本發(fā)明涉及氧化酶、編碼該氧化酶的多核苷酸、以及利用它們的α-氨基酸化合物等的制備方法。

背景技術：

以往，作為α-氨基酸化合物之一的甲硫氨酸用作動物用飼料添加劑。在制備該化合物時，使丙烯醛和甲硫醇反應生成3-甲硫基丙醛，再使3-甲硫基丙醛與氫氰酸、氨和二氧化碳反應生成5-（2-甲基-巰基乙基）-乙內酰脲（甲硫氨酸乙內酰脲）。最后，將5-（2-甲基-巰基乙基）-乙內酰脲通過堿水解生成堿金屬甲硫氨酸鹽，隨后通過用酸例如硫酸或碳酸中和使甲硫氨酸游離（例如，參見專利文獻1等）。

現(xiàn)有技術文獻

專利文獻

專利文獻1 : 特開昭55-102557號公報。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的課題

上述制備方法使用氫氰酸和丙烯醛作為C1或C3構成要素，但這些原料化合物的處理需要充分的管理和與其相適合的設備等。因此，期望開發(fā)例如甲硫氨酸等α-氨基酸化合物的新的制備方法。

解決課題的手段

本發(fā)明提供下列：

第1項．編碼下述（A1）至（A4）中的任一氨基酸序列的多核苷酸（下文也稱為本發(fā)明多核苷酸(A)）：

（A1）SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列、

（A2）i）與SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列具有45％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列、

（A3）i）與由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸所編碼的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列、或

（A4）i）在SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列；

第2項．前述第1項記載的多核苷酸，其具有SEQ ID NO:2、4、6、15、16或17中的任一所示的核苷酸序列；

第3項．在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子與前述第1或2項記載的多核苷酸以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸；

第4項．含有前述第1至3項中任一項記載的多核苷酸的重組載體（下文也稱為本發(fā)明重組載體）；

第5項．前述第4項記載的重組載體，進一步包含編碼具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉換成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列的多核苷酸、或該多核苷酸與在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸；

第6項．前述第5項記載的重組載體，其中具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉換成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列是下述（B1）至（B3）中任一氨基酸序列：

（B1）SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列、

（B2）i）與SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有將2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化轉換成對應的L-甲硫氨酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列、或

（B3）i）在SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有將2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化轉換成對應的L-甲硫氨酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列；

第7項．將前述第1至3項中任一項記載的多核苷酸或前述第4項記載的重組載體導入宿主細胞而成的轉化體；

第8項．前述第7項記載的轉化體，其中宿主細胞是微生物或大腸桿菌；

第9項．將前述第5或6項記載的重組載體導入宿主細胞而成的轉化體；

第10項．前述第9項記載的轉化體，其中宿主細胞是微生物或大腸桿菌；

第11項．擁有前述第1至3項中任一項記載的多核苷酸的轉化體；

第12項．轉化體，其擁有：

i）具有編碼具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉換成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，或該多核苷酸與在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸；和

ii）前述第1至3項中任一項記載的多核苷酸；

第13項．重組載體的制備方法，其包含在可在宿主細胞內復制的載體中整合前述第1至3項中任一項記載的多核苷酸的步驟；

第14項．轉化體的制備方法，其包含將前述第1至3項中任一項記載的多核苷酸或前述第4至6項中任一項記載的重組載體導入宿主細胞的步驟；

第15項．具有下述（A1）至（A4）中的任一氨基酸序列的蛋白質（下文也稱為本發(fā)明蛋白質(A)）：

（A1）SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列、

（A2）i）與SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列具有45％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列、

（A3）i）與由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸所編碼的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列、或

（A4）i）在SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列；

第16項．α-氧代羧酸化合物的制備方法（下文也稱為本發(fā)明制備方法1），其包含使具有下述（A1）至（A4）中的任一氨基酸序列的蛋白質與α-羥基羧酸化合物作用的步驟：

（A1）SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列、

（A2）i）與SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列具有45％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列、

（A3）i）與由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸所編碼的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列、或

（A4）i）在SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列；

第17項．前述第16項記載的制備方法，其中α-羥基羧酸化合物是含硫α-羥基羧酸化合物，對應的α-氧代羧酸化合物是含硫α-氧代羧酸化合物；

第18項．前述第17項記載的制備方法，其中：

含硫α-羥基羧酸化合物是式（1）所示化合物：

式中，R¹表示氫或任選取代的碳原子數為1-8的烷基；

含硫α-氧代羧酸化合物是式（2）所示化合物：

式中，R¹表示與前述相同的含義；

第19項．前述第16至18項中任一項記載的制備方法，其中具有前述（A1）至（A4）中任一氨基酸序列的蛋白質以包含在將編碼該蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中的形態(tài)提供給反應體系；

第20項．前述第19項記載的制備方法，其中前述轉化體是前述第7、8或11項中任一項記載的轉化體；

第21項．前述第16至20項中任一項記載的制備方法，其中前述步驟在具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質的存在下進行；

第22項．前述第21項記載的制備方法，其中具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質是過氧化氫酶；

第23項．前述第21或22項記載的制備方法，其中具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質以包含在將編碼該蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中的形態(tài)提供給反應體系；

第24項．L-α-氨基酸化合物的制備方法（下文也稱為本發(fā)明制備方法2），其包含：

（1）使具有下述（A1）至（A4）中任一氨基酸序列的蛋白質與α-羥基羧酸化合物作用，得到對應的α-氧代羧酸化合物的步驟：

（A1）SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列、

（A2）i）與SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列具有45％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列、

（A3）i）與由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸所編碼的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列、或

（A4）i）在SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列；

和

（2）使具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉換成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質與步驟（1）中得到的α-氧代羧酸化合物作用，得到對應的L-α-氨基酸化合物的步驟；

第25項．前述第24項記載的制備方法，其中α-羥基羧酸化合物是含硫α-羥基羧酸化合物，對應的α-氧代羧酸化合物是含硫α-氧代羧酸化合物，對應的L-α-氨基酸化合物是含硫L-α-氨基酸化合物；

第26項．前述第25項記載的制備方法，其中：

含硫α-羥基羧酸化合物是式（1）所示化合物：

式中，R¹表示氫或任選取代的碳原子數為1-8的烷基；

含硫α-氧代羧酸化合物是式（2）所示化合物：

式中，R¹表示與前述相同的含義；

含硫L-α-氨基酸化合物是式（3）所示化合物：

式中，R¹表示與前述相同的含義；

第27項．前述第24至26項中任一項記載的制備方法，其中具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉換成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質是亮氨酸脫氫酶；

第28項．前述第27項記載的制備方法，其中亮氨酸脫氫酶是來自球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）的亮氨酸脫氫酶；

第29項．前述第24至27項中任一項記載的制備方法，其中具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉換成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列是下述（B1）至（B3）中任一氨基酸序列：

（B1）SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列、

（B2）i）與SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有將2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化轉換成對應的L-甲硫氨酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列、或

（B3）i）在SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有將2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化轉換成對應的L-甲硫氨酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列；

第30項．前述第24至29項中任一項記載的制備方法，其中具有前述（A1）至（A4）中任一氨基酸序列的蛋白質以包含在將編碼該蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中的形態(tài)提供給反應體系；

第31項．前述第30項記載的制備方法，其中前述轉化體是前述第7至12項中任一項記載的轉化體；

第32項．前述第24至31項中任一項記載的制備方法，其中具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉換成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質以包含在將編碼該蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中的形態(tài)提供給反應體系；

第33項．前述第32項記載的制備方法，其中前述轉化體是前述第9、10或12項中任一項記載的轉化體；

第34項．前述第24至33項中任一項記載的制備方法，其中步驟（1）在具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質的存在下進行；

第35項．前述第34項記載的制備方法，其中具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質是過氧化氫酶；

第36項．前述第34或35項記載的制備方法，其中具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質以包含在將編碼該蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中的形態(tài)提供給反應體系；

第37項．前述第24至36項中任一項記載的制備方法，其中步驟（2）在具有將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉換成還原型的能力的蛋白質的存在下進行；

第38項．前述第37項記載的制備方法，其中具有將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉換成還原型的能力的蛋白質是甲酸脫氫酶；

第39項．前述第37或38項記載的制備方法，其中具有將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉換成還原型的能力的蛋白質以包含在將編碼該蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中的形態(tài)提供給反應體系；以及

第40項．前述第24至39項中任一項記載的制備方法，其中步驟（1）和步驟（2）在一個反應體系中進行；

等等。

發(fā)明效果

根據本發(fā)明，可以提供氧化酶、編碼該氧化酶的多核苷酸、以及利用它們的甲硫氨酸等α-氨基酸化合物的制備方法等。

具體實施方式

為了在宿主細胞中表達目標多核苷酸，例如，制備在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子和前述多核苷酸以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸，將其導入宿主細胞。

本文中，“以可發(fā)揮功能的形式連接而成”意指通過將目標多核苷酸導入宿主細胞來轉化宿主細胞時，該多核苷酸處于以在啟動子的控制下表達的方式與啟動子結合的狀態(tài)。

作為在微生物中可發(fā)揮功能的啟動子，可舉出：大腸桿菌乳糖操縱子的啟動子、大腸桿菌色氨酸操縱子的啟動子、T7噬菌體的啟動子、或者tac啟動子、trc啟動子或T7lac啟動子等在大腸桿菌內可發(fā)揮功能的合成啟動子等。

通過將目標多核苷酸、或在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子和前述多核苷酸以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸整合到載體，可以制備重組載體。作為所使用的載體，可舉出例如：包含能夠在宿主細胞中復制的遺傳信息，可以自主增殖，能夠從宿主細胞分離、純化，編碼可檢測標記的載體。作為可在宿主細胞為大腸桿菌時利用的載體，可舉出：pUC119（Takara Bio Inc.制）、pTV118N（Takara Bio Inc.制）、pBluescriptII （東洋紡公司制）、pCR2.1-TOPO（Invitrogen公司制）、pTrc99A（GE Healthcare 公司制）、pKK223-3（GE Healthcare 公司制）、pET-22b（Novagen公司制）、pET-15b（Novagen公司制）等。作為載體，若使用包含選擇標記基因（例如，卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因等賦予抗生素抗性的基因等）的載體，則可以將該選擇標記基因的表型等作為指標選擇導入了該載體的轉化體。

本發(fā)明中所使用的轉化體可以通過將目標多核苷酸、在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子和前述多核苷酸以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸、或含有這些多核苷酸的重組載體導入宿主細胞來制備。

作為宿主細胞，可舉出例如：屬于埃希氏菌（Escherichia）屬、芽孢桿菌（Bacillus）屬、棒狀桿菌（Corynebacterium）屬、葡萄球菌（Staphylococcus）屬、鏈霉菌（Streptomyces）屬、酵母菌（Saccharomyces）屬、克魯維酵母菌（Kluyveromyces）屬、畢赤酵母（Pichia）屬、紅球菌（Rhodococcus）屬和曲霉菌（Aspergillus）屬的微生物等。

作為將多核苷酸或重組載體導入宿主細胞的方法，可對應于所用宿主細胞適用通常所使用的導入方法，可舉出例如：“Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition”（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、“Current Protocols in Molecular Biology”(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等中記載的氯化鈣法、“Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System” Bio-Rad Laboratories, (1993)等中記載的電穿孔法等。

導入了目標多核苷酸或重組載體等的轉化體例如可以以如上所述載體中所含的選擇標記基因的表型作為指標來挑選。

例如，基于“Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition”（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press等中記載的通常的方法，通過進行限制性酶切位點的確認、核苷酸序列的解析、DNA印跡雜交（Southern hybridization）、蛋白質印跡雜交（Western hybridization）等，可以確認所得轉化體擁有目標多核苷酸。

作為用于培養(yǎng)本發(fā)明中使用的轉化體的培養(yǎng)基，可以使用例如：適宜含有微生物等宿主細胞的培養(yǎng)中所通常使用的碳源、氮源、有機鹽、無機鹽等的各種培養(yǎng)基。

作為碳源，可舉出例如：葡萄糖、糊精、蔗糖等糖類，甘油等糖醇，富馬酸、檸檬酸、丙酮酸等有機酸，動物油、植物油和糖蜜。這些碳源在培養(yǎng)基中的添加量相對于培養(yǎng)液通常為0.1至30%（w/v）左右。

作為氮源，可舉出例如：肉提取物、蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物、大豆粉、玉米漿（Corn Steep Liquor）、棉籽粉、干燥酵母、酪蛋白氨基酸等天然有機氮源，氨基酸類、硝酸鈉等無機酸的鈉鹽，氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等無機酸的銨鹽，富馬酸銨、檸檬酸銨等有機酸的銨鹽以及尿素。它們之中，有機酸的銨鹽、天然有機氮源、氨基酸類等在許多情形中也可作為碳源使用。這些氮源在培養(yǎng)基中的添加量相對于培養(yǎng)液通常為0.1至30%（w/v）左右。

作為有機鹽、無機鹽，可舉出例如：鉀、鈉、鎂、鐵、錳、鈷、鋅等的氯化物、硫酸鹽、乙酸鹽、碳酸鹽和磷酸鹽。具體可舉出例如：氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鈷、硫酸鋅、硫酸銅、乙酸鈉、碳酸鈣、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。這些有機鹽和/或無機鹽在培養(yǎng)基中的添加量相對于培養(yǎng)液通常為0.0001至5%（w/v）左右。

在導入tac啟動子、trc啟動子、T7lac啟動子和lac啟動子等由異乳糖誘導的類型的啟動子和編碼目標蛋白質的多核苷酸以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸所得的轉化體的情形中，還可以向培養(yǎng)基中少量添加例如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）作為用于誘導目標蛋白質產生的誘導劑。在整合了受lacUV5啟動子支配的T7 RNA聚合酶基因的噬菌體DE3的溶原菌（λDE3 lysogen）中，導入T7噬菌體啟動子和編碼目標蛋白質的多核苷酸以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸，并培養(yǎng)所得轉化體的情形中，也可以在培養(yǎng)基中少量添加IPTG作為用于誘導目標蛋白質產生的誘導劑。

轉化體的培養(yǎng)可以基于微生物等宿主細胞的培養(yǎng)所通常使用的方法來進行，可舉出例如：試管振蕩式培養(yǎng)、往復式振蕩培養(yǎng)、小型發(fā)酵罐（Jar Fermenter）培養(yǎng)、罐（tank）培養(yǎng)等液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)。

培養(yǎng)溫度可以在該轉化體能夠生長的范圍適宜改變，通常為約15℃至約40℃。培養(yǎng)基的pH優(yōu)選為約6至約8的范圍。培養(yǎng)時間根據培養(yǎng)條件而不同，但通常優(yōu)選為約1天至約5天。

作為從擁有編碼目標蛋白質的多核苷酸并產生該目標蛋白質的轉化體，例如，將編碼目標蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體的培養(yǎng)物純化目標蛋白質的方法，可以適用蛋白質純化中所使用的通常的方法，例如，可舉出如下所述的方法。

通過離心分離等從轉化體的培養(yǎng)物收集細胞后，將其通過超聲處理、DYNO MILL處理、弗氏壓碎器處理等物理破碎法、或者使用表面活性劑或溶菌酶(lysozyme)等溶菌酶的化學破碎法等進行破碎。通過離心分離、膜濾器過濾等從所得破碎液除去雜質，由此制備無細胞提取液，將其通過適宜使用陽離子交換色譜、陰離子交換色譜、疏水色譜、凝膠過濾色譜、金屬螯合色譜、親和色譜等分離純化方法進行分級，可以純化目標蛋白質。

作為色譜中所使用的載體，可舉出例如：導入了羧甲基（CM）基團、二乙基氨基乙基（DEAE）基團、苯基或丁基的纖維素、糊精或瓊脂糖等不溶性高分子載體。也可以使用市售的載體預填充柱，作為該市售的載體預填充柱，可舉出例如：Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名，均為GE Healthcare公司制）、TSK-gel G3000SW（商品名，Tosoh公司制）等。

在目標蛋白質是在其氨基酸末端或羧基末端區(qū)域添加了連續(xù)數個殘基的組氨酸的蛋白質時，可以使用金屬螯合親和柱來純化該蛋白質。在目標蛋白質是以與谷胱甘肽S-轉移酶融合的蛋白質的形式產生時，可以使用谷胱甘肽S-轉移酶單克隆抗體柱對其進行純化。

作為本發(fā)明中所使用的“轉化體的處理物”，可舉出例如：凍干轉化體、有機溶劑處理轉化體、干燥轉化體、轉化體磨碎物、轉化體的自溶物、轉化體的超聲處理物、轉化體提取物、轉化體的堿處理物。作為轉化體提取物，可舉出無細胞提取液、由轉化體制備的的粗純化蛋白質或純化蛋白質、以及它們的固定化物。作為得到固定化物的方法，可舉出例如：載體結合法（使目標蛋白質等吸附于硅膠、陶瓷等無機載體、纖維素、或離子交換樹脂等的方法）和包含法（將目標蛋白質等拘束于聚丙烯酰胺、含硫多糖凝膠（例如角叉菜膠凝膠）、海藻酸凝膠、或瓊脂凝膠等高分子的網孔結構之中的方法）。

若考慮使用了轉化體的工業(yè)生產，則相較于使用存活轉化體，使用殺死該轉化體得到的處理物在制造設備限制少的方面是優(yōu)選的。作為轉化體的殺死處理方法，可舉出例如：物理殺菌法（加熱、干燥、冷凍、光線、超聲、過濾、通電），使用化學藥品的殺菌法（堿、酸、鹵素、氧化劑、硫、硼、砷、金屬、醇、酚、胺、硫化物、醚、醛、酮、氰(シアン)和抗生素）。通常，這些殺菌法之中，理想的是選擇盡量不使目標蛋白質的酶活性失活、并且在反應體系中的殘留、污染等影響少的處理方法。

本發(fā)明多核苷酸(A)編碼下述（A1）至（A4）中任一氨基酸序列：

（A1）SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列、

（A2）i）與SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列具有45％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列、

（A3）i）與由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸所編碼的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列、或

（A4）i）在SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列。

本發(fā)明蛋白質(A)具有下述（A1）至（A4）中任一氨基酸序列：

（A1）SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列、

（A2）i）與SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列具有45％以上的序列同一性的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列、

（A3）i）與由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸所編碼的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列、或

（A4）i）在SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列，并且ii）具有將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列。

在本發(fā)明多核苷酸(A)編碼的氨基酸序列或本發(fā)明蛋白質(A)的氨基酸序列中，與SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列之間可觀察到的區(qū)別是一部分氨基酸的缺失、置換或添加等（以下，有時統(tǒng)稱為氨基酸的改變）。前述“添加”不僅包括氨基酸在序列端部的添加，而且還包括氨基酸在序列中的插入。作為該氨基酸的改變，可舉出例如：(a)具有SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列的蛋白質在細胞內受到的加工所致的缺失、(b)前述蛋白質由于來源生物的種類差異、個體差異等而天然產生的基因突變所造成的氨基酸的缺失、置換或添加、或者(c)由于人工導入的基因突變等而產生的氨基酸的缺失、置換或添加。

對于改變氨基酸的數目，只要是具有產生了改變的上述氨基酸序列的蛋白質可以發(fā)揮將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸衍生物氧化轉換成對應的2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物的能力的范圍內的數目即可。作為本發(fā)明多核苷酸(A)編碼的氨基酸序列的（A4）或本發(fā)明蛋白質(A)的氨基酸序列的（A4）中的“多個氨基酸”，可舉出例如：2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、30、35或40個氨基酸。

作為氨基酸的置換，可舉出例如：保守性置換為疏水性、電荷、pK、立體結構上的特征等類似的氨基酸。作為這樣的置換，具體可舉出例如：(1)甘氨酸、丙氨酸；(2)纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；(3)天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、(4)絲氨酸、蘇氨酸；(5)賴氨酸、精氨酸；(6)苯丙氨酸、酪氨酸等組內的置換。

作為氨基酸的添加，可舉出例如：在氨基酸序列的氨基末端或羧基末端的、包含連續(xù)6個殘基左右的組氨酸的約20個殘基的氨基酸的添加。

作為人工進行氨基酸的改變的手法，可舉出例如：對編碼SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列的多核苷酸實施位點特異性突變導入，然后通過常規(guī)方法使該多核苷酸表達的手法。作為位點特異性突變導入方法，可舉出例如：Olfert Landt 等人（Gene 96 125-128 1990）、Smith等人（Genetic Engineering 3 1 Setlow，J.and Hollaender，A Plenum：New York）、Vlasuk等人（Experimental Manipulation of Gene Expression，Inouye，M.：Academic Press，New York）、Hos.N.Hunt等人（Gene 77 51 1989）等的方法、利用Mutan-Express Km（Takara Bio Inc.制）、TaKaRa La PCR in vitro Mutagenesis Kit（Takara Bio Inc.制）、QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE公司制）等市售試劑盒的方法。

作為人工進行氨基酸的改變的手法，還可舉出例如：對編碼SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列的多核苷酸實施隨機突變導入，然后通過常規(guī)方法使該多核苷酸表達的手法。本文中，作為隨機導入突變的手法，可舉出例如，以編碼上述氨基酸序列中任一的多核苷酸為模板，使用能夠擴增各多核苷酸的全長這樣的引物對，在令用于底物的dATP、dTTP、dGTP、dCTP的各自添加濃度與通常發(fā)生了改變的反應條件下、或者在使促進聚合酶反應的Mg^2＋的濃度較通常增加的反應條件下進行PCR的方法等。作為這樣的PCR的手法，可舉出例如：Method in Molecular Biology, (31), 1994, 97-112中記載的方法。

“序列同一性”是指2個氨基酸序列或核苷酸序列間的同一性。前述“序列同一性”是通過對比較對象的序列整個區(qū)域以最適狀態(tài)比對的2個序列進行比較來決定。本文中，比較對象的氨基酸序列或核苷酸序列的最適比對中，可以允許添加或缺失（例如空位等）。這樣的序列同一性可以使用，例如，UWGCG Package提供的BESTFIT程序（Devereux et al（1984）Nucleic Acids Research 12， p387-395）、PILEUP、BLAST算法（Altschul S.F.（1993）J Mol Evol 36：290-300； Altschul S.F.（1990）J Mol Biol 215：403-10）等序列分析用工具而算出。序列同一性也可以使用市售的序列解析軟件求出。

作為本發(fā)明多核苷酸(A)編碼的氨基酸序列的（A2）或本發(fā)明蛋白質(A)的氨基酸序列的（A2）中的“45%以上的序列同一性”，可舉出例如：45、50、55、60、65、70、75、80，85、90、95、98或99%以上的序列同一性。

本發(fā)明多核苷酸(A)編碼的氨基酸序列或本發(fā)明蛋白質(A)的氨基酸序列中，“與由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸在嚴格條件下雜交的多核苷酸”是指，例如，在“克隆與測序”（渡邊格監(jiān)修、杉浦昌弘編集、1989年、農村文化社發(fā)行）等中記載的DNA印跡雜交法中，在（1）高離子濃度下［可舉出例如：6XSSC（900mM的氯化鈉、90mM的檸檬酸鈉）］，在65℃雜交從而與由SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的互補序列組成的多核苷酸通過堿基配對形成雜交體，在（2）低離子濃度下［可舉出例如：0.1 X SSC（15mM的氯化鈉、1.5mM的檸檬酸鈉）］，在65℃保溫30分鐘后該雜交體也能夠維持的多核苷酸。

