本發(fā)明涉及改進(jìn)的用于制備免疫球蛋白G(IgG)的工藝。

背景技術(shù)：

免疫球蛋白G(IgG)是人體中豐富的抗體同種型。IgG結(jié)合至許多不同類型的病原體，包括病毒、細(xì)菌和真菌，以保護(hù)身體免受感染。因此，IgG在免疫系統(tǒng)的功能中起到關(guān)鍵的作用。人體中存在四種IgG的亞型：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgG1和IgG2的是最常見的IgG的類型，占所有IgG的近90％。為便于參考，在涉及IgG的本文件中，IgG旨在涵蓋所有的四種類型，以及其任何組合。術(shù)語(yǔ)“IgG”還旨在涵蓋IVIG(靜脈內(nèi)免疫球蛋白)、SCIG(皮下免疫球蛋白)和IMIG(肌內(nèi)免疫球蛋白)。

如上所述，IgG在免疫系統(tǒng)的功能中起到關(guān)鍵的作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，患有免疫和自身免疫障礙的患者可以從用IgG的治療獲益?？捎肐gG進(jìn)行治療的病癥包括原發(fā)性免疫缺陷(PID)，包括重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)和普通變化型免疫缺陷(CVID)、和由其他疾病(如慢性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤或兒童艾滋病)引起的或骨髓移植后的繼發(fā)性免疫缺陷(SID)?？梢灾委煹钠渌“Y包括特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、川崎氏病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、重癥肌無(wú)力、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(CIDP)、和多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病(MMN)。IgG還用于許多其他風(fēng)濕、血液和皮膚病癥的治療。

通常使用常規(guī)分餾工藝從匯集的人血漿中分離IgG。在二十世紀(jì)40年代早期由科恩(Cohn)開發(fā)了冷乙醇分餾工藝，以從人血液中純化白蛋白(科恩，E.J.(Cohn,E.J.)等人，美國(guó)化學(xué)會(huì)志(J.Am.Chem.Soc.)，68：459-475，(1946))。這也稱為‘科恩方法6’。

這個(gè)工藝基于所希望的蛋白溶解度的差異，溶解度的差異基于pH、乙醇濃度、溫度、離子強(qiáng)度和蛋白濃度。在科恩工藝期間中，在分餾過(guò)程中將乙醇濃度增加至40％，將pH從中性降低至4.8，并將溫度從室溫降低至-5℃。隨著在工藝期間內(nèi)條件變化，不同的血漿蛋白依次沉淀出來(lái)，其他蛋白保留在溶液中。取決于確切的感興趣的蛋白，可以進(jìn)一步加工來(lái)自每個(gè)分餾步驟的沉淀物和上清液中的任一個(gè)或兩者。有五個(gè)主要的科恩沉淀物餾分，餾分I至V，每個(gè)餾分包括不同的蛋白作為其主要組分。例如，從餾分V獲得白蛋白，而從餾分II+III可以獲得IgG。隨后，開發(fā)了將科恩餾分II+III(科恩方法6的中間產(chǎn)物)進(jìn)一步亞分餾成餾分II(更純化的IgG沉淀物餾分)的方法，并稱為‘翁克雷(Oncley)方法9’(翁克雷，J.L.(Oncley,J.L.)等人，美國(guó)化學(xué)會(huì)志，71，541-550(1949))。

科恩方法存在許多變型，包括蓋爾洛(Gerlough)、英克(Hink)和馬爾福德(Mulford)方法。基斯特勒和聶克曼(Kistler&Nitschmann)方法是另一個(gè)著名的變體(P.基斯特勒(P.Kistler)和Hs.聶克曼(Hs.Nitschmann)，血液之聲(Vox Sang.)7:414-424(1962))。在該方法中，沉淀物A至C分別代替科恩餾分II+III、III和V。由于它總體上涉及比科恩方法中更少的步驟，具有更快的加工和更低的乙醇使用的優(yōu)勢(shì)，該工藝已被廣泛接受。

其他純化IgG的方法包括通過(guò)離子交換色譜和聚乙二醇沉淀，從來(lái)自科恩方法6的血漿或血漿中間產(chǎn)物II+III直接分離IgG。來(lái)自這些工藝的產(chǎn)量是相對(duì)高的。由于對(duì)純度，并且尤其是血源性病毒(如肝炎和HIV)傳播的擔(dān)憂，這些方法中的一些已經(jīng)被停止。然而，特定病毒的滅活步驟的引入導(dǎo)致了近年來(lái)在色譜方法中的巨額投資，盡管復(fù)雜性，高資本成本和高水/廢物處理需求將這種選項(xiàng)限制在除最大和最好資金的血漿分餾器之外的所有方面。

科恩法(及其變體)基本上產(chǎn)生單體IgG。由此，意味著大部分的IgG產(chǎn)物是單體的，不到20％的IgG處于二聚體以及更大的聚集體的形式。一般，IgG聚集體的存在是不期望的，因?yàn)樵诮邮茉醋匝獫{的IgG的患者中，它已連接至不想要的免疫應(yīng)答。因此，期望通過(guò)任何純化工藝獲得的IgG產(chǎn)物包含盡可能多的單體。

在1998年至2006年之間對(duì)IgG的需求增加了一倍以上，并且需求繼續(xù)增長(zhǎng)。2008年，血漿餾分的全球市場(chǎng)估計(jì)為120億美元，幾乎一半是IgG。目前，供應(yīng)必須來(lái)自人類供體捐贈(zèng)的血漿。由于存在有限的血漿供應(yīng)，因此本領(lǐng)域需要用于分離具有改進(jìn)的產(chǎn)量的IgG的改進(jìn)工藝。然而，對(duì)于所有臨床應(yīng)用，重要的是具有高純度的IgG以便最小化任何不希望的副作用，例如，由其他蛋白酶或凝結(jié)因子，或其他污染組分，如血源性病毒的存在導(dǎo)致的。

