上皮細(xì)胞構(gòu)成了藥物遞送的屏障。例如，口服給藥的治療藥物的吸收可能受到腸上皮的限制，并且通過(guò)吸入而遞送的治療藥物的吸收可能受到肺上皮的限制。同樣，遞送至其他上皮部位(如直腸腔、口腔、陰道腔、鼻腔)的、或者通過(guò)局部施用于皮膚的治療藥物的吸收可類似地受到上皮屏障的限制。該屏障對(duì)包括小分子、肽、蛋白質(zhì)、疫苗和核酸在內(nèi)的大范圍的藥物的遞送提出了挑戰(zhàn)。已經(jīng)進(jìn)行了各種嘗試來(lái)減輕由上皮細(xì)胞提供的屏障對(duì)藥物吸收的影響。然而，許多這些嘗試涉及使用有意或作為非預(yù)期的副作用損傷上皮的試劑。這種損傷可能導(dǎo)致材料不受控制地通過(guò)上皮，并且可能與由細(xì)胞損傷引起的免疫學(xué)危險(xiǎn)信號(hào)相結(jié)合，可能導(dǎo)致上皮的不期望的炎癥。因此，需要幫助治療劑通過(guò)上皮表面(優(yōu)選以可控的、暫時(shí)的且不引起無(wú)法接受的細(xì)胞損傷的方式)的改進(jìn)的技術(shù)(Brayden&Maher(2000)Therapeutic Delivery 1(1):5-9)。

由上皮提出的對(duì)于藥物吸收的挑戰(zhàn)已經(jīng)導(dǎo)致了某些藥物需要通過(guò)除了穿過(guò)上皮以外的途徑來(lái)遞送，例如，通過(guò)皮下注射。這帶來(lái)了許多缺點(diǎn)，包括降低的患者可接受性，更低的患者的依從性，以及與使用和貯存液體配方、提供注射裝置和以安全和負(fù)責(zé)的方式處置用過(guò)的注射裝置相關(guān)的更高成本。

上皮提供了對(duì)藥物吸收的屏障，因?yàn)槠浒ㄍㄟ^(guò)緊密連接而彼此連接的細(xì)胞層，所述緊密連接提供了對(duì)許多物質(zhì)的密閉，但是其能夠瞬時(shí)開(kāi)啟。存在有能夠更好地控制緊密連接的開(kāi)啟以幫助治療藥物遞送的需要。對(duì)于開(kāi)啟緊密連接的問(wèn)題已經(jīng)提出了多種解決方案。這些努力已經(jīng)引起了兩組分子的鑒定：非天然的、延長(zhǎng)的氨基酸(NEAA)和短鏈脂肪酸(SCFA)。NEAA已由Emisphere公司最初開(kāi)發(fā)，該公司已證明了藥物攝取中的邊際改善，但是尚未提交新藥的監(jiān)管批準(zhǔn)申請(qǐng)。一種SCFA，癸酸鈉用在經(jīng)批準(zhǔn)的直腸栓劑產(chǎn)品中以改善氨芐青霉素的攝取。然而，懷疑改善攝取的機(jī)制是通過(guò)粘膜上皮的局部損傷(Maher等人，(2009)Adv.Drug Deliv.Rev.61:1427-1449)。

特別感興趣的是口服遞送胰島素、胰高血糖素樣肽1(GLP-1)和其它相關(guān)分子用于治療糖尿病患者、肥胖癥、抑制食欲和改善碳水化合物代謝。這樣的化合物特別需要口服遞送途徑，因?yàn)樗鼈兺ǔ１皇┯脭?shù)月、數(shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間，這意味著避免注射可顯著提升患者的可接受性并潛在地降低成本，并且還因?yàn)樵谧匀恢羞@些腸激素通過(guò)肝門(mén)靜脈進(jìn)入受試者的血流，所以穿過(guò)腸屏障遞送將更接近地模擬生理遞送途徑。

本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)了對(duì)于上皮的緊密連接的受控開(kāi)啟有用的化合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)發(fā)明的第一方面，提供一種肽，其包含根據(jù)式1的序列：

X₄-X₅-X₆-X₇-X₈

式1(SEQ ID NO:1)

其中：

X₄為帶負(fù)電的氨基酸殘基，例如pTyr、Asp或Glu；

X₅為小的疏水性氨基酸殘基，例如Val或Ala；

X₆為帶正電的氨基酸殘基，例如Lys或Arg；

X₇為親水性氨基酸殘基，例如Tyr、Phe、Thr或Ser；并且

X₈為帶負(fù)電的氨基酸殘基，例如pTyr、Asp或Glu；

或者所述肽包含根據(jù)式2的序列：

X₅-X₆-X₇-X₈

式2(SEQ ID NO:2)

其中：

X₅為任意氨基酸殘基；

X₆為T(mén)yr；

X₇為Gln；并且

X₈為T(mén)yr；

或者所述肽包含根據(jù)式1或式2的序列的逆-反(retro-inverso)形式，其中所有氨基酸殘基均為D-構(gòu)型并且肽序列順序反轉(zhuǎn)。

根據(jù)發(fā)明的第二方面，提供一種藥物組合物，其包含一種肽以及藥學(xué)上可接受的載體，所述肽包含根據(jù)式1的序列：

X₄-X₅-X₆-X₇-X₈

式1(SEQ ID NO:1)

其中：

X₄為帶負(fù)電的氨基酸殘基，例如pTyr、Asp或Glu；

X₅為小的疏水性氨基酸殘基，例如Val或Ala；

X₆為帶正電的氨基酸殘基，例如Lys或Arg；

X₇為親水性氨基酸殘基，例如Tyr、Phe、Thr或Ser；并且

X₈為帶負(fù)電的氨基酸殘基，例如pTyr、Asp或Glu；

和/或所述肽包含根據(jù)式2的序列：

X₅-X₆-X₇-X₈

式2(SEQ ID NO:2)

其中：

X₅為任意氨基酸殘基；

X₆為T(mén)yr；

X₇為Gln；并且

X₈為T(mén)yr；

或者其中根據(jù)式1和/或式2的序列為逆-反構(gòu)型，其中所有氨基酸殘基均為D-構(gòu)型并且肽序列順序反轉(zhuǎn)。

根據(jù)發(fā)明的第三方面，提供根據(jù)發(fā)明第一方面的肽或者根據(jù)發(fā)明第二方面的藥物組合物，其用作藥物。

根據(jù)發(fā)明的第四方面，提供根據(jù)發(fā)明第一方面的肽或者根據(jù)發(fā)明第二方面的藥物組合物在制備藥物中的用途。

根據(jù)發(fā)明的第五方面，提供一種打開(kāi)上皮表面的緊密連接的方法，其包括將有效量的根據(jù)發(fā)明第一方面的肽或者根據(jù)發(fā)明第二方面的藥物組合物施用于上皮。

根據(jù)發(fā)明的第六方面，提供一種遞送藥劑穿過(guò)上皮表面的方法，其包括將所述藥劑與根據(jù)發(fā)明第一方面的肽聯(lián)合施用，或者作為根據(jù)發(fā)明第二方面的藥物組合物的一部分進(jìn)行施用。

附圖說(shuō)明

圖1：已知調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈(MLC)磷酸化狀態(tài)的磷酸酶和激酶的組織。能夠使MLC磷酸化的肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)，通過(guò)細(xì)胞質(zhì)鈣(Ca²⁺)-鈣調(diào)蛋白水平的增加而被活化。MLCK的活化形式能夠被小的、膜可透過(guò)的肽激酶抑制劑(PIK)抑制。肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)復(fù)合物的活性受到被稱為CPI-17和MYPT1的兩種調(diào)節(jié)亞基的控制。這些調(diào)節(jié)亞基的作用依次分別受到蛋白激酶C和Rho激酶活性的控制。

圖2：緊密連接(TJ)開(kāi)啟/關(guān)閉和MLC磷酸化/去磷酸化的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。在天然狀態(tài)中，MLCP是活化的，這使MLC保持在去磷酸化的狀態(tài)并且TJ結(jié)構(gòu)在關(guān)閉狀態(tài)，其中存在最少的細(xì)胞旁(相鄰上皮細(xì)胞之間)溶質(zhì)通量(flux)。MLCK的持續(xù)活化或MLCP的抑制將導(dǎo)致MLC磷酸化狀態(tài)增加和細(xì)胞旁溶質(zhì)通量的增加。

圖3：MYPT1的殘基1-299與PP1在一個(gè)表面相互作用，而CPI-17與另一個(gè)面相互作用。晶體結(jié)構(gòu)的帶狀描述說(shuō)明了MYPT1與CPI-17預(yù)計(jì)如何在平滑肌細(xì)胞中相互作用。這些相互作用可能不同于那些分化的上皮細(xì)胞。

圖4：[A]RRVEVKYDRR(肽640，SEQ ID NO:3)相對(duì)于沒(méi)有肽的對(duì)照以1mM和5mM對(duì)Caco-2細(xì)胞單層TEER(跨上皮電阻)的作用的時(shí)間過(guò)程。[B]至多5mM沒(méi)有肽細(xì)胞毒性——MMT試驗(yàn)、半胱天冬酶的活化等等。

圖5：RRVEVKYDRR(肽640，SEQ ID NO:3)和RKAKYQYRRK(肽250，SEQ ID NO:4)相對(duì)于對(duì)照肽(均以5mM加入)對(duì)TEER[左]和4kDa的熒光素標(biāo)記的葡聚糖(4FD)轉(zhuǎn)運(yùn)[右]的作用。在0、15、30、45、60、75、90和120分鐘進(jìn)行測(cè)量。在45分鐘時(shí)，所有頂部的培養(yǎng)基用4FD但沒(méi)有肽的培養(yǎng)基替換。在70分鐘時(shí)，所有頂部的培養(yǎng)基用4FD加上在沖去之前存在的相同肽的培養(yǎng)基來(lái)重新裝滿。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的值表示兩個(gè)Caco-2單層的平均值；未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

圖6：在應(yīng)用肽250或肽640之后穿過(guò)Caco-2單層的(A)絕對(duì)TEER和(B)初始TEER％。箭頭表示當(dāng)沖去肽并用PBS代替時(shí)的點(diǎn)。對(duì)照為沒(méi)有肽的PBS。對(duì)于對(duì)照，n＝6，并且，對(duì)于所有肽組，n＝5。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SD。

圖7：在應(yīng)用葡聚糖與肽250或肽640之后，在基底外側(cè)室中發(fā)現(xiàn)的(A)4kDa的葡聚糖的累積量和(B)70kDa的葡聚糖的累積量。對(duì)于對(duì)照，n＝6，并且，對(duì)于所有肽組，n＝5。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SD。

圖8：(A)在雄性Wistar大鼠中S.C.注射胰島素之后的初始血糖％。(B)在腸內(nèi)注射肽250與30IU/kg的胰島素之后的初始血糖水平％和(C)在腸內(nèi)注射肽640與30IU/kg胰島素之后的初始血糖水平％。對(duì)于所有數(shù)據(jù)組，n＝3。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SD。

圖9：腸腔內(nèi)注射PIP肽瞬時(shí)增加了pMLC含量并在體內(nèi)在非糖尿病大鼠腸組織中增強(qiáng)了胰島素的細(xì)胞旁攝取。(A)代表性半定量蛋白質(zhì)印記分析，其用于評(píng)估相對(duì)于總的MLC含量，肌球蛋白輕鏈(MLC)在Ser¹⁹處磷酸化(pMLC-Ser¹⁹)的程度的變化。(B)ILI注射PIP肽增加了pMLC的含量。以設(shè)定的濃度在頂部應(yīng)用PIP肽之后，在選定的時(shí)間點(diǎn)大鼠腸組織中的MLC與pMLC-Ser¹⁹水平之比。*p<0.05。(C)在ILI注射之后，通過(guò)PIP肽增強(qiáng)的發(fā)熒光的(Cy3-標(biāo)記的)胰島素的細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)。細(xì)胞核是DAPI染色的(藍(lán)色)。

圖10：PIP肽250和640以不同動(dòng)力學(xué)增強(qiáng)了非糖尿病大鼠的腸腔攝取人胰島素。(A)在ILI注射PIP肽與30IU/kg的胰島素之后，從門(mén)靜脈采集的血液的血清樣本中胰島素的時(shí)間-濃度曲線。單因素方差分析(one-way ANOVA)顯示數(shù)據(jù)組彼此顯著不同(p<0.01)。Bonferroni后測(cè)試顯示，胰島素與肽250(p<0.01)和胰島素與肽640(p<0.05)與僅有胰島素顯著不同。(B)在ILI注射PIP肽與30IU/kg的胰島素之后，從尾靜脈采集的血清樣本中胰島素的時(shí)間-濃度曲線。當(dāng)使用單因素方差分析進(jìn)行比較時(shí)在組之間沒(méi)有顯著的差別。(C)在SC注射3IU/kg的人胰島素之后，從非糖尿病大鼠的尾部和門(mén)靜脈采集的血液的血清樣本中胰島素的時(shí)間-濃度曲線。對(duì)每個(gè)治療組來(lái)說(shuō)n＝3，數(shù)據(jù)為平均值±SD。

