技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明總體上涉及新型陽(yáng)離子脂質(zhì)，其可用于與其他脂質(zhì)組分(例如中性脂質(zhì)、膽甾醇和聚合物綴合的脂質(zhì))結(jié)合，以便形成具有寡核苷酸的脂質(zhì)納米顆粒，從而促進(jìn)體外和體內(nèi)的治療性核酸(例如，寡核苷酸、信使RNA)的細(xì)胞內(nèi)遞送。

相關(guān)領(lǐng)域描述

關(guān)于遞送核酸以便在生物系統(tǒng)中產(chǎn)生所需的應(yīng)答存在著諸多挑戰(zhàn)?；诤怂岬闹委熅哂芯薮鬂摿?，但需要將核酸更有效地遞送至細(xì)胞或生物體內(nèi)的適當(dāng)位點(diǎn)，以便實(shí)現(xiàn)這種潛力。治療性核酸包括，例如，信使RNA(mRNA)、反義寡核苷酸、核酶、DNA酶、質(zhì)粒、免疫刺激核酸、antagomir、antimir、模擬物(mimic)、supermir和適配子。一些核酸，如mRNA或質(zhì)粒，可以用于影響特定細(xì)胞產(chǎn)物的表達(dá)，正如其對(duì)于治療例如與蛋白質(zhì)或酶的缺乏有關(guān)的疾病是有用的?？煞g的核苷酸遞送的治療性應(yīng)用是極其廣泛的，這是因?yàn)榭梢院铣蓸?gòu)建體以產(chǎn)生任何所選蛋白質(zhì)序列(不論是否為該系統(tǒng)固有的)。所述核酸的表達(dá)產(chǎn)物可以增大蛋白質(zhì)的存在水平，取代缺失的或非功能的蛋白質(zhì)型，或在細(xì)胞或生物體內(nèi)引入新的蛋白質(zhì)以及相關(guān)功能。

一些核酸，如miRNA抑制劑，可以用于影響由miRNA調(diào)控的特定細(xì)胞產(chǎn)物的表達(dá)，正如其對(duì)于治療例如與蛋白質(zhì)或酶的缺乏有關(guān)的疾病是有用的。miRNA抑制的治療性應(yīng)用是極其廣泛的，其原因是可以合成構(gòu)建體以抑制一種或多種進(jìn)而調(diào)控mRNA產(chǎn)物表達(dá)的miRNA。內(nèi)源性miRNA的抑制可以增加其下游的靶內(nèi)源性蛋白質(zhì)表達(dá)，并且恢復(fù)細(xì)胞或生物體內(nèi)的適當(dāng)功能，以治療與特定miRNA或miRNA組有關(guān)的疾病。

其他的核酸可以下調(diào)特定mRNA的細(xì)胞內(nèi)水平，并且，結(jié)果是，通過(guò)諸如RNA干擾(RNAi)或反義RNA的互補(bǔ)結(jié)合的過(guò)程下調(diào)相應(yīng)的蛋白質(zhì)的合成。反義寡核苷酸和RNAi的治療性應(yīng)用也是極其廣泛的，因?yàn)榭梢酝ㄟ^(guò)直接對(duì)應(yīng)靶mRNA的任何核苷酸序列合成寡核苷酸構(gòu)建體。靶標(biāo)可以包括來(lái)自正常細(xì)胞的mRNA、與病癥(例如癌癥)有關(guān)的mRNA以及感染因子(例如病毒)的mRNA。迄今為止，反義寡核苷酸構(gòu)建體已顯示出在體外和體內(nèi)模型中通過(guò)同源mRNA的降解來(lái)特異性地下調(diào)靶蛋白質(zhì)的能力。另外，反義寡核苷酸構(gòu)建體目前正在臨床研究中被評(píng)估。

然而，在治療過(guò)程下使用寡核苷酸目前面臨著兩個(gè)問(wèn)題。第一，游離的RNA易于在血漿中核酸酶消化。第二，游離RNA進(jìn)入存在相關(guān)翻譯機(jī)制的細(xì)胞內(nèi)隔室的能力受限。由陽(yáng)離子脂質(zhì)與其他脂質(zhì)組分(如中性脂質(zhì)、膽甾醇、PEG、PEG化的脂質(zhì)和寡核苷酸)形成的脂質(zhì)納米顆粒已用于阻止RNA在血漿中的降解并促進(jìn)寡核苷酸的細(xì)胞攝取。

仍然需要改進(jìn)的用于遞送寡核苷酸的陽(yáng)離子脂質(zhì)和脂質(zhì)納米顆粒。優(yōu)選地，這些脂質(zhì)納米顆粒會(huì)提供優(yōu)化的藥物:脂質(zhì)比，保護(hù)核酸不在血清中被降解和清除，其適于全身性遞送，并且提供核酸的細(xì)胞內(nèi)遞送。另外，這些脂質(zhì)-核酸顆粒應(yīng)當(dāng)是耐受良好的，并且提供足夠的治療指數(shù)，從而以不對(duì)患者產(chǎn)生不可接受的毒性和/或風(fēng)險(xiǎn)的核酸的有效劑量來(lái)對(duì)患者進(jìn)行治療。本發(fā)明提供這些優(yōu)點(diǎn)和相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。

概述

簡(jiǎn)言之，本發(fā)明提供了脂質(zhì)化合物，包括其立體異構(gòu)體、藥物可接受的鹽或互變異構(gòu)體，其可以單獨(dú)使用，或者結(jié)合其他脂質(zhì)組分，如中性脂質(zhì)、帶電脂質(zhì)、甾族化合物(包括例如，所有甾醇類)和/或他們的類似物和/或聚合物綴合的脂質(zhì)，以便形成用于遞送治療劑的脂質(zhì)納米顆粒。在一些實(shí)例中，所述脂質(zhì)納米顆粒用于遞送核酸，如反義RNA和/或信使RNA。還提供了這類脂質(zhì)納米顆粒用于治療各種疾病或病況(如感染性實(shí)體和/或蛋白質(zhì)缺乏引起的疾病或病況)的方法。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了具有下式(I)的化合物：

或其藥物可接受的鹽、互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，其中R^la、R^lb、R^2a、R^2b、R^3a、R^3b、R^4a、R^4b、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、L¹、L²、a、b、c、d和e如本文所定義。

還提供了包含前述式(I)的化合物中的一種或多種和治療劑的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物還包含一種或多種選自中性脂質(zhì)、帶電脂質(zhì)、甾族化合物和聚合物綴合的脂質(zhì)的組分。這類組合物對(duì)于形成用于遞送治療劑的脂質(zhì)納米顆粒是有用的。

在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了對(duì)有此需要的患者施用治療劑的方法，該方法包括制備包含式(I)的化合物的脂質(zhì)納米顆粒與治療劑的組合物，和將該組合物遞送至患者。

在更多的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有以下結(jié)構(gòu)(II)的聚乙二醇化的脂質(zhì)：

或其藥物可接受的鹽、互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，其中R¹⁰、R¹¹和z如本文所定義。

本發(fā)明的這些和其他方面經(jīng)參考以下詳細(xì)描述將會(huì)是顯而易見的。

附圖簡(jiǎn)述

在附圖中，相同的參考編號(hào)表示類似的要素。圖中要素的尺寸和相對(duì)位置不必按比例繪制，并且這些要素中的一些被任意地放大和放置以便改善圖的易讀性。并且，所繪制要素的特定形狀并非旨在表達(dá)有關(guān)特定要素的實(shí)際形狀的信息，并且僅選擇以便易于圖中的識(shí)別。

圖1示出了鼠肝臟中熒光素酶表達(dá)的時(shí)間過(guò)程。

圖2例示了MC3作為與所公開脂質(zhì)相關(guān)的代表性實(shí)例的pKa的計(jì)算。

圖3提供了對(duì)于不同脂質(zhì)的比較性的熒光素酶活性數(shù)據(jù)。

圖4為示出了包含兩種不同的聚乙二醇化的脂質(zhì)的組合物的比較性數(shù)據(jù)的柱狀圖。

發(fā)明詳述

在以下描述中，闡述了某些具體的詳細(xì)內(nèi)容，以便提供對(duì)本發(fā)明各種實(shí)施方案的透徹理解。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，本發(fā)明可以在沒(méi)有這些詳細(xì)內(nèi)容的情況下實(shí)施。

本發(fā)明部分基于新型陽(yáng)離子(氨基)脂質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，該新型陽(yáng)離子(氨基)脂質(zhì)當(dāng)在用于將活性劑或治療劑(例如核酸)體內(nèi)遞送至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的脂質(zhì)納米顆粒中使用時(shí)提供優(yōu)點(diǎn)。特別地，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了包含一種或多種本文描述的新型陽(yáng)離子脂質(zhì)的核酸-脂質(zhì)納米顆粒組合物，其提供增強(qiáng)的核酸活性和增強(qiáng)的組合物體內(nèi)耐受性，使得相比先前描述的核酸-脂質(zhì)納米顆粒組合物在治療指數(shù)上的顯著提高。

在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了新型陽(yáng)離子脂質(zhì)，其能夠形成改善的用于體外和體內(nèi)遞送mRNA和/或其他寡核苷酸的組合物。在一些實(shí)施方案中，這些改善的脂質(zhì)納米顆粒組合物對(duì)于由mRNA編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)是有用的。在其他實(shí)施方案中，這些改善的脂質(zhì)納米顆粒組合物通過(guò)遞送靶向一種特定miRNA或miRNA組(其調(diào)控一種靶mRNA或多種mRNA)的miRNA抑制劑從而對(duì)于上調(diào)內(nèi)源性蛋白質(zhì)表達(dá)是有用的。在其他實(shí)施方案中，這些改善的脂質(zhì)納米顆粒組合物對(duì)于下調(diào)(例如，沉默)靶基因的蛋白質(zhì)水平和/或mRNA水平是有用的。在一些其他實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)納米顆粒對(duì)用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的mRNA和質(zhì)粒的遞送也是有用的。在其他實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)納米顆粒組合物對(duì)于引發(fā)由蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)生的藥理學(xué)作用是有用的，所述藥理學(xué)作用例如，通過(guò)遞送適合的紅細(xì)胞生成素mRNA產(chǎn)生增加的紅細(xì)胞，或者通過(guò)遞送用于編碼適合抗體的mRNA來(lái)防止感染。

本發(fā)明的脂質(zhì)納米顆粒和組合物可以用于各種目的，包括在體外和體內(nèi)將封裝的或締合的(例如，復(fù)合的)諸如核酸的治療劑遞送至細(xì)胞。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案提供通過(guò)使有此需要的對(duì)象接觸封裝適合的治療劑或與適合的治療劑締合的脂質(zhì)納米顆粒，來(lái)治療或預(yù)防所述對(duì)象的疾病和病癥的方法，其中所述脂質(zhì)納米顆粒包含一種或多種本文描述的新型陽(yáng)離子脂質(zhì)。

如本文所描述的，本發(fā)明的脂質(zhì)納米顆粒的實(shí)施方案對(duì)于核酸的遞送是尤其有用的，所述核酸包括，例如，mRNA、反義寡核苷酸、質(zhì)粒DNA、微小RNA(miRNA)、miRNA抑制劑(antagomir/antimir)、信使-RNA-干擾互補(bǔ)RNA(micRNA)、DNA、多價(jià)RNA、dicer底物RNA、互補(bǔ)DNA(cDNA)等。因此，本發(fā)明的脂質(zhì)納米顆粒和組合物可以用于通過(guò)使細(xì)胞接觸包含一種或多種本文描述的新型陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)納米顆粒，來(lái)在體外或體內(nèi)引發(fā)所需蛋白質(zhì)的表達(dá)，其中所述脂質(zhì)納米顆粒封裝或締合表達(dá)產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的核酸(例如，編碼所需蛋白質(zhì)的信使RNA或質(zhì)粒)。可選地，本發(fā)明的脂質(zhì)納米顆粒和組合物可以用于通過(guò)使細(xì)胞接觸包含一種或多種本文描述的新型陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)納米顆粒，來(lái)在體外或體內(nèi)減少靶基因和靶蛋白質(zhì)的表達(dá)，其中所述脂質(zhì)納米顆粒封裝或締合減少靶基因表達(dá)的核酸(例如，反義寡核苷酸或小干擾RNA(siRNA))。本發(fā)明的脂質(zhì)納米顆粒和組合物也可以用于單獨(dú)或結(jié)合地共遞送不同的核酸(例如mRNA和質(zhì)粒DNA)，例如可以適用于提供需要不同核酸(例如編碼適合的基因修飾酶的mRNA和并入宿主基因組的DNA片段)共同定位的作用。

用于本發(fā)明的核酸可以根據(jù)任何可用的技術(shù)來(lái)制備。對(duì)于mRNA，主要的制備方法為，但不限于酶促合成(也稱為體外轉(zhuǎn)錄)，該方法目前代表著產(chǎn)生長(zhǎng)序列特異的mRNA的最有效的方法。體外轉(zhuǎn)錄描述了由工程化的DNA模板進(jìn)行RNA分子的模板導(dǎo)向合成的方法，該工程化的DNA模板包含上游噬菌體啟動(dòng)子序列(例如，包括但不限于來(lái)自T7、T3和SP6大腸桿菌噬菌體)，其與下游編碼相關(guān)的基因的序列連接?？梢杂杀绢I(lǐng)域熟知的很多來(lái)源和適當(dāng)?shù)募夹g(shù)來(lái)制備模板DNA用于體外轉(zhuǎn)錄，所述來(lái)源和適當(dāng)?shù)募夹g(shù)包括，但不限于質(zhì)粒DNA和聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增(參見Linpinsel,J.L和Conn,G.L.,General protocols for preparation of plasmid DNA template，以及Bowman,J.C.,Azizi,B.,Lenz,T.K.,Ray,P.和Williams,L.D.,RNA in vitro transcription and RNA purification by denaturing PAGE in Recombinant and in vitro RNA syntheses Methods v.941Conn G.L.(編著),New York,N.Y.Humana Press,2012)。

使用線性化DNA模板，在存在相應(yīng)的RNA聚合酶以及腺苷、鳥苷、尿苷和胞苷核糖核苷三磷酸(rNTP)時(shí)，在支持聚合酶活性同時(shí)使得到的mRNA轉(zhuǎn)錄物可能的降解最小化的條件下，在體外發(fā)生RNA的轉(zhuǎn)錄?？梢允褂酶鞣N可商購(gòu)的試劑盒以及可商購(gòu)的試劑來(lái)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，所述試劑盒包括，但不限于RiboMax大規(guī)模RNA生產(chǎn)系統(tǒng)(Promega)、MegaScript轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life Technologies)，所述試劑包括RNA聚合酶和rNTP。mRNA體外轉(zhuǎn)錄的方法是本領(lǐng)域熟知的。(參見，例如Losick,R.,1972,In vitro transcription,Ann Rev Biochem v.41409-46；Kamakaka,R.T.和Kraus,W.L.2001.In Vitro Transcription.Current Protocols in Cell Biology.2:11.6:11.6.1-11.6.17；Beckert,B.和Masquida,B.,(2010)Synthesis of RNA by In Vitro Transcription in RNA in Methods in Molecular Biology v.703(Neilson,H.編著),New York,N.Y.Humana Press,2010；Brunelle,J.L.和Green,R.,2013,Chapter Five-In vitro transcription from plasmid or PCR-amplified DNA,Methods in Enzymology v.530,101-114；通過(guò)引用將以上全部并入本文)。

然后將所需的體外轉(zhuǎn)錄的mRNA從轉(zhuǎn)錄或相關(guān)反應(yīng)的不希望的組分(包括未并入的rNTP、蛋白質(zhì)酶、鹽、短RNA寡核苷酸等)中純化。分離mRNA轉(zhuǎn)錄物的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。熟知的程序包括苯酚/氯仿萃取或在單價(jià)陽(yáng)離子或氯化鋰的存在下用醇(乙醇、異丙醇)沉淀。另外，可以使用的純化程序的非限定性實(shí)例包括尺寸排阻色譜(Lukavsky,P.J.和Puglisi,J.D.,2004,Large-scale preparation and purification of polyacrylamide-free RNA oligonucleotides,RNA v.10,889-893)、硅基親和色譜和聚丙烯酰胺凝膠電泳(Bowman,J.C.,Azizi,B.,Lenz,T.K.,Ray,P.和Williams,L.D.,RNA in vitro transcription and RNA purification by denaturing PAGE in Recombinant and in vitro RNA syntheses Methods v.941Conn G.L.(編著),New York,N.Y.Humana Press,2012)?？梢允褂酶鞣N可商購(gòu)的試劑盒來(lái)進(jìn)行純化，所述試劑盒包括，但不限于SV總分離系統(tǒng)(Promega)以及體外轉(zhuǎn)錄清潔和濃縮試劑盒(Norgen Biotek)。

此外，雖然逆轉(zhuǎn)錄可以產(chǎn)生大量的mRNA，但產(chǎn)物可以含有大量與不希望的聚合酶活性有關(guān)的異常RNA雜質(zhì)，所述雜質(zhì)可需要從全長(zhǎng)的mRNA制備物中去除。這些包括由失敗的轉(zhuǎn)錄起始導(dǎo)致的短RNA以及由RNA依賴的RNA聚合酶活性生成的雙鏈RNA(dsRNA)，來(lái)自RNA模板的RNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄和自補(bǔ)3’延長(zhǎng)。已經(jīng)證明這些具有dsRNA結(jié)構(gòu)的污染物可以通過(guò)與真核細(xì)胞中的功能為識(shí)別特定核酸結(jié)構(gòu)并引發(fā)強(qiáng)效免疫應(yīng)答的各種先天免疫傳感器相互作用來(lái)導(dǎo)致不希望的免疫刺激活性。這可以進(jìn)而顯著減少mRNA翻譯，因?yàn)橄忍旒?xì)胞免疫應(yīng)答期間的蛋白質(zhì)合成減少。因此，已研發(fā)并為本領(lǐng)域所知曉的用于去除這些dsRNA污染物的另外的技術(shù)包括但不限于可調(diào)比例的HPLC純化(參見，例如Kariko,K.,Muramatsu,H.,Ludwig,J.和Weissman,D.,2011,Generating the optimal mRNA for therapy:HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified,protein-encoding mRNA,Nucl Acid Res,v.39el42；Weissman,D.,Pardi,N.,Muramatsu,H.和Kariko,K.,HPLC Purification of in vitro transcribed long RNA in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biology v.969(Rabinovich,P.H.編著),2013)。已報(bào)導(dǎo)經(jīng)HPLC純化的mRNA以高得多的水平翻譯，特別是在原代細(xì)胞中和體內(nèi)。

本領(lǐng)域中已描述了很多種用于改變體外轉(zhuǎn)錄的mRNA的特定性質(zhì)，并且改善其效用的修飾。這些修飾包括，但不限于對(duì)mRNA的5’末端和3’末端的修飾。內(nèi)源性真核mRNA通常含有在成熟(mature)分子的5’-端上的帽結(jié)構(gòu)，其在介導(dǎo)mRNA帽結(jié)合蛋白質(zhì)(CBP)的結(jié)合中發(fā)揮重要作用，其進(jìn)而負(fù)責(zé)增強(qiáng)細(xì)胞中的mRNA穩(wěn)定性和mRNA翻譯效率。因此，用加帽的mRNA轉(zhuǎn)錄物實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)的最高水平。5’-帽含有5’-多數(shù)核苷酸與鳥嘌呤核苷酸之間的5’-5’-三磷酸連接。綴合的鳥嘌呤核苷酸在N7位置被甲基化。另外的修飾包括多數(shù)在2’-羥基上的最后的和倒數(shù)第二的5’-核苷酸的甲基化。

多個(gè)單獨(dú)帽結(jié)構(gòu)可以用于生成體外轉(zhuǎn)錄的合成的mRNA的5’-帽。合成的mRNA的5’-加帽可以用化學(xué)帽類似物與轉(zhuǎn)錄同時(shí)進(jìn)行(即在體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程中加帽)。例如，防逆轉(zhuǎn)帽類似物(ARCA)帽含有5’-5’-三磷酸鳥嘌呤-鳥嘌呤連接，其中一個(gè)鳥嘌呤含有N7甲基以及3’-O-甲基。然而，多達(dá)20％的轉(zhuǎn)錄物在該共轉(zhuǎn)錄過(guò)程中保持未加帽，并且合成的帽類似物與真實(shí)細(xì)胞mRNA的5’-帽結(jié)構(gòu)不相同，有可能降低可譯性和細(xì)胞穩(wěn)定性?；蛘?，合成的mRNA分子也可以在轉(zhuǎn)錄后酶促地加帽。這可以生成更真實(shí)的5’-帽結(jié)構(gòu)，其在結(jié)構(gòu)上或功能上更接近地模擬內(nèi)源性5’-帽，該內(nèi)源性5’-帽具有增強(qiáng)的帽結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)合、增長(zhǎng)的半衰期、降低的對(duì)5’內(nèi)切酶的敏感性和/或減少的5’脫帽。已研發(fā)且本領(lǐng)域所熟知很多合成的5’-帽類似物以增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性和可譯性(參見，例如Grudzien-Nogalska,E.,Kowalska,J.,Su,W.,Kuhn,A.N.,Slepenkov,S.V.,Darynkiewicz,E.,Sahin,U.,Jemielity,J.和Rhoads,R.E.,Synthetic mRNAs with superior translation and stability properties in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biology v.969(Rabinovich,P.H.Ed),2013)。

