用于生產(chǎn)短毛動(dòng)物的材料和方法與流程

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本申請(qǐng)的序列表標(biāo)記為SEQ-LIST-9-18-15-ST25.txt，其創(chuàng)建于2015年9月18日，大小為33KB。序列表的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用的方式并入本文。

背景技術(shù)：

在很多情況下，都期望動(dòng)物具有短毛的皮毛。一些動(dòng)物中，這在緩解熱應(yīng)激方面特別有用。也可能存在這樣的情況，基于美學(xué)和/或引起過(guò)敏等原因，短毛是優(yōu)選的。

耐熱性是大的牲畜尤其是牛的重要特征。在美國(guó)，每年過(guò)熱都會(huì)殺死數(shù)以千計(jì)的牛，降低牛的性能，并阻止最高性能的品種在炎熱氣候中的使用。減少牛的熱應(yīng)激的一個(gè)方法是縮短毛發(fā)。在牛中，短毛皮毛被稱為“光滑”皮毛，相關(guān)基因稱為SLICK基因，短毛皮毛的表型被稱為“光滑表型”。

一些牛生產(chǎn)者在夏天為牛剃毛以提高耐熱性；然而這一方法是勞動(dòng)密集型的和昂貴的，對(duì)大群牛是不切實(shí)際的。光滑表型天然存在于抽取的西非的一些牛品種中，包括Senepol、Carora和Romosinuano；然而這些品種具有不太優(yōu)良的性能和胴體品質(zhì)，這限制了他們?cè)陴B(yǎng)牛業(yè)的應(yīng)用。

光滑表型的基因基礎(chǔ)被認(rèn)別為是單個(gè)顯性基因(Olson等(2003),J Anim Sci.；81(1):80-90)。傳統(tǒng)的連鎖分析定位到負(fù)責(zé)的基因位于牛染色體20的500萬(wàn)堿基對(duì)區(qū)域(Mariasegaram等(2007),Anim Genet.；38(1):54-59)。該區(qū)域使用全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)進(jìn)一步縮小(Huson等(2014),Front Genet.；Apr 29,Vol.5:101)。但是較窄的區(qū)域包含幾個(gè)基因，它們都不包含突變。因此，變窄可能是一個(gè)錯(cuò)誤。

在熱應(yīng)激下維持體內(nèi)平衡的能力對(duì)亞熱帶和熱帶地區(qū)的牛是特別重要的。雖然品種間耐熱性的差異已被研究了很多年，但是針對(duì)闡明涉及耐熱性的遺傳模式的研究相對(duì)較少。在澳大利亞已經(jīng)研究了熱應(yīng)激下體溫的變化，并且表明具有低至中等的遺傳可能性(Turner,1982；1984；Mackinnon等,1991；Burrow,2001)。據(jù)報(bào)道，Senepol牛與婆羅門牛(Brahman cattle)的耐熱性相同(Hammond和Olson,1994；Hammond等,1996)。與溫帶品種雜交的Senepol F1顯示出與婆羅門牛和婆羅門雜交牛相當(dāng)?shù)哪蜔嵝?Hammond和Olson,1994；Hammond等,1996；1998)。

到目前為止，仍不知道是什么突變導(dǎo)致光滑皮毛的表型。

發(fā)明簡(jiǎn)述

本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)短毛動(dòng)物的材料和方法。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，這通過(guò)改變動(dòng)物中的編碼催乳素受體(PRLR)蛋白的核苷酸序列來(lái)實(shí)現(xiàn)，以產(chǎn)生縮短形式的蛋白質(zhì)。有利地并且意外地，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的縮短的蛋白質(zhì)保留了催乳的功能，但導(dǎo)致動(dòng)物具有短毛皮毛。

在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于編碼縮短的催乳素受體蛋白質(zhì)的聚核苷酸序列。聚核苷酸序列可以是用于縮短C-末端的缺失核苷酸，或如果所述核苷酸存在的話，它們與編碼N-末端的核苷酸都不在可讀框內(nèi)。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)短毛動(dòng)物的方法，其中所述方法包括在動(dòng)物中表達(dá)縮短的催乳素受體蛋白，所述縮短的催乳素受體蛋白具有提供催乳功能但不包含來(lái)自與長(zhǎng)毛皮毛相關(guān)的野生型蛋白的C-末端的氨基酸的氨基酸序列。

在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了基因工程牛，在其基因組內(nèi)具有編碼催乳素受體蛋白的催乳片段的聚核苷酸(如SEQ ID NO：3)但缺乏編碼可導(dǎo)致長(zhǎng)毛皮毛的氨基酸或至少缺少部分可導(dǎo)致長(zhǎng)毛皮毛的氨基酸的核苷酸(如SEQ ID NO：6)。本發(fā)明還提供了基因工程牛，其中催乳素受體基因的一個(gè)或兩個(gè)拷貝突變或縮短，使得牛表達(dá)縮短的家牛(B.Taurus)催乳素受體蛋白并顯示出短毛皮毛表型。

有利的是，動(dòng)物中動(dòng)物影響皮毛長(zhǎng)度，由此影響熱應(yīng)激的SLICK基因的識(shí)別，使得可以將所述特征改造至溫帶品種中，從而提高在較熱氣候的牛的產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明，可以通過(guò)在熱應(yīng)激期間增加胚胎存活率和產(chǎn)生更多的牛奶來(lái)實(shí)現(xiàn)奶牛的多產(chǎn)。將光滑的毛發(fā)導(dǎo)入溫帶?？破贩N中，使得他們?cè)诒纫郧翱赡芨鬅釕?yīng)激的條件下成功地增產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

專利或申請(qǐng)文件中包含至少一張彩色圖。具有彩色附圖的專利或?qū)＠暾?qǐng)公開(kāi)的副本在請(qǐng)求和支付必要的費(fèi)用后由官方提供。

圖1示出導(dǎo)致牛的催乳素受體(PRLR)蛋白縮短的突變。從野生型序列中刪除C(在SEQ ID NO：2的1382位置的胞嘧啶)引起丙氨酸461突變?yōu)槔i氨酸，并將以下密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子從而產(chǎn)生461個(gè)氨基酸的催乳素受體。所述突變表示為A461VfsX1，即，丙氨酸(A)是第一個(gè)改變的氨基酸，在位置461，由纈氨酸(V)代替，并且移位框的長(zhǎng)度為1，包括終止密碼子(X)。

