發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及雙特異性鯊魚(yú)可變抗體(vnar)結(jié)構(gòu)域的生成及其用途。具體而言，本發(fā)明涉及用于生成和篩選隨機(jī)化vnar結(jié)構(gòu)域的多核苷酸文庫(kù)以鑒定所需表型的vnar的方法。本發(fā)明方法對(duì)于生成新型雙特異性抗體及其用途是特別有用的。

發(fā)明背景

如今生物實(shí)體是制藥行業(yè)的主要驅(qū)動(dòng)力之一，如其當(dāng)前和預(yù)測(cè)的市場(chǎng)增長(zhǎng)率顯著超過(guò)整體行業(yè)的市場(chǎng)增長(zhǎng)率所例舉。在這組生物藥物內(nèi)，單克隆抗體(mab)是最高銷(xiāo)售類(lèi)型的生物制劑，隨后分別是激素、生長(zhǎng)因子和融合蛋白。與fc介導(dǎo)的免疫效應(yīng)子功能組合的同源抗原的高特異性已經(jīng)支持抗體成功作為醫(yī)療應(yīng)用的有效工具。用許多約40種美國(guó)食品和藥品管理局(fda)迄今為止批準(zhǔn)的抗體和用臨床開(kāi)發(fā)中的數(shù)百種mab，mab的治療和經(jīng)濟(jì)價(jià)值是顯而易見(jiàn)的。

igg-型抗體是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的、大雜四聚體蛋白，分子量為約150kd。igg-型抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈構(gòu)成。兩個(gè)相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)、即互補(bǔ)位分別由輕鏈的一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域和重鏈的一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。

由于存在不同的末端糖，igg分子的fc片段的ch2結(jié)構(gòu)域含有經(jīng)由n-糖基化連接的高度異質(zhì)的聚糖。fc聚糖影響igg與fc受體和c1q的結(jié)合，因此對(duì)于igg效應(yīng)子功能是重要的。具體地，末端糖諸如唾液酸、核心巖藻糖、二等分n-乙酰葡糖胺和甘露糖殘基影響igg與fcγriiia受體的結(jié)合，從而影響adcc活性(參見(jiàn)例如stadlmann等人.proteomics.2008jul;8(14):2858-71)。

然而，在某些情況下，由于其固有的物理化學(xué)特性，抗體(諸如igg型抗體)的治療和診斷效力可能受到限制。例如，經(jīng)典抗體分子的組織穿透可能受到其大尺寸的約束(參見(jiàn)例如mordenti等人.(1999)toxicolpathol27:536-44)，因此限制了其在體外以及體內(nèi)診斷方法中的用途。此外，由于其延長(zhǎng)的血漿半衰期，常規(guī)抗體的緩慢血液清除率另外構(gòu)成體內(nèi)腫瘤成像目的的問(wèn)題。此外，健康組織對(duì)經(jīng)典抗體的非特異性攝取進(jìn)一步增加了對(duì)其在分子成像中的用途構(gòu)成的限制。

為了試圖克服經(jīng)典抗體的上述限制并提高其總體治療效力，已經(jīng)設(shè)計(jì)了所謂的“下一代”抗體或抗體片段，以及非基于免疫球蛋白的蛋白支架。下一代抗體的實(shí)例包括例如單抗體、scfv、雙抗體，或例如adnectins、親和體、anticalins或半胱氨酸結(jié)蛋白(參見(jiàn)例如enever等人(2009)currentopinioninbiotechnology,vol20(4),405–411;l?fbl?m等人curropinbiotechnol.2011dec;22(6):843-8)。

在駱駝?lì)悇?dòng)物和軟骨魚(yú)中發(fā)現(xiàn)了在過(guò)去幾年由于其非典型結(jié)構(gòu)而受到很多重視的另一類(lèi)抗體，其具有僅由重鏈構(gòu)成的天然抗體(參見(jiàn)例如greenberg等人(1995)nature374:168-73;hamers-casterman等人(1993)nature363:446-8)。在這些抗體中，抗原結(jié)合位點(diǎn)僅由一個(gè)單個(gè)結(jié)構(gòu)域(分別稱(chēng)為vhh和vnar)形成。由于對(duì)應(yīng)于常規(guī)抗體的疏水性vh-vl界面的溶劑暴露區(qū)域的極性和帶電氨基酸的頻率增加，vnar和vhh結(jié)構(gòu)域是高度可溶的。

僅重鏈抗體(hcab)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域組合了非基于免疫球蛋白的蛋白支架的大部分有益特征(例如小尺寸和高穩(wěn)定性)以及經(jīng)典抗體分子的有利特征(最顯著的是通過(guò)免疫生成高度特異性和高親和力結(jié)合劑的可行性)。有趣的是，hcab天然互補(bǔ)了上述種類(lèi)的常規(guī)譜系：盡管經(jīng)典抗體通常具有平面或凹面抗原結(jié)合位點(diǎn)，但vnar-和vhh-結(jié)構(gòu)域具有多種額外(在vnar的情況下)和不同的環(huán)結(jié)構(gòu)。這導(dǎo)致得到能夠接近和結(jié)合更隱蔽的表位和酶的催化裂縫(其為經(jīng)典抗體難以處理的)的可用互補(bǔ)位的劇烈擴(kuò)展譜。

盡管駱駝vhh結(jié)構(gòu)域已證明在早期臨床試驗(yàn)中是成功的(參見(jiàn)例如holz等人(2012)transfusaphersci.2012jun;46(3):343-6)，但用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的vnar結(jié)構(gòu)域的工程改造到目前為止還沒(méi)有進(jìn)展。然而，在過(guò)去幾年中已經(jīng)取得了表明這些結(jié)構(gòu)域的治療效用的顯著進(jìn)展。

軟骨魚(yú)(鯊魚(yú)、rays、skates和吐火銀鮫(chimaeras))表達(dá)三種不同同種型的抗體，igm、ignar和原始igw(rumfeltll.等人bmcimmunology2004;5:8;rumfeltll等人journalofimmunology2004;173:1129-39)。在鉸口鯊(ginglymostomacirratum)的血清中首先鑒定了ignar(greenbergas等人nature1995;374:168-73)。ignar是沒(méi)有輕鏈的重鏈的同型二聚體。分泌形式的每條鏈由一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域、隨后五個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域(最后四個(gè)與igw恒定結(jié)構(gòu)域同源)組成。血清ignar水平范圍為約0.1mg/ml至1mg/ml。

基于原子分辨率結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)以及小角度x射線散射，獲得了完整ignar分子的結(jié)構(gòu)模型。在分子內(nèi)，每個(gè)鏈的結(jié)構(gòu)域c1和c3引起ignar的二聚化。盡管缺乏經(jīng)典的鉸鏈區(qū)域，但可變結(jié)構(gòu)域的間隔足夠?qū)?，足以結(jié)合多種表位，其也可以通過(guò)c1二聚化界面的廣角來(lái)促進(jìn)。兩個(gè)c3結(jié)構(gòu)域之間的小角度誘導(dǎo)形成ignar分子的狹窄莖(narrowstalk)。然而，莖的柔性由連接結(jié)構(gòu)域c3和c4的二硫化物橋聯(lián)的接頭誘導(dǎo)。僅重鏈分子大約在分子的中間、在柔性接頭的位置處扭結(jié)，造成其特征性形狀。目前還沒(méi)有解決任何效應(yīng)子功能是否由ignar的恒定區(qū)介導(dǎo)。

同型二聚體ignar展現(xiàn)幾種獨(dú)特的特征，其負(fù)責(zé)潛在輕鏈配對(duì)的抑制。在典型vh-vl相互作用位點(diǎn)，在哺乳動(dòng)物中介導(dǎo)這種結(jié)合的殘基的保守性不良。相反，這些典型疏水性氨基酸經(jīng)常被極性或帶電殘基代替。對(duì)于經(jīng)典抗體，特殊機(jī)制確保形成重鏈和輕鏈配對(duì)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，重鏈經(jīng)由與ch1結(jié)構(gòu)域的相互作用被ig-結(jié)合蛋白(bip)來(lái)捕獲。對(duì)于釋放，輕鏈必須代替bip。因此，僅分泌重鏈和輕鏈配對(duì)抗體。

新抗原受體的可變結(jié)構(gòu)域顯示與t細(xì)胞受體(tcr)vα和還有免疫球蛋白vκ結(jié)構(gòu)域的序列同源性，而結(jié)構(gòu)上其與vα、vλ和vh結(jié)構(gòu)域相關(guān)。此外，由于vnar結(jié)構(gòu)域共享細(xì)胞粘附分子的結(jié)構(gòu)特征，所以提示從細(xì)胞表面受體進(jìn)化的ignar將其與vhh(其明顯源自igg譜系)明顯區(qū)別。vnar屬于ig超家族，因此它具有β-夾心折疊。然而，與哺乳動(dòng)物v結(jié)構(gòu)域相比，該折疊僅由8個(gè)、而不是10個(gè)β鏈組成，這是由于在框架2-cdr2-區(qū)域中的缺失，其使得vnar結(jié)構(gòu)域是迄今為止動(dòng)物界中最小的抗體樣抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，分子量為大約12kda(barellec等人,advexpmedbiol2009;655:49-62;stanfieldrl等人science2004;305:1770-3)。

因此，與哺乳動(dòng)物可變結(jié)構(gòu)域相反，vnar結(jié)構(gòu)域僅具有兩個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)cdr1和cdr3。主要vnar譜的多樣性主要發(fā)現(xiàn)于cdr3中。在cdr1中，在cdr2截短位點(diǎn)處(其中剩余環(huán)在分子底部形成帶狀結(jié)構(gòu))和在tcr中對(duì)應(yīng)于hv4的環(huán)中觀察到抗原接觸后的高體細(xì)胞突變率。因此，這些突變易發(fā)區(qū)域已分別被命名為hv2和hv4(參見(jiàn)例如dooley等人,pnas(usa)2006;103:1846-51)。

盡管與經(jīng)典抗體(跨越兩條鏈的六個(gè)環(huán))相比具有減少數(shù)目的可能的抗原結(jié)合環(huán)(跨越單鏈四個(gè)環(huán))，但vnar結(jié)構(gòu)域以令人驚訝地高親和力結(jié)合抗原。甚至從其中抗原結(jié)合僅由cdr3介導(dǎo)的主要譜，也可以產(chǎn)生以低納摩爾范圍內(nèi)的親和力針對(duì)給定抗原的vnar分子。然而，在用稱(chēng)為e06的抗白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫后，已觀察到對(duì)于vnar結(jié)構(gòu)域的最高記錄的親和力，達(dá)到皮摩爾水平的親和力(muller等人,mabs2012;4:673-85)。

基于相應(yīng)數(shù)目的非典型半胱氨酸殘基，vnar分子已被分類(lèi)為四種類(lèi)型。所有類(lèi)型都通常具有經(jīng)典的ig規(guī)范半胱氨酸，其經(jīng)由二硫鍵穩(wěn)定免疫球蛋白折疊。i型可變結(jié)構(gòu)域在框架區(qū)域2和4中攜帶額外的半胱氨酸，因此在cdr3中攜帶偶數(shù)數(shù)目的配偶體半胱氨酸殘基。與溶菌酶復(fù)合的i型vnar的晶體結(jié)構(gòu)的測(cè)定顯示，兩個(gè)非典型框架半胱氨酸各自與cdr3的那些形成二硫鍵，引起該環(huán)緊緊地保持在hv2的方向。到目前為止，僅在鉸口鯊(ginglymostomacirratum)中鑒定了ignar的i型可變結(jié)構(gòu)域。

ii型結(jié)構(gòu)域分別借助cdr1和cdr3中的另外的半胱氨酸而不同于i型，所述另外的半胱氨酸導(dǎo)致分子內(nèi)二硫鍵，其使兩個(gè)環(huán)密切接近。然而，ii型結(jié)構(gòu)域缺乏將cdr3錨定至i型vnar中的框架的兩個(gè)半胱氨酸基序。因此，cdr3區(qū)域形成突出的“手指狀”結(jié)構(gòu)，其傾向于結(jié)合至口袋或凹槽(例如，酶的活性位點(diǎn))中。

iii型結(jié)構(gòu)域在新生魚(yú)中表達(dá)。類(lèi)似于ii型結(jié)構(gòu)域，該同種型的特征在于分別在cdr1和cdr3中的另外的非經(jīng)典半胱氨酸。然而，與ii型相反，iii型結(jié)構(gòu)域包含受限制的cdr3多樣性，氨基酸組成和長(zhǎng)度高度相似，以及鄰近位于兩環(huán)之間二硫化物橋的cdr1中的保守的色氨酸殘基。

iv型結(jié)構(gòu)域不同于所有描述的vnar類(lèi)型，因?yàn)樗鼈儍H包含經(jīng)典二硫鍵。因此，iv型可變結(jié)構(gòu)域的互補(bǔ)位的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是更柔性的并且不受物理約束。iv型結(jié)構(gòu)域也稱(chēng)為iib型(streltsov等人pnas2004;101:12444-9;liu等人,molecularimmunology2007;44:1775-83)。

