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      低細(xì)胞毒性血管阻斷劑的制作方法

      文檔序號:11106653閱讀:634來源:國知局
      低細(xì)胞毒性血管阻斷劑的制造方法與工藝

      本發(fā)明關(guān)于一種化學(xué)化合物作為血管阻斷劑用于治療的用途。

      【先前技術(shù)】

      功能性血管網(wǎng)絡(luò),它提供了必要的營養(yǎng)和氧氣,以維持整個身體的平衡,扮演對所有組織的發(fā)展、生長、存活、擴建和修復(fù)至關(guān)重要的角色。此外,脈管系統(tǒng)(vasculature)的異常的組成、分布和組合也被發(fā)現(xiàn)與幾種疾病,如癌癥、代謝性疾病和免疫疾病等相關(guān)聯(lián)。因此,靶向脈管系統(tǒng)代表了一個可用于經(jīng)由分子和生物醫(yī)學(xué)技術(shù)和治療藥物開發(fā)的一些臨床應(yīng)用的新疆界。

      脈管靶向劑可分為血管靶向劑(VTA)(例如,抗血管生成劑)和血管阻斷劑(VDA)(Dumontet和Jordan,2010;Hollebecque等人,2012;Lorusso等人,2011)。還有一些目前明確定義在腫瘤科有用的VTA和VDA,以抗有絲分裂劑為代表,如紫杉烷(例如,紫杉醇和多西紫杉醇)和Combretastatin A4(CA4)。然而,這些目前正在開發(fā)的藥物表現(xiàn)出狹窄的療效區(qū)間,需處理高毒性、復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和合成、耐藥性、純化方法和臨床治療副作用的問題。例如,秋水仙素,強效類的癌癥治療藥物之一,由于高毒性和隨之發(fā)生的極窄治療指數(shù),并未表現(xiàn)出作為臨床適用抗癌治療劑的實質(zhì)價值。因此,具有較寬療效區(qū)間的有益和有用新化合物的發(fā)現(xiàn)能改善上述問題。



      技術(shù)實現(xiàn)要素:

      在本發(fā)明的一方面,關(guān)于用于阻斷血流的式(I)化合物、其多晶型、互變異構(gòu)物、鏡像異構(gòu)物、立體異構(gòu)物、溶劑化物或醫(yī)藥上可接受的鹽:

      其中每個R1-R6獨立為R、硝基、亞硝基、氰基、迭氮化物、異硫代硝基、OR、OC(O)R、OC(O)OR、OC(O)NRR'、SO2R、SO3R、SO2NRR'、SR、NRR'、NRSO2NR'R″、NRSO2R'、NRSO3R'、NRC(O)R'、NRC(O)NR'R″、NRC(O)OR'、NRC(N)NR'R″、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR';并且

      其中每個R、R'和R″獨立為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烯基、芳基、雜芳基、環(huán)基或雜環(huán)基。

      如上述化合物,其中每個R1-R6獨立為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烯基、芳基、雜芳基、環(huán)基或雜環(huán)基。

      一或多個上述化合物,其中R為氫、鹵素或甲基。

      一或多個上述化合物,其中R1-R6獨立為氫或鹵素。

      上述的一個或多個化合物,其中所述化合物阻斷至非癌組織細(xì)胞的血流。受益于阻斷血流至非癌組織細(xì)胞的病癥或疾病可以包括動脈瘤、動靜脈畸形、靜脈畸形、淋巴管畸形、血管瘤、局部缺血性視網(wǎng)膜病、糖尿病視網(wǎng)膜病、脈絡(luò)膜新血管形成、濕性老年黃斑部病變和其他相關(guān)的病癥。

      上述的一個或多個化合物,其中所述化合物阻斷至癌組織細(xì)胞的血流。受益于阻斷血流至癌組織細(xì)胞的病癥或疾病可以包括骨癌、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳癌、結(jié)腸直腸癌、內(nèi)分泌癌、胃腸癌、生殖泌尿癌、婦科癌癥、頭頸癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、眼癌、皮膚癌、軟組織肉瘤、泌尿系統(tǒng)癌及其它類型或相關(guān)的病癥。

      在本發(fā)明的另一方面,其關(guān)于用于阻斷血流的醫(yī)藥組合物,包括治療有效量的上述任一化合物及醫(yī)藥可接受載體。

      上述藥物組合物,其中治療有效量的上述任一化合物介于5毫克/公斤和50毫克/公斤間。

      在本發(fā)明的另一方面,其關(guān)于上述任一化合物或上述藥物組合物在制造阻斷血流的藥物中的用途。

      在本發(fā)明的另一方面,其關(guān)于阻斷血流的方法,包括以上述任一化合物或上述藥物組合物接觸細(xì)胞。

      在本發(fā)明的另一方面,其關(guān)于抑制α-微管蛋白聚合的式(I)化合物、其多晶型、互變異構(gòu)物、鏡像異構(gòu)物、立體異構(gòu)物、溶劑化物或醫(yī)藥上可接受的鹽:

      其中每個R1-R6獨立為R、硝基、亞硝基、氰基、迭氮化物、異硫代硝基、OR、OC(O)R、OC(O)OR、OC(O)NRR'、SO2R、SO3R、SO2NRR'、SR、NRR'、NRSO2NR'R″、NRSO2R'、NRSO3R'、NRC(O)R'、NRC(O)NR'R″、NRC(O)OR'、NRC(N)NR'R″、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR';并且

      其中每個R、R'和R″獨立為氫、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烯基、芳基、雜芳基、環(huán)基或雜環(huán)基。

      在本發(fā)明的另一方面,其關(guān)于用于抑制α-微小管蛋白聚合的醫(yī)藥組合物,包括治療有效量的上述任一化合物及醫(yī)藥可接受載體。

      在本發(fā)明的另一方面,其關(guān)于上述任一化合物或上述藥物組合物在制造抑制α-微小管蛋白聚合的藥物中的用途。

      在本發(fā)明的另一方面,其關(guān)于抑制α-微管蛋白聚合的方法,包括以上述任一化合物或上述藥物組合物接觸細(xì)胞。

      在本發(fā)明的另一方面,其關(guān)于抑制類毛細(xì)管狀管形成的式(I)化合物、其多晶型、互變異構(gòu)物、鏡像異構(gòu)物、立體異構(gòu)物、溶劑化物或醫(yī)藥上可接受的鹽:

      其中每個R1-R6獨立為R、硝基、亞硝基、氰基、迭氮化物、異硫代硝基、OR、OC(O)R、OC(O)OR、OC(O)NRR'、SO2R、SO3R、SO2NRR'、SR、NRR'、NRSO2NR'R″、NRSO2R'、NRSO3R'、NRC(O)R'、NRC(O)NR'R″、NRC(O)OR'、NRC(N)NR'R″、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR';并且

      其中每個R、R'和R″獨立為氫、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烯基、芳基、雜芳基、環(huán)基或雜環(huán)基。

