相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求于2014年9月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)62/057,541和于2015年6月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)62/172,511的權(quán)益，所述申請(qǐng)兩者的內(nèi)容以其整體通過(guò)引用并入本文。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有特定特性的抗-犬pd-l1抗體。本發(fā)明也涉及針對(duì)犬pd-l1的犬源化（caninized）抗體，其具有特定序列并對(duì)犬pd-l1具有高結(jié)合親和力。本發(fā)明還涉及結(jié)合這些抗體的犬pd-l1的表位，以及結(jié)合這些表位的抗-犬pd-l1抗體。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗體在治療狗(包括癌癥治療)中的用途。發(fā)明背景主要在活化的t和b細(xì)胞上表達(dá)的免疫抑制性受體(程序性細(xì)胞死亡受體1，也被稱為程序性死亡受體(pd-1))是與cd28和細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白-4(ctla-4)相關(guān)的免疫球蛋白超家族的一個(gè)成員。pd-1和類(lèi)似家族成員是含有胞外ig可變型(v-型)結(jié)構(gòu)域(其結(jié)合其配體)和胞質(zhì)尾區(qū)(其結(jié)合信號(hào)傳導(dǎo)分子)的i型跨膜糖蛋白。pd-1的胞質(zhì)尾區(qū)含有兩個(gè)基于酪氨酸的信號(hào)傳導(dǎo)基序：itim(基于免疫受體酪氨酸的抑制基序)和itsm(基于免疫受體酪氨酸的轉(zhuǎn)換基序)。pd-1當(dāng)結(jié)合程序性細(xì)胞死亡配體1(也被稱為程序性死亡配體1(pd-l1))和/或程序性細(xì)胞死亡配體2(也被稱為程序性死亡配體2(pd-l2))時(shí)減弱t-細(xì)胞應(yīng)答。這些配體中的任一種與pd-1的結(jié)合負(fù)調(diào)節(jié)抗原受體信號(hào)傳導(dǎo)。阻斷pd-l1與pd-1的結(jié)合增強(qiáng)腫瘤特異性的cd8+t-細(xì)胞免疫，同時(shí)輔助免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的清除。已經(jīng)報(bào)道了鼠pd-1的三維結(jié)構(gòu)、以及小鼠pd-1與人pd-l1的共晶（co-crystal）結(jié)構(gòu)[zhang等人,immunity20:337-347(2004);lin等人,proc.natl.acad.sci.usa105:3011-3016(2008)]。pd-l1和pd-l2是含有胞外區(qū)域中的igv-和igc-樣結(jié)構(gòu)域以及不具有已知信號(hào)傳導(dǎo)基序的短細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的i型跨膜配體。pd-l1和pd-l2兩者組成型表達(dá)，或者可以在多種細(xì)胞類(lèi)型(包括非造血組織以及各種腫瘤類(lèi)型)中誘導(dǎo)。pd-l1不僅在b、t、髓樣和樹(shù)突細(xì)胞(dc)上表達(dá)，而且在周?chē)?xì)胞(諸如微血管內(nèi)皮細(xì)胞和非淋巴器官例如心臟或肺)上表達(dá)。相對(duì)照而言，pd-l2僅存在于巨噬細(xì)胞和dc上。pd-1配體的表達(dá)模式提示，pd-1在維持外周耐受中起作用，并且還可以用于調(diào)節(jié)外周中的自身反應(yīng)性t-和b-細(xì)胞應(yīng)答。在任何情況下，現(xiàn)在非常清楚的是，pd-1和pd-l1在至少某些人癌癥中起關(guān)鍵作用，據(jù)推測(cè)通過(guò)介導(dǎo)免疫逃避。因此，pd-l1已經(jīng)被顯示在許多小鼠和人腫瘤上表達(dá)，且在大多數(shù)pd-l1陰性的腫瘤細(xì)胞系中可被ifn-γ誘導(dǎo)[iwai等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.99:12293-12297(2002);strome等人,cancerres.,63:6501-6505(2003)]。此外，已經(jīng)在許多原發(fā)性人腫瘤活組織檢查中鑒定出pd-1在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞上的表達(dá)和/或pd-l1在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)。此類(lèi)腫瘤組織包括肺、肝、卵巢、子宮頸、皮膚、結(jié)腸、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱、乳房、腎、食管、胃、口腔鱗狀細(xì)胞、泌尿道上皮細(xì)胞和胰腺的癌癥以及頭和頸的腫瘤[brown等人,j.immunol.170:1257-1266(2003);dong等人,nat.med.8:793-800(2002);wintterle等人,cancerres.63:7462-7467(2003);strome等人,cancerres.,63:6501-6505(2003);thompson等人,cancerres.66:3381-5(2006);thompson等人,clin.cancerres.13:1757-1761(2007);nomi等人,clin.cancerres.13:2151-2157.(2007)]。更驚人的是，腫瘤細(xì)胞上的pd-配體表達(dá)已經(jīng)與跨多個(gè)腫瘤類(lèi)型的人癌癥患者的不良預(yù)后相關(guān)聯(lián)[綜述于okazaki和honjo,int.immunol.19:813-824(2007)]。此外，nomi等人[clin.cancerres.13:2151-2157(2007)]證明通過(guò)施用pd-1或pd-l1指導(dǎo)的抗體在侵襲性胰腺癌的鼠模型中阻斷pd-l1與pd-1的結(jié)合的治療功效。這些抗體有效地促進(jìn)腫瘤反應(yīng)性的cd8+t細(xì)胞向腫瘤中的滲入，從而導(dǎo)致抗腫瘤效應(yīng)物(包括ifn-γ、粒酶b和穿孔蛋白)的上調(diào)。類(lèi)似地，使用抗體來(lái)阻斷pd-l1和pd-1的結(jié)合在小鼠鱗狀細(xì)胞癌模型中顯著地抑制腫瘤生長(zhǎng)[tsushima等人,oraloncol.42:268-274(2006)]。在其它研究中，用pd-l1轉(zhuǎn)染鼠肥大細(xì)胞瘤系導(dǎo)致當(dāng)與腫瘤特異性ctl克隆共培養(yǎng)時(shí)減少的腫瘤細(xì)胞裂解。當(dāng)加入抗-pd-l1單克隆抗體時(shí)，裂解被恢復(fù)[iwai等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.99:12293-12297(2002)]。在體內(nèi)，顯示了阻斷pd-1/pd-l1相互作用增加繼承性t細(xì)胞轉(zhuǎn)移療法在小鼠腫瘤模型中的功效[strome等人,cancerres.63:6501-6505(2003)]。關(guān)于pd-1和pd-l1在癌癥治療中的作用的進(jìn)一步證據(jù)來(lái)自用pd-1敲除的小鼠執(zhí)行的實(shí)驗(yàn)，其中表達(dá)pd-l1的骨髓瘤細(xì)胞僅在野生型動(dòng)物中生長(zhǎng)(從而導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)和相關(guān)的動(dòng)物死亡)，但不在pd-1缺陷型小鼠中生長(zhǎng)[iwaiy.等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.99:12293-12297(2002)]。更近來(lái)，針對(duì)人pd-1的人源化鼠單克隆抗體已經(jīng)在人類(lèi)的癌癥療法中顯示了初步成功[參見(jiàn)例如，us8,354,509b2、us8,008,449b2和us7,595,048b2]?？?pd-l1抗體還可用于慢性病毒感染中。在急性病毒感染后產(chǎn)生的記憶cd8+t細(xì)胞是高度功能性的，并且構(gòu)成保護(hù)性免疫的一個(gè)重要組分。相對(duì)照而言，慢性感染經(jīng)常特征在于病毒特異性的t-細(xì)胞應(yīng)答的不同程度的功能損害(耗盡)，并且該缺陷是宿主不能消除持久病原體的主要原因。盡管功能性效應(yīng)t細(xì)胞最初在感染的早期階段產(chǎn)生，但它們?cè)诼愿腥镜倪M(jìn)程期間逐漸喪失功能。barber等人[nature439:682-687(2006)]顯示，用lcmv的實(shí)驗(yàn)室毒株感染的小鼠發(fā)展慢性感染，導(dǎo)致血液和其它組織中的高病毒水平。這些小鼠最初發(fā)展了穩(wěn)健的t細(xì)胞應(yīng)答，但最終在t細(xì)胞耗盡時(shí)屈服于感染。barber等人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)注射阻斷pd-1和pd-l1之間的相互作用的抗體，可以逆轉(zhuǎn)慢性感染的小鼠中效應(yīng)t細(xì)胞的數(shù)目和功能的下降。犬抗體(也稱為免疫球蛋白g或igg)是約150kd的大四聚體蛋白。每個(gè)igg蛋白由兩條相同的、各約25kd的輕鏈和兩條相同的、各約50kd的重鏈構(gòu)成。存在犬igg的四個(gè)已知的igg重鏈亞類(lèi)，且其被稱為igga、iggb、iggc和iggd。存在兩種類(lèi)型的輕鏈：κ和λ鏈。κ或λ輕鏈各自由一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(vl)和一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(cl)構(gòu)成。兩條重鏈各自由一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(vh)和三個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(稱為ch-1、ch-2和ch-3)組成。ch-1結(jié)構(gòu)域經(jīng)由稱為“鉸鏈”或可替代地稱為“鉸鏈區(qū)”的氨基酸序列連接至ch-2結(jié)構(gòu)域。在人類(lèi)中，igg以四個(gè)被稱為igg1、igg2、igg3和igg4的亞類(lèi)中的一類(lèi)而存在。igg的亞類(lèi)很大程度上由鉸鏈區(qū)的序列所確定，該序列在igg的四個(gè)亞類(lèi)中不同。兩條重鏈通過(guò)二硫鍵彼此連接，并且每條重鏈也通過(guò)二硫鍵連接至輕鏈之一。用酶木瓜蛋白酶消化igg抗體使抗體分子在鉸鏈區(qū)斷裂且導(dǎo)致形成三個(gè)片段。這些片段中的兩個(gè)是相同的并且各自由與重鏈的vh和ch1結(jié)構(gòu)域保持在一起的輕鏈組成。這些片段被稱為“fab”片段，并且其含有抗體的抗原結(jié)合部位。用木瓜蛋白酶消化所得的第三個(gè)片段被稱為“fc”，并且其含有通過(guò)二硫鍵保持在一起的兩條重鏈的剩余部分。fc因此含有由兩條重鏈各自的ch2和ch3結(jié)構(gòu)域組成的二聚體。盡管fab使得抗體能夠結(jié)合其相關(guān)表位，但fc使得抗體能夠介導(dǎo)免疫效應(yīng)子功能諸如抗體依賴性細(xì)胞毒作用(adcc)、依賴抗體的吞噬作用(adcp)和依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(cdc)。本領(lǐng)域眾所周知的是，igg抗體通過(guò)使其fc部分結(jié)合被稱為fcγ受體的蛋白家族來(lái)介導(dǎo)效應(yīng)子功能諸如adcc和adcp，而cdc通過(guò)使fc結(jié)合補(bǔ)體的第一組分c1q來(lái)介導(dǎo)。本領(lǐng)域還眾所周知的是，不同的igg亞類(lèi)在其介導(dǎo)這些效應(yīng)子功能的能力方面不同。例如，人igg1顯示出強(qiáng)adcc和cdc，而igg4顯示出弱至無(wú)adcc和cdc。另外，用于鑒定哪個(gè)igg亞類(lèi)顯示出或缺乏效應(yīng)子功能的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。依賴于針對(duì)治療目的的單克隆抗體使用的方法需要設(shè)計(jì)符合目的的抗體或抗體片段以實(shí)現(xiàn)所需的治療響應(yīng)。例如，一些癌癥治療方法需要治療用抗體具有增強(qiáng)的效應(yīng)子功能，而其它需要顯著減少或完全消除效應(yīng)子功能。效應(yīng)子功能的增強(qiáng)或消除可以通過(guò)如下實(shí)現(xiàn)：在抗體的fc部分引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸突變(取代)，從而增強(qiáng)或減少對(duì)fcγ受體以及補(bǔ)體的第一組分的結(jié)合?，F(xiàn)有技術(shù)中有許多報(bào)道描述了可被引入抗體分子以調(diào)節(jié)其效應(yīng)子功能的氨基酸取代。例如，shields等人[j.ofbiol.chem.,276(9):6591-6604(2001)]公開(kāi)了天冬酰胺至丙氨酸(n297a)取代，其導(dǎo)致非糖基化的抗體，顯著減少了抗體與幾種fcγ受體的結(jié)合。另外，shields等人公開(kāi)了天冬氨酸至丙氨酸(d265a)取代也顯著減少了抗體與fcγ受體的結(jié)合。n297a和d265a取代各自也顯示顯著損害cdc。還有其它類(lèi)似的報(bào)道也鑒定了可能減少或消除抗體中的效應(yīng)子功能的取代[例如，sazinsky等人，proc.nat.acad.sci.,105:20167-20172(2008),alegre等人,transplantation,57:1537-1543(1994),hutchins等人,proc.nat.acad.sci.92:11980-11984(1994),mcearchem等人,blood,109:1185-1192(2007)]。本文中的任何參考文獻(xiàn)的引用不應(yīng)解釋為承認(rèn)此參考文獻(xiàn)可作為本申請(qǐng)的“現(xiàn)有技術(shù)”得到。發(fā)明概述本發(fā)明提供了特異性結(jié)合犬程序性死亡配體1(犬pd-l1)的抗體及其抗原結(jié)合片段(包括分離的抗體和其分離的抗原結(jié)合片段)。在具體實(shí)施方案中，所述抗體及其片段是哺乳動(dòng)物抗體。在更具體實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體是鼠(即小鼠)抗體。在本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)方面，所述分離的抗體是犬源化抗體。在具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗體是犬源化哺乳動(dòng)物(例如小鼠)抗-犬pd-l1抗體。本發(fā)明的抗體及其抗原結(jié)合片段結(jié)合犬pd-l1，并且可以阻斷犬pd-l1與犬程序性死亡受體1(pd-1)的結(jié)合。本發(fā)明還提供了此類(lèi)抗體或其抗原結(jié)合片段在治療疾病(例如治療犬的癌癥)中的用途。在具體實(shí)施方案中，特異性結(jié)合犬pd-l1的抗體或其抗原結(jié)合片段包含三個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)：cdr輕1(cdrl1)、cdr輕2(cdrl2)和cdr輕3(cdrl3)；和三個(gè)重鏈cdr：cdr重1(cdrh1)、cdr重2(cdrh2)和cdr重3(cdrh3)。在某些實(shí)施方案中，cdrh1包含seqidno:13的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，cdrh1包含seqidno:13的保守修飾的變體。在還有其它實(shí)施方案中，cdrh1包含seqidno:13的變體(例如，功能保守的變體)，其包含1規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)。在還有其它實(shí)施方案中，cdrh1包含seqidno:19的氨基酸序列。在還有其它實(shí)施方案中，cdrh1包含seqidno:19的保守修飾的變體。在還有其它實(shí)施方案中，cdrh1包含seqidno:19的變體(例如，功能保守的變體)，其包含1規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)。在某些實(shí)施方案中，cdrh2包含seqidno:14的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，cdrh2包含seqidno:14的保守修飾的變體。在還有其它實(shí)施方案中，cdrh2包含seqidno:14的變體(例如，功能保守的變體)，其包含3b規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)。在還有其它實(shí)施方案中，cdrh2包含seqidno:20的氨基酸序列。在還有其它實(shí)施方案中，cdrh2包含seqidno:20的保守修飾的變體。在還有其它實(shí)施方案中，cdrh2包含seqidno:20的變體(例如，功能保守的變體)，其包含3b規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)。在某些實(shí)施方案中，cdrh3包含seqidno:15的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，cdrh3包含seqidno:15的保守修飾的變體。在還有其它實(shí)施方案中，cdrh3包含seqidno:15的變體(例如，功能保守的變體)，其包含10規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)。在還有其它實(shí)施方案中，cdrh3包含seqidno:21的氨基酸序列。在還有其它實(shí)施方案中，cdrh3包含seqidno:21的保守修飾的變體。在還有其它實(shí)施方案中，cdrh3包含seqidno:21的變體(例如，功能保守的變體)，其包含8規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)。在某些實(shí)施方案中，cdrl1包含seqidno:16的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，cdrl1包含seqidno:16的保守修飾的變體。在還有其它實(shí)施方案中，cdrl1包含seqidno:16的變體(例如，功能保守的變體)，其包含2規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)。在還有其它實(shí)施方案中，cdrl1的氨基酸序列包含seqidno:22。在還有其它實(shí)施方案中，cdrl1包含seqidno:22的保守修飾的變體。在還有其它實(shí)施方案中，cdrl1包含seqidno:22的變體(例如，功能保守的變體)，其包含3規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)。在某些實(shí)施方案中，cdrl2包含seqidno:17的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，cdrl2包含seqidno:17的保守修飾的變體。在還有其它實(shí)施方案中，cdrl2包含seqidno:17的變體(例如，功能保守的變體)，其包含1規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)。在還有其它實(shí)施方案中，cdrl2包含seqidno:23。在還有其它實(shí)施方案中，cdrl2包含seqidno:23的保守修飾的變體。在還有其它實(shí)施方案中，cdrl2包含seqidno:23的變體(例如，功能保守的變體)，其包含1規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)。在某些實(shí)施方案中，cdrl3包含seqidno:18的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，cdrl3包含seqidno:18的保守修飾的變體。在還有其它實(shí)施方案中，cdrl3包含seqidno:18的變體(例如，功能保守的變體)，其包含1規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)。在還有其它實(shí)施方案中，cdrl3包含seqidno:24的氨基酸序列。在還有其它實(shí)施方案中，cdrl3包含seqidno:24的保守修飾的變體。在還有其它實(shí)施方案中，cdrl3包含seqidno:24的變體(例如，功能保守的變體)，其包含1規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)。本發(fā)明還提供了給定抗體中的本發(fā)明的cdr(或其變體)中的兩個(gè)或更多個(gè)(例如，包含seqidno:15的氨基酸序列的cdrh3和包含氨基酸序列seqidno:18的氨基酸序列)的組合。在具體實(shí)施方案中，結(jié)合犬pd-l1的抗體及其抗原結(jié)合片段包含cdrh1，其包含seqidno:13、seqidno:13的保守修飾的變體或seqidno:13的包含1規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)的變體(例如，功能保守的變體)的氨基酸序列；cdrh2，其包含seqidno:14、seqidno:14的保守修飾的變體或seqidno:14的包含3b規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)的變體(例如，功能保守的變體)的氨基酸序列；cdrh3，其包含seqidno:15，seqidno:15的保守修飾的變體，或seqidno:15的包含10規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)的變體(例如，功能保守的變體)；cdrl1，其包含seqidno:16、seqidno:16的保守修飾的變體或seqidno:16的包含2規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)的變體(例如，功能保守的變體)的氨基酸序列；cdrl2，其包含seqidno:17、seqidno:17的保守修飾的變體或seqidno:17的包含1規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)的變體(例如，功能保守的變體)的氨基酸序列；和cdrl3，其包含seqidno:18、seqidno:18的保守修飾的變體或seqidno:18的包含1規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)的變體(例如，功能保守的變體)的氨基酸序列。在相關(guān)實(shí)施方案中，結(jié)合犬pd-l1的抗體及其抗原結(jié)合片段包含cdrh1，其包含seqidno:19、seqidno:19的保守修飾的變體或seqidno:19的包含1規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)的變體(例如，功能保守的變體)的氨基酸序列；cdrh2，其包含seqidno:20、seqidno:20的保守修飾的變體或seqidno:20的包含3b規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)的變體(例如，功能保守的變體)的氨基酸序列；cdrh3，其包含seqidno:21、seqidno:21的保守修飾的變體或seqidno:21的包含8規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)的變體(例如，功能保守的變體)；cdrl1，其包含seqidno:22、seqidno:22的保守修飾的變體或seqidno:22的包含3規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)的變體(例如，功能保守的變體)的氨基酸序列；cdrl2，其包含seqidno:23、seqidno:23的保守修飾的變體或seqidno:23的包含1規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)的變體(例如，功能保守的變體)的氨基酸序列；和cdrl3，其包含seqidno:24、seqidno:24的保守修飾的變體或seqidno:24的包含1規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)的變體(例如，功能保守的變體)的氨基酸序列。因此，在本發(fā)明的一個(gè)具體方面，本發(fā)明還提供了犬源化抗-犬pd-l1抗體。在某些實(shí)施方案中，所述犬源化抗-犬pd-l1抗體是犬源化哺乳動(dòng)物(例如，鼠)抗-犬pd-l1抗體。