作為上述多核苷酸，具體可舉出：具有SEQ ID NO:2、4、6、15、16或17中的任一所示的核苷酸序列的多核苷酸，具有在SEQ ID NO:2、4、6、15、16或17中的任一所示的核苷酸序列中缺失、置換或添加了其一部分核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸；或具有與SEQ ID NO:2、4、6、15、16或17中的任一所示核苷酸序列有90%、95%、98%或99%以上的序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸。

本發(fā)明多核苷酸(A)可以是從自然界存在的DNA之中克隆得到的多核苷酸，也可以是該克隆得到的多核苷酸的核苷酸序列中人工導入其一部分核苷酸的缺失、置換或添加而成的多核苷酸，還可以是化學合成得到的多核苷酸。

本發(fā)明多核苷酸(A)可以由例如具有將α-羥基羧酸氧化為對應的α-氧代羧酸的能力的微生物，具體由反硝化無色桿菌（Achromobacter denitrificans）ATCC55564株等屬于無色桿菌屬的微生物得到。這些微生物可以從天然分離，也可以通過從菌株保藏機構購入獲得。

作為能夠獲得這類微生物的菌株保藏機構，可舉出例如：下述的菌株保藏機構。

1.IFO（Institute of Fermentation Osaka：財團法人發(fā)酵研究所）保藏中心

現(xiàn)在移管于獨立行政法人 制品評價技術基礎機構 生物遺傳資源部門（NBRC）。在獲得微生物之際，向NBRC申請購入即可，購入申請時例如可以訪問NBRC的主頁。

2.ATCC（美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection））

可以通過Summit Pharmaceuticals International ATCC 商業(yè)團體獲得，購入微生物之際，例如可以訪問該團體的主頁。也可以從ATCC直接購入微生物。

3.JCM（理化學研究所微生物系統(tǒng)保存設施 (Japan Collection of Microorganisms, JCM)

現(xiàn)在移管于獨立行政法人理化學研究所生物資源中心 (RIKEN BRC) 微生物材料開發(fā)室。獲得微生物之際，向該機構申請購入即可，例如可以訪問該機構的主頁的培養(yǎng)物保藏中心相關的網址。

4.IAM培養(yǎng)物保藏中心

現(xiàn)在，IAM培養(yǎng)物保藏中心保存菌株之中，細菌、酵母、絲狀真菌移管于獨立行政法人 理化學研究所生物資源中心微生物材料開發(fā)室（JCM），微藻類則移管于獨立行政法人 國立環(huán)境研究所微生物系統(tǒng)保存設施（NIES）。獲得微生物之際，向這些機構申請購入即可，例如可以訪問這些機構的主頁的培養(yǎng)物保藏中心相關的網址。

本發(fā)明多核苷酸(A)例如可以如下所述制備。

由反硝化無色桿菌（Achromobacter denitrificans）等屬于無色桿菌屬的微生物等，基于通常的基因工程手法（例如，“新 細胞工學實驗規(guī)程”（東京大學醫(yī)科學研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）中記載的方法），制備DNA文庫，將制備的DNA文庫作為模板，并且使用適合的引物進行PCR，由此可以擴增編碼SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列的多核苷酸、編碼SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列的多核苷酸、或具有SEQ ID NO:2、4或6中的任一所示的核苷酸序列的多核苷酸等，并制備本發(fā)明多核苷酸(A)。

在上述PCR中所用的引物的5’末端側或3’末端側或這兩者中，可以添加限制酶識別序列等。

例如，以上述DNA文庫為模板，并且將具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的寡核苷酸與具有SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進行PCR，由此可以擴增由SEQ ID NO:2所示核苷酸序列組成的多核苷酸，并制備本發(fā)明多核苷酸(A)。

以上述DNA文庫為模板，并且將具有SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的寡核苷酸與具有SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進行PCR，由此可以擴增由SEQ ID NO:4所示核苷酸序列組成的多核苷酸。

以上述DNA文庫為模板，并且將具有SEQ ID NO:13所示核苷酸序列的寡核苷酸與具有SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物進行PCR，由此可以擴增由SEQ ID NO:6所示核苷酸序列組成的多核苷酸。

作為上述PCR的條件，可舉出例如下述條件：將混合了4種dNTP各20μM、2種寡核苷酸引物各15pmol、Taq聚合酶1.3U以及作為模板的DNA文庫的反應液在94℃保溫2分鐘后，將94℃10秒、然后65℃30秒、然后72℃90秒的保溫循環(huán)進行10次，接著將94℃10秒、然后65℃30秒、然后72℃1分鐘和5秒的保溫循環(huán)進行20次，進而在72℃保持7分鐘。

以上述DNA文庫為模板，將具有選自編碼SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列的寡核苷酸（例如，由編碼SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示氨基酸序列的核苷酸序列的5’末端的約14個核苷酸以上的核苷酸序列組成的寡核苷酸）以及由DNA文庫構建中所用載體的DNA插入位點附近的核苷酸序列的互補核苷酸序列組成的約14個核苷酸以上的寡核苷酸用作引物，進行PCR，由此也可以擴增具有編碼SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸、具有編碼SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示氨基酸序列中缺失、置換或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸等，并制備本發(fā)明多核苷酸(A)。

本發(fā)明多核苷酸(A)也可如下獲得，例如，對于插入微生物或噬菌體來源的載體的DNA文庫，以由具有選自編碼SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示氨基酸序列的核苷酸序列的部分核苷酸序列的約15個核苷酸以上的核苷酸序列組成的DNA作為探針，使之在后述條件下進行雜交，通過檢測該探針特異性結合的DNA而獲得。

作為使探針與染色體DNA或DNA文庫雜交的方法，可舉出例如：菌落雜交、噬菌斑雜交，可以根據制備文庫所用的載體的種類選擇方法。

在使用的文庫是使用質粒載體制備的情形中，可以利用菌落雜交。具體地，通過將文庫DNA導入宿主微生物獲得轉化體，稀釋所得轉化體后，將該稀釋物接種于瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)直至菌落出現(xiàn)。

在使用的文庫是使用噬菌體載體制備的情形中，可以利用噬菌斑雜交。具體地，將宿主微生物和文庫噬菌體在能夠感染的條件下混合，進而混合軟瓊脂培養(yǎng)基后，將該混合物接種于瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)直至噬菌斑出現(xiàn)。

在上述任一雜交的情形中，均在進行了上述培養(yǎng)的瓊脂培養(yǎng)基上設置膜，使轉化體或噬菌體吸附/轉印于該膜。將該膜進行堿處理后，進行中和處理，接著進行將DNA固定于該膜的處理。更具體地，例如，在噬菌斑雜交的情形中，在前述瓊脂培養(yǎng)基上設置硝基纖維素膜或尼龍膜（例如，Hybond-N+（GE Healthcare 公司商標）），靜置約1分鐘使噬菌體粒子吸附/轉印于膜。接著，將該膜在堿溶液（例如1.5M氯化鈉、0.5M氫氧化鈉）中浸漬約3分鐘使噬菌體粒子溶解，由此使噬菌體DNA溶出至膜上，然后在中和溶液（例如，1.5M氯化鈉、0.5MTris-鹽酸緩沖溶液pH7.5）中浸漬約5分鐘。接著將該膜用清洗液（例如，0.3M氯化鈉、30mM檸檬酸、0.2MTris-鹽酸緩沖液pH7.5）清洗約5分鐘，然后在例如約80℃加熱約90分鐘，由此將噬菌體DNA固定于膜。

使用如此制備的膜，以上述DNA為探針進行雜交。雜交可以基于例如，J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著“Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）” Cold Spring Harbor Laboratory Press等的記載進行。

用于探針的DNA可以是利用放射性同位素標記的DNA，也可以是用熒光色素標記的DNA。

作為將用于探針的DNA通過放射性同位素標記的方法，可舉出例如：通過利用Random Primer DNA Labeling Kit（Takara Bio Inc.制）等，將PCR反應液中的dCTP替換為（α-³²P）dCTP，以用于探針的DNA為模板進行PCR的方法。

在將用于探針的DNA以熒光色素標記的情形中，可以使用例如，ECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System（GE Healthcare 公司制）等。

雜交例如可以如下所述進行。

按照每1cm²如上所述制備的膜為50至200μl的比例，準備含有450至900mM的氯化鈉和45至90mM的檸檬酸鈉、以0.1至1.0重量%的濃度含有十二烷基硫酸鈉（SDS）、以0至200μl/ml的濃度含有變性的非特異性DNA、視情況可以以各自0至0.2重量%的濃度含有白蛋白、聚蔗糖（Ficoll）、聚乙烯吡咯烷酮等的預雜交液（優(yōu)選為含有900mM的氯化鈉、90mM的檸檬酸鈉、1.0重量%的SDS和100μl/ml的變性Calf-thymusDNA的預雜交液），將前述膜浸漬于該預雜交液中，在42至65℃保溫1至4小時。

接著，按照每1cm²膜為50至200μl的比例準備下述溶液，該溶液混合了例如含有450至900mM的氯化鈉和45至90mM的檸檬酸鈉、以0.1至1.0重量%的濃度含有SDS、以0至200μg/ml的濃度含有變性的非特異性DNA、視情況可以以各自0至0.2重量%的濃度含有白蛋白、聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等的雜交溶液（優(yōu)選為含有900mM的氯化鈉、90mM的檸檬酸鈉、1.0重量%的SDS和100μg/ml的變性Calf-thymusDNA的雜交溶液）以及通過前述方法制得的探針（相當于每1cm²膜為1.0×10⁴至2.0×10⁶cpm的量），浸漬于該雜交溶液中，在42至65℃保溫12至20小時。

該雜交后將膜取出，使用含有15至300mM的氯化鈉、1.5至30mM的檸檬酸鈉和0.1至1.0重量%的SDS等的42至65℃的清洗液（優(yōu)選為含有15mM的氯化鈉、1.5mM的檸檬酸鈉和1.0重量%的SDS的65℃的清洗液）等進行清洗。將清洗后的膜用2×SSC（300mM氯化鈉、30mM檸檬酸鈉）輕輕漂洗后，進行干燥。將該膜供給例如放射自顯影等檢測膜上探針的位置，由此在原始瓊脂培養(yǎng)基上鑒定相當于與所用探針雜交的DNA的膜上位置的克隆，通過對其進行釣菌，分離具有該DNA的克隆。

培養(yǎng)如此得到的克隆，可以由所得培養(yǎng)菌體制備本發(fā)明多核苷酸(A)。

本發(fā)明多核苷酸(A)也可以基于其核苷酸序列，按照例如亞磷酸三酯法（Hunkapiller, M.et al., Nature, 310, 105, 1984）等通常的方法，進行具有目標核苷酸序列的核酸的化學合成來制備。

作為編碼上述（A1）至（A4）中的任一氨基酸序列的密碼子，以匹配大腸桿菌中的密碼子使用頻率的方式選擇密碼子，由此設計核苷酸序列，通過化學合成由所設計核苷酸序列組成的多核苷酸，也可以制備本發(fā)明多核苷酸(A)。

具體地，例如，以近似于進行表達的微生物細胞（例如，大腸桿菌）中的密碼子使用頻率的密碼子使用頻率的方式，選擇與SEQ ID NO:1、3或5中的任一所示氨基酸序列所含的各氨基酸對應的密碼子，設計編碼目標氨基酸序列的核苷酸序列。大腸桿菌等中的密碼子使用頻率的信息可以利用，例如，本領域技術人員公知的DNA數據庫（GenBank、EMBL、DDBJ等）得到。

以下，示出具體步驟。

求出目標氨基酸序列所含的各氨基酸的個數。以與表達多核苷酸的微生物細胞的密碼子的平均出現(xiàn)頻率最接近的方式，對上述求出的個數的氨基酸分配使用的密碼子。以同一密碼子盡量不連續(xù)的方式，編輯各密碼子的使用順序。從N末端側的氨基酸開始依次按照對各氨基酸所確定的順序選擇密碼子，預定為該氨基酸殘基的密碼子。重復這些步驟，預定直至C末端的全部氨基酸的密碼子，最后配置終止密碼子。對于由預定密碼子組成的核苷酸序列，確認不存在在微生物細胞中阻礙基因轉錄的核苷酸序列、后續(xù)操作中使用的限制酶識別的核苷酸序列。這類核苷酸序列存在時，將該核苷酸序列所涉及的密碼子與其它部分使用的密碼子進行交換。在設計這種核苷酸序列之際，為了后續(xù)操作，優(yōu)選預先將適當的限制酶識別的核苷酸序列添加于5’末端側和3’末端側。

具有如此設計的核苷酸序列的多核苷酸的合成可以使用利用PCR的長鏈DNA合成法進行（細胞工學別冊，植物細胞工學系列7“植物的PCR實驗規(guī)程”，95-100頁、島本巧?佐佐木卓治編輯秀潤社、1997年7月1日刊行）（以下，有時將本法記為Assembly PCR法）。該方法中，僅使用長的合成寡核苷酸引物合成DNA。引物對以引物在各自3’末端具有約10bp至約12bp的互補鏈或重疊的方式而合成，以彼此的引物作為模板進行DNA合成。作為引物的全長，可舉出例如：約60mer至約100mer等。優(yōu)選可舉出例如：約80mer至約100mer等。

將這些寡核苷酸引物依次通過PCR反應結合，由此得到具有目標核苷酸序列的DNA。所得DNA按照常規(guī)方法導入克隆載體，進行克隆。所得克隆的核苷酸序列通過DNA測序儀來確認，確認得到了具有目標核苷酸序列的多核苷酸。如此可以人工合成例如具有SEQ ID NO:15、16或17中的任一所示核苷酸序列的本發(fā)明的多核苷酸，得到本發(fā)明多核苷酸(A)。

如上所述制備的多核苷酸可以基于“Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition”（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、“Current Protocols in Molecular Biology”(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等中記載的方法克隆到載體。

如上所述制備的多核苷酸的核苷酸序列可以通過F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著、Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁等中記載的雙脫氧鏈終止方法等進行解析。在用于核苷酸序列分析的試樣制備中，可以使用例如，Perkin Elmer公司的ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等市售的試劑。

如上所述制備的多核苷酸編碼具有將α-羥基羧酸（例如，2-羥基-4-（甲硫基）丁酸）氧化轉換成對應的α-氧代羧酸（例如，2-氧代-4-（甲硫基）丁酸）的能力的蛋白質的氨基酸序列的確認可以例如如下進行。

將如上所述得到的多核苷酸以連接于在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子的下游的方式插入載體，將所得重組載體導入宿主細胞獲得轉化體。將所得轉化體的培養(yǎng)物與α-羥基羧酸（例如，含硫α-羥基羧酸，更具體地2-羥基-4-（甲硫基）丁酸）作用。分析反應產物中的對應α-氧代羧酸（例如，含硫α-氧代羧酸，更具體地2-氧代-4-（甲硫基）丁酸）的量，由此可以確認所得多核苷酸編碼具有目標能力的蛋白質的氨基酸序列。

為了使本發(fā)明多核苷酸(A)在宿主細胞中表達，例如，制備將在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子與本發(fā)明多核苷酸(A)以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸，將其導入宿主細胞。

作為在微生物中可發(fā)揮功能的啟動子，可舉出如上所述的在大腸桿菌內可發(fā)揮功能的合成啟動子等。也可以利用在反硝化無色桿菌中控制本發(fā)明多核苷酸(A)的表達的啟動子。

將本發(fā)明多核苷酸(A)、或在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子和本發(fā)明多核苷酸(A)以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸整合至載體中，由此可以制備本發(fā)明重組載體。

除了本發(fā)明多核苷酸(A)、或在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子和本發(fā)明多核苷酸(A)以可發(fā)揮功能的形式連接而成多核苷酸之外，本發(fā)明重組載體還可以含有編碼具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉換成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質（以下，有時記作本蛋白質(B)）的氨基酸序列的多核苷酸、或該多核苷酸與在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸。

作為具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉換成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質，可舉出氨基酸脫氫酶、轉氨酶。作為氨基酸脫氫酶，具體可舉出：丙氨酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、亮氨酸脫氫酶、苯丙氨酸脫氫酶，優(yōu)選可舉出：亮氨酸脫氫酶。

作為具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉換成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的上述蛋白質，更具體地，可舉出：Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 23 (2003) 239-247中記載的來自球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus） IFO3525株的亮氨酸脫氫酶、和具有前述亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列中第113位的丙氨酸被改變?yōu)楦拾彼岬陌被嵝蛄械牡鞍踪|。

SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列是Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 23 (2003) 239-247中記載的來自球形芽孢桿菌 IFO3525株的亮氨酸脫氫酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列是SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列中第113位的丙氨酸被改變?yōu)楦拾彼岬陌被嵝蛄小?/p>

作為具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉換成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列，具體還可舉出下述（B1）至（B3）中任一氨基酸序列：

（B1）SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列、

（B2）i）與SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90%以上的序列同一性的氨基酸序列、并且ii）具有將2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化轉換成對應的L-甲硫氨酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列、或

（B3）i）SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列、并且ii）具有將2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化轉換成對應的L-甲硫氨酸衍生物的能力的蛋白質的氨基酸序列。

本蛋白質(B)的上述氨基酸序列中，在與SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列之間可觀察到的區(qū)別是一部分氨基酸的缺失、置換或添加等。前述“添加”不僅包括氨基酸在序列端部的添加，也包括氨基酸在序列中的插入。作為該氨基酸的改變，可舉出例如：(a)具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的蛋白質在細胞內受到的加工所致的缺失，(b)由于前述蛋白質的來源生物的種類差異、個體差異等而天然產生的基因突變導致的氨基酸的缺失、置換或添加，或(c)由于人工導入的基因突變等而產生的氨基酸的缺失、置換或添加。

對于改變氨基酸的數目，只要是具有產生了改變的上述氨基酸序列的蛋白質可以發(fā)揮將2-氧代-4-（甲硫基）丁酸衍生物氨基化轉換成對應的L-甲硫氨酸衍生物的能力的范圍內的數目即可。作為本蛋白質(B)的上述氨基酸序列的（B3）中的“多個氨基酸”，可舉出例如：2、3、4、5、6、7、10、15、18、20、25、30、35、36或40個氨基酸。

作為氨基酸的置換，可舉出例如：保守性置換為疏水性、電荷、pK、立體結構上的特征等類似的氨基酸。作為這樣的置換，具體可舉出例如：(1)甘氨酸、丙氨酸；(2)纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；(3)天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；(4)絲氨酸、蘇氨酸；(5)賴氨酸、精氨酸；(6)苯丙氨酸、酪氨酸等組內的置換。

作為氨基酸的添加，可舉出例如：在氨基酸序列的氨基末端或羧基末端的、包含連續(xù)6個殘基左右的組氨酸的約20個殘基的氨基酸的添加。

作為人工進行氨基酸的改變的手法，可舉出例如：對編碼SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的多核苷酸實施位點特異性突變導入，然后通過常規(guī)方法使該多核苷酸表達的手法。

作為人工進行氨基酸的改變的手法，可舉出例如：對編碼SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的多核苷酸實施隨機突變導入，然后通過常規(guī)方法使該多核苷酸表達的手法。

作為本蛋白質(B)的上述氨基酸序列的（B2）中的“90%以上的序列同一性”，可舉出例如90、95、98或99%以上的序列同一性。

編碼具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉換成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質的氨基酸序列的多核苷酸（以下，有時也記為本多核苷酸(B)）可以從例如具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉換成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的微生物、例如球形芽孢桿菌 IFO3525株等屬于芽孢桿菌屬的微生物得到。

基于通常的基因工程手法由球形芽孢桿菌 IFO3525株等屬于芽孢桿菌屬的微生物等制備DNA文庫，以制備的DNA文庫為模板，并且使用適合的引物進行PCR，由此可以擴增編碼SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的多核苷酸、或編碼SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列中缺失、置換或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列的多核苷酸等而制備本多核苷酸(B)。

例如，作為具有編碼SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的SEQ ID NO:40所示核苷酸序列的多核苷酸的擴增用引物，合成具有SEQ ID NO:18所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的寡核苷酸。作為用于將SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的第113位的丙氨酸改變?yōu)楦拾彼岬耐蛔儗胗靡?，合成具有SEQ ID NO:20所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的寡核苷酸。

以上述DNA文庫為模板，使用具有SEQ ID NO:18所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進行PCR，由此擴增具有SEQ ID NO:40所示核苷酸序列的多核苷酸。將擴增得到的多核苷酸整合至載體，得到含有具有SEQ ID NO:40所示核苷酸序列的多核苷酸的重組載體。以所得重組載體為模板，使用具有SEQ ID NO:20所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進行PCR，將所得PCR產物用Dpn I處理，然后導入大腸桿菌。分析所得轉化體擁有的重組載體的核苷酸序列，得到編碼導入了目標氨基酸突變的氨基酸序列、即SEQ ID NO:39所示氨基酸序列中第113位的丙氨酸被置換為甘氨酸的氨基酸序列（SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列）的多核苷酸。作為編碼SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的核苷酸序列，可舉出SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

本多核苷酸(B)可以基于其核苷酸序列，按照例如亞磷酸三酯法（Hunkapiller, M.et al., Nature, 310, 105, 1984）等通常的方法，進行具有目標核苷酸序列的核酸的化學合成來制備。

作為編碼上述（B1）至（B3）中任一氨基酸序列的密碼子，以匹配大腸桿菌中的密碼子使用頻率的方式選擇密碼子，由此設計核苷酸序列，通過化學合成由所設計核苷酸序列組成的多核苷酸，也可以制備本多核苷酸(B)。

為了使本多核苷酸(B)在宿主細胞中表達，例如，制備在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子和本多核苷酸(B)以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸，將其導入宿主細胞。

作為在微生物中可發(fā)揮功能的啟動子，可舉出如上所述的在大腸桿菌內可發(fā)揮功能的合成啟動子等。也可以利用在球形芽孢桿菌等屬于芽孢桿菌屬的微生物中控制本多核苷酸(B)的表達的啟動子。

如上所述制備的多核苷酸編碼具有將α-氧代羧酸化合物（例如，2-氧代-4-（甲硫基）丁酸）氨基化轉換成對應的L-α-氨基酸化合物（例如，L-甲硫氨酸）的能力的蛋白質的氨基酸序列的確認可以例如如下進行。

將如上所述得到的多核苷酸以連接于在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子的下游的方式插入載體，將所得重組載體導入宿主細胞獲得轉化體。將所得轉化體的培養(yǎng)物與α-氧代羧酸（例如，含硫α-氧代羧酸，更具體地2-氧代-4-（甲硫基）丁酸）作用。分析反應產物中的對應L-α-氨基酸（例如，含硫L-α-氨基酸，更具體地L-甲硫氨酸）的量，由此可以確認所得多核苷酸編碼具有目標能力的蛋白質的氨基酸序列。

