相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用[不適用]序列表本申請(qǐng)包含一個(gè)序列表，其通過引用并入，并且以作為名稱為“12350usll_seqlist.txt”的文本文件的方式與本申請(qǐng)一起提交。序列表文件是在2014年10月7日創(chuàng)建的，大小為17464字節(jié)?；鸨疚乃兜难芯恐兄辽儆幸徊糠值玫搅巳毡菊畽C(jī)構(gòu)的日本科技機(jī)構(gòu)(jst)的資助。檢測(cè)樣本中的靶核酸在各個(gè)領(lǐng)域都很重要，包括醫(yī)學(xué)和生物學(xué)。許多組合物、測(cè)定平臺(tái)和程序可用于檢測(cè)特異性核酸分子。為了使檢測(cè)是可重現(xiàn)的和準(zhǔn)確的，這些方法要求沒有或低水平的非特異性背景擴(kuò)增。然而，擴(kuò)增方法可能會(huì)產(chǎn)生影響結(jié)果的質(zhì)量、準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和整體可靠性的假陽(yáng)性信號(hào)。在一些試驗(yàn)中，可以在多種樣品中檢測(cè)到這些“假”陽(yáng)性信號(hào)，包括含有非模板dna(非靶dna)的對(duì)照樣品或甚至缺乏任何dna模板的樣品。
背景技術(shù)：
：用于從混合核酸序列群體擴(kuò)增特定序列的一種常用方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)。由于典型的pcr在三個(gè)不同的溫度下進(jìn)行，所以反應(yīng)可能遇到一些挑戰(zhàn)，例如難以保持精確的溫度，以及時(shí)間損耗隨著擴(kuò)增循環(huán)的數(shù)目而成比例地增加。雙鏈模板dna變性為單鏈(雖然在一定程度上依賴于特定序列)通常需要使用高“解鏈”溫度，這限制了能夠用于高熱穩(wěn)定的那些的dna聚合酶的類別。因此，已經(jīng)開發(fā)了等溫?cái)U(kuò)增平臺(tái)技術(shù)來在比pcr中使用的反應(yīng)條件更溫和的反應(yīng)條件下檢測(cè)核酸。然而，這些等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)尚未解決由能夠干擾靶序列檢測(cè)的高背景信號(hào)和非特異性擴(kuò)增事件所呈現(xiàn)的挑戰(zhàn)。以下公開內(nèi)容提供了用于在比pcr中使用的那些反應(yīng)條件更不嚴(yán)格的反應(yīng)條件下檢測(cè)核酸序列(例如dna或rna)的替代方法和組合物。本方法和組合物保持序列選擇性和靈敏度，其允許檢測(cè)可能以低濃度在樣品中的核酸分子和/或長(zhǎng)度短的核酸分子。本方法和組合物還可以減小可能由非特異性和/或非目標(biāo)依賴性的擴(kuò)增事件引起的任何背景信號(hào)。在其它方面，本公開提供了新方法和核酸分子，其能夠在低溫、等溫條件下提高樣品中靶核酸的檢測(cè)限，并且能夠簡(jiǎn)化或改進(jìn)樣品制備和自動(dòng)檢測(cè)方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在一個(gè)方面，本公開涉及一種檢測(cè)樣品中靶核酸的方法，所述方法包括使所述樣品與如下物質(zhì)接觸：寡核苷酸(序列轉(zhuǎn)換dna或scdna)，所述寡核苷酸在5’至3’方向上包含信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和具有至少一個(gè)化學(xué)修飾的核苷酸且與靶核酸的3’端互補(bǔ)的序列(c)；聚合酶；和用于切口反應(yīng)的核酸內(nèi)切酶。在該方面的實(shí)施方式中，該方法還包括確定信號(hào)dna是否存在，其中信號(hào)dna的存在表明在樣品中存在靶核酸。在一個(gè)方面，本公開涉及一種檢測(cè)樣品中靶核酸的方法，所述方法包括使所述樣品與如下物質(zhì)接觸：第一寡核苷酸(序列轉(zhuǎn)換dna或scdna)，所述第一寡核苷酸在5’至3’方向上包含信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和具有至少一個(gè)化學(xué)修飾的核苷酸且與靶核酸的3’端互補(bǔ)的序列(c)；第二寡核苷酸(信號(hào)擴(kuò)增dna或sadna)，所述第二寡核苷酸在5’至3’方向上包含與第一寡核苷酸的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(d)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(e)(其可以與sadna中核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)相同或者不同)和具有至少一個(gè)化學(xué)修飾的核苷酸且與第一寡核苷酸的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列(f)；聚合酶；和用于切口反應(yīng)的核酸內(nèi)切酶。在該方面的實(shí)施方式中，該方法還包括確定信號(hào)dna是否存在，其中信號(hào)dna的存在表明在樣品中存在靶核酸。在另一個(gè)方面，本公開涉及一種檢測(cè)樣品中靶核酸的方法，所述方法包括使所述樣品與如下物質(zhì)接觸：寡核苷酸(序列轉(zhuǎn)換dna或scdna)，所述寡核苷酸在5’至3’方向上包含信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和具有至少一個(gè)鎖核酸(lna)且與靶核酸的3’端互補(bǔ)的序列(c)；聚合酶；和用于切口反應(yīng)的核酸內(nèi)切酶。在該方面的實(shí)施方式中，該方法還包括確定信號(hào)dna是否存在，其中信號(hào)dna的存在表明在樣品中存在靶核酸。在另一個(gè)方面，本公開涉及檢測(cè)樣品中靶核酸的方法，所述方法包括使所述樣品與如下物質(zhì)接觸：第一寡核苷酸(序列轉(zhuǎn)換dna或scdna)，所述第一寡核苷酸在5’至3’方向上包含信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和具有至少一個(gè)鎖核酸(lna)且與靶核酸的3’端互補(bǔ)的序列(c)；第二寡核苷酸(信號(hào)擴(kuò)增dna或sadna)，所述第二寡核苷酸在5’至3’方向上包含與第一寡核苷酸的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(d)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(e)(其可以與sadna中核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)相同或者不同)和具有至少一個(gè)lna且與第一寡核苷酸的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列(f)；聚合酶；和用于切口反應(yīng)的核酸內(nèi)切酶。在該方面的實(shí)施方式中，該方法還包括確定信號(hào)dna是否存在，其中信號(hào)dna的存在表明在樣品中存在靶核酸。在某些實(shí)施方式中，在scdna的序列(c)或sadna的序列(f)中存在的lna可以包含任何lna，例如g、t、u、a和c及其化學(xué)修飾的衍生物。在其中核苷酸分子包含超過一種lna的實(shí)施方式中，每種lna可以獨(dú)立地選自任何lna(例如g、t、u、a和c)及其化學(xué)修飾的衍生物或其任意組合。在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)lna位于從scdna(在序列(c)內(nèi))和sadna(在序列(f)內(nèi))的3'端的位置1至50、1至45、1至40、1至35、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10或者1至5處。如下面進(jìn)一步所討論，發(fā)明人已經(jīng)闡明了本公開的某些實(shí)施方式，其舉例證明了在scdna中和在sadna中包含一個(gè)或多個(gè)lna在本文公開的方法中減小了背景信號(hào)(例如，由非目標(biāo)依賴性的擴(kuò)增引起的背景信號(hào))。在一些實(shí)施方式中，向sadna的序列(f)和scdna的序列(c)中引入lna能夠消除在擴(kuò)增反應(yīng)中非特異性背景信號(hào)的產(chǎn)生。在其它實(shí)施方式中，在sadna和scdna分子中引入lna能夠延遲非特異性擴(kuò)增事件的產(chǎn)生一段時(shí)間，所延遲的一段時(shí)間允許特異性且準(zhǔn)確地測(cè)量靶核酸。因此，本公開提供了核酸分子、組合物、試劑盒和方法，其允許在產(chǎn)生任何非特異性干擾背景信號(hào)之前測(cè)定表明靶核酸存在的信號(hào)序列。例如，在一些實(shí)施方式中，在可檢測(cè)到任何干擾性非特異性背景信號(hào)之前約10至約120分鐘，可檢測(cè)到由樣品中約1nm至約1fm靶核酸的存在產(chǎn)生的信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，聚合酶可以具有鏈置換活性。在另外的實(shí)施方式中，聚合酶可以是3'至5'核酸外切酶缺乏的、5'至3'核酸外切酶缺乏的或者既是3'至5'核酸外切酶缺乏的又是5'至3'核酸外切酶缺乏的。在一些實(shí)施方式中，聚合酶包含dna聚合酶。在實(shí)施方式中，核酸內(nèi)切酶可以包含能夠在切口寡核苷酸的反應(yīng)中使用的限制性核酸內(nèi)切酶或切口核酸內(nèi)切酶。雖然本文公開的方法可以在典型的dna擴(kuò)增條件(例如，與標(biāo)準(zhǔn)pcr相關(guān)的典型溫度、反應(yīng)物濃度、時(shí)間循環(huán)等)下進(jìn)行，但在一些實(shí)施方式中，該方法可以在等溫條件下或在基本恒定的溫度下進(jìn)行。在另外的實(shí)施方式中，該方法可以在低于標(biāo)準(zhǔn)pcr方法中所使用的溫度的溫度下進(jìn)行。作為一個(gè)示例，該方法的一些實(shí)施方式可以在等于或低于：下文所述的sadna的序列(f)和信號(hào)dna(s)的、scdna的序列(c)和靶核酸(t)的計(jì)算得到的最佳雜交或退火溫度或者實(shí)驗(yàn)測(cè)定的雜交或退火溫度。在實(shí)施方式中，該方法可以在低于與sadna的序列(f)結(jié)合的信號(hào)dna(s)或者與scdna的序列(c)結(jié)合的靶核酸(t)的解鏈溫度的溫度下進(jìn)行。在另外其它實(shí)施方式中，該方法可以在允許聚合酶和/或核酸內(nèi)切酶活性的溫度下進(jìn)行。在另外的實(shí)施方式中，該方法可以在用于檢測(cè)樣品中靶核酸的反應(yīng)混合物中存在的聚合酶和/或核酸內(nèi)切酶的最佳反應(yīng)溫度下或者大約該最佳反應(yīng)溫度下進(jìn)行。在另一個(gè)方面，本公開涉及化學(xué)修飾的寡核苷酸，其在本文中可以被稱為“序列轉(zhuǎn)換dna”(或"scdna")，其在5’至3’方向上包含信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和具有至少一個(gè)鎖核酸(lna)且與靶核酸的3’端互補(bǔ)的序列(c)。