本發(fā)明涉及了用于治療和/或診斷與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病的新適體分子、包含這類適體分子的藥物組合物、包含這類適體分子的血液成分分離柱和用于確定用作適體分子的序列的核苷酸序列的方法。

背景技術(shù)：

免疫系統(tǒng)形成每種哺乳動物的必需部分。哺乳動物在防御微生物、檢測及移除異常細(xì)胞例如腫瘤細(xì)胞和在組織再生方面利用其免疫系統(tǒng)。因而，生物依賴于兩種相互聯(lián)系的防御機(jī)制：體液免疫和細(xì)胞免疫。

當(dāng)與其抗原結(jié)合時，抗體是體液免疫應(yīng)答的觸發(fā)者?？贵w可以按多種方式發(fā)揮作用。除中和抗原之外，抗體還激活補(bǔ)體系統(tǒng)。還存在針對身體自身抗原的抗體。作為產(chǎn)生這些所謂自體抗體的原因，觀察到分子模擬和/或旁觀者激活作用。自體抗體與自身抗原的特異性結(jié)合可以活化能夠促進(jìn)這些抗原降解的天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)。

自體免疫疾病基于這類針對身體自身組成部分的抗體的特異性識別和結(jié)合，所述識別和結(jié)合觸發(fā)針對自身細(xì)胞或組織的免疫應(yīng)答。除這種免疫刺激性效應(yīng)之外，自體抗體還可以通過其他機(jī)制促進(jìn)致病表型的形成。

眾所周知，存在這樣的自體抗體，所述自體抗體對G-蛋白偶聯(lián)受體(如：腎上腺素能α-1受體、腎上腺素能β-1受體、腎上腺素能β-2受體、內(nèi)皮素ETA受體、毒蕈堿M受體、血管緊張素II AT1受體、蛋白酶激活的受體(PAR)受體、MAS-受體、5HT4-受體和/或M3-受體)的胞外部分具有特異性并且特異性結(jié)合時可以激活或阻斷這些受體。

G-蛋白偶聯(lián)受體是從胞外間隙轉(zhuǎn)導(dǎo)信息至細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。它們屬于涵蓋超過1000種不同受體并劃分成五個亞組的受體家族。它們代表了許多不同物種中存在的經(jīng)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)原理。

GPCR的常見特性是它們具有三個不同的胞外環(huán)，所述胞外環(huán)具有物質(zhì)可以與之結(jié)合并引起不同胞內(nèi)反應(yīng)的不同表位。體液蛋白質(zhì)腎上腺素(adrenaline)能夠與腎上腺素能β-1受體結(jié)合以增加心肌細(xì)胞搏動的力量和頻率。

針對GPCR的功能性致病的自體抗體往往但并非總是IgG3(糖蛋白免疫球蛋白G，亞類3)亞型并具有與不同的GPCR環(huán)及這些環(huán)內(nèi)部不同位置結(jié)合的能力。這些功能性致病的抗體通過它們與GPCR的相互作用產(chǎn)生病態(tài)細(xì)胞功能并轉(zhuǎn)而產(chǎn)生機(jī)體功能。

因此，存在針對不同受體的許多不同自體抗體。在心肌的情況下，這些抗體例如是針對腎上腺素能β-1受體或毒蕈堿性乙酰膽堿受體的自體抗體。在其他疾病中具有重要作用的其他抗體是針對腎上腺素能α-1受體、腎上腺素能α-2受體、腎上腺素能β-2受體、內(nèi)皮素1ETA受體、毒蕈堿M2受體、血管緊張素II AT1受體、蛋白酶激活的受體(PAR)受體、MAS-受體、5HT4-受體、M3-受體和其他受體的。

從永久性激活或阻斷在疾病形成中發(fā)揮作用的相應(yīng)受體意義上，生物中這類自體抗體的存在可以導(dǎo)致激動作用或拮抗作用。

擴(kuò)張性心肌病(DCM)是這樣的疾病之一，其中高百分?jǐn)?shù)的患者具有與腎上腺素能β-1受體的胞外部分、尤其與腎上腺素能β-1受體的第一或第二環(huán)結(jié)合的這類激活性自體抗體。因此，提出DCM在這些患者中的自身免疫發(fā)病機(jī)制。一旦結(jié)合這些自體抗體，這些受體持續(xù)激活，因為限制GPCR激活的生理反饋機(jī)制受到抑制。

存在被提出與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的其他心血管系統(tǒng)疾病，如，查加斯心肌病(Chagas’cardiomyopathy)、圍產(chǎn)期心肌病、心肌炎、肺動脈高血壓(pulmonary hypertension)和惡性高血壓。針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體還存在于例如青光眼、糖尿病、良性前列腺增生、硬皮病、雷諾氏綜合癥(Raynaud syndrome)和先兆子癇患者中和慢性查加斯病(Chaga’s disease)中以及那些腎同種異體移植排異的患者中。

通常，這些受體的表位區(qū)域由包含約20個氨基酸的肽鏈組成，而疾病特異性表位構(gòu)成這些區(qū)域之一的3至5個氨基酸的序列。然而，對于幾種自體免疫疾病的形成和慢性化，自體抗體與這些表位的不希望的相互作用發(fā)揮重要作用。

在最近研究中，可以證實，通過免疫球蛋白吸附從血液移除這些自體抗體有助于心肌再生(Wallukat G,Reinke P,Dorffel WV,Luther HP,Bestvater K,Felix SB,Baumann G.(1996)Removal of autoantibodies in dilated cardiomyopathy by immunoadsorption.lnt J Cardiol.54:191-195；Müller J,Wallukat G,Dandel M,Bieda H,Brandes K,Spiegelsberger S,Nissen E,Kunze R,Hetzer R(2000)Immunoglobulin adsorption in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy.Circulation.101:385-391.W.V.Dorffel,S.B.Felix,G.Wallukat,S.Brehme,K.Bestvater,T.Hofmann,F.K.Kleber,G.Baumann,P.Reinke(1997)Short-term hemodynamic effects of immunoadsorption in dilated cardiomyopathy.Circulation 95,1994-1997和W.V.Dorffel,G.Wallukat,Y.Dorffel,S.B.Felix,G.Baumann(2004)lmmunoadsorption in idiopathic dilated cardiomyopathy,a 3-year follow-up.lnt J.Cardiol.97,20 529-534)。

已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，某些適體可以用來干擾抗體、尤其對人β-1-腎上腺素能受體第二胞外環(huán)特異的自體抗體與其靶的相互作用(WO 2012/000889 A1)。適體是以對其靶分子的高親和力為特征的短鏈寡核苷酸。通過抑制相互作用，適體能夠在不需要移除這些抗體的情況下削弱或甚至永久消除對β-1-腎上腺素能受體的永久性激活。另外，用于治療和/或診斷與存在針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病的適體已經(jīng)在WO 2012/119938 A2中公開。

根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，這些適體用來削弱或消除相應(yīng)的自體抗體對G-蛋白偶聯(lián)受體的激活。根據(jù)另一個優(yōu)選實施方案，適體用來中和針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體和/或減少該自體抗體對它們針對的G-蛋白偶聯(lián)受體的影響。

然而，目前僅可獲得數(shù)目非常有限的可以針對上述具體自體免疫疾病應(yīng)用的適體并且它們在人類患者中應(yīng)用時的有效性和無害性仍待證實。因此需要額外的適體，所述適體顯示對自體抗體與GPCR的相互作用的增強(qiáng)干擾。

因此，本發(fā)明的目的是提供新適體用于治療和/或診斷與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病。

另外，本發(fā)明的另一個目的是提供包含這類適體分子的藥物組合物以及包含這類適體的血液成分分離柱(apheresis column)。

因此，本發(fā)明的目的還是提供種一種用于確定新適體的核苷酸序列的方法，所述的新適體用于治療和/或診斷與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

這個目的通過如下文闡述的本發(fā)明多個方面解決。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種適體，所述適體包含滿足產(chǎn)生規(guī)則集合P定義的語法的核苷酸序列：

條件為

a.)Q是自然數(shù)集

b.)F是如下定義的自然數(shù)子集

F:＝{X∈Q|(X>1)}

c.)使用F，定義：

d.)U是如下定義的非終結(jié)符集

U＝{S，M，N，D，E，Y，H，R，Z，L，BX，CX，K，V}

對于BX和CX，見c)

e.)W是如下定義的終結(jié)符集

W＝{A，C，G，T，G^X}

G^X指可以根據(jù)b.)和c.)導(dǎo)出的全部終結(jié)符(5)

f.)S∈U是起始符號

所述適體用于治療和/或診斷與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病，其中“A”意指腺嘌呤核苷酸，“C”意指胞嘧啶核苷酸，“G”意指鳥嘌呤核苷酸并且如果核苷酸序列是DNA序列，則“T”意指胸腺嘧啶核苷酸，并且如果核苷酸序列是RNA序列，則“T”意指尿嘧啶核苷酸，其中所述適體不包含核苷酸序列GGTTGGTGTGGTTGG(SEQ ID No:22)、GGTTGGTGTGGT(SEQ ID NO:23)或CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG(SEQ ID No:24)。

在本發(fā)明第一方面的優(yōu)選實施方案中，適體的核苷酸序列具有至多593個核苷酸的長度。

在本發(fā)明第一方面的另一個優(yōu)選實施方案中，核苷酸序列是DNA序列。

在本發(fā)明第一方面的又一個優(yōu)選的實施方案中，核苷酸序列是RNA序列。

在本發(fā)明第一方面的優(yōu)選實施方案中，包含于適體中的核苷酸序列是以下任一個序列：

(5'-GTTGTTTGGGGTGG-3'SEQ ID No:1)、

(5'-GTTGTTTGGGGTGGT-3'SEQ ID No:2)

(5'-GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGG-3'SEQ ID No:3)、

(5'-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG-3'SEQ ID No:4)、

(5'-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:5)、

(5'-TTTGGTGGTGGTGGTTTTGGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:6)、

(5'-TTTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:7)、

(5'-TTTGGTGGTGGTGGTTTGGGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:8)、

(5'-TGGTGGTGGTGGT-3'SEQ ID No:9)、

(5'-GGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:10)、

(5'-GGTGGTTGTGGTGG-3'SEQ ID No:11)、

(5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:12)、

(5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG TGG-3'SEQ ID No:13)、

(5'-GGTGGTTGTGGTGGTTGTGGTGGTTGTGGTGG-3'SEQ ID No:14)、

(5'-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3'SEQ ID No:15)、

(5'-GGTGGTGGTGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3'SEQ ID No:16)、

(5'-TTTGGTGGTGGTGGTGTGGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:17)、

(5'-TGGTGGTGGT-3'SEQ ID No:18)、

(5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'SEQ ID NO:20)，

在本發(fā)明第一方面的優(yōu)選實施方案中，適體的核苷酸序列具有至少4個核苷酸、優(yōu)選地至少8個核苷酸、更優(yōu)選地至少12個核苷酸的長度。

在本發(fā)明第一方面的優(yōu)選實施方案中，適體的核苷酸序列具有至多120個核苷酸、優(yōu)選地至多100個核苷酸、更優(yōu)選地至多80個核苷酸的長度。

在本發(fā)明第一方面的優(yōu)選實施方案中，適體能夠相互作用于自體抗體、優(yōu)選地相互作用于對G-蛋白偶聯(lián)受體特異的自體抗體、優(yōu)選地相互作用于對以下任一種人G-蛋白偶聯(lián)受體特異的自體抗體：腎上腺素能α-1受體、腎上腺素能β-1受體、腎上腺素能β-2受體、內(nèi)皮素1ETA受體、毒蕈堿M受體、血管緊張素II AT1受體、PAR受體、MAS-受體、5HT4-受體和/或M3受體。

在本發(fā)明第一方面的優(yōu)選實施方案中，適體用作患有自體免疫疾病的患者的血液或其成分(constituent)的治療性血液成分分離(apheresis)期間的選擇性組分(selective ingredient)，所述自體免疫疾病與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體的出現(xiàn)相關(guān)。

在本發(fā)明第一方面的優(yōu)選實施方案中，自體免疫疾病是以下之一：心肌病、缺血性心肌病(iCM)、擴(kuò)張型心肌病(DCM)、圍產(chǎn)期心肌病(PPCM)、特發(fā)性心肌病、查加斯心肌病、化療所致心肌病、查加斯巨結(jié)腸癥(Chagas’megacolon)、查加斯巨食道癥(Chagas’megaesophagus)、查加斯神經(jīng)病(Chagas’neuropathy)、良性前列腺增生、硬皮病、雷諾氏綜合癥、外周動脈閉塞性疾病(PAOD)、先兆子癇、腎同種異體移植排異、心肌炎、青光眼、高血壓、肺動脈高血壓、惡性高血壓、代謝綜合征、脫發(fā)、斑禿、偏頭痛、帕金森病、癲癇、叢集性頭痛、多發(fā)性硬化癥、抑郁、區(qū)域疼痛綜合征、不穩(wěn)定型心絞痛、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、精神分裂癥、舍格倫綜合征( syndrome)、牙周炎、心房顫動、白斑病、溶血性尿毒癥綜合征、僵人綜合征和/或先天性心臟傳導(dǎo)阻滯。

