本發(fā)明涉及一種制備非天然存在的限定的單體序列聚合物(defined monomer sequence polymer)的方法。更具體地，通過本發(fā)明的方法形成的限定的單體序列聚合物被限定為具有在結(jié)構(gòu)上彼此不同的至少兩種或更多種單體。本發(fā)明還涉及耐有機溶劑的膜在本發(fā)明的聚合物制備方法中的用途。

發(fā)明背景

非天然存在的聚合物材料的一級結(jié)構(gòu)—即在聚合物鏈中的單體單元的順序排列—在合成大分子中通?？刂撇涣?。常見的非天然聚合物通常是由相同單體單元制成的均聚物、或具有簡單的鏈微結(jié)構(gòu)的共聚物，諸如無規(guī)或嵌段共聚物。這些聚合物用于許多領域，但不具有限定的序列生物聚合物(諸如寡核苷酸、核酸、蛋白質(zhì)肽或寡糖)的結(jié)構(gòu)和功能復雜性。

在限定的單體序列非天然存在的聚合物中具有很大的實用性，所述聚合物即由官能性結(jié)構(gòu)單元(functional building block)的庫組裝使得單體次序被精確限定并且其中至少兩種或更多種單體在結(jié)構(gòu)上彼此不同的非生物聚合物。對于這樣的分子，也許可能的是編程它們的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，例如折疊和自組裝，以及還有它們的宏觀性質(zhì)(Lutz J-F等人，“Sequence-Controlled Polymers(序列控制的聚合物)”，Science.2013年8月9日，第341卷，第628頁。)還設想了醫(yī)學中的許多應用(Hartmann L和Borner HG，“Precision Polymers:Monodisperse,Monomer-Sequence-Defined Segments to Target Future Demands of Polymers in Medicine(精密聚合物：瞄準聚合物在醫(yī)學中的未來需求的單分散、單體序列限定段)”，Advanced Materials.2009，第21卷，第3425-3431頁)。

對于由非天然存在的單體形成的限定的單體序列聚合物的關鍵挑戰(zhàn)是如何制備它們。已經(jīng)提出了各種策略，包括使用迭代步驟的生物方法和化學合成，其中單體以給定的次序一個接一個地附接。該方法遭受在每個步驟的純化的困難。迄今為止已經(jīng)通過如用于序列限定的生物聚合物(諸如寡核苷酸和肽)的高級聚合化學或固相合成解決了這一挑戰(zhàn)(Lutz J-F等人，“Sequence-Controlled Polymers(序列控制的聚合物)”，Science.2013年8月9日，第341卷，第628頁，以及Hartmann L和Borner HG，“Precision Polymers:Monodisperse,Monomer-Sequence-Defined Segments to Target Future Demands of Polymers in Medicine(精密聚合物：瞄準聚合物在醫(yī)學中的未來需求的單分散、單體序列限定段)”，Advanced Materials.2009，第21卷，第3425-3431頁)。

膜法在分離科學領域是眾所周知的，并且可以應用于在液相和氣相中不同分子量的物質(zhì)的一系列分離(參見例如在Kirk Othmer Encyclopaedia of Chemical Technology(Kirk Othmer化學技術(shù)百科全書)中的“Membrane Technology(膜技術(shù))”，第4版，1993，第16卷，第135-193頁)。納濾是利用膜的膜法，所述膜的孔在0.5-5nm的范圍內(nèi)，并且其具有在200-3,000道爾頓范圍內(nèi)的分子量(MW)截止值(cut-off)。納濾已廣泛應用于含水流體的過濾，但由于沒有合適的溶劑穩(wěn)定的膜，尚未廣泛應用于在有機溶劑中分離溶質(zhì)。超濾膜通常具有在3,000至1,000,000道爾頓的范圍中的MW截止值。最近開發(fā)了新類別的膜，其甚至在最不利的溶劑中也是穩(wěn)定的，如在P.Vandezande、L.E.M.Gevers和I.F.J.Vankelecom Chem.Soc.Rev.，(2008)，第37卷，第365-405頁中報道的，新類別的膜中一些可適用于有機溶劑納濾(OSN)。這種膜可以是聚合物膜、陶瓷膜或混合的無機/有機膜。

膜法已經(jīng)與化學合成組合用于生產(chǎn)序列限定的生物聚合物，例如肽和寡核苷酸。在美國專利第3,772,264號中報道了在肽合成期間使用膜來分離生長的肽與過量的試劑和反應副產(chǎn)物。在液相中，用聚(乙二醇)(PEG)作為分子錨定基團來合成肽，并且用水相超濾實現(xiàn)生長的肽鏈與雜質(zhì)的分離。分離需要在每個偶聯(lián)步驟之后的有機溶劑的蒸發(fā)，在每次脫保護后的中和，隨后蒸發(fā)，并且然后對于偶聯(lián)或脫保護，在從水溶液超濾之前的水吸收。然后通過蒸發(fā)和/或共沸蒸餾除去水，然后將PEG錨定的肽重新溶解回到有機溶劑中用于下一偶聯(lián)或脫保護步驟。

美國專利第8,664,357號報道了有機溶劑納濾膜在用于制備選自寡核苷酸、肽和肽核酸的生物聚合物的方法中的用途。

美國專利申請US 20130072691 A1描述了有機溶劑納濾膜在制備基于聚乙二醇的、單分散(即相似或相等的分子量)、異雙官能(在聚合物的任一端具有不同的官能團)的合成聚合物中的用途。

迄今為止的研究集中在提供具有限定的單體單元序列的生物聚合物(諸如寡核苷酸、肽和肽核酸)。鑒于其廣泛的適用性，仍然存在對用于制備非天然存在的限定的單體序列聚合物的方法的需求。

本發(fā)明是考慮到上述內(nèi)容而設計的。

發(fā)明概述

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了用于制備是非天然存在的限定的單體序列聚合物的第一化合物的方法，其中單體單元中的至少兩種彼此不同；該方法包括以下步驟：

