本發(fā)明涉及編碼人乳頭瘤病毒抗原的基因及其在疫苗開發(fā)中的用途，特別是用于在人類中預(yù)防人乳頭瘤病毒感染的用途。本發(fā)明還提供了使用酵母的經(jīng)改進(jìn)人乳頭瘤病毒疫苗組合物。
背景技術(shù)：
：世界范圍內(nèi)，宮頸癌是在婦女中第二大常見的癌癥，其造成每年274,000例死亡。印度宮頸癌的發(fā)病率約為每年132,000例，占亞太地區(qū)記錄疾病發(fā)病率的近52％。在印度每年有將近73,000名婦女死于宮頸癌；因此其保有占據(jù)了全球記錄的所有宮頸癌死亡的近四分之一的不光彩的名聲。據(jù)估計(jì)到2025年，發(fā)展中世界的發(fā)病率將占全球發(fā)病率的近80％。人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)是大小約8kb的趨上皮性雙鏈dna病毒。hpv基因組編碼非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(e1、e2、e4、e5、e6和e7)和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(l1和l2)。報(bào)告有120多種hpv類型。高風(fēng)險(xiǎn)hpv類型的持續(xù)感染是誘導(dǎo)宮頸癌的唯一最重要的因素。在高風(fēng)險(xiǎn)hpv類型中，hpv16和18是全世界最常與宮頸癌相關(guān)的基因型。發(fā)現(xiàn)印度宮頸癌中的總體hpv類型發(fā)生率為以下順序：hpv16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59和hpv68。在印度，hpv16和hpv18類型共同貢獻(xiàn)了全部宮頸癌發(fā)病率的將近80％。目前，在全球市場(chǎng)上使用了兩種宮頸癌疫苗：由merck&co.inc.生產(chǎn)的四價(jià)hpv(qhpv)疫苗(merck，rahway，nj，美國)；和由glaxosmithklineplc.生產(chǎn)的二價(jià)hpv疫苗(cervarixtm，gsk，middlesex，英國)。gardasil由美國食品和藥物管理局(fda)于2006年6月批準(zhǔn)，其針對(duì)四種hpv毒株進(jìn)行保護(hù)——hpv6、11、16和18。雖然有超過100種hpv毒株，但某些類型特別可能與癌癥有關(guān)；毒株16和18與美國所有宮頸癌病例的70％相關(guān)。毒株6和11與90％的生殖器疣相關(guān)。在臨床試驗(yàn)中，疫苗在以前未感染過的女性中預(yù)防這四種毒株的持續(xù)感染、癌前病變和外生殖器病變方面表現(xiàn)出高效力。該試驗(yàn)中女性的一個(gè)子集已經(jīng)被隨訪了五年，并且已經(jīng)顯示95.8％的抵抗持續(xù)感染或疾病的疫苗效力和100％的抵抗癌前和外部病變效力。需要進(jìn)一步的后續(xù)研究來確定保護(hù)期，但研究已表明，10-14歲的青少年女性比15-24歲的女性對(duì)疫苗表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，這表明更早期的疫苗接種可導(dǎo)致更長久的抗體持久性。其他最近的研究已表明，疫苗還提供對(duì)陰道和外陰癌的保護(hù)。根據(jù)alanguttmacher研究所，hpv疫苗“被廣泛認(rèn)為是近年來對(duì)婦女最偉大的衛(wèi)生保健進(jìn)展之一”。與qhpv疫苗不同，二價(jià)hpv疫苗僅由兩種抗原組成：hpv16型和18型。對(duì)于其l1蛋白的合成，將基因克隆到桿狀病毒表達(dá)載體中，并將所制造的載體感染到昆蟲細(xì)胞粉紋夜蛾細(xì)胞(highfive)中，隨后在無血清培養(yǎng)基中孵育兩天；然后收獲細(xì)胞。目前可用并經(jīng)評(píng)估的hpv疫苗靶向預(yù)防hpv16型和18型的感染。hpv疫苗由通過重組技術(shù)產(chǎn)生的病毒樣顆粒(virus-likeparticle，vlp)制備，并且作為三次0.5ml肌內(nèi)注射在六個(gè)月時(shí)期內(nèi)施用。最近的結(jié)果表明，hpv疫苗是高度免疫原性的，在幾乎所有接種疫苗的婦女中誘導(dǎo)高水平的血清抗體，并且在完全接種疫苗的婦女中賦予了針對(duì)hpv-16/18感染和因此相關(guān)的癌前宮頸病變的高度保護(hù)。已在33個(gè)國家的27,000名婦女中評(píng)估的四價(jià)(hpv6/11/16/18)疫苗已被證明可有效預(yù)防超過99％的持續(xù)感染。根據(jù)本發(fā)明的疫苗使用在早期hpv疫苗的開發(fā)中所使用的重組技術(shù)產(chǎn)生。通過使用重組技術(shù)獲得所需蛋白質(zhì)產(chǎn)物所涉及的主要步驟是將所需基因克隆到表達(dá)載體中，將基因表達(dá)在宿主細(xì)胞中(其可以稱為表達(dá)系統(tǒng))，對(duì)從插入基因獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行純化和表征。在每個(gè)上述步驟中通常使用的方法和組分在現(xiàn)有技術(shù)中廣泛可用。所有這些提及的步驟對(duì)其中通常使用的組分具有一些限制和依賴性，例如表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、核苷酸序列等。本領(lǐng)域技術(shù)人員必須分析重組技術(shù)中每種組分彼此的相容性。本發(fā)明提供了使用酵母作為表達(dá)系統(tǒng)的具有新的密碼子優(yōu)化基因的人乳頭瘤病毒疫苗組合物，所述基因編碼四種不同hpv類型(hpv16、hpv18、hpv6和hpv11)晚期hpv蛋白的hpv蛋白質(zhì)。眾所周知，毒株hpv16和hpv18的組合僅可以保護(hù)所有流行hpv毒株中的70％。因此，建議向疫苗中加入額外的抗原。由于世界上的區(qū)域之間存在流行病學(xué)差異，建議在世界上的相關(guān)區(qū)域中包括更多的血清型(對(duì)于印度是hpv33和hpv45)以提供更廣泛的保護(hù)。已經(jīng)描述了l2抗原與l1抗原一起將擴(kuò)大保護(hù)的覆蓋范圍。發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明開發(fā)的人乳頭瘤疫苗的體內(nèi)血清轉(zhuǎn)化應(yīng)答遠(yuǎn)優(yōu)于現(xiàn)有的參考產(chǎn)品。在本發(fā)明的現(xiàn)有領(lǐng)域中，在本領(lǐng)域中可以得知，用含有野生型hpv16l1基因的相同質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母(p.pastoris)(km71菌株)不表達(dá)l1蛋白，表明需要對(duì)巴斯德畢赤酵母中的hpv16l1表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。[bazan等，archvirol.2009；154(10)；p1-16]本文描述了hpv16l1基因的密碼子優(yōu)化，并將其克隆到非整合載體中，并進(jìn)一步用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。bazan等公開了vlp似乎更規(guī)律和受限(45-50nm)。已知對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)，附加體載體(episomalvector)(非整合載體)不是有利的，因?yàn)檗D(zhuǎn)化的酵母在連續(xù)的有絲分裂后可能丟失這些載體，這是因?yàn)樗鼈儾徽系交蚪M中，因此可在不存在選擇壓力的情況下丟失。需要使密碼子優(yōu)化基因在選定的表達(dá)系統(tǒng)中獲得表達(dá)。用于采用合適表達(dá)系統(tǒng)的任何抗原，這種技術(shù)在本領(lǐng)域中是為人熟知的。例如，n.hanumantharao等，vaccine29(2011)7326-7334描述了在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)人乳頭瘤病毒16型和18型的密碼子優(yōu)化的主要衣殼蛋白(l1)。此外，hanumantharao等公開了“thepurifiedvlpsofhpv16andhpv18showedvariableparticlesizehavingameanofapproximately53nm.”(hpv16和hpv18的純化vlp顯示出平均約53nm的可變粒度)。其中，hpv基因在巴斯德畢赤酵母菌株gs115中克隆和表達(dá)。這些文章未提供與其vlp的免疫原性性質(zhì)的即興性(improvisation)有關(guān)的信息。增加的vlp免疫原性可以通過增加vlp的大小來實(shí)現(xiàn)，其允許更高數(shù)量的重復(fù)抗原呈遞。最終，它將提供針對(duì)hpv抗原的更好的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供了針對(duì)不同血清型的hpvl1基因的密碼子優(yōu)化，其提供具有改善的免疫學(xué)質(zhì)量的自組裝vlp，以及最終針對(duì)hpv抗原的基本上更高的免疫原性應(yīng)答。以相同的方式，可以產(chǎn)生hpvl2基因、hpv的早期抗原(e6和e7)的密碼子優(yōu)化以開發(fā)針對(duì)hpv抗原的疫苗。盡管選擇優(yōu)化基因以用于在特定宿主中表達(dá)所述基因是本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，但是在優(yōu)化中仍然存在許多可能的變化。密碼子優(yōu)化的方法不是通用的。因此，每個(gè)基因具有獨(dú)特的密碼子優(yōu)化方法。我們?cè)谙挛闹幸呀?jīng)提到幾個(gè)專利申請(qǐng)，其作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)的一部分。1066/mumnp/2010公開了編碼人乳頭瘤病毒的主要衣殼蛋白l1的密碼子優(yōu)化基因。提供了通過在酵母細(xì)胞中表達(dá)編碼人乳頭瘤病毒的主要衣殼蛋白l1的經(jīng)密碼子優(yōu)化的基因而產(chǎn)生的具有免疫原性的大分子、其用途和組合物。通過該申請(qǐng)中所描述的方法而獲得的vlp的尺寸在約50至80nm的范圍內(nèi)。