本發(fā)明涉及重組革蘭氏陰性細菌菌株及其將異源蛋白遞送到真核細胞中的用途。
背景技術：
：：瞬時轉染技術已經(jīng)在細胞生物學研究中應用多年以解決蛋白質功能。這些方法通常導致被研究的蛋白質大量過度表達，這可能產(chǎn)生過簡化的信號模型[1]。對于控制短壽命信號過程的蛋白質，目標蛋白質存在的時間遠長于它控制的信號事件[2]。甚至，基于dna轉染的瞬時過表達導致異質和不同步的細胞群，這使功能研究和阻礙組學方法復雜化。除此之外，將這些測定擴大到更大規(guī)模是非常昂貴的。以上提到的這些點由現(xiàn)有技術覆蓋，如顯微注射或純化蛋白的蛋白轉染、誘導型轉運策略快速靶向質粒出生的小gtp酶到細胞膜[2]或添加融合ω細胞可滲透細菌毒素的純化蛋白[3]。但是這些技術都很耗時且麻煩，并且根據(jù)我們的知識，沒有一個滿足所有提到的標準。細菌已經(jīng)進化形成不同的機制來直接注射蛋白質到靶細胞[4]。由耶爾森氏菌屬、志賀氏菌屬和沙門氏菌等細菌使用的iii型分泌系統(tǒng)(t3ss)的功能類似于將所謂的細菌效應蛋白注射到宿主細胞中的納米注射器。通過t3ss分泌的細菌蛋白，稱為效應物，含有短的n-末端分泌信號[6]。在細菌內(nèi)，有些效應物被伴侶結合。伴侶可能掩蓋毒性結構域[7]，它們有助于分泌信號的暴露[8，9]，并保持底物在分泌能力的構象[10]，因此促進分泌。在誘導分泌時，鄰近t3ss的atp酶去除伴侶蛋白[11]，并且效應物通過針頭展開或僅部分折疊[10]，并在宿主細胞質中重折疊一次。t3s已經(jīng)被用來將雜交肽和蛋白質遞送到靶細胞中。異源細菌t3ss效應器已經(jīng)被傳遞，以防所研究的細菌難以通過遺傳學獲得(如沙眼衣原體[12])。通常將報告蛋白融合到可能的t3ss分泌信號以研究對t3ss依賴性蛋白遞送的需求，例如百日咳博德特氏菌腺苷酸環(huán)化酶[13]、鼠dhfr[10]或可磷酸化標簽[14]。肽遞送主要以疫苗接種為目的進行。這包括病毒表位[15，16]、細菌表位(李斯特菌溶血素，[17])以及代表人類癌細胞表位的肽[18]。在少數(shù)情況下，如納米抗體[19]、核蛋白(cre重組酶，myod)[20，21]或i110和illra[22]所做的那樣，功能性真核蛋白已被遞送以調(diào)節(jié)宿主細胞。上述系統(tǒng)中沒有一個允許單蛋白遞送，因為在每種情況下一個或多個內(nèi)源效應子蛋白仍然被編碼。此外，使用的載體沒有設計出能簡單克隆編碼所選蛋白質的其它dna片段，阻礙了這種系統(tǒng)的廣泛應用。因此，發(fā)明一種能在生理濃度下目標蛋白質的可擴展的、快速的、同步同質和可調(diào)節(jié)的遞送的廉價和簡單的方法對于許多細胞生物學家是非常有益的。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明一般涉及重組革蘭氏陰性細菌菌株及其用于將異源蛋白質遞送到真核細胞中的用途。本發(fā)明提供革蘭氏陰性細菌菌株及其用途，其允許各種病毒蛋白的iii型效應器，也允許iv型效應器，和最重要的功能性真核蛋白轉運。本發(fā)明提供了用于熒光跟蹤遞送，用于重新定位至細胞核并且特別是用于在遞送至宿主細胞之后去除細菌附屬物的裝置。這允許第一次僅使用t3ss將幾乎天然蛋白質遞送到真核細胞中。所呈現(xiàn)的基于t3ss的系統(tǒng)導致目標蛋白質可擴展、快速、同步同質和可調(diào)節(jié)的遞送。本發(fā)明的遞送系統(tǒng)適合于在活動物中注射真核蛋白質并且可以用于治療目的。在第一方面，本發(fā)明涉及選自耶爾森氏菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬和假單胞菌屬的重組革蘭氏陰性細菌菌株，其中所述革蘭氏陰性細菌菌株用載體轉化，所述載體在5'至3'方向包含：啟動子；編碼來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號的第一dna序列，可操作地連接到所述啟動子上；框內(nèi)融合到所述第一dna序列的3'末端的編碼異源蛋白質的第二dna序列，其中所述異源蛋白質選自參與凋亡或凋亡調(diào)節(jié)的蛋白質。在另一方面，本發(fā)明涉及用載體轉化的重組革蘭氏陰性細菌菌株，其在5'至3'方向包含：啟動子；編碼來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號的第一dna序列，可操作地連接到所述啟動子；與框內(nèi)融合到所述第一dna序列的3'末端的編碼異源蛋白質的第二dna序列；和編碼蛋白酶切割位點的第三dna序列，其中所述第三dna序列位于所述第一dna序列的3'端和所述第二dna序列的5'端之間。在另一方面，本發(fā)明涉及重組革蘭氏陰性細菌菌株，其中所述重組革蘭氏陰性細菌菌株是耶爾森氏菌菌株，并且其中所述耶爾森氏菌菌株是野生型或對于至少一種t3ss效應蛋白的產(chǎn)生是缺陷的，并用載體轉化，所述載體在5'至3'方向：啟動子；可操作地連接到所述啟動子的編碼來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號的第一dna序列，其中來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號包含小腸結腸炎耶爾森氏菌yope效應蛋白的n末端138個氨基酸；以及框內(nèi)融合到所述第一dna序列的3'末端的編碼異源蛋白質的第二dna序列。在另一方面，本發(fā)明涉及重組革蘭氏陰性細菌菌株，其中所述重組革蘭氏陰性細菌菌株是沙門氏菌菌株，并且其中所述沙門氏菌菌株是野生型或對于至少一種t3ss效應蛋白的產(chǎn)生是缺陷的，并用載體轉化，所述載體在5'至3'方向包含：啟動子；可操作地連接到所述啟動子的編碼來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號的第一dna序列，其中來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號包含腸炎沙門氏菌stea效應蛋白或腸炎沙門氏菌sope效應蛋白的n-末端81或105氨基酸；以及框內(nèi)融合到所述第一dna序列的3'末端的編碼異源蛋白質的第二dna序列。在另一方面，本發(fā)明涉及一種載體，其在5'至3'方向包含：啟動子；編碼來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號的第一dna序列，可操作地連接到所述啟動子；框內(nèi)融合到所述第一dna序列的3'末端的編碼異源蛋白質的第二dna序列；編碼蛋白酶切割位點的第三dna序列，其中所述第三dna序列位于所述第一dna序列的3'端和所述第二dna序列的5'端之間。本發(fā)明還涉及將異源蛋白質遞送到真核細胞中的方法，包括以下步驟：i)培養(yǎng)革蘭氏陰性細菌菌株；以及ii)將真核細胞與i)的革蘭氏陰性細菌菌株接觸，其中包含來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號和異源蛋白質的融合蛋白由革蘭氏陰性細菌菌株表達，并且被轉運進入到真核細胞。本發(fā)明還涉及將異源蛋白質遞送到真核細胞中的方法，包括以下步驟：i)培養(yǎng)革蘭氏陰性細菌菌株；ii)使真核細胞與i)的革蘭氏陰性細菌菌株接觸，其中包含來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號和異源蛋白的融合蛋白由革蘭氏陰性細菌菌株表達，并被轉運進入真核細胞；和iii)切割融合蛋白，使得異源蛋白與細菌t3ss效應蛋白的遞送信號切割開來。本發(fā)明還涉及純化異源蛋白質的方法，包括培養(yǎng)革蘭氏陰性細菌菌株，使得包含來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號和異源蛋白質的融合蛋白質被表達并分泌到培養(yǎng)基的上清液中。在另一方面，本發(fā)明涉及革蘭氏陰性細菌菌株的文庫，其中由革蘭氏陰性細菌菌株的表達載體的第二dna序列編碼的異源蛋白質是人或鼠蛋白，并且其中由革蘭氏陰性菌株表達的每個人或鼠的氨基酸序列不同。附圖說明圖1：t3ss蛋白遞送的表征。(a)t3ss依賴性蛋白分泌到周圍介質(體外分泌)(左側)或真核細胞(右側)。i：表示3型分泌系統(tǒng)。ii表示分泌到周圍介質中的蛋白質，iii蛋白通過膜遞送到真核細胞的細胞質中(vii)。vi表示t3ss被插入的兩個細菌膜的拉伸和里面的細菌細胞溶質。iv是連接到y(tǒng)ope1-138n-末端片段(v)的融合蛋白(b)i：腸道沙門氏菌e40野生型的體外分泌，ii：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd或iii：使用抗yope抗體通過免疫印跡法在總細菌裂解物(iv)和沉淀的培養(yǎng)上清液(v)上顯示出小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+pbadsi_2。圖2：t3ss蛋白遞送進入上皮細胞的表征。(a)對用moi為100感染1小時的hela細胞用i：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd或ii：小腸結腸炎耶爾森氏菌△hopemtasd+pbad_si2的抗myc免疫熒光染色。(b)定量來自(a)的hela細胞內(nèi)的抗myc免疫熒光染色強度。從n＝20個位點合并數(shù)據(jù)，指示的誤差條是平均值的標準誤差。i：未感染，ii：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd或iii：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+pbad_si2。y軸表示抗myc染色強度[任意單位]，x軸表示感染時間(min)(c)細胞內(nèi)抗myc免疫熒光染色強度的定量。將hela細胞用在x軸上指示的moi處的腸炎沙門氏菌δhopemtasd+pbad_si2感染1小時。從n＝20個位點合并數(shù)據(jù)，指示的誤差條是平均值的標準誤差。y軸表示抗myc染色強度[a.u.]。圖3：基于t3ss的蛋白質遞送的修飾允許yope1-138融合蛋白(egfp)的核定位。在被以下感染的hela細胞中的egfp信號：i：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd或ii：moi為100的小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasdδyopb攜帶質粒iii：+yope1-138-egfp或iv：+yope1-138-egfp-nls。egfp信號顯示在“a”中，核在“b”中染色用于定位比較。圖4：基于t3ss的蛋白質遞送的修飾允許去除yope1-138附屬物。hela細胞同時用兩種不同的小腸結腸炎耶爾森氏菌菌株感染，這是通過兩種細菌懸浮液的簡單混合而達到的。一個菌株遞送與yope1-138融合的tev蛋白酶，而另一個菌株遞送利用含有雙tev蛋白酶切割位點的接頭與yope1-138融合的目標蛋白質。在蛋白質遞送到真核細胞中后，tev蛋白酶將從目標蛋白質上切割yope1-138附屬物。(a)對未感染的毛地黃皂苷裂解的hela細胞(ii)或用i：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd和iii：+pbadsi_2，iv：+yope1-138-2xtev切割位點-flagink4c，v：+yope1-138-2xtev切割位點-flagink4c，并用純化的tev蛋白酶進一步過夜處理，以及vi：+yope1-138tev切割位點-flag-ink4c和第二菌株+yope1-138-tev進行感染(moi為100)2小時后的毛地黃皂苷裂解的hela細胞采用免疫印跡抗ink4c(以“a”表示)分析yope1-138-2xtev切割位點-flag-ink4c或其裂解形式flag-ink4c的存在。免疫印跡抗肌動蛋白作為加載對照(以“b”表示)。在情況(v)下，裂解的細胞與純化的tev蛋白酶溫育過夜。(b)來自(a)的全長yope1-138-2xtev切割位點-flag-ink4c的抗-ink4c染色強度的肌動蛋白標準化定量(在y軸上顯示為[au])，其中將樣品iv設定為100％。i：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd和iv：+yope1-138-2xtev切割位點flag-ink4c，v：+yope1-138-2xtev切割位點flag-ink4c，并用純化的tev蛋白酶進一步過夜處理，和vi：+yope1-138-2xtev切割位點flag-ink4c和第二菌株+yope1-138-tev。將n＝2個獨立實驗的數(shù)據(jù)合并，誤差條表示平均標準誤差。(c)對未感染(ii)的毛地黃皂苷裂解的hela細胞或用i：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd和iii：+pbadsi_2，iv：+yope1-138-2xtev切割位點-et1-myc，v：+yope1-138-2xtev切割位點-et1-myc，并用純化的tev蛋白酶過夜處理，和vi：+yope1-138-2xtev切割位點-et1-myc和第二菌株+yope1-138-tev進行感染(moi為100)2小時后的毛地黃皂苷裂解的hela細胞通過免疫印跡抗myc分析yope1-138_2xtev切割位點-et1-myc或其切割形式et1-myc的存在(以“a”表示)。作為加載對照，進行抗肌動蛋白的免疫印跡(以“b”表示)。在情況(v)下，裂解的細胞與純化的tev蛋白酶溫育過夜。圖5：將細菌效應蛋白遞送到真核細胞中。(a)將hela細胞用攜帶ii：pbad_si2或iii：yope1-138-sope的i：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd感染，moi為100，時間如圖上所示(2、10或60min)。固定后，對細胞進行肌動蛋白細胞骨架染色(b)。不對hela細胞進行感染(ii)或將hela細胞用攜帶iii：yope1-138-sope-myc的i：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd進行感染1小時(在一些情況下用iv：yope1-138-sptp以在菌株下方所示的moi(moi50；moi50：moi50或moi50：mol100)共感染)。固定后，對細胞進行肌動蛋白細胞骨架染色(以“a”表示)，并且通過染色抗myc跟蹤yope1-138-sope-myc融合蛋白的存在(以“b”表示)。圖6：將細菌效應蛋白遞送到真核細胞中。(a)對未處理的hela細胞或以moi為100用攜帶iii：pbad_si2或iv：yope1-138-ospf的小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd感染75分鐘的hela細胞進行phospho-p38(“a”)、總p38(“b”)和肌動蛋白(“c”)免疫印跡分析。在所示(+表示加入tnfα，-表示未用tnfα處理)感染的最后30分鐘用tnfα刺激細胞。(b)對未處理(ii)的hela細胞或以moi為100用攜帶iii：pbad_si2、iv：yope1-138-sope或v:yope1-138-sopb的i:小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd感染22.5或45分鐘的hela細胞進行phospho-aktt308(“a”)、s473(“b”)和肌動蛋白(“c”)免疫印跡分析。(c)在未處理的hela細胞(i)或以moi為100用v：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+yope1-138-bepa、vi：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+yope1-138-bepae305-e、vii：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+yope1-138-bepgbid或viii小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+pbad_si2感染2.5小時后的hela細胞中的camp水平(在y軸上以fmol/孔表示)。將霍亂毒素(ct)作為陽性對照加入樣品ii(15μg/ml)、iii(25μg/ml)、iv(50μg/ml)。從n＝3個獨立實驗合并數(shù)據(jù)，指示的誤差條是平均值的標準誤差。使用不成對的雙尾t檢驗進行統(tǒng)計分析(ns表示非顯著變化，**表示p<0.01，***表示p<0.001)。圖7：將人tbid遞送到真核細胞中誘導大量凋亡。(a)對未處理的hela細胞或以moi為100用攜帶iii：pbad_si2、iv：yopel-138-bid或v：yope1-138-t-bid的i：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd感染60分鐘后的hela細胞進行裂解的caspase3p17(“a”)和肌動蛋白(“b”)蛋白質印跡分析。在有些情況下，細胞用vi：0.5μm星形孢菌素或vii：1μm星狀孢菌素處理。(b)對未處理的毛地黃皂苷裂解hela細胞或以moi為100用攜帶iii：pbad_si2、iv：yopel-138-bid或v：yope1-138-t-bid的i：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd感染1小時后的毛地黃皂苷裂解hela細胞進行免疫印跡anti-bid(a)分析，允許將內(nèi)源性bid水平(z標記)與轉運的yope1-138-bid(x標記)或yope1-138-t-bid(y標記)水平進行比較。免疫印跡抗肌動蛋白作為加載對照(以“b”表示)。在有些情況下，細胞用vi：0.5μm星形孢菌素或vii：1μm星形孢菌素處理。(c)hela細胞不處理(i)或以moi為100下用ii：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+pbad_si2、iii：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+yope1-138-bid、iv：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+yope1-138-tbid感染。在有些情況下，用v：0.5μm星形孢菌素或vi：1μm星形孢菌素處理細胞。固定后，將細胞進行肌動蛋白細胞骨架染色(灰色)。圖8：斑馬魚的t3ss依賴性遞送bim：誘導斑馬魚胚胎中的凋亡。(a)通過注射約400個細菌進入后腦區(qū)用表達小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+pbad_si1對照菌株(1)或zbim轉位菌株(ii：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+yope1-138-zbim)感染2個dpf斑馬魚胚胎。5.5小時后，將胚胎固定，對活化的caspase3(裂解的caspase3，p17；以“c”表示)染色并分析細菌的存在(egfp信號，以“b”表示)。最大強度z投影以熒光圖像顯示。亮場z投影以“a”表示。(b)記錄的(a)z-堆疊圖像在最大強度z投影上的自動圖像分析。簡要地，通過gfp通道檢測細菌，圍繞細菌斑點的每個區(qū)域產(chǎn)生半徑為10像素的圓，重疊區(qū)域在連接構件之間平均分開。在緊密圍繞細菌的那些區(qū)域中，測量caspase3p17染色強度并在y軸上繪圖(如[a.u.])使用mann-whitney檢驗進行統(tǒng)計分析(***表示p<0.001)。對于小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+pbad_si1對照菌株(i)，采取n＝14數(shù)據(jù)合并或對于ii：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+yope1-138-zb1m感染的動物，采取n＝19數(shù)據(jù)合并，指示的誤差條是標準誤差均值。圖9：tbid依賴性磷酸蛋白體：hela細胞用小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+yope1-138-t-bid以moi為100感染3分鐘，用小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+pbad_si2作為對照。(a)tbid磷酸化蛋白的圖示。含有以tbid依賴性方式(灰色)(q<0.01)顯著調(diào)節(jié)的磷酸肽蛋白以及已知凋亡相關蛋白(深灰色)在已知和預測的蛋白質-蛋白質相互作用的string網(wǎng)絡中列出(高可信度，得分0.7)。在string中至少有一個連接的蛋白質被列出。(b)用小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+pbad_si2(i)或小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+yope1-138-t-bid(ii)感染的hela細胞的共焦圖像顯示在tbid遞送時誘導凋亡表型。細胞用hoechst(“a”)對核染色，用鬼筆環(huán)肽對f-肌動蛋白染色(“b”)、用20抗微管蛋白抗體對微管蛋白染色(“c”)以及用mitotracker對線粒體染色。比例尺表示40μm。圖10：基于iii型分泌物遞送工具箱的描述。(a)用于產(chǎn)生具有yope1-138融合構建體的克隆質粒pbad_si1和pbad_si2的載體圖譜。分子伴侶syce和yope1-138-融合體在天然y腸道凝膠啟動子下。這兩種質粒僅在存在于pbad_si1上的阿拉伯糖誘導型egfp存在時不同。(b)多克隆位點直接在pbad_si1和pbad_si2質粒上的yope1-138片段之后。圖11：t3ss蛋白遞送到各種細胞系中的表征。在swiss3t3成纖維細胞('γ)、jurkat細胞(“b”)和未處理(ii)或用小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+pbad_si2(i)以上面圖像中所示的moi(huvecs的moi25、50、100和200)感染1小時的huvec細胞(“c”)的抗myc免疫熒光染色。圖12：細菌效應蛋白遞送到真核細胞中的t3ss依賴性。用免疫印跡抗myc分析以moi為100用小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasdδyobb+yope1-138-sope-myc(i)或小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasdδyobb+yope1-138-sope-myc(ii)感染上面所示印跡點(0、5、15、10、60和120min)時間后的毛地黃皂苷裂解的hela細胞。對應于yope1-138-sope-myc的大小用“a”標記，而內(nèi)源性c-myc蛋白的大小用“b”標記。圖13和14：t3ss依賴性分泌各種其他蛋白質到培養(yǎng)物上清液中。體外分泌實驗1：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasdδyobb+yope1-138融合到所示蛋白質。使用抗yope11au抗體通過免疫印跡分析總細菌裂解物(“a”)和沉淀的培養(yǎng)上清液(“b”)的蛋白質含量。數(shù)字表示在相應高度的分子量(kda)。圖15a至m：用于本研究的小腸結腸炎耶爾森氏菌和腸道沙門氏菌菌株。本研究中使用的小腸結腸炎耶爾森氏菌和腸道沙門氏菌菌株列表提供了編碼在相應質粒上針對t3ss依賴性遞送的背景菌株、質粒和蛋白質的信息。此外，提供了關于用于構建相應質粒、主鏈質粒和抗生素抗性的寡核苷酸的信息。圖16：將鼠tbid、鼠bidbh3和鼠baxbh3遞送到b16f10細胞中誘導大量凋亡。b16f10細胞未感染(i)或用小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd和ii：+pbadsi_2、iii：+yope1-138-小腸結腸炎耶爾森氏菌密碼子優(yōu)化的鼠tbid、iv：+yope1-138-小腸結腸炎耶爾森氏菌密碼子優(yōu)化的鼠bidbh3或v：+yopel-138-小腸結腸炎耶爾森氏菌密碼子優(yōu)化的鼠baxbh3感染2.5小時后(moi為50)。固定后，對細胞進行肌動蛋白細胞骨架和細胞核染色(兩者均為灰色)。圖17：將鼠tbid、鼠bidbh3和鼠baxbh3遞送到d2a1細胞中誘導大量凋亡。d2a1細胞未感染(i)或用小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd和ii：+pbadsi_2、iii：+yope1-138-小腸結腸炎耶爾森氏菌密碼子優(yōu)化的鼠tbid、iv：+yope1-138-小腸結腸炎耶爾森氏菌密碼子優(yōu)化的鼠bidbh3或v：+yopel-138-小腸結腸炎耶爾森氏菌密碼子優(yōu)化的鼠baxbh3感染2.5小時后(moi為50)。固定后，對細胞進行肌動蛋白細胞骨架和細胞核染色(兩者均為灰色)。圖18：將鼠tbid、鼠bh3和鼠baxbh3遞送到hela細胞中誘導大量凋亡。hela細胞未感染(i)或用小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd和ii：+pbadsi_2、iii：+yope1-138-小腸結腸炎耶爾森氏菌密碼子優(yōu)化的鼠tbid、iv：+yope1-138-小腸結腸炎耶爾森氏菌密碼子優(yōu)化的鼠bidbh3或v：+yopel-138-小腸結腸炎耶爾森氏菌密碼子優(yōu)化的鼠baxbh3感染2.5小時后(moi為50)。固定后，對細胞進行肌動蛋白細胞骨架和細胞核染色(兩者均為灰色)。圖19：將鼠tbid、鼠bidbh3和鼠baxbh3遞送到4t1細胞中誘導大量凋亡。4t1細胞未感染(1)或用小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd和ii：+pbadsi_2、iii：+yope1-138-小腸結腸炎耶爾森氏菌密碼子優(yōu)化的鼠tbid、iv：+yope1-138-小腸結腸炎耶爾森氏菌密碼子優(yōu)化的鼠bidbh3或v：+yopel-138-小腸結腸炎耶爾森氏菌密碼子優(yōu)化的鼠baxbh3感染2.5小時后(moi為50)。固定后，對細胞進行肌動蛋白細胞骨架和細胞核染色(兩者均為灰色)。圖20：在spi-1t3ss誘導條件下生長的腸桿菌向真核細胞遞送鼠tbid誘導凋亡。對未處理(i)和或用iii：攜帶iv：stea1-20-t-bid、v：steafl-bid、vi：sope1-81-t-bid或vii：sope1-105-t-bid，moi為100時用腸道沙門氏菌感染4小時的hela細胞進行裂解caspase3p17免疫印跡分析.對于該實驗，所有腸道沙門氏菌aroa菌株在spi-1t3ss誘導條件下生長。在有些情況下，用ii：1μm星形孢菌素處理細胞。數(shù)字表示在相應高度的分子量(kda)。圖21：在spi-2t3ss誘導條件下生長的腸桿菌向真核細胞遞送鼠tbid誘導凋亡。對未處理(i)和或用iii：攜帶iv：stea1-20-t-bid、v：steafl-bid、vi：sope1-81-t-bid或vii：sope1-105-t-bid，moi為100時用腸道沙門氏菌感染4小時的hela細胞進行裂解caspase3p17免疫印跡分析.對于該實驗，所有腸道沙門氏菌aroa菌株在spi-2t3ss誘導條件下生長。在有些情況下，用ii：1μm星形孢菌素處理細胞。數(shù)字表示在相應高度的分子量(kda)。圖22：腸炎沙門氏菌t3ss依賴性分泌各種細胞周期蛋白到培養(yǎng)上清液中。腸炎沙門氏菌aroa+與如下所列的蛋白質融合的steafl(i、iii、v、vii)或sope1-105(ii、iv、vi、viii)的體外分泌實驗i和ii：ink4amychis；iii和iv：ink4c-mychis；v和vi：mad2-mychis；vii和viii：cdk1-mychis。使用抗myc抗體通過免疫印跡分析沉淀的培養(yǎng)上清液(“a”)和總細菌素(“b”)的蛋白質含量。數(shù)字表示在相應高度的分子量(kda)。圖23：各種已知細胞周期干擾肽t3ss依賴性分泌到培養(yǎng)上清液中。小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+pbad_si2的體外分泌實驗。ii-vii：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+yope1-138，融合到下面所列的肽上：ii：ink4a84-103；iii：p107/rbl1657-662；iv：p21141-160d149a；v：p21145-160d149a；vi：p2117-33；vii：細胞周期蛋白d2139-147。使用抗yope抗體通過免疫印跡分析沉淀的培養(yǎng)基上清液(“a”)和總細菌裂解物(“b”)的蛋白質含量。數(shù)字表示在相應高度的分子量(kda)。圖24：t3ss遞送的蛋白質與泛素的融合允許去除yope1-138附屬物。將hela細胞用遞送目標蛋白菌株感染，其中目標蛋白用一個直接融合的泛素(yope1-138-ubi)融合到y(tǒng)ope1-138。在蛋白質遞送到真核細胞中后，內(nèi)源性泛素特異性蛋白酶將從目標蛋白質切割yope1-138-ubi附屬物。在未感染(ii)或用ii：小腸結腸炎耶爾森氏菌δhopemtasd+yope1-138-標志ink4c-mychis或iii：+yope1-138-flag-ubiquitin-1，感染1小時(moi為100)后通過免疫印跡抗ink4c分析iv：yope1-138-flag-ubiquitin-ink4c-mychis或v：yope1-138-flag-ink4c-mychis，裂解形式vi：ink4c-mychis和vii：內(nèi)源性ink4c的存在。具體實施方式本發(fā)明提供了重組革蘭氏陰性細菌菌株及其用于將異源蛋白質遞送到真核細胞中的用途。出于解釋本說明書的目的，將應用以下定義，并且在適當時，以單數(shù)使用的術語也將包括復數(shù)，反之亦然。應當理解，本文所使用的術語僅用于描述特定實施例目的，而不是限制性的。本文所用的術語“革蘭氏陰性細菌菌株”包括以下細菌：殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、厭氧粘細菌、支氣管炎博德特氏菌、支氣管炎博德特氏菌、副百日咳桿菌、百日咳桿菌、大豆慢生根瘤菌、伯克霍爾德新洋蔥伯克霍爾德桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌、鼻疽桿菌、沙眼衣原體肺炎、沙眼衣原體、流產(chǎn)衣原體、衣原體肺炎、紫色桿菌、枸櫞酸桿菌嚙齒類、普通脫硫弧菌、愛德華氏菌、endozoicomonaselysicola、梨火疫病菌、阿爾伯蒂埃希氏桿菌、大腸桿菌、細胞內(nèi)勞森菌、根瘤菌、黃色粘球菌、成團泛菌、美人魚發(fā)光桿菌、發(fā)光桿菌、photorabdustemperate、海綿假交替單胞菌、綠膿桿菌、變形假單胞菌、丁香假單胞菌、青枯雷爾氏菌、根瘤菌、沙門氏桿菌和其他沙門菌，志賀氏菌和其他志賀氏菌、sodalisglossinidius、溶藻弧菌、vibrioazureus、坎氏弧菌，vibriocaribbenthicus、哈維氏弧菌、副溶血性弧菌、vibriotasmaniensis、vibriotubiashii、地毯草黃單胞菌、野油菜黃單胞菌、白葉枯病菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、耶爾森氏菌、假結核菌。本發(fā)明優(yōu)選的革蘭氏陰性細菌菌是腸桿菌科和假單胞菌科包含的革蘭氏陰性細菌菌株。本發(fā)明的革蘭氏陰性細菌菌株通常被用于由細菌t3ss遞送異源蛋白質到體外和體內(nèi)的真核細胞。本文使用的術語“重組革蘭氏陰性細菌菌株”是指用載體遺傳轉化的革蘭氏陰性細菌菌株。本發(fā)明的有用載體是例如表達載體，用于染色體或毒力質粒插入的載體或用于染色體或毒力質粒插入的dna片段。術語“對產(chǎn)生生長必需氨基酸缺陷的革蘭氏陰性細菌菌株”和“營養(yǎng)缺陷型突變體”在本文中可互換使用，指在不存在至少一種外源提供的必需氨基酸或其前體的情況下不能生長的革蘭氏陰性細菌菌株。所述菌株缺陷產(chǎn)生的氨基酸是例如天冬氨酸，內(nèi)消旋-2,6-二氨基庚二酸，芳香族氨基酸或亮氨酸-精氨酸[23]。這種應變可以通過例如缺失天冬氨酸-β-半醛脫氫酶基因(δasd)。這樣的營養(yǎng)缺陷突變體不能在不存在外源性內(nèi)消旋-2,6-二氨基庚二酸的情況下生長[24]。突變，例如缺失天冬氨酸-β-半醛脫氫酶基因，優(yōu)選用于本發(fā)明的對產(chǎn)生生長必需的氨基酸缺陷的革蘭氏陰性細菌菌株。術語“對產(chǎn)生結合真核細胞表面或細胞外基質的粘附蛋白缺陷的革蘭氏陰性細菌菌株”是指與由相應野生型表達的粘附蛋白相比不表達至少一種粘附蛋白的突變革蘭氏陰性菌株型。粘附蛋白可以包括例如擴展的聚合物粘附分子如菌毛或非菌毛粘附素。菌毛粘附素包括1型菌毛(例如具有fimh粘附素的大腸桿菌菌毛)、p型菌毛(例如具有來自大腸桿菌的papg粘附素的pap-菌毛)、4型菌毛(例如來自銅綠假單胞菌的菌毛)或curli(csg蛋白與來自腸炎沙門氏菌的csga粘附素)。非菌毛粘附包括三聚體自轉運粘附素，例如來自小腸結腸炎耶爾森氏菌yada、bpaa(假單胞菌)、hia(流感嗜血桿菌)、bada(b.nselae)、nada(腦膜炎奈瑟氏球菌)或uspa1以及其它自轉運粘附素如aida-1(大腸桿菌)以及其他粘附素/侵襲素如來自小腸結腸炎耶爾森氏菌或intimin(大腸桿菌)的inva或dr-家族或afa-家族的成員(大腸桿菌)。本文所用的術語yada和inva是指來自小腸結腸炎耶爾森氏菌的蛋白質。自體轉運蛋白yada[25，26]結合不同的膠原蛋白以及纖連蛋白，而侵襲素inva[27-29]結合到真核細胞膜中的β-整合素。如果革蘭氏陰性細菌菌株是小腸結腸炎耶爾森氏菌菌株，那么該菌株優(yōu)選是inva和/或yada缺陷的。如本文所用，術語“腸桿菌科家族”包括在土壤、水、植物和動物中發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陰性、桿狀、兼性厭氧細菌家族，其經(jīng)常如脊椎動物中的病原體發(fā)生。該家族的細菌共享相似的生理學并且證明在相應基因組的功能元件和基因內(nèi)的保守性。除氧化酶陰性外，該家族的所有成員都是葡萄糖發(fā)酵，大多數(shù)是硝酸鹽還原劑。本發(fā)明的腸桿菌科細菌可以是來自該家族的任何細菌，具體包括但不限于以下屬的細菌：埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、愛德華氏菌屬、沙門氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、沙雷氏菌屬、變形桿菌屬、摩根(氏)菌屬、普羅威登斯菌屬或耶爾森氏鼠疫桿菌屬。在更具體的實施方案中，細菌是大腸桿菌、大腸桿菌、弗氏桿菌、埃氏腸桿菌、埃希氏菌、腸炎沙門氏菌、痢疾桿菌、志賀氏菌、志賀氏菌、志賀氏菌、志賀氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、腸桿菌、腸桿菌鐮刀菌、變形桿菌、普通變形桿菌、變形桿菌、普通變形桿菌、金黃色葡萄球菌或摩氏摩根氏菌。優(yōu)選地，革蘭氏陰性細菌菌株選自耶爾森氏菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、假單胞菌屬、衣原體屬、歐文氏菌屬、泛菌屬、弧菌屬、伯克霍爾德氏菌屬、蘭氏菌屬、黃單胞菌屬、色桿菌屬、sodalis、檸檬酸桿菌屬、愛德華氏菌屬、根瘤菌屬、氣單胞菌屬、光桿菌屬、博德特氏菌屬和脫硫弧菌屬、更優(yōu)選來自耶爾森氏菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬和假單胞菌屬、最優(yōu)選來自耶爾森氏菌屬和沙門氏菌屬。本文所用的術語“耶爾森氏菌”包括耶爾森氏菌的所有物種，包括小腸結腸炎耶爾森氏菌、假結核耶爾森氏菌和鼠疫耶爾森氏菌。優(yōu)選的是小腸結腸炎耶爾森氏菌。本文使用的術語“沙門氏菌”包括沙門氏菌的所有物種，包括腸道沙門氏菌和沙門氏菌。優(yōu)選為腸道沙門氏菌。本文所用的“啟動子”是指調(diào)節(jié)轉錄單位表達的核酸序列?！皢幼訁^(qū)”是能夠結合細胞中的rna聚合酶并啟動下游(3'方向)編碼序列的轉錄的調(diào)節(jié)區(qū)。在啟動子區(qū)域內(nèi)將發(fā)現(xiàn)轉錄起始位點(通過用核酸酶s1作圖方便定義)，以及負責rna聚合酶結合的蛋白質結合結構域(共有序列)，例如推定的-35區(qū)域和pribnow框。當描述兩個dna區(qū)之間的關系時，術語“可操作地連接”僅僅意味著它們彼此功能相關，并且它們位于相同的核酸片段上。如果啟動子控制基因的轉錄并且其位于與基因相同的核酸片段上，則啟動子可操作地連接到結構基因。通常啟動子在所述革蘭氏陰性細菌菌株中是有功能的，即啟動子能夠表達本發(fā)明的融合蛋白，即啟動子能夠表達本發(fā)明的融合蛋白，而不進一步基因工程或進一步表達蛋白質。此外，功能性啟動子不能對細菌t3ss天然地反調(diào)節(jié)。本文使用的術語“遞送”是指將蛋白質從重組革蘭氏陰性菌株運輸?shù)秸婧思毎ㄔ谥亟M革蘭氏陰性菌株中表達異源蛋白質的步驟，從這種革蘭氏陰性細菌菌株分泌表達的蛋白質，并通過這種革蘭氏陰性細菌菌株將分泌的蛋白質轉移到真核細胞的胞質溶膠中。因此，本文可互換使用的術語“遞送信號”或“分泌信號”是指可以被革蘭氏陰性細菌菌株分泌和轉運系統(tǒng)識別并指導從革蘭氏陰性細菌菌株遞送蛋白質到的真核細胞的多肽序列。如本文所用，蛋白質的“分泌”是指異源蛋白質跨越重組革蘭氏陰性細菌菌株的細胞膜的運輸。蛋白質的“轉位”是指異源蛋白質從重組革蘭氏陰性細菌菌株穿過真核細胞的質膜遞送到這種真核細胞的胞質溶膠中。本文所用的術語“真核細胞”包括以下真核細胞：hi-5、hela、hek、huvec、3t3、cho、jurkat、sf-9、hepg2、vera、mdck、mefs、thp-1、j774、raw、caco2、nci60、du145、lncap、mcf-7、mda-mb-438、pc3、t47d、a549、u87、shsy5y、ea.hy926、saos-2、4t1、d2a1、b16f10和原代人肝細胞。本文使用的“真核細胞”也稱為“靶細胞”或“靶真核細胞”。本文所用的術語“t3ss效應蛋白”是指通過t3s系統(tǒng)天然注射到真核細胞的細胞溶質中的蛋白質和由t3s系統(tǒng)天然分泌的蛋白質，其可能例如形成孔進入真核細胞膜(包括成孔遞送器(如耶爾森氏菌yopb和yopd)和尖端蛋白(如yersinialcrv)。優(yōu)選使用通過t3s系統(tǒng)天然注射到真核細胞的細胞質中的蛋白質。這些劇毒因子將使真核細胞麻痹或重編程以獲得病原體的益處。t3s效應物具有大量的生物化學活性和調(diào)節(jié)關鍵宿主調(diào)節(jié)分子的功能[5，30]，包括avra、avrb、avrbs2、avrbs3、avrbst、avrd、avrd1、avrpphb、avrpphc、avrpphepto、avrppibpto、avrpto、avrptob、avrrpml、avrrpt2、avrxv3、cigr、espf、espg、esph、espz、exos、exot、gogb、gtga、gtge、gala家族蛋白、hopab2、hopao1、hopl1、hopm1、hopn1、hopptod2、hopptoe、hopptof、ipb、ipgb、ipgb2、ipgd、lcrv、map、ospc1、ospe2、ospf、ospg、osp1、pipb、pipb2、popb、popp2、pthxol、pthxo6、pthxo7、sifa、sifb、sipa/sspa、sipb、sipc/sspc、sipd/sspd、slrp、sopa、sopb/sigd、sopd、sope、sope2、spic/ssab、sptp、spvb、spvc、srfj、sse、sseb、ssec、ssed、ssef、sseg、ssel/srfh、ssej、ssek1、ssek2、ssek3、ssel、ssph1、ssph2、stea、steb、stec、sted、stee、tccp2、tir、vira、virppha、vopf、xopd、yopb、yopd、yope、yoph、yopj、yopm、yopo、yopp、yopt、ypka。耶爾森氏菌的t3ss效應基因已經(jīng)從yope、yoph、yopm、yopo、yopp/yopj和yopt[31]。各自的效應基因可以從弗氏志賀氏菌(例如ospf、ipgd、ipgb1)、腸沙門氏菌(例如sope、sopb、sptp)、銅綠假單胞菌(例如exos、exot、exou、exoy)或大腸桿菌(map、espf、espg、esph、espz)克隆。這些基因的核酸序列對于本領域技術人員是可獲得的，例如在genebank數(shù)據(jù)庫(來自nc002120gl10955536的yoph、yopo、yope、yopp、yopm、yopt、；來自af386526.1gi18462515的福氏志賀菌桿菌效應蛋白；來自nco16810.1gi378697983或fq312003.1gi301156631的腸道沙門菌；來自ae004091.2gi：110227054或cp000438.1gi：115583796的綠膿桿菌效應子和來自nco11601.1gl215485161的大腸桿菌效應子蛋白)。為了本發(fā)明的目的，基因用小寫字母表示，斜體表示以區(qū)別于蛋白質。在基因(由小寫字母和斜體字母表示)遵循細菌物種名稱(如大腸桿菌)的情況下，它們是指相應細菌物種中相應基因的突變。例如，yope是指由yope基因編碼的效應子蛋白。小腸結腸炎耶爾森氏菌yope代表在yope基因中具有突變的腸道小腸結腸炎耶爾森氏菌。如本文所用，術語“多肽”、“肽”、“蛋白質”、“多肽的”和“肽的”可互換使用，表示通過α-氨基和羧基之間的肽鍵彼此連接的一系列氨基酸殘基相鄰殘基的組。優(yōu)選具有包含至少10個氨基酸，更優(yōu)選至少20個氨基酸的氨基酸序列的蛋白質。根據(jù)本發(fā)明，“異源蛋白質”包括天然存在的蛋白質或其部分，并且還包括人工改造的蛋白質或其部分。如本文所用，術語“異源蛋白質”是指除了其可融合的t3ss效應蛋白或其n末端片段之外的蛋白質或其部分。特別地，本文使用的異源蛋白質是指不屬于蛋白質組的蛋白質或其部分，即本發(fā)明提供和使用的特定重組革蘭氏陰性細菌菌株的完整天然蛋白質互補物，例如，其不屬于蛋白質組，即耶爾森氏菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬或假單胞菌屬的特定細菌菌株的完整天然蛋白質補體。通常異源蛋白質是動物來源的，包括人來源的。優(yōu)選地，異源蛋白質是人蛋白質。更優(yōu)選異源蛋白質選自參與凋亡或凋亡調(diào)節(jié)的蛋白質、細胞周期調(diào)節(jié)劑、錨蛋白重復蛋白、細胞信號轉導蛋白、報告蛋白、轉錄因子、蛋白酶、小gtp酶、gpcr相關蛋白、納米體融合構建體和納米抗體、細菌t3ss效應子、細菌t4ss效應子和病毒蛋白。特別優(yōu)選異源蛋白質選自參與凋亡或凋亡調(diào)節(jié)的蛋白質、細胞周期調(diào)節(jié)劑、錨蛋白重復蛋白、報告蛋白、小gtp酶、gpcr相關蛋白、納米抗體融合構建體、細菌t3ss效應子、細菌t4ss效應子和病毒蛋白。甚至更特別優(yōu)選的是選自參與凋亡或凋亡調(diào)節(jié)的蛋白質、細胞周期調(diào)節(jié)劑和錨蛋白重復蛋白的異源蛋白質。最優(yōu)選的是參與凋亡或凋亡調(diào)節(jié)的蛋白質，如動物，優(yōu)選參與凋亡或凋亡調(diào)節(jié)的人異源蛋白質。在一些實施方案中，本發(fā)明的革蘭氏陰性細菌菌株的載體包含相互獨立地框內(nèi)融合到所述第一dna序列的3'端的編碼相同或兩種不同異源蛋白質的兩個第二dna序列。在一些實施方案中，本發(fā)明的革蘭氏陰性細菌菌株的載體包含相互獨立地框內(nèi)融合到所述第一dna序列的3'端的編碼相同或三種不同異源蛋白質的三個第二dna序列。由重組革蘭氏陰性細菌菌株表達的異源蛋白質通常具有1-150kd，優(yōu)選1-120kd，更優(yōu)選在100kda，最優(yōu)選15-100kda之間的分子量。由重組革蘭氏陰性細菌菌株表達的異源蛋白質通常具有1-150kd，優(yōu)選1-120kd，更優(yōu)選在100kda，最優(yōu)選15-100kda之間的分子量。根據(jù)本發(fā)明，“參與凋亡或凋亡調(diào)節(jié)的蛋白質”包括但不限于bad、bcl2、bak、bmt、bax、puma、noxa、bim、bcl-xl、apaf1、caspase9、caspase3、caspase6、caspase7、caspase10、dffa、dffb、rock1、app、cad、icad、cad、endog、aif、htra2、smac/diablo、arts、atm、atr、bok/mtd、bmf、mcl-)、iap家族、lc8、pp2b、14-3-3蛋白、pka、pkc、pi3k、erk1/2、p90rsk、traf2、tradd、fadd、daxx、caspase8、caspase2、rip、raidd、mkk7、jnk、(p16(ink4a)、p15(ink4b)、p18(ink4c)、p19(ink4d))和cip1/waf1/kipl-2-家族(p21(cip1c))的fkhr、gsk3、cdks和它們的抑制劑/waf1)、p27(kipl)、p57(kip2)。