在本發(fā)明第一方面的優(yōu)選實施方案中，適體用于體外檢測對G-蛋白偶聯(lián)受體、優(yōu)選地對如下的人G-蛋白偶聯(lián)受體：腎上腺素能α-1受體、腎上腺素能β-1受體、腎上腺素能β-2受體、內(nèi)皮素1ETA受體、毒蕈堿M受體、血管緊張素II AT1受體、PAR受體、MAS-受體、5HT4-受體和/或M3受體特異的抗體。

在本發(fā)明第一方面的另一個優(yōu)選實施方案中，待檢測的抗體是自體抗體。

在本發(fā)明第一方面的又一個優(yōu)選的實施方案中，抗體存在于或來源于體液，優(yōu)選地人體的流體、更優(yōu)選地人血、血漿、血清、尿、糞便、滑液、間質(zhì)液、淋巴液、唾液、脊髓液和/或淚液。

在本發(fā)明第一方面的又一個優(yōu)選的實施方案中，身體流體取自患有或疑似患有自體免疫疾病的個體，優(yōu)選地所述自體免疫疾病為與患者血清中存在對G蛋白偶聯(lián)受體特異的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病，更優(yōu)選地所述自體免疫疾病為與患者血清中存在對腎上腺素能α-1受體、腎上腺素能β-1受體、腎上腺素能β-2受體、內(nèi)皮素1ETA受體、毒蕈堿M受體、血管緊張素II AT1受體、PAR受體、MAS-受體、5HT4-受體和/或M3受體特異的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病。

在本發(fā)明第一方面的又一個優(yōu)選的實施方案中，適體包含以下核苷酸序列(5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’SEQ ID No.12)。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種本發(fā)明的適體和任選地至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。

在本發(fā)明第二方面的優(yōu)選實施方案中，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物用于治療與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的，提供包含根據(jù)本發(fā)明第一方面的適體的血液成分分離柱。

在本發(fā)明第三方面的優(yōu)選實施方案中，提供用于治療和/或診斷自體免疫疾病的血液成分分離柱，其中自體免疫疾病是心肌病、擴(kuò)張型心肌病(DCM)、缺血性心肌病(iCM)、圍產(chǎn)期心肌病(PPCM)、特發(fā)性心肌病、查加斯心肌病、化療所致心肌病、查加斯巨結(jié)腸癥、查加斯巨食道癥、查加斯神經(jīng)病、良性前列腺增生、硬皮病、雷諾氏綜合癥、外周動脈閉塞性疾病(PAOD)、先兆子癇、腎同種異體移植排異、心肌炎、青光眼、高血壓、肺動脈高血壓、惡性高血壓、代謝綜合征、脫發(fā)、斑禿、偏頭痛、帕金森病、癲癇、叢集性頭痛、多發(fā)性硬化癥、抑郁、區(qū)域疼痛綜合征、不穩(wěn)定型心絞痛、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、精神分裂癥、舍格倫綜合征、牙周炎、心房顫動、白斑病、溶血性尿毒癥綜合征、僵人綜合征和/或先天性心臟傳導(dǎo)阻滯。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供一種用于制備適體寡核苷酸的方法，所述方法包括步驟：確定用作適體序列的核苷酸序列，其包括應(yīng)用以下的產(chǎn)生規(guī)則集合P：

條件為

a.)Q是自然數(shù)集

b.)F是如下定義的自然數(shù)子集

F:＝{X∈Q|(X>1)}

c.)使用F，定義：

d.)U是如下定義的非終結(jié)符集

U＝{S，M，N，D，E，Y，H，R，Z，L，BX，CX，K，V}

對于BX和CX，參見c)

e.)W是如下定義的非終結(jié)符集

W＝{A，C，G，T，G^X}

G^X指可以根據(jù)b.)和c.)導(dǎo)出的全部終結(jié)符(5)

f.)S∈U是起始符號

其中“A”意指腺嘌呤核苷酸，“C”意指胞嘧啶核苷酸，“G”意指鳥嘌呤核苷酸并且如果核苷酸序列是DNA序列，則“T”意指胸腺嘧啶核苷酸，并且如果核苷酸序列是RNA序列，則“T”意指尿嘧啶核苷酸，以及生產(chǎn)具有第一步驟中獲得的核苷酸序列的適體寡核苷酸。

附圖說明

圖1顯示通過適體(2μl)中和α1腎上腺素能受體AAB。

圖2顯示通過適體(2μl)中和β1腎上腺素能受體AAB。

圖3顯示適體對AAB作用于PAR1/PAR2受體的影響。

圖4顯示適體(2μl)中和內(nèi)皮素1ETA受體AAB。

圖5顯示通過SEQ ID No.10、SEQ ID No.19和SEQ ID No.20的適體中和β1-腎上腺素能受體AAB的作用。

圖6顯示不同適體(2μl)對心肌細(xì)胞搏動率的作用。

圖7顯示SEQ ID No.12的適體對針對不同G-蛋白偶聯(lián)受體的AAB的作用。

圖8顯示本發(fā)明的100nM、400nM和1000nM不同適體(SEQ ID No.:1、4至9、11至14和16至18)(2μl)中和β1腎上腺素能受體AAB。

圖9顯示使用根據(jù)本發(fā)明給定的語法算得的適體彼此(SEQ ID No.:25至45)及與非本發(fā)明的對照序列(SEQ ID No.:46至50)的相互序列同一性(mutual sequence identities)。

圖10顯示本發(fā)明的100nM不同適體(SEQ ID No.:25至45)(2μl)中和β1腎上腺素能受體AAB。

圖11顯示本發(fā)明的400nM不同適體(SEQ ID No.:31至34、44和45)(2μl)中和β1腎上腺素能受體AAB。

圖12顯示非本發(fā)明的100nM、400nM和1000nM不同對照序列(SEQ ID No.:46至50)(2μl)中和β1腎上腺素能受體AAB。

圖13顯示在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭受抑郁或查加斯心肌病的患者(從左至右)分離的β1腎上腺素能受體AAB的活性。

圖14顯示在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭受青光眼、精神分裂癥、查加斯心肌病、溶血性尿毒癥綜合征(EHEC)或阿爾茨海默病的患者(從左至右)分離的β2腎上腺素能受體AAB的活性。

圖15顯示在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭受脫發(fā)，腎同種異體移植排異或腎病下的高血壓(high blood pressure at kidney disease)的患者(從左至右)分離的AT1AAB的活性。

圖16顯示在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭受肺動脈高血壓、雷諾氏病(Raynaud’s disease)、心絞痛或腎病下的高血壓的患者(從左至右)分離的ETA AAB的活性。

圖17顯示在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭受肺動脈高血壓、化療、多發(fā)性硬化癥、脫發(fā)、斑禿、溶血性尿毒癥綜合征(EHEC)、舍格倫綜合征、阿爾茨海默病、神經(jīng)性皮炎、I型糖尿病或銀屑癬的患者(從左至右)分離的α1AAB的活性。

圖18顯示在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭受雷諾氏病、心絞痛或舍格倫綜合征的患者(從左至右)分離的PAR AAB的活性。

圖19顯示在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭受化療、多發(fā)性硬化癥或I型糖尿病的患者(從左至右)分離的MAS AAB的活性。

圖20顯示在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭受抑郁，精神分裂癥或偏頭痛/帕金森病的患者(從左至右)分離的5HT4AAB的活性。

圖21顯示在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭查加斯心肌病、斑禿、偏頭痛/帕金森病或舍格倫綜合征的患者(從左至右)分離的M2AAB的活性。

具體實施方式

發(fā)明詳述

發(fā)明人認(rèn)識到，能夠與對G-蛋白偶聯(lián)受體特異的自體抗體相互作用并且干擾這兩種分子之間致病型相互作用的寡核苷酸共有確定的分子樣式。從這個認(rèn)識出發(fā)，發(fā)明人成功地設(shè)想了由根據(jù)權(quán)利要求1的產(chǎn)生規(guī)則集合P定義的語法，復(fù)現(xiàn)了作為GPCR-自體抗體的有效結(jié)合物的適體的結(jié)構(gòu)樣式。

此前，本領(lǐng)域僅已知數(shù)目非常有限的似乎干擾自體抗體與G-蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合的適體。嘗試鑒定適于治療和/或診斷與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病的新適體是非常繁瑣的并且沒有前景最終確定合適的核苷酸序列，就適體以藥物方式應(yīng)用于人類患者的診斷或治療的嚴(yán)格要求而言尤其如此。為此目的，迫切需要提供用于對抗這些自體免疫疾病的額外適體。

發(fā)明人現(xiàn)在首次鑒定了有效對抗與G-蛋白偶聯(lián)受體自體抗體相關(guān)的疾病的適體的結(jié)構(gòu)共性，并且能夠確定產(chǎn)生規(guī)則集合以確定如適體那樣有功能并且有效的核苷酸序列集。因此，現(xiàn)在首次可以提供數(shù)目增加的干擾GPCR-自體抗體的適體。

鑒定共享相同或幾乎高度相同特性的序列的常見方案是過濾與具有這類特性的給定序列顯示例如至少80％或90％序列同一性的全部那些序列。這種方案背后的構(gòu)思是高度相似的序列應(yīng)當(dāng)共有高度相似的特性。

已經(jīng)使用并應(yīng)用在序列相似性和功能特性保留性之間的這種關(guān)系多年，例如在基于建模的知識背景下。然而，已知存在共有低相互序列同一性但是仍具有高度相似特性的核苷酸或氨基酸序列。為了識別并描述盡管序列相似性低但保留功能的那些序列，需要更復(fù)雜的方法。

本文展示的發(fā)明人認(rèn)識是，開發(fā)并利用在不考慮序列同一性的情況下特異性識別并且確定有效和有功能序列的語法。使用這種語法，可以僅算得具有所追求的特定序列特性的序列。相同的語法也可以用來在任意序列匯集物中特異性識別具有所需特性的序列。

語法的準(zhǔn)確性通常由以下事實反映：僅一個錯誤字符或在錯誤位置的字符就可能導(dǎo)致不能由語法識別的序列。這對本發(fā)明及其應(yīng)用具有高度意義。在要求保護(hù)的適體序列和序列的關(guān)鍵位置處的一個錯誤核苷酸會無法由語法識別。

使用這種方法，本發(fā)明允許特異性排除依據(jù)語法不符合序列標(biāo)準(zhǔn)并且因此將導(dǎo)致不能結(jié)合GPCR自體抗體的全部序列。在另一方面，這種方法允許算得和/或過濾符合設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的全部序列，無論復(fù)雜性或與給定模板的序列同一性如何。

為了顯示已算得序列的功能特性不是序列同一性或相似性的函數(shù)，而是語法的函數(shù)(相互序列同一性低的功能性序列具有相等或高度相似的特性)，應(yīng)用給定語法的規(guī)則，同時考慮邊界條件以算得顯示低相互序列同一性的幾個序列。然而，本文中將展示，如此依據(jù)語法產(chǎn)生的全部序列均具有要求保護(hù)的與GPCR自體抗體結(jié)合的特性。

圖9顯示根據(jù)本發(fā)明算得的適體的ID(SEQ ID No.:25至45)及其相互序列同一性。已經(jīng)通過使用Kalign軟件連同設(shè)定至最大的開放罰分(open penalty)和延長罰分(extension penalty)，確定序列同一性。這種軟件已經(jīng)在Lassmann和Sonnhammer,Kalign--an accurate and fast multiple sequence alignment algorithm.(2005)BMC bioinformatics 6:298；Lassmann等人,Kalign2:high-performance multiple alignment of protein and nucleotide sequences allowing external features.(2009Feb)Nucleic acids research 37(3):858-65；Goujon等人,A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI.(2010Jul)Nucleic acids research 38(網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器發(fā)布):W695-9；McWilliam等人,Analysis Tool Web Services from the EMBL-EBI.(2013Jul)Nucleic acids research 41(網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器發(fā)布):W597-600以及Li等人,The EMBL-EBI bioinformatics web and programmatic tools framework.(2015Jul 01)Nucleic acids research 43(W1):W580-4中描述。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，兩個核苷酸序列之間的同一性在可以如上所述確定。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，兩個核苷酸序列之間的同一性在可以根據(jù)上文援引的一個或多個文件確定。

已經(jīng)算得類型廣泛的要求保護(hù)的本發(fā)明不同序列，基本上涵蓋理論上可能的序列同一性的完整范圍。可以從圖9見到，功能性適體序列之間的相互序列同一性范圍從90％(在SEQ ID No.:38和42或40和41之間)至11％(在SEQ ID No.:28和29之間)。

對序列SEQ ID No:12、3、10和15使用如下文顯示的移位-歸約解析器(Shift-Reduce-Parser)，全部序列可以通過給定語法規(guī)則算得和/或識別。

