本發(fā)明尤其涉及式(I)的化合物

其中R¹是甲基并且其中所述甲基包含至少一個(gè)放射性核素。

大麻素受體是一類細(xì)胞膜受體，屬于G蛋白-偶聯(lián)受體超家族。目前存在兩種已知亞型，稱為大麻素受體1(CB1)和大麻素受體2(CB2)。CB1受體具有大的表達(dá)范圍。其主要表達(dá)在中樞神經(jīng)(即杏仁核小腦，海馬體)系統(tǒng)中并且在外周中以較少量表達(dá)。由CNR2基因編碼的CB2主要在免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和T-細(xì)胞上(Ashton，J.C.等Curr Neuropharmacol 2007，5(2)，73-80；Miller，A.M.等Br J Pharmacol 2008，153(2)，299-308；Centonze，D.，等Curr Pharm Des 2008，14(23)，2370-42)，和在胃腸系統(tǒng)中(Wright，K.L.等Br J Pharmacol 2008，153(2)，263-70)外周表達(dá)。CB2受體還存在于腦中，其中它主要發(fā)現(xiàn)于小膠質(zhì)細(xì)胞上而非神經(jīng)元上(Cabral，G.A.等Br J Pharmacol 2008，153(2):240-51)。

對(duì)于CB2受體激動(dòng)劑的興趣在過(guò)去十年間穩(wěn)步提升(目前有30-40件專利申請(qǐng)/年)，原因在于早期化合物中的幾種已經(jīng)在許多人類疾病的臨床前模型中顯示了具有有益效果的事實(shí)，所述疾病包括慢性疼痛(Beltramo，M.Mini Rev Med Chem 2009，9(1)，11-25)，動(dòng)脈粥樣硬化(Mach，F(xiàn).等，J Neuroendocrinol 2008，20Suppl 1，53-7)，骨質(zhì)調(diào)節(jié)(Bab，I.等，Br J Pharmacol 2008，153(2)，182-8)，神經(jīng)炎癥(Cabral，G.A.等，J Leukoc Biol 2005，78(6)，1192-7)，缺血/再灌注損傷(Pacher，P.等，Br J Pharmacol 2008，153(2)，252-62)，系統(tǒng)性纖維化(Akhmetshina，A.等，Arthritis Rheum 2009，60(4)，1129-36；Garcia-Gonzalez，E.等，Rheumatology(Oxford)2009，48(9)，1050-6)，肝纖維化(Julien，B.等，Gastroenterology 2005，128(3)，742-55；Munoz-Luque，J.等，J Pharmacol Exp Ther 2008，324(2)，475-83)。

缺血/再灌注(I/R)損傷是在諸如卒中，心肌梗死，心肺轉(zhuǎn)流術(shù)和其他血管手術(shù)，以及器官移植的病癥中出現(xiàn)的組織損害的主要原因，并且是使各種病因?qū)W的循環(huán)休克過(guò)程復(fù)雜化的終末器官損害的主要機(jī)制。所有這些病癥特征均在于正常血液供給的中斷，導(dǎo)致不充分的組織氧合。再氧合例如再灌注是復(fù)原正常組織氧合的最終治療。但是缺乏來(lái)自血液的氧和營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)生其中循環(huán)的復(fù)原導(dǎo)致進(jìn)一步組織損害的病癥。再灌注損傷的損害原因部分在于損害的組織的炎性反應(yīng)。由新回流的血液運(yùn)送到該區(qū)域的白細(xì)胞響應(yīng)組織損害釋放大量炎性因子如白細(xì)胞介素以及自由基。復(fù)原的血流再引入細(xì)胞內(nèi)的氧，其損害細(xì)胞蛋白，DNA，和質(zhì)膜。

遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理(remote ischemic preconditioning)(RIPC)代表一種利用身體內(nèi)源保護(hù)能力對(duì)抗由缺血和再灌注導(dǎo)致的損傷的策略。其描述其中一個(gè)器官或組織的暫時(shí)性非致死缺血和再灌注給予對(duì)在遠(yuǎn)端器官或組織中“致死”缺血再灌注損傷的隨后事件的抗性的有趣現(xiàn)象。盡管提出了幾種假設(shè)，但器官或組織的暫時(shí)性缺血和再灌注通過(guò)其給予保護(hù)的實(shí)際機(jī)理目前是未知的。

體液假設(shè)提出遠(yuǎn)端器官或組織中產(chǎn)生的內(nèi)源物質(zhì)(如腺苷，緩激肽，阿片樣物質(zhì)，CGRP，內(nèi)源性大麻素(endocannabinoids)，血管緊張素I或一些其他還未確認(rèn)的體液因子)進(jìn)入血流并在靶組織中活化其各自受體并從而恢復(fù)缺血預(yù)處理中涉及的心臟保護(hù)的各種細(xì)胞內(nèi)途徑。