通過將本發(fā)明多核苷酸(A)、本多核苷酸(B)、或含有這些多核苷酸中的任一或兩者的重組載體導入宿主細胞，可以制備轉化體。

作為宿主細胞，可舉出例如，屬于埃希氏菌（Escherichia）屬、芽孢桿菌（Bacillus）屬、棒狀桿菌（Corynebacterium）屬、葡萄球菌（Staphylococcus）屬、鏈霉菌（Streptomyces）屬、酵母菌（Saccharomyces）屬、克魯維酵母菌（Kluyveromyces）屬、畢赤酵母菌（Pichia）屬、紅球菌（Rhodococcus）屬和曲霉菌（Aspergillus）屬的微生物等。

如上所述操作，通過將本發(fā)明多核苷酸(A)、或在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子和本發(fā)明多核苷酸(A)以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸導入宿主細胞，可以得到擁有本發(fā)明多核苷酸(A)、或在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子和本發(fā)明多核苷酸(A)以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸的轉化體。作為該轉化體，可舉出：將外源的上述多核苷酸導入宿主細胞的染色體而成的轉化體，即，染色體上擁有外源的上述多核苷酸的轉化體。

擁有本發(fā)明多核苷酸(A)、或在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子與本發(fā)明多核苷酸(A)以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸的轉化體進而還可以擁有本多核苷酸(B)、或在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子和本多核苷酸(B)以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸。

如上所述操作，通過將：

i）本多核苷酸(B)、或在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子和本多核苷酸(B)以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸；和

ii）本發(fā)明多核苷酸(A)、或在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子和本發(fā)明多核苷酸(A)以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸

導入宿主細胞，可以獲得擁有下述多核苷酸的轉化體：

i）本多核苷酸(B)、或在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子和本多核苷酸(B)以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸；和

ii）本發(fā)明多核苷酸(A)、或在宿主細胞內可發(fā)揮功能的啟動子和本發(fā)明多核苷酸(A)以可發(fā)揮功能的形式連接而成的多核苷酸。

上述i）的多核苷酸和ii）的多核苷酸可以分別整合至不同的載體導入宿主細胞，也可以整合至相同的載體上導入宿主細胞。在兩個多核苷酸整合至單一載體的情形中，例如，可以將啟動子、終止子等的參與表達控制的區(qū)域與兩個多核苷酸各自連接整合至載體，也可以作為乳糖操縱子之類的含有多個順反子的操縱子，以使兩個多核苷酸表達的方式整合至載體?？梢栽谒拗骷毎娜旧w上擁有上述i）的多核苷酸和ii）的多核苷酸中的任一或兩者。

本發(fā)明蛋白質(A)可以通過例如培養(yǎng)擁有本發(fā)明多核苷酸(A)的轉化體而表達本發(fā)明蛋白質(A)來制備。

本蛋白質(B)可以通過例如培養(yǎng)擁有本多核苷酸(B)的轉化體而表達本蛋白質(B)來制備。

作為從擁有本發(fā)明多核苷酸(A)或本多核苷酸(B)的轉化體的培養(yǎng)物純化本發(fā)明蛋白質(A)或本蛋白質(B)的方法，可以適用蛋白質純化中所使用的通常的方法。

含有本發(fā)明蛋白質(A)的級分可以以例如將2-羥基-4-（甲硫基）丁酸氧化優(yōu)先地生產2-氧代-4-（甲硫基）丁酸的能力為指標進行挑選。

含有本蛋白質(B)的級分可以以例如將2-氧代-4-（甲硫基）丁酸氨基化優(yōu)先地生產L-甲硫氨酸的能力為指標進行挑選。

本發(fā)明制備方法1是包含使本發(fā)明蛋白質(A)與α-羥基羧酸化合物作用的步驟的α-氧代羧酸化合物的制備方法。

作為上述α-羥基羧酸化合物，可舉出含硫α-羥基羧酸化合物，作為對應α-氧代羧酸化合物，可舉出含硫α-氧代羧酸化合物。

作為上述含硫α-羥基羧酸化合物，例示式（1）所示的含硫α-羥基羧酸：

式中，R¹表示氫或任選取代的碳原子數為1-8的烷基。

作為使本發(fā)明蛋白質(A)與上述式（1）所示的含硫α-羥基羧酸作用而得的含硫α-氧代羧酸化合物，例示式（2）所示的含硫α-氧代羧酸：

式中，R¹表示與前述相同的含義。

式（1）的含硫α-羥基羧酸、和式（2）的含硫α-氧代羧酸中，作為R¹所表示的任選取代的C1-8的烷基中的C1-8的烷基，例示例如：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基。

作為式（1）所示的含硫α-羥基羧酸，具體可舉出例如：2-羥基-4-（甲硫基）丁酸、2-羥基-4-（乙硫基）丁酸、2-羥基-4-（丙硫基）丁酸、2-羥基-4-（丁硫基）丁酸、2-羥基-4-（戊硫基）丁酸、2-羥基-4-（己硫基）丁酸、2-羥基-4-（庚硫基）丁酸、2-羥基-4-（辛硫基）丁酸。

作為式（2）所示的含硫α-氧代羧酸，具體可舉出例如：2-氧代-4-（甲硫基）丁酸、2-氧代-4-（乙硫基）丁酸、2-氧代-4-（丙硫基）丁酸、2-氧代-4-（丁硫基）丁酸、2-氧代-4-（戊硫基）丁酸、2-氧代-4-（己硫基）丁酸、2-氧代-4-（庚硫基）丁酸、2-氧代-4-（辛硫基）丁酸等。

作為R¹所表示的任選取代的C1-8的烷基，優(yōu)選為甲基，作為式（1）所示的含硫α-羥基羧酸，優(yōu)選例示2-羥基-4-（甲硫基）丁酸。

本發(fā)明制備方法1中，以2-羥基-4-（甲硫基）丁酸為底物時，得到2-氧代-4-（甲硫基）丁酸。

本發(fā)明制備方法1中，本發(fā)明蛋白質(A)可以以各種形態(tài)供給用于與α-羥基羧酸化合物作用的反應體系。本發(fā)明蛋白質(A)可以以經純化的蛋白質的形態(tài)提供給本發(fā)明制備方法1的反應體系，也可以以包含于產生該蛋白質的微生物或該微生物的處理物中的形態(tài)提供給前述反應體系?！拔⑸锏奶幚砦铩币庵概c上述“轉化體的處理物”相同地制備的處理物。本發(fā)明蛋白質(A)還可以以包含于將編碼該蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中的形態(tài)提供給上述反應體系。

為了使本發(fā)明蛋白質(A)與α-羥基羧酸化合物作用，具體地，例如，可將本發(fā)明蛋白質(A)、本發(fā)明蛋白質(A)的固定化物、將編碼本發(fā)明蛋白質(A)的多核苷酸導入宿主細胞而成且產生本發(fā)明蛋白質(A)的轉化體的培養(yǎng)物、或前述轉化體的處理物提供給本發(fā)明制備方法1的反應體系。

本發(fā)明制備方法1通常在水的存在下進行。此時所用的水可以是緩沖水溶液。作為該緩沖水溶液中所用的緩沖劑，可舉出例如：三羥基甲基氨基甲烷、磷酸鈉或磷酸鉀等磷酸堿金屬鹽、乙酸鈉或乙酸鉀等乙酸堿金屬鹽、或它們的混合物。

本發(fā)明制備方法1中，除了水之外還可以使有機溶劑共存于反應體系中。作為所用的有機溶劑，可舉出例如：叔丁基甲醚、二異丙醚、四氫呋喃等醚類；甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯等酯類；甲苯、己烷、環(huán)己烷、庚烷、異辛烷等烴類；甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇、叔丁醇等醇類；二甲基亞砜等有機硫化合物、丙酮等酮類、乙腈等腈類、以及它們的混合物。

本發(fā)明制備方法1中，伴隨α-羥基羧酸化合物（例如，2-羥基-4-（甲硫基）丁酸等含硫α-羥基羧酸）的氧化反應的進行，反應液中的氧被消耗，轉換成過氧化氫。轉換產生的過氧化氫可通過與具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質作用而恢復至原始的分子氧，因此，在上述方法的反應體系內，可以進一步存在具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質。

作為具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質，可舉出例如過氧化氫酶。作為過氧化氫酶，可舉出大腸桿菌的過氧化氫酶，更具體地，可舉出：具有SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的過氧化氫酶。

具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質可以以經純化的蛋白質或其固定化物的形態(tài)提供給本發(fā)明制備方法1的反應體系，也可以以包含于產生該蛋白質的微生物或該微生物的處理物中的形態(tài)提供給前述反應體系。“微生物的處理物”意指與上述“轉化體的處理物”相同地制備的處理物?？梢詫⒕幋a具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物提供給上述反應體系。作為編碼具有SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的過氧化氫酶的核苷酸序列，可舉出SEQ ID NO:42所示的核苷酸序列。

本發(fā)明制備方法1中，可以將將編碼本發(fā)明蛋白質(A)的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物、以及將編碼具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物提供給用于與α-羥基羧酸化合物作用的反應體系。

本發(fā)明制備方法1中，可以將將編碼本發(fā)明蛋白質(A)的多核苷酸與編碼具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質的多核苷酸兩者導入同一宿主細胞而成的轉化體或其處理物提供給前述反應體系?？梢詫⒕幋a本發(fā)明蛋白質(A)的多核苷酸與編碼具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質的多核苷酸分別整合至不同的載體導入宿主細胞，也可以整合至相同載體上導入宿主細胞。將兩個多核苷酸整合至單一的載體時，例如，可以將啟動子、終止子等參與表達控制的區(qū)域與兩個多核苷酸各自連接整合至載體，也可以作為乳糖操縱子之類的含有多個順反子的操縱子，以使兩個多核苷酸表達的方式整合至載體。可以在宿主細胞的染色體上擁有編碼本發(fā)明蛋白質(A)的多核苷酸與編碼具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質的多核苷酸中的任一或兩者。

本發(fā)明制備方法1中的反應例如通過將含有水、α-羥基羧酸化合物(例如2-羥基-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-羥基羧酸化合物)、以及本發(fā)明蛋白質(A)或者產生該蛋白質的轉化體或其處理物、根據需要還含有有機溶劑、過氧化氫酶等的反應液通過攪拌、振蕩等進行混合來進行。

上述方法中的反應時的pH值可以適當選擇，但通常pH值在約3～約10的范圍。反應溫度可以適當選擇，但從原料和產物的穩(wěn)定性、反應速度的角度考慮，通常在約0℃～約60℃的范圍。

反應終點例如可以通過利用液相色譜等分析反應液中的α-羥基羧酸化合物(例如2-羥基-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-羥基羧酸化合物)的量來確定。

反應時間可以適當選擇，但通常是約0.5小時～約10天的范圍。

從反應液中回收α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸化合物)可以按照通常已知的任意方法來進行。

例如可以列舉下述方法：通過將反應液的有機溶劑提取操作、濃縮操作等后處理根據需要與柱色譜、蒸餾等組合進行來純化目標化合物。

本發(fā)明制備方法2是L-氨基酸化合物的制備方法，包括如下步驟：

(1). 使本發(fā)明蛋白質(A)與α-羥基羧酸化合物反應，得到對應的α-氧代羧酸化合物；以及

(2). 使具有將α-氧代羧酸化合物氨基化轉換成對應的L-α-氨基酸化合物的能力的蛋白質(本蛋白質(B))與步驟(1)中得到的α-氧代羧酸化合物反應，得到對應的L-α-氨基酸化合物。

作為上述α-羥基羧酸，例示式(1)所示的含硫α-羥基羧酸：

式中，R¹表示氫或任選取代的碳原子數為1-8的烷基。

作為使本發(fā)明蛋白質(A)與上述式(1)所示的含硫α-羥基羧酸作用而得到的含硫α-氧代羧酸化合物，例示式(2)所示的含硫α-氧代羧酸：

式中，R¹表示與前述相同的含義。

作為使本蛋白質(B)與上述式(2)所示的含硫α-氧代羧酸作用而得到的含硫L-氨基酸化合物，例示式(3)所示的含硫L-氨基酸。

在式(1)的含硫α-羥基羧酸、式(2)的含硫α-氧代羧酸和式(3)的含硫L-α-氨基酸中，作為R¹所表示的任選取代的C1-8烷基中的C1-8烷基，例如例示：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基。

作為式(1)所示的含硫α-羥基羧酸，具體而言，例如可以列舉：2-羥基-4-(甲硫基)丁酸、2-羥基-4-(乙硫基)丁酸、2-羥基-4-(丙硫基)丁酸、2-羥基-4-(丁硫基)丁酸、2-羥基-4-(戊硫基)丁酸、2-羥基-4-(己硫基)丁酸、2-羥基-4-(庚硫基)丁酸、2-羥基-4-(辛硫基)丁酸。

作為式(2)所示的含硫α-氧代羧酸，具體而言，例如可以列舉：2-氧代-4-(甲硫基)丁酸、2-氧代-4-(乙硫基)丁酸、2-氧代-4-(丙硫基)丁酸、2-氧代-4-(丁硫基)丁酸、2-氧代-4-(戊硫基)丁酸、2-氧代-4-(己硫基)丁酸、2-氧代-4-(庚硫基)丁酸、2-氧代-4-(辛硫基)丁酸。

作為式(3)所示的含硫L-α-氨基酸，具體而言，例如可以列舉：2-氨基-4-(甲硫基)丁酸、2-氨基-4-(乙硫基)丁酸、2-氨基-4-(丙硫基)丁酸、2-氨基-4-(丁硫基)丁酸、2-氨基-4-(戊硫基)丁酸、2-氨基-4-(己硫基)丁酸、2-氨基-4-(庚硫基)丁酸、2-氨基-4-(辛硫基)丁酸。

作為R¹所表示的任選取代的C1-8烷基，優(yōu)選甲基，作為式(1)所示的含硫α-羥基羧酸，優(yōu)選例示2-羥基-4-(甲硫基)丁酸。

在本發(fā)明制備方法2的步驟(1)中，當以2-羥基-4-(甲硫基)丁酸作為底物時，在步驟(1)中得到2-氧代-4-(甲硫基)丁酸，在步驟(2)中得到L-甲硫氨酸。

本發(fā)明制備方法2的步驟(1)可以和本發(fā)明制備方法1同樣地實施。

將步驟(1)中得到的α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸化合物)從反應液中純化或者部分純化后，可以供給步驟(2)。通過在步驟(2)中添加步驟(1)的反應液，還可以將步驟(1)中得到的α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸化合物)供給步驟(2)。

在本發(fā)明制備方法2的步驟(2)中，本蛋白質(B)能夠以各種形態(tài)提供給用于與α-氧代羧酸化合物作用的反應體系。本蛋白質(B)可以以純化蛋白質的形態(tài)提供給上述步驟(2)的反應體系，也可以以包含在產生該蛋白質的微生物或者該微生物的處理物中的形態(tài)提供給上述反應體系。“微生物的處理物”是指與上述的“轉化體的處理物”同樣制備的物質。本蛋白質(B)可以以包含在將編碼該蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中的形態(tài)提供給上述反應體系。

為了使本蛋白質(B)與α-氧代羧酸化合物作用，具體而言，例如可以將本蛋白質(B)、本蛋白質(B)的固定化物、將編碼本蛋白質(B)的多核苷酸導入宿主細胞而成的產生本蛋白質(B)的轉化體的培養(yǎng)物、或者上述轉化體的處理物提供給上述步驟(2)的反應體系。

本發(fā)明制備方法2的步驟(2)通常在水、銨離子和輔酶的存在下進行。

此時使用的水可以是緩沖水溶液。作為該緩沖水溶液中使用的緩沖劑，例如可以列舉：三羥甲基氨基甲烷、磷酸鈉或磷酸鉀等磷酸堿金屬鹽、乙酸鈉或乙酸鉀等乙酸堿金屬鹽、或者它們的混合物。

在本發(fā)明制備方法2的步驟(2)中，除了水以外，還可以使有機溶劑共存于反應體系中。作為使用的有機溶劑，例如可以列舉：叔丁基甲醚、二異丙醚、四氫呋喃等醚類；甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯、丙酸丁酯等酯類；甲苯、己烷、環(huán)己烷、庚烷、異辛烷等烴類；甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇、叔丁醇等醇類；二甲基亞砜等有機硫化合物、丙酮等酮類、乙腈等腈類、以及它們的混合物。

在本發(fā)明制備方法2的步驟(2)中，為了利用銨離子作為氨基供體，通常在反應體系中添加銨鹽化合物。作為所添加的銨鹽化合物，例如可以列舉硫酸銨、甲酸銨、氯化銨、硝酸銨、磷酸銨、氫氧化銨、酒石酸銨、乙酸銨等。反應體系內的銨離子的量通常是與作為底物的α-氧代羧酸化合物的量等摩爾或其以上，并優(yōu)選在反應開始時預先添加。

在本發(fā)明制備方法2的步驟(2)中，為了利用輔因子(cofactor)作為共軛系統(tǒng)，通?？梢栽诜磻w系中添加輔酶(coenzyme)。作為所添加的輔酶，例如可以列舉還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下有時還記作NADH。)、還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下有時還記作NADPH。)。反應體系內的輔因子的量通常是與作為底物的α-氧代羧酸化合物的量等摩爾或其以上，并優(yōu)選在反應開始時預先添加。

在本發(fā)明制備方法2的步驟(2)中，隨著α-氧代羧酸(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸)的還原性氨基化反應的進行，反應液中的NADH轉換成氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下有時還記作NAD+。)。經轉換而產生的NAD+通過與具有將NAD+轉換成還原型(NADH)的能力的蛋白質作用可以恢復成原始的NADH，因此在上述步驟(2)的反應體系內，還可以存在具有將NAD+轉換成NADH的能力的蛋白質。當上述步驟(2)的反應體系內還存在具有將NAD+轉換成NADH的能力的蛋白質時，反應體系內的輔因子的量通常可以是催化劑量，與作為底物的α-氧代羧酸化合物的量等摩爾或其以下。

作為具有將NAD+轉換成NADH的能力的蛋白質，例如可以列舉：甲酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等有機酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、或氨基酸脫氫酶。作為甲酸脫氫酶，可以列舉屬于芽孢桿菌(Bacillus)屬的微生物的甲酸脫氫酶，更具體而言，可以列舉具有SEQ ID NO: 43所示氨基酸序列的甲酸脫氫酶。

具有將NAD+轉換成NADH的能力的蛋白質可以以純化蛋白質或其固定化物的形態(tài)提供給本發(fā)明制備方法2的步驟(2)的反應體系，還可以以包含在產生該蛋白質的微生物或者該微生物的處理物中的形態(tài)提供給上述反應體系。“微生物的處理物”是指與上述的“轉化體的處理物”同樣制備的物質?？梢詫⒕幋a具有將NAD+轉換成NADH的能力的蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物提供給上述反應體系。

在本發(fā)明制備方法2的步驟(2)中，可以將將編碼本蛋白質(B)的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物、和將編碼具有將NAD+轉換成NADH的能力的蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物提供給用于與α-氧代羧酸化合物作用的反應體系。

在本發(fā)明制備方法2的步驟(2)中，可以將將編碼本蛋白質(B)的多核苷酸和編碼具有將NAD+轉換成NADH的能力的蛋白質的多核苷酸兩者導入同一宿主細胞而成的轉化體或其處理物提供給上述反應體系。編碼本蛋白質(B)的多核苷酸和編碼具有將NAD+轉換成NADH的能力的蛋白質的多核苷酸可以分別整合到不同的載體中導入宿主細胞，也可以整合到相同的載體上導入宿主細胞。將兩個多核苷酸整合到單一的載體中時，例如可以將啟動子、終止子等的參與表達控制的區(qū)域與兩個多核苷酸各自連接整合至載體，也可以作為乳糖操縱子之類的含有多個順反子的操縱子，以使兩個多核苷酸表達的方式整合至載體。可以在宿主細胞的染色體上擁有編碼本蛋白質(B)的多核苷酸和編碼具有將NAD+轉換成NADH的能力的蛋白質的多核苷酸中的任一或者兩者。

本發(fā)明制備方法2的步驟(2)中的反應例如通過將含有水、銨鹽化合物、NADH、α-氧代羧酸化合物(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸化合物)、以及本蛋白質(B)或者產生該蛋白質的轉化體或其處理物、根據需要還含有有機溶劑、具有將NAD+轉換成NADH的能力的蛋白質等的反應液通過攪拌、振蕩等混合來進行。

當具有將NAD+轉換成NADH的能力的蛋白質為葡萄糖脫氫酶時，通過使葡萄糖等共存于反應體系內，有時也增強該蛋白質的活性，例如可以在反應液中加入葡萄糖等。當具有將NAD+轉換成NADH的能力的蛋白質為甲酸脫氫酶時，通過使甲酸銨作為氨基供體共存于反應體系內，有時也增強該蛋白質的活性，例如可以在反應液中加入甲酸銨。

上述方法中的反應時的pH值可以適當選擇，但通常pH值在約3～約10的范圍。反應溫度可以適當選擇，但從原料和產物的穩(wěn)定性、反應速度的角度考慮，通常在約0℃～約60℃的范圍。

反應終點例如可以通過利用液相色譜等分析反應液中的α-氧代羧酸化合物(例如2-氧代-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-氧代羧酸化合物)的量來確定。

反應時間可以適當選擇，但通常是約0.5小時～約10天的范圍。

從反應液中回收L-α-氨基酸(例如L-甲硫氨酸等含硫L-α-氨基酸)可以按照通常已知的任意方法來進行。

例如，可以列舉下述方法：通過將反應液的晶析、有機溶劑提取操作、濃縮操作等后處理按照需要與柱色譜、蒸餾等組合進行來純化目標化合物。

還可以在一個反應體系內進行本發(fā)明制備方法2的步驟(1)和步驟(2)。

這種情況下，本發(fā)明蛋白質(A)和本蛋白質(B)各自可以以各種形態(tài)提供給上述反應體系。

本發(fā)明蛋白質(A)和本蛋白質(B)可以以純化蛋白質的形態(tài)提供給上述反應體系，也可以以包含在產生這些蛋白質的微生物或者該微生物的處理物中的形態(tài)提供給上述反應體系。

本發(fā)明蛋白質(A)和本蛋白質(B)可以以包含在將編碼這些蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物中的形態(tài)提供給上述反應體系。

例如，可以將將編碼本發(fā)明蛋白質(A)的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物和將編碼本蛋白質(B)的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物提供給上述反應體系。可以將將編碼本發(fā)明蛋白質(A)的多核苷酸和編碼本蛋白質(B)的多核苷酸兩者導入同一宿主細胞而成的轉化體或其處理物提供給上述反應體系。可以將編碼本發(fā)明蛋白質(A)的多核苷酸和編碼本蛋白質(B)的多核苷酸分別整合到不同的載體中導入宿主細胞，也可以整合到相同的載體上導入宿主細胞。將兩個多核苷酸整合到單一的載體中時，例如可以將啟動子、終止子等的參與表達控制的區(qū)域與兩個多核苷酸各自連接整合至載體，也可以作為乳糖操縱子之類的含有多個順反子的操縱子，以使兩個多核苷酸表達的方式整合至載體。可以在宿主細胞的染色體上擁有編碼本發(fā)明蛋白質(A)的多核苷酸和編碼本蛋白質(B)的多核苷酸中的任一或兩者。