(i)通過在第一有機溶劑中進行一個或更多個順序單體偶聯(lián)反應合成第一化合物，和

(ii)在每個偶聯(lián)反應之間，將所述一個或更多個順序偶聯(lián)反應的產(chǎn)物與至少一種第二化合物分離，所述至少一種第二化合物是合成產(chǎn)物的反應副產(chǎn)物和/或過量的用于合成產(chǎn)物的試劑；

其中在步驟(ii)期間，將所述一個或更多個順序偶聯(lián)反應的產(chǎn)物和至少一種第二化合物溶解在第二有機溶劑中，并通過使用膜的滲濾方法分離，所述膜在有機溶劑中是穩(wěn)定的并且提供大于對第二化合物的截留率的對產(chǎn)物的截留率。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了用于制備是限定的單體序列聚合物的第一化合物的方法，其中單體單元中的至少兩種彼此不同；該方法包括以下步驟：

(i)通過在第一有機溶劑中進行一個或更多個順序單體偶聯(lián)反應合成第一化合物，和

(ii)在每個偶聯(lián)反應之間，將所述一個或更多個順序偶聯(lián)反應的產(chǎn)物與至少一種第二化合物分離，所述至少一種第二化合物是合成產(chǎn)物的反應副產(chǎn)物和/或過量的用于合成產(chǎn)物的試劑；

其中在步驟(ii)期間，將所述一個或更多個順序偶聯(lián)反應的產(chǎn)物和至少一種第二化合物溶解在第二有機溶劑中，并通過使用膜的滲濾方法分離，所述膜在有機溶劑中是穩(wěn)定的并且提供大于對第二化合物的截留率的對產(chǎn)物的截留率，條件是第一化合物不是寡核苷酸、肽或肽核酸。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了用于在有機溶劑進料流中分離第一化合物與第二化合物的方法，該方法包括使進料流與滲濾膜接觸的步驟，所述滲濾膜在有機溶劑中是穩(wěn)定的并且提供大于對第二化合物的截留率的對第一化合物的截留率，其中，

(i)第一化合物是非天然存在的限定的單體序列聚合物，其中單體單元中的至少兩種彼此不同；并且

(ii)第二化合物是形成第一化合物的反應的副產(chǎn)物和/或在所述反應中使用的試劑。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了用于在有機溶劑進料流中分離第一化合物與第二化合物的方法，該方法包括使進料流與滲濾膜接觸的步驟，所述滲濾膜在有機溶劑中是穩(wěn)定的并且提供大于對第二化合物的截留率的對第一化合物的截留率，其中，

(i)第一化合物是限定的單體序列聚合物，其中單體單元中的至少兩種彼此不同；并且

(ii)第二化合物是形成第一化合物的反應的副產(chǎn)物和/或在所述反應中使用的試劑，

條件是第一化合物不是寡核苷酸、肽或肽核酸。

根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了耐有機溶劑的滲濾膜在本文限定的方法中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了通過本文限定的方法可獲得、獲得或直接獲得的限定的單體序列聚合物。

發(fā)明詳述

定義

術(shù)語“單體”或“單體單元”在本文中用于指具有限定的和獨特的分子結(jié)構(gòu)并且可以反應以形成聚合物的部分的聚合物結(jié)構(gòu)單元。

術(shù)語“限定的單體序列聚合物”在本文中用于指包含至少兩種單體的聚合物，其中單體中的至少兩種彼此不同，并且其中單體對于聚合物的所有分子以相同的次序存在于聚合物鏈中。

術(shù)語“非天然的”和“非天然存在的”在本文中同義地用于表示在自然界中不存在的人造實體。作為示例，應當理解，這樣的術(shù)語不能應用于完全天然的實體(例如寡核苷酸和肽)。還應當理解，這樣的術(shù)語不能應用于其中聚合物主鏈完全由氨基酸和/或磷酸糖類形成的實體(例如在寡核苷酸、肽和肽核酸的情況下)。為了避免疑問，應當理解，術(shù)語“非天然的”和“非天然存在的”可以應用于其中除了具有非天然存在的主鏈部分(例如聚(乙二醇)主鏈部分)的單一單體之外，聚合物主鏈完全由氨基酸和/或磷酸糖類形成的聚合物。類似地，應當理解，術(shù)語“非天然的”和“非天然存在的”可以應用于其中聚合物主鏈完全由非天然存在的主鏈部分(例如聚(乙二醇)主鏈部分)形成的聚合物。

術(shù)語“合成載體(synthesis support)”在本文中用于涉及一種化學實體，其允許第一化合物在反應和滲濾步驟期間留在溶液中，并任選地提供增加的分子體積以增強膜分離。合成載體可以是支化點分子、或聚合物、樹狀聚合物、樹突(dendron)、超支化聚合物或有機/無機材料，包括納米顆粒、富勒烯和2-D材料，諸如石墨烯和氮化硼。

術(shù)語“支化點分子”在本文中用于指具有至少2個反應性部分和共價結(jié)合到初始單體的末端的能力的多官能有機分子“中樞(hub)”。

本發(fā)明的方法

如上所述，本發(fā)明提供了用于制備是非天然存在的限定的單體序列聚合物的第一化合物的方法，其中單體單元中的至少兩種彼此不同；該方法包括以下步驟：

(i)通過在第一有機溶劑中進行一個或更多個順序單體偶聯(lián)反應合成第一化合物，和

(ii)在每個偶聯(lián)反應之間，將所述一個或更多個順序偶聯(lián)反應的產(chǎn)物與至少一種第二化合物分離，所述至少一種第二化合物是合成產(chǎn)物的反應副產(chǎn)物和/或過量的用于合成產(chǎn)物的試劑；

其中在步驟(ii)期間，將所述一個或更多個順序偶聯(lián)反應的產(chǎn)物和至少一種第二化合物溶解在第二有機溶劑中，并通過使用膜的滲濾方法分離，所述膜在有機溶劑中是穩(wěn)定的并且提供大于對第二化合物的截留率的對產(chǎn)物的截留率。