在另一個(gè)方面，本公開涉及化學(xué)修飾的寡核苷酸，其在本文中可以被稱為“信號(hào)擴(kuò)增dna”(或"sadna")，其在5’至3’方向上包含與序列轉(zhuǎn)換dna(scdna)的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(d)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(e)和具有至少一個(gè)鎖核酸(lna)且與序列轉(zhuǎn)換dna(scdna)的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列。靶核酸序列可以是感興趣的任何核苷酸序列，并且在一些實(shí)施方式中，可以包含來源于感染物或微rna的序列。在其它實(shí)施方式中，靶核酸可以包含來自可能與疾病或病癥相關(guān)的基因的序列。在一些實(shí)施方式中，核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)包含與被核酸內(nèi)切酶切割的序列互補(bǔ)的序列。在其它實(shí)施方式中，被核酸內(nèi)切酶切割的序列與被核酸內(nèi)切酶特異性識(shí)別的序列相鄰(下游或上游)。在另一個(gè)方面，本公開涉及一種用于檢測(cè)樣品中靶核酸的組合物，所述組合物包含：寡核苷酸(序列轉(zhuǎn)換dna或scdna)，所述寡核苷酸在5’至3’方向上包含信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和具有至少一個(gè)鎖核酸(lna)且與靶核酸的3’端互補(bǔ)的序列(c)；聚合酶；和用于切口反應(yīng)的核酸內(nèi)切酶。在另一個(gè)方面，本公開涉及一種用于檢測(cè)樣品中靶核酸的組合物，所述組合物包含：第一寡核苷酸(序列轉(zhuǎn)換dna或scdna)，所述第一寡核苷酸在5’至3’方向上包含信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和具有至少一個(gè)鎖核酸(lna)且與靶核酸的3’端互補(bǔ)的序列(c)；第二寡核苷酸(信號(hào)擴(kuò)增dna或sadna)，所述第二寡核苷酸在5’至3’方向上包含與第一寡核苷酸的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(d)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(e)(其可以與sadna中核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)相同或者不同)和具有至少一個(gè)lna且與第一寡核苷酸的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列(f)；聚合酶；和用于切口反應(yīng)的核酸內(nèi)切酶。組合物還可以包含聚合酶和/或當(dāng)核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)是雙鏈時(shí)能夠在第一和第二寡核苷酸的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)處或相鄰處切割的核酸內(nèi)切酶。組合物還可以包含其它試劑，例如反應(yīng)緩沖劑、脫氧核糖核苷酸和報(bào)道分子，例如用于熒光檢測(cè)新合成的dna的熒光團(tuán)修飾的探針dna(例如分子信標(biāo)探針)。在另外的一個(gè)方面，本公開涉及一種用于檢測(cè)樣品中靶核酸的試劑盒，所述試劑盒包含：寡核苷酸(序列轉(zhuǎn)換dna或scdna)，所述寡核苷酸在5’至3’方向上包含信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和具有至少一個(gè)鎖核酸(lna)且與靶核酸的3’端互補(bǔ)的序列(c)；聚合酶；和用于切口反應(yīng)的核酸內(nèi)切酶。在一些實(shí)施方式中，試劑盒還可以包含聚合酶和/或能夠在核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)或與核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)相鄰的位點(diǎn)處切割的核酸內(nèi)切酶。試劑合還可以包含諸如如下的試劑：例如反應(yīng)緩沖劑、脫氧核糖核苷酸和報(bào)道分子，例如用于熒光檢測(cè)新合成的dna(例如信號(hào)dna)的熒光團(tuán)修飾的探針dna(例如分子信標(biāo)探針)。在本文所公開的任意一個(gè)方法的實(shí)踐中，試劑盒還可以包含使用說明書。在另外的一個(gè)方面，本公開涉及一種用于檢測(cè)樣品中靶核酸的試劑盒，所述試劑盒包含：第一寡核苷酸(序列轉(zhuǎn)換dna或scdna)，所述第一寡核苷酸在5’至3’方向上包含信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和具有至少一個(gè)鎖核酸(lna)且與靶核酸的3’端互補(bǔ)的序列(c)；第二寡核苷酸(信號(hào)擴(kuò)增dna或sadna)，所述第二寡核苷酸在5’至3’方向上包含與第一寡核苷酸的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(d)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(e)(其可以與sadna中核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)相同或者不同)和具有至少一個(gè)lna且與第一寡核苷酸的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列(f)；聚合酶；和用于切口反應(yīng)的核酸內(nèi)切酶。在一些實(shí)施方式中，試劑盒還可以包含聚合酶和/或能夠在核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)或與核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)相鄰的位點(diǎn)處切割的核酸內(nèi)切酶。試劑盒還可以包含諸如如下的試劑：例如反應(yīng)緩沖劑、脫氧核糖核苷酸和報(bào)道分子，例如用于熒光檢測(cè)新合成的dna(信號(hào)dna)的熒光團(tuán)修飾的探針dna(例如分子信標(biāo)探針)。在本文所公開的任意一個(gè)方法的實(shí)踐中，試劑盒還可以包含使用說明書。本文中所公開的方法、寡核苷酸、組合物和試劑盒可以與集成的系統(tǒng)平臺(tái)組合使用。例如，本發(fā)明的方法、寡核苷酸、組合物和試劑盒可以與abbott'sarchitect系統(tǒng)組合使用。本文中所公開的方法、寡核苷酸、組合物和試劑盒可以與樣品制備系統(tǒng)平臺(tái)一起使用，例如m2000sp樣品制備系統(tǒng)(abbottdiagnostics,abbottpark,il)。類似地，本文中所公開的方法、寡核苷酸、組合物和試劑合可以與床旁護(hù)理(point-of-care)系統(tǒng)平臺(tái)，例如abbott'si-stat床旁護(hù)理系統(tǒng)(abbottdiagnostics,abbottpark,il)。此外，本發(fā)明的方法、寡核苷酸、組合物和試劑盒可以與任意數(shù)量的其它裝置、試驗(yàn)平臺(tái)和儀器一起使用，例如手持式熒光檢測(cè)器、微ph計(jì)、微流體裝置、微陣列、酶檢測(cè)系統(tǒng)、免疫色譜條和側(cè)流裝置。本文中公開的方法、寡核苷酸、組合物和試劑盒可以用于分子診斷領(lǐng)域，包括非感染性和感染性疾病的診斷。例如，本發(fā)明的方法、寡核苷酸、組合物和試劑盒可以用于檢測(cè)人體液例如血液、尿液、唾液、汗液和糞便中的微rna、信使rna、非編碼rna和甲基化dna。類似地，本發(fā)明的方法、寡核苷酸、組合物和試劑盒可用于在人體液例如血液、尿液、唾液、汗液和糞便中檢測(cè)來源于感染性疾病的靶核酸，例如hbv、hcv、hiv、hpv、htlv-1、parvo病毒、結(jié)核病、梅毒、瘧疾和溶組織內(nèi)阿米巴。應(yīng)當(dāng)理解，在本公開的一些方面，本文公開的sc和sadna可以包含除了鎖核酸之外的在相同或不同位置處的化學(xué)修飾的核苷酸。例如，本文公開的sc和sadna可以包含bna(橋連核酸)、ena(乙烯橋連核酸)、gna(乙二醇核酸)、tna(蘇糖核酸)、pna(肽核酸)、嗎啉代核酸和硫代磷酸酯核苷酸?？紤]到下文的描述，由本公開提供的其它方面、實(shí)施方式和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。附圖說明圖1a是示意性說明用于檢測(cè)樣品中靶核酸的序列轉(zhuǎn)換dna(scdna)的非限制性實(shí)例的圖。scdna在5'至3'方向上包含信號(hào)產(chǎn)生序列(a)、可用于切口反應(yīng)的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和包含鎖核酸(lna)且與靶核酸互補(bǔ)的序列(c)。圖1b是示意性說明用于檢測(cè)樣品中靶核酸的信號(hào)擴(kuò)增dna(sadna)的非限制性實(shí)例的圖。sadna在5'至3'方向上包含與scdna的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(d)；核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(e)(其可以與scdna的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)相同或不同)和包含鎖核酸且與第一scdna的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列(f)。圖2a是示意性說明靶(t)核酸與用于檢測(cè)樣品中靶核酸的序列轉(zhuǎn)換(sc)dna的示例性反應(yīng)進(jìn)展的圖。序列(a)-(c)如圖1a所示，序列(t)表示靶序列，序列(x)表示當(dāng)通過聚合酶來擴(kuò)展與序列(c)結(jié)合的序列(t)時(shí)所產(chǎn)生的序列，序列(x')表示切口的擴(kuò)展序列，并且序列(s)表示最終產(chǎn)生的信號(hào)dna序列。圖2b是示意性地說明信號(hào)dna(s)與用于檢測(cè)樣品中靶核酸的信號(hào)擴(kuò)增(sa)dna的示例性反應(yīng)進(jìn)展的圖。序列(d)-(f)如圖1b所述，如圖2a所述，序列(s)是由靶(t)核酸與scdna反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)dna，序列(y)表示當(dāng)通過聚合酶來擴(kuò)展與序列(d)結(jié)合的信號(hào)dna(s)時(shí)所產(chǎn)生的序列，序列(y')表示切口的擴(kuò)展序列，并且序列(s)表示最終產(chǎn)生的信號(hào)dna序列。由于sa信號(hào)產(chǎn)生序列(d)與sc信號(hào)產(chǎn)生序列(a)同源，因此產(chǎn)生相同的信號(hào)dna(s)。圖3描繪了使用dinamelt(nucleicacidsres.,33,w577-w581；和structure,functionandapplications(series:methodsinmolecularbiology,vol.no.:453),第1章,第3-31頁(yè)(isbn978-1-60327-428-9))計(jì)算的sadna#339(序列號(hào)：25)的所預(yù)測(cè)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。