本發(fā)明涉及一種新化合物E)-2-(5-((4-甲氧基-2-(三氟甲基)喹啉-6-基)甲氧基)-2-((4-(三氟甲基)苯甲基)氧基)-苯亞甲基)己酸(MTTB)及其衍生物。本發(fā)明的所述化合物用作選擇性過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)拮抗劑并且適用于治療免疫相關(guān)性疾病如全身性炎癥、膿毒癥和膿毒性休克。

描述

全身性炎癥、膿毒癥和膿毒性休克是危及生命的并發(fā)癥，每年引起約60000人死亡，因此在德國是第三最常見的死亡原因。這種疾患的發(fā)病率由于人口老齡化及免疫受損和危重患者數(shù)量越來越多而上升。膿毒癥包括復(fù)雜的臨床綜合征，該綜合征由身體對(duì)侵入身體的細(xì)菌和/或真菌病原體引起的感染的反應(yīng)而引起。通常，有效、復(fù)雜的免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)確保對(duì)人類中微生物侵入的迅速、保護(hù)性反應(yīng)。然而，免疫防御缺陷可使感染變得確立。進(jìn)一步地，過度或調(diào)控不力的反應(yīng)可通過內(nèi)源產(chǎn)生的炎癥化合物的不適應(yīng)性釋放而傷害宿主。膿毒癥特征在于高炎癥反應(yīng)期(hyper inflammatory phase)，接著是低炎癥反應(yīng)期(hypo inflammatory phase)，后者也被稱為“免疫麻痹”。具體而言，免疫麻痹對(duì)于患者而言至關(guān)重要。此時(shí)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞經(jīng)歷了凋亡和停滯。因此患者往往死于繼發(fā)性感染。

目前治療膿毒癥的方法集中在所述疾病的高炎癥反應(yīng)期以便阻遏疾病進(jìn)展。然而，目前治療很少成功，因?yàn)樗鼈內(nèi)Q于膿毒癥的極早診斷。其它治療方法僅靶向所述疾病的癥狀。已知治療膿毒癥的方法包括抗生素、抗體、小分子和肽、蛋白C、用氧的支持性療法、靜脈注射液和增高血壓的藥物。

然而，盡管在重度感染的治療中有過去幾十年的重大進(jìn)展，但膿毒癥的發(fā)病率和歸因于膿毒癥的死亡率持續(xù)增長。因此，需要用于預(yù)防和治療膿毒癥的新方法和組合物。

在脂肪細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPAR-γ或PPARG)是多功能核受體型轉(zhuǎn)錄因子，其通過響應(yīng)于前列腺素類和噻唑烷二酮(TZD)配體來調(diào)控脂肪細(xì)胞基因表達(dá)和分化，在胰島素敏感性的控制中起核心作用。其還已被鑒定為調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、癌細(xì)胞終末分化和炎癥過程中的關(guān)鍵作用因子。該蛋白質(zhì)還在其它組織如結(jié)腸和乳腺上皮細(xì)胞、骨髓、白細(xì)胞系和T細(xì)胞中表達(dá)，并且在巨噬細(xì)胞中，已經(jīng)與TZD的抗炎作用及其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的影響聯(lián)系起來。已經(jīng)證明在人原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺腺癌和阿耳茨海默氏病(Alzheimer's disease)腦部中過氧化物酶體增殖物活化受體γ的表達(dá)升高，而在散發(fā)性結(jié)腸癌已經(jīng)報(bào)道了等位基因變體。

與核激素受體超家族的其它成員一樣，PPARγ的組織和配體特異性活化和轉(zhuǎn)錄靶基因調(diào)控是多步過程(Kliewer等人，1994；Seargent等人，2004)。這個(gè)過程涉及幾種天然和合成配體的特異性結(jié)合(Forman等人，1995；Kliewer等人，1995)，與維甲類X受體α(RXRα)的異源二聚化，其靶基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)序列特異性PPARγ反應(yīng)元件(PPRE)的識(shí)別和相互作用及最后輔助因子和其它核輔調(diào)控蛋白的募集(Nolte等人，1998；Chawla等人，2001；Kliewer等人，2001；Spiegelman等人，2004)。

由于其在脂肪形成和葡萄糖代謝中的作用，其中PPARγ主要誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞蛋白質(zhì)2(aP2)、分化簇36(CD36)、脂蛋白脂肪酶(LPL)或葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT4)的基因表達(dá)，例如，已經(jīng)將其作為治療靶標(biāo)進(jìn)行深入研究(Lehmann等人，1995；Tontonoz等人，1995)。具有高受體親和力的最突出的合成PPARγ激動(dòng)劑為噻唑烷二酮(TZD)。這些用于2型糖尿病中，其中它們提高胰島素敏感性并引起游離葡萄糖水平隨之降低(Rangwala等人，2004；Staels等人，2005)。PPARγ也可以與其它蛋白質(zhì)直接結(jié)合并抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。這種能力，稱為反式阻抑(transrepression)，主要由PPARγ和其它轉(zhuǎn)錄因子(如活化B細(xì)胞的核因子“κ-輕鏈-增強(qiáng)子”(NFkB)、活化T細(xì)胞的核因子(NFAT)或活化蛋白1(AP-1))之間的直接蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用介導(dǎo)(Yang等人，2000；Wang等人，2001；Chen等人，2003)。

這樣，PPARγ抑制促炎信號(hào)并誘導(dǎo)抗炎反應(yīng)(Pascual等人，2006；Ricote等人，2007)。在這種情況下，PPARγ受TZD活化對(duì)減輕炎癥有效。與已經(jīng)證實(shí)的TZD在體內(nèi)的有益作用和廣泛用途相反，它們還與許多有害副作用、嚴(yán)重耐受性和安全問題相關(guān)，包括明顯增重、外周水腫、充血性心力衰竭和骨折(Nesto等人，2003；Nissen等人，2007)。另一方面，PPARγ還誘導(dǎo)凋亡并且因此發(fā)揮免疫抑制活性。最近，PPARγ拮抗作用，尤其是PPARγ拮抗劑2-氯-5-硝基苯甲酰苯胺(GW9662)(Leesnitzer等人，2002)，指導(dǎo)了用于各種不同癌癥類型，如乳腺癌(Seargent等人，2004；Burton等人，2008)，及免疫力調(diào)節(jié)和炎癥性疾病(Schmidt等人，2011)的新藥物和治療策略的開發(fā)。由于GW9962與PPARγ蛋白的不可逆結(jié)合，其不適于治療用。增進(jìn)對(duì)PPARγ生理作用和臨床相關(guān)性的理解已強(qiáng)調(diào)了在避免已知副作用的同時(shí)，對(duì)發(fā)現(xiàn)、鑒定和表征新PPARγ激動(dòng)劑、拮抗劑或選擇性PPARγ調(diào)節(jié)劑(SPPARγM)的關(guān)鍵性需求。

因此，至今也沒有用于治療或預(yù)防特征在于病理性炎癥(如膿毒癥)和全身性炎癥的疾病的滿意治療方法。此外，正需要鑒定具有更有益的毒理學(xué)性質(zhì)，可應(yīng)用于治療免疫相關(guān)性疾病或其它疾病的選擇性PPAR拮抗劑。