序列簡(jiǎn)要說(shuō)明

SEQ ID NO：1是家牛(Bos taurus)催乳素受體的全長(zhǎng)mRNA序列。

SEQ ID NO：2是編碼全長(zhǎng)/野生型家牛催乳素受體的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3是編碼保留催乳活性和產(chǎn)生光滑表型的家牛催乳素受體蛋白的最小390氨基酸部分的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4是編碼突變的/縮短的家牛催乳素受體蛋白的核苷酸序列的實(shí)施例。具體地，是對(duì)應(yīng)于A461VfsX1突變體的牛催乳素受體的mRNA突變體的蛋白質(zhì)編碼部分的序列。

SEQ ID NO：5是編碼縮短的家牛催乳素受體蛋白的核苷酸序列的實(shí)施例。具體地，是編碼縮短的包含氨基酸1-461的家牛催乳素受體的mRNA的序列。

SEQ ID NO：6提供了在編碼最小突變的/縮短的家牛催乳素受體蛋白的核苷酸中不存在(不在框內(nèi))的聚核苷酸序列。所述序列或其片段可以在編碼突變的/縮短的家牛催乳素受體蛋白的核苷酸中出現(xiàn)；然而所述序列或其片段未出現(xiàn)在具有核苷酸編碼突變的/縮短的家牛催乳素受體蛋白的蛋白質(zhì)讀取框中，或其編碼足夠少的氨基酸，使光滑皮毛表型出現(xiàn)。

SEQ ID NO：7是全長(zhǎng)家牛催乳素受體的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是家牛催乳素受體蛋白用于產(chǎn)奶所需的390氨基酸最小部分的序列，其可以提供光滑表型。

SEQ ID NO：9是突變的/縮短的家牛催乳素受體蛋白的實(shí)施例的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10是縮短的家牛催乳素受體蛋白的實(shí)施例的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是未出現(xiàn)在縮短的家牛催乳素受體蛋白中的家牛催乳素受體蛋白的部分氨基酸序列。

SEQ ID NO：12是未出現(xiàn)(未在框內(nèi))在縮短的家牛催乳素受體蛋白中的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13家牛催乳素受體突變體A461VfsX1的mRNA序列。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生短毛動(dòng)物的材料和方法。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，這通過(guò)改變動(dòng)物中的編碼催乳素受體(PRLR)蛋白的核苷酸序列來(lái)實(shí)現(xiàn)，以產(chǎn)生縮短形式的蛋白質(zhì)。有利地并且意外地，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的縮短的蛋白質(zhì)保留了催乳的功能，但導(dǎo)致動(dòng)物具有短毛皮毛。

因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，例如，本發(fā)明提供了通過(guò)給予動(dòng)物短毛(光滑)皮毛以提高動(dòng)物的耐熱性的材料和方法。在本文具體例示的優(yōu)選的實(shí)施方式中，動(dòng)物是?？苿?dòng)物。

本文具體例示的是牛，其表達(dá)賦予牛產(chǎn)奶能力但也導(dǎo)致短毛表型的催乳素受體蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，催乳素受體蛋白包含581氨基酸野生型蛋白的390N-末端氨基酸。除了最小390氨基酸片段之外可以存在為只要與全長(zhǎng)蛋白相比表達(dá)的蛋白被充分縮短從而獲得短毛表型的氨基酸。優(yōu)選地，全長(zhǎng)581氨基酸蛋白的C-末端被縮短至少1，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，或120或更多氨基酸。

在具體實(shí)施方式中，聚核苷酸包括編碼SEQ ID NO：8所示的催乳素受體蛋白的390氨基酸部分，并且其中聚核苷酸不包含編碼SEQ ID NO：11(氨基酸391-581)的核苷酸。可替代地，如果編碼SEQ ID NO：11的核苷酸全部或部分存在，則其不在與SEQ ID NO：3相同的蛋白的可讀框內(nèi)，或部分存在，和在與SEQ ID NO：3相同的可讀框內(nèi)不編碼足夠數(shù)量的氨基酸以產(chǎn)生正常(非光滑或非短毛的)皮毛。

光滑皮毛的存在可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用例如Olson等在“Evidence of a Major Gene Influencing Hair Length and Heat Tolerance in Bos Taurus Cattle,”J.Anim.Sci.(2003)81:80-90中提出的實(shí)驗(yàn)容易地確定，其全部?jī)?nèi)容以引證的方式并入本文。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，短毛皮毛的動(dòng)物的毛發(fā)小于不表現(xiàn)出光滑毛發(fā)表型的動(dòng)物(本文稱為“正?！被颉伴L(zhǎng)毛”)毛發(fā)長(zhǎng)度的50％，40％，30％，20％或甚至10％。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“牛(cattle)”是指術(shù)語(yǔ)家牛(B.Taurus)，牦牛(B.mutus)和牛(Bos)類其他成員的動(dòng)物。本發(fā)明用牛舉例說(shuō)明；然而本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在能夠受益于短毛皮毛的其它動(dòng)物上實(shí)踐本發(fā)明，以改善耐熱性、美觀性、過(guò)敏性和/或清潔性。優(yōu)選地，動(dòng)物是非人動(dòng)物。所述其它動(dòng)物包括但不限于其他?？?特別是牛科動(dòng)物)，豬，馬，山羊，貓，小鼠，大鼠，狗，猿，黑猩猩和猩猩。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，保持催乳功能所需的催乳素受體部分縮短的精確位置可以隨著物種的不同而不同，如實(shí)現(xiàn)短毛皮毛所需的C-末端縮短的程度。然而，對(duì)于給定動(dòng)物存在的催乳素受體蛋白的適當(dāng)部分可以容易地由受益于本申請(qǐng)內(nèi)容的技術(shù)人員確定。

根據(jù)本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)造成光滑表型的突變。突變是在家牛催乳素受體基因中的A461VfsX1突變。突變導(dǎo)致催乳素受體蛋白的羧基末端的120個(gè)氨基酸刪除。

從催乳素受體蛋白C-末端刪除的120個(gè)氨基酸基本上在所有哺乳動(dòng)物中都是保守的。這些氨基酸對(duì)于牛奶的生產(chǎn)不是必需的，即缺失所述C-末端氨基酸的催乳素受體可以在牛奶生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)揮其作用。

SEQ ID NO：2是編碼全長(zhǎng)家牛催乳素受體蛋白的核苷酸序列。SEQ ID NO：4和13是編碼家牛催乳素受體蛋白的突變的/縮短的形式的核苷酸序列。所述特定的縮短的蛋白由攜帶A461VfsX1突變的突變體催乳素受體基因編碼。攜帶這種突變的牛顯示出光滑的表型。

