發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及原樣使用的生物催化劑，使用生物催化劑還原底物的方法和包含該生物催化劑的試劑盒。

背景

在有機(jī)合成中酶(生物催化劑)的使用為金屬催化劑的使用提供了更為生態(tài)上可持續(xù)的替代方案，以及在催化的反應(yīng)中允許高程度的化學(xué)、區(qū)位和/或?qū)τ尺x擇性。

已經(jīng)使用“oldyellowenzyme”家族的烯還原酶描述了用于烯烴衍生物的酶促還原的方法。例如，us2010/0035315描述了在來自枯草芽孢桿菌的酶yqjm和來自番茄植物的酶opr1和opr3的存在下的底物的還原，其中所述底物是濃度為5mm的烯烴衍生物。

發(fā)明概述

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以有利地使用本文所述的催化劑進(jìn)行還原反應(yīng)，特別是不飽和碳-碳鍵的還原。具體地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于其對(duì)高底物濃度的耐受性，本文所述的催化劑特別可用于工業(yè)反應(yīng)中的應(yīng)用。

在一般方面，本發(fā)明提供了本文所述的催化劑作為催化劑(例如用于催化還原反應(yīng))的用途和使用本文所述的催化劑進(jìn)行還原反應(yīng)的方法。

在第一個(gè)開發(fā)中，本發(fā)明提供了本文所述的催化劑用于催化還原反應(yīng)的用途，其中底物濃度是高的。例如，本發(fā)明提供了催化劑用于催化還原反應(yīng)的用途，其中底物濃度為至少50mm，至少100mm，至少200mm，至少300mm或至少500mm。

在本發(fā)明的第一方面，提供了催化劑用于催化還原反應(yīng)的用途，其中所述催化劑是包含與seqidno：1具有至少50％同一性的氨基酸序列的多肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了催化劑用于催化還原反應(yīng)的用途，其中所述催化劑是包含與seqidno：1具有至少50％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中底物濃度為至少10mm，例如至少100mm，例如至少200mm或至少500mm。該用途可以包括使底物與催化劑接觸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了催化劑用于催化還原反應(yīng)的用途，其中所述催化劑是包含與seqidno：1具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中底物濃度為至少50mm。該用途可以包括使底物與催化劑接觸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了催化劑用于催化還原反應(yīng)的用途，其中所述催化劑是包含與seqidno：7具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中底物濃度為至少50mm。該用途可以包括使底物與催化劑接觸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了催化劑用于催化還原反應(yīng)的用途，其中所述催化劑是包含與seqidno：9具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中底物濃度為至少50mm。該用途可以包括使底物與催化劑接觸。

在第二個(gè)開發(fā)中，本發(fā)明提供了本文所述的催化劑在還原底物的方法中的用途，其中底物濃度是高的。例如，本發(fā)明提供了催化劑在還原底物的方法中的用途，其中底物濃度為至少50mm，至少100mm，至少200mm，至少300mm或至少500mm。

在本發(fā)明的第二方面，提供了催化劑在還原底物的方法中的用途，所述方法包括使底物與催化劑接觸，其中所述催化劑是包含與seqidno：1具有至少50％同一性的氨基酸序列的多肽。還提供了用于還原底物的方法，所述方法包括使底物與催化劑接觸，其中所述催化劑是包含與seqidno：1具有至少50％同一性的氨基酸序列的多肽。還提供了催化劑在還原底物的方法中的用途，所述方法包括使底物與催化劑接觸，其中所述催化劑是包含與seqidno：1具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽。還提供了用于還原底物的方法，所述方法包括使底物與催化劑接觸，其中所述催化劑是包含與seqidno：1具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽。所述方法可任選地包括在共底物的存在下使底物與催化劑接觸，在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了催化劑在還原底物的方法中的用途，所述方法包括使底物與催化劑接觸，其中所述催化劑是包含與seqidno：1具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在所述方法中，底物濃度為至少50mm。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了催化劑在還原底物的方法中的用途，所述方法包括使底物與催化劑接觸，其中所述催化劑是包含與seqidno：7具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在所述方法中，底物濃度為至少50mm。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了催化劑在還原底物的方法中的用途，所述方法包括使底物與催化劑接觸，其中所述催化劑是包含與seqidno：9具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽，并且其中在所述方法中，底物濃度為至少50mm。

在一個(gè)實(shí)施方案中，底物包含活化的乙烯基，例如位于酰基、羧基、酰氧基、硝基、酰基氨基或腈基的α、β位的乙烯基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，底物包含活化的乙烯基，例如位于?；?、羧基、酰氧基、硝基或?；被摩?、β位的乙烯基。

本發(fā)明還提供了本文所述的催化劑、編碼該催化劑的核酸、含有編碼該催化劑的核酸的宿主細(xì)胞、表達(dá)該催化劑的宿主細(xì)胞、用于產(chǎn)生如本文所述的催化劑的方法、以及包含如本文所述的催化劑的催化劑制劑。本發(fā)明還提供了包含任選與一種或多種另外的催化劑一起的催化劑的試劑盒。

附圖概述

圖1顯示了使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的催化劑，一系列底物(示出的)至其還原形式(未示出)的轉(zhuǎn)化百分比隨時(shí)間(小時(shí))過去的變化。

圖2顯示了使用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的催化劑，在不同的底物濃度下，一系列底物(示出的)至其還原形式(未示出)的轉(zhuǎn)化百分比隨時(shí)間(小時(shí))過去的變化。每個(gè)底物以50mm(菱形)、100mm(正方形)和300mm(三角形)使用。

圖3顯示了使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的催化劑，隨著反應(yīng)介質(zhì)的ph變化，催化劑活性(u/mg)的變化。使用底物檸檬醛。

圖4顯示了使用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的催化劑，隨著反應(yīng)溫度(℃)的變化，催化劑活性(u/mg)的變化。使用底物檸檬醛。

圖5顯示了使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的催化劑，在不同反應(yīng)溫度下殘留活性(u/mg)隨時(shí)間(小時(shí))的變化。反應(yīng)在30℃(菱形)、40℃(正方形)和50℃(三角形)下進(jìn)行。

圖6顯示了使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的催化劑，隨著反應(yīng)介質(zhì)共溶劑的變化，底物的轉(zhuǎn)化百分比(通過gc測(cè)定的峰面積％；淺色陰影)的變化和還原產(chǎn)物的ee(深色陰影)的變化。每種共溶劑以5體積％使用。

圖7顯示了使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的催化劑，隨著添加到反應(yīng)介質(zhì)共溶劑中的添加劑的變化，底物的轉(zhuǎn)化百分比(通過gc測(cè)定的峰面積％；淺色陰影)的變化和還原產(chǎn)物的ee(深色陰影)的變化。每種表面活性劑以0.1或0.3體積％使用。

圖8顯示了在不同底物濃度下底物的轉(zhuǎn)化百分比隨時(shí)間(小時(shí))的變化。底物以750mm(菱形)和1,500mm(正方形)使用。

圖9顯示了在不同底物濃度下產(chǎn)物濃度(mm)隨時(shí)間(小時(shí))的變化。底物以750mm(菱形)和1,500mm(正方形)使用。

圖10顯示了底物的轉(zhuǎn)化百分比隨時(shí)間(小時(shí))的變化。底物以730mm使用。

圖11顯示了產(chǎn)物濃度(mm)隨時(shí)間(小時(shí))的變化。底物以730mm使用。

圖12顯示了對(duì)于不同底物的ene-101(正方形)、ene-102(菱形)和ene-103(三角形)的轉(zhuǎn)化特征譜。

圖13a和13b顯示了對(duì)于不同濃度的不同底物的ene-101、ene-102和ene-103的轉(zhuǎn)化特征譜。

圖14顯示了對(duì)于ene-101、ene-102和ene-103的底物轉(zhuǎn)化百分比隨時(shí)間(小時(shí))的變化。對(duì)于ene-102(圓圈)使用300mm的底物，對(duì)于ene-101(實(shí)心三角形)、ene-102(正方形)和ene-103(空心三角形)使用750mm，對(duì)于ene-101(菱形)使用1.5m。

圖15顯示了對(duì)于ene-101、ene-102和ene-103的產(chǎn)物濃度(mm)隨時(shí)間(小時(shí))的變化。對(duì)于ene102(圓圈)使用300mm的底物，對(duì)于ene-101(實(shí)心三角形)、ene-102(正方形)和ene-103(空心三角形)使用750mm，對(duì)于ene-101(菱形)使用1.5m。

圖16顯示了對(duì)于ene-101(實(shí)心三角形)、ene-102(正方形)和ene-103(空心三角形)的底物轉(zhuǎn)化百分比隨時(shí)間(小時(shí))的變化。底物以730mm使用。

圖17顯示了對(duì)于ene-101(實(shí)心三角形)、ene-102(正方形)和ene-103(空心三角形)的產(chǎn)物濃度(mm)隨時(shí)間(小時(shí))的變化。底物以730mm使用。

圖18顯示了seqidno：1、7和9的clustalomega(1.2.1)多重序列比對(duì)。

序列

用于本發(fā)明的催化劑在本文中參考下面列出的序列識(shí)別號(hào)進(jìn)行描述。序列公開在序列表中。

seqidno：1：催化劑氨基酸序列(ene-101氨基酸序列)

seqidno：2：編碼催化劑的核酸序列(編碼seqidno：1)

seqidno：3：編碼催化劑的密碼子優(yōu)化的核酸序列(編碼seqidno：1)

seqidno：4：催化劑氨基酸序列，包含t7標(biāo)簽

seqidno：5：催化劑氨基酸序列，包含his標(biāo)簽和t7標(biāo)簽

seqidno：6：編碼包含his標(biāo)簽和t7標(biāo)簽的催化劑的核酸序列(編碼seqidno：5)

seqidno：7：催化劑氨基酸序列(ene-102氨基酸序列)

seqidno：8：編碼催化劑的核酸序列(編碼seqidno：7)

seqidno：9：催化劑氨基酸序列(ene-103氨基酸序列)

seqidno：10：編碼催化劑的核酸序列(編碼seqidno：9)

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了催化劑在底物反應(yīng)中的用途。如下文進(jìn)一步詳細(xì)描述的，所述催化劑適合用于還原反應(yīng)，例如活化的乙烯基的還原。所述催化劑允許以高產(chǎn)率(例如大于90％的轉(zhuǎn)化率)和/或以高的立體選擇性(例如大于99％的ee)產(chǎn)生反應(yīng)產(chǎn)物。所述催化劑可以在高底物濃度(例如50、100和300mm)下使用。實(shí)際上，本發(fā)明人已經(jīng)確定，催化劑可以在高達(dá)750和1,500mm的底物濃度下使用。

本發(fā)明提供了催化劑用于催化還原反應(yīng)的用途，其中底物濃度是高的。本發(fā)明提供了催化劑用于催化還原反應(yīng)的用途，其中底物濃度是高的，并且其中所述催化劑是包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與圖18中所示的氨基酸序列之一具有至少70％的同一性。

本發(fā)明提供了催化劑作為還原催化劑的用途，其中所述催化劑是包含與seqidno：1具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明提供了催化劑作為還原催化劑的用途，其中所述催化劑是包含與seqidno：7具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明提供了催化劑作為還原催化劑的用途，其中所述催化劑是包含與seqidno：9具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽。該用途可以是用作氫化催化劑。

本發(fā)明提供了催化劑作為還原催化劑的用途，其中所述催化劑是包含與seqidno：1具有至少95％同一性的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明提供了催化劑作為還原催化劑的用途，其中所述催化劑是包含與seqidno：7具有至少95％同一性的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明提供了催化劑作為還原催化劑的用途，其中所述催化劑是包含與seqidno：9具有至少95％同一性的氨基酸序列的多肽。該用途可以是用作氫化催化劑。

本發(fā)明提供了催化劑作為還原催化劑的用途，其中所述催化劑是包含seqidno：1的氨基酸序列或由seqidno：1的氨基酸序列組成的多肽。本發(fā)明提供了催化劑作為還原催化劑的用途，其中所述催化劑是包含seqidno：7的氨基酸序列或由seqidno：7的氨基酸序列組成的多肽。本發(fā)明提供了催化劑作為還原催化劑的用途，其中所述催化劑是包含seqidno：9的氨基酸序列或由seqidno：9的氨基酸序列組成的多肽。該用途可以是用作氫化催化劑。

本發(fā)明人已經(jīng)顯示，本文所述的催化劑能夠在高的底物濃度的存在下催化反應(yīng)。高底物或產(chǎn)物濃度對(duì)酶活性的抑制在酶促過程的按比例擴(kuò)大中通常是一個(gè)顯著的問題。因此，本文公開的催化劑、用途和方法對(duì)于工藝按比例擴(kuò)大是有利的。

本發(fā)明提供了本文所述的催化劑用于催化還原反應(yīng)的用途，其中底物濃度是高的。例如，本發(fā)明提供了催化劑用于催化還原反應(yīng)的用途，其中底物濃度為至少10mm，至少20mm，至少50mm，至少100mm，至少200mm，至少300mm，至少500mm或至少1500mm。所述催化劑是如本文所述的催化劑，例如催化劑可以是包含與seqidno：1、7或9中任一個(gè)具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽。所述催化劑可以是包含與seqidno：1、7或9中任一個(gè)具有至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了催化劑用于催化還原反應(yīng)的用途，其中底物濃度為至少50mm，并且其中所述催化劑是包含與seqidno：1、7或9中任一個(gè)具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了催化劑用于催化還原反應(yīng)的用途，其中底物濃度為至少100mm，并且其中所述催化劑是包含與seqidno：1、7或9中任一個(gè)具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了催化劑用于催化還原反應(yīng)的用途，其中底物濃度為至少50mm，并且其中所述催化劑為包含seqidno：1、7或9的氨基酸序列或由seqidno：1、7或9的氨基酸序列組成的多肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了催化劑用于催化還原反應(yīng)的用途，其中底物濃度為至少100mm，并且其中所述催化劑是包含seqidno：1、7或9的氨基酸序列或由seqidno：1、7或9的氨基酸序列組成的多肽。

催化劑-結(jié)構(gòu)

催化劑是多肽。多肽催化劑被稱為酶，因此催化劑是酶。酶也被稱為生物催化劑。更具體地，催化劑是還原酶。特別地，催化劑是能夠還原具有2-環(huán)-己烯-1-酮或2-環(huán)戊烯-1-酮組分的底物的還原酶。催化劑能夠使用nadh作為輔因子。催化劑是黃素依賴性酶。

催化劑可以是屬于被稱為“oldyellowenzymes”的組的酶。通過使用國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)的命名委員會(huì)(nc-iubmb)的命名法，催化劑是屬于1類的酶(氧化還原酶)。催化劑可以是屬于ec1.3的酶(該組包括作用于供體的ch-ch基團(tuán)的氧化還原酶)。催化劑可以是屬于ec1.3.1的酶(該組使用nadh或nadph作為輔因子)。催化劑可以是屬于ec1.3.1.42的酶(該組包括12-氧代植物二烯酸(oxophytodienoate)還原酶)。

催化劑可以是重組多肽，即，催化劑可以已經(jīng)從重組核酸序列表達(dá)，如下文更詳細(xì)討論的。催化劑可以從本文提供的核酸表達(dá)。催化劑可以從seqidno：3所示的核酸序列表達(dá)。

或者，催化劑可以是天然存在的多肽。催化劑可以是由細(xì)菌中的內(nèi)源(天然)基因表達(dá)的還原酶。

催化劑可以是由植物桿菌屬西瓜嗜酸菌(acidovoraxavenae)表達(dá)的酶。催化劑可以是由西瓜嗜酸菌(a.avenae)表達(dá)的還原酶。具體地，催化劑可以是由保藏為atcc19860的西瓜嗜酸菌(lucas等人，2011)表達(dá)的還原酶。由登錄號(hào)f0q098鑒定的多肽(uniprot數(shù)據(jù)庫中的變型1)是由通過登錄號(hào)adx43981.1鑒定的西瓜嗜酸菌核酸序列(變型1，embl-ebieuropeannucleotidearchive，lucas等人，2011)編碼的還原酶。

seqidno：1所示的氨基酸序列是f0q098的氨基酸序列。seqidno：2所示的核酸序列是adx43981.1的核酸序列。

催化劑可以是由紫色色桿菌(chromobacteriumviolaceum)表達(dá)的酶。催化劑可以是由紫色色桿菌(c.violaceum)表達(dá)的還原酶。具體地，催化劑可以是由保藏為atcc12472的紫色色桿菌表達(dá)的還原酶。由登錄號(hào)q7nsc5鑒定的多肽是由紫色色桿菌編碼的還原酶(變型1，uniprot，2003年12月15日發(fā)布)。

seqidno：7所示的氨基酸序列是q7nsc5的氨基酸序列。

催化劑可以是由芽孢桿菌屬物種表達(dá)的酶。催化劑可以是由芽孢桿菌屬物種表達(dá)的還原酶。具體地，催化劑可以是由芽孢桿菌屬的種nrrlb-14911表達(dá)的還原酶。由登錄號(hào)q2b6d5鑒定的多肽是由芽孢桿菌屬的種nrrlb-14911編碼的還原酶(變型1，uniprot，2006年4月4日發(fā)布)。

seqidno：9所示的氨基酸序列是q2b6d5的氨基酸序列。

圖18顯示seqidno：1、seqidno：7和seqidno：9的比對(duì)。在圖18和本申請(qǐng)的其它地方，seqidno：1的氨基酸序列被稱為ene-101，seqidno：7的氨基酸序列被稱為ene-102，seqidno：9的氨基酸序列被稱為ene-103。