以上問題在第一方面中通過式(I)的化合物或其立體異構(gòu)體、衍生物或鹽得以解決：

其中

R₁和R₂獨(dú)立地選自未取代、單取代或多取代的芳基或雜芳基，并且

R₁和R₂不同，并且

R₃為未取代、單取代或多取代的C₁-C₁₀-烷基，其中所述烷基可為直鏈、支鏈或環(huán)狀。

在本發(fā)明的上下文中術(shù)語“雜芳基”涵蓋在環(huán)結(jié)構(gòu)中具有至少一個(gè)可為氮、氧或硫的雜原子的單環(huán)、雙環(huán)或多環(huán)雜芳族化合物。屬于該定義范圍的代表性雜芳基，例如，吡啶、喹啉、吡咯、吲哚、噻吩、苯并咪唑、四唑、嘧啶等。

術(shù)語“芳基”指芳香基團(tuán)，優(yōu)選具有6至10個(gè)碳原子，例如苯基、甲苯基等。術(shù)語“雜取代基”在本發(fā)明的意義上應(yīng)涵蓋具有至少一個(gè)非碳鏈原子(雜原子)，優(yōu)選選自氧、氮或硫的雜原子的任何取代基。

驚人地發(fā)現(xiàn)，在針對(duì)PPARγ激動(dòng)劑試驗(yàn)時(shí)，本發(fā)明的化合物表現(xiàn)出競爭性拮抗作用，與最先進(jìn)的PPARγ拮抗劑如GW9662相比，本發(fā)明的化合物細(xì)胞積累極高、細(xì)胞毒性地且PPARγ激動(dòng)作用較小。

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及其中R₁和R₂為單取代或多取代的芳基或雜芳基的化合物。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及其中R₃為未取代的C₁-C₈烷基，優(yōu)選為未取代的C₂-C₆烷基，最優(yōu)選為未取代的直鏈C₄烷基的化合物。

在本發(fā)明另外的或替代性實(shí)施方案中，R₁可優(yōu)選為具有式(II)的基團(tuán)，

在式(II)中R₄-R₈獨(dú)立地選自H、OH、SH；未取代、單取代或多取代的C₁-C₁₈-烷基，其中所述烷基可為直鏈、支鏈或環(huán)狀；烯基；三氟甲基；未取代、單取代或多取代的芳基或雜芳基；未取代、單取代或多取代的苯甲基；酰基，例如甲?；?、乙?；?、三氯乙酰基、三氟乙酰基、富馬?；?、馬來酰基、琥珀?；?、苯甲?；蛑ф溁蚪?jīng)雜原子或芳基取代的?；煌檠趸〈?，例如-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、-OtBu，其烷基為支鏈、非支鏈或環(huán)狀；通過硫原子鍵合的烷基，例如-SMe、-SEt；或磺?；?，例如-SO₃H、-SO₂Me、-SO₂CF₃、-SO₂C₆H₄CH₃或SO₂C₆H₄CH₂Br；或氮取代基，例如-NH₂、-NHR、-NRR’(R、R’＝烷基、芳基等)、-NC或-NO2；或氟、氯、溴、碘、-CN或雜取代基。更優(yōu)選R₄、R₅、R₇和R₈為H，并且R₆為三氟甲基(-CF₃)。

另外或可選地，本發(fā)明的化合物包含為式(III)的基團(tuán)的R₂，

其中

X和Z獨(dú)立地選自C或N，

R₉至R₁₂獨(dú)立地選自H、羥基；未取代、單取代或多取代的C₁-C₁₈-烷基，其中所述烷基可為直鏈、支鏈或環(huán)狀；烯基；三氟甲基；未取代、單取代或多取代的芳基或雜芳基；未取代、單取代或多取代的苯甲基；?；缂柞；⒁阴；?、三氯乙酰基、三氟乙?；?、富馬?；?、馬來酰基、琥珀酰基、苯甲?；蛑ф溁蚪?jīng)雜原子或芳基取代的?；煌檠趸〈?，例如-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、-OtBu，其烷基為支鏈、非支鏈或環(huán)狀；通過硫原子鍵合的烷基，例如-SMe、-SEt；或磺?；?，例如-SO₃H、-SO₂Me、-SO₂CF₃、-SO₂C₆H₄CH₃或SO₂C₆H₄CH₂Br；或氮取代基，例如-NH₂、-NHR、-NRR’(R、R’＝烷基、芳基等)、-NC或-NO2；或氟、氯、溴、碘、-CN或雜取代基。

在這個(gè)實(shí)施方案中，Z優(yōu)選為N，并且X優(yōu)選為C。

此外可優(yōu)選R₁₀和R₁₂為H，R₉為-OMet(-OCH₃)，并且R₁₁為三氟甲基(-CF₃)。

在本發(fā)明的上下文中，最優(yōu)選為具有式(IV)的(E)-2-(5-((4-甲氧基-2-(三氟甲基)喹啉-6-基)甲氧基)-2-((4-(三氟甲基)苯甲基)氧基)-苯亞甲基)己酸(MTTB)：

特別優(yōu)選的化合物亞類屬于以下結(jié)構(gòu)通式，其具有前面描述的基團(tuán)R₁至R₁₂的定義。

具有通式(V)的化合物：

R₂選自未取代、單取代或多取代的芳基或雜芳基，優(yōu)選R₂為式(III)的基團(tuán)，

其中

X和Z獨(dú)立地選自C或N，

R₉至R₁₂獨(dú)立地選自H、羥基；未取代、單取代或多取代的C₁-C₁₈-烷基，其中所述烷基可為直鏈、支鏈或環(huán)狀；烯基；三氟甲基；未取代、單取代或多取代的芳基或雜芳基；未取代、單取代或多取代的苯甲基；?；缂柞；⒁阴；⑷纫阴；?、三氟乙?；?、富馬?；?、馬來?；㈢牾；⒈郊柞；蛑ф溁蚪?jīng)雜原子或芳基取代的?；?；烷氧基取代基，例如-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、-OtBu，其烷基為支鏈、非支鏈或環(huán)狀；通過硫原子鍵合的烷基，例如-SMe、-SEt；或磺?；?，例如-SO₃H、-SO₂Me、-SO₂CF₃、-SO₂C₆H₄CH₃或SO₂C₆H₄CH₂Br；或氮取代基，例如-NH₂、-NHR、-NRR’(R、R’＝烷基、芳基等)、-NC或-NO2；或氟、氯、溴、碘、-CN或雜取代基。

在這個(gè)實(shí)施方案中Z優(yōu)選為N，并且X優(yōu)選為C。

此外可優(yōu)選R₁₀和R₁₂為H，R₉為-OMet(-OCH₃)，并且R₁₁為三氟甲基(-CF₃)。

可選地或另外，R₄至R₈獨(dú)立地選自H、OH、SH；未取代、單取代或多取代的C₁-C₁₈-烷基，其中所述烷基可為直鏈、支鏈或環(huán)狀；烯基；三氟甲基；未取代、單取代或多取代的芳基或雜芳基；未取代、單取代或多取代的苯甲基；?；缂柞；?、乙?；?、三氯乙?；⑷阴；?、富馬?；?、馬來?；㈢牾；?、苯甲?；蛑ф溁蚪?jīng)雜原子或芳基取代的?；?；烷氧基取代基，例如-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、-OtBu，其烷基為支鏈、非支鏈或環(huán)狀；通過硫原子鍵合的烷基，例如-SMe、-SEt；或磺?；?，例如-SO₃H、-SO₂Me、-SO₂CF₃、-SO₂C₆H₄CH₃或SO₂C₆H₄CH₂Br；或氮取代基，例如-NH₂、-NHR、-NRR’(R、R’＝烷基、芳基等)、-NC或-NO2；或氟、氯、溴、碘、-CN或雜取代基。更優(yōu)選R₄、R₅、R₇和R₈為H，并且R₆為三氟甲基(-CF₃)。