最近的數(shù)據(jù)顯示內(nèi)源性大麻素和它們的受體，特別是CB2，可能涉及于預(yù)處理中并有助于通過(guò)炎癥反應(yīng)的減量調(diào)節(jié)防止再灌注損傷(Pacher，P.等，Br J Pharmacol 2008，153(2)，252-62)。具體地，最近使用CB2工具激動(dòng)劑的研究顯示了該概念用于減少心臟(Defer，N.等，F(xiàn)aseb J 2009，23(7)，2120-30)，腦(Zhang，M.等，J Cereb Blood Flow Metab 2007，27(7)，1387-96)，肝(Batkai，S.等，F(xiàn)aseb J 2007，21(8)，1788-800)和腎(Feizi，A.等，Exp Toxicol Pathol 2008，60(4-5)，405-10)中I/R損傷的功效。

此外，過(guò)去數(shù)年間，越來(lái)越多的文獻(xiàn)表明CB2還可以在亞慢性和慢性情況中有意義。CB1和CB2的特定增量調(diào)節(jié)已經(jīng)顯示在與纖維化有關(guān)的慢性疾病的動(dòng)物模型中(Garcia-Gonzalez，E.等，Rheumatology(Oxford)2009，48(9)，1050-6；Yang，Y.Y.等，Liver Int 2009，29(5)，678-85)與肌成纖維細(xì)胞即作為負(fù)責(zé)纖維化進(jìn)程的細(xì)胞中的CB2相關(guān)表達(dá)關(guān)聯(lián)。

CB2受體通過(guò)選擇性CB2激動(dòng)劑的活化實(shí)際上已經(jīng)顯示在彌散系統(tǒng)性硬化中產(chǎn)生抗纖維化效果(Garcia-Gonzalez，E.等，Rheumatology(Oxford)2009，48(9)，1050-6)并且CB2受體已經(jīng)顯現(xiàn)為實(shí)驗(yàn)真皮纖維化中(Akhmetshina，A.等，Arthritis Rheum 2009，60(4)，1129-36)和在肝病理生理學(xué)，包括與慢性肝病相關(guān)的纖維發(fā)生中(Lotersztajn，S.等，Gastroenterol Clin Biol 2007，31(3)，255-8；Mallat，A.等，Expert Opin Ther Targets 2007，11(3)，403-9；Lotersztajn，S.等，Br J Pharmacol 2008，153(2)，286-9)的關(guān)鍵靶標(biāo)。

明確地檢測(cè)組織中的CB2的需求伴隨對(duì)這種受體的日益增長(zhǎng)的興趣而來(lái)。用適當(dāng)工具評(píng)估患者或樣品中的CB2表達(dá)和受體占有率可以確認(rèn)表達(dá)的靶細(xì)胞，允許人類研究中任何CB2配體的劑量尋找(dose finding)，或者用于診斷目的。

迄今在用于檢測(cè)組織中CB2受體蛋白的有效工具中存在不足，這是CB2受體的低表達(dá)水平的結(jié)果。缺少作為CB2檢測(cè)工具的特異性抗體的另一個(gè)原因可能是因?yàn)槭褂肅B2作為免疫原(imunogen)的明顯困難。

為了解決該問(wèn)題，我們探索了使用選擇性地與CB2結(jié)合的放射性標(biāo)記配體的可能性。據(jù)我們所知，僅存在一種可用的放射性標(biāo)記CB2配體，稱為[³H]-CP55940(Priller,J.等，Molecular Pharmacology 1995,48,288-292)。然而[³H]-CP55940是CB1和CB2受體的非選擇性激動(dòng)劑并且在測(cè)試的多種哺乳動(dòng)物物種中兩種受體之間沒(méi)有區(qū)別。因此，為了檢測(cè)也可能會(huì)表達(dá)CB1的組織中的CB2，需要利用用于競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定的常用同位素³H、用于放射自顯影的¹⁴C或用于PET示蹤技術(shù)的¹¹C放射性標(biāo)記的選擇性CB2配體。

第一策略是鑒別相對(duì)于CB1對(duì)CB2具有高選擇性并且與自然存在的大麻素具有結(jié)構(gòu)同源性的配體。CB2激動(dòng)劑HU-910(在WO 2011/061744中描述)是根據(jù)其高選擇性并且根據(jù)其與在植物中發(fā)現(xiàn)的大麻素類化合物的結(jié)構(gòu)相關(guān)的性質(zhì)選擇的。盡管HU-910選擇性地且競(jìng)爭(zhēng)性地與已經(jīng)用[³H]-CP55940標(biāo)記的CB2受體結(jié)合，[³H]-HU-910顯示出高度非特異性結(jié)合，從而掩蔽與CB2受體的特異性結(jié)合位點(diǎn)(其預(yù)期代表全部結(jié)合位點(diǎn)中的小部分)。在不希望受這種理論約束的情況下，我們把這種現(xiàn)象歸因于[³H]-HU-910的高親油性，引起向膜中的高度分配并且從而引起不能被過(guò)量未標(biāo)記HU-910競(jìng)爭(zhēng)掉的高度非特異性結(jié)合。

因此需要尋找除了效力和選擇性之外具有高親水性的CB2配體，與在化學(xué)合成的最終步驟中引入放射性標(biāo)記的選擇方案配合。

如以上所定義的式(I)的化合物意外地被確認(rèn)具有所需性質(zhì)并且進(jìn)而具有大幅降低的非特異性結(jié)合。

式(I)的化合物被證實(shí)特異性地且選擇性地與由重組表達(dá)CB2受體的細(xì)胞制備的膜結(jié)合。此外，式(I)的化合物的結(jié)果是特異性地標(biāo)記脾組織中的CB2受體，所述脾組織是具有CB1和CB2受體二者的高度表達(dá)的器官。此外，在從CB2受體缺陷的小鼠中分離的脾組織中，不存在被式(I)的化合物結(jié)合。在這種具體情況中，總結(jié)合信號(hào)不會(huì)被過(guò)量的未標(biāo)記的式(I)的化合物(R¹＝CH₃)降低。