優(yōu)選bad、bmt、bcl2、bak、bax、puma、noxa、bim、bcl-xl、caspase9、caspase3、caspase6、caspase7、smac/diablo、bok/mtd、bmf、mcl-tradd、daxx、caspase8、caspase2、rip、raidd、fkhr、cdk及其抑制劑如ink4-家族(p16(ink4a)、p15(ink4b)、p18(ink4c)、p19(ink4d))，最優(yōu)選bim、截短的bid、fadd、胱天蛋白酶3(及其亞基)、bax、bad、akt、cdk及其抑制劑如ink4-家族(p16(ink4a)、p15(ink4b)、p18(ink4c)、p19[32-34]。此外，參與細胞凋亡或凋亡調(diào)節(jié)的蛋白質包括diva、bcl-xs、nbk/bik、hrk/dp5、bid和tbid、eg1-1、bcl-gs、細胞色素c、beclin、ced-13、bnip1、bnip3、bcl-b、bcl-w、ced-9、a1、nr13、bfl-1、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶8.參與凋亡或凋亡調(diào)節(jié)的蛋白質選自促凋亡蛋白質、抗凋亡蛋白、凋亡預防途徑的抑制劑和促存活信號或途徑的抑制劑。促凋亡蛋白包含選自bax、bak、diva、bcl-xs、nbk/bik、hrk/dp5、bmf、noxa、puma、bim、bad、bid和tbid、bok、apaf1、smac/diablo、bnip1、bnip3、bcl-gs、beclin1、egl-1和ced-13、細胞色素c、fadd、caspase家族和cdks及其抑制劑如ink4家族(p16(ink4a)、p15(ink4b)、pkl、bmf、noxa、puma、bim、bad、bid和tbid組成的組中選擇的一個或多個氨基酸序列(例如、p18(ink4c)、p19(ink4d)bok、egl-1、apaf1、smac/diablo、bnip1、bnip3、bcl-gs、beclin1、egl-1和ced-13、細胞色素c、fadd和caspase家族。優(yōu)選的是bax、bak、diva、bcl-xs、nbk/bik、hrk/dp5、bmf、noxa、puma、bim、bad、bid和tbid、bok、egl-1、apaf1、bnip1、bnip3、bcl-beclin1、egl-1和ced-13、smac/diablo、fadd、caspase家族、cdk及其抑制劑如ink4-家族(p16(ink4a)、p15(ink4b)、p18(ink4c)、p19(ink4d))。同樣優(yōu)選的是bax、bak、diva、bcl-xs、nbk/bik、hrk/dp5、bmf、noxa、puma、bim、bad、bid和tbid、bok、apaf1、bnip1、bnip3、bcl-gs、beclin1、egl-1和ced-13、smac/diablo、fadd、caspase家族?？沟蛲龅鞍装x自bcl-2、bcl-xl、bcl-b、bcl-w、mcl-1、ced-9、a1、nr13、iap家族和bfi-1的蛋白質。優(yōu)選的是bcl-2、bcl-xi、bcl-b、bcl-w、mcl-1、ced-9、a1、nr13和bfl-1。細胞凋亡預防途徑的抑制劑包含選自bad、noxa和cdc25a的蛋白質。優(yōu)選bad和noxa。促生存信號傳導或通路的抑制劑包含選自pten、rock、pp2a、phlpp、jnk，p38的蛋白質。優(yōu)選pten、rock、pp2a和phlpp。在有些實施方案中，參與凋亡或凋亡調(diào)節(jié)的異源蛋白選自唯bh3蛋白、胱天蛋白酶和凋亡的死亡受體控制的細胞內(nèi)信號傳導蛋白。唯bh3蛋白包含選自bad、bim、bid和tbid、puma、bik/nbk、bod、hrk/dp5、bnip1、bnip3、bmf、noxa、mcl-1、bcl-gs、beclin1、egl-1和ced-13的蛋白。優(yōu)選bad、bim、bid和tbid。半胱天冬酶包含選自半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10的蛋白質。優(yōu)選半胱天冬酶3、半胱天冬酶8和半胱天冬酶9的蛋白。細胞死亡受體控制的細胞內(nèi)信號蛋白包括選自fadd、tradd、asc、bap31、gulp1/ced-6、cidea、mfg-e8、cidec、ripk1/rip1、cradd、ripk3/rip3、crk、shb、crkl、daxx、14-3-3家族、flip、dff40和45、pea-15、sodd。優(yōu)選的是fadd和tradd。在有些實施方案中，參與凋亡或凋亡調(diào)節(jié)的兩種異源蛋白包含在本發(fā)明的革蘭氏陰性細菌菌株的載體中，其中一種蛋白是促凋亡蛋白，而另一種蛋白是凋亡預防途徑的抑制劑或其中一種蛋白是促凋亡蛋白，而另一種蛋白是促生存信號傳導或通路的抑制劑。本發(fā)明包括的促凋亡蛋白質通常具有α螺旋結構，優(yōu)選由兩親性螺旋環(huán)繞的疏水螺旋，通常包含bh1、bh2、bh3或bh4結構域中的至少一個，優(yōu)選包含至少一個bh3結構域。通常由本發(fā)明包括的促凋亡蛋白質不具有酶活性。本文所用的術語“蛋白酶切割位點”是例如指蛋白質或融合蛋白氨基酸內(nèi)的特定氨基酸基序。在蛋白質或融合蛋白的氨基酸序列內(nèi)，其被識別氨基酸基序的特異性蛋白酶切割。綜述見[35]。蛋白酶切割位點的實例是被選自腸激酶(輕鏈)、腸肽酶、解離蛋白酶、人鼻病毒蛋白酶(hrv3c)、tev蛋白酶、tvmv蛋白酶、factorxa蛋白酶和凝血酶一組的蛋白酶切割的氨基酸基序。以下氨基酸基序被相應的蛋白酶識別：-asp-asp-asp-asp-lys：腸激酶(輕鏈)/腸肽酶-leu-glu-val-leu-phe-gln/gly-pro：prescission蛋白酶/人鼻病毒蛋白酶(hrv3c)-glu-asn-leu-tyr-phe-gln-ser和基于glu-xx的修飾基序tyr-x-gln-gly/ser(其中x是任意氨基酸)被tev蛋白酶(煙草蝕紋病毒)-glu-thr-val-arg-phe-gln-ser：tvmv蛋白酶-ile-(glu或asp)-gly-arg：factorxa蛋白酶-leu-val-pro-arg/gly-ser：凝血酶。本文所用的蛋白酶切割位點包括泛素。因此，在一些優(yōu)選的實施方案中，泛素用作蛋白酶切割位點，即第三dna序列編碼泛蛋白如蛋白酶切割位點，其可以在n-末端位點被特異性泛素加工蛋白酶切割。其可以被特異性遍在蛋白加工蛋白酶切割，所述蛋白酶在融合蛋白已被遞送至的細胞中在n末端位點內(nèi)源性地稱為去泛素化酶。泛素在其c末端由一組內(nèi)源性泛素特異性c末端蛋白酶(去泛素化酶，dub)加工。通過dub的遍在蛋白的切割被認為發(fā)生在泛素的非常c末端(在g76之后)?！皞€體”，“受試者”或“患者”是脊椎動物。在某些實施方案中，脊椎動物是哺乳動物。哺乳動物包括但不限于靈長類(包括人和非人靈長類動物)和嚙齒動物(例如小鼠和大鼠)。在某些實施方案中，哺乳動物是人。術語“突變”在本文中用作一般術語，并且包括單個堿基對和多個堿基對的改變。這樣的突變可以包括取代、移碼突變、缺失、插入和截短。本文所用的術語“標記分子或標記分子的受體位點”是指結合特定氨基酸序列的小化合物，這樣導致結合的化合物產(chǎn)生熒光，結合的化合物優(yōu)選香豆素連接酶/香豆素受體位點(及其衍生物)、試鹵靈連接酶/試鹵靈受體位點(及其衍生物)和四半胱氨酸基模序(如cys-cys-pro-gly-cys-cys及其衍生物)與flash/reash染料蛋白(lifetechnologies)或如增強型綠色熒光蛋白(egfp)的熒光蛋白使用。本文所用的術語“核定位信號”是指標記導入真核細胞核中的蛋白質的氨基酸序列，并且優(yōu)選包括病毒核定位信號，例如sv40大t抗原衍生的nls(ppkkrkv)。本文所用的術語“多克隆位點”是指含有幾個限制性位點的短dna序列，用于通過限制性內(nèi)切核酸酶如ac11、hindiii、sspl、mluci、tsp509i、pcil、agel、bspmi、bfuai、sexai、mlui、bceai、hpych4iv、hpych4iii、bael、bsaxi、aflff1、spei、bsr1、bmr1、bglii、afei、alul、stui、seal、clal、bspdi、pi-scei、nsii、asel、swal、cspci、mfei、bsssi、bmgbi、pmll、drall1、alel、ecop15i、pvuii、alwni、btsimuti、tspri、ndei、nlalli、cviaii、fatl、msli、fspei、xcml、bstxi、pflmi、bed、ncol、bseyi、faul、smal、xmal、tspmi、nt.cvipii、lpnpi、acil、sacii、bsrbi、msp1、hpall、scrfi、bsski、styd4i、bsaji、bsli、btgi、neil、avrii、mnii、bbvci、nb.bbvci、nt.bbvci、sbfi、bpui1、bsu36i、econi、hpyav、bstni、pspgi、styl、bcgl、pvui、bstui、eagi、rsrii、bsiei、bsiwi、bsmbi、hpy99i、mspall、mspji、sgrai、bfal、bspcn1、xhoi、earl、acul、psti、bpml、ddel、sfc1、afl1、bpuei、smii、aval、bsobi、mboii、bbsi、xmni、bsml、nb.bsmi、ecori、hgal、aatii、zral、tth11i、pff1、pshai、ahd1、drd1、eco53ki、sad、bseri、plel、ntbbi、btsi、bmbi、btsi、nbbtsi、bstapi、sphii、sphi、nmeaiii、naei、ngomiv、bglii、bglii、bglii、bglii、bglii、asisi、btgzi、hinpli、hhal、bsshii、noti、fnu4h1、cac8i、mwol、nhei、bmt1、sapi、bspqi、nt.bspqi、blp1、tsel、apek1、bsp12861、alw1、nt.alwi、bamhi、foki、btsci、haelii、phol、fsei、sfi、nari、kasi、sfol、pluti、asci、ecil、bsmfi、apai、pspomi、sau96i、nlalv、kpni、acc65i、bsai、hphi、bsteii、avail、ban1、baegi、bsahi、、rsal、cviqi、bstz17i、bcivi、sali、nt.bsmai、bsmai、bcodi、apali、bsgl、accl、hpyl66ii、tsp45i、hpal、pmel、hindi、bsihkai、apoi、nspl、bsrfi、bstyi、haell、cviki-、ecori109i、ppumi、i-ceui、snabi、i-scei、bsphi、bspei、mmei、taqal、nrul、hpyl881、hpyl88iii、xbai、bell、hpych4v、fspi、pi-pspi、msci、bsrgi、psil、bstbi、dral、pspxi、bsawi、bsaai、eael、優(yōu)選xhol、xbai、hindiii、ncoi、noti、ecori、ecorv、bamhi、nhei、saci、sali、bstbi。本文所用的術語“多克隆位點”還指用于重組事件的短dna序列，例如在gateway克隆策略中或用于諸如gibbson裝配或拓撲克隆的方法。本文所用的術語“耶爾森氏菌野生型菌株”是指天然存在的變體(如小腸結腸炎耶爾森氏菌e40)或含有允許使用載體的遺傳修飾的天然存在的變體，例如限制性內(nèi)切核酸酶或抗生素抗性基因中的缺失突變(如小腸結腸炎耶爾森氏菌mrs40、小腸結腸炎耶爾森氏菌e40的氨芐青霉素敏感型衍生物)。這些菌株含有染色體dna以及未修飾的毒力質粒(稱為pyv)。術語“包含”通常在包括的意義上使用，也就是說允許一個或多個特征或組件的存在。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了重組革蘭氏陰性細菌菌株，其中所述革蘭氏陰性細菌菌株選自耶爾森氏菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬和假單胞菌屬。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種重組革蘭氏陰性細菌菌株，其中所述革蘭氏陰性細菌菌株選自耶爾森氏菌屬和沙門氏菌屬。優(yōu)選地，革蘭氏陰性細菌菌株是耶爾森氏菌菌株，更優(yōu)選地耶氏酵母菌株。最優(yōu)選的是小腸結腸炎耶爾森氏菌e40[13]或氨芐青霉素敏感性衍生物，如[36]中所述的小腸結腸炎耶爾森氏菌mrs40。還優(yōu)選地，革蘭氏陰性細菌菌株是沙門氏菌菌株，更優(yōu)選沙門氏菌腸道菌株。最優(yōu)選的是如publichealthenglandculturecollection(nctc13347)所述的鼠傷寒沙門氏菌sl1344。在本發(fā)明的一個實施方案中，來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號包含細菌t3ss效應蛋白或其n末端片段，其中t3ss效應蛋白或其n末端片段可包含伴侶結合位點。包含分子伴侶結合位點的t3ss效應子蛋白或其n末端片段在本發(fā)明中特別用作遞送信號。優(yōu)選的t3ss效應蛋白或其n末端片段選自sope、sope2、sptp、yope、exos、sipa、sipb、sipd、sopa、sopb、sopd、ipgb1、ipgd、sipc、sifa、ssej、sse、srfh、yopj、avra、avrbst、yopt、yoph、ypka、tir、espf、tccp2、ipgb2、ospf、map、ospg、ospl、ipah、ssph1、vopf、exos、exot、hopab2、xopd、avrrpt2、hopao1、hopptod2、hopu1、gala蛋白家族、avrbs2、avrd1、avrbs3、yopo、yopp、yope、yopm、yopt、espg、esph、espz、ipaa、ipab、ipac、vira、icsb、ospc1、ospe2、ipah9.8、ipah7.8、avrb、avrd、avrpphb、avrpphc、avrpphepto、avrppibpto、avrpto、avrptob、virppha、avrrpml、hopptoe、hopptof、hoppton、popb、popp2、avrbs3、xopd和avrxv3。更優(yōu)選的t3ss效應蛋白或其n末端片段選自sope、sptp、yope、exos、sopb、ipgb1、ipgd、yopj、yoph、espf、ospf、exos、yopo、yopp、yope、yopm、yopt、其中最優(yōu)選的t3ss效應蛋白或其n末端片段選自ipgb1、sope、sopb、sptp、ospf、ipgd、yoph、yopo、yopp、yope、yopm、yopt、特別是yope或其n末端片段。同樣優(yōu)選的t3ss效應蛋白或其n末端片段選自sope、sope2、sptp、stea、sipa、sipb、sipd、sopa、sopb、sopd、ipgb1、ipgd、sipc、sifa、sifb、ssej、sse、srfh、yopj、avra、avrbst、yoph、ypka、tir、espf、tccp2、ipgb2、ospf、map、ospg、ospl、ipah、vopf、exos、exot、hopab2、avrrpt2、hopao1、hopu1、gala蛋白家族、avrbs2、avrd1、yopo、yopp、yope、yopt、espg、esph、espz、ipaa、ipab、ipac、vira、icsb、ospc1、ospe2、ipah9.8、ipah7.8、avrb、avrd、avrpphb、avrpphc、avrpphep、avrppibpto、avrpto、avrptob、virppha、avrrpml、hopptod2、hopptoe、hopptof、hoppton、popb、popp2、avrbs3、xopd和avrxv3。同樣更優(yōu)選的t3ss效應蛋白或其n末端片段選自sope、sptp、stea、sifb、sopb、ipgb1、ipgd、yopj、yoph、espf、ospf、exos、yopo、yopp、yope、yopt、其中同樣最優(yōu)選的t3ss效應蛋白或其n末端片段選自ipgb1、sope、sopb、sptp、stea、sifb、ospf、ipgd、yoph、yopo、yopp、yope和yopt、特別是sope、stea或yope或其n末端片段、更特別是stea或yope或其n末端片段、最特別是yope或其n末端片段。在有些實施方案中，由第一dna序列編碼的細菌t3ss效應蛋白的遞送信號包含細菌t3ss效應蛋白或其n末端片段，其中其n末端片段包括至少前10個，優(yōu)選至少前20個，更優(yōu)選至少前100個氨基酸。一些實施方案中，由第一dna序列編碼的細菌t3ss效應蛋白的遞送信號包含細菌t3ss效應蛋白或其n末端片段，其中細菌t3ss效應蛋白或其n末端片段包含伴侶結合位點。優(yōu)選的包含伴侶結合位點的t3ss效應蛋白或其n末端片段包含伴侶伴侶結合位點和t3ss效應蛋白或其n末端片段的以下組合：syce-yope、invb-sope、sicp-sptp、syct-yopt、syco-yopo、sycn/yscb-yopn、sych-yoph、spcs-exos、cesf-espf、sycd-yopb、sycd-yopd。更優(yōu)選的是syce-yope、invb-sope、syct-yopt、syco-yopo、sycn/yscb-yopn、sych-yoph、spcs-exos、cesf-espf。最優(yōu)選的是yope或其包含syce伴侶結合位點的n-末端片段，例如yope效應蛋白的n-末端片段，其含有yope效應蛋白的n-末端138個氨基酸，本文稱為yope1-138，如圖所示在seqidno.2或sope或其n末端片段，其包含invb伴侶結合位點，如sope效應蛋白的n-末端片段，其含有sope效應蛋白的n-末端81或105個氨基酸，本文稱為sope1-81或sope1-81，如seqidno.142或143所示。在本發(fā)明的一個實施方案中，重組革蘭氏陰性細菌菌株是耶爾森氏菌菌株，并且由第一dna序列編碼的細菌t3ss效應蛋白的遞送信號，包含yope效應子蛋白或n末端部分，優(yōu)選為小腸結腸炎耶爾森氏菌菌株yope效應蛋白或其n末端部分。優(yōu)選地，syce結合位點包含在yope效應蛋白的n末端部分內(nèi)。在這方面，yope效應子蛋白的n末端片段可以包含n末端的12、16、18、52、53、80或138個氨基酸[10，37，38]。最優(yōu)選的是如在forsberg和wolf-watz[39]中所描述的，在本文中稱為yope1-138以及如seqidno.2所示的yope效應蛋白的n-末端片段，其含有yope效應蛋白的n末端138個氨基酸。在本發(fā)明的一個實施方案中，重組革蘭氏陰性細菌菌株是沙門氏菌菌株，并且由第一dna序列編碼的細菌t3ss效應蛋白的遞送信號包含sope或stea效應蛋白或其n末端部分，優(yōu)選腸沙門氏菌sope或stea效應蛋白或其n末端部分。優(yōu)選地，伴侶結合位點包含在sope效應蛋白的n末端部分內(nèi)。在這方面，sope效應蛋白的n末端片段可以包含n末端81或105個氨基酸。最優(yōu)選的是全長stea和含有如seqidno.142或143所描述的效應蛋白的n-末端105個氨基酸的sope效應蛋白的n末端片段。本領域技術人員熟悉鑒定能夠遞送蛋白質的效應子蛋白的多肽序列的方法。例如，由sory等人[13]描述的一種這樣的方法。簡言之，yop蛋白的各種部分可以框內(nèi)融合到報告子酶，例如百日咳博德特氏菌脂環(huán)化酶的鈣調(diào)蛋白激活的腺苷酸環(huán)化酶結構域(或cya)。yop-cya雜合蛋白到真核細胞的胞質溶膠中的遞送通過在感染的真核細胞中出現(xiàn)導致camp積累的環(huán)化酶活性來指示。通過采用這種方法，如果需要，本領域技術人員可以確定能夠遞送蛋白質的最小序列需求，即最短長度的連續(xù)氨基酸序列，參見例如[13]。因此，本發(fā)明的優(yōu)選遞送信號至少由能夠遞送蛋白質的t3ss效應蛋白的最小氨基酸序列組成。在一個實施方案中，本發(fā)明提供突變體重組革蘭氏陰性細菌菌株，特別是重組革蘭氏陰性細菌菌株，其對于至少一種t3ss功能性效應蛋白的產(chǎn)生是缺陷的。根據(jù)本發(fā)明，這種突變體革蘭氏陰性細菌菌株如這樣的突變型耶爾森氏菌菌株可以通過將至少一個突變引入至少一種效應物編碼基因中來產(chǎn)生。優(yōu)選地，就耶爾森氏菌菌株而言，這種效應物編碼基因包括yope、yoph、yopo/ypka、yopm、yopp/yopj和yopt。優(yōu)選地，就沙門氏菌菌株而言，這些效應物編碼基因包括avra、cigr、gogb、gtga、gtge、pipb、sifb、sipa/sspa、sipb、sipc/sspc、sipd/sspd、slrp、sopb/sigd、sopa、spic/ssab、sseb、ssec、ssed、ssef、sseg、ssel/srfh、sopd、sope、sope2、ssph1、ssph2、pipb2、sifa、sopd2、ssej、ssek1、ssek2、ssek3、ssel、stec、stea、steb、sted、stee、spvb、spvc、spvd、srfj、sptp。最優(yōu)選地，所有效應物編碼基因都缺失。本領域技術人員可以使用任何數(shù)量的標準技術在這些t3ss效應基因中產(chǎn)生突變。sambrook等描述了這樣的技術。參見sambrook等[40]。根據(jù)本發(fā)明，突變可以在效應物編碼基因的啟動子區(qū)產(chǎn)生，使得這種效應基因的表達被消除。突變也可以在效應物編碼基因的編碼區(qū)中產(chǎn)生，使得編碼的效應子蛋白的催化活性被消除。效應蛋白的“催化活性”通常指效應蛋白的抗靶細胞功能，即毒性。這種活性由效應子蛋白的催化結構域中的催化基序控制。用于鑒定效應蛋白的催化結構域和/或催化基序的方法是本領域技術人員公知的。例如參見[41，42]。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的突變是整個催化結構域的缺失。另一個優(yōu)選的突變是效應物編碼基因中的移碼突變，使得催化結構域不存在于由這種“移碼”基因表達的蛋白質產(chǎn)物中。最優(yōu)選的突變是具有效應子蛋白的整個編碼區(qū)缺失的突變。本發(fā)明還涵蓋其它突變，例如小缺失或堿基對取代，其在效應子蛋白的催化基序中產(chǎn)生，導致破壞給定效應子蛋白的催化活性。在t3ss功能效應蛋白的基因中產(chǎn)生的突變可以通過許多方法引入特定菌株。一種這樣的方法包括將突變基因克隆到“自殺”載體中，該載體能夠通過等位基因交換將突變序列引入菌株。這種“自殺”載體的一個例子描述在[43]中。以這種方式，可將多個基因中產(chǎn)生的突變連續(xù)地引入產(chǎn)生多突變體的革蘭氏陰性細菌菌株中，例如六重突變重組菌株。這些突變序列的引入順序并不重要。在有些情況下，可能需要僅突變一些但不是所有的效應基因。因此，本發(fā)明進一步考慮除六突變型耶爾森氏菌以外的多突變體耶爾森氏菌，例如雙突變體、三突變體、四突變體和五重突變株。為了遞送蛋白質的目的，本發(fā)明突變株的分泌和轉運系統(tǒng)需要是完整的。本發(fā)明優(yōu)選的重組革蘭氏陰性細菌菌株是六聯(lián)突變型耶爾森氏菌菌株，其中所有效應物編碼基因都被突變，使得所得的耶爾森氏菌不再產(chǎn)生任何功能效應蛋白。對于小腸結腸炎耶爾森氏菌，這種六聯(lián)突變型耶爾森氏菌菌株被命名為δyoph、o、p、e、m、t。如實例，這樣的六聯(lián)突變體可以從腸道結腸炎耶爾森氏菌mrs40菌株產(chǎn)生，產(chǎn)生小腸結腸炎耶爾森氏菌mrs40δyoph、o、p、e、m、t，這是優(yōu)選的。本發(fā)明的另一方面涉及用于與重組革蘭氏陰性細菌菌株組合用于將期望的蛋白質遞送到真核細胞中的載體，其中所述載體沿5'至3'方向包含：啟動子；編碼細菌t3ss效應蛋白的遞送信號的第一dna序列，可操作地連接到所述啟動子；框內(nèi)融合到所述第一dna序列的3'末端的編碼異源蛋白質的第二dna序列；和作為選擇的編碼蛋白酶切割位點的第三dna序列，其中所述第三dna序列位于所述第一dna序列的3'末端和所述第二dna序列的5'末端之間。如上所述的啟動子，異源蛋白和蛋白酶切割位點可用于革蘭氏陰性細菌菌株的載體。根據(jù)本發(fā)明可以使用的載體取決于本領域技術人員已知的革蘭氏陰性細菌菌株。根據(jù)本發(fā)明可以使用的載體包括表達載體、用于染色體或毒力質粒插入的載體和用于染色體或毒力質粒插入的dna片段。在例如耶爾森氏菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬或假單胞菌屬菌株上有用的表達載體是puc、pbad、pacyc、pucp20和pet質粒。在例如耶爾森氏菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬或假單胞菌屬菌株上有用的用于染色體或毒力質粒插入的載體是例如pkng101。用于染色體或毒力質粒插入的dna片段是指在例如耶爾森氏菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬或假單胞菌屬菌株如λ-紅色基因工程。用于染色體或毒力質粒插入的載體或用于染色體或毒力質粒插入的dna片段可以插入本發(fā)明的第一、第二和/或第三dna序列，使得第一、第二和/或第三dna序列可操作地連接到內(nèi)源重組革蘭氏陰性細菌菌株的啟動子。因此，如果使用用于染色體或毒力質粒插入的載體或用于染色體或毒力質粒插入的dna片段，可以在內(nèi)源細菌dna(染色體或質粒dna)上編碼內(nèi)源啟動子，并且僅第一和第二dna序列是由用于染色體或毒力質粒插入的工程化載體或用于染色體或毒力質粒插入的dna片段提供。因此，用于轉化重組革蘭氏陰性細菌菌株的載體不必包含啟動子，即本發(fā)明的重組革蘭氏陰性細菌菌株可以用不包含啟動子的載體轉化。優(yōu)選地，使用表達載體。本發(fā)明的載體通常用于通過細菌t3ss將異源蛋白質在體外和體內(nèi)遞送到真核細胞中。用于耶爾森氏菌的優(yōu)選表達載體選自pbad_si1和pbad_si2。通過將含有用于yope和syce的內(nèi)源啟動子的syce-yope1-138片段從純化的pyv40克隆到pbad-mychisa(invitrogen)的kpni/hindiii位點中構建pbad_si2。另外的修飾包括通過消化、klenow片段處理和重連接去除pbad-mychisa的ncoi/bgui片段。此外在yope1-138的3'端，添加以下切割位點：xbai-xhoi-bstbi-(hindiii)。pbadsil等于pbad_si2，但編碼從pegfp-cl(clontech)在阿拉伯糖誘導型啟動子下的ncoi/bgui位點擴增的egfp。沙門氏菌的優(yōu)選表達載體選自psi_266、psi_267、psi_268和psi_269。從腸炎沙門氏菌(s.enterica)sl1344中擴增含有相應的內(nèi)源性啟動子和stea1-20片段(psi_266)、全長stea序列(psi_267)、sope1-81片段(psi_268)或sope1-105片段(psi_269)的質粒psi_266、psi_267、psi_268和psi_269基因組dna并克隆到pbad-mychisa(invitrogen)的ncoi/kpni位點。本發(fā)明的載體可包括其它序列元件，例如3'終止序列(包括終止密碼子和polya序列)或賦予藥物抗性的基因，其允許選擇已接受本載體的轉化體。本發(fā)明的載體可以通過許多已知的方法轉化到重組革蘭氏陰性細菌菌株中。為了本發(fā)明的目的，用于導入載體的轉化方法包括但不限于電穿孔、磷酸鈣介導的轉化、綴合或其組合。例如，可以通過標準電穿孔程序將載體轉化入第一細菌菌株。隨后，這樣的載體可以通過綴合，也稱為“移動”的過程從第一細菌菌株轉移到期望的菌株中?？梢杂美缈股剡x擇轉化體(即：吸收載體的革蘭氏陰性細菌菌株)。這些技術是本領域公知的。參見例如[13]。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的重組革蘭氏陰性細菌菌株的表達載體的啟動子可以是相應菌株的t3ss效應蛋白的天然啟動子或相容的細菌菌株或用于表達載體的啟動子其可用于例如耶爾森氏菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬或假單胞菌屬菌株，例如puc和pbad。這樣的啟動子是t7啟動子，plac啟動子或ara-bad啟動子。如果重組革蘭氏陰性細菌菌株是耶爾森氏菌菌株，則啟動子可以來自耶爾森氏病毒virulon基因?！耙疇柹喜《緑irulon基因”是指在耶爾森氏菌pyv質粒上的基因，其表達受溫度和通過與靶細胞接觸兩者控制。這些基因包括編碼分泌機制元件(ysc基因)的基因、編碼轉運蛋白(yopb，yopd和lcrv)的基因、編碼控制元件的基因(yopn，tyea和lcrg)、編碼t3ss效應子伴侶(sycd、syce、sych、sycn、syco和syct)以及編碼效應子(yope、yoph、yopo/ypka、yopm、yopt和yopp/yopj)的基因以及其他pyv編碼的蛋白如virf和yada。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，啟動子是t3ss功能效應物編碼基因的天然啟動子。如果重組革蘭氏陰性細菌菌株是耶爾森氏菌菌株，則啟動子選自yope、yoph、yopo/ypka、yopm和yopp/yopj中的任一個。更優(yōu)選地、啟動子來自yope或syce。如果重組革蘭氏陰性細菌菌株是沙門氏菌菌株，則啟動子可以來自spil或spill致病性島或來自其他地方編碼的效應蛋白。這些基因包括編碼分泌機制元件的基因、編碼轉運蛋白的基因、編碼控制元件的基因、編碼t3ss效應子伴侶的基因、編碼效應子的基因以及由spi-1或spi-2編碼的其它蛋白。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，啟動子是t3ss功能效應物編碼基因的天然啟動子。如果重組革蘭氏陰性細菌菌株是沙門氏菌菌株，則啟動子選自任何一種效應蛋白。更優(yōu)選地，啟動子來自sope、invb或stea。在優(yōu)選的實施方案中，表達載體包含編碼蛋白酶切割位點的dna序列。功能性和通常適用的切割位點的產(chǎn)生允許在轉運后切割遞送信號。由于遞送信號可干擾靶細胞內(nèi)轉運蛋白的正確定位和/或功能，在遞送信號和目標蛋白之間引入蛋白酶切割位點提供了幾乎天然蛋白首次遞送到真核細胞中。優(yōu)選地，蛋白酶切割位點是被選自腸激酶(輕鏈)、腸肽酶、解離蛋白酶、人鼻病毒蛋白酶3c、tev蛋白酶、tvmv蛋白酶、因子xa的蛋白酶或其催化結構域切割的氨基酸基序蛋白酶和凝血酶，更優(yōu)選由tev蛋白酶切割的氨基酸基序。同樣優(yōu)選的蛋白酶切割位點是被選自腸激酶(輕鏈)、腸肽酶、解離蛋白酶、人類鼻病毒蛋白酶3c、tev蛋白酶、tvmv蛋白酶、因子xa蛋白酶、泛素加工蛋白酶(稱為去泛素化酶)和凝血酶一組的蛋白酶或催化結構域切割的氨基酸基序。最優(yōu)選的是被tev蛋白酶或泛素加工蛋白酶切割的氨基酸基序。因此，在本發(fā)明的另一個實施方案中，異源蛋白質通過蛋白酶從細菌t3ss效應蛋白的遞送信號裂解。優(yōu)選的裂解方法是這樣的方法，其中：a)蛋白酶通過本文所述的重組革蘭氏陰性細菌菌株轉移到真核細胞中，其表達包含來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號和作為異源蛋白的蛋白酶的融合蛋白；或b)蛋白酶在真核細胞中為組成型或瞬時表達。通常，用于將期望的蛋白質遞送到真核細胞中的重組革蘭氏陰性細菌菌株和將蛋白酶轉運到真核細胞中的重組革蘭氏陰性菌株是不同的。在本發(fā)明的一個實施方案中，載體包含編碼標記分子或標記分子的受體位點的另外的dna序列。編碼標記分子或標記分子的受體位點的另外的dna序列通常與第二dna序列的5'端或3'端融合。用于標記分子的優(yōu)選的標記分子或受體位點選自增強的綠色熒光蛋白(egfp)、香豆素、香豆素連接酶受體位點、試鹵靈、resurofm連接酶受體位點、與flash一起使用的四半胱氨酸基序/reash染料(lifetechnologies)。最優(yōu)選的是試鹵靈和resurofm連接酶受體位點或egfp。標記分子或受體位點對標記分子的使用將導致標記分子與目標異源蛋白質的連接，然后將其原樣傳遞到真核細胞中，使得能夠通過例如活細胞顯微鏡追蹤蛋白質。在本發(fā)明的一個實施方案中，載體包含編碼肽標簽的另外的dna序列。編碼肽標簽的另外的dna序列通常融合到第二dna序列的5'端或3'端。優(yōu)選的肽標簽選自myc標簽、his標簽、flag標簽、ha標簽、strep標簽或v5標簽或這些組中的兩個或多個標簽的組合。最優(yōu)選的是myc標簽、flag標簽、his標簽和組合的myc-和his-標簽。使用肽標簽將導致例如通過使用抗標簽抗體的免疫熒光或western印跡使得標記蛋白質具有可追蹤性。此外，使用肽標簽允許在分泌到培養(yǎng)物上清液中之后或在轉移到真核細胞中之后親和純化期望的蛋白質，在這兩種情況下，使用適合相應標簽的純化方法(例如使用的金屬螯合親和純化與flag標簽一起使用的基于his標簽或抗flag抗體的純化)。在本發(fā)明的一個實施方案中，載體包含編碼核定位信號(nls)的另外的dna序列。編碼核定位信號(nls)的另外的dna序列通常融合到第二dna序列的5'端或3'端，其中所述另外的dna序列編碼核定位信號(nls)。優(yōu)選的nls選自sv40大t抗原nls及其衍生物[44]以及其它病毒nls。最優(yōu)選的是sv40大t抗原nls及其衍生物。在本發(fā)明的一個實施方案中，載體包含多克隆位點。多克隆位點通常位于第一dna序列的3'端和/或第二dna序列的5'端或3'端。載體可包含一個或多于一個多克隆位點。優(yōu)選的多克隆位點選自由xhoi、xbai、hindiii、ncoi、noti、ecori、ecorv、bamhi、nhei、saci、sali、bstbi組成的限制酶組。最優(yōu)選的是xbai、xhoi、bstbi和hindiii。從載體的融合的第一和第二和任選的第三dna序列表達的蛋白質也稱為“融合蛋白”或“雜合蛋白”，即遞送信號和異源蛋白的融合蛋白或雜合物。融合蛋白也可以包括例如遞送信號和兩種或更多種不同的異源蛋白。本發(fā)明涉及用于將如上所述的異源蛋白質遞送到細胞培養(yǎng)物以及體內(nèi)的真核細胞中的方法。因此,在一個實施方案中，遞送異源蛋白質的方法包括i)培養(yǎng)如本文所述的革蘭氏陰性細菌菌株；ii)用i)中的革蘭氏陰性細菌菌株接觸真核細胞，其中包含來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號和異源蛋白的融合蛋白由革蘭氏陰性細菌菌株表達并轉移入真核細胞；和任選地iii)切割所述融合蛋白使得異源蛋白與菌t3ss效應蛋白的遞送信號切割開來。在有些實施方案中，包含來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號和異源蛋白的至少兩種融合蛋白由革蘭氏陰性細菌菌株表達并通過本發(fā)明的方法轉移到真核細胞中?？梢愿鶕?jù)本領域已知的方法(例如：fda、bacteriologicalanalyticalmanual(bam)、第8章：小腸結腸炎耶爾森氏菌)培養(yǎng)重組革蘭氏陰性細菌菌株從而表達包含來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號和異源蛋白的融合蛋白。優(yōu)選地、重組革蘭氏陰性細菌菌株可以在腦心浸液肉湯中在如在28℃時培養(yǎng)。為了誘導t3ss以及如yope/syce啟動子依賴基因的表達，細菌可以在37℃生長。在優(yōu)選的實施方案中，使真核細胞與i)的兩種革蘭氏陰性細菌菌株接觸，其中第一革蘭氏陰性細菌菌株表達第一融合蛋白，其包含來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號和第一異源蛋白，并且第二革蘭氏陰性細菌菌株表達第二融合蛋白，其包含來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號和第二異源蛋白，使得第一和第二融合蛋白轉運到真核細胞中。該實施方案提供了例如真核細胞與兩種細菌菌株共感染如遞送例如兩個不同的雜交蛋白質進入細胞以解決它們的功能性互作的有效方法。本發(fā)明涉及廣范圍的真核細胞，其可以被本發(fā)明的重組革蘭氏陰性細菌菌株靶向。hi-5(bti-tn-5b1-4；lifetechnologiesb855-02)、hela細胞、helaccl2(如atccno.ccl-2)、成纖維細胞、例如3t3成纖維細胞(atcc號ccl-92)或mef(atcc號scrc-1040)、hek(atcc號crl-1573)、huvec(atcc號pcs-100-013)、cho如atccno.ccl-61)、jurkat(如atccno.tib-152)、sf-9(如atccno.crl-1711)、hepg2(如atccno.hb-8065)、veraccl-81)、mdck(atcc編號ccl-34)、thp-1(atcc編號tib-202)、j774(編號tib-67)、raw(編號tib-、caco2(如atccno.htb-37)、nci細胞系(如atccno.htb-182)、du145(如atccno.htb-81)、lncap(如atccno.crl-1740)、mcf-7(atccno.htb-22)、mda-mb細胞系(如atccno.htb-128)、pc3(如atccno.crl-1435)、t47d(如atccno.crl-2865)、a549atccno.ccl-185)、u87(如atccno.htb-14)、shsy5y(如atccno.crl-2266s)、ea.hy926(如atccno.crl-2922)、saos-2htbh-85)、4t1(如atccno.crl-2539)、b16f10(如atccno.crl-6475)或原代人肝細胞(如lifetechnologieshmcpis)、優(yōu)選hela、hek、huvec、3t3、cho、jurkat、sf-9、hepg2vera、thp-1、caco2、mef、a549,4t1、b16f10和原代人肝細胞，最優(yōu)選hela、hek、huvec、3t3、cho、jurkat、thp-1、a549和mef?！鞍小笔侵钢亟M革蘭氏陰性細菌菌株對真核細胞的細胞外粘附。根據(jù)本發(fā)明，蛋白質的遞送可以通過在適當?shù)臈l件下使真核細胞與重組革蘭氏陰性細菌菌株接觸來實現(xiàn)。關于誘導virulon基因的表達和轉運的條件，包括期望的溫度、ca++濃度、添加剛果紅的誘導劑。本領域技術人員通常可獲得各種參考文獻和技術，其中重組將革蘭氏陰性細菌菌株和靶細胞混合等。參見例如[45]。條件可以根據(jù)待靶向的真核細胞的類型和待使用的重組細菌菌株而變化。這些變化可以由本領域技術人員使用常規(guī)技術來解決。本領域技術人員還可以使用多種測定來確定融合蛋白的遞送是否成功。例如：可以使用識別融合標簽(如myc標簽)的抗體通過免疫熒光檢測融合蛋白。測定還可以基于被遞送的蛋白質的酶活性如[13]所述的測定。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了純化異源蛋白的方法，包括培養(yǎng)如本文所述的革蘭氏陰性細菌菌株，使得包含來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號和異源蛋白的融合蛋白被表達和分泌培養(yǎng)物的上清液。所表達的融合蛋白還可以在來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號和異源蛋白之間包含蛋白酶切割位點和/或可以進一步包含肽標簽。因此，在一個具體實施方案中，純化異源蛋白質的方法包括：i)培養(yǎng)本文所述的革蘭氏陰性細菌菌株，使得包含來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號、異源蛋白和在細菌t3ss效應蛋白的遞送信號和異源蛋白之間蛋白酶裂解位點的融合蛋白表達并分泌到培養(yǎng)物的上清液中；ii)向培養(yǎng)物的上清液中加入蛋白酶，其中所述蛋白酶切割融合蛋白，使得異源蛋白質與來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號分割；iii)任選地從培養(yǎng)物的上清液中分離異源蛋白質。因此，在另一個具體實施方案中，純化異源蛋白質的方法包括：i)如本文所述培養(yǎng)革蘭氏陰性細菌菌株，使得包含來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號、異源蛋白和肽標簽的融合蛋白被表達并分泌到培養(yǎng)物的上清液中；ii)靶向肽標簽，例如通過上清液的親和柱純化。因此，在另一個具體實施方案中，純化異源蛋白質的方法包括：i)培養(yǎng)如本文所述的革蘭氏陰性細菌菌株，使得包含來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號、異源蛋白質和在細菌t3ss效應蛋白的遞送信號與異源蛋白質之間的肽標簽的融合蛋白表達并分泌到培養(yǎng)物的上清液中；ii)向培養(yǎng)物的上清液中加入蛋白酶，其中所述蛋白酶切割融合蛋白，使得異源蛋白質與來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號切割；iii)靶向肽標簽，例如通過上清液的親和柱純化。在上述特定實施方案中，蛋白酶可以以例如純化的蛋白酶蛋白的形式加入到培養(yǎng)物的上清液中，或通過向培養(yǎng)物的上清液中加入表達和分泌蛋白酶的細菌菌株。其它步驟可包括除去蛋白酶如通過親和柱純化。在一個實施方案中，本發(fā)明提供本文所述的重組革蘭氏陰性細菌菌株用于藥物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了本文所述的重組革蘭氏陰性細菌菌株，其用于將異源蛋白質如藥物或如疫苗遞送至受試者。異源蛋白質可以通過使革蘭氏陰性細菌菌株與真核細胞例如真菌細胞接觸而如疫苗遞送給受試者，例如與活的動物在體內(nèi)這樣異源蛋白質轉移到活動物中，然后產(chǎn)生針對異源蛋白質的抗體。產(chǎn)生的抗體可以直接使用或分離和純化并用于診斷、研究以及治療用途。包含抗體或其中含有的dna序列的b細胞可以用于進一步產(chǎn)生特異性抗體用于診斷、研究以及治療用途。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了遞送異源蛋白質的方法，其中異源蛋白質在體外遞送到真核細胞中。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了遞送異源蛋白質的方法，其中真核細胞是活的動物，其中活體動物與革蘭氏陰性細菌菌株在體內(nèi)接觸使得融合蛋白轉運到活的動物中。優(yōu)選的動物是哺乳動物，更優(yōu)選人。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了如上所述的重組革蘭氏陰性細菌菌株用于由遞送的異源蛋白質引發(fā)的細胞途徑或事件的抑制劑的高通量篩選的用途。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供革蘭氏陰性細菌菌株的文庫，其中由革蘭氏陰性細菌菌株的表達載體的第二dna序列編碼的異源蛋白質是人或鼠蛋白質、優(yōu)選人蛋白質。其中由革蘭氏陰性細菌菌株表達的每種人或胞壁質蛋白在氨基酸序列上不同?？赡艿膸炜梢园琣ddgene人激酶orf收集物的560蛋白(addgeneno.1000000014)。如用于表達的克隆載體可以使用上述表達載體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含本文所述的載體及表達和分泌能夠切割載體包含的蛋白酶裂解位點的蛋白酶的細菌菌株。特別有用的載體是與細菌菌株組合用于將所需蛋白質遞送到如上所述的真核細胞中的載體，其中所述載體沿5'至3'方向包含：啟動子；編碼來自細菌t3ss效應蛋白的遞送信號的第一dna序列，可操作地連接到所述啟動子；框內(nèi)融合到所述第一dna序列的3'末端的編碼異源蛋白質的第二dna序列；編碼蛋白酶切割位點的第三dna序列，其中所述第三dna序列位于所述第一dna序列的3'末端和所述第二dna序列的5'末端之間。實施例實施例1：a)材料和方法細菌菌株及其生長條件。本研究中使用的菌株列于圖15a至m。