已經(jīng)使用不根據(jù)本發(fā)明的隨機(jī)化寡核苷酸作為對照序列(SEQ ID No.:46至50)。這些序列不由給定語法識別。對照與本發(fā)明功能性適體顯示在10％(在SEQ ID No.:30和47之間)至60％(在SEQ ID No.:39和48之間)范圍內(nèi)的序列同一性。

值得注意地，本發(fā)明適體SEQ ID No:28與對照序列SEQ ID No:48具有44％的序列同一性，如下文將顯示，所述對照序列是無功能的(參見實施例11和圖12)。與之相反，本發(fā)明適體SEQ ID No:29與SEQ ID No:28顯示出僅11％的很低序列同一性，而兩個序列均有活性，如下文將顯示(參見實施例9和實施例10和圖10和圖11)。顯示本發(fā)明序列之間序列同一性很低和與無功能序列的同一性相比而言更高(即4倍更高)的這個實例清楚地顯示，序列的活性是由語法代表的序列共性的函數(shù)，而不是序列同一性的函數(shù)。

這些結(jié)果顯示了給定語法編碼的序列特性和借助該語法產(chǎn)生或識別的序列抑制自體抗體的能力之間的清晰關(guān)系。這種關(guān)系并不基于序列同一性，而基于語法本身，這通過算得相互序列同一性很低的有效序列展示。以相同方式，本發(fā)明適體的測量活性與對照序列的結(jié)果的比較證實了關(guān)于本文要求保護(hù)的全部適體序列之功能的結(jié)果。

本發(fā)明的適體以滿足下述語法為特征，所述語法由如通過權(quán)利要求1進(jìn)一步限定的產(chǎn)生規(guī)則集合定義。所述語法反映了有效對抗與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病的適體的結(jié)構(gòu)性要求。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，適體包含滿足下述語法的核苷酸序列，所述語法表征無語境語言(喬姆斯基層次(Chomsky hierarchy)中的2型語法)或語境敏感語言(喬姆斯基層次中的1型語法)或由短語結(jié)構(gòu)語法(喬姆斯基層次中的0型語法)描述的語言(遞歸可枚舉)。在一個更優(yōu)選的實施方案中，適體包含包含滿足下述語法的核苷酸序列，所述語法表征無語境語言(喬姆斯基層次中的2型語法)。

出于的目的本發(fā)明，術(shù)語“適體”指特異性并以高親和力結(jié)合于靶分子的寡核苷酸。在限定的條件下，適體可以折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的適體包含核酸分子的序列、核苷酸或由其組成。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的適體由滿足本發(fā)明語法的核苷酸序列組成或由本文另行限定的核苷酸序列組成。

本發(fā)明的適體優(yōu)選地包含未修飾和/或修飾的D-和/或L-核苷酸。根據(jù)常見的核酸單字母代碼，堿基“C”代表胞嘧啶，“A”代表腺嘌呤，”G”代表鳥嘌呤，并且如果核苷酸序列是DNA序列，則“T”代表胸腺嘧啶，以及如果核苷酸序列是RNA序列，“T”代表尿嘧啶核苷酸。如果下文不相反指示，術(shù)語“核苷酸”應(yīng)當(dāng)指核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸。

本發(fā)明的適體可以包含DNA核苷酸序列或nRNA-核苷酸序列或由其組成并且因此，可以分別稱作DNA-適體或RNA-適體。可以理解，如果本發(fā)明的適體在本發(fā)明各處具體說明的序列基序內(nèi)部包含RNA-核苷酸序列，則“T”代表尿嘧啶。

為了本發(fā)明各處的簡潔性，主要提到明確的DNA-核苷酸序列。然而，可以理解，相應(yīng)的RNA-核苷酸序列也包含于本發(fā)明包含。

根據(jù)一個實施方案，優(yōu)選使用DNA-適體。DNA-適體通常比RNA-適體在血漿中更穩(wěn)定。然而，根據(jù)備選實施方案，RNA-適體是優(yōu)選的。

本發(fā)明的適體可以包含含有2'-修飾的核苷酸(例如2'-氟-、2'-甲氧基-、2'-甲氧乙基-和/或2'-氨基修飾的核苷酸)的核苷酸序列。本發(fā)明的適體還可以包含脫氧核糖核苷酸、修飾的脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或修飾的核糖核苷酸的混合。術(shù)語“2'-氟-修飾的核苷酸”、“2'-甲氧基-修飾的核苷酸”、“2'-甲氧乙基-修飾的核苷酸”和/或“2-氨基-修飾的核苷酸"分別指修飾的核糖核苷酸和修飾的脫氧核糖核苷酸。

本發(fā)明的適體可以包含修飾。這類修飾涵蓋例如烷基化(即甲基化)、芳基化或乙?；辽僖粋€核苷酸、納入對映異構(gòu)體和/或適體與一個或多個其他核苷酸或核酸序列融合。這類修飾可以包含例如5'-和/或3’-PEG-或5’-和/或3'-CAP-修飾。備選地或額外地，本發(fā)明的適體可以包含修飾的核苷酸，優(yōu)選地選自鎖核酸、2'-氟-、2'-甲氧基-和/或2'-氨基修飾的核苷酸。

鎖核酸(LNA)代表相應(yīng)RNA核苷酸的類似物，其中構(gòu)象已經(jīng)固定。鎖核酸的寡核苷酸包含一個或多個雙環(huán)核糖核苷，其中2'-OH基團(tuán)借助曱基與C₄-碳原子連接。與相應(yīng)的未修飾RNA-適體對應(yīng)物相比，鎖核酸顯示出對于核酸酶的改善的穩(wěn)定性。雜交特性也改善，這允許適體的親和力和特異性增強(qiáng)。

另一個優(yōu)選的修飾是添加所謂3'-CAP-、5'-CAP-結(jié)構(gòu)和/或修飾的鳥苷-核苷酸(例如7-甲基-鳥苷)至適體的3'-和/或5'-端。這種3'-和/或5'-端修飾具有以下作用：保護(hù)適體免遭核酸酶快速降解。

備選地或額外地，本發(fā)明的適體可以顯示出聚乙二醇化3'或5'-端。3'-或5'-PEG修飾包括添加至少一個聚乙二醇(PEG)單位，優(yōu)選地PEG基團(tuán)包含1至900個亞乙基、更優(yōu)選地1至450個亞乙基。在優(yōu)選的實施方案中，適體包含具有HO-(CH₂CH₂O)_n-H的線性PEG單位，其中n是從1至900的整數(shù)，優(yōu)選地n是1至450的整數(shù)。

本發(fā)明的適體可以包含具有硫代磷酸酯主鏈的核酸序列或由其組成或可以完全或部分地配置為肽核酸(PNA)。還可以如Keefe AD等人,Nat Rev Drug Discov.2010Jul；9(7):537-50或Mayer G,Angew Chem Int Ed Engl.2009；48(15):2672-89或Mayer,G.和Famulok M.,Pharmazie in unserer Zeit 2007；36:432–436中所述那樣修飾本發(fā)明的適體。

另外，適體可以在合適的載體中包囊化以保護(hù)其結(jié)構(gòu)完整性以及促進(jìn)它們在細(xì)胞內(nèi)部遞送。優(yōu)選的載體包括脂質(zhì)體、脂質(zhì)囊泡、微粒子等。

脂質(zhì)囊泡類似于質(zhì)膜，并且可以使它們與細(xì)胞膜融合。大部分脂質(zhì)體和多層囊泡并不輕易融合，主要因為囊泡曲率半徑儲存的能量最小。優(yōu)選的脂質(zhì)囊泡包括單層小囊泡。構(gòu)思用于包囊化本發(fā)明適體的單層小囊泡極有融合性，因為它們具有非常緊湊的曲率半徑。單層小囊泡的平均直徑是5nm至500nm；優(yōu)選地10nm至100nm、更優(yōu)選地20nm至60nm，包括40nm。這種尺寸允許囊泡穿過內(nèi)皮細(xì)胞之間的間隙，因而允許靜脈內(nèi)施用后全身性遞送含有適體的囊泡。有用的囊泡可以在尺寸上大幅度變動并且根據(jù)適體的特定應(yīng)用而選擇。

單層小囊泡可以使用本領(lǐng)域可獲得的程序(如例如WO 2005/037323 A2中公開)在體外輕易地制備。從中形成囊泡的組合物含有作為穩(wěn)定囊泡前體的磷脂、優(yōu)選地連同另一種極性脂質(zhì)，和任選地連同一種或多種額外的極性脂質(zhì)和/或筏前體。作為穩(wěn)定囊泡前體的優(yōu)選磷脂包括1-棕櫚酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酰膽堿和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰膽堿。優(yōu)選的極性脂質(zhì)包括：1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油酰-3-磷酸酯、1,2-二油酰-sn-甘油酰-3-乙基磷酰膽堿、1,2-二油酰-sn-甘油酰-3-磷脂酰乙醇胺、1,2-二油酰-sn-甘油酰-3-[磷酰-l-絲氨酸](常見的鞘磷脂)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油和1-棕櫚酰-2-羥基-sn-甘油-3-磷酰膽堿。

其他優(yōu)選的極性脂質(zhì)包括磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、混合鏈磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇和含有二十碳六烯酸的磷脂。優(yōu)選的筏前體的一個例子是膽固醇。

通過上文提到的方式之一修飾本發(fā)明適體的一個優(yōu)點(diǎn)是，適體可以對抗多種不利影響(例如在其中使用適體的環(huán)境中存在的核酸酶)而被穩(wěn)定化。所述修飾也適于適應(yīng)適體的藥理學(xué)特性。修飾優(yōu)選地不改變適體的親和力或特異性。

本發(fā)明的適體也可以與載體分子和/或報道分子綴合。載體分子包括這類分子，與適體綴合時，所述分子延長綴合的適體在人血漿中的血漿半壽期，例如通過增強(qiáng)穩(wěn)定性和/或通過影響排泄率。合適載體分子的一個例子是PEG。

報道分子包括允許檢測綴合的適體的分子。這類報道分子的例子是GFP、生物素、膽固醇、染料例如熒光染料、電化學(xué)活性的報道分子和/或包含放射性殘余物、尤其適于PET(正電子發(fā)射斷層攝影術(shù))檢測的放射性核素例如¹⁸F、¹¹C、¹³N、¹⁵O、⁸²Rb或⁶⁸Ga的化合物。技術(shù)人員非常清楚合適的載體和報道分子以及如何將其與本發(fā)明適體綴合的方式。

在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明適體的核苷酸序列具有至少4個核苷酸、更優(yōu)選地至少8個核苷酸、甚至更優(yōu)選地至少12個核苷酸和甚至更優(yōu)選地至少16個核苷酸的長度。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明適體的核苷酸序列具有至多120個核苷酸、更優(yōu)選地至多100個核苷酸、甚至更優(yōu)選地至多80個核苷酸和甚至更優(yōu)選地至多60個核苷酸的長度。根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明適體的核苷酸序列具有至多40個核苷酸、尤其至多20個核苷酸的長度。

根據(jù)本發(fā)明的，適體不由以下任何核苷酸序列組成或不包含以下任何核苷酸序列GGTTGGTGTGGTTGG(SEQ ID No:22)、GGTTGGTGTGGT(SEQ ID NO:23)或CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG(SEQ ID No:24)。這個前提應(yīng)當(dāng)適用于如本文所述或定義的本發(fā)明適體或適體基團(tuán)的任何定義。

根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的適體不由核苷酸序列SEQ ID NO:22、23或24中任一者或與核苷酸序列SEQ ID NO:22、23或24中任一者大于90％相同的任何序列組成或不包含前述序列。根據(jù)另一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的適體不由核苷酸序列SEQ ID NO:22、23或24中任一者或與核苷酸序列SEQ ID NO:22、23或24中任一者大于85％相同的任何序列組成或不包含前述序列。根據(jù)一個具體實施方案，本發(fā)明的適體不由核苷酸序列SEQ ID NO:22、23或24中任一者或與核苷酸序列SEQ ID NO:22、23或24中任一者至少80％相同的任何序列組成或不包含前述序列。

根據(jù)另一個本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，適體序列形成本發(fā)明的部分，所述的部分由與本文公開的單個適體序列至少85％相同、更優(yōu)選至少90％相同，甚至更優(yōu)選至少95％相同的核酸序列組成或包含這種核酸序列。

根據(jù)本發(fā)明通過使用Karlin和Altschul的數(shù)學(xué)算法完成兩個序列之間同一性百分?jǐn)?shù)的確定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1993)90:5873-5877)。這種算法是Altschul等人的BLASTN和BLASTP程序(J.Mol.Biol.(1990)215:403-410)的基礎(chǔ)。用BLAST程序執(zhí)行BLAST核苷酸檢索。為了比較目的而獲得帶空位的比對結(jié)果，如Altschul等人中所述那樣(Nucleic Acids Res.(1997)25:3389-3402)使用空位BLAST(Gapped BLAST)。使用BLAST程序和空位BLAST程序時，可以使用相應(yīng)程序的默認(rèn)參數(shù)。