由于以下事實，限定的單體序列聚合物是非天然存在的：聚合物所包含的單體單元中的至少一種具有非天然存在的主鏈部分(即該單體不包含形成聚合物主鏈的部分的肽或磷酸糖類部分)。在實施方案中，聚合物所包含的單體單元中的多于一種具有非天然存在的主鏈部分。在另一個實施方案中，整個聚合物的聚合物主鏈由非天然存在的部分形成(即其不包含任何肽或磷酸糖類部分)。

在一個實施方案中，聚合物所包含的單體單元中的多于10％具有非天然存在的主鏈部分。在另一個實施方案中，聚合物所包含的單體單元中的多于30％具有非天然存在的主鏈部分。在另一個實施方案中，聚合物所包含的單體單元中的多于50％具有非天然存在的主鏈部分。在另一個實施方案中，聚合物所包含的單體單元中的多于70％具有非天然存在的主鏈部分。在另一個實施方案中，聚合物所包含的單體單元中的多于90％具有非天然存在的主鏈部分。

應當理解，步驟(i)是指一個或更多個順序單體(與聚合物相反)偶聯(lián)反應。本領域技術(shù)人員將清楚，術(shù)語“單體”屬于最小重復單元。

考慮到上述步驟(i)，將理解的是，“第一化合物”可以是僅含有兩種單體單元的限定的單體序列聚合物，在這種情況下，該聚合物通過初始單體單元與第一另外的單體單元的偶聯(lián)來合成。還將理解的是，“第一化合物”可以是含有三種單體單元的限定的單體序列聚合物，在這種情況下，該聚合物通過首先將初始單體單元與第一另外的單體單元偶聯(lián)、然后將第一另外的單體單元與第二另外的單體單元偶聯(lián)來合成。因此，含有4、5和6種單體單元的“第一化合物”分別通過將第三、第四和第五另外的單體單元分別順序偶聯(lián)到第二、第三和第四另外的單體單元來合成。

仍然考慮到步驟(i)，可以使用本領域已知的合成第一化合物的任何合適的方法。在實施方案中，第一化合物的合成可以包括一個或更多個偶聯(lián)和脫保護反應。在這樣的情況下，步驟(i)包括使初始單體單元與過量的第一另外的單體單元反應，在第一另外的單體單元中，反應性末端之一已經(jīng)使用保護基保護。在初始單體和第一另外的單體已偶聯(lián)后，保護基就被裂解以暴露第一另外的單體的反應性末端，該反應性末端然后準備好與第二另外的單體偶聯(lián)。因此，在實施方案中，步驟(i)的一個或更多個單體偶聯(lián)反應各自包括以下步驟：

a.使起始材料與過量的另外的單體反應，所述另外的單體具有被保護基保護的一個反應性末端或被保護基保護的其反應性末端，和

b.除去保護基以便暴露反應性末端，使得其準備好與隨后的另外的單體反應，

其中所述起始材料是使其反應性末端中的至少一個被保護的初始單體，或所述一個或更多個順序單體偶聯(lián)反應的聚合物產(chǎn)物。在這樣的實施方案中，步驟(ii)可以在步驟a)之后(為了除去過量的未反應的另外的單體和任選地其它小反應殘余物(reaction debris))和步驟b)之后(為了除去裂解的保護基、保護基除去的副產(chǎn)物和一種或更多種脫保護試劑)進行。應當理解，步驟(ii)中出現(xiàn)的術(shù)語“試劑”包括反應物和催化劑兩者。

在一個實施方案中，在第一化合物的合成期間，一個或更多個順序單體偶聯(lián)反應的產(chǎn)物通過初始單體單元共價附接到合成載體上。初始單體單元可以直接附接到合成載體上，或者通過連接基部分(linker moiety)(例如二羧酸部分)間接附接到合成載體上。合成載體可以是支化點分子、或聚合物、樹狀聚合物、樹突、超支化聚合物或有機/無機納米顆粒。在合成了期望的限定的單體序列聚合物后，將合成載體從初始單體裂解并從其中分離以露出第一化合物。

當用作合成載體時，合適的聚合物包括含有雜原子官能團的縮聚基質(zhì)或聚合基質(zhì)。這種雜原子官能團可以含有氧、氮、或可以含有多于一個雜原子，諸如酰胺基團。聚合物合成載體的示例包括聚亞烷基二醇，其包括聚乙二醇、聚己內(nèi)酯、用檸檬酸酯化的聚乙二醇、聚乙二醇和琥珀酸的共聚物、乙烯基吡咯烷酮和丙烯酸或丙烯酸β-羥基乙酯的共聚物；或丙烯酰胺和乙酸乙烯酯的共聚物。

當用作合成載體時，合適的樹狀聚合物包括聚(酰胺胺)，也稱為PAMAM樹狀聚合物；磷樹狀聚合物；聚賴氨酸樹狀聚合物；和聚丙烯亞胺(PPI)樹狀聚合物，其可具有包括-OH、-NH₂、-PEG和COOH基團的表面官能團。

當用作合成載體時，合適的納米顆?？梢杂蒘iO₂、TiO₂或其它有機或無機材料(包括富勒烯或2-D材料諸如石墨烯)來制備。

在另一個實施方案中，合成載體是具有兩個或更多個能夠共價結(jié)合到初始單體單元的反應性部分的支化點分子(即多官能分子)。適于將初始單體單元共價結(jié)合到支化點分子的化學過程對于本領域技術(shù)人員將是明顯的，并且包括酰胺、酯、醚和甲硅烷基醚偶聯(lián)。

在另一個實施方案中，支化點分子可以具有以下所示的任何結(jié)構(gòu)：

在實施方案中，過量的初始單體與合成載體反應，這允許合成可以從過量的初始單體純化的軛合物(conjugate)。隨后，可以使用一種或更多種另外的單體通過一系列偶聯(lián)/脫保護反應獲得第一化合物。

