相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求于2014年9月4日提交的新加坡專利申請no.10201405497u的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，其內(nèi)容出于所有目的而在此通過引用整體并入。

本發(fā)明一般性地涉及癌癥免疫治療。特別地，本發(fā)明涉及使用經(jīng)重編程的結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞來激活免疫系統(tǒng)細(xì)胞對抗癌細(xì)胞。

背景技術(shù)：

結(jié)腸直腸癌(colorectalcancer，crc)是世界范圍內(nèi)最常診斷的癌癥之一，并且在很多工業(yè)化國家是癌癥相關(guān)致死率的第二或第三主要原因。最初診斷患有局部化crc的患者中有超過50％最終發(fā)展成伴隨遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的iv期crc。已發(fā)現(xiàn)，高腫瘤發(fā)生性(或腫瘤引發(fā)性)細(xì)胞(即，結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞(cancerstemcell，csc))的小亞群存在于多種人惡性腫瘤例如crc中。csc使干細(xì)胞保持自我更新并且產(chǎn)生表型多樣的腫瘤細(xì)胞群的能力。這些腫瘤發(fā)生性細(xì)胞在維持腫瘤生長并且引發(fā)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移中是關(guān)鍵的。csc還被認(rèn)為導(dǎo)致腫瘤對主要常規(guī)治療策略(例如化學(xué)治療和放射治療)的抗性。認(rèn)為這些常規(guī)策略盡管去除原發(fā)性腫瘤和減小腫瘤體積但是未能完全消除csc使得腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，認(rèn)為csc導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和crc治療失效。

因此，需要靶向csc的新治療方法來防止crc轉(zhuǎn)移和腫瘤發(fā)生。探索的一種方法是基于癌干細(xì)胞的癌癥免疫治療。然而，開發(fā)該策略的限制之處在于：缺乏足夠量的腫瘤細(xì)胞來提供用于激活針對crc細(xì)胞的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的腫瘤特異性抗原(tumor-specificantigen，tsa)和腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associatedantigen，taa)。

因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供針對結(jié)腸直腸癌的經(jīng)改進(jìn)的癌癥免疫治療，其克服或至少改善上述一個(gè)或更多個(gè)缺點(diǎn)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供足夠量的攜帶腫瘤特異性抗原(tsa)和腫瘤相關(guān)抗原(taa)的腫瘤細(xì)胞來激活針對crc細(xì)胞的免疫系統(tǒng)細(xì)胞以用于癌癥治療。

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供足夠量的抗原(例如腫瘤特異性抗原(tsa)和腫瘤相關(guān)抗原(taa))來激活針對crc細(xì)胞的免疫系統(tǒng)細(xì)胞以用于癌癥治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在第一方面，提供了一種組合物，其包含通過與至少一種結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞或其碎片接觸而脈沖的至少一種分離的免疫系統(tǒng)細(xì)胞，其中所述結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞通過使至少一種分化的結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)以具有未分化的結(jié)腸直腸干細(xì)胞狀態(tài)來獲得。

在第二方面，提供了用于刺激對象的免疫系統(tǒng)的組合物，其包含通過與從結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞獲得的一種或更多種抗原接觸而脈沖的至少一種抗原呈遞細(xì)胞，其中所述結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞通過使至少一種分化的結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)以具有未分化的結(jié)腸直腸干細(xì)胞狀態(tài)來獲得，其中所述逆轉(zhuǎn)通過用選自oct4和sox2的細(xì)胞重編程因子或轉(zhuǎn)錄因子重編程從該對象獲得的分化結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。

在第三方面，提供了一種用于脈沖樹突細(xì)胞使得所述樹突細(xì)胞能夠誘導(dǎo)細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞針對體外結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物包含已從經(jīng)重編程的體外結(jié)腸直腸癌細(xì)胞富集的至少一種體外結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞或其碎片。

在第四方面，提供了一種產(chǎn)生經(jīng)刺激的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的方法，其包括：使結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞或其碎片與至少一種免疫系統(tǒng)細(xì)胞接觸，其中所述結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞通過使至少一種分化的結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)至其未分化的干細(xì)胞狀態(tài)來獲得。