根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，包含于適體中的核苷酸序列是以下任一個序列：(5'-GTTGTTTGGGGTGG-3'SEQ ID No:1)、

(5'-GTTGTTTGGGGTGGT-3'SEQ ID No:2)、

(5'-GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGG-3'SEQ ID No:3)、

(5'-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG-3'SEQ ID No:4)、

(5'-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:5)、

(5'-TTTGGTGGTGGTGGTTTTGGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:6)、

(5'-TTTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:7)、

(5'-TTTGGTGGTGGTGGTTTGGGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:8)、

(5'-TGGTGGTGGTGGT-3'SEQ ID No:9)、(5'-GGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:10)、(5'-GGTGGTTGTGGTGG-3'SEQ ID No:11)、

(5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:12)、

(5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:13)、

(5'-GGTGGTTGTGGTGGTTGTGGTGGTTGTGGTGG-3'SEQ ID No:14)、

(5'-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3'SEQ ID No:15)、

(5'-GGTGGTGGTGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3'SEQ ID No:16)、

(5'-TTTGGTGGTGGTGGTGTGGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:17)、

(5'-TGGTGGTGGT-3'SEQ ID No:18)、

(5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG(SEQ ID NO:20)。根據(jù)另一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的適體具有前述核苷酸序列之一。

根據(jù)更優(yōu)選的實施方案，包含于適體中的核苷酸序列是以下任一個序列：(5'-GTTGTTTGGGGTGGT-3'SEQ ID No:2)、

(5'-GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGG-3'SEQ ID No:3)、

(5'-GGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:10)、

(5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:12)、

(5'-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3'SEQ ID No:15)。根據(jù)另一個更優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的適體具有前述核苷酸序列之一。

根據(jù)特別優(yōu)選的實施方案，適體包含核苷酸序列

(5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’SEQ ID No.12)。根據(jù)另一個特別優(yōu)選的實施方案，適體具有核苷酸序列

(5’-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3’SEQ ID No.12)。

根據(jù)本發(fā)明的一個不同優(yōu)選實施方案，包含于適體中的核苷酸序列是以下任一個序列：(5'-GCGGTGGTGGGATGGGTTGGATCCGC-3'SEQ ID No:25)、(5'-GGGTCGGGATCTAGGGTCAGG-3'SEQ ID No:26)、(5'-

GGTGGGTCGGTAGGGTTT-3'SEQ ID No:27)、(5'-

TTGGCTGGATCGGACGGT-3'SEQ ID No:28)、

(5'-GGTCGGGTTCGGTGGTTA-3'SEQ ID No:29)、

(5'-GGGATCGGTTCGGTAGGTGGGTGGGTTGG-3'SEQ ID No:30)、

(5'-GGCCGGCGCGGCCGG-3'SEQ ID No:31)、

(5'-GGAAGGATCGGAAGG-3'SEQ ID No:32)、(5'-GGTAGGCTCGGTAGG-3'SEQ ID No:33)、(5'-GGATGGTTAGGATGG-3'SEQ ID No:34)、

(5'-CCGTCGGTCCGTTCGGTATTTTTTTCTGGGTGGCTGAGGATCG-3'

SEQ ID No:35)、

(5'-GGGTTGGTCCGTTGGGTATTTTTTTATGGGTTGCCTGGTTGGG-3'

SEQ ID No:36)、

(5'-TCCCATCGGGTAGGGTTATTTGGGTTCTGGGTGGCTGAGGATCGATC-3'SEQ ID No:37)、(5'-TGGCGGTGGT-3'SEQ ID No:38)、

(5'-TGGAGGTGGA-3'SEQ ID No:39)、(5'-AGGTGGTGGA-3'SEQ ID No:40)、(5'-AGGTGGCGGA-3'SEQ ID No:41)、

(5'-GTGGTGGTGGTGTTGGTGGTGGTGGG-3'SEQ ID No:42)、

(5'-TGGGTTGGGTTGTTGTTGTTGGGTTGGGT-3'SEQ ID No:43)、

(5'-GGTGGTGGTGGTGGTTGGTTTTTGGTTGGTGGTGGTGGTGG-3'SEQ ID No:44)、

(5'-CTGGGGTTGGGTTTGGTTTTGTTTTGGTTTGGGTTGGGGTC-3'SEQ ID No:45)。根據(jù)另一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的適體具有前述核苷酸序列之一。

根據(jù)更優(yōu)選的實施方案，包含于適體中的核苷酸序列是以下任一個序列：(5'-GGTGGGTCGGTAGGGTTT-3'SEQ ID No:27)、

(5'-TTGGCTGGATCGGACGGT-3'SEQ ID No:28)、(5'-GGTCGGGTTCGGTGGTTA-3'SEQ ID No:29)、(5'-TGGCGGTGGT-3'SEQ ID No:38)、(5'-TGGAGGTGGA-3'SEQ ID No:39)、(5'-AGGTGGTGGA-3'SEQ ID No:40)、(5'-AGGTGGCGGA-3'SEQ ID No:41)。根據(jù)另一個更優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的適體具有前述核苷酸序列之一。

根據(jù)另一個更優(yōu)選的實施方案，包含于適體中的核苷酸序列是以下任一個序列：5'-GGTGGGTCGGTAGGGTTT-3'SEQ ID No:27)、(5'-GGTCGGGTTCGGTGGTTA-3'SEQ ID No:29)、(5'-TGGCGGTGGT-3'SEQ ID No:38)、(5'-TGGAGGTGGA-3'SEQ ID No:39)、(5'-AGGTGGTGGA-3'SEQ ID No:40)、(5'-AGGTGGCGGA-3'SEQ ID No:41)。根據(jù)另一個更優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的適體具有前述核苷酸序列之一。

根據(jù)另一個更優(yōu)選的實施方案，包含于適體中的核苷酸序列是以下任一個序列：5'-GGTGGGTCGGTAGGGTTT-3'SEQ ID No:27)、(5'-GGTCGGGTTCGGTGGTTA-3'SEQ ID No:29)、(5'-TGGCGGTGGT-3'SEQ ID No:38)、(5'-TGGAGGTGGA-3'SEQ ID No:39)。根據(jù)另一個更優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的適體具有前述核苷酸序列之一。

根據(jù)特別優(yōu)選的實施方案，適體包含核苷酸序列(5'-TGGCGGTGGT-3'SEQ ID No:38)。根據(jù)另一個特別優(yōu)選的實施方案，適體具有核苷酸序列(5’-TGGCGGTGGT-3'SEQ ID No:38)。

本發(fā)明的適體可用于治療和/或診斷與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病。在本發(fā)明的上下文中，認(rèn)為適體可用于人類受試者以及用于動物受試者。根據(jù)一個實施方案，適體用于人受試者中。根據(jù)另一個實施方案，適體用于動物受試者中。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的適體用于治療如本文定義的自體免疫疾病。

與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的疾病是其中可以在受這種疾病侵襲的患者中使用如本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測到這類自體抗體的疾病。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，疾病由針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體引起。根據(jù)一個實施方案，其中可以檢測到針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體、但是其他癥狀不明顯的患者的狀態(tài)可以視為與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病。

因此，本發(fā)明的適體優(yōu)選地用于治療體液中具有針對G-蛋白偶聯(lián)受體的抗體的患者。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，使用本發(fā)明適體待處理或診斷的患者是其中可以檢測到針對G-蛋白偶聯(lián)受體的抗體的患者。

已經(jīng)報告或在文獻(xiàn)中已知幾種疾病與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)。發(fā)明人已經(jīng)就這種相關(guān)性實施進(jìn)一步研究并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，比先前報道更多的疾病與這類自體抗體相關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。

歸因于要求保護(hù)的適體對GPCR自體抗體的親和力，可信的是，與存在這類自體抗體相關(guān)的任何疾病有效地用本文中提出和要求保護(hù)的適體治療。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，自體免疫疾病是以下之一：心肌病、擴(kuò)張型心肌病(DCM)、缺血性心肌病(iCM)、圍產(chǎn)期心肌病(PPCM)、特發(fā)性心肌病、查加斯心肌病、化療所致心肌病、查加斯巨結(jié)腸癥、查加斯巨食道癥、查加斯神經(jīng)病、良性前列腺增生、硬皮病、雷諾氏綜合癥、外周動脈閉塞性疾病(PAOD)、先兆子癇、腎同種異體移植排異、心肌炎、青光眼、高血壓、肺動脈高血壓、惡性高血壓、代謝綜合征、脫發(fā)、斑禿、偏頭痛、帕金森病、癲癇、叢集性頭痛、多發(fā)性硬化癥、抑郁、區(qū)域疼痛綜合征、不穩(wěn)定型心絞痛、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、精神分裂癥、舍格倫綜合征、牙周炎、心房顫動、白斑病、溶血性尿毒癥綜合征、僵人綜合征、先天性心臟傳導(dǎo)阻滯、I型糖尿病、銀屑病、阿爾茨海默病、疲乏、神經(jīng)性皮炎、腎臟疾病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、Leber遺傳性視神經(jīng)病(LHON綜合征)、過敏性哮喘、心率失常、難治性高血壓、II型糖尿病、血管性癡呆、非查加斯巨結(jié)腸癥和/或體位性高血壓。

盡管本文展示的數(shù)據(jù)證實了廣泛類型疾病與本發(fā)明適體的靶分子的相關(guān)性，但原則上，發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識到本文所提到的全部疾病均與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)并且因此是有前景的可用本發(fā)明適體治療的目標(biāo)疾病。

根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，自體免疫疾病是以下之一：心肌病、擴(kuò)張型心肌病(DCM)、缺血性心肌病(iCM)、圍產(chǎn)期心肌病(PPCM)、特發(fā)性心肌病、查加斯心肌病、化療所致心肌病、查加斯巨結(jié)腸癥、查加斯巨食道癥、查加斯神經(jīng)病、良性前列腺增生、硬皮病、雷諾氏綜合癥、外周動脈閉塞性疾病(PAOD)、先兆子癇、腎同種異體移植排異、心肌炎、青光眼、高血壓、肺動脈高血壓、惡性高血壓、代謝綜合征、脫發(fā)、斑禿、偏頭痛、帕金森病、癲癇、叢集性頭痛、多發(fā)性硬化癥、抑郁、區(qū)域疼痛綜合征、不穩(wěn)定型心絞痛、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、精神分裂癥、舍格倫綜合征、牙周炎、心房顫動、白斑病、溶血性尿毒癥綜合征、僵人綜合征和/或先天性心臟傳導(dǎo)阻滯，更優(yōu)選地，自體免疫疾病是擴(kuò)張型心肌病(DCM)。

根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，自體免疫疾病是心臟病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血管疾病、結(jié)締組織病(CTD)、皮膚病或查加斯病，自體免疫疾病尤其是心臟病、神經(jīng)性疾病或血管疾病。根據(jù)一個具體實施方案，自體免疫疾病是心臟病。

處于本發(fā)明含義范圍內(nèi)的心臟病可以是心肌病、擴(kuò)張型心肌病、缺血性心肌病、特發(fā)性心肌病、圍產(chǎn)期心肌病、查加斯心肌病、心房顫動、急性和慢性心肌炎、先天性心臟傳導(dǎo)阻滯、不穩(wěn)定型心絞痛、化療所致心肌病或肥厚型心肌病。

本發(fā)明含義范圍內(nèi)的神經(jīng)性疾病可以是偏頭痛、抑郁、癲癇、帕金森病、多發(fā)性硬化癥、叢集性頭痛、精神分裂癥、僵人綜合征、查加斯神經(jīng)病或復(fù)合性區(qū)域性疼痛綜合征。

本發(fā)明含義范圍內(nèi)的血管疾病可以是高血壓、肺動脈高血壓、外周動脈閉塞性疾病、惡性高血壓或雷諾氏綜合癥。

本發(fā)明含義范圍內(nèi)的結(jié)締組織病(CTD)可以是硬皮病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡SLE或舍格倫綜合征。本發(fā)明含義范圍內(nèi)的皮膚病可以是斑禿、脫發(fā)或白斑病。本發(fā)明含義范圍內(nèi)的查加斯病可以是查加斯巨結(jié)腸癥或查加斯巨食道癥。

在一個備選實施方案中，自體免疫疾病是以下之一：青光眼、代謝綜合征、牙周炎、溶血性尿毒癥綜合征、先兆子癇、良性前列腺增生或腎同種異體移植排異。

根據(jù)另一個備選實施方案，自體免疫疾病是以下之一：擴(kuò)張型心肌病、特發(fā)性心肌病、急性和慢性心肌炎、查加斯心肌病、圍產(chǎn)期心肌病、肺動脈高血壓、高血壓、先兆子癇、惡性高血壓、不穩(wěn)定型心絞痛、缺血性心肌病、偏頭痛、抑郁、多發(fā)性硬化癥、帕金森病或癲癇、尤其以下之一：擴(kuò)張型心肌病、特發(fā)性心肌病、急性和慢性心肌炎、查加斯心肌病、圍產(chǎn)期心肌病、肺動脈高血壓或高血壓、任選地以下之一：擴(kuò)張型心肌病、特發(fā)性心肌病或急性和慢性心肌炎。