在具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗-犬pd-l1抗體(例如，犬源化哺乳動(dòng)物抗-犬pd-l1抗體，諸如犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體)包含其已經(jīng)被遺傳修飾以增強(qiáng)、降低或消除一種或多種效應(yīng)子功能的cfc。在這種類(lèi)型的具體實(shí)施方案中，遺傳修飾的cfc降低或消除一種或多種效應(yīng)子功能。在其它具體實(shí)施方案中，遺傳修飾的cfc增強(qiáng)一種或多種效應(yīng)子功能。在某些實(shí)施方案中，遺傳修飾的cfc區(qū)是遺傳修飾的犬iggbfc區(qū)。在另一個(gè)此類(lèi)實(shí)施方案中，遺傳修飾的cfc區(qū)是遺傳修飾的犬iggcfc區(qū)。在具體實(shí)施方案中，所述效應(yīng)子功能是被增強(qiáng)、降低或消除的抗體依賴性細(xì)胞毒作用(adcc)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述效應(yīng)子功能是被增強(qiáng)、降低或消除的依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(cdc)。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，cfc區(qū)已被遺傳修飾以增強(qiáng)、降低或消除adcc和cdc兩者。本發(fā)明還提供了包含遺傳修飾的cfc區(qū)的犬框架和/或全長(zhǎng)重鏈。因此，本發(fā)明提供了抗體的全長(zhǎng)重鏈，其中所述全長(zhǎng)重鏈包含本發(fā)明的遺傳修飾的cfc區(qū)和本發(fā)明的cdr。此類(lèi)全長(zhǎng)重鏈也可以與對(duì)應(yīng)的犬輕(κ或λ)鏈組合以形成完整的抗體。在這種類(lèi)型的具體實(shí)施方案中，所得抗體結(jié)合犬pd-l1。在某些實(shí)施方案中，遺傳修飾的cfc區(qū)包含seqidno:66(或seqidno:68)的氨基酸序列，其中下列氨基酸殘基中的一至七個(gè)在所示位置被另一個(gè)氨基酸殘基所替代：p4、d31、n63、g64、t65、a93或p95。取代p4、d31、n63、g64、t65、a93和/或p95的氨基酸單獨(dú)地選自其它19種標(biāo)準(zhǔn)天然存在的氨基酸之一，如下表1中所列。本發(fā)明還提供了遺傳修飾的cfc區(qū)的變體，其包含與此類(lèi)遺傳修飾的cfc區(qū)的氨基酸序列具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列，且保留了包含seqidno:66(或seqidno:68)的氨基酸序列的遺傳修飾的cfc區(qū)的adcc和/或cdc的增強(qiáng)、降低或消除的至少50%、75%、90%、95%或更多，其中下列氨基酸殘基中的一個(gè)或多個(gè)被替代：即，在p4、d31、n63、g64、t65、a93或p95處。在其它實(shí)施方案中，下列氨基酸殘基中的二至五個(gè)在所示位置被另一個(gè)氨基酸殘基所替代：p4、d31、n63、g64、t65、a93或p95。在這種類(lèi)型的具體實(shí)施方案中，遺傳修飾的cfc區(qū)包含seqidno:66或seqidno:68的氨基酸序列，其具有下列取代：p4a、d31a、n63a、a93g和p95a。在相關(guān)實(shí)施方案中，遺傳修飾的cfc區(qū)包含seqidno:66或seqidno:68的氨基酸序列，其具有下列取代：p4a、d31a、n63a和p95a。在其它實(shí)施方案中，遺傳修飾的cfc區(qū)包含seqidno:66或seqidno:68的氨基酸序列，其在d31和n63處具有取代。在這種類(lèi)型的具體實(shí)施方案中，位置31處的天冬氨酸被谷氨酸殘基、天冬酰胺殘基或丙氨酸殘基所替代，而位置63處的天冬酰胺殘基被谷氨酰胺殘基、組氨酸殘基或丙氨酸殘基所替代。在這種類(lèi)型的更具體實(shí)施方案中，遺傳修飾的cfc區(qū)包含seqidno:66或seqidno:68的氨基酸序列，其具有下列取代：d31a和n63a。在具體實(shí)施方案中，遺傳修飾的cfc區(qū)由包含核苷酸變化的seqidno:65或seqidno:67的核苷酸序列編碼，所述核苷酸變化對(duì)應(yīng)于其編碼的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳修飾的cfc區(qū)包含seqidno:66或seqidno:68的氨基酸序列，其在a93處具有取代。在這種類(lèi)型的具體實(shí)施方案中，所述取代為a93g。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述取代為a93s。如以其整體通過(guò)引用并入本文的于2014年7月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/030,812中所述，a93g的取代導(dǎo)致補(bǔ)體c1q結(jié)合的增強(qiáng)，其表明增加cdc活性。在相關(guān)實(shí)施方案中，遺傳修飾的cfc區(qū)還包含鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)包含seqidno:45的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，遺傳修飾的cfc區(qū)還包含鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)包含seqidno:46的氨基酸序列。在還有其它實(shí)施方案中，遺傳修飾的cfc區(qū)還包含鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)包含seqidno:47的氨基酸序列。在還有其它實(shí)施方案中，遺傳修飾的cfc區(qū)還包含遺傳修飾的鉸鏈區(qū)，所述遺傳修飾的鉸鏈區(qū)包含seqidno:48的氨基酸序列。在替代實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了犬iggdfc區(qū)，其具有來(lái)自犬iggd抗體的遺傳修飾的鉸鏈區(qū)、來(lái)自犬igga抗體的鉸鏈區(qū)、來(lái)自犬iggb抗體的鉸鏈區(qū)或來(lái)自犬iggc抗體的鉸鏈區(qū)。此外，本發(fā)明提供了抗體的全長(zhǎng)重鏈，其中所述全長(zhǎng)重鏈包含本發(fā)明的犬iggdfc區(qū)，其具有來(lái)自犬iggd抗體的遺傳修飾的鉸鏈區(qū)、來(lái)自犬igga抗體的鉸鏈區(qū)、來(lái)自犬iggb抗體的鉸鏈區(qū)或來(lái)自犬iggc抗體的鉸鏈區(qū)。此類(lèi)全長(zhǎng)重鏈也可以與對(duì)應(yīng)的犬輕(κ或λ)鏈組合以形成完整的抗體。因此，本發(fā)明提供了犬iggdfc區(qū)，其還包含來(lái)自犬iggd抗體的遺傳修飾的鉸鏈區(qū)。在這種類(lèi)型的具體實(shí)施方案中，所述犬iggdfc區(qū)和遺傳修飾的鉸鏈區(qū)包含seqidno:6的氨基酸序列或與seqidno:6的氨基酸序列具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列，其在位置10處包含脯氨酸殘基(p10)。在更具體實(shí)施方案中，所述犬iggdfc區(qū)和遺傳修飾的鉸鏈區(qū)由seqidno:5的核苷酸序列編碼。在其它實(shí)施方案中，所述犬iggdfc區(qū)還包含來(lái)自犬igga抗體的鉸鏈區(qū)。在這種類(lèi)型的具體實(shí)施方案中，所述犬iggdfc區(qū)和鉸鏈區(qū)包含seqidno:8的氨基酸序列或與seqidno:8的氨基酸序列具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在更具體實(shí)施方案中，所述犬iggdfc區(qū)和鉸鏈區(qū)由seqidno:7的核苷酸序列編碼。在還有其它實(shí)施方案中，所述犬iggdfc區(qū)還包含來(lái)自犬iggb抗體的鉸鏈區(qū)。在這種類(lèi)型的具體實(shí)施方案中，所述犬iggdfc區(qū)和鉸鏈區(qū)包含seqidno:10的氨基酸序列或與seqidno:10的氨基酸序列具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在更具體實(shí)施方案中，所述犬iggdfc區(qū)和鉸鏈區(qū)由seqidno:9的核苷酸序列編碼。在還有其它實(shí)施方案中，所述犬iggdfc區(qū)還包含來(lái)自犬iggc抗體的鉸鏈區(qū)。在這種類(lèi)型的具體實(shí)施方案中，所述犬iggdcfc區(qū)和鉸鏈區(qū)包含seqidno:12的氨基酸序列或與seqidno:12的氨基酸序列具有90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列。在更具體實(shí)施方案中，所述犬iggdcfc區(qū)和鉸鏈區(qū)由seqidno:11的核苷酸序列編碼。本發(fā)明還提供了包含這些犬iggdfc區(qū)和鉸鏈區(qū)的犬源化抗體。在具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合犬程序性死亡受體1(犬pd-1)。因此，本發(fā)明提供了對(duì)犬pd-l1具有特異性和/或具有高結(jié)合親和力的犬源化抗-犬pd-l1抗體。在具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗-犬pd-l1抗體還具有阻斷犬pd-l1與犬pd-1的結(jié)合的能力。此類(lèi)特異性結(jié)合犬pd-l1的犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段可包含本發(fā)明的犬igg重鏈和犬κ或λ輕鏈。在具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗-犬pd-l1抗體是犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體。本發(fā)明還涉及此類(lèi)犬源化抗體在治療疾病(諸如癌癥和/或由感染導(dǎo)致的那些)中的用途。在具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗-犬pd-l1抗體包含本發(fā)明的遺傳修飾的cfc區(qū)。在替代實(shí)施方案中，所述犬源化抗-犬pd-l1抗體包含犬iggdfc區(qū)，其具有來(lái)自犬iggd抗體的遺傳修飾的鉸鏈區(qū)、來(lái)自犬igga抗體的鉸鏈區(qū)、來(lái)自犬iggb抗體的鉸鏈區(qū)或來(lái)自犬iggc抗體的鉸鏈區(qū)。本發(fā)明還提供了此類(lèi)犬源化抗-犬pd-l1抗體，其包含本發(fā)明的犬框架與cdr的組合，所述cdr獲得自小鼠抗-犬pd-l1抗體，即，三個(gè)輕鏈cdr：cdr輕1(cdrl1)、cdr輕2(cdrl2)和cdr輕3(cdrl3)，以及三個(gè)重鏈cdr：cdr重1(cdrh1)、cdr重2(cdrh2)和cdr重3(cdrh3)。在具體實(shí)施方案中，所述犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體包含本發(fā)明的iggb或iggc的遺傳修飾的cfc區(qū)，或者可替代地，犬iggdfc區(qū)，連同：來(lái)自犬iggd抗體的遺傳修飾的鉸鏈區(qū)、來(lái)自犬igga抗體的鉸鏈區(qū)、來(lái)自犬iggb抗體的鉸鏈區(qū)或來(lái)自犬iggc抗體的鉸鏈區(qū)，與獲得自小鼠抗-犬pd-l1抗體的cdr的組合。此外，本發(fā)明不僅提供了如本文詳述的具有特定cdr的犬源化小鼠抗-犬pd-l1抗體，而且還進(jìn)一步提供了犬源化小鼠抗-犬pd-l1抗體，其包含那些cdr的保守修飾的變體以及包含(例如，共享)相同規(guī)范結(jié)構(gòu)的變體。因此，在具體實(shí)施方案中，犬源化抗-犬pd-l1抗體進(jìn)一步包含互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，其中cdr具有下列規(guī)范結(jié)構(gòu)：分別對(duì)于重鏈的cdr1、cdr2和cdr3的h1-1、h2-3b和h3-10。在甚至更具體的實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)輕鏈的cdr具有下列規(guī)范結(jié)構(gòu)：分別對(duì)于輕鏈的cdr1、cdr2和cdr3的l1-2、l2-1和l3-1。在其它實(shí)施方案中，犬源化抗-犬pd-l1抗體進(jìn)一步包含互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，其中cdr具有下列規(guī)范結(jié)構(gòu)：分別對(duì)于重鏈的cdr1、cdr2和cdr3的h1-1、h2-3b和h3-8。在這種類(lèi)型的甚至更具體實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)輕鏈的cdr具有以下規(guī)范結(jié)構(gòu)：分別對(duì)于輕鏈的cdr1、cdr2和cdr3的l1-3、l2-1和l3-1。在更具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含具有seqidno:13或seqidno:19的氨基酸序列的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(vhcdr1)中的一個(gè)或多個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(vhcdr2)包含seqidno:14或seqidno:20的氨基酸序列。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(vhcdr3)包含seqidno:15或seqidno:21的氨基酸序列。在這種類(lèi)型的具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:13或seqidno:19的氨基酸序列的vhcdr1和包含seqidno:14或seqidno:20的氨基酸序列的vhcdr2兩者。在另一個(gè)此類(lèi)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:13或seqidno:19的氨基酸序列的vhcdr1和包含seqidno:15或seqidno:21的氨基酸序列的vhcdr3兩者。在又另一個(gè)此類(lèi)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:14或seqidno:20的氨基酸序列的vhcdr2和包含seqidno:15或seqidno:21的氨基酸序列的vhcdr3兩者。在又另一個(gè)此類(lèi)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:13或seqidno:19的氨基酸序列的vhcdr1、包含seqidno:14或seqidno:20的氨基酸序列的vhcdr2和包含seqidno:15或seqidno:21的氨基酸序列的vhcdr3。在具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或抗原結(jié)合片段還含有包含seqidno:16或seqidno:22的氨基酸序列的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)1(vhcdr1)。在相關(guān)實(shí)施方案中，輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)2(vlcdr2)包含seqidno:17或seqidno:23的氨基酸序列。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)3(vlcdr3)包含seqidno:18或seqidno:24的氨基酸序列。在這種類(lèi)型的具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:16或seqidno:22的氨基酸序列的vlcdr1和包含seqidno:17或seqidno:23的氨基酸序列的vlcdr2兩者。在另一個(gè)此類(lèi)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:16或seqidno:22的氨基酸序列的vlcdr1和包含seqidno:18或seqidno:24的氨基酸序列的vlcdr3兩者。在又另一個(gè)此類(lèi)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:17或seqidno:23的氨基酸序列的vlcdr2和包含seqidno:18或seqidno:24的氨基酸序列的vlcdr3兩者。在又另一個(gè)此類(lèi)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:16或seqidno:22的氨基酸序列的vlcdr1、包含seqidno:17或seqidno:23的氨基酸序列的vlcdr2和包含seqidno:18或seqidno:24的氨基酸序列的vlcdr3。本發(fā)明還提供了包含seqidno:26的氨基酸序列或與seqidno:26的氨基酸序列具有90％、95％、98％或99％同一性和seqidno:28或與seqidno:28的氨基酸序列具有90％、95％、98％或99％同一性的犬源化抗體或這些犬源化抗體的抗原結(jié)合片段。本發(fā)明還提供了包含seqidno:30的氨基酸序列或與seqidno:30的氨基酸序列具有90％、95％、98％或99％同一性和seqidno:32或與seqidno:32的氨基酸序列具有90％、95％、98％或99％同一性的犬源化抗體或這些犬源化抗體的抗原結(jié)合片段。在具體實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:26(或與seqidno:26具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置242處的p、a、g或s，(ii)位置269處的a、g或s，(iii)位置301處的a、g或s，(iv)位置302處的g、p或a，(v)位置303處的t、a、g或s，(vi)位置331處的a、g或s，和(vii)位置333處的p、a、g或s。在其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:28或30(或與seqidno:28或30具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置240處的p、a、g或s，(ii)位置267處的a、g或s，(iii)位置299處的a、g或s，(iv)位置300處的g、p或a，(v)位置301處的t、a、g或s，(vi)位置329處的a、g或s，和(vii)位置331處的p、a、g或s。在還有其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:32(或與seqidno:32具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置238處的p、a、g或s，(ii)位置265處的a、g或s，(iii)位置297處的a、g或s，(iv)位置298處的g、p或a，(v)位置299處的t、a、g或s，(vi)位置327處的a、g或s，和(vii)位置329處的p、a、g或s。在還有其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:26(或與seqidno:26具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置242處的p、a、g或s，(ii)位置269處的a，(iii)位置301處的a，(iv)位置302處的g、p或a，(v)位置303處的t、a、g或s，(vi)位置331處的a、g或s，和(vii)位置333處的p、a、g或s。在其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:28或30(或與seqidno:28或30具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置240處的p、a、g或s，(ii)位置267處的a，(iii)位置299處的a，(iv)位置300處的g、p或a，(v)位置301處的t、a、g或s，(vi)位置329處的a、g或s，和(vii)位置331處的p、a、g或s。在還有其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:32(或與seqidno:32具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置238處的p、a、g或s，(ii)位置265處的a，(iii)位置297處的a，(iv)位置298處的g、p或a，(v)位置299處的t、a、g或s，(vi)位置327處的a、g或s，和(vii)位置329處的p、a、g或s。在還有其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:26(或與seqidno:26具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置242處的a，(ii)位置269處的a，(iii)位置301處的a，(iv)位置302處的p，(v)位置303處的a，(vi)位置331處的g，和(vii)位置333處的a。在其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:28或30(或與seqidno:28或30具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置240處的a，(ii)位置267處的a，(iii)位置299處的a，(iv)位置300處的p，(v)位置301處的a，(vi)位置329處的g，和(vii)位置331處的a。在還有其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:32(或與seqidno:32具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置238處的a，(ii)位置265處的a，(iii)位置297處的a，(iv)位置298處的p，(v)位置299處的a，(vi)位置327處的g，和(vii)位置329處的a。在還有其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:26(或與seqidno:26具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置242處的p，(ii)位置269處的a、g或s，(iii)位置301處的a、g或s，(iv)位置302處的g，(v)位置303處的t，(vi)位置331處的a，和(vii)位置333處的p。在其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:28或30(或與seqidno:28或30具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置240處的p，(ii)位置267處的a、g或s，(iii)位置299處的a、g或s，(iv)位置300處的g，(v)位置301處的t，(vi)位置329處的a，和(vii)位置331處的p。在還有其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:32(或與seqidno:32具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置238處的p，(ii)位置265處的a、g或s，(iii)位置297處的a、g或s，(iv)位置298處的g，(v)位置299處的t，(vi)位置327處的a，和(vii)位置329處的p。在還有其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:26(或與seqidno:26具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置242處的p，(ii)位置269處的a，(iii)位置301處的a，(iv)位置302處的g，(v)位置303處的t，(vi)位置331處的a，和(vii)位置333處的p。在其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:28或30(或與seqidno:28或30具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置240處的p，(ii)位置267處的a，(iii)位置299處的a，(iv)位置300處的g，(v)位置301處的t，(vi)位置329處的a，和(vii)位置331處的p。在還有其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:32(或與seqidno:32具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置238處的p，(ii)位置265處的a，(iii)位置297處的a，(iv)位置298處的p，(v)位置299處的t，(vi)位置327處的a，和(vii)位置329處的p。