本發(fā)明涉及新的低取代的多粘菌素以及它們的組合物。

背景技術(shù)：

在1947年發(fā)現(xiàn)了作為由多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)產(chǎn)生的抗生素的多粘菌素。多粘菌素是含有七肽環(huán)和N-端酰胺偶聯(lián)脂肪酸的抗生素十肽。如今，兩種商業(yè)化的多粘菌素混合物已在臨床使用中；多粘菌素B和多粘菌素E(粘菌素)。兩種混合物包含在Goevaerts等人的J Chromatogr A.2002 Nov 8；976(1-2)：65-78以及在Van den Bossche等人的Talanta 2011 Feb 15；83(5)：1521-9中所描述的多種組分。根據(jù)歐洲藥典(European pharmacopoeia)，粘菌素應(yīng)包含大于77％的多粘菌素E1、E2、E3、E1-i和E1-7MOA，且較少組分多粘菌素E3、E1-i和E1-7MOA的每種小于10％。

由于與粘菌素有關(guān)的毒性，在1950年代通過(guò)磺甲基化對(duì)混合物進(jìn)行改善?；羌谆恼尘乇环Q為粘菌素甲烷磺酸鈉(Colistimethate sodium，CMS)，其已經(jīng)被當(dāng)作是粘菌素的前體藥物。CMS作為用于多重耐藥微生物，如綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)以及其他革蘭氏陰性病原體(Gram negative pathogen)的最后防線治療選擇仍用于臨床應(yīng)用。多年來(lái)，通過(guò)霧化至患有囊性纖維化(CF)的患者的肺部，也已經(jīng)將CMS的溶液進(jìn)行給藥，從而控制由綠膿桿菌引起的定殖或感染。

現(xiàn)今，由耐抗生素的病原體所引起的感染問(wèn)題的增加已經(jīng)導(dǎo)致產(chǎn)品如粘菌素的使用增加。

事實(shí)上，含有不同多粘菌素的衍生物的復(fù)雜混合物的商業(yè)CMS產(chǎn)品具有若干不良的后果。這些首要地涉及到任何市售的產(chǎn)品的治療價(jià)值。由于CMS可以被認(rèn)為是在注入或吸入至身體內(nèi)之后的抗生素貯存器(antibiotic-reservoir)，所以重要的是在腎或代謝的清除之前達(dá)到活化化合物的治療水平。因此，僅含有兩個(gè)磺基甲基取代基的磺甲基化多粘菌素提供了與分子量和電荷相關(guān)的良好限定的產(chǎn)物。

因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供改善的多粘菌素化合物和用作為抗菌劑的組合物，以及克服或至少減輕先前技術(shù)產(chǎn)品的缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及包含連接至多粘菌素的多肽部分中的DAB或DAP殘基上的γ-氨基基團(tuán)的總共兩個(gè)磺基甲基基團(tuán)的多粘菌素。這些化合物和它們的組合物可以用于細(xì)菌感染的治療。

在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了比多粘菌素E和多粘菌素B更易溶于水的新的多粘菌素。在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了在水溶液中比市售的CMS更穩(wěn)定的磺甲基化多粘菌素。在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了比市售的CMS更均勻的磺甲基化多粘菌素的混合物。最后，與現(xiàn)有技術(shù)的多粘菌素組合物相比，本發(fā)明化合物或者它們的混合物或組合物提供了目前沒(méi)有良好限定的改善的多粘菌素劑量和療法。

因此，本發(fā)明提供了由式(I)表示的新的多粘菌素：

其中

R¹是脂肪族的直鏈或支鏈的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)或者

R⁵是–CH(CH₃)₂、–CH₂CH(CH₃)₂、–CH(CH₃)CH₂CH₃或–CH₂C₆H₅；

R⁶是–CH(CH₃)₂、–CH₂CH(CH₃)₂或–CH(CH₃)CH₂CH₃；

R²、R³、R⁴、R⁷和R⁸中的每一個(gè)是–(CH₂)_xCH₂NH₂或者

–(CH₂)_xCH₂N(CH₂SO₃M)₂；

其中x是0或1；

其中M是陽(yáng)離子；以及

條件是R²、R³、R⁴、R⁷和R⁸中的一個(gè)是–(CH₂)_xCH₂N(CH₂SO₃M)₂。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，提供了由式(I)表示的多粘菌素；其中，將兩個(gè)磺基甲基基團(tuán)連接至相同的γ-氨基基團(tuán)。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，提供了由式(I)表示的多粘菌素；其中，R¹是脂肪族的直鏈或支鏈的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)；

R⁵和R⁶是–CH₂CH(CH₃)₂；

R³、R⁴、R⁷和R⁸中的每一個(gè)是–CH₂CH₂NH₂；

以及；

R²是–CH₂CH₂N(CH₂SO₃M)₂。

其中M是一價(jià)陽(yáng)離子。

根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供了由式(I)表示的多粘菌素；其中，R¹是脂肪族的直鏈或支鏈的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)；

R⁵和R⁶是–CH₂CH(CH₃)₂；

R²、R⁴、R⁷和R⁸中的每一個(gè)是–CH₂CH₂NH₂；

以及；

R³是–CH₂CH₂N(CH₂SO₃M)₂。

其中M是一價(jià)陽(yáng)離子。

根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供了由式(I)表示的多粘菌素；其中，R¹是脂肪族的直鏈或支鏈的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)；