式(I)的化合物因此可以例如在組織放射自顯影和PET成像中使用，例如，用以評(píng)估受體表達(dá)和受體占有率，用于人類研究中任何CB2配體的劑量尋找或用于診斷目的。

在本說(shuō)明書中，術(shù)語(yǔ)“放射性核素”定義具有不穩(wěn)定原子核并且經(jīng)歷放射性衰變的原子的同位素。本發(fā)明的具體的放射性核素是[³H]、[¹¹C]和[¹⁴C]。

術(shù)語(yǔ)“結(jié)合常數(shù)”是指與配體和受體的結(jié)合反應(yīng)相關(guān)的平衡常數(shù)。

術(shù)語(yǔ)“選擇性結(jié)合”表征配體與非常有限類型的受體的結(jié)合。

本發(fā)明因此涉及:

式(I)的化合物，其中所述至少一個(gè)放射性核素獨(dú)立地選自[³H]、[¹¹C]和[¹⁴C]；

式(I)的化合物，其中R¹是C[³H]₃、[¹¹C]H₃或[¹⁴C]H₃；

式(I)的化合物，其選自

(NE)-N-[5-叔丁基-2-(環(huán)丁基甲基)-1-(三氚甲基)吡唑-3-亞基]-2-(2-羥基-2-甲基-丙氧基)-5-(三氟甲基)苯甲酰胺；

(NE)-N-[5-叔丁基-2-(環(huán)丁基甲基)-1-([¹⁴C]甲基)吡唑-3-亞基]-2-(2-羥基-2-甲基-丙氧基)-5-(三氟甲基)苯甲酰胺；和

(NE)-N-[5-叔丁基-2-(環(huán)丁基甲基)-1-([¹¹C]甲基)吡唑-3-亞基]-2-(2-羥基-2-甲基-丙氧基)-5-(三氟甲基)苯甲酰胺；

式(I)的化合物用于定位患者或樣品中CB2受體的用途；

式(I)的化合物用于將患者或樣品中CB2受體成像的用途；

式(I)的化合物用于確定另一種化合物是否與CB2受體結(jié)合的用途；

式(I)的化合物用于確定另一種化合物是否與CB2受體結(jié)合的用途還包括測(cè)量所述另一種化合物與所述CB2受體的結(jié)合常數(shù)；

在CB1受體的存在下的如以上所定義的用途；

式(I)的化合物用于確定疾病是否以CB2受體表達(dá)的改變?yōu)樘卣鞯挠猛荆?/p>

式(I)的化合物用于確定疾病是否以CB2受體表達(dá)的改變?yōu)樘卣鞯挠猛?，其中所述疾病是疼痛、?dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis)、老年性黃斑變性(age-related macular degeneration)、糖尿病性視網(wǎng)膜病(diabetic retinopathy)、青光眼(glaucoma)、糖尿病(diabetes mellitus)、炎癥、炎性腸病(inflammatory bowel disease)、缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury)、急性肝衰竭(acute liver failure)、肝纖維化(liver fibrosis)、肺纖維化(lung fibrosis)、腎纖維化(kidney fibrosis)、系統(tǒng)性纖維化(systemic fibrosis)、急性同種異體移植排斥(acute allograft rejection)、慢性同種異體移植腎病(chronic allograft nephropathy)、糖尿病腎病(diabetic nephropathy)、腎小球性腎病(glomerulonephropathy)、心肌病(cardiomyopathy)、心力衰竭(heart failure)、心肌缺血(myocardial ischemia)、心肌梗死(myocardial infarction)、系統(tǒng)性硬化(systemic sclerosis)、熱損傷(thermal injury)、燒傷(burning)、肥厚性瘢痕(hypertrophic scars)、瘢痕疙瘩(keloids)、齦炎發(fā)熱(gingivitis pyrexia)、肝硬化(liver cirrhosis)或腫瘤、骨質(zhì)調(diào)節(jié)(regulation of bone mass)、神經(jīng)變性(neurodegeneration)、卒中(stroke)、短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attack)或葡萄膜炎(uveitis)；

式(I)的化合物，其用于診斷患有疾病的患者或組織；

如以上所定義的用于診斷患有疾病的患者或組織的式(I)的化合物，其中，所述疾病的特征在于與健康受試者或組織中CB2受體的表達(dá)相比，所述患者或組織中CB2受體的表達(dá)的改變；

如以上所定義使用的化合物，其中所述診斷包括將所述患者或組織中CB2受體的表達(dá)與健康受試者或組織中CB2受體的表達(dá)進(jìn)行比較的步驟；

式(I)的化合物用于預(yù)測(cè)感染疾病的患者是否可能響應(yīng)于涉及CB2配體施用的治療的用途；

式(I)的化合物用于預(yù)測(cè)感染疾病的患者是否可能響應(yīng)于涉及CB2配體施用的治療的用途包括：將所述患者中CB2受體的表達(dá)與健康受試者或組織中CB2受體的表達(dá)進(jìn)行比較；和