還可以使具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質或者具有將NAD+轉換成NADH的能力的蛋白質、或者這兩種蛋白質存在于上述反應體系內。具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質和具有將NAD+轉換成NADH的能力的蛋白質可以以純化蛋白質或其固定化物的形態(tài)提供給上述反應體系，也可以以包含在產生這些蛋白質的微生物或者該微生物的處理物中的形態(tài)提供給上述反應體系?？梢詫⒕幋a具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質的多核苷酸或者編碼具有將NAD+轉換成NADH的能力的蛋白質的多核苷酸導入宿主細胞而成的轉化體或其處理物提供給上述反應體系。

可以將選自下述多核苷酸的兩種以上的多核苷酸導入同一宿主細胞而成的轉化體或其處理物提供給上述反應體系：編碼本發(fā)明蛋白質(A)的多核苷酸、編碼本蛋白質(B)的多核苷酸、編碼具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質的多核苷酸、以及編碼具有將NAD+轉換成NADH的能力的蛋白質的多核苷酸。

在一個反應體系中進行本發(fā)明制備方法2的步驟(1)和步驟(2)時的反應可以利用依據上述本發(fā)明制備方法2的步驟(2)的反應的反應液和反應條件來進行。

反應終點例如可以通過利用液相色譜等分析反應液中的α-羥基羧酸化合物(例如2-羥基-4-(甲硫基)丁酸等含硫α-羥基羧酸化合物)的量來確定。

反應時間可以適當選擇，但通常是約0.5小時～約10天的范圍。

從反應液中回收L-α-氨基酸(例如L-甲硫氨酸等含硫L-α-氨基酸)可以與上述本發(fā)明制備方法2的步驟(2)的情形同樣地進行。

實施例

以下，通過實施例等來更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實施例的限定。

參考例1 (染色體DNA的制備)

在兩只500ml容量的燒瓶中分別裝入各100ml的培養(yǎng)基(將2g葡萄糖、0.5g聚蛋白胨、0.3g酵母提取物、0.3g肉提取物、0.2g硫酸銨、0.1g磷酸二氫鉀、0.05g硫酸鎂七水合物溶解于100ml水中，用2N的HCl將pH值調節(jié)至6而得到的培養(yǎng)基)，在121℃滅菌15分鐘。向其中分別加入各0.3ml在相同組成的培養(yǎng)基中、在30℃振蕩培養(yǎng)了48小時的反硝化無色桿菌(Achromobacter denitrificans)ATCC55564株的培養(yǎng)液，在30℃振蕩培養(yǎng)24小時。將所得培養(yǎng)液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，收集所產生的沉淀。將所得沉淀用50ml的0.85%的食鹽水清洗，得到了3.5g的濕菌體。

使用QIAprep Genomic-tip System(Qiagen公司制)，由所得菌體得到了染色體DNA(以下記作染色體DNA(A)。)。

實施例1 (本發(fā)明多核苷酸(A)、本發(fā)明重組載體和本發(fā)明的轉化體的制備)

合成分別具有SEQ ID NO: 9～14所示核苷酸序列的寡核苷酸引物。

[表1]

。

使用具有SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO: 10所示的寡核苷酸引物，以上述染色體DNA(A)為模板，按照下述反應液組成進行了PCR。

[反應液組成]

染色體DNA(A)溶液 1.5μl

dNTP(各2mM的混合物) 10μl

引物(50pmol/μl) 各0.3μl

2×緩沖液 25μl

KOD-FX(1U/μl、東洋紡公司制) 1μl

超純水 11.9μl。

將裝有上述組成的反應液的容器放在熱循環(huán)儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 9700)中，在94℃保溫2分鐘，之后進行30次的98℃10秒、然后是60℃30秒、接著是68℃60秒的保溫循環(huán)，之后在4℃保持。

之后，將上述PCR反應液的一部分供給瓊脂糖凝膠電泳。檢測到了約1.2kb的DNA條帶。

在剩下的PCR反應液中加入限制酶NdeI和BamHI，將DNA進行雙酶切（double digestion），純化了酶切過的約1.2kb的DNA。

將質粒載體pET-22b(Novagen公司制)用限制酶NdeI和BamHI進行雙酶切，純化了酶切過的載體DNA。

混合這些已純化的DNA，用T4 DNA連接酶進行連接，使用所得的連接液來轉化大腸桿菌(E. coli)DH5α。

將所得的轉化體用含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從生長出的菌落中隨機挑選8個菌落。將所選擇的菌落分別接種在2ml的含50μg/ml氨芐青霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中、在37℃振蕩培養(yǎng)17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)從各培養(yǎng)菌體中提取出質粒。將所提取出的各質粒的一部分用NdeI和BamHI進行雙酶切，之后供給瓊脂糖凝膠電泳。在6個質粒中確認了，分別有約1.2kb的DNA被插入上述載體中。在分析這些質粒中的1個所擁有的約1.2kb的插入DNA的核苷酸序列時，判明了該DNA具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。將該質粒命名為pET174。SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列編碼SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。

使用具有SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO: 12所示的寡核苷酸引物，以上述染色體DNA(A)為模板，按照下述反應液組成進行了PCR。

[反應液組成]

染色體DNA(A)溶液 1.5μl

dNTP(各2mM的混合物) 10μl

引物(50pmol/μl) 各0.3μl

2×緩沖液 25μl

KOD-FX(1U/μl、東洋紡公司制) 1μl

超純水 11.9μl。

將裝有上述組成的反應液的容器放在熱循環(huán)儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 9700)中，在94℃保溫2分鐘，之后進行30次的98℃10秒、然后是60℃30秒、接著是68℃60秒的保溫循環(huán)，之后在4℃保持。

之后，將上述PCR反應液的一部分供給瓊脂糖凝膠電泳。檢測到了約1.2kb的DNA條帶。

在剩下的PCR反應液中加入限制酶NdeI和BamHI，將DNA進行雙酶切，純化了酶切過的約1.2kb的DNA。

將質粒載體pET-22b(Novagen公司制)用限制酶NdeI和BamHI進行雙酶切，純化了酶切過的載體DNA。

混合這些已純化的DNA，用T4 DNA連接酶進行連接，使用所得的連接液轉化大腸桿菌DH5α。

將所得的轉化體用含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從生長出的菌落中隨機挑選8個菌落。將所選擇的菌落分別接種在2ml的含50μg/ml氨芐青霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中、在37℃振蕩培養(yǎng)17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)從各培養(yǎng)菌體中提取出質粒。將所提取出的各質粒的一部分用NdeI和BamHI進行雙酶切，之后供給瓊脂糖凝膠電泳。在6個質粒中確認了，分別有約1.2kb的DNA被插入上述載體中。在分析這些質粒中的1個所擁有的約1.2kb的插入DNA的核苷酸序列時，判明了該DNA具有SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列。將該質粒命名為pET204。SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列編碼SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。

使用具有SEQ ID NO: 13所示核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO: 14所示的寡核苷酸引物，以上述染色體DNA(A)為模板，按照下述反應液組成進行了PCR。

[反應液組成]

染色體DNA(A)溶液 1.5μl

dNTP(各2mM的混合物) 10μl

引物(50pmol/μl) 各0.3μl

2×緩沖液 25μl

KOD-FX(1U/μl、東洋紡公司制) 1μl

超純水 11.9μl。

將裝有上述組成的反應液的容器放在熱循環(huán)儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 9700)中，在94℃保溫2分鐘，之后進行30次的98℃10秒、然后是60℃30秒、接著是68℃60秒的保溫循環(huán)，之后在4℃保持。

之后，將上述PCR反應液的一部分供給瓊脂糖凝膠電泳。檢測到了約1.2kb的DNA條帶。

在剩下的PCR反應液中加入限制酶NdeI和BamHI，將DNA進行雙酶切，純化了酶切過的約1.2kb的DNA。

將質粒載體pET-22b(Novagen公司制)用限制酶NdeI和BamHI進行雙酶切，純化了酶切過的載體DNA。

混合這些已純化的DNA，用T4 DNA連接酶進行連接，使用所得的連接液轉化大腸桿菌DH5α。

將所得的轉化體用含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從生長出的菌落中隨機挑選8個菌落。將所選擇的菌落分別接種在2ml的含50μg/ml氨芐青霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中、在37℃振蕩培養(yǎng)17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)從各培養(yǎng)菌體中提取出質粒。將所提取出的各質粒的一部分用NdeI和BamHI進行雙酶切，之后供給瓊脂糖凝膠電泳。在6個質粒中確認了，分別有約1.2kb的DNA被插入上述載體中。在分析這些質粒中的1個所擁有的約1.2kbp的插入DNA的核苷酸序列時，判明了該DNA具有SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。將該質粒命名為pET436。SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列編碼SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。

實施例2 (使用了本發(fā)明轉化體的處理物的L-α-氨基酸化合物的制備)

使用質粒pET174來轉化大腸桿菌BL21(DE3)株。將所得的轉化體接種在10ml的含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨芐青霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)15小時。將所得培養(yǎng)液進行離心分離，得到了濕菌體。將約1g的該濕菌體懸浮在1ml 0.1M的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmφ)以2500rpm進行了20分鐘的破碎處理。將所得破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到了約0.7ml的離心上清液。在所得的0.45ml離心上清液中混合1.0mg的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的鈣鹽(東京化成公司制)、2.5mg的NADH、0.05ml的100mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)、0.2mg的硫酸銨、0.4U的亮氨酸脫氫酶(和光公司制)，在30℃振蕩了22小時。將該反應液在下述條件下供給基于液相色譜的含量分析?？芍合鄬τ诜磻惺褂玫?-羥基-4-(甲硫基)丁酸的鈣鹽的量，生成了1.6%的L-甲硫氨酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)；

流動相：將含有50mM的磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)與乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)=90：10的比例混合；

流量：0.8ml/分鐘；

柱溫：37℃；

檢測：210nm。

使用質粒pET204來轉化大腸桿菌BL21(DE3)株。將所得的轉化體接種在10ml的含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨芐青霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)15小時。將所得培養(yǎng)液進行離心分離，得到了濕菌體。將約1g的該濕菌體懸浮在1ml 0.1M的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmφ)以2500rpm進行了20分鐘的破碎處理。將所得破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到了約0.7ml的離心上清液。在所得的0.45ml離心上清液中混合1.0mg的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的鈣鹽(東京化成公司制)、2.5mg的NADH、0.05ml的100mM的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)、0.2mg的硫酸銨、0.4U的亮氨酸脫氫酶(和光公司制)，在30℃振蕩了22小時。將該反應液在下述條件下供給基于液相色譜的含量分析。可知：相對于反應中使用的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的鈣鹽的量，生成了2.8%的L-甲硫氨酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)；

流動相：將包含50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)=90：10的比例混合；

流量：0.8ml/分鐘；

柱溫：37℃；

檢測：210nm。

使用質粒pET436來轉化大腸桿菌BL21(DE3)株。將所得的轉化體接種在10ml的含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨芐青霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)15小時。將所得的培養(yǎng)液進行離心分離，得到了濕菌體。將約1g的該濕菌體懸浮在1ml 0.1M的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmφ)以2500rpm進行了20分鐘的破碎處理。將所得破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到了約0.7ml的離心上清液。在所得的0.45ml離心上清液中混合1.0mg的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的鈣鹽(東京化成公司制)、2.5mg的NADH、0.05ml 100mM的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)、0.2mg的硫酸銨、0.4U的亮氨酸脫氫酶(和光公司制)，在30℃振蕩了22小時。在下述條件下將該反應液供給基于液相色譜的含量分析。可知：相對于反應中使用的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的鈣鹽的量，生成了3.9%的L-甲硫氨酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)；

流動相：將包含50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)=90：10的比例混合；

流量：0.8ml/分鐘；

柱溫：37℃；

檢測：210nm。

實施例3 (含有編碼本蛋白質(B)的多核苷酸的重組載體和擁有該載體的轉化體的制備、以及本蛋白質(B)的制備)

(1) 含有編碼本蛋白質(B)的氨基酸序列的多核苷酸的重組載體和擁有該載體的轉化體的制備(1)

將球形芽孢桿菌IFO3525株在100ml的滅菌LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，得到了0.4g菌體。使用Qiagen Genomic Tip(Qiagen公司制)，按照其附帶的操作手冊中記載的方法，由該菌體純化染色體DNA(以下記作染色體DNA(B)。)。

根據Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247中記載的、編碼來自球形芽孢桿菌IFO3525株的亮氨酸脫氫酶的核苷酸序列，合成具有SEQ ID NO: 18所示核苷酸序列(GCCATGGAAATCTTCAAGTATATGG)的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO: 19所示核苷酸序列(GGGCCCGGGTTAACGGCCGTTCAAAATATT)的寡核苷酸引物。

使用具有SEQ ID NO: 18所示核苷酸序列的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO: 19所示核苷酸序列的寡核苷酸引物，以上述染色體DNA(B)為模板，按照采用了Expand High Fidelity PCR System(Roche Diagnostic公司制)的下述反應液組成進行了PCR。

[反應液組成]

染色體DNA(B)溶液 1μl

dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl

引物(20pmol/μl) 0.4μl

引物(4pmol/μl) 2μl

5×緩沖液(含MgCl₂) 10μl

enz.expandHiFi(3.5×10³U/ml) 0.5μl

超純水 35.1μl。

將裝有上述組成的反應液的容器放在熱循環(huán)儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400)中，在94℃保溫2分鐘，之后進行25次的94℃20秒、然后是55℃30秒、接著是72℃1.5分鐘的保溫循環(huán)，再于72℃保持7分鐘。

之后，將上述PCR反應液的一部分供給瓊脂糖凝膠電泳。檢測到了約1.1kb的DNA條帶。

在剩下的PCR反應液中加入限制酶NcoI和SmaI，將DNA進行雙酶切，純化了酶切過的約1.1kb的DNA。

將質粒載體pTrc99A(GE Healthcare公司制)用限制酶NcoI和SmaI進行雙酶切，純化了酶切過的載體DNA。

混合這些已純化的DNA，用T4 DNA連接酶進行連接，使用所得的連接液來轉化大腸桿菌DH5α。

將所得轉化體用含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從生長出的菌落中隨機挑選8個菌落。將所選擇的菌落分別接種在2ml的含50μg/ml氨芐青霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中、在37℃振蕩培養(yǎng)17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)由各培養(yǎng)菌體中提取出質粒。將所提取出的各質粒的一部分用限制酶NcoI和XbaI進行雙酶切，之后供給瓊脂糖凝膠電泳。在6個質粒中確認了，分別有約1.1kb的DNA被插入上述載體中。將這些質粒中的1個命名為pTrcLD。

(2) 含有編碼本蛋白質(B)的氨基酸序列的多核苷酸的重組載體和擁有該載體的轉化體的制備(2)

根據Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247中記載的、編碼來自球形芽孢桿菌IFO3525株的亮氨酸脫氫酶的核苷酸序列，合成具有SEQ ID NO: 20所示核苷酸序列(GTCGCTATATTACCGGTGAAGATGTTG)的寡核苷酸(有義引物)和具有SEQ ID NO: 21所示核苷酸序列(CAACATCTTCACCGGTAATATAGCGAC)的寡核苷酸(反義引物)，作為用于將上述酶的第113位的丙氨酸置換成甘氨酸的突變導入引物。將具有SEQ ID NO: 20所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO: 21所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物，以上述(1)中制備的重組載體pTrcLD為模板，按照使用了QuikChange II定點誘變試劑盒(STRATAGENE公司制)的以下的反應液組成進行了PCR。

[反應液組成]

pTrcLD的DNA溶液 0.4μl

dNTP混合物(包含在上述試劑盒中) 1μl

有義引物(50μM) 0.4μl

反義引物(50μM) 0.4μl

10×緩沖液(包含在上述試劑盒中) 5μl

PfuUltra(包含在上述試劑盒中) 1μl

超純水 41.8μl。

將裝有上述組成的反應液的容器放在熱循環(huán)儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400)中，在95℃保溫1分鐘，之后進行12次的95℃50秒、然后是55℃1分鐘、接著是68℃5分鐘的保溫循環(huán)，之后在4℃保存。

在所得的PCR反應液中添加1μl的DpnI限制酶(包含在上述試劑盒中)，之后在37℃保溫1小時。使用所得的保溫液來轉化大腸桿菌DH5α。

從所得的各轉化體中提取質粒，之后利用雙脫氧法確定突變位點的核苷酸序列，確認到導入了如同設計的突變。將具有SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列的質粒命名為pTrcLD(A113G)。SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列編碼SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。

(3) 含有編碼本蛋白質(B)的氨基酸序列的多核苷酸的重組載體和擁有該載體的轉化體的制備(3)

(3-1) 用于核苷酸置換的位點特異性突變導入

根據Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247中記載的、編碼來自球形芽孢桿菌IFO3525株的亮氨酸脫氫酶的核苷酸序列，合成具有SEQ ID NO: 22所示核苷酸序列(GATAGTATTCCAACCTATGTTGCGGC)的寡核苷酸(有義引物)和具有SEQ ID NO: 23所示核苷酸序列(GCCGCAACATAGGTTGGAATACTATC)的寡核苷酸(反義引物)，作為用于將第993位的腺嘌呤置換成胞嘧啶的突變導入引物。將具有SEQ ID NO: 22所示核苷酸序列的寡核苷酸和具有SEQ ID NO: 23所示核苷酸序列的寡核苷酸用作引物，以上述(2)中制備的重組載體pTrcLD(A113G)為模板，按照使用了QuikChange II定點誘變試劑盒(STRATAGENE公司制)的下述反應液組成進行了PCR。

[反應液組成]

pTrcLD(A113G)的DNA溶液 1μl

dNTP混合物(包含在上述試劑盒中) 1μl

有義引物(50μM) 0.4μl

反義引物(50μM) 0.4μl

10×緩沖液(包含在上述試劑盒中) 5μl

PfuUltra(包含在上述試劑盒中) 1μl

超純水 41.2μl。

將裝有上述組成的反應液的容器放在熱循環(huán)儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400)中，在95℃保溫1分鐘，之后進行12次的95℃50秒、然后是60℃1分鐘、接著是68℃5.5分鐘的保溫循環(huán)，之后在4℃保存。

在所得的PCR反應液中添加1μl的DpnI限制酶(包含在上述試劑盒中)，之后在37℃保溫1小時。使用所得的保溫液來轉化大腸桿菌DH5α。

從所得的各轉化體中提取質粒，之后利用雙脫氧法確定突變位點的核苷酸序列。將確認到了導入有如同設計的突變的質粒命名為pTrcLD (A113G)nd。

(3-2) 含有編碼本蛋白質(B)的氨基酸序列的多核苷酸的重組載體和擁有該載體的轉化體的制備

根據Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247中記載的、編碼來自球形芽孢桿菌IFO3525株的亮氨酸脫氫酶的核苷酸序列，合成具有SEQ ID NO: 24所示核苷酸序列(GGGCATATGGAAATCTTCAAGTATATGG)的寡核苷酸引物(有義引物)和具有SEQ ID NO: 25所示核苷酸序列(GGATCCTTAACGGCCGTTCAAAATATT)的寡核苷酸引物(反義引物)。使用具有SEQ ID NO: 24所示核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO: 25所示寡核苷酸引物，以上述(3-1)中制備的重組載體pTrcLD(A113G)nd為模板，按照使用了Expand High Fidelity PCR System(Roche Diagnostic公司制)的下述反應液組成進行了PCR。

[反應液組成]

pTrcLD(A113G)nd的DNA溶液 1μl

dNTP(各2.5mM的混合物) 1μl

引物(20pmol/μl) 各0.4μl

5×緩沖液(具有MgCl₂) 10μl

enz.expandHiFi(3.5ｘ10³U/ml) 0.5μl

超純水 36.7μl。

將裝有上述組成的反應液的容器放在熱循環(huán)儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 2400)中，在94℃保溫2分鐘，之后進行10次的94℃15秒、然后是55℃30秒、接著是72℃1.5分鐘的保溫循環(huán)，然后進行20次的94℃15秒、然后是60℃30秒、接著是72℃1.5分鐘的保溫循環(huán)，再于72℃保持7分鐘。

之后，將上述PCR反應液的一部分供給瓊脂糖凝膠電泳。檢測到了約1.1kb的DNA條帶。

在剩下的PCR反應液中加入限制酶NdeI和BamHI，將DNA進行雙酶切，純化了酶切過的約1.1kb的DNA。

將質粒載體pET-15b(Novagen公司制)用限制酶NdeI和BamHI進行雙酶切，純化了酶切過的載體DNA。

混合這些已純化的DNA，用T4 DNA連接酶進行連接，利用所得的連接液來轉化大腸桿菌DH5α。

將所得轉化體用含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從生長出的菌落中隨機挑選10個菌落。將所選擇的菌落分別接種在2ml的含50μg/ml氨芐青霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中、在37℃振蕩培養(yǎng)17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)從各培養(yǎng)菌體中提取出質粒。將所提取出的各質粒的一部分用限制酶NdeI和BamHI進行雙酶切，之后供給瓊脂糖凝膠電泳。在4個質粒中，分別確認到了有約1.1kb的DNA被插入上述載體中。如此操作而得到的質粒設計成可以表達在重組載體pTrcLD(A113G)nd所編碼的亮氨酸脫氫酶的氨基末端添加由包含連續(xù)6個殘基的組氨酸的20個氨基酸構成的氨基酸序列(SEQ ID NO: 44：MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHis)的蛋白質。將所得質粒中的1個命名為pETLD(A113G)。

(4) 本蛋白質(B)的制備

使用重組載體pETLD(A113G)來轉化大腸桿菌BL21(DE3)株。將所得的轉化體接種在100ml的含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨芐青霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，在30℃振蕩培養(yǎng)15小時。將所得培養(yǎng)液進行離心分離，得到了約0.8g的濕菌體。將約0.8g的該濕菌體懸浮在10ml的包含0.5M的NaCl和5mM的咪唑的20mM的磷酸緩沖液(pH7.4)(以下有時還記作結合緩沖液。)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmφ)以2500rpm進行了20分鐘的破碎處理。將所得破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到了約7ml的離心上清液。

在所得的約7ml的離心上清液中追加3ml的結合緩沖液達到約10ml，之后將其以5ml/分鐘的流速加載到HisTrap HP柱(凝膠床5ml)(GE Healthcare公司制)上。使約25ml的結合緩沖液以5ml/分鐘的流速流過該柱，將未吸附蛋白質洗脫。之后，維持流速不變，使約35ml的包含0.5M NaCl和29.75mM咪唑的20mM的磷酸緩沖液(pH7.4)流過，將未吸附蛋白質和低吸附蛋白質洗脫。然后，通過在流過47.5ml期間將咪唑濃度由29.75mM增加到500mM的梯度洗脫來洗脫吸附蛋白質，分離收集了25ml的咪唑濃度為160mM～443mM左右的級分。將所得級分供給Amicon Ultra-15(Millipore公司制)，進行脫鹽濃縮和與0.5M Tris-HCl(pH9)的緩沖液交換，得到了約1.5ml的級分。以下，將該級分記作亮氨酸脫氫酶(A113G)純化酶液。