R⁵和R⁶是–CH₂CH(CH₃)₂；

R²、R³、R⁷和R⁸中的每一個(gè)是–CH₂CH₂NH₂；

以及；

R⁴是–CH₂CH₂N(CH₂SO₃M)₂。

其中M是一價(jià)陽(yáng)離子。

根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供了由式(I)表示的多粘菌素；其中，R¹是脂肪族的直鏈或支鏈的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)；

R⁵和R⁶是–CH₂CH(CH₃)₂；

R²、R³、R⁴和R⁸中的每一個(gè)是–CH₂CH₂NH₂；

以及；

R⁷是–CH₂CH₂N(CH₂SO₃M)₂。

其中M是一價(jià)陽(yáng)離子。

根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供了由式(I)表示的多粘菌素；其中，R¹是脂肪族的直鏈或支鏈的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)；

R⁵和R⁶是–CH₂CH(CH₃)₂；

R²、R³、R⁴和R⁷中的每一個(gè)是–CH₂CH₂NH₂；

以及；

R⁸是–CH₂CH₂N(CH₂SO₃M)₂。

其中M是一價(jià)陽(yáng)離子。

根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供了由式(I)表示的多粘菌素；其中，R¹是脂肪族的直鏈或支鏈的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)；

R⁵和R⁶是–CH₂CH(CH₃)₂或CH₂C₆H₅；

R³、R⁴、R⁷和R⁸中的每一個(gè)是–CH₂CH₂NH₂；

以及；

R²是–CH₂CH₂N(CH₂SO₃M)₂。

其中M是一價(jià)陽(yáng)離子。

根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供了由式(I)表示的多粘菌素；其中，R¹是脂肪族的直鏈或支鏈的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)；

R⁵和R⁶是–CH₂CH(CH₃)₂或CH₂C₆H₅；

R²、R⁴、R⁷和R⁸中的每一個(gè)是–CH₂CH₂NH₂；

以及；

R³是–CH₂CH₂N(CH₂SO₃M)₂。

其中M是一價(jià)陽(yáng)離子。

根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供了由式(I)表示的多粘菌素；其中，R¹是脂肪族的直鏈或支鏈的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)；

R⁵和R⁶是–CH₂CH(CH₃)₂或CH₂C₆H₅；

R²、R³、R⁷和R⁸中的每一個(gè)是–CH₂CH₂NH₂；

以及；

R⁴是–CH₂CH₂N(CH₂SO₃M)₂。

其中M是一價(jià)陽(yáng)離子。

根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供了由式(I)表示的多粘菌素；其中，R¹是脂肪族的直鏈或支鏈的C₆-C₁₀酰基基團(tuán)；

R⁵和R⁶是–CH₂CH(CH₃)₂或CH₂C₆H₅；

R²、R³、R⁴和R⁸中的每一個(gè)是–CH₂CH₂NH₂；

以及；

R⁷是–CH₂CH₂N(CH₂SO₃M)₂。

其中M是一價(jià)陽(yáng)離子。

根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供了由式(I)表示的多粘菌素；其中，R¹是脂肪族的直鏈或支鏈的C₆-C₁₀酰基基團(tuán)；

R⁵和R⁶是–CH₂CH(CH₃)₂或CH₂C₆H₅；

R²、R³、R⁴和R⁷中的每一個(gè)是–CH₂CH₂NH₂；

以及；

R⁸是–CH₂CH₂N(CH₂SO₃M)₂。

其中M是一價(jià)陽(yáng)離子。

根據(jù)本發(fā)明的以上實(shí)施方式的另一個(gè)方面，R¹是6-甲基辛?；?/p>

根據(jù)本發(fā)明的以上實(shí)施方式的另一個(gè)方面，R¹是6-甲基庚?；?。

根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式，提供了式(I)的多粘菌素，其中R¹是脂肪族的直鏈或支鏈的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)或者

R⁵是–CH(CH₃)₂、–CH₂CH(CH₃)₂、–CH(CH₃)CH₂CH₃或–CH₂C₆H₅；

R⁶是–CH(CH₃)₂、–CH₂CH(CH₃)₂或–CH(CH₃)CH₂CH₃；

R²、R³、R⁴、R⁷和R⁸中的每一個(gè)是–CH₂NH₂或–CH₂N(CH₂SO₃M)₂；

其中M是陽(yáng)離子；以及

條件是R²、R³、R⁴、R⁷和R⁸中的一個(gè)是CH₂N(CH₂SO₃M)₂。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含根據(jù)本發(fā)明的一種或多種多粘菌素的藥物組合物。

根據(jù)本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含如通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)測(cè)量的大于50％的根據(jù)本發(fā)明的多粘菌素。

根據(jù)又一個(gè)實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含如通過(guò)HPLC測(cè)量的大于50％的由式(I)表示的多粘菌素。

根據(jù)又一個(gè)實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含如通過(guò)HPLC測(cè)量的大于80％的由式(I)表示的多粘菌素。