在其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:26(或與seqidno:26具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置242處的p、a、g或s，(ii)位置269處的a、g或s，(iii)位置301處的a、g或s，(iv)位置302處的g，(v)位置303處的t，(vi)位置331處的a、g或s，和(vii)位置333處的p、a、g或s。在其它此類(lèi)實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:28或30(或與seqidno:28或30具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置240處的p、a、g或s，(ii)位置267處的a、g或s，(iii)位置299處的a、g或s，(iv)位置300處的g，(v)位置301處的t，(vi)位置329處的a、g或s，和(vii)位置331處的p、a、g或s。在還有其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:32(或與seqidno:32具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置238處的p、a、g或s，(ii)位置265處的a、g或s，(iii)位置297處的a、g或s，(iv)位置298處的g，(v)位置299處的t，(vi)位置327處的a、g或s，和(vii)位置329處的p、a、g或s。在還有其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:26(或與seqidno:26具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置242處的p、a、g或s，(ii)位置269處的a，(iii)位置301處的a，(iv)位置302處的g，(v)位置303處的t，(vi)位置331處的a、g或s，和(vii)位置333處的p、a、g或s。在還有其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:28或30(或與seqidno:28或30具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置240處的p、a、g或s，(ii)位置267處的a，(iii)位置299處的a，(iv)位置300處的g，(v)位置301處的t，(vi)位置329處的a、g或s，和(vii)位置331處的p、a、g或s。在其它此類(lèi)實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:32(或與seqidno:32具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置238處的p、a、g或s，(ii)位置265處的a，(iii)位置297處的a，(iv)位置298處的g，(v)位置299處的t，(vi)位置327處的a、g或s，和(vii)位置329處的p、a、g或s。在還有其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:26(或與seqidno:26具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置242處的a，(ii)位置269處的a，(iii)位置301處的a，(iv)位置302處的g，(v)位置303處的t，(vi)位置331處的g，和(vii)位置333處的a。在還有其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:28或30(或與seqidno:28或30具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置240處的a，(ii)位置267處的a，(iii)位置299處的a，(iv)位置300處的g，(v)位置301處的t，(vi)位置329處的g，和(vii)位置331處的a。在其它此類(lèi)實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:32(或與seqidno:32具有90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸序列，其包含(i)位置238處的a，(ii)位置265處的a，(iii)位置297處的a，(iv)位置298處的g，(v)位置299處的t，(vi)位置327處的g，和(vii)位置329處的a。此外，本發(fā)明提供了還包含犬輕鏈的犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段，所述犬輕鏈包含seqidno:38或seqidno:44的氨基酸序列。因此，本發(fā)明還提供了犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有包含seqidno:34的氨基酸序列的重鏈和包含seqidno:38的氨基酸序列的輕鏈。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:36的氨基酸序列的重鏈和包含seqidno:38的氨基酸序列的輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:40的氨基酸序列的重鏈和包含seqidno:44的氨基酸序列的輕鏈。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:42的氨基酸序列的重鏈和包含seqidno:44的氨基酸序列的輕鏈。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:34的氨基酸序列的重鏈和包含seqidno:44的氨基酸序列的輕鏈。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:36的氨基酸序列的重鏈和包含seqidno:44的氨基酸序列的輕鏈。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:40的氨基酸序列的重鏈和包含seqidno:38的氨基酸序列的輕鏈。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:42的氨基酸序列的重鏈和包含seqidno:38的氨基酸序列的輕鏈。本發(fā)明還提供了犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有包含seqidno:26的氨基酸序列的重鏈和包含seqidno:38的氨基酸序列的輕鏈。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:28的氨基酸序列的重鏈和包含seqidno:38的氨基酸序列的輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:30的氨基酸序列的重鏈和包含seqidno:44的氨基酸序列的輕鏈。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:32的氨基酸序列的重鏈和包含seqidno:44的氨基酸序列的輕鏈。本發(fā)明還提供了犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其含有包含seqidno:26的氨基酸序列的重鏈和包含seqidno:44的氨基酸序列的輕鏈。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:28的氨基酸序列的重鏈和包含seqidno:44的氨基酸序列的輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:30的氨基酸序列的重鏈和包含seqidno:38的氨基酸序列的輕鏈。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段含有包含seqidno:32的氨基酸序列的重鏈和包含seqidno:38的氨基酸序列的輕鏈。本發(fā)明還提供了核酸，其編碼本發(fā)明的任何氨基酸序列，包括本發(fā)明的犬源化抗體的cdr、cfc區(qū)、具有鉸鏈區(qū)的cfc區(qū)以及重鏈和輕鏈。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的一種或多種核酸的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的一種或多種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞和使用此類(lèi)宿主細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明的犬源化抗體的cdr和/或cfc區(qū)和/或具有鉸鏈區(qū)的cfc區(qū)和/或重鏈和/或輕鏈的方法。本發(fā)明還提供了宿主細(xì)胞，其已被基因工程改造以在不存在此類(lèi)載體的情況下表達(dá)本發(fā)明的犬源化抗體的cdr和/或cfc區(qū)和/或具有鉸鏈區(qū)的cfc區(qū)和/或重鏈和/或輕鏈。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的這些核酸、表達(dá)載體、多肽或宿主細(xì)胞可用于制備抗體的方法中。在具體實(shí)施方案中，所述抗體是重組抗體或其重組抗原結(jié)合片段。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述可變重鏈結(jié)構(gòu)域和可變輕鏈結(jié)構(gòu)域通過(guò)柔性接頭連接以形成單鏈抗體。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗體或其抗原結(jié)合片段(例如，分離的抗體或其分離的抗原結(jié)合片段)，其特異性結(jié)合犬pd-l1，并且當(dāng)其結(jié)合犬pd-l1時(shí)，所述抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合seqidno:82的氨基酸序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基。在相關(guān)實(shí)施方案中，特異性結(jié)合犬pd-l1的抗體或其抗原結(jié)合片段也結(jié)合seqidno:83的氨基酸序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基。在還有其它實(shí)施方案中，特異性結(jié)合犬pd-l1的抗體或其抗原結(jié)合片段也結(jié)合seqidno:82的氨基酸序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基和seqidno:83的氨基酸序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基。在具體實(shí)施方案中，這些抗體和/或其抗原結(jié)合片段阻斷犬pd-l1與犬pd-1的結(jié)合。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體。在這種類(lèi)型的具體實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆鼠抗-犬pd-l1抗體。在更具體實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是犬源化抗體。在又更具體實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體。在某些實(shí)施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合seqidno:82的2至5個(gè)氨基酸殘基。在其它實(shí)施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合seqidno:82的6至12個(gè)氨基酸殘基。在還有其它實(shí)施方案中，所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合seqidno:82的13至20個(gè)氨基酸殘基。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合seqidno:83的2至5個(gè)氨基酸殘基。在其它實(shí)施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合seqidno:83的6至11個(gè)氨基酸殘基。在還有其它實(shí)施方案中，提供了單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，其與本發(fā)明的抗-犬pd-l1抗體中的一種或多種交叉競(jìng)爭(zhēng)與犬pd-l1結(jié)合。在具體實(shí)施方案中，交叉競(jìng)爭(zhēng)性抗體及其抗原結(jié)合片段結(jié)合犬pd-l1且阻斷犬pd-l1與犬pd-1的結(jié)合。在更具體實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與4f9(或具有4f9的6個(gè)cdr的抗體)交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合犬pd-l1。在其它更具體實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與5f12(或具有5f12的6個(gè)cdr的抗體)交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合犬pd-l1。在還有其它實(shí)施方案中，所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段與4f9和5f12兩者交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合犬pd-l1。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體是鼠抗體。在其它實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是犬源化抗體。在更具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體是犬源化鼠抗體。此外，本發(fā)明提供了針對(duì)犬pd-l1的抗體(例如，犬源化抗體)，其包含本發(fā)明的cdr或具有本文提供的相應(yīng)規(guī)范結(jié)構(gòu)的cdr的變體，和/或結(jié)合pd-l1的seqidno:82和/或83的氨基酸序列。在這種類(lèi)型的具體實(shí)施方案中，犬源化抗體-犬pd-l1結(jié)合的解離常數(shù)(kd)為1x10-5至1x10-12m。在更具體實(shí)施方案中，針對(duì)犬pd-l1的犬源化抗體包含具有本文提供的相應(yīng)規(guī)范結(jié)構(gòu)的本發(fā)明的cdr的變體且結(jié)合pd-l1的seqidno:82和/或83的氨基酸序列。因此，本發(fā)明包括犬源化抗體及其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合犬pd-l1，并且當(dāng)其結(jié)合犬pd-l1時(shí)，所述抗體結(jié)合pd-l1的seqidno:82和/或83的氨基酸序列內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基。在這種類(lèi)型的具體實(shí)施方案中，所述抗體及其抗原結(jié)合片段結(jié)合犬pd-l1且阻斷犬pd-l1與犬pd-1的結(jié)合。因此，在具體實(shí)施方案中，當(dāng)結(jié)合犬pd-l1時(shí)，犬源化抗體(包括這樣的抗體，其具有一個(gè)或多個(gè)變體cdr，例如變體，諸如但不限于保守修飾的變體和/包含限定的規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別的變體)結(jié)合pd-l1的表位內(nèi)的至少一個(gè)氨基酸殘基，例如seqidno:82和/或seqidno:83的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了以低于1x10-12m(例如，1x10-13m，或甚至更低)的解離常數(shù)(kd)結(jié)合犬pd-l1的犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段。在其它實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段以1x10-5m至1x10-12m的解離常數(shù)結(jié)合犬pd-l1。在更具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段以1x10-7m至1x10-11m的解離常數(shù)結(jié)合犬pd-l1。在又更具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段以1x10-8m至1x10-11m的解離常數(shù)結(jié)合犬pd-l1。在又更具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段以1x10-8m至1x10-10m的解離常數(shù)結(jié)合犬pd-l1。本發(fā)明還提供了以大于1x107m-1s-1的結(jié)合速率(kon)結(jié)合犬pd-l1的犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段。在其它實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段以1x102m-1s-1至1x107m-1s-1的結(jié)合速率結(jié)合犬pd-l1。在更具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段以1x103m-1s-1至1x106m-1s-1的結(jié)合速率結(jié)合犬pd-l1。在又更具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段以1x103m-1s-1至1x105m-1s-1的結(jié)合速率結(jié)合犬pd-l1。在又更具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段以1x104m-1s-1至1x105m-1s-1的結(jié)合速率結(jié)合犬pd-l1。本發(fā)明還提供了以慢于1x10-7s-1的解離速率(koff)結(jié)合犬pd-l1的犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段。在具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段以1x10-3s-1至1x10-8s-1的解離速率結(jié)合犬pd-l1。在更具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段以1x10-4s-1至1x10-7s-1的解離速率結(jié)合犬pd-l1。在又更具體實(shí)施方案中，所述犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段以1x10-5s-1至1x10-7s-1的解離速率結(jié)合犬pd-l1。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述抗體(例如，犬源化抗體)或其抗原結(jié)合片段刺激對(duì)腫瘤或病原體的抗原特異性記憶應(yīng)答。在具體實(shí)施方案中，所述抗體(例如，犬源化抗體)或其抗原結(jié)合片段刺激體內(nèi)抗體應(yīng)答。在其它具體實(shí)施方案中，所述抗體(例如，犬源化抗體)或其抗原結(jié)合片段刺激動(dòng)物受試者中的免疫應(yīng)答。在更具體實(shí)施方案中，所述動(dòng)物受試者是犬科動(dòng)物。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，所述動(dòng)物受試者是貓科動(dòng)物。因此，本發(fā)明的任何抗體(例如，犬源化抗體)可以在動(dòng)物受試者中表現(xiàn)出一種、兩種、三種、四種、五種或所有這些特性，即前述與犬pd-l1的解離常數(shù)，前述與犬pd-l1結(jié)合的結(jié)合常數(shù)，前述從犬源化抗體-犬pd-l1結(jié)合復(fù)合物解離的解離速率，刺激對(duì)腫瘤或病原體的抗原特異性記憶應(yīng)答，刺激體內(nèi)抗體應(yīng)答，和/或刺激免疫應(yīng)答。在更具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體和/或其抗原結(jié)合片段結(jié)合犬pd-l1且還阻斷犬pd-l1與pd-1的結(jié)合。在甚至更具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的犬源化抗體及其抗原結(jié)合片段結(jié)合犬pd-l1且阻斷犬pd-l1與pd-1的結(jié)合。如上所述，本發(fā)明的抗體(及其抗原結(jié)合片段)，包括某些前述抗體(及其抗原結(jié)合片段)，可以是單克隆抗體(及其抗原結(jié)合片段)，哺乳動(dòng)物抗體(及其抗原結(jié)合片段)，例如，鼠(小鼠)抗體(及其抗原結(jié)合片段)，犬源化抗體(及其抗原結(jié)合片段)，包括犬源化鼠抗體(及其抗原結(jié)合片段)。在某些實(shí)施方案中，所述抗體(及其抗原結(jié)合片段)是分離的。在具體實(shí)施方案中，所述抗體是重組抗體或其抗原結(jié)合片段。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述可變重鏈結(jié)構(gòu)域和可變輕鏈結(jié)構(gòu)域通過(guò)柔性接頭連接以形成單鏈抗體。在具體實(shí)施方案中，所述抗體或抗原結(jié)合片段是fab片段。在其它實(shí)施方案中，所述抗體或抗原結(jié)合片段是fab'片段。在其它實(shí)施方案中，所述抗體或抗原結(jié)合片段是(fab')2片段。在還有其它實(shí)施方案中，所述抗體或抗原結(jié)合片段是雙抗體。在具體實(shí)施方案中，所述抗體或抗原結(jié)合片段是結(jié)構(gòu)域抗體。在具體實(shí)施方案中，所述抗體或抗原結(jié)合片段是駱駝源化（camelized）單結(jié)構(gòu)域抗體。在具體實(shí)施方案中，犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體或抗原結(jié)合片段增加所治療的動(dòng)物受試者(例如，犬科動(dòng)物或貓科動(dòng)物)的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的抗體及其部分(包括cdr)中的任一種的核酸(包括分離的核酸)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的犬源化抗體的輕鏈或其部分中的任一種的核酸(包括分離的核酸)。類(lèi)似地，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的犬源化抗體的重鏈或其部分中的任一種的核酸(包括分離的核酸)。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的一種或多種核酸(包括分離的核酸)的表達(dá)載體。因此，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體或其部分的核酸。在相關(guān)實(shí)施方案中，此類(lèi)抗體或抗原結(jié)合片段可用于制備藥物以治療犬科動(dòng)物和/或貓科動(dòng)物受試者中的癌癥?？商娲蚪Y(jié)合地，本發(fā)明提供了本發(fā)明的任何抗體或抗體片段用于診斷用途的用途。在又額外實(shí)施方案中，提供了包含本文公開(kāi)的任何犬源化抗體或抗原結(jié)合片段的試劑盒。在具體實(shí)施方案中，提供了表達(dá)載體，其包含編碼本發(fā)明的任何犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體或抗原結(jié)合片段的分離的核酸。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的一種或多種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的這些核酸、表達(dá)載體或多肽可用于制備抗體的方法中。本發(fā)明還提供了抗原肽(包括分離的抗原肽)，其由包含seqidno:82和/或seqidno:83的氨基酸序列的80個(gè)或更少個(gè)氨基酸殘基組成。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述抗原肽(包括分離的肽)由包含seqidno:82和/或seqidno:83的氨基酸序列的60個(gè)或更少個(gè)氨基酸殘基組成。