式(I)的化合物用于確定需要向需要其的患者施用的CB2配體的劑量的用途。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于鑒別與CB2受體結(jié)合的化合物的方法，其包括以下步驟:

(a)使疑似與CB2受體結(jié)合的化合物與包含CB2受體和式(I)的化合物的樣品接觸；和

(b)監(jiān)測(cè)所述疑似與CB2受體結(jié)合的化合物是否影響式(I)的化合物與CB2受體的結(jié)合。

本發(fā)明還涉及如以上所定義的方法，其還包括測(cè)量所述疑似與CB2受體結(jié)合的化合物與CB2受體的結(jié)合強(qiáng)度的步驟。

本發(fā)明還涉及用于確定化合物是否相對(duì)于CB1受體選擇性地與CB2受體結(jié)合的方法，其包括以下步驟:

(a)使疑似選擇性地與CB2受體結(jié)合的化合物與包含CB1受體、CB2受體和式(I)的化合物的樣品接觸；和

(b)監(jiān)測(cè)所述疑似選擇性地與CB2受體結(jié)合的化合物是否影響式(I)的化合物與CB2受體的結(jié)合。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及如以上所定義的用于確定化合物是否相對(duì)于CB1受體選擇性地與CB2受體結(jié)合的方法還包括：測(cè)量所述疑似選擇性地與CB2受體結(jié)合的化合物與CB2受體的結(jié)合常數(shù)。

本發(fā)明還涉及用于鑒別作為CB2受體的細(xì)胞受體的方法，其包括以下步驟:

(a)使疑似包含CB2受體的樣品與式(I)的化合物接觸；和

(b)監(jiān)測(cè)是否出現(xiàn)了式(I)的化合物的結(jié)合；以及

(c)任選進(jìn)一步使所述樣品與另一種已知CB2配體接觸并且監(jiān)測(cè)所述已知CB2配體是否已經(jīng)將式(I)的化合物從其結(jié)合位點(diǎn)置換。

本發(fā)明還涉及用于測(cè)量動(dòng)物、患者或樣品中當(dāng)將一定劑量的疑似與CB2受體結(jié)合的化合物施用于所述動(dòng)物或患者或者與所述樣品接觸時(shí)CB2受體被所述化合物占據(jù)的百分?jǐn)?shù)的方法，其包括以下步驟:

(a)將式(I)的化合物施用于動(dòng)物或患者或者與包含至少一種CB2受體的樣品接觸，所述化合物的量足以占據(jù)所述動(dòng)物、患者或樣品的100％CB2受體；

(b)將所述劑量的所述疑似與CB2受體結(jié)合的化合物施用于所述動(dòng)物或患者或者與所述樣品接觸；

(c)監(jiān)測(cè)式(I)的化合物被所述疑似與CB2受體結(jié)合的化合物的置換；和

(d)計(jì)算所述至少一種CB2受體被所述疑似與CB2受體結(jié)合的化合物占據(jù)的百分?jǐn)?shù)。

本發(fā)明還涉及用于確定需要向需要其的患者施用的CB2配體的劑量的方法，其包括以下步驟:

(a)確定動(dòng)物或樣品中在將已知在所述動(dòng)物或樣品中提供藥理學(xué)反應(yīng)的劑量的所述CB2配體施用于所述動(dòng)物或者與所述樣品接觸之后CB2受體被所述CB2配體占據(jù)的百分?jǐn)?shù)，包括:

(a1)將足以占據(jù)所述動(dòng)物或樣品的100％CB2受體的量的式(I)的化合物施用于所述動(dòng)物或者與所述樣品接觸；

(a2)將已知在所述動(dòng)物或樣品中提供所述藥理學(xué)反應(yīng)的所述劑量施用于所述動(dòng)物或與所述樣品接觸；

(a3)監(jiān)測(cè)式(I)的化合物被所述CB2配體的置換；和

(a4)計(jì)算CB2受體被所述CB2配體占據(jù)的百分?jǐn)?shù)；

(b)確定在人受試者或樣品中給出CB2受體被所述CB2配體占據(jù)的相同百分?jǐn)?shù)的所述CB2配體的劑量，包括:

(b1)將足以占據(jù)所述人受試者的100％CB2受體的量的式(I)的化合物施用于所述人受試者或者與所述樣品接觸；

(b2)將一定劑量的所述CB2配體施用于所述人受試者或者與所述樣品接觸；

(b3)監(jiān)測(cè)式(I)的化合物被所述CB2配體的置換；和

(b4)計(jì)算CB2受體被所述CB2配體占據(jù)的百分?jǐn)?shù)；

(b5)重復(fù)步驟(b2)至(b4)，直到在步驟(b4)中也得到在步驟(a4)中計(jì)算的CB2受體的百分?jǐn)?shù)；和

(b6)計(jì)算已經(jīng)在步驟(b2)中施用的劑量的加和，從而得到需要向患者施用的所述CB2配體的劑量。

本發(fā)明還涉及用于確定疾病是否以CB2受體表達(dá)的改變?yōu)樘卣鞯姆椒?，其包括以下步驟:

(a)將式(I)的化合物與樣品接觸或者施用于感染所述疾病的受試者以及與健康樣品接觸或者施用于健康受試者；

(b)監(jiān)測(cè)兩個(gè)樣品中是否出現(xiàn)式(I)的化合物的結(jié)合；和

(c)比較兩個(gè)樣品中與所述CB2受體結(jié)合的式(I)的化合物的量。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明的方法，其中在監(jiān)測(cè)期間使用放射自顯影或正電子發(fā)射斷層掃描。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及藥物組合物，其包含式(I)的化合物。

本發(fā)明還涉及式(I)的化合物，其用作診斷劑，即用于診斷疾病。

本發(fā)明還涉及式(I)的化合物，其用于診斷疼痛、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis)、老年性黃斑變性(age-related macular degeneration)、糖尿病性視網(wǎng)膜病(diabetic retinopathy)、青光眼(glaucoma)、糖尿病(diabetes mellitus)、炎癥、炎性腸病(inflammatory bowel disease)、缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury)、急性肝衰竭(acute liver failure)、肝纖維化(liver fibrosis)、肺纖維化(lung fibrosis)、腎纖維化(kidney fibrosis)、系統(tǒng)性纖維化(systemic fibrosis)、急性同種異體移植排斥(acute allograft rejection)、慢性同種異體移植腎病(chronic allograft nephropathy)、糖尿病腎病(diabetic nephropathy)、腎小球性腎病(glomerulonephropathy)、心肌病(cardiomyopathy)、心力衰竭(heart failure)、心肌缺血(myocardial ischemia)、心肌梗死(myocardial infarction)、系統(tǒng)性硬化(systemic sclerosis)、熱損傷(thermal injury)、燒傷(burning)、肥厚性瘢痕(hypertrophic scars)、瘢痕疙瘩(keloids)、齦炎發(fā)熱(gingivitis pyrexia)、肝硬化(liver cirrhosis)或腫瘤、骨質(zhì)調(diào)節(jié)(regulation of bone mass)、神經(jīng)變性(neurodegeneration)、卒中(stroke)、短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attack)或葡萄膜炎(uveitis)。

式(I)的化合物的合成可以例如根據(jù)以下方案實(shí)現(xiàn)。

方案1

使用廣泛接受的氚-甲基化試劑，比如磺酸[³H]甲酯(例如，4-硝基苯磺酸-[³H]甲酯)或[³H]甲基碘，通過(guò)去甲基前體N-[5-叔丁基-2-(環(huán)丁基甲基)吡唑-3-基]-2-(2-羥基-2-甲基-丙氧基)-5-(三氟甲基)苯甲酰胺的一步氚-甲基化反應(yīng)，容易得到目標(biāo)化合物。這種合成概念的主要優(yōu)勢(shì)是可以在合成途徑的最后步驟中完成放射性核素的摻入，其通常為履行被稱為ALARA(可合理達(dá)到的盡可能低的劑量(as low as reasonably achieveable))的輻射保護(hù)基本原則的最可行方法。

為了進(jìn)一步使放射性物質(zhì)的使用最小化，通常相對(duì)于放射性甲基化試劑2-3倍過(guò)量使用去甲基前體。

通過(guò)應(yīng)用相同的合成概念并且通過(guò)使用已知的[¹⁴C/¹¹C]標(biāo)記的甲基轉(zhuǎn)移試劑，比如[¹⁴C/¹¹C]MeI或磺酸[¹⁴C/¹¹C]甲酯(例如，三氟甲磺酸[¹⁴C/¹¹C]甲基酯、4-硝基苯磺酸[¹⁴C/¹¹C]甲酯)，可以從相同的前體分子開(kāi)始制備相應(yīng)的[¹⁴C]-和[¹¹C]標(biāo)記的衍生物。

尤其是對(duì)于[¹¹C]標(biāo)記策略來(lái)說(shuō)，歸因于正電子發(fā)射體碳-11的20min的短的半衰期，最重要的是建立短、快速且有效的合成方法。

本發(fā)明因此還涉及用于制造式(I)的化合物的方法，其包括使式(A)的化合物

在4-硝基苯磺酸-[³H]-甲酯、[³H]-甲基碘、三氟甲磺酸-[¹¹C]-甲酯、[¹¹C]-甲基碘、4-硝基苯磺酸-[¹¹C]-甲酯、三氟甲磺酸-[¹⁴C]-甲酯、[¹⁴C]-甲基碘或4-硝基苯磺酸-[¹⁴C]-甲酯的存在下反應(yīng)。

在本發(fā)明的方法中，式(A)的化合物有利地在4-硝基苯磺酸-[³H]-甲酯、三氟甲磺酸-[¹¹C]-甲酯或4-硝基苯磺酸-[¹⁴C]-甲酯的存在下反應(yīng)。

本發(fā)明的方法有利地在甲苯中進(jìn)行。

本發(fā)明的方法有利地在大約100℃至150℃的溫度、尤其是在大約120℃進(jìn)行。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明的方法制造的化合物。

現(xiàn)將通過(guò)以下沒(méi)有限制性質(zhì)的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。