      在本發(fā)明的另一方面,其關(guān)于用于抑制類毛細(xì)血管形成的醫(yī)藥組合物,包括治療有效量的上述任一化合物及醫(yī)藥可接受載體。

      在本發(fā)明的另一方面,其關(guān)于上述任一化合物或上述藥物組合物在制造抑制類毛細(xì)血管形成的藥物中的用途。

      在本發(fā)明的另一方面,其關(guān)于抑制類毛細(xì)管狀管形成的方法,包括以上述任一化合物或上述藥物組合物接觸細(xì)胞。

      在本發(fā)明的另一方面,其關(guān)于治療腫瘤或癌癥的式(I)化合物、其多晶型、互變異構(gòu)物、鏡像異構(gòu)物、立體異構(gòu)物、溶劑化物或醫(yī)藥上可接受的鹽,其中腫瘤或癌癥是骨癌、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳癌、結(jié)腸直腸癌、內(nèi)分泌癌、胃腸癌、生殖泌尿癌、婦科癌癥、頭頸癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、眼癌、皮膚癌、軟組織肉瘤、泌尿系統(tǒng)癌及其它類型或相關(guān)的病癥:

      其中每個R1-R6獨立為R、硝基、亞硝基、氰基、迭氮化物、異硫代硝基、OR、OC(O)R、OC(O)OR、OC(O)NRR'、SO2R、SO3R、SO2NRR'、SR、NRR'、NRSO2NR'R″、NRSO2R'、NRSO3R'、NRC(O)R'、NRC(O)NR'R″、NRC(O)OR'、NRC(N)NR'R″、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR';并且

      其中每個R、R'和R″獨立為氫、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烯基、芳基、雜芳基、環(huán)基或雜環(huán)基。

      在本發(fā)明的另一方面,其關(guān)于用于治療腫瘤或癌癥的醫(yī)藥組合物,包括治療有效量的上述任一化合物及醫(yī)藥可接受載體。

      如上述組合物,其中腫瘤或癌癥是胃腸癌。

      如上述組合物,其中腫瘤或癌癥是結(jié)腸直腸癌。

      在本發(fā)明的另一方面,其關(guān)于上述任一化合物或上述藥物組合物在制造治療腫瘤或癌癥的藥物中的用途,其中腫瘤或癌癥是骨癌、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳癌、結(jié)腸直腸癌、內(nèi)分泌癌、胃腸癌、生殖泌尿癌、婦科癌癥、頭頸癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、眼癌、皮膚癌、軟組織肉瘤、泌尿系統(tǒng)癌及其它類型或相關(guān)的病癥。

      在本發(fā)明的另一方面,其關(guān)于治療腫瘤或癌癥的方法,其中腫瘤或癌癥是骨癌、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳癌、結(jié)腸直腸癌、內(nèi)分泌癌、胃腸癌、生殖泌尿癌、婦科癌癥、頭頸癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、眼癌、皮膚癌、軟組織肉瘤、泌尿系統(tǒng)癌及其它類型或相關(guān)的病癥,包括以上述任一化合物或上述醫(yī)藥組合物接觸細(xì)胞。

      【附圖說明】

      在下文中,將參照附圖描述本發(fā)明的一些較佳實施方式。

      圖1a和圖1b顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對五個癌細(xì)胞株增殖的效果;

      圖2顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞增殖的效果;

      圖3a-3d顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS和HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞周期分布的效果;

      圖4顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS和HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞周期分布的另一效果;

      圖5顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS和HUVEC細(xì)胞中α-微小管蛋白的蛋白質(zhì)含量的效果;

      圖6a-6d顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS和HUVEC細(xì)胞中α-微小管蛋白的分布和結(jié)合的效果;

      圖7a-7d顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS和HUVEC細(xì)胞中α-微小管蛋白的分布和結(jié)合的另一效果;

      圖8a和8b顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS和HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)的效果;

      圖9顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對HUVEC細(xì)胞的類毛細(xì)管狀管形成的另一效果;

      圖10a和10b顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對HUVEC細(xì)胞的類毛細(xì)管狀管形成的另一效果;

      圖11顯示SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對COLO 250細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞增殖的效果;

      圖12a和12b顯示SB01和SB01-M2對在體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡效果;

      圖13a和13b顯示SB01和SB01-M2對腫瘤中小血管的效果;

      圖14顯示出SB01、SB01-M1和SB01-M2對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖效果;

      圖15顯示SB01、SB01-M1和SB01-M2對腫瘤血管破壞的效果;和

      圖16顯示SB01、SB01-M1和SB01-M2對在體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡效果。

      【實施方式】

      本發(fā)明是基于一種VDA藥物及其代謝物和試驗的出乎意料發(fā)現(xiàn)的進(jìn)一步研究。為更清楚理解本發(fā)明,提供下列定義:

      此處提及的“烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)基和雜環(huán)基”包括經(jīng)取代和未經(jīng)取代部分?!敖?jīng)取代”這個術(shù)語是指一個或多個取代基(其可以相同或不同),每個取代氫原子。取代基的實例包括,但不限于,鹵素、氰基、硝基、羥基、胺基、氫硫基、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、環(huán)基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、烷基硫烷基、芳硫基、烷胺基、芳胺基、二烷胺基、二芳胺基、烷羰基、芳羰基、雜芳羰基、烷羧基、芳羧基、雜芳羧基、烷氧羰基、芳氧羰基、雜芳氧羰基、烷脲基、芳脲基、雜脲基、芳胺甲酰基、芳胺甲?;?、雜胺甲?;?,其中每個烷基(包括烷)、烯基、芳基、雜芳基、環(huán)基和雜環(huán)基視情況被鹵素、氰基、硝基、羥基、胺基、氫硫基、烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、芳氧基,烷羰基、芳羰基、烷羧基、芳羧基、烷氧羰基或芳氧羰基取代。

      如本文所使用的,術(shù)語“烷基”是指含有1至6個碳原子的直鏈或支鏈烷基。烷基的實例包括甲基、乙基,正丙基、異丙基、叔丁基、和正戊基。類似地,術(shù)語“烯基”或“炔基”是指含有2至6個碳原子的直鏈或支鏈烯基或炔基基團(tuán)。術(shù)語“烷氧基”指的是指-O-烷基基團(tuán)。

      術(shù)語“芳基”是指具有至少一個芳環(huán)的烴環(huán)體系(單環(huán)或雙環(huán))。芳基基團(tuán)的實例包括,但不限于,苯基、萘基和芘基。

      術(shù)語“雜芳基”是指具有至少一個芳香環(huán)的烴環(huán)體系(單環(huán)或雙環(huán)狀),該芳香環(huán)包括至少一個雜原子如氧、氮或硫作為環(huán)體系的一部分,而其余的是碳。雜芳基基團(tuán)的實例包括,但不限于,呋喃基、吡咯基、噻吩基、惡唑基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、喹唑啉基,和吲哚基。

      術(shù)語“環(huán)基”和“雜環(huán)基”是指有4至14個環(huán)原子的部分或完全飽和的單環(huán)或雙環(huán)狀環(huán)體系。雜環(huán)基環(huán)包含一個或多個雜原子(例如,氧、氮或硫)作為環(huán)體系的一部分,其余部分為碳。示例性環(huán)基和雜環(huán)基環(huán)是環(huán)己烷、哌啶、哌嗪、嗎啉、硫代嗎啉、和1,4-氧氮雜環(huán)庚烷。

