本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生l-谷氨酰胺的微生物以及使用該微生物產(chǎn)生l-谷氨酰胺的方法。
背景技術(shù)：
：l-谷氨酰胺作為廣泛用于藥物、化妝品和保健食品中的氨基酸，主要使用化合物抗性或化合物敏感性微生物制備。例如，磺胺胍抗性菌株(jp1978-17675)、重氮絲氨酸抗性微生物(jp1980-148094)、青霉素敏感性微生物(jp1992-088994)和酪氨酸谷氨酸(tyr-glu)-抗性菌株(jp1990-186994)已經(jīng)用于這些目的。在這些情況下，在開發(fā)具有改善的l-谷氨酰胺生產(chǎn)力的菌株的研究過程中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了對高濃度l-谷氨酰胺具有抗性的突變體和通過使用突變體生產(chǎn)高產(chǎn)量的l-谷氨酰胺的方法，從而完成本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：[技術(shù)問題]本發(fā)明提供一種具有改善的l-谷氨酰胺生產(chǎn)力的谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)突變體。本發(fā)明提供一種通過使用谷氨酸棒桿菌突變體產(chǎn)生l-谷氨酰胺的方法。[技術(shù)方案]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種對l-谷氨酰胺具有抗性的產(chǎn)生l-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌突變體。如本文所用，術(shù)語“l(fā)-谷氨酰胺”是指谷氨酸的單酰胺，其是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸和具有式h2nco-ch2ch2ch(nh2)cooh的l-氨基酸。如本文所用，表述“對l-谷氨酰胺具有抗性”是指具有在具有高濃度l-谷氨酰胺的環(huán)境中能夠生長或能夠維持或增加產(chǎn)生l-谷氨酰胺活性的特性的微生物。當(dāng)l-谷氨酰胺在細(xì)胞中積累至某一濃度或更高濃度時(shí)，這可以通過反饋調(diào)節(jié)誘導(dǎo)抑制，導(dǎo)致禁止或抑制谷氨酰胺合成酶的活性，并因此抑制l-谷氨酰胺的生物合成。l-谷氨酰胺的反饋調(diào)節(jié)被釋放，并且l-谷氨酰胺合成的抑制在對l-谷氨酰胺具有抗性的菌株中不起作用，使得l-谷氨酰胺抗性菌株可在高濃度l-谷氨酰胺的條件下產(chǎn)生l-谷氨酰胺。突變體可以是谷氨酸棒桿菌kccm11553p或谷氨酸棒桿菌kccm11554p。突變體可以對高濃度的l-谷氨酰胺具有抗性。例如，突變體可以具有約5g/l至約30g/l的l-谷氨酰胺的抗性，并且在一些實(shí)施方式中，具有約15g/l至約30g/l的l-谷氨酰胺的抗性，并且在一些其它實(shí)施方式中，具有約20g/l至約25g/l的l-谷氨酰胺的抗性。突變體可以在含有約15g/l至約25g/l的l-谷氨酰胺的基本培養(yǎng)基中存活約6天或更長時(shí)間。例如，突變體可在含有約15g/l至約25g/l的l-谷氨酰胺、0.1％葡萄糖、0.04％硫酸鎂(mgso4·7h2o)、0.1％磷酸二氫鉀(kh2po4)、0.0001％硫胺素·hcl、200μg/l生物素和瓊脂的基本培養(yǎng)基(ph7.0)中在約30℃的培養(yǎng)下存活約6天或更長時(shí)間。如本文所用，術(shù)語“產(chǎn)生l-谷氨酰胺的微生物”可以指固有地具有產(chǎn)生l-谷氨酰胺的能力的微生物或獲得谷氨酰胺生產(chǎn)力的微生物(盡管其親本菌株缺乏產(chǎn)生l-谷氨酰胺的能力)。在一些實(shí)施方式中，具有改善的產(chǎn)生l-谷氨酰胺能力的谷氨酸棒桿菌突變體可以是通過突變親本菌株獲得的突變體。微生物的突變可以通過本領(lǐng)域廣泛已知的多種方法中的任一種進(jìn)行，例如物理誘變或化學(xué)誘變中的一個(gè)。