還優(yōu)選具有通式(VI)的化合物：

R₂選自未取代、單取代或多取代的芳基或雜芳基，優(yōu)選R₂為式(III)的基團(tuán)，

其中

X和Z獨(dú)立地選自C或N，

R₉至R₁₂獨(dú)立地選自H、羥基；未取代、單取代或多取代的C₁-C₁₈-烷基，其中所述烷基可為直鏈、支鏈或環(huán)狀；烯基；三氟甲基；未取代、單取代或多取代的芳基或雜芳基；未取代、單取代或多取代的苯甲基；酰基，例如甲?；?、乙?；?、三氯乙酰基、三氟乙?；⒏获R?；?、馬來?；㈢牾；?、苯甲酰基或支鏈或經(jīng)雜原子或芳基取代的?；煌檠趸〈?，例如-OMet、-OEt、-OnPr、-iPr、-OnBu、-OiBu、-OsecBu、-OtBu，其烷基為支鏈、非支鏈或環(huán)狀；通過硫原子鍵合的烷基，例如-SMe、-SEt；或磺?；?SO₃H、-SO₂Me、-SO₂CF₃、-SO₂C₆H₄CH₃或SO₂C₆H₄CH₂Br；或氮取代基，例如-NH₂、-NHR、-NRR’(R、R’＝烷基、芳基等)、-NC或-NO2；或氟、氯、溴、碘、-CN或雜取代基。

在這個(gè)實(shí)施方案中Z優(yōu)選為N，并且X優(yōu)選為C。

此外可優(yōu)選R₁₀和R₁₂為H，R₉為-OMet(-OCH₃)，并且R₁₁為三氟甲基(-CF₃)。

對(duì)于式(V)和式(VI)的所有化合物而言，對(duì)應(yīng)于以上描述的R₁和R₂的基團(tuán)不同。

本發(fā)明的另一方面涉及一種生成或化學(xué)合成本發(fā)明的化合物的方法。

優(yōu)選地，生成或化學(xué)合成本發(fā)明的化合物的方法包括以下步驟：

(a)：

(b)

(c)

和

(d)

其中R₁至R₃如以上所定義，并且X為反應(yīng)基，優(yōu)選為Cl、Br、OTs或OTf。

再一方面還涉及用于治療或預(yù)防免疫性疾病的過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)拮抗劑。在這個(gè)方面可優(yōu)選PPARγ拮抗劑為選擇性PPARγ拮抗劑，因此是一種不或僅僅弱(優(yōu)選低于50％，更優(yōu)選低于40％、30％、20％且最優(yōu)選低于10％)誘導(dǎo)或反式激活PPARγ的PPARγ拮抗劑。此類選擇性化合物尤其是本文描述的新一類PPARγ拮抗劑的化合物。

在本發(fā)明的上下文中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，PPARγ的選擇性拮抗劑在免疫性疾病的治療中有用。術(shù)語“免疫性疾病”或“免疫相關(guān)性疾病”出于本發(fā)明的目的應(yīng)被理解為是指特征在于免疫系統(tǒng)病理性活化或阻抑的疾病或疾患。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫性疾病為全身性炎癥或膿毒癥。最優(yōu)選地，免疫性疾病為低炎癥反應(yīng)期的膿毒癥。

用于本文描述的醫(yī)療用途的PPARγ拮抗劑優(yōu)選為上文和下文描述的發(fā)明的化合物，最優(yōu)選為化合物MTTB。

如本文中所用，術(shù)語“治療”是指防護(hù)性或預(yù)防性治療和治愈性或疾病緩解性治療，包括治療處于感染疾病的風(fēng)險(xiǎn)或疑似已經(jīng)感染疾病的患者，以及生病或已經(jīng)診斷為患有疾病或醫(yī)學(xué)疾患的患者。術(shù)語“治療”還指在未患病但可能易于發(fā)展不健康狀況，如病理性活躍或阻抑的免疫力的個(gè)體中保持和/或促進(jìn)健康。因此，“有效量”是在個(gè)體中治療疾病或醫(yī)學(xué)疾患，或更一般地說，為個(gè)體提供營養(yǎng)、生理或醫(yī)療益處的量。

優(yōu)選地本發(fā)明免疫性疾病的治療或預(yù)防包括向患有免疫性疾病或處于發(fā)展免疫性疾病風(fēng)險(xiǎn)的受試者施用治療有效劑量的所述PPARγ拮抗劑。免疫性疾病的治療或預(yù)防可包括向所述受試者施用額外的治療活性化合物，其中額外的治療活性化合物在免疫性疾病，如膿毒癥、全身性炎癥或膿毒性休克的治療中有效和/或有益。

本發(fā)明的額外的治療活性化合物優(yōu)選選自另一種PPARγ拮抗劑、免疫抑制劑、抗生素、血管加壓藥、皮質(zhì)類固醇或活化的蛋白C。

本發(fā)明化合物的治療活性或有效劑量通常將在每天0.1至100mg/kg患者體重，優(yōu)選每天0.5-20mg/kg的范圍內(nèi)，確切劑量由臨床醫(yī)師根據(jù)通用標(biāo)準(zhǔn)，考慮待治疾患的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、患者特性等來確定。劑量的確定在本領(lǐng)域普通技術(shù)水平范圍內(nèi)。本發(fā)明的化合物通常將施用長達(dá)28天。更常見的是，蛋白質(zhì)將施用一周或更少，常常施用一至三天。一般而言，本發(fā)明化合物的治療有效量是足以引起膿毒癥的低炎癥反應(yīng)期在臨床上顯著減少的量。

通常，施用的本發(fā)明的PPARγ拮抗劑的量將根據(jù)諸如患者年齡、體重、身高、性別、總體健康狀況和既往病史等因素改變。通常，雖然依情況而定也可以施用較低或較高劑量，但期望為受者提供劑量在1pg/kg至10mg/kg(試劑的量/患者體重)范圍內(nèi)的本發(fā)明的PPARγ拮抗劑。下文提供了本發(fā)明藥物組合物的具體實(shí)施方案。

另外通過包含(a)PPARγ拮抗劑和(b)在膿毒癥或全身性炎癥的治療中有效的第二化合物的組合解決了本發(fā)明的目的。

本發(fā)明的組合優(yōu)選包含作為試劑(a)的如上文所述的PPARγ拮抗劑，最優(yōu)選MTTB或其衍生物。試劑(b)，在膿毒癥或全身性炎癥的治療中有效的第二化合物，優(yōu)選選自另一種PPARγ拮抗劑、免疫抑制劑、抗生素、血管加壓藥、皮質(zhì)類固醇或活化的蛋白C。