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述抗原肽(包括分離的肽)由包含seqidno:82和/或seqidno:83的氨基酸序列的11至45個(gè)氨基酸殘基組成。在還有其它實(shí)施方案中，所述抗原肽由來(lái)自seqidno:83的氨基酸序列的5至20個(gè)氨基酸殘基組成。在還有其它實(shí)施方案中，所述抗原肽由來(lái)自seqidno:83的氨基酸序列的5至11個(gè)氨基酸殘基組成。本發(fā)明還提供了抗原肽(包括分離的肽)，其由包含與seqidno:82和/或seqidno:83的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的80個(gè)或更少個(gè)氨基酸殘基組成，且結(jié)合本發(fā)明的分離的哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述抗原肽(包括分離的抗原肽)由包含與seqidno:82和/或seqidno:83的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的60個(gè)或更少個(gè)氨基酸殘基組成，且結(jié)合分離的哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段。在其它實(shí)施方案中，所述肽由來(lái)自與seqidno:82的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的5個(gè)至20個(gè)氨基酸殘基組成，且結(jié)合分離的哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段。在其它實(shí)施方案中，所述肽由來(lái)自與seqidno:83的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的氨基酸序列的5個(gè)至11個(gè)氨基酸殘基組成，且結(jié)合分離的哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段。在具體實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體是4e9。在其它實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體是5f12。本發(fā)明還提供了包含任何前述抗原肽的融合蛋白。在具體實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含此抗原肽和非犬哺乳動(dòng)物igg抗體的fc區(qū)。在更具體實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含非犬哺乳動(dòng)物igg抗體的fc區(qū)。在某些實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是鼠igg。在替代實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是人igg。在其它實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是馬igg。在還有其它實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是豬igg。在還有其它實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是牛igg。在具體實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是igg1。在其它實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是igg2a。在還有其它實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是igg3。在還有其它實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是igg4。在其它實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和麥芽糖結(jié)合蛋白。在還有其它實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和β-半乳糖苷酶。在還有其它實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶。在還有其它實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和硫氧還蛋白。在還有其它實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和groel。在還有其它實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和nusa。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的抗原肽和相應(yīng)的融合蛋白的核酸(包括分離的核酸)。本發(fā)明還提供了包含這些核酸的表達(dá)載體和包含本發(fā)明的一種或多種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明包括藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗-犬pd-l1抗體或其抗原結(jié)合片段，來(lái)自犬pd-l1的抗原肽(包括分離的抗原肽)，包含來(lái)自本發(fā)明的犬pd-l1的抗原肽的融合蛋白，編碼本發(fā)明的抗原性片段和/或融合蛋白的核酸(包括分離的核酸)，包含此類(lèi)核酸的表達(dá)載體，或其任何組合，以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。在具體實(shí)施方案中，此類(lèi)藥物組合物還包含抗-犬pd-1抗體或其抗原結(jié)合片段。在更具體實(shí)施方案中，所述抗-犬pd-1抗體是犬源化鼠抗-犬pd-1抗體或犬源化鼠抗-犬pd-1抗體的抗原結(jié)合片段。在相關(guān)實(shí)施方案中，此類(lèi)藥物組合物還包含抗-犬ctla-4抗體或其抗原結(jié)合片段。在具體實(shí)施方案中，所述抗-犬ctla-4抗體是犬源化鼠抗-犬ctla4抗體或犬源化鼠抗-犬ctla4抗體的抗原結(jié)合片段。因此，本發(fā)明提供了包含下列中的一種、兩種、三種或更多種的藥物組合物：抗-犬pd-l1抗體、抗-犬pd-1抗體、抗-犬ctla-4抗體、抗-犬pd-l1抗體的抗原結(jié)合片段、抗-犬pd-1抗體的抗原結(jié)合片段或抗-犬ctla-4抗體的抗原結(jié)合片段。在具體實(shí)施方案中，此類(lèi)抗-犬蛋白(即，抗-犬pd-l1、pd-1或ctla-4)抗體或其抗原結(jié)合片段是鼠抗-犬蛋白抗體。在其它實(shí)施方案中，此類(lèi)抗-犬蛋白抗體或其抗原結(jié)合片段是犬源化抗-犬蛋白抗體。在更具體實(shí)施方案中，所述抗-犬蛋白抗體或其抗原結(jié)合片段是犬源化鼠抗-犬蛋白抗體。此外，本發(fā)明提供了增加免疫細(xì)胞的活性的方法，其包括向有需要的受試者施用治療有效量的本發(fā)明的藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，所述方法用于治療癌癥。在其它實(shí)施方案中，所述方法用于治療感染或傳染病。在還有其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段用作疫苗佐劑。在具體實(shí)施方案中，包含犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物可以在犬源化鼠抗-犬pd-1抗體或其抗原結(jié)合片段和/或犬源化鼠抗-犬ctla-4抗體或其抗原結(jié)合片段之前、之后或同時(shí)施用。通過(guò)參考以下附圖簡(jiǎn)述和詳述將更好地理解本發(fā)明的這些和其它方面。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示作為od650/490相比logmab(nm)的函數(shù)的兩種小鼠抗-犬pd-l1mab針對(duì)犬pd-l1的反應(yīng)性的elisa結(jié)果。被稱為4f9和5f12的兩種mab，顯示了與犬pd-l1的強(qiáng)烈和劑量依賴性的結(jié)合。圖2顯示用小鼠抗-犬pd-l1mab的配體阻斷。測(cè)試被稱為4f9和5f12的兩種mab抑制pd-l1與cho細(xì)胞上表達(dá)的pd-1結(jié)合的能力。兩種mab都阻斷pd-l1與pd-1的結(jié)合，盡管mab4f9是比5f12更強(qiáng)的抑制劑。發(fā)明詳述縮寫(xiě)貫穿本發(fā)明的詳述和實(shí)施例，將使用以下縮寫(xiě)：adcc抗體依賴性細(xì)胞毒作用cdc依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性cdr免疫球蛋白可變區(qū)中的互補(bǔ)性決定區(qū)，針對(duì)人抗體使用kabat編號(hào)系統(tǒng)定義cho中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢ec50導(dǎo)致50%功效或結(jié)合的濃度elisa酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定fr抗體構(gòu)架區(qū)：不包括cdr區(qū)的免疫球蛋白可變區(qū)。hrp辣根過(guò)氧化物酶ifn干擾素ic50導(dǎo)致50%抑制的濃度igg免疫球蛋白gkabat由elvina.kabat[sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991)]開(kāi)創(chuàng)的人抗體的免疫球蛋白比對(duì)和編號(hào)系統(tǒng)mab單克隆抗體(也表示為mab或mab)mes2-(n-嗎啉代)乙磺酸moa作用機(jī)制nhs正常人血清pcr聚合酶鏈反應(yīng)pk藥物代謝動(dòng)力學(xué)seb葡萄球菌腸毒素btt破傷風(fēng)類(lèi)毒素v區(qū)在不同抗體之間在序列上可變的人igg鏈的區(qū)段。其延伸至輕鏈中的kabat殘基109和重鏈中的kabat殘基113。vh免疫球蛋白重鏈可變區(qū)vk免疫球蛋白κ輕鏈可變區(qū)。定義為了可以更容易地理解本發(fā)明，下面特別地定義了某些技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)。除非在本文件別處特別地定義，本文中使用的所有其它技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。如本文(包括所附權(quán)利要求書(shū))中所使用，詞語(yǔ)的單數(shù)形式諸如“一個(gè)/種(a)”、“一個(gè)/種(an)”和“所述(the)”包括它們的對(duì)應(yīng)復(fù)數(shù)形式，除非上下文另外清楚地指明?！盎罨痹谄鋺?yīng)用于細(xì)胞或受體時(shí)指用配體活化或處理細(xì)胞或受體，除非上下文另外指出或明確地指出?！芭潴w”包括天然和合成的配體，例如，細(xì)胞因子、細(xì)胞因子變體、類(lèi)似物、突變蛋白和衍生自抗體的結(jié)合化合物。“配體”也包括小分子，例如，細(xì)胞因子的肽模擬物和抗體的肽模擬物?！盎罨笨梢灾溉绫粌?nèi)部機(jī)制以及被外部或環(huán)境因子調(diào)節(jié)的細(xì)胞活化。分子的“活性”可以描述或指分子與配體或與受體的結(jié)合，催化活性；刺激基因表達(dá)或細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、分化或成熟的能力；抗原活性，其它分子的活性的調(diào)節(jié)等。分子的“活性”還可以指調(diào)節(jié)或維持細(xì)胞-與-細(xì)胞相互作用(例如，黏附)的活性，或維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)(例如，細(xì)胞膜或細(xì)胞骨架)的活性。“活性”也可以意指比活性，例如，[催化活性]/[mg蛋白]或[免疫學(xué)活性]/[mg蛋白]，生物區(qū)室中的濃度等?！盎钚浴笨梢灾赶忍煨曰蜻m應(yīng)性免疫系統(tǒng)的組分的調(diào)節(jié)。“施用”和“處理”當(dāng)其應(yīng)用于動(dòng)物(例如，犬實(shí)驗(yàn)受試者)、細(xì)胞、組織、器官或生物學(xué)流體時(shí)指外源藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動(dòng)物(例如，犬受試者)、細(xì)胞、組織、器官或生物學(xué)流體的接觸。細(xì)胞的處理包括試劑與細(xì)胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中流體與細(xì)胞接觸?！爸委?treat)”或“治療(treating)”是指向具有一種或多種疾病癥狀或被懷疑患有藥劑對(duì)其具有治療活性的疾病的獸醫(yī)受試者(例如，犬科動(dòng)物或貓科動(dòng)物)內(nèi)部或外部施用治療劑，諸如含有本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段的組合物。因此，“施用(administration)”和“處理(treatment)”還包括通過(guò)試劑、診斷劑、結(jié)合化合物或另一種細(xì)胞體外和先體外后體內(nèi)處理例如細(xì)胞。通常，所述藥劑以有效地減輕和/或改善接受治療的受試者或群體中的一種或多種疾病癥狀的量施用，無(wú)論是以任何臨床上可測(cè)量的程度上誘導(dǎo)此類(lèi)癥狀的消退還是抑制此類(lèi)癥狀的進(jìn)展。有效地減輕任何具體疾病癥狀的治療劑的量(也被稱為“治療有效量”)可以根據(jù)因素諸如受試者(例如，犬科動(dòng)物)的疾病狀態(tài)、年齡和重量以及藥物組合物在受試者中引起期望應(yīng)答的能力而變化。疾病癥狀是否已經(jīng)減輕或改善，可以通過(guò)獸醫(yī)或其他熟練的衛(wèi)生保健提供者通常使用的任何臨床測(cè)量來(lái)評(píng)價(jià)，以評(píng)估該癥狀的嚴(yán)重程度或進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。盡管本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案(例如，治療方法或制品)可能不會(huì)在減輕每個(gè)受試者中的靶疾病癥狀中都有效，但其應(yīng)當(dāng)減輕統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著數(shù)目的受試者中的靶疾病癥狀，如通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)(諸如斯氏t-檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)、根據(jù)mann和whitney的u-檢驗(yàn)、kruskal-wallis檢驗(yàn)(h-檢驗(yàn))、jonckheere-terpstra-檢驗(yàn)和wilcoxon-檢驗(yàn))所確定的。術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”指例如淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和由以上細(xì)胞或肝產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細(xì)胞因子和補(bǔ)體)的作用，所述作用導(dǎo)致癌細(xì)胞(cancerouscell)、被病原體感染的細(xì)胞或組織、或侵入病原體對(duì)哺乳動(dòng)物身體(例如，犬身體)的選擇性損傷、破壞、或從其消除。術(shù)語(yǔ)“受試者”包括任何生物體，優(yōu)選動(dòng)物，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物(例如，犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物或人)，且最優(yōu)選犬科動(dòng)物。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“犬科動(dòng)物”包括所有家養(yǎng)狗，家犬(canislupusfamiliaris或canisfamiliaris)，除非另外指出。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“貓科動(dòng)物”指貓科(felidae)的任何成員。該科的成員包括野生、動(dòng)物園和家養(yǎng)成員，諸如貓亞科的任何成員，例如貓類(lèi)、獅類(lèi)、虎類(lèi)、美洲獅類(lèi)、美洲虎類(lèi)、豹類(lèi)、雪豹類(lèi)、黑豹類(lèi)、北美山獅類(lèi)、獵豹類(lèi)、猞猁、山貓類(lèi)、獰貓類(lèi)或其任何雜交品種。貓類(lèi)還包括家養(yǎng)貓類(lèi)、純種和/或雜種的伴侶貓類(lèi)(companioncats)、觀賞貓類(lèi)(showcats)、實(shí)驗(yàn)室貓類(lèi)、克隆貓類(lèi)以及野生或未馴服貓類(lèi)。已發(fā)現(xiàn)犬pd-1包含seqidno:50的氨基酸序列[于2013年12月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/918,946，其內(nèi)容在此以其整體并入本文]。在具體實(shí)施方案中，犬pd-l1由包含seqidno:49的核苷酸序列的核酸編碼。已發(fā)現(xiàn)犬pd-l1包含seqidno:56的氨基酸序列[于2013年12月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/918,946，同上]。在具體實(shí)施方案中，犬pd-l1由包含seqidno:55的核苷酸序列編碼。如本文中所用，在例如抗體的氨基酸序列中用另一個(gè)氨基酸殘基“取代氨基酸殘基”等同于用另一個(gè)氨基酸殘基“替代氨基酸殘基”，并且表示在氨基酸序列中的特定位置處的具體氨基酸殘基已經(jīng)由不同的氨基酸殘基替代(或取代)。例如，一種此類(lèi)取代(替代)被表示為iggb或iggc氨基酸序列的fc區(qū)的p4a，在這種情況下，iggb的fc區(qū)或iggc的fc區(qū)的氨基酸序列的氨基酸位置4處的脯氨酸殘基已經(jīng)被丙氨酸殘基取代(替代)。因此，此類(lèi)取代可以被特別設(shè)計(jì)，即，通過(guò)例如重組dna技術(shù)在氨基酸序列中的特定位置處有目的地用絲氨酸替代丙氨酸。或者，例如，基于細(xì)胞產(chǎn)生的抗體結(jié)合該抗原上的給定區(qū)域(例如，含有表位或其部分的區(qū)域)和/或使得該抗體包含保留與其替代的cdr相同的規(guī)范結(jié)構(gòu)的特定cdr的能力，抗體的特定氨基酸殘基或氨基酸殘基串可以通過(guò)更自然的選擇過(guò)程而被一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替代。此類(lèi)取代/替代可以導(dǎo)致“變體”cdr和/或變體抗體。序列同一性指當(dāng)最佳比對(duì)兩個(gè)多肽序列時(shí)兩個(gè)多肽的氨基酸在等同位置處相同的程度。如本文中所用，當(dāng)兩個(gè)序列的氨基酸殘基相同時(shí)，一個(gè)氨基酸序列與第二個(gè)氨基酸序列100%“相同”。因此，當(dāng)兩個(gè)氨基酸序列的50%的氨基酸殘基相同時(shí)，一個(gè)氨基酸序列與第二個(gè)氨基酸序列50%“相同”。序列比較在給定蛋白(例如，所比較的蛋白，或多肽的一部分)包含的氨基酸殘基的鄰接塊上進(jìn)行。在具體實(shí)施方案中，考慮可能否則改變兩個(gè)氨基酸序列之間的一致性的所選缺失或插入。序列相似性包括相同的殘基和不相同的、生化上相關(guān)的氨基酸。下文討論共享相似特性且可互換的生化相關(guān)的氨基酸。以下參考文獻(xiàn)涉及經(jīng)常用于序列分析的blast算法：blastalgorithms:altschul,s.f.,等人,j.mol.biol.215:403-410(1990);gish,w.,等人,naturegenet.3:266-272(1993);madden,t.l.,等人,meth.enzymol.266:131-141(1996);altschul,s.f.,等人,nucleicacidsres.25:3389-3402(1997);zhang,j.,等人,genomeres.7:649-656(1997);wootton,j.c.,等人,comput.chem.17:149-163(1993);hancock,j.m.等人,comput.appl.biosci.10:67-70(1994);alignmentscoringsystems:dayhoff,m.o.,等人,"amodelofevolutionarychangeinproteins."atlasofproteinsequenceandstructure,vol.5,suppl.3.m.o.dayhoff(編輯),第345-352頁(yè),(1978);natl.biomed.res.found.,washington,dc;schwartz,r.m.,等人,"matricesfordetectingdistantrelationships."atlasofproteinsequenceandstructure,vol.5,suppl.3."(1978),m.o.dayhoff(編輯),第353-358頁(yè)(1978),natl.biomed.res.found.,washington,dc;altschul,s.f.,j.mol.biol.219:555-565(1991);states,d.j.,等人,methods3:66-70(1991);henikoff,s.,等人,proc.natl.acad.sci.usa89:10915-10919(1992);altschul,s.f.,等人,j.mol.evol.36:290-300(1993);alignmentstatistics:karlin,s.,等人,proc.natl.acad.sci.usa87:2264-2268(1990);karlin,s.,等人,proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5877(1993);dembo,a.,等人,ann.prob.22:2022-2039(1994);和altschul,s.f."evaluatingthestatisticalsignificanceofmultipledistinctlocalalignments."theoreticalandcomputationalmethodsingenomeresearch(s.suhai,編輯),第1-14頁(yè),plenum,newyork(1997)。犬源化的抗-犬抗原抗體如本文中所用，如果抗體結(jié)合包含犬抗原(例如犬pd-l1)的氨基酸序列的一部分的多肽，但不結(jié)合缺乏所述犬抗原(例如犬pd-l1)的序列的該部分的其它犬蛋白，則該抗體被稱為特異性結(jié)合包含給定抗原序列(在這種情況下，犬抗原(例如犬pd-l1)的氨基酸序列的一部分)的多肽。例如，特異性地結(jié)合包含犬pd-l1的多肽的抗體可以結(jié)合犬pd-l1的flag?標(biāo)記的形式，但將不特異性結(jié)合其它flag?標(biāo)記的犬蛋白。當(dāng)抗體或衍生自抗體的抗原結(jié)合部位的結(jié)合化合物對(duì)犬抗原或其變體或突變蛋白的親和力是其對(duì)測(cè)試的任何其它犬抗原的親和力的至少10倍、更優(yōu)選至少20倍以及甚至更優(yōu)選至少100倍時(shí)，其“特異性”結(jié)合其犬抗原或其變體或突變蛋白。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”指表現(xiàn)出所需生物學(xué)活性的任何形式的抗體。因此，其以最寬泛的意義使用并且具體涵蓋但不限于單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、犬源化抗體、完全犬抗體、嵌合抗體和駱駝源化單結(jié)構(gòu)域抗體?！坝H本抗體”是在對(duì)抗體進(jìn)行修飾以用于預(yù)期用途(諸如對(duì)抗體進(jìn)行犬源化以用作犬治療用抗體)之前通過(guò)將免疫系統(tǒng)暴露于抗原而獲得的抗體。如本文中所用，除非另外指明，“抗體片段”或“抗原結(jié)合片段”指抗體的抗原結(jié)合片段，即保留特異性結(jié)合被全長(zhǎng)抗體結(jié)合的抗原的能力的抗體片段，例如保留一個(gè)或多個(gè)cdr區(qū)的片段?？乖Y(jié)合片段的實(shí)例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如，sc-fv；納米抗體(nanobody)以及由抗體片段形成的多特異性抗體。“fab片段”含有一條輕鏈和一條重鏈的ch1和可變區(qū)。fab分子的重鏈不能與另一個(gè)重鏈分子形成二硫鍵?！癴ab片段”可以是抗體的木瓜蛋白酶切割產(chǎn)物。“可結(jié)晶段”(“fc”)區(qū)含有包含抗體的ch2和ch3結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)重鏈片段(即，兩條相同的多肽)。