例如，在本發(fā)明中，適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)突變誘導(dǎo)因子可以包括n-甲基-n'-硝基-n-亞硝基胍(ntg)、二環(huán)氧丁烷、甲磺酸乙酯、芥子化合物、肼和亞硝酸鹽(酯)。然而，實(shí)施方式不限于此。物理突變誘導(dǎo)因子的非限制性實(shí)例可以包括紫外線和γ射線。在一些實(shí)施方式中，為了構(gòu)建具有改善的產(chǎn)生l-谷氨酰胺能力的突變體，可以使用常規(guī)的谷氨酰胺生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌kfcc10680(公開于kr10-0048440)作為親本菌株。在親本菌株谷氨酸棒桿菌kfcc10680中用ntg誘導(dǎo)隨機(jī)突變后，將所得菌株在含有l(wèi)-谷氨酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并比較不同菌株的產(chǎn)生l-谷氨酰胺的能力，以篩選兩種對l-谷氨酰胺具有抗性的突變體。這兩種突變體分別命名為gln096(kccm11553p)和gln265(kccm11554p)。發(fā)現(xiàn)這些谷氨酸棒桿菌突變體gln096和gln265具有改善的l-谷氨酰胺生產(chǎn)能力，具有比親本菌株高約10％以上的產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生l-谷氨酰胺的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)任一上述實(shí)施方式的谷氨酸棒桿菌突變體。谷氨酸棒桿菌突變體可以與上述相同，并且本文不再描述。培養(yǎng)可以使用合適的培養(yǎng)基在本領(lǐng)域熟知的合適培養(yǎng)條件下進(jìn)行。培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員改變。例如，培養(yǎng)基可以是液體培養(yǎng)基。然而，實(shí)施方式不限于此。培養(yǎng)的實(shí)例方法可以包括分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)或其組合。然而，實(shí)施方式不限于此。培養(yǎng)基對于特定選擇的菌株需要具有適當(dāng)?shù)臈l件，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還可以適當(dāng)?shù)馗淖?。例如，培養(yǎng)基可以選自在例如“一般細(xì)菌學(xué)方法手冊”(美國細(xì)菌學(xué)學(xué)會，華盛頓特區(qū)，美國，1981)中公開的棒桿菌菌株的各種培養(yǎng)基。然而，實(shí)施方式不限于此。培養(yǎng)基可以包括各種碳源、氮源和痕量元素。可用于培養(yǎng)基的碳源的非限制性實(shí)例可以包括：糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉和纖維素；油和脂肪，例如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，例如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸；醇，例如乙二醇和乙醇；以及有機(jī)酸，例如乙酸，其中，這些碳源可以單獨(dú)使用或組合使用?？捎糜谂囵B(yǎng)基的氮源的非限制性實(shí)例是有機(jī)化合物，例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麥芽提取物、玉米漿(csl)、大豆粉和尿素；以及無機(jī)化合物，例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨，其中這些氮源可以單獨(dú)使用或組合使用。