在3’-末端，腺嘌呤核苷酸的長(zhǎng)鏈(poly-A尾)通常在RNA加工期間加至mRNA分子。轉(zhuǎn)錄后，轉(zhuǎn)錄物的3’端立即斷裂從而形成游離3’羥基，向該3’羥基，poly-A聚合酶在被稱為聚腺苷酸化的過(guò)程中將腺嘌呤核苷酸鏈加至RNA。poly-A尾已廣泛地表現(xiàn)出增強(qiáng)翻譯效率和mRNA的穩(wěn)定性(參見Bernstein,P.和Ross,J.,1989,Poly(A),poly(A)binding protein and the regulation of mRNA stability,Trends Bio Sci v.14373-377；Guhaniyogi,J.和Brewer,G.,2001,Regulation of mRNA stability in mammalian cells,Gene,v.265,11-23；Dreyfus,M.和Regnier,P.,2002,The poly(A)tail of mRNAs:Bodyguard in eukaryotes,scavenger in bacteria,Cell,v.l l l,611-613)。

可以使用各種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)體外轉(zhuǎn)錄的mRNA的Poly(A)加尾，所述方法包括，但不限于，將poly(T)片段克隆至DNA模板中，或者通過(guò)使用Poly(A)聚合酶在轉(zhuǎn)錄后添加。第一種情況允許體外轉(zhuǎn)錄具有限定長(zhǎng)度(取決于poly(T)片段的尺寸)的poly(A)尾的mRNA，但需要對(duì)模板的另外操作。后一種情況涉及使用催化腺嘌呤殘基在RNA的3’末端并入的poly(A)聚合酶，將poly(A)尾酶促添加至體外轉(zhuǎn)錄的mRNA，不需要對(duì)DNA模板的另外操作，但得到具有不同長(zhǎng)度poly(A)尾的mRNA?？梢允褂酶鞣N可商購(gòu)的試劑盒以及可商購(gòu)的試劑、各種ARCA帽、Poly(A)聚合酶等來(lái)進(jìn)行5’-加帽和3’-poly(A)加尾，所述試劑盒包括，但不限于Poly(A)聚合酶加尾試劑盒(EpiCenter)、mMESSAGE mMACHINE T7Ultra試劑盒和Poly(A)加尾試劑盒(Life Technologies)。

除5’帽和3’聚腺苷酸化以外，也報(bào)導(dǎo)了對(duì)體外轉(zhuǎn)錄物的其他修飾以提供與翻譯效率和穩(wěn)定性有關(guān)的益處。本領(lǐng)域熟知，病原DNA和RNA可以通過(guò)各種真核細(xì)胞內(nèi)的傳感器識(shí)別，并引發(fā)強(qiáng)效先天免疫應(yīng)答。已表現(xiàn)出，辨別致病DNA和RNA與自身DNA和RNA的能力至少部分基于結(jié)構(gòu)修飾和核苷修飾，因?yàn)槎鄶?shù)來(lái)自天然來(lái)源的核酸含有修飾的核苷。相反，體外合成的RNA缺少這些修飾，因此導(dǎo)致其為免疫刺激的，進(jìn)而可以抑制上文概述的有效mRNA翻譯。將修飾的核苷引入體外轉(zhuǎn)錄的mRNA可以用于阻止RNA傳感器的識(shí)別和激活，由此緩和這種不希望的免疫刺激活性，并且增強(qiáng)翻譯能力(translational capacity)(參見，例如Kariko,K.和Weissman,D.2007,Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA:implication for therapeutic RNA development,Curr Opin Drug Discov Devel,v.10 523-532；Pardi,N.,Muramatsu,H.,Weissman,D.,Kariko,K.,In vitro transcription of long RNA containing modified nucleosides in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation，發(fā)表于Methods in Molecular Biology v.969(Rabinovich,P.H.編著),2013)；Kariko,K.,Muramatsu,H.,Welsh,F.A.,Ludwig,J.,Kato,H.,Akira,S.,Weissman,D.,2008,Incorporation of Pseudouridine Into mRNA Yields Superior Nonimmunogenic Vector With Increased Translational Capacity and Biological Stability,Mol Ther v.16,1833-1840)。用于合成修飾的RNA的修飾的核苷和核苷酸可以使用本領(lǐng)域已知的一般方法和程序來(lái)制備、監(jiān)控和使用?？墒褂煤芏喾N核苷修飾，其可以單獨(dú)或結(jié)合其他修飾的核苷以一定程度并入體外轉(zhuǎn)錄的mRNA(參見，例如US2012/0251618)。已報(bào)導(dǎo)核苷修飾的mRNA的體外合成減小了激活免疫傳感器的能力，伴隨著增強(qiáng)了翻譯能力。

可修飾以在可譯性和穩(wěn)定性方面提供益處的mRNA的其他組分包括5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)。針對(duì)兩者的或單獨(dú)的UTR優(yōu)化(有利的5’和3’UTR可以得自細(xì)胞或病毒RNA)已顯示出增強(qiáng)了體外轉(zhuǎn)錄的mRNA的mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率(參見，例如Pardi,N.,Muramatsu,H.,Weissman,D.,Kariko,K.,In vitro transcription of long RNA containing modified nucleosides in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biology v.969(Rabinovich,P.H.編著),2013)。

除mRNA以外，其他核酸凈荷(payload)可以用于本發(fā)明。對(duì)于寡核苷酸，制備方法包括但不限于化學(xué)合成和較長(zhǎng)前體的酶促、化學(xué)裂解、上文描述的體外轉(zhuǎn)錄等。合成DNA和RNA核苷酸的方法被廣泛使用，并且為本領(lǐng)域所熟知(參見，例如，Gait,M.J.(編著)Oligonucleotide synthesis:a practical approach,Oxford[Oxfordshire],Washington,D.C.:IRL Press,1984；以及Herdewijn,P.(編著)Oligonucleotide synthesis:methods and applications,Methods in Molecular Biology,v.288(Clifton,N.J.)Totowa,N.J.:Humana Press,2005；兩者均通過(guò)引用并入本文)。

對(duì)于質(zhì)粒DNA，用于本發(fā)明的制備通常使用但不限于，在含有相關(guān)的質(zhì)粒的細(xì)菌的液體培養(yǎng)基中體外擴(kuò)張和分離質(zhì)粒DNA。相關(guān)的編碼對(duì)特定抗生素(青霉素、卡那霉素等)的抗性的質(zhì)粒內(nèi)基因的存在允許那些含有相關(guān)質(zhì)粒的細(xì)菌在含抗生素的培養(yǎng)基中選擇性地生長(zhǎng)。分離質(zhì)粒DNA的方法被廣泛使用，并且為本領(lǐng)域所熟知(參見，例如Heilig,J.,Elbing,K.L.和Brent,R(2001)Large-Scale Preparation of Plasmid DNA.Current Protocols in Molecular Biology.41:II:1.7:1.7.1-1.7.16；Rozkov,A.,Larsson,B.,S.,R.和Schmidt,S.R.(2008),Large-scale production of endotoxin-free plasmids for transient expression in mammalian cell culture.Biotechnol.Bioeng.,99:557-566；以及US6197553B1)?？梢允褂酶鞣N可商購(gòu)的試劑盒以及可商購(gòu)的試劑來(lái)進(jìn)行質(zhì)粒分離，所述試劑盒包括，但不限于Plasmid Plus(Qiagen)、GenJET plasmid MaxiPrep(Thermo)和Pure Yield MaxiPrep(Promega)試劑盒。

本發(fā)明的陽(yáng)離子脂質(zhì)、脂質(zhì)納米顆粒和包含脂質(zhì)納米顆粒的組合物、以及它們遞送諸如核酸的活性劑和治療劑以調(diào)控基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的用途，以上的各種示例性實(shí)施方案在下文進(jìn)一步詳細(xì)地描述。

如本文所使用的，除非另外指明，以下術(shù)語(yǔ)具有它們被賦予的含義。

除非上下文另外需要，在本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，詞語(yǔ)“包含(comprise)”及其變形，如“包括”和“含有”，以開放且包括的含義解釋，即，為“包括，但不限于”。

在本說(shuō)明書中，提及“一個(gè)實(shí)施方案”或“實(shí)施方案”意指結(jié)合所述實(shí)施方案描述的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性包括在至少一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中。因此，在本說(shuō)明中各處出現(xiàn)短語(yǔ)“在一個(gè)實(shí)施方案中”或“在實(shí)施方案中”不一定是全部指同一個(gè)實(shí)施方案。此外，所述特定特征、結(jié)構(gòu)或特性可以以任何適合的方式與一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案結(jié)合。

除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科技術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解相同的含義。如本說(shuō)明書和權(quán)利要求書所使用的，除非上下文另外明確指定，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)引用。

短語(yǔ)“引發(fā)所需蛋白質(zhì)的表達(dá)”指核酸增加所需蛋白質(zhì)表達(dá)的能力。為檢驗(yàn)蛋白質(zhì)表達(dá)的程度，使測(cè)試樣品(例如，表達(dá)所需蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中的細(xì)胞樣品)或測(cè)試哺乳動(dòng)物(例如，諸如人的哺乳動(dòng)物或者諸如嚙齒動(dòng)物(例如，小鼠)或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如，猴)模型的動(dòng)物模型)接觸核酸(例如，結(jié)合本發(fā)明脂質(zhì)的核酸)。將測(cè)試樣品或測(cè)試動(dòng)物中的所需蛋白質(zhì)的表達(dá)與未接觸或未施用核酸的對(duì)照樣品(例如，表達(dá)所需蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中的細(xì)胞樣品)或?qū)φ詹溉閯?dòng)物(例如，諸如人的哺乳動(dòng)物或者諸如嚙齒動(dòng)物(例如，小鼠)或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如，猴)模型的動(dòng)物模型)中的所需蛋白質(zhì)的表達(dá)相比較。當(dāng)在對(duì)照樣品或?qū)φ詹溉閯?dòng)物中存在所需蛋白質(zhì)時(shí)，對(duì)照樣品或?qū)φ詹溉閯?dòng)物中所需蛋白質(zhì)的表達(dá)可以指定為1.0的值。在特定的實(shí)施方案中，當(dāng)測(cè)試樣品或測(cè)試哺乳動(dòng)物中的所需蛋白質(zhì)表達(dá)與對(duì)照樣品或?qū)φ詹溉閯?dòng)物中的所需蛋白質(zhì)表達(dá)水平的比例大于1時(shí)，例如，約1.1、1.5、2.0、5.0或10.0時(shí)，實(shí)現(xiàn)了引發(fā)所需蛋白質(zhì)的表達(dá)。當(dāng)對(duì)照樣品或?qū)φ詹溉閯?dòng)物中不存在所需蛋白質(zhì)時(shí)，當(dāng)在測(cè)試樣品或測(cè)試哺乳動(dòng)物中檢測(cè)到任何可測(cè)水平的所需蛋白質(zhì)時(shí)，實(shí)現(xiàn)了引發(fā)所需蛋白質(zhì)的表達(dá)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解，確定樣品中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的適合的測(cè)定例如，斑點(diǎn)印跡、northern印跡、原位雜交、ELISA、免疫沉淀、酶作用和表型測(cè)定，或者基于在適當(dāng)條件下可以產(chǎn)生熒光或發(fā)光的報(bào)告蛋白的測(cè)定。

短語(yǔ)“抑制靶基因的表達(dá)”指核酸沉默、減少或抑制靶基因表達(dá)的能力。為檢驗(yàn)基因沉默的程度，使測(cè)試樣品(例如，表達(dá)靶基因的培養(yǎng)基中的細(xì)胞樣品)或測(cè)試哺乳動(dòng)物(例如，諸如人的哺乳動(dòng)物或者諸如嚙齒動(dòng)物(例如，小鼠)或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如，猴)模型的動(dòng)物模型)接觸沉默、減少或抑制靶基因表達(dá)的核酸。將測(cè)試樣品或測(cè)試動(dòng)物中的靶基因的表達(dá)與未接觸或未施用核酸的對(duì)照樣品(例如，表達(dá)靶基因的培養(yǎng)基中的細(xì)胞樣品)或?qū)φ詹溉閯?dòng)物(例如，諸如人的哺乳動(dòng)物或者諸如嚙齒動(dòng)物(例如，小鼠)或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如，猴)模型的動(dòng)物模型)中的靶基因的表達(dá)相比較。對(duì)照樣品或?qū)φ詹溉閯?dòng)物中的靶基因的表達(dá)可以指定為100％的值。在特定的實(shí)施方案中，當(dāng)測(cè)試樣品或測(cè)試哺乳動(dòng)物中的靶基因表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照樣品或?qū)φ詹溉閯?dòng)物中的靶基因表達(dá)水平為約95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或0％時(shí)，實(shí)現(xiàn)了沉默、抑制或減少靶基因的表達(dá)。換言之，相對(duì)于未接觸或未施用核酸的對(duì)照樣品或?qū)φ詹溉閯?dòng)物中的靶基因表達(dá)水平，在測(cè)試樣品或測(cè)試哺乳動(dòng)物中，所述核酸能夠沉默、減少或抑制靶基因表達(dá)的至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。確定靶基因表達(dá)水平的適合的測(cè)定包括，但不限于，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行的蛋白質(zhì)或mRNA水平的檢驗(yàn)，所述技術(shù)例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的斑點(diǎn)印跡、northern印跡、原位雜交、ELISA、免疫沉淀、酶作用以及表型測(cè)定。

活性劑或治療劑(例如治療性核酸)的“有效量”或“治療有效量”是足以產(chǎn)生所需效果的量，所述所需效果例如，相比不存在核酸時(shí)檢測(cè)的靶序列的正常表達(dá)水平，對(duì)靶序列表達(dá)的增加或抑制。當(dāng)檢測(cè)到任何可測(cè)水平的在不存在核酸時(shí)不存在的表達(dá)產(chǎn)物時(shí)，實(shí)現(xiàn)了靶序列表達(dá)的增加。在與核酸接觸前，表達(dá)產(chǎn)物以一定水平存在的情況下，當(dāng)使用諸如mRNA的核酸得到的值的提高倍數(shù)相對(duì)于對(duì)照為約1.05、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.75、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100、250、500、750、1000、5000、10000或更大時(shí)，實(shí)現(xiàn)了表達(dá)增加。當(dāng)使用諸如反義寡核苷酸的核酸得到的值相對(duì)于對(duì)照為約95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或0％時(shí)，實(shí)現(xiàn)了靶基因或靶序列表達(dá)的抑制。測(cè)量靶基因或靶序列表達(dá)的適合的測(cè)定包括，例如，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行的蛋白質(zhì)或RNA水平的檢驗(yàn)，所述技術(shù)例如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的斑點(diǎn)印跡、northern印跡、原位雜交、ELISA、免疫沉淀、酶作用、適合的報(bào)告蛋白的熒光或發(fā)光以及表型測(cè)定。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸”指含有至少兩個(gè)單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，并且包括DNA、RNA及其雜合體。DNA可以是以下形式：反義分子、質(zhì)粒DNA、cDNA、PCR產(chǎn)物或載體。RNA可以是以下形式：小發(fā)夾RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)、反義RNA、miRNA、micRNA、多價(jià)RNA、dicer底物RNA或病毒RNA(vRNA)，及其組合。核酸包括含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接的核酸，所述核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或連接是合成的、天然存在的和非天然存在的，并且具有與參考核酸(reference nucleic acid)類似的結(jié)合性質(zhì)。這類類似物的實(shí)例包括，但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2’-O-甲基核糖核苷酸以及肽-核酸(PNA)。除非特別限定，該術(shù)語(yǔ)涵蓋包含已知的具有與參考核酸類似的結(jié)合性質(zhì)的天然核苷酸的類似物的核酸。除非另外表明，特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變體(例如，簡(jiǎn)并密碼子取代)、等位基因、直系同源物、單核苷酸多態(tài)性、和互補(bǔ)序列以及明確表明的序列。特別地，可以通過(guò)生成一個(gè)或多個(gè)所選(或全部)密碼子的三位被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來(lái)實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)并密碼子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.,19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.,260:2605-2608(1985)；Rossolini等人,Mol.Cell.Probes,8:91-98(1994))。“核苷酸”含有糖(脫氧核糖(DNA)或核糖(RNA))、堿基和磷酸基團(tuán)。核苷酸通過(guò)磷酸基團(tuán)連接在一起?！皦A基”包括嘌呤和嘧啶，其進(jìn)一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然類似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于，配置新反應(yīng)基團(tuán)的修飾，所述新反應(yīng)基團(tuán)例如，但不限于，胺、醇、硫醇、羧化物和烴基鹵化物。

術(shù)語(yǔ)“基因”指包含產(chǎn)生多肽或前體多肽所必須的部分長(zhǎng)度或全長(zhǎng)的編碼序列的核酸(例如，DNA或RNA)序列。

如本文所使用的，“基因產(chǎn)物”指諸如RNA轉(zhuǎn)錄物或多肽的基因產(chǎn)物。

術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)”指一組有機(jī)化合物，其包括但不限于脂肪酸的酯，并且特征通常為在水中具有差的溶解性，但在很多種有機(jī)溶劑中可溶。它們通常分為至少三類：(1)“簡(jiǎn)單脂質(zhì)”，其包括脂肪和油以及蠟；(2)“化合物脂質(zhì)”，其包括磷脂和糖脂；以及(3)“衍生脂質(zhì)”，例如甾族化合物。

“甾族化合物”為包含以下碳骨架的化合物：

甾族化合物的非限定性實(shí)例包括膽甾醇等。

“陽(yáng)離子脂質(zhì)”指能夠帶正電的脂質(zhì)。示例性的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括一種或多種帶有正電荷的胺基團(tuán)。優(yōu)選的陽(yáng)離子脂質(zhì)是可電離的，以便它們可以根據(jù)pH值以帶正電的形式或中性形式存在。陽(yáng)離子脂質(zhì)的電離影響脂質(zhì)納米顆粒在不同pH條件下的表面電荷。這種電荷狀態(tài)可以影響血漿蛋白質(zhì)吸收、血液清除和組織分布(Semple,S.C.等人,Adv.Drug Deliv Rev 32:3-17(1998))以及形成核內(nèi)體溶解(endosomolytic)非雙層結(jié)構(gòu)的能力(Hafez,I.M.等人,Gene Ther 8:1188-1196(2001))，對(duì)于核酸的細(xì)胞內(nèi)遞送是至關(guān)重要的。

術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)納米顆?！敝冈诩{米量級(jí)上具有至少一個(gè)維度(例如，1nm至1,000nm)，包含一種或多種式(I)的化合物或其他特定陽(yáng)離子脂質(zhì)的顆粒。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒包含在可用于將諸如核酸(例如，mRNA)的活性劑或治療劑遞送至相關(guān)的靶位點(diǎn)(例如，細(xì)胞、組織、器官、腫瘤等)的制劑中。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)納米顆粒包含核酸。這類脂質(zhì)納米顆粒通常包含式(I)的化合物以及一種或多種選自中性脂質(zhì)、帶電脂質(zhì)、甾族化合物和聚合物綴合的脂質(zhì)的賦形劑。在一些實(shí)施方案中，諸如核酸的活性劑或治療劑可以封裝于脂質(zhì)納米顆粒的脂質(zhì)部分中，或者封裝于由脂質(zhì)納米顆粒的一些或全部脂質(zhì)部分包裹的水性空間中，從而保護(hù)保護(hù)其不被酶促降解，或者不受到由宿主生物體或細(xì)胞的機(jī)制引發(fā)的其他的不希望的作用，例如不良的免疫應(yīng)答。

在各種實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒具有以下的平均直徑：約30nm至約150nm、約40nm至約150nm、約50nm至約150nm、約60nm至約130nm、約70nm至約110nm、約70nm至約100nm、約80nm至約100nm、約90nm至約100nm、約70至約90nm、約80nm至約90nm、約70nm至約80nm、或者約30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm，并且是基本無(wú)毒的。在某些實(shí)施方案中，核酸當(dāng)存在于脂質(zhì)納米顆粒時(shí)，其在水溶液中抵抗被核酸酶降解。在例如，美國(guó)專利公開第2004/0142025、2007/0042031號(hào)和PCT公開第WO 2013/016058和WO 2013/086373號(hào)中公開了包含核酸的脂質(zhì)納米顆粒及其制備方法，其全部公開內(nèi)容為了所有目的通過(guò)引用整體并入本文。

如本文所使用的，“封裝的脂質(zhì)”指提供完全封裝、部分封裝、或其兩種封裝的諸如核酸(例如，mRNA)的活性劑或治療劑的脂質(zhì)納米顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸(例如，mRNA)完全封裝于脂質(zhì)納米顆粒中。

術(shù)語(yǔ)“聚合物綴合的脂質(zhì)”指包含脂質(zhì)部分和聚合物部分的分子。聚合物綴合的脂質(zhì)的實(shí)例為聚乙二醇化的脂質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“聚乙二醇化的脂質(zhì)”指包含脂質(zhì)部分和聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化的脂質(zhì)是本領(lǐng)域已知的，并且包括l-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)等。

術(shù)語(yǔ)“中性脂質(zhì)”指在所選pH值下以不帶電形式或中性兩性離子形式存在的多種脂質(zhì)物質(zhì)中的任一種。在生理pH下，這類脂質(zhì)包括但不限于，磷脂酰膽堿，如l,2-二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DSPC)、l,2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DPPC)、l,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DMPC)、1-棕櫚酰基-2-油?；?sn-甘油基-3-磷酸膽堿(POPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DOPC)；磷脂酰乙醇胺，如l,2-二油?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、鞘磷脂(SM)、神經(jīng)酰胺；甾族化合物，如甾醇類及其衍生物。中性脂質(zhì)可以是合成的或天然衍生的。