用于質粒純化和克隆的大腸桿菌top10以及用于接合的大腸桿菌sm10λ以及用于繁殖pkg101的大腸桿菌bw19610[46]，常規(guī)地在37℃下在lb瓊脂平板上和在lb肉湯中生長。安非他酮以200μg/ml(yersinia)或100μg/ml(大腸桿菌)的濃度使用以選擇表達載體。鏈霉素以100μg/ml的濃度使用以選擇自殺載體。腸炎克雷伯菌mrs40[36]非安非他明抗性e40衍生物[13]及其衍生菌株在腦心浸液(bhi；difco)中常規(guī)生長。向所有小腸結腸炎耶爾森氏菌菌株中加入萘啶酸(35μg/ml)，并且所有的腸炎桿菌菌株另外補充100μg/ml內(nèi)消旋-2,6-二氨基庚二酸(mdap，sigmaaldrich)。腸桿菌sl1344在37℃下常規(guī)地在lb瓊脂平板上和在lb肉湯中生長。使用濃度為100μg/ml的安非他酮以選擇腸炎沙門氏菌中的表達載體。小腸結腸炎耶爾森氏菌的遺傳調(diào)控。小腸結腸炎耶爾森氏菌的遺傳調(diào)控已經(jīng)被描述[47，48]。簡言之，通過2-片段重疊pcr使用純化的pyv40質粒或基因組dna作為模板構建用于修飾或缺失pyv質?；蛉旧w上的基因修飾或缺失的突變體，生成相應基因缺失或修飾部分兩側200-250bp的側翼。將所得片段克隆在大腸桿菌bw19610[46]中的pkng101[43]中。將序列驗證的質粒轉化到大腸桿菌sm10λpir中，從中將質粒轉移到相應的小腸結腸炎耶爾森氏菌株中。攜帶整合載體的突變體在無選擇壓力的情況下繁殖一代。然后使用蔗糖選擇失去載體的克隆。最后通過菌落pcr鑒定突變體。質粒的構建。質粒pbad_si2或pbadsil(圖10)用于克隆具有yope(seqidno.2)的n末端138個氨基酸的融合蛋白。通過將包含用于yope和syce的內(nèi)源啟動子的syce-yope1-138片段從純化的pyv40克隆到pbad-mychisa(invitrogen)的kpni/hindiii位點中構建pbad_si2。另外的修飾包括通過消化，klenow片段處理和重新連接除去pbad-mychisa的ncoi/bgui片段。將雙向轉錄終止子(bba_b1006；igemfoundation)克隆到kpni切割和klenow處理(pbad_si2)或bgiii切割位點(pbadsil)中。此外，在yope1-138的3'端，添加以下切割位點：xbai-xhoi-bstbi-(hindiii)(圖10b)。pbadsil等于pbad_si2，但編碼從pegfp-cl(clontech)在阿拉伯糖誘導型啟動子下的ncoi/bgui位點擴增的egfp。從腸炎沙門氏菌(s.enterica)sl1344中擴增含有相應的內(nèi)源性啟動子和stea1-20片段(psi_266)、全長stea序列(psi_267)、sope1-81片段(psi_268)或將sope1-105片段(psi_269)的質粒psi_266、psi_267、psi_268和psi_269基因組dna并克隆到pbad-mychisa(invitrogen)的ncoi/kpni位點。全長基因或其片段用下表i中列出的特異性引物擴增，并作為與yope1-138的融合物克隆到質粒pbad_si2中或在z-bim(seqidno.21)的情況下克隆到pbadsil中(參見下表ii)。對于與stea或sope的融合，合成的dna構建體被kpni/hindiii切割并分別克隆到psi_266、psi_267、psi_268或psi_269中。在細菌種類的基因的情況下，使用純化的基因組dna作為模板(s.flexnerim90t、腸道沙門氏菌亞種鼠傷寒沙門氏菌sl1344、漢賽巴爾通體atcc49882)。對于人基因，如果沒有另外說明，使用通用cdna文庫(clontech)(圖15a-m)，從cdna文庫(m.affolter的贈品)擴增斑馬魚基因。將連接的質?？寺〉酱竽c桿菌top10中。使用如標準大腸桿菌電穿孔的設置將測序的質粒電穿孔到所需的腸道腸桿菌或腸桿菌菌株中。表i(引物nr.si_：序列)285:cataccatgggagtgagcaagggcgag286:ggaagatctttacttgtacagctcgtccat287:cggggtacctcaactaaatgaccgtggtg288:gttaaagcttttcgaatctagactcgagcgtggcgaactggtc292:cagtctcgagcaaattctaaacaaaatacttccac293:cagtttcgaattaatttgtattgctttgacgg296:cagtctcgagactaacataacactatccacccag297:gttaaagctttcaggaggcattctgaag299:cagtctcgagcaggccatcaagtgtgtg300:cagtttcgaatcattttctcttcctcttcttca301:cagtctcgaggctgccatccggaa302:cagtttcgaatcacaagacaaggcaccc306:gttaaagcttggaggcattctgaagatacttatt307:cagtctcgagcaaatacagagcttctatcactcag308:gttaaagctttcaagatgtgattaatgaagaaatg317:cagtttcgaacccataaaaaagccctgtc318:gttaaagcttctactctatcatcaaacgataaaatgg324:cagtctcgagttcactcaagaaacgcaaa339:cagtttcgaattttctcttcctcttcttcacg341:cgtatctagaaaaatgatgaaaatggagactg342:gttaaagcttttagctggagacggtgac346:cagtctcgagttccagatcccagagtttg347:gttaaagctttcactgggaggggg351:cagtctcgagctcgagttatctactcatagaaactacttttgcag352:cgcggatcctcagtgtctctgcggcatta353:catttattcctcctagttagtcacagcaactgctgctcctttc354:gaaaggagcagcagttgctgtgactaactaggaggaataaatg355:cgattcacggattgctttctcattattccctccaggtacta356:tagtacctggagggaataatgagaaagcaatccgtgaatcg357:cgtatctagacggctttaagtgcgacattc364:cgtatctagactaaagtatgaggagagaaaattgaa365:gttaaagctttcagcttgccgtcgt367:cgtatctagagacccgttcctggtgc369:cgtatctagaccccccaagaagaagc373:gttaaagcttgctggagacggtgacc386:cgtatctagatcaggacgcttcggaggtag387:cgtatctagaatggactgtgaggtcaacaa389:cgtatctagaggcaaccgcagca391:gttaaagctttcagtccatcccatttctg403:cgtatctagatctggaatatccctggaca406:gttaaagcttgtctgtctcaatgccacagt410:cagtctcgagatgtccggggtggtg413:cagtttcgaatcactgcagcatgatgtc417:cagtctcgagagtggtgttgatgatgacatg420:cagtttcgaattagtgataaaaatagagttcttttgtgag423:cagtctcgagatgcacataactaatttgggatt424:cagtttcgaattatacaaatgacgaatacccttt425:gttaaagcttttacaccttgcgcttcttcttgggcgggctggagacggtgac428:cgtatctagaatggacttcaacaggaacttt429:cgtatctagaggacatagtccaccagcg430:gttaaagctttcagttggatccgaaaaac433:cgtatctagagaattaaaaaaaacactcatccca434:cgtatctagaccaaaggcaaaagcaaaaa435:gttaaagcttttagctagccatggcaagc436:cgtatctagaatgccccgcccc437:gttaaagcttctacccaccgtactcgtcaat438:cgtatctagaatgtctgacacgtccagagag439:gttaaagctttcatcttcttcgcaggaaaaag445:cgcggatccttatgggttctcacagcaaaa446:catttattcctcctagttagtcaaggcaacagccaatcaagag447:ctcttgattggctgttgccttgactaactaggaggaataaatg448:ttgattgcagtgacatggtgcattattccctccaggtacta449:tagtacctggagggaataatgcaccatgtcactgcaatcaa450:cgtatctagatagccgcagatgttggtatg451:cgtatctagagatcaagtccaactggtgg463:cagtctcgaggaaagcttgtttaaggggc464:cagtttcgaattagcgacggcgacg476:gttaaagcttttacttgtacagctcgtccat477:cgtatctagagtgagcaagggcgag478:cagtctcgagatggaagattataccaaaatagagaaa479:gttaaagcttctacatcttcttaatctgattgtcca482:cgtatctagaatggcgctgcagct483:gttaaagctttcagtcattgacaggaattttg486:cgtatctagaatggagccggcggcg487:gttaaagctttcaatcggggatgtctg492:cgtatctagaatgcgcgaggagaacaaggg493:gttaaagctttcagtcccctgtggctgtgc494:cgtatctagaatggccgagccttg495:gttaaagcttttattgaagatttgtggctcc504:cgtatctagagaaaatctgtattttcaaagtgaaaatctgtattttcaaagtatgccccgcccc505:gttaaagcttcccaccgtactcgtcaattc508:cgtatctagagaaaatctgtattttcaaagtgaaaatctgtattttcaaagtatggccgagccttg509:gttaaagcttttgaagatttgtggctccc511:cgtatctagagaaaatctgtattttcaaagtgaaaatctgtattttcaaagtgtgagcaagggcgag512:cgtatctagagaaaatctgtattttcaaagtgaaaatctgtattttcaaagtccgccgaaaaaaaaacgtaaagttgtgagcaagggcgag513:gttaaagcttttaaactttacgtttttttttcggcggcttgtacagctcgtccat515:gtatctagagaaaatctgtattttcaaagtgaaaatctgtattttcaaagtgattataaagatgatgatgataaaatggccgagccttg558:cgtatctagaatgaccagttttgaagatgc559:gttaaagctttcatgactcattttcatccat561:cgtatctagaatgagtctcttaaactgtgagaacag562:gttaaagcttctacacccccgcatca580:catgccatggatttatggtcatagatatgacctc585:cagtctcgagatgcagatcttcgtcaagac586:gttaaagcttgctagcttcgaaaccaccacgtagacgtaagac588:cagtttcgaagattataaagatgatgatgataaaatggccgagccttg612:cggggtaccatgaggtagcttatttcctgataaag613:cggggtaccataattgtccaaatagttatggtagc614:catgccatggcggcaaggctcctc615:cggggtacctttatttgtcaacactgccc616:cggggtacctgcggggtctttactcg677:ttactattcgaagaaattattcataatattgcccgccatctggcccaaattggtgatgaaatggatcattaagcttggagta678:tactccaagcttaatgatccatttcatcaccaatttgggccagatggcgggcaatattatgaataatttcttcgaatagtaa682:ttactactcgagaaaaaactgagcgaatgtctgcgccgcattggtgatgaactggatagctaagcttggagta683:tactccaagcttagctatccagttcatcaccaatgcggcgcagacattcgctcagttttttctcgagtagtaa表ii：克隆的融合蛋白yop分泌。通過在bhi-ox(允許分泌條件)中將培養(yǎng)物轉移至37℃進行頂部調(diào)節(jié)子的誘導[49]。添加葡萄糖作為碳源(4mg/ml)。通過在4℃下以20800g離心10min來分離總細胞和上清液部分。將細胞沉淀作為總細胞級分。上清液中的蛋白質用10％(w/v)三氯乙酸在4℃沉淀1小時。在離心(20800g，15min)并除去上清液后，將所得沉淀在冰冷的丙酮中洗滌過夜。再次離心樣品，棄去上清液，將沉淀物空氣干燥并重懸于1xsds裝載染料中。通過sds-page分析分泌的蛋白。在每種情況下，每個泳道加載由3×108個細菌分泌的蛋白質。使用12.5％sds-page凝膠進行免疫印跡檢測特異性分泌蛋白。為了檢測總細胞中的蛋白質，如果沒有另外說明，每個泳道加載2×108個細菌，并且在免疫印跡檢測之前在12.5％sds-page凝膠上分離蛋白質。使用針對yope的大鼠單克隆抗體(mipa193-13a9；1:1000，[50])進行免疫印跡。將針對小腸結腸炎耶爾森氏菌δηορεμτasd的抗血清過夜預先吸附兩次以減少背景染色。在用ecl化學發(fā)光底物(lumiglo，kpm)顯色之前，用針對大鼠抗體并與辣根過氧化物酶綴合的二抗(1：5000；southernbiotech)進行檢測。細胞培養(yǎng)和感染。helaccl2、瑞士3t3成纖維細胞、4t1、b16f10和d2a1在補充有10％fcs和2mml-谷氨酰胺(cdmem)的dulbecco’s改進的eagle培養(yǎng)基(dmem)中培養(yǎng)。分離huvec并如所述[51]進行培養(yǎng)。jurkat和4t1細胞在補充有10％fcs和2mml-谷氨酰胺的rpmi1640中培養(yǎng)。使小腸結腸炎耶爾森氏菌在含有添加劑的bhi中在室溫下生長過夜，在新鮮bhi中稀釋至od600為0.2，并在室溫下生長2小時，然后溫度調(diào)至37℃下再水浴振蕩30min或在egfp遞送的情況下振蕩1小時。最后，通過離心(6000rcf，30秒)收集細菌，并用補充有10mmhepes和2mml-谷氨酰胺的dmem洗滌一次。腸桿菌在含有添加劑的lb中在37℃下生長過夜，并且在新鮮lb中1:40稀釋并在37℃生長2.5小時(spilt3ss誘導條件)，或者將過夜培養(yǎng)物在37℃下進一步溫育(溢出t3ss誘導條件)。最后，通過離心(6000rcf，30秒)收集細菌，并用補充有10mmhepes和2mml-谷氨酰胺的dmem洗滌一次。將接種在96孔(用于免疫熒光)或6孔(用于免疫印跡)板中的細胞以指定的moi在補充有10mmhepes和2mml-谷氨酰胺的dmem中感染。在添加細菌后，將板以1750rpm離心1min，并在37℃放置指定的時間段。如果需要，細胞外細菌用慶大霉素(100mg/ml)殺死。在免疫熒光分析的情況下，通過4％pfa固定來終止感染測定。對于免疫印跡分析，用冰冷的pbs洗滌細胞兩次，加入磷酸安全裂解緩沖液(novagen)以裂解細胞。在冰上溫育后，將細胞離心(16000rcf，25min，4℃)。收集上清液并通過bradfordbca測定法(pierce)在sdspage和免疫印跡之前使用anti-phospho-akt(ser473和t308，均為cellsignaling)、抗肌動蛋白(millipore)、anti-bid(cellsignaling)、anti-myc(santacruz)、anti-p38(cellsignaling)、anti-phospho-p38(thr80/tyr182；cellsignaling)、anti-caspase-3pl7(cellsignaling)和anti-ink4c(cellsignaling)抗體。腸炎沙門氏菌的分泌分析。為了誘導腸炎沙門氏菌的蛋白質分泌，將腸桿菌在定軌振蕩器(設定為150rpm)上在含有0.3mnacl的lb中培養(yǎng)過夜。然后將腸桿菌在含有0.3mnacl的新鮮lb中以1:50稀釋，并在37℃下振蕩生長4小時。通過在4℃下以80000g離心20min來分離總細胞和上清液部分。將細胞沉淀作為總細胞級分。上清液中的蛋白質用三氯乙酸10％(w/v)最終在4℃沉淀1小時。在離心(20800g，15min)并除去上清液后，將所得沉淀在冰冷的丙酮中洗滌過夜。將樣品再次離心，棄去上清液，將沉淀物空氣干燥并重懸于1xsds裝載染料中。通過sds-page分析分泌的蛋白。在每種情況下，每個泳道加載由3×108個細菌分泌的蛋白質。使用12.5％sds-page凝膠進行免疫印跡檢測特異性分泌蛋白。為了檢測總細胞中的蛋白質，如果沒有另外說明，每個泳道加載2×108個細菌，并且在免疫印跡檢測之前在12.5％sds-page凝膠上分離蛋白質。免疫印跡使用抗myc抗體(santacruz)進行。來自感染細胞的t3ss轉運蛋白的免疫印跡。如上所述，以100的moi感染6孔板中的hela細胞。在用tev蛋白酶轉位的小腸結腸炎耶爾森氏菌菌株共感染的情況下，設定菌株的od600，并將兩種細菌懸浮液以1：1的比例(如果沒有另外說明)在管中混合，然后加入細胞。在感染結束時，將細胞用冰冷的pbs洗滌兩次，并通過在小體積的冰冷pbs中刮取來收集。離心(16000rcf，5min，4℃)后，將沉淀溶解于補充有蛋白酶抑制劑混合物(rochecomplete，roche)的0.002％的洋地黃皂苷中。將溶解的沉淀物在冰上孵育5min，然后離心(16000rcf，25min，4℃)。收集上清液并通過bradfordbca測定(pierce)并在sdspage和使用anti-myc(santacruz，9e11)或anti-ink4c(cellsignaling)抗體的western印跡之前分析總蛋白含量。免疫熒光。如上所述感染接種在96孔板(corning)中的細胞，并在用4％pfa固定后，用pbs洗滌細胞三次。然后使用5％山羊血清在pbs0.3％tritonx-100中在室溫下封閉孔1小時。將一級抗體(anti-myc，santacruz，1:100)在含有1％bsa和0.3％tritonx-100的pbs中稀釋，并將細胞在4℃孵育過夜。在用含有1％bsa和0.3％tritonx-100的pbs稀釋二抗(af488抗小鼠，壽命技術，1:250)之前，用pbs洗滌細胞4次。如果需要，進行hoechstdna染色(壽命技術，1:2500)和/或肌動蛋白染色(dy647-phalloidin，dyeomics)。在有些情況下，在洗滌pfa之后僅直接施用dna和/或肌動蛋白染色。將細胞在室溫下孵育1小時，用pbs洗滌3次，并通過如下所述的自動圖像分析進行分析。自動顯微鏡和圖像分析。使用imagexpressmicro(moleculardevices，sunnyvale，usa)自動獲得圖像。使用metaxpress(moleculardevices，sunnyvale，usa)進行抗-myc染色強度的定量。手動選擇除了核區(qū)域的細胞內(nèi)的區(qū)域和含有細菌的區(qū)域(具有40個像素的面積的圓圈)并記錄平均強度。tnfa刺激和磷酸-p38的免疫印跡。如上所述，以100的moi感染接種在6孔板中的hela細胞。30min后加入慶大霉素以及45分鐘后加入tnfα(10ng/ml)。1小時15分鐘后將細胞用冰冷的pbs洗滌兩次，并加入磷酸安全裂解緩沖液(novagen)以裂解細胞。在冰上溫育后，將細胞離心(16000rcf，25min，4℃)。收集上清液并通過bradfordbca測定法(pierce)在sdspage和免疫印跡之前使用anti-phospho-p38、總p38抗體(cellsignaling)和抗肌動蛋白抗體(millipore)。感染的hela細胞的camp水平測定。如上所述感染接種在96孔板中的hela細胞。在感染前30分鐘，將cdmem改變?yōu)檠a充有10mmhepes和2mml-谷氨酰胺和100μm3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(ibmx，sigmaaldrich)的dmem。60min后，加入慶大霉素并將細胞在37℃下再溫育90分鐘。根據(jù)制造商的說明書(amersham，campbiotrak，rpn225)，使用競爭性elisa進行camp的測定。作為陽性對照，向補充有10mmhepes和2mml-谷氨酰胺和100μmibmx的dmem中向細胞中加入指定劑量的霍亂毒素(c8052，sigmaaldrich)1小時。斑馬魚胚胎感染、成像和自動圖像定量。所有動物實驗根據(jù)批準的指南進行。斑馬魚保持在標準條件下[52]。胚胎在28.5℃下按小時受精后(hpf)分期[53]。在本研究中使用以下斑馬魚系：野生型魚(ab/ek和ek/tl)。感染方案遵循[54]中給出的指南。將12hpf胚胎保持在含有0.2mmn-苯基硫脲(ptu)的e3培養(yǎng)基中以防止色素形成。受精2天(dpi)的胚胎用0.2mg/ml三卡因麻醉并使用發(fā)環(huán)工具在e3中的1％瓊脂板上對齊[54]。使小腸結腸炎耶爾森氏菌在補充有0.4％阿拉伯糖和抗生素的bhi和mdap中生長，并在室溫下過夜，用含有0.5％阿拉伯糖和其他添加劑的新鮮bhi稀釋至od600為0.2，在室溫下生長2小時，然后溫度轉變?yōu)?7℃水浴振蕩45分鐘。最后，通過離心(6000rcf，30秒)收集細菌，并用pbs洗滌一次。在含有mdap的pbs中od600設定為2。使用femtojetmicroinjector(eppendorf)使用femtotipsii(eppendorf)將1-2nl的該懸浮液注射到對齊的斑馬魚胚胎的后腦中，其中針尖用細鑷子折斷。注射時間設置為0.2s，補償壓力為15hpa(eppendorf，femtojet)，注射壓力調(diào)節(jié)在600和800hpa之間。通過顯微鏡檢查和通過對照板檢查液滴大小以及相應的接種物。顯微注射后，將魚收集在含有tricaine和ptu的e3中，并在37℃孵育30分鐘，并在28℃下孵育另外5小時。熒光雙目(leica)用于在斑馬魚后腦中感染后1小時觀察細菌egfp熒光，并且丟棄未正確注射的胚胎。在感染結束時，將魚用2％冰冷的pfa在冰上固定1小時，然后在4℃下用新鮮冰冷的pfa固定過夜。如前所述進行抗體染色[55,56]。毫無疑問，胚胎用0.1％吐溫pbs洗滌4次，每次洗滌5分鐘，并在室溫下用pbs-t+0.5％tritonx-100透化30分鐘。將胚在封閉溶液(pbs0.1％tween0.1％tritonx-1005％山羊血清和1％bsa)中在4℃封閉過夜。將抗體(裂解的胱天蛋白酶-3(asp175)，cellsignaling)在封閉溶液中以1:100稀釋，并在4℃下在黑暗中振蕩孵育。將魚用0.1％吐溫pbs洗滌7次，持續(xù)30分鐘，然后加入在封閉溶液中稀釋的二抗(山羊抗兔af647，invitrogen，1：500)，并在4℃溫育過夜。將幼蟲用0.1％tween的pbs在4℃下洗滌4次，每次30分鐘，并洗滌過夜，并進一步洗滌3-4次。使用40<x>水浸物鏡用leicatcssp5共聚焦顯微鏡拍攝圖像。使用imaris(bitplane)和imagej軟件(http://imagej.nih.gov/ij/)分析圖像。通過cellprofiler[57]對記錄的z-堆疊圖像的最大強度z投影執(zhí)行圖像分析(對于pbad_si2n＝14或對于z-bimn＝19)。簡而言之，通過gfp通道檢測細菌。圍繞細菌斑點的每個區(qū)域創(chuàng)建具有10個像素的半徑的圓。重疊區(qū)域在連接構件之間相等地分開。在緊密圍繞細菌的那些區(qū)域中，測量caspase3p17染色強度。磷酸化蛋白的樣品制備。對于每種條件，將helaccl-2細胞的兩個6孔板生長至匯合。如上所述感染細胞30分鐘。在指定的時間點，將板置于冰上，用冰冷的pbs洗滌兩次。然后將樣品收集在脲溶液[8m尿素(applichem)、0.1m碳酸氫銨(sigma)、0.1％rapigest(waters)、1xphosstop(roche)中。將樣品短暫渦旋，在4℃(hielscher)超聲處理，在熱混合器(eppendorf)上振蕩5分鐘，并在4℃和16000g下離心20分鐘。收集上清液并儲存在-80℃用于進一步處理。使用bca蛋白測定(pierce)測量蛋白濃度。磷酸肽富集。用終濃度為10mm的三(2-羧乙基)膦在37℃下將二硫鍵還原1小時。游離巰基用20mm碘乙酰胺(sigma)在室溫下在黑暗中烷基化30分鐘。在室溫下用n-乙酰半胱氨酸以終濃度25mm淬滅過量的碘乙酰胺10分鐘。加入lys-c內(nèi)肽酶(wako)至最終酶/蛋白質比例為1:200(w/w)，并在37℃溫育4小時。隨后將溶液用0.1m碳酸氫銨(sigma)稀釋至終濃度低于2m脲，并在37℃下用測序級修飾的胰蛋白酶(promega)以50:1的蛋白質-酶比消化過夜。在c18sep-pak柱(waters)上脫鹽并在真空下干燥。如前所述，從2mg總肽質量中用tio2分離磷酸肽[58]。簡言之，將干燥的肽溶解在用鄰苯二甲酸飽和的80％乙腈(acn)-2.5％三氟乙酸(tfa)溶液中。將肽加入到在封端的mobicol離心柱(mobitec)中的相同量的平衡的tio2(5-μm珠尺寸，glsciences)中，其在旋轉振蕩器上溫育30分鐘。將柱用飽和鄰苯二甲酸溶液洗滌兩次，用80％acn和0.1％tfa洗滌兩次，最后用0.1％tfa洗滌兩次。用0.3mnh4oh溶液洗脫肽。用5％tfa溶液和2mhcl將洗脫液的ph調(diào)節(jié)至低于2.5。磷酸肽再次用微型c18柱(harvardapparatus)脫鹽。lc-ms/ms分析。使用配備有內(nèi)部填充了1.9μmc18樹脂(reprosil-aqpur，dr.maisch)的加熱的rp-hplc柱(75μm×45cm)的easynano-lc系統(tǒng)(thermofisherscientific)進行肽的色譜分離。使用從98％溶劑a(0.15％甲酸)和2％溶劑b(98％乙腈，2％水，0.15％甲酸)的線性梯度，每個lc-ms/ms運行分析1μg總磷酸肽樣品的等分試樣至30％溶劑b，歷時120分鐘，流速為200nl/min。在裝備有納米電噴霧離子源(均為thermofisherscientific)的雙壓力ltq-orbitrap質譜儀上進行質譜分析。每個msi掃描(在orbitrap中獲得)之后是20個最豐富的前體離子的碰撞誘導解離(cid，在ltq中獲得)，動態(tài)排除30秒。對于磷酸肽分析，10種最豐富的前體離子經(jīng)受能夠進行多級激活的cid。總循環(huán)時間約為2秒。對于msi，在最大300ms的時間內(nèi)在軌道阱電池中累積106個離子，并在60,000fwhm(400m/z)的分辨率下掃描。使用正常掃描模式，104離子的目標設置和25ms的累積時間獲取ms2掃描。帶有未分配電荷狀態(tài)的單電荷離子和離子被排除觸發(fā)ms2事件。歸一化的碰撞能量設定為32％，并且對于每個光譜獲得一個微量。無標記定量和數(shù)據(jù)庫搜索。將獲得的原始文件導入到progenesis軟件工具(nonlineardynamics，版本4.0)中，以使用默認參數(shù)進行無標記定量。ms2光譜直接從progenesis以mgf格式導出，并使用mascot算法(matrixscience，version2.4)針對包含智人的預測swissprot條目的正向和反向序列的誘騙數(shù)據(jù)庫[59]進行搜索(www.ebi.ac。uk，發(fā)布日期16/05/2012)和使用來自maxquant軟件(版本1.0.13.13)的sequencereverser工具產(chǎn)生的常見的污染物(總共41,250個序列)。為了鑒定源自小腸結腸炎耶爾森氏菌的蛋白質，針對上述相同數(shù)據(jù)庫搜索非磷酸肽富集的樣品，包括預期的腸道沙門氏菌的swissprot條目(www.ebi.ac.uk，發(fā)布日期15/08/2013)前體離子耐受性設定為10ppm，并且將碎片離子耐受性設定為0.6da。搜索標準設置如下：需要完全胰蛋白酶特異性(在賴氨酸或精氨酸殘基之后切割，除非隨后是脯氨酸)，允許2次錯過切割，將脲基甲基化(c)設定為固定修飾，并將磷酸化(s，t，y)或氧化(m)分別作為富集tio2或未富集樣品的可變修飾。最后，數(shù)據(jù)庫搜索結果導出為xml文件，并導入回到progenesis軟件以進行msi功能分配。對于磷酸肽定量，輸出包含所有檢測到的特征的msi峰豐度的csv文件，并且對于未富集的樣品，創(chuàng)建包含基于每種蛋白質的所有鑒定的肽的總和特征強度的所有蛋白質測量的csv文件。重要的是，progenesis軟件設定由相似組的肽識別的蛋白質被分組在一起，并且僅數(shù)據(jù)庫中具有用于單個蛋白質的特定序列的非沖突肽被用于蛋白質定量。使用內(nèi)部開發(fā)的safequantv1.or腳本(未發(fā)布的數(shù)據(jù)，可從https://github.com/eahrne/safequant/獲得)進一步處理這兩個文件。簡而言之，軟件將識別水平假發(fā)現(xiàn)率設置為1％(基于誘餌蛋白序列數(shù)據(jù)庫命中的數(shù)量)，并且歸一化所有樣品中鑒定的ms1峰豐度(提取的離子色譜圖，xic)，即總和xic的所有確信識別的肽特征被縮放為對于所有l(wèi)c-ms運行相等。接下來，基于每個時間點的中值xic，為每個時間點分配所有定量的磷酸肽/蛋白質的豐度比。每個比率的統(tǒng)計顯著性由其q值(假發(fā)現(xiàn)率調(diào)整的p值)給出，通過計算修正的t統(tǒng)計p值[60]和調(diào)整多重測試[61]獲得。mascot自動分配磷酸化殘基的位置(得分>10)。所有注釋的光譜以及所用的ms原始文件和搜索參數(shù)將通過pride合作伙伴庫[62]保存到proteomexchangeconsortium(http：//proteomecentral.proteomexchange。org)。序列比對使用基于embl-ebiweb的clustalw2多序列比對工具在http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/進行。b)結果基于yope融合蛋白的3型分泌的蛋白質遞送系統(tǒng)雖然腸道粘桿菌t3ss效應子yope(seqidno.1)的n-末端含有足以使異源蛋白質轉運的分泌信號[10]，但其伴侶蛋白(syce)的伴侶結合位點(cbs)不包括在內(nèi)[63]。我們選擇yope(seqidno.2)的n-末端138個氨基酸與待遞送的蛋白質融合，因為已經(jīng)顯示其對于其他異源t3s底物的遞送提供最佳結果[38]。由于yope的這些n-末端138個氨基酸含有cbs，我們進一步?jīng)Q定共表達syce。從純化的小腸結腸炎耶爾森氏菌pyv40毒力質?？寺〉膕yce-yope1-138片段含有yope和其伴侶syce的內(nèi)源性啟動子(圖10)。因此，syce和任何yope1-138融合蛋白通過從在rt至37℃的生長的快速溫度轉換誘導。在37℃的培養(yǎng)時間將影響細菌中存在的融合蛋白量。在yope1-138(圖10b)的3'端添加多克隆位點(mcs)，隨后是myc和6xhis標簽和終止密碼子。仔細選擇背景應變。首先，為了限制內(nèi)源效應子的轉運，我們使用了對所有已知效應物yoph，o，p，e，m和t(命名為δηορεμτ)刪除的腸道沙門氏菌菌株。此外，我們使用的營養(yǎng)缺陷突變體不能在外源性內(nèi)消旋-2,6-二氨基庚二酸不存在下生長[65]。該菌株缺失天冬氨酸-β-半醛脫氫酶基因(aasd)，并由瑞士安全機構歸類為生物安全水平1(對ao10088/2的修改)。此外，我們刪除粘附蛋白yada和/或inva，以提供更大的背景菌株的選擇。雖然使用yada或yada/inva菌株減少背景信號誘導[66]，所傳遞的蛋白質量也受到影響[67]。yope融合蛋白遞送到真核細胞中的表征在體外分泌測定(參見圖1a)中，人工誘導蛋白分泌到周圍液體中。在基于tca的蛋白質沉淀后，使用抗yope抗體的免疫印跡分析來確定分泌的蛋白質量(圖1b)。雖然wt菌株分泌全長yope，但ahopemtasd菌株沒有。在存在yope1-138-myc-his(進一步稱為yope1-138-myc；seq_id_no._3)時，較小的yope條帶變得可見(圖1b)。因此，yope1-138片段在本文所述的裝置中分泌良好。為了分析蛋白質轉移到真核細胞的同源性，我們用yope1-138-myc編碼菌株感染hela細胞，并通過if染色myc標簽(圖2a和b)。雖然在開始只有細菌被染色，在感染后30分鐘(p.i.)，細胞輪廓開始可見，其在感染時間增加時增強(圖2b)。這種趨勢由hela細胞內(nèi)的myc標簽染色強度很好地反映(圖2a和b)。yope1-138-myc可以在細胞中的任何地方檢測到(圖2a)，除了核[68]。值得注意的是，大多數(shù)(如果不是所有)細胞通過這種方法以可比較的方式達到。由于小腸結腸炎已知感染許多不同的細胞類型[69]，我們遵循yope1-138-myc交付到各種細胞系。在感染的鼠成纖維細胞、jurkat細胞和huvec中觀察到相同的均一的抗mycif染色(圖11)。甚至，將moi向上或向下調(diào)節(jié)允許調(diào)節(jié)遞送的蛋白質量(圖2c)，而仍然大多數(shù)細胞保持靶向。低細菌數(shù)量不會導致少量具有大量遞送蛋白質的細胞，而是大多數(shù)細胞含有少量遞送蛋白質(圖2c)。t3ss遞送蛋白質到細胞核的重定向由于yope本身定位于細胞質(圖2a)，測試yope1-138片段是否阻礙核融合蛋白的定位是特別有趣。因此，我們將sv40nls添加到y(tǒng)ope1-138-egfp(分別為seqidno.39和seqidno.38)的c末端(和n末端，相似的結果)。雖然yope1-138-egfp(seqidno.37)導致弱的細胞質染色，但是yope1-138-egfp-nls在感染的hela細胞中產(chǎn)生更強的核egfp信號(圖3)。這表明yope1-138片段與nls的使用相容。雖然mcherry已經(jīng)用于植物病原體[70]，這代表gfp類蛋白通過編碼t3ss的人類或動物致病細菌的成功傳遞。這驗證了syce和yope1-138依賴性策略對于選擇的許多蛋白質的遞送非常有希望。去除融合蛋白轉運到真核細胞后的yope1-138附屬物而對于細菌遞送，yope1-138片段是非常有益的，它可能阻礙融合蛋白功能和/或定位。因此，其在蛋白質遞送后的去除將是最佳的。為此，我們在yope1-138和融合配偶體(轉錄調(diào)節(jié)因子et1-myc(seqidno.36和41)[74]和人ink4c(seqidno.3)之間插入兩個tev切割位點(enlyfqs)[71-73]40和seqidno.43))。為了保持所提出的方法的優(yōu)點，我們進一步將tev蛋白酶(s219v變體；[75])與yope1-138(seqidno.42)在另一腸炎桿菌菌株中融合。同時用兩種菌株感染hela細胞。為了允許分析蛋白質的轉運部分，在2小時后用已知不裂解細菌([76]；參見圖12作為對照)的洋地黃皂苷裂解感染的hela細胞(圖4)。免疫印跡分析揭示了僅當細胞已經(jīng)用相應的菌株感染時yope1-138-2xtev-切割位點-et1-myc或yope1-138-2xtev-切割位點flag-ink4c-myc的存在(圖4a和c)。在用純化的tev蛋白酶過夜消化該細胞裂解物時，可以觀察到移動帶(圖4a和c)。該條帶對應于具有tev切割位點的n-末端殘基的et1-myc(圖4c)或flag-ink4c(圖4a)，最可能只有一個絲氨酸。當細胞與遞送tev蛋白酶的菌株共同感染時，相同的裂解的et1-myc或flag-ink4c片段變得可見，表明經(jīng)由t3ss遞送的tev蛋白酶是功能性的，并且單個細胞已被兩種細菌菌株感染(圖4a和c)。雖然切割不完全，但大部分轉運蛋白質在感染2小時后已經(jīng)被切割，甚至用純化的tev蛋白酶過夜消化也不能產(chǎn)生更好的切割速率(圖4b)。據(jù)報道，tev蛋白酶依賴性切割可能需要依賴于融合蛋白的優(yōu)化[77，78]。轉移后tev蛋白酶依賴性去除yope1-138附屬物因此提供了第一次幾乎天然異源蛋白質的t3ss蛋白質遞送，僅通過一個n-末端氨基酸改變氨基酸組成。對yope片段的tev蛋白酶依賴性切割的替代方法包括將泛素摻入感興趣的融合蛋白中。實際上，泛素在其c-末端由一組內(nèi)源性泛素特異性c末端蛋白酶(去泛素化酶，dub)加工。由于切割假定發(fā)生在泛素的c-末端(在g76之后)，目標蛋白應該不含額外的氨基酸序列。該方法在yope1-138-泛素-flag-ink4c-mychis融合蛋白上測試。在受表達yope1-138-flag-ink4c-mychis的細菌感染的對照細胞中，發(fā)現(xiàn)對應于yope1-138-flag-ink4c-mychis的條帶，指示融合蛋白的有效轉運(圖24)。當細胞用yope1-138-泛素-flag-ink4c-mychis-表達細菌感染1小時時，可以看到對應于flag-ink4c-mychis大小的另外的條帶，表明融合蛋白的一部分被切割。該結果顯示，將泛素導入融合蛋白使得能夠切割yope1-138片段而不需要外源蛋白酶。iii型和iv型細菌效應子的轉運來自沙門氏菌的sope是一種良好表征的鳥嘌呤核苷酸交換因子(gef)，它與cdc42相互作用，促進肌動蛋白細胞骨架重塑[79]。鑒于yope1-138-myc向hela細胞的轉運沒有影響，轉運的yope1-138-sope(seqidno.5和135)誘導肌動蛋白網(wǎng)絡中的顯著變化(圖5a)。使用來自志賀氏菌(shigellaflexneri)的另一種gef效應蛋白ipgb1(seqidno.4)獲得了類似的結果。引人注目的是，肌動蛋白細胞骨架的第一次變化在2分鐘時被觀察到(圖5a)。因此，可以得出結論，t3ss依賴性蛋白質遞送在通過離心啟動感染后立即發(fā)生。為了證明嚴格的t3ss依賴性遞送，一個形成到真核細胞膜的轉運孔的t3ss蛋白之一被刪除(yopb，參見[80])(圖12)。在沙門氏菌感染期間，sope轉運之后是sptp的轉運，其作為cdc42的gtp酶活化蛋白(gap)[81]。盡管單獨的yope1-138-sope-myc(seqidno.135)的轉運觸發(fā)了大量的f-肌動蛋白重排，但與表達yope1-138-sptp(seqidno.8)的細菌的共感染取消了這種劑量依賴性方式效果(圖5b)?？筸yc染色表明這種抑制不是由于yope1-138-sope-myc轉運水平的降低(圖5b)。這些結果一起表明，細胞與兩種細菌菌株的共感染是將兩種不同效應物遞送到單細胞中以解決其功能相互作用的有效方法。s.flexneriiii型效應物ospf作為磷酸蘇氨酸裂解酶，使map激酶p38和er去磷酸化[82]。為了測試轉運的yope1-138-ospf(seqidno.7)的功能，我們監(jiān)測了用tnfα刺激后p38的磷酸化。在未感染的細胞或用表達yope1-138-myc的細菌感染的細胞中，tnfα誘導p38磷酸化。相比之下，在yope1-138-ospf轉運后，tnfα誘導的磷酸化被消除，這表明所遞送的ospf對p38具有活性(圖6a)。在沙門氏菌感染期間，iii型效應物sopb通過akt的持續(xù)活化來保護上皮細胞免于凋亡[83]。盡管yope1-138-myc或yope1-138-sope的轉運對akt沒有影響，但yope1-138-sopb(seqidno.6)的轉運在t308和s473處誘導akt的強烈磷酸化，反映了活性形式(圖6b)。使用來自柔紅霉素的sopb同源物(ipgd，seqidno.9)獲得了類似的結果。總而言之，我們的結果表明基于yope1-138的遞送系統(tǒng)對迄今測試的所有t3s效應器起作用，并且其允許研究涉及中央細胞功能包括細胞骨架、炎癥和細胞存活的控制的蛋白質。許多細菌，包括根癌土壤桿菌、嗜肺軍團桿菌和漢賽巴爾通體，使用iv型分泌以將效應物注入細胞中。我們測試了使用我們的工具是否可以將來自henselae的iv型效應物bepa轉運到hela細胞中。克隆含有c-末端bid結構域的全長bepa(seqidno.10)和bepae305-end(seqidno.11)，并用相應的菌株感染細胞。由于bepa顯示誘導環(huán)amp(camp)的產(chǎn)生[84]，在感染后測量hela細胞中camp的水平。盡管漢密氏酵母效應物bepg(seqidno.136)的bid結構域的轉運不能誘導camp、全長bepa和bepae305末端觸發(fā)的預期量的camp產(chǎn)生[84](圖6c)。該結果表明，iv型效應物也可以通過基于yope1-138的遞送系統(tǒng)有效地遞送到宿主細胞靶中，并且它們是功能性的。真核蛋白轉移到上皮細胞中為了表明人蛋白質可以通過iii型分泌遞送，我們?nèi)诤先思毎蛲稣T導劑用于由腸道沙門氏菌遞送至yope1-138或由腸桿菌遞送至stea1-20、stea、sope1-81或sope1-105。然后我們監(jiān)測了人bh3相互作用結構域死亡激動劑(bid，seqidno.24)的轉運，其是bcl-2蛋白家族的促凋亡成員。它是由caspase-8(casp8)誘導的線粒體損傷的介質。casp8切割bid，并且截短的bid(tbid，seqidno.25)轉運至線粒體，其中它觸發(fā)細胞色素c釋放。后者導致胱天蛋白酶3(casp3)激活的固有模式，在此期間它被切割成17和12kda亞基[85]。而用yope1-138-myc或yope1-138-bid表達小腸結腸炎桿菌感染1小時不能誘導細胞凋亡，人tbid的轉運比充分表征的細胞凋亡誘導劑星形孢菌素在更大程度上引發(fā)細胞死亡(圖7a和c)。如所預期的，tbid的轉運導致casp3p17亞基產(chǎn)生，甚至在與星形孢菌素一樣大的量(圖7a)。為了能夠將轉運蛋白質量與內(nèi)源bid進行比較，將hela細胞用洋地黃皂苷裂解，并使用抗bid抗體通過免疫印跡分析(圖7b)。t3ss遞送的yope1-138-tbid在hela細胞中達到約內(nèi)源性bid水平，而遞送的yope1-138-bid以甚至更高的量(2.5倍)存在(圖7b)。hela細胞的深度蛋白質組和轉錄組圖譜估計每個細胞4.4×105拷貝bid[86]。因此，可以得出結論，t3ss依賴性人蛋白質遞送達到每個細胞105至106個蛋白質。這些數(shù)字擬合通過大腸桿菌t3ss轉位的納米抗體的每個細胞的拷貝數(shù)[19]。假設對于moi和對于感染持續(xù)時間的因子為10的水平，對于抗生素添加的時間點和對于在感染之前在37℃的培養(yǎng)時間，因子為3.2，遞送的蛋白質拷貝/細胞可以從約1000個拷貝/細胞調(diào)節(jié)到約106個拷貝/細胞?？傊?，這些結果表明轉運的tbid是功能性的并在相關水平遞送。這驗證了研究蛋白質在細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，細胞生物學的中心方面的作用的轉運工具。我們進一步將鼠tbid(針對小腸結腸炎耶爾森氏菌的密碼子優(yōu)化；seqidno.194)或小鼠tbid或小鼠bax的bh3結構域(在這兩種情況下針對小腸結腸炎耶爾森氏菌進行密碼子優(yōu)化；seqidno.138和139)融合至yope1-138用于由腸道沙門氏菌遞送。而不傳遞蛋白質或yope1-138-myc的小腸結腸炎桿菌δhopetmtasd不能誘導細胞凋亡，而小鼠tbid(密碼子優(yōu)化至腸炎沙門氏菌，seqidno.194)的轉位在b16f10中引發(fā)細胞死亡(圖2)。16)，d2a1(圖17)，hela(圖18)和4t1(圖19)細胞。還發(fā)現(xiàn)針對小腸結腸炎耶爾森氏菌(seqid138)優(yōu)化的鼠bid密碼子的bh3結構域或針對小腸結腸炎耶爾森氏菌(seqid139)優(yōu)化的鼠bax密碼子的轉運誘導在b16f10(圖16)、d2a1(圖17)、hela(圖18)和4t1(圖19)細胞上的大量細胞死亡。然而用腸炎沙門氏菌(s.enterica)aroa細菌感染4小時不能誘導細胞凋亡，小鼠tbid的遞送引發(fā)細胞凋亡，因為小鼠tbid的遞送導致casp3p17亞基產(chǎn)生(圖20和21)。當使用spilt3ss誘導條件(圖20)時，sope融合蛋白的細胞凋亡誘導程度更大，這反映了sope排他地由spilt3ss遞送。stea1-20融合的鼠tbid不能誘導凋亡，非?？赡苁且驗閟tea的20個n-末端氨基酸內(nèi)的分泌信號不足以允許遞送融合蛋白(圖20和21)。