具有顯著影響。樣品儲存持續(xù)時間(‘時間’和‘時間’相互作用)對使用PTOLM的任何微生物或陽性對照的Ct值都沒有顯著影響；并且對于使用UMOLM的C.albicans和陽性對照而言也是非顯著的。然而，樣品儲存持續(xù)時間對于使用UMOLM的E.coli和S.aureus是顯著變量：最可能由于在這些樣品集中針對未用95℃步驟處理的樣品觀察到的Ct值隨時間的減小。95℃步驟對NSCUMOLM數(shù)據(jù)集沒有顯著影響；但是樣品儲存持續(xù)時間與95℃步驟之間存在顯著相互作用(‘時間:95℃’)。歸因于作為低QPCR擴增的結果丟失Ct值，無法在NSCPTOLM數(shù)據(jù)集上進行統(tǒng)計分析?？偨Y這里示出的數(shù)據(jù)表明，當除去95℃步驟時，ETGA模板DNA檢測得到了改進。此外，當使用PTOETGA底物DNA處理樣品時，在不存在95℃步驟的情況下，ETGAQPCR信號不會隨樣品儲存持續(xù)時間的增加而劣化。當使用UMOETGA底物DNA處理樣品時，ETGA信號不穩(wěn)定：在不存在95℃步驟的情況下，ETGAQPCR信號隨樣品儲存持續(xù)時間繼續(xù)增加；并且在具有95℃步驟的情況下，ETGAQPCR信號更可能由于核酸酶降解而不繼續(xù)產(chǎn)生ETGA模板DNA而劣化。這些結果與實施例3中呈現(xiàn)的結果是一致的。這里示出的所有數(shù)據(jù)都支持從CognitorMinus測試中除去95℃步驟，并且確認了在LM中使用PTOETGA底物DNA的重要性。這些結果還驗證了，使用PTOLM處理的樣品可以在4℃下儲存長達72小時，而不會對測試結果有害。值得注意的是，當除去95℃步驟時測試的敏感性增加能夠增加檢測到背景信號(血液來源的ETGAQPCR信號)的機會。然而，雖然NSCPTOLM樣品未提供用于比較的完整Ct值集(由于低擴增)，但是NSCUMOLM數(shù)據(jù)集證實與除去95℃相關的ETGAQPCR信號增加對于NSC而言比對于陽性樣品而言要低。此外，優(yōu)化其他因素(如血液裂解/洗滌性能)和解釋QPCR結果應該消除其影響。本發(fā)明在范圍方面不被本文描述的具體實施方案限制。事實上，除本文描述的那些之外，通過以上說明和附圖，本發(fā)明的不同修改對于本領域技術人員而言都將使顯而易見的。此類修改旨在處于所附權利要求書的范圍之內(nèi)。此外，本文所描述的所有實施方案被認為是廣泛適用的并且適當時與任何以及所有其他一致的實施方案可結合的。本文引用了多種出版物，其公開內(nèi)容以其全文通過引用結合。當前第1頁1 2 3