術(shù)語(yǔ)“帶電的脂質(zhì)”指不受有用的生理范圍內(nèi)的pH值(例如pH～3至pH～9)約束，以帶正電或帶負(fù)電的形式存在的多種脂質(zhì)物質(zhì)中的任一種。帶電的脂質(zhì)可以是合成的或天然衍生的。帶電的脂質(zhì)的實(shí)例包括磷脂酰絲氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、甾醇半琥珀酸酯、二烴基三甲基銨丙烷(例如DOTAP、DOTMA)、二烴基二甲基氨基丙烷、乙基磷酸膽堿、二甲基氨基乙烷氨基甲?；薮?例如DC-Choi)。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“水溶液”指包含水的組合物。

就核酸-脂質(zhì)納米顆粒而言，“血清穩(wěn)定的”意指核苷酸在暴露于血清后或在暴露于會(huì)顯著降解游離DNA或RNA的核酸酶測(cè)定后，不會(huì)顯著降解。適合的測(cè)定包括，例如，標(biāo)準(zhǔn)的血清測(cè)定、DNA酶測(cè)定或RNA酶測(cè)定。

如本文所使用的，“全身性遞送”指可以導(dǎo)致活性劑在生物體內(nèi)廣泛暴露的治療性產(chǎn)物的遞送。一些施用技術(shù)可以導(dǎo)致某些試劑的全身性遞送，但不會(huì)全身性遞送其他試劑。全身性遞送意味著有用量的，優(yōu)選治療量的試劑暴露于身體的多數(shù)部位。脂質(zhì)納米顆粒的全身性遞送可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方式進(jìn)行，包括，例如，靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)遞送。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒的全身性遞送通過(guò)靜脈內(nèi)遞送。

如本文所使用的，“局部遞送”指將活性劑直接遞送至生物體內(nèi)的靶位點(diǎn)。例如，可以通過(guò)在諸如腫瘤的疾病位點(diǎn)，諸如炎癥位點(diǎn)的其他靶位點(diǎn)，或諸如肝、心、胰腺、腎等靶器官中直接注射來(lái)局部遞送試劑。局部遞送也可以包括局部應(yīng)用或局部注射技術(shù)，例如肌內(nèi)、皮下或皮內(nèi)注射。局部遞送不妨礙全身性的藥理學(xué)作用。

“烴基”指僅由碳原子和氫原子組成的直鏈或支鏈的烴鏈自由基，其為飽和的或不飽和的(即，含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵和/或三鍵)，含有1至24個(gè)碳原子(C₁-C₂₄烴基)、1至12個(gè)碳原子(C₁-C₁₂烴基)、1至8個(gè)碳原子(C₁-C₈烴基)或1至6個(gè)碳原子(C₁-C₆烴基)，并且其與分子的剩余部分通過(guò)單鍵連接，例如，甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(異丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。除非在本說(shuō)明書中另外明確示出，烴基是任選取代的。

“環(huán)烴基”或“碳環(huán)”指僅有碳原子和氫原子組成的穩(wěn)定的非芳香單環(huán)或多環(huán)烴自由基，其可以包括稠合或橋接的環(huán)系統(tǒng)，含有3至15個(gè)碳原子，優(yōu)選含有3至10個(gè)碳原子，并且其為飽和的或不飽和的，并且通過(guò)單鍵與分子的剩余部分連接。單環(huán)自由基包括，例如，環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。多環(huán)自由基包括，例如，金剛烷基、降冰片基、十氫化萘基、7,7-二甲基-雙環(huán)[2.2.1]庚基等。除非在本說(shuō)明書中另外明確示出，環(huán)烴基是任選取代的。

“雜環(huán)基”或“雜環(huán)”指2至12個(gè)碳原子和1至6個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子組成的穩(wěn)定的3元至18元非芳香環(huán)自由基。除非在本說(shuō)明書中另外明確示出，雜環(huán)基自由基可以是單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)或四環(huán)的環(huán)系統(tǒng)，這些環(huán)系統(tǒng)可以包括稠合或橋接的環(huán)系統(tǒng)；并且所述雜環(huán)基自由基中的氮、碳或硫原子可以任選地被氧化；所述氮原子可以任選地季銨化；并且所述雜環(huán)基自由基可以是部分或完全飽和的。這類雜環(huán)基自由基的實(shí)例包括，但不限于，二氧戊環(huán)基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氫異喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、異噻唑烷基、異噁唑烷基、嗎啉基、八氫吲哚基、八氫異吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎寧環(huán)基、噻唑烷基、四氫呋喃基、三噻烷基、四氫吡喃基、硫代嗎啉基(thiomorpholinyl)、硫嗎啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代-硫代嗎啉基和1,1-二氧代-硫代嗎啉基。除非在本說(shuō)明書中另外明確示出，雜環(huán)基可以任選地取代。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“取代的”意指任何上述基團(tuán)(例如，烴基、環(huán)烴基或雜環(huán)基)其中至少一個(gè)氫原子被與非氫原子連接的鍵取代，該非氫原子例如，但不限于：諸如F、Cl、Br和I的鹵素原子；氧代基團(tuán)(＝O)；羥基(-OH)；烴氧基(-OR^a，其中R^a為C₁-C₁₂烴基或環(huán)烴基)；羧基(-OC(＝O)R^a或-C(＝O)OR^a，其中R^a為H、C₁-C₁₂烴基或環(huán)烴基)；胺基團(tuán)(-NR^aR^b，其中R^a和R^b各自獨(dú)立地為H、C₁-C₁₂烴基或環(huán)烴基)；C₁-C₁₂烴基；和環(huán)烴基。在一些實(shí)施方案中，所述取代基為C₁-C₁₂烴基。在其他實(shí)施方案中，所述取代基為環(huán)烴基。在其他實(shí)施方案中，所述取代基為鹵代基團(tuán)，例如氟代。在其他實(shí)施方案中，所述取代基為氧代基團(tuán)。在其他實(shí)施方案中，所述取代基為羥基。在其他實(shí)施方案中，所述取代基為烴氧基。在其他實(shí)施方案中，所述取代基為羧基。在其他實(shí)施方案中，所述取代基為胺基團(tuán)。

“任選的”或“任選地”(例如，任選取代的)意味著其后描述的情況事件可發(fā)生也可不發(fā)生，并且該描述包括所述事件或情況發(fā)生的實(shí)例以及所述事件或情況不發(fā)生的實(shí)例。例如，“任選取代的烴基”意味著所述烴基自由基可以被取代也可以不被取代，并且該描述包括取代的烴基自由基和不含取代的烴基自由基。

“前藥”意在表明在生理?xiàng)l件下或通過(guò)溶劑解可以轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的生物活性化合物的化合物。因此，術(shù)語(yǔ)“前藥”指藥物可接受的本發(fā)明化合物的代謝前體。前藥在對(duì)有此需要的對(duì)象施用時(shí)可以是惰性的，但在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的活性化合物。前藥通常在體內(nèi)快速轉(zhuǎn)化得到本發(fā)明的母體化合物，例如，通過(guò)在血液中水解。所述前藥化合物通常提供在哺乳動(dòng)物生物體內(nèi)的溶解性、組織相容性或延遲釋放的優(yōu)點(diǎn)(參見，Bundgard,H.,Design of Prodrugs(1985),7-9,21-24頁(yè)(Elsevier,阿姆斯特丹))。在Higuchi,T.等人,A.C.S.Symposium Series,第14卷，以及Bioreversible Carriers in Drug Design,編著Edward B.Roche,American Pharmaceutical Association和Pergamon Press,1987中提供了對(duì)前藥的討論。

術(shù)語(yǔ)“前藥”還意在包括任何共價(jià)鍵合的載體，當(dāng)這類前藥對(duì)哺乳動(dòng)物對(duì)象施用時(shí)，所述載體在體內(nèi)釋放本發(fā)明的活性化合物。本發(fā)明化合物的前藥可以通過(guò)修飾本發(fā)明化合物中存在的官能團(tuán)來(lái)制備，通過(guò)這種方式，所述修飾通過(guò)常規(guī)操作或在體內(nèi)裂解成為本發(fā)明的母體化合物。前藥包括以下本發(fā)明化合物：其中羥基、氨基或巰基與任何基團(tuán)鍵合，當(dāng)本發(fā)明化合物的前藥對(duì)哺乳動(dòng)物對(duì)象施用時(shí)，裂解分別形成游離羥基、游離氨基或游離巰基。前藥的實(shí)例包括，但不限于，本發(fā)明化合物中胺官能團(tuán)的醇或酰胺衍生物的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物等。

本文公開的本發(fā)明還意在涵蓋所有通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)原子取代成為具有不同原子量或質(zhì)量數(shù)的原子而被同位素標(biāo)記的式(I)或式(II)化合物的藥物可接受的化合物?？刹⑷胨_化合物的同位素的實(shí)例包括氫、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素，分別例如²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F、³⁶Cl、¹²³I和¹²⁵I。這些放射性標(biāo)記的化合物可以有用于：通過(guò)表征，例如，作用的位點(diǎn)或方式，或與藥理學(xué)重要的作用位點(diǎn)的結(jié)合親和力來(lái)幫助確定或測(cè)量化合物的效果。某些同位素標(biāo)記的結(jié)構(gòu)(I)或(II)的化合物，例如，那些并入放射性同位素的結(jié)構(gòu)(I)或(II)的化合物，在藥物和/或底物組織分布研究中是有用的。放射性同位素氚(即，³H)和碳-14(即，¹⁴C)，由于它們易于并入并且有現(xiàn)有的檢測(cè)手段，對(duì)于這一目的是特別有用的。

用諸如氘(即，²H)的更重的同位素取代，可以提供歸因于更強(qiáng)的代謝穩(wěn)定性的某些治療優(yōu)點(diǎn)，例如，增長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期或減少的劑量需要量，并且因此在一些情況下可以是優(yōu)選的。

用正電子發(fā)射同位素(例如¹¹C、¹⁸F、¹⁵O和¹³N)取代，在用于檢驗(yàn)底物受體占有率的正電子發(fā)射斷層掃描(PET)研究中可以是有用的。通常可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)，或者通過(guò)與下文闡述的制備和實(shí)施例中所描述類似的方法，使用適當(dāng)?shù)耐凰貥?biāo)記的試劑代替先前使用的未標(biāo)記的試劑來(lái)制備同位素標(biāo)記的結(jié)構(gòu)(I)或(II)的化合物。

本文公開的本發(fā)明還意在涵蓋所公開化合物的體內(nèi)代謝產(chǎn)物。這類產(chǎn)物可以得自，例如，所施用化合物的，主要由于酶促過(guò)程的氧化、還原、水解、酰胺化、酯化等。因此，本發(fā)明包括由以下方法所產(chǎn)生的化合物：將本發(fā)明的化合物對(duì)哺乳動(dòng)物施用足以產(chǎn)生其代謝產(chǎn)物的時(shí)間。這類產(chǎn)物通常通過(guò)以下方式來(lái)確認(rèn)：將放射性標(biāo)記的本發(fā)明化合物以可測(cè)劑量對(duì)諸如大鼠、小鼠、豚鼠、猴的動(dòng)物施用，或者對(duì)人施用，持續(xù)足夠的時(shí)間以允許代謝發(fā)生，并將其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物從尿、血液或其他生物樣品分離。

“穩(wěn)定的化合物”和“穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)”意在表明足夠穩(wěn)定以便在從反應(yīng)混合物分離至有用純度以及在配制成為有效治療劑的過(guò)程中得以保留的化合物。

“哺乳動(dòng)物”包括人；還包括家養(yǎng)動(dòng)物，例如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和家庭寵物(例如，貓、狗、豬、牛、綿羊、山羊、馬、兔)；以及非家養(yǎng)動(dòng)物，例如野生動(dòng)物等。

“藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑”包括但不限于：經(jīng)美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)，用于人或家養(yǎng)動(dòng)物可接受的任何佐劑、載體、賦形劑、助流劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染色/著色劑、增味劑、表面活性劑、潤(rùn)濕劑、分散劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、溶劑或乳化劑。

“藥物可接受的鹽”包括酸加成鹽和堿加成鹽。

“藥物可接受的酸加成鹽”指保留游離堿的生物效果和性質(zhì)，不是生物上或其他方面不良的，并且與以下無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸形成的那些鹽，所述無(wú)機(jī)酸例如，但不限于鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，而所述有機(jī)酸例如，但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗壞血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟腦酸、樟腦-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、檸檬酸、環(huán)拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、甲酸、富馬酸、半乳糖二酸、龍膽酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、馬尿酸、異丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、馬來(lái)酸、蘋果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羥基-2-萘甲酸、煙酸、油酸、乳清酸、草酸、棕櫚酸、雙羥萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水楊酸、4-氨基水楊酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、對(duì)甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。

“藥物可接受的堿加成鹽”指保留游離酸的非生物上或其他方面不良的生物效果和性質(zhì)的那些鹽。這些鹽通過(guò)無(wú)機(jī)堿或有機(jī)堿與游離酸的加成來(lái)制備。來(lái)源于無(wú)機(jī)堿的鹽包括，但不限于，鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽、鋁鹽等。優(yōu)選的無(wú)機(jī)鹽為銨鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽和鎂鹽。來(lái)源于有機(jī)堿的鹽包括，但不限于，下列伯胺、仲胺和叔胺，取代的胺(包括天然存在的取代的胺)、環(huán)狀胺和堿性離子交換樹脂的鹽：例如氨、異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二環(huán)己基胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因、海巴明(hydrabamine)、膽堿、甜菜堿、苯乙芐胺(benethamine)、芐星青霉素(benzathine)、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可堿、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺樹脂等。特別優(yōu)選的有機(jī)堿為異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二環(huán)己基胺、膽堿和咖啡因。

結(jié)晶通常產(chǎn)生本發(fā)明化合物的溶劑化物。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“溶劑化物”指包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明化合物分子與一個(gè)或多個(gè)溶劑分子的聚集物。所述溶劑可以是水，在這種情況下所述溶劑化物可以是水合物?；蛘?，所述溶劑可以是有機(jī)溶劑。因此，本發(fā)明的化合物可以以水合物存在，包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等，以及以相應(yīng)的溶劑化形式存在。本發(fā)明的化合物可以是真正的溶劑化物，而在其他情況下，本發(fā)明的化合物可以僅保留偶生的(adventitious)水，或者是水加上偶生溶劑的混合物。

“藥物組合物”指本發(fā)明化合物與本領(lǐng)域通常公認(rèn)用于向哺乳動(dòng)物(例如，人)遞送生物活性化合物的介質(zhì)的制劑。因此這類介質(zhì)包括所有藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

“有效量”或“治療有效量”指當(dāng)對(duì)哺乳動(dòng)物(優(yōu)選為人)施用時(shí)，足以產(chǎn)生對(duì)哺乳動(dòng)物(優(yōu)選為人)的治療的本發(fā)明化合物的量。構(gòu)成“治療有效量”的本發(fā)明脂質(zhì)納米顆粒的量將取決于化合物、病況及其嚴(yán)重性、施用方式以及待治療哺乳動(dòng)物的年齡，但可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)其自身的知識(shí)和本公開內(nèi)容來(lái)常規(guī)確定。

本文使用的“治療(Treating)”或“治療(treatment)”涵蓋針對(duì)患有相關(guān)的疾病或病況的哺乳動(dòng)物(優(yōu)選為人)的所述相關(guān)的疾病或病況的治療，并且包括：

(i)預(yù)防疾病或病況在哺乳動(dòng)物中出現(xiàn)，尤其是，當(dāng)這些哺乳動(dòng)物傾向患有所述病況，但尚未被診斷為患有所述病況時(shí)；

(ii)抑制所述疾病或病況，即，控制其發(fā)展；

(iii)減輕所述疾病或病況，即，使所述疾病或病況消退；或者

(iv)減輕由所述疾病或病況導(dǎo)致的癥狀，即，在不解決根本疾病或病況的情況下減輕疼痛。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“疾病”和“病況”可以交換使用，或者可以是不同的，因?yàn)樘囟ǖ募膊』虿r可能沒(méi)有已知的病原體(因此尚未找出病因)，因此尚未被認(rèn)為是疾病，而僅作為不希望的病況或綜合征，其中臨床醫(yī)生已經(jīng)在一定程度上鑒定了特定組的癥狀。

本發(fā)明的化合物或其藥物可接受的鹽可以含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心，并且可以由此產(chǎn)生對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體和其他立體異構(gòu)形式，對(duì)于氨基酸，其可以根據(jù)絕對(duì)立體化學(xué)定義為(R)-或(S)-，或者定義為(D)-或(L)-。本發(fā)明意在包括所有這些可能的異構(gòu)體，以及其外消旋形式和光學(xué)純的形式。光學(xué)活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-、或(D)-和(L)-異構(gòu)體可以使用手性合成子或手性試劑來(lái)制備，或者使用常規(guī)技術(shù)，例如色譜法和分級(jí)結(jié)晶來(lái)拆分。用于制備/分離單一對(duì)映異構(gòu)體的常規(guī)技術(shù)包括由適合的光學(xué)純前體手性合成，或者使用，例如，手性高壓液相層析法(HPLC)的外消旋體(或鹽或衍生物的外消旋體)的拆分。當(dāng)本文描述的化合物含有烯族雙鍵或其他幾何不對(duì)稱中心時(shí)，除非另外指定，意指該化合物包括E型和Z型幾何異構(gòu)體。同樣地，也意在包括所有的互變異構(gòu)形式。

“立體異構(gòu)體”指由相同的鍵連接的相同原子組成，但具有不同三維結(jié)構(gòu)的化合物，其不可互變。本發(fā)明涵蓋各種立體異構(gòu)體及其混合物，并且包括“對(duì)映異構(gòu)體”，所述對(duì)映異構(gòu)體指分子互為不可重疊的(nonsuperimposeable)鏡像的兩個(gè)立體異構(gòu)體。

“互變異構(gòu)體”指質(zhì)子從分子的一個(gè)原子轉(zhuǎn)移至同一分子的另一個(gè)原子。本發(fā)明包括任何所述化合物的互變異構(gòu)體。

化合物

一方面，本發(fā)明提供新型脂質(zhì)化合物，其能夠與其他脂質(zhì)組分(例如中性脂質(zhì)、帶電脂質(zhì)、甾族化合物和/或聚合物綴合的脂質(zhì))結(jié)合形成具有寡核苷酸的脂質(zhì)納米顆粒。不希望受理論束縛，認(rèn)為這些脂質(zhì)納米顆粒保護(hù)寡核苷酸不在血清中降解，并且在體外和體內(nèi)提供對(duì)細(xì)胞的寡核苷酸有效遞送。

在一個(gè)實(shí)施方案中，脂質(zhì)化合物具有式(I)的結(jié)構(gòu)：

或其藥物可接受的鹽、互變異構(gòu)體、前藥或立體異構(gòu)體，其中：

L¹和L²各自獨(dú)立地為–O(C＝O)-、-(C＝O)O-或碳-碳雙鍵；

R^1a和R^1b在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地(a)為H或C₁-C₁₂烴基，或(b)R^1a為H或C₁-C₁₂烴基，并且R^1b連同其連接的碳原子與相鄰的R^1b連同其連接的碳原子一起以形成碳-碳雙鍵；

R^2a和R^2b在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地(a)為H或C₁-C₁₂烴基，或(b)R^2a為H或C₁-C₁₂烴基，并且R^2b連同其連接的碳原子結(jié)合相鄰的R^2b及其連接的碳原子，以形成碳-碳雙鍵；

R^3a和R^3b在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為(a)H或C₁-C₁₂烴基，或(b)R^3a為H或C₁-C₁₂烴基，并且R^3b連同其連接的碳原子結(jié)合相鄰的R^3b及其連接的碳原子，以形成碳-碳雙鍵；

R^4a和R^4b在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地(a)為H或C₁-C₁₂烴基，或(b)R^4a為H或C₁-C₁₂烴基，并且R^4b連同其連接的碳原子結(jié)合相鄰的R^4b及其連接的碳原子，以形成碳-碳雙鍵；

R⁵和R⁶各自獨(dú)立地為甲基或環(huán)烴基；

R⁷在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為H或C₁-C₁₂烴基；

R⁸和R⁹各自獨(dú)立地為未取代的C₁-C₁₂烴基；或者R⁸和R⁹，連同其連接的氮原子，一起形成包含一個(gè)氮原子的5元、6元或7元雜環(huán)；

a和d各自獨(dú)立地為0至24的整數(shù)；

b和c各自獨(dú)立地為1至24的整數(shù)；并且

e為1或2。

在某些式(I)化合物的實(shí)施方案中，R^1a、R^2a、R^3a或R^4a中的至少一個(gè)為C₁-C₁₂烴基，或者L¹或L²中的至少一個(gè)為–O(C＝O)-或–(C＝O)O-。在其他實(shí)施方案中，R^1a和R^1b當(dāng)a為6時(shí)不為異丙基，或當(dāng)a為8時(shí)不為正丁基。

在其他實(shí)施方案中，R^1a、R^2a、R^3a或R^4a中的至少一個(gè)為C₁-C₁₂烴基，或者L¹或L²中的至少一個(gè)為–O(C＝O)-或–(C＝O)O-；并且