根據(jù)又一個(gè)實(shí)施方式，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含如通過(guò)HPLC測(cè)量的大于90％的由式(I)表示的多粘菌素。

根據(jù)又一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明的組合物包含如通過(guò)HPLC測(cè)量的大于50％的由圖1-5的式表示的一種或多種多粘菌素。

根據(jù)又一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明的組合物包含如通過(guò)HPLC測(cè)量的大于80％的由圖1-5的式表示的一種或多種多粘菌素。

根據(jù)又一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明的組合物包含如通過(guò)HPLC測(cè)量的大于90％的由圖1-5的式表示的一種或多種多粘菌素。

第一實(shí)施方式涉及由式(I)表示的多粘菌素：

其中

R¹是脂肪族的直鏈或支鏈的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)或者

R⁵是–CH(CH₃)₂、–CH₂CH(CH₃)₂、–CH(CH₃)CH₂CH₃或–CH₂C₆H₅；

R⁶是–CH(CH₃)₂、–CH₂CH(CH₃)₂、–CH(CH₃)CH₂CH₃或–CH₂CH₂CH₃；

R²、R³、R⁴、R⁷和R⁸中的每一個(gè)是–(CH₂)_xCH₂NH₂或

–(CH₂)_xCH₂N(CH₂SO₃M)₂；

其中x是0或1；

其中M是陽(yáng)離子；以及

其中R²、R³、R⁴、R⁷和R⁸中的一個(gè)是–(CH₂)_xCH₂N(CH₂SO₃M)₂。

在第一實(shí)施方式的第一方面中，R1是庚?；⒓谆；?、辛?；?、甲基辛?；?、壬酰基、甲基壬?；蚬秕；?。

在第一實(shí)施方式的第二方面中，R1是庚酰基、6-甲基庚?；⑿刘；?、(S)-6-甲基辛酰基、7-甲基辛?；?-羥基-6-甲基辛?；⑷甚；?、(8-甲基壬?；蚬秕；?/p>

在第一實(shí)施方式的第三方面中，前文描述的多粘菌素的特征在于M選自由Na⁺、K⁺、1/2Mg²⁺、H_mN(C_1-4烷基)_n⁺或它們的組合所組成的組，其中m是0-4且n是0-4，條件是m+n＝4。

在第一實(shí)施方式的第四方面中，x是1且M是H⁺、Na⁺或K⁺。

在第一實(shí)施方式的第五方面中，x是1且M是Na⁺或K⁺。

第二實(shí)施方式涉及一種含有至少一種由式(I)表示的多粘菌素的組合物：

其中

R¹是脂肪族的直鏈或支鏈的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)或

R⁵是–CH(CH₃)₂、–CH₂CH(CH₃)₂、–CH(CH₃)CH₂CH₃或–CH₂C₆H₅；

R⁶是–CH(CH₃)₂、–CH₂CH(CH₃)₂、–CH(CH₃)CH₂CH₃或–CH₂CH₂CH₃；

R²、R³、R⁴、R⁷和R⁸中的每一個(gè)是–(CH₂)_xCH₂NH₂或

–(CH₂)_xCH₂N(CH₂SO₃M)₂；

其中x是0或1；

其中M是陽(yáng)離子；以及

其中R²、R³、R⁴、R⁷和R⁸中的一個(gè)是–(CH₂)_xCH₂N(CH₂SO₃M)₂。

在第二實(shí)施方式的第一方面中，R1是庚酰基、甲基庚?；?、辛?；?、甲基辛?；?、3-羥基-6-甲基辛?；?、壬?；⒓谆甚；蚬秕；?/p>

在第二實(shí)施方式的第二方面中，R1是庚?；?-甲基庚?；⑿刘；?、(S)-6-甲基辛酰基、3-羥基-6-甲基辛?；?、7-甲基辛?；?、壬?；?、8-甲基壬?；蚬秕；?。

在第二實(shí)施方式的第三方面中，前文描述的多粘菌素的特征在于M選自由Na⁺、K⁺、H_mN(C_1-4烷基)_n⁺、1/2Mg²⁺或它們的組合所組成的組，其中m是0-4且n是0-4，條件是m+n＝4。

在第二實(shí)施方式的第四方面中，x是1且M是H⁺、Na⁺或K⁺。

在第二實(shí)施方式的第五方面中，x是1且M是Na⁺或K⁺。

在第二實(shí)施方式的第六方面中，藥物組合物包含如通過(guò)HPLC測(cè)量的大于50％的由式(I)表示的多粘菌素。

在第二實(shí)施方式的第七方面中，藥物組合物包含如通過(guò)HPLC測(cè)量的大于50％的由式(I)表示的多粘菌素，并且x是1且M是Na⁺或K⁺。

第三實(shí)施方式涉及由式(I)表示的多粘菌素：

其中

R¹是脂肪族的直鏈或支鏈的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)；

R⁵是–CH₂CH(CH₃)₂或–CH₂C₆H₅；

R⁶是–CH₂CH(CH₃)₂；

R²、R³、R⁴、R⁷和R⁸中的每一個(gè)是–CH₂CH₂NH₂或–CH₂CH₂N(CH₂SO₃M)₂；

其中M是陽(yáng)離子；以及

其中R²、R³、R⁴、R⁷和R⁸中的僅一個(gè)是–CH₂CH₂N(CH₂SO₃M)₂。

在第三實(shí)施方式的第一方面中，脂肪族的C₆-C₁₀酰基基團(tuán)或支鏈的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)可選地包含羥基基團(tuán)。