實施例4 (使用了本發(fā)明的轉化體處理物的L-α-氨基酸化合物的制備)

使用質粒pET174來轉化大腸桿菌BL21(DE3)株。將所得轉化體接種在10ml的含0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨芐青霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)15小時。將所得的培養(yǎng)液進行離心分離，得到了濕菌體。將約1g的該濕菌體懸浮在1ml的0.1M的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmφ)以2500rpm進行了20分鐘的破碎處理。將所得破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到了約0.7ml的離心上清液。在所得的0.4ml離心上清液中混合0.02ml的用氨水制備成了pH9的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(東京化成公司制)的40%水溶液、10mg的NAD+、2U的甲酸脫氫酶(SIGMA公司制)、2.5mg的甲酸銨、0.1ml的實施例3中得到的亮氨酸脫氫酶(A113G)純化酶液(36g蛋白質/l)，在30℃振蕩了16小時。將該反應液在下述條件下利用液相色譜進行含量分析?？芍合鄬τ诜磻惺褂玫?-羥基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了1.7%的L-甲硫氨酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)；

流動相：將包含50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)=90：10的比例混合；

流量：0.8ml/分鐘；

柱溫：37℃；

檢測：210nm。

使用質粒pET204來轉化大腸桿菌BL21(DE3)株。將所得轉化體接種在10ml的含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨芐青霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)了15小時。將所得培養(yǎng)液進行離心分離，得到了濕菌體。將約1g的該濕菌體懸浮在1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmφ)以2500rpm進行了20分鐘的破碎處理。將所得破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到了約0.7ml的離心上清液。在所得的0.4ml的離心上清液中混合0.02ml的用氨水制備成了pH9的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(東京化成公司制)的40%水溶液、10mg的NAD+、2U的甲酸脫氫酶(SIGMA公司制)、2.5mg的甲酸銨、0.1ml的實施例3中得到的亮氨酸脫氫酶(A113G)純化酶液(36g蛋白質/l)，在30℃振蕩了16小時。將該反應液在下述條件下利用液相色譜進行含量分析?？芍合鄬τ诜磻惺褂玫?-羥基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了9.7%的L-甲硫氨酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)；

流動相：將包含50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)=90：10的比例混合；

流量：0.8ml/分鐘；

柱溫：37℃

檢測：210nm。

使用質粒pET436來轉化大腸桿菌BL21(DE3)株。將所得轉化體接種在10ml的含有0.1mM的IPTG和50μg/ml的氨芐青霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)15小時。將所得培養(yǎng)液進行離心分離，得到了濕菌體。將約1g的該濕菌體懸浮在1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmφ)以2500rpm進行了20分鐘的破碎處理。將所得破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到了約0.7ml的離心上清液。在所得的0.4ml的離心上清液中混合0.02ml用氨水制備成了pH9的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(東京化成公司制)的40%水溶液、10mg的NAD+、2U的甲酸脫氫酶(SIGMA公司制)、2.5mg的甲酸銨、0.1ml的實施例3中得到的亮氨酸脫氫酶(A113G)純化酶液(36g蛋白質/l)，在30℃振蕩了16小時。將該反應液在下述條件下利用液相色譜進行含量分析。可知：相對于反應中使用的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了6.7%的L-甲硫氨酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)；

流動相：將包含50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)=90：10的比例混合；

流量：0.8ml/分鐘；

柱溫：37℃；

檢測：210nm。

實施例5 (本發(fā)明多核苷酸(A)、本發(fā)明重組載體和本發(fā)明的轉化體的制備)

制備具有分別在SEQ ID NO: 15所示核苷酸序列的5’末端添加核苷酸序列ccatggct、在3’末端添加核苷酸序列ggatcc的核苷酸序列的雙鏈DNA。SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列編碼SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。

將所制備的上述雙鏈DNA(約1.2kb)用限制酶NcoI和BamHI進行雙酶切，純化了酶切過的DNA。

將質粒載體pTrc99A(GE Healthcare公司制)用限制酶NcoI和BamHI進行雙酶切，純化了酶切過的載體DNA。

混合這些已純化的DNA，用T4 DNA連接酶進行連接，使用所得的連接液來轉化大腸桿菌JM109株。

將所得的轉化體用含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從生長出的菌落中隨機挑選8個菌落。將所選擇的菌落分別接種在2ml的含有50μg/ml的氨芐青霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中、在37℃振蕩培養(yǎng)了17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)從各培養(yǎng)菌體中提取出質粒。將已提取出的各質粒的一部分用限制酶NcoI和BamHI進行雙酶切，之后供給瓊脂糖凝膠電泳。在6個質粒中確認了，分別有約1.2kb的DNA被插入上述載體中。確定所得質粒的核苷酸序列，將具有目標核苷酸序列的質粒命名為pTrc174。

制備具有分別在SEQ ID NO: 16所示核苷酸序列的5’末端側添加核苷酸序列ccatggct、在3’末端側添加核苷酸序列ggatcc的核苷酸序列的雙鏈DNA。SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列編碼SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。

將所制備的上述雙鏈DNA(約1.2kb)用限制酶NcoI和BamHI進行雙酶切，純化了酶切過的DNA。

將質粒載體pTrc99A(GE Healthcare公司制)用限制酶NcoI和BamHI進行雙酶切，純化了酶切過的載體DNA。

混合這些已純化的DNA，用T4 DNA連接酶進行連接，使用所得的連接液來轉化大腸桿菌JM109株。

將所得的轉化體用含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從生長出的菌落中隨機挑選8個菌落。將所選擇的菌落分別接種在2ml的含有50μg/ml的氨芐青霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中、在37℃振蕩培養(yǎng)了17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)從各培養(yǎng)菌體中提取出質粒。將所提取出的各質粒的一部分用NcoI和BamHI進行雙酶切，之后供給瓊脂糖凝膠電泳。在6個質粒中確認了，分別有約1.2kb的DNA被插入上述載體中。確定所得質粒的核苷酸序列，將具有目標核苷酸序列的質粒命名為pTrc204。

制備具有分別在SEQ ID NO: 17所示核苷酸序列的5’末端側添加核苷酸序列ccatggct、在3’末端側添加核苷酸序列ggatcc的核苷酸序列的雙鏈DNA。SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列編碼SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。

將所制備的上述雙鏈DNA(約1.2kb)用限制酶NcoI和BamHI進行雙酶切，純化了酶切過的DNA。

將質粒載體pTrc99A(GE Healthcare公司制)用限制酶NcoI和BamHI進行雙酶切，純化了酶切過的載體DNA。

混合這些已純化的DNA，用T4 DNA連接酶進行連接，使用所得的連接液來轉化大腸桿菌JM109株。

將所得轉化體用含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從生長出的菌落中隨機挑選8個菌落。將所選擇的菌落分別接種在2ml的含有50μg/ml的氨芐青霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中、在37℃振蕩培養(yǎng)了17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen公司制)從各培養(yǎng)菌體中提取出質粒。將所提取出的各質粒的一部分用NcoI和BamHI進行雙酶切，之后供給瓊脂糖凝膠電泳。在6個質粒中確認了，分別有上述約1.2kb的DNA被插入上述載體中。確定所得質粒的核苷酸序列，將具有目標核苷酸序列的質粒命名為pTrc436。

實施例6 (含有編碼具有將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉換成還原型的能力的蛋白質的多核苷酸的重組載體和擁有該載體的轉化體的制備)

以Journal of Applied Microbiology, 111 (2011) 1075-1085中所述的芽胞桿菌物種(Bacillus sp.) F1(2010)株來源的甲酸脫氫酶的氨基酸序列為基礎，設計了SEQ ID NO: 26所示的核苷酸序列。SEQ ID NO: 26所示的核苷酸序列編碼SEQ ID NO: 43所示的氨基酸序列。制備具有分別在SEQ ID NO: 26所示的核苷酸序列的5’末端側添加核苷酸序列ccatggct、在3’末端側添加核苷酸序列ggatcc的核苷酸序列的雙鏈DNA。

用限制酶NcoI和BamHI對制備的上述雙鏈DNA(約1.2kb)進行雙酶切，純化了酶切過的DNA。

用限制酶NcoI和BamHI對質粒載體pTrc99A(GE Healthcare公司制)進行雙酶切，純化了酶切過的載體DNA。

將這些純化的DNA混合，用T4 DNA連接酶連接，并用所得的連接液轉化大腸桿菌JM109株。

在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)所得的轉化體，從生長出的菌落中隨機挑選8個菌落。將挑選的菌落分別接種到含有50μg/ml氨芐青霉素的2ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中于37℃振蕩培養(yǎng)17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各自的培養(yǎng)菌體提取出質粒。用NcoI和BamHI對提取出的各質粒的一部分進行雙酶切后，供給瓊脂糖凝膠電泳，在6個質粒中確認了，分別有約1.2kb的DNA插入到上述載體中。確定所得的質粒的核苷酸序列，將具有目標核苷酸序列的質粒命名為pTrcFDH。

用質粒pTrcFDH轉化大腸桿菌JM109株。將所得的轉化體接種到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨芐青霉素的20ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在30℃振蕩培養(yǎng)15小時。離心分離所得的培養(yǎng)液，得到濕菌體。將約0.7g該濕菌體懸浮到10ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎處理20分鐘。將所得的破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到約0.7ml離心上清液。

實施例7 (使用本發(fā)明的轉化體的處理物制備L-α-氨基酸化合物)

用質粒pTrc174轉化大腸桿菌JM109株。將所得的轉化體接種到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨芐青霉素的20ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在30℃振蕩培養(yǎng)15小時。離心分離所得的培養(yǎng)液，得到濕菌體。將約0.1g該濕菌體懸浮到1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎處理20分鐘。將所得的破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到約0.7ml離心上清液。在0.4ml所得的離心上清液中混合：0.02ml用氨水制備成pH9的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(東京化成公司制)的40%水溶液、10mg NAD＋、0.05ml實施例6中所得的離心上清液、2.5mg甲酸銨、0.05ml實施例3中所得的亮氨酸脫氫酶(A113G)純化酶液(36g蛋白質/l)，在30℃振蕩17.5小時。將該反應液在下述條件下利用液相色譜進行含量分析?？芍合鄬τ诜磻兴玫?-羥基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了5.6%的L-甲硫氨酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

流動相：將含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合

流速：0.8ml/分鐘

柱溫：37℃

檢測：210nm。

用質粒pTrc204轉化大腸桿菌JM109株。將所得的轉化體接種到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨芐青霉素的20ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在30℃振蕩培養(yǎng)15小時。離心分離所得的培養(yǎng)液，得到濕菌體。將約0.1g該濕菌體懸浮到1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎處理20分鐘。將所得的破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到約0.7ml離心上清液。在0.4ml所得的離心上清液中混合：0.02ml用氨水制備成pH9的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(東京化成公司制)的40%水溶液、10mg NAD＋、0.05ml實施例6中所得的離心上清液、2.5mg甲酸銨、0.05ml實施例3中所得的亮氨酸脫氫酶(A113G)純化酶液(36g蛋白質/l)，在30℃振蕩17.5小時。將該反應液在下述條件下利用液相色譜進行含量分析?？芍合鄬τ诜磻兴玫?-羥基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了30.2%的L-甲硫氨酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

流動相：將含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合

流速：0.8ml/分鐘

柱溫：37℃

檢測：210nm。

用質粒pTrc436轉化大腸桿菌JM109株。將所得的轉化體接種到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨芐青霉素的20ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在30℃振蕩培養(yǎng)15小時。離心分離所得的培養(yǎng)液，得到濕菌體。將約0.1g該濕菌體懸浮到1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎處理20分鐘。將所得的破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到約0.7ml離心上清液。在0.4ml所得的離心上清液中混合：0.02ml用氨水制備成pH9的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(東京化成公司制)的40%水溶液、10mg NAD＋、0.05ml實施例6中所得的離心上清液、2.5mg甲酸銨、0.05ml實施例3中所得的亮氨酸脫氫酶(A113G)純化酶液(36g蛋白質/l)，在30℃振蕩17.5小時。將該反應液在下述條件下利用液相色譜進行含量分析。可知：相對于反應中所用的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了12.1%的L-甲硫氨酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

流動相：將含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合

流速：0.8ml/分鐘

柱溫：37℃

檢測：210nm。

實施例8 (本發(fā)明的多核苷酸(A)、本發(fā)明的重組載體和本發(fā)明的轉化體的制備)

合成分別具有SEQ ID NO: 27至32所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物。

[表2]

使用具有SEQ ID NO: 27所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO: 28所示的寡核苷酸引物，將質粒pTrc174作為模板，以下述反應液組成進行了PCR。

[反應液組成]

pTrc174的DNA溶液　　　　　　　 1.5μl

dNTP(各2mM的混合物)　　　　　　10μl

引物(50pmol/μl) 　　　　　　　 各0.3μl

2×緩沖液 　　　　　 　　　　　25μl

KOD-FX(1U/μl，東洋紡公司制) 　　1μl

超純水　　　　　　　　　　　　 11.9μl。

將加入了上述組成的反應液的容器置于熱循環(huán)儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 9700)中，在94℃保溫2分鐘后，進行30次下述保溫循環(huán)：98℃ 10秒、接著60℃ 30秒、接著68℃ 60秒，然后在4℃保持。

其后，將上述PCR反應液的一部分供給瓊脂糖凝膠電泳。檢測到約1.2kb的DNA條帶。

在剩余的PCR反應液中加入限制酶NdeI和BamHI，對DNA進行雙酶切，純化了酶切過的約1.2kb的DNA。

用限制酶NdeI和BamHI對質粒載體pET-15b(Novagen公司制)進行雙酶切，純化了酶切過的載體DNA。

將這些純化的DNA混合，用T4 DNA連接酶連接，并用所得的連接液轉化大腸桿菌DH5α。

在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)所得的轉化體，從生長出的菌落中隨機挑選8個菌落。將挑選的菌落分別接種到含有50μg/ml氨芐青霉素的2ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中于37℃振蕩培養(yǎng)17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各自的培養(yǎng)菌體提取出質粒。用NcoI和BamHI對提取出的各質粒的一部分進行雙酶切后，供給瓊脂糖凝膠電泳。在6個質粒中確認了，分別有約1.2kb的DNA插入到上述載體中。如此操作而得到的質粒設計成可以表達在重組載體pTrc174所編碼的本發(fā)明蛋白質(A)的氨基末端添加由包含連續(xù)6個殘基的組氨酸的20個氨基酸組成的氨基酸序列(SEQ ID NO: 44：MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHis)的蛋白質。將所得的質粒中的1個命名為pET174SC。

使用具有SEQ ID NO: 29所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO: 30所示的寡核苷酸引物，將質粒pTrc204作為模板，以下述反應液組成進行了PCR。

[反應液組成]

pTrc204的DNA溶液　　　　　　　 1.5μl

dNTP(各2mM的混合物)　　　　　　10μl

引物(50pmol/μl) 　　　　　　　 各0.3μl

2×緩沖液 　　　　　　 　　　　25μl

KOD-FX(1U/μl，東洋紡公司制)　　 1μl

超純水　　　　　　 　　　　　　11.9μl。

將加入了上述組成的反應液的容器置于熱循環(huán)儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 9700)中，在94℃保溫2分鐘后，進行30次下述保溫循環(huán)：98℃ 10秒、接著60℃ 30秒、接著68℃ 60秒，然后在4℃保持。

其后，將上述PCR反應液的一部分供給瓊脂糖凝膠電泳。檢測到約1.2kb的DNA條帶。

在剩余的PCR反應液中加入限制酶NdeI和BamHI，對DNA進行雙酶切，純化了酶切過的約1.2kb的DNA。

用限制酶NdeI和BamHI對質粒載體pET-15b(Novagen公司制)進行雙酶切，純化了酶切過的載體DNA。

將這些純化的DNA混合，用T4 DNA連接酶連接，并用所得的連接液轉化大腸桿菌DH5α。

在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)所得的轉化體，從生長出的菌落中隨機挑選8個菌落。將挑選的菌落分別接種到含有50μg/ml氨芐青霉素的2ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中于37℃振蕩培養(yǎng)17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各自的培養(yǎng)菌體提取出質粒。用NcoI和BamHI對提取出的各質粒的一部分進行雙酶切后，供給瓊脂糖凝膠電泳。在6個質粒中確認到，分別有約1.2kb的DNA插入到上述載體中。如此操作而得到的質粒設計成可以表達在重組載體pTrc204所編碼的本發(fā)明蛋白質(A)的氨基末端添加由包含連續(xù)6個殘基的組氨酸的20個氨基酸組成的氨基酸序列(SEQ ID NO: 44：MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHis)的蛋白質。將所得的質粒中的1個命名為pET204SC。

使用具有SEQ ID NO: 31所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO: 32所示的寡核苷酸引物，將質粒pTrc436作為模板，以下述反應液組成進行了PCR。

[反應液組成]

pTrc436的DNA溶液　　　　　　　　1.5μl

dNTP(各2mM的混合物)　　　　　　 10μl

引物(50pmol/μl) 　　　　　　　 各0.3μl

2×緩沖液 　　　　　 　　　　　25μl

KOD-FX(1U/μl，東洋紡公司制)　　　1μl

超純水　　　　　　　　　　　　　11.9μl。

將加入了上述組成的反應液的容器置于熱循環(huán)儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System 9700)中，在94℃保溫2分鐘后，進行30次下述保溫循環(huán)：98℃ 10秒、接著60℃ 30秒、接著68℃ 60秒，然后在4℃保持。

其后，將上述PCR反應液的一部分供給瓊脂糖凝膠電泳。檢測到約1.2kb的DNA條帶。

在剩余的PCR反應液中加入限制酶NdeI和XhoI，對DNA進行雙酶切，純化了酶切過的約1.2kb的DNA。

用限制酶NdeI和XhoI對質粒載體pET-22b(Novagen公司制)進行雙酶切，純化了酶切過的載體DNA。

將這些酶切過的DNA混合，用T4 DNA連接酶連接，并用所得的連接液轉化大腸桿菌DH5α。

在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)所得的轉化體，從生長出的菌落中隨機挑選8個菌落。將挑選的菌落分別接種到含有50μg/ml氨芐青霉素的2ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中于37℃振蕩培養(yǎng)17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各自的培養(yǎng)菌體提取出質粒。用NcoI和XhoI對提取出的各質粒的一部分進行雙酶切后，供給瓊脂糖凝膠電泳。在6個質粒中確認到，分別有約1.2kb的DNA插入到上述載體中。如此操作而得到的質粒設計成可以表達在重組載體pTrc436所編碼的本發(fā)明蛋白質(A)的氨基末端添加由包含連續(xù)6個殘基的組氨酸的20個氨基酸組成的氨基酸序列(SEQ ID NO: 44：MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHis)的蛋白質。將所得的質粒中的1個命名為pET436SC。

實施例9 (含有編碼具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質的多核苷酸的重組載體和擁有該載體的轉化體的制備，以及該蛋白質的制備)

(1) 含有編碼具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質的氨基酸序列的多核苷酸的重組載體和擁有該載體的轉化體的制備

在100ml滅菌的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌BL21(DE3)株，得到約1.0g菌體。使用Qiagen Genomic Tip (Qiagen公司制)，按照其附帶的操作手冊中記載的方法，從該菌體純化了染色體DNA(以下記為染色體DNA(C))。

根據Journal of Bacteriology, 170(9) (1988) 4415-4419中記載的、編碼來自大腸桿菌的過氧化氫酶的核苷酸序列，合成了具有SEQ ID NO: 33所示的核苷酸序列(CCATATGAGCACGTCAGACGATATCCATAAC)的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO: 34所示的核苷酸序列(ACTCGAGCAGCAGGTCGAAACGGTCGAGGTTC)的寡核苷酸引物。

使用具有SEQ ID NO: 33所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO: 34所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物，將前述染色體DNA(C)作為模板，按照采用了Expand High Fidelity PCR System(Roche Diagnostic公司制)的以下反應液組成進行了PCR。

[反應液組成]

染色體DNA(C)溶液　　　　　　　　1μl

dNTP(各2.5mM的混合物)　　　　　 1μl

引物(20pmol/μl)　　　　　　　　 各0.4μl

5×緩沖液(具有MgCl₂)　 　　　　 10μl

enz.expandHiFi (3.5ｘ10³U/ml) 　0.5μl

超純水 　　　　 　　　　　　　　33.7μl。

將加入了上述組成的反應液的容器置于熱循環(huán)儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400)中，在94℃保溫2分鐘后，進行10次下述保溫循環(huán)：94℃ 15秒、接著60℃ 30秒、接著72℃ 2分鐘，接著進行20次下述保溫循環(huán)：94℃ 15秒、接著65℃ 30秒、接著72℃ 2分鐘，進而在72℃保持7分鐘。

其后，將上述PCR反應液的一部分供給瓊脂糖凝膠電泳。檢測到約2.2kb的DNA條帶。

在剩余的PCR反應液中加入限制酶NdeI和XhoI，對DNA進行雙酶切，純化了酶切過的約2.2kb的DNA。

用限制酶NdeI和XhoI對質粒載體pET-22b(Novagen公司制)進行雙酶切，純化了酶切過的載體DNA。

將這些純化的DNA混合，用T4 DNA連接酶連接，并用所得的連接液轉化大腸桿菌DH5α。

在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)所得的轉化體，從生長出的菌落中隨機挑選8個菌落。將挑選的菌落分別接種到含有50μg/ml氨芐青霉素的2ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中于37℃振蕩培養(yǎng)17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各自的培養(yǎng)菌體提取出質粒。用NdeI和XhoI對提取出的各質粒的一部分進行雙酶切后，供給瓊脂糖凝膠電泳。在6個質粒中確認到，分別有約2.2kb的DNA插入到上述載體中。如此操作而得到的質粒設計成可以表達在上述過氧化氫酶的羧基末端添加由包含連續(xù)6個殘基的組氨酸的8個氨基酸組成的氨基酸序列(SEQ ID NO: 45：LeuGluHisHisHisHisHisHis)的蛋白質。將所得的質粒中的1個命名為pETcatE。

(2)具有將過氧化氫轉換成分子氧的能力的蛋白質的制備

用重組載體pETcatE轉化大腸桿菌BL21(DE3)株。將所得的轉化體接種到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨芐青霉素的20ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)15小時。離心分離所得的培養(yǎng)液，得到約0.8g濕菌體。將約0.8g該濕菌體懸浮到10ml含有0.5M NaCl和5mM咪唑的20mM磷酸緩沖液(pH7.4)(即，結合緩沖液)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎處理20分鐘。將所得的破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到約7ml離心上清液。