      如本文所使用的術(shù)語“鹵素”是指氟、氯、溴、和碘。

      如本文所使用的術(shù)語“醫(yī)藥上可接受的鹽”指保留母化合物的所需生物活性并且不賦予不需要毒性作用的鹽。這些鹽的例子是:(a)與無機酸,例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸和類似物所形成的酸加成鹽;以及與有機酸,例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、單寧酸、棕櫚酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸及類似物所形成的鹽;(b)由元素離子如氯、溴、和碘所形成的鹽,和(c)從堿衍生的鹽,諸如銨鹽、堿金屬鹽,如鈉和鉀鹽、堿土金屬鹽諸如鈣鹽和鎂鹽,以及與有機堿如二環(huán)己基胺和N-甲基-D-葡萄糖胺所形成的鹽。

      如本文所使用的,術(shù)語“治療有效量”的化合物的或藥物組合物是指其量足以提供在蒙受增殖疾病,諸如癌癥的動物,較佳為人,期望的治療效果。例如,期望的治療效果可包括,但不限于,腫瘤生長(例如腫瘤生長延遲),腫瘤大小,或轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)、與特定相關(guān)的毒性和副作用的減少,腫瘤壞死或缺氧的增加、腫瘤血管生成的減少、腫瘤再生長的減少,CEP和其它促血管發(fā)生細(xì)胞腫瘤滯留的降低、臨床損傷或癌癥癥狀的改善或最小化、延長受試者的存活時間超過不進(jìn)行該治療所被預(yù)期的存活時間,和在投藥前對無任何腫瘤形成的動物的腫瘤生長預(yù)防,即,預(yù)防性投藥。

      I.化合物

      可描述本發(fā)明化合物為下式(Ⅰ),或其多晶型、互變異構(gòu)物、鏡像異構(gòu)物、立體異構(gòu)物、溶劑化物或醫(yī)藥上可接受的鹽

      其中每個R1-R6獨立為R、硝基、亞硝基、氰基、迭氮化物、異硫代硝基、OR、OC(O)R、OC(O)OR、OC(O)NRR'、SO2R、SO3R、SO2NRR'、SR、NRR'、NRSO2NR'R″、NRSO2R'、NRSO3R'、NRC(O)R'、NRC(O)NR'R″、NRC(O)OR'、NRC(N)NR'R″、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR';并且其中每個R、R'和R″獨立為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烯基、芳基、雜芳基、環(huán)基或雜環(huán)基。

      為了說明而無任何限制,本發(fā)明的代表性的化合物具有式(II)如下:

      其中每個R1-R6獨立為R、硝基、亞硝基、氰基、迭氮化物、異硫代硝基、OR、OC(O)R、OC(O)OR、OC(O)NRR'、SO2R、SO3R、SO2NRR'、SR、NRR'、NRSO2NR'R″、NRSO2R'、NRSO3R'、NRC(O)R'、NRC(O)NR'R″、NRC(O)OR'、NRC(N)NR'R″、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR';并且其中每個R、R'和R″獨立為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烯基、芳基、雜芳基、環(huán)基或雜環(huán)基;當(dāng)R1-R6為氫,例如(6-甲氧基-1H-吲哚-3-基)-(3,4,5-三甲氧基-苯基)-甲酮(″SB01″)。

      另一代表化合物如以下式(III)

      其中每個R1-R6獨立為R、硝基、亞硝基、氰基、迭氮化物、異硫代硝基、OR、OC(O)R、OC(O)OR、OC(O)NRR'、SO2R、SO3R、SO2NRR'、SR、NRR'、NRSO2NR'R″、NRSO2R'、NRSO3R'、NRC(O)R'、NRC(O)NR'R″、NRC(O)OR'、NRC(N)NR'R″、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR';并且其中每個R、R'和R″獨立為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烯基、芳基、雜芳基、環(huán)基或雜環(huán)基;當(dāng)R1-R6為氫,例如(6-羥基-1H-吲哚-3-基)-(3,4,5-三甲氧基-苯基)-甲酮(″SB01-M2″)。

      本發(fā)明化合物可以根據(jù)美國專利7,632,955號揭露的方法和本領(lǐng)域具有通常知識者可得的其他方法來制備。

      本發(fā)明化合物可以與藥物可接受的稀釋劑、賦形劑或載體結(jié)合,以用于本發(fā)明的藥物組合物。

      在本發(fā)明的藥物組合物的制造中,本發(fā)明化合物,包括其醫(yī)藥上可接受的鹽,通常和包括但不限于稀釋劑、賦形劑或載劑的醫(yī)藥可接受載體混合。當(dāng)然,載體必須是在與制劑中的任何其它成分兼容的意義上是可接受的,而且必須對患者無害。所述載體可以是固體或液體,或兩者,并且較佳地與化合物一起配制為單位劑量制劑,例如,錠劑,其可含有重量比0.01或0.5%以上至95%以上或99%的活性化合物。本發(fā)明化合物可經(jīng)實質(zhì)上包括混合各成分,其視情況包含一種或多種輔助成分的任何習(xí)知藥學(xué)技術(shù)與載體混合。

      II.化合物和組合物的用途

      本發(fā)明化合物顯著地顯示某些類型的癌細(xì)胞株和人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的抗增殖作用。這些化合物可用于治療增殖性疾病,如腫瘤或癌癥,包括但不限于骨癌、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳癌、結(jié)腸直腸癌、內(nèi)分泌癌、胃腸癌、生殖泌尿癌、婦科癌癥、頭頸癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、眼癌、皮膚癌、軟組織肉瘤、泌尿系統(tǒng)癌癥,以及其它類型的或相關(guān)的病癥。特別是,本發(fā)明的一些化合物相較于大多數(shù)現(xiàn)有的VDA藥物表現(xiàn)出不可預(yù)期的低細(xì)胞毒性。

      各種被用作抗癌化療藥物的細(xì)胞毒性化合物(例如,紫杉烷和長春花生物堿)已被發(fā)現(xiàn)通過干擾微管細(xì)胞骨架和有絲分裂構(gòu)造也具有過去幾年備受關(guān)注的血管靶向活性。然而,這些目前正在開發(fā)的藥物表現(xiàn)出狹窄的療效區(qū)間,需處理高毒性、復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和合成、抗藥性、純化方法和臨床治療副作用的問題。因此,本發(fā)明具有寬療效區(qū)間的化合物能改善上述問題。

      如此寬的療效區(qū)間顯示作為臨床適用抗癌治療劑的實質(zhì)價值。在毒性控制下,本發(fā)明化合物可獨立使用或與其它抗癌或抗腫瘤劑結(jié)合使用,例如用于治療腫瘤或癌癥受試者的靶向腫瘤或癌細(xì)胞藥劑。

      待治療個體通常是人類個體,盡管本發(fā)明化合物可用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適個體,特別是哺乳動物個體,包括,除了人以外,馬、牛、狗、兔、家禽、羊,和類似動物。如上所述,本發(fā)明提供了在醫(yī)藥可接受載體中包含本發(fā)明化合物的醫(yī)藥組合物,用于口服、直腸、局部、經(jīng)頰、胃腸外、肌內(nèi)、皮內(nèi)、或靜脈內(nèi)和經(jīng)皮施用。本發(fā)明范圍內(nèi)任何特定化合物的治療有效劑量視化合物到化合物,患者到患者而不同,并且將取決于患者的狀況和遞送途徑。