本發(fā)明的組合用于治療如上文所述的免疫性疾病。

此外提供了一種抑制細(xì)胞中的PPARγ的體外(在活體外)方法。該方法包括使細(xì)胞與本文先前所述的化合物接觸的步驟。

疾病和疾患

本發(fā)明提供了一類新的PPARγ拮抗劑，其用作治療劑用于治療或預(yù)防免疫相關(guān)性疾病或病理性細(xì)胞凋亡，如特征在于細(xì)胞過度凋亡的疾病，例如慢性HIV、EBV或HCV感染、阿爾茨海默病、帕金森氏病(Parkinson's disease)或缺血性心臟病。根據(jù)本發(fā)明所述化合物和組合物對(duì)于治療和或預(yù)防特征在于病理性激活的免疫或炎癥反應(yīng)的疾患特別有用。具體而言本發(fā)明設(shè)法提供對(duì)膿毒癥、膿毒性休克和全身性炎癥的治療。

治療或預(yù)防免疫相關(guān)性疾病的組合物和試劑盒

本發(fā)明的另一方面涉及用于治療或預(yù)防免疫相關(guān)性疾病的組合物、藥物組合物和試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包含如本文所述的化合物、組合或組合物，任選地連同藥學(xué)上可接受的載體。

如本文中所用，用語“藥學(xué)上可接受的載體”旨在包括與藥物施用相容的任何及所有溶劑、增溶劑、填料、穩(wěn)定劑、粘合劑、吸收劑、基質(zhì)、緩沖劑、潤滑劑、控釋媒介物、納米顆粒、脂質(zhì)體、稀釋劑、乳化劑、濕潤劑、潤滑劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌或抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。此類介質(zhì)和試劑作為藥物活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域公知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容，否則還考慮到了其在所述組合物中的用途。也可向組合物中摻入補(bǔ)充試劑。在某些實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的載體包含血清白蛋白。

本發(fā)明的藥物組合物配制成與其預(yù)期施用途徑相容。施用途徑的實(shí)例包括腸胃外，例如鞘內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口服、經(jīng)皮(局部)和經(jīng)粘膜施用。

用于腸胃外、皮內(nèi)或皮下施加的溶液或混懸液可包括以下組分：無菌稀釋劑如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽及用于調(diào)節(jié)張力的試劑如氯化鈉或右旋糖?？捎盟峄驂A，如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。腸胃外制劑可封裝在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。

適于注射用的藥物組合物包括無菌水溶液(可溶于水時(shí))或分散物及用于臨時(shí)制備無菌注射液或分散物的無菌粉末。對(duì)于靜脈施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、克列莫佛EL(Cremophor EL^TM,BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，可注射組合物都應(yīng)是無菌的并且應(yīng)是流動(dòng)性的，達(dá)到易于注射的程度。在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下必須穩(wěn)定并且必須受到保護(hù)免受微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適混合物的溶劑或分散介質(zhì)。例如，可以通過使用包衣如卵磷脂，在分散物的情況下通過維持所需粒度及通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。對(duì)微生物作用的預(yù)防可通過各種抗菌和抗真菌劑來實(shí)現(xiàn)，例如對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在許多情況下，將優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)和氯化鈉。可通過在組合物中包括延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠而引起可注射組合物的延時(shí)吸收。

可通過在根據(jù)需要具有上面列舉的一種成分或組合的適當(dāng)溶劑中按所需量摻入活性化合物(例如，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白)，接著過濾滅菌來制備無菌注射液。通常，通過將活性化合物摻入到含有基本分散介質(zhì)和來自以上列舉的那些其它所需成分的無菌媒介物中來制備分散物。在用于制備無菌注射液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，這樣產(chǎn)生活性成分加上來自其先前經(jīng)無菌過濾的溶液的任何所需額外成分的粉末。

口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載體。可將其封裝在明膠膠囊中或壓縮成片劑。為了口服治療施用的目的，活性化合物可以和賦形劑一起摻入并且呈片劑、錠劑或膠囊形式使用。也可以使用用作漱口水的液體載體制備口服組合物，其中液體載體中的化合物口服施加并且被漱洗和咳出或咽下。藥學(xué)上相容的粘合劑和/或輔助材料可作為組合物的一部分被包括在內(nèi)。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可含有以下任何成分或類似性質(zhì)的化合物：粘合劑如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如藻酸、普萊默膠(Primogel)或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或斯特爾特斯(Stertes)；助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑如薄荷、水楊酸甲酯或橙香精。

對(duì)于通過吸入施用，化合物呈氣溶膠噴霧的形式從含有合適推進(jìn)劑，例如氣體(如二氧化碳)的容器或分配器中或從噴霧器中遞送。

全身性施用也可以通過經(jīng)粘膜或經(jīng)皮方式。對(duì)于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮施用，在配制劑中使用適于待透過的屏障的滲透劑。此類滲透劑通常是本領(lǐng)域已知的，并且包括，例如，對(duì)于經(jīng)粘膜施用，去垢劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。經(jīng)粘膜施用可通過使用鼻噴霧或栓劑實(shí)現(xiàn)。對(duì)于經(jīng)皮施用，將藥物組合物配制成本領(lǐng)域通常所知的軟膏、藥膏、凝膠或乳霜。

在某些實(shí)施方案中，藥物組合物經(jīng)配制用于持續(xù)或控制釋放活性成分?？梢允褂蒙锟山到?、生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制備此類制劑的方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。所述材料也可以從(例如)阿爾扎公司(Alza Corporation)和諾華制藥公司(Nova Pharmaceuticals,Inc.)商業(yè)性獲得。脂質(zhì)體懸浮液(包括靶向具有病毒抗原的單克隆抗體的受感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)或納米顆粒，包括用聚(dl-丙交酯-co-乙交酯)制備的物質(zhì)，也可用作藥學(xué)上可接受的載體。這些可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。

為了易于施用和劑量均勻性，特別有利的是將口服或腸胃外組合物配制成劑量單位形式。如本文中所用的劑量單位形式包括適合作為待治受試者的單位劑量的物理離散單元；每個(gè)單元含有經(jīng)計(jì)算連同所需藥物載體一起會(huì)產(chǎn)生預(yù)期療效的預(yù)定量的活性化合物。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格由以下因素決定并直接取決于以下因素：活性化合物的獨(dú)特特征和要達(dá)到的特定療效，及使此類活性化合物化合用于治療個(gè)體的領(lǐng)域中固有的限制。

此類化合物的毒性和治療功效可以通過標(biāo)準(zhǔn)制藥過程在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中測定，例如測定LD50(群體50％致死的劑量)和ED50(在群體50％中治療有效的劑量)。毒性和療效之間的劑量比為治療指數(shù)并且可表示為LD50/ED50比率。優(yōu)選表現(xiàn)出大治療指數(shù)的化合物。雖然可以使用表現(xiàn)出毒副作用的化合物，但是應(yīng)該仔細(xì)設(shè)計(jì)使此類化合物靶向受影響組織部位的遞送系統(tǒng)以便將對(duì)未受感染的細(xì)胞的潛在損傷降到最低，從而減少副作用。

由細(xì)胞培養(yǎng)測定法和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于配制用于人類的各種劑量。此類化合物的劑量優(yōu)選在包括具有很少或無毒性的ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。該劑量可根據(jù)采用的劑量形式和利用的施用途徑在這個(gè)范圍內(nèi)變化。對(duì)于本發(fā)明方法中所用的任何化合物而言，最初可由細(xì)胞培養(yǎng)測定法估計(jì)治療有效劑量。在動(dòng)物模型中可將劑量配制成達(dá)到包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中測定的IC50(即，實(shí)現(xiàn)癥狀半最大抑制的試驗(yàn)化合物濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。此類信息可用于更精確地確定在人類中的有用劑量。可將藥物組合物連同施用說明書一起包括在容器、包裝或分配器中。