J.A.胡珀(J.A.Hooper)在北美免疫學(xué)與變態(tài)反應(yīng)臨床(Immunol.Allergy Clin.N.Am.)28(2008)765-778，以及安德里亞布沙爾(Andrea Buchacher)和沃特露德卡爾(Waltrud Kaar)在生產(chǎn)用于治療用途的血漿蛋白(Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use)(約翰·威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.)，2013年，約瑟夫·貝爾托利尼(Joseph Bertolini)、尼爾·戈斯(Neil Goss)和約翰柯林(John Curling)編輯)的第13章中描述了各種用于制備商用IgG配制品的方法。大多數(shù)批準(zhǔn)使用的IgG產(chǎn)物是通過(guò)冷乙醇分餾(即科恩/翁克雷方法或其變體)，隨后通過(guò)使用離子交換色譜進(jìn)行純化產(chǎn)生的。因?yàn)镮gG的主要損失發(fā)生在科恩/翁克雷(基斯特勒和聶克曼)分餾工藝的后續(xù)餾分III(沉淀物B)的階段，通過(guò)使用I+II+III(或II+III，如果纖維蛋白原在餾分I中較早沉淀)作為用于離子交換色譜的起始物質(zhì)來(lái)使IgG的損失最小化。

任何蛋白純化方案中所固有的是，從被視為對(duì)該過(guò)程是多余的任何不想要的蛋白和任何其他不想要的物質(zhì)中分離目標(biāo)蛋白。此類其他物質(zhì)可以包括在目標(biāo)產(chǎn)物中不希望的其他化學(xué)部分(包括有害或致病物質(zhì))。因此，蛋白純化工藝通常產(chǎn)生包含感興趣的蛋白和所謂的“廢物”或“副”的餾分的“產(chǎn)物餾分”。然而，這樣輕視的分類可能會(huì)產(chǎn)生誤導(dǎo)，因?yàn)檫@些所謂的“廢物餾分”作為其他蛋白或組分物質(zhì)的來(lái)源物質(zhì)可能仍然具有價(jià)值。

在血漿蛋白的領(lǐng)域中，在AU 715427 B2中發(fā)現(xiàn)了這種誤導(dǎo)性命名的證據(jù)，該AU 715427 B2描述了使用“廢物餾分”作為用于通過(guò)親和色譜純化特定的免疫球蛋白的原料的用途。類似地，JPS 601134 A描述了廢物餾分作為用于通過(guò)梯度電泳純化免疫球蛋白的原料的用途。WO 2010/132686 A1描述了使用來(lái)自IgG的分餾的廢棄餾分以純化存在于該餾分中的聚集的免疫球蛋白。

UA 45557 U通過(guò)描述正常血漿分餾工藝證明了術(shù)語(yǔ)“廢物餾分”的替代使用，該正常血漿分餾工藝程被應(yīng)用于由于丙型肝炎病原體的標(biāo)志物的污染而作為“廢物”所拒絕的血漿捐贈(zèng)物。

仍有一個(gè)未解決的問(wèn)題，即在科恩/翁克雷工藝及其變體(在下文中簡(jiǎn)稱為主要工藝流)的IgG產(chǎn)量小于血漿中存在的IgG的總量。這可以反映了在制造工藝中蛋白的一些變性。另外地或可替代地，可以通過(guò)捕獲在分離的和除去的“廢物”餾分(這些餾分還包含其他組分，包括多聚的和聚集的IgG)中，將少量殘留量的高質(zhì)量免疫球蛋白(即非聚集的，主要是單體的IgG)從主要的制造分餾途徑中分離。這損害了從稀有血漿起始物質(zhì)有效回收有價(jià)值的免疫球蛋白，從而對(duì)患者有益的治療產(chǎn)物的可用性產(chǎn)生影響。

在本申請(qǐng)的上下文中，術(shù)語(yǔ)“廢物餾分”定義為與所希望的“主要產(chǎn)物餾分”分離的餾分。產(chǎn)物餾分將通常包含所希望的高純度的目標(biāo)蛋白。所謂的廢物餾分將包含一些目標(biāo)蛋白，盡管與可能損害目標(biāo)蛋白的質(zhì)量、有效性或安全性的其他組分組合。廢物餾分實(shí)際上作為除目標(biāo)蛋白以外的蛋白來(lái)源可以是有價(jià)值的。在本申請(qǐng)中，目標(biāo)蛋白是免疫球蛋白IgG。

因此，在純化血漿以提取IgG的過(guò)程中，主要工藝流是生成IgG產(chǎn)物的工藝流。如果主要工藝是科恩分餾工藝，則主要的產(chǎn)物餾分是科恩餾分II。在產(chǎn)生IgG的科恩分餾工藝中，上清液A+I被認(rèn)為是“廢物”，因?yàn)樗话@著量的IgG。然而，如圖1所證實(shí)的，可進(jìn)一步純化這種的廢物，以產(chǎn)生其他目標(biāo)蛋白。例如，可以進(jìn)一步加工上清液A+I，以產(chǎn)生包含白蛋白的科恩餾分V。因此，當(dāng)來(lái)自血漿分餾工藝的感興趣的主要蛋白是除了白蛋白以外的任何物質(zhì)時(shí)，上清液A+I僅是“廢物餾分”。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在科恩/翁克雷工藝中產(chǎn)生的廢物餾分(以及其變體)可以包含顯著量的IgG。已經(jīng)顯示，該廢物餾分可以包含在起始血漿中高達(dá)總量30％的IgG。

提供用于生產(chǎn)IgG的改進(jìn)的工藝將是有利的，這些工藝可以具有比目前可用的方法更高的產(chǎn)量，同時(shí)保持高水平的純度和安全性，并且這些工藝不需要額外的復(fù)雜和昂貴的色譜步驟。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

現(xiàn)在已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，可以相對(duì)容易地從沉淀物餾分(這些沉淀物餾分在產(chǎn)生IgG的血漿分餾工藝期間先前被認(rèn)為是“廢物”餾分)獲得高純度的IgG(例如，符合歐洲藥典專論0338的正常免疫球蛋白，該正常免疫球蛋白包括不少于85wt.％的單體和二聚體以及不超過(guò)10wt.％的聚合物和/或聚集體)，而不需要色譜步驟，并且特別是不需要親和或陰離子交換色譜步驟。通過(guò)從這些廢物餾分中提取IgG，可以顯著提高IgG的總產(chǎn)量，而不需要額外的后續(xù)純化步驟。