已經(jīng)鑒定了cdr1中具有不變色氨酸殘基的iv型結(jié)構(gòu)域，從而展現(xiàn)與iii型結(jié)構(gòu)域的一定相似性。除了iii型vnar結(jié)構(gòu)域外，所有類(lèi)型的vnar結(jié)構(gòu)域都會(huì)產(chǎn)生高親合力結(jié)合劑。

基于抗體的療法在癌癥治療中的用途在過(guò)去二十年中已經(jīng)變得良好確立，并且現(xiàn)在是用于治療具有血液惡性腫瘤和實(shí)體瘤的患者的最成功和重要的策略之一?；诳贵w的腫瘤療法的根本基礎(chǔ)是與正常組織相比過(guò)表達(dá)、突變或選擇性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的抗原表達(dá)。

大多數(shù)批準(zhǔn)用于在美國(guó)銷(xiāo)售的單克隆抗體(mab)靶向單細(xì)胞表面抗原，諸如例如，針對(duì)tnfα的阿達(dá)木單抗(humira;abbott/abbvie)，針對(duì)egfr的panitumumab(vectibix;amgen)，針對(duì)cd20的阿伐單抗(arzerra;genmab)。然而，腫瘤細(xì)胞通常上調(diào)不同的生長(zhǎng)促進(jìn)受體，其可以獨(dú)立地起作用或在細(xì)胞內(nèi)交叉對(duì)話。通過(guò)單特異性抗體靶向一種受體可導(dǎo)致與替代受體的上調(diào)以及途徑轉(zhuǎn)換相關(guān)的抗性(kontermann(2012)mabs4:2,182-197)，表明其可能有益于靶向或阻斷腫瘤細(xì)胞上的多種細(xì)胞表面抗原(靶標(biāo))。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到這一點(diǎn)，并且目前在臨床試驗(yàn)中存在超過(guò)15種雙特異性抗體，即靶向兩種不同細(xì)胞表面抗原的抗體(參見(jiàn)例如garber,natrevdrugdiscov.2014oct31;13(11):799-801)。然而，迄今為止的人雙特異性抗體僅能夠靶向平面或凹面抗原結(jié)合位點(diǎn)，從而排除可能治療更有效的抗原結(jié)合位點(diǎn)。

因此，鑒于人或人源化雙特異性抗體靶向的經(jīng)典表位的限制，對(duì)新型和有效的基于雙特異性抗體的癌癥治療劑存在持續(xù)需求。因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供克服目前抗原靶向的限制的新型雙特異性抗體。

發(fā)明概述

本發(fā)明人已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)將vnari型、ii型和iv型結(jié)構(gòu)域的高變區(qū)2(hv2)的氨基酸序列隨機(jī)化來(lái)獲得雙特異性vnar結(jié)構(gòu)域。因此，本發(fā)明提供了用于生成具有以下結(jié)構(gòu)的雙特異性鯊魚(yú)可變抗體結(jié)構(gòu)域(vnar結(jié)構(gòu)域)的方法：

fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4,

其中所述方法包括以下步驟：

a.將至少一個(gè)編碼高變區(qū)2(hv2)的多核苷酸序列隨機(jī)化，

b.檢測(cè)vnar結(jié)構(gòu)域，其中hv2以相比于參考樣品改變的親和力結(jié)合目標(biāo)抗原，且第二目標(biāo)抗原被由cdr3和cdr1形成的互補(bǔ)位特異性結(jié)合，

c.選擇(b)的vnar結(jié)構(gòu)域。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)本發(fā)明方法隨機(jī)化的vnar結(jié)構(gòu)域是vnari型、vnarii型或vnariv型之一。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的至少一個(gè)編碼所述vnar的多核苷酸上包含的編碼hv2的區(qū)域的多核苷酸的隨機(jī)化包括基于密碼子的隨機(jī)化、nnb隨機(jī)化、nnk隨機(jī)化、nns隨機(jī)化或偏倚隨機(jī)化。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，編碼根據(jù)本發(fā)明的hv2結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列包含核苷酸序列nnn1(nnn)7nnn9，其中

-位置1中的密碼子的50％編碼氨基酸賴(lài)氨酸，而剩余50％編碼除半胱氨酸以外的任何氨基酸，且

-密碼子2-8可以編碼任何氨基酸，且

-位置9中的密碼子的50％編碼氨基酸蘇氨酸，而剩余50％編碼除半胱氨酸以外的任何氨基酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)酵母表面展示、噬菌體展示、哺乳動(dòng)物展示或蛋白陣列之一檢測(cè)和/或選擇根據(jù)本發(fā)明的展示與第一抗原的親和力相比于參考樣品改變的vnar。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，根據(jù)本發(fā)明的vnar還包含可檢測(cè)標(biāo)簽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的vnar的可檢測(cè)標(biāo)簽位于vnar的氨基末端和/或羧基末端。

在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、facs、elisa或微流體檢測(cè)和/或選擇本發(fā)明vnar。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明方法的第一和第二目標(biāo)抗原是細(xì)胞表面抗原，優(yōu)選癌細(xì)胞表面抗原。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了融合蛋白，其包含根據(jù)本發(fā)明方法的隨機(jī)化hv2結(jié)構(gòu)域或包含根據(jù)本發(fā)明方法的隨機(jī)化hv2結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明vnar結(jié)構(gòu)域。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明融合蛋白包含igg-fc結(jié)構(gòu)域、vh、vl、vhh抗體結(jié)構(gòu)域或其片段之一。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明融合蛋白是人源化的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明融合蛋白的fc-結(jié)構(gòu)域包含人igg-fc結(jié)構(gòu)域或其序列變體。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明融合蛋白當(dāng)與所述第一目標(biāo)抗原和所述第二目標(biāo)抗原結(jié)合時(shí)，在體內(nèi)誘導(dǎo)adcc。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可通過(guò)本發(fā)明方法獲得的vnar。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了載體，其包含編碼本發(fā)明vnar或本發(fā)明融合體的多核苷酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白的方法，其中所述方法包括以下步驟：

-在足以使本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白蛋白表達(dá)的條件下，培養(yǎng)至少一種根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，和

-分離和純化本發(fā)明vnar蛋白或vnar融合蛋白。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了多核苷酸文庫(kù)，其包含多個(gè)編碼如本文公開(kāi)的本發(fā)明hv2結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明多核苷酸文庫(kù)包含多個(gè)編碼總體結(jié)構(gòu)fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4的i型、ii型或iv型vnar結(jié)構(gòu)域的多核苷酸，其中hv2結(jié)構(gòu)域由根據(jù)本發(fā)明的隨機(jī)化多核苷酸序列編碼。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含根據(jù)seqidno:2、seqidno:4、seqidno:5的氨基酸序列的雙特異性vnar。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明vnar或本發(fā)明融合蛋白在制備藥物中的用途。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含如本文公開(kāi)的本發(fā)明vnar或本發(fā)明vnar融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療患有病理狀況的個(gè)體的方法，其包括向有需要的個(gè)體施用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，待通過(guò)本發(fā)明方法治療的病理狀況是癌癥、自身免疫疾病或病毒感染。

在一個(gè)實(shí)施方案中，待通過(guò)本發(fā)明方法治療的個(gè)體具有腫瘤。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，待通過(guò)本發(fā)明方法治療的個(gè)體是人。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了部件試劑盒，其包含雙特異性vnar或本發(fā)明vnar融合蛋白，以及用于檢測(cè)本發(fā)明vnar的裝置。

附圖簡(jiǎn)述

圖1：顯示常規(guī)互補(bǔ)位(抗原結(jié)合位點(diǎn))的vnar分子。經(jīng)由hv2的隨機(jī)化引入新的抗原結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致產(chǎn)生靶向兩種不同抗原的雙特異性分子。

圖2：各種抗體分子(a)igg分子、(b、c)駱駝科動(dòng)物和軟骨魚(yú)抗體分子(其僅天然僅由重鏈組成)的抗體結(jié)構(gòu)。

圖3：抗體結(jié)構(gòu)的比較：vnar屬于ig超家族且具有β-夾心折疊，然而，相比于哺乳動(dòng)物v結(jié)構(gòu)域，該折疊僅由8個(gè)、而不是10個(gè)β-鏈組成，這是由于框架2-cdr2-區(qū)域中的缺失。因此，與哺乳動(dòng)物可變結(jié)構(gòu)域相反，vnar結(jié)構(gòu)域僅具有兩個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)cdr1和cdr3。主要vnar譜的多樣性主要發(fā)現(xiàn)于cdr3中。在cdr1中、cdr2截短位點(diǎn)處和tcr中對(duì)應(yīng)于hv4的環(huán)中觀察到高體細(xì)胞突變率。因此，這些突變易發(fā)區(qū)域已分別被命名為hv2和hv4。

圖4：已知的不同vnar類(lèi)型，包括i型、ii型、iii型和iv型。

圖5：酵母表面展示的說(shuō)明。vnar在釀酒酵母的表面上分別被呈遞為具有n-末端ha-表位和c-末端cmyc-標(biāo)簽的aga2p融合體，用于檢測(cè)表面表達(dá)。

圖6：用于同時(shí)結(jié)合epcam和cd3ε的文庫(kù)篩選。二維進(jìn)行分選。顯示了文庫(kù)篩選的第1輪和第4輪、分選門(mén)控以及靶濃度。

圖7：使用酵母表面展示驗(yàn)證雙特異性。與540nmepcam(黑色)或770nmcd3ε或僅與二級(jí)檢測(cè)試劑孵育的在其表面上表達(dá)vnarb1的酵母細(xì)胞。

圖8：epcam-和cd3ε-特異性vnar分子b1及其親本分子5005(僅epcam特異性)的序列。以灰色顯示hv2中的隨機(jī)化殘基。

圖9：(a)使用酵母表面展示驗(yàn)證雙特異性。與540nmepcam(黑色)或僅與二級(jí)檢測(cè)試劑(灰色)孵育的在其表面上表達(dá)vnarf1的酵母細(xì)胞，(b)使用酵母表面展示驗(yàn)證雙特異性。與約500nmfc-片段(黑色)或僅與二級(jí)檢測(cè)試劑(灰色)孵育的在其表面上表達(dá)vnarf1的酵母細(xì)胞。

圖10：包含竹鯊(chiloscylliumplagiosum)的vnar結(jié)構(gòu)域的殘基43-56的vnar結(jié)構(gòu)域表面暴露的環(huán)hv2的模型；殘基編號(hào)根據(jù)物種和vnar類(lèi)型而不同。

圖11：用于構(gòu)建具有隨機(jī)化hv2的插入物的soe-pcr方案。在2步pcr中生成插入片段。在第一步中，將vnar-片段擴(kuò)增直至hv2的5'末端(1a)。在第二步中，使用hv2rand_up引物將hv2隨機(jī)化。這導(dǎo)致產(chǎn)生在hv2編碼區(qū)的5'末端開(kāi)始至vnar分子編碼區(qū)的3'末端的片段。在第二pcr中，兩個(gè)片段充當(dāng)自身的引物，以導(dǎo)致全長(zhǎng)隨機(jī)化hv2vnar插入物以得到引物。在6個(gè)循環(huán)后，添加引物以生成足夠量的全長(zhǎng)插入物。

序列表

seqidno:1用于hv2結(jié)構(gòu)域的隨機(jī)化的人工多核苷酸

seqidno:2vnar克隆b1的氨基酸序列

seqidno:3親本vnar克隆5005的氨基酸序列

seqidno:4vnarepha2-fc的氨基酸序列

seqidno:5vnarepha2_4-fc的氨基酸序列

seqidno:6生物素-受體多肽的氨基酸序列

seqidno:7actev位點(diǎn)

seqidno:8寡核苷酸hv2rand_up

seqidno:9pct-seq-lo

seqidno:10pct-seq-up

seqidno:11hv2rand_soe-lo。

發(fā)明詳述

盡管下面詳細(xì)地描述了本發(fā)明，但要理解，本發(fā)明不限于本文所述具體的方法、方案和試劑，因?yàn)檫@些可改變。還要理解，本文所用術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體實(shí)施方案的目的，并無(wú)意限制僅由隨附權(quán)利要求書(shū)限定的本發(fā)明的范圍。除非另有說(shuō)明，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