現(xiàn)將在以下實(shí)施例中參考附圖和序列，然而不限于此，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。為了本發(fā)明的目的，本文所引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用整體并入。圖中：

圖1：MTTB的化學(xué)結(jié)構(gòu)和計(jì)算模型。相應(yīng)的配體并入了MTTB(A)的所有結(jié)構(gòu)特征：酸性端基、相鄰親脂性部分和在相對(duì)位點(diǎn)上具有芳香族取代基的中心芳香核。對(duì)接方案集中于產(chǎn)生一個(gè)單結(jié)合模式(B)。羧基部分參與和賴氨酸265的離子相互作用和與絲氨酸323主鏈酰胺的氫鍵中。芳香族部分和α烷基鏈占據(jù)疏水位點(diǎn)，表明是有利的相互作用。

圖2：PPARγ激動(dòng)劑、PPARγ拮抗劑和SPPARγM在HEK293T細(xì)胞中的動(dòng)力學(xué)表征。使用PPARγ依賴性反式激活(transactivation)測定法來檢驗(yàn)PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮(rosiglitazone)、拮抗劑GW9662和兩種SPPARγM FMOC-L-亮氨酸和MCC-555在用不同濃度(0.01μΜ-10μΜ)的化合物(A)刺激24小時(shí)之后的激動(dòng)作用。為確定在對(duì)激動(dòng)劑(1μΜ羅格列酮)刺激(B)反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)程中使用10μΜ GW9662及FMOC-L-亮氨酸和MCC-555的激動(dòng)作用，再次使用PPARγ依賴性反式激活測定法。值是四次實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行四次。

圖3：針對(duì)體外遞增濃度的羅格列酮，MTTB拮抗作用與GW9662拮抗作用的比較。為檢驗(yàn)MTTB(A和C)和參考PPARγ拮抗劑GW9662(B和D)在HEK293T細(xì)胞(A和B)和Jurkat T細(xì)胞(C和D)中的激動(dòng)和拮抗作用，使用PPARγ依賴性反式激活測定法。用遞增劑量(0.1μΜ-10μΜ)的羅格列酮、MTTB或GW9662單獨(dú)地或在MTTB和GW9662(1μΜ或10μΜ)的存在下用相同濃度的羅格列酮培養(yǎng)細(xì)胞系24小時(shí)。為測定在HEK293T細(xì)胞中MTTB對(duì)羅格列酮反應(yīng)的拮抗作用的IC50值，使用PPARγ依賴性反式激活測定法(E)構(gòu)造MTTB拮抗作用的劑量-反應(yīng)曲線。數(shù)據(jù)顯示在遞增濃度的MTTB(0.1μ-50μΜ)的存在下對(duì)1μΜ激動(dòng)劑(羅格列酮)刺激反應(yīng)24小時(shí)。所有值均為四次實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行四次并且在Jurkat T細(xì)胞中進(jìn)行三次。在HEK293T細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞中在濃度為xμΜ和yμΜ(p<0.05)的MTTB的存在下，在對(duì)羅格列酮(1-10μΜ)的反應(yīng)中獲得與單獨(dú)的拮抗劑在統(tǒng)計(jì)上顯著的差異。

圖4：體外競爭性PPARγ拮抗劑MTTB和PPARγ拮抗劑GW9662的細(xì)胞毒性。在用不同濃度(0.1μΜ-30μΜ)的MTTB(A)或PPARγ拮抗劑GW9662(B)刺激24小時(shí)之后通過MTT測定法測定HEK293T細(xì)胞、HuT-78細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞的細(xì)胞活力。由以下方程式計(jì)算細(xì)胞活力：樣品的MTT光密度(OD)值/對(duì)照的MTT OD值(細(xì)胞經(jīng)DMSO處理)。數(shù)據(jù)顯示為溶劑DMSO對(duì)照的百分比并呈現(xiàn)為三次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行八次。

圖5：體外MTTB和GW9662的胞內(nèi)累積。用10μΜMTTB(A)或10μΜGW9662(B)刺激HEK293T細(xì)胞、HuT-78細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞24小時(shí)。在不同時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞并且將累積表示為通過LC-MS/MS測定的每5x10⁵個(gè)細(xì)胞按μmol計(jì)胞內(nèi)(I)與胞外(E)濃度的百分比。值是三次實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。

圖6：用MTTB處理之后膿毒癥模型中小鼠的存活。

實(shí)施例

材料和方法

化學(xué)藥品和試劑

所有化學(xué)藥品和試劑都是最高純度等級(jí)的并且如果沒有另外說明，則可從應(yīng)用化學(xué)GmbH(AppliChem GmbH,達(dá)木斯特,德國)、卡爾洛斯GmbH(Carl Roth GmbH,卡爾斯魯厄,德國)、阿法埃莎GmbH(Alfa Aesar GmbH,卡爾斯魯厄,德國)、阿波羅科技(Apollo Scientific,曼徹斯特,英國)和西格瑪奧德里奇化學(xué)GmbH(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,德國)商購獲得。PPARγ拮抗劑GW9662、SPPARγM N-(9-芴基甲氧羰基)-L-亮氨酸(FMOC-L-亮氨酸)和萘格列酮(netoglitazone)(MCC-555)從凱曼化工公司(Cayman Chemical Company,安娜堡,USA)獲得并且PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮從恩佐生命科學(xué)GmbH(Enzo Life Sciences GmbH,德國)獲得。細(xì)胞培養(yǎng)基和補(bǔ)充劑購自PAA實(shí)驗(yàn)室GmbH(德國)和西格瑪奧德里奇化學(xué)GmbH。

細(xì)胞培養(yǎng)

從LGC標(biāo)準(zhǔn)GmbH(韋澤爾,德國)獲得人T細(xì)胞-78(HuT-78)(Gazdar等人，1980)、Jurkat T細(xì)胞(Schneider等人，1977)和穩(wěn)定表達(dá)猿猴空泡病毒40的大T抗原的人胚腎293細(xì)胞(HEK293T細(xì)胞)(Graham等人，1977)。HuT-78細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞在勞斯維爾帕克記憶研究所(Roswell Park Memorial Institute(RPMI))1640培養(yǎng)基中并且HEK293T細(xì)胞在杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)中，在37℃下于加濕5％二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)。

兩種培養(yǎng)基均含10％(v/v)熱滅活胎牛血清、100單位/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)。培養(yǎng)基每周更換三次并且在達(dá)到融合之前使細(xì)胞傳代。使用DMSO時(shí)，在所有情況下，DMSO的最終濃度不超過0.1％并且在所用細(xì)胞系中未發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞毒性。