第四實(shí)施方式涉及一種含有至少一種由式(I)表示的多粘菌素的組合物：

其中

R¹是脂肪族的直鏈或支鏈的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)；

R⁵是–CH₂CH(CH₃)₂或–CH₂C₆H₅；

R⁶是–CH₂CH(CH₃)₂；

R²、R³、R⁴、R⁷和R⁸中的每一個(gè)是–CH₂CH₂NH₂或–CH₂CH₂N(CH₂SO₃M)₂；

其中M是陽(yáng)離子；以及

其中R²、R³、R⁴、R⁷和R⁸中的僅一個(gè)是–CH₂CH₂N(CH₂SO₃M)₂。

在第四實(shí)施方式的第一方面中，藥物組合物包含如通過(guò)HPLC測(cè)量的大于50％的由式(I)表示的多粘菌素。

在第四實(shí)施方式的第二方面中，藥物組合物包含如通過(guò)HPLC測(cè)量的大于80％的由式(I)表示的多粘菌素。

在第四實(shí)施方式的第三方面中，藥物組合物包含如通過(guò)HPLC測(cè)量的大于50％的由式(I)表示的多粘菌素，并且該藥物組合物用于治療由革蘭氏陰性細(xì)菌引起的感染。

在第四實(shí)施方式的第四方面中，藥物組合物包含如通過(guò)HPLC測(cè)量的大于50％的由式(I)表示的多粘菌素，并且M選自于藥學(xué)上可接受的陽(yáng)離子。

在第四實(shí)施方式的第五方面中，藥物組合物包含如通過(guò)HPLC測(cè)量的大于50％的由式(I)表示的多粘菌素，并且M選自于藥學(xué)上可接受的一價(jià)陽(yáng)離子。

在第四實(shí)施方式的第六方面中，脂肪族的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)或支鏈的C₆-C₁₀?；鶊F(tuán)可選地包含羥基基團(tuán)。

第五實(shí)施方式涉及一種含有至少一種由式(I)表示的多粘菌素的組合物：

其中

R¹是6-甲基辛?；?、6-甲基庚?；蛐刘；?/p>

R⁵是–CH₂CH(CH₃)₂或–CH₂C₆H₅；

R⁶是–CH₂CH(CH₃)₂；

R²、R³、R⁴、R⁷和R⁸中的每一個(gè)是–CH₂CH₂NH₂或–CH₂CH₂N(CH₂SO₃Na)₂；

以及

其中R²、R³、R⁴、R⁷和R⁸中的僅一個(gè)是–CH₂CH₂N(CH₂SO₃Na)₂。

在第五實(shí)施方式的第一方面中，藥物組合物包含如通過(guò)HPLC測(cè)量的大于50％的由式(I)表示的多粘菌素。

在第五實(shí)施方式的第二方面中，藥物組合物包含如通過(guò)HPLC測(cè)量的大于80％的由式(I)表示的多粘菌素。

在第五實(shí)施方式的第三方面中，藥物組合物包含如通過(guò)HPLC測(cè)量的大于50％的由式(I)表示的多粘菌素，并且該藥物組合物用于治療由革蘭氏陰性細(xì)菌引起的感染。

詳細(xì)說(shuō)明

附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1示出了PE1-(SM)₂¹的二鈉鹽的結(jié)構(gòu)

圖2示出了PE1-(SM)₂³的二鈉鹽的結(jié)構(gòu)

圖3示出了PE1-(SM)₂⁵的二鈉鹽的結(jié)構(gòu)

圖4示出了PE1-(SM)₂⁸的二鈉鹽的結(jié)構(gòu)

圖5示出了PE1-(SM)₂⁹的二鈉鹽的結(jié)構(gòu)

圖6示出了PE1-(SM)₁₀^1,3,5,8,9的色譜圖

圖7示出了在非平衡條件下在90分鐘(pH 9)之后的PE1-(SM)₁₀^1,3,5,8,9的降解。

圖8示出了在非平衡條件下在3天(pH 8.0)之后的PE1-(SM)₁₀^1,3,5,8,9的降解。

圖9示出了在非平衡條件下在3天(pH 7.0)之后的PE1-(SM)₁₀^1,3,5,8,9的降解。

圖10示出了在非平衡條件下在3天(pH 6.5)之后的PE1-(SM)₁₀^1,3,5,8,9的降解。

圖11示出了在非平衡條件下在3天(pH 6.0)之后的PE1-(SM)₁₀^1,3,5,8,9的降解。

圖12示出了對(duì)于兩種取代的多粘菌素E1獲得的MS譜。以負(fù)模式m/z 677.3[-2]和1355.5[-1]獲得。

圖13(上部)示出了確認(rèn)五種單獨(dú)的包含兩個(gè)磺甲基基團(tuán)的多粘菌素組分的存在的色譜圖(UV信號(hào)在215nm下)。

圖13(下部)示出了對(duì)應(yīng)于單(雙-磺甲基化)多粘菌素E1的質(zhì)量的引出束流(EIC)(677.62、1356.2、1378.06的m/z)。