下面，將描述本發(fā)明的要素。這些要素與具體實(shí)施方案一起列出，然而應(yīng)理解，它們可以任何方式和以任何數(shù)目組合以產(chǎn)生額外的實(shí)施方案。各個(gè)描述的實(shí)例和優(yōu)選的實(shí)施方案不應(yīng)解釋為僅將本發(fā)明限于明確描述的實(shí)施方案。該描述應(yīng)理解為支持和包括將明確描述的實(shí)施方案與任何數(shù)目的公開(kāi)的和/或優(yōu)選的要素組合的實(shí)施方案。此外，本申請(qǐng)中所有所描述的要素的任何排列和組合都應(yīng)視為通過(guò)本申請(qǐng)的描述而公開(kāi)，除非上下文中另有說(shuō)明。

在整個(gè)本說(shuō)明書(shū)和隨附的權(quán)利要求書(shū)中，除非上下文另有要求，否則術(shù)語(yǔ)“包含(comprise)”和變體諸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”應(yīng)理解為必然包括規(guī)定的成員、整數(shù)或步驟，但不排除任何其它未規(guī)定的成員、整數(shù)或步驟。術(shù)語(yǔ)“由……組成”是術(shù)語(yǔ)“包含”的一個(gè)具體實(shí)施方案，其中不包括任何其它未規(guī)定的成員、整數(shù)或步驟。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“包含”包括術(shù)語(yǔ)“由……組成”。

在描述本發(fā)明的上下文中(尤其在權(quán)利要求書(shū)的上下文中)使用的術(shù)語(yǔ)“一(a)”和“一(an)”和“該(the)”和類(lèi)似指代要解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)，除非本文另有說(shuō)明或上下文顯然抵觸。本文值的范圍的引述僅僅意在用作各別提及落入該范圍的每個(gè)單獨(dú)的值的簡(jiǎn)寫(xiě)方法。除非本文另有說(shuō)明，否則每個(gè)單獨(dú)的值都并入到本說(shuō)明書(shū)中，就像本文分別引述其一樣。本說(shuō)明書(shū)的用語(yǔ)都不應(yīng)解釋為說(shuō)明對(duì)實(shí)施本發(fā)明必要的任何非要求保護(hù)的要素。

在本說(shuō)明書(shū)的整個(gè)文本中引用了若干文件。本文引用的每份文件(包括所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、科技出版物、生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)、使用說(shuō)明等)，不論在上文還是在下文，都通過(guò)引用以其整體并入到本文中。本文任何東西都不得解釋為承認(rèn)本發(fā)明因在前的發(fā)明而無(wú)資格先于這類(lèi)公開(kāi)內(nèi)容。

所述目標(biāo)通過(guò)本發(fā)明、優(yōu)選通過(guò)隨附權(quán)利要求書(shū)的主題解決。發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，雙特異性vnar結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)本發(fā)明方法獲得，所述方法包括以下步驟：(a)將至少一個(gè)編碼高變區(qū)2(hv2)的多核苷酸序列隨機(jī)化，(b)檢測(cè)vnar結(jié)構(gòu)域，其中hv2以相比于參考樣品改變的親和力結(jié)合目標(biāo)抗原，且第二目標(biāo)抗原被由cdr3和cdr1形成的互補(bǔ)位特異性結(jié)合，和(c)選擇(b)的vnar結(jié)構(gòu)域。因此，本發(fā)明方法包括將至少一種編碼至少一種vnar的hv2結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列隨機(jī)化，和檢測(cè)vnar，其以相比于參考樣品改變的親和力結(jié)合第一目標(biāo)抗原和被由vnar結(jié)構(gòu)域的cdr1和cdr3形成的互補(bǔ)位結(jié)合的第二目標(biāo)抗原，隨后選擇vnar結(jié)構(gòu)域，其顯示對(duì)第一目標(biāo)抗原的改變的親和力。如本發(fā)明方法中使用的術(shù)語(yǔ)“vnar結(jié)構(gòu)域”是指由在軟骨魚(yú)(諸如例如鯊魚(yú)、ray和skate，例如鉸口鯊(ginglymostomacirratum)或竹鯊(c.plagiosum))中發(fā)現(xiàn)的ignar上存在的僅一個(gè)單一結(jié)構(gòu)域形成的抗原結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的vnar結(jié)構(gòu)域可以是如上所公開(kāi)或例如如kovaleva等人(2014),expertopinbiolther.oct;14(10):1527-39中所公開(kāi)的vnari型、vnarii型或vnariv型。

在本發(fā)明方法中，第一目標(biāo)抗原和第二目標(biāo)抗原可以是例如細(xì)胞表面抗原，其例如是指蛋白、多肽或肽，其中蛋白、多肽或肽的至少一個(gè)抗原部分暴露在生物膜的表面上，并且可以具有以下共價(jià)連接的部分中的一種或多種：一種或多種簡(jiǎn)單或復(fù)合糖部分(如在糖蛋白中)、脂質(zhì)部分(如在脂蛋白中)、脂質(zhì)和糖部分的組合或其他翻譯后修飾。“蛋白”通常是基于氨基酸的聚合物的長(zhǎng)鏈(“多肽”)。蛋白可以由一條、兩條或更多條多肽鏈構(gòu)成，并且可以進(jìn)一步含有與多肽鏈結(jié)合的一些其他類(lèi)型的物質(zhì)(諸如碳水化合物)。蛋白的大小涵蓋5,000至幾十萬(wàn)克/摩爾(的任意數(shù)字)的相當(dāng)寬的范圍。用于本發(fā)明方法的術(shù)語(yǔ)目標(biāo)抗原或細(xì)胞表面抗原還包括例如受體酪氨酸激酶，諸如例如pdgfr、egfr、vegfr、hgfr、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子r、her2、her3、her4、胰島素r、igfr、csfir、flk、kdr、vegfr2、cck4、met、trka、axl、tie、eph、ryk、ddr、ros、ret、ltk或musk。本發(fā)明方法中的目標(biāo)抗原可以例如還包含聚糖，其中術(shù)語(yǔ)“聚糖”是指由糖苷連接的大量單糖組成的化合物。例如，聚糖可以包括糖胺聚糖，其包含以交替形式與糖醛酸連接的2-氨基糖，并且包括聚合物諸如肝素、硫酸乙酰肝素、軟骨素、角蛋白和皮膚素。在本發(fā)明方法中，第一目標(biāo)抗原和第二目標(biāo)抗原可以例如位于相同分子或細(xì)胞表面抗原上，或者第一和第二目標(biāo)抗原可以位于兩個(gè)不同的分子上，例如，第一目標(biāo)抗原可以由細(xì)胞表面蛋白或蛋白片段形成，而第二目標(biāo)抗原可以由非蛋白細(xì)胞表面抗原諸如聚糖形成。本發(fā)明的第一和第二目標(biāo)抗原還可以是腫瘤抗原或細(xì)胞表面癌細(xì)胞抗原、腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原，其包含例如由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的任何免疫原性表位。所述蛋白可以由非腫瘤細(xì)胞表達(dá)，但僅當(dāng)由腫瘤細(xì)胞表達(dá)時(shí)才例如由于改變(增加或減少)的糖基化而具有免疫原性?；蛘?，所述蛋白可以由腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞、但非正常細(xì)胞表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤抗原、細(xì)胞表面癌細(xì)胞抗原或腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原是人腫瘤抗原。例如，腫瘤抗原可以包括黑色素瘤相關(guān)的硫酸軟骨素蛋白聚糖(mcsp,uniprotq6uvk1,ncbi登錄np001888)、成纖維細(xì)胞活化蛋白(fap,uniprotq12884,q86z29,q99998;ncbi登錄np004451)、表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr，也稱(chēng)為erbb1和herl,uniprotp00533;ncbi登錄np_958439,np_958440)、癌胚抗原(cea，也稱(chēng)為癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子5或cd66e;uniprotp06731,ncbi登錄np004354)和cd33(也稱(chēng)為gp76或唾液酸結(jié)合的ig樣凝集素3(siglec-3),uniprotp20138,ncbi登錄np001076087,np001171079)。

如用于本發(fā)明方法，術(shù)語(yǔ)“改變的”或“改變的親和力”包括通過(guò)例如由vnarhv2形成的互補(bǔ)位，或例如通過(guò)由vnarcdr1和cdr3形成的互補(bǔ)位的vnar與一種或多種目標(biāo)抗原(例如一種、兩種、三種或四種目標(biāo)抗原)的結(jié)合常數(shù)的變化。例如，改變的親和力可以包括與給定目標(biāo)抗原的降低或增加的親和力，優(yōu)選與目標(biāo)抗原(可含有線性和/或不連續(xù)的)的增加的親和力。片段的長(zhǎng)度沒(méi)有臨界上限，其可以(例如)包含抗原序列的幾乎全長(zhǎng)，或甚至包含來(lái)自靶抗原的兩個(gè)或更多個(gè)表位的融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，vnarhv2結(jié)構(gòu)域與第一目標(biāo)抗原的改變的親和力是至少例如10^-7m、2.5x10^-7m、5x10^-7m、7.5x10^-7m、1x10^-8m、2.5x10^-8m、5x10^-8m、7.5x10^-8m、10^-9m、2.5x10^-9m、5x10^-9m、7.5x10^-9m、10^-10m、2.5x10^-10m、5x10^-10m、7.5x10^-10m、10^-11m、2.5x10^-11m、5x10^-11m、7.5x10^-11m或10^-12m。

與本發(fā)明方法一起使用的術(shù)語(yǔ)隨機(jī)化是指產(chǎn)生多個(gè)序列的方法，其中一個(gè)或幾個(gè)位置已被隨機(jī)化。在一些實(shí)施方案中，隨機(jī)化是完全的(即，所有四個(gè)核苷酸，a、t、g和c可以在隨機(jī)化位置發(fā)生。在替代實(shí)施方案中，核苷酸的隨機(jī)化限于四個(gè)核苷酸的子集。隨機(jī)化可以應(yīng)用于編碼高變區(qū)2(hv2)的多核苷酸序列的一個(gè)或幾個(gè)密碼子。當(dāng)表達(dá)時(shí)，所得文庫(kù)產(chǎn)生hv2群體，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置可以含有所有20個(gè)氨基酸或氨基酸的子集的混合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中編碼hv2的多核苷酸序列(hv2編碼區(qū))的隨機(jī)化可以包括基于密碼子的隨機(jī)化、nnb隨機(jī)化、nnk隨機(jī)化、nns隨機(jī)化或偏倚隨機(jī)化。例如，如本發(fā)明方法中使用的基于密碼子的隨機(jī)化可以根據(jù)由gaytan等人(1998)chemistry&biology5:519-527描述的方法或根據(jù)monroy-lagos等人(2006),appliedandenvironmentalmicrobiology,may2006,p.3797–3801)進(jìn)行。在本發(fā)明方法中，nnb隨機(jī)化是指在前兩個(gè)位置具有每種核苷酸的25％和在第三位置具有c、t和g的33％的簡(jiǎn)并密碼子。tyr/ser是指酪氨酸和絲氨酸的均勻混合物。例如，如本發(fā)明方法中使用的“nnk隨機(jī)化”可用于產(chǎn)生單一氨基酸變體，其中“n”是指任何堿基(例如a、c、g或t)，而“k”是指g或t。nnk隨機(jī)化方案可以編碼覆蓋所有20種天然存在的氨基酸的32種不同的密碼子。蛋白的各位置的氨基酸殘基可以被突變?yōu)椴煌谙嗤恢玫囊吧桶被岬?9種氨基酸中的任一種，導(dǎo)致沿著蛋白的單一氨基酸點(diǎn)突變。最終結(jié)果是蛋白變體文庫(kù)，其涵蓋具有在文庫(kù)中成員與成員不同的一個(gè)殘基的多個(gè)蛋白的組。