圖11：PIP肽250和640以不同動(dòng)力學(xué)增強(qiáng)了非糖尿病大鼠的腸腔攝取人胰島素。(A)在ILI注射PIP肽與30IU/kg的胰島素之后，從門(mén)靜脈采集的血液的血清樣本中胰島素的時(shí)間-濃度曲線。單因素方差分析(one-way ANOVA)顯示數(shù)據(jù)組彼此顯著不同(p<0.01)。Bonferroni后測(cè)試顯示，胰島素與肽250(p<0.01)和胰島素與肽640(p<0.05)與僅有胰島素顯著不同。(B)在ILI注射PIP肽與30IU/kg的胰島素之后，從尾靜脈采集的血清樣本中胰島素的時(shí)間-濃度曲線。當(dāng)使用單因素方差分析進(jìn)行比較時(shí)在組之間沒(méi)有顯著的差別。(C)在SC注射3IU/kg的人胰島素之后，從非糖尿病大鼠的尾部和門(mén)靜脈采集的血液的血清樣本中胰島素的時(shí)間-濃度曲線。對(duì)每個(gè)治療組來(lái)說(shuō)n＝3，數(shù)據(jù)為平均值±SD。

定義

多肽：一種單體為氨基酸殘基通過(guò)酰胺鍵連接在一起的聚合物。當(dāng)氨基酸為α-氨基酸時(shí)，能夠使用L-光學(xué)異構(gòu)體或者D-光學(xué)異構(gòu)體。本發(fā)明涉及L-型異構(gòu)體和D-型異構(gòu)體二者。特別地，但非排它地，當(dāng)肽包含與式1或2中所指定的序列相反的序列時(shí)，發(fā)明優(yōu)選地涉及D-型異構(gòu)體。這樣的肽是指為“逆-反”形式。本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”或“蛋白質(zhì)”包括任何氨基酸序列，并且包括修飾的序列如糖蛋白以及使用天然存在和非天然存在的氨基酸的序列。術(shù)語(yǔ)“多肽”涵蓋了天然存在的蛋白質(zhì)，以及重組或合成制備的蛋白質(zhì)，多肽的鹽、溶劑合物和衍生物。本發(fā)明的肽優(yōu)選在其C末端酰胺化。

發(fā)明的肽的鹽或溶劑合物優(yōu)選為其中補(bǔ)償離子(counterion)或相關(guān)溶劑是藥學(xué)上可接受的那些。然而，具有非藥學(xué)上可接受的補(bǔ)償離子或相關(guān)溶劑的鹽和溶劑合物也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，例如，用作中間體。

肽活性

與發(fā)明所有方面相關(guān)的肽優(yōu)選為在其增強(qiáng)細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)的能力方面具有活性。這可根據(jù)本文詳述的方法之一(特別是在實(shí)施例中)來(lái)測(cè)量。

鹽和溶劑合物

根據(jù)發(fā)明合適的鹽包括那些與有機(jī)的或無(wú)機(jī)的酸或堿形成的。藥學(xué)上可接受的酸加成鹽包括那些與鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、檸檬酸、酒石酸、乙酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、高氯酸、富馬酸、馬來(lái)酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、對(duì)甲苯磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸和羥基乙磺酸形成的。其他酸如草酸，雖然其本身不是藥學(xué)上可接受的，但在獲得發(fā)明的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽時(shí)可用作中間體。與堿形成的藥學(xué)上可接受的鹽包括銨鹽、堿金屬鹽(例如鉀鹽和鈉鹽)、堿土金屬鹽(例如鈣鹽和鎂鹽)、以及與有機(jī)堿形成的鹽(例如二環(huán)己基胺和N-甲基-D-葡糖胺(glucomine))。

有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解到，許多有機(jī)化合物能夠與它們?cè)谄渲邪l(fā)生反應(yīng)或它們從中沉淀或結(jié)晶的溶劑形成復(fù)合物。這樣的復(fù)合物被稱為“溶劑合物”。例如，與水的復(fù)合物被稱為“水合物”。本發(fā)明提供發(fā)明化合物的溶劑合物。

肽合成

發(fā)明的肽可通過(guò)任何對(duì)制備肽來(lái)說(shuō)合適的技術(shù)來(lái)制備，包括但不限于常規(guī)的方法學(xué)，例如，從單獨(dú)的氨基酸來(lái)合成，特別是用全自動(dòng)肽合成儀的逐步合成；天然肽的修飾；或者重組制造技術(shù)。

雖然可能將發(fā)明的肽單獨(dú)施用，但是優(yōu)選其存在于藥物組合物中。因此，發(fā)明提供一種藥物組合物，其包括發(fā)明的肽以及藥學(xué)上可接受的載體。發(fā)明的藥物組合物可采取如下所述的藥物配方的形式。

藥物配方

與發(fā)明有關(guān)的藥物配方包括那些適用于口服、腸外吸入(parenteral inhalation)(包括可通過(guò)各種類型的計(jì)量劑量、加壓氣溶膠、霧化器或吹入器的手段產(chǎn)生的細(xì)顆粒粉劑或霧劑)、直腸和局部(包括皮膚、透皮、粘膜、口腔、舌下或眼內(nèi))給藥，盡管最合適的途徑可能取決于例如受體的狀況和病癥。

配方可方便地以單位劑量的形式存在，并且可通過(guò)任何藥學(xué)領(lǐng)域熟知的方法制備。所有方法都包括使活性成分與構(gòu)成一種或多種助劑的藥物載體相結(jié)合的步驟。通常，配方通過(guò)使活性成分與液體載體或細(xì)碎的固體載體或兩者均勻且緊密地結(jié)合來(lái)制備，然后，如有必要，使產(chǎn)品成形為所需的配方。

適用于口服給藥的本發(fā)明配方可作為分別包含預(yù)定量的活性成分的離散單元如膠囊、扁囊劑或片劑而存在；作為粉末或顆粒而存在；作為含水液體或非含水液體中的溶液或懸浮液而存在；或者作為水包油液體乳劑或油包水液體乳劑而存在?；钚猿煞诌€可作為丸劑、沖劑或糊劑存在。各種藥學(xué)上可接受的載體及其配方在標(biāo)準(zhǔn)配方論文中有述，例如，E.W.Martin的Remington’s Pharmaceutical Sciences。還參見(jiàn)Wang,Y.J.和Hanson,M.A.的Journal of Parenteral Science and Technology,Technical Report No.10,Supp.42:2S,1988。

片劑可任選與一種或多種助劑通過(guò)壓制或者模制制得。壓制的片劑可通過(guò)在合適的機(jī)器中對(duì)自由流動(dòng)形式(如粉末或顆粒)的活性成分進(jìn)行壓制而制備，所述活性成分任選地與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、潤(rùn)滑劑、表面活性劑或分散劑混合。模制的片劑可通過(guò)在合適的機(jī)器中對(duì)用惰性液體稀釋劑潤(rùn)濕的粉末化合物的混合物進(jìn)行模制而制得。片劑可任選地被包衣或者帶有刻痕(scored)，并且可被配制，以便提供其中活性成分的緩慢或可控釋放。本化合物能夠以例如適用于立即釋放或者延長(zhǎng)釋放的形式施用。立即釋放或者延長(zhǎng)釋放能夠通過(guò)使用包含本化合物的合適的藥物組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于口服給藥，該化合物與遞送劑或載體進(jìn)行配制，所述遞送劑或載體促進(jìn)治療性大分子和高荷電的化合物穿過(guò)細(xì)胞膜(特別是在小腸中)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，這樣的遞送劑或載體可抑制肽在通過(guò)胃腸(GI)道期間的酶降解，和/或該配方可包含另外的防止此類降解的藥劑。本化合物還能夠以脂質(zhì)體進(jìn)行施用。

用于口服給藥的示例性組合物包括可包含例如用于增量(imparting bulk)的微晶纖維素、作為懸浮劑的褐藻酸或褐藻酸鈉、作為增粘劑的甲基纖維素和本領(lǐng)域已知的甜味劑或調(diào)味劑的懸浮液；和可包含例如微晶纖維素、磷酸二鈣、淀粉、硬脂酸鎂和/或乳糖和/或本領(lǐng)域已知的其他賦形劑、粘合劑、增量劑、崩解劑、稀釋劑和潤(rùn)滑劑的速釋片。發(fā)明的肽還能夠通過(guò)口腔以舌下含服或者口腔含化給藥進(jìn)行遞送。模制片劑、壓制片劑或凍干片劑是其能夠使用的示例性方式。示例性組合物包括將本化合物與快速溶解稀釋劑如甘露醇、乳糖、蔗糖和/或環(huán)糊精進(jìn)行配制的那些。這樣的配方中還包含高分子量賦形劑如纖維素(微晶粉末纖維素)或聚乙二醇(PEG)。這樣的配方還包含輔助粘膜粘附的的賦形劑，如羥丙基纖維素(HPC)、羥丙甲基纖維素(HPMC)、羧甲基纖維素鈉(SCMC)、馬來(lái)酸酐共聚物(例如Gantrez)，以及控制釋放的試劑如聚丙烯酸共聚物(例如Carbopol 934)。還加入潤(rùn)滑劑、助流劑、矯味劑、著色劑和穩(wěn)定劑以便于制造和使用。

可包含的賦形劑為，例如，如人血清白蛋白的蛋白質(zhì)或血漿制品。如果需要，藥物組合物還包含少量的無(wú)毒輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑或乳化劑、防腐劑、和pH緩沖劑等，例如乙酸鈉或失水山梨醇單月桂酸酯。

鼻腔噴霧或者吸入給藥的示例性組合物包括可包含例如芐醇或其他合適的防腐劑的鹽水溶液、增強(qiáng)生物利用度的吸收促進(jìn)劑、和/或其他比如本領(lǐng)域已知的增溶劑或分散劑。方便地在鼻腔噴霧或吸入給藥的組合物中，借助合適的推進(jìn)劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體)，發(fā)明的化合物從加壓包裝或者噴霧器中以氣溶膠噴霧的形式進(jìn)行遞送。在加壓氣溶膠的情況下，劑量單位能夠通過(guò)提供閥門(mén)以遞送經(jīng)計(jì)量的量來(lái)確定。用在吸入器或吹藥器中的例如明膠的膠囊和藥筒(cartridge)可配制為包含化合物和合適的粉末基質(zhì)(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。在一個(gè)具體的非限制性實(shí)例中，發(fā)明的化合物作為噴霧劑通過(guò)也被稱為驅(qū)動(dòng)器(actuator)的噴霧適配器從定量閥來(lái)進(jìn)行施用。任選地，還包含穩(wěn)定劑，和/或包含用于肺部深處遞送的多孔顆粒(例如，參見(jiàn)US專利號(hào)6,447,743)。

用于直腸給藥的配方可作為保留灌腸劑或者借助常用載體(如可可油、合成甘油酯或聚乙二醇)的栓劑存在。這樣的載體在常溫下通常為固體，但是在直腸腔內(nèi)液化和/或溶解以釋放藥物。

用于在口中(例如向頰或舌下)的局部給藥的配方包括在調(diào)味基質(zhì)(如蔗糖和阿拉伯樹(shù)膠或黃芪膠)中包含的活性成分的含片，以及在基質(zhì)(如明膠和甘油或者蔗糖和阿拉伯樹(shù)膠)中包含的活性成分的錠劑。用于局部給藥的示例性組合物包含局部載體，如Plastibase(以聚乙烯凝膠化的礦物油)。

優(yōu)選的單位劑量配方是包含活性成分的如上文詳述的有效劑量或者其合適分?jǐn)?shù)的那些。

應(yīng)當(dāng)理解的是，除了上面具體提到的成分之外，考慮到所討論的配方的類型，本發(fā)明的配方包含本領(lǐng)域常規(guī)的其他試劑，例如適用于口服給藥的包含調(diào)味劑的那些。

發(fā)明的肽還適合作為持續(xù)釋放體系來(lái)施用。發(fā)明的持續(xù)釋放體系的合適實(shí)例包括適當(dāng)?shù)木酆喜牧希绯尚椭破沸问?例如膜或微膠囊)的半透型聚合物基質(zhì)；適當(dāng)?shù)氖杷牧希缭诳山邮艿挠椭凶鳛槿橐?；或者離子交換樹(shù)脂；和發(fā)明化合物的微溶性衍生物，例如微溶性鹽。持續(xù)釋放體系通常經(jīng)口服；直腸；腸胃外；腦池內(nèi)(intracistemally)；陰道內(nèi)；腹腔內(nèi)；例如作為粉末、軟膏、凝膠、滴劑或透皮貼劑的局部；向頰；或者作為口腔或鼻腔噴霧進(jìn)行施用。

用于給藥的制劑可適當(dāng)?shù)嘏渲瞥山o發(fā)明的化合物帶來(lái)控制釋放。例如，藥物組合物為包含一種或多種生物降解聚合物、凝膠狀多糖和/或生物粘附性聚合物、兩親性聚合物、能夠改變發(fā)明的肽顆粒的界面性能的試劑的顆粒形式。這些組合物顯示出特定的生物相容性能，其允許活性物質(zhì)的控制釋放。參見(jiàn)US專利號(hào)5,700,486。