特別地，本發(fā)明的適體能夠相互作用于自體抗體、優(yōu)選地對G-蛋白偶聯(lián)受體特異的自體抗體、優(yōu)選地對以下任一種人G-蛋白偶聯(lián)受體特異的自體抗體：腎上腺素能α-1受體、腎上腺素能β-1受體、腎上腺素能β-2受體、內(nèi)皮素1ETA受體、毒蕈堿M2受體、血管緊張素II AT1受體、PAR受體、MAS-受體、5HT4-受體和/或M3-受體，并且更優(yōu)選地能夠抑制這些自體抗體與其靶蛋白的特異性相互作用。

本文中，也可以將腎上腺素能β1-受體表示為β1-受體、β1-AR或β1-R.另外，也可以將腎上腺素能β2-受體表示為β2-受體、β2-AR或β2-R。另外，血管緊張素II受體I型可以命名為血管緊張素II AT1受體、血管緊張素AT1受體或AT1-R?？梢詫?nèi)皮素1ETA受體表示為ETA-R或ETA-1-R并且也可以將腎上腺素能α1-受體表示為α1-受體、α1-AR或α1-R。蛋白酶-激活受體可以命名為PAR-R。血管緊張素-II代謝物血管緊張素(1-7)結(jié)合受體可以在本文中命名為mas相關(guān)的G-蛋白偶聯(lián)受體A、MAS受體、MAS-R或MAS1。5-羥色胺受體4可以縮寫成5HT4-R，而可以將毒蕈堿受體表示為M_X-R，其中x表示毒蕈堿能受體的亞型。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，毒蕈堿M受體意在涵蓋M1、M2、M3和/或M4受體。根據(jù)另一個實施方案，毒蕈堿M1、M2、M3和/或M4-受體可用作具體例子，其中給出M3受體作為自體抗體可以針對的G-蛋白偶聯(lián)受體的一個例子。

如下文對具有SEQ ID No:12的序列的適體示例性顯示，本發(fā)明的適體可以用來中和全系列對G-蛋白偶聯(lián)受體特異的自體抗體。在本文的實施例12至20中，顯示這種適體特異性中和多種自體抗體，所述自體抗體取自患有與這些自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病的患者(參見圖13至圖21)。因此，可信的是，本發(fā)明的適體能夠中和針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體并且因此有效治療其中患有這種疾病的患者中存在這類自體抗體的疾病。

通過抑制針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體的病理學(xué)行為，本發(fā)明適體的中和作用削弱或甚至消除相應(yīng)G-蛋白偶聯(lián)受體的永久性激活。作為結(jié)果，不需要復(fù)雜地移除這些抗體。因此，本發(fā)明提供一組化合物，所述化合物適用于治療和/或診斷與存在識別G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病，即與存在對腎上腺素能α-1受體、腎上腺素能β-1受體、腎上腺素能β-2受體、內(nèi)皮素1ETA受體、毒蕈堿M2受體、血管緊張素II AT1受體、PAR受體、MAS-受體、5HT4-受體和/或M3-受體特異的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病。

另外在固定化后，本發(fā)明的適體能夠抓住或固定上文所述的自體抗體。因此，提供一個平臺，所述平臺建立用于從患者血清清除自體抗體的血液成分分離技術(shù)(apheresis technology)并且開發(fā)用于測量自體抗體的分析工具。后者可以特別用于診斷自體免疫疾病。

根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的適體用于診斷如本文定義的自體免疫疾病。特別地，適體用于體外檢測對G-蛋白偶聯(lián)受體、優(yōu)選地對如下的人G-蛋白偶聯(lián)受體：腎上腺素能α-1受體、腎上腺素能β-1受體、腎上腺素能β-2受體、內(nèi)皮素1ETA受體、毒蕈堿M受體、血管緊張素II AT1受體、PAR受體、MAS-受體、5HT4-受體和/或M3受體特異的抗體。根據(jù)另一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的適體用于體內(nèi)診斷如本文定義的自體免疫疾病。根據(jù)更優(yōu)選的實施方案，待檢測的抗體是自體抗體。

如本文所用，“自體抗體”意指響應(yīng)于患者自身組織的抗原性組分而形成并對其反應(yīng)的抗體。這種抗體可以攻擊其中形成它的生物的細(xì)胞、組織或天然蛋白并且通常隸屬于所述生物中的致病過程。

根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，對G-蛋白偶聯(lián)受體特異的抗體存在或來源于于體液，優(yōu)選地人體的流體、更優(yōu)選地人血、血漿、血清、尿、糞便、滑液、間質(zhì)液、淋巴液、唾液、脊髓液和/或淚液。更優(yōu)選地，身體流體取患有或疑似患有自體免疫疾病的個體，優(yōu)選地所述自體免疫疾病為與患者血清中存在對G蛋白偶聯(lián)受體特異的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病，更優(yōu)選地所述自體免疫疾病為與患者血清中存在對腎上腺素能α-1受體、腎上腺素能β-1受體、腎上腺素能β-2受體、內(nèi)皮素1ETA受體、毒蕈堿M受體、血管緊張素II AT1受體、PAR受體、MAS-受體、5HT4-受體和/或M3受體特異的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病。

當(dāng)用于治療或診斷自體免疫疾病時，本發(fā)明的適體不必然需要施用至個體或患者。也可以通過將本發(fā)明適體用于從身體或從體液消除抗體(例如自體抗體)，實現(xiàn)治療性或診斷性作用。

這種消除可以包括在這樣的設(shè)定下應(yīng)用本發(fā)明的適體，其中本發(fā)明的適體僅與體液離體接觸，例如在免疫吸附和/或血液成分分離術(shù)期間，從而本發(fā)明的適體不進(jìn)入待治療個體或患者的身體。因此，本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明適體的血液成分分離柱。

血液成分分離術(shù)是一項醫(yī)學(xué)技術(shù)，其中供體或患者的血液穿過這樣的裝置，所述裝置分離出一種特定成分并將剩余部分返回供體或患者的循環(huán)。因此，通過在封閉回路中連接患者血漿、患者身體和實現(xiàn)治療作用的裝置(即與柱結(jié)合的適體)，實施血液成分分離術(shù)。本發(fā)明的適體可以用作在血液成分分離期間的選擇性組分。選擇性組分負(fù)責(zé)特異性分離出所需的特定成分，即樣品或血液中存在的由本發(fā)明適體特異性靶向的抗體或自體抗體。

優(yōu)選地，本發(fā)明的適體用于治療和/或診斷自體免疫疾病，其中自體免疫疾病是心肌病、擴(kuò)張型心肌病(DCM)、缺血性心肌病(iCM)、圍產(chǎn)期心肌病(PPCM)、特發(fā)性心肌病、查加斯心肌病、化療所致心肌病、查加斯巨結(jié)腸癥、查加斯巨食道癥、查加斯神經(jīng)病、良性前列腺增生、硬皮病、雷諾氏綜合癥、外周動脈閉塞性疾病(PAOD)、先兆子癇、腎同種異體移植排異、心肌炎、青光眼、高血壓、肺動脈高血壓、惡性高血壓、代謝綜合征、脫發(fā)、斑禿、偏頭痛、帕金森病、癲癇、叢集性頭痛、多發(fā)性硬化癥、抑郁、區(qū)域疼痛綜合征、不穩(wěn)定型心絞痛、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、精神分裂癥、舍格倫綜合征、牙周炎、心房顫動、白斑病、溶血性尿毒癥綜合征、僵人綜合征和/或先天性心臟傳導(dǎo)阻滯。進(jìn)一步優(yōu)選地，使用本發(fā)明的適體用作血液或其成分的治療性血液成分分離的選擇性組分，所述血液或其成分源自如本文進(jìn)一步定義的患有自體免疫疾病的患者。

本發(fā)明還涉及與固相支持物偶聯(lián)的本發(fā)明適體。技術(shù)人員非常清楚可以用來產(chǎn)生與固相支持物偶聯(lián)的這類適體的技術(shù)和材料。在優(yōu)選的實施方案中，固相支持物包括在醫(yī)學(xué)測定法、生物化學(xué)測定法或生物測定法中可用的固態(tài)材料。

所述固態(tài)材料包括通常在醫(yī)學(xué)測定法、生物化學(xué)測定法或生物測定法中用作支持物的聚合物。特別地，本發(fā)明的適體可以與固相支持物偶聯(lián)，允許所得產(chǎn)物用于制造適合用于血液成分分離術(shù)的柱、優(yōu)選地適合用于血液成分分離術(shù)中從液態(tài)樣品(優(yōu)選地從體液)移除對G-蛋白偶聯(lián)受體特異的抗體的柱。

制造或大量生產(chǎn)本發(fā)明的適體是本領(lǐng)域熟知的并且代表僅例行的活動。

本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明的至少一種適體和任選地至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明的適體或本發(fā)明不同適體的混合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑，例如合適的載體或稀釋劑。

優(yōu)選地，本發(fā)明的適體構(gòu)成藥物組合物的有效成分和/或以有效量存在。術(shù)語“有效量“指對疾病或病理狀況具有預(yù)防、診斷或治療相關(guān)效果的本發(fā)明適體的量。預(yù)防性效果防止疾病的暴發(fā)。治療相關(guān)效果緩解疾病的一種或多種癥狀到某個程度或使得與疾病或病理狀況相關(guān)或作為其原因的一個或多個生理參數(shù)或生物化學(xué)參數(shù)部分地或完全恢復(fù)至正常。

施用本發(fā)明適體的相應(yīng)量足夠地高，以實現(xiàn)所需的預(yù)防性、診斷或治療效果。技術(shù)人員將理解，向任何特定哺乳動物施用的具體劑量水平、頻率和時間段將取決于多種因素，包括所用的具體組分的活性、年齡、體重、總體健康、性別、膳食、施用時間、施用途徑、藥物聯(lián)用和特定療法的嚴(yán)重性(severity)。使用熟知的手段和方法，精確數(shù)量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員作為例行實驗確定。

根據(jù)本發(fā)明藥物組合物的一個實施方案，至少20％、優(yōu)選地至少50％、更優(yōu)選地至少75％、最優(yōu)選的至少95％的總適體含量由本發(fā)明的適體構(gòu)成。

當(dāng)用于治療時，藥物組合物將通常作為與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑聯(lián)合的制劑施用。術(shù)語“賦形劑“在本文中用來描述除本發(fā)明適體之外的任何成分。賦形劑的選擇將很大程度取決于特定的施用模式。賦形劑可以是適合的載體和/或稀釋劑。

本發(fā)明的藥物組合物可以口服施用?？诜┯每梢陨婕巴萄?，從而組合物進(jìn)入胃腸道，或者可以使用頰部或舌下施用，組合物籍此從口腔直接進(jìn)入血流。

適于口服施用的制劑包括：固態(tài)制劑如片劑；包衣片劑、含有顆粒物、液體或粉末的膠囊劑；錠劑(包括充填液體的錠劑)；和咀嚼劑；多顆粒物和納米顆粒物；凝膠劑；固溶體；脂質(zhì)體；薄膜劑、珠劑(ovules)、噴霧劑和液態(tài)制劑。

液態(tài)制劑包括混懸劑、溶液劑、糖漿劑和酏劑。這類制劑可以作為軟膠囊劑或硬膠囊劑中的填料使用并且一般包含載體例如，水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纖維素或合適的油以及一種或多種乳化劑和/或助懸劑。也可以通過復(fù)溶(例如，從小袋復(fù)溶)固體，配制液態(tài)制劑。

對于片劑劑型，取決于劑量，本發(fā)明的適體可以構(gòu)成劑型的0.1重量％至80重量％，更一般地構(gòu)成劑型的5重量％至60重量％。除本發(fā)明的適體之外還，片劑通常含有崩解劑。

崩解劑的例子包括羧基乙酸淀粉鈉、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈣、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、交聯(lián)聚維酮、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、微晶纖維素、低級烷基取代的羥丙基纖維素、淀粉、預(yù)膠化淀粉和藻酸鈉。

通常，崩解劑將占據(jù)劑型的1重量％至25重量％、優(yōu)選地5重量％至20重量％。

片劑可以包含額外的賦形劑，例如粘結(jié)劑、表面活性物質(zhì)、潤滑劑和/或其他可能成分，例如抗氧化物質(zhì)、色料、增味劑、防腐劑和/或掩味劑。

片劑摻合料可以直接壓制或由輥壓制以形成片劑。片劑摻合料或摻合料的部分可以在造片之前可選地濕法制粒、干法制粒或熔融制粒、熔融凝固或擠出。最終的制劑可以包含一個或多個層并且可以經(jīng)包衣或未包衣；它可以甚至包囊化。