因此，本發(fā)明提供了在血漿分餾期間產(chǎn)生的廢物沉淀物餾分作為IgG來(lái)源的用途。優(yōu)選地，廢物沉淀物餾分是在生產(chǎn)包含IgG的液體餾分(上清液)的分餾步驟期間產(chǎn)生的。

更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了一種用于從廢物沉淀物餾分中提取IgG的方法，該廢物沉淀物餾分在血漿分餾期間產(chǎn)生，并且該廢物沉淀物餾分從主要的IgG制造工藝流中分離，該方法包括將廢物沉淀物與合適的溶劑接觸以從廢物沉淀物中提取IgG。優(yōu)選地，廢物沉淀物餾分是在生產(chǎn)包含IgG的液體餾分(上清液)的分餾步驟期間產(chǎn)生的。特別是，本發(fā)明的方法不需要任何色譜步驟，如親和色譜或陰離子交換色譜，并且不需要用于從血漿分餾期間產(chǎn)生的廢物沉淀物餾分中分離IgG的電學(xué)工藝，例如電泳。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在產(chǎn)生IgG的血漿分餾期間用于提高IgG產(chǎn)量的方法，該方法包括：使用合適的溶劑從廢物沉淀物餾分中提取IgG，該廢物沉淀物餾分是在血漿分餾期間產(chǎn)生的并且與主要的IgG制造加工流分離。優(yōu)選地，廢物沉淀物餾分是在生產(chǎn)包含IgG的液體餾分(上清液)的分餾步驟期間產(chǎn)生的。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于從血漿或血漿餾分中分離IgG的方法，該方法包括

a)分餾血漿或血漿餾分以產(chǎn)生包含血漿或血漿餾分中大部分IgG的液體餾分，和包含另外的IgG的廢物沉淀物餾分；并且

b)使用合適的溶劑從廢物沉淀物餾分中提取至少一些另外的IgG。

在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了用于制備IgG的方法，該方法包括：

a)從改良的基斯特勒和聶克曼B+I分餾工藝回收沉淀物和上清液；

b)均質(zhì)化步驟a)中獲得的沉淀物，并通過(guò)在0℃下在乙酸鹽/磷酸鹽水性緩沖液中與17vol.％乙醇混合1至3小時(shí)從其中提取IgG；并且然后

c)從任何剩余的沉淀物中分離該包含所提取的IgG的緩沖液。

更優(yōu)選地，上述方法還包括將步驟c)中獲得的包含所提取IgG的緩沖液與步驟a)中獲得的改良的基斯特勒和聶克曼B+I上清液組合?？商娲?，在上述方法中，步驟c)，并且該方法還包括在根據(jù)基斯特勒和聶克曼餾分II沉淀的條件在乙醇水溶液中孵育所提取的IgG；并回收所得的富含IgG的餾分II沉淀物。

在本發(fā)明的所有方面，廢物沉淀物餾分優(yōu)選基本上等同于科恩餾分III。更優(yōu)選地，它是科恩餾分III或I+III、基斯特勒和聶克曼沉淀物B或B+I、或改良的基斯特勒和聶克曼沉淀物B或B+I。

在本發(fā)明的所有方面，液體餾分優(yōu)選基本上等同于科恩餾分III。更優(yōu)選地，它是科恩上清液III或I+III、或基斯特勒和聶克曼上清液B或B+I、或改良的基斯特勒和聶克曼上清液B或B+I。最優(yōu)選地，可以將液體餾分重新引入主流科恩上清液III或I+III或改良的基斯特勒和聶克曼上清液B或B+I中，用于IgG的繼續(xù)下游加工。還可以將它作為單獨(dú)的子餾分繼續(xù)處理，，并在餾分II處或在任何合適的后續(xù)階段的進(jìn)一步下游加工之后重新引入主流加工?？商娲?，液體餾分可完全獨(dú)立地加工成純化的人IgG產(chǎn)物。

本文對(duì)改良的基斯特勒和聶克曼工藝的任何引用是指如在羅伯茨(Roberts)等人，生物制劑(Biologicals)，第43(2)卷，2015年3月，第123-129頁(yè)中所描述的工藝。

附圖說(shuō)明

圖1是可用于生產(chǎn)人IgG和白蛋白的改良的基斯特勒和聶克曼冷乙醇分餾工藝的示意圖。

圖2是示意圖，該示意圖顯示了可以如何將本發(fā)明的工藝整合到改良的基斯特勒和聶克曼冷乙醇分餾工藝中。

圖3是示意圖，該示意圖顯示了用于生產(chǎn)IgG的改良的基斯特勒和聶克曼冷乙醇分餾工藝。

圖4是示意圖，該示意圖顯示了合并本發(fā)明的另外的餾分B+1洗滌步驟的圖3的改良的基斯特勒和聶克曼冷乙醇分餾工藝，該工藝具有用于將另外所回收的IgG重新引入工藝流的可替代階段。

圖5是示意圖，該示意圖顯示了具有本發(fā)明的另外的餾分III/I+III洗滌步驟的科恩/翁克雷分餾工藝，該工藝具有用于將另外所回收的IgG重新引入工藝流中的可替代階段。