培養(yǎng)的細(xì)胞系的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

對(duì)于PPARγ依賴性反式激活測定法而言，在96孔板中每孔接種1x104個(gè)HEK293T細(xì)胞并且如上所述培養(yǎng)過夜以允許HEK293T細(xì)胞附著。第二天，使用JetPRIMETM轉(zhuǎn)染試劑(PEQLAB Biotechnologie GmbH,埃爾朗根,德國)，如制造商所述，用0.01μg/孔由Manfred Schubert-Zsilavecz博士教授(Institute of Pharmaceutical Chemistry,Department of Biochemistry,Chemistry and Pharmacy,Goethe-University Frankfurt am Main,德國)友好提供的pFA-PPARγ-LBD-GAL4-DBD，0.09μg/孔pFR-Luc(Stratagene,拉荷亞,USA)和0.0005μg/孔pRL-CMV(Promega GmbH,Mannheim,德國)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。4小時(shí)后，更換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基并且再在新鮮生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞24小時(shí)。對(duì)于每孔1x106個(gè)HuT-78細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，使用Super-FectTM轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN GmbH,希爾敦,德國)，如生產(chǎn)商所述，用0.2μg/孔pFA-PPARγ-LBD-GAL4-DBD、0.8μg/孔pFR-Luc和0.05μg/孔pRL-CMV。24小時(shí)后，添加1ml新鮮生長培養(yǎng)基并且再培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)。PPARγ依賴性反式激活測定法在HEK293T細(xì)胞中使用96孔板形式進(jìn)行四次并且在HuT-78細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞中使用12孔板形式進(jìn)行三次。

培養(yǎng)的細(xì)胞系的PPARγ依賴性反式激活測定法

PPARγ依賴性反式激活測定法是基于編碼雜交蛋白PPARγ-LBD-GAL4-DBD的載體pFA-PPARγ-LBD-GAL4-DBD和在螢火蟲熒光素酶基因的前面攜帶GAL4響應(yīng)元件的報(bào)告載體pFR-Luc。這兩種載體，如上所述，與編碼海腎熒光素酶的對(duì)照載體pRL-CMV組合共同轉(zhuǎn)染，以將螢火蟲熒光素酶活性歸一化為轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染之后，用MTTB、FMOC-L-亮氨酸、MCC-555、GW9662和羅格列酮并且在遞增濃度下(0.01-10μΜ)，有或無羅格列酮(0.01-10μΜ)孵育細(xì)胞不同時(shí)間(2-48小時(shí))。使用96孔板形式在密特拉斯(Mithras)LB940多模式酶標(biāo)儀(Berthold Technologies,Bad Wildbad,德國)中分析反式激活。通過使用圖像平板軟件普利姆(GraphPad Software Prism,拉荷亞,USA)將數(shù)據(jù)擬合為S形劑量-反應(yīng)曲線測定MTTB的IC50值。

細(xì)胞活力研究

按每孔5x104個(gè)細(xì)胞的密度將HuT-78細(xì)胞、Jurkat T細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞接種在96孔板中并且如上所述培養(yǎng)過夜以允許HEK293T細(xì)胞附著。第二天，將培養(yǎng)基更換為含有不同濃度的MTTB(1-30μΜ)和GW9662(1-30μΜ)的新鮮細(xì)胞特異性生長培養(yǎng)基。使用單獨(dú)的DMSO作為對(duì)照。24小時(shí)刺激后，添加3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)溶液(5mg/ml于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中)并且在37℃下再孵育細(xì)胞兩小時(shí)(Mosmann,1983)。之后，用MTT裂解緩沖液裂解細(xì)胞。細(xì)胞裂解后，在560nm吸光度下在密特拉斯(Mithras)LB940多模式酶標(biāo)儀中測量細(xì)胞活力。使用96孔板形式的細(xì)胞活力研究進(jìn)行八次。

胞內(nèi)MTTB和GW9662累積的測定

為測定MTTB和GW9662的胞內(nèi)累積，按每孔5x104個(gè)細(xì)胞的密度將HuT-78細(xì)胞、Jurkat T細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞接種在12孔板中并且如上所述培養(yǎng)過夜以允許HEK293T細(xì)胞附著。第二天將培養(yǎng)基更換為含有10μΜMTTB和10μΜ GW9662的新鮮細(xì)胞特異性生長培養(yǎng)基。用MTTB和GW9662處理24小時(shí)后，收獲細(xì)胞和上清液并通過LC-MS/MS分析。將累積表示為胞內(nèi)與胞外濃度比率(I/E)的百分比。

計(jì)算模型

使用分子操作環(huán)境(Molecular Operating Environment)軟件套件2012.10(Chemical Computing Group Inc.,蒙特利爾,加拿大)進(jìn)行計(jì)算對(duì)接。結(jié)構(gòu)中氫的分配使用普勞特耐特3D(Protonate3D)程序(Labute,2009)進(jìn)行。

統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均呈現(xiàn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)平均誤差(SEM)。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行三次。統(tǒng)計(jì)分析用分別經(jīng)邦弗倫尼(Bonferroni)多重比較檢驗(yàn)或非配對(duì)和配對(duì)學(xué)生t檢驗(yàn)改良的單或雙因素方差分析來進(jìn)行。當(dāng)：p<0.05時(shí)，視為差異顯著。

實(shí)施例1：MTTB的合成

本發(fā)明的化合物，尤其是MTTB在一個(gè)四階段過程中合成。在下文中E是指反應(yīng)物，P是指反應(yīng)產(chǎn)物。

階段1：

在具有回流冷凝器、氬氣源、隔膜和磁攪拌器的三頸反應(yīng)釜中，使E1(1個(gè)當(dāng)量)和Cs₂CO₃(1.3個(gè)當(dāng)量)在惰性氣體下懸浮于二甲基甲酰胺(DMF)中并略微加熱(約60℃約15分鐘)。冷卻至室溫(RT)后，經(jīng)由隔膜在幾毫升DMF中迅速添加E2(1個(gè)當(dāng)量)并且在攪拌下反應(yīng)，無需加熱。約1.5小時(shí)后在真空下去除溶劑直至幾乎完全干燥。為50ml的H₂O添加50ml乙酸乙酯以分相。水相用乙酸乙酯萃取三次，而有機(jī)相在MgSO₄上干燥并蒸發(fā)至完全干燥。殘余物進(jìn)行柱色譜法并且在分離后使產(chǎn)物重結(jié)晶兩次(己烷/乙酸乙酯)。

階段2：

在具有回流冷凝器、氬氣源、隔膜和磁攪拌器的三頸反應(yīng)釜中，使P1(1個(gè)當(dāng)量)和Cs₂CO₃(1.3個(gè)當(dāng)量)在惰性氣體下懸浮于二甲基甲酰胺(DMF)中并略微加熱(約60℃約15分鐘)。冷卻至室溫(RT)后，經(jīng)由隔膜在幾毫升DMF中迅速添加E3(1個(gè)當(dāng)量)并且在攪拌下反應(yīng)，無需加熱。約1.5小時(shí)后在真空下去除溶劑直至幾乎完全干燥。為50ml的H₂O添加50ml乙酸乙酯以分相。水相用乙酸乙酯萃取三次，而有機(jī)相在MgSO₄上干燥并蒸發(fā)至完全干燥。殘余物進(jìn)行柱色譜法并且在分離后使產(chǎn)物重結(jié)晶兩次(己烷/乙酸乙酯)。