發(fā)明的肽或藥物組合物的治療有效量能夠以單脈沖劑量、推注劑量或者隨時(shí)間推移施用的脈沖劑量進(jìn)行施用。因此，在脈沖劑量中，提供發(fā)明的肽或組合物的推注給藥，隨著時(shí)間流逝接著進(jìn)行第二次推注給藥。在具體的非限制性實(shí)例中，發(fā)明化合物的脈沖劑量在一天的過(guò)程中，在一周的過(guò)程中或在一個(gè)月的過(guò)程中施用。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明是基于通過(guò)利用內(nèi)源性調(diào)控機(jī)制經(jīng)過(guò)控制緊密連接的動(dòng)態(tài)開(kāi)啟和關(guān)閉來(lái)打開(kāi)上皮中相鄰細(xì)胞之間的細(xì)胞旁路的開(kāi)發(fā)策略。該策略涉及提供靶向特異性細(xì)胞靶標(biāo)并在對(duì)這些靶標(biāo)具有特異性作用的全新(de novo)設(shè)計(jì)的肽化合物。

近來(lái)的研究已經(jīng)表明，發(fā)生在一般粘膜表面(如腸道和氣道的那些)上的慢性炎癥事件與這些部位的上皮屏障透過(guò)性增加相關(guān)(4，13)。這種增加的透過(guò)性的基礎(chǔ)確定為緊密連接(TJ)相關(guān)的胞漿蛋白(被稱為肌球蛋白輕鏈(MLC))的磷酸化狀態(tài)的增加。這種機(jī)制通過(guò)選擇性抑制MLC磷酸化的九個(gè)氨基酸的透膜肽的識(shí)別和體內(nèi)測(cè)試而被證實(shí)。MLC磷酸化的腸細(xì)胞調(diào)節(jié)的內(nèi)源性機(jī)制的知識(shí)被用來(lái)設(shè)計(jì)兩類肽，以選擇性改變肌球蛋白磷酸酶靶亞基1(MYPT1)或17KDa L-激酶增效蛋白磷酸酶-1抑制劑(CPI-17)蛋白的功能。這兩種蛋白起到減少M(fèi)LC磷酸化的作用，并且本發(fā)明涉及其功能的瞬時(shí)抑制，以瞬時(shí)提高上皮的細(xì)胞旁透過(guò)性。兩種靶蛋白以不同的速率、并通過(guò)提供選擇性地靶向這兩種不同的蛋白的試劑和方法來(lái)調(diào)控MLC磷酸化，最終，能夠控制緊密連接的開(kāi)啟和再關(guān)閉的時(shí)間過(guò)程。

根據(jù)發(fā)明的第一方面，提供一種肽，其包含根據(jù)式1的序列：

X₄-X₅-X₆-X₇-X₈

式1(SEQ ID NO:1)

其中：

X₄為帶負(fù)電的氨基酸殘基，例如pTyr、Asp或Glu；

X₅為小的疏水性氨基酸殘基，例如Val或Ala；

X₆為帶正電的氨基酸殘基，例如Lys或Arg；

X₇為親水性氨基酸殘基，例如Tyr、Phe、Thr或Ser；并且

X₈為帶負(fù)電的氨基酸殘基，例如pTyr、Asp或Glu。

或者所述肽包含根據(jù)式2的序列的肽：

X₅-X₆-X₇-X₈

式2(SEQ ID NO:2)

其中：

X₅為任意氨基酸殘基；

X₆為T(mén)yr；

X₇為Gln；并且

X₈為T(mén)yr；

或者所述肽包含根據(jù)式1或式2的序列的逆-反形式，其中所有氨基酸殘基均為D-構(gòu)型并且肽序列順序反轉(zhuǎn)。

式1限定了靶向PP1-CP1-17相互作用的序列。式2限定了靶向PP1-MYPT1相互作用的序列。兩種序列的一致特征在于它們都用于降低MLC磷酸化，因此它們的抑制導(dǎo)致MLC磷酸化和上皮的緊密連接打開(kāi)的增加。

根據(jù)發(fā)明所有方面的一些實(shí)施方式，減少M(fèi)LC磷酸化的功能性特征可為要求保護(hù)的發(fā)明的一個(gè)特征。

式1的序列

根據(jù)式1的肽抑制PP1-CP1-17相互作用。根據(jù)發(fā)明各個(gè)方面的一些實(shí)施方式，根據(jù)由式1所包含的序列，其中：

X₄為pTyr、Asp或Glu；

X₅為Val或Ala；

X₆為L(zhǎng)ys或Arg；

X₇為T(mén)yr、Phe、Thr或Ser；并且

X₈為pTyr、Asp或Glu。

根據(jù)一些實(shí)施方式：

X₄為Asp或Glu；

X₅為Val或Ala；

X₆為L(zhǎng)ys或Arg；

X₇為T(mén)yr、Phe、Thr；并且

X₈為Asp或Glu。

根據(jù)一些實(shí)施方式：

X₄為Asp或Glu；

X₅為Val；

X₆為L(zhǎng)ys；

X₇為T(mén)yr；并且

X₈為Asp或Glu。

根據(jù)一些實(shí)施方式：

X₄為Glu；

X₅為Val；

X₆為L(zhǎng)ys；

X₇為T(mén)yr；并且

X₈為Asp。

根據(jù)式1的各個(gè)實(shí)施方式的序列，限定了PP1-CP1-17靶向基序。為了在發(fā)明的一些實(shí)施方式中有效地起作用，包含根據(jù)式1的序列的肽還包含確保將其遞送進(jìn)入上皮細(xì)胞的細(xì)胞液(其中具有其靶標(biāo))中的序列。這樣的序列為細(xì)胞透過(guò)-促進(jìn)序列，或者在吞噬進(jìn)入細(xì)胞之后促進(jìn)該細(xì)胞表面與上皮細(xì)胞結(jié)合的序列。根據(jù)某個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，根據(jù)式1的序列為：

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀(SEQ ID NO:5)，或

X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀(SEQ ID NO:6)，或

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈(SEQ ID NO:7)，

最優(yōu)選X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀(SEQ ID NO:5)(式1a)

其中：

X₁為至多10個(gè)帶正電的氨基酸殘基；

X₂為帶正電的氨基酸殘基；

X₃不存在，或者為疏水性氨基酸殘基；

X₄為帶負(fù)電的氨基酸殘基；

X₅為小的疏水性氨基酸殘基；

X₆為帶正電的氨基酸殘基；

X₇為疏水性氨基酸殘基；

X₈為帶負(fù)電的氨基酸殘基；

X₉為帶正電的氨基酸殘基；并且

X₁₀為至多10個(gè)帶正電的氨基酸殘基；或者其中所有氨基酸殘基均為D-構(gòu)型并且肽序列順序反轉(zhuǎn)。

作為涉及本發(fā)明的所有方面，根據(jù)上方給出的可供選擇的結(jié)構(gòu)式的某些實(shí)施方式：

X₁為至多10個(gè)帶正電的氨基酸殘基；

X₂為帶正電的氨基酸殘基；

X₃為Val、Ala、Leu或Ile；

X₄為pTyr、Asp或Glu；

X₅為Val或Arg；

X₆為L(zhǎng)ys或Arg；

X₇為T(mén)yr、Phe、Thr或Ser；

X₈為pTyr、Asp或Glu；

X₉為帶正電的氨基酸殘基；并且

X₁₀為至多10個(gè)帶正電的氨基酸殘基；或者所有氨基酸殘基均為D-構(gòu)型并且肽序列順序反轉(zhuǎn)。

根據(jù)一些實(shí)施方式：

X₁為至多10個(gè)Lys或Arg殘基；

X₂為L(zhǎng)ys或Arg；

X₃為Ala或Val；

X₄為pTyr、Asp或Glu；

X₅為Val或Arg；

X₆為L(zhǎng)ys或Arg；

X₇為T(mén)yr、Phe、Thr或Ser；

X₈為pTyr、Asp或Glu；

X₉為L(zhǎng)ys或Arg；并且

X₁₀為至多10個(gè)Lys或Arg殘基。

根據(jù)一些實(shí)施方式：

X₁為L(zhǎng)ys或Arg；

X₂為L(zhǎng)ys或Arg；

X₃為Ala或Val；

X₄為Asp或Glu；

X₅為Val；

X₆為L(zhǎng)ys；

X₇為T(mén)yr；

X₈為Asp或Glu；

X₉為L(zhǎng)ys或Arg；并且

X₁₀為L(zhǎng)ys或Arg。

根據(jù)一些實(shí)施方式：

X₁為L(zhǎng)ys或Arg；

X₂為L(zhǎng)ys或Arg；

X₃為Val；

X₄為Glu；

X₅為Val；

X₆為L(zhǎng)ys；

X₇為T(mén)yr；

X₈為Asp；

X₉為L(zhǎng)ys或Arg；并且

X₁₀為L(zhǎng)ys或Arg。

根據(jù)一些實(shí)施方式：

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀為

Arg₁-Arg₂-Val₃-Glu₄-Val₅-Lys₆-Tyr₇-Asp₈-Arg₉-Arg₁₀(SEQ ID NO:3)

在某些實(shí)施方式中，發(fā)明還包含以上給出的序列的逆-反形式。

式2的序列

根據(jù)式2的肽抑制PP1-MYPT1相互作用。根據(jù)發(fā)明各個(gè)方面的一些實(shí)施方式，根據(jù)由式2所包含的序列，其中：

X₅為帶正電的氨基酸殘基；

X₆為T(mén)yr；

X₇為Gln；并且

X₈為T(mén)yr。

根據(jù)一些實(shí)施方式：

X₅為L(zhǎng)ys或Arg；

X₆為T(mén)yr；

X₇為Gln；并且

X₈為T(mén)yr。

根據(jù)一些實(shí)施方式：

X₅為L(zhǎng)ys；

X₆為T(mén)yr；

X₇為Gln；并且

X₈為T(mén)yr。

在某些實(shí)施方式中，發(fā)明還包含以上給出的序列的逆-反形式。

根據(jù)式2的各個(gè)實(shí)施方式的序列限定了PP1-MYPT1靶向基序。為了在發(fā)明的一些實(shí)施方式中有效地起作用，包含根據(jù)式2的序列的肽還包含確保將其遞送進(jìn)入上皮細(xì)胞的細(xì)胞液(其中具有其靶標(biāo))中的序列。這樣的序列為細(xì)胞-透過(guò)-促進(jìn)序列，或者在吞噬進(jìn)入細(xì)胞之后促進(jìn)該細(xì)胞表面與上皮細(xì)胞結(jié)合的序列。

根據(jù)某些優(yōu)選的實(shí)施方式，根據(jù)式2的序列為：

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂(SEQ ID NO:9)，或

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉(SEQ ID NO:10)，或

X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂(SEQ ID NO:11)，

優(yōu)選X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂(SEQ ID NO:9)

式2a

其中：

X₁為至多10個(gè)帶正電的氨基酸殘基；

X₂為帶正電的氨基酸殘基；

X₃為Ala或Val；

X₄不存在，或者為Ala，或者為1、2、3或4個(gè)帶正電的氨基酸殘基；

X₅為帶正電的氨基酸殘基；

X₆為T(mén)yr；

X₇為Gln；

X₈為T(mén)yr；

X₉不存在，或者為Ala，或者為1、2、3或4個(gè)帶正電的氨基酸殘基；

X₁₀為帶正電的氨基酸殘基；

X₁₁為帶正電的氨基酸殘基；并且

X₁₂為至多10個(gè)帶正電的氨基酸殘基；或者其中所有氨基酸殘基均為D-構(gòu)型并且肽序列順序反轉(zhuǎn)。

涉及本發(fā)明的所有方面，根據(jù)上方給出的式2a的可供選擇的結(jié)構(gòu)式的某些實(shí)施方式：

X₁為至多10個(gè)Lys和/或Arg殘基的任意組合；

X₂為L(zhǎng)ys或Arg；

X₃為Ala或Val；

X₄不存在，或者為Ala、Lys或Arg；

X₅為L(zhǎng)ys或Arg；

X₆為T(mén)yr；

X₇為Gln；

X₈為T(mén)yr；

X₉為Ala或Lys或Arg；

X₁₀為L(zhǎng)ys或Arg；

X₁₁為L(zhǎng)ys或Arg；并且

X₁₂為至多10個(gè)Lys和/或Arg殘基的任意組合；或者其中所有氨基酸殘基均為D-構(gòu)型并且肽序列順序反轉(zhuǎn)。

根據(jù)一些實(shí)施方式：

X₁為L(zhǎng)ys或Arg；

X₂為L(zhǎng)ys或Arg；

X₃為Ala；

X₄不存在；

X₅為L(zhǎng)ys；

X₆為T(mén)yr；

X₇為Gln；

X₈為T(mén)yr；

X₉不存在；

X₁₀為L(zhǎng)ys或Arg；

X₁₁為L(zhǎng)ys或Arg；并且

X₁₂為L(zhǎng)ys或Arg。

根據(jù)一些實(shí)施方式：

X₁為Arg；

X₂為L(zhǎng)ys；

X₃為Ala；

X₄不存在；

X₅為L(zhǎng)ys；

X₆為T(mén)yr；

X₇為Gln；

X₈為T(mén)yr；

X₉不存在；

X₁₀為Arg；

X₁₁為Arg；并且

X₁₂為L(zhǎng)ys；

也就是說(shuō)，序列為Arg₁-Lys₂-Ala₃-Lys₅-Tyr₆-Gln₇-Tyr₈-Arg₁₀-Arg₁₁-Lys₁₂(SEQ ID NO:4).