in203333公開了包含來自人乳頭瘤病毒16、人乳頭瘤病毒18、人乳頭瘤病毒31和人乳頭瘤病毒45基因型的含有l(wèi)1蛋白或功能性l1蛋白衍生物之病毒樣顆粒的疫苗組合物，其中由所述疫苗產(chǎn)生的抗體免疫應(yīng)答處于與單獨(dú)配制的每種人乳頭瘤病毒、病毒樣顆粒類似的水平。該專利公開了在用編碼hpv36或18l1目的基因之重組桿狀病毒(moi為0.3)感染的粉紋夜蛾(highfivetm)細(xì)胞(密度為約350000個(gè)細(xì)胞/ml)中表達(dá)hpv16/18蛋白。其中公開了優(yōu)選的佐劑是與3d-mpl組合的氫氧化鋁。使用昆蟲細(xì)胞會(huì)包括雜質(zhì)(例如宿主細(xì)胞dna和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì))的風(fēng)險(xiǎn)。in245189公開了一種免疫原性組合物，其包含來自hpv16和18以及至少一種其他hpv癌癥類型的vlp或殼粒，所述其他癌癥類型選自hpv31型、45型和52型，其中所述至少一種其他癌癥類型的vlp或殼粒的劑量相對(duì)于hpv16或18的劑量減少。其中，發(fā)明人在配方中使用了兩種佐劑，即氫氧化鋁和3dmpl。這些佐劑有助于誘導(dǎo)抗原的免疫原性。上述現(xiàn)有專利申請(qǐng)描述了在開發(fā)針對(duì)hpv抗原的疫苗中已經(jīng)使用酵母作為表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行的大量工作。巴斯德畢赤酵母是在細(xì)菌大腸桿菌(escherichiacoli)后第二常用的異源表達(dá)系統(tǒng)。選擇巴斯德畢赤酵母作為表達(dá)所需抗原的宿主仍然不足以獲得所需抗原的更高表達(dá)并隨之成為用于開發(fā)針對(duì)hpv的疫苗的一種良好候選物。從上述參考文獻(xiàn)[bazan等]可以很好地理解。因此，需要根據(jù)宿主細(xì)胞對(duì)所需抗原進(jìn)行密碼子優(yōu)化以獲得目的插入基因的表達(dá)。因此，在hpv疫苗接種可在低資源國家廣泛實(shí)施之前，需要解決幾個(gè)挑戰(zhàn)和不確定性。挑戰(zhàn)包括：可用疫苗的目前高成本、可行性、可接受性、疫苗運(yùn)送的物流(鑒于需要經(jīng)6個(gè)月分發(fā)三個(gè)劑量、改善策略和疫苗平臺(tái)以延及青春期前期或早期的女孩)、長期免疫原性和預(yù)防宮頸腫瘤形成的效力、針對(duì)未被疫苗抗原靶向的hpv感染的交叉保護(hù)，以及在抗宮頸腫瘤而誘導(dǎo)并維持免疫原性和長期保護(hù)方面物流上更為可行的劑量方案的需要。這些問題對(duì)于在公共衛(wèi)生服務(wù)中引入hpv疫苗的全球接受度和動(dòng)力的充分支持而言至關(guān)重要。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)試圖解決與hpv疫苗的表達(dá)產(chǎn)量、免疫原性、劑量方案和成本相關(guān)的大多數(shù)問題。在本發(fā)明中，展示了通過在小鼠中僅以較低劑量的hpvl1抗原進(jìn)行一次免疫接種而遞送更高免疫原性的疫苗制劑。本發(fā)明提供了編碼多種血清型hpv的l1蛋白的新基因，其最終將提供令人驚訝的的針對(duì)hpv抗原的更高免疫應(yīng)答。因此，這些候選物可用于開發(fā)針對(duì)hpv的疫苗，其將解決與hpv疫苗相關(guān)的主要問題。本發(fā)明還提供了免疫原性組合物，其包含含有來自hpv16、hpv18、hpv6、hpv11和至少一種選自hpv31、hpv52、hpv58和hpv45基因型中的另一種基因型的l1蛋白的病毒樣顆粒以及僅一種佐劑。此外，本發(fā)明不使用昆蟲細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)。因此，它降低了昆蟲來源的宿主細(xì)胞雜質(zhì)如宿主細(xì)胞dna和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)，其可滿足安全方面的考慮(過敏)。可以根據(jù)本發(fā)明中描述的方法制備用于hpv的其他血清型例如hpv35、hpv39、hpv56、hpv59和hpv68的免疫原性組合物。此外，本發(fā)明提供了具有更大尺寸并具有改善的免疫學(xué)質(zhì)量的vlp，其將提供針對(duì)hpv抗原的顯著更高的免疫應(yīng)答?？缮藤彽膆pv疫苗以vlp的形成為基礎(chǔ)，通過在酵母(釀酒酵母(sacchromycescervisiae))或桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)hpv蛋白形成所述vlp，并且它們的免疫原性與其四級(jí)結(jié)構(gòu)形成直接相關(guān)。[henrykmach等，journalofpharmaceuticalsciences，vol.95，no.10，p2195-2206]。該文章公開了hpv6、11和16型l1vlp蛋白在釀酒酵母中的表達(dá)產(chǎn)生了尺寸(30-50nm)比預(yù)期(60nm)更小的形狀不規(guī)則、廣泛分布的vlp。在我們的發(fā)明中，發(fā)明人已經(jīng)優(yōu)化了分解/重組條件以通過形成更好的四級(jí)結(jié)構(gòu)來形成改善的vlp，導(dǎo)致在hpv的不同血清型中(優(yōu)選hpv16l1、hpv18l1、hpv6l1和hpv11l1)的更高的免疫原性。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，將基因針對(duì)不同hpv血清型(hpv血清型優(yōu)選hpv16l1、hpv18l1、hpv6l1和hpv11l1)進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在酵母中表達(dá)。修飾基因的某些區(qū)域(如下文在本申請(qǐng)的詳細(xì)描述中所述)，以實(shí)現(xiàn)vlp中的翻譯后構(gòu)象依賴性四級(jí)結(jié)構(gòu)變化。在本說明書和隨后的權(quán)利要求書中，除非上下文另有要求，詞語“包含/包括”將被理解為暗示包括所述整體或步驟或整體或步驟的組，但不排除任何其它整體或步驟或整體或步驟的組。本說明書中對(duì)任何在先公開(或從其得到的信息)或任何已知事物的引用不是并且不應(yīng)被視為承認(rèn)或確認(rèn)或任何形式暗示：所述在先公開(或從其得到的信息)或已知事物形成本說明書所涉及的領(lǐng)域中的公知常識(shí)的一部分。發(fā)明目的在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了編碼多種血清型的hpv之不同蛋白質(zhì)的分離基因，其中所述基因是根據(jù)宿主細(xì)胞密碼子優(yōu)化的。在所述方面之一，hpv的不同蛋白質(zhì)包括主要衣殼蛋白l1、次要衣殼蛋白l2和早期抗原e6和e7。在另一方面，本發(fā)明提供了編碼多種血清型(優(yōu)選hpv16、hpv18、hpv6、hpv11等)的l1蛋白的分離基因。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有改善的免疫學(xué)質(zhì)量的病毒樣顆粒，其作為整合到宿主細(xì)胞中的編碼不同hpv抗原的密碼子優(yōu)化基因之結(jié)果而獲得。在第三個(gè)方面，本發(fā)明提供了用編碼hpv的不同蛋白質(zhì)的所述基因轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了具有高拷貝數(shù)的編碼多種血清型的hpv的不同蛋白質(zhì)之基因的宿主細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了含有編碼多種血清型的hpv的不同蛋白質(zhì)之基因的載體。在第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有改善的四級(jí)結(jié)構(gòu)的病毒樣顆粒，其作為整合到宿主細(xì)胞中的編碼不同hpv抗原的密碼子優(yōu)化基因之結(jié)果而獲得。在第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了具有顯著更高免疫原性的針對(duì)人乳頭瘤病毒的疫苗。在第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種具有改進(jìn)的免疫接種程序的針對(duì)hpv抗原的疫苗，其中疫苗劑量方案減少到單次。在另一方面，本發(fā)明提供了具有實(shí)質(zhì)減少的抗原量的針對(duì)hpv抗原的疫苗。在另一方面，本發(fā)明提供了使用酵母作為表達(dá)系統(tǒng)的針對(duì)hpv抗原的疫苗。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了使用巴斯德畢赤酵母作為表達(dá)系統(tǒng)的針對(duì)hpv抗原的疫苗。發(fā)明概述本發(fā)明提供了編碼數(shù)種血清型的多種hpv抗原的密碼子優(yōu)化的基因。這些基因進(jìn)一步產(chǎn)生具有改善的免疫學(xué)質(zhì)量和四級(jí)結(jié)構(gòu)的病毒樣顆粒。此類vlp產(chǎn)生針對(duì)hpv抗原的實(shí)質(zhì)更高的免疫應(yīng)答。此外，本發(fā)明提供了合適的宿主細(xì)胞，優(yōu)選具有高拷貝數(shù)的編碼數(shù)種血清型的多種hpv抗原之基因的巴斯德畢赤酵母。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了具有改進(jìn)的免疫接種程序的針對(duì)hpv抗原的疫苗，其中減少了疫苗劑量方案和抗原劑量的量。此外，本發(fā)明提供了含有hpv抗原的蛋白質(zhì)以及合適佐劑的免疫原性組合物。附圖簡述圖1描述了含有hpv16l1基因的表達(dá)載體圖譜ppiczα。圖2描述了hpv16l1在不同生產(chǎn)階段的過程中分析。圖3描述了通過western印跡方法對(duì)hpv16l1的同一性分析。圖4描述了通過動(dòng)態(tài)光散射方法對(duì)hpv16l1vlp的尺寸分布分析(vlp的平均直徑：238.9nm)。圖5描述了經(jīng)負(fù)染色方法通過電子顯微術(shù)得到的最終vlp形成。圖6描述了通過hpv16l1抗原的單次免疫接種四周后的抗體應(yīng)答。