實(shí)施例

縮寫

CAN＝CAS登錄號(hào)；LC＝液相色譜法；MS＝質(zhì)譜法；NMR＝核磁共振；SEM＝平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差；THF＝四氫呋喃；WT＝野生型。

實(shí)驗(yàn)

所有反應(yīng)在氬氣氛下在火焰干燥的玻璃器皿中進(jìn)行。將分析級(jí)溶劑用于反應(yīng)，并且當(dāng)需要時(shí)，在不進(jìn)行進(jìn)一步純化的情況下使用干燥溶劑。除非另外說(shuō)明，試劑購(gòu)自聲譽(yù)良好的供應(yīng)廠商并且在不進(jìn)行進(jìn)一步純化的情況下使用。所有¹H NMR譜在Bruker Advance Ultra Shield 300MHz光譜儀上記錄。相對(duì)于所述的含氘溶劑報(bào)告化學(xué)位移。在PE Sciex API 150EX LC/MS渦輪噴霧系統(tǒng)(Turbo Spray System)上記錄質(zhì)譜。使用Isco Combi Flash companion，使用來(lái)自多個(gè)供應(yīng)廠商的多種尺寸的預(yù)裝的二氧化硅柱(230-400目、40-63μm)，進(jìn)行急驟色譜。薄層層析在購(gòu)自Merck KgaA的預(yù)涂布的板(20x 20cm、硅膠F254)上進(jìn)行并且使用254nm CAMAG UV燈或使用堿性高錳酸鉀溶液可視化。使用薄層層析、LCMS和¹H NMR的組合來(lái)監(jiān)測(cè)所有反應(yīng)。

實(shí)施例1

(NE)-N-[5-叔丁基-2-(環(huán)丁基甲基)-1-(三氚甲基)吡唑-3-亞基]-2-(2-羥基-2-甲基-丙氧基)-5-(三氟甲基)苯甲酰胺

a)N-[5-叔丁基-2-(環(huán)丁基甲基)吡唑-3-基]-2-氟-5-(三氟甲基)苯甲酰胺

向3-叔丁基-1-(環(huán)丁基甲基)-1H-吡唑-5-胺(458mg，2.21mmol，CAN 1018679-74-7)和三乙胺(670mg，923μL，6.62mmol)在無(wú)水THF(9mL)中的溶液中逐滴加入2-氟-5-(三氟甲基)苯甲酰氯(500mg，333μL，2.21mmol，CAN 207981-46-2)在無(wú)水THF(9mL)中的溶液。將粉色懸浮液在環(huán)境溫度攪拌30分鐘并且用1M碳酸氫鈉水溶液(70mL)萃取。將水層用乙酸乙酯(3x 70mL)萃取。將有機(jī)層合并并且使用硫酸鈉干燥，之后在真空中濃縮。通過(guò)閃蒸層析(在庚烷中10％至20％乙酸乙酯)將粗物質(zhì)純化，得到794.4mg(2.0mmol，91％收率)的作為橙色粉末的標(biāo)題化合物。

¹H NMR(300MHz,氯仿-d)δppm 1.32(s,9H),1.72-2.20(m,6H),2.81(dt,J＝14.73,7.37Hz,1H),4.04(d,J＝7.06Hz,2H),6.37(s,1H)7.38(dd,J＝11.61,8.58Hz,1H),7.80-7.91(m,1H),8.27(d,J＝15.95Hz,1H),8.53(dd,J＝6.96,2.32Hz,1H)。MS m/z 398.2[M+H]⁺。

b)N-[5-叔丁基-2-(環(huán)丁基甲基)吡唑-3-基]-2-(2-羥基-2-甲基-丙氧基)-5-(三氟甲基)苯甲酰胺

將叔丁醇鉀(203mg，1.81mmol)加入至2-甲基丙烷-1,2-二醇(136mg，138μL，1.51mmol，CAN 558-43-0)在無(wú)水THF(7mL)中的冰冷的溶液中。將無(wú)色懸浮液在0℃攪拌5分鐘，使其升溫至室溫并且攪拌1小時(shí)。在0℃下，加入(N-[5-叔丁基-2-(環(huán)丁基甲基)吡唑-3-基]-2-氟-5-(三氟甲基)苯甲酰胺(400mg，1.01mmol)。將所得的黃色懸浮液在室溫下攪拌72h。加入叔丁醇鉀(203mg，1.81mmol)并且在70℃繼續(xù)攪拌2小時(shí)。加入1M碳酸氫鈉水溶液(50mL)和乙酸乙酯(50mL)并且分層。將水相用乙酸乙酯(2x 50mL)萃取。將有機(jī)層合并并且使用硫酸鈉干燥，之后在真空中濃縮。通過(guò)急驟色譜(在庚烷中30至50％乙酸乙酯)將粗物質(zhì)純化，得到334mg(0.714mmol，71％收率)的作為白色粉末的標(biāo)題化合物。