在某些實(shí)施方式中，發(fā)明還包含以上給出的序列的逆-反形式。

逆-反(retro-inverso)序列

式1和式2的序列衍生自天然存在的序列。衍生出它們的天然存在的序列具有L-構(gòu)型的氨基酸殘基。因此，在這樣的情況下，根據(jù)一些實(shí)施方式，氨基酸是L-構(gòu)型的。

包含D-型氨基酸的肽作為藥物更具吸引力，因?yàn)樗鼈儍A向于更少受到胃內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)部由于蛋白水解而降解的影響。因此，它們傾向于更加適用于口服，并且傾向于在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)更有效。

本發(fā)明在其各個(gè)方面包括其中所有氨基酸均為D-構(gòu)型并且式1和2(以及落入式1或2和如上詳述的范圍內(nèi)的更窄限定的序列)的肽序列順序反轉(zhuǎn)的肽。

例如，發(fā)明涉及具有殘基優(yōu)選為L(zhǎng)-構(gòu)型的序列RRVEVKYDRR-NH₂(SEQ ID NO:3)的肽，和具有殘基為D-構(gòu)型的逆-反的序列NH₂-rrdykvevrr(SEQ ID NO:20)的肽。小寫(xiě)的單字母氨基酸碼是逆-反構(gòu)型的簡(jiǎn)寫(xiě)。根據(jù)某些實(shí)施方式，逆-反構(gòu)型是優(yōu)選的。

藥物組合物

根據(jù)發(fā)明的第二方面，提供有包含任意根據(jù)發(fā)明第一方面的各個(gè)實(shí)施方式的肽和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。

根據(jù)某些實(shí)施方式，藥物組合物包含促進(jìn)肽透過(guò)進(jìn)入靶上皮細(xì)胞的細(xì)胞液的試劑，例如脂質(zhì)體形成劑。如果肽本身缺乏細(xì)胞透過(guò)序列，例如如果其缺乏式1a或2a的細(xì)胞透過(guò)肽序列，這樣的試劑的存在是特別受青睞的。然而，根據(jù)一些實(shí)施方式，無(wú)論在根據(jù)發(fā)明第一方面的肽中這樣的序列存在或者不存在，都存在輔助細(xì)胞透過(guò)的試劑。根據(jù)某些實(shí)施方式，根據(jù)發(fā)明的藥物組合物包含根據(jù)式1的肽或者其逆-反類似物，與根據(jù)式2的肽或者其逆-反類似物的結(jié)合。

腸溶衣

藥物組合物包括具有腸溶衣的劑型。腸溶衣為應(yīng)用至口服藥物組合物(如片劑、囊片和膠囊)以便控制吸收使得吸收在小腸發(fā)生的包衣。腸溶衣通常應(yīng)用到劑型表面上，由此其在胃的高酸性pH中存在穩(wěn)定的表面，但是在小腸相對(duì)更堿性的環(huán)境中迅速崩解。用于腸溶衣的材料包括脂肪酸、石蠟、塑料和植物纖維。

當(dāng)本發(fā)明用于上下文中將口服劑量的第二治療劑遞送穿過(guò)小腸上皮時(shí)，如果不然治療劑會(huì)在胃環(huán)境中降解，則可使用腸溶衣。如果第二治療劑對(duì)胃有刺激、如果其是酸不穩(wěn)定的(例如某些唑類藥物如艾美拉唑是酸不穩(wěn)定的)、或者如果第二治療劑為預(yù)計(jì)會(huì)被胃中存在的酶降解的蛋白質(zhì)或肽(例如胰島素、GLD-1或其衍生物或類似物)，這樣的包衣可能特別有用。

因此，根據(jù)發(fā)明第二方面的藥物組合物包括具有腸溶衣的固體劑型，并且發(fā)明的其他方面還利用或涉及這樣的包衣。

第二治療劑

根據(jù)涉及發(fā)明的肽和第二治療劑的發(fā)明的各個(gè)方面，例如，根據(jù)發(fā)明第二方面的藥物組合物，兩種組分優(yōu)選例如在藥物組合物中共混，由此它們?cè)谙嗤瑫r(shí)間存在于上皮表面處。發(fā)明的肽可用于遞送廣泛的治療劑。特別地，它們可與小分子治療劑的遞送相關(guān)，并且還與肽或蛋白質(zhì)或核酸的治療劑的遞送相關(guān)。例如，治療劑為胰島素、甲狀旁腺激素、降鈣素、促紅細(xì)胞生成素、GM-SF或生長(zhǎng)激素、或者siRNA或基因治療劑。發(fā)明還涉及抗體或抗體衍生物的治療劑的遞送。應(yīng)當(dāng)發(fā)現(xiàn)，全抗體分子太大以至于無(wú)法根據(jù)發(fā)明被有效遞送，基于抗體技術(shù)的更小變體，例如scFv分子、駱駝抗體(camel antibody)、單變化抗體片段和結(jié)構(gòu)域等可能特別有用。在通過(guò)發(fā)明的肽打開(kāi)緊密連接之后，所有這些治療劑能夠單獨(dú)地或者與其他治療劑聯(lián)合施用。例如，胰島素和GLP-1能夠以與發(fā)明的肽相同的劑型被遞送。

藥學(xué)上載體

藥學(xué)上載體(或“藥物載體”)為藥物組合物中存在的改善藥物的遞送、配方、劑量或療效或輔助其保存、混合、制備或加工的物質(zhì)。

上皮

發(fā)明在各個(gè)方面涉及上皮(“上皮表面”)。這可能是體外或體內(nèi)的表面。非限制性的實(shí)例包括存在于體內(nèi)和體外二者中的大腸上皮、小腸上皮、直腸上皮、肛門(mén)上皮、宮頸上皮、陰道上皮、呼吸道(例如氣管、細(xì)支氣管或喉部)上皮、鼻上皮、口部上皮和眼角膜上皮。

特別考慮到了上皮細(xì)胞(例如以上所述的上皮細(xì)胞類型)的永生化細(xì)胞系。

藥物

根據(jù)發(fā)明的第三方面，提供有根據(jù)發(fā)明第一方面的肽或者根據(jù)發(fā)明第二方面的藥物組合物，其用作藥物。發(fā)明的第三和第四方面都是指“藥物”。參考發(fā)明的其他方面，所述藥物包含本文所述的發(fā)明的肽或者發(fā)明的肽和第二治療劑。該第二治療劑為肽、小分子實(shí)體、核酸或其他化學(xué)組成(chemical compound)。藥物如本文所述參考發(fā)明的其他方面被配制，用于治療本文其他部分所述的受試者的本文其他部分所述的疾病病癥或非醫(yī)學(xué)情況。

用于治療的受試者

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，在所有方面均涉及受試者的治療。這樣的受試者為具有緊密連接的上皮的任何物種。根據(jù)某些優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明在所有方面均涉及哺乳動(dòng)物受試者的治療。最優(yōu)選地，本發(fā)明在所有方面均涉及任一性別在任何年齡(例如從出生至1歲、出生至5歲、出生至12歲、出生至60歲、出生至80歲、2至60歲、5至80歲、12至80歲、或者16歲或18歲以上)的人受試者的治療。

根據(jù)某些實(shí)施方式，本發(fā)明在所有方面均涉及需要將治療劑穿過(guò)粘膜進(jìn)行遞送的人受試者的治療。治療劑為本文其他部分所述藥劑的一種。根據(jù)發(fā)明所有方面的某些實(shí)施方式，人受試者為在已經(jīng)向其施用上述治療劑的同時(shí)或在15、10、5、2或1分鐘的時(shí)間窗口內(nèi)任一方面施用發(fā)明的肽或藥物組合物的受試者。

治療的疾病

根據(jù)第一方面的肽，根據(jù)第二方面的藥物組合物，或者根據(jù)第三方面的藥物用于治療疾病或者病癥或者其他病情。根據(jù)某些實(shí)施方式，疾病或肺病，根據(jù)本發(fā)明的吸收較差的藥物的遞送可能具有與通過(guò)注射給藥類似的效果。重要的是，將治療劑遞送至分散的上皮部位的能力還將引起粘膜下空間的局部遞送。出于這些原因，發(fā)明特別適用于治療全身性病情和疾病(例如，關(guān)節(jié)炎、身材矮小等)以及將得益于治療劑的局部靶向的病情和疾病(例如，克羅恩病、哮喘等)。

非治療性治療

根據(jù)某些實(shí)施方式，發(fā)明的各個(gè)方面涉及病情(如化妝品皮膚病)的非治療性治療，或者治療并非醫(yī)學(xué)性肥胖但為了美容目的想要減輕體重(或者保持健康體重)的人。

藥物治療方法

考慮到構(gòu)成可授權(quán)主題的藥物治療方法的權(quán)限，本發(fā)明提供治療受試者的疾病的方法，其包括向所述受試者施用根據(jù)發(fā)明第二方面的藥物組合物，其中第二治療劑用于治療疾病，并且其中藥物組合物中存在的根據(jù)發(fā)明第一方面的肽改善了第二治療劑穿過(guò)受試者上皮的遞送。根據(jù)發(fā)明這一方面的某些優(yōu)選實(shí)施方式，參考發(fā)明的其他方面，受試者、給藥速率、藥物組合物的特點(diǎn)、發(fā)明的肽、第二治療劑、或者要治療的疾病為如本文所述。

打開(kāi)緊密連接的方法

根據(jù)發(fā)明的第四方面，提供有打開(kāi)上皮表面的緊密連接的方法，其包括將有效量的根據(jù)發(fā)明第一方面的肽，或者根據(jù)發(fā)明第二方面的藥物組合物施用于上皮。

該方法為體內(nèi)或體外方法。體內(nèi)方法包括針對(duì)受試者的藥物治療方法，例如，通過(guò)借助打開(kāi)所述受試者上皮的細(xì)胞旁給藥速率而促進(jìn)第二治療劑向受試者的血液循環(huán)遞送，并且通過(guò)參考發(fā)明的其他方面，要治療的疾病為如本文所述。

或者，發(fā)明這一方面的方法涉及在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人類志愿者或患者中遞送藥劑穿過(guò)上皮的體內(nèi)試驗(yàn)。例如，為了測(cè)量第二治療劑在治療疾病中的療效，或者為了輔助隨后的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)參數(shù)的測(cè)量，通過(guò)參考發(fā)明其他方面所限定的第二治療劑可穿過(guò)上皮進(jìn)行遞送。就此而言，發(fā)明這一方面的方法涉及穿過(guò)所述上皮的標(biāo)志物分子(例如放射性標(biāo)記的標(biāo)志物或其他顯像劑或造影劑)的測(cè)量。

或者，為了研究上皮或者穿過(guò)所述上皮的分子的通道的性質(zhì)，發(fā)明的這一方面涉及在細(xì)胞培養(yǎng)物(例如人類或動(dòng)物上皮的單層培養(yǎng)的細(xì)胞)中的上皮的緊密連接的體內(nèi)開(kāi)啟。

遞送方法

根據(jù)發(fā)明的第六方面，提供有遞送藥劑穿過(guò)上皮表面的方法，其包括將所述藥劑與根據(jù)發(fā)明第一方面的肽聯(lián)合施用，或者作為根據(jù)發(fā)明第二方面的藥物組合物的一部分進(jìn)行施用。

在發(fā)明這一方面的各個(gè)實(shí)施方式中，上皮表面、肽和藥物組合物為如參考發(fā)明其他各個(gè)方面所述。該方法可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。藥劑為診斷劑、造影劑或者如本文所述在“第二治療劑”標(biāo)題下的根據(jù)某些優(yōu)選實(shí)施方式的治療劑。