R^1a和R^1b當(dāng)a為6時(shí)不為異丙基，或當(dāng)a為8時(shí)不為正丁基。

在式I的化合物中，L¹或L²中的任一個(gè)可以為-O(C＝O)-或碳-碳雙鍵。L¹和L²可以各自為-O(C＝O)-，或者可以各自為碳-碳雙鍵。

在一些實(shí)施方案中，L¹或L²之一為-O(C＝O)-。在其他實(shí)施方案中，L¹和L²均為-O(C＝O)-。

在一些實(shí)施方案中，L¹或L²之一為-(C＝O)O-。在其他實(shí)施方案中，L¹和L²均為-(C＝O)O-。

在一些實(shí)施方案中，L¹或L²之一為碳-碳雙鍵。在其他實(shí)施方案中，L¹和L²均為碳-碳雙鍵。

在其他實(shí)施方案中，L¹或L²之一為-O(C＝O)-，并且L¹或L²中的另一個(gè)為-(C＝O)O-。在更多的實(shí)施方案中，L¹或L²之一為-O(C＝O)-，并且L¹或L²中的另一個(gè)為碳-碳雙鍵。在更多的實(shí)施方案中，L¹或L²之一為-(C＝O)O-，并且L¹或L²中的另一個(gè)為碳-碳雙鍵。

應(yīng)理解“碳-碳”雙鍵指以下結(jié)構(gòu)之一：

其中R^a和R^b在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為H或取代基。例如，在一些實(shí)施方案中，R^a和R^b在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為H、C₁-C₁₂烴基或環(huán)烴基，例如H或C₁-C₁₂烴基。

在其他實(shí)施方案中，脂質(zhì)化合物具有以下結(jié)構(gòu)(Ia)：

在其他實(shí)施方案中，脂質(zhì)化合物具有以下結(jié)構(gòu)(Ib)：

在其他實(shí)施方案中，脂質(zhì)化合物具有以下結(jié)構(gòu)(Ic)：

在某些前述實(shí)施方案中，a、b、c和d各自獨(dú)立地為2至12的整數(shù)或4至12的整數(shù)。在其他實(shí)施方案中，a、b、c和d各自獨(dú)立地為8至12的整數(shù)或5至9的整數(shù)。在某一些實(shí)施方案中，a為0。在一些實(shí)施方案中，a為1。在其他實(shí)施方案中，a為2。在更多的實(shí)施方案中，a為3。在其他實(shí)施方案中，a為4。在一些實(shí)施方案中，a為5。在其他實(shí)施方案中，a為6。在更多的實(shí)施方案中，a為7。在其他實(shí)施方案中，a為8。在一些實(shí)施方案中，a為9。在其他實(shí)施方案中，a為10。在更多的實(shí)施方案中，a為11。在其他實(shí)施方案中，a為12。在一些實(shí)施方案中，a為13。在其他實(shí)施方案中，a為14。在更多的實(shí)施方案中，a為15。在其他實(shí)施方案中，a為16。

在一些實(shí)施方案中，b為1。在其他實(shí)施方案中，b為2。在更多的實(shí)施方案中，b為3。在其他實(shí)施方案中，b為4。在一些實(shí)施方案中，b為5。在其他實(shí)施方案中，b為6。在更多的實(shí)施方案中，b為7。在其他實(shí)施方案中，b為8。在一些實(shí)施方案中，b為9。在其他實(shí)施方案中，b為10。在更多的實(shí)施方案中，b為11。在其他實(shí)施方案中，b為12。在一些實(shí)施方案中，b為13。在其他實(shí)施方案中，b為14。在更多的實(shí)施方案中，b為15。在其他實(shí)施方案中，b為16。

在一些實(shí)施方案中，c為1。在其他實(shí)施方案中，c為2。在更多的實(shí)施方案中，c為3。在其他實(shí)施方案中，c為4。在一些實(shí)施方案中，c為5。在其他實(shí)施方案中，c為6。在更多的實(shí)施方案中，c為7。在其他實(shí)施方案中，c為8。在一些實(shí)施方案中，c為9。在其他實(shí)施方案中，c為10。在更多的實(shí)施方案中，c為11。在其他實(shí)施方案中，c為12。在一些實(shí)施方案中，c為13。在其他實(shí)施方案中，c為14。在更多的實(shí)施方案中，c為15。在其他實(shí)施方案中，c為16。

在某一些實(shí)施方案中，d為0。在一些實(shí)施方案中，d為1。在其他實(shí)施方案中，d為2。在更多的實(shí)施方案中，d為3。在其他實(shí)施方案中，d為4。在一些實(shí)施方案中，d為5。在其他實(shí)施方案中，d為6。在更多的實(shí)施方案中，d為7。在其他實(shí)施方案中，d為8。在一些實(shí)施方案中，d為9。在其他實(shí)施方案中，d為10。在更多的實(shí)施方案中，d為11。在其他實(shí)施方案中，d為12。在一些實(shí)施方案中，d為13。在其他實(shí)施方案中，d為14。在更多的實(shí)施方案中，d為15。在其他實(shí)施方案中，d為16。

在一些其他不同實(shí)施方案中，a和d相同。在一些其他實(shí)施方案中，b和c相同。在一些其他特定實(shí)施方案中，a和d相同，并且b和c相同。

a和b的總和以及c和d的總和是可變因素，以獲得具有所需性質(zhì)的脂質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇a和b使得它們的總和為14至24的整數(shù)。在其他實(shí)施方案中，選擇c和d使得它們的總數(shù)為14至24的整數(shù)。在其他實(shí)施方案中，a和b的總數(shù)與c和d的總數(shù)相同。例如，在一些實(shí)施方案中，a和b的總數(shù)與c和d的總數(shù)是相同的，其可為從14至24的整數(shù)。在更多的實(shí)施方案中，選擇a、b、c和d使得a和b的總數(shù)以及c和d的總數(shù)為12或更大。

在一些實(shí)施方案中，e為1。在其他實(shí)施方案中，e為2。

R^1a、R^2a、R^3a和R^4a處的取代基未做特別限定。在某些實(shí)施方案中，R^1a、R^2a、R^3a和R^4a在每次出現(xiàn)時(shí)為H。在某些其他實(shí)施方案中，R^1a、R^2a、R^3a和R^4a中的至少一個(gè)為C₁-C₁₂烴基。在某些其他實(shí)施方案中，R^1a、R^2a、R^3a和R^4a中的至少一個(gè)為C₁-C₈烴基。在某些其他實(shí)施方案中，R^1a、R^2a、R^3a和R^4a中的至少一個(gè)為C₁-C₆烴基。在一些前述實(shí)施方案中，所述C₁-C₈烴基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正己基或正辛基。

在某些前述實(shí)施方案中，R^1a、R^1b、R^4a和R^4b在每次出現(xiàn)時(shí)為C₁-C₁₂烴基。

在其他前述實(shí)施方案中，R^1b、R^2b、R^3b和R^4b中的至少一個(gè)為H，或者R^1b、R^2b、R^3b和R^4b在每次出現(xiàn)時(shí)為H。

在某些前述實(shí)施方案中，R^1b連同其連接的碳原子結(jié)合相鄰的R^1b及其連接的碳原子，以形成碳-碳雙鍵。在其他前述實(shí)施方案中，R^4b連同其連接的碳原子結(jié)合相鄰的R^4b及其連接的碳原子，以形成碳-碳雙鍵。

在前述實(shí)施方案中，R⁵和R⁶處的取代基未做特別限定。在某些實(shí)施方案中，R⁵或R⁶之一或兩者為甲基。在某些其他實(shí)施方案中，R⁵或R⁶之一或兩者為環(huán)烴基，例如環(huán)己基。在這些實(shí)施方案中，所述環(huán)烴基可以是取代的或未取代的。在某些其他實(shí)施方案中，所述環(huán)烴基被C₁-C₁₂烴基(例如叔丁基)取代。

在前述實(shí)施方案中，R⁷處的取代基未做特別限定。在某些實(shí)施方案中，至少一個(gè)R⁷為H。在一些其他實(shí)施方案中，R⁷在每次出現(xiàn)時(shí)為H。在某些其他實(shí)施方案中，R⁷為C₁-C₁₂烴基。

在某些其他的前述實(shí)施方案中，R⁸或R⁹之一為甲基。在其他實(shí)施方案中，R⁸和R⁹均為甲基。

在一些不同的實(shí)施方案中，R⁸和R⁹，連同其連接的氮原子，形成5元、6元或7元雜環(huán)。在一些前述實(shí)施方案中，R⁸和R⁹，連同其連接的氮原子，形成5元雜環(huán)，例如吡咯烷基環(huán)。

在各種不同的實(shí)施方案中，所述化合物具有以下表1中所示的結(jié)構(gòu)之一。

表1

代表性化合物

應(yīng)理解，如上文所述的式(I)化合物的任何實(shí)施方案，以及如上文所述的化合物式(I)中的任何特定取代基和/或變量，可以獨(dú)立地與式(I)化合物的其他實(shí)施方案和/或取代基和/或變量結(jié)合，以形成上文未明確闡述的本發(fā)明的實(shí)施方案。另外，在對(duì)于特定實(shí)施方案和/或權(quán)利要求中的任何特定R基團(tuán)、L基團(tuán)或變量a-e列舉出取代基和/或變量的情況下，應(yīng)理解，各個(gè)單獨(dú)的取代基和/或變量可以從所述特定實(shí)施方案和/或權(quán)利要求中刪除，并且剩余的取代基和/或變量的列舉將會(huì)被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

應(yīng)理解，在本說(shuō)明書中，所述式的取代基和/或變量的組合僅在這些貢獻(xiàn)得到穩(wěn)定化合物時(shí)才是允許的。

在各種實(shí)施方案中，應(yīng)理解，以下化合物不包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)：

其中各個(gè)R^c和R^d為H，或者R^c和R^d結(jié)合形成氧代，并且x和y各自獨(dú)立地為0至6的整數(shù)。

在各種實(shí)施方案中還提供了聚乙二醇化的脂質(zhì)。例如在一個(gè)實(shí)施方案中，所述聚乙二醇化的脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)(II)：

或其藥物可接受的鹽、互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，其中：

R¹⁰和R¹¹各自獨(dú)立地為含有10至30個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烴基鏈，其中所述烴基鏈任選地被一個(gè)或多個(gè)酯鍵中斷；并且

z具有30至60的平均值。

在前述一些聚乙二醇化的脂質(zhì)(II)的實(shí)施方案中，當(dāng)z為42時(shí)R¹⁰和R¹¹不均為正十八烷基。在一些實(shí)施方案中，R¹⁰和R¹¹各自獨(dú)立地為含有10至18個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烴基鏈。在一些實(shí)施方案中，R¹⁰和R¹¹各自獨(dú)立地為含有12至16個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烴基鏈。在一些實(shí)施方案中，R¹⁰和R¹¹各自獨(dú)立地為含有12個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烴基鏈。在一些實(shí)施方案中，R¹⁰和R¹¹各自獨(dú)立地為含有14個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烴基鏈。在其他實(shí)施方案中，R¹⁰和R¹¹各自獨(dú)立地為含有16個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烴基鏈。在更多的實(shí)施方案中，R¹⁰和R¹¹各自獨(dú)立地為含有18個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烴基鏈。在其他實(shí)施方案中，R¹⁰為含有12個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烴基鏈，并且R¹¹為含有14個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烴基鏈。

在各種實(shí)施方案中，z所選的范圍使得(II)的PEG部分具有約400至約6000g/mol的平均分子量。在一些實(shí)施方案中，平均值z(mì)為約45。

在其他實(shí)施方案中，聚乙二醇化的脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)之一：

其中n的范圍使得所述聚乙二醇化的脂質(zhì)的平均分子量為約2500g/mol。

還提供了包含(II)和陽(yáng)離子脂質(zhì)的組合物。所述陽(yáng)離子脂質(zhì)可以選自任何陽(yáng)離子脂質(zhì)。在各種實(shí)施方案中，所述陽(yáng)離子脂質(zhì)為具有上述結(jié)構(gòu)(I)的化合物，包括任何表1中的子結(jié)構(gòu)和特定化合物。

在一些實(shí)施方案中，提供了包含式(I)化合物中的任一個(gè)或多個(gè)的組合物。例如，在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含任何式(I)化合物和治療劑以及一種或多種選自中性脂質(zhì)、甾族化合物和聚乙二醇化的脂質(zhì)的賦形劑。其他藥物可接受的賦形劑和/或載體也包括在組合物的各種實(shí)施方案內(nèi)。

在某些實(shí)施方案中，治療劑包含核酸，例如反義寡核苷酸或信使RNA。在一些實(shí)施方案中，中性脂質(zhì)選自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。在各種實(shí)施方案中，化合物與中性脂質(zhì)的摩爾比為約2:1至約8:1。

在各種實(shí)施方案中，組合物還包含甾族化合物或甾族化合物類似物。在某些實(shí)施方案中，所述甾族化合物或甾族化合物類似物為膽甾醇。在一些這樣的實(shí)施方案中，化合物與膽甾醇的摩爾比為約2:1至1:1。

在各種實(shí)施方案中，組合物包含聚乙二醇化的脂質(zhì)。例如，一些實(shí)施方案包括PEG-DMG。在各種實(shí)施方案中，化合物與聚乙二醇化的脂質(zhì)的摩爾比為約100:1至約25:1。

在一些實(shí)施方案中，組合物包含具有以下結(jié)構(gòu)(II)的聚乙二醇化的脂質(zhì)：

或其藥物可接受的鹽、互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，其中：

R¹⁰和R¹¹各自獨(dú)立地為含有10至30個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烴基鏈，其中所述烴基鏈任選地被一個(gè)或多個(gè)酯鍵中斷；并且

z具有30至60的平均值。

在一些實(shí)施方案中，R¹⁰和R¹¹各自獨(dú)立地為含有12至16個(gè)碳原子的直鏈的、飽和的烴基鏈。在其他實(shí)施方案中，平均值z(mì)為約45。

在一些前述組合物的實(shí)施方案中，治療劑包含核酸。例如，在一些實(shí)施方案中，所述核酸選自反義、質(zhì)粒DNA和信使RNA。

出于施用目的，本發(fā)明的化合物(通常是脂質(zhì)納米顆粒與治療劑結(jié)合的形式)可以以粗化學(xué)品施用，或者可以配制為藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物包含式(I)的化合物和一種或多種藥物可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。式(I)的化合物以有效形成脂質(zhì)納米顆粒并遞送治療劑以便，例如，治療相關(guān)的特定疾病或病況的量存在于組合物中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定適當(dāng)?shù)臐舛群蛣┝俊?/p>

本發(fā)明組合物的施用可以通過(guò)任何用于類似效用的試劑的可接受施用方式來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明的藥物組合物可以配制成固體、半固體、液體或氣體形式的制劑，例如片劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、懸浮液、栓劑、注射劑、吸入劑、膠、微球和氣溶膠。施用這類藥物組合物的典型途徑包括，但不限于，口服、局部、經(jīng)皮、吸入、胃腸外、舌下、口含、直腸、陰道和鼻內(nèi)途徑。本文使用的術(shù)語(yǔ)胃腸外包括皮下注射，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。配制本發(fā)明的藥物組合物以便允許經(jīng)過(guò)對(duì)患者施用該組合物后其中含有的活性成分是生物可利用的。待向?qū)ο蠡蚧颊呤┯玫慕M合物是一個(gè)或多個(gè)劑量單位的形式，其中，例如，片劑可以是單劑量單位，而本發(fā)明氣溶膠形式的化合物的容器可以具有多個(gè)劑量單位。制備這些劑型的現(xiàn)行的方法是已知的，或者對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的；例如，參見Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版(Philadelphia College of Pharmacy and Science,2000)。在任何情況下，待施用的組合物將會(huì)含有治療有效量的本發(fā)明化合物或其藥物可接受的鹽，以便根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)治療相關(guān)的疾病或病況。

本發(fā)明的藥物組合物可以是固體或液體的形式。一方面，載體是微粒，使得組合物是，例如，片劑或粉末形式。載體可以是液體，此時(shí)組合物是，例如，口服糖漿、可注射液體或氣溶膠，所述氣溶膠適用于，例如，吸入施用。

當(dāng)用于口服施用時(shí)，藥物組合物優(yōu)選為固體或液體形式，其中本文認(rèn)為是固體或液體的形式包括半固體、半液體、懸浮液和膠形式。

作為用于口服施用的固體組合物，藥物組合物可以配制成粉末、顆粒、壓縮的片劑、丸劑、膠囊、咀嚼膠、水等形式。這類固體組合物通常將含有一種或多種惰性稀釋劑或可食用載體。另外，可以存在以下的一種或多種：結(jié)合劑，例如羧甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，例如淀粉、乳糖或糊精；崩解劑，例如海藻酸、海藻酸鈉、Primogel、玉米淀粉等；潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂或Sterotex；助流劑，例如膠體二氧化硅；甜味劑，例如蔗糖或糖精；調(diào)味劑，例如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調(diào)味劑；以及著色劑。

當(dāng)藥物組合物是膠囊(例如，明膠膠囊)形式時(shí)，其可以含有上述類型材料之外的液體載體，例如聚乙二醇或油。

藥物組合物可以是液體的形式，例如，酏劑、糖漿、溶液、乳液或懸浮液。作為兩種實(shí)例，液體可以用于口服施用或用于注射遞送。當(dāng)用于口服施用時(shí)，優(yōu)選的組合物含有，除本化合物之外的，甜味劑、防腐劑、染色/著色劑和增味劑中的一種或多種。在通過(guò)注射施用的組合物中，可以包括表面活性劑、防腐劑、潤(rùn)濕劑、分散劑、懸浮劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑和等滲劑中的一種或多種。

本發(fā)明的液體藥物組合物，不論其為溶液、懸浮液還是其他類似的形式，可以包括以下佐劑中的一種或多種：無(wú)菌稀釋劑，例如注射用的水、鹽水溶液、優(yōu)選生理鹽水、林格氏溶液、等滲氯化鈉；不揮發(fā)性油類，例如可用作溶劑或懸浮介質(zhì)的合成的單甘酯或雙甘酯，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶劑；抗菌劑，例如芐醇或尼泊金甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩沖劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)節(jié)張力的制劑，例如氯化鈉或葡萄糖；用作冷凍保護(hù)劑的試劑，例如蔗糖或海藻糖。胃腸外制劑可以封裝在玻璃或塑料制作的安瓿、一次性注射器或多劑量瓶中。生理鹽水是優(yōu)選的佐劑?？勺⑸涞乃幬锝M合物優(yōu)選為無(wú)菌的。

用于胃腸外施用或口服施用的本發(fā)明的液體藥物組合物應(yīng)含有可獲得適合劑量的本發(fā)明化合物的量。

本發(fā)明的藥物組合物可以用于局部施用，在這種情況下，載體可以適當(dāng)?shù)匕芤夯|(zhì)、乳液基質(zhì)、軟膏基質(zhì)或凝膠基質(zhì)。例如，所述基質(zhì)可以包含以下的一種或多種：礦脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蠟、礦物油、諸如水和醇的稀釋劑、以及乳化劑和穩(wěn)定劑。增稠劑可以存在于用于局部施用的藥物組合物中。如果用于經(jīng)皮施用，組合物可以包括經(jīng)皮貼片或離子電滲裝置。

本發(fā)明的藥物組合物可以用于直腸施用，例如，為栓劑的形式，其在直腸中溶解并釋放藥物。用于直腸施用的組合物可以含有油脂性基質(zhì)作為適合的無(wú)刺激性賦形劑。這類基質(zhì)包括但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。

本發(fā)明的藥物組合物可以包括修飾固體或液體劑量單位的物理形式的各種材料。例如，組合物可以包括形成活性成分周圍的包衣殼的材料。形成包衣殼的材料通常是惰性的，并且可以選自，例如，糖、蟲膠、和其他腸溶包衣試劑?；蛘撸钚猿煞挚梢苑庋b在明膠膠囊中。

固體或液體形式的本發(fā)明藥物組合物可以包括與本發(fā)明化合物結(jié)合并由此有助于所述化合物遞送的試劑?？梢砸赃@種能力作用的適合的試劑包括單克隆或多克隆抗體或蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的藥物組合物可以由可作為氣溶膠施用的劑量單位組成。術(shù)語(yǔ)氣溶膠用于表示從膠體性質(zhì)的系統(tǒng)到由加壓包裝組成的系統(tǒng)的各種系統(tǒng)?？梢酝ㄟ^(guò)液化氣和壓縮氣來(lái)遞送，或者通過(guò)分散活性成分的適合的泵系統(tǒng)來(lái)遞送。本發(fā)明化合物的氣溶膠可以以單相、雙相系統(tǒng)或三相系統(tǒng)來(lái)遞送，以便遞送活性成分。氣溶膠的遞送包括必要的容器、活化器、閥、子容器等，其在一起可以形成試劑盒。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)的情況下可以確定優(yōu)選的氣溶膠。

本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)制藥領(lǐng)域熟知的方法來(lái)制備。例如，用于通過(guò)注射施用的藥物組合物可以通過(guò)將本發(fā)明的脂質(zhì)納米顆粒與無(wú)菌、蒸餾的水或其他載體結(jié)合以便形成溶液來(lái)制備。可以加入表面活性劑以促進(jìn)形成均勻的溶液或懸浮液。表面活性劑是與本發(fā)明化合物非共價(jià)地相互作用以便促進(jìn)所述化合物在水性遞送系統(tǒng)中溶解或均勻懸浮的化合物。

本發(fā)明的組合物或其藥物可接受的鹽以治療有效量施用，所述量將會(huì)根據(jù)多種因素變化，包括使用的具體治療劑的活性；治療劑的代謝穩(wěn)定性和作用時(shí)長(zhǎng)；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；施用的方式和時(shí)間；排泄速率；藥物組合；具體病癥或病況的嚴(yán)重性；以及經(jīng)受治療的對(duì)象。