¹H NMR(300MHz,氯仿-d)δppm 1.30(s,9H),1.43(s,6H),1.69-2.05(m,6H),2.77(dt,J＝14.63,7.22Hz,1H),4.02-4.19(m,4H),6.19(s,1H),7.13(d,J＝8.88Hz,1H),7.75(dd,J＝8.68,2.42Hz,1H),8.55(d,J＝2.22Hz,1H),9.69(s,1H)。MS m/z 468.3[M+H]⁺。

c)(NE)-N-[5-叔丁基-2-(環(huán)丁基甲基)-1-(三氚甲基)吡唑-3-亞基]-2-(2-羥基-2-甲基-丙氧基)-5-(三氟甲基)苯甲酰胺

在1ml的螺絲帽小瓶中，將N-[5-叔丁基-2-(環(huán)丁基甲基)吡唑-3-基]-2-(2-羥基-2-甲基-丙氧基)-5-(三氟甲基)苯甲酰胺(1.0mg，2.14μmmol)加入至4-硝基苯磺酸-[³H]甲酯(50mCi，0.16mg，0.71μmmol)在無(wú)水甲苯(50μL)中的溶液中。將小瓶封閉并且將反應(yīng)混合物在120℃攪拌2h。之后，通過(guò)急驟色譜(二氧化硅，二氯甲烷/甲醇95:5)將粗物質(zhì)純化，得到21.4mCi(43％)的>99％放射化學(xué)純度(HPLC：X-Bridge C18，乙腈/甲酸鹽緩沖液pH3.0)和85Ci/mmol的比活性的標(biāo)題化合物。

實(shí)施例2

(NE)-N-[5-叔丁基-2-(環(huán)丁基甲基)-1-([¹⁴C]甲基)吡唑-3-亞基]-2-(2-羥基-2-甲基-丙氧基)-5-(三氟甲基)苯甲酰胺

在2ml的螺絲帽小瓶中，將N-[5-叔丁基-2-(環(huán)丁基甲基)吡唑-3-基]-2-(2-羥基-2-甲基-丙氧基)-5-(三氟甲基)苯甲酰胺(209mg，0.45mmol)加入至4-硝基苯磺酸-[14C]甲酯(25mCi，98mg，0.45mmol)在無(wú)水甲苯(1.5mL)中的溶液中。將小瓶封閉并且將反應(yīng)混合物在120℃攪拌20h。在移除溶劑之后，通過(guò)急驟色譜(二氧化硅，二氯甲烷/甲醇/三乙胺97:3:0.5)將粗物質(zhì)純化，得到8.7mCi(35％)的>99％放射化學(xué)純度(HPLC：X-Bridge C18，水/含有0.05％三乙胺的乙腈)和56mCi/mmol的比活性的標(biāo)題化合物。

實(shí)施例3

(NE)-N-[5-叔丁基-2-(環(huán)丁基甲基)-1-([¹¹C]甲基)吡唑-3-亞基]-2-(2-羥基-2-甲基-丙氧基)-5-(三氟甲基)苯甲酰胺

通過(guò)¹⁴N(p，α)¹¹C核反應(yīng)，在Cyclone 18/9回旋加速器(18-MeV，IBA，比利時(shí))以[¹¹C]CO₂的形式制備碳-11。在包括[¹¹C]CO₂在鎳催化劑上還原為[¹¹C]甲烷和隨后的氣相碘化的2步反應(yīng)序列中產(chǎn)生[¹¹C]甲基碘([¹¹C]MeI)。在190℃經(jīng)過(guò)AgOTf/C柱之后，形成更高反應(yīng)性的三氟甲磺酸-[¹¹C]甲酯(大約30GBq)，其鼓泡通過(guò)含有N-[5-叔丁基-2-(環(huán)丁基甲基)吡唑-3-基]-2-(2-羥基-2-甲基-丙氧基)-5-(三氟甲基)苯甲酰胺(3mg，6.46μmol)和無(wú)水甲苯(0.25mL)的3mL反應(yīng)器小瓶。在5min內(nèi)將混合物加熱至150℃。在用在水(1.5mL)中的30％乙腈稀釋后，使用半制備型HPLC(柱：Sunfire C18 5μm；10x 150mm；在大約10min的產(chǎn)物峰)將粗產(chǎn)物純化。將收集的產(chǎn)物用水(10mL)稀釋，捕獲在C18筒(Waters，用5mL EtOH和10mL水預(yù)處理)上，用水(5mL)洗滌并且用EtOH(0.5mL)洗脫。為了配制最終產(chǎn)物，加入注射用水(9.5mL)，得到5％的乙醇濃度。為了質(zhì)量控制，將等分的配制溶液注射至分析HPLC系統(tǒng)(柱：ACE柱，C18，3μm)中。通過(guò)與其非放射性參比化合物的保留時(shí)間比較并且通過(guò)共同注射，確認(rèn)¹¹C標(biāo)記的產(chǎn)物的身份。通過(guò)UV峰強(qiáng)度與冷參比化合物的校準(zhǔn)曲線的比較，計(jì)算產(chǎn)物的比活性。在典型實(shí)驗(yàn)中，比活性為≥500GBq/μmol，并且在合成最后的總活性為2±1.00GBq(n＝30)。自粒子輻射(bombardment)結(jié)束起的總合成時(shí)間是大約40min。

實(shí)施例4

小鼠中的放射性配體結(jié)合

細(xì)胞培養(yǎng)