本發(fā)明的各個(gè)方面在下文參考以下的非限制性實(shí)例和附圖進(jìn)行描述。

實(shí)施例

材料和方法

肽合成

使用從Nova Biochem獲得的氨基酸(除異亮氨酸從Sigma Aldrich獲得之外)通過(guò)(Fmoc)-SPSS(ActivoSyn肽合成器)合成肽。用N,N’-二異丙基碳二亞胺將第一個(gè)氨基酸偶聯(lián)到Rink Amide MBHA樹(shù)脂(100-200目；Nova Biochem)。隨后使用PyBop在Activo P-11肽合成器上進(jìn)行偶聯(lián)。在二甲基甲酰胺中用20％的哌啶進(jìn)行脫保護(hù)。用三氟乙酸(TFA)、三異丙基硅烷和水(95:2.5:2.5)的混合物將肽從樹(shù)脂中分開(kāi)，然后在二乙醚中沉淀。使用Phenomenex Gemini C18柱(250x10mm，孔徑5μm)以及具有0.1％TFA的水和具有0.1％TFA的乙腈的梯度流動(dòng)相、用2.5ml/min的流速，通過(guò)HPLC對(duì)粗產(chǎn)物進(jìn)行純化。在Bruker Daltonics的micrOTOF質(zhì)譜儀上用噴霧電離質(zhì)譜(ESI)獲得高分辨率飛行時(shí)間質(zhì)譜，以驗(yàn)證肽的同一性。通過(guò)凍干將純化的肽干燥并儲(chǔ)存在-80℃。

細(xì)胞培養(yǎng)物

將永生化的人腸上皮細(xì)胞系(Caco-2)保持在補(bǔ)充有10％的FBS、2mM的L-谷氨酰胺(Gibco)、100U/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素(Gibco)的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，Paisley，UK)中。將Caco-2細(xì)胞以7x104/孔的密度接種在Transwell^TM(Corning，NY)聚酯膜濾器上(直徑12mm，孔徑0.4μm)。每?jī)商煊肈MEM(Life Technologies，Paisley，UK)換液。具有>350Ω·cm2的跨上皮電阻(TEER)的Caco-2單層被認(rèn)為是鋪滿的，并被用在轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)中；固定式電極用于測(cè)量TEER(World Precision Instruments，UK)。

體外轉(zhuǎn)運(yùn)研究

進(jìn)行50mg/ml 4kDa的葡聚糖或50mg/ml 70kDa的葡聚糖(Sigma)的頂部至基底的通量以評(píng)估PIP肽對(duì)細(xì)胞旁透過(guò)性的影響。頂部隔室(compartment)體積為200μl；以設(shè)定的次數(shù)收集到600μl的基底隔室體積并用新鮮的HBSS替換。用Floustar Omega酶標(biāo)儀(BMG Labtech，Ortenburg，德國(guó))測(cè)定頂部和基底的隔室的熒光。在HBSS替換之后立即對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行TEER測(cè)量。3小時(shí)后，除去頂部隔室的葡聚糖和肽溶液，并用PBS替換，進(jìn)一步記錄30分鐘的TEER值以評(píng)估單層的恢復(fù)。

磷酸化MLC分析

在用冰冷的PBS沖洗之后，將Caco-2單層或者來(lái)自分離的腸組織的上皮細(xì)胞在3μL的蛋白酶抑制劑混合物和200μL RIPA緩沖液中裂解，并在冰上放置10分鐘。將分離的腸組織類似地置于冰冷的PBS中15分鐘，然后在蛋白酶抑制劑混合物和RIPA緩沖液中浸漬，在冰上放置10分鐘。將所有細(xì)胞和組織裂解物在8000rpm下離心15分鐘以收集上清液，將其貯存在-80℃直到使用。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡分析，通過(guò)在220V下運(yùn)行40分鐘的SDS-PAGE(12％)對(duì)裂解物進(jìn)行分離，并且用XCellTM Blot模塊(Invitrogen)在30V下電轉(zhuǎn)移至PDVF膜上70分鐘。在TBS-T(2M Tris HCl，pH 7.5；4M NaCl和0.1％的吐溫20)中用5％的牛血清白蛋白將膜封閉1小時(shí)。將膜用水清洗，與第一抗體(抗肌球蛋白輕鏈(磷酸化S20)抗體或者抗肌球蛋白輕鏈2抗體)在5℃溫育過(guò)夜，用TBS-T清洗三次，然后與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的第二抗體在室溫下溫育1小時(shí)。在TBS-T中清洗三次之后，通過(guò)ECL(Santa Cruz)檢測(cè)HRP的活性。

細(xì)胞活力測(cè)定

MTT試驗(yàn)：用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴(MTT；Invitrogen，Paisley，UK)試驗(yàn)來(lái)評(píng)估細(xì)胞活力。在將細(xì)胞暴露于CPP復(fù)合物72小時(shí)之后，將0.5mg/ml的MTT加入培養(yǎng)基并與細(xì)胞進(jìn)一步孵育3小時(shí)。然后將培養(yǎng)基除去并用DMSO替換以使細(xì)胞裂解。然后記錄在550nm處的吸光度。

顯微鏡檢查

在加入CPP之前，將細(xì)胞在玻璃蓋玻片上培養(yǎng)，與羅丹明(Rhodamine)標(biāo)記的BSA復(fù)合。將細(xì)胞與復(fù)合物孵育2小時(shí)，之后接著用完全培養(yǎng)基洗滌數(shù)次以除去過(guò)量的復(fù)合物，然后以4％的多聚甲醛固定。通過(guò)共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM 510)測(cè)定標(biāo)記的BSA引入細(xì)胞中。BSA進(jìn)入的水平通過(guò)測(cè)定相對(duì)于視野中細(xì)胞數(shù)目的羅丹明標(biāo)記的平均熒光強(qiáng)度來(lái)估算。

體內(nèi)研究

當(dāng)進(jìn)行研究時(shí)，內(nèi)部培育的雄性Wistar大鼠為225-275g(大約6-8周大小)。將大鼠以每籠3-5只一組、12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗一周期的方式進(jìn)行安置。所有實(shí)驗(yàn)均在光照階段進(jìn)行，并且使用連續(xù)異氟醚麻醉的無(wú)法恢復(fù)的實(shí)驗(yàn)方案來(lái)實(shí)施。進(jìn)行4-5cm的腹部正中切口以暴露空腸中段至小腸的早期回腸區(qū)域，并為套管的插入提供門(mén)靜脈入口。在包含10mM檸檬酸的0.9％的鹽水中制備胰島素(人類重組；Sigma)和PIP肽的溶液以減少局部蛋白水解，并以1:1進(jìn)行混合，然后用29號(hào)注射針以200μL/kg的體積(或者每250g大鼠約50μL)進(jìn)行注射。用永久性記號(hào)筆對(duì)注射部位進(jìn)行標(biāo)記。用外科膠布封住切口。在接下來(lái)的兩個(gè)小時(shí)從門(mén)靜脈以及體循環(huán)抽血以監(jiān)測(cè)血糖、血清胰島素和內(nèi)毒素。對(duì)所有組使用的對(duì)照治療組包括：將胰島素遞送進(jìn)入腸腔的SC注射，以及不具有胰島素或者胰島素單獨(dú)在磷酸鹽緩沖液(PBS)配方中的PIP肽的腸道注射。在研究結(jié)束時(shí)，將大約3-5mm的標(biāo)記的腸片段區(qū)域分離。在經(jīng)執(zhí)業(yè)的獸醫(yī)病理學(xué)家分析解讀之前，將組織裂解用于MLC磷酸化狀態(tài)的生物化學(xué)評(píng)估或固定、切片，并用蘇木精/伊紅進(jìn)行染色。在肩胛骨中間區(qū)域進(jìn)行皮下(SC)胰島素注射(20μl/kg)，并以相同的方式測(cè)量血糖。所有實(shí)驗(yàn)根據(jù)1986年的英國(guó)動(dòng)物(科學(xué)程序(Scientific Procedures))法、1986年的歐共體理事會(huì)指令(European Communities Council Directive)(86/609/EEC)和巴比倫(Bath)大學(xué)的倫理審查程序而進(jìn)行。

體內(nèi)毒性試驗(yàn)

由于細(xì)胞透過(guò)性肽的作用有可能誘發(fā)細(xì)胞損傷和毒性(Carter,2013#109；Kilk，2009#110)，通過(guò)使用APT165商品化試劑盒根據(jù)每個(gè)制造商的說(shuō)明書(shū)(Millipore，Watford，UK)檢測(cè)半胱天冬酶-3的酶活性來(lái)評(píng)估作為早期細(xì)胞中毒測(cè)量的細(xì)胞凋亡的誘發(fā)。在暴露于通過(guò)直接腸腔內(nèi)注射而施用的檢測(cè)藥劑45分鐘之后，將腸組織分離。將潮霉素(150μg/mL)作為正對(duì)照施用以通過(guò)半胱天冬酶-3活化來(lái)促使細(xì)胞凋亡。

磷酸化MLC分析

在用冰冷的PBS沖洗以除去PIP肽或?qū)φ罩委焺┲螅瑢⒎蛛x的腸組織在冰冷的PBS中放置15分鐘，然后加入25μl蛋白酶抑制劑混合物(Fisher)、25μl磷酸酶抑制劑混合物(Fisher)和500μl RIPA緩沖液(Sigma Aldrich)。在冰上10分鐘之后，將裂解物在8000rpm下離心15分鐘以收集上清液，將其貯存在-80℃直到使用。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡分析，通過(guò)在220V下運(yùn)行40分鐘的SDS-PAGE(12％)對(duì)裂解物進(jìn)行分離，并且用XCell^TM Blot模塊(Invitrogen)在30V下電轉(zhuǎn)移至PDVF膜上70分鐘。在TBS-T(2M Tris HCl，pH 7.5；4M NaCl和0.1％的吐溫20)中用5％的牛血清白蛋白將膜封閉1小時(shí)。將膜用水清洗，與第一抗體(抗肌球蛋白輕鏈(磷酸化S19)抗體(Cell Signalling Technologies)或者抗肌球蛋白輕鏈2抗體(Abcam))在5℃溫育過(guò)夜，用TBS-T清洗三次，然后與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的第二抗體在室溫下溫育1小時(shí)。在TBS-T中清洗三次之后，通過(guò)ECL(Santa Cruz)檢測(cè)HRP的活性。

細(xì)胞活力測(cè)定

通過(guò)使用APT165商品化試劑盒根據(jù)每個(gè)制造商的說(shuō)明書(shū)(Millipore，Watford，UK)檢測(cè)半胱天冬酶-3的酶活性來(lái)評(píng)估作為早期細(xì)胞中毒測(cè)量的細(xì)胞凋亡的誘發(fā)。在暴露于通過(guò)直接腸腔內(nèi)注射而施用的檢測(cè)藥劑45分鐘之后，將腸組織分離。將潮霉素(150μg/mL)作為正對(duì)照施用以通過(guò)半胱天冬酶-3活化來(lái)促使細(xì)胞凋亡。

顯微鏡檢查

對(duì)于顯微分析，在給藥后15分鐘將體內(nèi)暴露的腸段分離，在此對(duì)PIP肽介導(dǎo)的Cy3-標(biāo)記的胰島素(Nancocs)的攝取進(jìn)行評(píng)估。分離的組織簡(jiǎn)單地在冰冷的PBS中沖洗，然后用4％的多聚甲醛固定，之后用Zeiss LSM 510熒光顯微鏡進(jìn)行評(píng)估。DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)用作核染色劑。

數(shù)據(jù)分析

通過(guò)扣除空白濾波器的讀數(shù)并對(duì)單層而言標(biāo)準(zhǔn)化為初始TEER值的百分比來(lái)計(jì)算TEER值。如前所述進(jìn)行用于計(jì)算細(xì)胞旁透過(guò)性的熒光葡聚糖通量。對(duì)每個(gè)動(dòng)物而言血糖水平表示為基線葡萄糖水平的百分比。使用雙尾未配對(duì)Student氏T檢驗(yàn)(two-tailed unpaired Student’s T-test)將數(shù)據(jù)與對(duì)照值進(jìn)行比較。p值<0.05被認(rèn)為顯示出顯著的差異。

實(shí)施例1.緊密連接(TJ)結(jié)構(gòu)和功能的動(dòng)態(tài)控制的背景理論

TJ結(jié)構(gòu)由內(nèi)在膜蛋白(integral membrane protein)構(gòu)成，所述內(nèi)在膜蛋白與可收縮及骨架成分相互作用以在健康或疾病中動(dòng)態(tài)地調(diào)控上皮屏障性質(zhì)(Turner(2009)Nat.Rev.Immunol.9:799-809；Xiao等，(2011)J.Aller.Clin.Immunol.128:549-556)。生理學(xué)和病理學(xué)刺激通過(guò)多種激酶(蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A、絲裂原活化蛋白激酶、磷酸肌醇3-激酶和Rho信號(hào)通路)改變TJ屏障性質(zhì)(Gonzalez-Mariscal(2008)Biochim.Biophys.Acta 1778:729-756)。這種激酶交叉感知(cross-talk)的核心要素涉及調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈(MLC)磷酸化(Woodsome等，(2006)J.Cell Sci.119:1769-1780)；圖1，增加的MLC磷酸化和降低的TJ屏障功能之間存在直接的聯(lián)系；借助起關(guān)鍵作用的MLC激酶(MLCK)，促炎性細(xì)胞因子可以驅(qū)動(dòng)MLC磷酸化，導(dǎo)致TJ的開(kāi)啟。發(fā)明人在先已經(jīng)確認(rèn)了一種膜透過(guò)的穩(wěn)定的MLCK肽抑制劑，被稱為PIK(圖1中箭頭)，其能夠糾正腸和肺中炎癥驅(qū)動(dòng)的TJ屏障功能降低(Clayburgh等，(2005)J.Clin.Invest.115:2702-2715；Mirzapoiazava等，(2011)Am.J.Respir.Cell Molec.Biol.44:40-52)。據(jù)推測(cè)MLCK的功能被MLC磷酸酶的作用所抵消。雖然對(duì)這樣的網(wǎng)絡(luò)中的靶標(biāo)使用基因敲除的研究可以提供對(duì)其在屏障功能中作用的洞察，但是通過(guò)針對(duì)這樣的網(wǎng)絡(luò)中單一靶標(biāo)的任何分子對(duì)整個(gè)體系的作用必須通過(guò)藥理學(xué)研究來(lái)確定。即，這些蛋白質(zhì)表面接觸位點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)的，并且這些藥劑的相關(guān)試驗(yàn)的第一位點(diǎn)為腸，成功的抑制劑應(yīng)當(dāng)優(yōu)選兼有穩(wěn)定性和膜可透過(guò)性。