還示出了在從sadna#339的3'端的位置3和6處的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖內(nèi)的兩個(gè)lna的位置。具體實(shí)施方式在一般意義上，本公開涉及在測(cè)試樣品中檢測(cè)靶核酸時(shí)令人驚奇地有效的核酸構(gòu)建體。本文中公開的構(gòu)建體包含允許產(chǎn)生信號(hào)dna的核酸序列，所述信號(hào)dna是在靶核酸存在下產(chǎn)生的，伴隨著由不存在靶核酸和/或非特異性擴(kuò)增事件引起的背景信號(hào)的減小。本文中公開的方法和核酸構(gòu)建體提供了可有利地在低溫和等溫條件下進(jìn)行靶核酸的選擇的和靈敏的檢測(cè)。在一個(gè)方面，本公開涉及化學(xué)修飾的寡核苷酸，其可以在本文中被稱為"信號(hào)擴(kuò)增dna"(或"sadna")，其在5’至3’方向上包含與已知的信號(hào)dna序列互補(bǔ)的第一序列、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)和與第一序列相同的已知的信號(hào)dna序列互補(bǔ)的第二序列，其中第二序列包含鎖核酸(lna)。第一序列是圖1b中的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(d)，其與scdna的已知的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源。第二序列是圖1b中的序列(f)，其具有至少一個(gè)lna且與相同scdna的相同的已知的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源。在該方面的一些實(shí)施方式中，第二序列包含多個(gè)lna(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)lna)。在一些實(shí)施方式中，第二序列包含2-6個(gè)lna。在一些實(shí)施方式中，第二序列包含2個(gè)lna、3個(gè)lna或4個(gè)lna。在其它實(shí)施方式中，化學(xué)修飾的寡核苷酸還包含3’端修飾。在該方面，第一和第二序列的長(zhǎng)度可以改變，但通常每個(gè)序列與另一個(gè)序列的長(zhǎng)度大約相同。在實(shí)施方式中，序列的長(zhǎng)度可以在從約5到約100個(gè)核苷酸的范圍中，但更典型地在長(zhǎng)度上為從約5至約30、從約10至約30或者從約15至約30個(gè)核苷酸。核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)包含可以被本文中所描述的核酸內(nèi)切酶識(shí)別、結(jié)合和切割的序列。這種序列在本領(lǐng)域中通常是已知的。核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)可以包含在5'或3'處與核酸內(nèi)切酶結(jié)合位點(diǎn)(或者5'和3'二者)結(jié)合的額外的核苷酸，但通常在長(zhǎng)度上不超過10個(gè)核苷酸。在本文中所公開的某些實(shí)施方式中，在第二序列中的lna或多個(gè)lna的位置是相對(duì)于序列的3'端被識(shí)別的并且可以改變。在一些實(shí)施方式中，lna或多個(gè)lna位于從序列的3’端的一個(gè)或多個(gè)位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20處。在包含單個(gè)lna的一些實(shí)施方式中，lna位于從序列的3’端的位置1、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20中的任意一個(gè)位置處。在包含兩個(gè)lna的實(shí)施方式中，lna可以位于選自從序列的3’端的位置1至20的兩個(gè)位置的任意組合。在一些實(shí)施方式中，lna可以位于從序列的3’端的位置6和任何其它位置1-5和7-20(例如1和6、2和6、3和6、4和6、5和6、7和6、8和6、9和6、10和6、11和6、12和6、13和6、14和6、15和6、16和6、17和6、18和6、19和6、或20和6)；從序列的3’端的位置1和2；位置1和10；位置2和10；位置4和8；位置5和9；位置1和8；位置2和8；位置3和8；以及位置2和7。在包含三個(gè)lna的實(shí)施方式中，lna可以位于選自從序列的3’端的位置1至20的三個(gè)位置的任意組合。在一些實(shí)施方式中，lna可以位于從序列的3’端的位置6以及兩個(gè)位置1-5和7-20的任意其它組合；以及從序列的3’端的位置1、2和10。在包含四個(gè)lna的實(shí)施方式中，lna可以位于選自從序列的3’端的位置1至20的四個(gè)位置的任意組合。在一些實(shí)施方式中，lna可以位于從序列的3’端的位置6以及三個(gè)位置1-5和7-20的任意其它組合。在該方面的實(shí)施方式中，本公開提供了一種可用于檢測(cè)樣品中靶核酸的新型序列轉(zhuǎn)換(sc)和信號(hào)擴(kuò)增(sa)寡核苷酸構(gòu)建體及其組合，伴隨著背景信號(hào)的減小。如圖1a的說明性實(shí)施方式所描繪，用于檢測(cè)樣品中靶核酸的序列轉(zhuǎn)換dna(scdna)寡核苷酸在5'至3'方向上包含信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和具有至少一個(gè)鎖核酸(lna)且與靶核酸的3’端互補(bǔ)的序列(c)。如圖1b的說明性實(shí)施方式所描繪，用于檢測(cè)樣品中靶核酸的信號(hào)擴(kuò)增dna(sadna)在5'至3'方向上包含與scdna的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(d)；核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(e)(其可以與scdna的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)相同或不同)和包含鎖核酸(lna)和與scdna的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列的序列(f)。在本公開的一些實(shí)施方式中，scdna的序列(c)和sadna的序列(f)二者均包含鎖核酸(lna)。在其它實(shí)施方式中，僅sadna的序列(f)會(huì)包含鎖核酸(lna)。鎖核酸是具有如下結(jié)構(gòu)的經(jīng)修飾的rna核苷酸：如圖所示，lna核苷酸的核糖片段通過以3'端結(jié)構(gòu)鎖定核糖且連接2'氧原子和4'碳原子的亞甲基橋而由典型的核糖結(jié)構(gòu)修飾。這樣的lna可以包含任何天然嘌呤或嘧啶堿基或非天然堿基(例如肌苷、化學(xué)修飾的堿基等)。通過將lna引入到擴(kuò)增寡核苷酸例如本文所述的sadna的序列(f)或引入到scdna的序列(c)中，非特異性背景信號(hào)擴(kuò)增被完全消除或延遲一段時(shí)間，所述一段時(shí)間足以在不存在來自非特異性背景信號(hào)的任何干擾的情況下檢測(cè)由靶核酸的存在產(chǎn)生的信號(hào)序列。例如，在一些實(shí)施方式中，在可檢測(cè)到任何非特異性背景信號(hào)之前，由樣品中約1nm至約1fm靶核酸的存在產(chǎn)生的信號(hào)在約5至約120分鐘內(nèi)、約5至約90分鐘內(nèi)、約5至約60分鐘內(nèi)、約5至約30分鐘內(nèi)、或約5至約15分鐘內(nèi)是可檢測(cè)到的。在一些實(shí)施方式中，在可檢測(cè)到任何非特異性背景信號(hào)之前，由樣品中約1nm至約1pm靶核酸的存在產(chǎn)生的信號(hào)在約5至約120分鐘內(nèi)、約5至約90分鐘內(nèi)、約5至約60分鐘內(nèi)、在約5至約30分鐘內(nèi)、或在約5至約15分鐘內(nèi)是可檢測(cè)到的。在其它實(shí)施方式中，在可檢測(cè)到任何非特異性背景信號(hào)之前，樣品中約1pm至約1fm靶核酸的存在產(chǎn)生的信號(hào)在約5至約120分鐘內(nèi)、約5至約90分鐘內(nèi)內(nèi)、約5至約60分鐘內(nèi)、在約5至約30分鐘內(nèi)、或在約5至約15分鐘內(nèi)是可檢測(cè)到的。在一些實(shí)施方式中，該方法不產(chǎn)生任何可檢測(cè)到的非特異性背景信號(hào)。如上所述，在沒有靶核酸的情況下，在有效減少或消除非特異性背景信號(hào)擴(kuò)增的任何位置處，將lna引入到sadna的序列(f)和scdna的序列(c)中。在一些實(shí)施方式中，在從各自的sc或sadna的3'端的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20處或其組合處，將lna引入到sadna的序列(f)中和scdna的序列(c)中。在一些實(shí)施方式中，lna位于從sadna的3'端的位置6或位置3和6。在其它實(shí)施方式中，lna存在于sadna中，在以下位置(從3'端開始數(shù))處：1、2、6和10(例如，序列號(hào)：2)；1、2和6(例如，序列號(hào)：3)；1、2和10(例如，序列號(hào)：4)；1、6和10(例如，序列號(hào)：5)；2、6和10(例如，序列號(hào)：6)；1和2(例如，序列號(hào)：7)；1和6(例如，序列號(hào)：8)；2和6(例如，序列號(hào)：9)；1和10(例如，序列號(hào)：10)；2和10(例如，序列號(hào)：11)；1(例如，序列號(hào)：16)；4和8(例如，序列號(hào)：23)；2、3和6(例如，序列號(hào)：26)；2、3、6和10(例如，序列號(hào)：27)；或者3和10(例如，序列號(hào)：35)。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)lna被引入到sadna的序列(f)中和scdna的序列(c)中，在包含任一序列的具體結(jié)構(gòu)基序處或內(nèi)部。例如，sadna的序列(f)可以自身形成發(fā)夾(莖-環(huán))結(jié)構(gòu)，或者與sadna內(nèi)的一些其它序列(例如，序列(d)或(e))的部分形成發(fā)夾(莖-環(huán))結(jié)構(gòu)，并且lna可以位于莖內(nèi)。莖可以包含約2至約10個(gè)堿基對(duì)、約2至約8個(gè)堿基對(duì)、約2至約6個(gè)堿基對(duì)、或約2至約4個(gè)堿基對(duì)，以及2個(gè)和10個(gè)堿基對(duì)之間的所有整數(shù)?；蛘?，lna可以位于單鏈dna區(qū)域(例如，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)或3'末端)中。類似地，scdna的序列(c)可以自身形成發(fā)夾(莖-環(huán))結(jié)構(gòu)，或者與scdna內(nèi)的一些其它序列(例如，序列(a)或(b))的部分形成發(fā)夾(莖-環(huán))結(jié)構(gòu)，并且lna可以位于莖內(nèi)。在替代的方式中，lna可以位于單鏈dna區(qū)域(例如，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)或3'末端)中。(參見例如圖3)。