具體實(shí)施方式

在下文中，術(shù)語(yǔ)“液體餾分”和“上清液”是等同的，術(shù)語(yǔ)“沉淀物”和“餾分”也是如此。

在本文所述的方法中獲得的IgG產(chǎn)物具有高純度，具有最小的聚集的IgG，并且因此滿足歐洲藥典專論0338(01/2015)提出的純度最低標(biāo)準(zhǔn)。因此，通過(guò)本文所述的方法直接獲得的IgG的產(chǎn)物包含至少90％的丙種球蛋白，如通過(guò)電泳所測(cè)定的。通過(guò)這些方法獲得的產(chǎn)物還包含至少85wt.％的單體和二聚體IgG，具有小于10wt.％的聚合的和聚集的IgG，如通過(guò)尺寸排阻色譜法測(cè)定的。HPLC還可以用于分析聚集體含量。這意味著，從本文所述的分餾工藝獲得的產(chǎn)物有足夠的純度和質(zhì)量以滿足歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)，并且因此不是一定需要任何進(jìn)一步的純化，以形成藥品。當(dāng)然，通過(guò)本文所述的分餾工藝獲得的IgG可以通過(guò)任何合適的手段進(jìn)一步加工，以獲得更高質(zhì)量的IgG產(chǎn)物，或者以獲得例如替代藥物用途的不同的產(chǎn)物譜。這樣進(jìn)一步的處理方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且可以特別包括一個(gè)或多個(gè)的病毒滅活步驟。

冷乙醇分餾是用于從血漿分離IgG的最廣泛使用的方法之一。通常，將來(lái)自多個(gè)供體的匯集的血漿批次進(jìn)行冷沉淀，以除去作為冷沉淀物的凝結(jié)因子如因子VIII。然后使冷沉淀上清液經(jīng)受一個(gè)或多個(gè)冷乙醇分餾步驟，以最終產(chǎn)生主要包含IgG的沉淀物餾分。在經(jīng)典的科恩/翁克雷工藝和基斯特勒和聶克曼方法中，這種富含IgG的餾分被稱為餾分II或沉淀物II。然后，使該沉淀物經(jīng)受進(jìn)一步純化和病毒滅活步驟，以提供藥學(xué)上可接受的IgG最終產(chǎn)物，用于靜脈輸注、皮下輸注或肌內(nèi)輸注。

“正常血漿”，“超免疫血漿”(如超免疫抗-D，破傷風(fēng)或乙型肝炎血漿)或與其等同的任何血漿可以用于本文所述的冷乙醇分餾工藝中。

在科恩分餾方法中，在第一分餾步驟產(chǎn)生主要包括纖維蛋白原和纖連蛋白的餾分I。將來(lái)自該步驟的上清液進(jìn)一步加工，以沉淀出餾分II+III，并且然后沉淀出餾分III和II。通常，餾分II+III包含約60％的IgG，以及雜質(zhì)如纖維蛋白原、IgM和IgA。然后在餾分III中除去大部分這些雜質(zhì)，其被認(rèn)為是廢物餾分并且通常被丟棄。然后處理上清液以沉淀出的主要包含IgG的餾分，餾分II，其可以包含大于90％的IgG。上述％值是指IgG的純度％。純度可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)測(cè)量，如凝膠電泳。

在基斯特勒和聶克曼方法中，餾分I等同于科恩方法的餾分I。接下來(lái)的沉淀物/餾分被稱為沉淀物A(餾分A)。該沉淀物與科恩餾分II+III大致等同，但不相同。然后將沉淀物再溶解，并調(diào)節(jié)條件以沉淀出的沉淀物B(餾分B)，該沉淀物B等同于科恩餾分III。同樣，這被認(rèn)為是廢物餾分，并通常被棄去。然后進(jìn)一步加工沉淀物B上清液以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于科恩餾分II的沉淀物II。

在圖1所示的基斯特勒和聶克曼工藝的改良版中，可以組合前兩個(gè)分餾步驟，這樣使得不回收餾分I，并且稱為A+I的第一沉淀物包括纖維蛋白原和纖連蛋白。當(dāng)該沉淀物重新懸浮并經(jīng)受進(jìn)一步沉淀步驟時(shí)，所形成的沉淀物(其可以稱為B+I)包含纖維蛋白原和纖連蛋白以及其他雜質(zhì)，這些其他雜質(zhì)包括IgM和IgA。然后將來(lái)自該沉淀步驟的上清液進(jìn)一步加工以產(chǎn)生富含IgG的餾分，餾分II。在涉及IgG工藝流的情況下，在該工藝中的B+I沉淀物也被認(rèn)為是廢物餾分。

原則上，本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于在生產(chǎn)餾分II(包括科恩餾分III和餾分I+III和基斯特勒和聶克曼沉淀物B或B+I)之前的冷乙醇分餾期間產(chǎn)生的任何沉淀物餾分。優(yōu)選地，這些方法適用于在分餾工藝中緊接在餾分II之前的沉淀物餾分，該沉淀物餾分通常被認(rèn)為是廢物餾分。優(yōu)選地，廢物沉淀物餾分是科恩餾分III或I+III、基斯特勒和聶克曼沉淀物B或B+I、改良的基斯特勒和聶克曼沉淀物B或B+I、或基本上與其等同的餾分。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這些廢物沉淀物餾分可以包含來(lái)自起始血漿池的顯著量的IgG，在一些情況下高達(dá)25％-30％。這被推測(cè)部分是由于一些上清液被捕獲在沉淀物餾分中，并且部分是由于IgG與雜質(zhì)如IgM和IgA的共沉淀。

令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)應(yīng)用于廢物餾分的簡(jiǎn)單洗滌(提取)工藝，可以回收相對(duì)純形式的商業(yè)上顯著比例的“丟失的”IgG。該結(jié)果是出人意料的，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員預(yù)期，考慮到沉淀物中存在的相對(duì)高水平的其他蛋白，從廢物沉淀物中提取IgG將是困難的，并且可以提取的任何IgG將是低純度的(例如，聚集和其他不想要的蛋白種類或蛋白水解活性)。

重要的是注意到，本發(fā)明的方法不需要任何色譜步驟從廢物餾分中進(jìn)一步提取IgG。因此，本發(fā)明的工藝提供了來(lái)自廢物餾分相對(duì)純的IgG產(chǎn)物，而不需要色譜法。