所述兩個(gè)重鏈片段通過(guò)兩個(gè)或更多個(gè)二硫鍵以及通過(guò)所述ch3結(jié)構(gòu)域的疏水相互作用而保持在一起。在本發(fā)明中，四個(gè)犬iggfc片段中每一個(gè)的氨基酸序列基于鑒定的ch1和ch2結(jié)構(gòu)域的邊界，如tang等人[vet.immunol.immunopathol.80:259-270(2001)]所確定的?！癴ab’片段”含有一條輕鏈和一條重鏈的一部分或片段，所述重鏈的一部分或片段含有vh結(jié)構(gòu)域和ch1結(jié)構(gòu)域以及ch1和ch2結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域，從而使得兩個(gè)fab’片段的兩條重鏈之間可以形成鏈間二硫鍵，以形成f(ab')2分子?！癴(ab')2片段”含有兩條輕鏈和兩條重鏈，所述重鏈含有在ch1和ch2結(jié)構(gòu)域之間的恒定區(qū)的一部分，從而使得所述兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此，f(ab')2片段由兩個(gè)fab’片段構(gòu)成，所述兩個(gè)fab’片段通過(guò)所述兩條重鏈之間的二硫鍵保持在一起?！癴(ab')2片段”可以是抗體的胃蛋白酶切割的產(chǎn)物。“fv區(qū)”包含重鏈和輕鏈兩者的可變區(qū)，但缺乏恒定區(qū)。術(shù)語(yǔ)“單鏈fv”或“scfv”抗體指包含抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域的抗體片段，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單個(gè)多肽鏈中。通常，所述fv多肽進(jìn)一步包含vh和vl域之間的多肽接頭，其使得scfv能夠形成用于抗原結(jié)合的所需結(jié)構(gòu)。[參見(jiàn)，pluckthun,thepharmacologyofmonoclonalantibodies,卷113rosenburg和moore編輯,springer-verlag,newyork,第269-315頁(yè)(1994);wo88/01649;以及u.s.4,946,778和u.s.5,260,203.]。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“規(guī)范結(jié)構(gòu)”指抗體的重鏈和輕鏈的高變區(qū)中每一個(gè)在其所處的構(gòu)架內(nèi)所采用的局部構(gòu)象。對(duì)于每個(gè)高變區(qū)，存在少量的規(guī)范結(jié)構(gòu)(通常用簡(jiǎn)單整數(shù)諸如1或2等表示)，其可以從對(duì)應(yīng)的高變區(qū)的氨基酸序列以高準(zhǔn)確度預(yù)測(cè)(尤其是在其構(gòu)架的氨基酸序列的背景內(nèi)，如下文中對(duì)于對(duì)應(yīng)的犬源化鼠抗-犬pd-l1的可變結(jié)構(gòu)域所提供的)。關(guān)于給定cdr的氨基酸序列的修飾是否將導(dǎo)致結(jié)合其抗原結(jié)合配偶體的能力的保持或喪失，這些規(guī)范結(jié)構(gòu)可以是決定性的[參見(jiàn)，chothia和lesk,canonicalstructuresforthehypervariableregionsofimmunoglobulins,j.mol.biol.196:901-917(1987);chothia等人,conformationofimmunoglobulinhypervaribaleregions,nature,34:877-883(1989);和al-lazikani等人,standardconformationsforthecanonicalstructuresofimmunoglobulins,j.mol.biol.273:927-948(1997)]?！敖Y(jié)構(gòu)域抗體”是僅含有重鏈的可變區(qū)或輕鏈的可變區(qū)的免疫學(xué)功能性免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個(gè)或更多個(gè)vh區(qū)與肽接頭共價(jià)連接以生成二價(jià)結(jié)構(gòu)域抗體。二價(jià)結(jié)構(gòu)域抗體的兩個(gè)vh區(qū)可以靶向相同或不同的抗原。“二價(jià)抗體”包含兩個(gè)抗原結(jié)合部位。在一些情況下，所述兩個(gè)結(jié)合部位具有相同的抗原特異性。然而，二價(jià)抗體可以是雙特異性的(參見(jiàn)下文)。在某些實(shí)施方案中，本文的單克隆抗體還包括駱駝源化單結(jié)構(gòu)域抗體。[參見(jiàn),例如,muyldermans等人,trendsbiochem.sci.26:230(2001);reichmann等人,j.immunol.methods231:25(1999);wo94/04678;wo94/25591;u.s.6,005,079]。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含兩個(gè)vh結(jié)構(gòu)域的單結(jié)構(gòu)域抗體，所述vh結(jié)構(gòu)域具有使得形成單結(jié)構(gòu)域抗體的修飾。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“雙抗體”指具有兩個(gè)抗原結(jié)合部位的小抗體片段，所述片段包含連接至同一多肽鏈中的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)(vh-vl或vl-vh)。通過(guò)使用太短以無(wú)法允許在同一鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間形成配對(duì)的接頭，迫使所述結(jié)構(gòu)域與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并生成兩個(gè)抗原結(jié)合部位。[參見(jiàn),ep0404097b1;wo93/11161;和holliger等人,proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993)]。對(duì)于工程改造的抗體變體的綜述，通常參見(jiàn)[holliger和hudsonnat.biotechnol.23:1126-1136(2005)]。通常，當(dāng)活性基于摩爾表示時(shí)，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段保留其犬pd-l1結(jié)合活性的至少10%(當(dāng)與親本抗體相比時(shí))。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段保留親本抗體的犬抗原(例如，pd-l1)結(jié)合親和力的至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多。還預(yù)期，本發(fā)明的犬源化抗體或抗原結(jié)合片段可以包括沒(méi)有實(shí)質(zhì)性改變其生物學(xué)活性的保守或非保守氨基酸取代(被稱為抗體的“保守變體”或“功能保守的變體”)。“分離的抗體”指純化狀態(tài)，并且在此背景下意指所述分子基本上不含其它生物學(xué)分子(諸如核酸、蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物)或其它材料(諸如細(xì)胞碎片和生長(zhǎng)培養(yǎng)基)。通常，術(shù)語(yǔ)“分離的”不意指完全不存在此類(lèi)材料或不存在水、緩沖液或鹽，除非其以實(shí)質(zhì)上妨礙如本文所述的結(jié)合化合物的實(shí)驗(yàn)或治療用途的量存在。如本文中所用，“嵌合抗體”是具有來(lái)自第一抗體的可變結(jié)構(gòu)域和來(lái)自第二抗體的恒定結(jié)構(gòu)域的抗體，其中所述第一和第二抗體來(lái)自不同物種。[u.s.4,816,567;和morrison等人,proc.natl.acad.sci.usa81:6851-6855(1984)]。通常，所述可變結(jié)構(gòu)域獲得自來(lái)自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物諸如嚙齒動(dòng)物的抗體(“親本抗體”)，且所述恒定結(jié)構(gòu)域序列獲得自動(dòng)物受試者抗體，例如，犬科動(dòng)物，從而使得與所述親本(例如，嚙齒動(dòng)物)抗體相比，所得嵌合抗體將不太可能在犬受試者中誘發(fā)不良免疫應(yīng)答。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“犬源化抗體”指含有來(lái)自犬和非犬(例如，鼠)抗體兩者的序列的抗體形式。通常，犬源化抗體將包含至少一個(gè)(且通常兩個(gè))可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中所有或基本上全部高變環(huán)均對(duì)應(yīng)于非犬免疫球蛋白的那些(例如，如下所示例，包含6個(gè)鼠抗-犬pd-l1cdr)，以及所有或基本上全部的犬框架。術(shù)語(yǔ)“全犬抗體”指僅包含犬免疫球蛋白蛋白序列的抗體。如果在小鼠中、在小鼠細(xì)胞中或在源于小鼠細(xì)胞的雜交瘤中產(chǎn)生，則全犬抗體可含有鼠碳水化合物鏈。類(lèi)似地，“小鼠抗體”指僅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗體?；蛘?，如果在大鼠中、在大鼠細(xì)胞中或在源于大鼠細(xì)胞的雜交瘤中產(chǎn)生，則全犬抗體可能含有大鼠碳水化合物鏈。類(lèi)似地，“大鼠抗體”指僅包含大鼠免疫球蛋白序列的抗體。每個(gè)輕/重鏈對(duì)的可變區(qū)形成抗體結(jié)合部位。因此，一般而言，完整抗體具有兩個(gè)結(jié)合部位。除了在雙功能或雙特異性抗體中，所述兩個(gè)結(jié)合部位一般而言是相同的。通常，重鏈和輕鏈兩者的可變結(jié)構(gòu)域包含位于相對(duì)保守的構(gòu)架區(qū)(fr)內(nèi)的三個(gè)高變區(qū)，也被稱為互補(bǔ)性決定區(qū)(cdr)。cdr通常側(cè)接所述構(gòu)架區(qū)，從而使得能夠結(jié)合特定表位。通常，從n末端到c末端，輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域兩者均包含fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。通常根據(jù)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,kabat,等人;nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.;第5版;nihpubl.no.91-3242(1991);kabat,adv.prot.chem.32:1-75(1978);kabat,等人,j.biol.chem.252:6609-6616(1977);chothia,等人,j.mol.biol.196:901-917(1987)或chothia,等人,nature342:878-883(1989)中的定義，將氨基酸分配至人抗體的各個(gè)結(jié)構(gòu)域中。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”指抗體的負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包含來(lái)自“互補(bǔ)性決定區(qū)”或“cdr”(即，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的cdrl1、cdrl2和cdrl3以及重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的cdrh1、cdrh2和cdrh3)的氨基酸殘基。[參見(jiàn)kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991)，其通過(guò)序列定義人抗體的cdr區(qū);還參見(jiàn)chothia和lesk,j.mol.biol.196:901-917(1987)，其通過(guò)結(jié)構(gòu)定義抗體的cdr區(qū)]。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“構(gòu)架”或“fr”殘基指除本文中定義為cdr殘基的高變區(qū)殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“犬框架”指除本文中定義為cdr殘基的高變區(qū)殘基以外的犬抗體的重鏈和輕鏈的氨基酸序列。在兩條鏈中，天然犬cdr的氨基酸序列均被對(duì)應(yīng)的外源cdr(例如，來(lái)自小鼠抗體的那些)替代。任選地，犬抗體的重鏈和/或輕鏈可以含有一些外源非cdr殘基，例如，以便在犬抗體內(nèi)保持所述外源cdr的構(gòu)象，和/或修飾fc功能，如下文所示例的。如本文中所用，“抗-犬pd-l1抗體”指針對(duì)犬pd-l1(例如，在哺乳動(dòng)物諸如小鼠或兔子中)產(chǎn)生并且特異性結(jié)合犬pd-l1的抗體?！疤禺愋越Y(jié)合犬pd-l1”的抗體或“特異性結(jié)合包含seqidno:56的氨基酸序列的多肽”的抗體，是與其它抗原相比表現(xiàn)出優(yōu)先結(jié)合犬pd-l1(例如，“特異性”結(jié)合犬pd-l1)的抗體。所述結(jié)合不需要絕對(duì)的結(jié)合特異性。如果其結(jié)合對(duì)樣品中犬pd-l1的存在是決定性的，或者如果其能夠改變?nèi)畃d-l1的活性而不會(huì)過(guò)度干擾犬樣品中的其它分子的活性，例如，不會(huì)產(chǎn)生不期望的結(jié)果諸如診斷背景下的假陽(yáng)性或在治療背景下的副作用，則抗-犬pd-l1抗體被認(rèn)為對(duì)于犬pd-l1特異性?？?犬pd-l1抗體所必需的特異性程度可取決于所述抗體的預(yù)期用途，并且至少由其用于預(yù)期目的的適合性所限定。設(shè)想的方法的抗體或衍生自抗體的抗原結(jié)合部位的結(jié)合化合物以與任何其它抗原的親和力的至少兩倍、優(yōu)選至少十倍、更優(yōu)選至少20倍、且最優(yōu)選至少100倍的親和力結(jié)合其抗原或其變體或突變蛋白。因此，本發(fā)明提供了(例如，特異性)結(jié)合犬pd-l1的犬源化抗-犬pd-l1抗體或其抗原結(jié)合片段(包括分離形式)以及此類(lèi)抗體或其片段的用途。在具體實(shí)施方案中，提供了來(lái)自鼠抗-犬pd-l1抗體的鼠抗-犬pd-l1cdr，已經(jīng)顯示，其既結(jié)合犬pd-l1又阻斷犬pd-l1結(jié)合其受體，例如，犬pd-1?？梢詫⑦@些cdr插入本發(fā)明的修飾的犬框架中，以制備犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體，如本文所示例的。更具體地，本發(fā)明的“犬源化鼠抗-pd-l1抗體”指這樣的抗體，其包含來(lái)自鼠抗-犬pd-l1抗體的三個(gè)重鏈cdr和三個(gè)輕鏈cdr，連同犬框架或修飾的犬框架。修飾的犬框架包含如本文所示例的一個(gè)或多個(gè)氨基酸變化，所述變化進(jìn)一步使所述犬源化抗體的有效性最優(yōu)化，例如，以增強(qiáng)、降低或消除抗體效應(yīng)子功能；以提高其與犬抗原(例如，犬pd-l1)的結(jié)合和/或提高其阻斷犬抗原(例如，犬pd-l1)結(jié)合其天然結(jié)合配偶體(例如，在其中抗原為犬pd-l1的情況下是犬pd-1)的能力。“同源性”指當(dāng)將它們最佳地比對(duì)時(shí)兩個(gè)多核苷酸序列之間或兩個(gè)多肽序列之間的序列相似性。當(dāng)在兩個(gè)對(duì)比的序列中的位置被相同堿基或氨基酸單體亞基占據(jù)時(shí)，例如，如果兩個(gè)dna分子的每一個(gè)中的位置被腺嘌呤占據(jù)時(shí)，則所述分子在該位置是同源的。同源性百分比是兩個(gè)序列共有的同源位置的數(shù)目除以比較的位置的總數(shù)×100。例如，如果當(dāng)將序列最佳地比對(duì)時(shí)兩個(gè)序列的10個(gè)位置中的6個(gè)是匹配的或同源的，則所述兩個(gè)序列是60%同源的。通常，當(dāng)比對(duì)兩個(gè)序列時(shí)進(jìn)行所述比較以給出最大同源性百分比?！胺蛛x的核酸分子”意指基因組、mrna、cdna或合成來(lái)源或其一些組合的dna或rna，所述dna或rna與在自然界中在其中發(fā)現(xiàn)所述分離的多核苷酸的多核苷酸的全部或部分無(wú)關(guān)，或與在自然界中它沒(méi)有與其連接的多核苷酸連接。為了本公開(kāi)的目的，應(yīng)當(dāng)理解，包含特定核苷酸序列的“核酸分子”不包括完整染色體。除了指定的序列以外，“包含”指定的核酸序列的分離的核酸分子還可以包括，多達(dá)10個(gè)或甚至多達(dá)20個(gè)或更多個(gè)其它蛋白或其部分或片段的編碼序列，或可以包括可操作連接的控制敘述的核酸序列的編碼區(qū)的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列，和/或可以包括載體序列。短語(yǔ)“控制序列”指可操作連接的編碼序列在特定宿主生物體中的表達(dá)所必需的dna序列。適合用于原核生物的控制序列例如包括啟動(dòng)子、任選的操縱基因序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞使用啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。當(dāng)核酸位于與另一個(gè)核酸序列的功能關(guān)系中時(shí)，所述核酸是“可操作連接的”。例如，前序列或分泌型前導(dǎo)序列的dna與多肽的dna可操作連接，如果其表達(dá)為參與所述多肽的分泌的前蛋白的話；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與編碼序列可操作連接，如果其影響所述序列的轉(zhuǎn)錄的話；或核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列可操作連接，如果其被定位從而促進(jìn)翻譯的話。通常，“可操作連接的”意指，所連接的dna序列是鄰接的，且在分泌型前導(dǎo)序列的情況下，是鄰接的且在閱讀相中。然而，增強(qiáng)子不必須是鄰接的。連接通過(guò)在方便的限制位點(diǎn)處的連接來(lái)實(shí)現(xiàn)。如果所述位點(diǎn)不存在，則根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。如本文中所用，表述“細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，且所有此類(lèi)名稱都包括后代。因此，詞語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括原代受試細(xì)胞和由其衍生出的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還應(yīng)當(dāng)理解，由于故意的或非故意的突變，并非所有后代都具有精確地相同的dna含量。包括具有相同功能或生物學(xué)活性的突變體后代，如在最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中所篩選的。當(dāng)意指不同名稱時(shí)，它從上下文是清楚的。如本文中所用，“種系序列”指未重排的免疫球蛋白dna序列的序列?？梢允褂梦粗嘏诺拿庖咔虻鞍仔蛄械娜我夂线m的來(lái)源。人種系序列可以例如獲得自美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的國(guó)家關(guān)節(jié)炎和肌肉骨骼疾病和皮膚疾病研究所(nationalinstituteofarthritisandmusculoskeletalandskindiseasesoftheunitedstatesnationalinstitutesofhealth)的網(wǎng)站上的joinsolver?種系數(shù)據(jù)庫(kù)?？梢垣@得小鼠種系序列，例如，如giudicelli等人[nucleicacidsres.33:d256-d261(2005)]中所述。犬源化抗體的特性在犬科動(dòng)物中，存在被稱為a、b、c和d的四種igg重鏈。這些重鏈代表了四個(gè)不同的狗igg亞類(lèi)，被稱為igga、iggb、iggc和iggd。這四種重鏈的dna和氨基酸序列由tang等人首次鑒定[vet.immunol.immunopathol.80:259-270(2001)]。這些重鏈的氨基酸和dna序列也可得自genbank數(shù)據(jù)庫(kù)。例如，igga重鏈的氨基酸序列具有登錄號(hào)aal35301.1，iggb具有登錄號(hào)aal35302.1，iggc具有登錄號(hào)aal35303.1，且iggd具有登錄號(hào)(aal35304.1)。犬抗體還含有兩種類(lèi)型的輕鏈，κ和λ。這些輕鏈的dna和氨基酸序列可獲得自genbank數(shù)據(jù)庫(kù)。例如，κ輕鏈氨基酸序列具有登錄號(hào)aby57289.1，且λ輕鏈具有登錄號(hào)aby55569.1。在本發(fā)明中，所述四個(gè)犬iggfc片段中每一個(gè)的氨基酸序列都基于鑒定的如通過(guò)tang等人(同上)所確定的ch1和ch2結(jié)構(gòu)域的邊界。治療用單克隆抗體的開(kāi)發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其需要協(xié)調(diào)一套復(fù)雜的活動(dòng)以生成所需的抗體。這些包括最優(yōu)化抗體特異性，親和力，功能活性，在工程改造的細(xì)胞系中的表達(dá)水平，長(zhǎng)期穩(wěn)定性，效應(yīng)子功能的消除或增強(qiáng)，以及商業(yè)上可行的制造和純化方法的開(kāi)發(fā)。考慮到本發(fā)明的目標(biāo)，并且除了活化免疫系統(tǒng)細(xì)胞的能力之外，針對(duì)犬pd-l1的犬源化或犬單克隆抗體最佳地具有三種額外的屬性：1.缺乏效應(yīng)子功能諸如抗體依賴性細(xì)胞毒作用(adcc)和依賴補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(cdc)；2.相對(duì)長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期；和3.易于使用工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(諸如基于a蛋白層析的技術(shù))進(jìn)行大規(guī)模純化。無(wú)一天然存在的犬igg亞類(lèi)滿足所有這些標(biāo)準(zhǔn)。例如，iggb可以使用a蛋白純化，但具有高水平的adcc活性。iggc也具有相當(dāng)大的adcc活性。另一方面，igga弱結(jié)合a蛋白，但顯示出不期望的adcc活性。此外，iggc和iggd均不能在a蛋白柱上純化，盡管iggd未顯示出adcc活性。另外，iggc具有短血清半衰期，因?yàn)槠洳唤Y(jié)合犬fcrn受體。本發(fā)明通過(guò)提供修飾的對(duì)犬抗原(例如，犬pd-l1)特異性的犬igg抗體來(lái)克服了這個(gè)難題；此類(lèi)抗體缺乏效應(yīng)子功能(諸如adcc和cdc)、表現(xiàn)出相對(duì)長(zhǎng)半衰期并且可以使用工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的a蛋白層析容易地進(jìn)行純化。迄今為止，先前尚未描述遺傳修飾的犬igg，其缺乏adcc和cdc效應(yīng)子功能兩者并且另外，可以通過(guò)a蛋白層析進(jìn)行純化。如本文所公開(kāi)的，在犬igg中的一個(gè)位置上的單個(gè)取代(類(lèi)似于人和小鼠igg中的取代)，諸如n297a或d265a，不會(huì)完全消除對(duì)應(yīng)的犬抗體中的adcc和cdc效應(yīng)子功能兩者。例如，盡管人或鼠抗體中的取代n297和d265各自均導(dǎo)致廢除與fcγ受體和c1q的結(jié)合，但單獨(dú)的取代均沒(méi)有完全廢除犬抗體與c1q的結(jié)合。相反，如下文進(jìn)一步公開(kāi)的，為了在iggb或iggc亞類(lèi)的犬抗體中同時(shí)消除adcc和cdc，證明有必要在犬抗體的fc中進(jìn)行雙重取代，其組合天冬酰胺至丙氨酸取代和天冬氨酸至丙氨酸取代兩者。此外，完全出乎意料地，一個(gè)已經(jīng)顯示降低人抗體的效應(yīng)子功能的取代實(shí)際上導(dǎo)致對(duì)應(yīng)的犬igg與fcγr和c1q的結(jié)合增加。為了生成缺乏效應(yīng)子功能的犬iggb和iggc的變體，可以生成修飾的犬iggb或修飾的犬iggc重鏈。鑒定了存在于這些犬可結(jié)晶段區(qū)(cfc)的兩者中的總共七個(gè)氨基酸殘基，用于此類(lèi)可能的取代。對(duì)于犬iggb的fc的seqidno:66的氨基酸序列和犬iggc的fc的seqidno:68的氨基酸序列兩者，這七個(gè)氨基酸殘基是：p4、d31、n63、g64、t65、a93和p95。