圖14示出了單(雙-磺甲基化)多粘菌素E1的質(zhì)譜。

定義

如貫穿本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)所使用的，以下術(shù)語(yǔ)具有以下含義：

如在本文中描述的術(shù)語(yǔ)“多粘菌素”是指包含與脂肪酸部分酰胺偶聯(lián)的肽部分的抗生素化合物。

如在本文中描述的術(shù)語(yǔ)“Dab殘基”是指與至少一個(gè)氨基酸酰胺偶聯(lián)的2,4-二氨基丁酸酯化合物。天然存在的多粘菌素通常包含6個(gè)Dab殘基，其中5個(gè)具有游離的γ-氨基基團(tuán)。

如在本文中描述的術(shù)語(yǔ)“Dab”是指衍生自2,4-二氨基丁酸的殘基，其中與羰基碳相鄰的碳原子(即α-碳)具有指定為L(zhǎng)-構(gòu)型的立體化學(xué)。L-Dab在文獻(xiàn)中可替代地被稱為L(zhǎng)-Dbu。

由式(I)表示的多粘菌素中位置6的氨基酸具有D-構(gòu)型，即將R⁵連接的氨基酸殘基。

如在本文中描述的術(shù)語(yǔ)“DAP殘基”是指與至少一個(gè)氨基酸酰胺偶聯(lián)的2,3-二氨基丙酸酯化合物。

如在本文中描述的術(shù)語(yǔ)“DAP”是指化合物2,3-二氨基丙酸酯。

如在本文中描述的術(shù)語(yǔ)“磺甲基”是指-CH₂SO₃M部分，其中M如下所定義?；撬狨?-SO₃)部分可以是酸性形式，但在生理環(huán)境(體內(nèi))中，它將具有負(fù)電荷并且將具有相關(guān)聯(lián)的陽(yáng)離子，例如M。

如在本文中描述的術(shù)語(yǔ)“CMS”是指包含磺甲基化的粘菌素的組合物?；瘜W(xué)文摘(Chemical abstract)已經(jīng)為CMS分配了這類組合物編號(hào)8068-28-8。

如在本文中描述的術(shù)語(yǔ)“CMS E1”是指由相對(duì)純的多粘菌素E1(通過(guò)HPLC測(cè)量的>80％純)的磺甲基化制備的組合物。

如在本文中描述的術(shù)語(yǔ)“粘菌素”是指包含多粘菌素E1和多粘菌素E2的組合物。化學(xué)文摘為粘菌素已經(jīng)分配了編號(hào)1066-17-7。根據(jù)歐洲藥典，粘菌素應(yīng)包含大于77％的多粘菌素E1、E2、E3、E1i和E1-7MOA，且較小組分多粘菌素E3、E1-i和E1-7MOA的每種少于10％。

如在本文中描述的術(shù)語(yǔ)“多粘菌素E”可與“粘菌素”互換使用。

如在本文中描述的術(shù)語(yǔ)“多粘菌素E1”是指具有CAS號(hào)7722-44-3的化合物。多粘菌素E1可與粘菌素A互換使用。

如在本文中描述的術(shù)語(yǔ)“多粘菌素E2”是指具有CAS號(hào)7239-48-7的化合物。多粘菌素E2可與粘菌素B互換使用。

如在本文中描述的表述“磺甲基化多粘菌素”是指包含至少一個(gè)連接至L-DAB殘基上的γ-氨基基團(tuán)的磺甲基基團(tuán)的多粘菌素。

術(shù)語(yǔ)“M”是陽(yáng)離子并且是指含有一個(gè)或兩個(gè)正電荷的陽(yáng)離子物質(zhì)，其實(shí)例包括但不限于Li⁺、Na⁺、K⁺、1/2Mg²⁺、H_mN(C_1-4烷基)_n⁺，其中m為0-4且n為0-4，條件是m+n＝4。

如在本文中描述的表述“脂肪族的直鏈或支鏈C6-C10?；鶊F(tuán)”是指含有羰基部分和包含總共6至10個(gè)碳原子的非羰基部分的取代基。它包括在已知的多粘菌素化合物中發(fā)現(xiàn)的?；鶊F(tuán)。它還包括但不限于庚酰基、甲基庚酰基(包括(S)-6-甲基庚?；?、辛?；⒓谆刘；?包括(S)-6-甲基辛?；?-甲基辛?；?、壬?；⒓谆甚；凸秕；?/p>

如在本文中描述的術(shù)語(yǔ)“鹽”或“它們的鹽是指包含陽(yáng)離子和陰離子的化合物，其可以通過(guò)普通技術(shù)人員已知的任何方法制備，例如通過(guò)接受質(zhì)子部分的質(zhì)子化和/或供給質(zhì)子部分的去質(zhì)子化。可替換地，可以通過(guò)陽(yáng)離子/陰離子的復(fù)分解或陽(yáng)離子/陰離子的交換反應(yīng)制備該鹽。

如在本文中描述的術(shù)語(yǔ)“通過(guò)HPLC測(cè)量的大于X％”應(yīng)理解為由在本申請(qǐng)的實(shí)施例中描述的或者可替換地如WO2014195405A1中所描述的HPLC方法得到的色譜中相關(guān)峰的相對(duì)積分面積。