催化劑可以是包含與seqidno：1具有至少約50％同一性的氨基酸序列的多肽。催化劑可以是包含與seqidno：1具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列的多肽。催化劑可以是包含與seqidno：1具有100％同一性的氨基酸序列的多肽，即，催化劑可以是包含如seqidno：1所示的氨基酸序列的多肽。

催化劑可以是包含與seqidno：7具有至少約50％同一性的氨基酸序列的多肽。催化劑可以是包含與seqidno：7具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列的多肽。催化劑可以是包含與seqidno：7具有100％同一性的氨基酸序列的多肽，即，催化劑可以是包含如seqidno：7所示的氨基酸序列的多肽。

催化劑可以是包含與seqidno：9具有至少約50％同一性的氨基酸序列的多肽。催化劑可以是包含與seqidno：9具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列的多肽。催化劑可以是包含與seqidno：9具有100％同一性的氨基酸序列的多肽，即，催化劑可以是包含如seqidno：9所示的氨基酸序列的多肽。

催化劑可以是基本上由與seqidno：1具有至少約50％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是基本上由與seqidno：1具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％，至少約95％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是基本上由與seqidno：1具有100％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽，即催化劑可以是基本上由seqidno：1所示的氨基酸序列組成的多肽。

催化劑可以是基本上由與seqidno：7具有至少約50％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是基本上由與seqidno：7具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％，至少約95％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是基本上由與seqidno：7具有100％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽，即催化劑可以是基本上由seqidno：7所示的氨基酸序列組成的多肽。

催化劑可以是基本上由與seqidno：9具有至少約50％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是基本上由與seqidno：9具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％，至少約95％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是基本上由與seqidno：9具有100％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽，即催化劑可以是基本上由seqidno：9所示的氨基酸序列組成的多肽。

催化劑可以是由與seqidno：1具有至少約50％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是由與seqidno：1具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是由與seqidno：1具有100％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽，即，催化劑可以是由seqidno：1所示的氨基酸序列組成的多肽。

催化劑可以是由與seqidno：7具有至少約50％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是由與seqidno：7具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是由與seqidno：7具有100％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽，即，催化劑可以是由seqidno：7所示的氨基酸序列組成的多肽。

催化劑可以是由與seqidno：9具有至少約50％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是由與seqidno：9具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％或至少約99％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是由與seqidno：9具有100％序列同一性的氨基酸序列組成的多肽，即，催化劑可以是由seqidno：9所示的氨基酸序列組成的多肽。

催化劑可以是包含與seqidno：1具有至少約50％相似性的氨基酸序列的多肽。序列相似性也被稱為序列同源性。催化劑可以是包含與seqidno：1具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％或至少約99％相似性的氨基酸序列的多肽。催化劑可以是包含與seqidno：1具有100％相似性的氨基酸序列的多肽。

催化劑可以是包含與seqidno：7具有至少約50％相似性的氨基酸序列的多肽。序列相似性也被稱為序列同源性。催化劑可以是包含與seqidno：7具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％或至少約99％相似性的氨基酸序列的多肽。催化劑可以是包含與seqidno：7具有100％相似性的氨基酸序列的多肽。

催化劑可以是包含與seqidno：9具有至少約50％相似性的氨基酸序列的多肽。序列相似性也被稱為序列同源性。催化劑可以是包含與seqidno：9具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％或至少約99％相似性的氨基酸序列的多肽。催化劑可以是包含與seqidno：9具有100％相似性的氨基酸序列的多肽。

催化劑可以是基本上由與seqidno：1具有至少約50％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是基本上由與seqidno：1具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％，或至少約99％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是基本上由與seqidno：1具有100％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。

催化劑可以是基本上由與seqidno：7具有至少約50％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是基本上由與seqidno：7具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％，或至少約99％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是基本上由與seqidno：7具有100％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。

催化劑可以是基本上由與seqidno：9具有至少約50％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是基本上由與seqidno：9具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％，或至少約99％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是基本上由與seqidno：9具有100％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。

催化劑可以是由與seqidno：1具有至少約50％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是由與seqidno：1具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％，或至少約99％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是由與seqidno：1具有100％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。

催化劑可以是由與seqidno：7具有至少約50％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是由與seqidno：7具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％，或至少約99％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是由與seqidno：7具有100％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。

催化劑可以是由與seqidno：9具有至少約50％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是由與seqidno：9具有至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％，或至少約99％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。催化劑可以是由與seqidno：9具有100％序列相似性的氨基酸序列組成的多肽。

催化劑可以是包含與如上所述的seqidno：1、seqidno：7或seqidno：9具有一定百分比序列同一性和/或相似性的氨基酸序列的多肽。所述多肽可以包含一個(gè)或多個(gè)另外的氨基酸。例如，多肽可以進(jìn)一步包含親和標(biāo)簽。親和標(biāo)簽可用于純化催化劑。這樣的親和標(biāo)簽是本領(lǐng)域公知的。例如，親和標(biāo)簽可以是用于使用鎳柱純化催化劑的多組氨酸標(biāo)簽(“his標(biāo)簽”)，其可以是用于使用包含抗-t7標(biāo)簽抗體的柱子純化蛋白質(zhì)的t7表位標(biāo)簽(t7標(biāo)簽)，或其可以是用于使用谷胱甘肽柱純化催化劑的谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽(“gst標(biāo)簽”)。親和標(biāo)簽可以位于多肽的n末端或c末端?；蛘呋蛄硗獾?，多肽還可以在n-末端包含前導(dǎo)序列。前導(dǎo)序列可用于在重組表達(dá)系統(tǒng)中指導(dǎo)多肽的分泌和/或細(xì)胞內(nèi)靶向。前導(dǎo)序列也被稱為信號(hào)肽，并且是本領(lǐng)域熟知的?；蛘呋蛄硗獾?，多肽可進(jìn)一步包含標(biāo)記，例如熒光標(biāo)記。

催化劑可以是包含與seqidno：1、seqidno：7或seqidno：9具有一定百分比序列同一性和/或相似性的氨基酸序列加上一個(gè)或多個(gè)另外的氨基酸的多肽，如上文所示的。催化劑可以是包含由seqidno：1、seqidno：7或seqidno：9所示的氨基酸序列組成的氨基酸序列的多肽。特別地，催化劑可以是包含由seqidno：1所示的氨基酸序列加上n端t7標(biāo)簽組成的氨基酸序列的多肽(例如seqidno：4所示的多肽)。催化劑可以是包含由seqidno：1所示的氨基酸序列加上n端his標(biāo)簽和t7標(biāo)簽組成的氨基酸序列的多肽(例如seqidno：5所示的多肽)。

催化劑-功能

所述催化劑是還原酶。所述催化劑能夠催化如本文所定義的底物的還原。具體地，所述催化劑能夠還原不飽和碳-碳雙鍵。特別地，所述催化劑可以能夠催化以下反應(yīng)圖解中所示的反應(yīng)：

其中-r¹至-r⁴中的每一個(gè)如下文進(jìn)一步詳細(xì)定義，例如在共底物的存在下。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，催化劑可以能夠催化以下反應(yīng)方案中所示的反應(yīng)：

其中-r¹至-r⁴中的每一個(gè)如下文進(jìn)一步詳細(xì)定義，例如在共底物的存在下。

可以通過光度法測(cè)量催化劑的活性，例如通過在作為輔因子的nadh的存在下進(jìn)行反應(yīng)并測(cè)量由nadh的氧化引起的在340nm處的吸光度的降低。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的催化劑是在nadh輔助因子的存在下在底物還原中具有活性的酶。

酶的量可以在其活性方面使用酶單位來表示。一個(gè)酶單位(u)是每分鐘轉(zhuǎn)化1微摩爾底物的酶的量。通常，使用參考底物測(cè)定催化劑制劑中存在的酶單位的數(shù)目，例如提供u/mg催化劑制劑。一個(gè)u的本發(fā)明的催化劑可以被定義為在22℃、ph7下每分鐘催化1μmolnadh至nad的催化劑的量，例如當(dāng)參考底物是1-辛烯-3-酮時(shí)。參考底物可以以0.98mm的濃度存在于測(cè)定混合物中。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，使用340nm處吸光度的變化來監(jiān)測(cè)nadh至nad的反應(yīng)。

以酶單元計(jì)的催化劑的活性可用于表示存在于催化劑制劑(其可提供如下所述的相對(duì)粗制形式的催化劑)中的酶的量。

(開特(katal)表示使用si基本單位的酶活性，其中一個(gè)開特是每秒轉(zhuǎn)化1摩爾底物的酶的量，因此1u等于1/60微開特)。

例如，催化劑制劑中存在的酶單位的數(shù)目可以根據(jù)下面所述的測(cè)定程序來確定。

將含有980μl溶液a(1-辛烯-3-酮在ph7.0的0.1m磷酸鉀緩沖液中的1mm溶液)的兩個(gè)比色皿在22℃下孵育至少5分鐘，以提供測(cè)試比色皿和空白比色皿。通過加入10μl溶液b(h2o中的15mmnadh)和10μl溶液c(h2o中的酶(例如凍干的酶)溶液；0.8mg催化劑制劑/mlh2o)并充分混合來在測(cè)試比色皿中起始反應(yīng)。將10μl溶液b和10μlh2o加入空白比色皿中并充分混合。測(cè)定在22℃在340nm處1分鐘內(nèi)的吸光度的降低。(如果降低不是線性的，則酶溶液(溶液c)應(yīng)用h2o稀釋。對(duì)于測(cè)試比色皿和空白比色皿均使用最大線性速率確定δa340min^-1。以u(píng)/mg催化劑制劑計(jì)的酶活性使用以下公式確定：

(δa340min^-1測(cè)試-δa340min^-1空白)/(6.2x0.01x0.8)

其中6.2x10³lmol^-1cm^-1是nadh在340nm處的摩爾消光系數(shù)，0.01是酶溶液的體積(ml)，0.8是催化劑制劑的量(mg/ml)(并且可以基于溶液c的任何稀釋度進(jìn)行調(diào)整)。

本文公開的催化劑是還原酶。它們可以催化3-甲基環(huán)己-2-烯-1-酮(表1的條目4至6中所示的底物)的還原，以產(chǎn)生具有70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或99.9％或更高的ee值的產(chǎn)物。這里，催化劑可以用于如本文所述的實(shí)驗(yàn)程序1或?qū)嶒?yàn)程序2中所示的方法。

其為包含與seqidno：1至少50％相同的氨基酸序列并且相對(duì)于seqidno：1的氨基酸序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、取代和/或缺失的多肽的催化劑可以催化3-甲基環(huán)己-2-烯-1-酮(表1的條目4至6中所示的底物)的還原以產(chǎn)生具有70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或99.9％或更高的ee值的產(chǎn)物。這里，催化劑可以用于如本文所述的實(shí)驗(yàn)程序1或?qū)嶒?yàn)程序2中所示的方法。

其為包含與seqidno：7至少50％相同的氨基酸序列并且相對(duì)于seqidno：7的氨基酸序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、取代和/或缺失的多肽的催化劑可以催化3-甲基環(huán)己-2-烯-1-酮(表1的條目4至6中所示的底物)的還原以產(chǎn)生具有70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或99.9％或更高的ee值的產(chǎn)物。這里，催化劑可以用于如本文所述的實(shí)驗(yàn)程序1或?qū)嶒?yàn)程序2中所示的方法。

本文公開的催化劑是還原酶。它們可以催化2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-酮(表1的條目7至9中所示的底物)的還原，以得到具有70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或99.9％或更高的轉(zhuǎn)化率的產(chǎn)物。這里，催化劑可以用于如本文實(shí)驗(yàn)部分所述的實(shí)驗(yàn)程序1或?qū)嶒?yàn)程序2中所示的方法。

其為包含與seqidno：1至少50％相同的氨基酸序列并且相對(duì)于seqidno：1的氨基酸序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、取代和/或缺失的多肽的催化劑可以催化2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-酮(表1的條目7至9所示的底物)的還原，以得到具有70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或99.9％或更高的轉(zhuǎn)化率的產(chǎn)物。這里，催化劑可以用于如本文實(shí)驗(yàn)部分所述的實(shí)驗(yàn)程序1或?qū)嶒?yàn)程序2中所示的方法。

其為包含與seqidno：7至少50％相同的氨基酸序列并且相對(duì)于seqidno：7的氨基酸序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、取代和/或缺失的多肽的催化劑可以催化2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-酮(表1的條目7至9所示的底物)的還原，以得到具有70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或99.9％或更高的轉(zhuǎn)化率的產(chǎn)物。這里，催化劑可以用于如本文實(shí)驗(yàn)部分所述的實(shí)驗(yàn)程序1或?qū)嶒?yàn)程序2中所示的方法。

其為包含與seqidno：9至少50％相同的氨基酸序列并且相對(duì)于seqidno：9的氨基酸序列包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、取代和/或缺失的多肽的催化劑可以催化2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-酮(表1的條目7至9所示的底物)的還原，以得到具有70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或99.9％或更高的轉(zhuǎn)化率的產(chǎn)物。這里，催化劑可以用于如本文實(shí)驗(yàn)部分所述的實(shí)驗(yàn)程序1或?qū)嶒?yàn)程序2中所示的方法。

本文所述的催化劑是具有高底物耐受性的還原酶。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0mm時(shí)，它們可以催化2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-酮(表1的條目7至9所示的底物)的還原，以得到具有70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或99.9％或更高的轉(zhuǎn)化率的產(chǎn)物。這里，催化劑可以用于如本文實(shí)驗(yàn)部分所述的實(shí)驗(yàn)程序1或?qū)嶒?yàn)程序2中所示的方法。反應(yīng)時(shí)間可以是18小時(shí)。在下文示出的“測(cè)試反應(yīng)條件”中催化劑可以能夠提供具有70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或99.9％或更高的轉(zhuǎn)化率的產(chǎn)物。

本文所述的催化劑是具有高底物耐受性的還原酶。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00mm時(shí)，它們可以催化2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-酮(表1的條目7至9中所示的底物)的還原，以得到具有70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或99.9％或更高的轉(zhuǎn)化率的產(chǎn)物。這里，催化劑可以用于如本文實(shí)驗(yàn)部分所述的實(shí)驗(yàn)程序1或?qū)嶒?yàn)程序2中所示的方法。反應(yīng)時(shí)間可以是18小時(shí)。在下文示出的“測(cè)試反應(yīng)條件”中催化劑可以能夠提供具有70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或99.9％或更高的轉(zhuǎn)化率的產(chǎn)物。

本文所述的催化劑是具有高底物耐受性的還原酶。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00mm時(shí)，它們可以催化2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-酮(表1的條目7至9中所示的底物)的還原，以得到具有70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或99.9％或更高的轉(zhuǎn)化率的產(chǎn)物。這里，催化劑可以用于如本文實(shí)驗(yàn)部分所述的實(shí)驗(yàn)程序1或?qū)嶒?yàn)程序2中所示的方法。反應(yīng)時(shí)間可以是18小時(shí)。在下文示出的“測(cè)試反應(yīng)條件”中催化劑可以能夠提供具有70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或99.9％或更高的轉(zhuǎn)化率的產(chǎn)物。

“測(cè)試反應(yīng)條件”可以是在35℃下的250mm磷酸鹽緩沖液ph7、1.1mmnad+、30mmd-葡萄糖、10u/mlgdh。反應(yīng)時(shí)間可以是3、6或18小時(shí)。