圖7描述了通過hpv18l1抗原的單次免疫接種四周后的抗體應(yīng)答。圖8描述了通過hpv11l1抗原的單次免疫接種四周后的抗體應(yīng)答。圖9描述了通過hpv6l1抗原的單次免疫接種四周后的抗體應(yīng)答。圖10描述了通過elisa測(cè)量的用本發(fā)明的hpv疫苗和進(jìn)行比較的參考疫苗進(jìn)行靈長類動(dòng)物免疫后獲得的針對(duì)hpv16l1抗原的抗體效價(jià)。圖11描述了通過elisa測(cè)量的用本發(fā)明的hpv疫苗和進(jìn)行比較的參考疫苗進(jìn)行靈長類動(dòng)物免疫后獲得的針對(duì)hpv18l1抗原的抗體效價(jià)。圖12描述了通過動(dòng)態(tài)光散射方法對(duì)hpv18l1vlp的尺寸分布分析(vlp的平均直徑：388.4nm)。圖13描述了通過動(dòng)態(tài)光散射方法對(duì)hpv6l1vlp的尺寸分布分析(vlp的平均直徑：365nm)。圖14描述了通過動(dòng)態(tài)光散射方法對(duì)hpv11l1vlp的尺寸分布分析(vlp的平均直徑：307.9nm)。發(fā)明詳述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼多種血清型的hpv的不同蛋白質(zhì)的分離基因，其中所述基因是根據(jù)宿主細(xì)胞密碼子優(yōu)化的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，hpv的不同蛋白包括主要衣殼蛋白l1，次要衣殼蛋白l2和早期抗原e6和e7。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼多種血清型的l1蛋白(例如hpv16l1，hpv18l1，hpv6l1和hpv11l1)的分離基因。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了作為整合到宿主細(xì)胞中的編碼不同hpv抗原的密碼子優(yōu)化基因的結(jié)果而獲得的具有改善的免疫學(xué)質(zhì)量的病毒樣顆粒。這樣的vlp遞送增強(qiáng)的免疫應(yīng)答以防止多種血清型的hpv感染。具有改善的免疫學(xué)質(zhì)量的vlp有助于減少佐劑在疫苗制備中的使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用所述編碼hpv的不同蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，宿主細(xì)胞可以被稱為表達(dá)系統(tǒng)，其中用合適的載體轉(zhuǎn)化的基因?qū)?huì)表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有高拷貝數(shù)的編碼多種血清型的hpv的不同蛋白質(zhì)之基因的宿主細(xì)胞。其導(dǎo)致不同血清型的hpv抗原的較高表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞，優(yōu)選巴斯德畢赤酵母。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，巴斯德畢赤酵母菌株x-33、gs115、km71、smd1168等可以用作表達(dá)系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有編碼多種血清型的hpv的不同蛋白質(zhì)之基因的載體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，ppicz、ppic6、pgapz、pao815或其他相似載體可用作本發(fā)明中的載體。這些載體是市售的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用編碼不同hpv蛋白的基因轉(zhuǎn)化的載體，所述載體可以選自登錄號(hào)為mtcc5969、mtcc5970、mtcc5971和mtcc5972的載體。這些載體已由本發(fā)明的申請(qǐng)人根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2014年11月17日保藏在微生物典型培養(yǎng)物保藏和基因銀行(microbialtypeculturecollection&genebank)，微生物技術(shù)研究所，部門39-a，昌迪加爾-160036，印度。所述保藏載體具有根據(jù)本發(fā)明開發(fā)的基因。mtcc5969、mtcc5970、mtcc5971和mtcc5972分別指ppiczhpv6l1、ppiczhpv11l1、ppiczhpv16l1和ppiczhpv18l1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了作為整合到宿主細(xì)胞中的編碼不同hpv抗原的密碼子優(yōu)化基因的結(jié)果而獲得的具有改進(jìn)的四級(jí)結(jié)構(gòu)的病毒樣顆粒。這樣的vlp具有約80至100nm的高直徑，并且vlp的平均直徑在50至80nm之間。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的vlp為50至500nm，優(yōu)選50至400nm，更優(yōu)選100至400nm。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于多種hpv抗原的含有本發(fā)明的免疫原性組合物的疫苗。這些疫苗可以常規(guī)途徑和劑量施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備人乳頭瘤疫苗的方法，其包括以下步驟：a.合成編碼人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白的基因，b.構(gòu)建編碼人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白之基因的表達(dá)載體，c.選擇具有高拷貝數(shù)的所述人乳頭瘤病毒蛋白之轉(zhuǎn)化基因的克隆，d.進(jìn)行所述人乳頭瘤病毒蛋白之轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)分析，e.純化由所述人乳頭瘤病毒蛋白之基因編碼的蛋白質(zhì)，f.制備所述人乳頭瘤病毒蛋白之vlp的批量溶液，g.表征宿主細(xì)胞中的所述蛋白質(zhì)，h.制備含有所述人乳頭瘤病毒蛋白的疫苗。在此，根據(jù)本發(fā)明的主要衣殼蛋白是多種血清型的l1蛋白，例如hpv16l1、hpv18l1、hpv6l1和hpv11l1。根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞，優(yōu)選畢赤酵母，更優(yōu)選巴斯德畢赤酵母。在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的純化方法是柱色譜、無菌過濾、滲濾或其合適的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了優(yōu)化的分解/重組條件以通過形成更好的四級(jí)結(jié)構(gòu)來形成改進(jìn)的vlp，導(dǎo)致在hpv的不同血清型方面更高的免疫原性。將從精制色譜步驟接收的vlp經(jīng)過合適的預(yù)制備緩沖液以獲得具有更好四級(jí)結(jié)構(gòu)的改進(jìn)vlp。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選預(yù)制備緩沖液是磷酸鹽緩沖液。預(yù)制備緩沖液可以定義為用于為vlp提供穩(wěn)定性來維持其結(jié)構(gòu)的緩沖液，其用于與不同佐劑及其組合一起用于進(jìn)一步的制劑開發(fā)。這種預(yù)制備緩沖液還可以包含合適的還原劑(dtt、β-巰基乙醇、吐溫80等)、鹽(nacl或kcl)、氨基酸以及酸性或堿性緩沖劑。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了針對(duì)人乳頭瘤病毒的具有顯著更高免疫原性的疫苗。根據(jù)本發(fā)明的疫苗引發(fā)針對(duì)不同hpv血清型的保護(hù)性免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了針對(duì)hpv抗原的疫苗，其具有改進(jìn)的免疫接種方案，其中減少了疫苗劑量方案。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了針對(duì)hpv抗原的具有顯著減少的抗原量的疫苗。這有助于降低疫苗的制備成本，使得可實(shí)現(xiàn)在發(fā)展中國家的商業(yè)水平使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有hpv抗原蛋白以及合適佐劑的免疫原性組合物?？梢允褂娩X鹽，單磷?；|(zhì)(monophosphoryllipid，mpl)類似物例如gla(吡喃葡糖基脂質(zhì)佐劑，glucopyranosyllipidadjuvant)、monatide、細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑、基于角鯊烯的佐劑、親脂性佐劑等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含具有藥學(xué)上可用載體或賦形劑的免疫原性組合物的藥物組合物。實(shí)施例以下非限制性實(shí)施例描述了對(duì)編碼表示為hpv16、hpv18、hpv6和hpv11的多種血清型的hpv之l1蛋白的基因的密碼子優(yōu)化。應(yīng)當(dāng)理解，可以制備具有不同抗原的其他免疫原性組合物，并且這種免疫原性組合物在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，并且也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例1：hpv16l1的密碼子優(yōu)化基因的合成收集可在genebank獲得的hpv16l1抗原的核苷酸序列。對(duì)從genebank收集的每個(gè)核苷酸序列獲得的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。