與全長stea融合的小鼠tbid在spil和spillt3ss誘導條件下導致hela細胞中凋亡誘導(圖20和21)，反映了stea由t3ss兩者遞送的能力。必須注意的是，即使在溢出t3ss誘導條件下，spilt3ss的部分活性也被期望，如在spillt3ss誘導條件下sope融合蛋白的活性所見(圖21)。除了這里功能上詳細闡述的轉運真核蛋白，使用這里描述的工具分泌了幾種其他真核蛋白。這包括用于遞送小腸結腸炎耶爾森氏菌蛋白的來自細胞周期調(diào)節(jié)(mad2(seqidno.15)、cdk1(seqidno.14)、ink4a(seqidno.16)、ink4b(seqidno.17)和ink4c(seqidno.18))及其部件(ink4a84-103(seqidno.158)、p107657-662(seqidno.159)、p21141-160(seqidno.160)、p21145-160(seqidno.161)、p2117-33(seqidno.162)和細胞周期蛋白d2139-147(seqidno163))、凋亡相關蛋白(bad(seqidno.29)、fadd(seqidno.28)和caspase3p17(seqidno.22)和p12(seqidno.23)、zebrafishbid(seqidno.19)(seqidno.13)、baxbh3(seqidno.139))，信號傳導蛋白(鼠traf6(seqidno.12))和其部件(tbidbh3、tifa(seqidno.13))、gpcrga亞基(gna12，最短同種型，(seqidno.30))、納米抗體(vhhgfp4，(seqidno.31))和納米抗體融合構建體(圖13和14)以及小的gtp酶(rac1q61e(seqidno.26和137)和rhoaq63l(seqidno.12))(seqidno.32,33,34)[87]27)和來自人akt的pleckstrin同源結構域(seqidno.35)。除了功能上詳盡的凋亡相關蛋白(鼠tbid，seqidno.144-147)之外，這還包括由腸桿菌遞送(圖22)來自細胞周期調(diào)節(jié)的蛋白質(mad2(seqidno.168-169)、cdk1(seqidno.170-171)、ink4a(seqidno.164-165)和ink4c(seqidno.166-167))。雖然這些蛋白質沒有被功能驗證，但是t3ss依賴分泌的多種真核蛋白與可能刪除yope附錄結合的可能性開放了t3ss在細胞生物學的廣泛適用性的新觀點。在斑馬魚胚胎中截斷的bid的體內(nèi)轉運誘導凋亡這種細菌工具的一個有趣的特點是活動物的潛在用途。斑馬魚在其胚胎狀態(tài)可以保持透明允許熒光染色和顯微鏡[54,88,89]。已經(jīng)詳細描述了幾種斑馬魚凋亡誘導劑，其中z-bim是最有效的[90]。因此，我們決定將z-bim克隆到我們的系統(tǒng)中。即使與人bim弱同源，我們測定人上皮細胞中yope1-138-z-bim(seqidno.21)的細胞凋亡誘導的效力。用菌株轉運的yope1-138-z-bim感染1小時的hela細胞顯示出細胞死亡的明顯跡象。然后我們進行體內(nèi)實驗與受精后(dpf)斑馬魚胚胎，使用局部感染模型通過顯微注射細菌進入后腦的[54]。在感染5.5小時后，將魚固定，透化并對存在的casp3p17染色。在用表達yope1-138-myc的菌株感染時，在后腦區(qū)域可見細菌(染色“b”，圖8aa)檢測到細菌周圍的凋亡誘導(染色“c”，圖8aa)。相比之下，在遞送yope1-138-z-bim的菌株感染時，在細菌周圍的區(qū)域中觀察到存在裂解的casp3的強烈增加(圖8aaii)。在最大強度z投影上的自動圖像分析證實，yope1-138-z-bim轉運細菌遠遠超過對照細菌，在附近細胞中誘導細胞凋亡(圖8b)。這表明z-bim在細菌轉運時在斑馬魚中有功能。這些結果進一步驗證了t3ss在活的動物中的真核蛋白遞送的用途。磷蛋白組學揭示轉運蛋白質對蛋白質磷酸化的全局影響磷酸化是廣泛的翻譯后修飾，其可以激活或滅活生物過程，因此是研究信號傳導事件的合適靶標[91，92]。盡管如此，目前還沒有系統(tǒng)級分析細胞凋亡中的磷酸化。為了分析遞送到hela細胞中的人tbid的影響，我們通過lc-ms/ms使用無標記的磷蛋白體方法。在三個獨立實驗中，將細胞保留未處理，用ahopemtasd+yope1-138-myc或用ahopemtasd+yope1-138-tbid感染30分鐘。裂解細胞，隨后進行酶消化，磷酸肽的富集和單個磷肽的定量和鑒定。我們將用δηορεμτasd+yope1-138-myc感染的細胞與用δηορεμτasd+yope1-138-tbid感染的細胞進行比較，從而允許我們鑒定363個tbid依賴性磷酸化事件。286個磷酸肽顯示磷酸化增加，而77個在tbid遞送時磷酸化較少，對應于243種不同的蛋白質，我們定義為tbid磷酸化蛋白質。string數(shù)據(jù)庫用于創(chuàng)建tbid磷酸化蛋白的蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡[93](圖9a)。另外，已知與線粒體凋亡相關的27種蛋白質被添加到網(wǎng)絡，構建中心簇。有趣的是，只有來自tbid磷酸化蛋白質的少數(shù)蛋白質連接到該中心簇，表明許多蛋白質經(jīng)歷磷酸化的變化，其迄今未直接與凋亡蛋白相關。為了表征tbid磷酸化蛋白質所涵蓋的生物功能，我們使用用于注釋，可視化和綜合發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫的功能注釋工具(david，http://david.abcc.ncifcrf.gov/)進行了基因本體論分析[94，95]。鑒定的生物學功能顯示不同的細胞過程受tbid影響。參與染色質重排和轉錄調(diào)節(jié)的許多蛋白質經(jīng)歷磷酸化的改變(即cbx3，cbx5，trim28，hdac1)。hdac1例如是在轉錄調(diào)節(jié)中起作用的組蛋白脫乙酰酶。已經(jīng)顯示hdac1可以調(diào)節(jié)nf-kb的轉錄活性，nf-kb是也參與凋亡的蛋白質。我們另外確定了一個參與rna加工的蛋白質簇，以前已經(jīng)表明它在調(diào)節(jié)細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[96]。finrpk例如介導p53/tp53對dna損傷的反應，并且是誘導凋亡所必需的[97]。此外，參與蛋白質翻譯的蛋白質的磷酸化也受影響。幾種真核起始因子(即eif4e2、eif4b、eif3a、eif4g2)經(jīng)歷磷酸化的變化，這與凋亡細胞中整體蛋白質合成減少的觀察一致。有趣的是，參與細胞骨架重塑的許多蛋白質(例如pxn，map1b9)的磷酸化在tbid遞送時被改變，這與細胞形態(tài)在tbid遞送時顯著改變的觀察一致(圖9b)。細胞收縮和損失接觸反映在事實上，我們觀察到粘附相關蛋白質如z02和paxillin的磷酸化。類似地，核的收縮伴隨層狀蛋白如lamina/c和laminb1的磷酸化。總而言之，tbid遞送誘導快速凋亡反應由線粒體完整性的破裂表示(圖9b)，我們發(fā)現(xiàn)tbid誘導的細胞凋亡影響參與不同細胞過程的數(shù)百個磷酸化事件。雖然許多已鑒定的蛋白質與凋亡有關，但是已知僅有少數(shù)已知在凋亡時被磷酸化磷酸化蛋白質方法因此為進一步研究凋亡提供了有用的資源。參考文獻列表1.gibson,t.j.,m.seiler,andr.a.veitia(2013)thetransienceoftransientoverexpression.natmethods.10:715-21.2.inoue,t.,w.d.heo,j.s.grimley,t.j.wandless,andt.meyer(2005)aninducibletranslocationstrategytorapidlyactivateandinhibitsmallgtpasesignalingpathways.natmethods.2:415-8.3.pust,s.,h.hochmann,e.kaiser,g.vonfigura,k.heine,etal.(2007)acell-permeablefusiontoxinasatooltostudytheconsequencesofactin-adp-ribosylationcausedbythesalmonellaentericavirulencefactorspvbinintactcells.jbiolchem.282:10272-82.4.hayes,c.s.,s.k.aoki,andd.a.low(2010)bacterialcontact-dependentdeliverysystems.annurevgenet.44:71-90.5.cornells,g.r.(2006)thetypeiiisecretioninjectisome.natrevmicrobiol.4:811-25.6.michiels,t.,p.wattiau,r.brasseur,j.m.ruysschaert,andg.cornells(1990)secretionofyopproteinsbyyersiniae.infectimmun.58:2840-9.7.letzelter,m.,i.sorg,l.j.mota,s.meyer,j.stalder,etal.(2006)thediscoveryofsycohighlightsanewfunctionfortypeiiisecretioneffectorchaperones.emboj.25:3223-33.8.gauthier,a.,andb.b.finlay(2003)translocatedintiminreceptoranditschaperoneinteractwithatpaseofthetypeiiisecretionapparatusofenteropathogenicescherichiacoli.jbacteriol.185:6747-55.9.wattiau,p.,andg.r.cornells(1993)syce,achaperone-likeproteinofyersiniaenterocoliticainvolvedinthesecretionofyope.molmicrobiol.8:123-31.10.feldman,m.f.,s.muller,e.wuest,andg.r.cornells(2002)syceallowssecretionofyope-dhfrhybridsbytheyersiniaenterocoliticatypeiiiyscsystem.molmicrobiol.46:1183-97.ii.akeda,y.,andj.e.galan(2005)chaperonereleaseandunfoldingofsubstratesintypeiiisecretion.nature.437:911-5.12.pais,s.v.,c.milho,f.almeida,andl.j.mota(2013)identificationofnoveltypeiiisecretionchaperone-substratecomplexesofchlamydiatrachomatis.plosone.8:e56292.13.sory,m.p.,andg.r.cornells(1994)translocationofahybridyope-adenylatecyclasefromyersiniaenterocoliticaintohelacells.molmicrobiol.14:583-94.14.garcia,j.t.,f.ferracci,m.w.jackson,s.s.joseph,i.pattis,etal.(2006)measurementofeffectorproteininjectionbytypeiiiandtypeivsecretionsystemsbyusinga13-residuephosphorylatableglycogensynthasekinasetag.infectimmun.74:5645-57.15.chen,l.m.,g.briones,r.o.donis,andj.e.galan(2006)optimizationofthedeliveryofheterologousproteinsbythesalmonellaentericaserovartyphimuriumtypeiiisecretionsystemforvaccinedevelopment.infectimmun.74:5826-33.16.russmann,h.,h.shams,f.poblete,y.fu,j.e.galan,etal.(1998)deliveryofepitopesbythesalmonellatypeiiisecretionsystemforvaccinedevelopment.science.281:565-8.17.russmann,h.,u.gerdemann,e.i.igwe,k.panthel,j.heesemann,etal.(2003)attenuatedyersiniapseudotuberculosiscarriervaccineforsimultaneousantigen-specificcd4andcd8t-cellinduction.infectimmun.71:3463-72.18.chaux,p.,r.luiten,n.demotte,v.vantomme,v.stroobant,etal.(1999)identificationoffivemage-a1epitopesrecognizedbycytolytictlymphocytesobtainedbyinvitrostimulationwithdendriticcellstransducedwithmage-a1.jimmunol.163:2928-36.19.blanco-toribio,a.,s.muyldermans,g.frankel,andl.a.fernandez(2010)directinjectionoffunctionalsingle-domainantibodiesfrome.coliintohumancells.plosone.5:el5227.20.bichsel,c,d.neeld,t.hamazaki,l.j.chang,l.j.yang,etal.(2013)directreprogrammingoffibroblaststomyocytesviabacterialinjectionofmyodprotein.cellreprogram.15:117-25.21.bichsel,c,d.k.neeld,t.hamazaki,d.wu,l.j.chang,etal.(2011)bacterialdeliveryofnuclearproteinsintopluripotentanddifferentiatedcells.plosone.6:el6465.22.chamekh,m.,a.phalipon,r.quertainmont,i.salmon,p.sansonetti,etal.(2008)deliveryofbiologicallyactiveanti-inflammatorycytokinesil-10andil-lrainvivobytheshigellatypeiiisecretionapparatus.jimmunol.180:4292-8.23.hoffman,r.m.(2011)tumor-seekingsalmonellaaminoacidauxotrophs.curropinbiotechnol.22:917-23.24.hoang,t.t.,s.williams,h.p.schweizer,andj.s.lam(1997)moleculargeneticanalysisoftheregioncontainingtheessentialpseudomonasaeruginosaasdgeneencodingaspartate-beta-semialdehydedehydrogenase.microbiology.143(pt3):899-907.25.skurnik,m.,andh.wolf-watz(1989)analysisoftheyopageneencodingtheyoplvirulencedeterminantsofyersiniaspp.molmicrobiol.3:517-29.26.tertti,r.,m.skurnik,t.vartio,andp.kuusela(1992)adhesionproteinyadaofyersiniaspeciesmediatesbindingofbacteriatofibronectin.infectimmun.60:3021-4.27.isberg,r.r.,andj.m.leong(1990)multiplebeta1chainintegrinsarereceptorsforinvasin,aproteinthatpromotesbacterialpenetrationintomammaliancells.cell.60:861-71.28.isberg,r.r.,d.l.voorhis,ands.falkow(1987)identificationofinvasin:aproteinthatallowsentericbacteriatopenetrateculturedmammaliancells.cell.50:769-78.29.leong,j.m.,r.s.fournier,andr.r.isberg(1990)identificationoftheintegrinbindingdomainoftheyersiniapseudotuberculosisinvasinprotein.emboj.9:1979-89.30.mota,l.j.,andg.r.cornells(2005)thebacterialinjectionkit:typeiiisecretionsystems.annmed.37:234-49.31.trosky,j.e.,a.d.liverman,andk.orth(2008)yersiniaouterproteins:yops.cellmicrobiol.10:557-65.32.brenner,d.,andt.w.mak(2009)mitochondrialcelldeatheffectors.curropincellbiol.21:871-7.33.chalah,a.,andr.khosravi-far(2008)themitochondrialdeathpathway.advexpmedbiol.615:25-45.34.fuchs,y.,andh.steller(2011)programmedcelldeathinanimaldevelopmentanddisease.cell.147:742-58.35.waugh,d.s.(2011)anoverviewofenzymaticreagentsfortheremovalofaffinitytags.proteinexprpurif.80:283-93.36.sarker,m.r.,c.neyt,i.stainier,andg.r.cornells(1998)theyersiniayopvirulon:lcrvisrequiredforextrusionofthetranslocatorsyopbandyopd.jbacteriol.180:1207-14.37.ramamurthi,k.s.,ando.schneewind(2005)asynonymousmutationinyersiniaenterocoliticayopeaffectsthefunctionoftheyopetypeiiisecretionsignal.jbacteriol.187:707-15.38.woike,s.,n.ackermann,andj.heesemann(2011)theyersiniaenterocoliticatype3secretionsystem(t3ss)astoolboxforstudyingthecellbiologicaleffectsofbacterialrhogtpasemodulatingt3sseffectorproteins.cellmicrobiol.13:1339-57.39.forsberg,a.,andh.wolf-watz(1990)geneticanalysisoftheyoperegionofyersiniaspp.:identificationofanovelconservedlocus,yera,regulatingyopeexpression.jbacteriol.172:1547-55.40.sambrook,j.2001.molecularcloning:alaboratorymanual.d.w.russell,editor.coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.41.alto,n.m.,andj.e.dixon(2008)analysisofrho-gtpasemimicrybyafamilyofbacterialtypeiiieffectorproteins.methodsenzymol.439:131-43.42.alto,n.m.,f.shao,c.s.lazar,r.l.brost,g.chua,etal.(2006)identificationofabacterialtypeiiieffectorfamilywithgproteinmimicryfunctions.cell.124:133-45.43.kaniga,k.,i.delor,andg.r.cornells(1991)awide-host-rangesuicidevectorforimprovingreversegeneticsingram-negativebacteria:inactivationoftheblaageneofyersiniaenterocolitica.gene.109:137-41.44.yoneda,y.,t.semba,y.kaneda,r.l.noble,y.matsuoka,etal.(1992)alongsyntheticpeptidecontaininganuclearlocalizationsignalanditsflankingsequencesofsv40t-antigendirectsthetransportofigmintothenucleusefficiently.expcellres.201:313-20.45.cornells,g.r.1997.crosstalkbetweenyersiniaandeukaryoticcells.inmolecularaspectsofhost-pathogeinteractions.s.mocrae,smyth,stow,editor.cambridgeuniversitypress.46.metcalf,w.w.,w.jiang,andb.l.wanner(1994)useofthereptechniqueforallelereplacementtoconstructnewescherichiacolihostsformaintenanceofr6kgammaoriginplasmidsatdifferentcopynumbers.gene.138:1-7.47.diepold,a.,m.amstutz,s.abel,i.sorg,u.jenal,etal.(2010)decipheringtheassemblyoftheyersiniatypeiiisecretioninjectisome.emboj.29:1928-40.48.iriarte,m.,i.stainier,andg.r.cornells(1995)therposgenefromyersiniaenterocoliticaanditsinfluenceonexpressionofvirulencefactors.infectimmun.63:1840-7.49.cornells,g.,j.c.vanootegem,andc.sluiters(1987)transcriptionoftheyopregulonfromy.enterocoliticarequirestransactingpyvandchromosomalgenes.microb.pathog.2:367-79.50.grosdent,n.,i.maridonneau-parini,m.p.sory,andg.r.cornells(2002)roleofyopsandadhesinsinresistanceofyersiniaenterocoliticatophagocytosis.infectimmun.70:4165-76.51.dehio,c,m.meyer,j.berger,h.schwarz,andc.lanz(1997)interactionofbartonellahenselaewithendothelialcellsresultsinbacterialaggregationonthecellsurfaceandthesubsequentengulfmentandinternalisationofthebacterialaggregatebyauniquestructure,theinvasome.jcellsci.110(pt18):2141-54.52.westerfield,m.(2000)thezebrafishbook:aguideforthelaboratoryuseofzebrafishdanioreriouniversityoforegonpress,eugene,orp.53.kimmel,c.b.,w.w.ballard,s.r.kimmel,b.ullmann,andt.f.schilling(1995)stagesofembryonicdevelopmentofthezebrafish.devdyn.203:253-310.54.benard,ex.,a.m.vandersar,f.ellett,g.j.lieschke,h.p.spaink,etal.(2012)infectionofzebrafishembryoswithintracellularbacterialpathogens.jvisexp.55.blum,y.,h.g.belting,e.euertsdottir,l.herwig,f.luders,etal.(2008)complexcellrearrangementsduringintersegmentalvesselsproutingandvesselfusioninthezebrafishembryo.devbiol.316:312-22.56.herwig,l.,y.blum,a.krudewig,e.euertsdottir,a.lenard,etal.(2011)distinctcellularmechanismsofbloodvesselfusioninthezebrafishembryo.currbiol.21:1942-8.57.carpenter,a.e.,t.r.jones,m.r.lamprecht,c.clarke,i.h.kang,etal.(2006)cellprofiler:imageanalysissoftwareforidentifyingandquantifyingcellphenotypes.genomebiol.7:r100.58.bensimon,a.,a.schmidt,y.ziv,r.elkon,s.y.wang,etal.(2010)atm-dependentand-independentdynamicsofthenuclearphosphoproteomeafterdnadamage.scisignal.3:rs3.59.perkins,d.n.,d.j.pappin,d.m.creasy,andj.s.cottrell(1999)probability-basedproteinidentificationbysearchingsequencedatabasesusingmassspectrometrydata.electrophoresis.20:3551-67.60.smyth,g.k.(2004)linearmodelsandempiricalbayesmethodsforassessingdifferentialexpressioninmicroarrayexperiments.statapplgenetmolbiol.3:article3.61.ting,l.,m.j.cowley,s.l.hoon,m.guilhaus,m.j.raftery,etal.(2009)normalizationandstatisticalanalysisofquantitativeproteomicsdatageneratedbymetaboliclabeling.molcellproteomics.8:2227-42.62.vizcaino,j.a.,r.g.cote,a.csordas,j.a.dianes,a.fabregat,etal.(2013)theproteomicsidentifications(pride)databaseandassociatedtools:statusin2013.nucleicacidsres.41:d1063-9.63.boyd,a.p.,i.lambermont,andg.r.cornells(2000)competitionbetweentheyopsofyersiniaenterocoliticafordeliveryintoeukaryoticcells:roleofthesycechaperonebindingdomainofyope.jbacteriol.182:4811-21.64.iriarte,m.,andg.r.cornells(1998)yopt,anewyersiniayopeffectorprotein,affectsthecytoskeletonofhostcells.molmicrobiol.29:915-29.65.kudryashev,m.,m.stenta,s.schmelz,m.amstutz,u.wiesand,etal.(2013)insitustructuralanalysisoftheyersiniaenterocoliticainjectisome.elife.2:e00792.66.schulte,r.,g.a.grassl,s.preger,s.fessele,c.a.jacobi,etal.(2000)yersiniaenterocoliticainvasinproteintriggersil-8productioninepithelialcellsviaactivationofrelp65-p65homodimers.fasebj.14:1471-84.67.mota,l.j.,l.journet,i.sorg,c.agrain,andg.r.cornells(2005)bacterialinjectisomes:needlelengthdoesmatter.science.307:1278.68.isaksson,ex.,m.aili,a.fahlgren,s.e.carlsson,r.rosqvist,etal.(2009)themembranelocalizationdomainisrequiredforintracellularlocalizationandautoregulationofyopeinyersiniapseudotuberculosis.infectimmun.77:4740-9.69.denecker,g.,s.totemeyer,l.j.mota,p.troisfontaines,i.lambermont,etal.(2002)effectoflow-andhigh-virulenceyersiniaenterocoliticastrainsontheinflammatoryresponseofhumanumbilicalveinendothelialcells.infectimmun.70:3510-20.70.sharma,s.,a.hirabuchi,k.yoshida,k.fujisaki,a.ito,etal.(2013)deploymentoftheburkholderiaglumaetypeiiisecretionsystemasanefficienttoolfortranslocatingpathogeneffectorstomonocotcells.plantj.74:701-12.71.carrington,j.c.,andw.g.dougherty(1988)aviralcleavagesitecassette:identificationofaminoacidsequencesrequiredfortobaccoetchviruspolyproteinprocessing.procnatlacadsciusa.85:3391-5.72.kapust,r.b.,j.tozser,t.d.copeland,andd.s.waugh(2002)theργspecificityoftobaccoetchvirusprotease.biochembiophysrescommun.294:949-55.73.liang,h.,h.gao,c.a.maynard,andw.a.powell(2005)expressionofaself-processing,pathogenresistance-enhancinggeneconstructinarabidopsis.biotechnollett.27:435-42.74.weber,w.,c.fux,m.daoud-elbaba,b.keller,c.c.weber,etal.(2002)macrolide-basedtransgenecontrolinmammaliancellsandmice.natbiotechnol.20:901-7.75.kapust,r.b.,j.tozser,j.d.fox,d.e.anderson,s.cherry,etal.(2001)tobaccoetchvirusprotease:mechanismofautolysisandrationaldesignofstablemutantswithwild-typecatalyticproficiency.proteineng.14:993-1000.76.lee,v.t.,d.m.anderson,ando.schneewind(1998)targetingofyersiniayopproteinsintothecytosolofhelacells:one-steptranslocationofyopeacrossbacterialandeukaryoticmembranesisdependentonsycechaperone.molmicrobiol.28:593-601.77.gray,d.c.,s.mahrus,andj.a.wells(2010)activationofspecificapoptoticcaspaseswithanengineeredsmall-molecule-activatedprotease.cell.142:637-46.78.henrichs,t.,n.mikhaleva,c.conz,e.deuerling,d.boyd,etal.(2005)target-directedproteolysisattheribosome.procnatlacadsciusa.102:4246-51.79.hardt,w.d.,l.m.chen,k.e.schuebel,x.r.bustelo,andj.e.galan(1998)s.typhimuriumencodesanactivatorofrhogtpasesthatinducesmembranerufflingandnuclearresponsesinhostcells.cell.93:815-26.80.hakansson,s.,k.schesser,c.persson,e.e.galyov,r.rosqvist,etal.(1996)theyopbproteinofyersiniapseudotuberculosisisessentialforthetranslocationofyopeffectorproteinsacrossthetargetcellplasmamembraneanddisplaysacontact-dependentmembranedisruptingactivity.emboj.15:5812-23.81.stebbins,c.e.,andj.e.galan(2001)structuralmimicryinbacterialvirulence.nature.412:701-5.82.li,fl,h.xu,y.zhou,j.zhang,c.long,etal.(2007)thephosphothreoninelyaseactivityofabacterialtypeiiieffectorfamily.science.315:1000-3.83.norris,f.a.,m.p.wilson,t.s.wallis,e.e.galyov,andp.w.majerus(1998)sopb,aproteinrequiredforvirulenceofsalmonelladublin,isaninositolphosphatephosphatase.procnatlacadsciusa.95:14057-9.84.pulliainen,a.t.,k.pieles,c.s.brand,b.hauert,a.bohm,etal.(2012)bacterialeffectorbindshostcelladenylylcyclasetopotentiategalphas-dependentcampproduction.procnatlacadsciusa.109:9581-6.85.li,fl,h.zhu,c.j.xu,andj.yuan(1998)cleavageofbidbycaspase8mediatesthemitochondrialdamageinthefaspathwayofapoptosis.cell.94:491-501.86.nagaraj,n.,j.r.wisniewski,t.geiger,j.cox,m.kircher,etal.(2011)deepproteomeandtranscriptomemappingofahumancancercellline.molsystbiol.7:548.87.caussinus,e.,o.kanca,andm.affolter(2011)fluorescentfusionproteinknockoutmediatedbyanti-gfpnanobody.natstructmolbiol.19:117-21.88.cosma,c.l.,l.e.swaim,h.volkman,l.ramakrishnan,andj.m.davis(2006)zebrafishandfrogmodelsofmycobacteriummarinuminfection.currprotocmicrobiol.chapter10:unit10b2.89.mathias,j.r.,m.e.dodd,k.b.walters,s.k.yoo,e.a.ranheim,etal.(2009)characterizationofzebrafishlarvalinflammatorymacrophages.devcompimmunol.33:1212-7.90.jette,c.a.,a.m.flanagan,j.ryan,u.j.pyati,s.carbonneau,etal.(2008)bimandotherbcl-2familyproteinsexhibitcross-speciesconservationoffunctionbetweenzebrafishandmammals.celldeathdiffer.15:1063-72.91.olsen,j.v.,b.blagoev,f.gnad,b.macek,c.kumar,etal.(2006)global,invivo,andsite-specificphosphorylationdynamicsinsignalingnetworks.cell.127:635-48.92.schmutz,c,e.ahrne,c.a.kasper,t.tschon,i.sorg,etal.(2013)systems-leveloverviewofhostproteinphosphorylationduringshigellaflexneriinfectionrevealedbyphosphoproteomics.molcellproteomics.12:2952-68.93.szklarczyk,d.,a.franceschini,m.kuhn,m.simonovic,a.roth,etal.(2011)thestringdatabasein2011:functionalinteractionnetworksofproteins,globallyintegratedandscored.nucleicacidsres.39:d561-8.94.huangda,w.,b.t.sherman,andr.a.lempicki(2009)bioinformaticsenrichmenttools:pathstowardthecomprehensivefunctionalanalysisoflargegenelists.nucleicacidsres.37:1-13.95.huangda,w.,b.t.sherman,r.stephens,m.w.baseler,h.c.lane,etal.(2008)davidgeneidconversiontool.bioinformation.2:428-30.96.schwerk,c,andk.schulze-osthoff(2005)regulationofapoptosisbyalternativepre-mrnasplicing.molcell.19:1-13.97.papagiannakopoulos,t.,a.shapiro,andk.s.kosik(2008)microrna-21targetsanetworkofkeytumor-suppressivepathwaysinglioblastomacells.cancerres.68:8164-72.98.hoiseth,s.k.,b.a.stocker(1981)aromatic-dependentsalmonellatyphimuriumarenon-virulentandeffectiveaslivevaccines.nature291:238-239.