如圖1a中所示，本文公開的scdna包含信號(hào)產(chǎn)生序列(a)。scdna中的信號(hào)產(chǎn)生序列(a)可以包含任何所期望的核酸序列，并且不受任何具體序列的限制。如下面更詳細(xì)地討論，信號(hào)產(chǎn)生序列(a)提供信號(hào)dna的模板的至少一部分(例如，圖2中的核酸(s))，其產(chǎn)生表明靶核酸的存在。scdna中的信號(hào)產(chǎn)生序列(a)不受長(zhǎng)度限制。在一些實(shí)施方式中，scdna中的信號(hào)產(chǎn)生序列(a)為約5至約100個(gè)核酸堿基，以及5至100之間的所有整數(shù)。在實(shí)施方式中，scdna中的信號(hào)產(chǎn)生序列(a)是從約5至約30個(gè)核酸堿基，以及5至30之間的所有整數(shù)。在一些實(shí)施方式中，scdna中的信號(hào)產(chǎn)生序列(a)為從約10至約30個(gè)核酸堿基，以及10至30之間的所有整數(shù)。在另外其它的實(shí)施方式中，scdna中的信號(hào)產(chǎn)生序列(a)為約15至約30個(gè)核酸堿基，以及15至30之間的所有整數(shù)(例如約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29或約30個(gè)堿基)。如圖1b所示，本文公開的sadna包含與scdna的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列(d)和與同一scdna的相同信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列(f)(包含鎖核酸)。在一些實(shí)施方式中，為了與scdna的信號(hào)dna產(chǎn)生序列同源，序列(d)和(f)與相應(yīng)的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)完全相同。在其它實(shí)施方式中，序列(f)與scdna的相應(yīng)信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)在序列上是相同的，除了它在3'端為更短了約1至約5、或約1至約4、或約1至約3個(gè)、或約1至約2個(gè)、或1個(gè)堿基外。當(dāng)sadna的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(d)與scdna的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源時(shí)，隨后產(chǎn)生了相同的信號(hào)dna(s)并且相同的信號(hào)dna(s)被指數(shù)擴(kuò)增。sc和sadna分別包含可以相同或不同的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和(e)。在單鏈形式(例如，圖1a和1b的結(jié)構(gòu))中，核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和(e)可以包含與可由核酸內(nèi)切酶切割的序列互補(bǔ)的序列。由核酸內(nèi)切酶切割的序列可以在核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列的內(nèi)部、下游或上游。適當(dāng)?shù)?，?dāng)雙鏈時(shí)，核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和(e)可被存在于反應(yīng)中的一個(gè)或多個(gè)核酸內(nèi)切酶識(shí)別，并且核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和(e)(或者與核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和(e)相鄰的序列)可以僅在雙鏈dna的一條鏈上被切開(即，切割)。如下面更詳細(xì)描述的那樣，靶核酸與scdna的互補(bǔ)序列(c)的結(jié)合通過dna聚合酶引發(fā)復(fù)制，以產(chǎn)生目前能夠作為核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)的活性雙鏈形式的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)(圖2a)。核酸內(nèi)切酶在新產(chǎn)生的雙鏈核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)(b)處或在與新產(chǎn)生的雙鏈核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)(b)相鄰的位點(diǎn)處切割，然后通過dna聚合酶引發(fā)復(fù)制，并產(chǎn)生信號(hào)dna(s)(參見例如圖2a)。如圖2a中所示，核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)是取向的，以使得新復(fù)制的鏈被切割而不是scdna。也就是說，當(dāng)產(chǎn)生新復(fù)制的鏈時(shí)，(b)中的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的取向指引新復(fù)制的鏈的核酸內(nèi)切酶活性(切開)。以其本身而言，核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)包含與由核酸內(nèi)切酶切割的序列互補(bǔ)的序列，這允許sc寡核苷酸在整個(gè)反應(yīng)中保持完整(即，scdna是未被切割或切開的)。如下面更詳細(xì)地描述，由scdna的信號(hào)產(chǎn)生序列(a)產(chǎn)生的信號(hào)dna(s)與sadna的序列(f)的結(jié)合通過dna聚合酶引發(fā)復(fù)制，以產(chǎn)生能夠作為核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)的活性雙鏈形式的sadna的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(e)(圖2b)。核酸內(nèi)切酶在sadna的新產(chǎn)生的雙鏈核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)(e)處或鄰近新產(chǎn)生的雙鏈核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)(e)的位點(diǎn)處切割，然后通過dna聚合酶引發(fā)復(fù)制，并產(chǎn)生與從scdna產(chǎn)生的信號(hào)dna(s)相同的信號(hào)dna(s)(圖2b)。如圖2b中所示，核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(e)是取向的，以使得新復(fù)制的鏈被切割，而不是sadna。也就是說，當(dāng)產(chǎn)生新復(fù)制的鏈時(shí)，e中的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的取向指引新復(fù)制的鏈的核酸內(nèi)切酶活性(切開)。以其本身而言，核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)包含與由核酸內(nèi)切酶切割的序列互補(bǔ)的序列，這允許sa寡核苷酸在整個(gè)反應(yīng)中保持完整(即，sadna是未被切割或切開的)。與靶dna互補(bǔ)的scdna的序列(c)不受長(zhǎng)度限制，并且可以是約5至約100個(gè)核酸堿基，以及5和100之間的所有整數(shù)。在一些實(shí)施方式中，scdna的序列(c)為約5至約30個(gè)核酸堿基，以及5和30之間的所有整數(shù)。在一些實(shí)施方式中，scdna中的序列(c)為約10至約30個(gè)核酸堿基，以及10和30之間的所有整數(shù)。在另外的實(shí)施方式中，scdna的序列(c)為約15至約30個(gè)核酸堿基，以及15和30之間的所有整數(shù)?；パa(bǔ)序列能夠形成氫鍵相互作用，以形成雙鏈核酸結(jié)構(gòu)(例如，核酸堿基對(duì))。例如，與第一序列互補(bǔ)的序列包含能夠與第一序列形成watson-crick堿基對(duì)的序列。本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”不要求序列在其互補(bǔ)鏈的全長(zhǎng)上是互補(bǔ)的，并且涵蓋了與另一序列的一部分互補(bǔ)的序列。因此，在一些實(shí)施方式中，互補(bǔ)序列涵蓋了在序列的整個(gè)長(zhǎng)度上或其一部分上互補(bǔ)的序列(例如，大于序列長(zhǎng)度的約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％或約90％)。例如，兩個(gè)序列可以在約2至約100個(gè)連續(xù)(相鄰)核苷酸之間的長(zhǎng)度或者2至100之間的任何整數(shù)的長(zhǎng)度上彼此互補(bǔ)。在一些實(shí)施方式中，兩個(gè)序列可以在約15至約30個(gè)連續(xù)(相鄰)核苷酸的長(zhǎng)度或者15至30之間的任何整數(shù)的長(zhǎng)度上彼此互補(bǔ)。如本文所用，互補(bǔ)序列可以涵蓋其中一些序列不匹配的序列。例如，互補(bǔ)序列可以包括序列長(zhǎng)度的至少約70％至100％、優(yōu)選地大于高于95％互補(bǔ)的序列。盡管一些量的錯(cuò)配，互補(bǔ)序列通常具有在適當(dāng)條件下與另一個(gè)選擇性地雜交的能力，適當(dāng)條件是例如嚴(yán)格和高度嚴(yán)格的條件，例如本文描述的那些或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的那些。sc和sadna可以通過已知方法合成。例如，可以使用亞磷酰胺法、磷酸三酯法、h-膦酸酯法或硫代膦酸鹽法來合成sc和sadna。在一些實(shí)施方式中，可以純化sc和/或sadna，例如使用離子交換hplc。sc和sadna可以包含本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾。在一些實(shí)施方式中，例如，sc和sadna可以包含化學(xué)修飾的核苷酸(例如2'-o甲基衍生物、硫代磷酸酯等)、3'端修飾、5'端修飾或其任何組合。在一些實(shí)施方式中，可以修飾sc和sadna的3'端，使得擴(kuò)展反應(yīng)不會(huì)從sc或sadna的3'端發(fā)生(例如，在結(jié)合靶序列或可能作為聚合酶擴(kuò)增的引物的另一非靶序列時(shí))。如圖2a中所示，是靶核酸(t)的3'端，而不是scdna，起始dna復(fù)制。從sc或sadna的3'端起始的任何復(fù)制可能導(dǎo)致檢測(cè)錯(cuò)誤(例如假陽(yáng)性)。此外，由如下事件引起從scdna的未修飾的3'端的非特異性擴(kuò)展反應(yīng)也可能導(dǎo)致檢測(cè)錯(cuò)誤，所述事件例如：scdna與非靶序列之間的結(jié)合、scdna與靶序列之間在錯(cuò)誤位置結(jié)合、sc和sadna之間的結(jié)合、或者非模板的重新或從頭的dna合成。因此，在實(shí)施方式中，sc和sadna包含3'端修飾，所述3'端修飾能夠減少或消除任何不期望的擴(kuò)展反應(yīng)(例如上述討論的那些)的發(fā)生。