已發(fā)現(xiàn)選擇用于洗滌工藝的合適的溶劑允許從廢物沉淀物中提取IgG，而不顯著提取沉淀物中存在的任何其他蛋白，這些其他蛋白在涉及IgG純化的情況下，被認(rèn)為是雜質(zhì)。因此，應(yīng)該選擇溶劑以特異性地從沉淀物中除去IgG，而不同時(shí)從沉淀物中除去不想要的雜質(zhì)。

廢物沉淀物餾分可以在其產(chǎn)生后立即進(jìn)行洗滌工藝?？商娲?，廢物餾分可以以冷凍形式存儲(chǔ)用于后續(xù)加工。在洗滌之前，如果需要，應(yīng)該將沉淀物平衡至進(jìn)行洗滌工藝的溫度。這種平衡通常是靜止的，即將不涉及沉淀物的任何攪拌。

應(yīng)選擇用于洗滌工藝的溶劑的類型和量，這樣使得IgG的回收最大化，而不過(guò)度損害所回收的IgG的純度。為了優(yōu)化IgG回收，同時(shí)最小化從廢物沉淀物提取雜質(zhì)，用于洗滌/提取的溶劑優(yōu)選相與產(chǎn)生所討論的廢物沉淀物的分餾步驟中使用的溶劑相同。

當(dāng)廢物餾分是(改良的)基斯特勒和聶克曼沉淀物B或B+I，或科恩餾分III或I+III是，優(yōu)選的溶劑是乙醇水溶液。更優(yōu)選地，這種乙醇溶液是緩沖的。應(yīng)控制乙醇濃度、溫度和pH，這樣使得從沉淀物中提取的IgG保留在溶液中。

優(yōu)選的乙醇濃度是在約10至約20vol.％的范圍內(nèi)。更優(yōu)選的是約11至約19vol.％的濃度范圍，甚至更優(yōu)選的是約12至約19vol.％的濃度范圍，最優(yōu)選的是約13至約17vol.％的濃度范圍。約13vol.％至約17vol.％是最優(yōu)選的?！凹s13vol.％”優(yōu)選為13±2vol.％，而“約17vol.％”優(yōu)選為17±2vol.％。

進(jìn)行該洗滌工藝的溫度也將影響所回收的IgG的量和純度。理想的是，洗滌工藝期間的溫度保持在產(chǎn)生所討論的廢物沉淀物的分餾步驟所使用的相同溫度下。因此，最佳溫度范圍將取決于所討論的餾分和分餾工藝。通常優(yōu)選的是在約-3℃至約-8℃范圍內(nèi)的溫度，包括約-3℃至約-7℃。例如，當(dāng)廢物餾分是(改良的)基斯特勒和聶克曼沉淀物B或B+I時(shí)，洗滌提取期間的溫度優(yōu)選為-5℃±2.0℃。當(dāng)廢物餾分是科恩餾分III或I+III時(shí)，優(yōu)選的溫度通常稍微更冷，優(yōu)選地-6℃±2.0℃。

通常優(yōu)選的是在約-3℃至約-8℃范圍內(nèi)的溫度，包括約-3℃至約-7℃。例如，當(dāng)廢物餾分是改良的基斯特勒和聶克曼沉淀物B或B+I時(shí)，洗滌提取期間的溫度優(yōu)選為-2℃±5℃。當(dāng)廢物餾分是科恩餾分III或I+III時(shí)，優(yōu)選的溫度通常稍微更冷，優(yōu)選地-3℃±5.0℃。

最佳pH范圍還取決于餾分。通常優(yōu)選的是在約4.8至約5.3范圍內(nèi)的pH，更優(yōu)選地約5.1至約5.3。例如，當(dāng)廢物餾分是(改良的)基斯特勒和聶克曼沉淀物B或B+I時(shí)，pH范圍優(yōu)選為5.1±0.05。當(dāng)廢物餾分是科恩餾分III或I+III時(shí)，pH可以稍微更高，優(yōu)選地5.2±0.05。

在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，當(dāng)廢物餾分是(改良的)基斯特勒和聶克曼沉淀物B或B+I時(shí)，溶劑是17±2vol.％乙醇水溶液，溫度為-5℃±2.0℃，并且pH范圍是5.1±0.05。

在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，當(dāng)廢物餾分是(改良的)基斯特勒和聶克曼沉淀物B或B+I時(shí)，溶劑是17±2vol.％乙醇水溶液，溫度為-2℃±5℃，并且pH范圍是5.1±0.05。

在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，當(dāng)廢物餾分是科恩餾分III或I+III時(shí)，溶劑是17±2vol.％乙醇水溶液，溫度為-6℃±2.0℃，并且pH范圍是5.2±0.05。

在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，當(dāng)廢物餾分是科恩餾分III或I+III時(shí)，溶劑是17±2vol.％乙醇水溶液，溫度為-3℃±5℃，并且pH值范圍是5.2±0.05。

在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，當(dāng)廢物餾分是從超免疫血漿或等同血漿制備的(改良的)基斯特勒和聶克曼沉淀物B或B+I時(shí)，溶劑是13±2vol.％乙醇水溶液，溫度為-5℃±2.0℃，并且pH范圍是5.1±0.05。

在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，當(dāng)廢物餾分是從超免疫血漿或等同血漿制備的(改良的)基斯特勒和聶克曼沉淀物B或B+I時(shí)，溶劑是13±2vol.％乙醇水溶液，溫度為-2℃±5℃，并且pH范圍是5.1±0.05。

在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，當(dāng)廢物餾分是從超免疫血漿或等同血漿制備的科恩餾分III或I+III時(shí)，溶劑是13±2vol.％乙醇水溶液，溫度為-6℃±2.0℃，并且pH范圍是5.2±0.05。

在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，當(dāng)廢物餾分是從超免疫血漿或等同血漿制備的科恩餾分III或I+III時(shí)，溶劑是13±2vol.％乙醇水溶液，溫度為-3℃±5℃，并且pH范圍是5.2±0.05。