因此，seqidno:2的氨基酸序列與seqidno:66的氨基酸序列的不同在于在位置：4、31、63、64、65、93和95處的氨基酸殘基對(duì)于全部七個(gè)位置均為“x”(或三字母代碼“xaa”)，表示這七個(gè)氨基酸位置可以是二十個(gè)天然氨基酸中的任一個(gè)(參見(jiàn)下表1的第1列中的列表)，在seqidno:66的氨基酸序列中，位置4、31、63、64、65、93和95處的氨基酸殘基分別為脯氨酸(p)、天冬氨酸(d)、天冬酰胺(n)、甘氨酸(g)、蘇氨酸(t)、丙氨酸(a)和脯氨酸(p)。類(lèi)似地，seqidno:4的氨基酸序列與seqidno:68的氨基酸序列的不同在于在位置4、31、63、64、65、93和95處的氨基酸殘基對(duì)于全部七個(gè)位置均被列為“x”(或三字母代碼“xaa”)，表示這七個(gè)氨基酸位置可以是二十個(gè)天然氨基酸中的任一個(gè)。seqidno:2的氨基酸序列由seqidno:1的核苷酸序列編碼，而seqidno:4的氨基酸序列由seqidno:3的核苷酸序列編碼。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述cfc包含seqidno:66的氨基酸序列，其具有下列取代：p4(a、g或s)、d31(a、g或s)、n63(a、g或s)、g64(a或p)、t65(a、g或s)、a93(g或s)和p95(a、g或s)；其中p4(a、g或s)表示在位置4處的脯氨酸殘基被丙氨酸、甘氨酸或絲氨酸殘基替代，類(lèi)似地，g64(a或p)表示在位置64處的甘氨酸殘基被脯氨酸或丙氨酸殘基所取代，等等。在具體實(shí)施方案中，所述cfc包含seqidno:66的氨基酸序列，其具有下列取代：p4a、d31a、n63a、g64p、t65a、a93g和p95a。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述cfc包含seqidno:4的氨基酸序列，其含有7個(gè)稱為xaa的氨基酸，其具有下列氨基酸殘基：a4、a31、a63、g64、t65、g93和a95，即，seqidno:68的氨基酸序列，其具有下列五(5)個(gè)氨基酸殘基變化：p4a、d31a、n63a、a93g和p95a，且七個(gè)氨基酸殘基中剩余的兩個(gè)，g64和t65，由seqidno:68的氨基酸序列保持不變。seqidno:26、seqidno:28、seqidno:30和seqidno:32的氨基酸序列在七個(gè)氨基酸位置處均含有“x”(或三字母代碼“xaa”)，表示這七個(gè)氨基酸位置可以是列于下表1的第1列中的二十個(gè)天然氨基酸中的任一個(gè)。值得注意的是，seqidno:26、seqidno:28、seqidno:30和seqidno:32在其各自的序列內(nèi)包含seqidno:2的氨基酸序列或seqidno:4的氨基酸序列。在所述氨基酸序列的這七個(gè)位置中的一處或多處的氨基酸殘基的特定實(shí)例在上下文中描述，并且因此被包括于seqidno:2、seqidno:4、seqidno:26、seqidno:28、seqidno:30和seqidno:32的單獨(dú)氨基酸序列的種類(lèi)里，以及包含這些序列的犬源化抗體內(nèi)。下文中提供的表10將ciggbfc(seqidno:66和seqidno:2)和ciggcfc(seqidno:68和seqidno:4)的如本文所公開(kāi)的可被替代的七個(gè)氨基酸位置與包含這些cfc氨基酸序列的全長(zhǎng)犬重鏈(即，seqidno:26、seqidno:28、seqidno:30和seqidno:32)的氨基酸位置具體關(guān)聯(lián)。因此，可以通過(guò)使用下表10而容易地將全長(zhǎng)序列iggb或iggc中的實(shí)際位置與其包含的cfc的位置協(xié)調(diào)。在具體實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:26的氨基酸序列，其包含(i)位置242處的p、a、g或s，(ii)位置269處的d、a、g或s，(iii)位置301處的n、a、g或s，(iv)位置302處的g、p或a，(v)位置303處的t、a、g或s，(vi)位置331處的a、g或s和(vii)位置333處的p、a、g或s。在其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:28或30的氨基酸序列，其包含(i)位置240處的p、a、g或s，(ii)位置267處的d、a、g或s，(iii)位置299處的n、a、g或s，(iv)位置300處的g、p或a，(v)位置301處的t、a、g或s，(vi)位置329處的a、g或s和(vii)位置331處的p、a、g或s。在其它實(shí)施方案中，抗體的重鏈包含seqidno:31的氨基酸序列，其包含(i)位置238處的p、a、g或s，(ii)位置265處的d、a、g或s，(iii)位置297處的n、a、g或s，(iv)位置298處的g、p或a，(v)位置299處的t、a、g或s，(vi)位置327處的a、g或s和(vii)位置329處的p、a、g或s。本發(fā)明還提供了修飾的犬iggd，其包含來(lái)自igga、iggb或iggc的鉸鏈區(qū)以替代其天然iggd鉸鏈區(qū)?；蛘?，可以如表5中所示通過(guò)用脯氨酸殘基替代絲氨酸殘基來(lái)遺傳修飾所述iggd鉸鏈區(qū)。此類(lèi)修飾可導(dǎo)致缺乏fab臂交換的犬iggd?？梢允褂弥亟Mdna技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)構(gòu)建修飾的犬iggd[例如，maniatis等人,molecularcloning,alaboratorymanual(1982)]。為了構(gòu)建這些變體，可以修飾編碼犬iggd的氨基酸序列的核酸，從而使得其編碼修飾的iggd。然后將所述修飾的核酸序列克隆至表達(dá)質(zhì)粒中用于蛋白表達(dá)。編碼所述具有取代的鉸鏈區(qū)的犬iggdfc的核酸由seqidno:7、9和11的核苷酸序列(其編碼seqidno:8、10和12的氨基酸序列)所示例。編碼具有修飾的iggd鉸鏈區(qū)的犬iggdfc的核酸包含seqidno:5的核苷酸序列，其編碼seqidno:6的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了全長(zhǎng)犬重鏈，其可以與對(duì)應(yīng)的輕鏈匹配以得到犬源化抗體。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了犬源化鼠抗-犬抗原抗體(包括分離的犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體)和使用所述抗體或其抗原結(jié)合片段治療疾病(例如，在犬中治療癌癥)的方法。此外，本發(fā)明提供了犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體或抗原結(jié)合片段，其結(jié)合犬pd-l1且阻斷犬pd-1結(jié)合犬pd-l1。在某些實(shí)施方案中，所述犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體包含如本文所述的修飾的犬iggbfc、修飾的犬iggcfc或修飾的缺乏fab臂交換的犬iggd。結(jié)合犬抗原(例如，犬pd-l1)的抗體或其抗原結(jié)合片段可包含如本文所述的鼠抗-犬抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(cdr)中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)。所述一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)cdr可以獨(dú)立地選自下文提供的那些的cdr序列。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，結(jié)合犬pd-l1的抗體或其抗原結(jié)合片段包含犬抗體κ輕鏈和犬抗體重鏈igg，所述犬抗體κ輕鏈包含鼠輕鏈cdr-1、cdr-2和/或cdr-3，所述犬抗體重鏈igg包含鼠重鏈cdr-1、cdr-2和/或cdr3。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了全長(zhǎng)犬重鏈，其可以例如與對(duì)應(yīng)的輕鏈匹配以制備犬源化抗體[參見(jiàn)下表2，其中提供了兩組鼠抗-犬pd-l1的cdr的序列，例如，4f9和5f12]。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抗體或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合pd-l1且具有犬抗體κ輕鏈和犬抗體重鏈igg，同時(shí)仍然表現(xiàn)出所需的結(jié)合和功能特性，所述犬抗體κ輕鏈包含一至六個(gè)不同的cdr，所述cdr與seqidno:16、17、18、22、23和/或24的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性，所述犬抗體重鏈igg包含一至六個(gè)不同的cdr，所述cdr與seqidno:13、14、15、19、20和/或21的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段包含犬框架，同時(shí)仍然表現(xiàn)出所需的結(jié)合和功能特性，所述犬框架包含igg重鏈序列與κ輕鏈的組合，其具有一個(gè)或多個(gè)具有0、1、2、3、4或5個(gè)保守或非保守氨基酸取代的上述cdr氨基酸序列?！氨Ｊ匦揎椀淖凅w”或“保守取代”指用具有類(lèi)似特征(例如電荷、側(cè)鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構(gòu)象和剛性等)的其它氨基酸取代蛋白中的氨基酸，從而使得所述變化可以經(jīng)常在不改變蛋白的生物活性的情況下進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，一般而言，在多肽的非必需區(qū)域中的單個(gè)氨基酸取代不會(huì)實(shí)質(zhì)上改變生物學(xué)活性[參見(jiàn)，例如，watson等人,molecularbiologyofthegene,thebenjamin/cummingspub.co.,第224頁(yè)(第4版;1987)]。另外，結(jié)構(gòu)或功能類(lèi)似的氨基酸的取代不太可能破壞生物學(xué)活性。示例性的保守取代闡述在下表i中。表1示例性保守氨基酸取代。本發(fā)明也考慮本發(fā)明的抗體的功能保守變體。如本文中所用的“功能保守變體”指這樣的抗體或片段，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基已經(jīng)被改變，而不改變期望的特性，諸如抗原親和力和/或特異性。此類(lèi)變體包括、但不限于用具有類(lèi)似特性的氨基酸替代一個(gè)氨基酸，諸如上表i的保守氨基酸取代。核酸本發(fā)明進(jìn)一步包括編碼本文公開(kāi)的犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體和其抗原結(jié)合片段的免疫球蛋白鏈的核酸(參見(jiàn)下述實(shí)施例)。本發(fā)明中還包括編碼免疫球蛋白多肽的核酸，當(dāng)通過(guò)blast算法(其中選擇算法的參數(shù)以在各個(gè)參照序列的整個(gè)長(zhǎng)度上給出各個(gè)序列之間的最大匹配)執(zhí)行對(duì)比時(shí)，所述免疫球蛋白多肽包含的氨基酸序列與本文提供的cdr和/或犬cfc和/或抗體的氨基酸序列具有至少約70%同一性，優(yōu)選地至少約80%同一性，更優(yōu)選地至少約90%同一性和最優(yōu)選地至少約95%同一性(例如，95%、96%、97%、98%、99%、100%)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼免疫球蛋白多肽的核酸，當(dāng)用blast算法(其中選擇算法的參數(shù)以在各個(gè)參照序列的整個(gè)長(zhǎng)度上給出各個(gè)序列之間的最大匹配)執(zhí)行對(duì)比時(shí)，所述免疫球蛋白多肽包含的氨基酸序列與任何參照氨基酸序列具有至少約70%相似性，優(yōu)選地至少約80%相似性，更優(yōu)選地至少約90%相似性和最優(yōu)選地至少約95%相似性(例如，95%、96%、97%、98%、99%、100%)。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的核酸(包括分離的核酸)的表達(dá)載體，其中所述核酸可操作連接至控制序列，當(dāng)用所述載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞時(shí)，所述控制序列被宿主細(xì)胞識(shí)別。還提供了包含本發(fā)明的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞和用于生產(chǎn)本文公開(kāi)的抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，所述方法包括：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)攜帶編碼抗體或抗原結(jié)合片段的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，和從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基分離所述抗原或其抗原結(jié)合片段。犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體例如可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法重組產(chǎn)生?？捎米饔糜诒磉_(dá)本文公開(kāi)的抗體或片段的宿主的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是本領(lǐng)域眾所周知的，且包括從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)可得的許多無(wú)限增殖化的細(xì)胞系。這些尤其包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞、nso、sp2細(xì)胞、hela細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(bhk)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(cos)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如，hepg2)、a549細(xì)胞、3t3細(xì)胞、hek-293細(xì)胞和許多其它細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、豬、羊、牛、馬和倉(cāng)鼠細(xì)胞。通過(guò)確定哪些細(xì)胞系具有高表達(dá)水平，選擇特別優(yōu)選的細(xì)胞系?？梢允褂玫钠渌?xì)胞系是昆蟲(chóng)細(xì)胞系，諸如sf9細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、植物細(xì)胞和真菌細(xì)胞。當(dāng)將編碼重鏈或其抗原結(jié)合部分或片段、輕鏈和/或其抗原結(jié)合片段的重組表達(dá)載體引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，通過(guò)如下產(chǎn)生抗體：將所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)足以允許所述抗體在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，或者更優(yōu)選地，使所述抗體分泌至宿主細(xì)胞在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中的時(shí)間段。使用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白純化方法，可以從培養(yǎng)基回收抗體。此外，可以使用許多已知技術(shù)增強(qiáng)本發(fā)明的抗體(或來(lái)自其的其它部分)從生產(chǎn)細(xì)胞系的表達(dá)。例如，谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)系統(tǒng)(gs系統(tǒng))是一種用于增強(qiáng)在特定條件下的表達(dá)的常見(jiàn)方法。連同歐洲專(zhuān)利號(hào)0216846、0256055和0323997和歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?9303964.4完整地或部分地討論了gs系統(tǒng)。一般而言，在特別的細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生的糖蛋白將具有在所述細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生的糖蛋白特征性的糖基化模式。因此，抗體的特別的糖基化模式將取決于用于產(chǎn)生所述抗體的特定細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。然而，由本文提供的核酸分子編碼或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗體構(gòu)成本發(fā)明，其不依賴于所述抗體可能具有的糖基化模式。類(lèi)似地，在具體實(shí)施方案中，具有僅包含未巖藻糖基化的n-聚糖的糖基化模式的抗體可能是有利的，因?yàn)檫@些抗體已經(jīng)顯示通常在體外和在體內(nèi)表現(xiàn)出比它們的巖藻糖基化的對(duì)應(yīng)物更有效的功效[參見(jiàn)例如，shinkawa等人,j.biol.chem.278:3466-3473(2003);美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,946,292和7,214,775]。本發(fā)明進(jìn)一步包括本文公開(kāi)的犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體的抗體片段。所述抗體片段包括f(ab)2片段，其可以通過(guò)例如胃蛋白酶對(duì)igg的酶切割來(lái)生產(chǎn)。fab片段可以通過(guò)例如用二硫蘇糖醇或巰基乙胺還原f(ab)2來(lái)產(chǎn)生。fab片段是通過(guò)二硫鍵附加至vh-ch1鏈的vl-cl鏈。f(ab)2片段是兩個(gè)進(jìn)而通過(guò)兩個(gè)二硫鍵附加的fab片段。f(ab)2分子的fab部分包括二硫鍵位于其中間的fc區(qū)的部分。fv片段是vl或vh區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含重鏈恒定區(qū)，例如，犬恒定區(qū)，諸如igga、iggb、iggc和iggd犬重鏈恒定區(qū)或其變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含輕鏈恒定區(qū)，例如，犬輕鏈恒定區(qū)，諸如λ或κ犬輕鏈區(qū)域或其變體。作為實(shí)例，且非限制性地，所述犬重鏈恒定區(qū)可以來(lái)自iggb，且所述犬輕鏈恒定區(qū)可以來(lái)自κ?？贵w工程改造本發(fā)明的犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體可被工程改造以包括親本(即，犬)單克隆抗體的犬框架中的修飾，例如以改善抗體的特性，如下文所詳述的。交叉阻斷抗體和表位結(jié)合與4f9和/或5f12交叉競(jìng)爭(zhēng)的交叉阻斷抗體及其抗原結(jié)合片段，包括犬源化的交叉阻斷抗體及其抗原結(jié)合片段，是本發(fā)明的一部分。此外，與本發(fā)明的任何抗-犬pd-l1抗體或其片段結(jié)合相同表位的抗體及其抗原結(jié)合片段也形成本發(fā)明的一部分。交叉阻斷抗體和抗原結(jié)合片段可以基于它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定(例如，biacore?、elisa或流式細(xì)胞術(shù))中與4f9和/或5f12交叉競(jìng)爭(zhēng)的能力來(lái)鑒定。例如，可以使用標(biāo)準(zhǔn)elisa測(cè)定，其中將重組犬pd-l1蛋白固定在板上，將抗體之一熒光標(biāo)記，且評(píng)價(jià)未標(biāo)記的抗體競(jìng)爭(zhēng)掉標(biāo)記抗體的結(jié)合的能力。另外或可替代地，biacore?分析可用于評(píng)估抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)的能力。測(cè)試抗體抑制例如4f9和/或5f12與犬pd-l1結(jié)合的能力表明測(cè)試抗體可與4f9和/或5f12競(jìng)爭(zhēng)與犬pd-l1的結(jié)合，且因此，在一些情況下，可結(jié)合犬pd-l1上與4f9和/或5f12相同的表位。在更具體實(shí)施方案中，與4f9和/或5f12交叉競(jìng)爭(zhēng)且還結(jié)合犬pd-l1上與4f9和/或5f12相同的表位的交叉阻斷抗體及其抗原結(jié)合片段也是本發(fā)明的一部分。肽和融合蛋白疫苗包含由抗-犬pd-l1mab識(shí)別的表位(或其部分)的肽和包含此類(lèi)肽的融合蛋白可以用作引發(fā)阻斷pd-l1與pd-1的結(jié)合的抗體且導(dǎo)致t細(xì)胞活化和免疫應(yīng)答的增強(qiáng)的疫苗。此類(lèi)疫苗可用作疾病諸如癌癥的治療用疫苗或用作對(duì)其它疫苗的免疫應(yīng)答的增強(qiáng)劑。為了使用這些肽作為疫苗，這些肽中的一種或多種可以化學(xué)或通過(guò)重組dna技術(shù)的技術(shù)與載體蛋白偶聯(lián)，以增強(qiáng)這些肽的免疫原性且引發(fā)肽特異性抗體。用于將肽偶聯(lián)至載體蛋白的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。肽(和相應(yīng)的融合蛋白)疫苗可用于通過(guò)例如肌內(nèi)(im)、皮下(s/c)、口服、噴霧或卵內(nèi)（inovo）途徑將動(dòng)物接種疫苗(參見(jiàn)下文)。此類(lèi)疫苗可以用作從細(xì)菌、病毒、酵母或桿狀病毒病毒系統(tǒng)表達(dá)的亞單位蛋白?；蛘撸祟?lèi)肽(或融合蛋白)疫苗可在施用表達(dá)此類(lèi)肽或融合蛋白的多種病毒或細(xì)菌載體之后遞送，如可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法實(shí)施的。所述肽或融合蛋白疫苗可以以1-1000μg的劑量施用，并且可以任選地含有佐劑和可接受的藥物載體。藥物組合物和施用為了制備犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物或無(wú)菌組合物，可以將其與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合[參見(jiàn)，例如，remington'spharmaceuticalsciences和u.s.pharmacopeia:nationalformulary,mackpublishingcompany,easton,pa(1984)]。通過(guò)與可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合，可以制備治療劑和診斷劑的制劑，所述制劑呈例如冷凍干燥粉末、漿劑、水溶液或懸浮液的形式[參見(jiàn)，例如，hardman,等人(2001)goodmanandgilman’sthepharmacologicalbasisoftherapeutics,mcgraw-hill,newyork,ny;gennaro(2000)remington:thescienceandpracticeofpharmacy,lippincott,williams,andwilkins,newyork,ny;avis,等人(編)(1993)pharmaceuticaldosageforms:parenteralmedications,marceldekker,ny;lieberman,等人(編)(1990)pharmaceuticaldosageforms:tablets,marceldekker,ny;lieberman,等人(編)(1990)pharmaceuticaldosageforms:dispersesystems,marceldekker,ny;weiner和kotkoskie(2000)excipienttoxicityandsafety,marceldekker,inc.,newyork,ny]。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的抗-pd-l1抗體在乙酸鈉溶液(ph5-6)中稀釋至適當(dāng)濃度，并為了張力加入nacl或蔗糖?？