本發(fā)明的組合物也可以在施用一種或多種其他治療劑的同時(shí)、之前或之后施用。這類組合治療包括施用本發(fā)明組合物和一種或多種另外的活性劑的單一藥物劑量制劑，以及施用本發(fā)明組合物和各個(gè)在其自身單獨(dú)藥物劑量制劑中的活性劑。例如，本發(fā)明組合物和其他活性劑可以以單一口服劑量組合物(例如片劑或膠囊)一起向患者施用，或者各個(gè)試劑以不同的口服劑量制劑施用。當(dāng)使用不同的劑量制劑時(shí)，本發(fā)明化合物和一種或多種另外的活性劑可以在基本同一時(shí)間(即，同時(shí))施用，或者在相互交錯(cuò)的時(shí)間(即，依序)施用；應(yīng)理解組合治療包括所有的這些給藥方案。

上述化合物和組合物的制備方法在下文描述，和/或在本領(lǐng)域已知。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，在本文描述的方法中，中間化合物的官能團(tuán)可能需要通過(guò)適合的保護(hù)基保護(hù)。這類官能團(tuán)包括羥基、氨基、巰基和羧酸。用于羥基的適合的保護(hù)基包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氫吡喃基、芐基等。用于氨基、脒基和胍基的適合的保護(hù)基包括叔丁氧基羰基、芐氧基羰基等。用于巰基的適合的保護(hù)基包括-C(O)-R”(其中R”為烴基、芳基或芳烴基)、對(duì)甲氧基芐基、三苯甲基等。用于羧酸的適合的保護(hù)基包括烴基、芳基或芳烴基酯。保護(hù)基可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)添加或去除，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和本文中描述的。在Green,T.W.和P.G.M.Wutz,Protective Groups in Organic Synthesis(1999),第3版,Wiley中詳細(xì)描述了保護(hù)基團(tuán)的使用。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到的，保護(hù)基也可以是聚合物樹脂，例如Wang樹脂、Rink樹脂或2-氯三苯甲基-氯樹脂。

本領(lǐng)域技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到，雖然本發(fā)明化合物的這類經(jīng)保護(hù)的衍生物可以不由此具有藥理活性，但其可以對(duì)哺乳動(dòng)物施用并且之后在體內(nèi)代謝形成藥理活性的本發(fā)明化合物。這類衍生物因此可以被描述為“前藥”。所有本發(fā)明化合物的前藥包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

此外，所有以游離堿或游離酸形式存在的本發(fā)明化合物可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法用適當(dāng)?shù)臒o(wú)機(jī)或有機(jī)的堿或酸處理來(lái)轉(zhuǎn)化為其藥物可接受的鹽。本發(fā)明化合物的鹽可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)轉(zhuǎn)化為其游離堿或酸形式。

以下反應(yīng)方案說(shuō)明了制備本發(fā)明化合物，即，式(I)的化合物的方法：

其中R^1a、R^1b、R^2a、R^2b、R^3a、R^3b、R^4a、R^4b、R⁵、R⁶、R⁷、R⁸、R⁹、a、b、c、d和e如本文所定義。應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)類似的方法或者通過(guò)結(jié)合本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法來(lái)制備這些化合物。還應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠以下文描述的類似的方式，通過(guò)使用適當(dāng)?shù)钠鹗冀M分并按照需要修改合成的參數(shù)，來(lái)制備下文未明確說(shuō)明的式(I)的其他化合物。通常，起始組分可以得自諸如Sigma Aldrich、Lancaster Synthesis,Inc.、Maybridge、Matrix Scientific、TCI和Fluorochem USA等來(lái)源，或者根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的資源(參見，例如，Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,第5版(Wiley,2000年12月))，或者如本發(fā)明描述來(lái)制備。

一般反應(yīng)方案1

結(jié)構(gòu)(I)的化合物(例如，化合物A-5)的實(shí)施方案可以根據(jù)一般反應(yīng)方案1(“方法A”)制備，其中R為飽和或不飽和的C₁-C₂₄烴基，或者為飽和或不飽和的環(huán)烴基，m為0或1并且n為1至24的整數(shù)。參考一般反應(yīng)方案1，結(jié)構(gòu)A-1的化合物可以從商業(yè)來(lái)源購(gòu)得，或者根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的方法制備。用DCC處理A-1、A-2和DMAP的混合物以得到溴化物A-3。在足以在任何必要的后處理和/或純化步驟后產(chǎn)生A-5的溫度和時(shí)間下，將溴化物A-3、堿(例如，N,N-二異丙基乙胺)和N,N-二甲基二胺A-4的混合物加熱。

一般反應(yīng)方案2

結(jié)構(gòu)(I)的化合物(例如，化合物B-5)的實(shí)施方案可以根據(jù)一般反應(yīng)方案2(“方法B”)制備，其中R為飽和或不飽和的C₁-C₂₄烴基，或者為飽和或不飽和的環(huán)烴基，m為0或1并且n為1至24的整數(shù)。如一般反應(yīng)方案2所示，結(jié)構(gòu)B-1的化合物可以從商業(yè)來(lái)源購(gòu)得，或者根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的方法制備。用酰氯B-2(1當(dāng)量)和堿(例如，三乙胺)處理B-1(1當(dāng)量)的溶液。用氧化劑(例如，氯鉻酸吡啶鎓鹽)處理粗產(chǎn)物，并且回收中間產(chǎn)物B-3。然后用還原劑(例如，三乙酰氧基硼氫化鈉)處理粗制B-3、酸(例如，乙酸)和N,N-二甲基氨基胺B-4的溶液，以便在任何必要的后處理和/或純化后獲得B-5。

應(yīng)注意，雖然起始材料A-1和B-1在上文描述為僅包含飽和的亞甲基碳，但包含碳-碳雙鍵的起始材料也可以用于制備包含碳-碳雙鍵的化合物。

一般反應(yīng)方案3

結(jié)構(gòu)(I)的化合物(例如，化合物C-7或C9)的實(shí)施方案可以根據(jù)一般反應(yīng)方案3(“方法C”)制備，其中R為飽和或不飽和的C₁-C₂₄烴基，或者為飽和或不飽和的環(huán)烴基，m為0或1并且n為1至24的整數(shù)。參考一般反應(yīng)方案3，結(jié)構(gòu)C-1的化合物可以從商業(yè)來(lái)源購(gòu)得，或者根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的方法制備。

提供了以下實(shí)施例，其目的在于說(shuō)明而并非限定。

實(shí)施例1

化合物1的合成

根據(jù)如下的方法B制備化合物1：

用2-乙基己酰氯(10g)處理辛-1,8-二醇(9.8g)在二氯甲烷(100mL)和四氫呋喃(60mL)中的溶液。緩慢加入三乙胺(15mL)，并且將溶液攪拌三天。將反應(yīng)混合物過(guò)濾，并且用鹵水(2x)洗滌濾液。有機(jī)部分經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。使用二氯甲烷將粗產(chǎn)物過(guò)濾通過(guò)硅膠(20g)，得到15.8g粗產(chǎn)物。將得到的油狀物溶解于二氯甲烷(100mL)，并用氯鉻酸吡啶鎓鹽(13g)處理兩小時(shí)。加入乙醚(400mL)并將上層清液通過(guò)硅膠床過(guò)濾。從濾液去除溶劑，并使用乙酸乙酯/己烷(0-6％)梯度使得到的油狀物通過(guò)硅膠(77g)柱?；厥?-O-(2’-乙基己酰氧基)辛醛(6.7g)，為油狀物。

將8-O-(2’-乙基己酰氧基)辛醛(6.7g)、乙酸(25滴)和2-N,N-二甲基氨基乙胺(0.54g)在二氯甲烷(40mL)中的溶液用三乙酰氧基硼氫化鈉(1.5g)處理過(guò)夜。該溶液用碳酸氫鈉水溶液洗滌，然后用鹵水洗滌。有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。使用甲醇/二氯甲烷(0-10％)梯度使殘余物通過(guò)硅膠(75g)柱，然后通過(guò)第二根柱(20g)，以得到化合物1(1g)，為無(wú)色油狀物。

實(shí)施例2

化合物2的合成

根據(jù)如下的方法A制備化合物2：

在氬氣氣氛下，向裝有溶于二氯甲烷(20mL)的葉綠醇(593mg,2mmol)、6-溴己酸(780mg,4mmol)和4-(二甲基氨基)吡啶(60mg)的圓底燒瓶加入二環(huán)己基碳二亞胺(908mg,4.4mmol)。通過(guò)過(guò)濾將沉淀拋棄。濃縮濾液，并且得到的殘余物通過(guò)在用含乙酸乙酯的己烷的梯度混合物(0％至3％)洗脫的硅膠上進(jìn)行柱層析來(lái)純化。這得到(E)-3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基6-溴己酸酯的無(wú)色油狀物(0.79g1.67mmol,83％)。

將(E)-3,7,11,15-四甲基十六碳-2-烯基6-溴己酸酯(0.42g,0.887mmol)、N,N-二異丙基乙胺(1.5mol當(dāng)量,1.33mmol,MW 129.25,171mg)和N,N-二甲基乙二胺(39mg,0.44mmol)在DMF(4mL)中的溶液在77℃下加熱18h。然后將反應(yīng)混合物冷卻，并用己烷(3x 20mL)萃取。合并己烷萃取物，經(jīng)硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。其與第2次反應(yīng)合并(總計(jì)約0.7g)。粗產(chǎn)物通過(guò)在用含甲醇的DCM的梯度混合物(0％至5％)洗脫的硅膠進(jìn)行柱層析來(lái)純化多次。這得到所需產(chǎn)物的淡黃色油狀物(39mg)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ:5.33(m,2H),4.59(m,4H),2.85-2.25(m,18H)。

實(shí)施例3

化合物3的合成

通過(guò)與化合物2類似的方式，從溴乙酸起始，而不是從6-溴己酸起始，來(lái)制備化合物3，得到22mg濃稠無(wú)色油狀物，0.029mmol，6％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:5.32(m,2H),4.62(m,4H),3.62(s,2H),3.60(s,2H),3.28-2.33(m,10H),2.09-2.00(m,4H),1.76(s,3H),1.70(s,3H),1.60-1.47(m,6H),1.47-0.97(32H),0.89-0.84(m,24H)。

實(shí)施例4

化合物4的合成

根據(jù)如下的方法B來(lái)制備化合物4：

用2-乙基己酸(7.2g)、DCC(10.5g)、DMAP(3.5g)和三乙胺(10mL)處理十二烷-1,12-二醇(10g)在二氯甲烷(100mL)和四氫呋喃(50mL)中的溶液。將該溶液攪拌四天。將反應(yīng)混合物過(guò)濾，并且用稀鹽酸洗滌濾液。有機(jī)部分經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。將殘余物溶解于二氯甲烷(50mL)，使其靜置過(guò)夜，并過(guò)濾。去除溶劑以得到12.1g粗產(chǎn)物。

將粗產(chǎn)物溶解于二氯甲烷(100mL)，并用氯鉻酸吡啶鎓鹽(8g)處理過(guò)夜。加入乙醚(400mL)，并將上層清液通過(guò)硅膠床過(guò)濾。從濾液去除溶劑，并使用乙酸乙酯/己烷(0-6％)梯度使得到的油狀物通過(guò)硅膠(75g)柱?；厥沾种?2-O-(2’-乙基己酰氧基)十二醛(3.5g)，為油狀物。

將粗產(chǎn)物(3.5g)、乙酸(60滴)和2-N,N-二甲基氨基乙胺(0.30g)在二氯甲烷(20mL)中的溶液用三乙酰氧基硼氫化鈉(0.86g)處理過(guò)夜。該溶液用碳酸氫鈉水溶液洗滌，然后用鹵水洗滌。有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。使用甲醇/二氯甲烷(0-8％)梯度使殘余物通過(guò)硅膠(20g)柱，然后通過(guò)第二根柱(20g)，以得到所需產(chǎn)物(0.6g)，為無(wú)色油狀物。

實(shí)施例5

化合物5的合成

根據(jù)如下方法B制備化合物5：

用2-己基癸酰氯(10g)和三乙胺(10mL)處理己-1,6-二醇(10g)在二氯甲烷(40mL)和四氫呋喃(20mL)中的溶液。將溶液攪拌一小時(shí)并去除溶劑。將反應(yīng)混合物懸浮于己烷中，過(guò)濾并用水洗滌濾液。去除溶劑，并使用己烷和之后的二氯甲烷作為洗脫液使殘余物通過(guò)硅膠(50g)柱，得到6-(2’-己基癸酰氧基)己-1-醇，為油狀物(7.4g)。

將純化的產(chǎn)物(7.4g)溶解于二氯甲烷(50mL)，并用氯鉻酸吡啶鎓鹽(5.2g)處理兩小時(shí)。加入乙醚(200mL)，并將上層清液通過(guò)硅膠床過(guò)濾。從濾液去除溶劑，并使用乙酸乙酯/己烷(0-5％)梯度使得到的油狀物通過(guò)硅膠(50g)柱?；厥?-(2’-己基癸酰氧基)十二醛(5.4g)，為油狀物。

將產(chǎn)物(4.9g)、乙酸(0.33g)和2-N,N-二甲基氨基乙胺(0.40g)在二氯甲烷(20mL)中的溶液用三乙酰氧基硼氫化鈉(2.1g)處理兩小時(shí)。用氫氧化鈉水溶液洗滌該溶液。有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。使用甲醇/二氯甲烷(0-8％)梯度使殘余物通過(guò)硅膠(50g)柱，以得到所需產(chǎn)物(1.4g)，為無(wú)色油狀物。

實(shí)施例6

化合物6的合成

根據(jù)如下方法B制備化合物6：

用2-己基癸酸(10.0g)、DCC(8.7g)和DMAP(5.7g)處理壬-1,9-二醇(12.6g)的二氯甲烷(80mL)溶液。將溶液攪拌兩小時(shí)。將反應(yīng)混合物過(guò)濾并去除溶劑。將殘余物溶解于加熱的己烷(250mL)，并允許結(jié)晶。將溶液過(guò)濾，并去除溶劑。將殘余物溶解于二氯甲烷，并用稀鹽酸洗滌。有機(jī)部分經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。使用0-12％乙酸乙酯/己烷作為洗脫液，使殘余物通過(guò)硅膠柱(75g)，得到9-(2’-己基癸酰氧基)壬-1-醇(9.5g)，為油狀物。

將產(chǎn)物溶解于二氯甲烷(60mL)，并用氯鉻酸吡啶鎓鹽(6.4g)處理兩小時(shí)。加入乙醚(200mL)，并將上層清液通過(guò)硅膠床過(guò)濾。從濾液去除溶劑，并使用乙酸乙酯/己烷(0-12％)梯度使得到的油狀物通過(guò)硅膠(75g)柱，得到9-(2’-乙基己酰氧基)壬醛(6.1g)，為油狀物。

將粗產(chǎn)物(6.1g)、乙酸(0.34g)和2-N,N-二甲基氨基乙胺(0.46g)在二氯甲烷(20mL)中的溶液用三乙酰氧基硼氫化鈉(2.9g)處理兩小時(shí)。該溶液用二氯甲烷稀釋，用氫氧化鈉水溶液洗滌，然后用水洗滌。有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。使用甲醇/二氯甲烷(0-8％)梯度使殘余物通過(guò)硅膠(75g)柱，然后使用二氯甲烷/乙酸/甲醇梯度通過(guò)第二根柱(20g)。將純化的流份溶解于二氯甲烷，用稀氫氧化鈉水溶液洗滌，經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑，以得到所需產(chǎn)物(1.6g)，為無(wú)色油狀物。

實(shí)施例7

化合物7的合成

根據(jù)方法A，由3,5,5-三甲基己基10-溴癸酸酯和N,N-二甲基乙烷-1,2-二胺制備化合物7，得到144mg淡黃色油狀物(0.21mmol,11％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.09(似三重峰,6.6Hz,4H),2.58-2.51(m,2H),2.44-2.34(m,6H),2.29(似三重峰,7.5Hz,4H),2.25(s,6H),1.67-1.57(m,8H),1.52-1.39(m,6H),1.36-1.21(m,24H),0.95(d,6.6Hz,6H),0.90(s,18H)。

實(shí)施例8

化合物8的合成

通過(guò)方法A制備化合物8，產(chǎn)率15％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:5.11-5.04(m,2H),2.60-2.54(m,2H),2.47-2.36(m,6H),2.27(似三重峰,7.4Hz,4H),2.25(s,6H),1.66-1.40(m,16H),1.34-1.23(m,24H),0.91(d,6.5Hz,24H)。

實(shí)施例9

化合物9的合成

根據(jù)如下方法B制備化合物9：

用香茅酰氯(10.1g，由香茅酸和草酰氯制備)和三乙胺(10mL)處理壬-1,9-二醇(10.0g)的二氯甲烷(100mL)溶液，并攪拌三天。反應(yīng)混合物用二氯甲烷稀釋，并用稀鹽酸洗滌。有機(jī)部分經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。將殘余物溶于己烷，過(guò)濾并去除溶劑。使用己烷和之后的二氯甲烷作為洗脫液，使殘余物通過(guò)一系列的硅膠柱(60-70g)，得到9-(香茅酰氧基)壬-1-醇(7.6g)，為油狀物。

將產(chǎn)物溶解于二氯甲烷(50mL)，并用氯鉻酸吡啶鎓鹽(6.4g)處理90分鐘。加入乙醚(200mL)，并將上層清液通過(guò)硅膠床過(guò)濾。將殘余物溶解于己烷，并使用己烷作為洗脫液使其通過(guò)硅膠(20g)柱，得到9-(香茅酰氧基)壬醛(5g)，為油狀物。

將粗產(chǎn)物(5g)、乙酸(0.33g)和2-N,N-二甲基氨基乙胺(0.48g)在二氯甲烷(40mL)中的溶液用三乙酰氧基硼氫化鈉(1.2g)處理過(guò)夜。該溶液用二氯甲烷稀釋，并用氫氧化鈉水溶液洗滌。有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。使用0-12％甲醇/二氯甲烷梯度使殘余物通過(guò)硅膠(50g)柱，然后使用相同的梯度使其通過(guò)第二根硅膠柱(20g)，以得到所需產(chǎn)物(0.6g)，為無(wú)色油狀物。

實(shí)施例10

化合物10的合成

根據(jù)方法A制備化合物10，以得到147mg無(wú)色油狀物，0.23mmol，17％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.11(t,6.9Hz,4H),2.56-2.52(m,2H),2.44-2.35(m,6H),2.29(似三重峰,7.5Hz,4H),2.24(s,6H),1.75-1.66(m,8H),1.66-1.57(m,4H),1.52(類四重峰,6.9Hz,4H),1.46-1.38(m,4H),1.38-1.13(m,30H),0.98-0.87(m,4H)。

實(shí)施例11

化合物11的合成

根據(jù)方法A制備化合物11，以得到154mg淡黃色油狀物(0.22mmol,14％)。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.88(五重峰,6.2Hz,2H),3.20-2.40(m,8H),2.39(s,6H),2.29(t,7.5Hz,4H),1.67-1.56(m,4H),1.56-1.48(m,8H),1.38-1.21(m,44H),0.92-0.86(m,12H)。

實(shí)施例12

化合物12的合成

根據(jù)方法A制備化合物12，以得到169mg淡黃色油狀物(0.26mmol,17％)。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.03-3.95(ABX樣式,4H),2.54(m,2H),2.44-2.35(m,6H),2.30(似三重峰,7.5Hz,4H),2.25(s,6H),1.66-1.54(m,6H),1.47-1.23(m,40H),0.92-0.88(m,12H)。

實(shí)施例13

化合物13的合成

根據(jù)方法A制備化合物13，以得到152mg白色糊狀物，0.23mmol，16％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.03(t,6.7Hz,4H),3.10-2.41(非常寬的峰,8H),2.34(s,6H),2.30(t,7.5Hz,4H),1.66-1.46(m,12H),1.39-1.21(m,40H),0.89(似三重峰,6.9Hz,6H)。

實(shí)施例14

化合物14的合成

根據(jù)方法A制備化合物14，以得到111mg無(wú)色油狀物，0.16mmol，11％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:5.09(m,2H),4.16-4.05(m,4H),3.10-2.40(非常寬的峰,8H),2.31(s,6H),2.29(t,7.5Hz,4H),2.06-1.89(m,4H),1.69(d,0.8Hz,6H),1.61(s,6H),1.73-1.13(m,50H),0.92(d,6.6Hz,6H)。

實(shí)施例15

化合物15的合成

根據(jù)方法A制備化合物15，以得到116mg白色糊狀物，0.16mmol，10％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.06(t,6.7Hz,4H),2.62-2.51(寬峰,2H),2.48-2.33(br.,6H),2.29(t,7.5Hz,4H),2.25(s,6H),1.69(五重峰,7.0Hz,8H),1.48-1.38(br.,4H),1.38-1.21(m,52H),0.89(似三重峰,6.8Hz,6H)。

實(shí)施例16

化合物16的合成

根據(jù)方法A制備化合物16，以得到118mg無(wú)色油狀物，0.17mmol，12％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.06(t,6.8Hz,4H),2.57-2.52(m,2H),2.44-2.34(m,6H),2.29(t,7.6Hz,4H),2.25(s,6H),1.62(似五重峰,7.0Hz,8H),1.47-1.39(m,4H),1.37-1.22(m,44H),0.89(似三重峰,6.8Hz,6H)。

實(shí)施例17

化合物17的合成

根據(jù)方法A制備化合物17，以得到145mg淡黃色油狀物，0.21mmol，13％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:5.01(m,0.27H來(lái)自順式異構(gòu)體),4.63(tt,11.2Hz,4.5Hz,1.73H來(lái)自反式異構(gòu)體),2.61-2.24(18H),2.01(m,4H),1.81(m,4H),1.61(似五重峰,7.2Hz,4H),1.44(m,4H),1.36-1.21(24H),1.11(m,4H),1.01(m,2H),0.87(s,2.7H來(lái)自順式異構(gòu)體),0.86(s,15.3H來(lái)自反式異構(gòu)體)。

實(shí)施例18

化合物18的合成

根據(jù)方法A制備化合物18，以得到111mg無(wú)色油狀物，0.17mmol，14％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.88(五重峰,6.2Hz,2H),2.61-2.51(br.,2H),2.48-2.34(br,6H),2.29(t,7.6Hz,4H),2.25(s,6H),1.62(似五重峰,7.3Hz,4H),1.55-1.48(m,8H),1.47-1.39(m,4H),1.37-1.21(m,32H),0.91-0.86(m,12H)。

實(shí)施例19

化合物19的合成

根據(jù)方法A制備化合物19，以得到76mg無(wú)色油狀物，0.11mmol，6％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:5.77(似雙三重峰,14.4Hz,6.6Hz,2H),5.55(似dtt峰,14.4Hz,6.5Hz,1.4Hz,2H),4.51(dd,6.6Hz,0.6Hz,4H),2.61-2.50(br.,2H),2.50-2.34(br.6H),2.30(t,7.5Hz,4H),2.25(s,6H),2.04(q,7.1Hz,4H),1.62(五重峰,7.3Hz,4H),1.48-1.21(40H),0.88(似三重峰,6.8Hz,6H)。

實(shí)施例20

化合物20的合成

根據(jù)一般程序A制備化合物20，以得到157mg無(wú)色油狀物，0.22mmol，14％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:3.97(d,5.8Hz,4H),2.57-2.51(m,2H),2.44-2.33(m,6H),2.30(t,7.5Hz,4H),2.24(s,6H),1.63(似五重峰,7.3Hz,6H),1.43(似五重峰,7.3Hz,4H),1.36-1.21(44H),0.93-0.86(m,12H)。

實(shí)施例21

化合物21的合成

根據(jù)一般程序A制備化合物21，以得到164mg無(wú)色油狀物，0.21mmol，14％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:3.97(d,5.8Hz,4H),2.57-2.51(m,2H),2.44-2.34(m,6H),2.30(t,7.5Hz,4H),2.24(s,6H),1.62(似五重峰,7.3Hz,6H),1.43(似五重峰,7.3Hz,4H),1.36-1.21(52H),0.93-0.86(m,12H)。

實(shí)施例22

化合物22的合成

根據(jù)如下方法A制備化合物22：

步驟1.