可以將口服施用的固態(tài)制劑配制成速釋和/或受調(diào)節(jié)釋放。受調(diào)節(jié)釋放制劑包括延遲釋放、持久釋放、脈沖釋放、受控釋放、定向釋放和編程釋放。

本發(fā)明的藥物組合物也可以直接施用入血流、肌肉或內(nèi)臟中。用于腸胃外施用的合適手段包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、尿道內(nèi)、胸骨內(nèi)、顱內(nèi)、肌內(nèi)和皮下。腸胃外施用的合適裝置包括針頭(包括微量針頭)注射器、無針頭注射器和輸注技術(shù)。

腸胃外制劑一般是水溶液劑，所述水溶液劑可以含有賦形劑如鹽、碳水化合物和緩沖劑(優(yōu)選地，至3至9的pH)，但是，對于一些應(yīng)用，它們可以更適當(dāng)?shù)嘏渲茷闊o菌非水溶液或配制為與合適溶媒如無菌無熱原水一起待使用的干燥形式。

無菌條件下腸胃外制劑的制備(例如通過凍干法)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)技術(shù)輕易地完成。

可以通過使用適宜的制劑技術(shù)，如摻入溶解度增強(qiáng)劑，增加用于配制腸胃外溶液劑的本發(fā)明藥物組合物的溶解度。

可以將腸胃外施用的制劑配制成速釋和/或受調(diào)節(jié)釋放。受調(diào)節(jié)釋放制劑包括延遲釋放、持久釋放、脈沖釋放、受控釋放、定向釋放和編程釋放。因此，可以將本發(fā)明的化合物配制為固體劑、半固體劑或觸變液體劑作為植入貯庫施用，其中所述植入貯庫提供活性化合物的受調(diào)節(jié)釋放。這類制劑的例子包括涂藥支架和PGLA聚(dl-乳酸-共乙醇酸)(PGLA)微球體。

本發(fā)明的藥物組合物也可以外用地施用至皮膚或粘膜，即，皮膚或經(jīng)皮施用。用于該目的的常見制劑包括凝膠劑、水凝膠劑、露劑(lotion)、溶液劑、乳膏劑、油膏劑、撒粉散劑、敷劑(dressing)、泡沫劑、膜劑、皮膚貼劑、薄片劑(wafer)、植入劑、海綿劑、纖維劑、繃帶劑和微乳劑。

也可以使用脂質(zhì)體。常見的載體包括醇、水、礦物油、石蠟油、白凡士林、丙三醇、聚乙二醇和丙二醇?？梢該饺霛B透促進(jìn)劑。外用施用法的其他手段包括借助電穿孔法、離子導(dǎo)入法、聲透入法(phonophoresis)、超聲導(dǎo)入法(sonophoresis)和微量針注射或無針注射(例如，Powderject(TM)、Bioject(TM)等)輸送。可以將外用施用的制劑配制成速釋和/或受調(diào)節(jié)釋放。受調(diào)節(jié)釋放制劑包括延遲釋放、持久釋放、脈沖釋放、受控釋放、定向釋放和編程釋放。

為了施用至人類患者，本發(fā)明適體和/或本發(fā)明藥物組合物的每日總劑量一般處于0.001mg至5000mg范圍內(nèi)，當(dāng)然，這取決于施用模式。例如，靜脈內(nèi)每日劑量可以僅需要0.001mg至40mg。每日總劑量可以按單一或或分開的劑量施用并且根據(jù)醫(yī)師的決定，可以落在本文給出的常見范圍外。

這些劑量基于具有約75kg至80kg體重的平均人類受試者。醫(yī)師將輕易能夠確定其體重落于該范圍之外的受試者(如嬰兒和老年人)的劑量。

本發(fā)明還涵蓋一種試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的適體、藥物組合物、容器和任選地書面使用說明書和/或連同施用手段。

對于治療和/或診斷疾病，無論施用途徑是什么，本發(fā)明的適體均每個治療周期以不多于20mg/kg體重、優(yōu)選地不多于10mg/kg體重、更優(yōu)選地選自范圍1μg/kg至20mg/kg體重，最優(yōu)選地選自0.01mg/kg至10mg/kg體重范圍的每日劑量施用。

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于體外檢測和/或表征對G-蛋白偶聯(lián)受體、優(yōu)選地以下G-蛋白偶聯(lián)受體：腎上腺素能α-1受體、腎上腺素能β-1受體、腎上腺素能β-2受體、內(nèi)皮素1ETA受體、毒蕈堿M2受體、血管緊張素II AT1受體、PAR受體、MAS-受體、5HT4-受體和/或M3-受體特異的抗體(例如自體抗體)中的本發(fā)明適體。因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案涉及如權(quán)利要求1至8中任一項所限定的適體的用途，用于體外檢測對G-蛋白偶聯(lián)受體、優(yōu)選地對如下的人G-蛋白偶聯(lián)受體：腎上腺素能α-1受體、腎上腺素能β-1受體、腎上腺素能β-2受體、內(nèi)皮素1ETA受體、毒蕈堿M受體、血管緊張素II AT1受體、PAR受體、MAS-受體、5HT4-受體和/或M3受體特異的抗體。

這種用途可以包括在大鼠心肌細(xì)胞搏動頻率測定法中在有效量的本發(fā)明適體存在和不存在下檢驗樣品。取決于樣品和本發(fā)明適體對搏動頻率的影響，技術(shù)人員可以就相應(yīng)抗體的存在情況得出結(jié)論。也可以獲得關(guān)于樣品中這類抗體的總量或相對量的數(shù)據(jù)以及這類抗體的其他特性的數(shù)據(jù)。

所謂大鼠心肌細(xì)胞搏動頻率測定法是一項充分建立的測定法，其檢測并表征對多種人G-蛋白偶聯(lián)受體例如人腎上腺素能α-1受體、腎上腺素能β-1受體、腎上腺素能β-2受體、內(nèi)皮素1ETA受體、毒蕈堿M2受體、血管緊張素II AT1受體、PAR受體、MAS-受體、5HT4-受體和/或M3-受體特異的抗體，例如源自患者的自體抗體。

該測定法在以下文獻(xiàn)中詳述：Wallukat等人,(1987)Effects of the serum gamma globulin fraction of patients with allergic asthma and dilated cardiomyopathy on chromotropic beta adrenoceptor function in cultured neonatal rat heart myocytes,Biomed.Biochim.Acta 46,634-639；Wallukat等人,(1988)Cultivated cardiac muscle cells-a functional test system for the detection of autoantibodies against the beta adrenergic receptor,Acta Histochem.Suppl.35,145-149；和Wallukat等人,(2010)Distinct patterns of autoantibodies against G-protein coupled receptors in Chagas'cardiomyopathy and megacolon.Their potential impact for early risk assessment in asymptomatic Chagas'patients,J.Am.Col.Cardiol.55,463-468。因此，技術(shù)人員是非常清楚這個測定法的性質(zhì)并知道如何應(yīng)用它。

為了檢測和/或表征這類抗體，本發(fā)明的適體可以在溶液中或以固定形式使用。

本發(fā)明的適體可以用于直接或間接檢測和/或表征所述抗體。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種用于制備適體寡核苷酸的方法，所述方法包括步驟：確定用作適體序列的核苷酸序列，包括應(yīng)用以下的產(chǎn)生規(guī)則集合P：

條件為

a.)Q是自然數(shù)集

b.)F是如下定義10^{F:＝{X∈Q|(X＞1)}}的自然數(shù)子集

F:＝{X∈Q|(X>1)}

c.)使用F，定義：

d.)U是如下定義的非終結(jié)符集

U＝{S，M，N，D，E，Y，H，R，Z，L，BX，CX，K，V}

對于BX和CX，見c)

e.)W是如下定義的非終結(jié)符集

W＝{A，C，G，T，G^X}

G^X指可以根據(jù)b.)和c.)導(dǎo)出的全部終結(jié)符(5)

f.)S∈U是起始符號

其中“A”意指腺嘌呤核苷酸，“C”意指胞嘧啶核苷酸，“G”意指鳥嘌呤核苷酸并且如果核苷酸序列是DNA序列，則“T”意指胸腺嘧啶核苷酸，并且如果核苷酸序列是RNA序列，則“T”意指尿嘧啶核苷酸，以及生產(chǎn)具有第一步驟中獲得的核苷酸序列的適體寡核苷酸。

根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，確定用作適體序列的核苷酸序列的步驟包括應(yīng)用以下共有序列

S_i-(GGG-S-GGG-S)_n-(GGG-S-GGG)_k-S_m (1)

其中n>1；

i、m、k＝0、1；

S＝{A、C、G、T}⁺或{A、C、G}⁺或{A、C、T}⁺或{A、G、T}⁺或{C、G、T}⁺或{A、C}⁺或{A、G}⁺或{A、T}⁺或{C、G}⁺或{C、T}⁺或{G、T}⁺或{A}⁺或{C}⁺或{T}⁺，其中{}⁺指給定字母集的正克林閉包(Kleene Closure)。

術(shù)語正克林閉包描述了有限非空符號(詞匯或字母)集的成員的并置方式。作為這個進(jìn)程的結(jié)果，將產(chǎn)生新詞(符號串)。每個詞具有大于零的長度。

根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，提供一種包含滿足式(1)共有序列(consensus sequences)的核苷酸序列的適體用于治療和/或診斷與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病，其中“A”意指腺嘌呤核苷酸，“C”意指胞嘧啶核苷酸，“G”意指鳥嘌呤核苷酸并且如果核苷酸序列是DNA序列，則“T”意指胸腺嘧啶核苷酸，并且如果核苷酸序列是RNA序列，則“T”意指尿嘧啶核苷酸，其中適體不包含核苷酸序列CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG(SEQ ID No:24)。

根據(jù)又一個優(yōu)選的實施方案，確定用作適體序列的核苷酸序列的步驟包括應(yīng)用以下共有序列

S_i-(GG-S-GG-S)_n-(GG-S-GG)_k-S_m (2)

其中n>1；

i、m、k＝0、1；

S＝{A、C、G、T}⁺或{A、C、G}⁺或{A、C、T}⁺或{A、G、T}⁺或{C、G、T}⁺或{A、C}⁺或{A、G}⁺或{A、T}⁺或{C、G}⁺或{C、T}⁺或{G、T}⁺或{A}⁺或{C}⁺或{T}⁺，

其中{}⁺指給定字母集的正克林閉包。

根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，提供一種包含滿足式(2)共有序列的核苷酸序列的適體用于治療和/或診斷與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病，其中“A”意指腺嘌呤核苷酸，“C”意指胞嘧啶核苷酸，“G”意指鳥嘌呤核苷酸并且如果核苷酸序列是DNA序列，則“T”意指胸腺嘧啶核苷酸，并且如果核苷酸序列是RNA序列，則“T”意指尿嘧啶核苷酸，其中適體不包含核苷酸序列GGTTGGTGTGGTTGG(SEQ ID No:22)、GGTTGGTGTGGT(SEQ ID NO:23)或CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG(SEQ ID No:24)。

根據(jù)另一個優(yōu)選實施方案，確定用作適體序列的核苷酸序列的步驟包括應(yīng)用以下共有序列

S_i-P-(LM)_j-E_k； (3)

其中i，k＝0，1；

j>＝0；

P＝(G_m-(X)-G_m-(Y)-G_m-(Z)-G_m)；

M＝(G_m-(X)-G_m-(Y)-G_m-(Z)-G_m)；

m>1；

S、L、E、X、Y、Z＝{A、C、G、T}⁺或{A、C、G}⁺或{A、C、T}⁺或{A、G、T}⁺或{C、G、T}⁺或{A、C}⁺或{A、G}⁺或{A、T}⁺或{C、G}⁺或{C、T}⁺或{G、T}⁺或{A}⁺或{C}⁺或{T}⁺，其中{}⁺指給定字母集的正克林閉包。

根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，提供一種包含滿足式(3)共有序列的核苷酸序列的適體用于治療和/或診斷與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病，其中“A”意指腺嘌呤核苷酸，“C”意指胞嘧啶核苷酸，“G”意指鳥嘌呤核苷酸并且如果核苷酸序列是DNA序列，則“T”意指胸腺嘧啶核苷酸，并且如果核苷酸序列是RNA序列，則“T”意指尿嘧啶核苷酸，其中適體不包含核苷酸序列GGTTGGTGTGGTTGG(SEQ ID No:22)、GGTTGGTGTGGT(SEQ ID NO:23)或CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG(SEQ ID No:24)。

根據(jù)另一個優(yōu)選實施方案，確定用作適體序列的核苷酸序列的步驟包括應(yīng)用以下共有序列

S_i-P-E_j； (4)