例如，為了減少本發(fā)明方法中編碼本發(fā)明雙特異性vnar的hv結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的隨機(jī)化中的終止密碼子的頻率，可以包括nns隨機(jī)化，其中n表示待包括的隨機(jī)三聯(lián)體的數(shù)目，n代表任何核苷酸，s代表標(biāo)準(zhǔn)iupac核苷酸命名中的c或g。由于三個(gè)終止密碼子中的兩個(gè)(tga和taa)在第三位置具有a，所以預(yù)期nns策略相比于nnn策略將終止密碼子的頻率從3/64降低至1/32。本發(fā)明方法中的隨機(jī)化可以例如，也是偏倚隨機(jī)化，例如序列中的一些位置保持不變，或者選自有限數(shù)量的可能性。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，包含hv2編碼區(qū)的隨機(jī)多核苷酸的第一個(gè)和最后一個(gè)密碼子可以進(jìn)行偏倚隨機(jī)化，例如，第一密碼子可以包含除了tgt、tgc之外的所有密碼子，并且最后一個(gè)密碼子可以是除了tgt、tgc之外的任何密碼子，而在用于第一密碼子的密碼子的50％中，第一密碼子可以選自tta、ttg、ctt、ctc、cta、ctg，而第二密碼子可以選自act、acc、aca、acg。

在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼hv2結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列包含根據(jù)seqidno:1的核苷酸序列，其可以例如根據(jù)上面公開(kāi)的任何隨機(jī)化技術(shù)隨機(jī)化。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的第一個(gè)密碼子可以在50％的多核苷酸中編碼氨基酸賴(lài)氨酸，例如，在50％的多核苷酸中，所述密碼子選自aaa或aag，而在50％的多核苷酸中，可以存在任何密碼子，除了編碼半胱氨酸的tgt、tgc。編碼根據(jù)本發(fā)明的hv2結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的密碼子2-8可以編碼任何氨基酸，例如，除taa、tag或tga以外，可存在任何密碼子。編碼根據(jù)本發(fā)明的hv2結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的密碼子9可以在50％的多核苷酸中編碼氨基酸蘇氨酸，例如，在50％的多核苷酸中，所述密碼子選自act、acc、aca或acg，除了tgt、tgc之外，可存在任何密碼子。例如，根據(jù)seqidno:1的多核苷酸序列可以包含在寡核苷酸序列(諸如例如，根據(jù)seqidno:8的寡核苷酸序列)中，其可以用于基于pcr的技術(shù)(例如soepcr)中以產(chǎn)生多核苷酸文庫(kù)，其包含或編碼包含隨機(jī)化hv2結(jié)構(gòu)域的vnar蛋白。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，vnar文庫(kù)可以例如使用例如omniscript?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(qiagen)和odt-寡核苷酸從作為用于cdna合成的模板的來(lái)自鯊魚(yú)的總rna獲得。pcr擴(kuò)增的vnar產(chǎn)物可以例如用作用于半合成文庫(kù)構(gòu)建的起始材料。初始文庫(kù)可以例如在三個(gè)連續(xù)的pcr步驟中建立(參見(jiàn)例如所附實(shí)施例中，或例如zielonka,s.等人(2014)journalofbiotechnology)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)酵母表面展示、噬菌體展示、哺乳動(dòng)物展示或蛋白陣列之一檢測(cè)和/或選擇本發(fā)明的展示與第一抗原的親和力相比于參考樣品改變的vnar。因此，本發(fā)明方法包括例如使包含隨機(jī)化hv2結(jié)構(gòu)域的vnar進(jìn)行酵母表面展示、噬菌體展示、哺乳動(dòng)物展示或蛋白陣列之一。例如，編碼包含根據(jù)本發(fā)明的隨機(jī)化hv2結(jié)構(gòu)域的vnar的多核苷酸可以進(jìn)行酵母展示以檢測(cè)和選擇與第一抗原的親和力相比于參考樣品改變的vnar。例如，酵母展示可以根據(jù)如rakestraw(參見(jiàn)rakestraw(2011)proteinengineering,design&selectionvol.24,no.6:525-530)提供的方法進(jìn)行。例如，可以將至少一種編碼本發(fā)明的vnar的多核苷酸例如克隆入secant載體中，由此經(jīng)由例如actev蛋白酶位點(diǎn)(enlyfqg)將本發(fā)明vnar與生物素-受體肽(bap:glndifeaqkiewhe)基因融合。載體可以例如還包含與vnar5'可操作連接的標(biāo)簽，諸如例如flag標(biāo)簽(sigma)或myc標(biāo)簽。標(biāo)簽和與之可操作連接的5'可以例如是前導(dǎo)序列，諸如源自wtαmfpp的前導(dǎo)序列。表達(dá)盒可以例如3'克隆，并在低拷貝prs314酵母/大腸桿菌穿梭載體(atccmanassas,va,usa)中與gal10(半乳糖誘導(dǎo)型)啟動(dòng)子可操作連接以產(chǎn)生具有不同分泌型前導(dǎo)序列和bap取向的載體組。所有載體都可以例如含有kpni和mlui限制性位點(diǎn)側(cè)接的克隆位點(diǎn)，其便于在actev/bap和flag標(biāo)簽之間引入poi。宿主菌株(源自bj5464a)表達(dá)負(fù)責(zé)將生物素連接至bap標(biāo)簽上的大腸桿菌bira生物素連接酶。bira(codondevices,inc.)攜帶c末端his-asp-glu-leu內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號(hào)序列，并通過(guò)融合至酵母轉(zhuǎn)化酶分泌前導(dǎo)序列而引導(dǎo)至分泌途徑，并在細(xì)胞色素c(cyc1)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。蛋白二硫化物異構(gòu)酶(pdi)在adh1啟動(dòng)子的控制下共表達(dá)。bira和pdi基因可以例如分別克隆至prs306和prs305載體(atcc)中，然后其可以例如穩(wěn)定地整合至酵母染色體中以產(chǎn)生jac100hsecant表面展示菌株(mata,trp1,pep4::his3,dpdb1,adh-pdi::leu2,cyc1-bira::ura3)。酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以例如通過(guò)如所附實(shí)施例中所概述的根據(jù)benatuil等人(2011)proteinengineering,design&selectionvol.23,4:155-159的方法或例如根據(jù)rakestraw等人進(jìn)行，例如如下：ez酵母轉(zhuǎn)化試劑盒(zymoresearch,orange,ca,usa)可用于用含有本發(fā)明多核苷酸的secant載體轉(zhuǎn)化jac100h展示菌株。然后可以在30℃下在sc葡萄糖、trp2板(teknova,hollister,ca,usa)上選擇轉(zhuǎn)化體2天。然后可以挑取單個(gè)菌落并將其接種至5ml補(bǔ)充有生物素(2％葡萄糖、0.67％酵母氮堿、0.54%na2hpo4、0.86%nah2po4.h2o、0.5％酪蛋白氨基酸和2.5mg/l生物素)的合成右旋糖酪蛋白氨基酸(sd-caa)氨基酸，并且可以例如在30℃下生長(zhǎng)過(guò)夜。一旦培養(yǎng)物已例如生長(zhǎng)至od600~0.5；可以將其沉淀，然后重懸浮于5ml磷酸鹽緩沖、生物素補(bǔ)充酵母提取物、蛋白胨、半乳糖(ypg)培養(yǎng)基(2％半乳糖、2％蛋白胨、1％酵母提取物、0.025％牛血清白蛋白(bsa)、0.54%na2hpo4、0.86%nah2po4.h2o和2.5mg/l生物素)。然后可以例如將培養(yǎng)物在20℃下?lián)u動(dòng)24小時(shí)。這種ypg中的孵育開(kāi)始poi的生產(chǎn)和生物素化，并被稱(chēng)為“預(yù)誘導(dǎo)”。

在預(yù)誘導(dǎo)后，可以取出2x10⁷個(gè)細(xì)胞用于抗生物素蛋白標(biāo)記：例如，可以將細(xì)胞首先沉淀并在1ml碳酸鹽緩沖液(4.2%nahco3和0.034%na2co3,ph?8.4)中洗滌三次，然后通過(guò)在室溫下在溶解于40ml碳酸鹽緩沖液中的4mg(40ml干體積)3.4kdanhs-peg-生物素(laysanbio,arab,al,usa)中孵育15分鐘而生物素化。在生物素標(biāo)記后，可以將細(xì)胞沉淀并在1ml磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)/bsa(1mg/ml)中洗滌三次。在預(yù)誘導(dǎo)后，可以取出2x10⁷個(gè)細(xì)胞用于抗生物素蛋白標(biāo)記(圖1b)。例如，可以將細(xì)胞例如首先沉淀并在1ml碳酸鹽緩沖液(4.2%nahco3和0.034%na2co3,ph?8.4)中洗滌三次，然后通過(guò)在室溫下在溶解于40ml碳酸鹽緩沖液中的4mg(40ml干體積)3.4kdanhs-peg-生物素(laysanbio,arab,al,usa)中孵育15分鐘而生物素化。在生物素標(biāo)記后，可以將細(xì)胞例如沉淀并在1ml磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)/bsa(1mg/ml)中洗滌三次。然后可以例如通過(guò)向每個(gè)孔中添加1mlpbs/bsa并在室溫下孵育2分鐘而從板中洗滌細(xì)胞。然后可以例如通過(guò)上下移液而將細(xì)胞懸浮于pbs/bsa中并轉(zhuǎn)移至1.5ml管。任何剩余的細(xì)胞可以例如通過(guò)至少一次額外應(yīng)用1mlpbs/bsa而從板收集，然后轉(zhuǎn)移至1.5ml管。然后可以例如將細(xì)胞沉淀，在1mlpbs/bsa中洗滌三次并置于冰上。然后可以例如將細(xì)胞懸浮于40μl20mg/ml抗生物素蛋白(sigma)中，并可以在室溫下孵育10分鐘。預(yù)先誘導(dǎo)、但未用抗生物素蛋白標(biāo)記的細(xì)胞將可溶性、生物素化蛋白直接分泌至培養(yǎng)基中。在抗生物素蛋白標(biāo)記后，可以將細(xì)胞沉淀，在1mlpbs/bsa中洗滌兩次，并重懸浮于50μlpbs/bsa中?？梢岳鐚⒍逦⑸募?xì)胞接種至1.2ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基中并充分渦旋。通過(guò)將ypg/bsa(2％半乳糖、2％蛋白胨、1％酵母提取物和0.025％bsa)通過(guò)抗生物素蛋白-瓊脂糖柱(pierce,rockford,il,usa)以除去培養(yǎng)基中天然發(fā)現(xiàn)的生物素來(lái)制備誘導(dǎo)培養(yǎng)基。然后，將20.6w/v%(對(duì)于hsa)或11w/v%8kda聚乙二醇(sigma)溶解于3ml生物素-過(guò)濾的培養(yǎng)基中，并用0.2μm注射器過(guò)濾器(bectondickinson,franklinlakes,nj,usa)過(guò)濾除菌。最后，可以例如添加100mg/ml抗生物素蛋白至1mg/ml的最終濃度。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中混合細(xì)胞后，可以例如將1.2ml培養(yǎng)基/細(xì)胞懸浮液添加至六孔板(bectondickinson)的一個(gè)孔中，并在20℃或25℃下孵育16小時(shí)而不搖動(dòng)。該誘導(dǎo)允許細(xì)胞分泌生物素化的蛋白，其然后將被表面結(jié)合的抗生物素蛋白捕獲。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可以例如通過(guò)噬菌體展示檢測(cè)和/或選擇本發(fā)明的展示與第一抗原的親和力相比于參考樣品改變的vnar。

如本文所用，“噬菌體展示”描述了體外選擇技術(shù)，其中根據(jù)本發(fā)明的vnar結(jié)構(gòu)域或例如，包含本發(fā)明的hv2結(jié)構(gòu)域的融合蛋白被基因融合至噬菌體的衣殼蛋白，導(dǎo)致在噬菌體病毒粒子的外部展示融合的蛋白，而編碼融合蛋白或肽的dna位于病毒粒子內(nèi)。展示的蛋白和其編碼dna之間的該物理連接允許篩選大量本發(fā)明的vnarhv2結(jié)構(gòu)域的變體，或例如包含本發(fā)明vnar結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。例如，噬菌體展示可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方案(諸如例如engberg等人.(1996)molbiotechnol.dec;6(3):287-310的方案)進(jìn)行。

在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)哺乳動(dòng)物展示檢測(cè)和/或選擇本發(fā)明的展示與第一抗原的親和力相比于參考樣品改變的vnar。例如，用于哺乳動(dòng)物酵母展示的任何方案或技術(shù)可用于本發(fā)明方法，諸如例如，wo2008/070367a2中公開(kāi)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白陣列例如也可用于檢測(cè)和/或選擇本發(fā)明vnar結(jié)構(gòu)域，或例如包含本發(fā)明vnar結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明融合蛋白。如本發(fā)明方法中使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白陣列”是指蛋白陣列、蛋白微陣列或蛋白納米陣列。蛋白陣列可以包括例如"protoarray?"，人類(lèi)蛋白高密度陣列(invitrogencorporation，可在互聯(lián)網(wǎng)得自lnvitrogen.com)。protoarray?高密度蛋白陣列可用于篩選復(fù)雜生物混合物，諸如血清，以測(cè)定針對(duì)人蛋白的自身抗體的存在。術(shù)語(yǔ)“蛋白芯片”可以與本發(fā)明方法中的蛋白陣列同義使用。如本發(fā)明方法中使用的術(shù)語(yǔ)“參考樣品”是指至少一個(gè)或多個(gè)，例如，至少10、100、10³、10⁴、10⁵或10⁶個(gè)未被隨機(jī)化的vnar結(jié)構(gòu)域，或者是指例如至少10、100、10³、10⁴、10⁵或10⁶個(gè)在其表面上展示至少一個(gè)vnar結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞，例如，10、100、10³、10⁴、10⁵或10⁶個(gè)未被隨機(jī)化且其中與第一目標(biāo)抗原結(jié)合未改變的vnar結(jié)構(gòu)域。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明vnar結(jié)構(gòu)域包含可檢測(cè)標(biāo)簽。如本發(fā)明方法中所用的術(shù)語(yǔ)可檢測(cè)標(biāo)簽是指與本發(fā)明vnar結(jié)構(gòu)域共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的部分。根據(jù)本發(fā)明的標(biāo)簽可以例如是可以直接(即，一級(jí)標(biāo)記)或間接(即二級(jí)標(biāo)簽)檢測(cè)的分子；例如，可以顯現(xiàn)和/或測(cè)量或以其他方式識(shí)別標(biāo)簽，使得可以知道其存在或不存在。示例性標(biāo)記包括熒光標(biāo)記(例如綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白等)和標(biāo)記酶，或者例如光學(xué)可檢測(cè)的標(biāo)記、結(jié)合對(duì)的配偶體和表面底物結(jié)合分子(或附接標(biāo)簽)。如技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)，取決于如何使用標(biāo)簽，許多分子可以用作多于一種類(lèi)型的標(biāo)簽。在一個(gè)實(shí)施方案中，如下所述的標(biāo)簽或標(biāo)記作為融合蛋白并入多肽。根據(jù)本發(fā)明的可檢測(cè)標(biāo)簽可以例如還包括多肽，其提供為本發(fā)明的嵌合vnar分子的一部分，所述本發(fā)明的嵌合vnar分子包含與另一個(gè)異源多肽或氨基酸序列融合的第一多肽(例如本發(fā)明vnar結(jié)構(gòu)域)。在一個(gè)實(shí)施方案中，此嵌合vnar分子包含第一多肽與標(biāo)簽多肽的融合體?？蓹z測(cè)標(biāo)簽可以由多肽諸如flag、his、myc、ha、v5標(biāo)簽、s-標(biāo)簽、sbp標(biāo)簽或strep-標(biāo)簽組成，或者可以例如包含蛋白標(biāo)簽，諸如例如gst-標(biāo)簽、mbp-標(biāo)簽、gfp-標(biāo)簽。

根據(jù)本發(fā)明的可檢測(cè)標(biāo)簽可以例如存在于本發(fā)明vnar結(jié)構(gòu)域或在vnar結(jié)構(gòu)域的氨基或羧基末端包含本發(fā)明vnar結(jié)構(gòu)域的融合蛋白(例如，融合蛋白可以包含至少一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的vnar結(jié)構(gòu)域)或例如包含至少一個(gè)本發(fā)明vnar結(jié)構(gòu)域的融合蛋白上。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的vnar結(jié)構(gòu)域的檢測(cè)和/或選擇包含流式細(xì)胞術(shù)、facs、elisa或微流體。如本發(fā)明方法中使用的術(shù)語(yǔ)“選擇”是指鑒定和/或分離vnar結(jié)構(gòu)域或例如包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的vnar結(jié)構(gòu)域的融合蛋白或例如在其表面上展示本發(fā)明vnar或例如包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的vnar結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的過(guò)程。本發(fā)明方法中的選擇可包括技術(shù)人員已知的各種技術(shù)，諸如例如免疫淘選(immuno-panning)(參見(jiàn)例如wysocki等人,proc.nati.acad.sci.usa第75卷,第6期,第2844-2848頁(yè),1978年6月)、磁激活的細(xì)胞分選(macs)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光激活的細(xì)胞分選(facs)或基于微滴的微流體法(參見(jiàn)例如mazutis等人,2013,natureprotocols8,870–891)。本發(fā)明的選擇細(xì)胞可作為選擇的一部分，例如與通過(guò)上文所公開(kāi)的方法從不在其表面展示目標(biāo)蛋白的宿主細(xì)胞分離或分開(kāi)。例如，facs可用來(lái)將細(xì)胞分選至不同的小瓶或容器中，或macs可用來(lái)分離在其表面上展示蛋白的宿主細(xì)胞，或基于微滴的微流體法可用來(lái)選擇和分離在其表面上展示目標(biāo)蛋白的根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，第一目標(biāo)抗原可以是細(xì)胞表面抗原，優(yōu)選癌細(xì)胞表面抗原或癌細(xì)胞表面抗原，諸如上述公開(kāi)的那些。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明vnar結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。例如，本發(fā)明融合蛋白可以包含以下結(jié)構(gòu)fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4的vnar結(jié)構(gòu)域，其中fwx表示框架x，cdrx表示互補(bǔ)決定區(qū)x，hv2表示本發(fā)明hv2結(jié)構(gòu)域，例如根據(jù)本發(fā)明的隨機(jī)化hv2結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明vnar結(jié)構(gòu)域可以是例如融合的fc結(jié)構(gòu)域。如用于本發(fā)明方法中的術(shù)語(yǔ)“fc結(jié)構(gòu)域”或“fc區(qū)”是指免疫球蛋白的一部分，例如與通過(guò)木瓜蛋白酶消化igg分子獲得的可結(jié)晶片段有關(guān)的igg分子。fc區(qū)包含通過(guò)二硫鍵連接的igg分子的2條重鏈的c末端一半。它沒(méi)有抗原結(jié)合活性，但含有碳水化合物部分以及補(bǔ)體和fc受體(包括fcrn受體)的結(jié)合位點(diǎn)。

fc結(jié)構(gòu)域包含通過(guò)二硫鍵連接的igg分子的2條重鏈的c末端一半。它沒(méi)有抗原結(jié)合活性，但含有碳水化合物部分以及補(bǔ)體和fc受體(包括fcrn受體)的結(jié)合位點(diǎn)。“fc結(jié)構(gòu)域”包括例如天然序列fc區(qū)和變體fc區(qū)，例如諸如公開(kāi)于wo02/094852中那些)，以及在fc結(jié)構(gòu)域的多個(gè)位置，包括但不限于位置270、272、312、315、356和358觀察到多態(tài)性。在本發(fā)明方法內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“fc”可指分離的這個(gè)區(qū)域或在抗體、抗體片段或fc融合蛋白的背景下的這個(gè)區(qū)域。

例如，iggfc區(qū)可包含iggch2和iggch3結(jié)構(gòu)域。人iggfc區(qū)的“ch2結(jié)構(gòu)域”通常從約位置231的氨基酸殘基延伸到約位置340的氨基酸殘基，其中碳水化合物鏈可與ch2結(jié)構(gòu)域連接。“ch3結(jié)構(gòu)域”可包含氨基酸c末端至fc區(qū)中的ch2結(jié)構(gòu)域的一段，例如從igg的約位置341的氨基酸殘基至約位置447的氨基酸殘基。所述融合蛋白可以例如還包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明vnar結(jié)構(gòu)域與血清白蛋白、優(yōu)選人血清白蛋白的融合體。本發(fā)明融合蛋白可以例如包含vnar結(jié)構(gòu)域作為氨基末端融合體或作為羧基末端融合體。例如，本發(fā)明融合蛋白還可以包含多于一個(gè)vndar結(jié)構(gòu)域，例如，本發(fā)明融合蛋白可以包含兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)本發(fā)明vnar結(jié)構(gòu)域，例如，通過(guò)與相應(yīng)融合蛋白的氨基和羧基末端融合。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明融合蛋白包含人fc結(jié)構(gòu)域或其序列變體。因此，本發(fā)明融合蛋白可以包含如上文所公開(kāi)的fc結(jié)構(gòu)域或其序列變體。本發(fā)明fc-vnar融合蛋白的fc結(jié)構(gòu)域的序列變體與如上文所公開(kāi)的fc結(jié)構(gòu)域具有至少80%、85%、90%、95%或98%或約92%至約98%、例如92%、93%、94%、95%、96%、97%或98％同一性?？梢匀缟纤鲇?jì)算本發(fā)明fc融合蛋白的序列相似性。序列相似性可以在fc結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的整個(gè)長(zhǎng)度上計(jì)算，但也可以在以下氨基酸序列的任何部分或位置上計(jì)算：長(zhǎng)度為10-200個(gè)氨基酸或110-190個(gè)氨基酸或120-180個(gè)氨基酸或130-170個(gè)氨基酸或140-160個(gè)氨基酸或10-100個(gè)氨基酸或20-90個(gè)氨基酸、30-80個(gè)氨基酸、40-70個(gè)氨基酸、50-60個(gè)氨基酸，例如長(zhǎng)度為約15-55個(gè)氨基酸或長(zhǎng)度為約25-115個(gè)氨基酸或長(zhǎng)度為約35-95個(gè)氨基酸或長(zhǎng)度為約45-85個(gè)氨基酸或長(zhǎng)度為約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、34、35、36、37、38、39、40、42、46、48、51、54、56、57、59或60個(gè)氨基酸。

例如，本發(fā)明融合蛋白或如本發(fā)明中公開(kāi)的任何蛋白的氨基酸序列的序列同一性定義為在比對(duì)序列和必要時(shí)引入空位以獲得最大百分比序列同一性后，且不考慮任何保守取代作為序列同一性的一部分，與本發(fā)明的目標(biāo)蛋白中的氨基酸殘基相同的候選序列中的氨基酸殘基的百分比。可用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的各種方式，諸如應(yīng)用可公開(kāi)獲得的計(jì)算機(jī)軟件諸如blast、blast-2、align、align-2或megalign(dnastar)軟件，實(shí)現(xiàn)用于測(cè)定百分比氨基酸序列同一性的目的的比對(duì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定用于測(cè)量比對(duì)的合適參數(shù)，包括實(shí)現(xiàn)所比較序列全長(zhǎng)內(nèi)的最大比對(duì)所需的任何算法。

例如，還可通過(guò)公開(kāi)于altschul等,bullmath.bio.48:603(1986)和henikoff和henikoff,proc.natlacad.sci.usa1992nov15；89(22):10915-9中的方法，測(cè)定百分比序列同一性。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使用10的空位開(kāi)放罰分(gapopeningpenalty)、1的空位延伸罰分(gapextensionpenalty)和下文公開(kāi)的henikoff和henikoff的“blosum62”評(píng)分矩陣(氨基酸用標(biāo)準(zhǔn)一字母代碼表示)，對(duì)2個(gè)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)以使比對(duì)評(píng)分最優(yōu)化。然后如下計(jì)算百分比同一性：([相同匹配的總數(shù)]/[較長(zhǎng)序列的長(zhǎng)度加引入較長(zhǎng)序列中以比對(duì)2個(gè)序列的空位數(shù)])*100)。