之后，選擇作為hpv16l1蛋白氨基酸序列的最具代表性的共有序列。由所選擇的共有氨基酸序列確定核苷酸序列，以進(jìn)一步根據(jù)宿主細(xì)胞進(jìn)行密碼子優(yōu)化。將該序列定義為seqidno.1。seqidno.1：hpv16l1抗原的核苷酸序列(genebank號(hào)gb|gq423063.1|)1atgtctttgtggttgccatctgaagctactgtttacttgccaccagttccagtttctaag61gttgtttctactgatgaatacgttgctagaactaacatttactaccatgctggtacttct121agattgttggctgttggtcacccatactttccaattaagaagccaaacaacaacaagatt181ttggttccaaaggtttctggtttgcaatacagagtttttagaatccatttgccagatcca241aacaagtttggttttccagatacttctttttacaacccagatactcaaagattggtttgg301gcttgtgttggtgttgaagttggtagaggtcaaccattgggtgttggtatttctggtcac361ccattgttgaacaagttggatgatactgaaaacgcttctgcttacgctgctaacgctggt421gttgataacagagaatgtatttctatggattacaagcaaactcaattgtgtttgattggt481tgtaagccaccaattggtgaacattggggtaagggttctccatgtactaacgttgctgtt541aacccaggtgattgtccaccattggaattgattaacactgttattcaagatggtgatatg601gttgatactggttttggtgctatggattttactactttgcaagctaacaagtctgaagtt661ccattggatatttgtacttctatttgtaagtacccagattacattaagatggtttctgaa721ccatacggtgattctttgtttttttacttgagaagagaacaaatgtttgttagacacttg781tttaacagagctggtgctgttggtgaaaacgttccagatgatttgtacattaagggttct841ggttctactgctaacttggcttcttctaactactttccaactccatctggttctatggtt901acttctgatgctcaaatttttaacaagccatactggttgcaaagagcccaaggtcataac961aacggtatttgttggggtaaccaattgtttgttactgttgttgatactactagatctact1021aacatgtctttgtgtgctgctatttctacttctgaaactacttacaagaacactaacttt1081aaggaatacttgagacacggtgaagaatacgatttgcaatttatttttcaattgtgtaag1141attactttgactgctgatgttatgacttacattcattctatgaactctactattttggaa1201gattggaactttggtttgcaaccaccaccaggtggtactttggaagatacttacagattt1261gttacttctcaagctattgcttgtcaaaagcacactccaccagctccaaaggaagatcca1321ttgaagaagtacactttttgggaagttaacttgaaggaaaagttttctgctgatttggat1381caatttccattgggtagaaagtttttgttgcaagctggtttgaaggctaagccaaagttt1441actttgggtaagagaaaggctactccaactacttcttctacttctactactgctaagaga1501aagaagagaaagttgtaatag在此，在本發(fā)明中，使用巴斯德畢赤酵母作為宿主細(xì)胞。其他酵母生物體(優(yōu)選畢赤酵母屬的多個(gè)種)也可以用作用于密碼子優(yōu)化方法的宿主細(xì)胞。hpv16l1蛋白的核苷酸序列定義為seqidno.1，其如下所述被進(jìn)一步修飾。在seqidno.1中給出的hpv16l1的核苷酸序列中的61-300、361-840和/或961-1520位置處進(jìn)行修飾。這些修飾以這樣的方式進(jìn)行：使得在核苷酸序列的密碼子優(yōu)化之后獲得的氨基酸序列將與hpv16l1蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)100％同源。繼而，這種密碼子優(yōu)化的序列在尺寸和免疫原性方面為vlp提供了更好的四級(jí)結(jié)構(gòu)。在所述核苷酸序列中重復(fù)修飾后，在所述位置處，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了hpv16l1抗原的一種新的改變的密碼子優(yōu)化序列，其在本文中定義為seqidno.2。seqidno.2：hpv16l1抗原的核苷酸序列1atgtctttgtggttgccatctgaagctactgtttacttgccacca46gttccagtttctaaagttgtttccactgacgaatacgttgctaga91actaacatctactaccacgctggtacttctagattgttggctgtt136ggtcatccatacttcccaattaagaagccaaacaacaacaagatt181ttggttccaaaggtttccggattgcaatacagagttttcagaatc226catttgccagatccaaacaagtttggtttcccagatacttctttc271tacaacccagacactcaaagacttgtttgggcttgtgttggtgtt316gaagttggtagaggtcaaccattgggtgttggtatttctggtcac361ccattgttgaacaagttggacgatactgaaaacgcttctgcttac406gctgctaacgctggtgttgataacagagaatgtatttctatggac451tacaagcaaactcaattgtgtttgattggttgtaagccaccaatt496ggtgaacattggggaaagggttctccatgtactaatgttgctgtt541aaccctggtgattgtccaccattggaattgattaacactgttatt586caagacggtgatatggttgatactggtttcggtgctatggatttc631actactttgcaagctaacaagtctgaagttccattggacatttgt676acttccatctgtaagtacccagactacattaagatggtttctgaa721ccatacggtgattctttgttcttctacttgagaagagaacaaatg766tttgttagacacttgttcaacagagctggtgctgttggtgaaaac811gttccagatgacttgtacattaagggttctggttctactgctaac856ttggcttcttctaactactttccaactccatctggttctatggtt901acttctgacgctcaaattttcaacaagccatactggttgcaaaga946gcacaaggtcataacaacggtatttgttggggtaaccaattgttc991gttactgttgttgacactactagatccactaacatgtccttgtgt1036gctgctatttctacttctgaaactacttacaagaacactaacttc1081aaagagtacttgagacacggagaagaatacgacttgcaattcatt1126ttccaattgtgtaagattactttgactgctgacgttatgacttac1171attcactctatgaactctactattttggaagattggaacttcgga1216ttgcaaccaccaccaggtggtactttggaagatacttacagattc1261gttacttctcaagctattgcttgtcaaaagcatactccacctgct1306ccaaaagaagatccattgaagaagtacactttctgggaagttaac1351ttgaaagaaaagttctctgctgatttggatcaattcccattgggt1396agaaagtttttgttgcaagctggattgaaggctaaaccaaagttc1441actttgggaaagagaaaggctactccaactacttcttctacttct1486actactgctaagagaaagaagagaaaattgtaa1518以相同的方式，產(chǎn)生了用于hpv18l1、hpv6l1和hpv11l1的密碼子優(yōu)化序列。hpv18l1、hpv6l1和hpv11l1的密碼子優(yōu)化序列分別給出為seqidno.3、4和5。