其中i，j＝0，1；

P＝(G_m-(X)-G_m-(Y)-G_m)；

m>1；

X、Y、S、E＝{A、C、G、T}⁺或{A、C、G}⁺或{A、C、T}⁺或{A、G、T}⁺或{C、G、T}⁺或{A、C}⁺或{A、G}⁺或{A、T}⁺或{C、G}⁺或{C、T}⁺或{G、T}⁺或{A}⁺或{C}⁺或{T}⁺，其中{}⁺指給定字母集的正克林閉包。

根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，提供一種包含滿足式(4)共有序列的核苷酸序列的適體用于治療和/或診斷與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病，其中“A”意指腺嘌呤核苷酸，“C”意指胞嘧啶核苷酸，“G”意指鳥嘌呤核苷酸并且如果核苷酸序列是DNA序列，則“T”意指胸腺嘧啶核苷酸，并且如果核苷酸序列是RNA序列，則“T”意指尿嘧啶核苷酸，其中適體不包含核苷酸序列GGTTGGTGTGGTTGG(SEQ ID No:22)、GGTTGGTGTGGT(SEQ ID NO:23)或CGCCTAGGTTGGGTAGGGTGGTGGCG(SEQ ID No:24)。

使用本發(fā)明的方法，可以確定具有下述結(jié)構(gòu)樣式的核苷酸序列，所述結(jié)構(gòu)樣式對有效作為治療適體和/或診斷適體用于治療和/或診斷與針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體相關(guān)的自體免疫疾病是必要和充分的。

可以通過使用本發(fā)明方法，產(chǎn)生本發(fā)明適體的序列。在下文中，示例性顯示本發(fā)明SEQ ID No.:12的序列的導(dǎo)出：

序列#12的導(dǎo)出：(5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3')

X＝2

S→M

→NRM

→MRM

→C2LC2RM

→C2LC2RC2LC2

→B2LB2LC2RC2LC2

→B2LB2LB2LB2RC2LC2

→B2LB2LB2LB2RB2LB2LC2

→B2LB2LB2LB2RB2LB2LB2LB2

→GGLB2LB2LB2RB2LB2LB2LB2

→GGLGGLB2LB2RB2LB2LB2LB2

→GGLGGLGGLB2RB2LB2LB2LB2

→GGLGGLGGLGGRB2LB2LB2LB2

→GGLGGLGGLGGRGGLB2LB2LB2

→GGLGGLGGLGGRGGLGGLB2LB2

→GGLGGLGGLGGRGGLGGLGGLB2

→GGLGGLGGLGGRGGLGGLGGLGG

→GGZGGLGGLGGRGGLGGLGGLGG

→GGTGGLGGLGGRGGLGGLGGLGG

→GGTGGZGGLGGRGGLGGLGGLGG

→GGTGGTGGLGGRGGLGGLGGLGG

→GGTGGTGGZGGRGGLGGLGGLGG

→GGTGGTGGTGGRGGLGGLGGLGG

→GGTGGTGGTGGLGGLGGLGGLGG

→GGTGGTGGTGGZLGGLGGLGGLGG

→GGTGGTGGTGGZZGGLGGLGGLGG

→GGTGGTGGTGGTZGGLGGLGGLGG

→GGTGGTGGTGGTTGGLGGLGGLGG

→GGTGGTGGTGGTTGGZGGLGGLGG

→GGTGGTGGTGGTTGGTGGLGGLGG

→GGTGGTGGTGGTTGGTGGZGGLGG

→GGTGGTGGTGGTTGGTGGTGGLGG

→GGTGGTGGTGGTTGGTGGTGGZGG

→GGTGGTGGTGGTTGGTGGTGGTGGSEQ ID NO:12

使用移位-歸約解析器，SEQ ID No.:12的序列也可以在應(yīng)用下表中列出的語法規(guī)則后，在隨機(jī)化序列的匯集物中作為有效序列被識別。由于輸入序列可以歸約至起始符號S，序列是所定義語法的有效句子。

下文顯示導(dǎo)出要求保護(hù)的本發(fā)明適體序列SEQ ID No.:3、10和15的其他示例：

序列#3的導(dǎo)出：(5'-GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGG-3')

X＝3

S→M

→RM

→LM

→LC3LC3

→ZLC3LC3

→ZZLC3LC3

→ZZZLC3LC3

→ZZZZLC3LC3

→ZZZZZLC3LC3

→ZZZZZZLC3LC3

→ZZZZZZZLC3LC3

→ZZZZZZZZLC3LC3

→ZZZZZZZZZC3LC3

→GZZZZZZZZC3LC3

→GGZZZZZZZC3LC3

→GGTZZZZZZC3LC3

→GGTTZZZZZC3LC3

→GGTTGZZZZC3LC3

→GGTTGGZZZC3LC3

→GGTTGGGZZC3LC3

→GGTTGGGGZC3LC3

→GGTTGGGGTB3LB3LC3

→GGTTGGGGTB3LB3LB3LB3

→GGTTGGGGTGGGLB3LB3LB3

→GGTTGGGGTGGGZB3LB3LB3

→GGTTGGGGTGGGTB3LB3LB3

→GGTTGGGGTGGGTGGGLB3LB3

→GGTTGGGGTGGGTGGGZLB3LB3

→GGTTGGGGTGGGTGGGZZB3LB3

→GGTTGGGGTGGGTGGGGZB3LB3

→GGTTGGGGTGGGTGGGGTB3LB3

→GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGLB3

→GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGZB3

→GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTB3

→GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGGSEQ ID NO:3

序列#10的導(dǎo)出：(5'-GGTGGTGGTGG-3')

X＝2

S→M

→C2LC2

→B2LB2LC2

→GGLB2LC2

→GGZB2LC2

→GGTB2LC2

→GGTGGLC2

→GGTGGZC2

→GGTGGTC2

→GGTGGTB2LB2

→GGTGGTGGLB2

→GGTGGTGGZB2

→GGTGGTGGTB2

→GGTGGTGGTGGSEQ ID NO:10

序列#15的導(dǎo)出：

(5'-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3')

X＝2

S→M

→RM

→RNRM

→RNRMR

→RMRMR

→LMRMR

→ZLMRMR

→ZZLMRMR

→ZZZMRMR

→TZZMRMR

→TTZMRMR

→TTTMRMR

→TTTC2LC2RMR

→TTTB2LB2LC2RMR

→TTTGGLB2LC2RMR

→TTTGGLB2LC2RMR

→TTTGGZB2LC2RMR

→TTTGGTB2LC2RMR

→TTTGGTGGLC2RMR

→TTTGGTGGZC2RMR

→TTTGGTGGTC2RMR

→TTTGGTGGTB2LB2RMR

→TTTGGTGGTGGLB2RMR

→TTTGGTGGTGGZB2RMR

→TTTGGTGGTGGTB2RMR

→TTTGGTGGTGGTGGRMR

→TTTGGTGGTGGTGGLMR

→TTTGGTGGTGGTGGZLMR

→TTTGGTGGTGGTGGZZLMR

→TTTGGTGGTGGTGGZZZLMR

→TTTGGTGGTGGTGGZZZZMR

→TTTGGTGGTGGTGGTZZZMR

→TTTGGTGGTGGTGGTTZZMR

→TTTGGTGGTGGTGGTTGZMR

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTMR

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTC2LC2R

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTB2LB2LC2R

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGLB2LC2R

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGZB2LC2R

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTB2LC2R

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGLC2R

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGZC2R

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTC2R

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTB2LB2R

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGLB2R

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGZB2R

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTB2R

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGR

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGL

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGZL

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGZZL

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGZZZ

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTZZ

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTZ

→TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTSEQ ID NO:15

如本文所述的本發(fā)明全部實施方案均視為以任何組合方式可組合，除非技術(shù)人員認(rèn)為這種組合不產(chǎn)生任何技術(shù)意義。

實施例

估計自體抗體活性(針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體，AAB)的功能測定法

能夠鑒定并定量針對G-蛋白偶聯(lián)受體的自體抗體(AAB)的功能測定法用于評估本發(fā)明適體的AAB中和能力。

這種功能測定法利用自發(fā)搏動的大鼠心肌細(xì)胞，與等分試樣的純化IgG級分一起添加時，所述細(xì)胞能夠?qū)颊逜AB做出反應(yīng)，伴隨它們的搏動頻率變化–變時性反應(yīng)。變時性反應(yīng)是由刺激性AAB(如靶向腎上腺素能β1-、β2-或-α1受體、毒蕈堿M2受體和內(nèi)皮素受體A型(ETA-受體)的那些)引起的正變時性或負(fù)變時性的總和并且表述為相對于基礎(chǔ)搏動頻率的差異，Δ搏動/時間。

抑制性AAB如過敏性哮喘患者中存在的β2-腎上腺素能受體AAB拮抗由β2-腎上腺素能激動劑引起的正變時作用。

為了就其對變時性反應(yīng)(正變時性或負(fù)變時性)的貢獻(xiàn)區(qū)分AAB種類，在特定拮抗劑如針對β2-AAB的ICI-118.551、針對M2-AAB的阿托品、針對β1/β2-AAB的普萘洛爾、針對ETA-受體的BQ610或BQ123、針對α1-腎上腺素能受體的哌唑嗪或烏拉地爾和針對AT1-受體的厄貝沙坦或氯沙坦存在下實施分析。剩余活性變化由AAB引起，遭特異性阻斷的那些除外。

另外，使用與可以中和AAB活性的受體的胞外結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的G-蛋白偶聯(lián)受體的肽，更詳細(xì)地分析AAB的特異性。以相似方式，對適體檢驗其中和AAB的能力。

這種功能測定法可以檢測并定量人血清全部AAB和靶向細(xì)胞表面上受體的其他分子，所述受體的序列是人受體的同源物(AAB靶向作用的前提)并且所述受體與調(diào)節(jié)細(xì)胞搏動頻率(收縮性、變時性)的蛋白質(zhì)級聯(lián)如G-蛋白系統(tǒng)關(guān)聯(lián)。

新生心肌細(xì)胞的制備

為了制備新生心肌細(xì)胞，將1至3日齡大鼠的心臟在無菌條件下取出并轉(zhuǎn)移至含有青霉素/鏈霉素的磷酸鹽緩沖鹽水溶液(PBS)。在分離心室組織后，將它剖分成小片并用10ml PBS洗滌兩次。此后，將剖分的心室小片是懸浮于30ml PBS/0.2％胰蛋白酶中并且在37℃溫育15分鐘。添加5ml冰冷的熱滅活新生牛血清，終止胰蛋白酶消化過程。將所產(chǎn)生的懸液離心(130x g，15分鐘)并將沉淀物轉(zhuǎn)移至20ml SM20-I培養(yǎng)基。計數(shù)細(xì)胞，同時用相同體積的臺盼藍(lán)溶液稀釋所產(chǎn)生懸液的等分試樣。

將懸浮于2.0ml用濕潤空氣平衡并補(bǔ)充有10％熱滅活新生牛血清、2μM氟脫氧尿苷的含有葡萄糖的SM20-I培養(yǎng)基中的2.4x10⁶個細(xì)胞轉(zhuǎn)移至12.5-cm²Falcon瓶以作為單層在37℃培養(yǎng)4天。在第1天和此后每兩天更新培養(yǎng)基。實驗在這些瓶中進(jìn)行。

AAB測量用血清樣品的制備

為了制備適于AAB測量的IgG級分，將1ml血清和660μl飽和硫酸銨溶液混合(終濃度40％硫酸銨)，在4℃溫育18小時并且按6,000x g離心15分鐘。

將沉淀物重懸于750μl PBS中，與750μl飽和硫酸銨溶液(終濃度50％硫酸銨)混合并再次離心。將沉淀物懸浮于700μl PBS中并對100倍體積的PBS透析。所產(chǎn)生的IgG級分含有AAB并將其貯存在-20℃直至測量。

AAB測量原理和適體測試設(shè)置

實驗在12.5-cm²Falcon瓶中進(jìn)行。標(biāo)記用于測量的六個獨(dú)立細(xì)胞簇并且在標(biāo)記的區(qū)域記錄基礎(chǔ)心肌細(xì)胞搏動率。

為了測量AAB活性，將制備的IgG樣品以如圖中所示的最終稀釋度(例如AAB 1:50，其對應(yīng)于如上文所述制備的40μl IgG溶液在2000μl細(xì)胞培養(yǎng)基中)添加至細(xì)胞。在添加IgG樣品后，將瓶在37℃溫育60分鐘并且再次計數(shù)標(biāo)記的區(qū)帶處心肌細(xì)胞搏動率并且計算相對于基礎(chǔ)搏動率的差異，所述差異對應(yīng)于陽性變時性AAB活性或陰性變時性AAB活性分別為陽性或陰性。

檢驗適體效應(yīng)，將含有AAB的IgG樣品與相應(yīng)的適體(如圖中所示的SEQ ID No.)預(yù)溫育15分鐘，之后添加混合物至心肌細(xì)胞。在溫育時間60分鐘(37℃)后，評估搏動頻率并且計算相對于基礎(chǔ)搏動率的差異。