在第五方面，提供了一種疫苗，其包含用如本文中限定的方法刺激的至少一種免疫細(xì)胞。

在第六方面，提供了通過如本文中限定的方法獲得的經(jīng)刺激的免疫細(xì)胞。

在第七方面提供了一種在對象中治療結(jié)腸直腸癌的方法，其包括：用本文中限定的組合物或本文中限定的疫苗或通過如本文中限定的方法刺激的免疫細(xì)胞免疫所述對象。

在第八方面，提供了本文中限定的組合物或本文中限定的疫苗或通過如本文中限定的方法刺激的免疫細(xì)胞在制備用于治療對象中結(jié)腸直腸癌的藥物中的用途。

在第九方面，提供了一種制備用于對象的包含自體同源樹突細(xì)胞的抗結(jié)腸直腸癌疫苗的方法，其包括以下步驟：(a)提取并純化從來自所述對象的樣品獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞(單核細(xì)胞)；(b)將所述單核細(xì)胞在有效地誘導(dǎo)單核細(xì)胞向樹突細(xì)胞分化的條件下培養(yǎng)；(c)使(b)中的經(jīng)培養(yǎng)未成熟樹突細(xì)胞與癌干細(xì)胞或其碎片接觸，所述癌干細(xì)胞或其碎片通過使至少一種分化的結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)至其未分化的結(jié)腸直腸干細(xì)胞狀態(tài)來獲得；(d)用樹突細(xì)胞成熟誘導(dǎo)劑培養(yǎng)(c)中裝載有結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞的樹突細(xì)胞；以及(e)收獲裝載有結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞的成熟樹突細(xì)胞作為抗癌疫苗。

附圖說明

在參照發(fā)明詳述的同時(shí)結(jié)合非限制性實(shí)施例和附圖考慮將更好地理解本發(fā)明，在附圖中：

圖1

[圖1]示出了結(jié)腸直腸癌(crc)細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)多能癌(inducedpluripotentcancer，ipc)細(xì)胞的重編程。(a)是顯示根據(jù)bv-zfn誘導(dǎo)的dnadbs由桿狀病毒(bv)dna供體bv-oskm提供的oskm表達(dá)盒的aavs1基因座整合。hr(l)&hr(r)：hr的左臂和右臂。fp&rp：用于pcr基因分型的pcr正向和反向引物的結(jié)合位點(diǎn)。(b)示出了bv轉(zhuǎn)導(dǎo)之后的ipc細(xì)胞產(chǎn)生。觀察到在絲裂霉素c失活小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouseembryonicfibroblast，mef)上形成ips細(xì)胞樣集落。示出了由hct8細(xì)胞衍生的集落的相差圖像(左)和egfp熒光圖像(右)。細(xì)胞在人ips細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。示出了來自人crchct8亞克隆的結(jié)果。(c)示出了pcr基因分型的結(jié)果以確定oskm盒靶向地整合到aavs1基因座中。利用(a)中所示的3-kbdna碎片的擴(kuò)增來鑒定所靶向插入。(d)示出了由hct-8細(xì)胞衍生的ipc細(xì)胞中多能性標(biāo)志物的表達(dá)。進(jìn)行了免疫染色以檢測ipc細(xì)胞集落中nanog、ssea-4和tra-1-60的表達(dá)。(e)示出了由所衍生ipc細(xì)胞形成的崎胎瘤的組織切片的蘇木精和伊紅染色。該畸胎瘤中發(fā)現(xiàn)的分化組織的組織學(xué)顯示了未成熟的神經(jīng)膠質(zhì)組織和神經(jīng)上皮玫瑰花結(jié)(外胚層)、軟骨(中胚層)和腺(內(nèi)胚層)。

圖2

[圖2]顯示oskm的異位表達(dá)導(dǎo)致人crc中的csc樣特性提高。(a)是顯示通過rt-qpcr量化的oskm基因表達(dá)的圖。引物設(shè)計(jì)成擴(kuò)增內(nèi)源和外源oskm基因二者。使用gapdh基因表達(dá)來歸一化和計(jì)算倍數(shù)變化。(b)是舉例說明腫瘤球形成效率的圖。測試了兩個(gè)oskm表達(dá)克隆hct3.11和sw1.9的效率。將結(jié)果相對于其親代細(xì)胞的歸一化。(c)是量化csc標(biāo)志物陽性細(xì)胞的百分比的流式細(xì)胞術(shù)分析的結(jié)果。所示結(jié)果是三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±sd。