      作為一般建議,約0.1至約100毫克/公斤的劑量將具有治療功效??紤]較高劑量的毒性可限制劑量至較低劑量,如最高至約10毫克/公斤,所有的重量基于活性成分計算,包括使用鹽的情況下。與大多數(shù)現(xiàn)有的VDA藥物不同,本發(fā)明的一些具有低細(xì)胞毒性的化合物的可使用高劑量,如超過25毫克/公斤、超過50毫克/公斤或更高。例如,SB01-M2的劑量可以是25-50毫克/公斤。

      本發(fā)明的化合物或組合物可用于阻斷血流。本發(fā)明的一些化合物,例如SB01-M2可能會關(guān)閉血流而不引起細(xì)胞毒性作用并顯示出寬的治療區(qū)間以作為新的抗癌藥。因此,本發(fā)明的化合物或組合物可以用于阻斷血流至不僅只腫瘤或癌癥組織也可是非癌癥細(xì)胞,如動脈瘤、動靜脈畸形、靜脈畸形、淋巴管畸形、血管瘤、局部缺血性視網(wǎng)膜病、糖尿病視網(wǎng)膜病、脈絡(luò)膜新血管形成、濕性老年黃斑部病變和其他相關(guān)的病癥。

      本發(fā)明的化合物或組合物也用于抑制α-微小管蛋白聚合。

      本發(fā)明的化合物或組合物可以抑制抑制類毛細(xì)管狀管形成。

      在以下非限制性實施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)解釋。

      III.實例

      實例1:SB01和SB01-M2在癌細(xì)胞和HUVEC

      1.1細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞株

      人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人類癌細(xì)胞株從American Type Culture Collection(ATCC,美國,弗吉尼亞州,馬納薩斯)、Bioresource Collection and Research Center(BCRC,食品工業(yè)發(fā)展研究所,臺灣新竹),或Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank(JCRB細(xì)胞庫,生物醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究所,日本)取得。內(nèi)皮細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在補充有低血清生長補充劑(LSGS)(2%胎牛血清;FBS)(Invitrogen,Life Technologies,美國)的Medium 200,作為在37℃下含有5%二氧化碳的潮濕空氣中適合來自大血管的內(nèi)皮細(xì)胞生長在培養(yǎng)環(huán)境中的完整成分。在37℃含有5%二氧化碳的潮濕空氣下含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)屬于頭頸癌的人類口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)細(xì)胞株HSC-3和SAS、人類卵巢腺癌細(xì)胞株SK-OV-3以及人類前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3至預(yù)期的匯合。在37℃含有5%二氧化碳的潮濕空氣下含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)人類胃腺癌細(xì)胞株AGS。SB01(DBPR104,BPROL075)、SB01代謝物M2(SB01-M2,BPROL082)和紫杉醇由杏國新藥股份有限公司(臺灣)提供。Combretastatin A4(CA4)和抗肌動蛋白和α-微小管蛋白購自默克公司(美國)。

      1.2癌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖

      如Hsu,S.C.,Ou,C.C.,Li,J.W.,Chuang,T.C.,Kuo,H.P.,Liu,J.Y.,Chen,C.S.,Lin,S.C.,Su,C.H.,and Kao,M.C.(2008).Ganoderma tsugae extracts inhibit colorectal cancer cell growth via G(2)/M cell cycle arrest.J Ethnopharmacol 120,394-401所述,采用MTT分析進(jìn)行實驗,調(diào)查SB01和SB01-M2對人類腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。

      最初篩選五個癌細(xì)胞株,包括HSC-3、SAS、SK-OV-3、PC-3和AGS,對藥物最敏感的癌細(xì)胞株和內(nèi)皮細(xì)胞一起進(jìn)行進(jìn)一步的研究。如圖1a和圖1b所示,四種化合物:SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4在第72小時未對四種癌細(xì)胞株,包括HSC-3,SAS,SK-OV-3和PC-3,顯示出明顯的抗增殖效果。唯一存在SB01-M2的IC50值可達(dá)60μM作用于SAS癌細(xì)胞。意外地,人類胃腺癌細(xì)胞株AGS是基于初始篩選試驗對藥物最敏感的癌細(xì)胞株,而SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4在72小時IC50值分別約為7.53nM、148.89nM、8.46nM和5.94nM。

      隨后,利用AGS和HUVEC細(xì)胞在24、48和72小時進(jìn)行進(jìn)一步的時間進(jìn)程試驗。如下表1和圖1a和1b所示,4種測試化合物顯示對AGS和HUVEC細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用。SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS在72小時的IC50值分別為7.2nM、921.75nM(約0.9μM)、7.70nM和6.27nM。

      表1.SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS和HUVEC細(xì)胞增殖的效果

      SB01-2作用在AGS在72小時IC50的差異(即,SB01-M2-LD為148.89nM和SB01-M2-HD為921.75nM)可能是由于人為誤差和實驗設(shè)計中濃度的大范圍。對于HUVEC,在72小時4個測試化合物的IC50分別為8.18nM、6145.67nM(約6.1μM)、53.43nM和7.11nM。這些數(shù)據(jù)表示,在4個測試化合物中,SB01-M2對AGS(102-103nM)和HUVEC細(xì)胞的增殖(103-104nM)有較少的抑制作用,代表SB01-M2相較于其它三個化合物具有較低的細(xì)胞毒性。

      1.3癌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期的分布

      如先前Hsu,S.C.,Ou,C.C.,Li,J.W.,Chuang,T.C.,Kuo,H.P.,Liu,J.Y.,Chen,C.S.,Lin,S.C.,Su,C.H.,and Kao,M.C.(2008).Ganoderma tsugae extracts inhibit colorectal cancer cell growth via G(2)/M cell cycle arrest.J Ethnopharmacol 120,394-401中所述,采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行進(jìn)一步實驗測試與SB01和SB01-M2接觸的AGS和HUVEC的細(xì)胞周期分布。

      細(xì)胞經(jīng)72小時的SB01-M2或其它化合物(SB01、紫杉醇和CA4)的IC50劑量作用(由實例1.2獲得)48和72小時。如示于下表2和圖3,在48和72小時四個試驗化合物都明顯有助于AGS和HUVEC細(xì)胞的G2/M期阻滯并影響sub-G1期的誘發(fā)。

      表2 SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4對AGS和HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞分布周期效果

      有趣的是,SB01(66.93±5.49%在48小時和68.56±8.31%在72小時)和SB01-M2(64.32±9.63%在48小時和61.29±7.74%在72小時低劑量,以及71.45±4.22%在48小時和64.33±6.14%在72小時高劑量)作用導(dǎo)致AGS累積在G2/M期停滯伴隨著自G1期的喪失顯著多于紫杉醇(21.71±4.26%在48小時和22.28±2.45%在72小時)和CA4(29.59±10.91%在48小時和20.30±3.64%在72小時)。然而,所有的四個試驗化合物對HUVEC細(xì)胞顯著導(dǎo)致G1、G2/M和sub-G1期的類似效果。此外,如示于圖4,在24小時SB01和高劑量SB01-M2有助于AGS的G2/M期停滯比HUVEC細(xì)胞更明顯。