技術(shù)人員能夠?qū)⒉痪哂懈叩孜锬褪苄缘拇呋瘎┡c本公開內(nèi)容的催化劑(其具有高底物耐受性并因此適于本文所述的用途和方法)區(qū)分開。具有高底物耐受性的催化劑具有上文所述的功能性能力。相比之下，不具有高底物耐受性的催化劑不具有那些功能性能力。不具有高底物耐受性的催化劑可以在底物濃度為50mm時(shí)催化2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-酮(表1的條目7至9所示的底物)的還原，以得到具有20％或更低、10％或更低、5％或更低或2％或更低的轉(zhuǎn)化率。不具有高底物耐受性的催化劑可以在底物濃度為20mm或更低時(shí)催化2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-酮的還原以得到具有30％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或99.9％或更高的轉(zhuǎn)化率的產(chǎn)物，并且在底物濃度為50mm或更高時(shí)，得到具有30％或更低、20％或更低、10％或更低、5％或更低或2％或更低的轉(zhuǎn)化率的產(chǎn)物。不具有高底物耐受性的催化劑可以在底物濃度為20mm或更低時(shí)催化2-甲基環(huán)戊-2-烯-1-酮的還原，以得到具有30％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高、95％或更高、98％或更高、99％或更高或99.9％或更高的轉(zhuǎn)化率的產(chǎn)物，并且在底物濃度為300mm或更高時(shí)，得到具有30％或更低、20％或更低、10％或更低、5％或更低或2％或更低的轉(zhuǎn)化率的產(chǎn)物。這里，催化劑可以在如本文實(shí)驗(yàn)部分所述的實(shí)驗(yàn)程序1或?qū)嶒?yàn)程序2中所示的方法中或在上述“測(cè)試條件”下使用。反應(yīng)時(shí)間可以是18小時(shí)。

核酸

本文提供了編碼催化劑的核酸序列。核酸可以是dna或rna。核酸可以是單鏈或雙鏈的。催化劑可以由如seqidno：2中所示的核酸序列編碼，所述核酸序列是來自西瓜嗜酸菌基因組(lucas等人，2011)的核酸序列。seqidno：2的核酸序列編碼seqidno：1的氨基酸序列。因?yàn)檫z傳密碼是簡(jiǎn)并的(多于一個(gè)密碼子可以編碼一個(gè)氨基酸)，所以可以改變seqidno：2的核酸序列，以提供也編碼seqidno：1的氨基酸序列的其它核酸序列。

催化劑可以由如seqidno：8中所示的核酸序列編碼。seqidno：8的核酸序列編碼seqidno：7的氨基酸序列。因?yàn)檫z傳密碼是簡(jiǎn)并的(多于一個(gè)密碼子可以編碼一個(gè)氨基酸)，所以可以改變seqidno：8的核酸序列以提供也編碼seqidno：7的氨基酸序列的其它核酸序列。

催化劑可以由如seqidno：10所示的核酸序列編碼。seqidno：10的核酸序列編碼seqidno：9的氨基酸序列。因?yàn)檫z傳密碼是簡(jiǎn)并的(多于一個(gè)密碼子可以編碼一個(gè)氨基酸)，所以可以改變seqidno：10的核酸序列，以提供也編碼seqidno：9的氨基酸序列的其它核酸序列。

可將編碼催化劑的核酸序列引入宿主細(xì)胞中，以提供表達(dá)催化劑的重組宿主細(xì)胞。可以通過提供表達(dá)催化劑的宿主細(xì)胞在細(xì)胞中提供催化劑。可以通過提供表達(dá)催化劑的宿主細(xì)胞、在宿主細(xì)胞中表達(dá)催化劑并分離催化劑，來以分離的形式提供催化劑。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如大腸桿菌(escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)或假單胞菌(pseudomonas)物種。宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞例如釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如hela細(xì)胞或cho細(xì)胞。

可以優(yōu)化編碼催化劑的核酸序列以在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)。因?yàn)檫z傳密碼可以在生物體之間變化(密碼子偏好可以在生物體之間變化)，所以可以通過根據(jù)宿主細(xì)胞的密碼子偏好改變編碼多肽的核酸來改善特定宿主細(xì)胞中期望多肽的表達(dá)。為了改善催化劑在宿主細(xì)胞例如大腸桿菌中的表達(dá)，改變了西瓜嗜酸菌核酸序列seqidno：2以提供seqidno：3。因?yàn)檫z傳密碼是簡(jiǎn)并的，所以可以改變seqidno：3的核酸序列，以提供在宿主細(xì)胞例如大腸桿菌中也編碼催化劑的其它核酸序列。因?yàn)槊艽a子使用可以在生物體之間變化，所以可以改變seqidno：2和/或seqidno：3的核酸序列，以提供適于在其它宿主細(xì)胞中表達(dá)催化劑的其它核酸。因?yàn)榇呋瘎┛梢允莝eqidno：1的氨基酸序列的變體，所以編碼seqidno：1的變體的核酸序列可以適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)催化劑。類似地，可以改變seqidno：8和seqidno：10的核酸序列以提供適于在其它宿主細(xì)胞中表達(dá)催化劑的其它核酸，并且因?yàn)榇呋瘎┛梢允莝eqidno：7和seqidno：9的氨基酸序列的變體，所以編碼seqidno：7或seqidno：9的變體的核酸序列可適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)催化劑。

編碼催化劑的核酸序列可以包含與seqidno：3具有至少50％同一性的核酸序列。編碼催化劑的核酸序列可以包含與seqidno：3具有至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或至少約99％同一性的核酸序列。編碼催化劑的核酸序列可以包含與seqidno：3具有100％同一性的核酸序列。編碼催化劑的核酸序列可以包含如seqidno：3所示的核酸序列。

編碼催化劑的核酸序列可以包含與seqidno：8具有至少50％同一性的核酸序列。編碼催化劑的核酸序列可以包含與seqidno：8具有至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或至少約99％同一性的核酸序列。編碼催化劑的核酸序列可以包含與seqidno：8具有100％同一性的核酸序列。編碼催化劑的核酸序列可以包含如seqidno：8中所示的核酸序列。

編碼催化劑的核酸序列可以包含與seqidno：10具有至少50％同一性的核酸序列。編碼催化劑的核酸序列可以包含與seqidno：10具有至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或至少約99％同一性的核酸序列。編碼催化劑的核酸序列可以包含與seqidno：10具有100％同一性的核酸序列。編碼催化劑的核酸序列可以包含如seqidno：10所示的核酸序列。

編碼催化劑的核酸可以是分離的和/或純化的形式，或者不含或基本上不含與其天然締合的物質(zhì)，例如不含或基本上不含在西瓜嗜酸菌基因組中seqidno：2側(cè)翼的核酸序列。編碼催化劑的核酸可以是分離的和/或純化的形式，或者不含或基本上不含與其天然締合的物質(zhì)，例如不含或基本上不含在紫色色桿菌基因組中seqidno：8側(cè)翼的核酸序列。編碼催化劑的核酸可以是分離的和/或純化的形式，或者不含或基本上不含與其天然締合的物質(zhì)，例如不含或基本上不含在芽孢桿菌物種基因組中seqidno：10側(cè)翼的核酸序列。

通常，編碼催化劑的核酸可以通過修飾seqidno：2或seqidno：3獲得。重組技術(shù)諸如定點(diǎn)誘變可用于修飾seqidno：2或seqidno：3，以提供編碼催化劑的其它核酸序列。這樣的其它核酸序列可以編碼seqidno：1的變體。編碼催化劑的核酸可以通過修飾seqidno：8獲得。重組技術(shù)諸如定點(diǎn)誘變可用于修飾seqidno：8以提供編碼催化劑的其它核酸序列。這樣的其它核酸序列可以編碼seqidno：7的變體。編碼催化劑的核酸可以通過修飾seqidno：10獲得。重組技術(shù)諸如定點(diǎn)誘變可用于修飾seqidno：10以提供編碼催化劑的其它核酸序列。這樣的其它核酸序列可以編碼seqidno：9的變體。

本發(fā)明提供了包含如seqidno：3所示的核酸序列的核酸。本發(fā)明還提供了包含與seqidno：3具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列的核酸，其中所述核酸編碼催化劑。本發(fā)明提供了包含與seqidno：3具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列的核酸，其中所述核酸編碼包含與seqidno：1具有至少50％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽是還原酶。

本發(fā)明提供了包含seqidno：8所示的核酸序列的核酸。本發(fā)明還提供了包含與seqidno：8具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列的核酸，其中所述核酸編碼催化劑。本發(fā)明提供了包含與seqidno：8具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列的核酸，其中所述核酸編碼包含與seqidno：7具有至少50％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽是還原酶。

本發(fā)明提供了包含seqidno：10所示的核酸序列的核酸。本發(fā)明還提供了包含與seqidno：10具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列的核酸，其中所述核酸編碼催化劑。本發(fā)明提供了包含與seqidno：10具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列的核酸，其中所述核酸編碼包含與seqidno：9具有至少50％同一性的氨基酸序列的多肽，所述多肽是還原酶。

用于產(chǎn)生催化劑的載體、宿主細(xì)胞和方法

編碼催化劑的核酸可以并入可復(fù)制的載體中。載體可以用于在相容的宿主細(xì)胞中復(fù)制核酸。因此，編碼催化劑的核酸可以通過將編碼催化劑的核酸引入可復(fù)制的載體中、將載體引入相容性宿主細(xì)胞中并在導(dǎo)致載體復(fù)制的條件下生長(zhǎng)宿主細(xì)胞來產(chǎn)生。

編碼催化劑的核酸可以可操作地連接到能夠提供催化劑在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的控制序列。例如，編碼催化劑的核酸可以在表達(dá)載體中。例如，編碼催化劑的核酸可以在質(zhì)?；蛉旧w中。術(shù)語“可操作地連接”是指其中所描述的組分處于允許它們以其預(yù)期方式發(fā)揮功能的關(guān)系中的毗連?！翱刹僮鞯剡B接”編碼序列的控制序列以這樣的方式連接，其使得編碼序列的表達(dá)在與控制序列相容的條件下實(shí)現(xiàn)。

任選地，seqidno：2中的n末端ttg密碼子可以用起始密碼子如atg替換。

可以選擇或構(gòu)建合適的載體，其包含合適的調(diào)節(jié)序列，包括啟動(dòng)子序列、終止子片段、多聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因和其它適當(dāng)?shù)男蛄小Ｒ暻闆r而定，載體可以是質(zhì)粒、病毒例如噬菌體噬?；驐U狀病毒、粘粒、yac、bac或pac。載體包括基因治療載體，例如基于腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如hiv或mlv)的載體或α病毒載體。

載體可以具有復(fù)制起點(diǎn)、任選地用于表達(dá)催化劑的啟動(dòng)子和任選地啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)子。載體可以是低拷貝質(zhì)粒、中等拷貝質(zhì)?；蚋呖截愘|(zhì)粒。載體可以含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，例如在細(xì)菌質(zhì)粒的情況下的氨芐青霉素抗性基因或用于哺乳動(dòng)物載體的新霉素抗性基因。載體可以在體外使用，例如用于產(chǎn)生rna或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。用于在多種不同宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是公知的。

載體可以包含其它序列例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子以驅(qū)動(dòng)插入的核酸的表達(dá)。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以使得可以通過向宿主細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑來開始或增強(qiáng)催化劑的表達(dá)。例如，啟動(dòng)子可以基于lac操縱子，對(duì)于該操縱子iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)是誘導(dǎo)劑。或者，啟動(dòng)子可以是組成型活性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是強(qiáng)啟動(dòng)子。

載體可以包含其它核酸序列，以使得催化劑作為融合蛋白(例如包含催化劑和親和標(biāo)簽的融合蛋白)產(chǎn)生，和/或包含編碼前導(dǎo)序列的核酸序列，以使得在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的多肽從細(xì)胞分泌。

本文提供了宿主細(xì)胞，例如上述的宿主細(xì)胞，其可在使催化劑表達(dá)的條件下培養(yǎng)。催化劑可以在宿主細(xì)胞內(nèi)提供。以這種方式，催化劑可以在還原反應(yīng)中在體內(nèi)使用，即，催化劑可以用于細(xì)胞內(nèi)還原反應(yīng)?；蛘?，在催化劑的表達(dá)之后可以從宿主細(xì)胞中分離催化劑?？梢允褂秒娪竞?或色譜技術(shù)分離催化劑?？梢岳缤ㄟ^將催化劑表達(dá)為包含親和標(biāo)簽的融合蛋白并使用結(jié)合親和標(biāo)簽的試劑回收融合蛋白來分離催化劑。例如該試劑可以附著至瓊脂糖柱。可以在已分離蛋白質(zhì)后從其切割掉親和標(biāo)簽。

催化劑制劑

催化劑可以以純的或基本上純的形式提供。將純的或基本上純的形式的催化劑與天然伴隨蛋白質(zhì)的其它分子或細(xì)胞組分(例如核糖體，細(xì)胞膜組分)分離。

催化劑可以以相對(duì)粗的形式作為催化劑制劑提供，例如催化劑制劑可以是表達(dá)催化劑的重組細(xì)胞的裂解物或澄清的裂解物。催化劑制劑可以是表達(dá)催化劑的重組細(xì)胞的勻漿或糊劑。

催化劑可以包含在宿主細(xì)胞中。催化劑可以以游離形式或以固定化形式提供。固定化形式的催化劑可以附著至惰性載劑例如纖維素粉末或合成聚合物例如聚乙烯(lalondeandmargolin,2002)。

本文提供了產(chǎn)生催化劑的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼催化劑的核酸，并從宿主細(xì)胞中分離催化劑。該方法可以包括裂解宿主細(xì)胞以提供細(xì)胞裂解物，并且還可以包括移除宿主細(xì)胞碎片(例如通過離心)以提供澄清的細(xì)胞裂解物。裂解宿主細(xì)胞的步驟可以使用包含黃素單核苷酸(fmn)的裂解緩沖液，例如裂解緩沖液可以包含約1-50μmfmn、或約5-25μmfmn、或約20μmfmn。另外或備選地，裂解宿主細(xì)胞的步驟可使用含有mgso4的裂解緩沖液，例如裂解緩沖液可包含約1-50mmmgso4、約1-5mmmgso4或約5mmmgso4。裂解緩沖液可以包含fmn和mgso4。

可以從催化劑或催化劑制劑中除去水，以提供凍干形式的催化劑。催化劑可以作為凍干物提供。催化劑或催化劑制劑可以是冷凍的。

催化劑制劑中的催化劑的量可以表示為酶單位(u)/mg催化劑制劑，例如表示為酶單位/mg凍干物。

催化劑制劑中的催化劑的量可以為至少約0.25u/mg催化劑制劑，至少約1u/mg催化劑制劑或至少約3u/mg催化劑制劑(例如使用上文所述的測(cè)定方法測(cè)定的)。催化劑制劑中的催化劑的量可以是至多約5u/mg催化劑制劑，至多約10u/mg催化劑制劑，至多約20u/mg催化劑制劑或至多約50u/mg催化劑制劑(例如使用上文所述的測(cè)定方法測(cè)定的)。催化劑制劑可以是包含至少約0.25u/mg凍干物、至少約1u/mg凍干物或至少約3u/mg凍干物的凍干物(例如使用上文所述的測(cè)定方法測(cè)定的)。凍干物中的催化劑的量可以是至多約5u/mg凍干物，至多約10u/mg凍干物，至多約20u/mg凍干物或至多約50u/mg凍干物(例如使用上文所述的測(cè)定方法測(cè)定的)。

制劑中催化劑的量可以在選自上文給出的較高量和較低量的范圍內(nèi)，例如在1-20u/mg催化劑制劑的范圍內(nèi)。

本發(fā)明提供了包含如本文所定義的催化劑的催化劑制劑。催化劑制劑可以包含至少一定量的如上所定義的催化劑(以u(píng)催化劑/mg催化劑制劑定義的)。例如，催化劑制劑可以包含其為包含與seqidno：1具有至少約70％序列同一性的氨基酸的多肽的催化劑，其中催化劑制劑中的催化劑的量為至少0.25u/mg催化劑制劑。例如，催化劑制劑可以包含其為包含與seqidno：7具有至少約70％序列同一性的氨基酸的多肽的催化劑，其中催化劑制劑中的催化劑的量為至少0.25u/mg催化劑制劑。例如，催化劑制劑可以包含其為包含與seqidno：9具有至少約70％序列同一性的氨基酸的多肽的催化劑，其中催化劑制劑中的催化劑的量為至少0.25u/mg催化劑制劑。

相似性和序列同一性

氨基酸序列同一性和相似性和核酸序列同一性可以使用標(biāo)準(zhǔn)生物信息學(xué)軟件工具(例如可免費(fèi)獲得的emboss或blast軟件工具)測(cè)量。通常使用默認(rèn)參數(shù)。例如，embossneedle配對(duì)序列比對(duì)可用于確定氨基酸序列同一性。使用needleman-wunsch算法(j.mol.biol.(48)：444-453(1970))的embossneedle配對(duì)序列比對(duì)可以用于確定氨基酸序列相似性，例如使用默認(rèn)參數(shù)并使用blosum評(píng)分矩陣，例如blosum62評(píng)分矩陣。默認(rèn)參數(shù)可以與間隙生成罰分＝12和間隙擴(kuò)展罰分＝4一起使用。可以優(yōu)選使用gap，但是可以使用其它算法，例如blast或tblastn(其使用altschul等人(1990)j.mol.biol.215：405-410的方法)，fasta(其使用pearsonandlipman(1988)pnasusa85：2444-2448的方法)，或smith-waterman算法(smithandwaterman(1981)j.molbiol.147：195-197)，通常采用默認(rèn)參數(shù)。