在約7ml所得的離心上清液中追加3ml結合緩沖液使達到約10ml之后，將其以1ml/min的流速加載到HisTrap HP柱(凝膠床1ml)(GE Healthcare Japan公司制)上。使約5ml的結合緩沖液以1ml/分鐘的流速流過該柱，將未吸附蛋白質洗脫。之后，維持流速不變，使約7ml的包含0.5M NaCl和29.75mM咪唑的20mM的磷酸緩沖液(pH7.4)流過，將未吸附蛋白質和低吸附蛋白質洗脫。接著，通過在流過9.5ml期間將咪唑濃度從29.75mM增加到500mM的梯度洗脫來洗脫吸附蛋白質，分離收集了5ml的咪唑濃度為30mM~180mM左右的級分。將所得級分供給Amicon Ultra-15(Millipore公司制)，進行脫鹽濃縮和與0.1M Tris-HCl(pH8)的緩沖液交換，得到約1ml的級分。以下，將該級分記作過氧化氫酶純化酶液。

實施例10 (使用本發(fā)明的轉化體的處理物制備α-氧代羧酸化合物)

用質粒pET174SC轉化大腸桿菌BL21(DE3)株。將所得的轉化體接種到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨芐青霉素的20ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在30℃振蕩培養(yǎng)15小時。離心分離所得的培養(yǎng)液，得到濕菌體。將約0.1g該濕菌體懸浮到1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎處理20分鐘。將所得的破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到約0.7ml離心上清液。在0.35ml所得的離心上清液中混合：0.02ml用氨水制備成pH9的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(東京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml實施例9中所得的過氧化氫酶純化酶液(3.3g蛋白質/l)和0.1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，在30℃振蕩22小時。將該反應液在下述條件下利用液相色譜進行含量分析。可知：相對于反應中所用的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了18.0%的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

流動相：將含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合

流速：0.8ml/分鐘

柱溫：37℃

檢測：210nm。

用質粒pET204SC轉化大腸桿菌BL21(DE3)株。將所得的轉化體接種到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨芐青霉素的20ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在30℃振蕩培養(yǎng)15小時。離心分離所得的培養(yǎng)液，得到濕菌體。將約0.1g該濕菌體懸浮到1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)、玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎處理20分鐘。將所得的破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到約0.7ml離心上清液。在0.35ml所得的離心上清液中混合：0.02ml用氨水制備成pH9的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(東京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml實施例9中所得的過氧化氫酶純化酶液(3.3g蛋白質/l)和0.1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，在30℃振蕩22小時。將該反應液在下述條件下利用液相色譜進行含量分析?？芍合鄬τ诜磻兴玫?-羥基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了22.8%的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

流動相：將含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合

流速：0.8ml/分鐘

柱溫：37℃

檢測：210nm。

用質粒pET436SC轉化大腸桿菌BL21(DE3)株。將所得的轉化體接種到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨芐青霉素的20ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在30℃振蕩培養(yǎng)15小時。離心分離所得的培養(yǎng)液，得到濕菌體。將約0.1g該濕菌體懸浮到1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎處理20分鐘。將所得的破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到約0.7ml離心上清液。在0.35ml所得的離心上清液中混合：0.02ml用氨水制備成pH9的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(東京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml實施例9中所得的過氧化氫酶純化酶液(3.3g蛋白質/l)和0.1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，在30℃振蕩22小時。將該反應液在下述條件下利用液相色譜進行含量分析?？芍合鄬τ诜磻兴玫?-羥基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了24.2%的2-氧代-4-(甲硫基)丁酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

流動相：將含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合

流速：0.8ml/分鐘

柱溫：37℃

檢測：210nm。

實施例11 (含有編碼具有將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉換成還原型的能力的蛋白質的多核苷酸的重組載體和擁有該載體的轉化體的制備，以及該蛋白質的制備)

(1)含有編碼具有將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉換成還原型的能力的蛋白質的多核苷酸的重組載體和擁有該載體的轉化體的制備

以Journal of Applied Microbiology 111 (2011) 1075-1085中所述的芽胞桿菌物種(Bacillus sp.) F1(2010)株來源的甲酸脫氫酶的氨基酸序列為基礎，以其密碼子使用頻率與大腸桿菌中的密碼子使用頻率相近的方式設計SEQ ID NO: 26所示的核苷酸序列，基于該核苷酸序列，合成了具有SEQ ID NO: 35所示的核苷酸序列(CCATATGGCTAAGATCGTTTGCGTTCTGTAC)的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO: 36所示的核苷酸序列(ACTCGAGAGCAGATTTCTTGAAACGTGCAG)的寡核苷酸引物。

使用具有SEQ ID NO: 35所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO: 36所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物，將重組載體pTrcFDH作為模板，按照采用了Expand High Fidelity PCR System(Roche Diagnostic公司制)的以下反應液組成進行了PCR。

[反應液組成]

pTrcFDH的DNA溶液 　　 　　　　1μl

dNTP(各2.5mM的混合物)　　　　　1μl

引物(20pmol/μl)　　　　　　　　各0.4μl

5×緩沖液(具有MgCl₂)　 　　　　10μl

enz.expandHiFi (3.5×10³U/ml)　0.5μl

超純水 　　　　　　　　　　　　33.7μl。

將加入了上述組成的反應液的容器置于熱循環(huán)儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400)中，在94℃保溫2分鐘后，進行10次下述保溫循環(huán)：94℃ 15秒、接著55℃ 30秒、接著72℃ 1.5分鐘，接著進行20次下述保溫循環(huán)：94℃ 15秒、接著60℃ 30秒、接著72℃ 1.5分鐘，進而在72℃保持7分鐘。

其后，將上述PCR反應液的一部分供給瓊脂糖凝膠電泳。檢測到約1.2kb的DNA條帶。

在剩余的PCR反應液中加入限制酶NdeI和XhoI，對DNA進行雙酶切，純化了酶切過的約1.2kb的DNA。

用限制酶NdeI和XhoI對質粒載體pET-22b(Novagen公司制)進行雙酶切，純化了酶切過的載體DNA片段。

將這些純化的DNA混合，用T4 DNA連接酶連接，并用所得的連接液轉化大腸桿菌DH5α。

在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)所得的轉化體，從生長出的菌落中隨機挑選8個菌落。將挑選的菌落分別接種到含有50μg/ml氨芐青霉素的2ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中于37℃振蕩培養(yǎng)17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各自的培養(yǎng)菌體提取出質粒。用NdeI和XhoI對提取出的各質粒的一部分進行雙酶切后，供給瓊脂糖凝膠電泳。在6個質粒中確認到，分別有約1.2kb的DNA插入到上述載體中。如此操作而得到的質粒設計成可以表達在上述甲酸脫氫酶的羧基末端添加由包含連續(xù)6個殘基的組氨酸的8個氨基酸組成的氨基酸序列(SEQ ID NO: 45：LeuGluHisHisHisHisHisHis)的蛋白質。將所得的質粒中的1個命名為pETFDH。

(2)具有將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉換成還原型的能力的蛋白質的制備

用重組載體pETFDH轉化大腸桿菌BL21(DE3)株。將所得的轉化體接種到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨芐青霉素的20ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)15小時。離心分離所得的培養(yǎng)液，得到約0.8g濕菌體。將約0.8g該濕菌體懸浮到10ml含有0.5M NaCl和5mM咪唑的20mM磷酸緩沖液(pH7.4)(即，結合緩沖液)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎處理20分鐘。將所得的破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到約7ml離心上清液。

在約7ml所得的離心上清液中追加3ml結合緩沖液使達到約10ml之后，將其以1ml/min的流速加載到HisTrap HP柱(凝膠床1ml)(GE Healthcare公司制)上。使約5ml的結合緩沖液以1ml/分鐘的流速流過該柱，將未吸附蛋白質洗脫。之后，維持流速不變，使約7ml的包含0.5M NaCl和29.75mM咪唑的20mM的磷酸緩沖液(pH7.4)流過，將未吸附蛋白質和低吸附蛋白質洗脫。接著，通過在流過9.5ml期間將咪唑濃度從29.75mM增加到500mM的梯度洗脫來洗脫吸附蛋白質，分離收集了4ml的咪唑濃度為30mM~230mM左右的級分。將所得級分供給Amicon Ultra-15(Millipore公司制)，進行脫鹽濃縮和與0.1M Tris-HCl(pH8)的緩沖液交換，得到約1ml的級分。以下，將該級分記作甲酸脫氫酶純化酶液。

實施例12 (使用本發(fā)明的轉化體的處理物制備L-α-氨基酸化合物)

用質粒pET174SC轉化大腸桿菌BL21(DE3)株。將所得的轉化體接種到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨芐青霉素的20ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在30℃振蕩培養(yǎng)15小時。離心分離所得的培養(yǎng)液，得到濕菌體。將約0.1g該濕菌體懸浮到1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎處理20分鐘。將所得的破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到約0.7ml離心上清液。在0.35ml所得的離心上清液中混合：0.02ml用氨水制備成pH9的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(東京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml實施例9中所得的過氧化氫酶純化酶液(3.3g蛋白質/l)、0.05ml實施例11中所得的甲酸脫氫酶純化酶液(5.3g蛋白質/l)、10mg NAD＋、2.5mg甲酸銨和0.05ml實施例3中所得的亮氨酸脫氫酶(A113G)純化酶液(36g蛋白質/l)，在30℃振蕩22小時。將該反應液在下述條件下利用液相色譜進行含量分析?？芍合鄬τ诜磻兴玫?-羥基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了12.0%的L-甲硫氨酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

流動相：將含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合

流速：0.8ml/分鐘

柱溫：37℃

檢測：210nm。

用質粒pET204SC轉化大腸桿菌BL21(DE3)株。將所得的轉化體接種到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨芐青霉素的20ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在30℃振蕩培養(yǎng)15小時。離心分離所得的培養(yǎng)液，得到濕菌體。將約0.1g該濕菌體懸浮到1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎處理20分鐘。將所得的破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到約0.7ml離心上清液。在0.35ml所得的離心上清液中混合：0.02ml用氨水制備成pH9的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(東京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml實施例9中所得的過氧化氫酶純化酶液(3.3g蛋白質/l)、0.05ml實施例11中所得的甲酸脫氫酶純化酶液(5.3g蛋白質/l)、10mg NAD＋、2.5mg甲酸銨和0.05ml實施例3中所得的亮氨酸脫氫酶(A113G)純化酶液(36g蛋白質/l)，在30℃振蕩22小時。將該反應液在下述條件下利用液相色譜進行含量分析。可知：相對于反應中所用的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了7.7%的L-甲硫氨酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

流動相：將含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合

流速：0.8ml/分鐘

柱溫：37℃

檢測：210nm。

用質粒pET436SC轉化大腸桿菌BL21(DE3)株。將所得的轉化體接種到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨芐青霉素的20ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在30℃振蕩培養(yǎng)15小時。離心分離所得的培養(yǎng)液，得到濕菌體。將約0.1g該濕菌體懸浮到1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎處理20分鐘。將所得的破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到約0.7ml離心上清液。在0.35ml所得的離心上清液中混合：0.02ml用氨水制備成pH9的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(東京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml實施例9中所得的過氧化氫酶純化酶液(3.3g蛋白質/l)、0.05ml實施例11中所得的甲酸脫氫酶純化酶液(5.3g蛋白質/l)、10mg NAD＋、2.5mg甲酸銨和0.05ml實施例3中所得的亮氨酸脫氫酶(A113G)純化酶液(36g蛋白質/l)，在30℃振蕩22小時。將該反應液在下述條件下利用液相色譜進行含量分析?？芍合鄬τ诜磻兴玫?-羥基-4-(甲硫基)丁酸的量，生成了33.9%的L-甲硫氨酸。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

流動相：將含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合

流速：0.8ml/分鐘

柱溫：37℃

檢測：210nm。

實施例13 (本發(fā)明重組載體的制備)

(1)編碼本蛋白質(B)的多核苷酸的制備

以pTrc99A(GE Healthcare公司制)的SD序列附近的序列為參考，合成了具有SEQ ID NO: 37所示的核苷酸序列(CGGATCCGAGGAAACAGACCATGG)的寡核苷酸引物。以Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 23 (2003) 239-247中所述的球形芽孢桿菌IFO3525株來源的亮氨酸脫氫酶的序列為基礎，合成了具有SEQ ID NO: 38所示的核苷酸序列(ctcagagTTAACGGCCGTTCAAAATATT)的寡核苷酸引物。

使用具有SEQ ID NO: 37所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物和具有SEQ ID NO: 38所示的核苷酸序列的寡核苷酸引物，將實施例3(2)中所述的重組載體pTrcLD(A113G)作為模板，按照采用了Expand High Fidelity PCR System(Roche Diagnostic公司制)的以下反應液組成進行了PCR。

[反應液組成]

質粒pTrcLD液　　　　　　　　　 1μl

dNTP(各2.5mM的混合物)　 　　　　1μl

引物(20pmol/μl)　　　　　　　 　各0.4μl

5×緩沖液(具有MgCl₂)　 　　　　 10μl

enz.expandHiFi (3.5×10³U/ml)　 0.5μl

超純水 　　　　　 　　　　　　　36.7μl。

將加入了上述組成的反應液的容器置于熱循環(huán)儀(PERKIN ELMER-GeneAmp PCR System2400)中，在94℃保溫2分鐘后，進行25次下述保溫循環(huán)：94℃ 20秒、接著55℃ 30秒、接著72℃ 1.5分鐘，進而在72℃保持7分鐘。

其后，將上述PCR反應液的一部分供給瓊脂糖凝膠電泳。檢測到約1.1kb的DNA條帶。

在剩余的PCR反應液中加入限制酶BamHI和XbaI，對DNA進行雙酶切，純化了酶切過的約1.1kbp的DNA。

(2)本發(fā)明載體的制備

用限制酶BamHI和XbaI對實施例5中所述的重組載體pTrc174進行雙酶切，純化酶切過的DNA。

將所得的DNA和上述(1)中純化的約1.1kbp的DNA混合，用T4 DNA連接酶連接，并用所得的連接液轉化大腸桿菌DH5α。

在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)所得的轉化體，從生長出的菌落中隨機挑選菌落。將挑選的菌落分別接種到含有50μg/ml氨芐青霉素的2ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中于37℃振蕩培養(yǎng)17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各自的培養(yǎng)菌體提取出質粒。用BamHI和XbaI對提取出的各質粒的一部分進行雙酶切后，供給瓊脂糖凝膠電泳。確認在所得的質粒中插入有約1.1kb的DNA。以下將如此得到的質粒記作pTrc174LD(A113G)。

用限制酶BamHI和XbaI對實施例5中所述的重組載體pTrc204進行雙酶切，純化酶切過的DNA。

將所得的DNA和上述(1)中純化的約1.1kbp的DNA混合，用T4 DNA連接酶連接，并用所得的連接液轉化大腸桿菌DH5α。

在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)所得的轉化體，從生長出的菌落中隨機挑選菌落。將挑選的菌落分別接種到含有50μg/ml氨芐青霉素的2ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中于37℃振蕩培養(yǎng)17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各自的培養(yǎng)菌體提取出質粒。用BamHI和XbaI對提取出的各質粒的一部分進行雙酶切后，供給電泳。確認在所得的質粒中插入有約1.1kbp的DNA。以下將如此得到的質粒記作pTrc204LD(A113G)。

用限制酶BamHI和XbaI對實施例5中所述的質粒載體pTrc436進行雙酶切，純化酶切過的DNA。

將所得的DNA和上述(1)中純化的約1.1kbp的DNA混合，用T4 DNA連接酶連接，并用所得的連接液轉化大腸桿菌DH5α。

在含有50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)所得的轉化體，從生長出的菌落中隨機挑選菌落。將挑選的菌落分別接種到含有50μg/ml氨芐青霉素的2ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在試管中于37℃振蕩培養(yǎng)17小時。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen公司制)，從各自的培養(yǎng)菌體提取出質粒。用BamHI和XbaI對提取出的各質粒的一部分進行雙酶切后，供給電泳。確認在所得的質粒中插入有約1.1kbp的DNA。以下將如此得到的質粒記作pTrc436LD(A113G)。

實施例14 (使用本發(fā)明的轉化體的處理物制備L-α-氨基酸化合物)

用實施例13的(2)中所述的質粒pTrc174LD(A113G)轉化大腸桿菌JM109株。將所得的轉化體接種到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨芐青霉素的20ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在30℃振蕩培養(yǎng)15小時。離心分離所得的培養(yǎng)液，得到濕菌體。將約0.1g該濕菌體懸浮到1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎處理20分鐘。將所得的破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到約0.7ml離心上清液。在0.35ml所得的離心上清液中混合：0.02ml用氨水制備成pH9的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(東京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml實施例9中所述的過氧化氫酶純化酶液(3.3g蛋白質/l)、0.05ml實施例11中所述的甲酸脫氫酶純化酶液(5.3g蛋白質/l)、10mg NAD＋和2.5mg甲酸銨，在30℃振蕩22小時。對于該反應液，在下述條件下進行基于液相色譜的含量分析。確認L-甲硫氨酸相對于反應中所用的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的量的收率。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

流動相：將含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合

流速：0.8ml/分鐘

柱溫：37℃

檢測：210nm。

用實施例13的(2)中所述的質粒pTrc204LD(A113G)轉化大腸桿菌JM109株。將所得的轉化體接種到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨芐青霉素的20ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在30℃振蕩培養(yǎng)15小時。離心分離所得的培養(yǎng)液，得到濕菌體。將約0.1g該濕菌體懸浮到1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎處理20分鐘。將所得的破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到約0.7ml離心上清液。在0.35ml所得的離心上清液中混合：0.02ml用氨水制備成pH9的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(東京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml實施例9中所述的過氧化氫酶純化酶液(3.3g蛋白質/l)、0.05ml實施例11中所述的甲酸脫氫酶純化酶液(5.3g蛋白質/l)、10mg NAD＋和2.5mg甲酸銨，在30℃振蕩22小時。對于該反應液，在下述條件下進行基于液相色譜的含量分析。確認L-甲硫氨酸相對于反應中所用的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的量的收率。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

流動相：將含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合

流速：0.8ml/分鐘

柱溫：37℃

檢測：210nm。

用實施例13的(2)中所述的質粒pTrc436LD(A113G)轉化大腸桿菌JM109株。將所得的轉化體接種到含有0.1mM的IPTG和50μg/ml氨芐青霉素的20ml滅菌LB培養(yǎng)基中，在30℃振蕩培養(yǎng)15小時。離心分離所得的培養(yǎng)液，得到濕菌體。將約0.1g該濕菌體懸浮到1ml的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中，使用Multi-Beads Shocker(安井器械公司制)和玻璃珠(0.1mmΦ)在2500rpm破碎處理20分鐘。將所得的破碎液在8000rpm、4℃離心分離10分鐘，得到約0.7ml離心上清液。在0.35ml所得的離心上清液中混合：0.02ml用氨水制備成pH9的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸(東京化成公司制)的40%水溶液、0.05ml實施例9中所述的過氧化氫酶純化酶液(3.3g蛋白質/l)、0.05ml實施例11中所述的甲酸脫氫酶純化酶液(5.3g蛋白質/l)、10mg NAD＋和2.5mg甲酸銨，在30℃振蕩22小時。對于該反應液，在下述條件下進行基于液相色譜的含量分析。確認L-甲硫氨酸相對于反應中所用的2-羥基-4-(甲硫基)丁酸的量的收率。

(含量分析條件)

柱：UNISON UK-C18(4.6mmφ×25cm、3μm)

流動相：將含有50mM磷酸的12mM的1-庚烷磺酸鈉水溶液(A液)和乙腈(B液)以A液(%)：B液(%)＝90：10的比例混合

流速：0.8ml/分鐘

柱溫：37℃

檢測：210nm。

工業(yè)利用性

依據本發(fā)明，可提供氧化酶、編碼該酶的多核苷酸和利用它們的甲硫氨酸等α-氨基酸化合物的制備方法等。

[序列表自由文本]

SEQ ID NO: 9-14

設計用于PCR的寡核苷酸引物

SEQ ID NO: 15-17

編碼氧化酶的多核苷酸

SEQ ID NO: 18-38

設計用于PCR的寡核苷酸引物

SEQ ID NO: 44-45

設計的氨基酸序列。

序列表

<110> SUMITOMO CHEMICAL CO., LTD.