      1.4微管在腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的組合

      以前述些微調(diào)整的蛋白質(zhì)印跡法(見Ou,C.C.,Hsu,S.C.,Hsieh,Y.H.,Tsou,W.L.,Chuang,T.C.,Liu,J.Y.,and Kao,M.C.2008)對α-微管蛋白(微管的主要組成)蛋白質(zhì)表現(xiàn)進(jìn)行進(jìn)一步的分析。在AGS和HUVEC的微管分布和組合是由免疫熒光法可視化,并使用熒光顯微鏡觀察影像(見Shi,K.,Jiang,Q.,Li,Z.,Shan,L.,Li,F.,An,J.,Yang,Y.,and Xu,C.(2013).Sodium selenite alters microtubule assembly and induces apoptosis in vitro and in vivo.J Hematol On col6,7.)。

      細(xì)胞亦經(jīng)四種測試化合物72小時的IC50劑量作用48和72小時。如圖5,使用蛋白質(zhì)印跡法測試在AGS和HUVEC細(xì)胞中微管蛋白的蛋白含量的影響。

      在統(tǒng)計上四種測試化合物皆未影響AGS細(xì)胞內(nèi)α-微管蛋白含量,經(jīng)SB01、SB01-M2(LD和HD)和CA4作用后相較于以紫杉醇處理在趨勢上差異在于α-微管蛋白含量的變化;后者導(dǎo)致AGS細(xì)胞內(nèi)α-微管蛋白含量以時間依賴的方式增加。

      令人驚訝地,經(jīng)SB01、SB01-M2和CA4作用在HUVEC細(xì)胞顯示α-微管含量在48小時明顯下降,而只有以SB01-M2作用顯著降低α-微管含量直到72小時。此外,為了確定在與SB01和SB01-M2接觸的AGS和HUVEC細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞微管網(wǎng)狀系統(tǒng)的反應(yīng),進(jìn)行α-微管蛋白的免疫染色測定法。如示于圖6a-6d(放大400倍)和圖7a-7d(放大200X倍),未經(jīng)測試化合物處理的AGS和HUVEC細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞微管網(wǎng)狀系統(tǒng)顯示正常排列和組合。然而,經(jīng)SB01和SB01-M2處理48和72小時似乎導(dǎo)致AGS和HUVEC細(xì)胞內(nèi)α-微管蛋白聚合(解聚)的抑制,類似于CA4介導(dǎo)的微管網(wǎng)狀系統(tǒng)的改變。CA4,一個公知的微管結(jié)合劑和VDA,被用作陽性對照以顯示通過在秋水仙素結(jié)合位點結(jié)合的微管解聚。相反地,紫杉醇在48和72小時顯著促成AGS和HUVEC細(xì)胞內(nèi)微管聚合(虛線箭頭)。此外,我們還觀察到與SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4接觸的HUVEC細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)被劇烈地改變。SB01、SB01-M2和CA4從紡錘形、圓形或甚至不規(guī)則形狀改變了HUVEC的細(xì)胞形態(tài)。而較厚細(xì)胞形態(tài)的形成是由于紫杉醇引起的微管聚合,如圖6c和6d、圖7c和7d和圖8。除了細(xì)胞微管網(wǎng)狀系統(tǒng)的改變,四個試驗化合物都似乎致使伴隨產(chǎn)生多個微核和巨細(xì)胞的AGS和HUVEC細(xì)胞內(nèi)有絲分裂災(zāi)變的發(fā)現(xiàn)也引起了更多注意(實線箭頭)(圖6a-6d、7a-7d和8b)。

      1.5內(nèi)皮細(xì)胞的類毛細(xì)管狀管生成

      內(nèi)皮細(xì)胞的類毛細(xì)管狀管形成是血管生成的重要一步。根據(jù)實例1.4獲得的結(jié)果,SB01和SB01-M2處理導(dǎo)致抑制α-微管蛋白聚合,隨后從紡錘形至圓形或甚至不規(guī)則形狀改變內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。四個試驗化合物以IC50在72小時的劑量處理HUVEC6小時,以進(jìn)一步驗證SB01和SB01-M2是否能阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常生理功能。利用類毛細(xì)管狀管形成分析測試SB01-M2對HUVEC自發(fā)類毛細(xì)管狀管形成的影響。如圖9和圖10a和10b,四個試驗化合物皆顯示對類毛細(xì)管狀管形成長度明顯抑制效果,而與其它三個化合物相比只有經(jīng)SB01-M2作用4、6和8小時后顯著抑制HUVEC的管形成數(shù)量。這些結(jié)果也表示SB01-M2可能被用來作為潛在的抗血管生成劑。

      上述實驗顯示,所有化合物(SB01、SB01-M2、紫杉醇和CA4)明顯展現(xiàn)出對AGS和HUVEC細(xì)胞的抗增殖作用,并也促進(jìn)了這兩個細(xì)胞株的G2/M期停滯和細(xì)胞凋亡。四個試驗化合物中,與其它三種化合物比較SB01-M2似乎對AGS和HUVEC細(xì)胞也具有較低的細(xì)胞毒性。

      此外,經(jīng)SB01和SB01-M2作用似乎相對于AGS細(xì)胞更明顯減少HUVEC細(xì)胞內(nèi)α-微管蛋白含量,并且引起α-微管蛋白聚合的抑制,隨后從紡錘形至圓形,甚至不規(guī)則形狀改變HUVEC的細(xì)胞形態(tài)。最明顯的,如同,紫杉醇和CA4的其他化合物,SB01和SB01-M2可能導(dǎo)致伴隨產(chǎn)生AGS和HUVEC的巨細(xì)胞和多微核的有絲分裂災(zāi)變。

      此外,上述數(shù)據(jù)還顯示,SB01和SB01-M2處理導(dǎo)致HUVEC類毛細(xì)管狀管形成中斷,其為血管生成的重要一步。

      總之,關(guān)于SB01-M2,上述實驗表明它對AGS和HUVEC細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活具有較低細(xì)胞毒性但表現(xiàn)出明顯的抗微管活性和有絲分裂災(zāi)變,這可能是有吸引力的機制證明SB01-M2是具血流阻斷能力和較低細(xì)胞毒性作用的新形態(tài)VDA。

      更具體地,與其它良好表征的臨床使用抗有絲分裂劑,如紫杉醇、CA4和甚至SB01比較,SB01-M2對多種人類癌細(xì)胞,包括HSC-3、SAS、SK-OV-3和PC-3(10-100μM和甚至更高),以及內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)(1-10μM)的增殖和存活有較少的抑制作用。甚至在藥物敏感細(xì)胞株(AGS),SB01-M2的IC50在72小時達(dá)0.9μM(102-103nM)高于紫杉醇(7.7nM)和CA4(6.27nM),這表示SB01-M2比其他三個化合物具有較低的細(xì)胞毒性(參見表I、圖1a、1b和2)。盡管低細(xì)胞毒性,SB01-M2的機制仍然顯著造成G2/M細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡(表2,圖3a-3d和4)。盡管直方圖顯示經(jīng)SB01和SB01-M2作用后只有少部分sub-G1期被誘發(fā),這表示它們?nèi)匀辉诘蛲鲂约?xì)胞死亡之前誘發(fā)G2/M期停滯。

      紫杉醇和CA4是已知的微管結(jié)合(抗有絲分裂)劑。紫杉醇屬于紫杉烷,是通過誘發(fā)微管聚合來穩(wěn)定微管的充分表征微管抑制劑。相反地,CA4是已知的微管結(jié)合劑和VDA,它通過在秋水仙素結(jié)合位點結(jié)合至微管會導(dǎo)致微管的解聚。根據(jù)免疫熒光的結(jié)果(圖6a-6d和7a-7d),SB01和SB01-M2作用導(dǎo)致在48和72小時AGS和HUVEC細(xì)胞內(nèi)類似于CA4介導(dǎo)的微管系統(tǒng)改變的α-微管蛋白聚合的抑制(解聚)。像許多以影響微管穩(wěn)定干擾有絲分裂的正常進(jìn)程的抗有絲分裂劑,SB01和SB01-M2引起解聚并導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G2/M期。