階段3：

在具有回流冷凝器、氬氣源、隔膜和磁攪拌器的三頸反應(yīng)釜中，首先在氬氣下添加NaH(1.3個(gè)當(dāng)量)，然后用四氫呋喃(THF)使其懸浮。攪拌并冷卻約15分鐘后在幾分鐘之內(nèi)滴加于THF中的E4(1.3個(gè)當(dāng)量)。E4可經(jīng)由艾伯佐夫(Arbuzov)反應(yīng)制備，通過使各自的α-溴代-酯在亞磷酸三乙酯中回流并蒸餾得到E4。然后于冰浴中攪拌混合物30至60分鐘。經(jīng)由隔膜滴加于THF中的醛(1個(gè)當(dāng)量)。經(jīng)由TLC觀察反應(yīng)。完成反應(yīng)(約1至3小時(shí))后，去除溶劑并且使反應(yīng)經(jīng)受柱色譜法。使純化產(chǎn)物P3重結(jié)晶(己烷/乙酸乙酯)。

階段4：

在具有回流冷凝器和熱浴的反應(yīng)釜中，使于THF中的酯與溶于H₂O中的LiOH一水合物(10個(gè)當(dāng)量)合并。添加甲醇直至溶液只有一個(gè)相并且邊攪拌邊在40-60℃下加熱直至完全水解。約12-72小時(shí)后在真空下蒸發(fā)THF和甲醇。用2NHCl使酸沉淀。從沉淀中去除溶劑并干燥后，通過重結(jié)晶獲得最終產(chǎn)物。

實(shí)施例2：MTTB與PPARγ-LBD對(duì)接

在先前的研究中已經(jīng)證實(shí)，由于對(duì)PPARγ已知的明顯誘導(dǎo)契合，共晶配體的相似性對(duì)于受體結(jié)合的配體構(gòu)象的預(yù)測模型至關(guān)重要(Weber等人，2012)。因此，發(fā)明人選擇比較與PPARγ-LBD(PDB代碼：2HFP)復(fù)合的有效磺?；柞０忿卓箘┑腦-射線結(jié)構(gòu)(Hopkins等人，2006)。

相應(yīng)的配體并入了MTTB的所有結(jié)構(gòu)特征(圖1A)：酸性端基、相鄰親脂性部分和在相對(duì)位點(diǎn)上具有芳香族取代基的中心芳香核。如圖1B所示，對(duì)接方案集中于產(chǎn)生一個(gè)單結(jié)合模式。羧基部分參與和賴氨酸265的離子相互作用和與絲氨酸342主鏈酰胺的氫鍵中。芳香族部分和α烷基鏈占據(jù)疏水位點(diǎn)，表明是有利的相互作用。位于共晶(見上文)配體部分上的藥效特征用于配體布置。水分子留在結(jié)合位點(diǎn)中。將經(jīng)證實(shí)非常適合在PPARγ-LBD中對(duì)接的αHB分?jǐn)?shù)(Weber等人，2012)用于初始評(píng)分GBVI/WSA dG(基于力場的函數(shù))，以用于改進(jìn)。

實(shí)施例3：MTTB抑制羅格列酮誘導(dǎo)的PPARγ反式激活

為分析細(xì)胞水平下PPARγ拮抗劑GW9662(Leesnitzer等人，2002)、SPPARγM FMOC-L-亮氨酸(Rocchi等人，2001)和MCC-555(Reginato等人，1998)及PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮(Willson等人，1996)的激動(dòng)和拮抗作用，在HEK293T細(xì)胞中使用PPARγ依賴性反式激活測定法。測定每份樣品中的螢火蟲熒光素酶發(fā)光值和對(duì)照海腎熒光素酶發(fā)光值。使用螢火蟲與海腎熒光素酶發(fā)光值之比歸一化熒光素酶活性值。

在刺激24小時(shí)后激動(dòng)劑濃度相對(duì)于PPARγ受體相互作用劑的曲線表現(xiàn)出不同的進(jìn)程(圖2A)。僅羅格列酮顯示出高激動(dòng)作用并且以劑量依賴方式反式激活PPARγ。令人驚訝的是，作為不可逆性完全PPARγ拮抗劑的GW9662，顯示出激動(dòng)作用并且與DMSO對(duì)照處理相比，導(dǎo)致非劑量依賴性、高3倍的PPARγ反式激活。更高濃度(高于1μΜ)的SPPARγM MCC-555反式激活PPARγ。在所有情況下，F(xiàn)MOC-L-亮氨酸均未顯示出激動(dòng)作用。如圖2B所示，僅PPARγ拮抗劑GW9962抑制對(duì)激動(dòng)劑(1μΜ羅格列酮)刺激反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)程。SPPARγM，F(xiàn)MOC-L-亮氨酸和MCC-555在HEK293T細(xì)胞中都未顯示出任何拮抗作用。FMOC-L-亮氨酸和MCC-555極弱的激動(dòng)作用和不存在的拮抗作用促使我們使用GW9662進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)并且作為參考化合物來分析。

為檢驗(yàn)提出的MTTB與PPARγ-LBD的相互作用(圖1B)并且測試在HEK293T細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞中的潛在激動(dòng)和拮抗作用，也在PPARγ依賴性反式激活測定法中試驗(yàn)了該化合物。細(xì)胞用不同劑量的單獨(dú)或組合的MTTB和羅格列酮培養(yǎng)24小時(shí)。如圖3A和C所示，MTTB在HEK293T細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞中未表現(xiàn)出激動(dòng)作用。在兩種細(xì)胞系中，MTTB導(dǎo)致劑量依賴性抑制羅格列酮誘導(dǎo)的PPARγ反式激活，具有競爭性拮抗/部分激動(dòng)特征。參考化合物GW9662在HEK293T細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞中顯示出完全拮抗作用并且非劑量依賴性地抑制羅格列酮介導(dǎo)的PPARγ反式激活(圖3B和D)。然而，單獨(dú)的GW9662激活PPARγ并且在在兩種細(xì)胞系中的反式激活測定法中顯示出驚人高的激動(dòng)作用。如圖3E所示，MTTB能夠抑制羅格列酮(1μΜ)的激動(dòng)活性，在HEK293T細(xì)胞中24小時(shí)后IC50值為4.3μΜ。

實(shí)施例4：MTTB和GW9662對(duì)細(xì)胞存活的影響

為研究MTTB和參考化合物GW9662對(duì)HEK293T細(xì)胞、HuT-78細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞存活的影響，使細(xì)胞經(jīng)受遞增劑量(1-30μΜ)的MTTB或GW9662，持續(xù)24小時(shí)。通過MTT測定法分析細(xì)胞活力。MTTB在高達(dá)10μΜ的濃度下無細(xì)胞毒性作用(圖4A)。在全部三種細(xì)胞系中MTTB展示出同等活力損失。相反，GW9662在所用細(xì)胞系中顯示出不同的細(xì)胞毒性(圖4B)。在HEK293T細(xì)胞中，高達(dá)30μΜ的濃度，未檢測到活力損失。然而，在HuT-78細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞中，GW9662分別在高于20μΜ和30μΜ的濃度下明顯有細(xì)胞毒性。

實(shí)施例5：MTTB顯示出高胞內(nèi)累積

通過LC-MS/MS分析MTTB(10μΜ)和參考PPARγ拮抗劑GW9662(10μΜ)的百分比胞內(nèi)累積的時(shí)間進(jìn)程。如圖5A所示，MTTB在HuT-78細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞中24小時(shí)后顯示出約10％的快速持續(xù)時(shí)間非依賴性胞內(nèi)累積。在HEK293T細(xì)胞中，看到胞內(nèi)MTTB濃度的時(shí)間依賴性增加，24小時(shí)后達(dá)到胞外濃度的約25％。如圖5B所示，GW9662與MTTB相比顯示出低10倍的胞內(nèi)積累率，在HEK293T細(xì)胞中隨時(shí)間而減少。在HuT-78細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞中，GW9662的胞內(nèi)累積比MTTB低約100倍(圖5A)。尤其是在HuT-78細(xì)胞中，胞內(nèi)GW9662累積存在快速的時(shí)間依賴性降低。