<120> 氧化酶、編碼該酶的多核苷酸、以及它們的應用

<130> S33396WO01

<150> JP2014-143021

<151> 2014-7-11

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 391

<212> PRT

<213> 反硝化無色桿菌（Achromobacter denitrificans）

<400> 1

Met Ser Arg Leu Asp Arg Cys Leu Ser Val Arg Asp Phe Glu Arg Glu

1 5 10 15

Ala Arg Arg Ile Met Pro Arg Cys Val Glu Gly Tyr Val Cys Gly Gly

20 25 30

Thr Glu Asp Gly Ala Ser Leu Ala Glu Ser Val Arg Ala Leu Gly Asp

35 40 45

Val Gly Phe Arg Pro Arg Gly Leu Arg Val Val Asp Gln Arg Asn Ser

50 55 60

Lys Val Glu Leu Tyr Gly Gln Thr Tyr Ala Met Pro Val Gly Phe Ala

65 70 75 80

Pro Thr Gly Phe Ser Ala Ile Val Met His Glu Cys Asp Leu Ala Leu

85 90 95

Ala Gln Ala Ala Gln His Ala Glu Ile Pro Phe Ile Ile Ser Gly Ala

100 105 110

Ser Ser Val Pro Leu Glu Arg Leu Gln Gln Ala Thr Gly Lys Arg Cys

115 120 125

Trp Tyr Gln Ala Tyr Leu Pro Gly Asn Thr Glu Arg Ile Gly Arg Leu

130 135 140

Leu Gly Arg Leu Arg Gln Ala Glu Ile Pro Val Leu Val Val Thr Ile

145 150 155 160

Asp Thr Cys Val Gly Ala Asn Arg Glu Asn Leu Gln Arg Leu Ala Phe

165 170 175

Thr Val Pro Phe Lys Met Ser Ala Ser Val Val Leu Asp Gly Leu Arg

180 185 190

His Pro Arg Trp Ser Leu Asn Val Phe Met Arg Thr Leu Leu Gly Ser

195 200 205

Gly Val Pro Arg Phe Ser Asn Leu Cys Glu Glu Ile Gly Pro Pro Ile

210 215 220

Thr Gln Asp Pro Pro Asn Gly Phe Arg Gly Glu Arg Asp Lys Leu Ser

225 230 235 240

Trp Glu His Ile Arg Trp Ile Arg Glu Asn Trp Pro Gly Lys Leu Val

245 250 255

Leu Lys Gly Val Met His Pro Asp Asp Ala Arg Gln Ala Cys Val Ala

260 265 270

Gly Ala Asp Gly Val Ile Val Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp

275 280 285

Gly Cys Ile Ser Pro Leu Gln Ala Leu Pro Glu Ile Val Ala Ala Val

290 295 300

Pro Pro Gly Phe Pro Val Met Val Asp Gly Gly Phe Arg Arg Gly Ser

305 310 315 320

Asp Val Leu Lys Ala Val Ala Leu Gly Ala Arg Met Val Phe Thr Gly

325 330 335

Arg Pro Gln Leu Phe Gly Ala Ala Val Gly Gly Gln Ala Gly Ile Arg

340 345 350

Lys Val Ala Ala Ile Phe Arg Ser Glu Ile Ser Thr Asp Leu Ala Leu

355 360 365

Leu Gly Cys Ser Ser Leu Ala Asp Val Thr Pro Asp Leu Ile Ala Pro

370 375 380

Ile Arg Pro Ala Ser Pro Ala

385 390

<210> 2

<211> 1173

<212> DNA

<213> 反硝化無色桿菌

<400> 2

atgagccggc tggaccgctg cctgtcggtg cgcgacttcg agcgcgaggc gcggcgcatc 60

atgccgcgct gcgtcgaagg ctacgtctgc ggcggcaccg aggacggcgc ttcgctggcc 120

gagtcggtgc gcgccctggg cgacgtcggg ttccggccgc gggggctgcg cgtagtggac 180

cagcgcaaca gcaaggtcga actctacggc cagacctacg ccatgccggt gggtttcgcg 240

cccaccggat tctccgccat cgtcatgcac gagtgcgacc tggcgctggc gcaggccgcg 300

cagcacgccg agattccgtt catcatcagc ggcgcttcca gcgtgccgct ggaacgcctg 360

cagcaggcca cgggcaagcg ctgctggtac caggcctatc tgccgggcaa caccgaacgc 420

atcggcaggc tgttgggccg cctgcgccag gccgagatcc cggtgctggt ggtcaccatc 480

gacacctgcg taggcgcgaa ccgcgagaac ctgcagcgcc tggccttcac cgtgcctttc 540

aagatgagcg ccagcgtggt actcgacggc ctgcggcatc cgcgctggag cctgaacgtc 600

ttcatgcgca cgctgctggg cagcggcgtg ccgcgcttct cgaatctttg cgaggagatc 660

ggcccgccca tcacgcagga cccacccaac ggctttcgcg gcgaacgcga caagctgtcg 720

tgggagcaca tccgctggat tcgcgagaac tggccgggca agctggtgct caagggcgtg 780

atgcatcccg acgacgcgcg ccaggcctgc gtggccggcg ccgacggcgt catcgtctcc 840

aaccacggcg gccgccagct ggacggctgc atttcgccgc tgcaggcgct gcccgagatc 900

gtggcggcgg tgccgcccgg atttccggtc atggtcgacg gcggattccg ccgcggctcg 960

gacgtgctca aggcggtggc cctgggcgcg cgcatggtgt tcaccggcag gccgcagctt 1020

ttcggggcgg cggtcggcgg ccaggccggc atccgcaagg tggccgcgat tttccgcagc 1080

gaaatctcga ccgacctggc gctgctgggc tgcagcagcc tggccgacgt cacgccggat 1140

ctgatcgcgc cgatacggcc ggccagcccg gca 1173

<210> 3

<211> 386

<212> PRT

<213> 反硝化無色桿菌

<400> 3

Met Asn Ser Lys Lys Leu Leu Ser Ile Gly Asp Tyr Glu Arg Ala Ala

1 5 10 15

Lys Ala Val Leu Pro His Ala Val Phe Gly Tyr Val Asn Gly Gly Thr

20 25 30

Glu Asp Cys Leu Thr Leu Gln Ala Asn Arg Glu Ala Phe Arg Ser Val

35 40 45

Gln Phe Arg Pro Arg Gly Leu Val Gly Val Ala Gln Arg Thr Gln Ala

50 55 60

Val Glu Leu Trp Gly Arg Gln Tyr Arg His Pro Phe Gly Ile Ala Pro

65 70 75 80

Met Gly Met Thr Ala Met Cys Arg His Arg Cys Glu Trp Asp Leu Ala

85 90 95

Lys Ala Ala Ser Glu Ala Lys Ile Pro Phe Val Leu Ser Gly Leu Ser

100 105 110

Thr Leu Ala Met Glu Thr Val Arg Gln Ala Asp Ala Asp Phe Trp Tyr

115 120 125

Gln Gly Tyr Ile Pro Gly Asp Lys Asp Val Ile Glu Pro Leu Leu Arg

130 135 140

Arg Leu Arg Ala Asn Glu Val Asp Val Leu Val Val Thr Ile Asp Thr

145 150 155 160

Pro Val Gly Ala Asn Arg Glu Asn Asn Gln Arg Asn Gly Phe Thr Ile

165 170 175

Pro Phe Lys Phe Ser Gly Gly Leu Leu Trp Asp Gly Leu Arg His Pro

180 185 190

Arg Trp Ser Ala Asn Val Phe Leu Arg Thr Leu Leu Ser Asp Arg Gln

195 200 205

Val Pro Arg Phe Cys Asn Val Val Ala Asp Thr Arg Gly Tyr Arg Ile

210 215 220

Thr Glu Glu Pro Lys Gly Gly Leu Arg Gly Gly Arg Asp Arg Leu Asp

225 230 235 240

Trp Ser His Leu Ala Trp Met Arg Asp Ile Trp Pro Gly Arg Ile Val

245 250 255

Leu Lys Gly Val Ala His Pro Gly Asp Ala Gln Leu Ala Glu Gln Met

260 265 270

Gly Leu Asp Gly Val Ile Val Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp

275 280 285

Gly Ala Gln Gly Ala Leu Asp Ala Leu Pro Glu Val Val Ala Ala Val

290 295 300

Gly Pro Asn Phe Pro Val Met Val Asp Gly Gly Phe Arg Arg Gly Ala

305 310 315 320

Asp Val Leu Lys Ala Ile Ala Leu Gly Ala Arg Met Val Phe Leu Gly

325 330 335

Arg Pro Phe Leu Tyr Gly Ala Ser Val Ala Gly Gln Ala Gly Val Ala

340 345 350

Arg Ile Ile Asp Ile Leu Gly Thr Glu Ile Asp Arg Asn Leu Gly Leu

355 360 365

Leu Gly Cys Arg Asp Leu Ala Glu Leu Gly Ser Asp Phe Ile Val Ser

370 375 380

Arg Pro

385

<210> 4

<211> 1158

<212> DNA

<213> 反硝化無色桿菌

<400> 4

atgaactcaa agaaactctt gtcgataggc gactacgagc gcgcggccaa ggcggtcctg 60

ccgcacgcgg tgttcggcta cgtcaacggc ggcaccgaag actgtctgac gctgcaagcc 120

aaccgcgagg cgttccgttc ggtccagttc cgtccgcgcg gcctggtcgg cgtcgcgcag 180

cgcacgcagg ccgtggaact ctggggaagg caataccggc atcctttcgg gatcgcgccc 240

atgggcatga ccgccatgtg ccgccaccgc tgcgaatggg acctggccaa ggccgcgtca 300

gaggcgaaaa ttccgttcgt gctcagcggc ctttccacgc tggccatgga aaccgtgcgc 360

caggccgatg ccgatttctg gtaccagggc tacatccccg gcgacaagga cgtcatcgaa 420

ccgctgctgc ggcgcctgcg ggccaacgag gtcgacgtgc tggtcgtcac catcgacacg 480

cccgtgggcg cgaaccgcga gaacaaccag cgcaacggct tcaccattcc gttcaagttc 540

agcggcggcc tgctctggga cgggctgcgt catccccgct ggtccgccaa cgtgtttctc 600

cgcaccctgc tttcggaccg gcaggtgccg cgcttctgca acgtggtcgc cgatacgcgc 660

ggctaccgca tcaccgaaga acccaagggc ggcctgcgcg gcggccgcga ccggctggac 720

tggtcgcacc tggcctggat gcgcgacatc tggccgggcc gcatcgtcct caagggcgtc 780

gcccatcccg gcgacgcgca gctggcggaa caaatgggcc tggacggcgt catcgtctcc 840

aaccacggcg gacgccagct cgacggcgcg cagggcgccc tggacgcctt gcccgaggtc 900

gtcgccgcgg tgggcccgaa tttcccggtg atggtcgacg gcggttttcg ccgcggcgcc 960

gacgtcctca aggccatcgc gctgggcgcg cgcatggtgt tcctgggccg cccctttctc 1020

tacggcgcgt ccgtggccgg acaggccggc gtggcgcgca tcatcgacat tttgggaacc 1080

gaaatcgacc gcaacctggg gttgcttggg tgccgcgacc tggcggagct gggaagcgac 1140

ttcatcgtgt cgcgccct 1158

<210> 5

<211> 409

<212> PRT

<213> 反硝化無色桿菌

<400> 5

Met Thr Ser Ile Leu Pro Ser Val Thr Val Pro Gly Ser Ser Pro Ala

1 5 10 15

Glu Ala Ser Arg Pro Leu Pro Arg Ala Leu Gln Arg Met Leu Ser Leu

20 25 30

Asp Asp Phe Glu Ala Ala Ala Arg Arg Arg Leu Pro Arg Pro Ile Phe

35 40 45

Gly Tyr Ile Ala Gly Ala Ala Glu Asp Asn Gln Ser Leu Arg Ser Asn

50 55 60

Arg Glu Ala Phe Gly Arg Tyr Ala Phe Ala Pro Arg Val Leu Val Asp

65 70 75 80

Val Ser Arg Arg Ser Gln Gln Thr Glu Leu Phe Gly Arg Arg Tyr Ala

85 90 95

Ser Pro Phe Gly Ile Ala Pro Met Gly Ile Ser Ala Leu Ser Thr Tyr

100 105 110

Arg Gly Asp Ile Val Leu Ala Arg Ala Ala Arg Glu Gln Gly Ile Pro

115 120 125

Ala Ile Leu Ser Gly Thr Ser Leu Ile Pro Leu Glu Asp Val Ile Arg

130 135 140

Glu Ala Pro Gly Thr Trp Phe Gln Ala Tyr Leu Pro Gly Asp Pro Gln

145 150 155 160

Arg Ile Asp Ala Leu Val Glu Arg Ala Arg Arg Ala Gly Phe Glu Thr

165 170 175

Leu Val Leu Thr Val Asp Ile Pro Val Ser Ala Asn Arg Glu Asn Asn

180 185 190

Val Arg Thr Gly Phe Ser Thr Pro Leu Lys Pro Ser Leu Arg Leu Ala

195 200 205

Trp Asp Gly Val Thr Arg Pro Arg Trp Leu Ala Gly Thr Phe Leu Arg

210 215 220

Thr Leu Leu Lys His Gly Met Pro His Phe Glu Asn Ser Phe Ala Thr

225 230 235 240

Arg Gly Ala Pro Ile Val Ser Ala Ser Val Leu Arg Asp Phe Ser Ala

245 250 255

Arg Asp His Leu Asn Trp Glu His Val Ala Arg Ile Arg Arg Gln Trp

260 265 270

Pro Gly Ala Leu Ile Ile Lys Gly Ile Leu His Pro Gln Asp Ala Ala

275 280 285

Leu Ala Arg Ser His Gly Ala Asp Gly Val Ile Val Ser Asn His Gly

290 295 300

Gly Arg Gln Leu Asp Gly Ala Ile Ser Pro Leu Arg Ala Leu Pro Gly

305 310 315 320

Val Val Ala Ala Ala Gly Asp Met Thr Val Met Met Asp Ser Gly Ile

325 330 335

Arg Arg Gly Ser Asp Val Leu Lys Ala Leu Ala Leu Gly Ala Arg His

340 345 350

Val Phe Val Gly Arg Pro Phe Asn Tyr Ala Ala Ala Val Gly Gly Glu

355 360 365

Ala Gly Val Ala His Ala Ile Gly Leu Leu Arg Ala Glu Ile Asp Arg

370 375 380

Asn Met Ala Met Leu Gly Ile Asn Thr Leu Arg Glu Met Asp Ala Gly

385 390 395 400

Leu Leu Ala Arg Glu Ser Leu Ala Asp

405

<210> 6

<211> 1227

<212> DNA

<213> 反硝化無色桿菌

<400> 6

atgacatcca tccttccgtc cgtcaccgtt cccggcagca gccccgccga ggcctcgcgg 60

ccgctgccgc gcgcgctgca acgcatgctg tcgctggatg atttcgaggc cgccgcgcgc 120

cgccgcctgc cgcgcccgat cttcggctac atcgccggcg cggccgaaga caaccagtcg 180

ctgcgcagca accgcgaggc cttcggccgc tacgcgttcg cgccccgcgt gctggtggac 240

gtgtcgcgcc gcagccagca gaccgaactg ttcggacgcc gctacgcctc gcccttcggc 300

atcgcgccga tgggcatcag cgcgctgtcg acctaccgcg gcgacatcgt gctggcgcgc 360

gccgcccgcg agcaaggcat cccggccatc ctcagcggga cttcgctgat tccgctggaa 420

gacgtgatcc gcgaagcgcc cggcacctgg ttccaggcct atctgccggg cgatccgcag 480

cgcatcgacg cgctggtcga acgcgcgcgc cgcgccggtt tcgaaaccct ggtgctgacg 540

gtggacatcc cggtgtcggc caatcgcgaa aacaacgtgc gcaccggctt ttccacgccg 600

ctcaagccca gcctgcggct ggcctgggac ggcgtcacgc gcccgcgctg gttggccggc 660

acctttctgc gcacgctgct caagcacggc atgccgcatt tcgagaattc cttcgccacg 720

cgcggcgcgc ccatcgtctc ggcctcggtg ctgcgcgact tcagcgcgcg cgaccacctg 780

aactgggaac acgtggcccg catccgccgg caatggcccg gcgcgctgat catcaagggc 840

atcctgcacc cgcaggacgc ggcgctggcc cgcagccacg gcgccgacgg cgtcatcgtc 900

tcgaaccacg gcggccgcca gctcgacggc gcgatctcgc cgctgcgcgc gctgcccggc 960

gtggtcgcgg ccgccggcga catgacggtg atgatggaca gcggcatccg ccgcggcagc 1020

gacgtgctca aggccctggc gctgggcgcg cgccacgtgt tcgtgggccg ccccttcaac 1080

tatgcggcgg cggtcggcgg cgaggccggc gtggcgcacg ccatcggcct gctgcgcgcc 1140

gagatcgacc gcaacatggc catgctggga atcaatacat tgcgcgaaat ggacgcaggc 1200

ctgctggccc gcgagagcct ggcagat 1227

<210> 7

<211> 364

<212> PRT

<213> 球形芽孢桿菌(Bacillus sphaericus)

<400> 7

Met Glu Ile Phe Lys Tyr Met Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val

1 5 10 15

Phe Cys Gln Asp Glu Ala Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His

20 25 30

Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Ala Arg Met Trp Thr Tyr

35 40 45

Ala Thr Glu Glu Asn Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly

50 55 60

Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys

65 70 75 80

Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Phe Lys Asp Lys Asn Glu Glu Met Phe

85 90 95

Arg Ala Leu Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr

100 105 110

Gly Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Thr Asp Met Asp Leu Ile His Glu

115 120 125

Glu Thr Asn Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly

130 135 140

Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala

145 150 155 160

Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Met Leu Glu Gly Arg Thr Ile

165 170 175

Ser Val Gln Gly Leu Gly Asn Val Ala Tyr Lys Leu Cys Glu Tyr Leu

180 185 190

His Asn Glu Gly Ala Lys Leu Val Val Thr Asp Ile Asn Gln Ala Ala

195 200 205

Ile Asp Arg Val Val Asn Asp Phe Gly Ala Thr Ala Val Ala Pro Asp

210 215 220

Glu Ile Tyr Ser Gln Glu Val Asp Ile Phe Ser Pro Cys Ala Leu Gly

225 230 235 240

Ala Ile Leu Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile

245 250 255

Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Gln Asp Ser Arg His Gly Asp Tyr

260 265 270

Leu His Glu Leu Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala

275 280 285

Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Glu

290 295 300

Arg Ala Leu Lys Arg Val Asp Gly Ile Tyr Asp Ser Ile Glu Lys Ile

305 310 315 320

Phe Glu Ile Ser Lys Arg Asp Ser Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asn

325 330 335

Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Arg Val Ala Lys Ser Arg Ser Gln