      有趣的是,有人指出,SB01是CA4的一種新的合成雜環(huán)類似物,在SB01、SB01-M2和CA4間表現(xiàn)出對α-微管解聚的類似效果。然而,SB01和SB01-M2的結(jié)構(gòu)分析目前尚無法解釋CA4、SB01和SB01-M2之間的相似性。因此,此一發(fā)現(xiàn)是無法預(yù)期的,可能指向影響微管穩(wěn)定的新目標(biāo)。

      此外,如同其他兩個化合物,在上述數(shù)據(jù)中的最重要的發(fā)現(xiàn)是有絲分裂災(zāi)變的產(chǎn)生,這是SB0l和SB01-M2作用后AGS和HUVEC細(xì)胞內(nèi)巨細(xì)胞形成和多微核產(chǎn)生的特性(圖6a-6d、7a-7d和8a、8b)。先前報告還指出,在外部刺激處理后,如輻射后延遲程序性細(xì)胞死亡,內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)有絲分裂災(zāi)變形成。此外,一些文獻(xiàn)還說明誘導(dǎo)抗有絲分裂劑誘發(fā)的有絲分裂阻抑根據(jù)不同濃度的藥物,如紫杉醇,顯示不同機制。SB01和SB01-M2的作用無法預(yù)期地也導(dǎo)致了這結(jié)果。此外,這發(fā)現(xiàn)也可能被用來解釋為什么經(jīng)SB01和SB01-M2作用后AGS和HUVEC細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)少部分的sub-G1期。

      有趣的是,上述數(shù)據(jù)也證實SB01和SB01-M2表現(xiàn)出對HUVEC的類毛細(xì)管狀管形成長度在作用4、6及8小時顯著抑制效果(圖9和10a和10b)。此外,SB01-M2與其他三個化合物相比也顯著抑制管形成數(shù)。這些結(jié)果表明,SB01-M2可能被用作抗血管生成劑。

      總之,本實施例證明,SB01和SB01-M2顯然有助于AGS和HUVEC細(xì)胞的G2/M期停滯和抗微管活性以及有絲分裂災(zāi)變,并進(jìn)一步SB01-M2可能是一個具有較低細(xì)胞毒性的新抗有絲分裂和微管中斷劑。這些發(fā)現(xiàn)提供了一個有吸引力的機制來解釋SB01-M2的發(fā)現(xiàn)作為具阻斷血流能力和較低細(xì)胞毒性作用的新一類VDA。

      實例2:SB01和SB01-M2作用在HUVEC和人類直腸癌細(xì)胞

      2.1細(xì)胞株

      人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人類直腸癌細(xì)胞COLO 205(BCRC60054;ATCC CCL-222 TM)從American Type Culture Collection(ATCC,美國,弗吉尼亞州,馬納薩斯)取得。在37℃下5%二氧化碳的潮濕空氣中,HUVEC和COLO 205分別在補充有為10%小牛血清(FCS)的Medium 200和PRMI 1640常規(guī)培養(yǎng)。

      2.2內(nèi)皮細(xì)胞的增殖

      使用MTS分析進(jìn)行實驗來研究這些化合物活性對抗活化(生長因子補充)和靜態(tài)(生長因子剝奪)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。如表3所示,SB01和紫杉醇顯著抑制活化和靜態(tài)的HUVEC增殖。

      表3:SB01和SBM2對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的效果

      HUVEC經(jīng)SB01、SBM2和紫杉醇作用48小時。利用CellTiter 96 Aqueous One Reagent(Promega)測定這些藥物對活化和靜態(tài)HUVEC增殖的影響。EC50:半最大效應(yīng)濃度

      在48小時用于活化HUVEC的SB01半最大效應(yīng)濃度(EC50)(陽性對照)約為14.86nM。在48小時用于靜態(tài)HUVEC的SB01EC50值約為13.91nM。在此實驗條件下無法偵測用于活化和靜態(tài)HUVEC的SBM2EC50(>1000nM)(見表3)。這些數(shù)據(jù)表明,SBM2可能不抑制人類內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。

      2.3腫瘤脈管系統(tǒng)阻斷

      評估具有取自直腸癌COLO 205細(xì)胞的固體腫瘤的動物,以決定SB01和SB01-M2的腫瘤脈管系統(tǒng)阻斷的效果。以SB01-LD(25毫克/公斤,n=5)、SB01-HD(50毫克/公斤,n=5)、SBM2-LD(25毫克/公斤,n=5)、SBM2-HD(50毫克/公斤,n=5)、CA4(50毫克/公斤,n=5)和對照組(n=5)經(jīng)尾靜脈靜脈注射植入腫瘤小鼠。注射Hoechst 33342染料到尾靜脈并在給藥24小時后犧牲。為觀察小鼠死前的生理形態(tài),測量每只小鼠的腫瘤大小和體重。

      使用H33342Hoechst熒光染料灌注組織學(xué)上測定給藥24小時后腫瘤脈管系統(tǒng)阻斷對這些化合物的反應(yīng)。如圖11,經(jīng)SBM2作用導(dǎo)致具有取自直腸癌COLO 205固體腫瘤的動物的腫瘤脈管系統(tǒng)顯著阻斷。腫瘤切片的Hoechst染料染色定量分析顯示經(jīng)SBM2至25毫克/公斤作用引起約48%的血管阻斷而至50毫克/公斤引起38%的血管阻斷,如圖11。

      評估腫瘤內(nèi)細(xì)胞凋亡程度并發(fā)現(xiàn)SB01和SB01-M2可能改變固體腫瘤微環(huán)境(如,細(xì)胞凋亡程度)。利用原位細(xì)胞凋亡試劑盒,POD(TUNEL,羅氏公司)組織學(xué)上測定給藥24小時后細(xì)胞凋亡對SB01-M2的反應(yīng)。使用NIH Image 1的軟件計算染色核占總核區(qū)域的百分比且每個樣品隨機拍攝6張照片。如示于圖12a和12b,相較于對照組,給予25和50毫克/公斤的SB01(靜脈內(nèi)),50毫克/公斤SBM2(靜脈內(nèi))的COL0205移植瘤內(nèi)的細(xì)胞凋亡百分比分別增加約1.37、1.82、1.22倍。給予25毫克/公斤SBM2(靜脈內(nèi))(0.94倍)和50毫克/公斤CA4(靜脈內(nèi))(0.83倍)的腫瘤中未觀察到細(xì)胞凋亡誘發(fā)作用。

      2.4腫瘤異種移植的小血管數(shù)量

      為特異性確認(rèn)SBM2在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞上的效果,CD31的IHC染色涂布應(yīng)用在腫瘤切片。組織學(xué)影像數(shù)據(jù)由病理學(xué)家進(jìn)行進(jìn)一步分析以指出施用試劑后血流阻塞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。病理學(xué)家認(rèn)為給予SBM2明顯引起血流堵塞。此外,雖然血管結(jié)構(gòu)沒有顯著中斷,內(nèi)皮細(xì)胞排列被中斷(圖13a和13b)。