因此，本發(fā)明提供了包含序列SEQ ID NO：3的聚核苷酸。所述序列SEQ ID NO：3編碼縮短的家牛催乳素受體蛋白。其中所述聚核苷酸在與包含SEQ ID NO：3的聚核苷酸相同的蛋白閱讀框內(nèi)不包含核苷酸序列SEQ ID NO：6(或其足夠大的部分以導(dǎo)致長(zhǎng)毛皮毛)。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述聚核苷酸稱為“縮短的家牛催乳素受體聚核苷酸”。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，如果兩個(gè)聚核苷酸連接(融合)時(shí)，第一聚核苷酸在與第二聚核苷酸相同的蛋白閱讀框內(nèi)，融合的聚核苷酸編碼包含由第一和第二聚核苷酸獨(dú)立編碼的多肽的蛋白質(zhì)。因此，當(dāng)兩個(gè)聚核苷酸彼此連接而沒(méi)有干擾核苷酸時(shí)，維持兩個(gè)聚核苷酸的蛋白閱讀框。如果插入在第一和第二聚核苷酸之間的核苷酸個(gè)數(shù)不是3的整數(shù)倍(例如1,2,4,5,7,8,9,11等)和/或在第一聚核苷酸的蛋白閱讀框中出現(xiàn)終止密碼子，則不能保持閱讀框在兩個(gè)聚核苷酸之間。

因此，在某些具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的縮短的家牛催乳素受體聚核苷酸包含序列SEQ ID NO：3、4或5，其與包含全部或部分SEQ ID NO：6的聚核苷酸連接，其中插入SEQ ID NO：3、4或5的聚核苷酸和SEQ ID NO：6的聚核苷酸之間的核苷酸數(shù)量不是3的整數(shù)倍和/或在兩個(gè)聚核苷酸之間導(dǎo)入了具有SEQ ID NO：3、4或5序列的蛋白閱讀框中的終止密碼子。這樣的聚核苷酸的序列的實(shí)例是包含SEQ ID NO：13的聚核苷酸，其是家牛催乳素受體蛋白A461VfsX1突變體的核苷酸序列并且包含在序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6部分序列之間的核苷酸。可選地，SEQ ID NO：6的全部或部分可以完全不存在，只存在序列的一部分，則不足以產(chǎn)生長(zhǎng)毛皮毛。

因此，縮短的家牛催乳素受體聚核苷酸可能包含SEQ ID NO：6的序列，或其片段；然而，在具有縮短的家牛催乳素受體聚核苷酸序列的蛋白閱讀框中SEQ ID NO：6的序列或其片段不能編碼足夠數(shù)量的氨基酸，以產(chǎn)生長(zhǎng)毛。

本發(fā)明的一個(gè)縮短的家牛催乳素受體聚核苷酸編碼了縮短的家牛催乳素受體蛋白，其中縮短的蛋白包含SEQ ID NO：8序列，其中縮短的家牛催乳素受體蛋白不包含足以引起長(zhǎng)毛皮毛的SEQ ID NO：11的序列或片段。

因此，根據(jù)本發(fā)明的有用的縮短的家牛催乳素受體蛋白的實(shí)例包括SEQ ID NO：7所示的全長(zhǎng)催乳素受體蛋白的片段，其中縮短的蛋白包括SEQ ID NO：7的1-390到1-461氨基酸的氨基酸序列和不含有SEQ ID NO：11的序列或片段的SEQ ID NO：7片段。

表1提供了縮短的家牛催乳素受體聚核苷酸和由上述聚核苷酸編碼的縮短的家牛催乳素受體蛋白的某些實(shí)施例。表1中所描述的所有縮短的家牛催乳素受體聚核苷酸序列都從SEQ ID NO：4或5的位置1開(kāi)始，表1所描述的縮短的家牛催乳素受體蛋白的序列從SEQ ID NO：7的位置1開(kāi)始。聚核苷酸的多個(gè)終止位置對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO：4或5，并且氨基酸的多個(gè)終止位置對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO：7。

表1

大于461個(gè)氨基酸的片段也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，只要他們不大到足以產(chǎn)生非光滑表型。

本發(fā)明還提供了縮短的家牛催乳素受體聚核苷酸和縮短的家牛催乳素受體蛋白的同系物。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“同系物”指與參考序列具有至少70％到約90％(含)之間的百分比一致性的序列。百分比一致性的上述范圍被認(rèn)為包括并且以1％的間隔為70％至99％之間的任何分?jǐn)?shù)百分比提供書面描述支持。例如，同源序列可以表現(xiàn)出與參考序列70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99的百分比一致性。

通常，在整個(gè)參考序列上計(jì)算百分比一致性。在兩個(gè)或更多個(gè)序列的情況中，術(shù)語(yǔ)“相同”或百分比“一致性”是指當(dāng)通過(guò)對(duì)比窗口比較和排列最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，使用序列比較算法或通過(guò)手動(dòng)排列和目視檢查測(cè)量相同或具有相同的殘基的指定百分比的兩個(gè)或更多個(gè)序列或子序列。

本發(fā)明還提供了縮短的家牛催乳素受體聚核苷酸和縮短的家牛催乳素受體蛋白的同系物，其與縮短的家牛催乳素受體聚核苷酸和縮短的家牛催乳素受體蛋白具有至少70％至約99％(包括99％)的序列一致性。

縮短的家牛催乳素受體聚核苷酸的同系物的某些實(shí)例包括具有與SEQ ID NO：3、4或5序列相比約百分之70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99的序列一致性的聚核苷酸?？s短的家牛催乳素受體聚核苷酸的同系物在同系物的閱讀框內(nèi)還不包括足以產(chǎn)生長(zhǎng)皮毛的SEQ ID NO:6的序列或其片段。

縮短的家牛催乳素受體聚蛋白的同系物的某些實(shí)例包括具有與SEQ ID NO：8、9或10序列相比約百分之70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99的序列一致性的蛋白。縮短的家牛催乳素受體蛋白同系物也不包含足以產(chǎn)生長(zhǎng)毛皮毛SEQ ID NO：11的序列或其片段。