例如，可獲得的其它確立的算法可用來(lái)比對(duì)和測(cè)定兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列的相似性。pearson和lipman的“fasta”相似性搜索算法是用于檢查兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列共享的同一性水平的合適的蛋白比對(duì)方法(參見(jiàn)例如pearson和lipman,proc.natl.acad.sci.usa&5:2444(1988)和pearson,meth.enzymol.183:63(1990))。簡(jiǎn)單地說(shuō)，fasta首先通過(guò)鑒定具有最高同一性密度(densityofidentities)(如果ktup變量為1)或成對(duì)同一性(pairsofidentities)(如果ktup=2)的查詢(xún)序列和測(cè)試序列共有的區(qū)域，來(lái)表征序列相似性，而不考慮保守氨基酸取代、插入或缺失。然后通過(guò)使用氨基酸取代矩陣比較所有配對(duì)氨基酸的相似性，對(duì)具有最高同一性密度的10個(gè)區(qū)重新評(píng)分，并“修整”各區(qū)的末端以?xún)H包括有助于最高評(píng)分的那些殘基。如果有其評(píng)分大于“截止值(根據(jù)序列的長(zhǎng)度和ktup值通過(guò)預(yù)先確定的方程式計(jì)算)”的幾個(gè)區(qū)，則檢測(cè)修整的起始區(qū)以確定各區(qū)是否可連接以形成具有空位的近似比對(duì)。最后，利用needleman-wunsch-sellers算法的修改(needleman和wunsch,j.molbiol.48:444(1970)；sellers,siamj.appl.math.25:787(1974))(其允許氨基酸插入和缺失)，對(duì)2個(gè)氨基酸序列的最高評(píng)分區(qū)進(jìn)行比對(duì)。fasta分析的說(shuō)明性參數(shù)為：ktup=1，空位開(kāi)放罰分=10，空位延伸罰分=1，取代矩陣=blosum62?？扇鏿earson,meth.enzymol.183:63(1990)的附錄2中所解釋?zhuān)ㄟ^(guò)修改評(píng)分矩陣文件(“smatrk”)，將這些參數(shù)引入fasta程序。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白可以包含本發(fā)明hv2結(jié)構(gòu)域與vh抗體的融合體，例如，通過(guò)cdr2和cdr3之間的同框融合，由此替代cdr2和cdr3之間的β-折疊，或例如hv2可以包括在β-折疊中。本發(fā)明hv2-結(jié)構(gòu)域也可以通過(guò)接枝至其他免疫球蛋白(諸如例如，igm型抗體)上，或可以例如與vhh抗體融合，代替vhh結(jié)構(gòu)域。

在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在體內(nèi)與第一和第二目標(biāo)抗原結(jié)合時(shí)，例如，當(dāng)本發(fā)明雙特異性融合蛋白與腫瘤或癌細(xì)胞上的第一和第二抗原結(jié)合、例如與如上所公開(kāi)的癌細(xì)胞表面抗原結(jié)合時(shí)，本發(fā)明融合蛋白誘導(dǎo)adcc。如用于本發(fā)明融合蛋白的術(shù)語(yǔ)adcc(抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性)是指細(xì)胞介導(dǎo)的免疫防御的機(jī)制，其中免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞活性地裂解靶細(xì)胞，其膜表面抗原已被特異性抗體結(jié)合。adcc通過(guò)例如在nk細(xì)胞上表達(dá)的cd16(fcγriii)與抗體的fc結(jié)構(gòu)域的結(jié)合來(lái)介導(dǎo)(參見(jiàn)例如clynes等人(2000)naturemedicine6,443-446)。adcc可以例如通過(guò)影響fc結(jié)構(gòu)域與cd16結(jié)合的fc結(jié)構(gòu)域中的氨基酸取代而得到改善。例如，shields等人(jbiolchem9(2),6591-6604(2001))顯示fc區(qū)的位置298、333和/或334的氨基酸取代(殘基的eu編號(hào))改善adcc?；蛘?，增加的fc受體結(jié)合和效應(yīng)子功能可以例如通過(guò)改變fc區(qū)的糖基化獲得。與fc結(jié)構(gòu)域的asn297連接的兩個(gè)復(fù)雜雙天線糖寡糖通常被掩埋在ch2結(jié)構(gòu)域之間，與多肽骨架形成廣泛的接觸，并且它們的存在對(duì)于抗體介導(dǎo)效應(yīng)子功能(包括adcc)是至關(guān)重要的(lifely等人,glycobiology5,813-822(1995);jefferis等人,immunolrev163,59-76(1998);wright和morrison,trendsbiotechnol15,26-32(1997))。例如β(1,4)-n-乙酰氨基葡糖基轉(zhuǎn)移酶iii(gntiii)(催化二等分寡糖的形成的糖基轉(zhuǎn)移酶)的過(guò)表達(dá)顯著增加抗體的體外adcc活性。因此，用于產(chǎn)生本發(fā)明融合蛋白的細(xì)胞系中例如gntiii的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致本發(fā)明的富含二等分的寡糖的融合蛋白，其通常也是非巖藻糖基化的并且可以表現(xiàn)出增加的adcc。

本發(fā)明融合蛋白的adcc可以例如在宿主細(xì)胞或細(xì)胞系中額外過(guò)表達(dá)除了gntiii之外的甘露糖苷酶ii(manii)來(lái)進(jìn)一步增加，因?yàn)樗帽景l(fā)明融合蛋白可以富含復(fù)合型的二等分、非巖藻糖基化寡糖(參見(jiàn)例如ferrara等人,biotechnbioeng93,851-861(2006))。例如，從存在于本發(fā)明fc融合蛋白中的寡糖核心的最內(nèi)部n-乙酰葡糖胺殘基消除巖藻糖也可以增加adcc活性(參見(jiàn)例如shinkawa等人,jbiolchem278,3466-3473(2003))，因此本發(fā)明fc融合蛋白也可以例如在宿主細(xì)胞或具有降低的巖藻糖基化的細(xì)胞系中產(chǎn)生，通過(guò)例如在α(1,6)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶缺陷宿主細(xì)胞中的表達(dá)(參見(jiàn)例如yamane-ohnuki等人,biotechbioeng87,614-622(2004);niwa等人,jimmunolmethods306,151-160(2006))。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可通過(guò)本發(fā)明方法獲得的vnar，例如如上所公開(kāi)的vnar，其可以是如上所公開(kāi)的vnari型、ii型或iv型。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了編碼如上所公開(kāi)的本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白的多核苷酸或載體。用于本發(fā)明方法或本發(fā)明融合蛋白的術(shù)語(yǔ)載體或表達(dá)載體是指能夠染色體外復(fù)制的核酸分子。優(yōu)選的載體是能夠自主復(fù)制和表達(dá)與其連接的核酸的載體。能夠指導(dǎo)與其可操作連接的基因的表達(dá)的載體在本文中稱(chēng)為“表達(dá)載體”。通常，用于重組dna技術(shù)中的表達(dá)載體通常是“質(zhì)粒”的形式，其通常是指環(huán)狀雙鏈dna環(huán)，其以其載體形式不與染色體結(jié)合。在真核細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明融合蛋白或本發(fā)明vnar所必需的核酸序列包含例如至少一個(gè)啟動(dòng)子，和增強(qiáng)子、終止和聚腺苷酸化信號(hào)以及選擇性標(biāo)記，諸如例如抗生素耐藥性。可用于表達(dá)本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白的表達(dá)載體可以例如包含pcmv、pcdna、p4x3、p4x4、p4x5、p4x6、pvl1392、pvl1393、pacyc177、prs420，或者(如果使用基于病毒的載體系統(tǒng))例如pbabepuro、pwpxl、pxp-衍生的載體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含如上所公開(kāi)的多核苷酸序列或載體(例如，包含如本文所公開(kāi)的本發(fā)明vnar或本發(fā)明融合蛋白的編碼序列的多核苷酸或載體或表達(dá)載體)的宿主細(xì)胞。例如，用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。例如，本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是選自sf9、sf21、s2、hi5或bti-tn-5b1-4細(xì)胞的昆蟲(chóng)細(xì)胞，或者例如本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是選自以下的酵母細(xì)胞：釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、多形漢遜酵母(hansenulapolymorpha)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、許旺酵母(schwanniomycesoccidentalis)、乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)和巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)，或者例如本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是選自以下的哺乳動(dòng)物細(xì)胞：hek293、hek293t、hek293e、hek293f、ns0、per.c6、mcf-7、hela、cos-1、cos-7、pc-12、3t3、vero、vero-76、pc3、u87、saos-2、lncap、du145、a431、a549、b35、h1299、huvec、jurkat、mda-mb-231、mda-mb-468、mda-mb-435、caco-2、cho、cho-k1、cho-b11、cho-dg44、bhk、age1.hn、namalwa、wi-38、mrc-5、hepg2、l-929、rab-9、sirc、rk13、11b11、1d3、2.4g2、a-10、b-35、c-6、f4/80、iec-18、l2、mh1c1、nrk、nrk-49f、nrk-52e、rmc、cv-1、bt、mdbk、cpae、mdck.1、mdck.2和d-17。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)如本文所公開(kāi)的本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白的方法，其中本發(fā)明方法包括以下步驟：在足以使本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)至少一種如上所公開(kāi)的本發(fā)明的宿主細(xì)胞，以及分離和純化本發(fā)明vnar蛋白或vnar融合蛋白。例如，可使本發(fā)明的宿主細(xì)胞在含有10%fbs的dmem中生長(zhǎng)，并在37℃下在10%co2中孵育，或例如在無(wú)蛋白培養(yǎng)基中孵育以利于隨后的分離和純化，或例如在grace昆蟲(chóng)培養(yǎng)基、expressfive?sfm(lifetechnologies)或highfive?培養(yǎng)基(lifetechnologies)、ynm培養(yǎng)基、ypd液體培養(yǎng)基或例如pichiapink(lifetechnologies)中孵育。