根據(jù)本發(fā)明，提供了包含兩個(gè)磺甲基基團(tuán)的新型的多粘菌素，該磺甲基基團(tuán)連接至具有游離γ-胺的以上結(jié)構(gòu)的任何Dab殘基，即Dab殘基Dab1、Dab3、Dab5、Dab8或Dab9中的任一個(gè)。因此，式(I)旨在涵蓋單(雙-磺甲基化)多粘菌素，而不是三-、四-或五(雙-磺甲基化)多粘菌素。

新的多粘菌素的實(shí)例在本文中被稱為單(N^γ-雙-磺甲基)Dab⁹多粘菌素E1，即其中式I的取代基表示為R¹是6-甲基辛?；?，R⁵和R⁶為-CH₂CH(CH₃)₂；R²、R³、R⁴和R⁷中的每一個(gè)是-CH₂CH₂NH₂；以及R⁸是-CH₂CH₂N(CH₂SO₃M)₂

其中M是Na⁺。在圖5中示出了這種化合物的實(shí)例。該化合物的縮寫(xiě)名為PE1-(SM)₂⁹。

單雙-磺基甲基化多粘菌素的其他實(shí)例是單(N^γ-雙-磺甲基)Dab¹多粘菌素E1、單(N^γ-雙-磺甲基)Dab³多粘菌素E1、單(N^γ-雙-磺甲基)Dab⁵多粘菌素E1、單(N^γ-雙-磺甲基)Dab⁸多粘菌素E1，在圖1-4中分別示出了它們的二鈉結(jié)構(gòu)。

表述“-CH₂CH₂NH₂”應(yīng)理解為涵蓋-CH₂CH₂NH₂或-CH₂CH₂NH₃⁺，取決于介質(zhì)的pH。

表述“-CH₂NH₂”應(yīng)理解為涵蓋-CH₂NH₂或-CH₂NH₃⁺，取決于介質(zhì)的pH。

在本文中描述的多粘菌素包括許多分子種類。例如在水溶液中，電荷將取決于pH。在本文中描述的多粘菌素化合物涵蓋它們的所有藥學(xué)上可接受的鹽和離子。在這些中，多粘菌素當(dāng)然是二鈉鹽。其他藥學(xué)上可接受的鹽也包括在內(nèi)，例如，鉀、鋰和銨鹽(如H_mN(C_1-4烷基)_n⁺，其中m為0-4且n為0-4，條件是m+n＝4)或它們的組合。

如在本文中描述的多粘菌素可用于治療或預(yù)防感染性疾病，特別是由革蘭氏陰性細(xì)菌引起的感染，該革蘭氏陰性細(xì)菌如但不限于，綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)和鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)、大腸桿菌(Eschericia coli)和產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)。根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明包括包含有效量的本文描述的任何組合物的藥物組合物在治療革蘭氏陰性細(xì)菌感染中的用途。

可以以治療有效量給藥本發(fā)明化合物。“治療有效量”旨在描述足以治療感染的化合物的量。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，特定患者的合適的日劑量可根據(jù)如所治療的病癥及其嚴(yán)重性；使用的組合物，患者的年齡、體重、性別和飲食，以及所涉及的醫(yī)師的傾向和經(jīng)驗(yàn)等的因素變化。

可以給藥根據(jù)本發(fā)明的組合物用于人類以及獸醫(yī)學(xué)的用途?？梢越?jīng)由各種途徑，如皮下，通過(guò)吸入、口服、腸胃外或局部途徑將本文描述的組合物給藥至需要的患者。組合物可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何形式，且包括例如片劑、膠囊、粉末、顆粒、錠劑、霜?jiǎng)┗蛞后w制劑，如無(wú)菌的注入液或懸浮液。

在一個(gè)方面中，組合物可用于通過(guò)靜脈輸注或注射而給藥。可以根據(jù)技術(shù)人員熟知的方法制備靜脈內(nèi)或注射制劑。例如，可以將在本文描述的化合物溶解于用于注射的水中，隨后過(guò)濾滅菌，進(jìn)一步地將所述過(guò)濾的組合物轉(zhuǎn)移至合適的小瓶中。

根據(jù)一個(gè)方面，組合物是凍干的。在使用前，例如在通過(guò)注射給藥之前，或在通過(guò)吸入給藥(例如，使用噴霧器或任何其他合適的吸入設(shè)備)之前，將凍干的粉末重新組成，例如在用于注射的水中。因此，根據(jù)另一個(gè)方面，配制用于通過(guò)吸入給藥的組合物。

本文描述的化合物可以進(jìn)一步地包含一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑(輔料，excipient)，包括但不限于防腐劑、緩沖劑和抗氧化劑或稀釋劑。合適的稀釋劑包括，例如用于注射的水、0.9％的NaCl、0.9％的NaCl中的5％的葡萄糖、水中的5％的葡萄糖、0.45％的NaCl中的5％的葡萄糖、0.225％的NaCl中的5％的葡萄糖和乳酸林格氏溶液(Lactated Ringer’s solution)。

此外，可以將本文公開(kāi)的化合物與一種或多種另外的抗細(xì)菌劑組合該給藥。當(dāng)與另一抗菌劑組合使用時(shí)，本文描述的化合物可與一種或多種其他的抗菌劑同時(shí)地、分開(kāi)地或依次地給藥。

下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步地說(shuō)明了本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的范圍不以任何方式受限于以下實(shí)施例的范圍。

實(shí)施例

根據(jù)以下實(shí)驗(yàn)性部分進(jìn)一步地支持和舉例說(shuō)明了本公開(kāi)，但不受限于其中。

實(shí)施例1：

起始材料.