根據(jù)本發(fā)明有用的核酸序列包括例示性核苷酸序列的變體，其中變體編碼與例示性聚核苷酸序列編碼的氨基酸序列相同的氨基酸序列。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，多個(gè)核酸序列編碼任一給定的蛋白質(zhì)。比如，密碼子GCA,GCC,GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，在由密碼子指定的丙氨酸的每個(gè)位置，密碼子可以改變?yōu)樗龅娜魏蜗鄳?yīng)的密碼子而不改變所編碼的多肽。這樣的核苷酸變化稱為沉默突變。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到核酸中的每個(gè)密碼子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子)可以被改變，但仍然能編碼相同的氨基酸序列。所述具有沉默突變體的變體序列在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍內(nèi)，其編碼本發(fā)明的多肽。

可以使用本領(lǐng)域已知的多種序列比較算法和程序中的任一種來(lái)鑒定核酸序列同系物。所述算法和程序包括，但不限于，TBLASTN,BLASTP,FASTA,TFASTA,和CLUSTALW(Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8):2444-2448；Altschu等,1990,J.Mol.Biol.215(3):403-410；Thompson等,1994,Nucleic Acids Res.22(2):4673-4680；Higgins等,1996,Methods Enzymol.266:383-402；Altschul等,1990,J.Mol.Biol.215(3):403-410；Altschul等,1993,Nature Genetics 3:266-272)。通常使用由供應(yīng)商提供的默認(rèn)參數(shù)或使用在上述參考文獻(xiàn)中提出的參數(shù)進(jìn)行序列比較，上述文獻(xiàn)以引證的方式全部并入本文。

術(shù)語(yǔ)“約”在本申請(qǐng)中用于描述本發(fā)明的一些定量方面，比如誘導(dǎo)劑的濃度或核苷酸序列之間的百分比一致性。應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的定量方面操作不需要絕對(duì)的準(zhǔn)確度。當(dāng)術(shù)語(yǔ)“約”用于描述本發(fā)明的定量方面時(shí)，相關(guān)方面可以變化±10％。

如本文所用的“互補(bǔ)”聚核苷酸序列通常指在雙鏈核酸分子(DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA)中特定嘌呤和特定嘧啶之間的氫鍵產(chǎn)生的序列。主要特異性配對(duì)是鳥(niǎo)嘌呤配對(duì)胞嘧啶和腺嘌呤配對(duì)胸腺嘧啶或尿嘧啶?！盎パa(bǔ)”聚核苷酸序列也可以稱為“反義”聚核苷酸序列或“反義序列”。在本發(fā)明的各個(gè)方面，序列與參考序列“完全互補(bǔ)”指在其堿基配對(duì)中不含錯(cuò)配的序列。

如本文所使用的，“載體”是指用于將核苷酸構(gòu)建體，如DNA構(gòu)建體，導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的DNA分子，如質(zhì)粒、粘粒或細(xì)菌噬菌體。克隆載體通常含有一個(gè)或少數(shù)的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)，在這些位點(diǎn)外源DNA序列可以確定的方式插入，而不喪失載體的基本生物學(xué)功能，以及適用于用克隆載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的鑒定和選擇的標(biāo)記基因。標(biāo)記基因通常包括提供抗生素抗性的基因?？捎糜趯?shí)踐本發(fā)明的選擇抗生素的非限制性實(shí)施例包括遺傳霉素(Geniticin，G-418)、霉酚酸和吉?dú)W霉素。適用于本發(fā)明的抗生素的其他實(shí)施例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

本發(fā)明還提供了用于與靶序列或從靶序列產(chǎn)生的擴(kuò)增子雜交的檢測(cè)探針(如，家牛催乳素受體聚核苷酸的片段)。所述檢測(cè)探針包含家牛催乳素受體聚核苷酸(如，表1中描述的聚核苷酸，SEQ ID NO：3，4，和5)中的至少8，9，10，11，12，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100或更多核苷酸的連續(xù)的/連貫的范圍。

標(biāo)記的探針或用放射性化合物標(biāo)記的或其他類型標(biāo)記物，如1)放射性標(biāo)記、2)酶標(biāo)記、3)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、4)熒光標(biāo)記、或5)磁性標(biāo)記，標(biāo)記的引物?？蛇x地，非標(biāo)記的核苷酸序列可以直接用作探針或引物；然而序列通常用放射性元素(³²P,³⁵S,³H,¹²⁵I)標(biāo)記或用如生物素、乙酰氨基芴、地高辛、5-溴-脫氧尿苷或熒光素的分子標(biāo)記，以提供可用于許多應(yīng)用的探針。

本文公開(kāi)的家牛催乳素受體聚核苷酸可用于在細(xì)胞或動(dòng)物(如，牛和其他?？苿?dòng)物)中表達(dá)縮短的家牛催乳素受體蛋白。這可以通過(guò)用包含家牛催乳素受體聚核苷酸的DNA構(gòu)建體(轉(zhuǎn)基因的基因構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化目標(biāo)細(xì)胞，并產(chǎn)生表達(dá)縮短的家牛催乳素受體蛋白的轉(zhuǎn)化細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。

在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含編碼縮短的催乳素受體蛋白的縮短的家牛催乳素受體聚核苷酸的轉(zhuǎn)染載體、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及分離的縮短的家牛催乳素受體蛋白，以及包含所述分離的縮短的家牛催乳素受體蛋白的融合的多肽。

本文公開(kāi)的各種方法包括將核苷酸(DNA)構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)入”在本文中用于指以構(gòu)建體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的方式向細(xì)胞提供核苷酸構(gòu)建體。這些方法不依賴于用于將核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入到細(xì)胞的特定方法，只是核苷酸構(gòu)建體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于將核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞的方法包括，但不限于，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法和病毒-介導(dǎo)的方法。

本發(fā)明還提供了使用縮短的催乳素受體聚核苷酸來(lái)遺傳性修飾不天然表現(xiàn)出光滑表型的動(dòng)物以產(chǎn)生呈現(xiàn)光滑表型的動(dòng)物的方法。為了使任一品種增加光滑表型，任何可以導(dǎo)致縮短的催乳素受體蛋白表達(dá)的突變都可以使用。