可例如使本發(fā)明的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)12-408小時(shí)，例如約12-約400小時(shí)，例如14小時(shí)、16小時(shí)、18小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)-約120小時(shí)、144小時(shí)、168小時(shí)、192、216小時(shí)、240小時(shí)、264小時(shí)、288小時(shí)、312小時(shí)、336小時(shí)、360小時(shí)、384小時(shí)、408小時(shí)。隨后，可分離并純化本發(fā)明vnar或本發(fā)明融合蛋白。例如，可通過(guò)層析法，例如離子交換層析法、大小排阻層析法、硫酸銨沉淀或超濾，分離并純化本發(fā)明的蛋白。例如，本發(fā)明vnar或本發(fā)明融合蛋白還可以包含信號(hào)序列，其是指能夠使例如通過(guò)肽鍵與之可操作連接的多肽穿入宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)的氨基酸序列。信號(hào)肽一般被內(nèi)肽酶(例如特異性定位于er的信號(hào)肽酶)切割掉以釋放(成熟的)多肽。信號(hào)肽的長(zhǎng)度范圍通常為約10-約40個(gè)氨基酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了多核苷酸文庫(kù)，其包含多個(gè)編碼本發(fā)明的hv2結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸文庫(kù)”或“多個(gè)多核苷酸”表示至少兩個(gè)不同dna序列的文庫(kù)或集合，其至少編碼本發(fā)明hv2結(jié)構(gòu)域，或例如其編碼包含本發(fā)明hv2結(jié)構(gòu)域的vnari型、ii型或iv型之一。例如，所述多核苷酸文庫(kù)包含至少1000個(gè)不同的dna序列，更優(yōu)選至少10⁴、10⁵、10⁶或至少100、1000或約10³至約10⁷個(gè)不同的dna序列，其編碼本發(fā)明hv2結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸文庫(kù)包含多個(gè)編碼總體結(jié)構(gòu)fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw的i型、ii型或iv型vnar結(jié)構(gòu)域的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)seqidno:2、seqidno:4、seqidno:5的雙特異性vnar分子。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明vnar或本發(fā)明vnar融合蛋白在制備藥物中的用途。因此，本發(fā)明vnar蛋白或本發(fā)明vnar融合蛋白可以例如用于制備藥物，例如，配制成施用于有需要的個(gè)體。本發(fā)明的創(chuàng)造性藥物可以例如為可注射液體、膠囊、錠劑、用于重構(gòu)的冷凍干燥制劑，并且可以包含例如約0.01mg/ml至約25mg/ml本發(fā)明vnar蛋白或本發(fā)明vnar融合蛋白，或約0.02mg/ml至約20mg/ml、或約0.075mg/ml至約17.5mg/ml、或約0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、3.75mg/ml、4mg/ml、4.25mg/ml、4.5mg/ml、5mg/ml、5.5mg/ml、6mg/ml、6.5mg/ml、7mg/ml、7.5mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、9.5mg/ml、10mg/ml、10.5mg/ml、11mg/ml、11.5ml/ml、12mg/ml、12.5mg/ml、12.75mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、14.5mg/ml、15mg/ml至約16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml、或例如約26mg/ml至約50mg/ml、例如27mg/ml、28mg/ml、29mg/ml、30mg/ml、31mg/ml、32mg/ml、33mg/ml、34mg/ml、35mg/ml、36mg/ml、37mg/ml、38mg/ml、39mg/ml、40mg/ml、41mg/ml、42mg/ml、43mg/ml、44mg/ml、45mg/ml、46mg/ml、47mg/ml、48mg/ml、49mg/ml、50mg/ml、或例如0.001mg/ml至約0.009mg/ml。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含如本文所公開(kāi)的本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。在本發(fā)明的藥物組合物的上下文中，藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)上可接受的材料、組合物或媒介物，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料，諸如脂質(zhì)體、聚乙二醇(peg)、聚乙二醇化脂質(zhì)體、納米顆粒等，其參與將主題組合物或治療劑從身體的一個(gè)器官或部分?jǐn)y帶或運(yùn)輸至身體的另一個(gè)器官或部分。每種載體在與制劑的其他成分相容且對(duì)患者無(wú)害的意義上必須是“可接受的”?？梢猿洚?dāng)藥學(xué)上可接受的載體的材料的一些實(shí)例包括例如，糖類(lèi)，諸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；或例如淀粉類(lèi)，諸如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；或例如纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；或例如明膠；或例如賦形劑，諸如可可脂和栓劑蠟；或例如油類(lèi)，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；或例如二醇類(lèi)，諸如丙二醇；或例如多元醇類(lèi)，諸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；或例如酯類(lèi)，諸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；或例如還可以使用以下物質(zhì)：等滲鹽水或緩沖(水)溶液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽等，緩沖溶液、含水緩沖溶液，其含有例如鈉鹽，優(yōu)選至少50mm的鈉鹽、鈣鹽，優(yōu)選至少0.01mm的鈣鹽和/或鉀鹽，優(yōu)選至少3mm的鉀鹽。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，鈉、鈣和/或鉀鹽可以以其鹵化物(例如，氯化物、碘化物或溴化物)的形式、其氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或硫酸鹽等的形式存在。不限于此，鈉鹽的實(shí)例包括例如nacl、nai、nabr、na2co3、nahco3、na2so4，任選的鉀鹽的實(shí)例包括例如kcl、ki、kbr、k2co3、khco3、k2so4，鈣鹽的實(shí)例包括例如cacl2、cai2、cabr2、caco3、caso4、ca(oh)2。此外，上述陽(yáng)離子的有機(jī)陰離子可以包含在本發(fā)明的組合物中。根據(jù)一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案，如上所定義的適用于注射目的的本發(fā)明組合物可以含有選自氯化鈉(nacl)、氯化鈣(cacl2)和任選氯化鉀(kcl)的鹽，其中還可存在除氯化物以外的其他陰離子。cacl2還可以被另一鹽如kcl替代。本發(fā)明的組合物可以是相對(duì)于特定參考介質(zhì)高滲、等滲或低滲的，即本發(fā)明的藥物組合物可以具有相對(duì)于特定參考介質(zhì)更高、相同或更低的鹽含量，其中優(yōu)選地，可以使用此類(lèi)濃度的上述鹽，其不會(huì)由于滲透或其他濃縮效應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。參考介質(zhì)是例如以“體內(nèi)”方法存在的液體，諸如血液、淋巴、胞質(zhì)溶膠液體或其他體液，或例如液體，其可以在“體外”方法中用作參考介質(zhì)，諸如常見(jiàn)的緩沖液或液體。此類(lèi)常見(jiàn)的緩沖液或液體是技術(shù)人員已知的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療患有病理病況的有需要的個(gè)體的方法，其包括向有需要的人施用如本文所公開(kāi)的本發(fā)明藥物組合物。例如，本發(fā)明治療方法可以包括向患有病理病況的有需要的人施用約0.001mg/kg至約50mg/kg本發(fā)明藥物組合物，或約0.005mg/kg至約45mg/kg、或約0.01mg/kg至約40mg/kg、或約0.05mg/kg至約35mg/kg、或約0.1mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、12.5mg/kg、15mg/kg、17.5mg/kg、20mg/kg、22.5mg/kg、25mg/kg至約26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、32.5mg/kg、35mg/kg、37.5mg/kg、40mg/kg、42.5mg/kg、45mg/kg。如所用，術(shù)語(yǔ)“mg/kg”是指mg本發(fā)明藥物組合物/kg本發(fā)明中的體重。可以通過(guò)本發(fā)明方法治療的病理病況可以是癌癥、自身免疫疾病或病毒感染。如本發(fā)明治療方法的上下文中使用的術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指由細(xì)胞的異常、不受控制的生長(zhǎng)引起的多種病況，例如被稱(chēng)為“癌細(xì)胞”的能夠引起癌癥的細(xì)胞具有特征性特性，諸如不受控制的增殖、永生化、轉(zhuǎn)移潛力，快速生長(zhǎng)和增殖速度，和/或某些典型的形態(tài)特征。癌細(xì)胞可以是例如腫瘤的形式，但此類(lèi)細(xì)胞也可以單獨(dú)存在于受試者內(nèi)，或者可以是非致瘤性癌細(xì)胞。如本發(fā)明治療方法的上下文中使用的術(shù)語(yǔ)癌癥可以例如是指前列腺癌、乳腺癌、腎上腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、單克隆丙種球蛋白病、良性單克隆丙種球蛋白病、重鏈疾病、骨和結(jié)締組織肉瘤、腦腫瘤、甲狀腺癌、胰腺癌、垂體癌、眼癌、陰道癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、肺癌、睪丸癌、陰莖癌(penalcancer)、口腔癌、皮膚癌、腎癌、wilms氏腫瘤和膀胱癌。在本發(fā)明治療方法的上下文中，術(shù)語(yǔ)自身免疫疾病可以例如是指系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)、格雷夫斯病、i型和ii型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、干燥綜合征、硬皮病、腎小球腎炎、移植排斥反應(yīng)，例如器官和組織同種異體移植物和異種移植物排斥反應(yīng)和移植物抗宿主病。如本發(fā)明治療方法的上下文中使用的術(shù)語(yǔ)“病毒感染”是指特征在于細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)化、病毒復(fù)制和增殖的異常狀態(tài)或病況，諸如例如，皰疹家族病毒、水痘帶狀皰疹病毒(vzv)、eb病毒(ebv)、巨細(xì)胞病毒(cmv)等感染。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，待通過(guò)如本文公開(kāi)的本發(fā)明方法治療的個(gè)體是人。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了部件試劑盒，其包含如上文所公開(kāi)的本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白以及用于檢測(cè)的裝置。因此，本發(fā)明部件試劑盒可以例如包含本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白，其呈穩(wěn)定形式諸如例如，凍干的，或作為液體制劑，使得本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白足夠穩(wěn)定用于儲(chǔ)存，例如，用于在4℃-10℃下或在環(huán)境溫度下儲(chǔ)存例如至少1-12周，或例如至少1-6個(gè)月，或例如至少2-12個(gè)月，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個(gè)月。本發(fā)明試劑盒還可以包含用于檢測(cè)本發(fā)明vnar蛋白或本發(fā)明vnar融合蛋白的裝置，諸如例如量子點(diǎn)，可檢測(cè)標(biāo)記的抗體，諸如抗體-酶復(fù)合物，或與熒光標(biāo)記偶聯(lián)的抗體。

如本發(fā)明試劑盒的上下文中或如上面公開(kāi)的本發(fā)明方法的上下文中使用的術(shù)語(yǔ)量子點(diǎn)是指半導(dǎo)體材料的單個(gè)球狀納米晶體，其中納米晶體的半徑小于或等于該半導(dǎo)體材料的激子玻爾半徑的大小(激子玻爾半徑的值可從存在于以下含有有關(guān)半導(dǎo)體性質(zhì)信息的手冊(cè)中的數(shù)據(jù)計(jì)算，諸如crchandbookofchemistryandphysics,第83版,lide,davidr.(編輯),crcpress,bocaraton,fla.(2002))。量子點(diǎn)是本領(lǐng)域已知的，因?yàn)樗鼈兠枋鲇谝韵聟⒖嘉墨I(xiàn)中，諸如weller,angew.chem.int.ed.engl.32:41-53(1993)；alivisatos,j.phys.chem.100:13226-13239(1996)；以及alivisatos,science271:933-937(1996)。量子點(diǎn)可為例如約1nm-約1000nm直徑，例如10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm或500nm、優(yōu)選至少約2nm-約50nm、更優(yōu)選qd的直徑為至少約2nm-約20nm(例如約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nm)。qd的特征在于其基本均一的納米大小，常常顯示約10%-15%多分散性或大小范圍。qd在激發(fā)后能夠發(fā)射電磁輻射(即qd是光致發(fā)光的)，且包括一種或多種第一半導(dǎo)體材料的“核”，且可被第二半導(dǎo)體材料的“殼”包繞。被半導(dǎo)體殼包繞的qd核稱(chēng)為“核/殼”qd。包“殼”材料將優(yōu)選具有大于核心材料的帶隙能(bandgapenergy)的帶隙能，并可選擇為具有接近于“核”基質(zhì)的原子間距的原子間距。核和/或殼可為半導(dǎo)體材料，包括但不限于第ii-vi族(zns、znse、znte、us、cdse、cdte、hgs、hgse、hgte、mgs、mgse、mgte、cas、case、cate、srs、srse、srte、bas、base、bate等)和第iii-v族(gan、gap、gaas、gasb、inn、inp、inas、insb等)和第iv族(ge、si等)材料的那些、pbs、pbse及其合金或混合物。優(yōu)選的殼材料包括zns。

可以例如用于本發(fā)明用于標(biāo)記抗體的試劑盒(其可以用于檢測(cè)本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白)的術(shù)語(yǔ)“熒光標(biāo)記”或“熒光染料”或“熒光團(tuán)”是指在規(guī)定激發(fā)波長(zhǎng)下吸收光能并在不同波長(zhǎng)下發(fā)射光能的部分?？捎糜诒景l(fā)明中的熒光標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于：丹酰氯、dapoxyl、二烷基氨基香豆素、異硫氰酸羅丹明、alexa350、alexa430、alexafluor488、alexafluor532、alexafluor546、alexafluor568、alexafluor594、alexafluor633、alexafluor660、alexafluor680、amca、氨基吖啶、bodipy630/650、bodipy650/665、bodipy-fl、bodipy-r6g、bodipy-tmr、bodipy-trx、bodipyfl、bodipyr6g、bodipytmr、bodipytr、bodipy530/550、bodipy558/568、bodipy564/570、bodipy576/589、bodipy581/591、bodipy630/650、bodipy650/665)、羧基羅丹明6g、羧基-x-羅丹明(rox)、cascade藍(lán)、cascade黃、香豆素343、花青染料(cy3、cy5、cy3.5、cy5.5)、丹酰(dansyl)、dapoxyl、二烷基氨基香豆素、4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基-熒光素、dm-nerf、伊紅、赤蘚紅、熒光素、fam、羥基香豆素、irdyes(ird40、ird700、ird800)、joe、麗絲胺羅丹明b、marina藍(lán)、甲氧基香豆素、naphtho熒光素、oregon綠488、oregon綠500、oregon綠514、pacific藍(lán)、pympo、5-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基熒光素、5-羧基-2',4',5',7'-四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四甲基氨基、cascade藍(lán)、cy2、cy3、cy5,6-fam、丹酰氯、熒光素、hex、6-joe、nbd(7-硝基苯并-2-氧雜-l,3-二唑)、oregon綠488、oregon綠500、oregon綠514、pacific藍(lán)、酞酸、對(duì)苯二甲酸、間苯二甲酸、甲酚固紫(cresylfastviolet)、甲酚藍(lán)紫(cresylblueviolet)、亮甲酚藍(lán)、對(duì)氨基苯甲酸、赤蘚紅、酞菁、偶氮甲堿、花青、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、稀土金屬穴狀絡(luò)合物、三聯(lián)吡啶二胺銪(europiumtrisbipyridinediamine)、銪穴狀化合物或螯合物、二胺、雙花青、lajolla藍(lán)染料、別藻藍(lán)蛋白(allopycocyanin)、allococyaninb、藻青蛋白c、藻青蛋白r、硫胺、藻紅青素、藻紅蛋白r、reg、羅丹明綠、異硫氰酸羅丹明、羅丹明紅、tamra、tet、trit(四甲基羅丹明異硫醇(tetramethylrhodamineisothiol))、四甲基羅丹明或德克薩斯紅。例如，本發(fā)明試劑盒可以用于檢測(cè)樣品諸如例如組織活檢樣品、或石蠟切片、組織培養(yǎng)物或體液中如上所公開(kāi)的癌細(xì)胞表面抗原。所述樣品可以例如源自患有病理病況的患者，其中從患者獲得樣品不形成本發(fā)明的一部分。

要理解，本發(fā)明不限于本文所述具體的方法、方案和試劑，因?yàn)檫@些可變化。還要理解，本文所用術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體實(shí)施方案的目的，并無(wú)意限制僅受隨附權(quán)利要求書(shū)限制的本發(fā)明的范圍。除非另有說(shuō)明，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