seqidno.3：hpv18l1抗原的核苷酸序列1atggctctttggagaccatccgacaacactgtttacttgccacca46ccatccgttgctagagttgttaacactgacgactacgttactaga91acttccatcttctaccacgctggttcttccagattgttgactgtt136ggtaacccatacttcagagttccagctggaggtggtaacaagcaa181gacatcccaaaggtttccgcttaccagtacagagttttcagagtt226cagttgccagacccaaacaagtttggattgccagacaattccatc271tacaacccagagactcagagacttgtttgggcttgtgctggtgtt316gaaatcggtagaggacagccattgggtgttggtttgtctggtcac361ccattctacaacaagttggacgacactgaatcttctcacgctgct406acttctaacgtttccgaggatgttagagacaacgtttccgttgac451tacaagcagactcagttgtgtatcttgggttgtgctccagctatt496ggtgaacattgggctaagggtactgcttgtaagtccagaccattg541tctcagggagattgtccaccattggagttgaagaacactgttttg586gaggacggtgatatggttgatactggttacggtgctatggacttc631tctactttgcaggacactaagtgtgaagttccattggacatctgt676cagtccatctgtaagtacccagactacttgcaaatgtccgctgat721ccatacggtgactctatgttcttctgtttgagaagagagcagttg766ttcgctagacacttctggaacagagctggtactatgggtgacact811gttccacaatccttgtacatcaagggtactggaatgagagcttct856cctggttcttgtgtttactctccatctccatccggttccattgtt901acttccgactcccagttgttcaacaagccatactggttgcataag946gctcaaggtcacaacaacggtatttgttggcacaaccagttgttc991gttactgttgttgacactactagatccactaacttgactatctgt1036gcttccactcaatctccagttccaggacaatacgacgctactaag1081ttcaagcagtactccagacacgttgaagagtacgacttgcagttc1126atcttccagttgtgtactatcactttgactgctgatgttatgtcc1171tacatccactctatgaactcctccattttggaggattggaacttc1216ggtgttccaccaccaccaactacttcattggttgacacttacaga1261ttcgttcagtccgttgctatcacttgtcaaaaggacgctgctcca1306gctgaaaacaaggacccatacgacaagttgaagttctggaacgtt1351gacttgaaagagaagttctccttggacttggaccaatacccattg1396ggtagaaagtttttggttcaggctggattgagaagaaagccaact1441atcggtccaagaaagagatcagctccatccgctactacttcatcc1486aagccagctaagagagttagagttagagctagaaagtag1524seqidno.4：hpv6l1抗原的核苷酸序列1atgtggagaccatccgactccactgtttatgttccaccaccaaac46ccagtttccaaggttgttgctactgacgcttacgttactagaact91aatatcttctaccacgcttcctcatccagattgttggctgttggt136cacccatacttctccatcaagagagctaacaagactgttgttcca181aaggtttccggttaccagtacagagtttttaaggttgttttgcca226gacccaaacaagttcgctttgccagactcttccttgttcgaccca271actactcagagattggtttgggcttgtactggtttggaggttggt316agaggtcagccattgggtgttggtgtttctggtcacccattcttg361aacaagtacgacgacgttgagaactctggttctggtggtaaccca406ggtcaggacaacagagttaacgttggtatggactacaagcagact451cagttgtgtatggttggttgtgctccaccattgggtgaacattgg496ggtaagggtaagcagtgtacaaacactccagttcaggctggtgac541tgtccacctttggagttgatcacttccgttattcaggacggtgac586atggttgacactggttttggtgctatgaacttcgctgacttgcag631actaacaagtccgacgttccaatcgacatctgtggtactacttgt676aagtacccagactacttgcagatggctgctgatccatacggtgac721agattgttcttcttcttgagaaaagaacagatgttcgctagacac766ttcttcaacagagctggtgaagttggtgagccagttccagacact811ttgatcattaagggttccggtaacagaacttccgttggttcctcc856atctacgttaacactccatccggttccttggtttcttctgaggct901cagttgttcaacaagccatactggttgcagaaggctcagggtcac946aacaacggtatctgttggggtaaccagttgttcgttactgttgtt991gacactactagatccactaatatgactttgtgtgcttccgttact1036acttcctccacttacactaactccgactacaaagagtacatgaga1081cacgttgaagagtacgacttgcagttcatcttccagttgtgttcc1126atcactttgtccgctgaggttatggcttacatccacactatgaac1171ccatccgttttggaggactggaacttcggtttgtctccaccacct1216aacggtactttggaggacacttacagatacgttcagtcccaggct1261atcacttgtcagaagccaactccagagaaagagaagccagaccct1306tacaagaacttgtccttctgggaggttaacttgaaagagaagttc1351tcctcagagttggaccagtacccattgggtagaaagttcttgttg1396cagtccggttacagaggtagatcctccatcagaactggtgttaag1441agaccagctgtttccaaggcttctgctgctccaaagagaaagaga1486gctaagactaagagatag1503seqidno.5：hpv11l1抗原的核苷酸序列1atgtggagaccatccgactccactgtttatgttccaccaccaaac46ccagtttccaaggttgttgctactgacgcttacgttaagagaact91aatatcttctaccacgcttcctcatccagattgttggctgttggt136cacccttactactccatcaagaaggttaacaagactgttgttcca181aaggtttccggttaccagtacagagtttttaaggttgttttgcca226gacccaaacaagttcgctttgccagactcttccttgttcgaccca271actactcagagattggtttgggcttgtactggtttggaggttggt316agaggtcagccattgggtgttggtgtttctggtcaccctttgttg361aacaagtacgacgacgttgagaactccggtggttatggtggtaac406ccaggtcaagacaacagagttaacgttggtatggactacaagcac451actcagttgtgtatggttggttgtgctccaccattgggtgaacat496tggggtaagggtactcagtgttccaacacttccgttcagaacggt541gactgtccacctttggagttgatcacttccgttattcaggacggt586gacatggttgacactggttttggtgctatgaacttcgctgacttg631cagactaacaagtccgacgttccattggacatctgtggtactgtt676tgtaaatacccagactacttgcagatggctgctgatccatacggt721gacagattgttcttctacttgagaaaagaacagatgttcgctaga766cacttcttcaacagagctggtactgttggtgagccagttccagat811gacttgttggttaagggtggtaacaacagatcctccgttgcttcc856tccatctacgttcatactccatccggttccttggtttcttctgag901gctcagttgttcaacaagccatactggttgcagaaggctcagggt946cacaacaacggtatttgttggggtaaccacttgttcgttactgtt991gttgacactactagatccactaatatgactttgtgtgcttccgtt1036tccaagtccgctacttacactaactccgactacaaagagtacatg1081agacacgttgaagagttcgacttgcagttcatcttccagttgtgt1126tccatcactttgtccgctgaggttatggcttacatccacactatg1171aacccatccgttttggaggactggaacttcggtttgtctccacca1216cctaacggtactttggaggacacttacagatacgttcagtcccag1261gctatcacttgtcagaagccaactccagagaaagagaagcaggac1306ccatacaaggacatgtctttctgggaggttaacttgaaagagaag1351ttctcctcagagttggaccagttcccattgggtagaaagttcttg1396ttgcagtccggttacagaggtagaacttccgctagaactggtatc1441aaaagaccagctgtttccaagccatccactgctccaaagagaaaa1486agaactaagactaagaagtag1506實(shí)施例2：hpv16l1表達(dá)載體的構(gòu)建將表達(dá)載體ppiczα用于hpv16l1基因的表達(dá)。ppic6、pgapz、pao815或其他相似載體也可用于表達(dá)hpv16l1。ppiczα是用于在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)和分泌重組蛋白的3.6kb載體。它具有以下特點(diǎn)：含有aox1啟動(dòng)子的942bp片段，其允許甲醇誘導(dǎo)的，高水平表達(dá)畢赤酵母中的目的基因。靶向質(zhì)粒整合到aox1基因座。aox1轉(zhuǎn)錄終止(transcriptiontermination，tt)區(qū)域允許來自aox1基因(約260bp)的天然轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號(hào)，其允許有效的3’mrna加工(包括聚腺苷酸化)以提高mrna穩(wěn)定性。博來霉素抗性基因允許在大腸桿菌和畢赤酵母中選擇轉(zhuǎn)化體。