因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有短毛表型的非人類哺乳動(dòng)物的方法，其中哺乳動(dòng)物表達(dá)縮短的催乳素受體蛋白，其包含SEQ ID NO：7所示序列的至少1-390氨基酸，并且不包含SEQ ID NO：7所示序列的所有氨基酸391-581。本發(fā)明的方法包括：

a)獲得能夠發(fā)育成非人哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，和

b)將編碼縮短的催乳素受體蛋白的聚核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞或控制細(xì)胞的基因組DNA，使得基因組DNA包括編碼縮短的催乳素受體蛋白的聚核苷酸，和

c)從所述細(xì)胞繁殖非人類哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

編碼縮短的催乳素受體蛋白的聚核苷酸可能包括SEQ ID NO：3的序列或與SEQ ID NO：3序列具有至少90％序列一致性的同系物，并且聚核苷酸不包含SEQ ID NO：6的全部核苷酸序列或在SEQ ID NO：3聚核苷酸的蛋白閱讀框中不包含SEQ ID NO：6的全部核苷酸序列?？捎糜诒景l(fā)明方法的聚核苷酸的實(shí)例是包含SEQ ID NO：3，4，5或13的序列的聚核苷酸。為非人類哺乳動(dòng)物提供短毛的縮短的催乳素受體蛋白的一個(gè)實(shí)例是具有SEQ ID NO：8序列的蛋白。

在一個(gè)實(shí)施方式中，能夠發(fā)育成非人類哺乳動(dòng)物的細(xì)胞是全能細(xì)胞。全能細(xì)胞具有發(fā)育成完整的生物體或分化成其任一種細(xì)胞或組織的能力。可用于本發(fā)明的方法的全能細(xì)胞的非限制性實(shí)例是干細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、受精卵和合子?？捎糜诒景l(fā)明的全能細(xì)胞的其它實(shí)例對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)來(lái)說(shuō)是已知的，并且這樣的實(shí)施例在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

在某些實(shí)施方式中，非人類哺乳動(dòng)物是?？苿?dòng)物、牛、豬、馬、山羊、貓、小鼠、綿羊、大鼠、狗、猿、黑猩猩或猩猩。根據(jù)本發(fā)明使用的催乳素受體蛋白的非限制性實(shí)例的UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為Q28172，Q08501，P14787，O46561，P05710，Q58DZ7，Q6JTA8，C7T4Z0，Q3HNA7，D0VFV2，C7T4V8，C7T4W1，C7T4W4，C7T4X8，Q2PBP0，B3GDH0，C7T4X9，E7BKJ5，G3UVW6，Q58DZ7，E7CHC7，E5KXH8，D3ZV73，D0VFV3，F(xiàn)2XX66，I7FI71，E9MW50，Q28172，F(xiàn)1N4H8，Q2PBN9，C7F8W7，G1DE70，S5TFK4，Q28235，O46561，Q08501，Q99JZ1，U6CXL9，P05710，F(xiàn)1M137，P14787，F(xiàn)7HIV1，Q865V4，Q6JTA8，D9IWB8，Q9XS92，和K7GKV2。

基因工程動(dòng)物可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的用于產(chǎn)生基因工程動(dòng)物，尤其是哺乳動(dòng)物的方法產(chǎn)生。這種技術(shù)的非限制性實(shí)例包括產(chǎn)生表達(dá)縮短的家牛催乳素受體蛋白的轉(zhuǎn)基因牛，用縮短的蛋白替換牛類中的野生型蛋白的同源重組，在牛類基因組中導(dǎo)致縮短的蛋白產(chǎn)生的堿基對(duì)缺失，或任何其他基因組編輯的方法。其他實(shí)例包括涉及重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、原核注射、精子介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移、生殖細(xì)胞移植和細(xì)胞核移植克隆的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)基因改造的哺乳動(dòng)物的其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且這些方法在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“基因工程?！卑ㄞD(zhuǎn)基因牛和在催乳素受體基因的一個(gè)或兩個(gè)拷貝中攜帶突變的牛，其中突變導(dǎo)致縮短的催乳素受體蛋白的表達(dá)。

轉(zhuǎn)基因牛是指通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)拷貝的縮短的催乳素受體多核苷酸整合到牛基因組中表達(dá)縮短的催乳素受體蛋白的牛。在催乳素受體基因的一個(gè)拷貝中攜帶突變或縮短的牛被稱為純合子牛，其中突變或縮短導(dǎo)致縮短的催乳素受體蛋白的表達(dá)；而在催乳素受體基因的兩個(gè)拷貝中都攜帶突變或縮短的牛被稱為雜合子牛，其中突變導(dǎo)致縮短的催乳素受體蛋白的表達(dá)。

表達(dá)縮短的催乳素受體蛋白的轉(zhuǎn)基因的純合子?；螂s合子牛可以表現(xiàn)出光滑的表型。

在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄激活因子類效應(yīng)物核酸酶-介導(dǎo)的(TALEN-介導(dǎo)的)同源重組用于產(chǎn)生表現(xiàn)出光滑表型的純合子?；螂s合子牛。產(chǎn)生TALEN-介導(dǎo)的基因工程生物體的實(shí)例由Zu等(2013),TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish,Nature Methods,10:329–331；Katsuyama等(2013),An efficient strategy for TALEN-mediated genome engineering in Drosophila,Nucleic Acids Research,Vol.41,No.17,e163；和Liu等(2014),TALEN-Mediated Gene Mutagenesis in Rhesus and Cynomolgus Monkeys,Cell Stem Cell,Vol.14,Issue 3,pp.323–328提供。

成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)和CRISPR相關(guān)基因(CAS)系統(tǒng)(CRISPR/CAS系統(tǒng))也可以用于產(chǎn)生表現(xiàn)出光滑表型的純合子?；螂s合子牛。使用CRISPR/CAS系統(tǒng)產(chǎn)生基因工程的生物體，特別是哺乳動(dòng)物的實(shí)例由Cong等(2013),Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems,Science,Vol.339no.6121pp.819-823和美國(guó)專利8,795,965提供。

產(chǎn)生純合子?？苿?dòng)物或雜合子?？苿?dòng)物和其他動(dòng)物的其他技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且這樣的實(shí)施方式在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢詫⑥D(zhuǎn)基因基因構(gòu)建體導(dǎo)入牛的生殖細(xì)胞中以制備轉(zhuǎn)基因牛。例如，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將一個(gè)或幾個(gè)拷貝的構(gòu)建體整合到哺乳動(dòng)物胚胎的基因組中。

轉(zhuǎn)基因?？梢酝ㄟ^(guò)將編碼縮短的家牛催乳素受體蛋白的轉(zhuǎn)基因?qū)肱５纳臣?xì)胞中來(lái)產(chǎn)生。在各種發(fā)育階段的胚胎靶細(xì)胞可以用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因。根據(jù)胚胎靶細(xì)胞的發(fā)育階段使用不同的方法。選擇所使用的任何動(dòng)物的特定細(xì)胞系以具有大致良好的健康，良好的胚胎產(chǎn)量，胚胎中良好的原核可見(jiàn)度和良好的繁殖適應(yīng)性。