實(shí)施例2.初步研究

發(fā)明人在先已經(jīng)開(kāi)發(fā)了MLCK的9個(gè)殘基的肽(PIK)抑制劑，其封閉由于炎癥事件而處于開(kāi)放位置的TJ結(jié)構(gòu)。PIK模仿了對(duì)MLCK功能而言關(guān)鍵的蛋白質(zhì)表面結(jié)構(gòu)。在確認(rèn)了關(guān)鍵的界面接觸之后，修飾該肽以整合氨基酸，這將允許細(xì)胞透過(guò)性肽(CPP)起作用并增加代謝穩(wěn)定性。采用這些相同的設(shè)計(jì)理念，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出根據(jù)本發(fā)明各個(gè)方面的試劑和方法。

MLCP為三聚蛋白磷酸酶-1(PP1)全酶，其由PP1異構(gòu)體、肌球蛋白靶向亞基MYPT1-CPI-17調(diào)節(jié)復(fù)合物以及21kDa輔助亞基構(gòu)成。為確認(rèn)潛在的肽MLCP抑制劑，發(fā)明人已經(jīng)關(guān)注MYPT1或17kDa蛋白抑制劑CPI-17與PP1之間的相互作用，以直接地調(diào)控MLCP功能(圖3)。

實(shí)施例3.靶向PP1-CPI-17相互作用

通過(guò)CPI-17的MLCP抑制由PKC刺激的事件驅(qū)動(dòng)；CPI-17中的殘基T³⁸的磷酸化(pT³⁸)使MLCP的抑制作用增強(qiáng)了超過(guò)1000倍；確定了在CPI-17中的最小抑制結(jié)構(gòu)域，其包括T³⁸(24)，并且合成了模仿CPI-17中的R³⁶VTVKYDRR⁴⁴(SEQ ID NO:13)序列的肽的小骨架，所述R³⁶VTVKYDRR⁴⁴序列參與其與PP1的相互作用。初始肽組中包括模仿pT³⁸(谷氨酸；E)的修飾，并且引入另外的要素(basic)以模仿CPP序列，以增強(qiáng)膜透過(guò)性(表1)。

表1顯示出測(cè)試的CPI-17衍生肽的結(jié)果。選擇R³⁶VTVKYDRR⁴⁴(SEQ ID NO:8)作為起始序列(條目1)。在測(cè)試系列(條目2-6)中殘基如所示的進(jìn)行變化(黑體，下劃線)。在頂部應(yīng)用到Caco-2細(xì)胞單層之后，功效通過(guò)TEER降低來(lái)測(cè)定。

將肽以5mM的濃度頂部應(yīng)用至在半透的插入小室(insert)上生長(zhǎng)的Caco-2細(xì)胞鋪滿的單層上(Rubus等，(1996)J.Pharma.Sci 85:165-169)，以評(píng)估其影響TJ功能的能力(Peterson&Mooseker(1992)J.Cell.Sci.102(3):581-600)。在加入25分鐘之內(nèi)，RRVEVKYDRR(6#肽；肽640，SEQ ID NO:3)使Caco-2單層的跨上皮電阻(TEER)降低50％(圖4)，并且根據(jù)MTT試驗(yàn)，這些肽在該濃度下沒(méi)有一種是有毒性的(Mosman(1983)J.Immunol.Methods 65:55-63)。關(guān)鍵是，在溫和清洗之后，RRVEVKYDRR(SEQ ID NO:3)治療過(guò)的Caco-2單層TEER值在24小時(shí)之內(nèi)恢復(fù)到其初始值的80％?；赗RVEVKYDRR(SEQ ID NO:3)序列確認(rèn)了首選的侯選物：肽NH₂-rrdykvevrr-NH₂(SEQ ID NO:20)，但是使用具有D-構(gòu)型氨基酸的逆-反構(gòu)型。

雖然CPI-17在平滑肌中廣泛表達(dá)(Eto(2009)J.Bid.Chem.369:149-156)，但是該數(shù)據(jù)是第一次提出其在分化的上皮細(xì)胞中的功能性作用。雖然pT³⁸對(duì)CPI-17本身的抑制性功能必不可少，但是本發(fā)現(xiàn)指明一種合適的穩(wěn)定模擬物(例如，E殘基)能夠替代pT³⁸用于我們的應(yīng)用。表1的肽的N和C末端作為細(xì)胞透過(guò)性序列而提供，但是如果采用其他實(shí)現(xiàn)細(xì)胞透過(guò)性的方法也可以不需要它。

實(shí)施例4.靶向PP1-MYPT1相互作用

在Rho-激酶介導(dǎo)的MYPT1在殘基T⁶⁹⁶和T⁸⁵³處的磷酸化之后發(fā)生MLCP抑制(Murthy等，(2003)Biochem.J.374:145-155)。MYPT1通過(guò)三個(gè)不同的區(qū)域與PP1結(jié)合：RVxF結(jié)合基序、N-末端臂和該蛋白的第二組錨蛋白重復(fù)序列。雖然MYPT1在T⁶⁹⁶和T⁸⁵³二者處的磷酸化似乎參與MLCP調(diào)控，但是在MYPT1的300個(gè)殘基N-末端結(jié)構(gòu)域中的KVKF序列促進(jìn)其與PP1的聯(lián)合(Peti等，(2013)FEB S.J.280:596-611)。MYPT結(jié)合至PP1的結(jié)構(gòu)分析顯示PP1的E³⁰⁰至E³⁰⁹位于MYPT的兩個(gè)錨蛋白重復(fù)序列之間；特別是，錨蛋白重復(fù)序列與Y³⁰⁵和Y³⁰⁷結(jié)合，表明PP1的C末端對(duì)介導(dǎo)異構(gòu)體特異性的調(diào)節(jié)亞基相互作用是非常重要的。因此，推測(cè)與該區(qū)域?qū)?yīng)的肽能夠防止MYPT結(jié)合至PP1，并由此減少M(fèi)YPT/PP1復(fù)合物的肌球蛋白特異性。

為測(cè)試該假說(shuō)，合成了包含PP1的C末端區(qū)域的³⁰¹KAKYQY³⁰⁶(SEQ ID NO:19)區(qū)域的RKAKYQYRRK(肽250，SEQ ID NO:4)。靶向的面間接觸的評(píng)估表明可以分別在N和C末端加入R殘基和三肽RRK，而不干擾促進(jìn)CPP起作用的功能。由于聚陽(yáng)離子可引發(fā)細(xì)胞損傷和毒性(Wender等，(2005)Org.Lett.7:4815-4818)，用MTT試驗(yàn)確認(rèn)對(duì)該肽來(lái)說(shuō)缺乏細(xì)胞毒性(數(shù)據(jù)未顯示)。將5mM肽250頂部添加至分化的Caco-2單層與添加5mM RRVEVKYDRR(6#肽；肽640,SEQ ID NO:3)以及對(duì)照肽進(jìn)行比較(圖5)。雖然相對(duì)于對(duì)照，肽250和640均增加了細(xì)胞旁標(biāo)志物的轉(zhuǎn)運(yùn)，但是它們表現(xiàn)為不同的時(shí)間過(guò)程并且對(duì)TEER具有不同的影響。發(fā)明人選擇4kDa的熒光葡聚糖(4FD)作為細(xì)胞旁標(biāo)志物，因?yàn)樵摲肿拥牧黧w動(dòng)力學(xué)半徑略大于胰島素和GLP-1的，因此應(yīng)當(dāng)預(yù)示它們的轉(zhuǎn)運(yùn)。靶向PP1-CPI-17相互作用的肽640，引起TEER迅速降低至其初始值的約50％，并且?guī)缀趿⒓匆鹆?FD轉(zhuǎn)運(yùn)的增加；這些作用與在第45分鐘時(shí)洗掉并在第70分鐘時(shí)再次加入的肽密切偶聯(lián)。與肽640相比，靶向PP1-MYPT1相互作用的肽250，產(chǎn)生了較慢且較不顯著的TEER降低，以及較不顯著的4FD轉(zhuǎn)運(yùn)中的初始增加。有趣的是，雖然在第45分鐘時(shí)除去肽250引起TEER的恢復(fù)，但是在第70分鐘時(shí)再次加入肽無(wú)法影響TEER，而是進(jìn)一步增強(qiáng)了4FD的轉(zhuǎn)運(yùn)。

基于以上信息，確定了首選的侯選物為肽250：NH₂-krryqykakr-NH₂(SEQ ID NO:21)，其使用逆-反構(gòu)型和D-型氨基酸。

這些研究顯示，就TEER和細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)而言，為阻斷CPI-17或MYPT1與PP1的相互作用而合理設(shè)計(jì)的肽能夠產(chǎn)生獨(dú)特的藥理學(xué)成果，表明存在包括CPI-17和MYPT1在內(nèi)的獨(dú)立的調(diào)節(jié)機(jī)理，這允許TJ動(dòng)態(tài)開(kāi)啟至各種程度和速度。

體外研究

為了充分地對(duì)PIP肽250和640進(jìn)行比較，我們嘗試基于對(duì)以TEER為基礎(chǔ)的響應(yīng)將二者進(jìn)行匹配。這樣做是因?yàn)閹追N不確定因素使得直接劑量比較不適當(dāng)，因?yàn)榭赡軆煞N肽具有對(duì)它們的作用關(guān)鍵的不同性質(zhì)：對(duì)其細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的可及性(由于CPP能力不同)、對(duì)其各自的MLCP-相關(guān)的靶標(biāo)的親合力、脫靶(off-target)作用和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性。我們確定20mM肽250提供了與10mM的肽640相當(dāng)?shù)捻憫?yīng)(圖6)。減少兩種PIP肽的頂部劑量表明，各自誘導(dǎo)TEER中的劑量依賴性變化，包括起始速率和最大效應(yīng)(圖6)。在PIP肽暴露180分鐘后，將新鮮培養(yǎng)基替換至頂部隔室顯示，這些PIP肽的除去引發(fā)TEER抑制的快速逆轉(zhuǎn)，暴露于肽640的細(xì)胞可能比那些暴露于肽250的細(xì)胞更快地響應(yīng)(圖6)。這樣的觀察表明，由肽250誘導(dǎo)的細(xì)胞改變的恢復(fù)可能不如肽640作用的通路活躍。由于肽640設(shè)計(jì)為影響PKC-介導(dǎo)的MLCP調(diào)節(jié)子，并且肽250設(shè)計(jì)為影響Rho激酶-介導(dǎo)的MLCP的調(diào)節(jié)，PKC和Rho-激酶在TJ結(jié)構(gòu)/功能的快速和更持久的改變中所發(fā)揮的覺(jué)察到的(perceived)作用一致。

接下來(lái)我們?cè)儐?wèn)PIP肽640和250對(duì)TEER的作用是否轉(zhuǎn)化為細(xì)胞旁透過(guò)性的變化(圖7)。盡管在暴露180分鐘之后在TEER中產(chǎn)生了接近50％的損失，但是5mM的肽640無(wú)法影響4kDa葡聚糖穿過(guò)Caco-2單層的透過(guò)性。10mM肽640的頂部施加使4kDa透過(guò)性的速率增加了3倍。有趣的是，就4kDa通量率而言，10mM肽640等同于10mM肽250，盡管與其他肽相比對(duì)TEER變化具有略微延遲和較弱的作用。令人驚訝的是，與10mM肽640相比，即使TEER變化圖對(duì)這些治療而言幾乎是相同的，但20mM肽250導(dǎo)致對(duì)4kDa葡聚糖而言通量率加倍(與對(duì)照相比大約6倍)。我們還觀察到肽640無(wú)法影響70kDa葡聚糖的通量，而20mM下的肽250可以使該通量增加約3倍。這些增強(qiáng)的4kDa葡聚糖通量的線性度(圖7)表明，不管達(dá)到TEER響應(yīng)平臺(tái)的時(shí)間，由這些PIP肽引起的透過(guò)性改變的作用非常迅速(圖6)。有跡象表明由20mM肽250誘導(dǎo)的增強(qiáng)的70kDa葡聚糖轉(zhuǎn)運(yùn)的誘導(dǎo)有輕微的延遲?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明，與由肽250誘導(dǎo)的等價(jià)作用相比(基于TEER)，肽640誘導(dǎo)更動(dòng)態(tài)和不太強(qiáng)鍵的分子旁路徑的開(kāi)啟。