可用于培養(yǎng)基的磷源的非限制性實(shí)例可以包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和相應(yīng)的含鈉鹽。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基可以包括生長必需的金屬鹽，例如硫酸鎂或硫酸鐵。然而，實(shí)施方式不限于此。在一些實(shí)施方式中，除了上述成分之外，培養(yǎng)基還可以包括生長必需的氨基酸和維生素。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基還可以包括合適的前體。培養(yǎng)基或單個(gè)成分可以以適當(dāng)?shù)姆绞剑缫蚤g歇或連續(xù)方式加入培養(yǎng)溶液中。然而，實(shí)施方式不限于此。在一些實(shí)施方式中，在培養(yǎng)期間，培養(yǎng)溶液的ph可以通過向所選擇的微生物的培養(yǎng)物溶液中以適當(dāng)?shù)姆绞郊尤牖衔?，例如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸或硫酸來調(diào)節(jié)。在一些實(shí)施方式中，在培養(yǎng)期間，可以使用消泡劑例如脂肪酸聚乙二醇酯抑制培養(yǎng)溶液中的發(fā)泡。為了將培養(yǎng)溶液保持在好氧條件下，可以向培養(yǎng)液中供應(yīng)氧氣或含氧氣體(例如，空氣)。例如，培養(yǎng)溶液的溫度可以保持在約20℃至約45℃的溫度范圍內(nèi)，并且在一些實(shí)施方式中，在約25℃至約40℃的溫度下。例如，可以進(jìn)行培養(yǎng)直至獲得目標(biāo)量的l-谷氨酰胺，例如，培養(yǎng)時(shí)間為約10小時(shí)至160小時(shí)?？梢栽诤懈邼舛鹊膌-谷氨酰胺，例如約15g/l至約25g/l的l-谷氨酰胺，并在一些實(shí)施方式中為約20g/l至約25g/l的l-谷氨酰胺的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。產(chǎn)生l-谷氨酰胺的方法可以包括從培養(yǎng)的微生物或培養(yǎng)的培養(yǎng)基中回收l-谷氨酰胺。從微生物或培養(yǎng)基中回收l-谷氨酰胺可以根據(jù)所使用的培養(yǎng)方法使用本領(lǐng)域中已知的適當(dāng)方法進(jìn)行，從而從培養(yǎng)基收集或回收所產(chǎn)生的l-谷氨酰胺?；厥账a(chǎn)生的l-谷氨酰胺的方法的非限制性實(shí)例可以包括離心分離、過濾、陰離子交換色譜、結(jié)晶和高效液相色譜(hplc)。[本發(fā)明的有益效果]如上所述，根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式，即使在含有高濃度的l-谷氨酰胺的培養(yǎng)基中，也可以利用谷氨酸棒桿菌突變體產(chǎn)生l-谷氨酰胺。因此，可以在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模上以高效率生產(chǎn)高產(chǎn)率的l-谷氨酰胺。具體實(shí)施方式現(xiàn)在將參考以下實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式。然而，這些實(shí)施例僅用于說明性目的，并且不旨在限制本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式的范圍。實(shí)施例1：產(chǎn)生l-谷氨酰胺的突變體篩選為了獲得具有改善的產(chǎn)生谷氨酰胺能力的微生物突變體，以下述方式在微生物中誘導(dǎo)突變。特別地，將作為親本菌株的谷氨酸棒桿菌kfcc10680(谷氨酸棒桿菌kfcc10680，參見kr10-0048440)在活化培養(yǎng)基中培養(yǎng)約16小時(shí)(所述活化培養(yǎng)基含有1％牛肉提取物、1％聚胨、0.5％氯化鈉(nacl)、0.5％酵母提取物和2％瓊脂，ph為7.2，其中，實(shí)施例中使用的每種活化培養(yǎng)基具有與本實(shí)施例中使用的相同組成，百分比單位(％)表示w/v％，其適用于所有實(shí)施例)。