可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法，例如顯微注射，電穿孔或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)基因?qū)肱咛?。例如但不限于，縮短的催乳素受體蛋白轉(zhuǎn)基因可以通過(guò)將構(gòu)建體顯微注射到受精牛卵的原核中而導(dǎo)入動(dòng)物中，使得一個(gè)或多個(gè)拷貝的構(gòu)建體保留在發(fā)育中的牛的細(xì)胞中。在將轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體導(dǎo)入受精卵中之后，可以將卵在體外培養(yǎng)不同的時(shí)間，或重新植入代孕宿主，或兩者。包括體外培養(yǎng)至成熟。常見(jiàn)的方法是在體外培養(yǎng)胚胎約1-7天，并將其重新植入代孕宿主。

可以通過(guò)設(shè)計(jì)用于鑒定縮短的催乳素受體聚核苷酸的存在的各種方法測(cè)試轉(zhuǎn)基因操作的胚胎的后代中構(gòu)建體的存在。如果外源克隆構(gòu)建體的一個(gè)或多個(gè)拷貝保持穩(wěn)定整合到所述轉(zhuǎn)基因胚胎的基因組中，則可以建立攜帶轉(zhuǎn)基因添加構(gòu)建體的永久轉(zhuǎn)基因系。

可以在轉(zhuǎn)基因改變的動(dòng)物的后代出生后測(cè)定構(gòu)建體是否整合到了后代的基因組中。優(yōu)選地，該測(cè)定通過(guò)將對(duì)應(yīng)于編碼期望的縮短的催乳素受體蛋白的DNA序列的探針雜交到來(lái)自子代的染色體材料上來(lái)實(shí)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)在后代基因組中含有構(gòu)建體的至少一個(gè)拷貝的那些后代生長(zhǎng)至成熟。

本文使用的術(shù)語(yǔ)合子是指能夠發(fā)育成完整生物體的二倍體細(xì)胞。通常，合子由含有通過(guò)來(lái)自一個(gè)或多個(gè)配子的兩個(gè)單倍體核的天然或人工融合形成的細(xì)胞核的卵組成。因此，配子核必須是天然相容的，即導(dǎo)致活的合子，能夠經(jīng)歷分化并發(fā)育成功能生物體。通常，優(yōu)選整倍體合子。如果獲得非整倍體合子，則相對(duì)于產(chǎn)生配子的生物體的整倍體數(shù)目，染色體的數(shù)目改變不應(yīng)多于一個(gè)。

添加到合子中的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的拷貝數(shù)取決于添加的外源遺傳物質(zhì)的總量，并且是能夠發(fā)生基因轉(zhuǎn)化的量。理論上只需要一個(gè)拷貝；然而，通常使用許多拷貝，例如，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的1,000到20,000個(gè)拷貝以確保一個(gè)拷貝是功能性的。通常具有每個(gè)插入的外源DNA序列的多于一個(gè)的功能拷貝以增強(qiáng)外源DNA序列的表型表達(dá)是有優(yōu)勢(shì)的。

可以使用允許將外源遺傳物質(zhì)添加到核酸遺傳物質(zhì)中的任何技術(shù)，只要其不破壞細(xì)胞、核膜或其他存在的細(xì)胞結(jié)構(gòu)或遺傳結(jié)構(gòu)即可。外源遺傳物質(zhì)優(yōu)選通過(guò)顯微注射插入核酸遺傳物質(zhì)中。細(xì)胞和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的顯微注射是本領(lǐng)域已知和使用的。

再植入通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)方法完成。通常，將代孕宿主麻醉，并將胚胎插入輸卵管中。

可以通過(guò)任何合適的方法篩選代孕宿主的轉(zhuǎn)基因后代的轉(zhuǎn)基因的存在和/或表達(dá)。篩選可以通過(guò)Southern雜交或Northern雜交分析，使用與至少一部分轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)的探針完成。通常，從組織制備DNA并通過(guò)Southern雜交或PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因進(jìn)行分析?？蛇x地，測(cè)試被認(rèn)為在最高水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因的組織或細(xì)胞中縮短的家牛催乳素受體蛋白的存在和/或表達(dá)，盡管任何組織或細(xì)胞類型都可用于所述分析。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的子代可以通過(guò)將轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與合適的配偶交配或通過(guò)從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獲得的卵和/或精子的體外受精來(lái)獲得。當(dāng)進(jìn)行與配偶的交配時(shí)，配偶可以是或不是轉(zhuǎn)基因的和/或基因敲除的。當(dāng)配偶是轉(zhuǎn)基因時(shí)，其可以含有相同或不同的轉(zhuǎn)基因，或兩者都有?？蛇x地，配偶可以是親本系的。當(dāng)使用體外受精時(shí)，受精胚可以植入代孕宿主或在體外培養(yǎng)，或兩者。使用這些方法，可以使用合適的方法評(píng)估后代的轉(zhuǎn)基因的存在。

根據(jù)本說(shuō)明書生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將包括外源遺傳物質(zhì)。如上所述，在某些實(shí)施方式中，外源遺傳物質(zhì)將是導(dǎo)致縮短的催乳素受體蛋白產(chǎn)生的DNA序列。此外，在這樣的實(shí)施方式中，序列將連接到轉(zhuǎn)錄控制元件，例如啟動(dòng)子，其優(yōu)選允許轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物在特定類型的細(xì)胞中表達(dá)，其產(chǎn)生以組織特異性方式表達(dá)縮短的催乳素受體蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

胚細(xì)胞提供了用于將轉(zhuǎn)基因?qū)肱?和其他動(dòng)物)的第二種類型的靶細(xì)胞。當(dāng)發(fā)育的轉(zhuǎn)基因牛，牛胚胎，體外培養(yǎng)到囊胚階段，它可以靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。卵裂球的有效感染通過(guò)酶處理以除去透明帶獲得(Manipulating the Mouse Embryo，Hogan eds.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1986)。用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因的病毒載體系統(tǒng)通常是攜帶轉(zhuǎn)基因的復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒。通過(guò)在病毒生產(chǎn)細(xì)胞的單層上培養(yǎng)卵裂球容易且有效地獲得轉(zhuǎn)染。