如上所述，催化劑是與seqidno：1具有至少50％氨基酸序列同一性并且能夠催化底物的還原的多肽。與seqidno：1具有小于50％氨基酸序列同一性的催化劑能夠催化底物的還原，因此具有至少50％氨基酸序列同一性的許多多肽也能夠催化底物的還原。例如，被稱為來自枯草芽孢桿菌的yqjm(ec1.6.99.1，uniprot條目p54550)的酶與seqidno：1具有約30％的序列同一性，并且能夠還原某些

烯烴衍生物，由番茄oypr1基因編碼的酶(ec1.3.1.42，uniprotq9xg54)與seqidno：1具有約42％的序列同一性，并且能夠還原某些烯烴衍生物，以及由番茄oypr3基因編碼的酶(ec1.3.1.42，uniprotq9few9)與seqidno：1具有約42％序列同一性并且能夠還原某些烯烴衍生物(參見us2010/0035315，其通過引用整體并入

本文)。

其為包含與seqidno：1至少50％相同的氨基酸序列的多肽的催化劑可以包含相對(duì)于seqidno：1的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、取代和/或缺失。催化劑可以包含相對(duì)于seqidno：1的氨基酸序列的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸添加、取代和/或缺失。相對(duì)于seqidno：1的氨基酸序列，催化劑可以包含1-150、1-100、1-50、1-20或1-10個(gè)氨基酸添加、取代和/或缺失。

其為包含與seqidno：7至少50％相同的氨基酸序列的多肽的催化劑可以包含相對(duì)于seqidno：7的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、取代和/或缺失。相對(duì)于seqidno：7的氨基酸序列，催化劑可以包含一個(gè)或幾個(gè)氨基酸添加、取代和/或缺失。相對(duì)于seqidno：7的氨基酸序列，催化劑可以包含1-150、1-100、1-50、1-20或1-10個(gè)氨基酸添加、取代和/或缺失。

其為包含與seqidno：9至少50％相同的氨基酸序列的多肽的催化劑可以包含相對(duì)于seqidno：9的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、取代和/或缺失。催化劑可以包含相對(duì)于seqidno：9的氨基酸序列的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸添加、取代和/或缺失。相對(duì)于seqidno：9的氨基酸序列，催化劑可以包含1-150、1-100、1-50、1-20或1-10個(gè)氨基酸添加、取代和/或缺失。

本發(fā)明的催化劑可以是seqidno：1、7和9中任一個(gè)所示的多肽的變體。變體可以通過插入、添加、取代或缺失1個(gè)氨基酸、2、3、4、5-10、10-20、20-30、30-50、50-100或超過150個(gè)氨基酸而不同于seqidno：1、7和9中所示的序列。變體可以使用常規(guī)分子克隆方法制備。

技術(shù)人員知道如何制備這樣的變體并且意識(shí)到可能影響催化劑的功能性能力的因素。例如，技術(shù)人員理解具有相對(duì)少的氨基酸插入、添加、缺失和取代的變體比具有相對(duì)多的氨基酸取代的變體相對(duì)更可能保留seqidno：1、7和9中所示的催化劑的功能性。技術(shù)人員還理解具有一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸取代的變體比具有一個(gè)或多個(gè)非保守取代的變體更可能保留功能性。

seqidno：1、7和9的比對(duì)顯示在圖18中。關(guān)于如圖18中所示的seqidno：1、7和9之間的保守氨基酸(由*表示)、強(qiáng)相似氨基酸(由:表示)和弱相似氨基酸(由.表示)表明可能需要避免取代的氨基酸位置。不保守、或不相似或僅微弱相似的氨基酸位置可以更適于取代同時(shí)保留功能性。因此，技術(shù)人員能夠產(chǎn)生seqidno：所示多肽的變體。技術(shù)人員能夠使用例如本文所述的方法確定變體多肽是否適合用作根據(jù)本發(fā)明的催化劑。氨基酸取代可以是保守氨基酸取代，其中seqidno：1、seqidno：7或seqidno：9的氨基酸被具有相似特征的氨基酸取代。例如疏水氨基酸(例如leu)被另一疏水氨基酸(例如ile)取代。氨基酸和保守取代顯示在下表中。

用途

本發(fā)明的催化劑可以原樣使用，例如用作離體例如體外反應(yīng)中的催化劑。在此上下文中，體外反應(yīng)是指細(xì)胞外或無細(xì)胞反應(yīng)。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的催化劑具有在還原反應(yīng)中用作催化劑的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，還原反應(yīng)是不飽和鍵例如不飽和碳-碳鍵、例如乙烯鍵的還原。催化劑可以被認(rèn)為具有氫化活性或轉(zhuǎn)移氫化活性。因此，本發(fā)明的催化劑通常用于還原含烯基的化合物，例如以得到相應(yīng)的還原產(chǎn)物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的催化劑用作還原本文所述的底物例如式(i)化合物的催化劑。本發(fā)明的催化劑可以被稱為還原酶。因此，催化劑通常用于還原反應(yīng)并且更特別地用于氫化反應(yīng)。因此，催化劑可催化還原反應(yīng)，其形式上導(dǎo)致在碳-碳雙鍵(c＝c)上添加氫。通常，本文所述的還原反應(yīng)中的氫化物源由輔因子例如nadh提供。

在一個(gè)實(shí)施方案中，如上所述，本發(fā)明的催化劑在細(xì)胞內(nèi)提供，用于細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。

在一個(gè)方面，提供了seqidno：1的催化劑用作催化劑的用途，任選地與輔因子一起使用。在另一方面，提供了seqidno：7的催化劑用作催化劑的用途，任選地與輔因子一起使用。在另一方面，提供了seqidno：9的催化劑用作催化劑的用途，任選地與輔因子一起使用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，催化劑具有還原活性，例如氫化活性，例如碳-碳雙鍵(c＝c)的氫化。

在一個(gè)實(shí)施方案中，催化劑具有烯還原酶活性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的催化劑用于本文所述的方法中。

方法

一方面，本發(fā)明提供了一種合成方法，該方法包括在本發(fā)明的催化劑的存在下使底物反應(yīng)從而提供產(chǎn)物的步驟。該方法可以包括使底物與催化劑接觸。

該方法可以是還原，并因此在催化劑和還原劑的存在下還原底物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)是立體特異性反應(yīng)。

任選地，該方法還包括分離產(chǎn)物的步驟，例如將產(chǎn)物與催化劑和任何剩余的底物分離。分離步驟可以包括將產(chǎn)物與副產(chǎn)物(例如作為產(chǎn)物的立體異構(gòu)體(包括對(duì)映異構(gòu)體)的那些產(chǎn)物)分離。分離步驟還可以包括將產(chǎn)物與反應(yīng)介質(zhì)分離的步驟。

在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括分離催化劑的步驟。根據(jù)需要，催化劑隨后可以在本發(fā)明的另一種方法中重復(fù)使用。

本發(fā)明的催化劑可以允許以高產(chǎn)率制備產(chǎn)物，例如還原的產(chǎn)物。工作實(shí)施例表明，催化劑可用于還原反應(yīng)，以得到產(chǎn)率為50％或更高，例如60％或更高的產(chǎn)物。

本發(fā)明的方法可以在水中進(jìn)行，通常在另一種溶劑(“共溶劑”)存在的情況下。反應(yīng)介質(zhì)可以是單相或雙相的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，共溶劑以至多10體積％、至多15體積％或至多25體積％的量存在。

在一個(gè)實(shí)施方案中，共溶劑以至少0.5體積％，至少1體積％或至少2體積％的量存在。

在一個(gè)實(shí)施方案中，共溶劑以約5體積％的量存在。

共溶劑可以選自由甲苯，二甲苯，乙醇，異丙醇，乙醚，四氫呋喃，2-甲基四氫呋喃，乙酸乙酯，乙酸異丙酯，乙腈，甲基叔丁基醚(mtbe)，異丙醇，二甲基甲酰胺(dmf)和二甲基亞砜(dmso)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，共溶劑是甲苯。

反應(yīng)可以在其中水以非常低的量(例如相對(duì)于溶劑的總體積為5v/v％或更低)存在的反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行。這是不太優(yōu)選的。

反應(yīng)可以在環(huán)境溫度或升高的溫度下進(jìn)行。

反應(yīng)可以在至多35℃、至多40℃、至多45℃、至多50℃或至多55℃的溫度下進(jìn)行。如所預(yù)期的，非常高和持續(xù)的溫度與酶活性的喪失相關(guān)。

反應(yīng)可以在至少30℃、至少25℃、至少20℃、至少15℃或至少0℃的溫度下進(jìn)行。

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)催化劑在選自上文給出的較高量和較低量的范圍內(nèi)(例如在20至45℃的范圍內(nèi)或在20至35℃的范圍內(nèi))的溫度下使用時(shí)，獲得最佳結(jié)果。

在水性介質(zhì)中的反應(yīng)可以在有限范圍內(nèi)的ph下進(jìn)行。

在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)介質(zhì)的ph為至多8，至多9或至多10。

在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)介質(zhì)的ph為至少5，至少6，至少6.5或至少7。

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)催化劑在選自上文給出的較高量和較低量的范圍內(nèi)(例如在ph6.5至8的范圍內(nèi))的ph下使用時(shí)，獲得最佳結(jié)果。

反應(yīng)介質(zhì)的ph可以指反應(yīng)開始時(shí)反應(yīng)介質(zhì)的ph。另外或可選擇地，ph可以指反應(yīng)的反應(yīng)終點(diǎn)的ph。

可以在反應(yīng)介質(zhì)中提供緩沖液以將反應(yīng)介質(zhì)的ph保持在選自上面給出的較高值和較低值的范圍內(nèi)。

本發(fā)明人已經(jīng)確定，本發(fā)明的催化劑可以在高底物濃度下使用。工作實(shí)施例證明了催化劑在300mm、750mm和1,500mm的底物濃度下的使用。相反，us2010/0035315中的工作證明生物催化劑僅在至多5mm的底物濃度下使用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，底物以至少0.1mm，至少0.5mm，至少1mm，至少5mm，至少10mm，至少50mm，至少100mm，至少200mm，至少300mm，至少400mm，至少500mm，至少750mm，至少1,000mm，至少1,500mm，至少2,000mm，至少2,500mm或至少3,000mm的濃度存在。

在一個(gè)實(shí)施方案中，底物以至多50mm，至多100mm，至多200mm，至多300mm，至多500mm，至多1,000mm，至多1,500mm，至多2,000，至多2,500mm，至多3,000mm，至多3,500mm，至多4,000mm，至多4,500mm或至多5,000mm的濃度存在。

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)孜镆栽谶x自上面給出的較高量和較低量的范圍內(nèi)(例如在5mm至1,500mm的范圍內(nèi))的濃度使用時(shí)，獲得最佳結(jié)果。

底物濃度可以在50mm至5,000mm，50mm至3,000mm，50mm至1,500mm，50mm至1,000mm，50mm至500mm，100mm至5,000mm，100mm至3,000mm，100mm至1,500mm，100mm至1,000mm，500mm至5,000mm，500mm至3,000mm，500mm至1,500mm或500mm至1,000mm的范圍內(nèi)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，底物以至少10mg/l，至少50mg/l，至少100mg/l，至少500mg/l，至少1,000mg/l，至少5g/l，至少10g/l，至少20g/l，至少30g/l，至少40g/l，至少50g/l，至少75g/l，至少100g/l，至少150g/l，至少200g/l，至少250g/l或至少300g/l的濃度存在。

在一個(gè)實(shí)施方案中，底物以至多5g/l，至多10g/l，至多20g/l，至多30g/l，至多50g/l，至多100l，至多150g/l，至多200g/l，至多250g/l，至多300g/l，至多350g/l，至多400g/l，至多450g/l，或至多500g/l的濃度存在。

反應(yīng)中所需的催化劑制劑的量相對(duì)于存在的底物量可以是小的，并且就其在反應(yīng)介質(zhì)中的濃度而言是低的。例如，可以使用0.4g/l的催化劑制劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，催化劑制劑可以以至多5g/l，至多10g/l，至多50g/l，至多100g/l的濃度存在。

在一個(gè)實(shí)施方案中，催化劑制劑可以以至少0.05g/l，至少0.10g/l，至少0.25g/l，至少0.5g/l或至少1.0g/l的濃度存在。

在一個(gè)實(shí)施方案中，催化劑制劑以約0.4g/l存在。

在一個(gè)實(shí)施方案中，催化劑制劑以約0.4g/l存在。

如上所述，酶的量可以在其活性方面使用酶單位u來表示。u可以使用上文所述的測(cè)定來確定。類似地，酶的濃度可以表示為u/ml。

在一個(gè)實(shí)施方案中，酶可以以至多500u/ml，至多300u/ml，至多200u/ml或至多150u/ml的濃度存在。在一些實(shí)施方案中，酶可以以至多50u/ml的濃度存在。

在一個(gè)實(shí)施方案中，酶可以以至少1u/ml，至少5u/ml，至少10u/ml或至少20um/l的濃度存在。在一些實(shí)施方案中，酶可以以至少50u/ml的濃度存在。

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶以在選自上文給出的較高量和較低量的范圍內(nèi)的量使用時(shí)，獲得最佳結(jié)果。

反應(yīng)中所需的酶的量相對(duì)于存在的底物的量可以是小的。例如，每mmol底物可存在約70u的酶，或每mmol底物可存在約140u的酶。例如，每mmol底物可存在1250u的酶。

在一個(gè)實(shí)施方案中，酶以每mmol底物至多5000u，每mmol底物至多2500u，每mmol底物至多2000u，或每mmol底物至多1500u的量存在。在一些實(shí)施方案中，酶以每mmol底物至多500u，每mmol底物至多300u，或每mmol底物至多200u的量存在。

在一個(gè)實(shí)施方案中，酶以每mmol底物至少1u，每mmol底物至少10u，每mmol底物至少20u，每mmol底物至少40u，或每mmol底物至少60u的量存在。

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶以在選自上文給出的較高量和較低量的范圍內(nèi)的量使用時(shí)，獲得最佳結(jié)果。

反應(yīng)可以進(jìn)行足夠的時(shí)間以允許產(chǎn)生所需量的材料。隨后，可以加工(workup)反應(yīng)混合物以分離產(chǎn)物材料。

在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)時(shí)間為至少1小時(shí)，至少2小時(shí)或至少3小時(shí)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)時(shí)間為至多18小時(shí)，至多24小時(shí)，至多36小時(shí)，至多48小時(shí)，至多72小時(shí)，至多96小時(shí)或至多120小時(shí)。

反應(yīng)的結(jié)束可以是催化劑和產(chǎn)物的分離時(shí)。

當(dāng)所需產(chǎn)物的產(chǎn)率不隨時(shí)間顯著增加時(shí)，可以認(rèn)為反應(yīng)完成。

在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)在體外進(jìn)行。

反應(yīng)可以連續(xù)或不連續(xù)進(jìn)行。

底物

本發(fā)明的催化劑可以原樣用于底物的反應(yīng)中。底物在催化劑的存在下反應(yīng)以產(chǎn)生產(chǎn)生。底物可與共底物反應(yīng)以產(chǎn)生產(chǎn)物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，底物是具有可以被還原的官能性的化合物。因此，反應(yīng)的產(chǎn)物是還原產(chǎn)物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，底物具有乙烯鍵(c＝c)。反應(yīng)的產(chǎn)物可以是具有還原的乙烯鍵的底物，例如-ch-ch-。

在一個(gè)實(shí)施方案中，乙烯鍵是活化的乙烯鍵。因此，乙烯鍵可以位于活化基團(tuán)的α、β位?；罨鶊F(tuán)的實(shí)例包括酰基、羧基、酰氧基、硝基、?；被碗婊Ｒ虼?，底物可以具有α,β-不飽和?；?、酰氧基、硝基、酰基氨基或腈基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，乙烯鍵是活化的乙烯鍵。因此，乙烯鍵可以位于活化基團(tuán)的α、β位?；罨鶊F(tuán)的實(shí)例包括?；Ⅳ然?、酰氧基、硝基或?；被Ｒ虼耍孜锟梢跃哂笑?β-不飽和?；?、酰氧基、硝基或?；被?/p>

在一個(gè)實(shí)施方案中，底物是式(i)的化合物：

其中：

-r¹獨(dú)立地選自?；?、羧基、酰氧基、硝基、酰基氨基和腈；

-r²獨(dú)立地選自氫、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、氨基、羥基和氧基，并且-r²任選地進(jìn)一步選自酰氨基或腈；

-r³是氫、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、氨基、羥基、氧基、羧基、酰氧基、腈和?；被?，

或其中-r¹是?；?、酰氧基或?；被?r¹和-r²可以形成含有?；ⅤＱ趸蝓；被沫h(huán)，或者-r¹和-r³可以形成含有酰基、酰氧基或?；被沫h(huán)；和

-r⁴是氫、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、氨基、羥基、氧基、羧基、酰氧基、腈和酰基氨基，

并且烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基和芳基各自任選被取代；

或者-r²和-r⁴可一起形成未取代或取代的環(huán)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，r¹獨(dú)立地選自?；?、羧基、酰氧基、硝基和?；被?。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r¹是酰基或酰氧基。本發(fā)明人已經(jīng)確定，在本發(fā)明的催化劑的存在下，具有存在于-r¹的這樣的基團(tuán)的底物以良好的產(chǎn)率和/或以高對(duì)映體過量還原。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r¹是?；被?。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r²是氫。在該實(shí)施方案中，-r³和-r⁴可以不同。在這種情況下，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)還原反應(yīng)提供了具有特別高的對(duì)映體過量的產(chǎn)物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r²是未取代的或取代的烷基，例如未取代的烷基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r²與-r⁴和它們連接的碳原子一起形成未取代的或取代的碳環(huán)，例如未取代的或取代的碳環(huán)。例如，環(huán)可以是環(huán)戊烯或環(huán)己烯環(huán)，例如未取代或取代的環(huán)己烯環(huán)。該環(huán)可以任選地包括雜原子。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r²是酰氨基，例如當(dāng)-r¹是酰氧基時(shí)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)-r¹是酰基、酰氧基或?；被鶗r(shí)，-r¹和-r²可以形成含有酰基、酰氧基或酰基氨基的環(huán)。在該實(shí)施方案中，碳-碳雙鍵是在環(huán)外的。該環(huán)可以具有4-7個(gè)環(huán)原子，例如5或6個(gè)環(huán)原子。當(dāng)-r¹是酰氧基時(shí)，一個(gè)環(huán)原子是氧原子，并且當(dāng)-r¹是酰基氨基時(shí)，一個(gè)環(huán)原子是氮原子。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r¹和-r²與它們連接的碳原子(α碳)一起形成環(huán)戊烯酮或環(huán)己烯酮環(huán)。這里，-r¹是?；?/p>

當(dāng)-r¹和-r²形成環(huán)時(shí)，該環(huán)任選被取代。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r³選自氫，和未取代或取代的烷基、環(huán)烷基、烯基和炔基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r³是氫。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r³選自未取代或取代的烷基、環(huán)烷基、烯基和炔基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r³選自未取代或取代的烷基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)-r¹是?；?、酰氧基或?；被鶗r(shí)，-r³和-r¹形成含有?；ⅤＱ趸蝓；被奈慈〈蛉〈沫h(huán)。該環(huán)可以具有4-7個(gè)環(huán)原子，例如5或6個(gè)環(huán)原子。例如，該環(huán)可以是環(huán)戊烯酮或環(huán)己烯酮環(huán)。

該環(huán)可以任選地包括雜原子。該環(huán)可以被提供為具有環(huán)碳原子上的氧代(＝o)取代基。氧代取代的碳環(huán)原子可以與?；被B接以形成環(huán)狀酰亞胺(-c(o)-nr-c(o)-)。例如在sye-4酶的存在下這樣的結(jié)構(gòu)被顯示為活性底物(例如參見iqbal等人)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)-r¹包含?；鶗r(shí)，-r³和-r¹形成未取代或取代的環(huán)。

當(dāng)烯基或炔基存在于-r²、-r³和-r⁴中的任一個(gè)中時(shí)，其優(yōu)選不與位于基團(tuán)-r¹的α、β位的不飽和鍵共軛。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r⁴選自氫和未取代或取代的烷基、環(huán)烷基、烯基和炔基。在一個(gè)實(shí)施方案中，-r⁴是氫。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r²、-r³和-r⁴之一不是氫。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r²、-r³和-r⁴之一是氫。例如，-r²是氫或-r³是氫。

在一個(gè)實(shí)施方案中，r³和-r⁴是氫。

在一個(gè)實(shí)施方案中，底物不是12-氧代-順式-10,15-植物二烯酸酯(phytodienoate)。

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ene-103對(duì)底物3-甲基-2-環(huán)戊烯酮和3-甲基-2-環(huán)己烯酮具有小的活性。然而，這種小活性被認(rèn)為與這些特定的底物相關(guān)，并且ene-103表現(xiàn)出與其它結(jié)構(gòu)相關(guān)的底物的催化劑活性，如本案的工作實(shí)施例所顯示的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，底物不是3-甲基-2-環(huán)戊烯酮或3-甲基-2-環(huán)己烯酮，例如當(dāng)催化劑是包含與seqidno：9具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽時(shí)，例如其中多肽包含seqidno：9的氨基酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r⁴是氫。在一個(gè)實(shí)施方案中，-r²獨(dú)立地選自烷基，烯基，炔基，環(huán)烷基，雜環(huán)基，芳基，氨基，羥基和氧基。

這些實(shí)施方案可應(yīng)用于其中-r¹是?；?r¹和-r³一起形成含有酰基的環(huán)，例如環(huán)戊烯酮環(huán)時(shí)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，底物不含腈(-cn)基團(tuán)。例如，-r¹、-r³和-r⁴中的每一個(gè)不是腈。因此，基團(tuán)-r¹可以獨(dú)立地選自?；?、羧基、酰氧基、硝基和?；被；鶊F(tuán)-r³可獨(dú)立地選自氫、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、氨基、羥基、氧基、羧基、酰氧基和?；被??；鶊F(tuán)-r⁴可以是獨(dú)立選擇的氫、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、氨基、羥基、氧基、羧基、酰氧基和?；被?。

烷基可以指直鏈或支鏈的c1-20飽和烷基。烷基可以是c1-4、c1-6或c1-10烷基。烷基的實(shí)例包括甲基，乙基，丙基和1-甲基乙基(異丙基)。

烯基可以指直鏈或支鏈的c2-20烯基。烯基可以是c2-4、c2-6或c2-10烯基。烯基的實(shí)例包括乙烯基和丙烯基。當(dāng)烯基被提供為具有取代基時(shí)，該基團(tuán)的乙烯可以被提供在取代基的α、β位。烯基可以具有一個(gè)或多個(gè)不飽和鍵。

炔基可以指直鏈或支鏈的c2-20炔基。炔基可以是c2-4、c2-6或c2-10炔基。炔基的實(shí)例包括乙炔基和丙炔基。炔基可以具有一個(gè)或多個(gè)不飽和鍵。

環(huán)烷基可以指c6-10環(huán)烷基。烷基的實(shí)例包括環(huán)己基和環(huán)戊基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)烷基是任選不飽和的。

環(huán)烷基可以是稠環(huán)體系的一部分。在稠環(huán)體系中，環(huán)烷基具有包含兩個(gè)或更多個(gè)稠環(huán)的環(huán)體系，其中稠環(huán)體系的一個(gè)環(huán)可以是芳族環(huán)(包括雜芳族環(huán))，并且該基團(tuán)通過非芳族環(huán)原子(即作為環(huán)體系的一部分的非芳族環(huán)的一部分的環(huán)原子)連接到分子的其余部分。因此，稠環(huán)體系通過環(huán)烷基環(huán)的環(huán)原子連接。稠合體系的實(shí)例包括四氫萘基和茚滿基。稠環(huán)體系可以任選在任何可用的環(huán)原子上被取代。

雜環(huán)基可以指c5-10雜環(huán)基。雜環(huán)基可以是c5-7、c5-6或c6雜環(huán)基。雜環(huán)基含有一個(gè)或多個(gè)，例如一個(gè)或兩個(gè)選自n、o和s的雜原子。雜環(huán)基可以通過環(huán)碳原子或環(huán)氮原子連接(如果存在的話)。氮環(huán)原子可以是基團(tuán)nh，或者氮環(huán)原子可以是取代的。硫環(huán)原子可以是基團(tuán)-s-，-s(o)-或-s(o)2-。

雜環(huán)基的實(shí)例包括四氫呋喃，四氫噻吩，吡咯烷，1,4-二惡烷，嗎啉，硫代嗎啉，哌嗪，哌啶和1,4-二氮雜卓(diazepine)。

雜環(huán)基可以是稠環(huán)體系的一部分。在稠合體系中，雜環(huán)基具有包含兩個(gè)或更多個(gè)稠環(huán)的環(huán)體系，其中稠環(huán)體系的一個(gè)環(huán)可以是芳族環(huán)(包括雜芳族環(huán))，并且基團(tuán)通過非芳族環(huán)原子(即作為環(huán)體系的一部分的非芳族環(huán)的一部分的環(huán)原子)連接至分子的其余部分。因此，稠環(huán)體系通過雜環(huán)基環(huán)的環(huán)原子連接。實(shí)例包括二氫吲哚基，吲哚基，二氫苯并呋喃基，苯并二氫吡喃基和2,3-二氫-1,4-苯并二氧雜環(huán)己烯基(benzodioxinyl)。稠環(huán)體系可以任選在任何可用的環(huán)原子上被取代。

芳基可以指c5-14碳芳基(carboaryl)或雜芳基。

碳芳基可以是c6-14或c6-10碳芳基。

碳芳基的實(shí)例包括苯基和萘基。

碳芳基可以是稠環(huán)體系的一部分。在稠環(huán)體系中，碳芳基具有包含兩個(gè)或更多個(gè)稠環(huán)的環(huán)體系，其中稠環(huán)體系的至少一個(gè)環(huán)是芳族環(huán)(包括雜芳族環(huán))，并且該基團(tuán)通過芳族環(huán)原子(即，作為環(huán)體系的一部分的芳族環(huán)的一部分的環(huán)原子)連接到分子的其余部分。因此，稠環(huán)體系通過芳族環(huán)的環(huán)原子連接。實(shí)例包括萘基，二氫吲哚基，吲哚基和二氫苯并呋喃基，苯并二氫吡喃基和2,3-二氫-1,4-苯并二氧雜環(huán)己烯基。稠環(huán)體系可以任選在任何可用的環(huán)原子上被取代。

雜芳基可以是c5-14、c5-10或c5-6雜芳基。

雜芳基的實(shí)例包括呋喃基，吡咯基，咪唑基，惡唑基，噻唑基，吡啶酮基，吡嗪基，喹啉基和異喹啉基。

雜芳基可以是稠環(huán)體系的一部分。在稠環(huán)體系中，雜芳基具有包含兩個(gè)或更多個(gè)稠環(huán)的環(huán)體系，其中稠環(huán)體系的至少一個(gè)環(huán)是雜芳族環(huán)，并且該基團(tuán)通過雜芳族環(huán)中的環(huán)原子(即，作為環(huán)體系的一部分的芳族環(huán)的一部分的環(huán)原子)連接到分子的其余部分。因此，稠環(huán)體系通過芳族環(huán)的環(huán)原子連接。雜芳基可以通過環(huán)碳原子或環(huán)氮原子連接(如果存在的話)。實(shí)例包括吲哚基，苯并呋喃基，異苯并呋喃基，苯并惡唑基，嘌呤基，喹啉基和異喹啉基。

烷基、烯基、炔基環(huán)烷基、雜環(huán)基和芳基任選被取代。基團(tuán)可以是單-、二-或三-取代的。

當(dāng)基團(tuán)被稱為被取代時(shí)，其可以被獨(dú)立地選自鹵素、羥基(-oh)、硝基(-no2)、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、氧基、硫基、氨基、?；?、羧基、酰氧基、氧酰基、酰氨基和?；被娜〈〈＿@些基團(tuán)將在下文討論。

當(dāng)?shù)h(huán)原子存在于雜環(huán)基中時(shí)，環(huán)原子可以是未取代的(nh)或任選地被烷基、烯基、炔基環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、?；王Ｑ趸〈?，例如本文所述的。

鹵素、羥基(-oh)、硝基(-no2)、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、氧基、硫基、氨基、酰基、羧基、酰氧基、氧?；?、酰氨基和?；被梢允侨缦挛乃枋龅幕鶊F(tuán)。

酰基是基團(tuán)-c(o)h或-c(o)r，其中r選自取代或未取代的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基和芳基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，?；?c(o)r。

當(dāng)酰基是氮環(huán)原子的取代基時(shí)，酰基與氮環(huán)原子一起形成酰氨基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)-r¹是?；鶗r(shí)，-r選自取代或未取代的烷基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，其中-r¹是?；?，該基團(tuán)可以是與基團(tuán)-r³一起形成的環(huán)的一部分。例如，-r¹和-r³與它們所連接的碳原子一起可以形成環(huán)己-2-烯-1-酮或環(huán)戊-2-烯-1-酮環(huán)。

羧基是c(o)oh或該基團(tuán)的羧酸鹽形式。

酰氧基是基團(tuán)-c(o)or，其中-r選自取代或未取代的烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基和/或芳基。

當(dāng)酰基是氮環(huán)原子的取代基時(shí)，酰氧基與氮環(huán)原子一起形成氨基甲酸酯基。

基團(tuán)-r¹可以是酰氧基。在一個(gè)實(shí)施方案中，-r可以與-r³一起形成環(huán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，-r⁶和-r³以及它們所連接的原子形成未取代或取代的環(huán)，其中該環(huán)具有4-8個(gè)，例如5-7個(gè)環(huán)原子。該環(huán)可以是例如環(huán)己烯或環(huán)戊烯環(huán)。該環(huán)任選被取代。

在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)-r¹是酰氧基時(shí)，-r選自取代或未取代的烷基。

鹵素基團(tuán)獨(dú)立地選自-f、-cl、-i和-br。

氧基是基團(tuán)-or，其中r獨(dú)立地選自烷基，烯基，炔基，環(huán)烷基，雜環(huán)基和芳基。

硫基是基團(tuán)-sh或sr，其中r獨(dú)立地選自烷基，烯基，炔基，環(huán)烷基，雜環(huán)基和芳基。

氨基是選自-nh2，-nhr和-n(r)2的基團(tuán)，其中每個(gè)r獨(dú)立地選自烷基，烯基，炔基，環(huán)烷基，雜環(huán)基和芳基，例如烷基、環(huán)烷基和芳基。

氧酰基是基團(tuán)-oc(o)r，其中-r獨(dú)立地選自取代或未取代的烷基，烯基，炔基，環(huán)烷基，雜環(huán)基和芳基。

酰氨基是基團(tuán)-nhc(o)r，-nrc(o)r，其中-r獨(dú)立地選自取代或未取代的烷基，烯基，炔基，環(huán)烷基，雜環(huán)基和芳基，例如取代或未取代的烷基。

?；被腔鶊F(tuán)-c(o)nh2，-c(o)nhr或-c(o)n(r)2，其中r獨(dú)立地選自取代或未取代的烷基，烯基，炔基，環(huán)烷基，雜環(huán)基和芳基，或兩個(gè)r基團(tuán)可以與它們所連接的氮原子一起形成取代或未取代的氮雜環(huán)，任選地含有一個(gè)另外的環(huán)雜原子。雜環(huán)任選被烷基，烯基，炔基，環(huán)烷基，雜環(huán)基和芳基取代。

上文描述的是基團(tuán)-r，其選自取代或未取代的烷基，烯基，炔基，環(huán)烷基，雜環(huán)基和芳基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)存在時(shí)，-r選自取代或未取代的烷基，烯基，炔基和環(huán)烷基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)存在時(shí)，-r選自取代或未取代的烷基和環(huán)烷基，例如烷基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)存在時(shí)，-r選自取代或未取代的烷基，烯基和芳基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)存在時(shí)，-r是取代或未取代的芳基。

烷基、烯基或炔基不被烷基、烯基或炔基取代。

每個(gè)取代基可以任選進(jìn)一步被取代。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r³和-r⁴不相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，-r²、-r³和-r⁴不相同。

在一個(gè)實(shí)施方案中，-r²、-r³和-r⁴不含位于活化基團(tuán)的α、β位(例如?；?、羧基、酰氧基或硝基的α、β位)的乙烯基。這里，底物僅具有一個(gè)活化的乙烯基，并且是位于-r¹的α、β位的乙烯基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，底物是分子量為至多500，至多750，或至多1,000的化合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，底物是非手性的。

共底物

在本發(fā)明的方法中，底物可與共底物一起反應(yīng)以產(chǎn)生產(chǎn)物。在還原反應(yīng)中，共底物可以被認(rèn)為是還原劑。還原劑可以形式上提供用于還原的氫。還原劑通常是輔因子。