序列表<110>巴塞爾大學<120>基于細菌的蛋白質遞送<130>p3119pc00<160>199<170>patentinversion3.5<210>1<211>219<212>prt<213>小腸結腸炎耶爾森氏菌(yersiniaenterocolitica)<400>1metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrglyserglyproleuarg130135140glyserilethrglncysglnglyleumetglnphecysglyglyglu145150155160leuglnalaglualaseralaileleuasnthrprovalcysglyile165170175propheserglntrpglythrvalglyglyalaalaseralatyrval180185190alaserglyvalaspleuthrglnalaalaasngluilelysglyleu195200205glyglnglnmetglnglnleuleuserleumet210215<210>2<211>138<212>prt<213>小腸結腸炎耶爾森氏菌(yersiniaenterocolitica)<400>2metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathr130135<210>3<211>169<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-mychis<400>3metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargpheglu130135140lysleuglyprogluglnlysleuileserglugluaspleuasnser145150155160alavalasphishishishishishis165<210>4<211>348<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-ipgb1<400>4metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleuglumetglnileleu130135140asnlysileleuproglnvalgluphealaileproargproserphe145150155160aspserleuserargasnlysleuvallyslysileleuservalphe165170175asnleulysglnargpheproglnlysasnpheglycysprovalasn180185190ileasnlysileargaspservalileasplysilelysaspserasn195200205serglyasnglnleuphecystrpmetserglngluargthrthrtyr210215220valsersermetileasnargserileaspglumetalailehisasn225230235240glyvalvalleuthrseraspasnlysargasnilephealaalaile245250255glulyslyspheproaspilelysleuaspglulysseralaglnthr260265270serileserhisthralaleuasngluilealaserserglyleuarg275280285alalysileleulysargtyrserseraspmetaspleupheasnthr290295300glnmetlysaspleuthrasnleuvalserserservaltyrasplys305310315320ilepheasngluserthrlysvalleuglnilegluileseralaglu325330335valleulysalavaltyrargglnserasnthrasn340345<210>5<211>380<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-sope<400>5metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluvalthrasnile130135140thrleuserthrglnhistyrargilehisargseraspvalglupro145150155160vallysglulysthrthrglulysaspilephealalysserilethr165170175alavalargasnserpheileserleuserthrserleuserasparg180185190pheserleuhisglnglnthraspileprothrthrhisphehisarg195200205glyasnalasergluglyargalavalleuthrserlysthrvallys210215220aspphemetleuglnlysleuasnserleuaspilelysglyasnala225230235240serlysaspproalatyralaargglnthrcysglualaileleuser245250255alavaltyrserasnasnlysaspglncyscyslysleuleuileser260265270lysglyvalserilethrpropheleulysgluileglyglualaala275280285glnasnalaglyleuproglygluilelysasnglyvalphethrpro290295300glyglyalaglyalaasnprophevalvalproleuilealaserala305310315320serilelystyrprohismetpheileasnhisasnglnglnvalser325330335phelysalatyralaglulysilevalmetlysgluvalthrproleu340345350pheasnlysglythrmetprothrproglnglnpheglnleuthrile355360365gluasnilealaasnlystyrleuglnasnalaser370375380<210>6<211>701<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-sopb<400>6metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleuglumetglnilegln130135140serphetyrhisseralaserleulysthrglnglualaphelysser145150155160leuglnlysthrleutyrasnglymetglnileleuserglyglngly165170175lysalaproalalysalaproaspalaargprogluileilevalleu180185190arggluproglyalathrtrpglyasntyrleuglnhisglnlysala195200205serasnhisserleuhisasnleutyrasnleuglnargaspleuleu210215220thrvalalaalathrvalleuglylysglnaspprovalleuthrser225230235240metalaasnglnmetgluleualalysvallysalaaspargproala245250255thrlysglngluglualaalaalalysalaleulyslysasnleuile260265270gluleuilealaalaargthrglnglnglnaspglyleuproalalys275280285glualahisargphealaalavalalapheargaspalaglnvallys290295300glnleuasnasnglnprotrpglnthrilelysasnthrleuthrhis305310315320asnglyhishistyrthrasnthrglnleuproalaalaglumetlys325330335ileglyalalysaspilepheproseralatyrgluglylysglyval340345350cyssertrpaspthrlysasnilehishisalaasnasnleutrpmet355360365serthrvalservalhisgluaspglylysasplysthrleuphecys370375380glyilearghisglyvalleuserprotyrhisglulysaspproleu385390395400leuarghisvalglyalagluasnlysalalysgluvalleuthrala405410415alaleupheserlysprogluleuleuasnlysalaleualaglyglu420425430alavalserleulysleuvalservalglyleuleuthralaserasn435440445ilepheglylysgluglythrmetvalgluaspglnmetargalatrp450455460glnserleuthrglnproglylysmetilehisleulysileargasn465470475480lysaspglyaspleuglnthrvallysilelysproaspvalalaala485490495pheasnvalglyvalasngluleualaleulysleuglypheglyleu500505510lysalaseraspsertyrasnalaglualaleuhisglnleuleugly515520525asnaspleuargproglualaargproglyglytrpvalglyglutrp530535540leualaglntyrproaspasntyrgluvalvalasnthrleualaarg545550555560glnilelysaspiletrplysasnasnglnhishislysaspglygly565570575gluprotyrlysleualaglnargleualametleualahisgluile580585590aspalavalproalatrpasncyslysserglylysaspargthrgly595600605metmetaspsergluilelysarggluileileserleuhisglnthr610615620hismetleuseralaproglyserleuproaspserglyglyglnlys625630635640ilepheglnlysvalleuleuasnserglyasnleugluileglnlys645650655glnasnthrglyglyalaglyasnlysvalmetlysasnleuserpro660665670gluvalleuasnleusertyrglnlysargvalglyaspgluasnile675680685trpglnservallysglyileserserleuilethrser690695700<210>7<211>383<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-ospf<400>7metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargpheglu130135140metproilelyslysprocysleulysleuasnleuaspserleuasn145150155160valvalargsergluileproglnmetleuseralaasngluargleu165170175lysasnasnpheasnileleutyrasnglnileargglntyrproala180185190tyrtyrphelysvalalaserasnvalprothrtyrseraspilecys195200205glnserpheservalmettyrglnglypheglnilevalasnhisser210215220glyaspvalpheilehisalacysarggluasnproglnserlysgly225230235240aspphevalglyasplysphehisileserilealaarggluglnval245250255proleualapheglnileleuserglyleuleuphesergluaspser260265270proileasplystrplysilethraspmetasnargvalserglngln275280285serargvalglyileglyalaglnphethrleutyrvallysserasp290295300glnglucysserglntyrseralaleuleuleuhislysilearggln305310315320pheilemetcysleugluserasnleuleuargserlysilealapro325330335glyglutyrproalaseraspvalargprogluasptrplystyrval340345350sertyrargasngluleuargseraspargaspglysergluarggln355360365gluglnmetleuargglugluprophetyrargleumetileglu370375380<210>8<211>685<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-sptp<400>8metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargmetleu130135140lystyrglugluarglysleuasnasnleuthrleuserserpheser145150155160lysvalglyvalserasnaspalaargleutyrilealalysgluasn165170175thrasplysalatyrvalalaproglulyspheserserlysvalleu180185190thrtrpleuglylysmetproleuphelysasnthrgluvalvalgln195200205lyshisthrgluasnileargvalglnaspglnlysileleuglnthr210215220pheleuhisalaleuthrglulystyrglygluthralavalasnasp225230235240alaleuleumetserargileasnmetasnlysproleuthrglnarg245250255leualavalglnilethrglucysvallysalaalaaspgluglyphe260265270ileasnleuilelysserlysaspasnvalglyvalargasnalaala275280285leuvalilelysglyglyaspthrlysvalalaglulysasnasnasp290295300valglyalagluserlysglnproleuleuaspilealaleulysgly305310315320leulysargthrleuproglnleugluglnmetaspglyasnserleu325330335arggluasnpheglnglumetalaserglyasnglyproleuargser340345350leumetthrasnleuglnasnleuasnlysileproglualalysgln355360365leuasnasptyrvalthrthrleuthrasnileglnvalglyvalala370375380argpheserglntrpglythrcysglyglygluvalgluargtrpval385390395400asplysalaserthrhisgluleuthrglnalavallyslysilehis405410415valilealalysgluleulysasnvalthralagluleuglulysile420425430glualaglyalaprometproglnthrmetserglyprothrleugly435440445leualaargphealavalserserileproileasnglnglnthrgln450455460vallysleuseraspglymetprovalprovalasnthrleuthrphe465470475480aspglylysprovalalaleualaglysertyrprolysasnthrpro485490495aspalaleuglualahismetlysmetleuleuglulysglucysser500505510cysleuvalvalleuthrsergluaspglnmetglnalalysglnleu515520525proprotyrpheargglysertyrthrpheglygluvalhisthrasn530535540serglnlysvalserseralaserglnglyglualaileaspglntyr545550555560asnmetglnleusercysglyglulysargtyrthrileprovalleu565570575hisvallysasntrpproasphisglnproleuproserthraspgln580585590leuglutyrleualaaspargvallysasnserasnglnasnglyala595600605proglyargserserserasplyshisleuprometilehiscysleu610615620glyglyvalglyargthrglythrmetalaalaalaleuvalleulys625630635640aspasnprohisserasnleugluglnvalargalaasppheargasp645650655serargasnasnargmetleugluaspalaserglnphevalglnleu660665670lysalametglnalaglnleuleumetthrthralaser675680685<210>9<211>678<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-ipgd<400>9metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleuglumethisilethr130135140asnleuglyleuhisglnvalserpheglnserglyaspsertyrlys145150155160glyalaglugluthrglylyshislysglyvalservalilesertyr165170175glnargvallysasnglygluargasnlysglyileglualaleuasn180185190argleutyrleuglnasnglnthrserleuthrglylysserleuleu195200205phealaargasplysalagluvalphecysglualailelysleuala210215220glyglyaspthrserlysilelysalametmetgluargleuaspthr225230235240tyrlysleuglygluvalasnlysarghisileasngluleuasnlys245250255valileserglugluileargalaglnleuglyilelysasnlyslys260265270gluleuglnthrlysilelysglnilephethrasptyrleuasnasn275280285lysasntrpglyprovalasnlysasnileserhishisglylysasn290295300tyrserpheglnleuthrproalaserhismetlysileglyasnlys305310315320asnilephevallysglutyrasnglylysglyilecyscysalaser325330335thrarggluargasphisilealaasnmettrpleuserlysvalval340345350aspaspgluglylysgluilepheserglyilearghisglyvalile355360365seralatyrglyleulyslysasnsersergluargalavalalaala370375380argasnlysalaglugluleuvalseralaalaleutyrserargpro385390395400gluleuleuserglnalaleuserglylysthrvalaspleulysile405410415valserthrserleuleuthrprothrserleuthrglyglygluglu420425430sermetleulysaspglnvalseralaleulysglyleuasnserlys435440445argglyglyprothrlysleuleuileargasnseraspglyleuleu450455460lysgluvalservalasnleulysvalvalthrpheasnpheglyval465470475480asngluleualaleulysmetglyleuglytrpargasnvalasplys485490495leuasnaspgluserilecysserleuleuglyaspasnpheleulys500505510asnglyvalileglyglytrpalaalaglualaileglulysasnpro515520525procyslysasnaspvaliletyrleualaasnglnilelysgluile530535540valasnasnlysleuglnlysasnaspasnglygluprotyrlysleu545550555560serglnargvalthrleuleualatyrthrileglyalavalprocys565570575trpasncyslysserglylysaspargthrglymetglnaspalaglu580585590ilelysarggluileilearglyshisgluthrglyglnphesergln595600605leuasnserlysleusersergluglulysargleupheserthrile610615620leumetasnserglyasnmetgluileglnglumetasnthrglyval625630635640proglyasnlysvalmetlyslysleuproleuserserleugluleu645650655sertyrsergluargileglyaspprolysiletrpasnmetvallys660665670glytyrserserpheval675<210>10<211>446<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-bepa<400>10metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargmetpro130135140lysalalysalalysthrlysasnthrgluileileserprohishis145150155160tyrvaltyrproasnthrthrthrleulysasnlystyrglyilelys165170175asnleuasnalapheleuglulyscysserhisaspthralalysala180185190metileasnleuargglugluserleuproglutyrpheaspthrala195200205tyrleucyshisilehisglnglnleuphelysasnthrpheglutrp210215220alaglytyrleuarghisileprophethrphealaaspglythrthr225230235240alaalametproglumetlysargthrglytrplysasnalapheala245250255ileglyaspgluileglngluglyleuglnargleuaspglnthrleu260265270alaglulysasnasnleuglnglyleuthrarggluglupheasnser275280285glualailegluleupheasnserleuasnglnleuhisprophearg290295300gluglyasnglyargthrglnargleuphephegluasnleualalys305310315320alaalaglyhisglnleuasnpheserleuilethrlysgluargmet325330335metvalalaservalalavalalagluasnglyaspleuglupromet340345350glnhisleuphegluaspileserasnproglulysileargleuleu355360365lysgluphemethisthrmetlysasnthrglyargasnvalasnasp370375380argprovalmetvalalalysgluglygluthrtyrthrglythrtyr385390395400argglyalaglyleugluglyphealaleuasnvallysglyalatyr405410415ileileglyasnileasphisleuproprogluglnleulysileleu420425430lysproglyasplysilethrphethralaprolysalaglu435440445<210>11<211>284<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-bepae305-end<400>11metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargglugly130135140asnglyargthrglnargleuphephegluasnleualalysalaala145150155160glyhisglnleuasnpheserleuilethrlysgluargmetmetval165170175alaservalalavalalagluasnglyaspleugluprometglnhis180185190leuphegluaspileserasnproglulysileargleuleulysglu195200205phemethisthrmetlysasnthrglyargasnvalasnaspargpro210215220valmetvalalalysgluglygluthrtyrthrglythrtyrarggly225230235240alaglyleugluglyphealaleuasnvallysglyalatyrileile245250255glyasnileasphisleuproprogluglnleulysileleulyspro260265270glyasplysilethrphethralaprolysalaglu275280<210>12<211>672<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-murinetraf6<400>12metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargmetser130135140leuleuasncysgluasnsercysglyserserglnserserserasp145150155160cyscysalaalametalaalasercysseralaalavallysaspasp165170175servalserglyseralaserthrglyasnleuserserserphemet180185190glugluileglnglytyraspvalglupheaspproproleugluser195200205lystyrglucysproilecysleumetalaleuargglualavalgln210215220thrprocysglyhisargphecyslysalacysileilelysserile225230235240argaspalaglyhislyscysprovalaspasngluileleuleuglu245250255asnglnleupheproaspasnphealalysarggluileleuserleu260265270thrvallyscysproasnlysglycysleuglnlysmetgluleuarg275280285hisleugluasphisglnvalhiscysgluphealaleuvalasncys290295300proglncysglnargpropheglnlyscysglnvalasnthrhisile305310315320ilegluaspcysproargargglnvalsercysvalasncysalaval325330335sermetalatyrgluglulysgluilehisaspglnsercysproleu340345350alaasnileilecysglutyrcysglythrileleuileargglugln355360365metproasnhistyraspleuaspcysprothralaproileprocys370375380thrpheservalpheglycyshisglnlysmetglnargasnhisleu385390395400alaarghisleuglngluasnthrglnleuhismetargleuleuala405410415glnalavalhisasnvalasnleualaleuargprocysaspalaala420425430serproserargglycysargprogluaspproasntyrglugluthr435440445ilelysglnleugluserargleuvalargglnasphisglnilearg450455460gluleuthralalysmetgluthrglnsermettyrvalglygluleu465470475480lysargthrileargthrleugluasplysvalalaglumetgluala485490495glnglncysasnglyiletyriletrplysileglylyspheglymet500505510hisleulysserglngluglugluargprovalvalilehisserpro515520525glyphetyrthrglyargproglytyrlysleucysmetargleuhis530535540leuglnleuprothralaglnargcysalaasntyrileserleuphe545550555560valhisthrmetglnglyglutyraspserhisleuprotrpprophe565570575glnglythrileargleuthrileleuaspglnserglualaleuile580585590argglnasnhisglugluvalmetaspalalysprogluleuleuala595600605pheglnargprothrileproargasnprolysglypheglytyrval610615620thrphemethisleuglualaleuargglnglythrpheilelysasp625630635640aspthrleuleuvalargcysgluvalserthrargpheaspmetgly645650655glyleuarglysgluglypheglnproargserthraspalaglyval660665670<210>13<211>326<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-tifa<400>13metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargmetthr130135140serphegluaspalaaspthrglugluthrvalthrcysleuglnmet145150155160thrvaltyrhisproglyglnleuglncysglyilepheglnserile165170175serpheasnargglulysleuprosersergluvalvallysphegly180185190argasnserasnilecyshistyrthrpheglnasplysglnvalser195200205argvalglnpheserleuglnleuphelyslyspheasnserserval210215220leuserphegluilelysasnmetserlyslysthrasnleuileval225230235240aspserarggluleuglytyrleuasnlysmetaspleuprotyrarg245250255cysmetvalargpheglyglutyrglnpheleumetglulysgluasp260265270glygluserleugluphephegluthrglnpheileleuserproarg275280285serleuleuglngluasnasntrpproprohisargproileproglu290295300tyrglythrtyrserleucysserserglnserserserprothrglu305310315320metaspgluasngluser325<210>14<211>437<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-cdk1<400>14metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleuglumetgluasptyr130135140thrlysileglulysileglygluglythrtyrglyvalvaltyrlys145150155160glyarghislysthrthrglyglnvalvalalametlyslysilearg165170175leuglusergluglugluglyvalproserthralailearggluile180185190serleuleulysgluleuarghisproasnilevalserleuglnasp195200205valleumetglnaspserargleutyrleuilepheglupheleuser210215220metaspleulyslystyrleuaspserileproproglyglntyrmet225230235240aspserserleuvallyssertyrleutyrglnileleuglnglyile245250255valphecyshisserargargvalleuhisargaspleulysprogln260265270asnleuleuileaspasplysglythrilelysleualaaspphegly275280285leualaargalapheglyileproileargvaltyrthrhisgluval290295300valthrleutrptyrargserprogluvalleuleuglyseralaarg305310315320tyrserthrprovalaspiletrpserileglythrilephealaglu325330335leualathrlyslysproleuphehisglyaspsergluileaspgln340345350leupheargilepheargalaleuglythrproasnasngluvaltrp355360365progluvalgluserleuglnasptyrlysasnthrpheprolystrp370375380lysproglyserleualaserhisvallysasnleuaspgluasngly385390395400leuaspleuleuserlysmetleuiletyraspproalalysargile405410415serglylysmetalaleuasnhisprotyrpheasnaspleuaspasn420425430glnilelyslysmet435<210>15<211>347<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-mad2<400>15metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargmetala130135140leuglnleuserarggluglnglyilethrleuargglyseralaglu145150155160ilevalalagluphepheserpheglyileasnserileleutyrgln165170175argglyiletyrprosergluthrphethrargvalglnlystyrgly180185190leuthrleuleuvalthrthraspleugluleuilelystyrleuasn195200205asnvalvalgluglnleulysasptrpleutyrlyscysservalgln210215220lysleuvalvalvalileserasnilegluserglygluvalleuglu225230235240argtrpglnpheaspileglucysasplysthralalysaspaspser245250255alaproargglulysserglnlysalaileglnaspgluileargser260265270valileargglnilethralathrvalthrpheleuproleuleuglu275280285valsercysserpheaspleuleuiletyrthrasplysaspleuval290295300valproglulystrpglugluserglyproglnpheilethrasnser305310315320glugluvalargleuargserphethrthrthrilehislysvalasn325330335sermetvalalatyrlysileprovalasnasp340345<210>16<211>298<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-ink4a<400>16metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargmetglu130135140proalaalaglysersermetgluproseralaasptrpleualathr145150155160alaalaalaargglyargvalglugluvalargalaleuleugluala165170175glyalaleuproasnalaproasnsertyrglyargargproilegln180185190valmetmetmetglyseralaargvalalagluleuleuleuleuhis195200205glyalagluproasncysalaaspproalathrleuthrargproval210215220hisaspalaalaarggluglypheleuaspthrleuvalvalleuhis225230235240argalaglyalaargleuaspvalargaspalatrpglyargleupro245250255valaspleualaglugluleuglyhisargaspvalalaargtyrleu260265270argalaalaalaglyglythrargglyserasnhisalaargileasp275280285alaalagluglyproseraspileproasp290295<210>17<211>280<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-ink4b<400>17metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargmetarg130135140glugluasnlysglymetproserglyglyglyseraspgluglyleu145150155160alaseralaalaalaargglyleuvalglulysvalargglnleuleu165170175glualaglyalaaspproasnglyvalasnargpheglyargargala180185190ileglnvalmetmetmetglyseralaargvalalagluleuleuleu195200205leuhisglyalagluproasncysalaaspproalathrleuthrarg210215220provalhisaspalaalaarggluglypheleuaspthrleuvalval225230235240leuhisargalaglyalaargleuaspvalargaspalatrpglyarg245250255leuprovalaspleualaglugluargglyhisargaspvalalagly260265270tyrleuargthralathrglyasp275280<210>18<211>310<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-ink4c<400>18metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargmetala130135140gluprotrpglyasngluleualaseralaalaalaargglyaspleu145150155160gluglnleuthrserleuleuglnasnasnvalasnvalasnalagln165170175asnglypheglyargthralaleuglnvalmetlysleuglyasnpro180185190gluilealaargargleuleuleuargglyalaasnproaspleulys195200205aspargthrglyphealavalilehisaspalaalaargalaglyphe210215220leuaspthrleuglnalaleuproglupheglnalaaspvalasnile225230235240gluaspasngluglyasnleuproleuhisleualaalalysglugly245250255hisleuargvalvalglupheleuvallyshisthralaserasnval260265270glyhisargasnhislysglyaspthralacysaspleualaargleu275280285tyrglyargasngluvalvalserleumetglnalaasnglyalagly290295300glyalathrasnleugln305310<210>19<211>329<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-z-bid<400>19metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargmetasp130135140pheasnargasnpheasphisileprohisthrserleuvalleuleu145150155160serpheleuasnglnlysaspcysglnasnglygluserglyargval165170175pheasptyrarggluaspasnleuserthrasnhisileaspserasp180185190glyaspilegluthraspglyhisserproproalathrtyrargasp195200205leuleuhisgluleuglnhisgluvalglnproglyleuservalasn210215220alagluglualaargalaalaargglumetalaalagluleuilearg225230235240ilealaaspleuleugluglnservalleuserglnalaalagluser245250255leuthrlyslysleuargserpheglngluglnvaltrpalaserhis260265270leuserlysglyvalglnthrleuleuglnhisvalalaalaalalys275280285gluphelyslysgluleuvalglumetalaphethrphemetleumet290295300lysthrvalcysgluargthrproasppheleupheglyleutyrgly305310315320thrvalvalglnphepheglyserasn325<210>20<211>273<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-z-t-bid<400>20metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargglyhis130135140serproproalathrtyrargaspleuleuhisgluleuglnhisglu145150155160valglnproglyleuservalasnalagluglualaargalaalaarg165170175glumetalaalagluleuileargilealaaspleuleugluglnser180185190valleuserglnalaalagluserleuthrlyslysleuargserphe195200205glngluglnvaltrpalaserhisleuserlysglyvalglnthrleu210215220leuglnhisvalalaalaalalysgluphelyslysgluleuvalglu225230235240metalaphethrphemetleumetlysthrvalcysgluargthrpro245250255asppheleupheglyleutyrglythrvalvalglnphepheglyser260265270asn<210>21<211>318<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-z-bim<400>21metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargmetser130135140aspthrserarggluglnthrleualaasnglyproalaserglngly145150155160serglygluserthrglyglyglyvalvalleuproalaglyhisphe165170175asppheproglnproglygluglyaspproleuargglyglyileser180185190metserasnasnglnserargserprometasnargthrpheserarg195200205serserserglytyrpheservalaspseraspservalproglyser210215220proleumetproasnileserglualaglnaspglyglnasnaspglu225230235240valtrpleusergluhisserhisglnhisleuglnmetalaalapro245250255valalaalaleuproproglumetvalvalalaarggluleuargarg260265270ileglyaspglupheasnargleutyrcysglualaglyalaglyval275280285asnglnleuargalaproasngluhisalailevalleutrpmetasn290295300valileileglyargleuvalhisphepheleuargargarg305310315<210>22<211>289<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-caspase3p17<400>22metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargsergly130135140ileserleuaspasnsertyrlysmetasptyrproglumetglyleu145150155160cysileileileasnasnlysasnphehislysserthrglymetthr165170175serargserglythraspvalaspalaalaasnleuarggluthrphe180185190argasnleulystyrgluvalargasnlysasnaspleuthrargglu195200205gluilevalgluleumetargaspvalserlysgluasphisserlys210215220argserserphevalcysvalleuleuserhisglyglugluglyile225230235240ilepheglythrasnglyprovalaspleulyslysilethrasnphe245250255pheargglyaspargcysargserleuthrglylysprolysleuphe260265270ileileglnalacysargglythrgluleuaspcysglyilegluthr275280285asp<210>23<211>242<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-caspase3p10/12<400>23metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserglyvalasp130135140aspaspmetalacyshislysileprovalglualaasppheleutyr145150155160alatyrserthralaproglytyrtyrsertrpargasnserlysasp165170175glysertrppheileglnserleucysalametleulysglntyrala180185190asplysleugluphemethisileleuthrargvalasnarglysval195200205alathrgluphegluserpheserpheaspalathrphehisalalys210215220lysglnileprocysilevalsermetleuthrlysgluleutyrphe225230235240tyrhis<210>24<211>337<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-人bid<400>24metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargmetasp130135140cysgluvalasnasnglyserserleuargaspglucysilethrasn145150155160leuleuvalpheglypheleuglnsercysseraspasnserphearg165170175arggluleuaspalaleuglyhisgluleuprovalleualaprogln180185190trpgluglytyraspgluleuglnthraspglyasnargserserhis195200205serargleuglyargileglualaaspsergluserglngluaspile210215220ileargasnilealaarghisleualaglnvalglyaspsermetasp225230235240argserileproproglyleuvalasnglyleualaleuglnleuarg245250255asnthrserargserglugluaspargasnargaspleualathrala260265270leugluglnleuleuglnalatyrproargaspmetglulysglulys275280285thrmetleuvalleualaleuleuleualalyslysvalalaserhis290295300thrproserleuleuargaspvalphehisthrthrvalasnpheile305310315320asnglnasnleuargthrtyrvalargserleualaargasnglymet325330335asp<210>25<211>277<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-人t-bid<400>25metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargglyasn130135140argserserhisserargleuglyargileglualaaspsergluser145150155160glngluaspileileargasnilealaarghisleualaglnvalgly165170175aspsermetaspargserileproproglyleuvalasnglyleuala180185190leuglnleuargasnthrserargserglugluaspargasnargasp195200205leualathralaleugluglnleuleuglnalatyrproargaspmet210215220glulysglulysthrmetleuvalleualaleuleuleualalyslys225230235240valalaserhisthrproserleuleuargaspvalphehisthrthr245250255valasnpheileasnglnasnleuargthrtyrvalargserleuala260265270argasnglymetasp275<210>26<211>327<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-rac1q61e<400>26metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluglnalailelys130135140cysvalvalvalglyaspglyalavalglylysthrcysleuleuile145150155160sertyrthrthrasnalapheproglyglutyrileprothrvalphe165170175aspasntyrseralaasnvalmetvalaspglylysprovalasnleu180185190glyleutrpaspthralaglyglugluasptyraspargleuargpro195200205leusertyrproglnthraspvalpheleuilecyspheserleuval210215220serproalaserphegluasnvalargalalystrptyrprogluval225230235240arghishiscysproasnthrproileileleuvalglythrlysleu245250255aspleuargaspasplysaspthrileglulysleulysglulyslys260265270leuthrproilethrtyrproglnglyleualametalalysgluile275280285glyalavallystyrleuglucysseralaleuthrglnargglyleu290295300lysthrvalpheaspglualaileargalavalleucyspropropro305310315320vallyslysarglysarglys325<210>27<211>333<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-rhoaq63l<400>27metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleuglumetalaalaile130135140arglyslysleuvalilevalglyaspglyalacysglylysthrcys145150155160leuleuilevalpheserlysaspglnpheprogluvaltyrvalpro165170175thrvalphegluasntyrvalalaaspilegluvalaspglylysgln180185190valgluleualaleutrpaspthralaglyleugluasptyrasparg195200205leuargproleusertyrproaspthraspvalileleumetcysphe210215220serileaspserproaspserleugluasnileproglulystrpthr225230235240progluvallyshisphecysproasnvalproileileleuvalgly245250255asnlyslysaspleuargasnaspgluhisthrargarggluleuala260265270lysmetlysglngluprovallysproglugluglyargaspmetala275280285asnargileglyalapheglytyrmetglucysseralalysthrlys290295300aspglyvalarggluvalpheglumetalathrargalaalaleugln305310315320alaargargglylyslyslysserglycysleuvalleu325330<210>28<211>350<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-fadd<400>28metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargmetasp130135140propheleuvalleuleuhisservalserserserleuserserser145150155160gluleuthrgluleulyspheleucysleuglyargvalglylysarg165170175lysleugluargvalglnserglyleuaspleuphesermetleuleu180185190gluglnasnaspleugluproglyhisthrgluleuleuarggluleu195200205leualaserleuargarghisaspleuleuargargvalaspaspphe210215220glualaglyalaalaalaglyalaalaproglyglugluaspleucys225230235240alaalapheasnvalilecysaspasnvalglylysasptrpargarg245250255leualaargglnleulysvalseraspthrlysileaspserileglu260265270aspargtyrproargasnleuthrgluargvalarggluserleuarg275280285iletrplysasnthrglulysgluasnalathrvalalahisleuval290295300glyalaleuargsercysglnmetasnleuvalalaaspleuvalgln305310315320gluvalglnglnalaargaspleuglnasnargserglyalametser325330335prometsertrpasnseraspalaserthrserglualaser340345350<210>29<211>308<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-bad<400>29metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleuglumetpheglnile130135140progluphegluprosergluglngluaspserserseralagluarg145150155160glyleuglyproserproalaglyaspglyproserglyserglylys165170175hishisargglnalaproglyleuleutrpaspalaserhisglngln180185190gluglnprothrserserserhishisglyglyalaglyalavalglu195200205ileargserarghissersertyrproalaglythrgluaspaspglu210215220glymetglyglugluproserpropheargglyargserargserala225230235240proproasnleutrpalaalaglnargtyrglyarggluleuargarg245250255metseraspgluphevalaspserphelyslysglyleuproargpro260265270lysseralaglythralathrglnmetargglnsersersertrpthr275280285argvalpheglnsertrptrpaspargasnleuglyargglyserthr290295300alaprosergln305<210>30<211>309<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-gpcrgna12<400>30metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleuglumetserglyval130135140valglyprometglngluproglyalaleuaspvalglyglyleuarg145150155160serglnargglnlystrppheglncyspheaspglyilethrserile165170175leuphemetvalserserserglutyraspglnvalleumetgluasp180185190argargthrasnargleuvalglusermetasnilephegluthrile195200205valasnasnlysleuphepheasnvalserileileleupheleuasn210215220lysmetaspleuleuvalglulysvallysthrvalserilelyslys225230235240hispheproasppheargglyaspprohisargleugluaspvalgln245250255argtyrleuvalglncyspheasparglysargargasnargserlys260265270proleuphehishisphethrthralaileaspthrgluasnvalarg275280285phevalphehisalavallysaspthrileleuglngluasnleulys290295300aspilemetleugln305<210>31<211>259<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-vhh4nanobodyrecognizingegfp<400>31metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargmetasp130135140glnvalglnleuvalgluserglyglyalaleuvalglnproglygly145150155160serleuargleusercysalaalaserglypheprovalasnargtyr165170175sermetargtrptyrargglnalaproglylysgluargglutrpval180185190alaglymetserseralaglyaspargsersertyrgluaspserval195200205lysglyargphethrileserargaspaspalaargasnthrvaltyr210215220leuglnmetasnserleulysprogluaspthralavaltyrtyrcys225230235240asnvalasnvalglypheglutyrtrpglyglnglythrglnvalthr245250255valserser<210>32<211>458<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-slmb1-vhh4<400>32metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserarglysmet130135140metlysmetgluthrasplysilemetaspgluthrasnserasnala145150155160glnalaphethrthrthrmetleutyraspprovalarglyslysasp165170175serserprothrtyrglnthrgluarggluleucyspheglntyrphe180185190thrglntrpsergluserglyglnvalaspphevalgluhisleuleu195200205serargmetcyshistyrglnhisglyglnileasnalatyrleulys210215220prometleuglnargasppheilethrleuleuproilelysglyleu225230235240asphisilealagluasnileleusertyrleuaspalagluserleu245250255lyssersergluleuvalcyslysglutrpleuargvalileserglu260265270glymetleutrplyslysleuilegluarglysvalargthraspser275280285leutrpargglyleualagluargargasntrpmetglntyrleuphe290295300lysproargproglyglnthrglnargprohisserphehisargglu305310315320leupheprolysilemetasnaspileaspserilegluasnasntrp325330335argthrglyarghismetaspglnvalglnleuvalgluserglygly340345350alaleuvalglnproglyglyserleuargleusercysalaalaser355360365glypheprovalasnargtyrsermetargtrptyrargglnalapro370375380glylysgluargglutrpvalalaglymetserseralaglyasparg385390395400sersertyrgluaspservallysglyargphethrileserargasp405410415aspalaargasnthrvaltyrleuglnmetasnserleulysproglu420425430aspthralavaltyrtyrcysasnvalasnvalglypheglutyrtrp435440445glyglnglythrglnvalthrvalserser450455<210>33<211>470<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-nls-slmb1-vhh4<400>33metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargpropro130135140lyslyslysarglysvalglnphelysmetmetlysmetgluthrasp145150155160lysilemetaspgluthrasnserasnalaglnalaphethrthrthr165170175metleutyraspprovalarglyslysaspserserprothrtyrgln180185190thrgluarggluleucyspheglntyrphethrglntrpsergluser195200205glyglnvalaspphevalgluhisleuleuserargmetcyshistyr210215220glnhisglyglnileasnalatyrleulysprometleuglnargasp225230235240pheilethrleuleuproilelysglyleuasphisilealagluasn245250255ileleusertyrleuaspalagluserleulyssersergluleuval260265270cyslysglutrpleuargvalilesergluglymetleutrplyslys275280285leuilegluarglysvalargthraspserleutrpargglyleuala290295300gluargargasntrpmetglntyrleuphelysproargproglygln305310315320thrglnargprohisserphehisarggluleupheprolysilemet325330335asnaspileaspserilegluasnasntrpargthrglyarghisleu340345350glumetaspglnvalglnleuvalgluserglyglyalaleuvalgln355360365proglyglyserleuargleusercysalaalaserglypheproval370375380asnargtyrsermetargtrptyrargglnalaproglylysgluarg385390395400glutrpvalalaglymetserseralaglyaspargsersertyrglu405410415aspservallysglyargphethrileserargaspaspalaargasn420425430thrvaltyrleuglnmetasnserleulysprogluaspthralaval435440445tyrtyrcysasnvalasnvalglypheglutyrtrpglyglnglythr450455460glnvalthrvalserser465470<210>34<211>466<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-slmb1-vhh4-nls<400>34metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserarglysmet130135140metlysmetgluthrasplysilemetaspgluthrasnserasnala145150155160glnalaphethrthrthrmetleutyraspprovalarglyslysasp165170175serserprothrtyrglnthrgluarggluleucyspheglntyrphe180185190thrglntrpsergluserglyglnvalaspphevalgluhisleuleu195200205serargmetcyshistyrglnhisglyglnileasnalatyrleulys210215220prometleuglnargasppheilethrleuleuproilelysglyleu225230235240asphisilealagluasnileleusertyrleuaspalagluserleu245250255lyssersergluleuvalcyslysglutrpleuargvalileserglu260265270glymetleutrplyslysleuilegluarglysvalargthraspser275280285leutrpargglyleualagluargargasntrpmetglntyrleuphe290295300lysproargproglyglnthrglnargprohisserphehisargglu305310315320leupheprolysilemetasnaspileaspserilegluasnasntrp325330335argthrglyarghismetaspglnvalglnleuvalgluserglygly340345350alaleuvalglnproglyglyserleuargleusercysalaalaser355360365glypheprovalasnargtyrsermetargtrptyrargglnalapro370375380glylysgluargglutrpvalalaglymetserseralaglyasparg385390395400sersertyrgluaspservallysglyargphethrileserargasp405410415aspalaargasnthrvaltyrleuglnmetasnserleulysproglu420425430aspthralavaltyrtyrcysasnvalasnvalglypheglutyrtrp435440445glyglnglythrglnvalthrvalserserproprolyslyslysarg450455460lysval465<210>35<211>246<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-aktph-domain<400>35metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargalaile130135140vallysgluglytrpleuhislysargglyglutyrilelysthrtrp145150155160argproargtyrpheleuleulysasnaspglythrpheileglytyr165170175lysgluargproglnaspvalaspglnargglualaproleuasnasn180185190pheservalalaglncysglnleumetlysthrgluargproargpro195200205asnthrpheileileargcysleuglntrpthrthrvalilegluarg210215220thrphehisvalgluthrproglugluarggluglutrpthrthrala225230235240ileglnthrvalalaasp245<210>36<211>465<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-et1<400>36metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargmetpro130135140argprolysleulysseraspaspgluvalleuglualaalathrval145150155160valleulysargcysglyproilegluphethrleuserglyvalala165170175lysgluvalglyleuserargalaalaleuileglnargphethrasn180185190argaspthrleuleuvalargmetmetgluargglyvalgluglnval195200205arghistyrleuasnalaileproileglyalaglyproglnglyleu210215220trpglupheleuglnvalleuvalargsermetasnthrargasnasp225230235240pheservalasntyrleuilesertrptyrgluleuglnvalproglu245250255leuargthrleualaileglnargasnargalavalvalgluglyile260265270arglysargleuproproglyalaproalaalaalagluleuleuleu275280285hisservalilealaglyalathrmetglntrpalavalaspproasp290295300glygluleualaasphisvalleualaglnilealaalaileleucys305310315320leumetpheprogluhisaspasppheglnleuleuglnalahisala325330335seralatyrserargalaargthrlysasnasntyrglyserthrile340345350gluglyleuleuaspleuproaspaspaspalaprogluglualagly355360365leualaalaproargleuserpheleuproalaglyhisthrargarg370375380leuserthralaproprothraspvalserleuglyaspgluleuhis385390395400leuaspglygluaspvalalametalahisalaaspalaleuaspasp405410415pheaspleuaspmetleuglyaspglyaspserproglyproglyphe420425430thrprohisaspseralaprotyrglyalaleuaspmetalaaspphe435440445gluphegluglnmetphethraspalaleuglyileaspglutyrgly450455460gly465<210>37<211>381<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-egfp<400>37metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargmetval130135140serlysglyglugluleuphethrglyvalvalproileleuvalglu145150155160leuaspglyaspvalasnglyhislyspheservalserglyglugly165170175gluglyaspalathrtyrglylysleuthrleulyspheilecysthr180185190thrglylysleuprovalprotrpprothrleuvalthrthrleuthr195200205tyrglyvalglncyspheserargtyrproasphismetlysglnhis210215220aspphephelysseralametprogluglytyrvalglngluargthr225230235240ilephephelysaspaspglyasntyrlysthrargalagluvallys245250255phegluglyaspthrleuvalasnargilegluleulysglyileasp260265270phelysgluaspglyasnileleuglyhislysleuglutyrasntyr275280285asnserhisasnvaltyrilemetalaasplysglnlysasnglyile290295300lysvalasnphelysilearghisasnilegluaspglyservalgln305310315320leualaasphistyrglnglnasnthrproileglyaspglyproval325330335leuleuproaspasnhistyrleuserthrglnseralaleuserlys340345350aspproasnglulysargasphismetvalleuleugluphevalthr355360365alaalaglyilethrleuglymetaspgluleutyrlys370375380<210>38<211>402<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-2xtevsite-nls-egfp<400>38metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserarggluasn130135140leutyrpheglnsergluasnleutyrpheglnserproprolyslys145150155160lysarglysvalvalserlysglyglugluleuphethrglyvalval165170175proileleuvalgluleuaspglyaspvalasnglyhislyspheser180185190valserglygluglygluglyaspalathrtyrglylysleuthrleu195200205lyspheilecysthrthrglylysleuprovalprotrpprothrleu210215220valthrthrleuthrtyrglyvalglncyspheserargtyrproasp225230235240hismetlysglnhisaspphephelysseralametprogluglytyr245250255valglngluargthrilephephelysaspaspglyasntyrlysthr260265270argalagluvallysphegluglyaspthrleuvalasnargileglu275280285leulysglyileaspphelysgluaspglyasnileleuglyhislys290295300leuglutyrasntyrasnserhisasnvaltyrilemetalaasplys305310315320glnlysasnglyilelysvalasnphelysilearghisasnileglu325330335aspglyservalglnleualaasphistyrglnglnasnthrproile340345350glyaspglyprovalleuleuproaspasnhistyrleuserthrgln355360365seralaleuserlysaspproasnglulysargasphismetvalleu370375380leugluphevalthralaalaglyilethrleuglymetaspgluleu385390395400tyrlys<210>39<211>402<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-2xtevsite-egfp-nls<400>39metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserarggluasn130135140leutyrpheglnsergluasnleutyrpheglnservalserlysgly145150155160glugluleuphethrglyvalvalproileleuvalgluleuaspgly165170175aspvalasnglyhislyspheservalserglygluglygluglyasp180185190alathrtyrglylysleuthrleulyspheilecysthrthrglylys195200205leuprovalprotrpprothrleuvalthrthrleuthrtyrglyval210215220glncyspheserargtyrproasphismetlysglnhisaspphephe225230235240lysseralametprogluglytyrvalglngluargthrilephephe245250255lysaspaspglyasntyrlysthrargalagluvallyspheglugly260265270aspthrleuvalasnargilegluleulysglyileaspphelysglu275280285aspglyasnileleuglyhislysleuglutyrasntyrasnserhis290295300asnvaltyrilemetalaasplysglnlysasnglyilelysvalasn305310315320phelysilearghisasnilegluaspglyservalglnleualaasp325330335histyrglnglnasnthrproileglyaspglyprovalleuleupro340345350aspasnhistyrleuserthrglnseralaleuserlysaspproasn355360365glulysargasphismetvalleuleugluphevalthralaalagly370375380ilethrleuglymetaspgluleutyrlysproprolyslyslysarg385390395400lysval<210>40<211>324<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-2xtevsite-ink4c<400>40metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserarggluasn130135140leutyrpheglnsergluasnleutyrpheglnsermetalaglupro145150155160trpglyasngluleualaseralaalaalaargglyaspleuglugln165170175leuthrserleuleuglnasnasnvalasnvalasnalaglnasngly180185190pheglyargthralaleuglnvalmetlysleuglyasnprogluile195200205alaargargleuleuleuargglyalaasnproaspleulysasparg210215220thrglyphealavalilehisaspalaalaargalaglypheleuasp225230235240thrleuglnalaleuproglupheglnalaaspvalasnilegluasp245250255asngluglyasnleuproleuhisleualaalalysgluglyhisleu260265270argvalvalglupheleuvallyshisthralaserasnvalglyhis275280285argasnhislysglyaspthralacysaspleualaargleutyrgly290295300argasngluvalvalserleumetglnalaasnglyalaglyglyala305310315320thrasnleugln<210>41<211>479<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-2xtevsite-et1<400>41metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserarggluasn130135140leutyrpheglnsergluasnleutyrpheglnsermetproargpro145150155160lysleulysseraspaspgluvalleuglualaalathrvalvalleu165170175lysargcysglyproilegluphethrleuserglyvalalalysglu180185190valglyleuserargalaalaleuileglnargphethrasnargasp195200205thrleuleuvalargmetmetgluargglyvalgluglnvalarghis210215220tyrleuasnalaileproileglyalaglyproglnglyleutrpglu225230235240pheleuglnvalleuvalargsermetasnthrargasnasppheser245250255valasntyrleuilesertrptyrgluleuglnvalprogluleuarg260265270thrleualaileglnargasnargalavalvalgluglyilearglys275280285argleuproproglyalaproalaalaalagluleuleuleuhisser290295300valilealaglyalathrmetglntrpalavalaspproaspglyglu305310315320leualaasphisvalleualaglnilealaalaileleucysleumet325330335pheprogluhisaspasppheglnleuleuglnalahisalaserala340345350tyrserargalaargthrlysasnasntyrglyserthrileglugly355360365leuleuaspleuproaspaspaspalaprogluglualaglyleuala370375380alaproargleuserpheleuproalaglyhisthrargargleuser385390395400thralaproprothraspvalserleuglyaspgluleuhisleuasp405410415glygluaspvalalametalahisalaaspalaleuaspasppheasp420425430leuaspmetleuglyaspglyaspserproglyproglyphethrpro435440445hisaspseralaprotyrglyalaleuaspmetalaaspphegluphe450455460gluglnmetphethraspalaleuglyileaspglutyrglygly465470475<210>42<211>380<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-tevproteases219v<400>42metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleuglugluserleuphe130135140lysglyproargasptyrasnproileserserthrilecyshisleu145150155160thrasngluseraspglyhisthrthrserleutyrglyileglyphe165170175glypropheileilethrasnlyshisleupheargargasnasngly180185190thrleuleuvalglnserleuhisglyvalphelysvallysasnthr195200205thrthrleuglnglnhisleuileaspglyargaspmetileileile210215220argmetprolysaspphepropropheproglnlysleulysphearg225230235240gluproglnargglugluargilecysleuvalthrthrasnphegln245250255thrlyssermetsersermetvalseraspthrsercysthrphepro260265270serseraspglyilephetrplyshistrpileglnthrlysaspgly275280285glncysglyserproleuvalserthrargaspglypheilevalgly290295300ilehisseralaserasnphethrasnthrasnasntyrphethrser305310315320valprolysasnphemetgluleuleuthrasnglnglualaglngln325330335trpvalserglytrpargleuasnalaaspservalleutrpglygly340345350hislysvalphemetvallysprogluglupropheglnprovallys355360365glualathrglnleumetasnargargargargarg370375380<210>43<211>332<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-2xtevsite-flag-ink4c<400>43metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserarggluasn130135140leutyrpheglnsergluasnleutyrpheglnserasptyrlysasp145150155160aspaspasplysmetalagluprotrpglyasngluleualaserala165170175alaalaargglyaspleugluglnleuthrserleuleuglnasnasn180185190valasnvalasnalaglnasnglypheglyargthralaleuglnval195200205metlysleuglyasnprogluilealaargargleuleuleuarggly210215220alaasnproaspleulysaspargthrglyphealavalilehisasp225230235240alaalaargalaglypheleuaspthrleuglnalaleuprogluphe245250255glnalaaspvalasnilegluaspasngluglyasnleuproleuhis260265270leualaalalysgluglyhisleuargvalvalglupheleuvallys275280285histhralaserasnvalglyhisargasnhislysglyaspthrala290295300cysaspleualaargleutyrglyargasngluvalvalserleumet305310315320glnalaasnglyalaglyglyalathrasnleugln325330<210>44<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_285<400>44cataccatgggagtgagcaagggcgag27<210>45<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_286<400>45ggaagatctttacttgtacagctcgtccat30<210>46<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_287<400>46cggggtacctcaactaaatgaccgtggtg29<210>47<211>43<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_288<400>47gttaaagcttttcgaatctagactcgagcgtggcgaactggtc43<210>48<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_292<400>48cagtctcgagcaaattctaaacaaaatacttccac35<210>49<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_293<400>49cagtttcgaattaatttgtattgctttgacgg32<210>50<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_296<400>50cagtctcgagactaacataacactatccacccag34<210>51<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_297<400>51gttaaagctttcaggaggcattctgaag28<210>52<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_299<400>52cagtctcgagcaggccatcaagtgtgtg28<210>53<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_300<400>53cagtttcgaatcattttctcttcctcttcttca33<210>54<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_301<400>54cagtctcgaggctgccatccggaa24<210>55<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_302<400>55cagtttcgaatcacaagacaaggcaccc28<210>56<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_306<400>56gttaaagcttggaggcattctgaagatacttatt34<210>57<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_307<400>57cagtctcgagcaaatacagagcttctatcactcag35<210>58<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_308<400>58gttaaagctttcaagatgtgattaatgaagaaatg35<210>59<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_317<400>59cagtttcgaacccataaaaaagccctgtc29<210>60<211>37<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_318<400>60gttaaagcttctactctatcatcaaacgataaaatgg37<210>61<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_324<400>61cagtctcgagttcactcaagaaacgcaaa29<210>62<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_339<400>62cagtttcgaattttctcttcctcttcttcacg32<210>63<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_341<400>63cgtatctagaaaaatgatgaaaatggagactg32<210>64<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_342<400>64gttaaagcttttagctggagacggtgac28<210>65<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_346<400>65cagtctcgagttccagatcccagagtttg29<210>66<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_347<400>66gttaaagctttcactgggaggggg24<210>67<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_351<400>67cagtctcgagctcgagttatctactcatagaaactacttttgcag45<210>68<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_352<400>68cgcggatcctcagtgtctctgcggcatta29<210>69<211>43<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_353<400>69catttattcctcctagttagtcacagcaactgctgctcctttc43<210>70<211>43<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_354<400>70gaaaggagcagcagttgctgtgactaactaggaggaataaatg43<210>71<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_355<400>71cgattcacggattgctttctcattattccctccaggtacta41<210>72<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_356<400>72tagtacctggagggaataatgagaaagcaatccgtgaatcg41<210>73<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_357<400>73cgtatctagacggctttaagtgcgacattc30<210>74<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_364<400>74cgtatctagactaaagtatgaggagagaaaattgaa36<210>75<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_365<400>75gttaaagctttcagcttgccgtcgt25<210>76<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_367<400>76cgtatctagagacccgttcctggtgc26<210>77<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_369<400>77cgtatctagaccccccaagaagaagc26<210>78<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_373<400>78gttaaagcttgctggagacggtgacc26<210>79<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_386<400>79cgtatctagatcaggacgcttcggaggtag30<210>80<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_387<400>80cgtatctagaatggactgtgaggtcaacaa30<210>81<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_389<400>81cgtatctagaggcaaccgcagca23<210>82<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_391<400>82gttaaagctttcagtccatcccatttctg29<210>83<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_403<400>83cgtatctagatctggaatatccctggaca29<210>84<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_406<400>84gttaaagcttgtctgtctcaatgccacagt30<210>85<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_410<400>85cagtctcgagatgtccggggtggtg25<210>86<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_413<400>86cagtttcgaatcactgcagcatgatgtc28<210>87<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_417<400>87cagtctcgagagtggtgttgatgatgacatg31<210>88<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_420<400>88cagtttcgaattagtgataaaaatagagttcttttgtgag40<210>89<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_423<400>89cagtctcgagatgcacataactaatttgggatt33<210>90<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_424<400>90cagtttcgaattatacaaatgacgaatacccttt34<210>91<211>52<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_425<400>91gttaaagcttttacaccttgcgcttcttcttgggcgggctggagacggtgac52<210>92<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_428<400>92cgtatctagaatggacttcaacaggaacttt31<210>93<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_429<400>93cgtatctagaggacatagtccaccagcg28<210>94<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_430<400>94gttaaagctttcagttggatccgaaaaac29<210>95<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_433<400>95cgtatctagagaattaaaaaaaacactcatccca34<210>96<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_434<400>96cgtatctagaccaaaggcaaaagcaaaaa29<210>97<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_435<400>97gttaaagcttttagctagccatggcaagc29<210>98<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_436<400>98cgtatctagaatgccccgcccc22<210>99<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_437<400>99gttaaagcttctacccaccgtactcgtcaat31<210>100<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_438<400>100cgtatctagaatgtctgacacgtccagagag31<210>101<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_439<400>101gttaaagctttcatcttcttcgcaggaaaaag32<210>102<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_445<400>102cgcggatccttatgggttctcacagcaaaa30<210>103<211>43<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_446<400>103catttattcctcctagttagtcaaggcaacagccaatcaagag43<210>104<211>43<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_447<400>104ctcttgattggctgttgccttgactaactaggaggaataaatg43<210>105<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_448<400>105ttgattgcagtgacatggtgcattattccctccaggtacta41<210>106<211>41<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_449<400>106tagtacctggagggaataatgcaccatgtcactgcaatcaa41<210>107<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_450<400>107cgtatctagatagccgcagatgttggtatg30<210>108<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_451<400>108cgtatctagagatcaagtccaactggtgg29<210>109<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_463<400>109cagtctcgaggaaagcttgtttaaggggc29<210>110<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_464<400>110cagtttcgaattagcgacggcgacg25<210>111<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_476<400>111gttaaagcttttacttgtacagctcgtccat31<210>112<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_477<400>112cgtatctagagtgagcaagggcgag25<210>113<211>37<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_478<400>113cagtctcgagatggaagattataccaaaatagagaaa37<210>114<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_479<400>114gttaaagcttctacatcttcttaatctgattgtcca36<210>115<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_482<400>115cgtatctagaatggcgctgcagct24<210>116<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_483<400>116gttaaagctttcagtcattgacaggaattttg32<210>117<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_486<400>117cgtatctagaatggagccggcggcg25<210>118<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_487<400>118gttaaagctttcaatcggggatgtctg27<210>119<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_492<400>119cgtatctagaatgcgcgaggagaacaaggg30<210>120<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_493<400>120gttaaagctttcagtcccctgtggctgtgc30<210>121<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_494<400>121cgtatctagaatggccgagccttg24<210>122<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_495<400>122gttaaagcttttattgaagatttgtggctcc31<210>123<211>64<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_504<400>123cgtatctagagaaaatctgtattttcaaagtgaaaatctgtattttcaaagtatgccccg60cccc64<210>124<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_505<400>124gttaaagcttcccaccgtactcgtcaattc30<210>125<211>66<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_508<400>125cgtatctagagaaaatctgtattttcaaagtgaaaatctgtattttcaaagtatggccga60gccttg66<210>126<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_509<400>126gttaaagcttttgaagatttgtggctccc29<210>127<211>67<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_511<400>127cgtatctagagaaaatctgtattttcaaagtgaaaatctgtattttcaaagtgtgagcaa60gggcgag67<210>128<211>91<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_512<400>128cgtatctagagaaaatctgtattttcaaagtgaaaatctgtattttcaaagtccgccgaa60aaaaaaacgtaaagttgtgagcaagggcgag91<210>129<211>55<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_513<400>129gttaaagcttttaaactttacgtttttttttcggcggcttgtacagctcgtccat55<210>130<211>90<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_515<400>130cgtatctagagaaaatctgtattttcaaagtgaaaatctgtattttcaaagtgattataa60agatgatgatgataaaatggccgagccttg90<210>131<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_558<400>131cgtatctagaatgaccagttttgaagatgc30<210>132<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_559<400>132gttaaagctttcatgactcattttcatccat31<210>133<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_561<400>133cgtatctagaatgagtctcttaaactgtgagaacag36<210>134<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_562<400>134gttaaagcttctacacccccgcatca26<210>135<211>405<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-sope-mychis<400>135metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluvalthrasnile130135140thrleuserthrglnhistyrargilehisargseraspvalglupro145150155160vallysglulysthrthrglulysaspilephealalysserilethr165170175alavalargasnserpheileserleuserthrserleuserasparg180185190pheserleuhisglnglnthraspileprothrthrhisphehisarg195200205glyasnalasergluglyargalavalleuthrserlysthrvallys210215220aspphemetleuglnlysleuasnserleuaspilelysglyasnala225230235240serlysaspproalatyralaargglnthrcysglualaileleuser245250255alavaltyrserasnasnlysaspglncyscyslysleuleuileser260265270lysglyvalserilethrpropheleulysgluileglyglualaala275280285glnasnalaglyleuproglygluilelysasnglyvalphethrpro290295300glyglyalaglyalaasnprophevalvalproleuilealaserala305310315320serilelystyrprohismetpheileasnhisasnglnglnvalser325330335phelysalatyralaglulysilevalmetlysgluvalthrproleu340345350pheasnlysglythrmetprothrproglnglnpheglnleuthrile355360365gluasnilealaasnlystyrleuglnasnalaserlysleuglypro370375380gluglnlysleuileserglugluaspleuasnseralavalasphis385390395400hishishishishis405<210>136<211>435<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-bepg715-end<400>136metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluphethrglnglu130135140thrglnlysmetleuileglulysgluileileproproleusertyr145150155160valaspvalalaserlysileargglusergluvalvallysserser165170175metglnlysilelysthrleucysglyvalvaltyrglyasnproasp180185190ileleugluglylysmetprolysmetglyileprovalthrasnlys195200205asnvalglugluleuglulysphealaargglnvalglyasnphepro210215220sersercysglylysilevalglypheserpheleuglyilelysser225230235240glualaargalahisalaglugluasnpheleuproleuserhisala245250255ilephesertyralahisasnvallysglnalaglulysaspileleu260265270glualatyrphelysgluglngluargcysalaglnservalgluthr275280285proserglugluilethrasnleuleuserphethrglngluglngln290295300lysgluileleuserasnserprolysleuargthrglnvallysala305310315320tyrserglnlysleuhisasnargleuserproasnaspleuglnala325330335ilesergluargserhisthrlysleualagluserleuglythrser340345350valasnglnalaglulysilealaglnileleuthrglnthrlysasp355360365valvalglnileleuglnglnglnglulysleuglyleutyrglnser370375380ilemetlysglyaspglyarggluthralalysvalasnmetserala385390395400ilelysalathrglnmetthrthrlysvalthrserleulysalaval405410415gluglnilevalargproprolysvalgluthralalysvalvalser420425430metserarg435<210>137<211>354<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-rac1q61e-mychis<400>137metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluglnalailelys130135140cysvalvalvalglyaspglyalavalglylysthrcysleuleuile145150155160sertyrthrthrasnalapheproglyglutyrileprothrvalphe165170175aspasntyrseralaasnvalmetvalaspglylysprovalasnleu180185190glyleutrpaspthralaglyglugluasptyraspargleuargpro195200205leusertyrproglnthraspvalpheleuilecyspheserleuval210215220serproalaserphegluasnvalargalalystrptyrprogluval225230235240arghishiscysproasnthrproileileleuvalglythrlysleu245250255aspleuargaspasplysaspthrileglulysleulysglulyslys260265270leuthrproilethrtyrproglnglyleualametalalysgluile275280285glyalavallystyrleuglucysseralaleuthrglnargglyleu290295300lysthrvalpheaspglualaileargalavalleucyspropropro305310315320vallyslysarglysarglyspheglulysleuglyprogluglnlys325330335leuileserglugluaspleuasnseralavalasphishishishis340345350hishis<210>138<211>163<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-y.enterocoliticacodonoptimizedmurinebidbh3part<400>138metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluserargpheglu130135140gluileilehisasnilealaarghisleualaglnileglyaspglu145150155160metasphis<210>139<211>156<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-y.enterocoliticacodonoptimizedmurinebaxbh3part<400>139metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleuglulyslysleuser130135140glucysleuargargileglyaspgluleuaspser145150155<210>140<211>20<212>prt<213>腸炎沙門氏菌(salmonellaenterica)<220><223>stea1-20<400>140metprotyrthrservalserthrtyralaargalaleuserglyasn151015lysleuprohis20<210>141<211>210<212>prt<213>腸炎沙門氏菌(salmonellaenterica)<220><223>stea<400>141metprotyrthrservalserthrtyralaargalaleuserglyasn151015lysleuprohisvalalaalaglyasptyrgluasnlysleuserthr202530lysilemetlysglyileleutyrvalleuthralaglyleualatyr354045glyphethrargvalilegluhistyrcysasnvalthrprolysval505560alagluphecysalaasnalaglyasnilehisasnhisleualaasp65707580alavalargaspglyleuphethrileaspvalgluleuseraspgly859095argmetleuthrphegluglnleuserleuilealagluglylyspro100105110ilevalargileseraspglygluhisthrvalgluvalgluglythr115120125pheglugluilecysmetargleuglugluglyphepheglualapro130135140alatyrtyrasptyraspileaspglulystyrlysthrvalargglu145150155160argmetalaalatyrasnalaleuproglnalaleuglyalailepro165170175cysleuglutyrtyrilealaargalaserasnmetglnglualalys180185190alaglntrpalaalaaspilelysalaargtyrhisasntyrleuasp195200205asntyr210<210>142<211>81<212>prt<213>腸炎沙門氏菌(salmonellaenterica)<220><223>sope1-81<400>142valthrlysilethrleuserproglnasnpheargileglnlysgln151015gluthrthrleuleulysglulysserthrglulysasnserleuala202530lysserileleualavallysasnhispheilegluleuargserlys354045leusergluargpheileserhislysasnthrgluserseralathr505560hisphehisargglyseralasergluglyargalavalleuthrasn65707580lys<210>143<211>105<212>prt<213>腸炎沙門氏菌(salmonellaenterica)<220><223>sope1-105<400>143valthrlysilethrleuserproglnasnpheargileglnlysgln151015gluthrthrleuleulysglulysserthrglulysasnserleuala202530lysserileleualavallysasnhispheilegluleuargserlys354045leusergluargpheileserhislysasnthrgluserseralathr505560hisphehisargglyseralasergluglyargalavalleuthrasn65707580lysvalvallysaspphemetleuglnthrleuasnaspileaspile859095argglyseralaserlysaspproala100105<210>144<211>158<212>prt<213>人工序列<220><223>stea1-20-s.entericacodonoptimizedmurinet-bid<400>144metprotyrthrservalserthrtyralaargalaleuserglyasn151015lysleuprohisglythrglyserglnalaserargserpheasngln202530glyargilegluproaspsergluserglnglugluileilehisasn354045ilealaarghisleualaglnileglyaspglumetasphisasnile505560glnprothrleuvalargglnleualaalaglnphemetasnglyser65707580leuserglugluasplysargasncysleualalysalaleuaspglu859095vallysthralapheproargaspmetgluasnasplysalametleu100105110ilemetthrmetleuleualalyslysvalalaserhisalaproser115120125leuleuargaspvalphehisthrthrvalasnpheileasnglnasn130135140leuphesertyrvalargasnleuvalargasnglumetasp145150155<210>145<211>348<212>prt<213>人工序列<220><223>stea-s.entericacodonoptimizedmurinet-bid<400>145metprotyrthrservalserthrtyralaargalaleuserglyasn151015lysleuprohisvalalaalaglyasptyrgluasnlysleuserthr202530lysilemetlysglyileleutyrvalleuthralaglyleualatyr354045glyphethrargvalilegluhistyrcysasnvalthrprolysval505560alagluphecysalaasnalaglyasnilehisasnhisleualaasp65707580alavalargaspglyleuphethrileaspvalgluleuseraspgly859095argmetleuthrphegluglnleuserleuilealagluglylyspro100105110ilevalargileseraspglygluhisthrvalgluvalgluglythr115120125pheglugluilecysmetargleuglugluglyphepheglualapro130135140alatyrtyrasptyraspileaspglulystyrlysthrvalargglu145150155160argmetalaalatyrasnalaleuproglnalaleuglyalailepro165170175cysleuglutyrtyrilealaargalaserasnmetglnglualalys180185190alaglntrpalaalaaspilelysalaargtyrhisasntyrleuasp195200205asntyrglythrglyserglnalaserargserpheasnglnglyarg210215220ilegluproaspsergluserglnglugluileilehisasnileala225230235240arghisleualaglnileglyaspglumetasphisasnileglnpro245250255thrleuvalargglnleualaalaglnphemetasnglyserleuser260265270glugluasplysargasncysleualalysalaleuaspgluvallys275280285thralapheproargaspmetgluasnasplysalametleuilemet290295300thrmetleuleualalyslysvalalaserhisalaproserleuleu305310315320argaspvalphehisthrthrvalasnpheileasnglnasnleuphe325330335sertyrvalargasnleuvalargasnglumetasp340345<210>146<211>219<212>prt<213>人工序列<220><223>sope1-81-s.entericacodonoptimizedmurinet-bid<400>146valthrlysilethrleuserproglnasnpheargileglnlysgln151015gluthrthrleuleulysglulysserthrglulysasnserleuala202530lysserileleualavallysasnhispheilegluleuargserlys354045leusergluargpheileserhislysasnthrgluserseralathr505560hisphehisargglyseralasergluglyargalavalleuthrasn65707580lysglythrglyserglnalaserargserpheasnglnglyargile859095gluproaspsergluserglnglugluileilehisasnilealaarg100105110hisleualaglnileglyaspglumetasphisasnileglnprothr115120125leuvalargglnleualaalaglnphemetasnglyserleuserglu130135140gluasplysargasncysleualalysalaleuaspgluvallysthr145150155160alapheproargaspmetgluasnasplysalametleuilemetthr165170175metleuleualalyslysvalalaserhisalaproserleuleuarg180185190aspvalphehisthrthrvalasnpheileasnglnasnleupheser195200205tyrvalargasnleuvalargasnglumetasp210215<210>147<211>243<212>prt<213>人工序列<220><223>sope1-105-s.entericacodonoptimizedmurinet-bid<400>147valthrlysilethrleuserproglnasnpheargileglnlysgln151015gluthrthrleuleulysglulysserthrglulysasnserleuala202530lysserileleualavallysasnhispheilegluleuargserlys354045leusergluargpheileserhislysasnthrgluserseralathr505560hisphehisargglyseralasergluglyargalavalleuthrasn65707580lysvalvallysaspphemetleuglnthrleuasnaspileaspile859095argglyseralaserlysaspproalaglythrglyserglnalaser100105110argserpheasnglnglyargilegluproaspsergluserglnglu115120125gluileilehisasnilealaarghisleualaglnileglyaspglu130135140metasphisasnileglnprothrleuvalargglnleualaalagln145150155160phemetasnglyserleuserglugluasplysargasncysleuala165170175lysalaleuaspgluvallysthralapheproargaspmetgluasn180185190asplysalametleuilemetthrmetleuleualalyslysvalala195200205serhisalaproserleuleuargaspvalphehisthrthrvalasn210215220pheileasnglnasnleuphesertyrvalargasnleuvalargasn225230235240glumetasp<210>148<211>82<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_677<400>148ttactattcgaagaaattattcataatattgcccgccatctggcccaaattggtgatgaa60atggatcattaagcttggagta82<210>149<211>82<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_678<400>149tactccaagcttaatgatccatttcatcaccaatttgggccagatggcgggcaatattat60gaataatttcttcgaatagtaa82<210>150<211>73<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_682<400>150ttactactcgagaaaaaactgagcgaatgtctgcgccgcattggtgatgaactggatagc60taagcttggagta73<210>151<211>73<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_683<400>151tactccaagcttagctatccagttcatcaccaatgcggcgcagacattcgctcagttttt60tctcgagtagtaa73<210>152<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_580<400>152catgccatggatttatggtcatagatatgacctc34<210>153<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_612<400