3'端修飾的非限制性實(shí)例包括tamra、dabcyl和fam。修飾的其它非限制性實(shí)例包括例如生物素化、熒光染色、磷酸化、硫醇化、胺化、反轉(zhuǎn)核苷酸或無堿基團(tuán)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涵蓋了檢測(cè)樣品中靶核酸(t)的方法。所述方法一般包括使所述樣品與如下物質(zhì)接觸：第一寡核苷酸(或序列轉(zhuǎn)換dna或scdna)，所述第一寡核苷酸在5’至3’方向上包含信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)和具有鎖核酸(lna)且與所述靶核酸(t)的3’端互補(bǔ)的序列(c)；第二寡核苷酸(或信號(hào)擴(kuò)增dna或sadna)，所述第二寡核苷酸在5’至3’方向上包含與第一寡核苷酸的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(d)、核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(e)(其與第一寡核苷酸的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)相同或不同)和包含鎖核酸(lna)且與第一寡核苷酸的信號(hào)dna產(chǎn)生序列(a)同源的序列(f)；聚合酶；和用于切口反應(yīng)的核酸內(nèi)切酶。在該方面的實(shí)施方式中，該方法還包括確定信號(hào)dna是否存在，其中信號(hào)dna的存在表明在樣品中存在靶核酸。該方法包含使樣品與核酸內(nèi)切酶接觸。核酸內(nèi)切酶可以是切口核酸內(nèi)切酶或限制性核酸內(nèi)切酶，其能夠或可以用于切割在scdna內(nèi)使與核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)互補(bǔ)的序列、或切割在sadna內(nèi)與核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(e)互補(bǔ)的序列。在一些實(shí)施方式中，核酸內(nèi)切酶包含切口核酸內(nèi)切酶或限制性核酸內(nèi)切酶，其可以催化或者可以用于催化雙鏈dna切口反應(yīng)。在提供切口核酸內(nèi)切酶的實(shí)施方式中，雙鏈dna的一條鏈的磷酸二酯鍵可以被切開，以在切開位點(diǎn)產(chǎn)生5'側(cè)的磷酸酯基和3'側(cè)的羥基。切口核酸內(nèi)切酶的非限制性實(shí)例包括nb.bbvci、ntalwi、nt.bbvci、nb.bsrdi、nb.btsl、nt.bspqi、nt.bstnbi、nb.bsmi、nt.cvipii和nt.bsmai。在一些實(shí)施方式中，核酸內(nèi)切酶可以是限制性核酸內(nèi)切酶。在這些實(shí)施方式中，限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)可以被修飾，以使限制性核酸內(nèi)切酶僅在雙鏈dna的一條鏈上切開磷酸二酯鍵，并且在雙鍵上產(chǎn)生切口?？梢允褂迷S多方法或策略來修飾限制性核酸內(nèi)切酶的活性，例如包括未被限制酶切開的雙鏈核酸的至少一條鏈中的化學(xué)修飾。這種修飾的一個(gè)非限制性示例包括用硫原子替換一條鏈的磷酸二酯鍵的氧原子。在提供限制性核酸內(nèi)切酶的實(shí)施方式中，雙鍵dna的一條鏈的磷酸二酯鍵可以被切開，以在切開位點(diǎn)產(chǎn)生5'側(cè)的磷酸酯基和3'側(cè)的羥基。限制性核酸內(nèi)切酶的非限制性示例包括hincii、hindii、avai、fnu4hi、tthllli和ncii。本方法包括使樣品與聚合酶接觸。在一些實(shí)施方式中，聚合酶可以是具有鏈置換活性的dna聚合酶。在一些實(shí)施方式中，聚合酶可以缺乏5'-3'核酸外切酶活性、缺乏3'-5'核酸外切酶活性、或者缺乏5'-3'和3'-5'核酸外切酶活性二者的聚合酶。聚合酶可以來源于真核生物、原核生物或病毒，也可以被遺傳修飾。在一些實(shí)施方式中，聚合酶選自在較低溫度(包括環(huán)境溫度(例如室溫))下起作用的那些聚合酶。dna聚合酶的非限制性實(shí)例包括klenow片段、從大腸桿菌(e.coli)獲得的dna聚合酶i、從嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophilus)獲得的5'至3'核酸外切酶缺乏型bstdna聚合酶、以及從熱堅(jiān)芽孢桿菌(bacilluscaldotenax)獲得的5'至3'核酸外切酶缺乏型bcadna聚合酶。在圖2a和2b中示出了本文公開的方法的一個(gè)非限制性實(shí)施方式。簡(jiǎn)言之，如圖2a所示，在dna聚合酶和能夠切割雙鏈形式(即互補(bǔ)序列)的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)或鄰近雙鏈形式的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)的位點(diǎn)的核酸內(nèi)切酶存在下，使樣品與scdna接觸。如果樣品中存在靶核酸(t)，則靶核酸(t)的3'端序列與scdna的序列(c)雜交，其與靶標(biāo)互補(bǔ)，并引發(fā)或起始復(fù)制(通過存在于反應(yīng)混合物中的dna聚合酶)，從而產(chǎn)生包含雙鏈核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)的雙鏈擴(kuò)展序列(x)。新產(chǎn)生的雙鏈核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(b)(通過反應(yīng)混合物中存在的核酸內(nèi)切酶)的識(shí)別和隨后的對(duì)新產(chǎn)生的鏈(由反應(yīng)混合物中存在的核酸內(nèi)切酶)進(jìn)行的切割，產(chǎn)生寡核苷酸信號(hào)序列(s)和擴(kuò)展序列(x')。因?yàn)榍锌谔幍男蛄?x')的3'-oh作為后續(xù)一連串的鏈置換復(fù)制的起始位點(diǎn)，所以寡核苷酸(s)通過在反應(yīng)混合物中繼續(xù)復(fù)制并擴(kuò)增信號(hào)dna(s)的dna聚合酶來從scdna中置換。如圖2b中進(jìn)一步所示，可以通過信號(hào)擴(kuò)增dna(或sadna)的存在來進(jìn)一步擴(kuò)增由信號(hào)dna(s)的產(chǎn)生所獲得的信號(hào)。簡(jiǎn)言之，反應(yīng)中存在的信號(hào)dna(s)與引發(fā)或起始復(fù)制(由反應(yīng)混合物中存在的dna聚合酶)的sadna的序列(f)雜交，從而產(chǎn)生包含雙鏈核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(e)的雙鏈擴(kuò)展序列(y)。新產(chǎn)生的雙鏈核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(e)的識(shí)別(通過在反應(yīng)混合物中存在的核酸內(nèi)切酶)和隨后的對(duì)新產(chǎn)生的鏈(通過反應(yīng)混合物中存在的核酸內(nèi)切酶)進(jìn)行的切割，產(chǎn)生寡核苷酸信號(hào)序列(s)和擴(kuò)展序列(y')。因?yàn)榍锌谔幍男蛄?y')的3'-oh作為后續(xù)一連串的鏈置換復(fù)制的起始位點(diǎn)，所以寡核苷酸(s)通過在反應(yīng)混合物中繼續(xù)復(fù)制并擴(kuò)增信號(hào)dna(s)的dna聚合酶來從sadna中置換。根據(jù)本發(fā)明的方法可以在等溫或基本恒定的溫度條件下進(jìn)行。在涉及在基本恒定的溫度下執(zhí)行該方法的實(shí)施方式中，溫度的一些波動(dòng)是允許的。例如，在一些實(shí)施方式中，基本恒定的溫度可以在期望的或確認(rèn)的目標(biāo)溫度范圍(例如，約+/-2℃或約+/-5℃)內(nèi)波動(dòng)。在實(shí)施方式中，基本恒定的溫度可以包含不包括熱循環(huán)的溫度。在一些實(shí)施方式中，方法可以在等溫或基本恒定的溫度下進(jìn)行，例如(1)溫度大約等于或低于計(jì)算/預(yù)測(cè)或?qū)嶒?yàn)確定的靶核酸(t)到scdna的序列(c)的最佳雜交或退火溫度；(2)溫度等于或低于與scdna結(jié)合的靶核酸(t)的解鏈溫度(通常，雜交或退火溫度略低于解鏈溫度)；(3)溫度等于或低于與sadna結(jié)合的信號(hào)dna(s)的解鏈溫度；或者(4)溫度等于或大約為計(jì)算/預(yù)測(cè)或?qū)嶒?yàn)確定的在反應(yīng)混合物中存在的聚合酶和/或核酸內(nèi)切酶的最佳反應(yīng)溫度。該方法可以包括約20℃至約70℃的反應(yīng)溫度，包括落在約20℃至約42℃范圍內(nèi)的較低溫度。在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)溫度范圍為35℃至40℃(例如，35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃)。在其它實(shí)施方式中，反應(yīng)溫度低于65℃，包括低于約55℃、約50℃、約45℃、約40℃或約30℃的較低溫度。在另外其它實(shí)施方式中，反應(yīng)溫度可以是約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、約39℃、約40℃、約41℃、約42℃、約43℃、約44℃、約45℃、約46℃、約47℃、約48℃、約49℃、約50℃、約51℃、約52℃、約53℃、約54℃、約55℃、約56℃、約57℃、約58℃、約59℃、約60℃、約61℃、約62℃、約63℃、約64℃、約65℃、約66℃、約67℃、約68℃、約69℃或約70℃。本方法可以進(jìn)行在靶核酸存在下足以允許擴(kuò)增可檢測(cè)到的量的信號(hào)序列的時(shí)間。在一些實(shí)施方式中，反應(yīng)時(shí)間范圍可以為約5分鐘至16小時(shí)或者約3分鐘至16小時(shí)。在另外其它實(shí)施方式中，反應(yīng)時(shí)間范圍可以為約5至120分鐘，或約15至60分鐘。在整個(gè)說明書中，寡核苷酸(s)也稱為信號(hào)dna(s)。因?yàn)樾盘?hào)dna僅在靶核酸(t)的存在下產(chǎn)生，所以根據(jù)本發(fā)明的方法通過檢測(cè)信號(hào)dna的存在或不存在來檢測(cè)樣品中存在或不存在靶核酸(t)。信號(hào)dna(s)不受序列限制，可以是可檢測(cè)到的任何序列。信號(hào)dna也不受長(zhǎng)度限制。優(yōu)選地，信號(hào)dna可以是約5至約100個(gè)堿基，以及5至100之間的任何整數(shù)。在一些實(shí)施方式中，信號(hào)dna可以是約5至約30個(gè)核酸堿基，以及在5和30之間的所有整數(shù)。在一些實(shí)施方式中，信號(hào)dna的長(zhǎng)度可以為約10至約30個(gè)堿基，以及10至30之間的所有整數(shù)。在另外其它實(shí)施方式中，信號(hào)dna的長(zhǎng)度可以為約15至約30個(gè)堿基，以及15和30之間的所有整數(shù)。根據(jù)本公開的方法可以在包含約4至約10或者約7至約9的ph范圍的緩沖條件下進(jìn)行。緩沖液可以包含約10mm至約500mm或約50mm至150mm的鹽濃度。在一些實(shí)施方式中，方法可以使用如下含量的sc和/或sadna進(jìn)行本方法，所述含量的sc和/或sadna允許在靶核酸存在下擴(kuò)增可檢測(cè)到的量的信號(hào)序列。