圖3

[圖3]描述了通過定量rtpcr分析的oskm表達(dá)結(jié)腸直腸csc樣細(xì)胞的分子表征。(a)是顯示結(jié)腸直腸csc標(biāo)志物的結(jié)果的圖。(b)是顯示上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymaltransition，emt)標(biāo)志物的結(jié)果的圖。(c)是顯示常用的crc臨床生物標(biāo)志物的結(jié)果的圖。(d)是顯示通過gwas鑒定的與crc高風(fēng)險(xiǎn)基因座相關(guān)的基因的結(jié)果的圖。使用進(jìn)行oskm遺傳修飾的野生型hct-8衍生單細(xì)胞克隆作為對照。所有倍數(shù)變化均相對于gapdh表達(dá)水平歸一化。

圖4

[圖4]示出了通過用裝載有oskm基因表達(dá)crc細(xì)胞的裂解物的樹突細(xì)胞致敏cd8+初始t細(xì)胞的來自人pbmc的oct反應(yīng)性t細(xì)胞的產(chǎn)生。(a)是該方案的示意圖：開發(fā)了dc并且cd8+初始t細(xì)胞選自健康供體的hla-a2+人pbmc。在用腫瘤裂解物進(jìn)行dc脈沖和dc成熟之后，使用dc來刺激體外自體同源t細(xì)胞持續(xù)連續(xù)兩周。然后，收獲活t細(xì)胞并在ifn-γelispot測定中評價(jià)其抗原特異性ifn-γ應(yīng)答。(b)示出了分化期間以及用腫瘤裂解物脈沖和成熟之后的dc形態(tài)。(c)示出了在脈沖和成熟前后通過流式細(xì)胞術(shù)分析的dc表征?？梢钥闯?，在成熟之后，cd83和cd40的表達(dá)顯著提高。(d)示出了在選擇前后通過流式細(xì)胞術(shù)分析的初始t細(xì)胞表征。觀察到cd8+群增加，以及cd45ro+和cd57+記憶t細(xì)胞消耗。(e)中的圖顯示，經(jīng)hct3.11腫瘤裂解物脈沖的dc刺激體外自體同源oct4反應(yīng)性t細(xì)胞應(yīng)答。通過裝載有oct4和gfp(陽性對照)肽的t2細(xì)胞重新刺激來在ifn-γelispot中檢測t細(xì)胞針對腫瘤抗原的反應(yīng)性。示出了預(yù)先用以下刺激的t細(xì)胞的ifn-γ應(yīng)答：未經(jīng)脈沖的dc、經(jīng)野生型(wt)hct8細(xì)胞的裂解物脈沖的dc以及經(jīng)oct4-和gfp-表達(dá)hct3.1克隆、t細(xì)胞單獨(dú)和t2細(xì)胞單獨(dú)的裂解物脈沖的dc。***,p<0.001相對于t2單獨(dú)，通過方差分析。

圖5

[圖5]示出了用經(jīng)熱激腫瘤細(xì)胞進(jìn)行dc脈沖對結(jié)腸直腸csc反應(yīng)性t細(xì)胞的產(chǎn)生的作用。(a)示出了oskm表達(dá)的hct3.11細(xì)胞中熱激上調(diào)的hsp70而不影響oct4表達(dá)。樣品#1和#2：在具有(#1)或不具有(#2)熱激下在cellgro培養(yǎng)基中的細(xì)胞。樣品#3和#4：在具有(#4)或不具有(#3)熱激下在pbs中的細(xì)胞。(b)顯示，在用從經(jīng)熱激hct3.11細(xì)胞收集的上清液脈沖之后不影響成熟dc(mdc)上的dc標(biāo)志物表達(dá)。dc表征用流式細(xì)胞術(shù)來進(jìn)行。(c)是通過流式細(xì)胞術(shù)分析在dc致敏之后表征t細(xì)胞的結(jié)果。(d)顯示，用從經(jīng)熱激hct3.11細(xì)胞收集的上清液脈沖的dc在體外刺激針對結(jié)腸直腸csc的自體同源t細(xì)胞應(yīng)答。通過裝載指定肽的t細(xì)胞重新刺激來在ifn-γelispot中檢測t細(xì)胞針對腫瘤抗原的反應(yīng)性。包括以下用于進(jìn)行比較：無dc致敏下的t細(xì)胞、用經(jīng)未經(jīng)脈沖dc刺激的t細(xì)胞和用經(jīng)未熱激hct3.11的全裂解物脈沖之后的dc刺激的t細(xì)胞。