添加2μl適體對應(yīng)于最終細(xì)胞瓶中添加100nM適體(總體積2000μl)。

實施例1：

通過記錄新生心肌細(xì)胞搏動率的增加，監(jiān)測α1-腎上腺素能受體AAB的活性(參見圖1，列1：AAB 1:50)。圖1的列2-5和列7顯示在AAB與100nM相應(yīng)序列(分別是Seq.ID No:2、3、10、15和20)的適體預(yù)溫育后，AAB活性降低。通過使用100nM不是本發(fā)明適體序列的對照適體序列(Seq.ID No.19:TCGAGAAAAACTCTCCTCTCCTTCCTTCCTCTCCA)獲得了圖1的列6的結(jié)果。

實施例2：

通過記錄新生心肌細(xì)胞搏動率的增加，監(jiān)測β1-腎上腺素能受體AAB的活性(參見圖2，列1：AAB 1:50)。圖2的列2-5和列7顯示在AAB與100nM相應(yīng)序列(分別是Seq.ID No:2、3、10、15和20)的適體預(yù)溫育后，AAB活性降低。通過使用100nM不是本發(fā)明適體序列的對照適體序列(Seq.ID No.19)獲得了圖2的列6的結(jié)果。

實施例3：

通過記錄新生心肌細(xì)胞搏動率的增加，監(jiān)測PAR1/PAR2-受體AAB的活性(參見圖3，列1：AAB 1:50)。圖3的列2-5和列7顯示在AAB與100nM相應(yīng)序列(分別是Seq.ID No:2、3、10、15和20)的適體預(yù)溫育后，AAB活性降低。通過使用100nM不是本發(fā)明適體序列的對照適體序列(Seq.ID No.19)獲得了圖3的列6的結(jié)果。

實施例4：

通過記錄新生心肌細(xì)胞搏動率的減少，監(jiān)測內(nèi)皮素1ETA-受體AAB的活性(參見圖3，列1：AAB 1:50)。圖3的列2-5和列7顯示在AAB與100nM相應(yīng)序列(分別是Seq.ID No:2、3、10、15和20)的適體預(yù)溫育后，AAB活性降低。通過使用100nM不是本發(fā)明適體序列的對照適體序列(Seq.ID No.19)獲得了圖4的列6的結(jié)果。

實施例5：

通過記錄新生心肌細(xì)胞搏動率的增加，監(jiān)測SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:20的適體對β1-腎上腺素能受體AAB的濃度依賴性影響(x-軸標(biāo)簽中的數(shù)據(jù)點(diǎn)“無”對應(yīng)于：AAB 1:50)。曲線使得適體SEQ ID No.:10和20的適體作用的劑量-依賴關(guān)系可視化。使用用SEQ ID NO 19獲得的曲線充當(dāng)對照，因為SEQ ID NO 19不是本發(fā)明的適體序列。

實施例6：

在實施例6中，顯示本發(fā)明適體(分別是列1、2、3、4、6和7中所示的SEQ ID NO 2、3、10、15、20和12)本身對基礎(chǔ)心肌細(xì)胞搏動率的影響。通過使用不是本發(fā)明適體序列的對照適體序列(Seq.ID No.19)獲得了圖6的列5的結(jié)果。

實施例7：

通過記錄新生心肌細(xì)胞搏動率的增加，監(jiān)測AAB的活性(參見圖7，列1：β1-AAB No.1，1:50；列3：β1-AAB No.2，1:50，列5：β1-AAB No.3，1:50；列7：α1-AAB No.1，1:50；列8：α1-AAB No.2，1:50；列11：β2-AAB No.1，1:50；列13：β2-AAB No.2，1:50)。圖7的列2、4、6、8、10、12、14顯示在100nM SEQ ID NO:12的適體處AAB活性降低(β1AAB1、β1AAB2、β1AAB 3、α1AAB1、α1AAB 2、β2-AAB 1、β2-AAB 2)。AAB No.1、2和3代表從不同患者材料制備的AAB。

實施例8：

實施例8如上文實施例2中那樣實施。通過在不添加適體的時(參見圖8，列1：AAB 1:50)和添加本發(fā)明適體時記錄新生心肌細(xì)胞搏動率的增加，監(jiān)測β1-腎上腺素能受體AAB的活性。用本發(fā)明適體處理的全部樣品顯示在AAB與100nM、400nM或1000nM相應(yīng)序列(分別是圖8中的Seq.ID No 1、4至7至9、11至14和16至18)的適體預(yù)溫育后，AAB活性降低。

實施例9：

實施例9如上文實施例2中那樣實施。通過在不添加適體時(參見圖10，列1：AAB 1:50)和添加本發(fā)明適體時記錄新生心肌細(xì)胞搏動率的增加，監(jiān)測β1-腎上腺素能受體AAB的活性。用本發(fā)明適體處理的全部樣品顯示在AAB與100nM相應(yīng)序列(分別是圖8中的Seq.ID No 25至45；對于這些序列的相互同一性，參見圖9)的適體預(yù)溫育后，AAB活性降低。使用400nM每種適體進(jìn)一步重復(fù)適體序列SEQ ID No.:31至34、44和45的實驗(參見下文在中的實施例10)。

實施例10：

實施例10如上文實施例2中那樣實施。通過在不添加適體的時(參見圖11，列1：AAB 1:50)和添加本發(fā)明適體時記錄新生心肌細(xì)胞搏動率的增加，監(jiān)測β1-腎上腺素能受體AAB的活性。用本發(fā)明適體處理的全部樣品顯示在AAB與100nM相應(yīng)序列(分別是Seq.ID No 31至34、44和45)的適體預(yù)溫育后，AAB活性降低。

實施例11：

實施例11如上文實施例2中那樣實施。通過在不添加適體時(參見圖12，列1：AAB 1:50)和添加不是本發(fā)明的對照序列時記錄新生心肌細(xì)胞搏動率的增加，監(jiān)測β1-腎上腺素能受體AAB的活性。用對照序列處理的全部樣品顯示在AAB與100nM、400nM或1000nM相應(yīng)序列(分別是Seq.ID No 46:5'-ACCTCTCCTTCCTTCCTCTCCTCTCAAAAAGAGCT-3'、SEQ ID No 47:5'-TCCCATCTATTATTTTTCTTCTAATCATC-3'、SEQ ID No 48:5’-ATCTCATGAACGTAAAGCCATTCAAACG-3’、SEQ ID No 49:5’-ACACTAGTAGCCACACTGAG-3’、SEQ ID No 50:5’-CCTGCCCCCTAAA-3’)的對照預(yù)溫育后，AAB活性不受影響。

實施例12：

實施例12如上文實施例2中那樣實施。通過在不添加適體時(參見圖13，列1：AAB 1:50)和添加100nM本發(fā)明的SEQ ID No:12的適體時記錄新生心肌細(xì)胞搏動率的增加，監(jiān)測從患有抑郁或查加斯心肌病的患者(圖13中從左至右)分離的β1-腎上腺素能受體AAB的活性。用本發(fā)明適體處理的樣品顯示與尚未添加適體的對照樣品相比，在AAB與100nM SEQ ID No:12預(yù)溫育后，AAB活性降低。

實施例13：

實施例13如上文實施例12中那樣實施，其中在這個實施例中，監(jiān)測在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭受青光眼、精神分裂癥、查加斯心肌病、溶血性尿毒癥綜合征(EHEC)或阿爾茨海默病的患者(圖14中從左至右)分離的β2-腎上腺素能受體AAB的活性。

實施例14：

實施例14如上文實施例12中那樣實施，其中在這個實施例中，監(jiān)測在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭受脫發(fā)、腎同種異體移植排異或腎病下高血壓的患者(圖15中從左至右)分離的AT1AAB的活性。

實施例15：

實施例15如上文實施例12中那樣實施，其中在這個實施例中，監(jiān)測在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭受肺動脈高血壓、雷諾氏病、心絞痛或腎病下高血壓的患者(圖16中從左至右)分離的ETA AAB的活性。

實施例16：

實施例16如上文實施例12中那樣實施，其中在這個實施例中，監(jiān)測在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭受肺動脈高血壓、化療、多發(fā)性硬化癥、脫發(fā)、斑禿、溶血性尿毒癥綜合征(EHEC)、舍格倫綜合征、阿爾茨海默病、神經(jīng)性皮炎、I型糖尿病或銀屑癬的患者(圖17中從左至右)分離的α1AAB的活性。

實施例17：

實施例17如上文實施例12中那樣實施，其中在這個實施例中，監(jiān)測在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭受雷諾氏病、心絞痛或舍格倫綜合征的患者(圖18中從左至右)分離的PAR AAB的活性。

實施例18：

實施例18如上文實施例12中那樣實施，其中在這個實施例中，監(jiān)測在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭受化療、多發(fā)性硬化癥或I型糖尿病的患者(圖19中從左至右)分離的MAS AAB的活性。

實施例19：

實施例19如上文實施例12中那樣實施，其中在這個實施例中，監(jiān)測在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭受抑郁、精神分裂癥或偏頭痛/帕金森病的患者(圖20中從左至右)分離的5HT4AAB的活性。

實施例20：

實施例20如上文實施例12中那樣實施，其中在這個實施例中，監(jiān)測在100nM SEQ ID No.:12的本發(fā)明適體不存在或存在下，從遭受查加斯心肌病、斑禿、偏頭痛/帕金森病或舍格倫綜合征的患者(圖21中從左至右)分離的M2AAB的活性。

序列表

<110> 柏林制藥控股公司

<120> 用于自體抗體相關(guān)疾病的適體

<130> 7161-X-29454WO

<150> EP14179715.9

<151> 2014-08-04

<160> 50

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 1

gttgtttggg gtgg 14

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 2

gttgtttggg gtggt 15

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 3

ggttggggtg ggtggggtgg gtggg 25

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 4

tttggtggtg gtggttgtgg tggtggtg 28

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 5

tttggtggtg gtggttgtgg tggtggtgg 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 6

tttggtggtg gtggttttgg tggtggtgg 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 7

tttggtggtg gtggtggtgg tggtggtgg 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 8

tttggtggtg gtggtttggg tggtggtgg 29

<210> 9

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 9

tggtggtggt ggt 13

<210> 10

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 10

ggtggtggtg g 11

<210> 11

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 11

ggtggttgtg gtgg 14

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 12

ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26

<210> 13

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 13

ggtggtggtg gttgtggtgg tggtggttgt ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 56

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 14

ggtggttgtg gtggttgtgg tggttgtggt gg 32

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 15

tttggtggtg gtggttgtgg tggtggtggt tt 32

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 16

ggtggtggtg ttgtggtggt ggtggttt 28

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 17

tttggtggtg gtggtgtggt ggtggtgg 28

<210> 18

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 18

tggtggtggt 10

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 19

tcgagaaaaa ctctcctctc cttccttcct ctcca 35

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 20

ttagggttag ggttagggtt aggg 24

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 21

gactgtaccg aggtgcaagt actcta 26

<210> 22

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 22

ggttggtgtg gttgg 15

<210> 23

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 23

ggttggtgtg gt 12

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 24

cgcctaggtt gggtagggtg gtggcg 26

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 25

gcggtggtgg gatgggttgg atccgc 26

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 26

gggtcgggat ctagggtcag g 21

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 27

ggtgggtcgg tagggttt 18

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 28

ttggctggat cggacggt 18

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 29

ggtcgggttc ggtggtta 18

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 30

gggatcggtt cggtaggtgg gtgggttgg 29

<210> 31

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 31

ggccggcgcg gccgg 15

<210> 32

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 32

ggaaggatcg gaagg 15

<210> 33

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 33

ggtaggctcg gtagg 15

<210> 34

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 34

ggatggttag gatgg 15

<210> 35

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 35

ccgtcggtcc gttcggtatt tttttctggg tggctgagga tcg 43

<210> 36

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 36

gggttggtcc gttgggtatt tttttatggg ttgcctggtt ggg 43

<210> 37

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 37

tcccatcggg tagggttatt tgggttctgg gtggctgagg atcgatc 47

<210> 38

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 38

tggcggtggt 10

<210> 39

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 39

tggaggtgga 10

<210> 40

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 40

aggtggtgga 10

<210> 41

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 41

aggtggcgga 10

<210> 42

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 42

gtggtggtgg tgttggtggt ggtggg 26

<210> 43

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 43

tgggttgggt tgttgttgtt gggttgggt 29

<210> 44

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 44

ggtggtggtg gtggttggtt tttggttggt ggtggtggtg g 41

<210> 45

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 適體序列

<400> 45

ctggggttgg gtttggtttt gttttggttt gggttggggt c 41

<210> 46

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對照序列

<400> 46

acctctcctt ccttcctctc ctctcaaaaa gagct 35

<210> 47

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對照序列

<400> 47

tcccatctat tatttttctt ctaatcatc 29

<210> 48

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對照序列

<400> 48

atctcatgaa cgtaaagcca ttcaaacg 28

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對照序列

<400> 49

acactagtag ccacactgag 20

<210> 50

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對照序列

<400> 50

cctgccccct aaa 13