在一些實(shí)施方式中，sc和/或sadna濃度范圍可以為約100pm至約100μm、約1nm至約150nm、約5nm至約50nm或者約5nm至約25nm。信號(hào)dna(s)的存在可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法檢測(cè)。例如，可以使用凝膠電泳和用溴化乙錠染色。此外，信號(hào)dna的存在可以使用熒光偏振、免疫試驗(yàn)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、酶標(biāo)記(例如過氧化物酶或堿性磷酸酶)、熒光標(biāo)記(例如熒光素或羅丹明)、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、表面等離子體共振(spr)或熒光團(tuán)修飾的探針dna(例如，taqman探針)來檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物也可以通過使用標(biāo)記的(例如用生物素標(biāo)記的)核苷酸來檢測(cè)。在這種情況下，例如，可以使用熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白或酶標(biāo)記的抗生物素蛋白來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中的生物素。也可以通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的氧化還原嵌入劑來用電極檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。也可以使用表面等離子體共振(spr)、石英晶體微量天平(qcm)或電化學(xué)方法(包括使用納米孔傳感器的那些方法)來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的方法檢測(cè)樣品中存在或不存在靶核酸(t)。根據(jù)本發(fā)明的方法還可以用于定量測(cè)量靶核酸在測(cè)試樣品中的濃度。例如，根據(jù)本公開的方法可以在靶核酸的不同的已知濃度的范圍的存在下進(jìn)行，然后如本領(lǐng)域通常實(shí)踐的那樣，可以制作和使用校準(zhǔn)曲線。靶核酸(圖2中的(t))可以包含任何核酸序列，并且可以包括dna、rna、化學(xué)修飾的核酸、非天然核酸、核酸類似物或任何雜交體或其組合。因此，在一些實(shí)施方式中，dna可以包括cdna、基因組dna和合成的dna，并且rna可以包括總rna、mrna、rrna、sirna、hnrna、pirna、arna、mirna和合成的rna。盡管一些實(shí)施方式涉及具體的靶核酸序列，但任何核酸序列(包括輔助核酸序列)可以是待檢測(cè)的靶核酸序列。本公開提供了即使當(dāng)核酸是短鏈核酸時(shí)仍具有選擇性和靈敏度的靶核酸的檢測(cè)。因此，scdna的序列(c)與靶核酸(t)之間的互補(bǔ)程度允許序列之間的特異性雜交(例如，靶核酸序列和序列轉(zhuǎn)換dna的序列(c)中互補(bǔ)核苷酸的數(shù)目避免了在給定的一組反應(yīng)條件下的非特異性雜交)。在實(shí)施方式中，靶核酸序列可來自或衍生自任何數(shù)量的來源，包括例如基因組dna、表達(dá)的mrna、來自病原體的核酸序列(微生物、病毒)或治療性核酸。因此，sc和sadna以及本文公開的方法可用于疾病的診斷和預(yù)后(例如，由遺傳和感染源產(chǎn)生)、污染物的鑒定(例如，食源性疾病、設(shè)備污染)和個(gè)性化醫(yī)學(xué)(例如，治療的監(jiān)測(cè)和/或預(yù)后)等。例如，可以針對(duì)以下感染性疾病進(jìn)行分子診斷測(cè)試：乙型肝炎病毒(hbv)；丙型肝炎(hcv)；hcv(基因型1-6)；人類免疫缺陷病毒1型(hiv-1)；沙眼衣原體；淋病奈瑟氏菌；甲型流感；乙型流感；呼吸道合胞病毒(rsv)；和parvo病毒。在一些實(shí)施方式中，靶核酸可以包含微rna(mirna)。微rna包括約22個(gè)核苷酸的小的非編碼rna分子。已知微rna在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起作用。已知微rna通過與信使rna(mrna)的互補(bǔ)區(qū)域的堿基配對(duì)而起作用，從而通過翻譯抑制或靶標(biāo)降解導(dǎo)致基因沉默?？梢园泻怂岬娜魏晤愋偷臉悠房捎糜诒疚墓_的方法中。就本身而言，含有或懷疑含有靶核酸的樣品沒有特別限制，包括例如來自活體的生物樣品，例如全血、血清、血沉棕黃層、尿液、糞便、腦脊髓液、精液、唾液、組織(例如癌組織或淋巴結(jié))、細(xì)胞培養(yǎng)物(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)菌培養(yǎng)物)；含有核酸的樣品，例如類病毒、病毒、細(xì)菌、真菌、酵母、植物和動(dòng)物；可能含有微生物或被微生物(如病毒或細(xì)菌)感染的樣品(如食品和生物制品)；以及可能含有生物物質(zhì)的樣品，如土壤、工業(yè)處理和制造設(shè)備以及廢水；和來自各種水源(例如飲用水)的樣品。此外，可以通過任何已知方法處理樣品，以制備在本文公開的方法中使用的含有核酸的組合物。這種制品的實(shí)例可以包括細(xì)胞碎片(例如，細(xì)胞裂解物和提取物)、樣品餾分、樣品中的核酸和特異性核酸分子基團(tuán)，例如富含mrna的樣品。在檢測(cè)本發(fā)明的靶核酸的方法中使用的樣品不限于如上所述的從生物產(chǎn)品和天然產(chǎn)品獲得的那些樣品，并且可以是含有合成的寡核苷酸的樣品。根據(jù)本發(fā)明的方法可以與abbottm2000sp樣品制備系統(tǒng)結(jié)合進(jìn)行。m2000sp使用磁粉技術(shù)捕獲核酸，并洗滌顆粒以除去未結(jié)合的樣品組分。將結(jié)合的核酸洗脫并轉(zhuǎn)移到96深孔板中。abbottm2000sp還可以與將洗滌后的核酸轉(zhuǎn)移到96深孔板中所需要的任何試劑結(jié)合，以便執(zhí)行根據(jù)本技術(shù)的方法。例如，可以根據(jù)需要或期望來添加sc和sadna、聚合酶、核酸內(nèi)切酶、分子信標(biāo)和任何其它試劑(例如dntp)。根據(jù)本發(fā)明的方法也可以與床旁護(hù)理平臺(tái)接口。例如，將脫氧核糖核苷三磷酸(dntp)引入到生長(zhǎng)的dna鏈中涉及共價(jià)鍵的形成以及影響反應(yīng)ph的帶正電荷的氫離子和焦磷酸鹽的釋放。就本身而言，可以通過使用例如床旁護(hù)理微量ph計(jì)跟蹤ph的變化來檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明的方法的信號(hào)dna的合成。例如，abbott'si-stat床旁護(hù)理系統(tǒng)可以提供單次使用的一次性藥筒，其中包含微型制造的傳感器、校準(zhǔn)溶液、流體系統(tǒng)和用于ph分析的廢物室。本文公開的方法可以包含額外的試劑?？捎糜诤怂釘U(kuò)增反應(yīng)的其它試劑的一些非限制性實(shí)例包括金屬鹽，例如氯化鈉、氯化鎂、乙酸鎂和硫酸鎂；底物，例如dntp混合物；和緩沖液，例如tris-hcl緩沖液、三氯緩沖液、磷酸鈉緩沖液和磷酸鉀緩沖液。同樣，洗滌劑、氧化劑和還原劑也可用于本文公開的方法的實(shí)踐中。此外，可以使用諸如二甲基亞砜和甜菜堿(n,n,n-三甲基甘氨酸)；國(guó)際公開號(hào)wo99/54455中描述的酸性物質(zhì)以及陽(yáng)離子絡(luò)合物的試劑。本文提供的方法和核酸結(jié)構(gòu)可以與其它方法組合使用，以提供在靶核酸存在下信號(hào)dna的指數(shù)擴(kuò)增。例如，根據(jù)本公開的方法和組合物可以與覆蓋序列轉(zhuǎn)換dna組合使用，如名稱為“覆蓋序列轉(zhuǎn)換dna和檢測(cè)方法”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/927710中所述，該臨時(shí)申請(qǐng)通過引用并入本文。術(shù)語(yǔ)“約”通常是指本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)為等同于所引用的值(即具有相同的功能或結(jié)果)的數(shù)量范圍。本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“約”旨在表示大于或小于參考值的約10-20％的范圍。在某些情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，由于參考值的性質(zhì)，術(shù)語(yǔ)“約”可以意味著與該值的偏差大于或小于10-20％。以下實(shí)施例旨在說明上述各方面和實(shí)施方式。上述公開內(nèi)容和下文的實(shí)施例都不應(yīng)視為限制所附權(quán)利要求的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本公開不受用于描述和說明本公開的各個(gè)方面的特定術(shù)語(yǔ)的限制。實(shí)施例1在如下情況下進(jìn)行反應(yīng)：使用scdna#246:5'-agccctgtacaatgccctcagcctgttcctgctgaactgagcca-idt-idt-3'(序列號(hào)：32；粗體位置表示存在lna)和sadna#253:5'-agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat-idt-idt-3'(序列號(hào)：2；粗體位置表示存在lna)來檢測(cè)在靶dna的以各種用量(1nm、100pm、10pm、1pm、100fm、10fm或1fm)存在或不存在下信號(hào)dna的產(chǎn)生，其是與人hsa-mir-24(序列號(hào)：33)相同的dna序列。scdna#246和sadna#253二者均使用離子交換hplc來被純化。反應(yīng)在37℃下在含有終濃度為10mmtris-hcl、50mmnacl、10mmmgcl2、1mmdtt、ph7.9的newenglandbiolabs(neb)緩沖液2的25μl反應(yīng)體積中進(jìn)行。在反應(yīng)中使用的切口核酸內(nèi)切酶是nb.bbvci，其以0.1單位/μl的濃度存在。在反應(yīng)中使用的聚合酶是bstdna聚合酶大片段，其以0.08單位/μl的濃度存在。每個(gè)dntp以200μm的終濃度存在。反應(yīng)中存在的sc和sadna的終濃度分別為5nm和20nm。使用最終濃度為100nm的分子信標(biāo)探針(序列號(hào)：34)來檢測(cè)信號(hào)dna的產(chǎn)生。使用bio-rad實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)cfx96進(jìn)行熒光測(cè)量，并且結(jié)果示于下表1中。表1靶dna的濃度擴(kuò)增時(shí)間(分鐘)0>138.221nm5.84100pm15.0310pm32.181pm55.31100fm69.6810fm73.48實(shí)施例2在如下情況下進(jìn)行反應(yīng)：在各種溫度(20℃、25℃、30℃、37℃、45℃和50℃)下使用scdna#246(序列號(hào)：32)和sadna#339(序列號(hào)：25)，來檢測(cè)在靶dna的存在(1nm、100pm、10pm、1pm、100fm)或不存在下信號(hào)dna的產(chǎn)生，其是與人hsa-mir-24(序列號(hào)：33)相同的dna序列。