將分離的多粘菌素E1硫酸鹽(3.5g)與45％w/w的羥基甲烷硫酸鈉的水溶液(11.3g)混合且加溫至60℃，同時(shí)攪拌。然后通過(guò)幾次添加2M的NaOH將pH保持在7.0-7.5。在18個(gè)小時(shí)之后，將混合物冷卻至周圍溫度，并且通過(guò)在200mL的甲醇/乙腈(1/1v/v)中沉淀，將粗產(chǎn)物提供為白色固體。

通過(guò)以下步驟將產(chǎn)物脫鹽和精處理(polish)：洗滌C18柱6μ(例如Phenomenex X Bridge Prep Shield 10×250mm)或相似物且用5％的MeCN(無(wú)鹽)平衡。將柱安裝于Waters Delta Prep HPLC系統(tǒng)中，150mL/min的最大流速。檢測(cè)器是調(diào)節(jié)至280nm的5a Waters 2487。將9mL的230mg PE1-(SM)₁₀^1,3,5,8,9的5％MeCN溶液和1mL的2M NaCl的混合物加載于柱并且流速是6-8mL/min。

以6-8mL/min用5％的MeCN將柱洗脫并脫鹽，并且收集PE1-(SM)₁₀^1,3,5,8,9餾分。在過(guò)程期間在柱中出現(xiàn)一些降解，但是通過(guò)將頭部和尾部切割掉，保持高純度。在2L的梨形蒸發(fā)燒瓶中的97:3的MeCN:H₂O溶液的真空蒸發(fā)之前，將頭部餾分(Head Fraction)，ca.35mL直接地收集至450mL 100％的MeCN中，并且添加另外的550mL 100％的MeCN。

利用Büchi 15旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Rotavapor)進(jìn)行蒸餾過(guò)程。94:6的共沸物餾出使得不含水的PE1-(SM)₁₀^1,3,5,8,9殘留在2L的真空蒸餾燒瓶中。用3×8mL 100％的MeOH(干)將殘余物移除并且傾倒至50mL的真空蒸發(fā)燒瓶中，并且真空蒸發(fā)至1-2mL的MeOH-PE1-(SM)₁₀^1,3,5,8,9懸浮液。添加15mL 100％的MeCN，并且在用35℃的水浴溫度干燥的情況下，將20溶液/懸浮液進(jìn)一步地真空蒸發(fā)。在該過(guò)程期間，壓力從70-60托降低至20-15托。進(jìn)一步地利用在保持真空的35℃水浴中減緩旋轉(zhuǎn)進(jìn)行真空干燥30分鐘。產(chǎn)率是150mg的PE1-(SM)₁₀^1,3,5,8,9物質(zhì)。

實(shí)施例2

包含單(N^γ-雙-磺甲基)多粘菌素E1的混合物的生產(chǎn)。

當(dāng)磺甲基化多粘菌素降解接近于粘菌素時(shí)，釋放羥基甲烷磺酸酯。由于羥基甲烷磺酸酯易于再生母磺甲基化分子，因此該過(guò)程是可逆的。

該研究的目的是研究通過(guò)使用納米過(guò)濾連續(xù)地去除羥基甲烷磺酸酯在非平衡條件下磺甲基化多粘菌素的降解。

在RO水中使用2L的10mM PE1-(SM)₁₀^1,3,5,8,9建立實(shí)驗(yàn)，并且通過(guò)頻繁地添加RO水，將溶液的體積在過(guò)濾單元中保持恒定。納米過(guò)濾單元在40C在3巴壓力下運(yùn)行每日活動(dòng)，每次去除約5l的流出液。用0.1M HCl調(diào)節(jié)pH直至穩(wěn)定至8.0、7.0、6.5和6.0。在圖6-11中示出了結(jié)果。

MS數(shù)據(jù)確定了多粘菌素的二磺甲基化。圖12示出了以負(fù)模式(m/z677.3[-2]和1355.5[-1])獲得的MS譜。

實(shí)施例3：低取代的粘菌素的合成。

將粘菌素硫酸鹽(1.0g，0.71mmol)溶于20ml水中。添加45％的羥基甲烷磺酸鈉(0.847g，2.841mmol)和NaHCO₃(0.12g，1.40mmol)。將透明溶液在25℃下攪拌12h。通過(guò)緩慢添加100ml的乙腈和甲醇(50:50)沉淀出產(chǎn)物。將產(chǎn)物分離為白色粉末。