進行聚合物鏈從支化點分子的裂解以基本上產(chǎn)生最終的限定的單體序列聚合物，其具有對初始單體的游離的未結(jié)合的末端進行的任何修飾。用于將聚合物從支化點分子上脫離的裂解反應的選擇取決于期望合成的產(chǎn)物，并且可以在合成策略結(jié)束時或根據(jù)方便在任何階段進行。

在另一個實施方案中，共同形成第一化合物的單體單元各自具有主鏈部分，并且單體單元中的至少一種具有懸垂側(cè)鏈部分。在另外的實施方案中，所有單體單元都具有側(cè)鏈部分。

在實施方案中，單體單元中的至少三種彼此不同。合適地，單體單元中的至少四種彼此不同。更合適地，單體單元中的至少五種彼此不同。在特定的實施方案中，構(gòu)成限定的單體序列聚合物的所有單體單元彼此不同。

在特定的實施方案中，在步驟(i)期間偶聯(lián)(并因此形成第一化合物)的所有單體單元具有相同的主鏈部分，但單體單元中的至少兩種由于其各自的側(cè)鏈部分而彼此不同。應當理解，當只有一種單體單元具有懸垂側(cè)鏈部分時，盡管如此，形成聚合物的單體單元中的兩種由于其各自的側(cè)鏈部分而彼此不同，這意味著一種單體具有側(cè)鏈部分，并且另一種單體不具有側(cè)鏈部分。在這樣的實施方案中，第一化合物可以具有選自以下的主鏈：聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、聚(丁二醇)、聚(環(huán)氧乙烷)、聚(環(huán)氧丙烷)、聚(環(huán)氧丁烷)、聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)、聚丁二烯、聚異戊二烯、聚苯乙烯、尼龍和聚酯、聚(乙烯亞胺)(PEI)、聚(丙烯亞胺)、聚(L-賴氨酸)(PLL)、聚(酰胺胺)(PAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(乙烯基苯甲酸)、聚(羥基苯乙烯)、N-取代的甘氨酸和聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。

在可選擇的實施方案中，不是所有在步驟(i)期間偶聯(lián)(并因此形成第一化合物)的單體單元都具有相同的主鏈部分。在這樣的實施方案中，第一化合物可以是具有選自以下的兩種或更多種的主鏈的共聚物：聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、聚(丁二醇)、聚(環(huán)氧乙烷)、聚(環(huán)氧丙烷)、聚(環(huán)氧丁烷)、聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)、聚丁二烯、聚異戊二烯、聚苯乙烯、尼龍和聚酯、聚(乙烯亞胺)(PEI)、聚(丙烯亞胺)、聚(L-賴氨酸)(PLL)、聚(酰胺胺)(PAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(乙烯基苯甲酸)、聚(羥基苯乙烯)、N-取代的甘氨酸和聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。在這樣的實施方案中，單體單元的側(cè)鏈基團可以相同或不同。

在可選擇的實施方案中，在步驟(i)期間偶聯(lián)(并因此形成第一化合物)的單體單元中的至少兩種由于它們各自的側(cè)鏈部分和它們的主鏈兩者而彼此不同。

在特定的實施方案中，在步驟(i)期間偶聯(lián)(并因此形成第一化合物)的所有單體單元具有相同的主鏈部分，但單體單元中的至少兩種由于其各自的側(cè)鏈部分而彼此不同。合適地，所有單體單元具有亞烷基二醇(例如乙二醇)主鏈部分，得到聚(亞烷基二醇)(例如聚(乙二醇))聚合物主鏈。

在另一個特定實施方案中，在步驟(i)期間偶聯(lián)的單體單元中的至少一種具有手性。

在另一個特定實施方案中，在步驟(i)中順序偶聯(lián)的單體單元中的至少兩種由于其立體化學而彼此不同。在這樣的實施方案中，單體單元可以在結(jié)構(gòu)上相同，但是在存在的原子的空間排列方面不同。

在另一個特定實施方案中，在步驟(i)期間偶聯(lián)的單體單元中的至少一種包含與存在于主鏈部分中的手性碳原子結(jié)合的側(cè)鏈。合適地，單體單元中的至少兩種包含側(cè)鏈，所述側(cè)鏈各自與存在于主鏈部分中的手性碳原子結(jié)合。側(cè)鏈在其結(jié)構(gòu)和立體化學方面可以相同或不同。

在另一個特定實施方案中，在步驟(i)中順序偶聯(lián)(并因此形成第一化合物)的所有單體單元具有相同的亞烷基二醇主鏈部分(例如乙二醇主鏈部分)，但是單體單元中的至少兩種由于其各自的側(cè)鏈部分而彼此不同，所述側(cè)鏈部分中的每個與存在于主鏈部分中的手性碳原子結(jié)合，并且其中所述側(cè)鏈部分在其結(jié)構(gòu)或其立體化學或兩者方面彼此不同。

當存在時，在步驟(i)中順序偶聯(lián)(并因此形成第一化合物)的單體單元的側(cè)鏈部分(moieties)或部分(moiety)可以采取活性成分(例如活性藥物成分)的形式，或通過合適的連接基團鏈接到主鏈部分的活性成分的形式。連接基團可以使得限定的單體序列聚合物可以響應于環(huán)境(例如pH、某些酶的表達或?qū)膊〔课晃h(huán)境特異性的一種或更多種條件)的變化而釋放活性成分。在這樣的實施方案中，本發(fā)明允許制備具有適于實現(xiàn)活性成分在生物體內(nèi)的有效遞送的分子量的限定的單體序列聚合物。例如，本發(fā)明允許制備具有大于腎清除所需的腎小球過濾閾值的分子量的限定的單體序列聚合物，這意味著限定的單體序列聚合物在生物體中循環(huán)持續(xù)延長的時間段?？蛇x擇地，可將所限定的單體序列聚合物制備成具有低于腎清除所需的腎小球過濾閾值的分子量，這意味著聚合物在釋放其有效負載后容易從身體清除。在這樣的實施方案中，應當理解，在步驟(i)期間偶聯(lián)的具有包含活性成分的側(cè)鏈部分的單體單元必須足夠小(例如在分子量方面)以在該方法的步驟(ii)期間通過膜，否則不可能將生長的聚合物與過量的單體單元分離。