輔因子

催化劑可以使用nad(p)h作為輔因子以提供還原反應(yīng)的還原當(dāng)量(reducingequivalent)。例如，在催化不飽和碳-碳雙鍵的還原時(shí)，催化劑可以使用來自nad(p)h的還原等價(jià)物，從而將其氧化成nad(p)⁺。還原的輔因子與氧化的輔因子的比率，例如nad(p)h與nad(p)⁺的比率應(yīng)當(dāng)相對(duì)較高，以便有利于輔因子氧化和伴隨的底物還原。

輔因子也被稱為輔酶，也可稱為共底物。術(shù)語“nad(p)h”用于表示nadh和/或nadph，并且術(shù)語和“nad(p)⁺”用于表示nad⁺和/或nadp⁺。例如，使用“nad(p)h”作為輔因子的催化劑可以使用nadh作為輔因子，并且可以額外地或可選擇地使用nadph作為輔因子。

在體外反應(yīng)中，還原的輔因子可以以化學(xué)計(jì)量的量與底物一起存在?；蛘?，還原的輔因子可以以顯著小于化學(xué)計(jì)量的量與底物存在?？梢允褂眠€原輔因子再生系統(tǒng)再生還原的輔因子，所述系統(tǒng)還原在反應(yīng)期間氧化的輔因子，從而允許輔因子以顯著小于化學(xué)計(jì)量的量與底物存在。還原輔因子再生系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的。這樣的系統(tǒng)可以包含還原劑，任選地連同能夠?qū)⑦€原當(dāng)量從還原劑轉(zhuǎn)移到氧化的輔因子的酶。還原劑包括糖，特別是己糖如葡萄糖、甘露糖、果糖，還原劑還包括可氧化的醇如乙醇、丙醇和異丙醇，還原劑還包括甲酸鹽、亞磷酸鹽和分子氫。這樣的系統(tǒng)可以包含糖作為還原劑，任選地具有相容的糖脫氫酶以催化還原當(dāng)量從糖至氧化的輔因子的轉(zhuǎn)移。對(duì)于nadh作為輔因子，還原輔因子再生系統(tǒng)可以包括葡萄糖和葡萄糖脫氫酶(gdh)，如方案1所示。對(duì)于nadh作為輔因子，還原輔因子再生系統(tǒng)可以包含甲酸鹽和甲酸脫氫酶。對(duì)于nadph作為輔因子，輔因子再生系統(tǒng)可以包括葡萄糖-6-磷酸鹽和葡萄糖-6-磷酸酶。

在體內(nèi)反應(yīng)中，當(dāng)在細(xì)胞中提供催化劑時(shí)，還原的nad(p)h通過細(xì)胞內(nèi)酶再生。這樣的酶可以是內(nèi)源的或重組的。例如，參與糖酵解的細(xì)胞內(nèi)酶如磷酸甘油醛脫氫酶可將nad⁺還原為nadh。

催化劑可以是黃素依賴性酶。也就是說，催化劑可以接受來自輔因子的還原當(dāng)量，以通過黃素單核苷酸(fmn)輔基還原不飽和碳-碳雙鍵。

立體選擇性反應(yīng)

本發(fā)明的催化劑可用于產(chǎn)生其中產(chǎn)物中的一個(gè)或多個(gè)例如兩個(gè)碳原子具有特定立體化學(xué)的產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的催化劑可有利地用于制備手性化合物。

本發(fā)明的催化劑可用于產(chǎn)生具有70％或更高，80％或更高，95％或更高，99％或更高的ee值的產(chǎn)物。

因此，本發(fā)明的催化劑可用于制備主要含有一種立體異構(gòu)體和少量另一種立體異構(gòu)體如對(duì)映異構(gòu)體的產(chǎn)物。

本發(fā)明的催化劑可以與非手性的底物一起使用。因此，底物可以不具有擁有立體中心的原子。本文所述的方法允許在產(chǎn)物中產(chǎn)生一個(gè)或兩個(gè)立體中心。因此，本發(fā)明的催化劑可用于從非手性原料賦予手性。

應(yīng)注意，本文所述的反應(yīng)方法不限于立體選擇性合成方法。如工作實(shí)施例所示，本發(fā)明的催化劑可用于產(chǎn)生高產(chǎn)率的還原底物。在有或沒有高產(chǎn)率的產(chǎn)物的情況下，可發(fā)生底物的立體選擇性還原。

當(dāng)?shù)孜锖幸蚁╂I時(shí)，使用催化劑的該鍵的還原應(yīng)理解為在鍵的相對(duì)面(反)上發(fā)生氫的形式添加。在式(i)的化合物中，顯示了乙烯鍵，其中基團(tuán)-r¹位于右下方。如圖所示，在催化劑的存在下該鍵的還原可以發(fā)生為在與-r³和-r⁴鍵合的碳的頂面(紙平面上方)加入氫原子，和在與-r¹和-r²鍵合的碳的底面(在紙平面下方)加入氫原子。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，式(i)化合物的還原如此發(fā)生：

產(chǎn)物中對(duì)映異構(gòu)體的量或?qū)τ钞悩?gòu)體的比率可以通過標(biāo)準(zhǔn)光譜技術(shù)測(cè)定，例如使用手性固定相的hplc。如本文所述，還原反應(yīng)產(chǎn)物的ee值通過產(chǎn)物混合物的gc分析測(cè)定。

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)-r³和-r⁴所連接的碳原子是前手性碳原子(在還原時(shí)成為手性碳原子的碳原子)時(shí)，可以獲得高對(duì)映體過量。相反，當(dāng)-r¹和-r²連接的碳原子(α碳)是前手性原子時(shí)，在一些情況下不能獲得高對(duì)映體過量。這被認(rèn)為是由于在還原后與α碳連接的氫原子的較高的相對(duì)不穩(wěn)定性，這可能在α碳是手性碳原子時(shí)導(dǎo)致外消旋化反應(yīng)(例如當(dāng)-r¹是?；鶗r(shí)通過烯醇化物形式)。因此，當(dāng)需要高對(duì)映體過量時(shí)，可優(yōu)選與-r³和-r⁴連接的碳原子是前手性碳原子。優(yōu)選的是，-r¹和-r²所連接的碳原子不是前手性碳原子。

特別地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于其中-r²是氫并且-r³和-r⁴各自不是氫并且不相同的那些化合物，可以獲得高對(duì)映體過量。這里，-r³和-r⁴所連接的碳可以被認(rèn)為是前手性中心，因?yàn)槠湓谶€原時(shí)將變成手性碳原子。相比之下，-r¹的α碳在還原時(shí)不會(huì)產(chǎn)生四元立體中心，因?yàn)榉磻?yīng)將導(dǎo)致該碳原子帶有兩個(gè)氫原子。

技術(shù)人員將容易地理解本文所用的術(shù)語手性碳原子。它包括具有與其連接的四個(gè)不同基團(tuán)的碳原子，其中一個(gè)可以是氫原子。

試劑盒

在一個(gè)方面，本發(fā)明在試劑盒中提供本發(fā)明的催化劑。

試劑盒可以包含一種或多種另外的催化劑。另外的催化劑可以用于還原反應(yīng)，例如本文所述的乙烯基的還原。

另外或可選地，另外的催化劑可以用于不是還原反應(yīng)或不是乙烯基的還原的反應(yīng)中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，另外的催化劑是生物催化劑。因此，每種催化劑具有酶活性。

催化劑可以與試劑盒的其它催化劑或其它組分在空間上分離。因此，可以在孔板的孔中，或在單獨(dú)的小瓶或其它容器中提供催化劑。

本發(fā)明的試劑盒可以是具有還原催化劑以及一種或多種其它催化劑的試劑盒，其中還原催化劑是包含與seqidno：1具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽。其可以是具有還原催化劑以及一種或多種其它催化劑的試劑盒，其中所述還原催化劑是包含與seqidno：7具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽。其可以是具有還原催化劑和一種或多種其它催化劑的試劑盒，其中所述還原催化劑是包含與seqidno：9具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽。

試劑盒可以提供有使用試劑盒的說明書。任選地，試劑盒可以提供與催化劑一起使用的另外的試劑。例如，可以提供輔因子，緩沖液，溶劑等?？梢砸詽饪s形式提供緩沖液，用于隨后的再水化。

其它催化劑之一或全部可以是酶催化劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒還包含一種或多種具有選自轉(zhuǎn)移酶活性，水解酶活性，裂解酶活性，異構(gòu)酶活性和連接酶活性的活性的催化劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒還包含一種或多種具有選自以下的活性的催化劑：脂肪酶活性，酯酶活性，酰胺酶活性(包括肽酶活性)，糖苷酶活性，乙二醇轉(zhuǎn)移酶活性，環(huán)氧酶活性，腈水解酶活性(包括腈水合酶活性)，羥化活性，脫氫酶活性(包括醇脫氫酶活性)，二羥基化活性，baeyer-villiger氧化活性，醛縮酶活性，氧腈酶活性，氨基轉(zhuǎn)移酶活性和輔因子再生活性。

另外或可選地，試劑盒包含具有作為烯還原酶活性的活性的催化劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒被提供為具有用于試劑盒中的一種或每種催化劑的底物。可以提供底物作為參考底物，例如以確定試劑盒內(nèi)的催化劑的活性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒提供使用每種催化劑的說明書。

其它實(shí)施方案

上面描述的實(shí)施方案的每一個(gè)相容組合在本文中被明確地公開，如同每一個(gè)組合被單獨(dú)地和明確地記載。

考慮到本公開內(nèi)容，本發(fā)明的各種其它方面和實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的。

“和/或”在本文中被用作兩個(gè)指定特征或部件中的每一個(gè)在具有或不具有另一個(gè)的情況下的具體公開。例如，“a和/或b”被認(rèn)為是(i)a、(ii)b和(iii)a和b中的每一個(gè)的具體公開，如同每一個(gè)在本文中單獨(dú)示出。

除非上下文另有規(guī)定，否則上述特征的描述和定義不限于本發(fā)明的任何特定方面或?qū)嵤┓桨?，并且同樣適用于所描述的所有方面和實(shí)施方案。

現(xiàn)在將通過實(shí)例并參考上文描述的附圖來說明本發(fā)明的某些方面和實(shí)施方案。

實(shí)驗(yàn)

催化劑

使用標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)ene-101。將針對(duì)ene-101在大腸桿菌中的表達(dá)而優(yōu)化的核酸序列(seqidno：3)克隆到用于iptg誘導(dǎo)型表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)載體中。

在一些實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)并證實(shí)具有一個(gè)或多個(gè)n端標(biāo)簽的編碼ene-101的核酸序列(非密碼子優(yōu)化的)(seqidno：5和seqidno：7)具有催化活性。

通過收獲細(xì)胞、回收生物質(zhì)并在緩沖液(0.1m磷酸鉀，ph7.0)中重懸浮生物質(zhì)、裂解懸浮液并除去細(xì)胞碎片以提供澄清的細(xì)胞裂解物來產(chǎn)生ene-101制劑。在一些實(shí)驗(yàn)中，裂解緩沖液含有20μmfmn(黃素單核苷酸)和5mmmgso4。在裂解緩沖液中包含20μmfmn和5mmmgso4導(dǎo)致ene-101活性增加10％。澄清的細(xì)胞裂解物首先通過0.5μm和0.2μm孔徑的過濾器過濾，然后通過超濾進(jìn)一步濃縮以提供ene-101制劑。這種ene-101制劑可以直接使用或凍干用于隨后的重構(gòu)和使用。ene-101制劑通常包含約5umg^-1的催化劑，通過上述測(cè)定法測(cè)定，使用1-辛烯-3-酮作為參照底物。

對(duì)于活性研究，使用表達(dá)seqidno：3的載體制備ene-101制劑。

下面描述了seqidno：1的催化劑的用途。這被稱為ene-101。

實(shí)驗(yàn)程序1

將50μl凍干的ene-101制劑的水溶液(100mg/ml；每次測(cè)試5mg酶)加入到含有900μlph7的水性介質(zhì)(250mm磷酸鉀緩沖液ph7，1.1mmnad+，30mmd-葡萄糖，10u/mlgdh)和50μl的在甲苯中的底物溶液(400mm，底物終濃度20mm)的反應(yīng)小瓶。將小瓶在35℃下振蕩3、6和18小時(shí)。加入1mletoac后，將反應(yīng)小瓶渦旋并離心。通過gc分析有機(jī)相的樣品以測(cè)量轉(zhuǎn)化率和ee。

結(jié)果示于表1。

在所使用的具體反應(yīng)條件下，發(fā)現(xiàn)一些實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)化率值相對(duì)較低。然而，沒有觀察到副產(chǎn)物，并且未反應(yīng)的底物是剩余的主要組分。假設(shè)底物可以回收并在隨后的反應(yīng)中再使用，則產(chǎn)物的產(chǎn)率可以被認(rèn)為是相對(duì)高的。

表1-實(shí)驗(yàn)程序1中底物的反應(yīng)時(shí)間、轉(zhuǎn)化率和ee

^a產(chǎn)物峰在gc中的積分(未校正的gc面積)。^b觀察到反應(yīng)介質(zhì)中產(chǎn)物ee的減少；這種減少不是酶促催化的。^cee尚未確定。^c立體化學(xué)是指產(chǎn)物的所分配的立體化學(xué)。

3-甲基-2-環(huán)戊烯酮(條目1、2和3)和3-甲基-2-環(huán)己烯酮(條目4、5和6)的還原被證明是緩慢的，并且在這兩種情況下僅獲得部分轉(zhuǎn)化。這兩種底物的對(duì)映體選擇性都很好。

另一方面，2-甲基-2-環(huán)戊烯酮證明非常有活性并且反應(yīng)快。注意到，相應(yīng)的產(chǎn)物2-甲基環(huán)戊酮在反應(yīng)條件下外消旋化。

圖1顯示表1中列出的四種底物的％轉(zhuǎn)化隨反應(yīng)時(shí)間(h.)的變化的變化。

濃度研究

隨后在三種不同濃度：50、100和300mm下測(cè)試那些被證明對(duì)ene-101更具活性的底物。對(duì)于這些測(cè)試，遵循實(shí)驗(yàn)程序1。葡萄糖、ene-101、gdh和nad的量根據(jù)底物濃度按比例放大，因此當(dāng)量數(shù)保持恒定。如上述實(shí)驗(yàn)程序中所述，將250mm磷酸鹽緩沖液(ph7.0)用于反應(yīng)。沒有嘗試在反應(yīng)發(fā)生時(shí)調(diào)節(jié)ph。這意味著在高底物濃度下，所產(chǎn)生的葡萄糖酸可能不會(huì)被完全中和，因此使得培養(yǎng)基的ph對(duì)于ene-101來說過于酸性而無法發(fā)揮作用。

結(jié)果示于表2。

表2-具有濃度變化的底物的反應(yīng)時(shí)間、轉(zhuǎn)化率和ee

^a產(chǎn)物峰在gc中的積分(未校正的gc面積)。^b觀察到反應(yīng)介質(zhì)中產(chǎn)物ee的減少；這種減少不是酶促催化的。^cee尚未確定。

圖2顯示了表1中列出的三種底物的％轉(zhuǎn)化隨反應(yīng)時(shí)間(h.)的變化和底物濃度的變化的變化。

對(duì)于大多數(shù)測(cè)試的底物，注意到當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從3小時(shí)增加到18小時(shí)時(shí)，轉(zhuǎn)化率沒有顯著改善。這在高底物濃度下特別顯著，并且表明反應(yīng)介質(zhì)的ph對(duì)于酶起作用過于酸性，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化停止。這通過在3小時(shí)和18小時(shí)后測(cè)量反應(yīng)小瓶的ph來證明。

在所測(cè)試的實(shí)例中，沒有一個(gè)顯示產(chǎn)物或底物抑制的證據(jù)，即使在高達(dá)300mm的濃度下。這表明以高達(dá)300mm(甚至更高)的濃度運(yùn)行這些還原應(yīng)當(dāng)是可能的，并且理想地與反應(yīng)介質(zhì)ph的控制一起。

ph研究

在ph研究中，選擇檸檬醛(3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛)作為進(jìn)一步研究的測(cè)試底物。然后研究緩沖液的ph的影響，結(jié)果示于圖3中。

鑒于反應(yīng)時(shí)間短(通常約1分鐘)，假定反應(yīng)混合物的ph在整個(gè)反應(yīng)過程中保持基本上恒定。

通過光度測(cè)定確定反應(yīng)性，由nadh的氧化引起的340nm處的吸光度的降低是ene-101的催化活性的量度。測(cè)定濃度：在1ml反應(yīng)混合物中，終濃度為0.1m磷酸鉀ph7.4，10mm底物，15mmnadh和0.4mgene-101。

測(cè)量每個(gè)ph值的背景活性(在不存在底物時(shí)nadh吸光度的降低)。發(fā)現(xiàn)其對(duì)于ph6至6.5和對(duì)于ph8至9較高。發(fā)現(xiàn)ene-101是穩(wěn)定的并且在ph6.5至8之間更有活性。