圖6

[圖6]概括了采用crc細(xì)胞的oskm重編程來進(jìn)行針對crccsc的dc疫苗接種的策略。oskm:oct4、sox2、klf4和c-myc；ctl：細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容

癌細(xì)胞重編程是csc分化成腫瘤細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)過程。該過程有利于非腫瘤發(fā)生性癌細(xì)胞向較不分化的狀態(tài)去分化，從而產(chǎn)生具有腫瘤引發(fā)能力的細(xì)胞群。

在第一個(gè)方面，提供了一種組合物，其包含通過與至少一種結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞或其碎片接觸而脈沖的至少一種分離的免疫系統(tǒng)細(xì)胞，其中所述結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞通過使至少一種分化的結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)以具有未分化的結(jié)腸直腸干細(xì)胞狀態(tài)獲得。

所述分離的免疫系統(tǒng)細(xì)胞可以是抗原呈遞細(xì)胞。示例性的抗原呈遞細(xì)胞包括但不限于樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、b細(xì)胞、活化上皮細(xì)胞等。

在一個(gè)實(shí)例中，所述抗原呈遞細(xì)胞是樹突細(xì)胞。dc作為最有效抗原呈遞細(xì)胞的鑒定和重組已經(jīng)是癌癥免疫治療中的顯著進(jìn)展之一。外源抗原可通過dc胞吞被捕獲，釋放到其細(xì)胞質(zhì)隔室中并路由至mhc-i抗原呈遞途徑。dc疫苗接種基于該抗原交叉呈遞過程，并且可誘導(dǎo)cd8+腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)，代表癌癥的潛在有效治療方案。dc還通過直接或間接地經(jīng)來源于效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞因子促進(jìn)免疫效應(yīng)細(xì)胞(例如，常規(guī)αβt細(xì)胞、γδt細(xì)胞、nk細(xì)胞和非變體nkt細(xì)胞)和dc之間的串?dāng)_而在橋連先天免疫和獲得性免疫中其關(guān)鍵作用。

先前的癌癥免疫治療涉及靶向表達(dá)分化的腫瘤抗原的細(xì)胞。最近來自動(dòng)物研究、培養(yǎng)人腫瘤細(xì)胞和臨床血樣的發(fā)現(xiàn)支持以下觀念：基于dc的csc疫苗接種通過選擇性靶向csc而賦予優(yōu)越的保護(hù)性抗腫瘤免疫。基于dc的csc疫苗可引發(fā)針對干細(xì)胞抗原的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答并且與誘導(dǎo)高效的保護(hù)性抗csc免疫相關(guān)。例如，與靶向主體腫瘤細(xì)胞相比，dc介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤csc神經(jīng)球靶向在小鼠中產(chǎn)生更大的抗腫瘤免疫。這些研究表明，盡管可能csc和正常成體干細(xì)胞之間共有的途徑產(chǎn)生免疫耐受，但是免疫系統(tǒng)仍然可識別這兩種類型干細(xì)胞之間的差異且對此作出反應(yīng)，并且隨后消除csc。由于csc公認(rèn)地對涉及化學(xué)和放射的傳統(tǒng)治療失效，因此作為靶向tsa和/或taa并且較不依賴于癌細(xì)胞的代謝或增殖狀況的治療平臺的免疫干預(yù)變得特別地有吸引力。csc對常規(guī)治療的抗性表明，這些癌癥引發(fā)細(xì)胞除了包含干細(xì)胞抗原之外還可包含多個(gè)編碼腫瘤特異性新抗原的突變。因此，使用csc作為dc疫苗制劑的腫瘤抗原源提供刺激針對未鑒定到的新抗原和與csc相關(guān)的腫瘤發(fā)生性抗原的免疫應(yīng)答從而導(dǎo)致csc殺死且具有持久益處的方式。