將得到的活化菌株在預(yù)先在約121℃下滅菌15分鐘的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)約14小時(shí)，所述種子培養(yǎng)基(ph7.0)含有5.0％葡萄糖、1％細(xì)菌蛋白胨、0.25％氯化鈉(nacl)、1％酵母提取物、3μg/l生物素和0.4％尿素，其中實(shí)施例中使用的每種“種子培養(yǎng)基”具有與本實(shí)施例中使用的相同組成。將5ml培養(yǎng)溶液加入試管中，以約8000rpm離心分離約5分鐘，并除去上清液。然后，向試管中加入100mm檸檬酸鹽緩沖液以重新懸浮細(xì)胞團(tuán)塊，然后在與上述相同的條件下對試管進(jìn)行離心分離，并從中除去上清液，從而洗滌細(xì)胞。將5ml100mm檸檬酸鹽緩沖液加入試管中以重新懸浮細(xì)胞團(tuán)塊，然后向其中加入n-甲基-n'-硝基-n-亞硝基胍(ntg)至終濃度為約200mg/l，并在室溫下放置約20分鐘。接著，將ntg處理的細(xì)胞以約8000rpm離心分離約5分鐘，并除去上清液，加入100-mm磷酸鹽緩沖液以重新懸浮細(xì)胞團(tuán)塊，然后在與上述相同的條件下進(jìn)行離心分離，并除去上清液，從而洗滌細(xì)胞。接著，將5ml種子培養(yǎng)基加入到所得ntg處理的細(xì)胞團(tuán)塊中以使其再懸浮。將該懸浮液涂布在含有基本培養(yǎng)基的板上，所述基本培養(yǎng)基(ph7.0)含有0.1％葡萄糖、0.04％硫酸鎂(mgso4·7h2o)、0.1％磷酸二氫鉀(kh2po4)、0.0001％硫胺素·hcl、200μg/l生物素和1.5％瓊脂，其中實(shí)施例中使用的每種“基本培養(yǎng)基”具有與本實(shí)施例中使用的相同組成，并在約30℃下培養(yǎng)約6天。然后測量活細(xì)胞的od600值。作為計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡率為約85％。將洗過的ntg處理的菌株涂布在含有基本培養(yǎng)基的板上，所述基本培養(yǎng)基含有l(wèi)-谷氨酰胺(終濃度：15g/l)，并在約30℃下培養(yǎng)約6天。選擇活細(xì)胞集落以篩選l-谷氨酰胺抗性突變體。在用于振動的錐形瓶中，將篩選的l-谷氨酰胺抗性突變體用接種環(huán)接種到25ml谷氨酰胺生產(chǎn)培養(yǎng)基(ph6.8)(含有4.0％葡萄糖、3.0％氯化銨(nh4cl)、0.3％大豆蛋白酸水解產(chǎn)物、5％碳酸鈣(caco3)、0.1％氯化鈣(cacl2)、0.05％硫酸鎂(mgso4·7h2o)、0.15％磷酸二氫鉀(kh2po4)、0.15％磷酸氫二鉀(k2hpo4)、0.3％尿素、2mg/l硫胺素(硫胺素·hcl)、5μg/l生物素、20mg/l的硫酸亞鐵(feso4·7h2o)、20mg/l硫酸錳(mnso4·h2o)和12mg/l硫酸鋅(znso4·7h2o)，其中實(shí)施例中使用的每種“谷氨酰胺生產(chǎn)培養(yǎng)基”具有該相同的組成))上，然后在約30℃下同時(shí)以約200rpm振蕩培養(yǎng)約48小時(shí)。作為對照組，在相同條件下培養(yǎng)親本菌株。從培養(yǎng)產(chǎn)物中選擇產(chǎn)生比親本菌株谷氨酸棒桿菌kfcc-10680高10％以上的谷氨酰胺產(chǎn)量的兩種類型的l-谷氨酰胺抗性突變體。所選擇的突變體分別命名為谷氨酸棒桿菌gln096和谷氨酸棒桿菌gln265，并且于2014年7月3日保藏在韓國微生物保藏中心(kccm)，保藏號為kccm11553p和kccm11554p。