實(shí)施例

實(shí)施例1：用于酵母展示的片段生成的soepcr

為了生成用于酵母表面展示的插入片段，使用來(lái)自epcam特異性結(jié)合劑5005的質(zhì)粒dna作為起始材料。平行實(shí)施兩次pcr反應(yīng)，以生成用作第3次pcr的起始材料的兩個(gè)dna-片段(參見(jiàn)圖11)。pcr-條件如下：92℃持續(xù)30秒，[92℃持續(xù)30秒，52℃30秒，72℃30秒]x30，隨后72℃持續(xù)5分鐘。對(duì)于第3次pcr，將片段a和片段b(參見(jiàn)圖11)以1:1摩爾比(各約50ng)混合并用作模板。在上述pcr-運(yùn)行的6個(gè)循環(huán)后，添加寡核苷酸pct_seq_up和pct_seq_lo以得到具有隨機(jī)化hv2編碼區(qū)的最終pcr產(chǎn)物，其被用作用于文庫(kù)生成的插入材料。

實(shí)施例2：文庫(kù)生成

為了生成具有高序列多樣性的酵母文庫(kù)，根據(jù)benatuil等人,proteinengdessel2010;23:155-9的方案進(jìn)行釀酒酵母的轉(zhuǎn)化。使用釀酒酵母菌株eby100的過(guò)夜培養(yǎng)物，將100mlypd培養(yǎng)基接種至od600=0.3，繼續(xù)孵育，直到達(dá)到od600=1.6的細(xì)胞密度。經(jīng)由以3000rpm離心5分鐘來(lái)將細(xì)胞與培養(yǎng)基分離。在進(jìn)一步過(guò)程中，將細(xì)胞用50ml冰冷水洗滌兩次，并用電穿孔緩沖液洗滌兩次，隨后在30℃下在以180rpm振蕩下，在20ml鋰緩沖液中調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞30分鐘。在用電穿孔緩沖液洗滌最后一個(gè)步驟之后，將細(xì)胞沉淀重懸浮于100-200μl電穿孔緩沖液中，導(dǎo)致1ml的最終體積，并保持在冰上。

對(duì)于每個(gè)電穿孔反應(yīng)，在冷轉(zhuǎn)化比色皿中將1μg消化的載體骨架和3μgdna插入物與400μl電感受態(tài)細(xì)胞混合。電穿孔(u=2.5kv；c=25μf；r<200ω；時(shí)間脈沖=5ms)之后，立即添加8ml1m山梨糖醇:ypd培養(yǎng)基的1:1混合物，然后在30℃下以180rpm孵育1小時(shí)。在最后一次離心步驟之后，將細(xì)胞重懸浮于sdcaa培養(yǎng)基中并孵育兩天。通過(guò)在sdcaa板上劃出連續(xù)稀釋的細(xì)胞，可以在三天后從菌落計(jì)數(shù)測(cè)定文庫(kù)大小。如果需要更多的電感受態(tài)細(xì)胞來(lái)制備較大文庫(kù)，則將細(xì)胞培養(yǎng)和制備按比例放大。

sgcaa培養(yǎng)基：2%(w/v)半乳糖，0.17%(w/v)酵母氮堿，0.5%(w/v)酪蛋白氨基酸，0.5%(w/v)硫酸銨，10%w/v聚乙二醇8000，38mmna2hpo4，62mmnah2po4?h2o[ph7.4]。

實(shí)施例3：釀酒酵母中基因表達(dá)的誘導(dǎo)

用pct載體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞(參見(jiàn)實(shí)施例2)用于細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)。因?yàn)樵诎肴樘菃?dòng)子的控制下，在載體中編碼鯊魚(yú)抗體變體，所以可以通過(guò)將培養(yǎng)基從含有葡萄糖的培養(yǎng)基更換為含有半乳糖的sgcaa培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行基因表達(dá)的誘導(dǎo)。因此，將相應(yīng)體積的酵母過(guò)夜培養(yǎng)物的細(xì)胞沉降(14000u/分鐘；2分鐘)，并用于將搖瓶中的50–1000mlsgcaa培養(yǎng)基接種至od600=0.5的細(xì)胞密度，在20℃下孵育時(shí)間為至少1天。

sgcaa培養(yǎng)基：2%(w/v)半乳糖，0.17%(w/v)酵母氮堿，0.5%(w/v)酪蛋白氨基酸，0.5%(w/v)硫酸銨，10%w/v聚乙二醇8000，38mmna2hpo4，62mmnah2po4?h2o[ph7.4]。

實(shí)施例4：用于facs的細(xì)胞染色和facs分析

使酵母細(xì)胞在sgcaa培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜，并沉淀并用pbs洗滌一次。然后將細(xì)胞在足夠體積的1μmepcam中孵育。15分鐘后，再次用pbs洗滌細(xì)胞，并添加cd3ε-生物素(1μm)。孵育30-60分鐘后，再次洗滌細(xì)胞。使用pe-標(biāo)記的抗epcam-抗體檢測(cè)epcam-結(jié)合。使用生物素化的cd3ε和鏈霉抗生物素蛋白-apc或使用his-標(biāo)記的cd3ε和alexaflur-標(biāo)記的五his抗體檢測(cè)cd3ε-結(jié)合。與二級(jí)試劑的孵育在冰上實(shí)施5分鐘。在用pbs重復(fù)洗滌后，將酵母細(xì)胞進(jìn)行二維facs分選(a維：epcam-結(jié)合；b維：cd3ε-結(jié)合)。類(lèi)似于此，還實(shí)施篩選以選擇針對(duì)epcam和人fc的雙特異性結(jié)合劑。此處使用his-標(biāo)記的epcam和alexaflur-標(biāo)記的五his抗體檢測(cè)epcam結(jié)合。使用pe-標(biāo)記的抗人抗體檢測(cè)與人fc的結(jié)合。

熒光-活化的細(xì)胞分選

熒光-活化的細(xì)胞分選使用moflocytomation裝置進(jìn)行，并經(jīng)由summit4.3分析。該裝置能夠測(cè)量含有單個(gè)細(xì)胞的微滴的熒光。通過(guò)使用在488nm和640nm發(fā)射光的兩種激光，平行測(cè)量單個(gè)酵母細(xì)胞上的vnar表面呈遞和靶蛋白結(jié)合的熒光強(qiáng)度是可能的。在開(kāi)始細(xì)胞分選程序之前，使用熒光標(biāo)記的珠粒來(lái)調(diào)整分選裝置的激光。此外，進(jìn)行液滴-延遲，以確定應(yīng)當(dāng)分析的含有細(xì)胞的微滴的位置。對(duì)于每個(gè)分選輪，設(shè)置分選門(mén)控，其定義應(yīng)當(dāng)分選出的細(xì)胞的熒光特性。分選門(mén)控的設(shè)置通常允許0.1％假陽(yáng)性細(xì)胞，如在抗原不存在的情況下通過(guò)對(duì)照染色所判斷。

在本工作中用于細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)的moflo裝置的參數(shù)：

側(cè)面散射：650(lin模式)

fl1：650(log模式)

fl2：600(log模式)

fl3：640(log模式)

板的電荷：2,500v

事件率5,000-30,000個(gè)事件/s

樣品壓力：60.1psi

鞘壓力：59psi

噴嘴直徑：70μm

分選模式：分選純化1。

在細(xì)胞分選后，通過(guò)分析已經(jīng)分選的細(xì)胞的一小部分來(lái)測(cè)定分選效率。然后，使細(xì)胞在30℃下在sdcaa板上生長(zhǎng)2天，隨后用于誘導(dǎo)細(xì)胞表面呈遞，用于以下分選輪。對(duì)于每個(gè)分選輪，在板上孵育后，將分選出的10倍過(guò)量的細(xì)胞懸浮于10％甘油中，用于低溫保存。

使用的sdcaa培養(yǎng)基包含：2%(w/v)葡萄糖，0.17%(w/v)酵母氮堿，0.5%(w/v)酪蛋白氨基酸，0.5%(w/v)硫酸銨，38mmna2hpo4，62mmnah2po4?h2o[ph7.4]。facs結(jié)果顯示于圖6、7和9中。

序列表

<110>merckpatentgmbh

<120>用于生成雙特異性鯊魚(yú)可變抗體結(jié)構(gòu)域的方法及其用途

<130>p14/207

<160>11

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>用于hv2結(jié)構(gòu)域的隨機(jī)化的寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3)

<223>第一個(gè)密碼子(nnn)可以是除tgt、tgc以外的任何密碼子，

其中在50%中，可以存在密碼子tta、ttg、ctt、ctc、cta、ctg之一

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(24)

<223>可以存在除taa、tga、tag以外的任何密碼子

<220>

<221>misc_feature

<222>(25)..(27)

<223>最后一個(gè)密碼子(nnn)可以是除tgt、tgc以外的任何密碼子，

其中在50%中，可以存在密碼子act、acc、aca、acg之一

<400>1

nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn27

<210>2

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>vnar克隆b1氨基酸序列

<400>2

metalaalaargleugluglnthrprothrthrthrthrlysgluala

151015

glygluserleuthrileasncysvalleulysproglutrpthrile

202530

leuglyargthrtyrtrptyrphethrlyslysglythralaphelys

354045

ileglylystrpmetglyglyargtyrseraspthrlysasnthrala

505560

serlysserleuserleuargileseraspleuargvalgluaspser

65707580

glythrtyrhiscysglualaleuiletyrseraspmetglymetile

859095

mettrplysilegluglyglyglythrthrvalthrvallys

100105110

<210>3

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>親本vnar克隆5005

<400>3

metalaalaargleugluglnthrprothrthrthrthrlysgluala

151015

glygluserleuthrileasncysvalleulysproglutrpthrile

202530

leuglyargthrtyrtrptyrphethrlyslysglyalathrlyslys

354045

alaargleuserthrglyglyargtyrseraspthrlysasnthrala

505560

serlysserleuserleuargileseraspleuargvalgluaspser

65707580

glythrtyrhiscysglualaleuiletyrseraspmetglymetile

859095

mettrplysilegluglyglyglythrthrvalthrvallys

100105110

<210>4

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>vnarepha2-fc

<400>4

metalaalaargleugluglnthrprothrthrthrthrlysgluala

151015

glygluserleuthrileasncysvalleulysproglutrpthrile

202530

leuglyargthrtyrtrptyrphethrlyslysglylysleuasngly

354045

arglysleuarglysglyglyargtyrseraspthrlysasnthrala

505560

serlysserleuserleuargileseraspleuargvalgluaspser

65707580

glythrtyrhiscysglualaleuiletyrseraspmetglymetile

859095

mettrplysilegluglyglyglythrthrvalthrvallys

100105110

<210>5

<211>109

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>epha2_4_fc

<400>5

metalaalaargleugluglnthrprothrthrthrthrlysgluala

151015

glygluserleuthrileasncysvalleulysproglutrpthrile

202530

leuglyargthrtyrtrptyrphethrlyslysglythrargargleu

354045

lysasnleulysthrglyglyargtyrseraspthrlysasnthrala

505560

serlysserleuserleuargileseraspleuargvalgluaspser

65707580

glythrtyrhiscysglualaleuiletyrsermetglymetilemet

859095

trplysilegluglyglyglythrthrvalthrvallys

100105

<210>6

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>生物素-受體肽

<400>6

glyleuasnaspilepheglualaglnlysileglutrphisglu

151015

<210>7

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>actev位點(diǎn)

<400>7

gluasnleutyrpheglngly

15

<210>8

<211>68

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸hv2rand_up

<220>

<221>misc_feature

<223>在位置22-24的第一個(gè)密碼子(nnn)可以是除tgt、tgc以外的任何密碼子，

其中在50%中，可以存在密碼子tta、ttg、ctt、ctc、cta、ctg之一

<220>

<221>misc_feature

<223>在位置22-24的第一個(gè)密碼子(nnn)可以是除tgt、tgc以外的任何密碼子，

其中在50%中，可以存在密碼子tta、ttg、ctt、ctc、cta、ctg之一

<220>

<221>misc_feature

<223>在位置45-47的最后一個(gè)簡(jiǎn)并密碼子(nnn)可以是除tgt、tgc以外的任何密碼子，

其中在50%中，可以存在密碼子act、acc、aca、acg之一

<220>

<221>misc_feature

<223>在23-44的簡(jiǎn)并密碼子(nnn)可以編碼任何氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(47)

<223>n是a、c、g或t

<400>8

tggtatttcacaaagaagggcnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnggcggacgatact60

cggacaca68

<210>9

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pct-seq-lo

<400>9

gcgcgctaacggaacgaaaaatagaaa27

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pct-seq-up

<400>10

aggacaatagctcgacgattg21

<210>11

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hv2rand_soe-lo

<400>11

gcccttctttgtgaaatacca21