      固體瘤的增殖和移轉(zhuǎn)依賴由周圍脈管系統(tǒng)的供給營養(yǎng)素和氧氣。因此,它提供靶向支持腫瘤生長脈管的推力。事實上,血管阻斷劑(VDA),如CA4和ZD6126(5),通過靶向建立的腫瘤脈管系統(tǒng)并引起血管的急性和顯著關(guān)閉發(fā)揮它們的影響,最終導(dǎo)致選擇性腫瘤壞死。然而,仍然需要一種用于改善癌癥治療發(fā)現(xiàn)更有效和有用VDA。

      實驗后,本發(fā)明化合物(如,SB01和SBM2)表現(xiàn)出較寬治療區(qū)間。體外篩選測定(MTS測試)被用來確定活化或靜態(tài)生長條件下的內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的不同特性。此外,進(jìn)一步產(chǎn)生具有來自直腸癌COLO 205細(xì)胞固體腫瘤的動物以測量這些化合物在阻斷腫瘤血管的效果。數(shù)據(jù)顯示SBM2在實驗條件下不展現(xiàn)對HUVEC增殖的顯著抑制效果(藥物濃度:0.1-1000nM),這表示低劑量SBM2不具有抗有絲分裂的效果。以組織學(xué)熒光強度來評估VDA對關(guān)閉腫瘤中血流的影響。總之,結(jié)果表明SB01和SB01-M2表現(xiàn)出對腫瘤脈管系統(tǒng)的阻斷效果。此外,也顯現(xiàn),給予SB01和SB01-M2的COLO205-異種移植腫瘤中些微改變了固體腫瘤微環(huán)境,如腫瘤內(nèi)細(xì)胞凋亡程度??偨Y(jié),此實驗指出,SB01和SB01-M2可用作無細(xì)胞毒性作用的血管靶向劑。

      實例3:SB01、SB01-M1和SB01-M2作用在腫瘤脈管系統(tǒng)

      具有如下式(IV)的化合物也是本發(fā)明代表化合物:

      其中每個R1-R6獨立為R、硝基、亞硝基、氰基、迭氮化物、異硫代硝基、OR、OC(O)R、OC(O)OR、OC(O)NRR'、SO2R、SO3R、SO2NRR'、SR、NRR'、NRSO2NR'R″、NRSO2R'、NRSO3R'、NRC(O)R'、NRC(O)NR'R″、NRC(O)OR'、NRC(N)NR'R″、C(O)R、C(O)OR、C(O)NRR';并且其中每個R、R'和R″獨立為氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烯基、芳基、雜芳基、環(huán)基或雜環(huán)基;例如當(dāng)R1及R3-R6為氫,(6-甲氧基-5-羥基-1H-吲哚-3-基)-(3,4,5-三甲氧基-苯基)-甲酮(SB01-M1)。

      3.1細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞株

      人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人類大腸癌細(xì)胞株COLO 205細(xì)胞從American Type Culture Collection(ATCC,美國,弗吉尼亞州,馬納薩斯)取得。在37℃5%二氧化碳的潮濕空氣下分別在補充有10%小牛血清(FCS)的Medium 200和PRMI 1640常規(guī)培養(yǎng)HUVEC和COLO 205。

      3.2化學(xué)試劑和抗體

      SB01、SB01-M1、SB01-M2、紫杉醇、供SB01載劑-1(乙醇/PEG300/SOLUTOL 30/20/50%,體積/體積/體積),和載劑-2(TPGS1000/Transcutol-HP/PEG400 20/20/60%,體積/體積/體積)均取自杏輝藥業(yè)有限公司(臺灣)。Combretastatin A-4(CA4)來自默克公司(美國)。AQueous One Solution Reagent來自Promega公司(美國)。原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是從羅氏公司(瑞士)獲得。H33342Hoechst熒光染料從Invitrogen,Life Technologies公司(美國)購得??笴D31抗體(ab28364)購得自Abcam公司(美國)。

      3.3內(nèi)皮細(xì)胞增殖試驗

      使用如先前所述(4)MTS分析來決定內(nèi)皮細(xì)胞增殖。以0.1至1000nM的濃度范圍使用測試化合物(例如,SB01和紫杉醇)?;罨L條件下,將HUVEC以9000/孔個細(xì)胞的密度接種在于含有2%FCS的Medium 200中的96孔板。為靜態(tài)生長條件下,將HUVEC以15,000/孔個細(xì)胞的密度接種在含有0.5%FCS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Medium 200)中。細(xì)胞粘附到培養(yǎng)板后,加入各種劑量的測試藥物至細(xì)胞,然后將培養(yǎng)物培養(yǎng)48小時。使用根據(jù)制造商的建議含有MTS的CellTiterAQueous One Solution Reagent測定相對細(xì)胞增殖率。最終的溶液通過使用分光亮度計在492nm的波長下測量。

      3.4血管阻斷分析

      如前所述進(jìn)行體內(nèi)血液阻斷實驗(4)。簡言之,將5×106COLO 205細(xì)胞皮下植入到雌性BALB/c裸小鼠(BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu/CrlNarl)后肢側(cè)翼區(qū)域??偣?5只小鼠用于該實驗;當(dāng)COLO 205異種移植腫瘤生長至300立方毫米的平均尺寸植入腫瘤小鼠被經(jīng)由尾靜脈靜脈內(nèi)注射完全溶解于6倍生理鹽水稀釋的載劑-1的SB01(25或50毫克/公斤)、SB01-M1(25或50毫克/公斤)、SB01-M2(5或10毫克/公斤)和CA4(50毫克/公斤)或經(jīng)口強飼(50或100毫克/公斤)的懸浮于載劑-2溶液。給予這些測試化合物二十四小時后,然后將小鼠靜脈注射10毫克/公斤的H33342Hoechst熒光染料(用于血液灌注)。1分鐘后,犧牲小鼠和切除COLO 205異種移植腫瘤供其他組織學(xué)檢查,如H&E染色(用于壞死的測量)、CD31染色(用于內(nèi)皮細(xì)胞檢測)和終端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)染色(用于細(xì)胞凋亡的測量)。免疫染色切片用Scan-Scope(Aperio Technologies)在20倍放大倍率掃描。使用NIH ImageJ(版本1.47)軟件進(jìn)行H33342 Hoechst和TUNEL染色的量化。

      3.5 SB01、SB01-M1和SB01-M2對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

      使用MTS分析檢測SB01、SB01-M1和SB01-M2對活化(生長因子補充)和靜止(生長因子剝奪)人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性。如示于表4和補充圖14中,兩種化合物SB01和顯著抑制活化和靜態(tài)的HUVEC的增殖。

      表4:SB01、SB01-M1和SB01-M2對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的效果

      注記:HUVEC經(jīng)SB01、SBM2和紫杉醇作用48小時。利用CellTiter 96Aqueous One Reagent(Promega)測定這些藥物對活化和靜態(tài)HUVEC增殖的影響。EC50:半最大效應(yīng)濃度

      在48小時活化內(nèi)皮細(xì)胞的SB01半最大效應(yīng)濃度(EC50)約為為14.86nM。對于靜態(tài)HUVEC,在48小時這三種藥物的EC50值分別約為13.91nM和27.59nM。本實驗條件下活化和靜態(tài)HUVEC的SB01-M1和SB01-M2的EC50為不可檢測(>1000nM)。