實(shí)施例4a：低取代的多粘菌素E1的合成。

將多粘菌素E1(1.0g，0.71mmol)溶于20ml水中。添加45％的羥基甲烷磺酸鈉(0.847g，2.841mmol)和NaHCO₃(0.12g，1.40mmol)。將澄清溶液(clear solution)在25℃下攪拌12小時(shí)。通過(guò)緩慢添加100ml的乙腈和甲醇(50:50)沉淀出產(chǎn)物。將產(chǎn)物分離為白色粉末。

實(shí)施例4b：低取代的多粘菌素E1的色譜和MS。

使用質(zhì)譜(負(fù)模式的MS)和UV兼容的方法分析由實(shí)施例4a制備的單(雙-磺甲基化)多粘菌素E1，其中在pH 6.6下進(jìn)行分離。圖13的上部示出了確認(rèn)包含兩個(gè)磺甲基的五種單獨(dú)的多粘菌素組分存在的色譜圖(在215nm處的UV信號(hào))。圖13的下部示出了對(duì)應(yīng)于單(雙-磺甲基化)多粘菌素E1的質(zhì)量的引出束流(extracted ion current，EIC)(677.62、1356.2、1378.06的m/z)。

圖14示出了單(雙-磺甲基化)多粘菌素E1的單獨(dú)的質(zhì)譜。677的m/z對(duì)應(yīng)于單(雙-磺甲基化)多粘菌素E1的[M+2H]2+，1356的m/z對(duì)應(yīng)于單(雙-磺甲基化)多粘菌素E1的[M+H]+，并且1378的m/z對(duì)應(yīng)于單(雙-磺甲基化)多粘菌素E1的[M+Na]+。

實(shí)施例5：MIC

使包含ca.93％的單(N^γ-雙-磺甲基)多粘菌素E1的樣品經(jīng)受針對(duì)支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)，ATCC 4617的MIC分析，并且測(cè)量的微生物效價(jià)是611μg/g。

MIC分析

在250rpm對(duì)于綠膿桿菌的34℃以及對(duì)于克雷伯氏菌鮑氏和鮑氏不動(dòng)桿菌的37℃下，將測(cè)試生物體在搖瓶中培養(yǎng)約16小時(shí)。將它們重新培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期晚期，稀釋至準(zhǔn)備使用的濃度，并在÷75℃下用甘油冷凍。所用的培養(yǎng)基是Mueller Hinton Broth。

通過(guò)將5mg的化合物溶解于1ml的Mueller Hinton Broth中制備樣品。將樣品稀釋并添加至孔中，加入測(cè)試生物體且在溫育大約16個(gè)小時(shí)之后(對(duì)于克雷伯氏菌鮑氏和鮑氏不動(dòng)桿菌在37℃下?lián)u動(dòng)，對(duì)于綠膿桿菌在34℃下不搖動(dòng))通過(guò)OD₆₀₀測(cè)量生長(zhǎng)抑制。結(jié)果提供在表1中。

表1

實(shí)施例6：本發(fā)明的化合物的毒性

使用KIM-1(腎臟損傷分子-1)作為急性腎小管壞死的生物標(biāo)志物測(cè)量腎毒性。

用包含93％的單(N^γ-雙-磺甲基)多粘菌素E1或CMS的混合物治療小鼠5天，并且監(jiān)測(cè)毒性和KIM-1的尿濃度的臨床征象。在5天的治療小鼠期間沒(méi)有示出毒性的臨床征象。與載體治療(vehicle treatment)相比，在尿中的KIM-1水平顯示出輕微的增加。按照ELISA試劑盒說(shuō)明中規(guī)定的，在小鼠尿中的KIM-1的正常范圍是456-8048pg/ml。

作為干粉接收混合物，并且在注射前立即將其溶于無(wú)菌鹽水的小瓶中至表1中描述的濃度。

每天一次，持續(xù)5天，在頸部區(qū)域用0.2ml的對(duì)應(yīng)于表1中描述的劑量皮下地治療小鼠。劑量基于28g的平均體重。

在第二次給藥后24小時(shí)和第五次給藥后4小時(shí)收集尿樣品。將樣品儲(chǔ)存在-80℃直至分析KIM-1濃度。

在根據(jù)Quantikine ELISA小鼠TIM-1/KIM-1/HAVCR免疫測(cè)定試劑盒中的說(shuō)明進(jìn)行ELISA之前，將尿樣品解凍，在2000g下離心5分鐘并稀釋×50。

表1.治療計(jì)劃表

如通過(guò)體重和臨床得分測(cè)定的，小鼠對(duì)所有的測(cè)試混合物良好耐受。在注入有包含93％的單(N^γ-雙-磺甲基)多粘菌素E1的混合物的小鼠的組中觀察到在注入部位處的皮膚變厚。然而，觀察到尿KIM-1水平僅僅輕微而不顯著的增加：

表2.在5次給藥后尿的KIM-1濃度。

實(shí)施例6：?jiǎn)坞p-磺甲基化多粘菌素E1的體內(nèi)活性

用多粘菌素E1、CMS E1和單雙-磺甲基化多粘菌素E1的腹膜給藥治療具有綠膿桿菌(菌株P(guān)AX11045)的肺部感染的小鼠模型。CFU是除了小鼠的未治療組之外的在22小時(shí)之后在肺組織中的菌落形成單位的計(jì)算數(shù)量。臨床得分基于在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的觀察，如在表3中示出的：

表3：