scdna#246和sadna#339二者均使用離子交換hplc來被純化。除溫度外，反應(yīng)條件如實(shí)施例1所述，并且結(jié)果示于下表2中。表2實(shí)施例3至38使用scdna#246(序列號(hào)：32)連同許多不同的sadna(如下表3所述)進(jìn)行進(jìn)一步的反應(yīng)，以檢測(cè)在靶dna的存在(100pm)或不存在下信號(hào)dna的產(chǎn)生，其是與人hsa-mir-24(序列號(hào)：33)相同的dna序列。反應(yīng)條件如實(shí)施例1中所述，并且結(jié)果如表3中所示。序列擴(kuò)增dna序列提供于表格上方，并且表示可以包含lna的位置(從3'端編號(hào))。表3實(shí)施例39-92使用scdna#246(序列號(hào)：32)連同許多不同的sadna(如下表4所述)進(jìn)行進(jìn)一步的反應(yīng)，以檢測(cè)在靶dna的存在(1nm、100pm、10pm、1pm和100fm)或不存在下信號(hào)dna的產(chǎn)生，其是與人hsa-mir-24(序列號(hào)：33)相同的dna序列。如表4所示，使用未純化或hplc純化的sadna進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件如實(shí)施例1所述，并且結(jié)果如表4所示。序列擴(kuò)增dna序列提供于表格上方，并且表示可以包含lna的位置(從3'端編號(hào))。表4雖然已經(jīng)參考某些方面和實(shí)施方式描述了本申請(qǐng)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以對(duì)本文提供的公開內(nèi)容進(jìn)行改變，并且在不違背本公開的保護(hù)范圍的情況下可以替換等同物。因此，本申請(qǐng)不應(yīng)該限于所公開的具體方面和實(shí)施方式，而應(yīng)理解為和意識(shí)到包括落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)的所有方面和實(shí)施方式。序列表<110>kenkomiyamakotokomoritoruyoshimura<120>具有鎖核酸的序列轉(zhuǎn)換和信號(hào)擴(kuò)增dna以及使用其的檢測(cè)方法<130>28295us01(12350uso1)<160>35<170>patentin版本3.5<210>1<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>1agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>2<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置26,30,34,35處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(26)..(26)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(30)..(30)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(35)..(35)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>2agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>3<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置30,34,35處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(30)..(30)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(35)..(35)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>3agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>4<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置26,34,35處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(26)..(26)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(35)..(35)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>4agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>5<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置26,30,35處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(26)..(26)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(30)..(30)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(35)..(35)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>5agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>6<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置26,30,34處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(26)..(26)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(30)..(30)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>6agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>7<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置34,35處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(35)..(35)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>7agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>8<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置30,35處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(30)..(30)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(35)..(35)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>8agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>9<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置30,34處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(30)..(30)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>9agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>10<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置26,35處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(26)..(26)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(35)..(35)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>10agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>11<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置26,34處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(26)..(26)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>11agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>12<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置26,30處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(26)..(26)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(30)..(30)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>12agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>13<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置26處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(26)..(26)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>13agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>14<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置30處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(30)..(30)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>14agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>15<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置34處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>15agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>16<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置35處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(35)..