溶劑可以使用已知的緩沖液(包括磷酸鹽和乙酸鹽)進(jìn)行緩沖。

通常，洗滌步驟包括將廢物餾分在溶劑中懸浮?；旌蠎腋∫?，理想地是直到其均質(zhì)化，并且然后放置足夠的時(shí)間以將IgG提取到溶劑中。這對(duì)應(yīng)于圖2、4和5中所示的“提取”和“調(diào)節(jié)”步驟。該懸浮/調(diào)節(jié)/提取步驟沒(méi)有具體的時(shí)間上限。事實(shí)上，所花費(fèi)的時(shí)間將受外部因素如過(guò)程效率的限制。出于這個(gè)原因，提取時(shí)間優(yōu)選為在1和24小時(shí)之間，例如在約2和約10小時(shí)之間。約2小時(shí)例如90-150分鐘的時(shí)間也可以是合適的。

在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了用于制備IgG的方法，該方法包括：

a)從改良的基斯特勒和聶克曼B+I分餾工藝回收沉淀物和上清液；

b)均質(zhì)化步驟a)中獲得的該沉淀物，并通過(guò)在0℃下在乙酸鹽/磷酸鹽緩沖液中與17vol.％乙醇水溶液混合1至3小時(shí)從其中提取IgG；并且然后

c)從任何剩余的沉淀物中分離該包含所提取的IgG的緩沖液。

更優(yōu)選地，上述方法還包括將步驟c)中獲得的包含所提取IgG的緩沖液與步驟a)中獲得的改良的基斯特勒和聶克曼B+I上清液組合。可替代地，在上述方法中，通過(guò)過(guò)濾進(jìn)行步驟c)，并且該方法還包括根據(jù)改良的基斯特勒和聶克曼餾分II沉淀的條件在乙醇水溶液中孵育所提取的IgG；并回收所得的富含IgG的餾分II沉淀物。

通過(guò)洗滌/提取步驟產(chǎn)生的富含IgG的溶液優(yōu)選包含與當(dāng)廢物餾分從建立的IgG目標(biāo)蛋白制造工藝流沉淀出和/或分離出時(shí)產(chǎn)生的主要包含IgG的上清液具有相同或相似純度的IgG。

考慮到IgG的商業(yè)和治療價(jià)值，來(lái)自起始血漿的IgG產(chǎn)量的任何改進(jìn)可能是重要的，并且來(lái)自廢物餾分的甚至相對(duì)低％的IgG回收率可以是非常有價(jià)值的。

可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法回收所得的富含IgG的溶液，例如離心或過(guò)濾以將其與剩余的沉淀物分離。如果使用離心，則上清液將富含IgG(即將包含所提取的IgG)，并且可以棄去沉淀物，根據(jù)本發(fā)明再次處理，以進(jìn)一步提取的IgG和/或用于提取其他蛋白。如果使用過(guò)濾，則濾液將富含IgG，并且可以棄去所得的濾餅，進(jìn)一步?jīng)_洗以回收殘留夾帶的IgG，根據(jù)本發(fā)明再次處理，以進(jìn)一步提取IgG和/或用于其他蛋白。適合的過(guò)濾介質(zhì)是本領(lǐng)域已知的?？梢蕴砑庸杷猁}助濾劑如硅藻土，例如或以促進(jìn)過(guò)濾。

任何體積的溶劑可能用于洗滌工藝中，但理想地應(yīng)針對(duì)可用的加工設(shè)備進(jìn)行優(yōu)化。如果使用非常小的體積，則所得到的懸浮液可能太粘而不能容易地加工，而非常大的體積可能會(huì)導(dǎo)致工藝效率低下。出于工藝效率的原因，因此通常優(yōu)選保持溶劑體積相對(duì)低。例如，廢物餾分與溶劑的重量通常為約1:2至約1:10。優(yōu)選地，溶劑的重量可以是約四倍的廢物餾分重量，即廢物餾分與溶劑的重量比約為1:4。

據(jù)美國(guó)和歐洲藥典設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)，使用本發(fā)明的工藝獲得的富含IgG的溶液可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)一步加工，以提供藥學(xué)上可接受的IgG產(chǎn)物。優(yōu)選地，使用標(biāo)準(zhǔn)條件從溶液中沉淀餾分II，然后將其進(jìn)一步純化以提供藥品，如靜脈內(nèi)免疫球蛋白(IVIG)或皮下免疫球蛋白(SCIG)。

進(jìn)一步的純化可以采用陰離子和/或陽(yáng)離子交換色譜的形式，與合適的步驟相組合，以確保IVIG或SCIG的病毒安全性(參見羅伯茨等人，生物制劑，第43(2)卷，2015年3月，第123-129頁(yè))。

可以將從廢物餾分中提取所得的富含IgG的溶液?jiǎn)为?dú)加工，與相同的廢物餾分的其他溶劑提取物相組合和/或與來(lái)自其他工藝批次的廢物餾分的溶劑提取物相組合。然而，將這些溶液與主要目標(biāo)蛋白下游工藝的大量IgG工藝中間產(chǎn)物組合通常更有效。例如，可以將來(lái)自“廢物餾分”的溶劑提取的IgG與來(lái)自產(chǎn)生有關(guān)廢物沉淀物的分餾步驟中的富含IgG的上清液組合。這可以是來(lái)自相同分餾批次或不同批次的上清液。

可替代地，從廢物餾分所提取的IgG可以經(jīng)歷如在主要的IgG工藝中所使用的相同的下游制造步驟中一個(gè)或多個(gè)，隨后在下游工藝階段與大量的IgG中間產(chǎn)物組合。例如，可以將通過(guò)從沉淀物B+I洗滌/提取產(chǎn)生的富含IgG的溶液與B+I上清液組合，然后將其進(jìn)一步加工成最終產(chǎn)物。可替代地，可以將通過(guò)從沉淀物B+I洗滌/提取產(chǎn)生的富含IgG的溶液通過(guò)下游工藝步驟如乙醇沉淀加工成餾分II，隨后與從B+I上清液加工的主要IgG餾分Ⅱ中間產(chǎn)物組合，并加工成最終產(chǎn)物。根據(jù)制造設(shè)備和相關(guān)物流的可用規(guī)模，任一選項(xiàng)可以是優(yōu)選的。用于提取的最佳溶劑可以部分取決于任何預(yù)期后續(xù)處理步驟。