對于dc癌癥免疫治療，重要的是，有大量的腫瘤細(xì)胞可用于提供用于dc脈沖的腫瘤特異性抗原(tsa)和腫瘤相關(guān)抗原(taa)。從原發(fā)性腫瘤分離的csc在體外可容易地分化成代表腫瘤中大部分細(xì)胞的非csc。這是減慢發(fā)現(xiàn)靶向csc藥物的一個(gè)主要限制性因素，也是阻止大規(guī)模生產(chǎn)csc用于臨床癌癥免疫治療的一個(gè)技術(shù)障礙。

本公開內(nèi)容的免疫系統(tǒng)細(xì)胞是“分離的”。本文中使用的術(shù)語分離的意指“人工地”由其天然狀態(tài)改變而來；即，如果其天然存在，則其已發(fā)生改變或從其原始環(huán)境移出，或者二者。分離的免疫系統(tǒng)細(xì)胞可通過與至少一種結(jié)腸直腸csc或其碎片接觸而脈沖。分離的免疫系統(tǒng)細(xì)胞可以是例如未成熟的樹突細(xì)胞。術(shù)語“脈沖”指向未成熟的樹突細(xì)胞裝載抗原，或者使未成熟的樹突細(xì)胞暴露于抗原一段短時(shí)間。因此，任選地在如本文中所述的一種或多種成熟誘導(dǎo)劑存在下，“脈沖”未成熟樹突細(xì)胞可導(dǎo)致未成熟樹突細(xì)胞成熟為成熟樹突細(xì)胞。

通過“接觸”，細(xì)胞可與其他細(xì)胞或其碎片物理結(jié)合。例如，分離的免疫系統(tǒng)細(xì)胞可以通過與結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞或其碎片緊密接近或者通過與其物理結(jié)合而“接觸”結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞或細(xì)胞碎片。接觸可以是直接接觸，或者通過中間劑來進(jìn)行?？梢酝ㄟ^用腫瘤抗原“脈沖”未成熟樹突細(xì)胞來使其與腫瘤抗原接觸，所述腫瘤抗原例如經(jīng)熱激的腫瘤裂解物中存在的那些。

因此，在一個(gè)實(shí)例中，所述結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞可以是經(jīng)熱激的結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞或其碎片。所述碎片可以是經(jīng)熱激的結(jié)腸直腸干細(xì)胞的裂解物。垂死腫瘤細(xì)胞提供腫瘤抗原源和能夠觸發(fā)細(xì)胞活化的內(nèi)源性危險(xiǎn)信號。因此，可使用熱應(yīng)激來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，之后使用其裂解物，例如用于dc脈沖。熱激通常涉及使細(xì)胞經(jīng)受比細(xì)胞體內(nèi)的正常生理溫度更高的溫度。熱激的過程可以在多種介質(zhì)，例如在co2培養(yǎng)箱、o2培養(yǎng)箱中或在熱水浴中進(jìn)行。例如，可以在約42℃下將細(xì)胞熱處理約60分鐘。有利地，如下文實(shí)施例4所述，結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞的熱激過程使得產(chǎn)生更擅長引發(fā)csc抗原特異性ctl的成熟樹突細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，所述樹突細(xì)胞可以是未成熟的樹突細(xì)胞。例如，未成熟樹突細(xì)胞可如本文中所述由外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)產(chǎn)生。在用至少一種csc或其碎片脈沖之后，未成熟樹突細(xì)胞可變?yōu)槌墒鞓渫患?xì)胞，任選地如本文中所述在暴露于一種或多種成熟誘導(dǎo)劑之后。成熟樹突細(xì)胞可具有上調(diào)的cd83、cd40和cd86表達(dá)。有利地，本發(fā)明的成熟樹突細(xì)胞能夠誘導(dǎo)細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞針對癌癥干細(xì)胞抗原(例如結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞抗原)的特異性免疫應(yīng)答。

所述結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞可以是通過在體外使至少一種分化的腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為未分化的干細(xì)胞狀態(tài)而獲得的體外(試管衍生的)結(jié)腸直腸干細(xì)胞。術(shù)語“體外結(jié)腸直腸干細(xì)胞”、“試管結(jié)腸直腸干細(xì)胞”和“試管衍生的結(jié)直腸干細(xì)胞”在本文中可互換使用。

術(shù)語“逆轉(zhuǎn)”或“重編程”可指將分化的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化回未分化或非完全分化的細(xì)胞，即癌干細(xì)胞。例如，可將分化的結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞(例如sw480或hct-9細(xì)胞)“逆轉(zhuǎn)”或“重編程”為結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞。