(35)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>16agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>17<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置27處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(27)..(27)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>17agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>18<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置28處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(28)..(28)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>18agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>19<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置29處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(29)..(29)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>19agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>20<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置31處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(31)..(31)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>20agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>21<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置32處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(32)..(32)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>21agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>22<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置33處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(33)..(33)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>22agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>23<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置28,32處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(28)..(28)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(32)..(32)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>23agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>24<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置27,31處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(27)..(27)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(31)..(31)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>24agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>25<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置30,33處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(30)..(30)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(33)..(33)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>25agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>26<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置30,33,34處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(30)..(30)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(33)..(33)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>26agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>27<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置26,30,33,34處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(26)..(26)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(30)..(30)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(33)..(33)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>27agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>28<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置28,35處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(28)..(28)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(35)..(35)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>28agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>29<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置28,34處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(28)..(28)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>29agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>30<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置28,33處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(28)..(28)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(33)..(33)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>30agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>31<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置29,34處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(29)..(29)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(34)..(34)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>31agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35<210>32<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>序列轉(zhuǎn)換dna在位置30,38處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(30)..(30)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(38)..(38)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(44)..(44)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>32agccctgtacaatgccctcagcctgttcctgctgaactgagcca44<210>33<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>與人hsa-mir-24相同的dna序列<400>33tggctcagttcagcaggaacag22<210>34<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>分子信標(biāo)探針，具有在5'端的6-羧基熒光素和3'端的4-(4'-二甲基氨基苯偶氮)苯甲酸<220><221>尚未歸類的特征<222>(1)..(1)<223>5'端fam修飾<220><221>尚未歸類的特征<222>(19)..(19)<223>3'端dabcyl修飾<400>34agccctgtacaatgcggct19<210>35<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>信號(hào)擴(kuò)增dna在位置26,33處具有鎖核酸<220><221>修飾的堿基<222>(26)..(26)<223>lna修飾的堿基<220><221>修飾的堿基<222>(33)..(33)<223>lna修飾的堿基<220><221>尚未歸類的特征<222>(35)..(35)<223>3'端修飾：兩個(gè)倒置的胸腺嘧啶<400>35agccctgtacaatgccctcagcagccctgtacaat35當(dāng)前第1頁(yè)12