溫度特征譜和穩(wěn)定性

還研究了ene-101的溫度特征譜，并測(cè)量了每個(gè)溫度的背景活性，并從酶活性測(cè)定值中減去。結(jié)果示于圖4中。

通過如上關(guān)于ph研究所述的光度測(cè)定法測(cè)定反應(yīng)性。底物是檸檬醛。

在三種不同的溫度(30、40和50℃)下研究ene-101的穩(wěn)定性。如前所述，測(cè)量并除去背景活性。殘余活性的結(jié)果顯示在圖5中。同樣，通過光度測(cè)定法測(cè)定反應(yīng)性，底物是檸檬醛。

圖5中的結(jié)果表明，ene-101在低于40℃的溫度下相當(dāng)穩(wěn)定，但在50℃下迅速喪失活性

溶劑和添加劑效應(yīng)

使用相對(duì)反應(yīng)性的底物2-甲基-2-環(huán)戊烯酮研究溶劑和添加劑效應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)程序1之后比較5體積％的不同共溶劑。來自該比較的關(guān)于產(chǎn)物的產(chǎn)率和ee的結(jié)果如圖6所示。

如前所述，還原產(chǎn)物2-甲基環(huán)戊酮在反應(yīng)條件下外消旋化。在所測(cè)試的共溶劑中，它們似乎都不以顯著的程度改善轉(zhuǎn)化或防止外消旋作用。

在相同的條件下，評(píng)價(jià)對(duì)反應(yīng)混合物的表面活性劑添加效應(yīng)(0.1和0.3體積％)。結(jié)果示于圖7中。

在指定體積下測(cè)試的共溶劑中，它們似乎都不以顯著程度改善轉(zhuǎn)化或防止外消旋化。

按比例放大實(shí)驗(yàn)

隨后進(jìn)行更大規(guī)模的催化反應(yīng)以顯示催化劑在工業(yè)上有用的水平上的效用。

按比例放大反應(yīng)觀察還原反應(yīng)，如以下方案1所示。

方案1

程序1-試劑和方法

在溫度控制(40℃)并配備有ph控制計(jì)量泵的磁力攪拌(600rpm，蛋形攪拌棒)50ml圓底燒瓶中引入去離子水(36.3ml)、k2hpo4(597mg)和kh2po4(27mg)。這產(chǎn)生0.1mph8.0的磷酸鹽緩沖溶液。然后加入d-葡萄糖一水合物(8.2g)，使溶液的ph降至7.1。溫度穩(wěn)定后，加入nacl(1.68g)，然后加入ene-101(1.0g)，gdh(103mg；4.88u/mg；500u)，nad(166mg)和1-乙?；h(huán)己烯(4.67g；37.6mmol)。

將反應(yīng)在40℃下攪拌，直到通過gc分析觀察到完全轉(zhuǎn)化。為了保持恒定的ph7.0，將反應(yīng)用45％naoh溶液計(jì)量加入。

為了監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)化，以規(guī)律的間隔從反應(yīng)中取出樣品(50μl)。將它們用dcm(1.5ml)處理，渦旋、離心以除去不溶物質(zhì)，并通過gc分析以測(cè)量轉(zhuǎn)化。20小時(shí)后，通過gc觀察到99.3％轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。反應(yīng)特征譜可見于圖8和9。

程序2-試劑和方法

按照與上述相同的程序，在雙倍底物濃度下重復(fù)反應(yīng)。在這種情況下，將d-葡萄糖一水合物(15.4g；77.7mmol)、氯化鈉(1.68g)、nad(316mg；0.47mmol)、gdh(103mg；4.88u/mg；500u)和ene-101(1.0g)在ph8.0的0.1m磷酸鹽緩沖液(24.8ml)中的溶液在40℃下置于磁力攪拌的圓底燒瓶中，然后用1-乙酰基環(huán)己烯(9.34g；75.2mmol)處理。將反應(yīng)在40℃下攪拌96小時(shí)。為了保持恒定的ph7.0，將反應(yīng)用45％naoh溶液計(jì)量加入。

以規(guī)律的間隔從反應(yīng)中取出樣品(25μl)以監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)化。將它們用dcm(1.5ml)處理，渦旋、離心以除去不溶物質(zhì)，并通過gc分析以測(cè)量轉(zhuǎn)化。26小時(shí)后，通過gc觀察到75％轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(1.125m產(chǎn)物濃度)。反應(yīng)減慢并在95％轉(zhuǎn)化率下停止。反應(yīng)的特征譜可以在圖8和9中找到。

觀察還原的進(jìn)一步按比例放大反應(yīng)如下面方案2所示。

方案2

程序3-試劑和方法

在溫度控制(40℃)且配備有ph控制計(jì)量泵的磁力攪拌(600rpm，蛋形攪拌棒)50ml圓底燒瓶中引入去離子水(36.8ml)、k2hpo4(597mg)和kh2po4(27mg)。這產(chǎn)生0.1mph8.0的磷酸鹽緩沖溶液。然后加入d-葡萄糖一水合物(8.2g)，使溶液的ph降至7.1。溫度穩(wěn)定后，加入nacl(1.68g)，然后加入ene-101(1.0g)、gdh(103mg；4.88u/mg；500u)、nad(166mg)和衣康酸二甲酯(5.9g；37.3mmol)。將反應(yīng)在40℃下攪拌，直到通過gc分析觀察到完全轉(zhuǎn)化。為了保持恒定的ph7.0，將反應(yīng)用45％naoh溶液計(jì)量加入。

為了監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)化，以規(guī)律的間隔從反應(yīng)中取出樣品(50μl)。將它們用dcm(1.5ml)處理，渦旋、離心以除去不溶物質(zhì)，并通過gc分析以測(cè)量轉(zhuǎn)化。43小時(shí)后，通過gc觀察到99％轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(>99.9％ee，r對(duì)映異構(gòu)體)。反應(yīng)特征譜可見于圖10和11。

進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

催化劑

ene-102和ene-103被產(chǎn)生為具有標(biāo)簽(例如，具有n末端t7和his標(biāo)簽)或沒有標(biāo)簽。

ene-102和ene-103以與上述ene-101類似的方式制備。ene-102和ene-103制劑通常包含使用nadph作為輔因子的約1-2umg^-1的催化劑制劑，如通過上述測(cè)定一般描述的，使用1-辛烯-3-酮作為參照底物。

這些進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)包括上面已經(jīng)給出的數(shù)據(jù)，以便于比較。

為了定義酶ene-101、ene-102和ene-103的底物范圍，針對(duì)許多底物(活化的c＝c鍵)測(cè)試它們。反應(yīng)在相同條件下進(jìn)行(如“實(shí)驗(yàn)程序2”中所述)；在3、6和18小時(shí)后取樣，并通過gc分析以測(cè)量轉(zhuǎn)化率和對(duì)映體過量。這些反應(yīng)的結(jié)果描述在表3中。

實(shí)驗(yàn)程序2：將凍干酶ene-101、ene-102或ene-103制劑的50μl水溶液(100mg/ml；每次測(cè)試5mg酶)加入到含有900μlph7的水性介質(zhì)(250mm磷酸鉀緩沖液ph7，1.1mmnad⁺，30mmd-葡萄糖，10u/mlgdh)和50μl的在甲苯中的底物溶液(400mm，底物終濃度20mm)的反應(yīng)小瓶。將小瓶在35℃下振蕩3、,6和18小時(shí)。加入1mletoac后，將反應(yīng)小瓶渦旋并離心。通過gc分析有機(jī)相的樣品以測(cè)量轉(zhuǎn)化率和ee。

表3

^a產(chǎn)物峰在gc中的積分(未校正的gc面積)。^b觀察到反應(yīng)介質(zhì)中產(chǎn)物ee的減少；這種減少不是酶促催化的。^cee尚未確定。

3-甲基-2-環(huán)戊烯酮和3-甲基-2-環(huán)己烯酮的還原被證明是緩慢的，并且使用ene-101和ene-102僅獲得部分轉(zhuǎn)化。然而，對(duì)于兩種底物的對(duì)映選擇性都是優(yōu)良的。ene-103對(duì)這些底物明顯無活性(數(shù)據(jù)未顯示)。這似乎是一個(gè)孤立的無活性事件，因?yàn)橛^察到ene-103對(duì)結(jié)構(gòu)相關(guān)的形式(例如2-甲基-2-環(huán)戊烯酮和1-(環(huán)己烯-1-基)乙酮(表3中的條目16和17))具有活性。

2-甲基-2-環(huán)戊烯酮被三種酶快速還原。不幸的是，相應(yīng)的產(chǎn)物2-甲基環(huán)戊酮在反應(yīng)條件下外消旋化。

據(jù)報(bào)道，α-取代的烯酮比β-取代的烯酮更容易被老黃酶還原。例如，參見關(guān)于希瓦氏菌屬(shewanella)oye(sye-4)(iqbal等人，2012)、來自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(zymomonasmobilis)的烯酸還原酶(enoatereductase)和來自乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)(kye1)和來自伯氏耶爾森氏菌(yersiniabercovieri)(yers-er)的oye的還原的報(bào)告(yanto等人，2011；hall等人，2008)。

圖12顯示了表3中報(bào)告的數(shù)據(jù)。

隨后在三種不同濃度：50、100和300mm下測(cè)試證明更容易還原的那些底物。對(duì)于這些測(cè)試，遵循實(shí)驗(yàn)程序2。葡萄糖、ene、gdh和nad的量根據(jù)底物濃度增加，因此當(dāng)量數(shù)保持恒定。如實(shí)驗(yàn)程序中所述，將250mm磷酸鹽緩沖液(ph7.0)用于反應(yīng)。沒有嘗試在反應(yīng)發(fā)生時(shí)調(diào)節(jié)ph。這意味著在高底物濃度下，所產(chǎn)生的葡萄糖酸可能不會(huì)被完全中和，以使得培養(yǎng)基的ph對(duì)于ene來說過于酸性而無法發(fā)揮作用。

這些測(cè)試的結(jié)果可以在表4和圖13a和13b中找到。

表4

^a產(chǎn)物峰在gc中的積分(未校正的gc面積)。^b觀察到反應(yīng)介質(zhì)中產(chǎn)物ee的減少；這種減少不是酶促催化的。^cee尚未確定。

對(duì)于大多數(shù)測(cè)試的底物，在3至18小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間時(shí)，轉(zhuǎn)化率沒有顯著改善。這在高底物濃度下特別顯著，并且表明反應(yīng)介質(zhì)的ph對(duì)于酶起作用過于酸性，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化停止。這通過在3小時(shí)和18小時(shí)后測(cè)量反應(yīng)小瓶的ph來證明。

在任何實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物或底物抑制的證據(jù)，即使在高達(dá)300mm的濃度下。這表明，以高達(dá)300mm或高于300mm的濃度運(yùn)行這些還原是可能的。調(diào)節(jié)反應(yīng)介質(zhì)的ph可以進(jìn)一步改善使用高底物濃度的反應(yīng)。

按比例放大實(shí)驗(yàn)

1-乙?；h(huán)己烯的還原

方案3.反應(yīng)方案。

程序a.1(0.75m)

在溫度控制(40℃)并配備有ph控制計(jì)量泵的磁力攪拌(600rpm，蛋形攪拌棒)50ml圓底燒瓶中引入去離子水(36.3ml)、k2hpo4(597mg)和kh2po4(27mg)。這產(chǎn)生0.1mph8.0的磷酸鹽緩沖溶液。然后加入d-葡萄糖一水合物(8.2g)，使溶液的ph降至7.1。溫度穩(wěn)定后，加入nacl(1.68g)，然后加入ene(-101、-102或-103,1.0g)，gdh(103mg；4.88u/mg；500u)，nad(166mg)和1-乙酰基環(huán)己烯(4.67g；37.6mmol)。

將反應(yīng)在40℃下攪拌，直到通過gc分析觀察到完全轉(zhuǎn)化。為了保持恒定的ph7.0，將反應(yīng)用45％naoh溶液計(jì)量加入。

對(duì)于在750mm下獲得的ene-102不完全轉(zhuǎn)化(即使在延長(zhǎng)的時(shí)間后)，以300mm重復(fù)該反應(yīng)，導(dǎo)致過夜完全轉(zhuǎn)化。對(duì)于ene-101，在雙倍濃度1500mm下重復(fù)反應(yīng)。

程序a.2(1.5m)

按照與上述相同的程序，在雙倍底物濃度下重復(fù)反應(yīng)。在這種情況下，將d-葡萄糖一水合物(15.4g；77.7mmol)、氯化鈉(1.68g)、nad(316mg；0.47mmol)、gdh(103mg；4.88u/mg；500u)和ene-101(1.0g)在ph8.0的0.1m磷酸鹽緩沖液(24.8ml)中的溶液在40℃下置于磁力攪拌的圓底燒瓶中，然后用1-乙酰基環(huán)己烯(9.34g；75.2mmol)處理。將反應(yīng)在40℃下攪拌96小時(shí)。為了保持恒定的ph7.0，將反應(yīng)用45％naoh溶液計(jì)量加入。

為了監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)化，以規(guī)律的間隔從不同的反應(yīng)中取出樣品(50μl)。將它們用dcm(1.5ml)處理，渦旋、離心以除去不溶物質(zhì)，并通過gc分析以測(cè)量轉(zhuǎn)化。不同反應(yīng)的特征譜可以在圖14和15中看到。

衣康酸二甲酯的還原

方案4.反應(yīng)方案。

程序b.1(0.73m)

在溫度控制(40℃)且配備有ph控制計(jì)量泵的磁力攪拌(600rpm，蛋形攪拌棒)50ml圓底燒瓶中引入去離子水(36.8ml)、k2hpo4(597mg)和kh2po4(27mg)。這產(chǎn)生0.1mph8.0的磷酸鹽緩沖溶液。然后加入d-葡萄糖一水合物(8.2g)，使溶液的ph降至7.1。溫度穩(wěn)定后，加入nacl(1.68g)，然后加入ene(-101、-102或-103,1.0g)，gdh(103mg；4.88u/mg；500u)，nad(166mg)和衣康酸二甲酯(5.9g；37.3mmol)。

將反應(yīng)在40℃下攪拌，直到通過gc分析觀察到完全轉(zhuǎn)化。為了保持恒定的ph7.0，將反應(yīng)用45％naoh溶液計(jì)量加入。

為了監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)化，以規(guī)律的間隔從反應(yīng)中取出樣品(50μl)。將它們用dcm(1.5ml)處理，渦旋、離心以除去不溶物質(zhì)，并通過gc分析以測(cè)量轉(zhuǎn)化。對(duì)于三種酶，通過gc觀察到超過95％轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(>99.9％ee，r對(duì)映異構(gòu)體)。反應(yīng)特征譜可見于圖16和17。

參考文獻(xiàn)

上文引用了許多出版物以便更充分地描述和公開本發(fā)明以及本發(fā)明所屬領(lǐng)域的現(xiàn)狀。這些參考文獻(xiàn)的完整引用如下。這些參考文獻(xiàn)中的每一個(gè)的全部?jī)?nèi)容并入本文。