實(shí)施例6：MTTB顯著增強(qiáng)膿毒癥小鼠模型中的存活

在先前公開的膿毒癥小鼠模型中測試MTTB的活性(Rittirsch D,Huber-Lang MS,Flierl MA,Ward PA.Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture.Nat Protoc 2009；4:31-36)。簡言之，盲腸結(jié)扎和穿刺模型(CLP)如Rittirsch等人所述，使用20號(hào)口徑穿刺針進(jìn)行或?qū)τ谘鹧b小鼠而言無需結(jié)扎和穿刺。在結(jié)扎和穿刺3小時(shí)后腹膜內(nèi)施加負(fù)載MTTB的納米顆粒。圖6示出了與對(duì)照納米顆粒相比，經(jīng)MTTB處理的膿毒癥小鼠的體內(nèi)顯著存活率。這是本發(fā)明化合物在免疫性疾病如膿毒癥治療中的適用性的驚人證明。

討論和結(jié)論

對(duì)PPARγ分子相互作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，及其在分子、細(xì)胞和臨床情況下的激活的大量闡釋，已經(jīng)提供了設(shè)計(jì)治療上有用的PPARγ激動(dòng)劑和SPPARγM的寶貴見解(Willson等人，2000；Sporn等人，2001；Balint等人，2006)。雖然PPARγ受天然和合成配體的激活是非常確實(shí)的(Forman等人，1995；Kliewer等人，1995)，但是關(guān)于PPARγ拮抗作用知之甚少。然而，增進(jìn)對(duì)PPARγ拮抗作用的生物相關(guān)性的理解強(qiáng)調(diào)了對(duì)發(fā)現(xiàn)不產(chǎn)生已知副作用的新的治療上有用的PPARγ拮抗劑的關(guān)鍵性需求。

目前，GW9662是最熟知且最突出的PPARγ拮抗劑(Leesnitzer等人，2002)，但是其顯示出不良性質(zhì)，包括不可逆性PPARγ拮抗作用。因此，發(fā)明人已經(jīng)從結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物篩選中鑒定并表征MTTB，為有前景的新一類競爭性PPARγ拮抗劑的原型。與可商購獲得的PPARγ拮抗劑GW9662相比，MTTB提供了調(diào)節(jié)PPARγ抑制和免疫反應(yīng)的可能性并且可能非常適合在炎癥情況下的受控治療使用。

與Leesnitzer和其同事一致，發(fā)明人用GW9662觀察到非競爭不可逆性拮抗作用(Leesnitzer等人，2002)，使得羅格列酮介導(dǎo)的PPARγ反式激活完全受抑制。用羅格列酮和GW9662共同處理HEK293T細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞顯示出預(yù)計(jì)的拮抗作用。有趣的是，單獨(dú)的GW9662導(dǎo)致非劑量依賴性、約3倍的PPARγ反式激活，就發(fā)明人所知這在之前尚未被報(bào)道。這些結(jié)果表明在HEK293T細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞中GW9662不是典型的完全PPARγ拮抗劑，而是起到具有強(qiáng)拮抗活性和不同的非劑量依賴性激動(dòng)活性的SPPARγM的作用(Olefsky等人，2000；Knouff等人，2004)。由于GW9962在PPARγ蛋白質(zhì)處的不可逆性結(jié)合和非劑量依賴性激動(dòng)作用，它不適合治療使用。

已經(jīng)報(bào)道稱GW9962在無細(xì)胞和基于細(xì)胞的測定法中(IC50為3.3nM)和在人乳腺腫瘤細(xì)胞系中通過共價(jià)修飾PPARγ的配體結(jié)合位點(diǎn)中的半胱氨酸285殘基而起到具有高親和力和選擇性的有效PPARγ拮抗劑的作用(Leesnitzer等人，2002；Seargent等人，2004)。因此，GW9662完全且不可逆地消除PPARγ激活和信號(hào)傳遞。發(fā)明人僅觀察到SPPARγM，F(xiàn)MOC-L-亮氨酸和MCC-555的溫和或微弱作用，而GW9662和MTTB在HEK293T細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞中強(qiáng)有力地抑制羅格列酮的作用。在HEK293T細(xì)胞中的IC50為4.3μΜ，MTTB在低于對(duì)細(xì)胞系中PPARγ受GW9662的拮抗作用所報(bào)道的濃度下表現(xiàn)出溫和的劑量依賴性、競爭性拮抗活性。在Jurkat T細(xì)胞中也檢驗(yàn)了MTTB對(duì)羅格列酮介導(dǎo)的PPARγ反式激活的這種競爭性拮抗效力。與GW9662相反，MTTB在HuT-78細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞兩者中顯示出更低的細(xì)胞毒性，表明在試驗(yàn)濃度下，很可能對(duì)炎癥細(xì)胞發(fā)揮藥理而非毒理作用。發(fā)明人觀察到與GW9662相比，MTTB向HuT-78細(xì)胞和Jurkat T細(xì)胞中的胞內(nèi)累積高約100倍，與HEK293T細(xì)胞相反，其中MTTB攝取量僅比GW9662高10倍，表明對(duì)淋巴細(xì)胞的潛在選擇性。

有趣的是，MTTB的結(jié)構(gòu)和計(jì)算對(duì)接分析強(qiáng)調(diào)了MTTB對(duì)PPARγ-LBD的潛在親和力并且著重指出了在PPARγ處MTTB、拮抗劑GW9662和激動(dòng)劑羅格列酮之間的結(jié)合特征的差異(Chandra等人，2008)。

因此MTTB將用作先導(dǎo)化合物用于通過修飾其外部殘基而增強(qiáng)PPARγ結(jié)合親和力。考慮到正如已經(jīng)對(duì)結(jié)構(gòu)相似的PPARγTZD完全激動(dòng)劑羅格列酮和吡格列酮(pioglitazone)所示(Berger等人，2005；Nissen等人，2007)，配體受體相互作用的微小變化導(dǎo)致藥理學(xué)性質(zhì)上的差異，結(jié)構(gòu)修飾可進(jìn)一步提高M(jìn)TTB的拮抗作用。

由于GW9662的強(qiáng)拮抗活性，所以在細(xì)胞培養(yǎng)體系和動(dòng)物模型中將其廣泛用作研究工具用于研究PPARγ在生物過程中的作用。與GW9662結(jié)合的不可逆性相反，MTTB似乎與PPARγ蛋白可逆性結(jié)合。總的來說，競爭性拮抗作用、低的部分激動(dòng)作用、低的細(xì)胞毒性和高的胞內(nèi)攝取量是將允許MTTB安全重復(fù)給藥以供潛在治療使用的性質(zhì)。計(jì)劃在動(dòng)物模型中進(jìn)一步研究。這里用MTTB呈現(xiàn)的結(jié)果表明，它是新一類競爭性PPARγ拮抗劑的原型，及炎癥和免疫性病癥受控治療廣泛適用的治療方法的有前景的候選方法。