可以將所提取的IgG與主要的IgG工藝流重組的各種替代點(diǎn)示于圖4和5中。

可以以任何方式組合本發(fā)明的優(yōu)選特征。因此，為清楚起見，可以以任何方式組合本文在單獨(dú)實(shí)施例的上下文中描述的某些特征。相反，為簡(jiǎn)潔起見，也可以單獨(dú)地或以任何子組合提供在單個(gè)優(yōu)選特征的上下文中描述的各種特征。此外，對(duì)范圍中所述的值的引用包括該范圍內(nèi)的每個(gè)值。

注意，在一般說(shuō)明中以上描述的活動(dòng)并非所有都是必需的，可以不需要一部分特定活動(dòng)，并且除了所描述的那些之外，可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)其他的活動(dòng)。再者，列出活動(dòng)的順序不一定是進(jìn)行它們的順序。

實(shí)例

以下非限制性實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。

在以下實(shí)例/表中，使用‘SpaPlus’自動(dòng)分析儀(英國(guó)伯明翰市結(jié)合位點(diǎn)公司(The Binding Site))分析沉淀物和上清液的蛋白含量，該自動(dòng)分析儀是一個(gè)比濁分析平臺(tái)。使用AssayPro ELISA試劑盒(由英國(guó)劍橋市通用生物制劑公司(Universal Biologicals)提供)分析凝血因子VII、IX、XI和XII。使用Hyphen BioPhen顯色測(cè)定試劑盒(由英國(guó)埃普索姆市夸德拉泰克診斷公司(Quadratech Diagnostics)提供，埃普索姆，)測(cè)量因子XIa。

下表1示出了B+I沉淀物的典型組成，該B+I沉淀物為通過(guò)基斯特勒和聶克曼冷乙醇分餾產(chǎn)生的廢物餾分(等同于科恩/翁克雷餾分III)。

表1

下述實(shí)驗(yàn)起始物質(zhì)是包含IgG的沉淀物B+I，該沉淀物B+I具有有類似于表1所示的組合物。

在下面的實(shí)例中，如下制備17vol.％的乙醇水溶液緩沖溶液：

磷酸氫二鈉二水合物7.1mM(1.27g/L)

冰乙酸12.8mM(0.77g/L)

17vol.％的乙醇在磷酸鹽/乙酸鹽緩沖液中：添加至858.4g磷酸鹽/乙酸緩沖液的141.6g的96％的乙醇(最終pH為約5.0-5.1)。

實(shí)例1

在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在pH 4.8至5.2下，在1,000g的17vol.％的乙醇緩沖水溶液的存在下，在約-3℃至-7℃的溫度范圍下，通過(guò)勻漿器快速重新懸浮97g沉淀物B+I，以給出1:10的沉淀物與緩沖液的比例。緩沖液由調(diào)節(jié)至合適的pH的包含磷酸鹽和乙酸鹽的17vol.％乙醇水溶液(“乙醇緩沖液”)組成。

在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在約-3℃至-7℃的溫度范圍下，以相同的方式將99g相同的沉淀物B+I重新懸浮在1,000g的17vol.％的乙醇水溶液(即未緩沖的乙醇溶液)中。然后通過(guò)適度攪拌將兩種重新懸浮液連續(xù)混合，并在所述條件下在24小時(shí)內(nèi)調(diào)節(jié)(熟化)沉淀物。將緩沖和非緩沖的重新懸浮液的樣品離心以回收的富含IgG的液體。針對(duì)IgG和若干感興趣的其他蛋白的存在，分析預(yù)離心的懸浮液和上清液(表2)。

表2

分析來(lái)自緩沖的和未緩沖的17vol.％乙醇水溶液的重新懸浮的沉淀物B+I和上清液餾分

^aNQ＝無(wú)法定量-標(biāo)準(zhǔn)線的空白和最低點(diǎn)之間的樣品OD

NTU＝比濁法濁度比例單位，使用在NTU中校準(zhǔn)的濁度儀測(cè)量

從表2可以看出，在磷酸鹽/乙酸鹽緩沖的17vol.％乙醇水溶液(“乙醇緩沖液”)和未緩沖的乙醇溶液中的重新懸浮成功地提取了IgG。未緩沖的乙醇上清液提取物包含比緩沖上清液更高濃度的IgG，但是緩沖的乙醇上清液提取物包含具有更高質(zhì)量的IgG和低得多比例的IgA和IgM。蛋白酶活性、因子XI/XIa和因子XII在緩沖的乙醇上清液提取物中也較低。在IVIG產(chǎn)物中血栓栓塞副作用的高速率與因子XI和XIa相關(guān)，并且因此非常希望不將這些重新提取到上清液餾分中。不像乙醇/水提取物，乙醇/緩沖液提取物在組分上與上清液B+I餾分(其接著稱為餾分II)相似，并且因此混合的兩種餾分的可以產(chǎn)生含有較高的產(chǎn)量IgG的相當(dāng)純度的單一餾分II。

來(lái)自磷酸鹽/乙酸鹽緩沖的乙醇水溶液上清液的IgG的產(chǎn)量等同于0.55g的IgG/升血漿，這代表約10％血漿IgG的產(chǎn)量增加，該約10％血漿IgG可以轉(zhuǎn)化為10％-20％的額外產(chǎn)量的IgG最終產(chǎn)物。

實(shí)例2

在第二組實(shí)驗(yàn)中，研究了降低重新懸浮比例的效果以降低總體積。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，將500g的B+I沉淀物重新懸浮于1000g的緩沖的乙醇水溶液(一份沉淀物與兩份緩沖液)。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將250g相同的B+I沉淀物重新懸浮于1000g的乙醇緩沖液中(一份沉淀物與四份緩沖液)。在成熟期間間隔采集樣品用于分析(表3)。