em7啟動(dòng)子，其驅(qū)動(dòng)大腸桿菌中博來霉素抗性基因的組成型表達(dá)。來自釀酒酵母的tef1啟動(dòng)子，其驅(qū)動(dòng)畢赤酵母中博來霉素抗性基因的表達(dá)。puc起始位點(diǎn)允許質(zhì)粒在大腸桿菌中的復(fù)制和保持。通過將編碼hpv16l1的bstbi/noti片段插入載體ppiczá的多克隆位點(diǎn)來構(gòu)建hpv16l1表達(dá)載體。所得表達(dá)載體命名為ppicz-hpv16l1。其物理圖譜如圖1所示。用于構(gòu)建的方法基本上與sambrook和russell(2001)中的一樣。以相同的方式，構(gòu)建了含有hpv18l1、hpv6l1和hpv11l1的表達(dá)載體。實(shí)施例3：選擇具有高拷貝數(shù)的hpv16l1轉(zhuǎn)化基因的克隆a)感受態(tài)細(xì)胞的制備使巴斯德畢赤酵母菌株在酵母提取物蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeastextractpeptonedextrosemedium，ypd)中在30℃下生長過夜。在2升燒瓶中的500ml新鮮培養(yǎng)基中接種0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物。再次生長過夜，直到od600＝1.3-1.5。將細(xì)胞離心并將沉淀物用冰冷的無菌水重懸浮一次或兩次。將細(xì)胞離心并將沉淀物重懸于20ml冰冷的1m山梨糖醇中。將細(xì)胞離心并將沉淀物重懸于1ml冰冷的1m山梨糖醇中，最終體積為約1.5ml。保持細(xì)胞在冰上并當(dāng)天使用。b)轉(zhuǎn)化將80μl來自上述步驟的細(xì)胞與5-10μg線性化的ppiczαdna(在5-10μl無菌水中)混合，并將其轉(zhuǎn)移到冰冷的0.2cm電穿孔杯中。將帶有細(xì)胞的杯在冰上孵育5分鐘。將感受態(tài)酵母細(xì)胞的等分試樣在冰上解凍，并向每個(gè)等分試樣中加入600ng環(huán)狀質(zhì)粒dna。將懸浮液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷卻的電穿孔杯中。在bioradgenepulserii中在1.7kv，25μf，200ohm下進(jìn)行電穿孔。立即將1ml冰冷的1m山梨糖醇加入杯中。將杯內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到無菌的15ml試管中。將試管在30℃孵育2小時(shí)，不搖動(dòng)。將200μl管內(nèi)容物分散在含有150μg/ml濃度博來霉素的每個(gè)單獨(dú)的、標(biāo)記的ypd平板上。將平板在30℃孵育3天直至形成菌落。挑選10-20個(gè)菌落，并在含有適當(dāng)濃度的博來霉素的新鮮ypd平板上純化(單菌落劃線)?；谡系疆叧嘟湍富蚪M中的基因的拷貝數(shù)進(jìn)行克隆的初步選擇。這與克隆的表達(dá)相關(guān)。使用特異性針對(duì)相應(yīng)的特定基因(hpv16l1、hpv18l1、hpv6l1或hpv11l1)的半定量pcr進(jìn)行篩選。使用不同的引物組來優(yōu)化定量菌落pcr測(cè)定的不同參數(shù)。進(jìn)一步測(cè)試這些引物與畢赤酵母基因組的交叉反應(yīng)性及其對(duì)挑選最低拷貝數(shù)特定基因的靈敏度。在定量菌落pcr后，使用rtpcr分析hpv16l1克隆的基因拷貝數(shù)，并選擇具有最高基因拷貝數(shù)的克隆。實(shí)施例4：hpv16l1轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)分析將從rtpcr結(jié)果中選擇的克隆接種到bgy培養(yǎng)基中，并在對(duì)培養(yǎng)物甲醇誘導(dǎo)后分析它們的表達(dá)。將培養(yǎng)物裂解并通過western印跡分析所得的轉(zhuǎn)化體庫上清液?；谠趙estern印跡上表達(dá)的條帶的強(qiáng)度選擇最終克隆。再次通過sdspage和western印跡分析這些克隆，以選擇hpv蛋白的最佳生產(chǎn)克隆。sdspage凝膠在考馬斯亮藍(lán)染色后如圖2所示。通過western印跡對(duì)hpv血清型16l1的鑒定如圖3所示。實(shí)施例5：hpv16l1蛋白的純化hpv16l1蛋白的純化過程如下：已經(jīng)用一種代表性批料說明了每種hpv蛋白的純化和回收過程中涉及的每個(gè)單元操作步驟。a)經(jīng)洗滌細(xì)胞沉淀的裂解在生產(chǎn)階段結(jié)束時(shí)收獲批次。從每個(gè)發(fā)酵罐收集約12l的培養(yǎng)液。首先通過離心分離細(xì)胞，以便從用過的培養(yǎng)基中分離含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)細(xì)胞。將洗滌的沉淀溶解在裂解緩沖液中。使用高壓均質(zhì)器裂解細(xì)胞。b)澄清細(xì)胞裂解后，通過離心將含有產(chǎn)物的上清液與細(xì)胞碎片分離。使用0.45μm過濾器進(jìn)一步使上清液澄清。c)捕獲步驟色譜將澄清的裂解物加樣到合適的樹脂上。通過提高緩沖液中的氯化鈉濃度進(jìn)行蛋白質(zhì)的洗脫。d)精制步驟色譜將含有目的蛋白質(zhì)的合并級(jí)分加樣到合適的樹脂上。通過降低緩沖液中的氯化鈉濃度來進(jìn)行蛋白質(zhì)的洗脫。e)通過滲濾進(jìn)行緩沖液交換將合并的級(jí)分通過針對(duì)磷酸鹽緩沖液的合適的pes膜過濾器滲濾，以從蛋白質(zhì)溶液中除去過量的氯化鈉。f)無菌過濾在滲濾步驟之后，對(duì)純化的蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行其批量溶液的制備。實(shí)施例6：hpv16l1的vlp的批量溶液的制備將在上述純化過程之后獲得的純化蛋白經(jīng)歷分解/重組條件，以獲得具有改進(jìn)的四級(jí)結(jié)構(gòu)的最終穩(wěn)定的vlp。在預(yù)制備緩沖液中進(jìn)行所表達(dá)vlp的分解/重組。將該預(yù)制備緩沖液稀釋至約5-10倍，以便重組表達(dá)的vlp。將鹽如nacl或kcl以500mm至2m的濃度加入到在所表達(dá)的vlp的分解時(shí)使用的預(yù)制備緩沖液中。分解緩沖液含有還原劑和氨基酸。重組緩沖液包括更高濃度的鹽以及分解緩沖液的組分。通過動(dòng)態(tài)光散射法分析所獲得的vlp的尺寸。在該步驟后獲得的hpv16l1的均一vlp具有90nm的平均直徑。其在圖4中描述。其在圖4中描述。在該步驟后獲得的hpv18l1、hpv6l1和hpv11l1的均一vlp分別描述于圖12、圖13和圖14中。將純化的蛋白質(zhì)溶液在無菌條件下通過0.22微米過濾器過濾并作為原料藥物儲(chǔ)存。實(shí)施例7：巴斯德畢赤酵母中hpv-16l1衣殼蛋白的表征蛋白質(zhì)的部分n-末端序列已經(jīng)被edman降解確認(rèn)，并且已觀察到一級(jí)結(jié)構(gòu)(胰蛋白酶圖譜)。如通過dtnb測(cè)定所評(píng)估的，批量純化的抗原在結(jié)構(gòu)中不顯示任何游離硫醇(-sh)基團(tuán)。發(fā)現(xiàn)批量純化的抗原沒有如通過納米顆粒示蹤分析所確定的任何聚集體。通過elisa發(fā)現(xiàn)批量純化的抗原不含宿主細(xì)胞蛋白，并且通過基于rt-pcr的方法發(fā)現(xiàn)也不含dna污染物。通過lal測(cè)試評(píng)估，發(fā)現(xiàn)該制劑不含內(nèi)毒素。為了確認(rèn)vlp的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，進(jìn)行電子顯微鏡檢查，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)這些vlp是具有約90nm的平均直徑的顆粒。hpv16l1vlp的負(fù)染色顯示于圖5中。在該實(shí)施例中提及的所有技術(shù)都是本領(lǐng)域中廣泛可用的。將原料藥物在-80℃下儲(chǔ)存在無熱原的容器中。實(shí)施例8：含hpv16l1的疫苗的制備將純化的抗原吸附到基于鋁的佐劑上，并無菌地填充到小瓶中。將磷酸鋁以0.8-20mg/0.5ml磷酸鹽緩沖鹽水加入到160μg的hpv16l1蛋白中用于最終制劑?；阡X的佐劑可以用礦物鹽佐劑如鈣、鐵和鋯的鹽，完全弗氏佐劑(completefreund’sadjuvant，cfa)，佐劑乳劑例如不完全弗氏佐劑(incompletefreund’sadjuvant，ifa)，montanide，mf59和佐劑65，細(xì)菌衍生的佐劑或其組合來代替。以相同的方式，技術(shù)人員可以制備含有其他血清型(如18、6、11)的l1蛋白及其組合的疫苗。實(shí)施例9：小鼠免疫接種和表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性的測(cè)定方法：基于英國藥典2012，在有佐劑、無佐劑的情況下對(duì)測(cè)試樣品的一個(gè)代表性批次和參考產(chǎn)品進(jìn)行該研究。使用表1中提及的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，使用balb/c小鼠(6-8周齡雌性小鼠)來分析其體內(nèi)效力。表1：用于hpv疫苗的小鼠免疫原性研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將0.5ml稀釋的參考產(chǎn)品/測(cè)試疫苗皮下注射到每只小鼠中(每個(gè)稀釋組10只小鼠)。在10只小鼠中以相同的方式施用0.5ml疫苗稀釋劑。這些是pbs對(duì)照并將動(dòng)物維持28天。在第29天，通過眼部靜脈穿刺從每只小鼠收集血液，并在室溫下靜置1小時(shí)以凝固。將管在4℃下以4，000rpm離心10分鐘，并將血清收集到單獨(dú)的標(biāo)記的微量離心管中。使用來自美國adi(alphadiagnosticinternational)的以下elisa試劑盒一次性測(cè)試所有血清樣品。小鼠抗hpv16l1elisa試劑盒(＃550-316-pmg)小鼠抗hpv18l1elisa試劑盒(＃550-318-pmg)小鼠抗hpv6l1elisa試劑盒(＃550-306-pmg)小鼠抗hpv11l1elisa試劑盒(＃550-311-pmg)將根據(jù)本發(fā)明的基于vlp的疫苗與不合佐劑的vlp制劑和參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。