340 345 350

Phe Leu Lys Asn Glu Lys Asn Ile Leu Asn Gly Arg

355 360

<210> 8

<211> 1095

<212> DNA

<213> 球形芽孢桿菌

<400> 8

atggaaatct tcaagtatat ggaaaagtat gattatgaac aattggtatt ttgccaagac 60

gaagcatctg ggttaaaagc gattatcgct atccatgaca caacacttgg accagcatta 120

ggtggtgctc gtatgtggac ctacgcgaca gaagaaaatg cgattgagga tgcattaaga 180

ttagcacgcg ggatgacata taaaaatgca gctgctggtt taaaccttgg cggtggaaaa 240

acggtcatta ttggggaccc atttaaagat aaaaacgaag aaatgttccg tgctttaggt 300

cgtttcattc aaggattaaa cggtcgctat attaccggtg aagatgttgg tacaaccgta 360

acagatatgg atttaatcca tgaggaaaca aattacgtta caggtatatc gccagcgttt 420

ggttcatcgg gtaatccttc accagtaact gcttatggcg tttatcgtgg catgaaagca 480

gcggcgaaag aagcatttgg tacggatatg ctagaaggtc gtactatatc ggtacaaggg 540

ctaggaaacg tagcttacaa gctttgcgag tatttacata atgaaggtgc aaaacttgta 600

gtaacagata ttaaccaagc ggctattgat cgtgttgtca atgattttgg cgctacagca 660

gttgcacctg atgaaatcta ttcacaagaa gtcgatattt tctcaccgtg tgcacttggc 720

gcaattttaa atgacgaaac gattccgcaa ttaaaagcaa aagttattgc tggttctgct 780

aataaccaac tacaagattc acgacatgga gattatttac acgagctagg cattgtttat 840

gcacctgact atgtcattaa tgcaggtggt gtaataaatg tcgcggacga attatatggc 900

tataatcgtg aacgagcgtt gaaacgtgta gatggtattt acgatagtat tgaaaaaatc 960

tttgaaattt ccaaacgtga tagtattcca acatatgttg cggcaaatcg tttggcagaa 1020

gaacgtattg ctcgtgtagc gaaatcgcgt agtcagttct taaaaaatga aaaaaatatt 1080

ttgaacggcc gttaa 1095

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 9

ccatatgagc cggctggacc gctgcctgtc 30

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 10

ggatccctat gccgggctgg ccggccgtat c 31

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 11

ccatatgaac tcaaagaaac tcttgtcgat ag 32

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 12

ggatccctaa gggcgcgaca cgatgaagtc g 31

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 13

ccatatgaca tccatccttc cgtccgtcac c 31

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 14

ggatccctaa tctgccaggc tctcgcgggc c 31

<210> 15

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 多核苷酸，編碼氧化酶

<400> 15

atgtctcgcc tggaccgctg tctgagcgtt cgcgattttg agcgtgaagc ccgtcgtatt 60

atgccgcgct gcgtagaagg ttatgtgtgt ggtggtacgg aagatggtgc atctctggcg 120

gagtctgtgc gcgcgctggg cgatgtgggc ttccgtccgc gtggcctgcg tgtagtggac 180

cagcgcaatt ccaaagttga gctgtacggt cagacctacg cgatgccggt cggtttcgcg 240

cctactggct tctctgctat cgttatgcac gaatgcgatc tggccctggc ccaggcggca 300

cagcatgcgg aaatcccttt tatcatctcc ggcgcgtcca gcgttccgct ggaacgtctg 360

caacaggcaa ccggcaaacg ctgttggtat caggcgtacc tgccgggcaa caccgaacgc 420

atcggtcgcc tgctgggtcg tctgcgtcag gccgaaatcc cggttctggt agttaccatc 480

gacacttgcg tcggtgctaa ccgcgagaac ctgcaacgcc tggcgttcac cgttccattc 540

aagatgtccg cgagcgtagt tctggacggc ctgcgccacc cgcgttggag cctgaacgta 600

ttcatgcgta ctctgctggg ctctggtgtt ccgcgtttca gcaacctgtg cgaagaaatt 660

ggcccaccaa tcacccagga cccgccaaac ggcttccgtg gcgaacgtga caaactgtct 720

tgggagcaca tccgttggat tcgtgaaaac tggcctggca aactggttct gaaaggcgtg 780

atgcacccag acgatgcgcg tcaggcgtgt gttgcaggtg ctgacggtgt gatcgttagc 840

aatcatggtg gtcgtcagct ggatggctgc atttctccgc tgcaagcact gccggaaatt 900

gtagctgctg tcccgccggg ctttccggtg atggttgatg gcggtttccg tcgtggttcc 960

gatgtcctga aggctgttgc tctgggcgct cgtatggtgt ttacgggtcg tccgcagctg 1020

ttcggtgccg ctgtgggtgg tcaggctggc atccgtaaag tcgcggcaat tttccgttct 1080

gaaatctcta ccgacctggc actgctgggt tgctcctccc tggcagatgt aactccggac 1140

ctgattgcac cgatccgtcc ggccagcccg gcttaa 1176

<210> 16

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 多核苷酸，編碼氧化酶

<400> 16

atgaactcca agaaactgct gtctatcggc gactacgaac gtgccgctaa agccgttctg 60

ccacacgcgg tattcggtta tgtgaacggt ggcaccgaag attgtctgac gctgcaagct 120

aaccgtgaag cattccgtag cgtacaattt cgcccgcgcg gtctggtagg tgtagcgcag 180

cgtactcagg cggtggaact gtggggtcgt cagtaccgtc acccgttcgg tatcgccccg 240

atgggtatga ccgctatgtg ccgtcatcgc tgcgaatggg atctggcaaa agctgcgagc 300

gaagcgaaga tccctttcgt actgtctggt ctgtccaccc tggctatgga aaccgttcgc 360

caggcagatg ccgacttctg gtatcagggc tacattccgg gcgataaaga tgttatcgaa 420

ccgctgctgc gccgtctgcg cgccaacgaa gttgatgttc tggttgtgac tatcgacacc 480

ccggtgggtg ctaaccgcga gaacaaccaa cgcaacggct tcaccatccc gttcaaattc 540

tccggcggtc tgctgtggga tggtctgcgt cacccgcgtt ggtctgcaaa tgtcttcctg 600

cgtactctgc tgagcgaccg tcaggtgcca cgtttttgca acgtagtggc ggacacccgt 660

ggctaccgta tcactgaaga accgaaaggt ggcctgcgtg gtggccgtga tcgcctggat 720

tggtcccacc tggcgtggat gcgcgatatt tggccgggtc gcatcgtcct gaaaggcgtt 780

gcgcaccctg gtgacgcgca gctggctgaa cagatgggcc tggacggtgt gattgtgagc 840

aatcatggcg gtcgtcagct ggatggcgca cagggtgctc tggacgctct gccggaggtt 900

gtcgcggctg ttggtccgaa cttcccggtc atggttgacg gtggctttcg tcgtggcgca 960

gacgttctga aagcaattgc gctgggtgcg cgtatggttt ttctgggtcg cccattcctg 1020

tacggcgcat ctgtggcggg ccaggctggt gtagcacgta tcattgacat tctgggcacg 1080

gagatcgacc gtaacctggg cctgctgggc tgtcgtgacc tggccgagct gggttctgac 1140

tttatcgttt ctcgtccgta a 1161

<210> 17

<211> 1230

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 多核苷酸，編碼氧化酶

<400> 17

atgacctcta ttctgccttc tgttactgtt ccgggttctt ctccggcgga ggcttctcgc 60

ccgctgcctc gtgcactgca acgtatgctg tccctggacg attttgaggc tgctgcacgt 120

cgtcgcctgc cgcgcccgat tttcggttat atcgcaggcg ccgccgaaga taaccagtct 180

ctgcgtagca atcgcgaagc gttcggccgc tacgcattcg ctccgcgtgt actggttgac 240

gtatcccgtc gttctcagca gactgaactg ttcggccgtc gttacgcgag cccgttcggc 300

attgcgccga tgggtatctc tgctctgagc acctaccgtg gcgacatcgt actggctcgt 360

gcggcccgtg aacagggtat cccagctatc ctgtccggta cgtctctgat tccgctggaa 420

gacgtgattc gcgaagcacc gggcacctgg ttccaagcat atctgccggg tgatccacag 480

cgcatcgacg cactggtcga gcgcgcccgt cgtgcgggct tcgagactct ggtgctgacc 540

gttgacatcc cggtctccgc taaccgtgaa aacaacgttc gcaccggctt ctctaccccg 600

ctgaaaccga gcctgcgcct ggcatgggat ggcgtaactc gtccgcgttg gctggcaggt 660

acttttctgc gtaccctgct gaaacatggt atgccgcact tcgaaaactc cttcgcgacc 720

cgtggcgcac cgatcgtgag cgcctccgtg ctgcgtgact ttagcgcacg tgaccacctg 780

aactgggaac acgttgctcg catccgtcgt cagtggccgg gtgcactgat cattaagggt 840

attctgcacc ctcaggatgc cgctctggca cgttctcacg gtgctgatgg cgttatcgtt 900

tccaatcatg gtggccgtca gctggatggc gcgatctctc cactgcgtgc gctgccaggt 960

gttgtggcgg ctgcgggtga tatgaccgtg atgatggaca gcggtatccg tcgcggttct 1020

gatgtcctga aagctctggc gctgggtgcc cgccatgttt tcgtgggtcg cccgtttaac 1080

tacgctgctg cggttggtgg cgaagcgggc gtagcccacg cgatcggtct gctgcgtgcc 1140

gaaattgacc gcaacatggc gatgctgggc atcaacacgc tgcgcgaaat ggatgcgggc 1200

ctgctggcgc gtgaatccct ggctgactaa 1230

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 18

gccatggaaa tcttcaagta tatgg 25

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 19

gggcccgggt taacggccgt tcaaaatatt 30

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于誘變

<400> 20

gtcgctatat taccggtgaa gatgttg 27

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于誘變

<400> 21

caacatcttc accggtaata tagcgac 27

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于誘變

<400> 22

gatagtattc caacctatgt tgcggc 26

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于誘變

<400> 23

gccgcaacat aggttggaat actatc 26

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 24

gggcatatgg aaatcttcaa gtatatgg 28

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 25

ggatccttaa cggccgttca aaatatt 27

<210> 26

<211> 1206

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 多核苷酸，編碼甲酸脫氫酶

<400> 26

atggctaaga tcgtttgcgt tctgtacgat gacccggtta ccggttaccc taaaacttac 60

gcacgcgatg atctgccgaa aatcgaatgc tatccggacg gccagaccct gccgacccca 120

cgtgcgattg acttccagcc gggtgctctg ctgggtagcg tatctggtga actgggtctg 180

cgtaaatacc tggaaagcaa cggccacgaa ctggtcgtta cctcttccaa agacggtgac 240

aattccgtac tggaccgtga actggcagat gcggaaattg ttatcagcca gccgttctgg 300

ccagcgtata tgacggctga acgtatcaag cgcgcgaaaa aactgaaaat gattgtgact 360

gcgggcattg gctccgacca cacggatctg caagcagcga tggaacacgg tatcaccgtg 420

gcagaagtta cttactgcaa ctccaactcc gtggcggaac atgttatgat gaccaccctg 480

gctctggtac gtaactacct gccatcctac cagtgggtac tgaaaggtgg ttggaacatc 540

gcagattgtg ttgaacgttc ttacgatctg gaaggcatgc acgtcggtac tgtagcggcc 600

ggtcgtattg gtctgcgtgt tctgcgcctg atgaaacctt tcggtactca cctgcattat 660

ctggatcgtc accgcctgcc ggaatctgtg gagaaagagc tgaacctgac ccaccacact 720

tctctggagt ccctggcgaa agtgtgcgac gtggttacgc tgaactgccc gctgcacccg 780

gaaaccgaac acatgatcaa cgctgactcc ctgaaacatt ttaaacgcgg tgcgtacctg 840

atcaataccg cccgtggcaa actgtgtgac cgtgatgccg tcgcggcagc cctggaatct 900

ggccaactgg ccggctacgg cggcgacgtt tggtttccgc agccggcacc ggcggatcat 960

ccgtggcgta gcatgccgca ccacggtatg actccgcata ttagcggcac ctctctgtct 1020

gcccagaccc gttacgcggc tggcacccgc gagatcctgg aatgttattt cgagaaccgc 1080

ccgatccgta acgaatatct gatcgtgcag aacggcaagc tggctggtgt cggtgctcac 1140

agctattctg ctggtaacgc aactggcggc agcgaggaag ctgcacgttt caagaaatct 1200

gcttaa 1206

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 27

ccatatgtct cgcctggacc gctgtctgag 30

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 28

ggatccttaa gccgggctgg ccggacgg 28

<210> 29

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 29

ccatatgaac tccaagaaac tgctgtctat c 31

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 30

ggatccttac ggacgagaaa cgataaag 28

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 31

ccatatgacc tctattctgc cttctgttac 30

<210> 32

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 32

actcgaggtc agccagggat tcacgcgcca g 31

<210> 33

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 33

ccatatgagc acgtcagacg atatccataa c 31

<210> 34

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 34

actcgagcag caggtcgaaa cggtcgaggt tc 32

<210> 35

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 35

ccatatggct aagatcgttt gcgttctgta c 31

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 36

actcgagagc agatttcttg aaacgtgcag 30

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 37

cggatccgag gaaacagacc atgg 24

<210> 38

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的寡核苷酸引物，用于PCR

<400> 38

ctcagagtta acggccgttc aaaatatt 28

<210> 39

<211> 364

<212> PRT

<213> 球形芽孢桿菌

<400> 39

Met Glu Ile Phe Lys Tyr Met Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val

1 5 10 15

Phe Cys Gln Asp Glu Ala Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His

20 25 30

Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Ala Arg Met Trp Thr Tyr

35 40 45

Ala Thr Glu Glu Asn Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly

50 55 60

Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys

65 70 75 80

Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Phe Lys Asp Lys Asn Glu Glu Met Phe

85 90 95

Arg Ala Leu Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr

100 105 110

Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Thr Asp Met Asp Leu Ile His Glu

115 120 125

Glu Thr Asn Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly

130 135 140

Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala

145 150 155 160

Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Met Leu Glu Gly Arg Thr Ile

165 170 175

Ser Val Gln Gly Leu Gly Asn Val Ala Tyr Lys Leu Cys Glu Tyr Leu

180 185 190

His Asn Glu Gly Ala Lys Leu Val Val Thr Asp Ile Asn Gln Ala Ala

195 200 205

Ile Asp Arg Val Val Asn Asp Phe Gly Ala Thr Ala Val Ala Pro Asp

210 215 220

Glu Ile Tyr Ser Gln Glu Val Asp Ile Phe Ser Pro Cys Ala Leu Gly

225 230 235 240

Ala Ile Leu Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile

245 250 255

Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Gln Asp Ser Arg His Gly Asp Tyr

260 265 270

Leu His Glu Leu Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala

275 280 285

Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Glu

290 295 300

Arg Ala Leu Lys Arg Val Asp Gly Ile Tyr Asp Ser Ile Glu Lys Ile

305 310 315 320

Phe Glu Ile Ser Lys Arg Asp Ser Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asn

325 330 335

Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Arg Val Ala Lys Ser Arg Ser Gln

340 345 350

Phe Leu Lys Asn Glu Lys Asn Ile Leu Asn Gly Arg

355 360

<210> 40

<211> 1095

<212> DNA

<213> 球形芽孢桿菌

<400> 40

atggaaatct tcaagtatat ggaaaagtat gattatgaac aattggtatt ttgccaagac 60

gaagcatctg ggttaaaagc gattatcgct atccatgaca caacacttgg accagcatta 120

ggtggtgctc gtatgtggac ctacgcgaca gaagaaaatg cgattgagga tgcattaaga 180

ttagcacgcg ggatgacata taaaaatgca gctgctggtt taaaccttgg cggtggaaaa 240

acggtcatta ttggggaccc atttaaagat aaaaacgaag aaatgttccg tgctttaggt 300

cgtttcattc aaggattaaa cggtcgctat attaccgctg aagatgttgg tacaaccgta 360

acagatatgg atttaatcca tgaggaaaca aattacgtta caggtatatc gccagcgttt 420

ggttcatcgg gtaatccttc accagtaact gcttatggcg tttatcgtgg catgaaagca 480

gcggcgaaag aagcatttgg tacggatatg ctagaaggtc gtactatatc ggtacaaggg 540

ctaggaaacg tagcttacaa gctttgcgag tatttacata atgaaggtgc aaaacttgta 600

gtaacagata ttaaccaagc ggctattgat cgtgttgtca atgattttgg cgctacagca 660

gttgcacctg atgaaatcta ttcacaagaa gtcgatattt tctcaccgtg tgcacttggc 720

gcaattttaa atgacgaaac gattccgcaa ttaaaagcaa aagttattgc tggttctgct 780

aataaccaac tacaagattc acgacatgga gattatttac acgagctagg cattgtttat 840

gcacctgact atgtcattaa tgcaggtggt gtaataaatg tcgcggacga attatatggc 900

tataatcgtg aacgagcgtt gaaacgtgta gatggtattt acgatagtat tgaaaaaatc 960

tttgaaattt ccaaacgtga tagtattcca acatatgttg cggcaaatcg tttggcagaa 1020

gaacgtattg ctcgtgtagc gaaatcgcgt agtcagttct taaaaaatga aaaaaatatt 1080

ttgaacggcc gttaa 1095

<210> 41

<211> 726

<212> PRT

<213> 大腸桿菌（Escherichia coli）

<400> 41

Met Ser Thr Ser Asp Asp Ile His Asn Thr Thr Ala Thr Gly Lys Cys

1 5 10 15

Pro Phe His Gln Gly Gly His Asp Gln Ser Ala Gly Ala Gly Thr Thr

20 25 30

Thr Arg Asp Trp Trp Pro Asn Gln Leu Arg Val Asp Leu Leu Asn Gln

35 40 45

His Ser Asn Arg Ser Asn Pro Leu Gly Glu Asp Phe Asp Tyr Arg Lys

50 55 60

Glu Phe Ser Lys Leu Asp Tyr Tyr Gly Leu Lys Lys Asp Leu Lys Ala

65 70 75 80

Leu Leu Thr Glu Ser Gln Pro Trp Trp Pro Ala Asp Trp Gly Ser Tyr

85 90 95

Ala Gly Leu Phe Ile Arg Met Ala Trp His Gly Ala Gly Thr Tyr Arg

100 105 110

Ser Ile Asp Gly Arg Gly Gly Ala Gly Arg Gly Gln Gln Arg Phe Ala

115 120 125

Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp Asn Val Ser Leu Asp Lys Ala Arg Arg

130 135 140

Leu Leu Trp Pro Ile Lys Gln Lys Tyr Gly Gln Lys Ile Ser Trp Ala

145 150 155 160

Asp Leu Phe Ile Leu Ala Gly Asn Val Ala Leu Glu Asn Ser Gly Phe

165 170 175

Arg Thr Phe Gly Phe Gly Ala Gly Arg Glu Asp Val Trp Glu Pro Asp

180 185 190

Leu Asp Val Asn Trp Gly Asp Glu Lys Ala Trp Leu Thr His Arg His

195 200 205

Pro Glu Ala Leu Ala Lys Ala Pro Leu Gly Ala Thr Glu Met Gly Leu

210 215 220

Ile Tyr Val Asn Pro Glu Gly Pro Asp His Ser Gly Glu Pro Leu Ser

225 230 235 240

Ala Ala Ala Ala Ile Arg Ala Thr Phe Gly Asn Met Gly Met Asn Asp

245 250 255

Glu Glu Thr Val Ala Leu Ile Ala Gly Gly His Thr Leu Gly Lys Thr

260 265 270

His Gly Ala Gly Pro Thr Ser Asn Val Gly Pro Asp Pro Glu Ala Ala

275 280 285

Pro Ile Glu Glu Gln Gly Leu Gly Trp Ala Ser Thr Tyr Gly Ser Gly

290 295 300

Val Gly Ala Asp Ala Ile Thr Ser Gly Leu Glu Val Val Trp Thr Gln

305 310 315 320

Thr Pro Thr Gln Trp Ser Asn Tyr Phe Phe Glu Asn Leu Phe Lys Tyr

325 330 335

Glu Trp Val Gln Thr Arg Ser Pro Ala Gly Ala Ile Gln Phe Glu Ala

340 345 350

Val Asp Ala Pro Glu Ile Ile Pro Asp Pro Phe Asp Pro Ser Lys Lys

355 360 365

Arg Lys Pro Thr Met Leu Val Thr Asp Leu Thr Leu Arg Phe Asp Pro

370 375 380

Glu Phe Glu Lys Ile Ser Arg Arg Phe Leu Asn Asp Pro Gln Ala Phe

385 390 395 400

Asn Glu Ala Phe Ala Arg Ala Trp Phe Lys Leu Thr His Arg Asp Met

405 410 415

Gly Pro Lys Ser Arg Tyr Ile Gly Pro Glu Val Pro Lys Glu Asp Leu

420 425 430

Ile Trp Gln Asp Pro Leu Pro Gln Pro Ile Tyr Asn Pro Thr Glu Gln

435 440 445

Asp Ile Ile Asp Leu Lys Phe Ala Ile Ala Asp Ser Gly Leu Ser Val

450 455 460

Ser Glu Leu Val Ser Val Ala Trp Ala Ser Ala Ser Thr Phe Arg Gly

465 470 475 480

Gly Asp Lys Arg Gly Gly Ala Asn Gly Ala Arg Leu Ala Leu Met Pro

485 490 495

Gln Arg Asp Trp Asp Val Asn Ala Ala Ala Val Arg Ala Leu Pro Val

500 505 510

Leu Glu Lys Ile Gln Lys Glu Ser Gly Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ile

515 520 525

Ile Val Leu Ala Gly Val Val Gly Val Glu Lys Ala Ala Ser Ala Ala

530 535 540

Gly Leu Ser Ile His Val Pro Phe Ala Pro Gly Arg Val Asp Ala Arg

545 550 555 560

Gln Asp Gln Thr Asp Ile Glu Met Phe Glu Leu Leu Glu Pro Ile Ala

565 570 575

Asp Gly Phe Arg Asn Tyr Arg Ala Arg Leu Asp Val Ser Thr Thr Glu

580 585 590

Ser Leu Leu Ile Asp Lys Ala Gln Gln Leu Thr Leu Thr Ala Pro Glu

595 600 605

Met Thr Ala Leu Val Gly Gly Met Arg Val Leu Gly Gly Asn Phe Asp

610 615 620

Gly Ser Lys Asn Gly Val Phe Thr Asp Arg Val Gly Val Leu Ser Asn

625 630 635 640

Asp Phe Phe Val Asn Leu Leu Asp Met Arg Tyr Glu Trp Lys Ala Thr

645 650 655

Asp Glu Ser Lys Glu Leu Phe Glu Gly Arg Asp Arg Glu Thr Gly Glu

660 665 670

Val Lys Phe Thr Ala Ser Arg Ala Asp Leu Val Phe Gly Ser Asn Ser

675 680 685

Val Leu Arg Ala Val Ala Glu Val Tyr Ala Ser Ser Asp Ala His Glu

690 695 700

Lys Phe Val Lys Asp Phe Val Ala Ala Trp Val Lys Val Met Asn Leu

705 710 715 720

Asp Arg Phe Asp Leu Leu

725

<210> 42

<211> 2181

<212> DNA

<213> 大腸桿菌

<400> 42

atgagcacgt cagacgatat ccataacacc acagccactg gcaaatgccc gttccatcag 60

ggcggtcacg accagagtgc gggggcgggc acaaccactc gcgactggtg gccaaatcaa 120

cttcgtgttg acctgttaaa ccaacattct aatcgttcta acccactggg tgaggacttt 180

gactaccgca aagaattcag caaattagat tactacggcc tgaaaaaaga tctgaaagcc 240

ctgttgacag aatctcaacc gtggtggcca gccgactggg gcagttacgc cggtctgttt 300

attcgtatgg cctggcacgg cgcggggact taccgttcaa tcgatggacg cggtggcgcg 360

ggtcgtggtc agcaacgttt tgcaccgctg aactcctggc cggataacgt aagcctcgat 420

aaagcgcgtc gcctgttgtg gccaatcaaa cagaaatatg gtcagaaaat ctcctgggcc 480

gacctgttta tcctcgcggg taacgtggcg ctagaaaact ccggcttccg taccttcggt 540

tttggtgccg gtcgtgaaga cgtctgggaa ccggatctgg atgttaactg gggtgatgaa 600

aaagcctggc tgactcaccg tcatccggaa gcgctggcga aagcaccgct gggtgcaacc 660

gagatgggtc tgatttacgt taacccggaa ggcccggatc acagcggcga accgctttct 720

gcggcagcag ctatccgcgc gaccttcggc aacatgggca tgaacgacga agaaaccgtg 780

gcgctgattg cgggtggtca tacgctgggt aaaacccacg gtgccggtcc gacatcaaat 840

gtaggtcctg atccagaagc tgcaccgatt gaagaacaag gtttaggttg ggcgagcact 900

tacggcagcg gcgttggcgc agatgccatt acctctggtc tggaagtagt ctggacccag 960

acgccgaccc agtggagcaa ctatttcttc gagaacctgt tcaagtatga gtgggtacag 1020

acccgcagcc cggctggcgc aatccagttc gaagcggtag acgcaccgga aattatcccg 1080

gatccgtttg atccgtcgaa gaaacgtaaa ccgacaatgc tggtgaccga cctgacgctg 1140

cgttttgatc ctgagttcga gaagatctct cgtcgtttcc tcaacgatcc gcaggcgttc 1200

aacgaagcct ttgcccgtgc ctggttcaaa ctgacgcaca gggatatggg gccgaaatct 1260

cgctacatcg ggccggaagt gccgaaagaa gatctgatct ggcaagatcc gctgccgcag 1320

ccgatctaca acccgaccga gcaggacatt atcgatctga aattcgcgat tgcggattct 1380

ggtctgtctg ttagtgagct ggtatcggtg gcctgggcat ctgcttctac cttccgtggt 1440

ggcgacaaac gcggtggtgc caacggtgcg cgtctggcat taatgccgca gcgcgactgg 1500

gatgtgaacg ccgcagccgt tcgtgctctg cctgttctgg agaaaatcca gaaagagtct 1560

ggtaaagcct cgctggcgga tatcatagtg ctggctggtg tggttggtgt tgagaaagcc 1620

gcaagcgccg caggtttgag cattcatgta ccgtttgcgc cgggtcgcgt tgatgcgcgt 1680

caggatcaga ctgacattga gatgtttgag ctgctggagc caattgctga cggtttccgt 1740

aactatcgcg ctcgtctgga cgtttccacc accgagtcac tgctgatcga caaagcacag 1800

caactgacgc tgaccgcgcc ggaaatgact gcgctggtgg gcggcatgcg tgtactgggt 1860

ggcaacttcg atggcagcaa aaacggcgtc ttcactgacc gcgttggcgt attgagcaat 1920

gacttcttcg tgaacttgct ggatatgcgt tacgagtgga aagcgaccga cgaatcgaaa 1980

gagctgttcg aaggccgtga ccgtgaaacc ggcgaagtga aatttacggc cagccgtgcg 2040

gatctggtgt ttggttctaa ctccgtcctg cgtgcggtgg cggaagttta cgccagtagc 2100

gatgcccacg agaagtttgt taaagacttc gtggcggcat gggtgaaagt gatgaacctc 2160

gaccgtttcg acctgctgta a 2181

<210> 43

<211> 401

<212> PRT

<213> 芽孢桿菌物種（Bacillus sp.）

<400> 43

Met Ala Lys Ile Val Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Thr Gly Tyr

1 5 10 15

Pro Lys Thr Tyr Ala Arg Asp Asp Leu Pro Lys Ile Glu Cys Tyr Pro

20 25 30

Asp Gly Gln Thr Leu Pro Thr Pro Arg Ala Ile Asp Phe Gln Pro Gly

35 40 45

Ala Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu

50 55 60

Glu Ser Asn Gly His Glu Leu Val Val Thr Ser Ser Lys Asp Gly Asp

65 70 75 80

Asn Ser Val Leu Asp Arg Glu Leu Ala Asp Ala Glu Ile Val Ile Ser

85 90 95

Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Met Thr Ala Glu Arg Ile Lys Arg Ala

100 105 110

Lys Lys Leu Lys Met Ile Val Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Thr

115 120 125

Asp Leu Gln Ala Ala Met Glu His Gly Ile Thr Val Ala Glu Val Thr

130 135 140

Tyr Cys Asn Ser Asn Ser Val Ala Glu His Val Met Met Thr Thr Leu

145 150 155 160

Ala Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser Tyr Gln Trp Val Leu Lys Gly

165 170 175

Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Glu Gly

180 185 190

Met His Val Gly Thr Val Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Arg Val Leu

195 200 205

Arg Leu Met Lys Pro Phe Gly Thr His Leu His Tyr Leu Asp Arg His

210 215 220

Arg Leu Pro Glu Ser Val Glu Lys Glu Leu Asn Leu Thr His His Thr

225 230 235 240

Ser Leu Glu Ser Leu Ala Lys Val Cys Asp Val Val Thr Leu Asn Cys

245 250 255

Pro Leu His Pro Glu Thr Glu His Met Ile Asn Ala Asp Ser Leu Lys

260 265 270

His Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Leu Ile Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu

275 280 285

Cys Asp Arg Asp Ala Val Ala Ala Ala Leu Glu Ser Gly Gln Leu Ala

290 295 300

Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Ala Asp His

305 310 315 320

Pro Trp Arg Ser Met Pro His His Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly

325 330 335

Thr Ser Leu Ser Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile

340 345 350

Leu Glu Cys Tyr Phe Glu Asn Arg Pro Ile Arg Asn Glu Tyr Leu Ile

355 360 365

Val Gln Asn Gly Lys Leu Ala Gly Val Gly Ala His Ser Tyr Ser Ala

370 375 380

Gly Asn Ala Thr Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ala Arg Phe Lys Lys Ser

385 390 395 400

Ala

<210> 44

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的氨基酸序列

<400> 44

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His

20

<210> 45

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 設計的氨基酸序列

<400> 45

Leu Glu His His His His His His

1 5