術(shù)語“分化的結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞”可指完全分化(即其不具有進(jìn)一步分化的能力)的初始結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞(即，直接從對象獲得的結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞)。其還可指完全分化的結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞系。示例性的分化結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞包括人腸腺癌hct-9細(xì)胞或人結(jié)腸腺癌sw480細(xì)胞。分化的結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞還可包括但不限于人結(jié)腸腺癌sw620細(xì)胞、人結(jié)腸腺癌caco-2細(xì)胞、人結(jié)腸腺癌lovo細(xì)胞、人結(jié)腸腺癌colo205細(xì)胞、人結(jié)腸癌ht55細(xì)胞和人結(jié)腸癌ht155細(xì)胞。

術(shù)語“未分化的”當(dāng)在提及細(xì)胞使用時(shí)指能夠分化成一種或多種特化細(xì)胞類型的細(xì)胞。因此，“未分化”細(xì)胞是未分化的細(xì)胞或未完全分化的細(xì)胞?！拔捶只?xì)胞”可以是干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或去分化細(xì)胞。例如，“未分化”細(xì)胞可以是已經(jīng)重編程為未分化結(jié)腸直腸干細(xì)胞狀態(tài)的結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞?！拔捶只奔?xì)胞可以是多能的、多潛能的、寡能的或單能的。

“結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞”可指未分化的、去分化的或未完全(部分)分化的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，“結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞”處于“未分化結(jié)腸直腸干細(xì)胞狀態(tài)”。因此，“結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞”可具有分化成多種分化結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的潛力。其還可具有繼續(xù)增殖并產(chǎn)生更多“結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞”的能力。

在一個(gè)實(shí)例中，所述結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞是表達(dá)能夠在體外將分化結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)或重編程為未分化結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子的未分化結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)例中，所述未分化結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞通過用能夠?qū)⒎只Y(jié)腸直腸瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)或重編程為未分化結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子重編程分化結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞而獲得。

在另一個(gè)實(shí)例中，所述結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞通過用細(xì)胞重編程因子或轉(zhuǎn)錄因子逆轉(zhuǎn)或重編程分化結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞來獲得。所述細(xì)胞重編程因子或轉(zhuǎn)錄因子可包括但不限于oct4和sox2。

“結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞”可表達(dá)多種結(jié)腸直腸干細(xì)胞標(biāo)志物或“腫瘤相關(guān)”抗原，例如oct4和sox2。這些標(biāo)志物中的有一些可能是維持細(xì)胞的癌干細(xì)胞樣特性所必需的。“結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞”可以是結(jié)腸直腸csc樣細(xì)胞。結(jié)腸直腸csc樣細(xì)胞可如下獲得：將結(jié)腸直腸癌細(xì)胞(crc)oskm重編程為誘導(dǎo)多能癌(ipc)細(xì)胞并在癌癥干細(xì)胞(csc)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)多能癌(ipc)細(xì)胞以產(chǎn)生結(jié)腸直腸csc樣細(xì)胞，如圖6所示。

本公開內(nèi)容的結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞可以在體外制備。換言之，所述結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞可在試管中制備，因此術(shù)語“體外結(jié)腸直腸干細(xì)胞”、“試管結(jié)腸直腸干細(xì)胞”和“試管衍生的結(jié)直腸干細(xì)胞”。以此方式制備結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞克服了在使用癌干細(xì)胞進(jìn)行dc癌癥免疫治療中的兩個(gè)主要技術(shù)障礙。這兩個(gè)障礙是：1)癌干細(xì)胞在原發(fā)性腫瘤中罕見，因此難以分離和獲得足夠的用于dc疫苗接種的細(xì)胞；和2)從原發(fā)性腫瘤分離的癌干細(xì)胞將在體外迅速地分化成代表腫瘤中大多數(shù)細(xì)胞的非csc，因此不能提供用于dc疫苗接種的癌干細(xì)胞抗原。因此，本公開內(nèi)容能夠大規(guī)模生產(chǎn)用于臨床癌癥免疫治療的癌干細(xì)胞。