通過elisa測(cè)定獲得的結(jié)果顯示在圖6、7、8和9以及表2中。表2：針對(duì)多種血清型的hpv抗原的elisa抗體應(yīng)答，吸光度單位/mlat血清號(hào)組(佐劑)hpv16l1hpv18l1hpv11l1hpv6l11僅hpv抗原0.360.190.660.302加德西0.400.290.700.353鋁1.390.452.090.704pbs0.190.0450.230.151實(shí)施例10：對(duì)在大鼠中針對(duì)人乳頭瘤病毒疫苗產(chǎn)生之抗體終點(diǎn)的鑒定和測(cè)定方法：首先將hpv16l1或hpv18l1蛋白固定在微量滴定板的孔上。將板用脫脂奶粉進(jìn)一步封閉以避免非特異性相互作用。將來自具有抗hpv16l1和hpv18l1的抗體的大鼠的血清樣品在樣品稀釋緩沖液中稀釋，以實(shí)現(xiàn)各蛋白(hpv16l1/hpv18l1)與在相應(yīng)板上包被的相應(yīng)抗原的特異性結(jié)合。加入hrp標(biāo)記的抗大鼠抗體作為二抗。免疫反應(yīng)導(dǎo)致抗大鼠抗體和特異性抗體(hpv16l1/hpv18l1)之間形成復(fù)合物。在每個(gè)洗滌步驟中除去未結(jié)合的反應(yīng)物。然后使底物opd反應(yīng)。在微量滴定板讀數(shù)器上經(jīng)顯色反應(yīng)讀出的底物的量與血清樣品中存在的各抗體的濃度成正比。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用人乳頭瘤病毒(rdna)疫苗制劑處理每組10只雄性和10只雌性大鼠的組，每兩周一次以三個(gè)劑量水平對(duì)wistar大鼠經(jīng)肌內(nèi)注射：0.25ml/動(dòng)物(低)、0.5ml/動(dòng)物(中)和1.0ml/動(dòng)物(高)，持續(xù)3個(gè)月。在本研究中存在獨(dú)立對(duì)照組，其作為載劑對(duì)照組僅接受安慰劑。此外，在處理后一個(gè)月的時(shí)間內(nèi)將恢復(fù)組并且同時(shí)將載劑對(duì)照維持在高劑量水平，以觀察不良反應(yīng)的可逆性、持續(xù)性或延遲發(fā)生。在處理前、處理后和恢復(fù)后期間收集血液樣品以檢測(cè)免疫原性，然后通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzymelinkedimmuno-sorbentassay，elisa)，針對(duì)載劑對(duì)照(1.0ml安慰劑/大鼠)、低劑量(0.25ml疫苗/大鼠)、中劑量(0.5ml疫苗/大鼠)和高劑量(1.0ml疫苗/大鼠)與處理前組測(cè)定抗hpv。表3：處理詳細(xì)信息滴度測(cè)定通過將抗原濃度定為50ng/孔并靜置在2-8℃過夜孵育來包被用于hpv16l1或hpv18l1的不同平板。然后，將板靜置于5％封閉溶液(在pbst中的脫脂乳)中，并在37℃下孵育2小時(shí)。分別匯集來自每組的所有樣品并在pbst(磷酸鹽緩沖鹽水-吐溫20)緩沖液中稀釋50倍。洗滌板，將50μl每種樣品加入預(yù)定孔中，并靜置于37℃下孵育1小時(shí)。將板用pbst洗滌，然后向每個(gè)孔中加入50μl抗大鼠igghrp，并靜置在37℃下孵育60分鐘。然后再次用pbst洗滌板，向每個(gè)孔中加入50μl底物(溶于檸檬酸磷酸鹽緩沖液和h2o2中的opd)，并在室溫下在黑暗中靜置板15分鐘。然后，向每個(gè)孔中加入25μl終止液(在100mlwfi中的5.4mlh2so4)，并將平板在spectramax190微量板讀數(shù)器上在490nm處讀數(shù)。結(jié)果表4：處理前-雄性表5：處理前恢復(fù)-雄性表6：處理后雄性表7：恢復(fù)后雄性表8：處理前-雌性表9：處理前恢復(fù)-雌性表10：處理后-雌性表11：恢復(fù)后-雌性總結(jié)處理前樣品的結(jié)果顯示，在雄性和雌性大鼠兩者中，其吸光度值幾乎等于對(duì)照大鼠并且都是非反應(yīng)性的。將相同組的雄性和雌性大鼠以低劑量(0.25ml/動(dòng)物)、中等劑量(0.5mv動(dòng)物)和高劑量(1.0ml/動(dòng)物)的人乳頭瘤病毒(rdna)疫苗處理三個(gè)月。在三個(gè)月處理結(jié)束時(shí)，結(jié)果顯示對(duì)疫苗高度反應(yīng)性的較高吸光度值。在雄性組中，用elisa滴度測(cè)量的反應(yīng)性為，在低劑量情況下對(duì)于hpv16l1為3880.417并且對(duì)于hpv18l1為522.338，在中等劑量情況下對(duì)于hpv16l1為6377.327并且對(duì)于hpv18l1為632.235，并且在高劑量情況下對(duì)于hpv16l1為25832.417并且對(duì)于hpv18l1為1198.762；在雌性組中，用elisa滴度測(cè)量的反應(yīng)性為，在低劑量情況下對(duì)于hpv16l1為15567.343并且對(duì)于hpv18l1為770.180，在中等劑量情況下對(duì)于hpv16l1為24445.245并且對(duì)于hpv18l1為4058.034，并且在高劑量情況下對(duì)于hpv16l1為26283.248并且對(duì)于hpv18l1為4100.000。在一個(gè)月恢復(fù)期結(jié)束時(shí)，血清樣品顯示，根據(jù)elisa滴度的反應(yīng)性為：在雄性大鼠中，對(duì)于hpv16l1為25416.265并且對(duì)于hpv18l1為1042.376；在雌性大鼠中，對(duì)于hpv16l1為30410.085并且對(duì)于hpv18l1為951.940。結(jié)論終點(diǎn)研究結(jié)果表明：由卡迪拉保健有限公司制造的人乳頭瘤病毒(rdna)疫苗是免疫原性的，通過針對(duì)低、中和高劑量產(chǎn)生的抗體在elisa中可測(cè)量為高至hpv16l1中為30410.085，在hpv18l1中為4100.000的最高滴度。實(shí)施例11：靈長類動(dòng)物(恒河猴)免疫接種和滴度測(cè)定在磷酸鋁凝膠中制備hpv疫苗制劑，其對(duì)于hpv6l1和hpv18l1分別含有20μg并且對(duì)于hpv16l1和hpv11l1分別含有40μg。配制的疫苗儲(chǔ)存在2-8℃直至使用。在恒河猴中對(duì)每只動(dòng)物用1ml疫苗免疫接種(相當(dāng)于一次人類劑量)，在第0天通過單次劑量肌內(nèi)施用，隨后于第21天、第180天，以及在參考疫苗組和陰性對(duì)照組中額外在第342天加強(qiáng)注射。在實(shí)驗(yàn)開始之前，對(duì)所有非人靈長類動(dòng)物進(jìn)行徹底的生理、獸醫(yī)檢查和臨床化學(xué)參數(shù)的分析。根據(jù)以下免疫接種程序，用以下疫苗以多種時(shí)間間隔免疫接種所述靈長類動(dòng)物。表12：靈長類動(dòng)物研究的免疫接種程序在第21、33、46、63、126、186、193、342、372和433天收集血液樣品中的血清，以用于通過elisa測(cè)定抗體滴度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以預(yù)定間隔從猴中收集血清樣品。將血清樣品進(jìn)一步儲(chǔ)存在-20℃以用于通過elisa測(cè)量抗體。在用hpv16l1/hpvl1純化蛋白質(zhì)以50-100ng/孔在elisa板上包被過夜后，進(jìn)行elisa。用pbs吐溫緩沖液洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，并向板中加入含有1％bsa的封閉緩沖液1小時(shí)以封閉非特異性位點(diǎn)。將血清樣品適當(dāng)稀釋在pbs中并加入孔中。用pbs吐溫緩沖液洗去未結(jié)合的樣品，并加入用hrpo標(biāo)記的抗猴igg45分鐘。再次用洗滌緩沖液洗滌板，加入過氧化物酶底物。將其在黑暗中孵育25分鐘。最后，將25μl終止溶液加入每個(gè)測(cè)試孔中。在15分鐘內(nèi)在405nm處讀板。使用陽性參考疫苗血清庫的不同稀釋度，以o.d.值相對(duì)于其指定的elisa滴度，基于對(duì)elisa截?cái)鄌.d.(來自空白和陰性樣品的o.d.的平均值+3s.d.)之后的終點(diǎn)滴度的考慮來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過elisa測(cè)量的抗體滴度如下表13和14以及圖10和11所示。表13：抗hpv16l1elisa滴度(以log10幾何平均值計(jì))表14：抗hpv18l1elisa滴度(以log10幾何平均值計(jì))結(jié)果根據(jù)本發(fā)明制備的測(cè)試疫苗起初提供了與參考疫苗相當(dāng)?shù)膽?yīng)答。之后，由測(cè)試疫苗獲得的免疫應(yīng)答持續(xù)更長的時(shí)間段，而參考疫苗需要加強(qiáng)劑量以實(shí)現(xiàn)類似的免疫應(yīng)答。類似地，為了確認(rèn)hpv16l1和hpv18l1中的中和抗體應(yīng)答，我們還通過偽病毒中和測(cè)定發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答。發(fā)現(xiàn)就通過elisa測(cè)量的總抗體應(yīng)答而言，在疫苗接種后433天的時(shí)間內(nèi)，對(duì)于hpv16l1和hpv18l1，我們的疫苗的總共3個(gè)劑量具有與參考疫苗的4個(gè)劑量相當(dāng)?shù)目偪贵w應(yīng)答。因此，其提供了我們的疫苗相比于參考疫苗在猴中具有針對(duì)hpv16和18l1的優(yōu)勢(shì)效力的強(qiáng)有力證據(jù)。