可選地，感染可以在稍后階段進(jìn)行。病毒或病毒產(chǎn)生細(xì)胞可以注射到卵裂球中。大多數(shù)所發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因都是嵌合體，因?yàn)檎蟽H發(fā)生在形成轉(zhuǎn)基因牛的細(xì)胞的子集中。此外，所發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因可以在基因組中的不同位置包含轉(zhuǎn)基因的各種逆轉(zhuǎn)錄病毒插入，所述轉(zhuǎn)基因通常在后代中分離。此外，還可能通過(guò)妊娠中期胚胎的子宮內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染將轉(zhuǎn)基因?qū)肷臣?xì)胞系。

用于轉(zhuǎn)基因?qū)氲牡谌N類型的靶細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞(ES)。胚胎干細(xì)胞來(lái)自體外培養(yǎng)并與胚胎融合的預(yù)植入胚胎。可以通過(guò)DNA轉(zhuǎn)染或通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)將轉(zhuǎn)基因有效地導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞。這樣轉(zhuǎn)化的胚胎干細(xì)胞之后可以與來(lái)自牛的囊胚組合。然后，胚胎干細(xì)胞移植于胚胎中并有助于所得嵌合體動(dòng)物的生殖細(xì)胞系。

還提供了轉(zhuǎn)基因牛科動(dòng)物和其他動(dòng)物，其中轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的特征在于光滑表型。基因的改變可以包括導(dǎo)致縮短的催乳素受體蛋白產(chǎn)生的缺失、突變或縮短；或?qū)胪庠椿?，例如具有縮短的催乳素受體聚核苷酸的基因；或前述的組合。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式提供了鑒定特定動(dòng)物是否攜帶編碼縮短的催乳素受體蛋白的突變體催乳素受體基因的方法。鑒定催乳素受體突變的存在和突變體催乳素受體基因的拷貝數(shù)的測(cè)試還可以改進(jìn)在生產(chǎn)基因工程牛(和其他動(dòng)物)的方法中轉(zhuǎn)移的胚胎的選擇。

可用于鑒定催乳素受體縮短突變體的非限制性分子生物學(xué)技術(shù)的實(shí)例包括：

(A)DNA或RNA的突變特異性PCR。可以從待測(cè)試的動(dòng)物中分離DNA或RNA(轉(zhuǎn)化為cDNA)?？梢栽O(shè)計(jì)突變或正常等位基因的特異性的引物，使得PCR指示突變是否存在。基于本文提供的核苷酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從DNA或RNA設(shè)計(jì)用于突變特異性PCR的合適的引物，并且這些實(shí)施方式在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

(B)限制位點(diǎn)。突變A461VfsX1在基因組DNA-ACATGT中產(chǎn)生了新的回文序列。該回文序列不存在于天然/非突變基因組中。用擴(kuò)增跨越突變位點(diǎn)的基因組DNA區(qū)域的引物產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物可以用對(duì)該序列特異的限制酶(例如限制性內(nèi)切核酸酶PciI)切割。能夠由作用于回文序列TGTACA的內(nèi)切核酸酶切割指示突變的存在。

(C)直接測(cè)序。突變的區(qū)域可以從mRNA(其可以任選地轉(zhuǎn)化為cDNA)或基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。可以對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序以鑒定催乳素受體突變基因的存在。基于本文提供的核苷酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)合適的引物對(duì)DNA或RNA進(jìn)行測(cè)序，并且這些實(shí)施方式在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

(D)可以設(shè)計(jì)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)和異源雙鏈分析測(cè)試以鑒定DNA中的點(diǎn)突變。

(E)使用對(duì)催乳素受體蛋白的羧基末端特異性的抗體的Western雜交。在對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)催乳素受體蛋白的Western雜交上缺失條帶表明存在突變和縮短的催乳素受體蛋白的表達(dá)。

本發(fā)明還提供了可用于檢測(cè)牛中突變體的抗體，所述突變體表達(dá)家牛催乳素受體蛋白。這些抗體針對(duì)位于全長(zhǎng)催乳素受體蛋白的C-末端區(qū)域中的C-末端氨基區(qū)或表位。因此，本發(fā)明提供由SEQ ID NO：11的序列或其片段組成的多肽。這些多肽可用于產(chǎn)生用于檢測(cè)牛中表達(dá)縮短的家牛催乳素受體蛋白的突變體的抗體。

本文提及或引用的所有專利、專利申請(qǐng)、臨時(shí)申請(qǐng)和公開(kāi)申請(qǐng)?jiān)谄渑c本說(shuō)明書的明確教導(dǎo)不矛盾的程度上以其全部?jī)?nèi)容，包括所有附圖和表格通過(guò)引用的方式并入本文。

應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于說(shuō)明目的，并且啟示本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)其進(jìn)行各種修改或改變，并且這些修改或改變包括在本申請(qǐng)和所附權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)。此外，本文所公開(kāi)的任何發(fā)明或其實(shí)施方式的任何元件或限制可以與本文所公開(kāi)的任何和/或所有其他元件或限制(單獨(dú)地或以任何組合)或任何其他發(fā)明或?qū)嵤┓绞浇M合，并且所有這樣的組合在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)而且不限于此。