在補(bǔ)充有10％FBS、300μg ml-1潮霉素(hygromycin)和800μg ml-1遺傳霉素(geneticin)(G418)的F-12營(yíng)養(yǎng)混合物(HAM)中培養(yǎng)表達(dá)人CB1和人CB2的CHO-K1β-抑制蛋白(arrestin)細(xì)胞(DiscoveRx Inc.，F(xiàn)remont，CA)。細(xì)胞于潮濕氣氛中在37℃在5％CO2下溫育。

放射性配體結(jié)合測(cè)定

使用玻璃罐和以47,800g在4℃離心30min，在pH 7.4的15mmol L-1Hepes、0.3mmol L-1EDTA、1mmol L-1EGTA、2mmol L-1MgCl₂、完全無(wú)EDTA蛋白酶抑制劑(Roche Applied Science，Rotkreuz，瑞士)中，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或脾組織均化。之后在相同緩沖液中將片狀沉淀物重新均化兩次并且離心(47,800g，4℃，30min)。之后在pH 7.4的75mmol L-1Tris、0.3mmol L-1EDTA、1mmol L-1EGTA、12.5mmol L-1MgCl₂、250mmol L-1蔗糖中，將最終片狀沉淀物以1至3mg mL-1的蛋白質(zhì)濃度重懸，等分，在干冰上冷凍并且在-80℃儲(chǔ)存。

飽和結(jié)合

用0.05至2.4nM的式(I)的化合物和40μg的膜蛋白進(jìn)行飽和結(jié)合。使用CP55940(10μM)限定非特異性結(jié)合。測(cè)定緩沖液由pH 7.4的50mmol.L-1Tris-HCl、5mmol L-1MgCl₂、2.5mmol L-1EGTA、和0.1％無(wú)脂肪酸BSA組成。通過(guò)以250μl/孔的最終體積加入膜來(lái)開(kāi)始測(cè)定。將測(cè)定物在室溫下溫育2h，然后在Filtermate細(xì)胞收集器(cell harvester)上通過(guò)在0.3％聚乙烯亞胺中預(yù)浸漬的Packard GF/B過(guò)濾器真空過(guò)濾并且用洗滌緩沖液(50mmol L-1Tris-HCl、5mmol L-1MgCl₂、2.5mmol L-1EGTA和0.5％無(wú)脂肪酸BSA，pH 7.4)沖洗。

競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合

對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合來(lái)說(shuō)，或者在存在或不存在逐漸增加的濃度的未標(biāo)記的式(I)的化合物(R¹＝CH₃)的情況下用0.3nM的[³H]-CP55940，或者在存在或不存在CP55940(10μM)的情況下用1.5nM式(I)的化合物和逐漸增加的量的膜(2.5-80μg)，將膜制劑在30℃在0.2mL最終體積的50mmol L-1Tris-HCl、5mmol L-1MgCl₂、2.5mmol L-1EGTA、0.1％無(wú)脂肪酸BSA和1％DMSO的pH 7.4的緩沖液中溫育，輕輕地振蕩。通過(guò)在0.5％聚乙烯亞胺預(yù)浸漬的GF/B過(guò)濾板(Packard)上真空過(guò)濾接著用2mL的含有0.5％無(wú)脂肪酸BSA的冰冷結(jié)合緩沖液簡(jiǎn)短洗滌七次，終止所有結(jié)合反應(yīng)。將板在50℃干燥1h并且使用液體閃爍計(jì)數(shù)確定所結(jié)合的放射性標(biāo)記。通過(guò)四參數(shù)邏輯模型使用ActivityBase(ID Business Solution,Ltd.)確定IC50值和Hill斜率。

結(jié)果在以下表1和在圖1至3中示出。

表1

使用表達(dá)人CB2受體的CHO-K1細(xì)胞的[³H]-CP55940的放射性配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合

表1說(shuō)明了在重組表達(dá)人CB1受體和人CB2受體的細(xì)胞中并且使用非選擇性CB1/CB2放射性配體[³H]-CP55940，未標(biāo)記的式(I)的化合物(R¹＝CH₃)對(duì)于人CB2受體(pKi 8.97)相對(duì)于人CB1受體(pKi 5.41)的高結(jié)合選擇性。

圖1：使用小鼠脾組織WT的放射性配體結(jié)合(1.5nM[³H]-式(I)的化合物)

圖1示出了式(I)的化合物在小鼠脾組織中的高特異性結(jié)合。使用逐漸增加的量的膜，非特異性結(jié)合保持恒定，但是特異性結(jié)合增加。

圖2：使用小鼠脾組織WT的放射性配體飽和結(jié)合([³H]-式(I)的化合物)

圖2示出了式(I)的化合物在小鼠脾組織中的特異性結(jié)合是可飽和的。對(duì)于小鼠CB2受體來(lái)說(shuō)，計(jì)算的半數(shù)最大親和性(Kd)是0.58nM，并且在小鼠脾組織中CB2受體表達(dá)水平(Bmax)是430fmol/mg。

圖3：使用小鼠脾KO(NIH)的放射性配體結(jié)合(³[H]-式(I)的化合物)

與圖1相比，圖3示出了在從CB2缺失的小鼠取得的小鼠脾組織中缺少式(I)的化合物的特異性結(jié)合。使用逐漸增加的量的膜，特異性結(jié)合仍然不存在，表明與CB2受體的高特異性結(jié)合，如在從野生型同窩出生仔畜中取得的小鼠脾組織中證明的。