向6-溴己酸(20mmol,3.901g)、2-己基-1-癸醇(1.8當(dāng)量,36mmol,8.72g)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP 0.5當(dāng)量,10mmol,1.22g)在DCM(80mL)中的溶液加入DCC(1.1當(dāng)量,22mmol,4.54g)。將得到的混合物在室溫下攪拌16h。通過(guò)過(guò)濾將沉淀拋棄。濃縮濾液。殘余物通過(guò)在用含乙酸乙酯的己烷(0％至2％)的梯度混合物洗脫的硅膠上進(jìn)行柱層析來(lái)純化。這得到了所需產(chǎn)物，為無(wú)色油狀物(7.88g,18.8mmol,94％)。

步驟2.

將來(lái)自步驟1的溴化物(1.34當(dāng)量,7.88g,18.8mmol)、N,N-二異丙基乙胺(1.96當(dāng)量,27.48mmol,4.78mL)和N,N-二甲基乙二胺(1當(dāng)量,14.02mmol,1.236g,1.531mL)在乙腈(70mL)中的混合物，在裝配有冷凝器的250mL燒瓶中于79℃(油浴)下加熱16h。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并濃縮。將殘余物溶于乙酸乙酯和己烷(1:9)和水的混合物中。將各相分離，用水(100mL)和鹵水洗滌。經(jīng)硫酸鈉干燥并濃縮(8.7g油狀物)。粗產(chǎn)物(8.7g油狀物)通過(guò)在硅膠(0％至3％MeOH于氯仿中)上進(jìn)行柱層析來(lái)純化。合并含有期望產(chǎn)物的流份，并濃縮。將殘余物溶解于1mL己烷中，并通過(guò)硅膠層(3-4mm，用8mL己烷洗滌)過(guò)濾。用Ar流將濾液吹干，并在真空中充分地干燥過(guò)夜(1.30g,mmol,％,無(wú)色油狀物，所需產(chǎn)物)。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:3.96(d,5.8Hz,4H),2.55-2.50(m,2H),2.43-2.39(m,4H),3.37-3.32(m,2H),2.30(t,7.5Hz,4H),2.23(s,6H),1.63(似五重峰,7.6Hz,6H),1.48-1.40(m,4H),1.34-1.20(52H),0.88(似三重峰,6.8Hz,12H)。

實(shí)施例23

化合物23的合成

根據(jù)一般程序A制備化合物23，以得到200mg無(wú)色油狀物，0.24mmol，16％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:3.97(d,5.8Hz,4H),2.57-2.51(m,2H),2.44-2.34(m,6H),2.30(t,7.5Hz,4H),2.24(s,6H),1.67-1.58(m,6H),1.43(似五重峰,7.3Hz,4H),1.36-1.21(60H),0.89(似三重峰,6.8Hz,12H)。

實(shí)施例24

化合物24的合成

根據(jù)一般程序A制備化合物24，以得到138mg無(wú)色油狀物，0.18mmol，12％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.90(類六重峰,6.3Hz,2H),2.63-2.33(br.8H),2.27(t,7.5Hz,4H),2.26(s,6H),1.66-1.57(m,4H),1.51-1.39(m,6H),1.35-1.21(54H),1.20(d,6.2Hz,6H),0.89(似三重峰,6.8Hz,6H)。

實(shí)施例25

化合物25的合成

根據(jù)一般程序A制備化合物25，以得到214mg無(wú)色油狀物，0.24mmol，17％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:3.97(d,5.8Hz,4H),2.58-2.52(m,2H),2.45-2.35(m,6H),2.30(t,7.5Hz,4H),2.25(s,6H),1.62(似五重峰,7.0Hz,6H),1.43(似五重峰,7.0Hz,4H),1.36-1.21(68H),0.89(似三重峰,6.7Hz,12H)。

實(shí)施例26

化合物26的合成

根據(jù)一般程序A制備化合物26，以得到170mg無(wú)色油狀物，0.21mmol，13％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:5.42-5.29(m,8H),4.05(t,6.8Hz,4H),2.77(t,6.5Hz,4H),2.55-2.50(m,2H),2.43-2.39(m,4H),2.37-2.32(m,2H),2.29(t,7.6Hz,4H),2.23(s,6H),2.05(q,6.8Hz,8H),1.63(似五重峰,7.5Hz,8H),1.48-1.40(m,4H),1.39-1.23(36H),0.90(似三重峰,6.8Hz,6H)。

實(shí)施例27

化合物27的合成

根據(jù)一般程序A制備化合物27，以得到255mg無(wú)色油狀物，0.29mmol，18％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:3.96(d,5.8Hz,4H),2.55-2.50(m,2H),2.43-2.39(m,4H),3.37-3.32(m,2H),2.30(t,7.5Hz,4H),2.23(s,6H),1.63(似五重峰,7.6Hz,6H),1.48-1.40(m,4H),1.34-1.20(68H),0.88(似三重峰,6.8Hz,12H)。

實(shí)施例28

化合物28的合成

根據(jù)一般程序A制備化合物28，以得到248mg無(wú)色油狀物，0.27mmol，19％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:3.97(d,5.8Hz,4H),2.57-2.52(m,2H),2.44-2.34(m,6H),2.30(t,7.5Hz,4H),2.24(s,6H),1.67-1.58(m,6H),1.43(似五重峰,7.3Hz,4H),1.36-1.21(76H),0.89(似三重峰,6.8Hz,12H)。

實(shí)施例29

化合物29的合成

根據(jù)一般程序A制備化合物29，以得到181mg無(wú)色油狀物，0.23mmol，17％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.87(五重峰,6.3Hz,4H),2.56-2.51(m,2H),2.43-2.34(m,6H),2.27(t,7.5Hz,4H),2.24(s,6H),1.61(似五重峰,7.3Hz,4H),1.55-1.46(m,8H),1.46-1.37(m,4H),1.36-1.08(52H),0.88(似三重峰,6.8Hz,12H)。

實(shí)施例30

化合物30的合成

根據(jù)一般程序A制備化合物30，以得到88mg無(wú)色油狀物，0.11mmol，3％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:3.97(d,5.5Hz,4H),2.58-2.51(m,2H),2.49-2.44(m,4H),2.38-2.30(m,6H),2.24(s,6H),1.75(似五重峰,7.3Hz,4H),1.66-1.54(m,2H),1.35-1.06(64H),0.89(似三重峰,6.4Hz,12H)。

實(shí)施例31

化合物31的合成

根據(jù)一般程序C制備化合物31，以得到275mg淡黃色油狀物，0.30mmol，三步的總產(chǎn)率35％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:3.97(d,5.8Hz,4H),2.63-2.47(m,8H),2.45-2.41(m,4H),2.31(t,7.5Hz,4H),1.82-1.74(m,4H),1.64(似五重峰,7.6Hz,6H),1.46(似五重峰,7.6Hz,4H),1.36-1.18(68H),0.89(似三重峰,6.8Hz,12H)。

實(shí)施例32

化合物32的合成

根據(jù)如下方法C制備化合物32：

步驟1.

在Ar下向2-氨基乙醇(116mg,1.9mmol,115uL,MW 61.08,d1.012)在15ml無(wú)水THF中的溶液加入，2-己基癸基6-溴己酸酯(1.9當(dāng)量,1.52g,3.62mmol)、碳酸鉀(1.9當(dāng)量,3.62mmol,500mg)、碳酸銫(0.3當(dāng)量,0.57mmol,186mg,)和碘化鈉(10mg)，并加熱至回流持續(xù)6天。在減壓下蒸發(fā)溶劑，并將殘余物溶于己烷，并用水和鹵水洗滌。分離有機(jī)層，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并在減壓下蒸發(fā)以獲得無(wú)色油狀物。粗產(chǎn)物通過(guò)在硅膠(230-400目硅膠，含MeOH的氯仿，0％至4％)上進(jìn)行快速柱層析來(lái)純化，以得到936mg無(wú)色油狀物(1.27mmol,70％)。

步驟2.

在Ar氣氛下，向磁力攪拌且冰浴冷卻的936mg(1.27mmol)步驟1的產(chǎn)物在2mL CHC1₃中的溶液中，逐滴加入在15mL氯仿中的亞硫酰氯(2.9當(dāng)量,3.70mmol,440mg,270uL)。SOCl₂加入完成后，將冰浴移除，并且將反應(yīng)混合物在Ar氣氛下于室溫下攪拌16h。在減壓下去除CHC1₃和SOCl₂，得到濃稠黃色油狀物。

步驟3.

將步驟2的粗產(chǎn)物溶解于THF(20mL)。向該THF溶液中加入吡咯烷(1.6mL,1.36g,19mmol)。將密封的混合物在64℃下加熱過(guò)夜。濃縮反應(yīng)混合物(暗棕色油狀物)。殘余物通過(guò)在硅膠(含MeOH的氯仿，0％至4％)上進(jìn)行快速干柱層析來(lái)純化。這得到所需產(chǎn)物，為淡黃色油狀物(419mg,0.53mmol,83％)。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:3.97(d,5.8Hz,4H),2.65-2.47(m,8H),2.45-2.41(m,4H),2.31(t,7.5Hz,4H),1.81-1.74(m,4H),1.64(似五重峰,7.6Hz,6H),1.46(似五重峰,7.6Hz,4H),1.36-1.21(52H),0.89(似三重峰,6.8Hz,12H)。

實(shí)施例33

化合物33的合成

根據(jù)一般程序C制備化合物33，以得到419mg淡黃色油狀物，0.54mmol，三步的總產(chǎn)率60％。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:3.97(d,5.8Hz,4H),2.57-2.53(m,2H),2.46-2.40(m,8H),2.31(t,7.5Hz,4H),2.23(s,3H),1.64(似五重峰,7.6Hz,6H),1.46(似五重峰,7.6Hz,4H),1.36-1.20(52H),1.06(t,7.2Hz,3H),0.89(似三重峰,6.8Hz,12H)。

實(shí)施例34

化合物34的合成

根據(jù)如下方法B制備化合物34：

用2-乙基己酸(4.5g)、DCC(7.7g)和DMAP(4.2g)處理壬-1,9-二醇(10g)的二氯甲烷(250mL)溶液。將溶液攪拌三天。將反應(yīng)混合物過(guò)濾，并向?yàn)V液中加入己烷(200mL)。將混合物攪拌，并使沉淀析出。傾倒出上層清液，并去除溶劑。將殘余物懸浮于己烷(70mL)中，并沉淀。傾倒出上層清液，并去除溶劑。將殘余物溶解于己烷，使其在室溫下靜置，然后過(guò)濾。去除溶劑，并使用0％–10％乙酸乙酯/己烷梯度以及之后的0％–8％甲醇/二氯甲烷梯度使殘余物通過(guò)硅膠柱(50g)，得到5.6g的9-(2’-乙基己酰氧基)壬-1-醇，為無(wú)色油狀物。

將產(chǎn)物溶解于二氯甲烷(70mL)，并用氯鉻酸吡啶鎓鹽(5g)處理兩小時(shí)。加入乙醚(250mL)，并將上層清液通過(guò)硅膠床過(guò)濾。從濾液去除溶劑，并將得到的油狀物溶解于己烷。將懸浮液通過(guò)硅膠塞過(guò)濾，并去除溶劑，得到粗制的9-(2’-乙基己酰氧基)壬醛(3.4g)，為油狀物。

將粗產(chǎn)物(3.4g)、乙酸(0.52g)和2-N,N-二甲基氨基乙胺(0.33g)在二氯甲烷(50mL)中的溶液用三乙酰氧基硼氫化鈉(1.86g)處理過(guò)夜。用氫氧化鈉水溶液洗滌該溶液。有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。使用乙酸/甲醇/二氯甲烷(2-0％/0-12％/98-88％)梯度使殘余物通過(guò)硅膠(50g)柱。純化的流份用碳酸氫鈉水溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑，得到化合物34，為油狀物(0.86g)。

實(shí)施例35

化合物35的合成

根據(jù)如下方法B制備化合物35：

用香茅酸(7.5g)、DCC(10.0g)和DMAP(9.5g)處理十二烷-1,12-二醇(18.1g)的二氯甲烷(90mL)溶液。將該溶液攪拌過(guò)夜。過(guò)濾反應(yīng)混合物，并用稀鹽酸洗滌濾液。有機(jī)部分經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑以得到12.2g的粗制12-香茅酰氧基十二烷-1-醇。

將粗產(chǎn)物溶解于二氯甲烷(60mL)，并用氯鉻酸吡啶鎓鹽(6.8g)處理三小時(shí)。加入乙醚(200mL)，并將上層清液通過(guò)硅膠床過(guò)濾。從濾液去除溶劑，并使用乙酸乙酯/己烷(0-12％)梯度使得到的油狀物通過(guò)硅膠(75g)柱。回收粗制的12-香茅酰氧基十二醛(6.2g)，為油狀物。

將粗產(chǎn)物(6.2g)、乙酸(0.44g)和2-N,N-二甲基氨基乙胺(0.50g)在二氯甲烷(40mL)中的溶液用三乙酰氧基硼氫化鈉(2.9g)處理過(guò)夜。該溶液用碳酸氫鈉水溶液洗滌，然后用鹵水洗滌。有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。使用乙酸/甲醇/二氯甲烷(2-0％/0-12％/98-88％)梯度使殘余物通過(guò)硅膠(75g)柱。純化的流份用碳酸氫鈉水溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑，得到化合物35(1.68g)，為油狀物。

實(shí)施例36

化合物36的合成

根據(jù)一般程序C制備化合物36，以得到108mg無(wú)色油狀物(0.14mmol)。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.87(五重峰,6.3Hz,2H),2.56-2.51(m,2H),2.45-2.40(m,4H),2.38-2.33(m,2H),2.29(t,7.5Hz,4H),2.24(s,6H),1.64(似五重峰,7.7Hz,4H),1.55-1.41(m,12H),1.35-1.18(m,52H),0.89(似三重峰,6.8Hz,12H)。

實(shí)施例37

化合物37的合成

根據(jù)一般程序C制備化合物37，以得到330mg無(wú)色油狀物(0.40mmol,三步的總產(chǎn)率80％)。¹HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.87(五重峰,6.5Hz,2H),2.64-2.47(m,8H),2.45-2.40(m,4H),2.29(t,7.5Hz,4H),1.81-1.74(m,4H),1.64(似五重峰,7.6Hz,4H),1.55-1.41(m,12H),1.35-1.18(m,50H),0.89(似三重峰,6.8Hz,12H)。

實(shí)施例38

化合物38的合成

根據(jù)如下方法B制備化合物38：

用2-丁基辛酸(10g)、DCC(10.3g)和DMAP(6.7g)處理壬-1,9-二醇(16g)的二氯甲烷(100mL)溶液。將該溶液攪拌三天。將反應(yīng)混合物過(guò)濾，并向?yàn)V液中加入己烷(250mL)。將混合物攪拌，并使沉淀析出。傾倒出上層清液，并去除溶劑。將殘余物懸浮于己烷中，并沉淀。傾倒出上層清液，并去除溶劑(重復(fù)兩次)。將殘余物溶解于己烷，使其在室溫下靜置，然后過(guò)濾。去除溶劑，并使用二氯甲烷使殘余物通過(guò)硅膠柱(18g)，得到粗制9-(2’-丁基辛酰氧基)壬-1-醇(17.7g)，為油狀物。

將粗產(chǎn)物溶解于二氯甲烷(250mL)，并用氯鉻酸吡啶鎓鹽(11.2g)處理過(guò)夜。加入乙醚(750mL)，并將上層清液通過(guò)硅膠床過(guò)濾。從濾液去除溶劑，并將得到的油狀物溶解于己烷(150mL)。將懸浮液通過(guò)硅膠塞過(guò)濾，并去除溶劑。使用0-6％乙酸乙酯/己烷梯度使粗產(chǎn)物通過(guò)硅膠(80g)柱，得到9-(2’-丁基辛酰氧基)壬醛(5.3g)，為油狀物。

將產(chǎn)物(5.3g)、乙酸(0.37g)和2-N,N-二甲基氨基乙胺(0.47g)在二氯甲烷(50mL)中的溶液用三乙酰氧基硼氫化鈉(3.35g)處理過(guò)夜。用氫氧化鈉水溶液洗滌該溶液。有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。使用乙酸/甲醇/二氯甲烷(2-0％/0-12％/98-88％)梯度使殘余物通過(guò)硅膠(60g)柱。純化的流份用碳酸氫鈉水溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑，得到化合物38，為油狀物(2.3g)。

實(shí)施例39

化合物39的合成

根據(jù)如下方法B制備化合物39：

用2-癸基十四烷酸(17.5g)、DCC(11.3g)和DMAP(6.8g)處理己-1,6-二醇(12g)的二氯甲烷(250mL)溶液。將該溶液攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)混合物過(guò)濾，并向?yàn)V液中加入己烷。將混合物攪拌，并使沉淀析出。傾倒出上層清液，并去除溶劑。使用己烷以及之后的0-1％甲醇/二氯甲烷使殘余物通過(guò)硅膠柱(80g)，得到粗制的6-(2’-癸基十四烷酰氧基)己-1-醇(5.8g)，為油狀物。

將粗產(chǎn)物溶解于二氯甲烷(70mL)，并用氯鉻酸吡啶鎓鹽(2.9g)處理兩小時(shí)。加入乙醚(250mL)，并將上層清液通過(guò)硅膠床過(guò)濾。從濾液去除溶劑，并將得到的油狀物溶解于己烷。將懸浮液通過(guò)硅膠塞過(guò)濾，并去除溶劑。使用0-5％乙酸乙酯/己烷梯度使粗產(chǎn)物通過(guò)硅膠(10g)柱，得到6-(2’-癸基十四烷酰氧基)己醛(3.2g)，為油狀物。

將產(chǎn)物(3.2g)、乙酸(0.28g)和2-N,N-二甲基氨基乙胺(0.15g)在二氯甲烷(20mL)中的溶液用三乙酰氧基硼氫化鈉(0.98g)處理過(guò)夜。用氫氧化鈉水溶液洗滌該溶液。有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。使用乙酸/甲醇/二氯甲烷(2-0％/0-12％/98-88％)梯度使殘余物通過(guò)硅膠(50g)柱。純化的流份用碳酸氫鈉水溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑，得到化合物39，為油狀物(1.2g)。

實(shí)施例40

化合物40的合成

根據(jù)如下方法B制備化合物40：

用2-辛基十二烷酸(10.0g)、DCC(8.3g)和DMAP(5.0g)處理壬-1,9-二醇(10.1g)的二氯甲烷(200mL)溶液。將該溶液攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)混合物過(guò)濾，并向?yàn)V液中加入己烷(200mL)。將混合物攪拌，并使沉淀析出。傾倒出上層清液，并去除溶劑。將該過(guò)程重復(fù)兩次。使用己烷以及之后的4-10％甲醇/二氯甲烷使殘余物通過(guò)硅膠柱(75g)，得到粗制的9-(2’-辛基十二烷酰氧基)壬-1-醇(～11g)，為油狀物。