>153cggggtaccatgaggtagcttatttcctgataaag35<210>154<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_613<400>154cggggtaccataattgtccaaatagttatggtagc35<210>155<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_614<400>155catgccatggcggcaaggctcctc24<210>156<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_615<400>156cggggtacctttatttgtcaacactgccc29<210>157<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_616<400>157cggggtacctgcggggtctttactcg26<210>158<211>164<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-y.enterocoliticacodonoptimizedink4a84-103<400>158metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluglyalaileasp130135140aspalaalaarggluglypheleuaspthrleuvalvalleuhisarg145150155160alaglyalaarg<210>159<211>164<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-y.enterocoliticacodonoptimizedp107/rbl1657-662(aaa02489.1)<400>159metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluglyalaileasp130135140tyrglyarglyslysargargglnargargargglyprovallysarg145150155160argleuphegly<210>160<211>164<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-y.enterocoliticacodonoptimizedp21141-160(aah13967.1)<400>160metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluglyalaileasp130135140lysargargglnthrsermetthralaphetyrhisserlysargarg145150155160leuilepheser<210>161<211>160<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-y.enterocoliticacodonoptimizedp21145-160(aah13967.1)<400>161metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluglyalaileasp130135140thrsermetthralaphetyrhisserlysargargleuilepheser145150155160<210>162<211>161<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-y.enterocoliticacodonoptimizedp2117-33(aah13967.1)<400>162metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluglyalaileasp130135140alacysargargleupheglyprovalaspsergluglnleuserarg145150155160asp<210>163<211>153<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-y.enterocoliticacodonoptimizedcyclind2139-147(caa48493.1)<400>163metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluglyalaileasp130135140trpgluleuvalvalleuglylysleu145150<210>164<211>397<212>prt<213>人工序列<220><223>stea-ink4a-mychis<400>164metprotyrthrservalserthrtyralaargalaleuserglyasn151015lysleuprohisvalalaalaglyasptyrgluasnlysleuserthr202530lysilemetlysglyileleutyrvalleuthralaglyleualatyr354045glyphethrargvalilegluhistyrcysasnvalthrprolysval505560alagluphecysalaasnalaglyasnilehisasnhisleualaasp65707580alavalargaspglyleuphethrileaspvalgluleuseraspgly859095argmetleuthrphegluglnleuserleuilealagluglylyspro100105110ilevalargileseraspglygluhisthrvalgluvalgluglythr115120125pheglugluilecysmetargleuglugluglyphepheglualapro130135140alatyrtyrasptyraspileaspglulystyrlysthrvalargglu145150155160argmetalaalatyrasnalaleuproglnalaleuglyalailepro165170175cysleuglutyrtyrilealaargalaserasnmetglnglualalys180185190alaglntrpalaalaaspilelysalaargtyrhisasntyrleuasp195200205asntyrglythriletrpgluphemetgluproalaalaglyserser210215220metgluproseralaasptrpleualathralaalaalaargglyarg225230235240valglugluvalargalaleuleuglualaglyalaleuproasnala245250255proasnsertyrglyargargproileglnvalmetmetmetglyser260265270alaargvalalagluleuleuleuleuhisglyalagluproasncys275280285alaaspproalathrleuthrargprovalhisaspalaalaargglu290295300glypheleuaspthrleuvalvalleuhisargalaglyalaargleu305310315320aspvalargaspalatrpglyargleuprovalaspleualagluglu325330335leuglyhisargaspvalalaargtyrleuargalaalaalaglygly340345350thrargglyserasnhisalaargileaspalaalagluglyproser355360365aspileproasplysleuglyprogluglnlysleuilesergluglu370375380aspleuasnseralavalasphishishishishishis385390395<210>165<211>292<212>prt<213>人工序列<220><223>sope1-105-ink4a-mychis<400>165valthrlysilethrleuserproglnasnpheargileglnlysgln151015gluthrthrleuleulysglulysserthrglulysasnserleuala202530lysserileleualavallysasnhispheilegluleuargserlys354045leusergluargpheileserhislysasnthrgluserseralathr505560hisphehisargglyseralasergluglyargalavalleuthrasn65707580lysvalvallysaspphemetleuglnthrleuasnaspileaspile859095argglyseralaserlysaspproalaglythriletrpgluphemet100105110gluproalaalaglysersermetgluproseralaasptrpleuala115120125thralaalaalaargglyargvalglugluvalargalaleuleuglu130135140alaglyalaleuproasnalaproasnsertyrglyargargproile145150155160glnvalmetmetmetglyseralaargvalalagluleuleuleuleu165170175hisglyalagluproasncysalaaspproalathrleuthrargpro180185190valhisaspalaalaarggluglypheleuaspthrleuvalvalleu195200205hisargalaglyalaargleuaspvalargaspalatrpglyargleu210215220provalaspleualaglugluleuglyhisargaspvalalaargtyr225230235240leuargalaalaalaglyglythrargglyserasnhisalaargile245250255aspalaalagluglyproseraspileproasplysleuglyproglu260265270glnlysleuileserglugluaspleuasnseralavalasphishis275280285hishishishis290<210>166<211>409<212>prt<213>人工序列<220><223>stea-ink4c-mychis<400>166metprotyrthrservalserthrtyralaargalaleuserglyasn151015lysleuprohisvalalaalaglyasptyrgluasnlysleuserthr202530lysilemetlysglyileleutyrvalleuthralaglyleualatyr354045glyphethrargvalilegluhistyrcysasnvalthrprolysval505560alagluphecysalaasnalaglyasnilehisasnhisleualaasp65707580alavalargaspglyleuphethrileaspvalgluleuseraspgly859095argmetleuthrphegluglnleuserleuilealagluglylyspro100105110ilevalargileseraspglygluhisthrvalgluvalgluglythr115120125pheglugluilecysmetargleuglugluglyphepheglualapro130135140alatyrtyrasptyraspileaspglulystyrlysthrvalargglu145150155160argmetalaalatyrasnalaleuproglnalaleuglyalailepro165170175cysleuglutyrtyrilealaargalaserasnmetglnglualalys180185190alaglntrpalaalaaspilelysalaargtyrhisasntyrleuasp195200205asntyrglythriletrpgluphemetalagluprotrpglyasnglu210215220leualaseralaalaalaargglyaspleugluglnleuthrserleu225230235240leuglnasnasnvalasnvalasnalaglnasnglypheglyargthr245250255alaleuglnvalmetlysleuglyasnprogluilealaargargleu260265270leuleuargglyalaasnproaspleulysaspargthrglypheala275280285valilehisaspalaalaargalaglypheleuaspthrleuglnthr290295300leuleuglupheglnalaaspvalasnilegluaspasngluglyasn305310315320leuproleuhisleualaalalysgluglyhisleuargvalvalglu325330335pheleuvallyshisthralaserasnvalglyhisargasnhislys340345350glyaspthralacysaspleualaargleutyrglyargasngluval355360365valserleumetglnalaasnglyalaglyglyalathrasnleugln370375380lysleuglyprogluglnlysleuileserglugluaspleuasnser385390395400alavalasphishishishishishis405<210>167<211>304<212>prt<213>人工序列<220><223>sope1-105-ink4c-mychis<400>167valthrlysilethrleuserproglnasnpheargileglnlysgln151015gluthrthrleuleulysglulysserthrglulysasnserleuala202530lysserileleualavallysasnhispheilegluleuargserlys354045leusergluargpheileserhislysasnthrgluserseralathr505560hisphehisargglyseralasergluglyargalavalleuthrasn65707580lysvalvallysaspphemetleuglnthrleuasnaspileaspile859095argglyseralaserlysaspproalaglythriletrpgluphemet100105110alagluprotrpglyasngluleualaseralaalaalaargglyasp115120125leugluglnleuthrserleuleuglnasnasnvalasnvalasnala130135140glnasnglypheglyargthralaleuglnvalmetlysleuglyasn145150155160progluilealaargargleuleuleuargglyalaasnproaspleu165170175lysaspargthrglyphealavalilehisaspalaalaargalagly180185190pheleuaspthrleuglnthrleuleuglupheglnalaaspvalasn195200205ilegluaspasngluglyasnleuproleuhisleualaalalysglu210215220glyhisleuargvalvalglupheleuvallyshisthralaserasn225230235240valglyhisargasnhislysglyaspthralacysaspleualaarg245250255leutyrglyargasngluvalvalserleumetglnalaasnglyala260265270glyglyalathrasnleuglnlysleuglyprogluglnlysleuile275280285serglugluaspleuasnseralavalasphishishishishishis290295300<210>168<211>446<212>prt<213>人工序列<220><223>stea-mad2-mychis<400>168metprotyrthrservalserthrtyralaargalaleuserglyasn151015lysleuprohisvalalaalaglyasptyrgluasnlysleuserthr202530lysilemetlysglyileleutyrvalleuthralaglyleualatyr354045glyphethrargvalilegluhistyrcysasnvalthrprolysval505560alagluphecysalaasnalaglyasnilehisasnhisleualaasp65707580alavalargaspglyleuphethrileaspvalgluleuseraspgly859095argmetleuthrphegluglnleuserleuilealagluglylyspro100105110ilevalargileseraspglygluhisthrvalgluvalgluglythr115120125pheglugluilecysmetargleuglugluglyphepheglualapro130135140alatyrtyrasptyraspileaspglulystyrlysthrvalargglu145150155160argmetalaalatyrasnalaleuproglnalaleuglyalailepro165170175cysleuglutyrtyrilealaargalaserasnmetglnglualalys180185190alaglntrpalaalaaspilelysalaargtyrhisasntyrleuasp195200205asntyrglythriletrpgluphemetalaleuglnleuserargglu210215220glnglyilethrleuargglyseralagluilevalalagluphephe225230235240serpheglyileasnserileleutyrglnargglyiletyrproser245250255gluthrphethrargvalglnlystyrglyleuthrleuleuvalthr260265270thraspleugluleuilelystyrleuasnasnvalvalgluglnleu275280285lysasptrpleutyrlyscysservalglnlysleuvalvalvalile290295300serasnilegluserglygluvalleugluargtrpglnpheaspile305310315320glucysasplysthralalysaspaspseralaproargglulysser325330335glnlysalaileglnaspgluileargservalileargglnilethr340345350alathrvalthrpheleuproleuleugluvalsercysserpheasp355360365leuleuiletyrthrasplysaspleuvalvalproglulystrpglu370375380gluserglyproglnpheilethrasnserglugluvalargleuarg385390395400serphethrthrthrilehislysvalasnsermetvalalatyrlys405410415ileprovalasnasplysleuglyprogluglnlysleuileserglu420425430gluaspleuasnseralavalasphishishishishishis435440445<210>169<211>341<212>prt<213>人工序列<220><223>sope1-105-mad2-mychis<400>169valthrlysilethrleuserproglnasnpheargileglnlysgln151015gluthrthrleuleulysglulysserthrglulysasnserleuala202530lysserileleualavallysasnhispheilegluleuargserlys354045leusergluargpheileserhislysasnthrgluserseralathr505560hisphehisargglyseralasergluglyargalavalleuthrasn65707580lysvalvallysaspphemetleuglnthrleuasnaspileaspile859095argglyseralaserlysaspproalaglythriletrpgluphemet100105110alaleuglnleuserarggluglnglyilethrleuargglyserala115120125gluilevalalagluphepheserpheglyileasnserileleutyr130135140glnargglyiletyrprosergluthrphethrargvalglnlystyr145150155160glyleuthrleuleuvalthrthraspleugluleuilelystyrleu165170175asnasnvalvalgluglnleulysasptrpleutyrlyscysserval180185190glnlysleuvalvalvalileserasnilegluserglygluvalleu195200205gluargtrpglnpheaspileglucysasplysthralalysaspasp210215220seralaproargglulysserglnlysalaileglnaspgluilearg225230235240servalileargglnilethralathrvalthrpheleuproleuleu245250255gluvalsercysserpheaspleuleuiletyrthrasplysaspleu260265270valvalproglulystrpglugluserglyproglnpheilethrasn275280285serglugluvalargleuargserphethrthrthrilehislysval290295300asnsermetvalalatyrlysileprovalasnasplysleuglypro305310315320gluglnlysleuileserglugluaspleuasnseralavalasphis325330335hishishishishis340<210>170<211>538<212>prt<213>人工序列<220><223>stea-cdk1-mychis<400>170metprotyrthrservalserthrtyralaargalaleuserglyasn151015lysleuprohisvalalaalaglyasptyrgluasnlysleuserthr202530lysilemetlysglyileleutyrvalleuthralaglyleualatyr354045glyphethrargvalilegluhistyrcysasnvalthrprolysval505560alagluphecysalaasnalaglyasnilehisasnhisleualaasp65707580alavalargaspglyleuphethrileaspvalgluleuseraspgly859095argmetleuthrphegluglnleuserleuilealagluglylyspro100105110ilevalargileseraspglygluhisthrvalgluvalgluglythr115120125pheglugluilecysmetargleuglugluglyphepheglualapro130135140alatyrtyrasptyraspileaspglulystyrlysthrvalargglu145150155160argmetalaalatyrasnalaleuproglnalaleuglyalailepro165170175cysleuglutyrtyrilealaargalaserasnmetglnglualalys180185190alaglntrpalaalaaspilelysalaargtyrhisasntyrleuasp195200205asntyrglythriletrpgluphemetgluasptyrthrlysileglu210215220lysileglygluglythrtyrglyvalvaltyrlysglyarghislys225230235240thrthrglyglnvalvalalametlyslysileargleugluserglu245250255glugluglyvalproserthralailearggluileserleuleulys260265270gluleuarghisproasnilevalserleuglnaspvalleumetgln275280285aspserargleutyrleuilepheglupheleusermetaspleulys290295300lystyrleuaspserileproproglyglntyrmetaspserserleu305310315320vallyssertyrleutyrglnileleuglnglyilevalphecyshis325330335serargargvalleuhisargaspleulysproglnasnleuleuile340345350aspasplysglythrilelysleualaasppheglyleualaargala355360365pheglyileproileargvaltyrthrhisgluvalvalthrleutrp370375380tyrargserprogluvalleuleuglyseralaargtyrserthrpro385390395400valaspiletrpserileglythrilephealagluleualathrlys405410415lysproleuphehisglyaspsergluileaspglnleupheargile420425430pheargalaleuglythrproasnasngluvaltrpprogluvalglu435440445serleuglnasptyrlysasnthrpheprolystrplysproglyser450455460leualaserhisvallysasnleuaspgluasnglyleuaspleuleu465470475480serlysmetleuiletyraspproalalysargileserglylysmet485490495alaleuasnhisprotyrpheasnaspleuaspasnglnilelyslys500505510metlysleuglyprogluglnlysleuileserglugluaspleuasn515520525seralavalasphishishishishishis530535<210>171<211>433<212>prt<213>人工序列<220><223>sope1-105-cdk1-mychis<400>171valthrlysilethrleuserproglnasnpheargileglnlysgln151015gluthrthrleuleulysglulysserthrglulysasnserleuala202530lysserileleualavallysasnhispheilegluleuargserlys354045leusergluargpheileserhislysasnthrgluserseralathr505560hisphehisargglyseralasergluglyargalavalleuthrasn65707580lysvalvallysaspphemetleuglnthrleuasnaspileaspile859095argglyseralaserlysaspproalaglythriletrpgluphemet100105110gluasptyrthrlysileglulysileglygluglythrtyrglyval115120125valtyrlysglyarghislysthrthrglyglnvalvalalametlys130135140lysileargleuglusergluglugluglyvalproserthralaile145150155160arggluileserleuleulysgluleuarghisproasnilevalser165170175leuglnaspvalleumetglnaspserargleutyrleuilepheglu180185190pheleusermetaspleulyslystyrleuaspserileproprogly195200205glntyrmetaspserserleuvallyssertyrleutyrglnileleu210215220glnglyilevalphecyshisserargargvalleuhisargaspleu225230235240lysproglnasnleuleuileaspasplysglythrilelysleuala245250255asppheglyleualaargalapheglyileproileargvaltyrthr260265270hisgluvalvalthrleutrptyrargserprogluvalleuleugly275280285seralaargtyrserthrprovalaspiletrpserileglythrile290295300phealagluleualathrlyslysproleuphehisglyaspserglu305310315320ileaspglnleupheargilepheargalaleuglythrproasnasn325330335gluvaltrpprogluvalgluserleuglnasptyrlysasnthrphe340345350prolystrplysproglyserleualaserhisvallysasnleuasp355360365gluasnglyleuaspleuleuserlysmetleuiletyraspproala370375380lysargileserglylysmetalaleuasnhisprotyrpheasnasp385390395400leuaspasnglnilelyslysmetlysleuglyprogluglnlysleu405410415ileserglugluaspleuasnseralavalasphishishishishis420425430his<210>172<211>95<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_745<400>172catgctcgagggtgccatcgatgatgccgcccgcgaaggttttctggataccctggtggt60gctgcatcgcgccggtgcccgctaattcgaacatg95<210>173<211>95<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_746<400>173catgttcgaattagcgggcaccggcgcgatgcagcaccaccagggtatccagaaaacctt60cgcgggcggcatcatcgatggcaccctcgagcatg95<210>174<211>95<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_747<400>174catgctcgagggtgccatcgattatggtcgcaaaaaacgccgccaacgccgccgcggtcc60ggtgaaacgccgcctgtttggttaattcgaacatg95<210>175<211>95<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_748<400>175catgttcgaattaaccaaacaggcggcgtttcaccggaccgcggcggcgttggcggcgtt60ttttgcgaccataatcgatggcaccctcgagcatg95<210>176<211>95<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_749<400>176catgctcgagggtgccatcgataaacgccgccaaaccagcatgaccgccttttatcatag60caaacgccgcctgatttttagctaattcgaacatg95<210>177<211>95<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_750<400>177catgttcgaattagctaaaaatcaggcggcgtttgctatgataaaaggcggtcatgctgg60tttggcggcgtttatcgatggcaccctcgagcatg95<210>178<211>83<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_753<400>178catgctcgagggtgccatcgataccagcatgaccgccttttatcatagcaaacgccgcct60gatttttagctaattcgaacatg83<210>179<211>83<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_754<400>179catgttcgaattagctaaaaatcaggcggcgtttgctatgataaaaggcggtcatgctgg60tatcgatggcaccctcgagcatg83<210>180<211>86<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_755<400>180catgctcgagggtgccatcgatgcctgtcgccgcctgtttggtccggtggatagcgaaca60actgagccgcgattaattcgaacatg86<210>181<211>86<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_756<400>181catgttcgaattaatcgcggctcagttgttcgctatccaccggaccaaacaggcggcgac60aggcatcgatggcaccctcgagcatg86<210>182<211>62<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_757<400>182catgctcgagggtgccatcgattgggaactggtggtgctgggtaaactgtaattcgaaca60tg62<210>183<211>62<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_758<400>183catgttcgaattacagtttacccagcaccaccagttcccaatcgatggcaccctcgagca60tg62<210>184<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_703<400>184gacatggaattcatggagccggcggcg27<210>185<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_704<400>185catgaagcttatcggggatgtctgaggg28<210>186<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_705<400>186gacatggaattcatggccgagccttgggg29<210>187<211>51<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_706<400>187gttaacatcagcttgaaactccagcaaagtctgtaaagtgtccaggaaacc51<210>188<211>51<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_707<400>188ggtttcctggacactttacagactttgctggagtttcaagctgatgttaac51<210>189<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_708<400>189catgaagcttttgaagatttgtggctcccc30<210>190<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_709<400>190gacatggaattcatggcgctgcagctctcc30<210>191<211>33<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_710<400>191catgaagcttgtcattgacaggaattttgtagg33<210>192<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_711<400>192gacatggaattcatggaagattataccaaaatagagaa38<210>193<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_712<400>193catgaagcttcatcttcttaatctgattgtccaa34<210>194<211>276<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-y.enterocoliticacodonoptimizedmurinetbid<400>194metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleugluglyserglnala130135140serargserpheasnglnglyargilegluproaspserglusergln145150155160glugluileilehisasnilealaarghisleualaglnileglyasp165170175glumetasphisasnileglnprothrleuvalargglnleualaala180185190glnphemetasnglyserleuserglugluasplysargasncysleu195200205alalysalaleuaspgluvallysthralapheproargaspmetglu210215220asnasplysalametleuilemetthrmetleuleualalyslysval225230235240alaserhisalaproserleuleuargaspvalphehisthrthrval245250255asnpheileasnglnasnleuphesertyrvalargasnleuvalarg260265270asnglumetasp275<210>195<211>245<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-ubiquitin<400>195metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleuglumetglnilephe130135140vallysthrleuthrglylysthrilethrleugluvalgluproser145150155160aspthrilegluasnvallysalalysileglnasplysgluglyile165170175proproaspglnglnargleuilephealaglylysglnleugluasp180185190glyargthrleuserasptyrasnileglnlysgluserthrleuhis195200205leuvalleuargleuargglyglypheglualaserlysleuglypro210215220gluglnlysleuileserglugluaspleuasnseralavalasphis225230235240hishishishishis245<210>196<211>419<212>prt<213>人工序列<220><223>yope1-138-ubiquitin-flag-ink4c-mychis<400>196metlysileserserpheileserthrserleuproleuproalaser151015valserglyserserservalglyglumetserglyargservalser202530glnglnlysseraspglntyralaasnasnleualaglyargthrglu354045serproglnglyserserleualaserargileilegluargleuser505560sermetalahisservalileglypheileglnargmetpheserglu65707580glyserhislysprovalvalthrproalaleuthrproalaglnmet859095proserprothrserpheseraspserilelysglnleualaalaglu100105110thrleuprolystyrmetglnglnleuserserleuaspalagluthr115120125leuglnlysasnhisaspglnphealathrleuglumetglnilephe130135140vallysthrleuthrglylysthrilethrleugluvalgluproser145150155160aspthrilegluasnvallysalalysileglnasplysgluglyile165170175proproaspglnglnargleuilephealaglylysglnleugluasp180185190glyargthrleuserasptyrasnileglnlysgluserthrleuhis195200205leuvalleuargleuargglyglyphegluasptyrlysaspaspasp210215220asplysmetalagluprotrpglyasngluleualaseralaalaala225230235240argglyaspleugluglnleuthrserleuleuglnasnasnvalasn245250255valasnalaglnasnglypheglyargthralaleuglnvalmetlys260265270leuglyasnprogluilealaargargleuleuleuargglyalaasn275280285proaspleulysaspargthrglyphealavalilehisaspalaala290295300argalaglypheleuaspthrleuglnalaleuproglupheglnala305310315320aspvalasnilegluaspasngluglyasnleuproleuhisleuala325330335alalysgluglyhisleuargvalvalglupheleuvallyshisthr340345350alaserasnvalglyhisargasnhislysglyaspthralacysasp355360365leualaargleutyrglyargasngluvalvalserleumetglnala370375380asnglyalaglyglyalathrasnleuglnlysleuglyproglugln385390395400lysleuileserglugluaspleuasnseralavalasphishishis405410415hishishis<210>197<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_585<400>197cagtctcgagatgcagatcttcgtcaagac30<210>198<211>43<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_586<400>198gttaaagcttgctagcttcgaaaccaccacgtagacgtaagac43<210>199<211>48<212>dna<213>人工序列<220><223>引物no.:si_588<400>199cagtttcgaagattataaagatgatgatgataaaatggccgagccttg48當前第1頁12當前第1頁12