在實施方案中，側(cè)鏈部分或部分可以采取多種不同活性成分(例如活性藥物成分)或鏈接于不同活性成分的連接基團的形式。不同的活性成分可以以預定比率偶聯(lián)到限定的單體序列聚合物，從而促進聯(lián)合治療的施用。

在另一個實施方案中，側(cè)鏈部分或部分可以采取靶向基團(例如特異性配體或抗體)的形式，所述靶向基團用于幫助將限定的單體序列聚合物導向生物體內(nèi)的相關位點，用于隨后釋放活性有效負載。

在另一個實施方案中，第一溶劑(即步驟(i)中使用的溶劑)和第二溶劑(即步驟(ii)中使用的溶劑)可以相同或不同。適當?shù)?，用于滲濾的溶劑應當將聚合物和/或官能化聚合物保持在溶液中。示例性溶劑包括芳族化合物、烷烴、酮、二醇、氯化溶劑、酯、醚、胺、腈、醛、酚、酰胺、羧酸、醇、呋喃和偶極非質(zhì)子溶劑、及其混合物和與水的混合物。溶劑的具體示例包括甲苯、二甲苯、苯、苯乙烯、苯甲醚、氯苯、二氯苯、氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲基醚酮(MEK)、甲基異丁基酮(MIBK)、丙酮、乙二醇、乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、己烷、環(huán)己烷、二甲氧基乙烷、甲基叔丁基醚(MTBE)、二乙醚、己二腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、N,N-二甲基乙酰胺、二氧六環(huán)、硝基甲烷、硝基苯、吡啶、二硫化碳、四氫呋喃、甲基-四氫呋喃、N-甲基吡咯烷酮、N-乙基吡咯烷酮、乙腈及其混合物和與水的混合物。

用于本發(fā)明的合適的膜包括聚合物膜和陶瓷膜，以及混合的聚合物/無機膜。膜截留率R_i是本領域技術(shù)人員已知的常見術(shù)語，并且定義為：

其中C_P,i＝滲透物中物質(zhì)i的濃度，滲透物是已經(jīng)通過膜的液體，并且C_R,i＝在滲余物中物質(zhì)i的濃度，滲余物是沒有通過膜的液體。應當理解，膜適于本發(fā)明，如果

R_{(限定的單體序列聚合物或軛合物)}>R_{(至少一種反應副產(chǎn)物或試劑)}。

本發(fā)明的膜可以由提供能夠優(yōu)先分離第一分子或軛合物與至少一種反應副產(chǎn)物或試劑的分離層的任何聚合物或陶瓷材料形成。優(yōu)選地，膜由選自適合于制造微濾膜、超濾膜、納濾膜或反滲透膜的聚合物材料的材料形成或包含該材料，該材料包括聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚砜、聚醚砜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酯、聚酰亞胺、聚醚酰亞胺、乙酸纖維素、聚苯胺、聚吡咯、聚苯并咪唑、聚醚醚酮(PEEK)及其混合物。膜可以通過本領域已知的任何技術(shù)制備，包括燒結(jié)、拉伸、徑跡蝕刻、模板浸出(template leaching)、界面聚合或相轉(zhuǎn)化。更優(yōu)選地，可以交聯(lián)或處理膜以便提高其在反應溶劑中的穩(wěn)定性。PCT/GB2007/050218描述了可適用于本發(fā)明的膜。

在特定的實施方案中，膜是復合材料，并且其無孔的、選擇性滲透層由選自基于改性聚硅氧烷的彈性體的材料形成或包含該材料，該材料包括基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的彈性體、基于乙烯-丙烯二烯(EPDM)的彈性體、基于聚降冰片烯的彈性體、基于聚辛烯的彈性體(polyoctenamer based elastomer)、基于聚氨酯的彈性體、基于丁二烯和丁腈橡膠的彈性體(butadiene and nitrile butadiene rubber based elastomer)、天然橡膠、基于丁基橡膠的彈性體、基于聚氯丁二烯(Neoprene(氯丁橡膠))的彈性體、表氯醇彈性體、聚丙烯酸酯彈性體、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、基于聚偏二氟乙烯(PVDF)的彈性體、聚醚嵌段酰胺(PEBAX)、聚氨酯彈性體、交聯(lián)型聚醚、通過界面聚合形成的聚酰胺、及其混合物。

在另一個實施方案中，使用本領域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)，諸如燒結(jié)、浸出或溶膠凝膠方法，由無機材料(例如碳化硅、氧化硅、氧化鋯、氧化鈦或沸石)制備膜。

在另一個實施方案中，膜包括具有分散的有機或無機基質(zhì)的聚合物膜，所述基質(zhì)是以粉末狀固體的形式，以多達聚合物膜的20wt％的量存在。碳分子篩基質(zhì)可以通過任何合適的材料的熱解來制備，如美國專利第6,585,802號中描述的。如美國專利第6,755,900號描述的沸石也可用作無機基質(zhì)。可以使用金屬氧化物，例如二氧化鈦、氧化鋅和二氧化硅，例如可從Evonik Industries(Germany)以其Aerosol和AdNano商標獲得的材料?？梢允褂没旌辖饘傺趸?，例如鈰、鋯和鎂的氧化物的混合物?？梢允褂檬?、氧化石墨烯、金屬有機骨架化合物(MOF)、氮化硼、碳納米管。優(yōu)選的基質(zhì)是直徑小于1.0微米、優(yōu)選地直徑小于0.1微米、并且優(yōu)選地直徑小于0.01微米的顆粒。