序列表

<110> Ag遺傳學(xué)股份有限公司

詹姆士?韋斯特

<120> 用于生產(chǎn)短毛的動(dòng)物的材料和方法

<130> MWH.106X

<150> 62/054,169

<151> 2014-09-23

<160> 13

<170> PatentIn 版本3.5

<210> 1

<211> 2389

<212> DNA

<213> 家牛

<400> 1

cgggcaaatg ctgaggatac tttccaagtg aaccctgagt gaacctctaa tatatttatt 60

tcctgtggaa agaggaagga gccaacatga aggaaaatgc agcatctaga gtggttttca 120

ttttgctact ttttctcagt gtcagccttc tgaatggaca gtcacctcct gaaaaaccca 180

agctcgttaa atgtcggtct cctggaaagg aaacattcac ctgctggtgg gagcctgggg 240

cagatggagg acttcctacc aattacacgc tgacttacca caaggaagga gaaacactca 300

tccatgaatg tccagactac aaaaccgggg gccccaactc ctgctacttt agcaagaagc 360

acacctccat atggaagatg tacgtcatca cagtaaacgc catcaaccag atgggaatca 420

gttcctcgga tccactttat gtgcacgtga cttacatagt tgaaccagag cctcctgcaa 480

acctgacttt ggaattaaaa catccagaag atagaaaacc atatctatgg ataaaatggt 540

ctccacccac catgactgat gtaaaatctg gttggttcat tatccagtac gaaattcgat 600

taaaacctga gaaagcaact gattgggaga ctcattttac tctgaagcaa actcagctta 660

agattttcaa cttatatcca ggacaaaaat accttgtgca gattcgctgc aagccagacc 720

atggatactg gagtgagtgg agcccagaga gctccatcca gatacctaat gacttcccag 780

tgaaggacac aagcatgtgg atctttgtgg ccatcctttc tgctgtcatc tgtttgatta 840

tggtctgggc agtggctttg aagggctata gcatggtgac ctgcatcctc ccaccagttc 900

cagggccaaa aataaaagga tttgatgttc atctgctgga gaagggcaag tccgaagaac 960

ttctgcgagc tctggaaagc caagacttcc cccccacttc tgactgcgag gacttgctga 1020

tggagttcat agaggtagat gactgtgagg accagcagct gatgccacgc ccctccaaag 1080

aacacacgga gcaaggcgtg aagcccatgc acctggatct tgacagtgac tctggccggg 1140

gcagctgcga cagcccttcg ctcttgtctg aaaagtgtga tgaacctcag gcccatccct 1200

ccaagttcca tactcccgag ggccctgaga agctggagaa tccggaaaca aaccttacat 1260

gtctccaggc ccctcagagc acaagcgtgg aaggcaaaat cccctatttt ctggccaatg 1320

gacccaaatc ttccacatgg cctttcccgc agccccccag cctatacagc cccagatatt 1380

cttaccacaa cattgctgac gtgtgtgagc tggccctggg catggccggc accacagcca 1440

cttcgctgga ccaaacagac caacatgctt taaaagcctc aaaaaccatt gaaactggca 1500

gggaaggaaa ggcaaccaag cagagggagt cagaaggctg cagttccaag cctgaccaag 1560

acacggtgtg gccacgaccc caagacaaaa cccccttgat ctctgctaaa cccttggaat 1620

acgtggagat ccacaaggtc agccaagatg gagtgctggc tctgttccca aaacaaaacg 1680

agaagtttgg cgcccctgaa gccagcaagg agtactcaaa ggtgtcccgg gtgacagata 1740

gcaacatcct ggtattggtg ccggatccgc aagcgcaaaa cctgactctg ttagaagaac 1800

cagccaagaa ggccccgcca gccctgccat agaatccagc caaggccgac ctggctatct 1860

cccccacaac cccaggcaac tgcagactcc agttgggctg gggactgggt cccgcaggtt 1920

ttatgcactc ttgcagtgag agttatggaa ggatgggttc aattgtgatt ttccttcagg 1980

gaacactaca gagtacgtga aatgcactct accagagagg gctcaagaac agggttagaa 2040

tgacactacc caactcccag ttcactctta attctctatt ttcaaccagt tgcctctttg 2100

tccaacagct gattccagaa caaatcgttc catcttgtgt gatttgtaga tttacttttt 2160

tgctattagt tgtcagatta tatgttcaaa gatataaaag cacattgcct agtattctta 2220

agagacagtg ccaataggta tataatctgg aaaaggcctt catggtttcg tatgtgacag 2280

aggggtataa gtcagtcaaa attgtttacc atgggaagat ggtagatagg agagaaatgc 2340

catgaaaacc actttgaaga ccagttgctt aacctttgca ctcctcttt 2389

<210> 2

<211> 1746

<212> DNA

<213> 家牛

<400> 2

atgaaggaaa atgcagcatc tagagtggtt ttcattttgc tactttttct cagtgtcagc 60

cttctgaatg gacagtcacc tcctgaaaaa cccaagctcg ttaaatgtcg gtctcctgga 120

aaggaaacat tcacctgctg gtgggagcct ggggcagatg gaggacttcc taccaattac 180

acgctgactt accacaagga aggagaaaca ctcatccatg aatgtccaga ctacaaaacc 240

gggggcccca actcctgcta ctttagcaag aagcacacct ccatatggaa gatgtacgtc 300

atcacagtaa acgccatcaa ccagatggga atcagttcct cggatccact ttatgtgcac 360

gtgacttaca tagttgaacc agagcctcct gcaaacctga ctttggaatt aaaacatcca 420

gaagatagaa aaccatatct atggataaaa tggtctccac ccaccatgac tgatgtaaaa 480

tctggttggt tcattatcca gtacgaaatt cgattaaaac ctgagaaagc aactgattgg 540

gagactcatt ttactctgaa gcaaactcag cttaagattt tcaacttata tccaggacaa 600

aaataccttg tgcagattcg ctgcaagcca gaccatggat actggagtga gtggagccca 660

gagagctcca tccagatacc taatgacttc ccagtgaagg acacaagcat gtggatcttt 720

gtggccatcc tttctgctgt catctgtttg attatggtct gggcagtggc tttgaagggc 780

tatagcatgg tgacctgcat cctcccacca gttccagggc caaaaataaa aggatttgat 840

gttcatctgc tggagaaggg caagtccgaa gaacttctgc gagctctgga aagccaagac 900

ttccccccca cttctgactg cgaggacttg ctgatggagt tcatagaggt agatgactgt 960

gaggaccagc agctgatgcc acgcccctcc aaagaacaca cggagcaagg cgtgaagccc 1020

atgcacctgg atcttgacag tgactctggc cggggcagct gcgacagccc ttcgctcttg 1080

tctgaaaagt gtgatgaacc tcaggcccat ccctccaagt tccatactcc cgagggccct 1140

gagaagctgg agaatccgga aacaaacctt acatgtctcc aggcccctca gagcacaagc 1200

gtggaaggca aaatccccta ttttctggcc aatggaccca aatcttccac atggcctttc 1260

ccgcagcccc ccagcctata cagccccaga tattcttacc acaacattgc tgacgtgtgt 1320

gagctggccc tgggcatggc cggcaccaca gccacttcgc tggaccaaac agaccaacat 1380

gctttaaaag cctcaaaaac cattgaaact ggcagggaag gaaaggcaac caagcagagg 1440

gagtcagaag gctgcagttc caagcctgac caagacacgg tgtggccacg accccaagac 1500

aaaaccccct tgatctctgc taaacccttg gaatacgtgg agatccacaa ggtcagccaa 1560

gatggagtgc tggctctgtt cccaaaacaa aacgagaagt ttggcgcccc tgaagccagc 1620

aaggagtact caaaggtgtc ccgggtgaca gatagcaaca tcctggtatt ggtgccggat 1680

ccgcaagcgc aaaacctgac tctgttagaa gaaccagcca agaaggcccc gccagccctg 1740

ccatag 1746

<210> 3

<211> 1170

<212> DNA

<213> 家牛

<400> 3