將粗產(chǎn)物溶解于二氯甲烷(70mL)，并用氯鉻酸吡啶鎓鹽(8g)處理兩小時(shí)。加入乙醚(400mL)，并將上層清液通過(guò)硅膠床過(guò)濾。從濾液去除溶劑，并將得到的油狀物溶解于己烷。將懸浮液通過(guò)硅膠塞過(guò)濾，并去除溶劑，得到粗制的9-(2’-辛基十二烷酰氧基)壬醛(8.4g)，為油狀物。

將產(chǎn)物(8.4g)、乙酸(0.84g)和2-N,N-二甲基氨基乙胺(0.55g)在二氯甲烷(60mL)中的溶液用三乙酰氧基硼氫化鈉(2.9g)處理兩小時(shí)。用氫氧化鈉水溶液洗滌該溶液。有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。使用乙酸/甲醇/二氯甲烷(2-0％/0-12％/98-88％)梯度使殘余物通過(guò)硅膠(75g)柱。純化的流份用碳酸氫鈉水溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑，得到化合物40，為油狀物(3.2g)。

實(shí)施例41

化合物41的合成

根據(jù)如下方法B制備化合物41：

用2-癸基十四烷酸(8.4g)、DCC(8.6g)和DMAP(5.0g)處理壬-1,9-二醇(9.6g)的二氯甲烷(200mL)溶液。將該溶液攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)混合物過(guò)濾，并向?yàn)V液中加入己烷(200mL)。將混合物攪拌，并使沉淀析出。傾倒出上層清液，并去除溶劑。將該過(guò)程重復(fù)兩次。使用己烷以及之后的4-10％甲醇/二氯甲烷使殘余物通過(guò)硅膠柱(75g)，得到粗制的9-(2’-癸基十四烷酰氧基)壬-1-醇(6.4g)，為油狀物。

將粗產(chǎn)物溶解于二氯甲烷(50mL)，并用氯鉻酸吡啶鎓鹽(5.7g)處理兩小時(shí)。加入乙醚(200mL)，并將上層清液通過(guò)硅膠床過(guò)濾。從濾液去除溶劑，并將得到的油狀物溶解于己烷。將懸浮液通過(guò)硅膠塞過(guò)濾，并去除溶劑，得到粗制的9-(2’-癸基十四烷酰氧基)壬醛(5g)，為油狀物。

將產(chǎn)物(5g)、乙酸(0.45g)和2-N,N-二甲基氨基乙胺(0.32g)在二氯甲烷(20mL)中的溶液用三乙酰氧基硼氫化鈉(1.6g)處理兩小時(shí)。用氫氧化鈉水溶液洗滌該溶液。有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。使用乙酸/甲醇/二氯甲烷(2-0％/0-12％/98-88％)梯度使殘余物通過(guò)硅膠(50g)柱。純化的流份用碳酸氫鈉水溶液洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑，得到化合物41，為油狀物(2.2g)。

實(shí)施例42

PEG脂質(zhì)的合成

根據(jù)上述反應(yīng)方案制備聚乙二醇化的脂質(zhì)42-6(“PEG-DMA”)，其中n接近于聚乙二醇化的脂質(zhì)中乙烯氧化物重復(fù)單元的范圍中心。42-1和42-2的合成

在室溫下向肉豆蔻酸(6g,26mmol)的甲苯(50mL)溶液加入草酰氯(39mmol,1.5當(dāng)量,5g)。將得到的混合物在70℃下加熱2h后，將混合物濃縮。將殘余物溶于甲苯并再次濃縮。在10℃下，通過(guò)注射器將殘余的油狀物加入濃縮的氨溶液(20mL)。將反應(yīng)混合物過(guò)濾，并用水洗滌。將白色固體在真空中干燥。獲得所需產(chǎn)物，為白色固體(3.47g,15mmol,58.7％)。

42-3的合成

在室溫下，經(jīng)30min的時(shí)間，向20-2(3.47g,15mmol)在THF(70mL)中的懸浮液分批加入氫化鋁鋰(1.14g,30mmol)。然后將混合物緩慢加熱至回流(65℃油浴)過(guò)夜。將混合物冷卻至5℃，并加入硫酸鈉9水合物。將混合物攪拌2h，通過(guò)硅藻土層過(guò)濾，用含15％MeOH的DCM(200mL)洗滌。將濾液和洗液合并，并濃縮。將殘余的固體在真空中干燥。獲得所需產(chǎn)物，為白色固體(2.86 13.4mmol,89.5％)。

42-4的合成

在室溫下，向肉豆蔻酸(3.86g,16.9mmol)在苯(40mL)和DMF(1滴)中的溶液加入草酰氯(25.35mmol,1.5當(dāng)量3.22g)。將混合物在室溫下攪拌1.5h。在60℃下加熱30min。將混合物濃縮。將殘余物溶于甲苯，并再次濃縮。將殘余的油狀物(淡黃色)溶于20mL的苯，并在10℃下通過(guò)注射器將其加入20-3(2.86 13.4mmol)和三乙胺(3.53mL,1.5當(dāng)量)在苯(40mL)中的溶液。加入后，將得到的混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。反應(yīng)混合物用水稀釋，并用20％H₂SO₄調(diào)節(jié)至pH 6-7。將混合物過(guò)濾并用水洗滌。獲得灰白色固體。將粗產(chǎn)物從甲醇中重結(jié)晶。這得到所需產(chǎn)物，為淡白色固體(5.65g,13mmol,100％)。

42-5的合成

在室溫下，經(jīng)30min的時(shí)間，向20-4(5.65g,13mmol)在THF(60mL)中的懸浮液分批加入氫化鋁鋰(0.99g,26mmol)。然后將混合物緩慢加熱至回流過(guò)夜。將混合物冷卻至0℃，并加入硫酸鈉九水合物。將混合物攪拌2h，然后通過(guò)硅藻土和硅膠的墊過(guò)濾，并首先用乙醚洗滌。濾液變?yōu)闇啙岵⑿纬沙恋?，過(guò)濾得到白色固體。將固體從MeOH重結(jié)晶，并獲得無(wú)色晶狀固體(2.43g)。

然后用含5％MeOH的DCM(400mL)，再用含有1％三乙胺的含10％MeOH的DCM(300mL)洗滌硅藻土和硅膠的墊。合并含有所需產(chǎn)物的流份，并濃縮。獲得白色固體。將固體從MeOH重結(jié)晶，并獲得無(wú)色晶狀固體(0.79g)。將上述兩份固體(2.43g和0.79g)合并，并在真空中干燥(3.20g,60％)。1HNMR(CDCl3于7.27ppm處)δ:2.58(似三重峰,7.2Hz,4H),1.52-1.44(m,4H),1.33-1.24(m,44H),0.89(似三重峰,6.6Hz,6H),2.1-1.3(非常寬的峰,1H)。

42-6的合成

向20-5(7mmol,2.87g)和三乙胺(30mmol,4.18mL)在DCM(100mL)中的溶液加入mPEG-NHS(得自NOF,5.0mmol,9.97g,PEG MW約2,000,n＝約45)的DCM(120mL)溶液。24h后，用水(300mL)洗滌反應(yīng)溶液。用DCM(100mL x 2)將水相萃取兩次。合并DCM萃取物，用鹵水(100mL)洗滌。有機(jī)相經(jīng)硫酸鈉干燥，過(guò)濾，部分濃縮。將濃縮的溶液(約300mL)在約–15℃下冷卻。過(guò)濾得到白色固體(1.030g,未反應(yīng)的起始的胺)。向過(guò)濾物加入Et₃N(1.6mmol,0.222mL,4當(dāng)量)和乙酸酐(1.6mmol,164mg)。將混合物在室溫下攪拌3h，然后濃縮至固體。殘余的固體通過(guò)在硅膠(含0-8％甲醇的DCM)上進(jìn)行柱層析來(lái)純化。這得到所需產(chǎn)物，為白色固體(9.211g)。1HNMR(CDCl3于7.27ppm處)δ:4.19(s,2H),3.83-3.45(m,180-200H),3.38(s,3H),3.28(似三重峰,7.6Hz,2H,CH₂N),3.18(似三重峰,7.8Hz,2H,CH2N),1.89(s,6.6H,水),1.58-1.48(m,4H),1.36-1.21(m,48-50H),0.88(似三重峰,6.6Hz,6H)。

實(shí)施例43

PEG脂質(zhì)的合成

將棕櫚酸(10g)在苯(50mL)中的懸浮液用草酰氯(5mL)處理三小時(shí)。去除溶劑，并將殘余物溶解于二氯甲烷(40mL)。將該溶液緩慢加入攪拌中的濃縮的氨(100mL)。將得到的懸浮液過(guò)濾，并用水洗滌。將沉淀懸浮于甲醇中，升溫至50℃以溶解固體，然后冷卻至室溫。將重結(jié)晶的粗產(chǎn)物過(guò)濾并干燥，得到十六烷?；０?，為白色固體(8.7g)。

將粗產(chǎn)物懸浮于THF(50mL)中，并用氫化鋁鋰(1.1g,緩慢加入)處理。將反應(yīng)混合物攪拌一小時(shí)。緩慢加入過(guò)量的甲醇，然后緩慢加入水(2mL)。加入二氯甲烷(200mL)，并將混合物過(guò)濾。從濾液去除溶劑，得到粗制的十六烷基胺(7g)。

將如上制備的十六烷酰氯(10.5g)的二氯甲烷(40mL)溶液緩慢加入攪拌中的粗制十六烷基胺的二氯甲烷(40mL)溶液。加入三乙胺(15mL)，并將溶液在室溫下攪拌過(guò)夜。將溶液過(guò)濾，并將收集的沉淀(N-(十六烷?；?十六烷基酰胺，約10.7g)在真空下干燥。

將粗產(chǎn)物懸浮于THF(60mL)中并用氫化鋁鋰(1.1g,緩慢加入)處理。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。緩慢加入過(guò)量的甲醇，然后緩慢加入水(3mL)。加入二氯甲烷(250mL)，并將溶液過(guò)濾。去除溶劑，得到粗制的二(十六烷基)胺(7.6g)，為白色粉末。

將二(十六烷基)胺(3g)和單甲氧基-PEG-2000-乙酰基N-羥基琥珀酰亞胺酯(10g)在二氯甲烷(60mL)中的溶液用三乙胺(3mL)處理并攪拌過(guò)夜。加入乙酸酐(1mL)，并將溶液攪拌30分鐘。反應(yīng)混合物用二氯甲烷稀釋，并用鹵水洗滌。有機(jī)部分經(jīng)硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。使用0-8％甲醇/二氯甲烷梯度使殘余物通過(guò)硅膠(75g)柱，以得到43-1，為白色粉末(5.2g)。

實(shí)施例44

PEG脂質(zhì)的合成

將硬脂酸(6.5g)在苯(20mL)中的懸浮液用草酰氯(7mL)處理三天。去除溶劑，并將殘余物溶解于苯(40mL)中。在攪拌下，緩慢加入濃縮的氨(50mL)。將得到的懸浮液過(guò)濾，并用水洗滌。將沉淀懸浮于甲醇中，并過(guò)濾。收集的沉淀用甲醇洗滌并干燥，得到十八烷?；０?，為白色粉末(6.5g)。

將粗產(chǎn)物懸浮于THF(80mL)中，并用過(guò)量的氫化鋁鋰(1.6g,緩慢加入)處理。將反應(yīng)混合物攪拌一小時(shí)。緩慢加入過(guò)量的甲醇，然后緩慢加入濃鹽酸，直至沉淀溶解。反應(yīng)混合物用水稀釋，并使其重結(jié)晶。將溶液過(guò)濾，并將收集的沉淀干燥，得到粗制的十八烷基胺(5.9g)。

在攪拌下，用粗制的十八烷基胺處理如上制備的十八烷酰氯(8g)的二氯甲烷(40mL)溶液。加入三乙胺(15mL)和己烷(100mL)，并將溶液在45℃下攪拌一小時(shí)。將溶液冷卻，過(guò)濾，并用甲醇洗滌收集的沉淀。將沉淀從二氯甲烷重結(jié)晶，得到N-(十八烷?；?十八烷基酰胺(6.8g)，為白色粉末。

將產(chǎn)物懸浮于THF(150mL)中，并用氫化鋁鋰(1.5g,緩慢加入)處理。將反應(yīng)混合物回流過(guò)夜。緩慢加入過(guò)量的甲醇，然后緩慢加入濃鹽酸，直至沉淀溶解。溶液用水稀釋，并使其結(jié)晶。將溶液過(guò)濾，并用水(4x)洗滌收集的沉淀。將沉淀在真空下干燥，得到二十八烷基胺(6.2g)，為白色粉末。

將二十八烷基胺(4.5g)和單甲氧基-PEG-2000-乙?；鵑-羥基琥珀酰亞胺酯(9g)在氯仿(90mL)中的溶液用三乙胺(40mL)處理并在50℃下攪拌30分鐘。將溶液過(guò)濾。將乙酸酐(1mL)加入濾液，并將溶液攪拌15分鐘。加入氨(150mL)，然后加入鹵水(150mL)。用二氯甲烷萃取反應(yīng)混合物，并用稀鹽酸洗滌有機(jī)相。有機(jī)部分經(jīng)硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑。使用0-8％甲醇/二氯甲烷梯度使殘余物通過(guò)硅膠(75g)柱，以得到44-1，為白色粉末(7.4g)。

實(shí)施例45

PEG脂質(zhì)的合成

將月桂酸(10g)在苯(20mL)中的懸浮液用草酰氯(10mL)處理一小時(shí)。去除溶劑，并將殘余物溶解于二氯甲烷(50mL)。將該溶液緩慢加入攪拌中的濃縮的氨(150mL)。用二氯甲烷洗滌反應(yīng)混合物。有機(jī)相經(jīng)硫酸鎂干燥，過(guò)濾并去除溶劑，得到粗制的十二烷?；０?，為白色粉末(10g)。

將產(chǎn)物懸浮于THF(150mL)中，并用氫化鋁鋰(3g,緩慢加入)處理。將反應(yīng)混合物攪拌一小時(shí)。緩慢加入過(guò)量的甲醇，然后緩慢加入氫氧化鈉水溶液(5mL)。加入二氯甲烷(100mL)，并將得到的懸浮液過(guò)濾。從濾液去除溶劑，并使用甲醇/二氯甲烷梯度使殘余物通過(guò)硅膠(80g)柱，得到十二烷基胺(4.5g)。

將月桂酸(7.3g)、粗制的十四烷基胺(4.5g)和N-羥基琥珀酰亞胺(4.2g)在二氯甲烷(200mL)中的溶液用EDC(7.0g)處理，然后用三乙胺(15mL)處理，并將溶液在室溫下攪拌過(guò)夜。將溶液過(guò)濾，得到粗制的N-十二烷?；榛０?1g)粉末。從濾液去除溶劑，將殘余物懸浮于甲醇并過(guò)濾，又得到2g粗制的N-十二烷?；榛０?。

將粗產(chǎn)物(3g)懸浮于THF(60mL)中，并用氫化鋁鋰(過(guò)量，緩慢加入)處理兩小時(shí)。緩慢加入過(guò)量的甲醇，然后緩慢加入水(1mL)。加入二氯甲烷(100mL)，并將懸浮液過(guò)濾。從濾液去除溶劑，并使用0-12％甲醇/二氯甲烷梯度使殘余物通過(guò)硅膠柱(20g)，得到N-十二烷?；榛?1.4g)，為蠟狀固體。

將N-十二烷基十二烷基胺(0.52g)和單甲氧基-PEG-2000-乙?；鵑-羥基琥珀酰亞胺酯(1.5g)在二氯甲烷(10mL)中的溶液用三乙胺(0.2mL)處理并攪拌過(guò)夜。將溶劑去除，并使用0-6％甲醇/二氯甲烷梯度使產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱(20g)。將乙酸酐(5滴)和三甲胺(10滴)加入回收產(chǎn)物的二氯甲烷溶液，并使其攪拌一小時(shí)。將溶劑去除，并使用0-4％甲醇/二氯甲烷梯度使殘余物通過(guò)硅膠(20g)柱，以得到MePEGA-2000-DLA，為白色粉末(0.44g)。

實(shí)施例46

PEG脂質(zhì)的合成

將肉豆蔻酸(30g)在苯(100mL)中的懸浮液用草酰氯(15mL)處理過(guò)夜。將溶劑去除，并將殘余物溶解于二氯甲烷(100mL)。將溶液緩慢加入至攪拌中的濃縮的氨(70mL)。將得到懸浮液過(guò)濾，并用水洗滌。將沉淀干燥，得到粗制的十四烷酰基酰胺，為白色固體(27g)。

將產(chǎn)物懸浮于THF(200mL)中，并用氫化鋁鋰(4.5g,緩慢加入)處理。將反應(yīng)混合物攪拌一小時(shí)。緩慢加入過(guò)量的甲醇，然后緩慢加入水(10mL)。加入二氯甲烷(250mL)，并將得到的懸浮液過(guò)濾。從濾液去除溶劑，得到粗制的十四烷基胺(17.6g)。

將月桂酸(3.5g)、粗制的十四烷基胺(3g)和N-羥基琥珀酰亞胺(1.9g)在二氯甲烷(40mL)中的溶液用EDC(3.3g)處理，然后用三乙胺(4mL)處理，并將溶液在室溫下攪拌三天。將溶液過(guò)濾，并將收集的沉淀干燥，得到粗制的N-月桂?；耐榛?2.6g)粉末。

將粗產(chǎn)物懸浮于THF(60mL)中，并用氫化鋁鋰(0.8g,緩慢加入)處理一小時(shí)。緩慢加入過(guò)量的甲醇，然后緩慢加入水(2mL)。加入二氯甲烷，并將懸浮液過(guò)濾。將溶劑去除，并將殘余物溶解于熱的甲醇(100mL)。將溶液冷卻并過(guò)濾，以得到0.5g的N-十二烷基十四烷基胺。從濾液去除溶劑，并用20mL甲醇重復(fù)該過(guò)程，產(chǎn)生第二批N-十二烷基十四烷基胺(0.9g)。

將N-十二烷基十四烷基胺(0.5g)和單甲氧基-PEG-2000-乙酰基N-羥基琥珀酰亞胺酯(1.5g)在二氯甲烷(10mL)的溶液用三乙胺(0.2mL)處理并攪拌過(guò)夜。將溶劑去除，并使用0-6％甲醇/二氯甲烷梯度使產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱(20g)。將乙酸酐(5滴)和三甲胺(10滴)加入回收產(chǎn)物的二氯甲烷溶液，并使其攪拌一小時(shí)。將溶劑去除，并使用0-4％甲醇/二氯甲烷梯度使殘余物通過(guò)硅膠(20g)柱，以得到MePEGA-2000-LMA，為白色粉末(0.76g)。

實(shí)施例47

使用脂質(zhì)納米顆粒組合物的熒光素酶mRNA體內(nèi)評(píng)估

將陽(yáng)離子脂質(zhì)(MC3)、DSPC、膽甾醇和PEG-脂質(zhì)以50:10:38.5:1.5的摩爾比溶解于乙醇。以約10:1至30:1的總脂質(zhì)與mRNA的重量比制備脂質(zhì)納米顆粒(LNP)。簡(jiǎn)略地，將mRNA在10至50mM檸檬酸鹽緩沖液(pH 4)中稀釋至0.2mg/mL。使用注射器泵，將脂質(zhì)的乙醇溶液與mRNA水溶液以約1:5至1:3(體積/體積)的比例混合，總流速為15ml/min以上。然后去除乙醇，并通過(guò)透析用PBS替代外部的緩沖液。最后，將脂質(zhì)納米顆粒通過(guò)0.2μm孔無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾。使用Nicomp370亞微米粒度分選器(Santa Barbara,CA)通過(guò)準(zhǔn)彈性光散射確定的脂質(zhì)納米顆粒的粒徑為直徑70-90nm。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)(ACC)和加拿大動(dòng)物管理委員會(huì)(CCAC)制定的指南，在6-8周大的雌性C57BL/6小鼠(Charles River)中進(jìn)行研究。通過(guò)尾靜脈注射全身性施用不同劑量的mRNA-脂質(zhì)納米顆粒，并將動(dòng)物在施用后的特定時(shí)間點(diǎn)(1、2、4、8和24hrs)執(zhí)行安樂(lè)死。將肝和脾收集在經(jīng)過(guò)預(yù)稱重的管中，確定重量，立即在液氮中快速冷凍，并且在-80℃下儲(chǔ)存，直至用于分析。

對(duì)于肝，切割約50mg以便在2mL FastPrep管(MP Biomedicals,Solon OH)中進(jìn)行分析。向各個(gè)管中加入1/4”陶瓷球(MP Biomedicals)，并且將與室溫相匹配的500μL Glo溶胞緩沖液–GLB(Promega,Madison WI)加入肝組織。使用FastPrep24儀(MP Biomedicals)將肝組織在2x 6.0m/s下勻化15秒。將勻漿在室溫下孵育5分鐘，然后在GLB中進(jìn)行1:4稀釋，并使用SteadyGlo熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行評(píng)估。具體地，將50μL稀釋的組織勻漿與50μL SteadyGlo底物反應(yīng)，震搖10秒，然后孵育5分鐘，然后使用CentroXS³LB 960光度計(jì)(Berthold Technologies,Germany)定量。使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Pierce,Rockford IL)來(lái)確定測(cè)定的蛋白質(zhì)的量。然后將相對(duì)熒光單位(RLU)以測(cè)定蛋白質(zhì)的總ug數(shù)進(jìn)行歸一化。為了將RLU轉(zhuǎn)化為ng熒光素酶，用QuantiLum重組熒光素酶(Promega)生成了標(biāo)準(zhǔn)曲線。基于圖1中提供的數(shù)據(jù)，選擇四小時(shí)時(shí)間點(diǎn)用于脂質(zhì)制劑的功效評(píng)估(參見實(shí)施例48)。