如上所述，本發(fā)明還提供了在有機溶劑進料流中分離第一化合物與第二化合物的方法，所述方法包括使進料流與滲濾膜接觸的步驟，所述滲濾膜在有機溶劑中是穩(wěn)定的并且提供大于對第二化合物的截留率的對第一化合物的截留率，其中，

(i)第一化合物是非天然存在的限定的單體序列聚合物，其中單體單元中的至少兩種彼此不同；并且

(ii)第二化合物是形成第一化合物的反應的副產(chǎn)物和/或在所述反應中使用的試劑。

應當理解，本發(fā)明的第一和第二，以及第三和第四方面共同的特征可以通過參考在前面的段落中敘述的任何定義、實施方案和示例來進一步限定。

本發(fā)明的用途

如上所述，本發(fā)明還提供了耐有機溶劑的滲濾膜在本文限定的方法中的用途。

應當理解，本發(fā)明的方法和用途兩者共有的特征可以通過參考在前面的段落中敘述的任何定義、實施方案和示例來進一步限定。

實施例

僅為了參考和說明的目的，現(xiàn)在將參考附圖對本發(fā)明進行例示，在附圖中：

圖1圖示制備基于PEG主鏈的各種限定的單體序列聚合物的合成策略。

圖2圖示兩種限定的單體序列聚合物可以如何基于其組成單體的次序和它們的側(cè)鏈的相互作用在溶液中相互作用。

圖3圖示在圖1的方案中的用于鏈延長的示例性單體結(jié)構(gòu)單元的制備。

圖4圖示在圖1的方案中的用于鏈延長的示例性單體結(jié)構(gòu)單元的制備。

圖5圖示在圖3和圖4中所描繪的單體結(jié)構(gòu)單元的偶聯(lián)。

圖6圖示限定的單體序列聚合物的制備。

實施例1

基于PEG主鏈的序列限定的聚合物的制備：合成載體被選擇成具有在合成結(jié)束時可通過氫解裂解的芐型反應位點(圖1)。例如，長鏈的單甲氧基-PEG(mPEG-5000)可以用乙烯基氯甲基苯處理，并且所得的mPEG-苯乙烯的乙烯基單元轉(zhuǎn)化為溴甲基；商業(yè)上可獲得的1,3,5-三溴甲基苯可直接用作三臂中樞；容易制備的單氨基四苯基甲烷的官能團互變(functional group interconversion)提供了容易獲得大體積的4-三苯甲基芐基載體。

首先使用在G.Szekely、M.Schaepertoens、P.R.J.Gaffney、A.G.Livingston Polymer Chem.，(2014)，第5卷，第694-697頁；Chem.Eur.J，(2014)，DOI：10.1002/chem.201402186中報道的操作，使用不含任何側(cè)鏈的低聚乙二醇(oligoethylene glycol)結(jié)構(gòu)單元來制備一段長度的PEG主鏈。然后可以用不相同的結(jié)構(gòu)單元來延長單分散PEG的初始區(qū)域，以制備限定的單體序列聚合物。這些帶有具有附加的官能團的側(cè)鏈的新的結(jié)構(gòu)單元(2)通過化學合成制備：例如，甘油醇縮丙酮(glycerol acetonide)的3-C羥甲基可以轉(zhuǎn)化成R¹，接著解除該縮丙酮的封閉并將所得的二醇轉(zhuǎn)化成短的PEG鏈；烯烴諸如5-甲基-1-己烯(側(cè)鏈C)也容易通過不對稱二羥基化轉(zhuǎn)化成結(jié)構(gòu)單元2的二醇前體，并且可以使用具有初始保護/官能團操作的類似方法從3-丁烯酸(A)或3-丁烯醇(B和D)制備其他結(jié)構(gòu)單元。結(jié)構(gòu)單元2類似于已經(jīng)報道的制備單分散PEG的那些(參見G.Szekely、M.Schaepertoens、P.R.J.Gaffney、A.G.Livingston)，其由具有確切地限定的長度的短的低聚乙二醇主鏈組成，在一端具有臨時的、弱酸不穩(wěn)定的保護基(PG)，并且在另一端具有易于受到在通過Williamson醚化的鏈延長期間通過醇鹽親核試劑的置換所影響的離去基團(LG)。側(cè)鏈(例如圖1中的A至D)對這樣的條件是惰性的，或者具有被在合成結(jié)束時除去的永久保護基掩蔽的反應性官能團。

在強堿性條件下用過量的第一不相同的結(jié)構(gòu)單元(2¹)處理負載的單分散PEG 1，以延長序列限定的聚合物主鏈。通過在有機溶劑(優(yōu)選THF或MeCN)中滲濾，純化含有期望的具有第一側(cè)鏈(R¹)的序列限定的聚合物(3)的粗反應混合物。在滲濾期間，過量的結(jié)構(gòu)單元2¹和其它鏈延長試劑滲透通過膜，但是由于其高分子量/空間位阻(steric bulk)/分子結(jié)構(gòu)的組合，具有一個側(cè)鏈的負載的序列限定的聚合物(3)的截留率是非常高的。滲透物中殘留的未反應結(jié)構(gòu)單元2¹可以從其它反應殘余物中重新純化(例如，通過色譜法)并用于隨后的偶聯(lián)循環(huán)中，這提高合成效率。然而，結(jié)構(gòu)單元2¹是必須滲透通過膜的最大的物質(zhì)(即，除了3之外，其在粗反應混合物中具有最高的截留率)，并且因此是在鏈延長之后最可能污染3的物質(zhì)。在該階段，完全純化(需要大量溶劑的滲透)是不必要的。相反，僅足夠的溶劑需要滲透以回收大部分結(jié)構(gòu)單元2¹(如果需要)，并除去隨后可與4的游離羥基反應的任何其它試劑。