體內(nèi)研究

我們的焦點(diǎn)在于在解決與繞開(kāi)胃酸和胰腺酶相關(guān)的配方挑戰(zhàn)之前檢查腸上皮轉(zhuǎn)運(yùn)；這樣的挑戰(zhàn)可以借助已建立的藥丸或片劑技術(shù)來(lái)解決，但是需要比嚙齒動(dòng)物更高級(jí)的動(dòng)物模型。目前，我們使用大鼠模型，其中將較小體積(50μL)直接注入小腸腔中，具體為遠(yuǎn)端空腸至近端回腸。我們通過(guò)胰島素的皮下(SC)注射校正通過(guò)口服遞送達(dá)到的響應(yīng)；劑量依賴性的血糖降低在約30分鐘達(dá)到最低點(diǎn)并且在約90分鐘時(shí)開(kāi)始恢復(fù)。3IU/kg的SC注射產(chǎn)生約50％的血糖降低(圖8a)。將30IU/kg直接腔內(nèi)注射至大鼠的小腸(空腸中段至回腸中段)對(duì)血糖沒(méi)有影響(圖8b)。然而，30IU/kg的胰島素加上10mM的肽250的ILI引起與SC注射3IU胰島素所觀察到的類似的血糖降低和恢復(fù)曲線，注意到在90分鐘時(shí)已經(jīng)達(dá)到了70-80％的血糖恢復(fù)(圖8a、b)。有趣的是，通過(guò)ILI以30IU/kg施用的20mM的肽250引起30分鐘時(shí)40％的血糖降低，在試驗(yàn)的剩余階段保持在這一水平(圖8b)。與SC注射(圖8a)或10mM肽250(圖8b)相比，30IU/kg的胰島素與10mM肽640的直接ILI引起血糖變化曲線中降低大大延遲(圖8c)；需要20mM肽640的ILI以產(chǎn)生與用10mM的肽250所觀察到的類似的效果。

這些結(jié)果是有趣的，因?yàn)樗鼈儽砻鬟@些PIP肽在體外和體內(nèi)具有不同的響應(yīng)曲線，這可能與其響應(yīng)的耐久性有關(guān)。在體外，采用的PIP肽保持存在和功能直到其被物理地除去。然而，在體內(nèi)，在腔上皮表面處的PIP肽的有效濃度通過(guò)某些事件如腔沖洗和全身吸收而復(fù)雜化；可能改變PIP肽的量和持續(xù)時(shí)間的事件可能在小腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。我們觀察到，肽640對(duì)TEER顯現(xiàn)出比肽250更動(dòng)態(tài)的響應(yīng)，這會(huì)引起體內(nèi)更持久的響應(yīng)。

PIP肽作用的機(jī)理

這些體內(nèi)結(jié)果通常與我們用人腸上皮細(xì)胞系Caco-2進(jìn)行的體外研究相一致，其表明細(xì)胞旁透過(guò)性的動(dòng)態(tài)變化(圖6和7)。如所預(yù)期的，這些PIP肽在體內(nèi)的作用是瞬時(shí)的，并且它們作用的持續(xù)時(shí)間和起始時(shí)間是劑量依賴性的。PIP肽250和640在體外的區(qū)別是顯而易見(jiàn)的，其中它們的絕對(duì)濃度和暴露持續(xù)時(shí)間是可控的。通過(guò)將MLC的位置19處的磷酸絲氨酸(pMLC)的程度與從經(jīng)血糖測(cè)定的時(shí)間過(guò)程的PIP肽暴露部位分離出的大鼠腸組織中的總MLC進(jìn)行比較來(lái)測(cè)定MLC的磷酸化狀態(tài)，我們檢查了PIP肽250和640在體內(nèi)作用的起始和持續(xù)時(shí)間(圖8B和8C)。

通過(guò)半定量蛋白質(zhì)印記分析(圖9A)來(lái)評(píng)估總MLC與pMLC之比。該分析顯示，由20mM肽640誘導(dǎo)的MLC磷酸化比例在15分鐘內(nèi)顯著增加，并在45分鐘時(shí)保持升高，然后在90分鐘時(shí)回到初始水平之前。20mM肽250達(dá)到的MLC對(duì)pMLC比例曲線在15分鐘時(shí)顯示無(wú)明顯的變化，而在45分鐘時(shí)升高，然后在90分鐘時(shí)回到基底水平(圖9B)。這些結(jié)果與由這些PIP肽和胰島素的共同給藥誘導(dǎo)的血糖降低的時(shí)間過(guò)程非常相關(guān)(圖8B和8C)。重要的是我們注意到，當(dāng)關(guān)注僅從腸上皮細(xì)胞中分離的MLC時(shí)，使用的提取過(guò)程可能已經(jīng)引起這些分離的腸組織中存在一些從其他細(xì)胞分離的MLC。

通過(guò)檢查在其ILI注射之后胰島素的熒光標(biāo)記形式的去向，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了PIP肽作用機(jī)理的假說(shuō)。只有當(dāng)與PIP肽共同施用而沒(méi)有上皮的大體解剖修飾時(shí)，在腸細(xì)胞旁空間觀察到熒光(cy3-標(biāo)記)胰島素(圖9C)。這些結(jié)構(gòu)共同地支持了該假說(shuō)，即，PIP肽的頂部、局部施用起到局部增加體內(nèi)大鼠腸上皮的細(xì)胞旁透過(guò)性的作用。進(jìn)而，胰島素的細(xì)胞旁透過(guò)性增加的時(shí)間過(guò)程與上皮細(xì)胞中pMLC含量的瞬時(shí)增加的作用是一致的。

PIP增強(qiáng)的胰島素?cái)z取的去向

在ILI注射PIP肽和10IU胰島素之后，監(jiān)控血糖降低和總的MLC細(xì)胞含量有關(guān)的MLC磷酸化的變化的時(shí)間過(guò)程研究表明了大約30-60分鐘的體內(nèi)事件窗口期。為進(jìn)一步探究，我們測(cè)量了在ILI之后5到90分鐘從門(mén)靜脈(圖10A)和尾靜脈(圖10B)收集的血液中的血清胰島素濃度。門(mén)靜脈中胰島素水平增加的起始時(shí)間和這些增加的水平的持續(xù)時(shí)間表明，與肽250相比，肽640激起了更迅速的作用起始時(shí)間和更短的作用持續(xù)時(shí)間，這與這兩種肽的磷酸化比例改變來(lái)說(shuō)的時(shí)間過(guò)程是一致的(圖9)。

在10IU/kg的ILI之后，通過(guò)在門(mén)靜脈和全身(尾靜脈)中的ELISA檢測(cè)的總胰島素量，對(duì)于本文的試驗(yàn)條件，在通過(guò)肽250相比肽640增強(qiáng)攝取之后顯示略微不同的曲線。另外，我們測(cè)定了SC注射之后胰島素的門(mén)靜脈和全身濃度的時(shí)間-濃度曲線(圖10C)。采用非小室模型(non-compartmental)分析和Wagner-Nelson去卷積(deconvolution)，當(dāng)通過(guò)ILI施用肽250和肽640時(shí)，對(duì)于在門(mén)靜脈中檢測(cè)出的人胰島素而言，口服給藥(相對(duì)于SC)的相對(duì)生物利用度分別為4％和3％。有趣的是，在ILI施用肽250和肽640之后，對(duì)于到達(dá)體循環(huán)的人胰島素而言，相對(duì)生物利用度分別為1.6％和1.4％。這些結(jié)果表明相當(dāng)一部分遞送至門(mén)靜脈的人胰島素沒(méi)有到達(dá)體循環(huán)。

在PIP肽暴露之后的上皮細(xì)胞活力

采用Caco-2細(xì)胞的初始體外研究表明，在調(diào)節(jié)TEER和細(xì)胞旁透過(guò)性的濃度下測(cè)試的肽250和640并不影響通過(guò)線粒體膜極性標(biāo)志物MTS評(píng)估的細(xì)胞活力。由于體內(nèi)PIP作用的瞬時(shí)特性，我們關(guān)注了可能與降低的細(xì)胞活力有關(guān)的可能更好地限定早期細(xì)胞變化的細(xì)胞信號(hào)；半胱天冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的活化是上皮細(xì)胞中細(xì)胞凋亡事件的早期步驟。我們測(cè)量了將肽250或肽640以顯示為降低血糖(圖8)、增加pMLC的程度(圖9)且增強(qiáng)胰島素進(jìn)入門(mén)靜脈的攝取(圖10)的濃度進(jìn)行頂部暴露60分鐘之后分離的大鼠腸組織中的半胱天冬酶-3的活性水平。在類似的20mM的PIP肽250或640進(jìn)行頂部暴露之后，腸組織沒(méi)有顯示半胱天冬酶-3活性的誘導(dǎo)，而通過(guò)ILI施用的對(duì)于半胱天冬酶-3的誘導(dǎo)用作正對(duì)照的潮霉素(150mg/mL)卻引起了這種酶活性的增加(圖11)。在注射胰島素與20mM的PIP肽250或640、或者單獨(dú)的胰島素之后，測(cè)量門(mén)靜脈中內(nèi)毒素的濃度。在治療組中沒(méi)有觀察到區(qū)別。

結(jié)論

為了增強(qiáng)生物藥物的口服遞送的目的，已經(jīng)探索了多種試劑以增加腸細(xì)胞旁通量；皂樹(shù)皂苷(quilaja saponin)、甘草酸二鉀、18β-甘草(glycyrrhetinic)、癸酸鈉、?；撬岷屯榛溠刻擒?alkylmaltosides)僅是已經(jīng)描述的試劑的一小部分?？偟膩?lái)說(shuō)，這些試劑通常用體外細(xì)胞體系(諸如Caco-2單層或分離的腸組織)進(jìn)行篩選。這些試劑中的一些，如棕櫚酰肉堿，最初顯示出希望，但最終其優(yōu)勢(shì)與對(duì)細(xì)胞膜的裂解作用有關(guān)并降低了細(xì)胞活力。人乳中存在的中鏈脂肪酸癸酸鈉，甚至已經(jīng)被批準(zhǔn)作為直腸氨芐青霉素栓劑中的吸收增強(qiáng)劑。雖然癸酸鹽顯示引起TJ擴(kuò)張，以增強(qiáng)體外細(xì)胞旁透過(guò)性，但是在體內(nèi)癸酸鹽對(duì)于其在人中的作用的功效與細(xì)胞旁透過(guò)性修飾相比，與直腸粘膜的非特異性損傷具有更好的相關(guān)性。目前，沒(méi)有設(shè)計(jì)為在口服遞送之后增強(qiáng)生物藥物的細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)的試劑被批準(zhǔn)。

最初基于其作用機(jī)理的不確定性的毒性似乎是限制藥劑鑒定為在口服遞送之后安全地增強(qiáng)細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)的核心要素。鑒于此，最近的研究表明癸酸鹽可以改變TJ成分三細(xì)胞素(tricellulin)的表達(dá)，以通過(guò)上皮中的三細(xì)胞接觸來(lái)增加細(xì)胞旁通量。這一發(fā)現(xiàn)可能解釋癸酸鹽在體外的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槠渑c由模仿了TJ蛋白claudin 1的細(xì)胞外環(huán)結(jié)構(gòu)域的肽誘導(dǎo)的體外和體內(nèi)的細(xì)胞旁攝取可能增加類似，所述肽。因此，選擇性解構(gòu)三細(xì)胞TJ接觸的方法可提供安全且有效地增加細(xì)胞旁透過(guò)性的潛在作用機(jī)理。我們已經(jīng)采取了這樣的方法以確定具有限定的作用機(jī)理的藥劑，其可以瞬時(shí)地打開(kāi)腸TJ以增強(qiáng)生物藥物的細(xì)胞旁攝取。我們的方法是基于最初由Papenheimer做出的發(fā)現(xiàn)，其說(shuō)明腸上皮頂部具有內(nèi)源性營(yíng)養(yǎng)活化的機(jī)理以增加溶質(zhì)的細(xì)胞旁透過(guò)。隨后的研究顯示這樣的細(xì)胞旁透過(guò)的增加是由于肌球蛋白輕鏈(MLC)磷酸化的增加。