梢约尤腩~外的試劑(諸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)以增強(qiáng)穩(wěn)定性。單獨(dú)地或與另一種試劑組合地施用的抗體組合物的毒性和治療功效可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥物操作在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中確定，例如，確定ld50(對(duì)群體的50%致死的劑量)和ed50(對(duì)群體中的50%治療上有效的劑量)。有毒和治療效果之間的劑量比是治療指數(shù)(ld50/ed50)。在具體方面，表現(xiàn)出高治療指數(shù)的抗體是期望的。從這些細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)可以用于訂出用于犬科動(dòng)物中的劑量的范圍。此類(lèi)化合物的劑量?jī)?yōu)選地在包括ed50且?guī)缀鯖](méi)有或沒(méi)有毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。所述劑量可以在該范圍內(nèi)變化，這取決于采用的劑型和施用途徑。施用模式可以變化。合適的施用途徑包括口服、直腸、跨粘膜、經(jīng)腸、腸胃外；肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、吸入、吹入法、局部、皮膚、經(jīng)皮或動(dòng)脈內(nèi)。在具體實(shí)施方案中，可以通過(guò)侵襲性途徑(諸如通過(guò)注射)來(lái)施用犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體或其抗原結(jié)合片段。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中，靜脈內(nèi)地、皮下地、肌內(nèi)地、動(dòng)脈內(nèi)地、腫瘤內(nèi)地或通過(guò)吸入、氣溶膠遞送，施用鼠抗-犬pd-l1抗體或其抗原結(jié)合片段或其藥物組合物。通過(guò)非侵襲性途徑(例如，口服地；例如，在丸劑、膠囊或片劑中)的施用也在本發(fā)明范圍內(nèi)。還可以通過(guò)輸注來(lái)施用本文公開(kāi)的藥物組合物。用于施用藥物組合物的眾所周知的植入物和模塊形式的實(shí)例包括:美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,487,603，其公開(kāi)了一種用于以受控的速率分配藥物的可植入的微量輸注泵；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,447,233，其公開(kāi)了一種用于以精確的輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,447,224，其公開(kāi)了一種用于連續(xù)藥物遞送的可變流可植入的輸注裝置；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,439,196，其公開(kāi)了一種具有多室區(qū)室(multi-chambercompartment)的滲透藥物遞送系統(tǒng)。許多其它此類(lèi)植入物、遞送系統(tǒng)和模塊是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。或者，人們可以以局部方式而不是全身方式施用犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體，例如，通過(guò)將抗體直接注射進(jìn)特征在于免疫病理學(xué)的關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)或病原體誘導(dǎo)的病灶中，經(jīng)常在貯庫(kù)(depot)或持續(xù)釋放制劑中。此外，可以在靶向藥物遞送系統(tǒng)中施用抗體，例如，在用組織特異性抗體包被的脂質(zhì)體中，所述組織特異性抗體靶向例如特征在于免疫病理學(xué)的關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)或病原體誘導(dǎo)的病灶。所述脂質(zhì)體將選擇性地靶向患病組織和被患病組織攝入。施用方案取決于幾個(gè)因素，包括治療用抗體的血清或組織周轉(zhuǎn)率、癥狀的水平、治療用抗體的免疫原性和靶細(xì)胞在生物基質(zhì)中的可及性。優(yōu)選地，施用方案遞送足夠的治療用抗體以實(shí)現(xiàn)靶疾病狀態(tài)的改善，同時(shí)使不希望的副作用最小化。因此，遞送的生物制劑的量部分地取決于特定治療用抗體和要治療的狀況的嚴(yán)重程度?？傻玫竭x擇治療用抗體的適當(dāng)劑量的指南[參見(jiàn)，例如，wawrzynczakantibodytherapy,biosscientificpub.ltd,oxfordshire,uk(1996);kresina(編)monoclonalantibodies,cytokinesandarthritis,marceldekker,newyork,ny(1991);bach(編)monoclonalantibodiesandpeptidetherapyinautoimmunediseases,marceldekker,newyork,ny(1993);baert,等人,newengl.j.med.348:601-608(2003);milgrom等人,newengl.j.med.341:1966-1973(1999);slamon等人,newengl.j.med.344:783-792(2001);beniaminovitz等人,newengl.j.med.342:613-619(2000);ghosh等人,newengl.j.med.348:24-32(2003);lipsky等人,newengl.j.med.343:1594-1602(2000)]。適當(dāng)劑量的確定由獸醫(yī)做出，例如，使用本領(lǐng)域已知或疑似影響治療的參數(shù)或因素。通常，所述劑量開(kāi)始于稍微小于最適劑量的量，并且它在此后以小增量增加，直到相對(duì)于任何負(fù)面副作用達(dá)到期望的或最適的效果。重要的診斷措施包括例如炎癥的癥狀的診斷措施或產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子的水平的診斷措施?？梢酝ㄟ^(guò)連續(xù)輸注或通過(guò)例如每天1次、每周1-7次、每周1次、每2周1次、每月1次、每2月1次、每季度1次、每半年1次、每年1次等施用的劑量來(lái)提供本文公開(kāi)的抗體或其抗原結(jié)合片段。可以例如靜脈內(nèi)地、皮下地、局部地、口服地、鼻地、直腸地、肌內(nèi)地、大腦內(nèi)地、脊柱內(nèi)地或通過(guò)吸入提供劑量?？偯恐軇┝客ǔＪ侵辽?.05μg/kg體重，更通常是至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/ml、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或更多[參見(jiàn)，例如，yang,等人,newengl.j.med.349:427-434(2003)；herold,等人,newengl.j.med.346:1692-1698(2002)；liu,等人,j.neurol.neurosurg.psych.67:451-456(1999)；portielji,等人,cancerimmunol.immunother.52:133-144(2003)]。還可以提供劑量以達(dá)到犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體在受試者的血清中的預(yù)定靶濃度，諸如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml或更多。在其它實(shí)施方案中，每周、每2周、“每4周”、每月、每2月或每季度以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg/受試者皮下地或靜脈內(nèi)地施用本發(fā)明的犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體。如本文中所用，“抑制”或“治療”或“處理”包括與病癥相關(guān)的癥狀的發(fā)展的延遲和/或此類(lèi)病癥的癥狀的嚴(yán)重性的減少。該術(shù)語(yǔ)還包括改善既有的不受控制的或不希望的癥狀，預(yù)防另外的癥狀，和改善或預(yù)防此類(lèi)癥狀的基礎(chǔ)原因。因此，該術(shù)語(yǔ)表示，已經(jīng)給脊椎動(dòng)物受試者賦予有益的結(jié)果，所述脊椎動(dòng)物受試者具有病癥、疾病或癥狀或具有發(fā)展此類(lèi)病癥、疾病或癥狀的可能。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”、“治療有效劑量”和“有效量”指這樣的本發(fā)明的犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體或其抗原結(jié)合片段的量：當(dāng)單獨(dú)地或與另外的治療劑組合地施用于細(xì)胞、組織或受試者時(shí)，所述量有效地引起疾病或狀況的一種或多種癥狀或此類(lèi)疾病或狀況的進(jìn)展的可測(cè)量的改善。治療有效劑量進(jìn)一步指，足以導(dǎo)致癥狀的至少部分改善的結(jié)合化合物的量，例如，相關(guān)的醫(yī)學(xué)狀況的治療、治愈、預(yù)防或改善，或此類(lèi)狀況的治療、治愈、預(yù)防或改善的速率的增加。當(dāng)應(yīng)用于單獨(dú)施用的個(gè)別活性成分時(shí)，治療有效劑量表示單獨(dú)的該成分。當(dāng)應(yīng)用于組合時(shí)，治療有效劑量表示產(chǎn)生治療效果的活性成分的組合量，無(wú)論是組合地、連續(xù)地還是同時(shí)地施用。有效量的治療劑將導(dǎo)致診斷測(cè)量或參數(shù)改善至少10%；經(jīng)常至少20%；優(yōu)選地至少約30%；更優(yōu)選地至少40%，和最優(yōu)選地至少50%。在使用主觀測(cè)量來(lái)評(píng)估疾病嚴(yán)重程度的情況下，有效量還可以導(dǎo)致主觀測(cè)量的改善。其它組合療法如前面所述，犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體或其抗原結(jié)合片段可以與一種或多種其它治療劑(諸如化療劑)一起共同施用。所述抗體可以連接至所述試劑(作為免疫復(fù)合物)，或可以與所述試劑分開(kāi)施用。在后一種情況(分開(kāi)施用)下，所述抗體可以在所述試劑之前、之后或同時(shí)施用，或可以與其它已知的療法一起共同施用。在具體組合療法中，犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體或其抗原結(jié)合片段可以與犬源化鼠抗-犬pd-1抗體或其抗原結(jié)合片段[例如，如公開(kāi)于2013年12月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/918,946以及2014年7月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)62/030,812，2014年12月16日提交的臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)62/092,496，pct/ep2014/078655(wo2015091911)和pctep2014/078653(wo2015/091910)中的，其內(nèi)容全部以其整體通過(guò)引用并入本文]和/或犬源化鼠抗-犬細(xì)胞毒性t-淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白-4(ctla-4)抗體或其抗原結(jié)合片段共同施用。因此，可以共同施用這三種犬源化鼠抗-犬蛋白(即，抗-犬pd-l1、pd-1或ctla-4)抗體或其抗原結(jié)合片段的任何組合。例如，犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體或其抗原結(jié)合片段可以在犬源化鼠抗-犬pd-1抗體或其抗原結(jié)合片段和/或犬源化鼠ctla-4抗體或其抗原結(jié)合片段之前、之后或同時(shí)施用。此外，犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體或其抗原結(jié)合片段與犬源化鼠抗-犬pd-1抗體或其抗原結(jié)合片段和/或犬源化鼠ctla-4抗體或其抗原結(jié)合片段的組合也可以與其它已知的療法共同施用，即，之前、之后或同時(shí)施用。試劑盒還提供了試劑盒，其包含一種或多種組分，其包括但不限于如本文所討論的特異性結(jié)合pd-l1的抗體或抗原結(jié)合片段(例如，犬源化鼠抗-犬pd-l1抗體或其抗原結(jié)合片段)，其與一種或多種額外組分結(jié)合，包括但不限于如本文所討論的犬源化鼠抗-犬pd-1抗體或其抗原結(jié)合片段，和/或犬源化鼠抗-犬ctla-4抗體或其抗原結(jié)合片段，藥學(xué)上可接受的載體和/或化療劑。在替代實(shí)施方案中，所述試劑盒可以包含一種或多種肽，其包含由如上所討論的抗-犬pd-l1mab識(shí)別的表位或其部分(或包含表位或其部分的融合蛋白)。結(jié)合組合物和/或化療劑或包含表位或其部分的肽(或包含表位或其部分的融合蛋白)可以配制為純組合物或與藥學(xué)上可接受的載體組合于藥物組合物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包括一個(gè)容器中(例如，無(wú)菌玻璃或塑料小瓶中)的本發(fā)明的結(jié)合組合物，例如犬源化鼠抗-犬pd-l1(或其抗原結(jié)合片段)或其藥物組合物和/或另一個(gè)容器中(例如，無(wú)菌玻璃或塑料小瓶中)的其藥物組合物和/或化療劑和/或一個(gè)或多個(gè)其它容器中(例如，無(wú)菌玻璃或塑料小瓶中)的犬源化鼠抗-犬pd-1(或其抗原結(jié)合片段)和/犬源化鼠抗-犬ctla-4(或其抗原結(jié)合片段)或其藥物組合物。如果試劑盒包括用于腸胃外施用于受試者的藥物組合物，則所述試劑盒也可以包括用于執(zhí)行此施用的設(shè)備。例如，所述試劑盒可以包括一個(gè)或多個(gè)皮下注射針頭或如上面討論的其它注射設(shè)備。所述試劑盒還可以包括包裝插頁(yè)，其包括關(guān)于所述試劑盒中的藥物組合物和劑型的信息。通常，此信息幫助寵物主人和獸醫(yī)有效地和安全地使用包封的藥物組合物和劑型。例如，以下關(guān)于本發(fā)明的組合的信息可以提供在插頁(yè)中：藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)、臨床研究、功效參數(shù)、適應(yīng)癥和用法、禁忌癥、警告信息、預(yù)防措施、不良反應(yīng)、過(guò)量給藥、適當(dāng)劑量和施用、供應(yīng)規(guī)格、適當(dāng)儲(chǔ)存條件、參考文獻(xiàn)、生產(chǎn)商/分銷(xiāo)商信息和專(zhuān)利信息。為了方便起見(jiàn)，可以將本文公開(kāi)的抗體或特異性結(jié)合劑提供在試劑盒(即，具有關(guān)于執(zhí)行診斷或檢測(cè)測(cè)定的說(shuō)明書(shū)的預(yù)定量的試劑的包裝組合)中。在用酶標(biāo)記抗體的情況下，所述試劑盒將包括所述酶需要的底物和輔因子(例如，提供可檢測(cè)的發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)的底物前體)。另外，可能包括其它添加劑，諸如穩(wěn)定劑、緩沖劑(例如，封閉緩沖劑或裂解緩沖劑)等。各種試劑的相對(duì)量可以寬泛地變化，以提供實(shí)質(zhì)上最優(yōu)化測(cè)定的靈敏度的試劑溶液的濃度。具體地，所述試劑可以提供為干粉，經(jīng)常是冷凍干燥的，包括賦形劑，其在溶解時(shí)將提供具有適當(dāng)濃度的試劑溶液。實(shí)施例實(shí)施例1犬pd-1和pd-l1犬pd-1和pd-l1序列：在此以其整體通過(guò)引用并入的于2013年12月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/918,946和于2014年7月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/030,812提供了：seqidno:49的犬pd-1(cpd-1)的全長(zhǎng)核苷酸序列[seqidno:69包括信號(hào)序列]；seqidno:50的對(duì)應(yīng)的翻譯的氨基酸序列[seqidno:70包括信號(hào)序列]；編碼犬pd-1的胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)的核苷酸序列，seqidno:51；犬pd-1的ecd的氨基酸序列，seqidno:52；犬pd-1ecd加gt接頭以及人igg1fc基因的fc部分的核苷酸序列，seqidno:53；和犬pd-1ecd加gt接頭以及人igg1fc基因的fc部分的氨基酸序列，seqidno:54[seqidno:81包括信號(hào)序列]。在此以其整體通過(guò)引用并入的于2013年12月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/918,946和于2014年7月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/030,812還提供了：seqidno:55的犬pd-l1(cpd-l1)的全長(zhǎng)核苷酸序列[seqidno:71包括信號(hào)序列]；seqidno:56的對(duì)應(yīng)的翻譯的氨基酸序列[seqidno:72包括信號(hào)序列]；編碼犬pd-l1的胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)的核苷酸序列，seqidno:57；犬pd-l1的ecd的氨基酸序列，seqidno:58；犬pd-l1ecd加gt接頭以及人igg1fc基因的fc部分的核苷酸序列，seqidno:59；和pd-l1ecd加gt接頭以及人igg1fc基因的fc部分的氨基酸序列，seqidno:60。犬pd-1的鑒定和克隆：通過(guò)檢索ncbi基因庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)xm_543338.4)，鑒定編碼全長(zhǎng)犬pd-1(cpd-1)的核酸。翻譯的氨基酸序列(登錄號(hào)xp_543338.3)對(duì)應(yīng)于推定的犬pd-1蛋白，其如下進(jìn)一步鑒定：檢索基因庫(kù)(ncbi)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，并將鑒定的氨基酸序列與鼠、貓和人pd-1氨基酸序列比對(duì)。合成了針對(duì)cho細(xì)胞進(jìn)行了密碼子最優(yōu)化的、與全長(zhǎng)犬pd-1基因?qū)?yīng)的dna序列，并將其克隆進(jìn)命名為p96793的質(zhì)粒中。預(yù)期的犬pd-1的dna和蛋白序列與已知的pd-1dna和蛋白序列的對(duì)比導(dǎo)致編碼犬pd-1的胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)的dna序列和犬pd-1的ecd的氨基酸序列的鑒定。合成了除了gt接頭和8個(gè)組氨酸殘基以外還編碼犬pd-1的ecd的dna序列，并將其克隆至命名為lpd2726的質(zhì)粒中?；瘜W(xué)合成了對(duì)應(yīng)于犬pd-1ecd加gt接頭以及人igg1fc基因的fc部分的核酸序列，并將其克隆至命名為lpd2727的質(zhì)粒中。犬pd-1ecd和人igg1fc的fc部分包含seqidno:81的氨基酸序列(包括信號(hào)序列)。犬pd-l1的鑒定和克隆：通過(guò)檢索ncbi基因庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)(登錄號(hào)xm_541302.4)，鑒定編碼全長(zhǎng)犬pd-l1的核酸。通過(guò)如下鑒定對(duì)應(yīng)于推定的犬pd-l1蛋白的翻譯的氨基酸序列(登錄號(hào)xp-541302.4)：檢索基因庫(kù)(ncbi)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，并將鑒定的序列與已知的pd-l1小鼠和人序列比對(duì)。編碼犬pd-l1的dna與已知的pd-l1序列的比較鑒定出對(duì)應(yīng)于犬pd-l1的ecd結(jié)構(gòu)域的dna序列(其針對(duì)cho細(xì)胞進(jìn)行了密碼子最優(yōu)化)。犬pd-l1的ecd的預(yù)期氨基酸序列是seqidno:58。合成了編碼pd-l1ecd加gt接頭以及8個(gè)組氨酸殘基的dna，并將其克隆至命名為lpd2695的質(zhì)粒中?；瘜W(xué)合成了編碼犬pd-l1ecd加gt接頭以及人igg1fc的fc部分的氨基酸序列的dna序列，并將其克隆至命名為lpd2697的質(zhì)粒中。犬pd-l1ecd加gt接頭以及人igg1的fc部分包含seqidno:60的氨基酸序列。pd-1和pd-l1蛋白的表達(dá)：將編碼pd-1ecd-his、pd-1ecd-fc、pdl-l1ecd-his和pd-l1ecd-fc蛋白的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞中，并使用a蛋白(對(duì)于fc融合蛋白)或鎳(ni2+)柱層析(對(duì)于his-標(biāo)記的蛋白)從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清液純化蛋白。將純化的蛋白用于如下詳述的elisa或結(jié)合測(cè)定。通過(guò)sds-page凝膠分析表達(dá)的蛋白。全長(zhǎng)犬pd-1dna序列：信號(hào)序列加下劃線且以粗體顯示核苷酸序列seqidno:49無(wú)信號(hào)序列。全長(zhǎng)犬pd-1氨基酸序列：信號(hào)序列加下劃線且以粗體顯示氨基酸序列seqidno:50無(wú)信號(hào)序列犬pd-1胞外結(jié)構(gòu)域dna序列：seqidno:51(密碼子最優(yōu)化用于在cho細(xì)胞中表達(dá))犬pd-1胞外結(jié)構(gòu)域：seqidno:52犬pd-1胞外結(jié)構(gòu)域–人igg1fcdna序列：seqidno:53(密碼子最優(yōu)化用于在hek-293細(xì)胞中表達(dá))犬pd-1胞外結(jié)構(gòu)域–人igg1fc融合蛋白：信號(hào)序列加下劃線且以粗體顯示：氨基酸seqidno:54無(wú)信號(hào)序列。全長(zhǎng)犬pd-l1dna序列：信號(hào)序列加下劃線且以粗體顯示核苷酸序列seqidno:55無(wú)信號(hào)序列。全長(zhǎng)犬pd-l1：信號(hào)序列加下劃線且以粗體顯示氨基酸序列seqidno:56無(wú)信號(hào)序列犬pd-l1胞外結(jié)構(gòu)域dna序列：seqidno:57(密碼子最優(yōu)化用于在cho細(xì)胞中表達(dá))犬pd-l1胞外結(jié)構(gòu)域蛋白：seqidno:58犬pd-l1胞外結(jié)構(gòu)域–人igg1fcdna序列：seqidno:59(密碼子最優(yōu)化用于在hek-293細(xì)胞中表達(dá))犬pd-l1胞外結(jié)構(gòu)域–人igg1fc融合蛋白：seqidno:60實(shí)施例2鼠抗-犬pd-l1抗體抗-犬pd-l1單克隆抗體的生成：在17天時(shí)間段內(nèi)，將總共三只balb/c小鼠免疫多次(每次10μg)。免疫抗原是犬pd-l1ecd-fc融合蛋白。在免疫后，從各小鼠采集血清并測(cè)試其與犬pd-l1ecd-his標(biāo)記的蛋白的反應(yīng)性。將具有最高血清抗-pd-l1ecd-his效價(jià)的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤p3x63ag8.653細(xì)胞系融合。融合后約2周，通過(guò)elisa測(cè)試來(lái)自推定雜交瘤細(xì)胞的上清液與pd-l1ecd-his標(biāo)記的蛋白的反應(yīng)性。將在elisa中產(chǎn)生強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)的雜交瘤通過(guò)有限稀釋進(jìn)行亞克隆并再次測(cè)試與犬pd-l1ecd-his標(biāo)記的蛋白的反應(yīng)性。單克隆抗體針對(duì)犬pd-l1的反應(yīng)性的證實(shí)：通過(guò)elisa證實(shí)由雜交瘤分泌的抗體與犬pd-l1的ecd的反應(yīng)性。使用celline生物反應(yīng)器(integra-biosciences)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞10-30天。最初將細(xì)胞保持在補(bǔ)充有4mml谷氨酰胺和10%超低igg胎牛血清(fbs)的dmem(來(lái)自gibco)中。將雜交瘤細(xì)胞以約2x106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度接種于celline生物反應(yīng)器細(xì)胞室的15ml相同培養(yǎng)基(fbs濃度提高至20%)中。