在鏈末端保護的序列限定的聚合物3已經(jīng)通過滲濾被純化后，將弱酸[例如二氯乙酸(DCA)或低濃度的HCl]加入到該溶液中以實現(xiàn)包括陽離子捕集劑(例如吡咯、水、硫醇等)的酸不穩(wěn)定的臨時保護基(PG，圖1)的解除封閉以驅(qū)使反應完成，如果需要的話。第二輪滲濾被完全用于純化負載的序列限定的聚合物4，其現(xiàn)在具有準備好用于另一輪鏈延長的鏈末端羥基。該過程除去酸試劑、保護基殘余物和另外的試劑。關鍵的是，其還除去了否則可能參與下一輪鏈延長的任何最后的痕量的結(jié)構(gòu)單元2¹；在解除PG的封閉之后，任何殘留的結(jié)構(gòu)單元2¹也將被解除封閉(至5，減小其尺寸)，因此將具有顯著更低的截留率，使得全部純化更有效。

然后將來自解除封閉的、負載的序列限定的聚合物4的滲濾的滲余物濃縮(通過滲濾或通過蒸發(fā))，準備好用于另一輪鏈延長(圖1)；濃縮(特別是從THF或MeCN中)方便地除去在前述方法期間可能積聚的痕量的水，并且所述水將消耗昂貴的結(jié)構(gòu)單元2。在如上所述的同一系列方法中，首先使負載的序列限定的聚合物4與序列中的第二結(jié)構(gòu)單元(2²)反應；所得的鏈延長的、序列限定的聚合物再次通過滲濾純化以回收過量的結(jié)構(gòu)單元2²；然后用弱酸將臨時保護基PG解除封閉；并且最后將鏈延長的、羥基封端的序列限定的聚合物完全純化，準備好用于另一輪鏈延長。重復該循環(huán)直到實現(xiàn)期望的序列。

在期望的序列被制備后，其接下來必須從合成載體中被裂解并除去側(cè)鏈上的任何永久保護基。序列限定的聚合物的兩個靶序列(6a和6b)圖示于圖2中。二者可以通過在原位制備的高反應性披鈀木炭(palladised charcoal)上的催化氫解從合成載體上裂解。在該程序中，并入序列6a中的結(jié)構(gòu)單元B的疊氮官能團也將同時還原為期望的靶標的胺基團。相比之下，序列6b中結(jié)構(gòu)單元D的雙環(huán)原酸酯保護基在合成載體裂解期間將保持完整。相反，其將需要在另外的步驟中用更強的含水酸單獨地解除封閉。

眾所周知，PEG在溶液和晶體結(jié)構(gòu)中采用螺旋構(gòu)象，每轉(zhuǎn)(turn)有四個或五個乙二醇單體單元。結(jié)構(gòu)單元2的手性迫使這些螺旋采用單旋向性(single handedness)，其側(cè)鏈徑向輻射，這將改善在超分子結(jié)構(gòu)中相鄰螺旋的堆積。序列6a和6b兩者都是共聚物，其由共價鍵合到兩親性螺旋的親水性單分散PEG尾部(沒有側(cè)鏈)組成。6a的兩親性螺旋在一側(cè)具有疏水性異戊基側(cè)鏈，而在另一側(cè)(在中性pH下)具有帶正電荷的烷基銨離子。6b的兩親性螺旋在一側(cè)也具有疏水性異戊基側(cè)鏈，但在另一側(cè)(在中性pH下)具有帶負電荷的羧酸根基團。雖然6a和6b兩者的疏水性側(cè)鏈可以在水溶液中自締合(self-associate)(類似于蛋白質(zhì)亮氨酸拉鏈(proteinogenic leucine zipper))，但是由于相同電荷的排斥，單獨的6a或6b的較大的聚集將不能形成。然而，在混合6a和6b的水溶液時，大規(guī)模結(jié)構(gòu)將形成，其被覆蓋在分子均勻的PEG的親水層中，具有通過疏水性堆積(hydrophobic packing)和離子締合而結(jié)合的芯。

可以制備許多其他側(cè)鏈，其賦予強的分子內(nèi)識別，以構(gòu)建精確限定的官能分子。例如，具有側(cè)鏈D的冠醚的結(jié)構(gòu)單元預期優(yōu)先對接烷基胺，諸如側(cè)鏈B，并且已經(jīng)觀察到穿過(thread)多胺鏈。將與多輪Williamson醚鏈延長相容的、較大的正交識別元件對(pair of orthogonal recognition element)可以圍繞帶有疏水性金剛烷基的側(cè)鏈構(gòu)建，所述疏水性金剛烷基緊密地插入β-環(huán)糊精的中心空隙中。

實施例2

制備用于制備基于PEG主鏈的序列限定的聚合物的單體結(jié)構(gòu)單元。圖3圖示如何制備具有側(cè)鏈的新的結(jié)構(gòu)單元。使用催化四氧化鋨和二氫奎尼丁-酞嗪[(DHQD)₂PHAL]使1-癸烯(7)經(jīng)受不對稱二羥基化。2小時后，用亞硫酸鈉使反應猝滅，并且將粗制材料萃取到乙酸乙酯中。稍后將4,4'-二甲氧基三苯基(Dmtr)醚9官能化為其樟腦酸酯(camphanate ester)證明粗制的癸烷1,2-二醇(8)具有低的對映體過量(ee)。然而，粗制的癸二醇從MeCN中的結(jié)晶提供了高光學純度的8，因為在其¹³C NMR光譜中可以檢測到9的樟腦酸酯的僅一種非對映異構(gòu)體；因此，典型的S/N表明ee>98％。