序列表<110>卡迪拉保健有限公司<120>具有優(yōu)異免疫學(xué)特性的優(yōu)異的人乳頭瘤病毒抗原和含有其的疫苗<130>chl-pct0719<140>2905/mum/2014<141>2014-09-11<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>3027<212>dna<213>hpv16l1<400>1atgtctatgtggagaccatccgactccactgtttatgttccaccaccaaacccagtttcc60aaggttgttgctactgacgcttacgttaagagaactaatatcttctaccacgcttcctca120tccagattgttggctgttggtcacccttactactccatcaagaaggttaacaagactgtt180gttccaaaggtttccggttaccagtacagagtttttaaggttgttttgccagacccaaac240aagttcgctttgccagactcttccttgttcgacccaactactcagagattggtttgggct300tgtactggtttggaggttggtagaggtcagccattgggtgttggtgtttctggtcaccct360ttgttgaacaagtacgacgacgttgagaactccggtggttatggtggtaacccaggtcaa420gacaacagagttaacgttggtatggactacaagcagactcagttgtgtatggttggttgt480gctccaccattgggtgaacattggggtaagggtactcagtgttccaacacttccgttcag540aacggtgactgtccacctttggagttgatcacttccgttattcaggacggtgacatggtt600gacactggttttggtgctatgaacttcgctgacttgcagactaacaagtccgacgttcca660ttggacatctgtggtactgtttgtaaatacccagactacttgcagatggctgctgatcca720tacggtgacagattgttcttctacttgagaaaagaacagatgttcgctagacacttcttc780aacagagctggtactgttggtgagccagttccagatgacttgttggttaagggtggtaac840aacagatcctccgttgcttcctccatctacgttcatactccatccggttccttggtttct900tctgaggctcagttgttcaacaagccatactggttgcagaaggctcagggtcacaacaac960ggtatttgttggggtaaccacttgttcgttactgttgttgacactactagatccactaat1020atgactttgtgtgcttccgtttccaagtccgctacttacactaactccgactacaaagag1080tacatgagacacgttgaagagttcgacttgcagttcatcttccagttgtgttccatcact1140ttgtccgctgaggttatggcttacatccacactatgaacccatccgttttggaggactgg1200aacttcggtttgtctccaccacctaacggtactttggaggacacttacagatacgttcag1260tcccaggctatcacttgtcagaagccaactccagagaaagagaagcaggacccatacaag1320gacatgtctttctgggaggttaacttgaaagagaagttctcctcagagttggaccagttc1380ccattgggtagaaagttcttgttgcagtccggttacagaggtagaacttccgctagaact1440ggtatcaaaagaccagctgtttccaagccatccactgctccaaagagaaaaagaactaag1500actaagaagtagttgtggttgccatctgaagctactgtttacttgccaccagttccagtt1560tctaaggttgtttctactgatgaatacgttgctagaactaacatttactaccatgctggt1620acttctagattgttggctgttggtcacccatactttccaattaagaagccaaacaacaac1680aagattttggttccaaaggtttctggtttgcaatacagagtttttagaatccatttgcca1740gatccaaacaagtttggttttccagatacttctttttacaacccagatactcaaagattg1800gtttgggcttgtgttggtgttgaagttggtagaggtcaaccattgggtgttggtatttct1860ggtcacccattgttgaacaagttggatgatactgaaaacgcttctgcttacgctgctaac1920gctggtgttgataacagagaatgtatttctatggattacaagcaaactcaattgtgtttg1980attggttgtaagccaccaattggtgaacattggggtaagggttctccatgtactaacgtt2040gctgttaacccaggtgattgtccaccattggaattgattaacactgttattcaagatggt2100gatatggttgatactggttttggtgctatggattttactactttgcaagctaacaagtct2160gaagttccattggatatttgtacttctatttgtaagtacccagattacattaagatggtt2220tctgaaccatacggtgattctttgtttttttacttgagaagagaacaaatgtttgttaga2280cacttgtttaacagagctggtgctgttggtgaaaacgttccagatgatttgtacattaag2340ggttctggttctactgctaacttggcttcttctaactactttccaactccatctggttct2400atggttacttctgatgctcaaatttttaacaagccatactggttgcaaagagcccaaggt2460cataacaacggtatttgttggggtaaccaattgtttgttactgttgttgatactactaga2520tctactaacatgtctttgtgtgctgctatttctacttctgaaactacttacaagaacact2580aactttaaggaatacttgagacacggtgaagaatacgatttgcaatttatttttcaattg2640tgtaagattactttgactgctgatgttatgacttacattcattctatgaactctactatt2700ttggaagattggaactttggtttgcaaccaccaccaggtggtactttggaagatacttac2760agatttgttacttctcaagctattgcttgtcaaaagcacactccaccagctccaaaggaa2820gatccattgaagaagtacactttttgggaagttaacttgaaggaaaagttttctgctgat2880ttggatcaatttccattgggtagaaagtttttgttgcaagctggtttgaaggctaagcca2940aagtttactttgggtaagagaaaggctactccaactacttcttctacttctactactgct3000aagagaaagaagagaaagttgtaatag3027<210>2<211>1518<212>dna<213>hpv16l1<400>2atgtctttgtggttgccatctgaagctactgtttacttgccaccagttccagtttctaaa60gttgtttccactgacgaatacgttgctagaactaacatctactaccacgctggtacttct120agattgttggctgttggtcatccatacttcccaattaagaagccaaacaacaacaagatt180ttggttccaaaggtttccggattgcaatacagagttttcagaatccatttgccagatcca240aacaagtttggtttcccagatacttctttctacaacccagacactcaaagacttgtttgg300gcttgtgttggtgttgaagttggtagaggtcaaccattgggtgttggtatttctggtcac360ccattgttgaacaagttggacgatactgaaaacgcttctgcttacgctgctaacgctggt420gttgataacagagaatgtatttctatggactacaagcaaactcaattgtgtttgattggt480tgtaagccaccaattggtgaacattggggaaagggttctccatgtactaatgttgctgtt540aaccctggtgattgtccaccattggaattgattaacactgttattcaagacggtgatatg600gttgatactggtttcggtgctatggatttcactactttgcaagctaacaagtctgaagtt660ccattggacatttgtacttccatctgtaagtacccagactacattaagatggtttctgaa720ccatacggtgattctttgttcttctacttgagaagagaacaaatgtttgttagacacttg780ttcaacagagctggtgctgttggtgaaaacgttccagatgacttgtacattaagggttct840ggttctactgctaacttggcttcttctaactactttccaactccatctggttctatggtt900acttctgacgctcaaattttcaacaagccatactggttgcaaagagcacaaggtcataac960aacggtatttgttggggtaaccaattgttcgttactgttgttgacactactagatccact1020aacatgtccttgtgtgctgctatttctacttctgaaactacttacaagaacactaacttc1080aaagagtacttgagacacggagaagaatacgacttgcaattcattttccaattgtgtaag1140attactttgactgctgacgttatgacttacattcactctatgaactctactattttggaa1200gattggaacttcggattgcaaccaccaccaggtggtactttggaagatacttacagattc1260gttacttctcaagctattgcttgtcaaaagcatactccacctgctccaaaagaagatcca1320ttgaagaagtacactttctg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tacagaggtagaacttccgctagaactggtatc1440aaaagaccagctgtttccaagccatccactgctccaaagagaaaaagaactaagactaag1500aagtag1506當(dāng)前第1頁12