外部室充入1l的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(含有4mml-谷氨酰胺和2%標(biāo)準(zhǔn)fbs的dmem)。在3-7天內(nèi)將細(xì)胞室中的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)增至約2.5x107個(gè)細(xì)胞/ml。然后，從細(xì)胞室中收獲10ml的細(xì)胞懸浮液并用新鮮培養(yǎng)基替換以允許細(xì)胞再擴(kuò)增和后續(xù)收獲。根據(jù)需要重復(fù)該程序以從各個(gè)雜交瘤克隆獲得足夠量的mab。將收獲的細(xì)胞懸浮液離心并將上清液用0.2微米過(guò)濾膜過(guò)濾。對(duì)于抗體純化，使用g蛋白sepharose4fastflow5ml柱(gehealthcare)通過(guò)重力流動(dòng)純化各克隆的上清液。在用tris-edta(te)緩沖液(ph8.0)洗滌后，使用0.1m甘氨酸緩沖液(ph2.7)洗脫結(jié)合的抗體，隨后使用1mtris(ph8.0)進(jìn)行ph中和。濃縮抗體并使用centriprepym-10，10kdanmwl離心過(guò)濾單元(millipore)將緩沖液更換成磷酸緩沖鹽水(pbs)。使用分光光度法定量抗體濃度。如下通過(guò)elisa測(cè)試純化的抗-犬pd-l1mab與犬pd-l1-hfc融合蛋白的反應(yīng)性：將犬pd-l1-hfc融合蛋白在包被緩沖液(碳酸鹽/碳酸氫鹽，ph9.0)中稀釋至10μg/ml并以100μl/孔分配至96孔平底elisa板(nunc)中。將該板在4℃溫育過(guò)夜。然后將板用含有0.05%tween?20的磷酸緩沖鹽水(pbst)洗滌三次。接著，向每孔中加入200μl封閉緩沖液(pbst中的5%脫脂奶)并將板在37℃溫育60分鐘。然后將板用pbst洗滌三次。接著，向適當(dāng)列的第一孔中加入100μl稀釋于封閉緩沖液中的測(cè)試mab。然后將測(cè)試mab2倍稀釋至適當(dāng)?shù)陌逦恢?。將該板?7℃溫育60分鐘后，將該板用pbst洗滌3次。接著，將100μl/孔的辣根過(guò)氧化物酶綴合的山羊抗-小鼠igg(kpl)的1:2,000稀釋物加入板，然后將該板在37℃溫育60分鐘。然后，將該板用pbst洗滌3次，并將100μl/孔的3,3’,5,5’四甲基聯(lián)苯胺，(tmb)底物(來(lái)自kpl)加入板。允許顏色反應(yīng)在37℃進(jìn)行5-20分鐘，然后在650nm測(cè)量吸光度。表達(dá)犬pd-1蛋白的cho細(xì)胞：將全長(zhǎng)犬pd-1基因克隆至質(zhì)粒p96793中。在該質(zhì)粒中，pd-1蛋白的表達(dá)由hcmv啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。將chodxb11細(xì)胞(dhfr-)維持于補(bǔ)充有10%胎牛血清的mem-α(gibco)中。通過(guò)使用lipofectamine(invitrogen)的脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因遞送，在含有約6x106個(gè)細(xì)胞的75cm2燒瓶中，進(jìn)行用質(zhì)粒p96793對(duì)cho細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，將細(xì)胞傳代到補(bǔ)充有10%fbs和400μg/ml潮霉素b的、不含核苷的mem-α培養(yǎng)基(選擇性培養(yǎng)基)中。對(duì)dhfr+、潮霉素抗性的細(xì)胞的合并物執(zhí)行限度稀釋克隆。通過(guò)免疫熒光測(cè)定，評(píng)估克隆的犬pd-1表達(dá)。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞單層固定在含有80%丙酮的96孔板中。然后將固定且干燥的細(xì)胞單層與多克隆山羊抗-人pd-1抗體(r&dsystems)溫育1小時(shí)。將該板用pbs洗滌，然后與熒光素-標(biāo)記的兔抗-山羊igg抗體(kpl)溫育1小時(shí)。將該板用pbs洗滌。將表現(xiàn)出熒光的克隆擴(kuò)增，并確立細(xì)胞儲(chǔ)備物。通過(guò)小鼠抗-pd-l1mab的配體阻斷：使用基于表達(dá)犬pd-1的cho細(xì)胞系的基于細(xì)胞的elisa(celisa)測(cè)定來(lái)證明小鼠抗-犬pd-l1抗體阻斷犬pd-l1和其受體犬pd-1之間的相互作用(例如，阻斷其結(jié)合)的能力。使用連同犬pd-l1/hfc蛋白一起的該測(cè)定證實(shí)配體阻斷，如下：1.在96-孔板中接種cpd-1cho細(xì)胞，并使細(xì)胞生長(zhǎng)至95-100％匯合。用于將cho細(xì)胞平板接種的一般指南，在第-3天：1x103c/孔(1x105c/ml)在第-2天：2x104c/孔(2x105c/ml)在第-1天：4x104c/孔(4x105c/ml)。2.將抗-cpdl1mab3倍稀釋于cho培養(yǎng)基中，以30μg/ml開(kāi)始，100μl/孔。在cho培養(yǎng)基中將cpd-l1-hfc添加至4μg/ml，100μl/孔，在稀釋板中在37℃、5%co2下振蕩共溫育60分鐘。3.從細(xì)胞包被的板上吸出細(xì)胞培養(yǎng)基，用pbs+0.05%tween20和1xcho培養(yǎng)基洗板3次。4.將來(lái)自稀釋板的共溫育的cpd-l1mab/pd-l1fc加入細(xì)胞包被的板中。100ul/孔。在37℃、5%co2下振蕩溫育60分鐘。5.用pbs+0.05%tween20洗板6次(使用手工洗滌規(guī)程)。6.在cho培養(yǎng)基中加入抗-人fc-hrp(calbiochem)(1:2500)，100ul/孔，在37℃/5%co2下溫育30-60分鐘。7.用pbs+0.05%tween20洗板5次(使用手工洗滌規(guī)程)。8.加入100μl/孔tmbmircowell底物。在室溫下溫育10分鐘。使用來(lái)自pierce的一步底物。9.用100μl/孔1.5m磷酸終止。10.在elisa讀數(shù)器上測(cè)量a450–a620。對(duì)應(yīng)于小鼠抗-犬pd-l1mab可變區(qū)的dna序列的克隆和鑒定：使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法從每個(gè)雜交瘤分離mrna后，鑒定小鼠vh和vl鏈的dna序列和編碼其cdr的dna序列。本文例舉的兩種抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的序列提供于下表12中。來(lái)自這些雜交瘤的cdr的預(yù)測(cè)氨基酸序列的seqidno列于下表2中：表2實(shí)施例3犬源化抗體的犬源化和表征為了產(chǎn)生犬源化抗體，有必要鑒定編碼犬igg的重鏈和輕鏈的dna序列。犬重鏈的核苷酸和氨基酸序列可以獲得自ncbi基因和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。存在犬igg的四種已知igg亞類(lèi)：igga、iggb、iggc和iggd，以及兩種類(lèi)型的輕鏈：κ和λ。表7列出了未修飾的犬fc片段的氨基酸和核苷酸seqidno。不受任何特定方法束縛，產(chǎn)生具有各種犬和小鼠序列含量的抗pdl-1單克隆抗體的變體的方法涉及以下常規(guī)方案：i)確定小鼠mab的vh和vl鏈的核苷酸序列；ii)鑒定小鼠mab的h和l鏈cdr；iii)鑒定合適的犬igg的h和l鏈；iv)確定犬iggh和l鏈的核苷酸序列；v)用編碼各小鼠cdr的核苷酸序列替代編碼內(nèi)源性犬h和l鏈cdr的核苷酸序列。另外，任選地用來(lái)自小鼠構(gòu)架區(qū)的所選殘基替代一些犬構(gòu)架殘基；vi)合成來(lái)自步驟(v)的核苷酸并將其插入合適的表達(dá)質(zhì)粒中；將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至適當(dāng)?shù)募?xì)胞(例如，hek293細(xì)胞)中；vii)從hek293上清液中純化表達(dá)的抗體；以及viii)測(cè)試純化的抗體與犬pd-l1的結(jié)合。實(shí)施例4遺傳修飾的犬igg為了生成缺乏效應(yīng)子功能的犬igg變體，生成許多突變?nèi)甶ggb重鏈[參見(jiàn)，在此以其整體通過(guò)引用并入的于2014年7月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/030,812]。這些變體可包括重鏈氨基酸序列的fc部分中的下列單個(gè)或組合取代之一：p4a、d31a、n63a、g64p、t65a、a93g和p95a。將變體重鏈(即，含有此類(lèi)氨基酸取代)克隆至表達(dá)質(zhì)粒中，并連同含有編碼輕鏈的基因的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染入hek293細(xì)胞中。評(píng)價(jià)從hek293細(xì)胞表達(dá)和純化的完整抗體與fcγri和c1q的結(jié)合，以評(píng)估其介導(dǎo)免疫效應(yīng)子功能的潛力。表3列出了編碼遺傳修飾的犬源化重鏈的質(zhì)粒、犬源化重鏈以及這些重鏈中的遺傳修飾的實(shí)例。變體重鏈用于評(píng)估遺傳修飾的mab中的效應(yīng)子功能。所有這些重鏈均包含來(lái)自鼠抗-犬pd-1抗體的cdr。[參見(jiàn)，美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/030,812，同上]。表3。表4具有鉸鏈序列的修飾的cfc或天然cfc#n.a.修飾的fc1*√修飾的fc–ciggb2*√修飾的fc–ciggb3*√修飾的fc–ciggc4*√修飾的fc–ciggc5#√ciggd鉸鏈的s變?yōu)閜的ciggdfc6#√ciggd鉸鏈的s變?yōu)閜的ciggdfc7√具有a鉸鏈的ciggdfc8√具有a鉸鏈的ciggdfc9√具有b鉸鏈的ciggdfc10√具有b鉸鏈的ciggdfc11√具有c鉸鏈的ciggdfc12√具有c鉸鏈的ciggdfc*取代是在氨基酸序列seqidno:2和4的p4、d31、n63、g64、t65、a93和p95處；或在核苷酸序列seqidno:1和3的編碼那些氨基酸的核苷酸處。#如下表5中顯示于iggd的鉸鏈區(qū)中的單個(gè)氨基酸取代。表5鉸鏈區(qū)序列#如以粗體顯示且加下劃線的絲氨酸至脯氨酸的單個(gè)氨基酸取代。表6犬pd-1/pd-l1序列#n.a.pd-1描述#n.a.pd-l1描述49√√全長(zhǎng)55√√全長(zhǎng)50√√全長(zhǎng)56√√全長(zhǎng)51√√ecd57√√ecd52√√ecd58√√ecd53√√cecd-higg159√√cecd-higg154√√cecd-higg160√√cecd-higg169√√+信號(hào)序列71√√+信號(hào)序列70√√+信號(hào)序列72√√+信號(hào)序列81√√+信號(hào)序列表7天然cfc序列。表8cdr氨基酸序列。表9個(gè)別取代的犬源化重鏈#n.a.25√4f9-vh3-ch1-鉸鏈-fc-ciggbfc26√4f9-vh3-ch1-鉸鏈-fc-ciggbfc27√4f9-vh3-ch1-鉸鏈-fc-ciggcfc28√4f9-vh3-ch1-鉸鏈-fc-ciggcfc29√5f12-vh3-ch1-鉸鏈-fc-ciggbfc30√5f12-vh3-ch1-鉸鏈-fc-ciggbfc31√5f12-vh3-ch1-鉸鏈-fc-ciggcfc32√5f12-vh3-ch1-鉸鏈-fc-ciggcfc潛在具體取代是在p4、d31、n63、g64、t65、a93和p95。表10氨基酸殘基位置的相互關(guān)系##天然和取代的cfc的氨基酸殘基位置與相應(yīng)的取代的犬重鏈的氨基酸殘基位置的相互關(guān)系。第一列列出seqidno.；剩余列列出相應(yīng)的氨基酸位置。對(duì)于兩個(gè)天然氨基酸序列(seqidno.66和68)，還提供了天然氨基酸殘基的單字母代碼。表11個(gè)別未取代的犬源化重鏈和輕鏈#n.a.33√4f9-vh3-ch1-鉸鏈-fc-ciggafc34√4f9-vh3-ch1-鉸鏈-fc-ciggafc35√4f9-vh3-ch1-鉸鏈-fc-ciggdfc36√4f9-vh3-ch1-鉸鏈-fc-ciggdfc37√4f9-vl3-cl-κ38√4f9-vl3-cl-κ39√5f12-vh3-ch1-鉸鏈-fc-ciggafc40√5f12-vh3-ch1-鉸鏈-fc-ciggafc41√5f12-vh3-ch1-鉸鏈-fc-ciggdfc42√5f12-vh3-ch1-鉸鏈-fc-ciggdfc43√5f12-vl3-cl-κ44√5f12-vl3-cl-κ表12重鏈和輕鏈的可變區(qū)#n.a.抗體#n.a.抗體73√4f9-重77√5f12-重74√4f9-重78√5f12-重75√4f9-輕79√5f12-輕76√4f9-輕80√5f12-輕修飾的fcciggdfc(d鉸鏈中的s-->p)fab臂交換[seqidno:6]ciggdfc(d鉸鏈中的s-->p)fab臂交換[seqidno:5]ciggdfc(a鉸鏈)fab臂交換[seqidno:8]ciggdfc(a鉸鏈)fab臂交換[seqidno:7]ciggdfc(b鉸鏈)fab臂交換[seqidno:10]ciggdfc(b鉸鏈)fab臂交換[seqidno:9]ciggdfc(c鉸鏈)fab臂交換[seqidno:12]ciggdfc(c鉸鏈)fab臂交換[seqidno:11]天然fc個(gè)別取代的重鏈個(gè)別未取代的犬源化重鏈和輕鏈4f9-vl3-cl-κ[seqidno:38]4f9-vl3-cl-κ[seqidno:37]5f12-vl3–clκ[seqidno:44]5f12-vl3–clκ[seqidno:43]小鼠抗-犬pdl-1:4f9的可變區(qū)重鏈:dna序列[seqidno:73]重鏈:氨基酸序列[seqidno:74]輕鏈:dna序列[seqidno:75]輕鏈:氨基酸序列[seqidno:76]小鼠抗-犬pdl-1:抗-pdl-15f12的可變區(qū)重鏈:dna序列[seqidno:77]重鏈:氨基酸序列[seqidno:78]輕鏈:dna序列[seqidno:79]輕鏈:氨基酸序列[seqidno:80]實(shí)施例5抗-犬pd-l1抗體的表位定位抗體與其相關(guān)蛋白抗原的相互作用通過(guò)該抗體的特定氨基酸(互補(bǔ)位)與靶抗原的特定氨基酸(表位)的結(jié)合來(lái)介導(dǎo)。表位是通過(guò)免疫球蛋白引起特定反應(yīng)的抗原決定簇。表位由所述抗原表面上的一組氨基酸組成。目標(biāo)蛋白可含有幾個(gè)由不同抗體識(shí)別的表位。由抗體識(shí)別的表位被分為線性表位或構(gòu)象表位。線性表位由蛋白中的一段連續(xù)氨基酸序列形成，而構(gòu)象表位由這樣的氨基酸構(gòu)成：所述氨基酸在一級(jí)氨基酸序列中是不連續(xù)的(例如，相距遠(yuǎn))，但在三維蛋白折疊后匯聚在一起。表位定位指鑒定由抗體在其靶抗原上識(shí)別的氨基酸序列(即，表位)的方法。鑒定由單克隆抗體(mab)在靶抗原上識(shí)別的表位具有重要應(yīng)用。例如，其可以有助于開(kāi)發(fā)新的治療劑、診斷劑和疫苗。表位定位還可以有助于選擇最優(yōu)化的治療用mab并幫助闡明其作用機(jī)制。pd-l1上的表位信息還可以闡明獨(dú)特的癌癥表位并定義疫苗的保護(hù)或致病作用。表位鑒定還可以基于鑒定的肽表位與載體蛋白或其它免疫刺激劑的化學(xué)或遺傳偶聯(lián)導(dǎo)致亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)。表位定位可以使用多克隆或單克隆抗體進(jìn)行，并且根據(jù)表位的疑似性質(zhì)(即，線性的相比構(gòu)象的)采用幾種方法用于表位鑒定。定位線性表位是更直接的并且相對(duì)更容易進(jìn)行。出于此目的，用于線性表位定位的商業(yè)性服務(wù)經(jīng)常采用肽掃描。在這種情況下，化學(xué)合成靶蛋白的短肽序列的重疊集合，并測(cè)試其結(jié)合目標(biāo)抗體的能力。該策略快速，高通量，并且執(zhí)行起來(lái)相對(duì)便宜。另一方面，定位不連續(xù)的表位在技術(shù)上更有挑戰(zhàn)性，并且需要更專(zhuān)門(mén)的技術(shù)諸如單克隆抗體連同其靶蛋白的x射線共結(jié)晶晶體分析法(x-rayco-crystallography)、氫-氘(h/d)交換、與酶促消化偶聯(lián)的質(zhì)譜分析法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾種其它方法。使用質(zhì)譜分析法定位pd-l1表位：采用基于化學(xué)交聯(lián)和質(zhì)譜法檢測(cè)的方法來(lái)鑒定由抗-犬pd-l1mab識(shí)別的表位[covalx?instrumentincorporated]。將該技術(shù)應(yīng)用于犬pd-l1的表位定位導(dǎo)致鑒定由表13中所列的指出的mab識(shí)別的表位。用mab4f9對(duì)犬pd-l1的表位定位的結(jié)果顯示，該mab識(shí)別位于包含seqidno:82代表的氨基酸序列和seqidno:83代表的氨基酸序列的犬pd-l1的胞外結(jié)構(gòu)域中的表位[參見(jiàn)，表13]。此外，用mab5f12的表位定位實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，該mab識(shí)別位于包含seqidno:82所示的氨基酸序列的犬pd-l1的胞外結(jié)構(gòu)域中的表位。值得注意的是，本文鑒定的犬pd-l1上的表位的定位與最近報(bào)道的對(duì)應(yīng)的人pd-l1的那些合理地一致[hao等人,j.mol.recognit.28:269-276(2015)]，其為上述提供的測(cè)定提供了進(jìn)一步的信心。表13由抗-犬pd-l1mab識(shí)別的pd-l1表位。本文中引用的所有參考文獻(xiàn)都通過(guò)引用并入，其程度如同每篇單獨(dú)的出版物、數(shù)據(jù)庫(kù)條目(例如genbank序列或geneid條目)、專(zhuān)利申請(qǐng)或?qū)＠幻鞔_地且單獨(dú)地指出通過(guò)引用并入一樣。申請(qǐng)人根據(jù)37c.f.r.§1.57(b)(1)意圖用該通過(guò)引用并入的聲明來(lái)表示每個(gè)和每篇單獨(dú)的出版物、數(shù)據(jù)庫(kù)條目(例如genbank序列或geneid條目)、專(zhuān)利申請(qǐng)或?qū)＠?，它們中的每一個(gè)按照37c.f.r.§1.57(b)(2)清楚地鑒定，即使此引用不緊接于通過(guò)引用并入的專(zhuān)用聲明。如果有的話，在說(shuō)明書(shū)中包括的通過(guò)引用并入的專(zhuān)用聲明不以任何方式弱化該通過(guò)引用并入的一般聲明。本文中對(duì)參考文獻(xiàn)的引用無(wú)意承認(rèn)：所述參考文獻(xiàn)為相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，其也不構(gòu)成關(guān)于這些出版物或文件的內(nèi)容或日期的任何承認(rèn)。本發(fā)明在范圍上不受本文描述的具體實(shí)施方案限制。實(shí)際上，除了本文描述的那些以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員從前述描述和附圖將明白本發(fā)明的各種修改。此類(lèi)修改意圖落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。前述書(shū)面說(shuō)明書(shū)被認(rèn)為足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本發(fā)明。除了本文顯示和描述的那些以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員從前述描述將明白本發(fā)明的各種修改，并且所述修改落入所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。序列表<110>intervet,inc.intervetinternational,bvmohamad,morseyyuanzheng,zhangbartels-morozov,deniseerskine,jasontarpey,ian<120>結(jié)合犬pd-l1的pd-l1抗體<130>23837wo<150>62/057541<151>2014-09-30<150>62/172511<151>2015-06-08<160>83<170>patentinversion3.5<210>1<211>645<212>dna<213>人工序列<220><223>修飾的犬序列<220><221>misc_feature<222>(10)..(12)<223>n是a、c、g或t<220><221>misc_feature<222>(91)..(93)<223>n是a、c、g或t<220><221>misc_feature<222>(187)..(195)<223>n是a、c、g或t<220><221>misc_feature<222>(277)..(279)<223>n是a、c、g或t<220><221>misc_feature<222>(283)..(285)<223>n是a、c、g或t<400>1ctgggcggcnnnagcgtgtttatttttccgccgaaaccgaaagataccctgctgattgcg60cgcaccccggaagtgacctgcgtggtggtgnnnctggatccggaagatccggaagtgcag120attagctggtttgtggatggcaaacagatgcagaccgcgaaaacccagccgcgcgaagaa180cagtttnnnnnnnnntatcgcgtggtgagcgtgctgccgattggccatcaggattggctg240aaaggcaaacagtttacctgcaaagtgaacaacaaannnctgnnnagcccgattgaacgc300accattagcaaagcgcgcggccaggcgcatcagccgagcgtgtatgtgctgccgccgagc360cgcgaagaactgagcaaaaacaccgtgagcctgacctgcctgattaaagatttttttccg420ccggatattgatgtggaatggcagagcaacggccagcaggaaccggaaagcaaatatcgc480accaccccgccgcagctggatgaagatggcagctattttctgtatagcaaactgagcgtg540gataaaagccgctggcagcgcggcgatacctttatttgcgcggtgatgcatgaagcgctg600cataaccattatacccaggaaagcctgagccatagcccgggcaaa645<210>2<211>215<212>prt<213>人工序列<220><223>修飾的犬序列<220><221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220><221>misc_feature<222>(31)..(31)<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220><221>misc_feature<222>(63)..(65)<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220><221>misc_feature<222>(93)..(93)<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220><221>misc_feature<222>(95)..(95)<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸<400>2leuglyglyxaaservalpheilepheproprolysprolysaspthr151015leuleuilealaargthrprogluvalthrcysvalvalvalxaaleu202530aspprogluaspprogluvalglnilesertrpphevalaspglylys354045glnmetglnthralalysthrglnproargglugluglnphexaaxaa505560xaatyrargvalvalservalleuproileglyhisglnasptrpleu65707580lysglylysglnphethrcyslysvalasnasnlysxaaleuxaaser859095proilegluargthrileserlysalaargglyglnalahisglnpro100105110servaltyrvalleuproproserargglugluleuserlysasnthr115120125valserleuthrcysleuilelysaspphepheproproaspileasp130135140valglutrpglnserasnglyglnglngluprogluserlystyrarg145150155160thrthrproproglnleuaspgluaspglysertyrpheleutyrser165170175lysleuserv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