通過用稍過量的DmtrCl處理，在伯羥基上選擇性保護癸二醇(8)，并且用過量萘甲基四甘醇對甲苯磺酸酯(naphthylmethyl tetragol tosylate)(10)醚化Dmtr-醚9(G.Szekely，M.Schaepertoens，P.R.J.Gaffney，Chem.Eur.J.，(2014)，20,10038-10051；參見Supporting Information(輔助信息)，化合物38)。然后將在所得的辛基五甘醇(octyl pentagol)上的酸不穩(wěn)定的保護基交換為較小的保護基，這將允許過量的未消耗的結(jié)構(gòu)單元更容易通過OSN膜(參見圖1中的一般化合物2¹)。用二氯乙酸(DCA)裂解五甘醇的Dmtr-醚11，通過用吡咯捕獲Dmtr⁺陽離子來迫使反應完成。通過對二氫吡喃(DHP)的酸催化加成，將所得的醇(12)再保護為四氫吡喃基(Thp)縮醛。中間體13不能被完全純化，因為它與來自過量DHP的殘余物共洗脫。因此，將粗品13氫解，這之后，可以通過色譜法完全純化醇14。通過用甲苯磺酰氯磺化游離羥基，以良好收率制備最終結(jié)構(gòu)單元15。

實施例3

制備用于制備基于PEG主鏈的序列限定的聚合物的單體結(jié)構(gòu)單元。圖4圖示可以如何制備具有官能性側(cè)鏈的新的結(jié)構(gòu)單元。首先通過甲硅烷基化使過量的四甘醇(16)去對稱化(desymmetrise)，這之后，通過分配到水中來除去剩余的未反應的四甘醇，并且通過色譜法容易分離出痕量的雙-Tbdms四甘醇。然后通過用甲磺酰氯將剩余的羥基磺化來活化所得的單甲硅烷基醚(17)。同時，(R)-(+)-芐基甘油的二醇高度區(qū)域選擇性地在伯羥基上被保護為其1-Dmtr醚(20)，留下仲羥基是游離的，用于附接PEG鏈。試圖用17的甲苯磺酸酯所進行的20的Williamson醚化給出很差的收率，其中許多副產(chǎn)物主要來源于緩慢的堿驅(qū)動的脫甲硅基作用。然而，通過使用較小的甲磺酸酯來減小親電體的尺寸極大地加速了該反應，這限制了可用于緩慢的副產(chǎn)物積聚的時間，導致五甘醇21的良好收率。盡管Dmtr-醚與我們的總體合成策略化學相容，但經(jīng)驗表明，該大的疏水性保護基對大多數(shù)OSN膜提供一些截留率，這限制了從生長的聚合物homostar分離過量結(jié)構(gòu)單元的能力。因此，五甘醇Dmtr-醚21選擇性地用DCA和吡咯解除封閉，并且所得的中間體22的羥基被再保護為其較小的Thp-縮醛。通過用在MeCN中的1M四乙基氟化銨進行初始脫甲硅基作用、然后用TsCl使中間體醇(24)磺化可以將所得到的具有帶有掩蔽的羥基的側(cè)鏈的五甘醇的Thp-縮醛(23)直接攜帶至完成的結(jié)構(gòu)單元(25)。然而，23的芐醚也可以選擇性地被解除封閉，這允許將暴露的羥基官能團互變成其它側(cè)鏈。芐醚23在甲醇中的氫解導致Tbdms-醚基本上同時解除封閉，推測是由于Pd-催化劑的殘留酸性。但在乙酸乙酯中23的較慢氫解給出完全轉(zhuǎn)化為側(cè)鏈羥基(26)。這被活化為其甲苯磺酸酯(27)，其甲苯磺酸酯(27)然后用疊氮化物置換。使用如與芐氧基取代的五甘醇23相同的脫甲硅基作用、然后磺化的程序，以將Tbdms-醚28經(jīng)由羥基中間體29轉(zhuǎn)化為完成的疊氮基結(jié)構(gòu)單元30。

實施例4

單體結(jié)構(gòu)單元的偶聯(lián)。參考圖5，制備兩個結(jié)構(gòu)單元以例示用于鏈延長的偶聯(lián)策略。Npm-Dmtr-中間體11通過用DCA和吡咯在五甘醇鏈的一端的脫三苯甲基作用，以及在另一端通過氫解來選擇性地解除封閉，以分別給出單醇31和32；還注意到，在非質(zhì)子溶劑中氫解11將大大降低是主要副產(chǎn)物的同時的脫三苯甲基作用的水平。在用于偶聯(lián)的制備中，中間體32以常規(guī)方式磺化；注意到，最小受阻羥基被活化以最大化成功偶聯(lián)的機會，但是如果必要，也可以使用甲磺酸酯。

實施例5

制備限定的單體序列聚合物。在完整的homostar聚合物合成中，并參考圖5，Npm-保護的結(jié)構(gòu)單元31是生長的負載鏈。因此，用稍過量的辛基五甘醇Dmtr-醚甲苯磺酸酯33處理單羥基辛基五甘醇Nmp-醚31。成功醚化以給出十甘醇(decagol)34表明，可以組合這樣的結(jié)構(gòu)單元以制備具有側(cè)鏈的序列限定的PEG，甚至采用低過量的親電體。在實踐中，在單分散PEG的制備期間，通常使用較大過量的甲苯磺酸酯組分(3.3當量)以確保鏈末端的總轉(zhuǎn)化率。

因此，該實施例證明，側(cè)鏈修飾的單體結(jié)構(gòu)單元可以順序添加到具有非常高的膜截留率的四甘醇homostar 35上，接著OSN純化以回收過量的結(jié)構(gòu)單元并解除中間體三-Thp-縮醛homostar的封閉，以給出homostar負載的限定序列聚合物36。36的氫解提供沿其長度在精確限定的位置處具有辛基、羥甲基和氨基甲基側(cè)鏈、以及具有限定的手性的十八甘醇(octadecagol)37。

雖然為了參考和說明的目的在本文中已描述了本發(fā)明的具體實施方案，但是在不脫離由所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍的情況下，各種修改對于本領域技術(shù)人員將是明顯的。

導致本發(fā)明的工作已經(jīng)在授予協(xié)議n°238291下從[歐洲共同體]第七框架計劃(Seventh Framework Programme)([FP7/2007-2013]]中獲得資助。