實(shí)施例2：產(chǎn)生l-谷氨酰胺的突變體之間對l-谷氨酰胺的抗性的比較為了比較實(shí)施例1中選擇的突變體之間對l-谷氨酰胺的抗性，將親本菌株(kfcc10680)、谷氨酸棒桿菌gln096(kccm11553p)和谷氨酸棒桿菌gln265(kccm11554p)中的每一個(gè)涂抹在含有分別含有2.5g/l、10g/l、15g/l、20g/l和25g/l的l-谷氨酰胺(基于終濃度)的基本培養(yǎng)基的板上，并在約30℃下培養(yǎng)約6天。作為結(jié)果，如表1中所示，親本菌株在l-谷氨酰胺濃度為15g/l時(shí)表現(xiàn)出差的生長，并且在l-谷氨酰胺濃度為20g/l以上時(shí)不生長，而突變體谷氨酸棒桿菌gln096(kccm11553p)和谷氨酸棒桿菌gln265(kccm11554p)在l-谷氨酰胺濃度為15g/l時(shí)仍顯示高生長，甚至在l-谷氨酰胺濃度為20g/l以上時(shí)也生長，表明突變體對高濃度的l-谷氨酰胺具有抗性。[表1]對l-谷氨酰胺抗性的比較+：生長/-：不生長；在約30℃下培養(yǎng)6天后實(shí)施例3：產(chǎn)生l-谷氨酰胺的突變體的l-谷氨酰胺生產(chǎn)力評價(jià)為了評價(jià)實(shí)施例1中獲得的突變體谷氨酸棒桿菌gln265(kccm11554p)和谷氨酸棒桿菌gln096(kccm11553p)的l-谷氨酰胺生產(chǎn)力，將這些突變體以下列方式培養(yǎng)以產(chǎn)生l-谷氨酰胺。將20ml發(fā)酵培養(yǎng)基(ph6.8)(含有10％葡萄糖、4.5％氯化銨(nh4cl)、0.5％大豆蛋白酸水解產(chǎn)物、5％碳酸鈣(caco3)、0.1％氯化鈣(cacl2)、0.05％硫酸鎂(mgso4·7h2o)、0.15％磷酸二氫鉀(kh2po4)、0.15％磷酸氫二鉀(k2hpo4)、0.3％尿素、2mg/l硫胺素(硫胺素·hcl)、5μg/l生物素、20mg/l硫酸亞鐵(feso4·7h2o)、20mg/l硫酸錳(mnso4·h2o)和12mg/l硫酸鋅(znso4·7h2o)，其中在實(shí)施例中使用的每種“發(fā)酵培養(yǎng)基”具有相同的組成)加入250ml錐形瓶中進(jìn)行振蕩，并在約121℃下滅菌約15分鐘。將親本菌株谷氨酸棒桿菌kfcc10680以及突變體谷氨酸棒桿菌gln265(kccm11554p)和谷氨酸棒桿菌gln096(kccm11553p)分別在約30℃下在活化培養(yǎng)基中培養(yǎng)約16小時(shí)。將每種所得活化菌株(kfcc10680、gln096和gln265)用接種環(huán)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在約30℃下以約200rpm振蕩培養(yǎng)約48小時(shí)。培養(yǎng)完成后，使用ysi7100多參數(shù)生物分析系統(tǒng)(可得自ysiinc.)測量去除細(xì)胞的每種培養(yǎng)基的上清液中存在的l-谷氨酰胺的濃度。結(jié)果示于表2。[表2]菌株l-谷氨酰胺濃度(g/l)kfcc1068012.6gln096(突變體)13.8gln265(突變體)14.1參考表2，根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，親本菌株谷氨酸棒桿菌kfcc10680產(chǎn)生約12.6g/l的l-谷氨酰胺，而突變谷氨酸棒桿菌gln096產(chǎn)生約13.8g/l的l-谷氨酰胺，與親本菌株相比，l-谷氨酰胺生產(chǎn)力提高約9.5％以上。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，突變谷氨酸棒桿菌gln265產(chǎn)生約14.1g/l的l-谷氨酰胺，與親本菌株相比，l-谷氨酰胺生產(chǎn)力提高約11％以上。保藏機(jī)構(gòu)：韓國微生物保藏中心(kccm)(國際保藏機(jī)構(gòu))登錄號：kccm11553p保藏日期：20140703保藏機(jī)構(gòu)：韓國微生物保藏中心(kccm)(國際保藏機(jī)構(gòu))登錄號：kccm11554p保藏日期：20140703pct/ro/134表當(dāng)前第1頁12