表3

在24小時(shí)內(nèi)重新懸浮比例(沉淀物：乙醇緩沖液)對(duì)B+I懸浮上清液質(zhì)量的影響

表3中的數(shù)據(jù)表明，1:2和1:4的比例能夠從沉淀物中提取IgG，并且所提取的IgG的產(chǎn)量和質(zhì)量比1:4比例更高。例如，1:4上清液的濁度(其是物質(zhì)質(zhì)量的總指標(biāo))比等同的1:2的重新懸浮上清液低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，與1:2上清液相比，在1:4上清液中污染物如IgM、IgA和因子XIa的濃度顯著降低。來(lái)自兩個(gè)實(shí)驗(yàn)運(yùn)行的數(shù)據(jù)還表明，可以使用約2小時(shí)或更長(zhǎng)的成熟時(shí)間維持IgG的質(zhì)量和產(chǎn)率。在1:4和1:2上清液中，2小時(shí)成熟后的IgG的產(chǎn)量分別為0.47g和0.42g IgG/升血漿。

實(shí)例3

以1:4的比例進(jìn)行若干次重新懸浮以確認(rèn)實(shí)例2的結(jié)果。在六次重新懸浮中使用不同批次的起始物質(zhì)。在每一種情況下，250g的B+I沉淀物重新懸浮于1000g的如上所述的含水乙醇緩沖液。在-5℃下調(diào)節(jié)沉淀物懸浮液，同時(shí)混合最少2小時(shí)。在調(diào)節(jié)結(jié)束時(shí)，離心重新懸浮液。分析重新懸浮液和上清液。計(jì)算上清液的IgG濃度和IgG產(chǎn)量(血漿當(dāng)量)(表4)。

表4

確認(rèn)的B+I重新懸浮液的IgG含量和產(chǎn)量

IgG的平均產(chǎn)量是每升血漿0.57g的IgG。通過(guò)添加到主要的分餾工藝流中，該產(chǎn)率可以轉(zhuǎn)化為顯著的產(chǎn)率增加，代表來(lái)自每升所加工的血漿的額外的0.57g IgG。

實(shí)例4

將334g的B+I沉淀物重新懸浮于1,335g的17vol.％乙醇緩沖液中，并在-5℃的溫度下混合2小時(shí)。然后從固相通過(guò)離心分離液相(“第一提取物”)。

將274g固相沉淀物重新懸浮于1,096g的17vol.％乙醇緩沖液中，并在-5℃的溫度下混合2小時(shí)。然后通過(guò)離心將液相(“第二提取物”)與固相分離。

針對(duì)IgG和若干其他感興趣的蛋白的存在，分析來(lái)自每個(gè)程序的預(yù)離心的懸浮液和上清液(表5)。這證實(shí)了重復(fù)順序提取B+I沉淀物在溶劑上清液相中產(chǎn)生IgG，其他蛋白質(zhì)等同的減少。

表5

實(shí)例5

通過(guò)在-5℃的溫度下將一份沉淀物與四份17vol.％乙醇緩沖液混合兩小時(shí)來(lái)制備B+I沉淀物的提取物。然后通過(guò)離心將提取物與殘留的沉淀物分離。

然后將B+I沉淀物的提取物與B+I上清液按體積計(jì)以1:10的比例混合。將B+I上清液的組成與組合的B+I上清液和B+I沉淀物提取物的組成進(jìn)行比較(表6)。這證實(shí)了可以將上清液與沉淀物提取物組合以增加IgG濃度，同時(shí)保持可接受的IgG純度曲線。

表6

實(shí)例6

根據(jù)改良的基斯特勒和聶克曼方法，在0℃±2℃下，調(diào)節(jié)來(lái)自所分餾的血漿分餾的250kg的B+I沉淀物，并在1000kg 17vol.％乙醇緩沖液的存在下，在0℃±2℃下通過(guò)均質(zhì)化重新懸浮1小時(shí)。然后將混合物在0℃±2℃下熟化2小時(shí)，之后pH為5.14，并且電導(dǎo)率為0.6mS/cm。通過(guò)過(guò)濾或離心將上清液提取物與沉淀物分離。該提取方法和通過(guò)過(guò)濾或離心的回收成功地從B+I沉淀物中提取高純度的IgG(表7)。

表7

實(shí)例7

將313kg來(lái)自實(shí)例6的上清液提取物濾液調(diào)節(jié)至3.9mS/cm的離子強(qiáng)度，將乙醇濃度提高至25vol.％，并且用1M氫氧化鈉通過(guò)滴定將pH調(diào)節(jié)至pH 6.9，并且然后-6.5℃下孵育6小時(shí)，以產(chǎn)生通過(guò)離心收集的2.4kg餾分II沉淀物。將餾分II(FrII)沉淀物溶解于水中(FrII:水＝1:2)。分析顯示，B+I沉淀物的上清提取物與產(chǎn)生具有低水平聚集體的IgG的進(jìn)一步下游純化相容(表8)。

表8

來(lái)自所提取的B+I沉淀的再溶解的餾分II沉淀物的組成

實(shí)例8

將在低于-30℃下冷凍儲(chǔ)存的100g的B+I沉淀物在控制至0℃的容器(選項(xiàng)(a))中或在控制在0℃的包含17vol.％乙醇緩沖液的容器(選項(xiàng)(b))中在沒(méi)有任何攪拌的情況下升至0℃。通過(guò)在冷凍前放置于沉淀物中的探針測(cè)量溫度。當(dāng)沉淀物溫度達(dá)到0℃±1℃時(shí)，向來(lái)自選項(xiàng)(a)的沉淀物中添加17vol.％乙醇緩沖液，并且在將IgG萃取到溶劑緩沖液中之前，在攪拌不少于2小時(shí)的情況下，將兩種沉淀均質(zhì)化(成熟/調(diào)節(jié))。然后將上清液與剩余的沉淀物分離并分析。當(dāng)有或沒(méi)有緩沖液的情況下調(diào)節(jié)至0℃時(shí)，存在來(lái)自沉淀物的當(dāng)量IgG提取物表9)。

表9