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<120>催化劑及其用途

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<151>2014-08-06

<160>10

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>376

<212>prt

<213>西瓜嗜酸菌

<400>1

metserhisthrleupheaspprovalglnalaglyaspleuglnleu

151015

alaasnargilealametalaproleuthrargasnargserproasn

202530

alavalprolysaspilethralathrtyrtyralaglnargalathr

354045

alaglyleuleuilethrglualathralaileserhisglnglygln

505560

glytyralaaspvalproglyleutyrserthrgluglnleuaspgly

65707580

trplyslysvalthralaalavalhisgluargglyglyargileval

859095

thrglnleutrphisvalglyargileserhisasnaspleuglnpro

100105110

aspglyglyalaprovalalaproseralailealaalalysserlys

115120125

thrtyrleuileasplysalathrglyglnglyhisphealaalathr

130135140

sergluproargalaleuaspalaglugluleuproglyilevalhis

145150155160

asptyralaalaalaalaargasnalavalgluthralaglypheasp

165170175

glyvalgluilehisglyalaasnglytyrleuleuaspglnpheleu

180185190

lysthrglyalaasnargargthraspasptyrglyglyserileglu

195200205

asnargalaargleuleuleuglualathrargalavalvalaspala

210215220

ileglyglyglylysvalglyileargleuserprovalthrproala

225230235240

asnaspilevalaspalaaspproglnproleupheasptyrvalile

245250255

argglnleualaproleuglyleualatyrvalhisvalileglugly

260265270

serthrglyglyproarggluleugluaspargpropheasptyrglu

275280285

alaleulysthralatyrargglualaglyglylysglyalatrpmet

290295300

valasnasnalatyraspargalaleualametglualavalalaser

305310315320

glyargalaaspilevalalapheglylysalapheileserasnpro

325330335

aspleuvalgluargleuargglnaspalaproleuasnprotrpasp

340345350

serlysthrphetyrglyglyglyglulysglytyrthrasptyrpro

355360365

thrleuglygluseralalysgly

370375

<210>2

<211>1131

<212>dna

<213>西瓜嗜酸菌

<400>2

ttgtcccatacgcttttcgatcccgtccaggccggcgacctgcagctcgccaaccgcatc60

gccatggcgccgctcacgcgcaaccgctcgccgaatgcggtgcccaaggacattaccgcc120

acctactacgcccagcgcgccaccgccggcctgctgatcaccgaggccacggccatcagc180

caccagggccagggctatgcggacgtgccgggcctgtacagcaccgaacagctcgatgga240

tggaaaaaggtcaccgcagcggtccatgagcgcggcggcaggatcgtgacccagctctgg300

cacgtgggccgcatttcccacaatgacctgcagcccgacggcggcgcccccgtggccccc360

tccgccatcgccgccaagtccaagacctacctgatcgacaaggccaccggccagggccat420

ttcgcggccacgtccgaaccccgtgcgctggatgccgaagagctgcccggcatcgtgcac480

gactacgccgccgccgcgcgcaacgcggtggagacggccggattcgacggcgtcgagatc540

cacggcgccaacggctacctgctggaccagttcctcaagaccggcgccaaccggcgcacc600

gacgactacggcggcagcatcgagaaccgcgcgcgcctgctgctcgaagccacgcgcgcc660

gtggtggacgcgatcggcggcggcaaggtgggcatccgactctcgcccgtcacgccggcc720

aacgacatcgtcgatgccgatccgcagccgctgttcgactacgtgatccgccagctcgca780

ccgctgggcctggcctacgtgcacgtgatcgaaggctccaccggcggcccgcgcgagctg840

gaagaccgtccgttcgactacgaagccctgaagaccgcctaccgcgaggccggcggcaaa900

ggcgcctggatggtcaacaacgcctatgaccgtgcgttggcgatggaagcggtggccagt960

ggccgcgccgacatcgtcgccttcggcaaggccttcatctccaaccccgacctggtcgag1020

cggctgcgccaggacgcaccgctcaacccctgggactccaagaccttctacggcggcggc1080

gagaagggctacaccgactacccgacgctcggcgaatcggcgaaaggctga1131

<210>3

<211>1134

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列:密碼子優(yōu)化的編碼催化劑的核酸序列(編碼seqidno:1)

<400>3

atgagccataccctgtttgatccggttcaggcaggcgatctgcagctggcaaatcgtatt60

gcaatggcaccgctgacccgtaatcgtagcccgaatgcagttccgaaagatattaccgca120

acctattatgcacagcgtgcaaccgcaggtctgctgattaccgaagcaaccgcaattagc180

catcagggtcagggttatgcagatgttccgggtctgtatagcaccgaacagctggatggt240

tggaaaaaagttaccgcagcagtgcatgaacgtggtggtcgtattgttacccagctgtgg300

catgtgggtcgtattagccataatgatctgcaaccggatggtggtgctccggtggcaccg360

agcgcaattgcagcaaaaagcaaaacctatctgattgataaagcaaccggtcagggtcat420

tttgcagcaaccagcgaaccgcgtgcactggatgcagaagaactgcctggtattgttcat480

gattatgcagcagcagcacgtaatgcagttgaaaccgcaggctttgatggtgttgaaatt540

catggtgcaaatggctatctgctggatcagtttctgaaaaccggtgcaaatcgtcgtacc600

gatgattatggtggtagcattgaaaatcgtgcccgtctgctgctggaagcaacccgtgca660

gttgttgatgcaattggtggtggtaaagttggtattcgtctgagtccggttacaccggca720

aatgatattgtggatgccgatccgcagccgctgtttgattatgttattcgtcagctggct780

ccgctgggtctggcctatgttcatgttattgaaggtagcaccggtggtcctcgtgaactg840

gaagatcgtccgttcgattatgaagcactgaaaacagcatatcgtgaagcaggcggtaaa900

ggtgcatggatggttaataatgcctatgatcgtgccctggcaatggaagcagttgcaagc960

ggtcgtgcagatattgttgcatttggtaaagcctttattagcaatccggatctggttgaa1020

cgtctgcgtcaggatgctccgctgaatccgtgggatagtaaaaccttttatggtggcggt1080

gaaaaaggctataccgattatccgaccctgggtgaaagcgcaaaaggttaataa1134

<210>4

<211>392

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列:催化劑氨基酸序列,包含t7標(biāo)簽

<400>4

metalasermetthrglyglyglnglnmetglyargglysergluphe

151015

metserhisthrleupheaspprovalglnalaglyaspleuglnleu

202530

alaasnargilealametalaproleuthrargasnargserproasn

354045

alavalprolysaspilethralathrtyrtyralaglnargalathr

505560

alaglyleuleuilethrglualathralaileserhisglnglygln

65707580

glytyralaaspvalproglyleutyrserthrgluglnleuaspgly

859095

trplyslysvalthralaalavalhisgluargglyglyargileval

100105110

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115120125

aspglyglyalaprovalalaproseralailealaalalysserlys

130135140

thrtyrleuileasplysalathrglyglnglyhisphealaalathr

145150155160

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165170175

asptyralaalaalaalaargasnalavalgluthralaglypheasp

180185190

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195200205

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210215220

asnargalaargleuleuleuglualathrargalavalvalaspala

225230235240

ileglyglyglylysvalglyileargleuserprovalthrproala

245250255

asnaspilevalaspalaaspproglnproleupheasptyrvalile

260265270

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275280285

serthrglyglyproarggluleugluaspargpropheasptyrglu

290295300

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305310315320

valasnasnalatyraspargalaleualametglualavalalaser

325330335

glyargalaaspilevalalapheglylysalapheileserasnpro

340345350

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355360365

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385390

<210>5

<211>412

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列:催化劑氨基酸序列,包含his標(biāo)簽和t7標(biāo)簽

<400>5

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151015

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hisglnglyglnglytyralaaspvalproglyleutyrserthrglu

100105110

glnleuaspglytrplyslysvalthralaalavalhisgluarggly

115120125

glyargilevalthrglnleutrphisvalglyargileserhisasn

130135140

aspleuglnproaspglyglyalaprovalalaproseralaileala

145150155160

alalysserlysthrtyrleuileasplysalathrglyglnglyhis

165170175

phealaalathrsergluproargalaleuaspalaglugluleupro

180185190

glyilevalhisasptyralaalaalaalaargasnalavalgluthr

195200205

alaglypheaspglyvalgluilehisglyalaasnglytyrleuleu

210215220

aspglnpheleulysthrglyalaasnargargthraspasptyrgly

225230235240

glyserilegluasnargalaargleuleuleuglualathrargala

245250255

valvalaspalaileglyglyglylysvalglyileargleuserpro

260265270

valthrproalaasnaspilevalaspalaaspproglnproleuphe

275280285

asptyrvalileargglnleualaproleuglyleualatyrvalhis

290295300

valilegluglyserthrglyglyproarggluleugluaspargpro

305310315320

pheasptyrglualaleulysthralatyrargglualaglyglylys

325330335

glyalatrpmetvalasnasnalatyraspargalaleualametglu

340345350

alavalalaserglyargalaaspilevalalapheglylysalaphe

355360365

ileserasnproaspleuvalgluargleuargglnaspalaproleu

370375380

asnprotrpaspserlysthrphetyrglyglyglyglulysglytyr

385390395400

thrasptyrprothrleuglygluseralalysgly

405410

<210>6

<211>1239

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列:編碼包含his標(biāo)簽和t7標(biāo)簽的催化劑的核酸序列(編碼seqidno:5)

<400>6

atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccat60

atggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgcggatccgaattcatgtcccatacg120

cttttcgatcccgtccaggccggcgacctgcagctcgccaaccgcatcgccatggcgccg180

ctcacgcgcaaccgctcgccgaatgcggtgcccaaggacattaccgccacctactacgcc240

cagcgcgccaccgccggcctgctgatcaccgaggccacggccatcagccaccagggccag300

ggctatgcggacgtgccgggcctgtacagcaccgaacagctcgatggatggaaaaaggtc360

accgcagcggtccatgagcgcggcggcaggatcgtgacccagctctggcacgtgggccgc420

atttcccacaatgacctgcagcccgacggcggcgcccccgtggccccctccgccatcgcc480

gccaagtccaagacctacctgatcgacaaggccaccggccagggccatttcgcggccacg540

tccgaaccccgtgcgctggatgccgaagagctgcccggcatcgtgcacgactacgccgcc600

gccgcgcgcaacgcggtggagacggccggattcgacggcgtcgagatccacggcgccaac660

ggctacctgctggaccagttcctcaagaccggcgccaaccggcgcaccgacgactacggc720

ggcagcatcgagaaccgcgcgcgcctgctgctcgaagccacgcgcgccgtggtggacgcg780

atcggcggcggcaaggtgggcatccgactctcgcccgtcacgccggccaacgacatcgtc840

gatgccgatccgcagccgctgttcgactacgtgatccgccagctcgcaccgctgggcctg900

gcctacgtgcacgtgatcgaaggctccaccggcggcccgcgcgagctggaagaccgtccg960

ttcgactacgaagccctgaagaccgcctaccgcgaggccggcggcaaaggcgcctggatg1020

gtcaacaacgcctatgaccgtgcgttggcgatggaagcggtggccagtggccgcgccgac1080

atcgtcgccttcggcaaggccttcatctccaaccccgacctggtcgagcggctgcgccag1140

gacgcaccgctcaacccctgggactccaagaccttctacggcggcggcgagaagggctac1200

accgactacccgacgctcggcgaatcggcgaaaggctga1239

<210>7

<211>364

<212>prt

<213>紫色色桿菌

<400>7

metasnalaasplysleuleuthrproleuthrmetglyalavalala

151015

leuserasnargvalvalmetalaproleuthrargleuargasnile

202530

gluproglyaspvalproglyproleualalysglutyrtyrarggln

354045

argalaseralaglyleuilevalalagluglythrhisileserpro

505560

thralalysglytyralaglyalaproglyiletyrsergluglugln

65707580

valargalatrpsergluvalthrglyalavalhisglnaspglygly

859095

lysilealaleuglnleutrphisthrglyargileserhisargser

100105110

leuglnproasnglyaspalaprovalglyproseralaileglnala

115120125

aspserargthrasnileargalaalaaspglyserleuvalargglu

130135140

glncysaspthrproargalaleugluileglugluilegluaspile

145150155160

ilegluasptyrargargalaalaaspasnalaargargalaglyphe

165170175

aspmetvalgluilehisglyalahisglytyrleuileaspglnphe

180185190

leuserproalaalaasnvalargthraspglntyrglyglyserval

195200205

gluasnargalaargpheleuleugluvalvalaspalavalvalala

210215220

glutrpaspalaasphisvalglyileargileserproleuglyile

225230235240

pheasnglyvalserasnthraspglnleuaspmetalaleutyrleu

245250255

alagluglnleualalysarglysleualapheleuhisileserglu

260265270

proasptrpalaglyglyprothrleuaspaspglypheargalaglu

275280285

leuargglnargtyrproglyvalileileglyalaglyglytyrser

290295300

alaglulysalagluthrleuleulyslysglypheileaspalaala

305310315320

alapheglyargsertyrilealaasnproaspleuvalgluargleu

325330335

lysglnasnalaproleuasnproprolysproaspthrphetyrgly

340345350

glyglyalagluglytyrthrasptyrprothrleu

355360

<210>8

<211>1095

<212>dna

<213>紫色色桿菌

<400>8

atgaacgccgacaaactgctgaccccgctgaccatgggcgccgtcgccctgagcaaccgc60

gtcgtcatggccccgctgacccgcctgcgcaacatcgaaccgggcgacgtgcccggcccg120

ctggccaaggaatactaccgccagcgcgccagcgccggcctgatcgtggccgaaggcacc180

cacatttcccccaccgccaagggctatgccggcgcgcccggcatctacagcgaggaacaa240

gtgcgcgcctggagcgaagtcaccggcgcggtgcatcaagacggcggcaagatcgcgctg300

caactgtggcacaccggccgcatctcgcaccgctcgctgcagccgaacggcgacgcgccg360

gtcggcccgtccgccatccaggccgacagccgcaccaacatccgcgccgccgacggcagc420

ctggtgcgcgaacaatgcgacaccccgcgcgcgctggaaatcgaggaaatcgaggacatc480

atcgaggactaccgccgcgccgccgacaacgcgcgccgcgccggtttcgacatggtggag540

atccacggcgcccacggctatctgatcgaccagttcctgtcgccggccgccaacgtccgc600

accgaccagtacggcggcagcgtggaaaaccgcgcccgcttcctgctggaagtggtggac660

gcggtggtggcggaatgggacgccgatcacgtcggcatccgcatctcgccgctgggcatc720

ttcaacggcgtcagcaacaccgaccagctggacatggcgctgtacctggccgagcagttg780

gccaagcgcaagctggccttcctgcacatctccgagccggactgggccggcggcccgacg840

ctggacgacggcttccgcgccgaactgcgccagcgctatcccggcgtgatcatcggcgcc900

ggcggctactccgcggagaaggccgaaacgctgctgaagaaaggctttatcgacgccgcc960

gccttcggccgcagctacatcgccaacccggatctggtggagcgtctgaagcagaacgct1020

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tacccgacgctgtaa1095

<210>9

<211>338

<212>prt

<213>芽孢桿菌屬的種

<400>9

metaspthrlysleuphesersertyrthrvallysaspvalthrleu

151015

lysasnargilevalmetalaprometcysmettyrserserhisasn

202530

gluaspglylysvalgluasntrphisleuthrhistyrthrserarg

354045

alavalglyglnvalglyleuileilevalglualathralavalthr

505560

alaglnglyargileserproglnaspleuglyiletrpseraspasp

65707580

hisilegluglyleuglnglnleuthrglymetmetlysgluhisgly

859095

thrargalaglyileglnleualahisalaglyarglysalavalile

100105110

gluglygluileilealaproseralavalalapheasnglulysmet

115120125

lyslysprolysglumetthrlysglugluilelysgluthrileglu

130135140

alaphelysgluglyalavalargalalyslysalaglyphegluval

145150155160

ilegluilehisalaalahisglytyrleuileasnglupheleuser

165170175

proleuserasnleuarggluaspglutyrglyglyilealagluasn

180185190

argtyrargpheleuarggluvalileaspserileglnservaltrp

195200205

aspglyproleuphevalargvalseralaserasptyrasngluasn

210215220

glyleuaspvalgluasptyrvalthrpheglyargtrpmetlysglu

225230235240

glnglyileaspleuileaspvalserserglyalaleuvalproala

245250255

argilehisalatyrproglytyrglnvallysphealagluthrile

260265270

lysasnglualaaspileprothrglyalavalglyleuilethrser

275280285

glyleuglnalaglugluileleuglnasnaspargalaaspleuile

290295300

pheilealaarggluleuleuargaspprotyrpheprolysthrala

305310315320

alalysglnleuglythrgluilegluproprolysglntyrasparg

325330335

glytrp

<210>10

<211>1017

<212>dna

<213>芽孢桿菌屬的種

<400>10

atggacacaaagttattttcttcatacacagtgaaagacgtcacactaaaaaaccgcatc60

gtcatggcgccgatgtgcatgtattccagccataatgaagatggaaaagtagaaaactgg120

catttgacccattatacaagcagagctgttggacaggttggcctgatcattgtggaagcg180

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catatcgaggggctgcagcagctgacaggcatgatgaaggagcatggcacccgtgccggc300

atccagcttgcgcatgcaggcagaaaagcggttattgagggcgaaatcattgctccatct360

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gaaacgatcgaagcctttaaggaaggcgctgtccgtgctaaaaaagcaggcttcgaggtt480

atagaaatccatgctgcccacggctatctgatcaatgagtttctatccccgctttccaat540

ctgcgggaggatgaatacggcgggatcgcagaaaaccgctaccgcttcctgagggaagtc600

atcgacagcatccagtctgtttgggacggacctctctttgtaagggtatcagcgagcgat660

tataacgaaaacggacttgatgttgaggattatgtcacgttcgggcgctggatgaaagag720

cagggcatcgacctgatcgatgtaagctccggagcactggtgccggcccgcattcacgct780

tatccaggctaccaggtcaaattcgctgaaaccatcaagaatgaggcagacatcccgaca840

ggcgccgtcggcctgattacatccggactgcaggctgaagagatcctgcaaaacgacaga900

gcagaccttatcttcatcgcacgtgagctgctccgcgatccatacttcccaaaaaccgca960

gccaaacagctcggcaccgaaatcgaacccccgaaacaatatgatagagggtggtaa1017