在控制TJ-介導(dǎo)的溶質(zhì)透過(guò)性中MLC磷酸化的驗(yàn)證，最初使用合理設(shè)計(jì)的、穩(wěn)定的MLC激酶(PIK)肽的膜透過(guò)性抑制劑來(lái)確認(rèn)，該透過(guò)性抑制劑在慢性上皮炎癥模型中顯示有效。目前，我們的目標(biāo)是確認(rèn)膜透過(guò)性的、穩(wěn)定的MLC磷酸酶(MLCP)的選擇性抑制劑，其抵消殘余的MLC激酶活性的作用(圖12)。我們采用公認(rèn)的原則來(lái)鑒定能夠選擇性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的短肽序列，目的是模擬涉及MLCP調(diào)節(jié)蛋白(CPI-17和MYPT)的界面接觸。通過(guò)這些調(diào)節(jié)元件的MLCP調(diào)節(jié)為上皮細(xì)胞提供了至少兩個(gè)不同的控制MLC磷酸化的機(jī)理，從而改變了TJ的功能性特性。具有足以實(shí)現(xiàn)靶特異性的廣泛界面接觸位點(diǎn)的肽具有差的膜透過(guò)性，并且進(jìn)一步限制了腸腔中和上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的肽酶-介導(dǎo)的分解代謝。我們?cè)O(shè)計(jì)并測(cè)試了模擬內(nèi)源性序列以增加特異性的肽組，其由D-型氨基酸制備用于增加穩(wěn)定性，并且包含提高的正/負(fù)電荷比以增加膜透過(guò)性。

目前的研究已經(jīng)證實(shí)了在活細(xì)胞中使用穩(wěn)定的膜透過(guò)性肽以干擾界面接觸位點(diǎn)并改變蛋白質(zhì)磷酸酶1的方法。如在先所示以設(shè)計(jì)為靶向RVxF-型PP1-結(jié)合基序的膜透過(guò)性肽或者其他細(xì)胞膜透過(guò)性肽的MLPC調(diào)節(jié)而言，在本研究中檢測(cè)的PIP肽在體外或體內(nèi)沒(méi)有顯示任何細(xì)胞毒性作用。這與微囊藻毒素形成鮮明對(duì)比，微囊藻毒素是一類通過(guò)結(jié)合常見(jiàn)位點(diǎn)而抑制多種PP1以及其它Ser/Thr蛋白磷酸酶的環(huán)狀七肽肝毒素；與微囊藻毒素中毒相關(guān)的疾病與由多種蛋白質(zhì)的磷酸化增加而引起的非特異性作用相關(guān)。我們的結(jié)果說(shuō)明了，通過(guò)靶向MLCP和不誘導(dǎo)細(xì)胞毒性(可能由于它們的特定作用)的特異性調(diào)節(jié)蛋白之間的界面接觸而選擇性抑制MLCP活性，增強(qiáng)生物藥物的口服攝取的可行性。

在過(guò)去20年的調(diào)查表明，Ca²⁺/鈣調(diào)蛋白活化MLCK的活性，而Rho激酶和蛋白激酶C分別通過(guò)MYPT1和CPI-17調(diào)節(jié)MLCP。當(dāng)與肽640的作用相比，肽250具有較小的動(dòng)態(tài)作用并打開(kāi)TJ結(jié)構(gòu)以轉(zhuǎn)運(yùn)更大的溶質(zhì)。這樣的數(shù)據(jù)表明，與那些通過(guò)CPI-17介導(dǎo)的相比，通過(guò)Rho激酶有關(guān)的機(jī)理的MLCP抑制引起了更為持久和廣泛的TJ功能的修飾(圖12)。這些研究與Rho A可通過(guò)其對(duì)MYPT1的作用來(lái)介導(dǎo)緩慢的、持久的TJ改變的可能性是一致的，而PKC對(duì)CPI-17的作用可為JI功能中更迅速且動(dòng)態(tài)的改變提供機(jī)理。PIP肽250和640作用中的差別在其中它們的濃度和持續(xù)暴露可以被控制的體外研究中更加顯而易見(jiàn)。體內(nèi)研究與關(guān)于PIP肽作用的動(dòng)態(tài)性質(zhì)的體外觀察結(jié)果一致，但不是顯而易見(jiàn)的。這可能是由于體內(nèi)所經(jīng)歷條件的增加的可變性。

在這些研究中鑒定和測(cè)試的PIP肽已經(jīng)為支持關(guān)于MLC磷酸化的調(diào)控的幾種概念提供了主要成果的證明。1)為干擾PP1及其調(diào)節(jié)蛋白CPI-17以及MYPT1之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用而設(shè)計(jì)的肽能夠瞬時(shí)地增加MLC的磷酸化。2)由這些肽誘發(fā)的MLC磷酸化的增加能夠增加大分子的細(xì)胞旁通量。3)由這些為干擾PP1及其調(diào)節(jié)蛋白CPI-17以及MYPT1之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用而設(shè)計(jì)的肽誘導(dǎo)的細(xì)胞旁透過(guò)性改變的調(diào)控是迅速且可逆的。4)與這些對(duì)細(xì)胞旁屏障性質(zhì)的動(dòng)態(tài)效果相關(guān)聯(lián)的MLC磷酸化中的改變與細(xì)胞毒性無(wú)關(guān)，或者不導(dǎo)致細(xì)胞毒性。最后這一點(diǎn)在下一步的考慮中是非常重要的。雖然PIP肽640和250是有效且明顯為特異性和非毒性的，但是對(duì)其功能而言所需的濃度在mM的范圍內(nèi)。這實(shí)際上并不是一個(gè)重要的問(wèn)題，因?yàn)樵谄渲型瑫r(shí)定位生物藥物的局部應(yīng)用中實(shí)現(xiàn)這些濃度是易于實(shí)現(xiàn)的。優(yōu)化這些PIP肽以降低所需的濃度是未來(lái)感興趣的一個(gè)領(lǐng)域。這樣的效果將需要多重和反復(fù)的努力以使肽結(jié)構(gòu)最小化，同時(shí)保持靶特異性和作用以及增加膜透過(guò)性的效率以達(dá)到所需的細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)。這些努力可能得益于使用穩(wěn)定的磷酸化氨基酸類似物，而不是使用帶負(fù)電的氨基酸來(lái)模擬這些所需的功能要素。

總的來(lái)說(shuō)，我們的研究表明，合理設(shè)計(jì)阻斷CPI-17或MYPT1與PP1(MLCP)的相互作用的肽能夠產(chǎn)生關(guān)于TEER和細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)的不同的藥理學(xué)結(jié)果。雖然CPI-17在平滑肌中廣泛表達(dá)，但是該數(shù)據(jù)是第一次表明其在分化的上皮細(xì)胞中的功能性作用。此外，我們的結(jié)果表明，可能存在獨(dú)立的調(diào)節(jié)機(jī)理，其允許CPI-17和MYPT1動(dòng)態(tài)地打開(kāi)TJ至各種程度和速率。最終，我們已經(jīng)表明，使用設(shè)計(jì)為增加MLCP活性的肽操縱MLCP功能可以應(yīng)用于增加胰島素的口服生物利用度的藥學(xué)相關(guān)問(wèn)題。

序列表

<110> 巴斯大學(xué)

<120> 藥物遞送增強(qiáng)劑

<130> P021142WO

<160> 21

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> 磷酸化

<220>

<221> 變體

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1 為任意帶負(fù)電的氨基酸殘基, 例如 pTyr,

Asp 或 Glu

<220>

<221> 變體

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2 為任意小的疏水性氨基酸殘基, 例如 Val

或 Ala

<220>

<221> 變體

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3 為任意帶正電的氨基酸殘基, 例如

Lys 或 Arg

<220>

<221> 變體

<222> (4)..(4)

<223> Xaa4 為任意親水性氨基酸殘基, 例如Tyr, Phe,

Thr 或 Ser

<220>

<221> 變體

<222> (5)..(5)

<223> Xaa4 為任意帶負(fù)電的氨基酸殘基, 例如

PTyr, Asp 或 Glu

<400> 1

Tyr Val Lys Tyr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<220>

<221> 變體

<222> (1)..(1)

<223> Xaa 在位置1 為任意氨基酸殘基

<400> 2

Xaa Tyr Gln Tyr

1

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<400> 3

Arg Arg Val Glu Val Lys Tyr Asp Arg Arg

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<400> 4

Arg Lys Ala Lys Tyr Gln Tyr Arg Arg Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<220>

<221> 變體

<222> (1)..(1)

<223> Xaa 為至多10個(gè)帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2 為帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3 不存在或?yàn)槭杷园被釟埢?/p>

<220>

<221> 變體

<222> (4)..(4)

<223> Xaa4為帶負(fù)電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (5)..(5)

<223> Xaa5 為小的疏水性氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (6)..(6)

<223> Xaa6 為帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (7)..(7)

<223> Xaa7 為疏水性氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (8)..(8)

<223> Xaa8 為帶負(fù)電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (8)..(8)

<223> Xaa8 為帶負(fù)電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (9)..(9)

<223> Xaa9 為帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (10)..(10)

<223> Xaa10 為至多10個(gè)帶正電的氨基酸殘基

<400> 5

Lys Lys Ala Asp Ala Lys Ala Asp Lys Lys

1 5 10

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<220>

<221> 變體

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1 不存在或?yàn)槭杷园被釟埢?/p>

<220>

<221> 變體

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2 為帶負(fù)電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3 為小的疏水性氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (4)..(4)

<223> Xaa4 為帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (5)..(5)

<223> Xaa5 為疏水性氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (6)..(6)

<223> Xaa6 為帶負(fù)電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (7)..(7)

<223> Xaa7 為帶正電的氨基酸殘基

<400> 6

Ala Asp Ala Lys Ala Asp Lys Lys

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<220>

<221> 變體

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1 為至多10個(gè)帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2 為帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3 不存在或?yàn)槭杷园被釟埢?/p>

<220>

<221> 變體

<222> (4)..(4)

<223> Xaa4 為帶負(fù)電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (5)..(5)

<223> Xaa5 為小的疏水性氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (6)..(6)

<223> Xaa6 為帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (7)..(7)

<223> Xaa7 為疏水性氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (8)..(8)

<223> Xaa8 為帶負(fù)電的氨基酸殘基

<400> 7

Lys Lys Ala Asp Ala Lys Ala Asp

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<400> 8

Arg Val Thr Val Lys Tyr Asp Arg Arg

1 5

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<220>

<221> 變體

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1 為至多10個(gè)帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2 為帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3 為 Ala 或 Val

<220>

<221> 變體

<222> (4)..(4)

<223> Xaa4 不存在或?yàn)?Ala 或 為1、2、3 或 4個(gè)帶正電的

氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (6)..(6)

<223> Xaa6 為帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (6)..(6)

<223> Xaa6 為帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (9)..(9)

<223> Xaa9 不存在或?yàn)?Ala 或 為1、2、3 或 4個(gè)帶正電的

氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (10)..(10)

<223> Xaa10 為帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (12)..(12)

<223> Xaa12 為至多10個(gè)帶正電的氨基酸殘基

<400> 9

Lys Lys Ala Ala Lys Tyr Gln Tyr Ala Lys Lys Lys

1 5 10

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<220>

<221> 變體

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1 為至多10個(gè)帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2 為帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3 為Ala 或 Val

<220>

<221> 變體

<222> (4)..(4)

<223> Xaa4 不存在或 為Ala 或?yàn)?1、2、3、或 4個(gè)帶正電的

氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (5)..(5)

<223> Xaa5 為帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (5)..(5)

<223> Xaa5 為帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (9)..(9)

<223> Xaa9 不存在或?yàn)锳la 或?yàn)?1、2、3、或 4個(gè)帶正電的

氨基酸殘基

<400> 10

Lys Lys Ala Ala Lys Tyr Gln Tyr Ala

1 5

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<220>

<221> 變體

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1 為Ala 或 Val

<220>

<221> 變體

<222> (1)..(1)

<223> Xaa1 為Ala 或 Val

<220>

<221> 變體

<222> (2)..(2)

<223> Xaa2 不存在或 為Ala 或 為1、2、3 或 4個(gè)帶正電的

氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (3)..(3)

<223> Xaa3 為帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (7)..(7)

<223> Xaa7 不存在或?yàn)?Ala, 或?yàn)?1、2、3、或 4個(gè)帶正電的

氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (8)..(8)

<223> Xaa8 為帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (8)..(8)

<223> Xaa8 為帶正電的氨基酸殘基

<220>

<221> 變體

<222> (10)..(10)

<223> Xaa10 為至多10個(gè)帶正電的氨基酸殘基

<400> 11

Ala Ala Lys Tyr Gln Tyr Ala Lys Lys Lys

1 5 10

<210> 12

<400> 12

000

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<400> 13

Arg Val Thr Val Lys Tyr Asp Arg Arg

1 5

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<400> 14

Arg Arg Val Thr Val Lys Tyr Asp Arg Arg

1 5 10

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> 磷酸化

<400> 15

Arg Arg Val Thr Val Lys Tyr Asp Arg Arg

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<400> 16

Arg Arg Val Thr Val Lys Tyr Lys Arg Arg

1 5 10

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> 磷酸化

<400> 17

Arg Arg Val Thr Val Lys Tyr Lys Arg Arg

1 5 10

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<400> 18

Arg Arg Lys Thr Val Lys Tyr Asp Arg Arg

1 5 10

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<400> 19

Lys Ala Lys Tyr Gln Tyr

1 5

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<400> 20

Arg Arg Asp Tyr Lys Val Glu Val Arg Arg

1 5 10

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 藥物遞送增強(qiáng)肽

<400> 21

Lys Arg Arg Tyr Gln Tyr Lys Ala Lys Arg

1 5 10