得自Trilink Biotechnologies的FLuc mRNA(L-6107)將表達(dá)最初從螢火蟲Photinus pyralis分離的熒光素酶蛋白。FLuc常用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)以測(cè)量基因表達(dá)和細(xì)胞活度。其在螢光素底物的存在下發(fā)射出生物光。這種加帽并且聚腺苷酸化的mRNA是被5-甲基胞苷和假尿苷完全取代的。

實(shí)施例48

使用體內(nèi)熒光素酶mRNA表達(dá)的嚙齒動(dòng)物模型確定含有各種陽(yáng)離子

脂質(zhì)的脂質(zhì)納米顆粒制劑的功效

預(yù)先用核酸檢測(cè)了表2中示出的陽(yáng)離子脂質(zhì)。為了比較，這些脂質(zhì)也用于使用串聯(lián)(in line)混合方法配制含有FLuc mRNA(L-6107)的脂質(zhì)納米顆粒，所述串聯(lián)混合方法如實(shí)施例47和PCT/US10/22614(由此通過(guò)引用整體并入本文)中所描述。使用以下摩爾比來(lái)配制脂質(zhì)納米顆粒：50％陽(yáng)離子脂質(zhì)/10％二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)/38.5％膽甾醇/1.5％PEG脂質(zhì)(“PEG-DMG”，即，(1-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻?；视?，具有2000的平均PEG分子量)。在如實(shí)施例47所述的尾靜脈注射施用之后的4小時(shí)內(nèi)，通過(guò)測(cè)量肝中的熒光素酶表達(dá)來(lái)確定相對(duì)活性。所述活性在0.3和1.0mg mRNA/kg的劑量比較，并且，以如實(shí)施例47所述的施用后4小時(shí)測(cè)量的ng熒光素酶/g肝來(lái)表達(dá)。

表2

與mRNA表現(xiàn)出活性的脂質(zhì)

表3中示出的本發(fā)明的新型脂質(zhì)使用以下摩爾比來(lái)配制：50％陽(yáng)離子脂質(zhì)/10％二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)/38.5％膽甾醇/1.5％PEG脂質(zhì)(“PEG-DMA”化合物42-6)。在如實(shí)施例47所述的尾靜脈注射施用之后的4小時(shí)內(nèi)，通過(guò)測(cè)量肝中的熒光素酶表達(dá)來(lái)確定相對(duì)活性。所述活性在0.3和1.0mg mRNA/kg的劑量比較，并且，以如實(shí)施例47所述的施用后4小時(shí)測(cè)量的ng熒光素酶/g肝來(lái)表達(dá)。

表3

新型陽(yáng)離子脂質(zhì)

實(shí)施例49

所配制脂質(zhì)pK_A的確定

如本文其他部分所述，所配制陽(yáng)離子脂質(zhì)的pKa與LNP遞送核酸的效果有關(guān)(參見Jayaraman等人,Angewandte Chemie,國(guó)際版(2012),51(34),8529-8533；Semple等人,Nature Biotechnology 28,172-176(2010))。優(yōu)選的pKa范圍是約5至約7。使用基于2-(對(duì)甲苯胺基)-6-萘磺酸(TNS)的熒光的測(cè)定來(lái)在脂質(zhì)納米顆粒測(cè)定各陽(yáng)離子脂質(zhì)的pK_a。使用實(shí)施例47中描述的串聯(lián)方法來(lái)制備以0.4mM總脂質(zhì)濃度于PBS中的含有陽(yáng)離子脂質(zhì)/DSPC/膽甾醇/PEG-脂質(zhì)(50/10/38.5/1.5mol％)的脂質(zhì)納米顆粒。TNS制成為蒸餾水中的100μM儲(chǔ)備溶液。將囊泡稀釋為于2mL緩沖溶液中的24μM脂質(zhì)，所述緩沖溶液含有10mM HEPES、10mM MES、10mM乙酸銨、130mM NaCl，其中pH為2.5至11。加入等份的TNS溶液以得到1μM的最終濃度，然后在室溫下于SLM Aminco Series 2發(fā)光分光光度計(jì)中使用321nm和445nm的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)來(lái)測(cè)量渦流混合熒光強(qiáng)度。對(duì)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行反曲最佳擬合分析，并且按照得到半最大熒光強(qiáng)度的pH測(cè)量pK_a(參見圖2)。

實(shí)施例50

氨基脂質(zhì)的比較活性和烴鏈結(jié)構(gòu)的影響

表5中示出的陽(yáng)離子脂質(zhì)使用以下摩爾比來(lái)配制：50％陽(yáng)離子脂質(zhì)/10％二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)/38.5％膽甾醇/1.5％PEG-脂質(zhì)(42-6)。在如實(shí)施例48所述的尾靜脈注射施用之后的4小時(shí)內(nèi)，通過(guò)測(cè)量肝中的熒光素酶表達(dá)來(lái)確定相對(duì)活性。所述活性在0.1、0.3和1.0mg mRNA/kg的劑量比較，并且，以如實(shí)施例48所述的施用后4小時(shí)測(cè)量的ng熒光素酶/g肝來(lái)表達(dá)。在圖3中繪制數(shù)據(jù)(從頂部至底部：菱形＝化合物6；正方形＝化合物5；三角形＝MC3；以及圓形＝化合物A)?；衔顰、化合物5和化合物6具有共同的首基(headgroup)但具有不同的烴鏈結(jié)構(gòu)。

表5

比較數(shù)據(jù)

實(shí)施例51

陽(yáng)離子脂質(zhì)的比較活性和首基鏈長(zhǎng)度的影響

表6中示出的陽(yáng)離子脂質(zhì)使用以下摩爾比來(lái)配制：50％陽(yáng)離子脂質(zhì)/10％二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)/38.5％膽甾醇/1.5％PEG-脂質(zhì)(42-6)。在如實(shí)施例48所述的尾靜脈注射施用之后的4小時(shí)內(nèi)，通過(guò)測(cè)量肝中的熒光素酶表達(dá)來(lái)確定相對(duì)活性。所述活性在0.1、0.3和1.0mg mRNA/kg的劑量比較，并且，以如實(shí)施例48所述的施用后4小時(shí)測(cè)量的ng熒光素酶/g肝來(lái)表達(dá)?；螦、B和C具有共同的烴鏈結(jié)構(gòu)，但具有不同的首基鏈長(zhǎng)度?；衔?與化合物A共享優(yōu)選的首基，并且證明了將首基與烴鏈結(jié)構(gòu)結(jié)合的出乎意料的優(yōu)點(diǎn)。

表6

比較數(shù)據(jù)

實(shí)施例52

PEG-DMG和PEG-DMA脂質(zhì)的比較活性

圖4中示出了PEG-DMG和PEG-DMA脂質(zhì)的比較活性。使用以下摩爾比配制LNP：50％MC3脂質(zhì)/10％二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)/38.5％膽甾醇/1.5％PEG-脂質(zhì)(PEG-DMG或PEG-DMA)。在如實(shí)施例48所述的尾靜脈注射施用之后的4小時(shí)內(nèi)，通過(guò)測(cè)量肝中的熒光素酶表達(dá)來(lái)確定相對(duì)活性。所述活性在0.1、0.3和1.0mg mRNA/kg的劑量比較，并且，以如實(shí)施例48所述的施用后4小時(shí)測(cè)量的ng熒光素酶/g肝來(lái)表達(dá)。

數(shù)據(jù)以柱狀圖形式在圖4中呈現(xiàn)。

實(shí)施例53

使用紅色熒光蛋白(稱為櫻桃紅(CR))mRNA的LNP活性

如實(shí)施例47所述，使用化合物6配制具有mRNA的LNP，該mRNA為紅色熒光蛋白(稱為櫻桃紅(CR,例如TriLink Biotechnologies product L-6113))編碼。如實(shí)施例47所述進(jìn)行體內(nèi)研究，并且處理肝組織切片并通過(guò)共焦熒光顯微鏡在施用后的4、6和24小時(shí)觀察。表達(dá)水平在約6小時(shí)處達(dá)到最大值，并且保持到至少24小時(shí)。觀察到的組織切片證明了在肝中的均勻表達(dá)。

實(shí)施例54

LNP將人FIX mRNA體內(nèi)遞送至肝細(xì)胞而引起小鼠血漿中的hFIX蛋

白質(zhì)的治療水平

將表7中示出的具有陽(yáng)離子脂質(zhì)的LNP與編碼人FIX(例如TriLink Biotechnologies product L-6110)的mRNA進(jìn)行配制，使用如實(shí)施例47所述的脂質(zhì)摩爾比：50％脂質(zhì)/10％二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)/38.5％膽甾醇/1.5％PEG-脂質(zhì)。按照各個(gè)供應(yīng)商的說(shuō)明使用可商購(gòu)的試劑盒(例如Abcam ab108831)，通過(guò)ELISA分析血漿蛋白質(zhì)。對(duì)于化合物5和化合物6的LNP，在表7中給出的測(cè)量的hFIX表達(dá)水平是臨床相關(guān)的，并且以1mg/kg的劑量施用這些hFIX mRNA LNP會(huì)得到足以使患者從嚴(yán)重的疾病狀態(tài)轉(zhuǎn)為輕微的疾病狀態(tài)的hFIX蛋白濃度。hFIX處于這些水平的時(shí)間是約15小時(shí)或更長(zhǎng)。

表7

比較數(shù)據(jù)

示例性的實(shí)施方案包括以下：

實(shí)施方案1.具有式I結(jié)構(gòu)的化合物：

或其藥物可接受的鹽、互變異構(gòu)體、前藥或立體異構(gòu)體，其中：

L¹和L²各自獨(dú)立地為–O(C＝O)-、-(C＝O)O-或碳-碳雙鍵；

R^1a和R^1b在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地(a)為H或C₁-C₁₂烴基，或(b)R^1a為H或C₁-C₁₂烴基，并且R^1b連同其連接的碳原子與相鄰的R^1b連同其連接的碳原子一起以形成碳-碳雙鍵；

R^2a和R^2b在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地(a)為H或C₁-C₁₂烴基，或(b)R^2a為H或C₁-C₁₂烴基，并且R^2b連同其連接的碳原子結(jié)合相鄰的R^2b及其連接的碳原子，以形成碳-碳雙鍵；

R^3a和R^3b在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地(a)為H或C₁-C₁₂烴基，或(b)R^3a為H或C₁-C₁₂烴基，并且R^3b連同其連接的碳原子結(jié)合相鄰的R^3b及其連接的碳原子，以形成碳-碳雙鍵；

R^4a和R^4b在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地(a)為H或C₁-C₁₂烴基，或(b)R^4a為H或C₁-C₁₂烴基，并且R^4b連同其連接的碳原子結(jié)合相鄰的R^4b及其連接的碳原子，以形成碳-碳雙鍵；

R⁵和R⁶各自獨(dú)立地為甲基或環(huán)烴基；

R⁷在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為H或C₁-C₁₂烴基；

R⁸和R⁹各自獨(dú)立地為未取代的C₁-C₁₂烴基；或者R⁸和R⁹，連同它們連接的氮原子，一起形成包含一個(gè)氮原子的5元、6元或7元雜環(huán)；

a和d各自獨(dú)立地為0至24的整數(shù)；

b和c各自獨(dú)立地為1至24的整數(shù)；并且

e為1或2，

條件是：

R^1a、R^2a、R^3a或R^4a中的至少一個(gè)為C₁-C₁₂烴基，或者L¹或L²中的至少一個(gè)為-O(C＝O)-或–(C＝O)O-；并且

R^1a和R^1b當(dāng)a為6時(shí)不為不為異丙基，或當(dāng)a為8時(shí)不為正丁基。

實(shí)施方案2.如實(shí)施方案1的化合物，其中L¹或L²之一為-O(C＝O)-。

實(shí)施方案3.如實(shí)施方案1或2中任一項(xiàng)的化合物，其中L¹或L²之一為-(C＝O)O-。

實(shí)施方案4.如實(shí)施方案1-3中任一項(xiàng)的化合物，其中L¹或L²之一為碳-碳雙鍵。

實(shí)施方案5.如實(shí)施方案1的化合物，其中所述化合物具有以下結(jié)構(gòu)(Ia)、(Ib)或(Ic)之一：

實(shí)施方案6.如實(shí)施方案1-5中任一項(xiàng)的化合物，其中a、b、c和d各自獨(dú)立地為2至12的整數(shù)。

實(shí)施方案7.如實(shí)施方案1-5中任一項(xiàng)的化合物，其中a、b、c和d各自獨(dú)立地為5至9的整數(shù)。

實(shí)施方案8.如實(shí)施方案1-7中任一項(xiàng)的化合物，其中R^1a、R^2a、R^3a和R^4a中的至少一個(gè)為H。

實(shí)施方案9.如實(shí)施方案1-7中任一項(xiàng)的化合物，其中R^1a、R^2a、R^3a和R^4a在每次出現(xiàn)時(shí)為H。

實(shí)施方案10.如實(shí)施方案1-7中任一項(xiàng)的化合物，其中R^1a、R^2a、R^3a和R^4a中的至少一個(gè)為C₁-C₈烴基。

實(shí)施方案11.如實(shí)施方案10的化合物，其中C₁-C₈烴基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正己基或正辛基。

實(shí)施方案12.如實(shí)施方案1-11中任一項(xiàng)的化合物，其中R^1b、R^2b、R^3b和R^4b中的至少一個(gè)為H。

實(shí)施方案13.如實(shí)施方案1-11中任一項(xiàng)的化合物，其中R^1b、R^2b、R^3b和R^4b在每次出現(xiàn)時(shí)為H。

實(shí)施方案14.如實(shí)施方案1-11中任一項(xiàng)的化合物，其中R^1b連同其連接的碳原子結(jié)合相鄰的R^1b及其連接的碳原子，以形成碳-碳雙鍵。

實(shí)施方案15.如實(shí)施方案1-11或14中任一項(xiàng)的化合物，其中R^4b連同其連接的碳原子結(jié)合相鄰的R^4b及其連接的碳原子，以形成碳-碳雙鍵。

實(shí)施方案16.如實(shí)施方案1-15中任一項(xiàng)的化合物，其中R⁵或R⁶之一為甲基。

實(shí)施方案17.如實(shí)施方案1-15中任一項(xiàng)的化合物，其中各個(gè)R⁵和R⁶為甲基。

實(shí)施方案18.如實(shí)施方案1-15中任一項(xiàng)的化合物，其中R⁵或R⁶之一為環(huán)烴基。

實(shí)施方案19.如實(shí)施方案1-15中任一項(xiàng)的化合物，其中各個(gè)R⁵和R⁶為環(huán)烴基。

實(shí)施方案20.如實(shí)施方案18或19中任一項(xiàng)的化合物，其中所述環(huán)烴基是未取代的。

實(shí)施方案21.如實(shí)施方案18或19中任一項(xiàng)的化合物，其中所述環(huán)烴基是取代的。

實(shí)施方案22.如實(shí)施方案18或19中任一項(xiàng)的化合物，其中所述環(huán)烴基被C₁-C₆烴基取代。

實(shí)施方案23.如實(shí)施方案22的化合物，其中C₁-C₆烴基為叔丁基。

實(shí)施方案24.如實(shí)施方案18-23中任一項(xiàng)的化合物，其中環(huán)烴基為環(huán)己基。

實(shí)施方案25.如實(shí)施方案1-24中任一項(xiàng)的化合物，其中至少一個(gè)R⁷為H。

實(shí)施方案26.如實(shí)施方案25的化合物，其中各個(gè)R⁷為H。

實(shí)施方案27.如實(shí)施方案1-25中任一項(xiàng)的化合物，其中至少一個(gè)R⁷為C₁-C₆烴基。

實(shí)施方案28.如實(shí)施方案1-27中任一項(xiàng)的化合物，其中e為2。

實(shí)施方案29.如實(shí)施方案1-28中任一項(xiàng)的化合物，其中R⁸或R⁹中的至少一個(gè)為甲基。

實(shí)施方案30.如實(shí)施方案1-29的化合物，其中各個(gè)R⁸和R⁹為甲基。

實(shí)施方案31.如實(shí)施方案1的化合物，其中所述化合物選自表1中的化合物。

實(shí)施方案32.包含實(shí)施方案1-31中任一項(xiàng)的化合物和治療劑的組合物。

實(shí)施方案33.如實(shí)施方案32的組合物，其還包含一種或多種選自中性脂質(zhì)、甾族化合物和聚合物綴合的脂質(zhì)的賦形劑。

實(shí)施方案34.如實(shí)施方案33的組合物，其中所述組合物包含一種或多種選自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM的中性脂質(zhì)。

實(shí)施方案35.如實(shí)施方案34的組合物，其中所述中性脂質(zhì)為DSPC。

實(shí)施方案36.如實(shí)施方案33-35中任一項(xiàng)的組合物，其中所述化合物與所述中性脂質(zhì)的摩爾比為約2:1至約8:1。

實(shí)施方案37.如實(shí)施方案32-36中任一項(xiàng)的組合物，其中所述甾族化合物為膽甾醇。

實(shí)施方案38.如實(shí)施方案37的組合物，其中所述化合物與膽甾醇的摩爾比為約2:1至1:1。

實(shí)施方案39.如實(shí)施方案32-38中任一項(xiàng)的組合物，其中所述聚合物綴合的脂質(zhì)為聚乙二醇化的脂質(zhì)。

實(shí)施方案40.如實(shí)施方案39的組合物，其中所述化合物與所述聚乙二醇化的脂質(zhì)的摩爾比為約100:1至約25:1。

實(shí)施方案41.如實(shí)施方案39或40中任一項(xiàng)的組合物，其中所述聚乙二醇化的脂質(zhì)為PEG-DMG。

實(shí)施方案42.如實(shí)施方案39或40中任一項(xiàng)的組合物，其中所述聚乙二醇化的脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)(II)：

或其藥物可接受的鹽、互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，其中：

R¹⁰和R¹¹各自獨(dú)立地為含有10至30個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烴基鏈，其中所述烴基鏈任選地被一個(gè)或多個(gè)酯鍵中斷；并且

z具有30至60的平均值。

實(shí)施方案43.如實(shí)施方案42的組合物，其中R¹⁰和R¹¹各自獨(dú)立地為含有12至16個(gè)碳原子的直鏈的、飽和的烴基鏈。

實(shí)施方案44.如實(shí)施方案42或43中任一項(xiàng)的組合物，其中平均值z(mì)為約45。

實(shí)施方案45.如實(shí)施方案32-44中任一項(xiàng)的組合物，其中所述治療劑包含核酸。

實(shí)施方案46.如實(shí)施方案45的組合物，其中所述核酸選自反義RNA和信使RNA。

實(shí)施方案47.向由此需要的患者施用治療劑的方法，所述方法包括制備或提供實(shí)施方案32-46中任一項(xiàng)的組合物，并向所述患者施用該組合物。

實(shí)施方案48.具有以下結(jié)構(gòu)(II)的聚乙二醇化的脂質(zhì)：

或其藥物可接受的鹽、互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體，其中：

R¹⁰和R¹¹各自獨(dú)立地為含有10至30個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、飽和或不飽和的烴基鏈，其中所述烴基鏈任選地被一個(gè)或多個(gè)酯鍵中斷；并且

z具有30至60的平均值；

條件是，R¹⁰和R¹¹當(dāng)z為42時(shí)不均為正十八烷基。

實(shí)施方案49.如實(shí)施方案48的聚乙二醇化的脂質(zhì)，其中R¹⁰和R¹¹各自獨(dú)立地為含有12至16個(gè)碳原子的直鏈的、飽和的烴基鏈。

實(shí)施方案50.如實(shí)施方案48或49中任一項(xiàng)的聚乙二醇化的脂質(zhì)，其中z為約45。

實(shí)施方案51.如實(shí)施方案48的聚乙二醇化的脂質(zhì)，其具有以下結(jié)構(gòu)之一：

其中n具有40至50的平均值。

實(shí)施方案52.包含實(shí)施方案48-51中任一項(xiàng)的聚乙二醇化的脂質(zhì)和陽(yáng)離子脂質(zhì)的組合物。

實(shí)施方案53.如實(shí)施方案52的組合物，其中所述陽(yáng)離子脂質(zhì)為實(shí)施方案1-31中任一項(xiàng)的化合物。

可以合并上述各種實(shí)施方案以提供其他實(shí)施方案。本說(shuō)明書中提及的和/或申請(qǐng)數(shù)據(jù)單中列出的所有美國(guó)專利、美國(guó)專利申請(qǐng)公開、美國(guó)專利申請(qǐng)、外國(guó)專利、外國(guó)專利申請(qǐng)和非專利出版物，包括但不限于2014年6月25日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第62/016,839號(hào)，通過(guò)引用整體并入本文。如果有必要，可使用各種專利、申請(qǐng)和出版物的概念修改各實(shí)施方案的方面，來(lái)提供其他的實(shí)施方案。根據(jù)上文詳細(xì)的描述，可以對(duì)實(shí)施方案進(jìn)行這些和其他的改變。通常，在以下權(quán)利要求中，不應(yīng)將所使用的術(shù)語(yǔ)解釋為將權(quán)利要求限定于本說(shuō)明書中公開的特定實(shí)施方案，并且應(yīng)當(dāng)將權(quán)利要求解釋為包括所有可能的實(shí)施方案，以及這些權(quán)利要求有權(quán)享有的等價(jià)物的全部范圍。因此，權(quán)利要求不受本公開內(nèi)容限定。