      3.2 SB01、SB01-M1和SB01-M2的腫瘤脈管系統(tǒng)的阻斷效果

      具有來自直腸癌COLO 205細(xì)胞的固體腫瘤的動物被進(jìn)一步評估以決定SB01、SB01-M1和SB01-M2在阻斷腫瘤脈管系統(tǒng)的功效。

      以SB01-LD(25毫克/公斤,n=5)、SB01-HD(50毫克/公斤,n=5)、SB01-M1-LD(25毫克/公斤,n=5)、SB01-M1-HD(50毫克/公斤,n=5)、SB01-M2-LD(5毫克/公斤,n=5)、SB01-M2-HD(10毫克/公斤,n=5)、CA4(50毫克/公斤,n=5)和對照組(6倍稀釋載劑-1,n=5)經(jīng)尾靜脈靜脈注射五十五只腫瘤植入小鼠。注射Hoechst 33342染料到尾靜脈并在給藥24小時后犧牲。為觀察小鼠死前的生理形態(tài),測量每只小鼠的腫瘤大小和體重結(jié)果示于下表中:

      表5:

      表6:

      表7:

      表8:

      表9:

      表10:

      表11:

      表12:

      表13:

      在實驗過程中,我們發(fā)現(xiàn)了一些組小鼠有較低的運動能力,特別是在給予SB01-HD的組。

      利用H33342 Hoechst熒光染料灌注組織學(xué)測量腫瘤脈管系統(tǒng)阻斷對這些化合物作用24小時后的反應(yīng)。如圖15,經(jīng)SB01、SB01-M1和SB01-M2作用導(dǎo)致在具有來自COLO 205固體腫瘤的動物中顯著的腫瘤脈管系統(tǒng)阻斷。腫瘤切片中的Hoechst染料染色定量分析顯示給予SB01導(dǎo)致大約在25毫克/公斤54%的血管關(guān)閉和在50毫克/公斤73%的血管關(guān)閉。經(jīng)SB01-M1作用在25毫克/公斤導(dǎo)致大約48%的血管關(guān)閉和在50毫克/公斤導(dǎo)致大約38%的血管關(guān)閉。經(jīng)SB01-M2作用分別在5和10毫克/公斤導(dǎo)致大約為0%和34%的腫瘤血管灌注減少。經(jīng)50和100毫克/公斤作用造成腫瘤血管灌注最高至100%的減少。

      評估腫瘤內(nèi)的細(xì)胞凋亡程度(例如,細(xì)胞凋亡程度)以確定經(jīng)SB01、SB01-M1和SB01-M2作用后固體腫瘤微環(huán)境的改變。利用原位細(xì)胞凋亡試劑盒,POD(TUNEL,羅氏公司)在給藥24小時后進(jìn)行組織學(xué)測定細(xì)胞凋亡對這些測試化合物的反應(yīng)。以NIH ImageJ的軟件計算染色核對比總核領(lǐng)域百分比并且每個樣本隨機拍攝6張照片。如圖16,相較于對照組,給予25和500毫克/公斤SB01(靜脈內(nèi))和50毫克/公斤SB01-M1的(靜脈內(nèi))的COLO205移植瘤內(nèi)細(xì)胞凋亡的百分比分別約增加了1.17、1.65和1.11倍。未在經(jīng)25毫克/公斤的SB01-M1(靜脈內(nèi))(0.83×)、5和10毫克/公斤SB01-M2(靜脈內(nèi))(分別為0.64×和0.91)和50毫克/公斤的CA4(靜脈內(nèi))(0.75×)作用的腫瘤中觀察到對細(xì)胞凋亡誘發(fā)作用。

      細(xì)胞增殖和實體瘤的轉(zhuǎn)移依賴于營養(yǎng)素由周圍脈管系統(tǒng)的供給和氧氣。因此,它提供了動力供靶向支持腫瘤生長的脈管系統(tǒng)。事實上,血管阻斷劑(VDA),如CA4和ZD6126(5),通過靶向建立的腫瘤脈管系統(tǒng)和引起血管的急性和顯著關(guān)閉,最終導(dǎo)致選擇性腫瘤壞死發(fā)揮它們的影響。然而,窄的療效區(qū)間局限性限制了它們在癌癥治療的應(yīng)用。測試化合物(例如,SB01、SB01-M1和SB01-M2)在基于活化或靜態(tài)生長條件內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的差異化特性的體外篩選分析(MTS測試)顯示出較寬的療效區(qū)間。此外,進(jìn)一步產(chǎn)生具有來自直腸癌COLO 205細(xì)胞固體瘤的動物以證明這些測試化合物阻斷腫瘤脈管系統(tǒng)顯著效果。

      類似CA4,該實驗表明SB01對于活化的或靜態(tài)的HUVEC無選擇性地顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖(表4和圖14)。此外,該數(shù)據(jù)還表明在我們的實驗條件下這兩種SB01代謝物(SB01-M1和SB01-M2)未顯示對HUVEC的增殖明顯抑制的效果(藥物濃度:0.1-1000nM)。SB01-M1和SB01-M2對活化和靜態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞的EC50是無法檢測的(>1000nM)。連同實例1和2,這兩個SB01代謝物明顯表現(xiàn)出對匯合非增殖的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖選擇性,這是以前未預(yù)期的。

      已從熒光強度進(jìn)行組織學(xué)評估VDA對關(guān)閉腫瘤血流的影響。依據(jù)Hoechst染料染色(圖15),與對照組比較經(jīng)CA4(50毫克/公斤)作用使約70%的血管關(guān)閉。然而,根據(jù)該實驗設(shè)計和在本實施例中的分析方法,實驗結(jié)果是令人驚訝的多。相較于CA4,經(jīng)相同劑量(50毫克/公斤)的SB01作用也導(dǎo)致約70%的血管關(guān)閉和給予25毫克/公斤大約50%保留。雖然SB01-M1和SB01-M2效果較少,其中在高劑量給藥不能阻斷超過50%腫瘤脈管系統(tǒng),10毫克/公斤的SB01-M2可導(dǎo)致約40%的腫瘤血管阻斷效果。

      總之,數(shù)據(jù)顯示,SB01顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖而不具活化或靜止HUVEC的選擇性。給予SB01也導(dǎo)致在COLO 205-異種移植動物中腫瘤脈管系統(tǒng)阻斷。該結(jié)果也顯示SB01-M1和SB01-M2表現(xiàn)出腫瘤脈管系統(tǒng)阻斷作用,而且這兩個SB01代謝物不顯示對HUVEC增殖顯著抑制作用。此外,這也表明固體腫瘤微環(huán)境,如腫瘤內(nèi)細(xì)胞凋亡的程度,在給予SB01和兩個SB01代謝物的COLO 205-異種移植腫瘤中稍有改變??偨Y(jié),這個實例說明SB01、SB01-M1和SB01-M2可用于血管靶向劑而不涉及副作用。

      本發(fā)明的以上具體實施方式為用于說明目的公開并且本發(fā)明并不限于所公開的特定形式或方法。熟知此技術(shù)人員將理解各種調(diào)整、增加和替代是可能的。因此,本發(fā)明將涵蓋落入所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)的所有調(diào)整、等同和替代。

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