本公開內(nèi)容的特別令人驚訝的優(yōu)點(diǎn)是試管癌干細(xì)胞可提供足夠量和廣譜的腫瘤抗原，其可分為三類：1)多能性相關(guān)抗原，包括oct4和sox2：編碼多能性相關(guān)抗原的基因被位點(diǎn)特異性地引入癌細(xì)胞基因組中穩(wěn)定且高水平地表達(dá)，這在從原發(fā)性腫瘤分離的癌干細(xì)胞中很少見到；2)癌干細(xì)胞相關(guān)基因：試管癌干細(xì)胞表達(dá)許多癌干細(xì)胞相關(guān)的腫瘤發(fā)生性抗原，其由于多能性基因介導(dǎo)的細(xì)胞重編程而產(chǎn)生；和3)試管癌干細(xì)胞由分化的腫瘤細(xì)胞衍生，因此其還攜帶原始體細(xì)胞突變、內(nèi)部缺失、親代癌細(xì)胞中的染色體易位和與親代癌細(xì)胞相關(guān)的許多未鑒定的新抗原。

使用可作為穩(wěn)定癌細(xì)胞系培養(yǎng)的試管癌干細(xì)胞為疫苗制備和應(yīng)用提供許多技術(shù)優(yōu)勢。以此方式，可提供針對未被免疫系統(tǒng)識別為自體抗原的抗原的免疫保護(hù)。首先，使用已建立的細(xì)胞系有助于規(guī)避耗時(shí)且成本高的患者個(gè)體化gmp生產(chǎn)，并且消除連續(xù)生產(chǎn)定制的單獨(dú)疫苗的需求。其次，使用已建立的細(xì)胞系簡化物流、降低疫苗生產(chǎn)和遞送過程的勞力并且提高其成本效用。第三，使用已建立的細(xì)胞系允許高度標(biāo)準(zhǔn)化地大規(guī)模生產(chǎn)適合于具有特定腫瘤類型的所有患者的同種異體疫苗，所謂的“現(xiàn)成”產(chǎn)品。最后，與hla單倍型無關(guān)，使用單一批次的同種異體疫苗消除疫苗在質(zhì)量和組成方面的變化，有利于臨床結(jié)果的可靠比較分析。

在第二方面，提供了用于刺激對象的免疫系統(tǒng)的組合物，其包含通過與從結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞獲得的一種或多種抗原接觸而被脈沖的至少一種抗原呈遞細(xì)胞，其中所述結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞通過使至少一種分化結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)以具有未分化結(jié)腸直腸干細(xì)胞狀態(tài)獲得，其中所述逆轉(zhuǎn)是通過用包括但不限于oct4和sox2的細(xì)胞重編程因子或轉(zhuǎn)錄因子重編程從對象獲得的分化結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞獲得。

術(shù)語“刺激”免疫系統(tǒng)指激活免疫系統(tǒng)的多種組分，例如，如激活細(xì)胞毒性t細(xì)胞淋巴細(xì)胞，以針對特定的威脅作出反應(yīng)。例如，可刺激免疫系統(tǒng)以靶向和除去癌細(xì)胞。一種或多種抗原或疫苗可刺激免疫系統(tǒng)以針對這樣的威脅作出反應(yīng)。

抗原呈遞細(xì)胞和結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞都可從相同或不同的對象獲得。換言之，抗原呈遞細(xì)胞和結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞二者均可以是自體同源細(xì)胞，或者其可以是同種異體細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，抗原呈遞細(xì)胞和結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞二者均從同一對象獲得。因此，抗原呈遞細(xì)胞和結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞二者均是自體同源細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)例中，抗原呈遞細(xì)胞和結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞從不同的對象獲得。因此，抗原呈遞細(xì)胞和結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞是同種異體細(xì)胞。這些同種異體細(xì)胞在遺傳上是不相似的并且因此可能是免疫不相容的，即使兩個(gè)對象是同一物種。

可使用本領(lǐng)域已知的多種方法例如通過使用載體來將細(xì)胞重編程因子或轉(zhuǎn)錄因子遞送到結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞中。所述載體可包括核酸，包括表達(dá)控制元件，例如轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號、復(fù)制起點(diǎn)、多聚腺苷酸化信號、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等，其中所述控制元件與編碼基因產(chǎn)物例如oct4和sox2的核酸可操縱地相連。這些及其他共有載體元件的選擇是常規(guī)的，并且很多這樣的序列可從市售載體獲得。所述載體可以是質(zhì)粒載體、病毒載體或任何其他適于插入外來序列并導(dǎo)入真核細(xì)胞(例如結(jié)腸直腸癌細(xì)胞)中的合適載體。優(yōu)選地，所述載體是能夠指導(dǎo)細(xì)胞重編程因子或轉(zhuǎn)錄因子的dna序列轉(zhuǎn)錄的表達(dá)載體。病毒表達(dá)載體包括例如基于桿狀病毒、前列腺病毒、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒的載體。在一個(gè)實(shí)例中，通過使用桿狀病毒載體促進(jìn)遞送。

在一個(gè)實(shí)例中，使用包含以下的桿狀病毒載體來將細(xì)胞重編程因子或轉(zhuǎn)錄因子遞送到結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞中：鋅指核酸酶編碼序列和包含細(xì)胞重編程因子或轉(zhuǎn)錄因子的融合基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解，可使用其他載體，例如細(xì)菌載體(即質(zhì)粒)或其他病毒載體(例如上述腺病毒載體)來將細(xì)胞重編程因子或轉(zhuǎn)錄因子遞送到細(xì)胞中。

已經(jīng)重編程的結(jié)腸直腸干細(xì)胞的未分化狀態(tài)可基于癌干細(xì)胞特有的多種特征來鑒定。例如，未分化的結(jié)腸直腸干細(xì)胞可以以上皮特征喪失且e-鈣粘蛋白表達(dá)降低為特征?？商孢x地或另外地，未分化的結(jié)腸直腸干細(xì)胞狀態(tài)還可以以獲得間充質(zhì)特性且例如波形蛋白(vim)、纖連蛋白(fn1)、玻連蛋白(vtn)、n-鈣粘蛋白(cdh2)、snail(snai1)、twist(twist1)、鋅指e盒結(jié)合同源框1(zeb1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(tgfb1)、slug(snai2)和sox4差異表達(dá)為特征。仍然可替選地或另外地，未分化的結(jié)腸直腸干細(xì)胞狀態(tài)可以以表達(dá)包括但不限于以下的癌干細(xì)胞標(biāo)志物為特征：cd24、cs133、cd144、cd166、醛脫氫酶1(aldh1a1)、含有富亮氨酸重復(fù)序列的g蛋白偶聯(lián)受體5(lgr5)、二肽基肽酶4(dpp4)、連環(huán)蛋白β-1(ctnnb1)、atp結(jié)合盒亞家族g成員5(abcg5)和整聯(lián)蛋白β-1(itgb1)。

在一個(gè)實(shí)例中，提供了如本文中限定的組合物，其中所述未分化的結(jié)腸直腸干細(xì)胞狀態(tài)以下列至少一項(xiàng)為特征：(a)上皮特征喪失且e-鈣粘蛋白表達(dá)降低；(b)獲得間充質(zhì)特性且波形蛋白(vim)、纖連蛋白(fn1)、玻連蛋白(vtn)、n-鈣粘蛋白(cdh2)、snail(snai1)、twist(twist1)、鋅指e盒結(jié)合同源框1(zeb1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(tgfb1)、slug(snai2)和sox4差異表達(dá)；以及(c)表達(dá)選自以下的癌干細(xì)胞標(biāo)志物：cd24、cs133、cd144、cd166、醛脫氫酶1(aldh1a1)、含有富亮氨酸重復(fù)序列的g蛋白偶聯(lián)受體5(lgr5)、二肽基肽酶4(dpp4)、連環(huán)蛋白β-1(ctnnb1)、atp結(jié)合盒亞家族g成員5(abcg5)和整聯(lián)蛋白β-1(itgb1)。

在第三方面，提供了用于脈沖樹突細(xì)胞使得樹突細(xì)胞能夠誘導(dǎo)細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞針對體外結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物包含已從經(jīng)重編程的體外結(jié)腸直腸癌細(xì)胞富集的至少一種體外結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞或其碎片。

術(shù)語“富集”或其語法上的變化形式指在混合物中提高一個(gè)實(shí)體相對于其他實(shí)體的量的過程。例如，在細(xì)胞混合物中，可“富集”特定的細(xì)胞類型(例如體外結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞)使得其在混合物中以比其他細(xì)胞類型(例如不具有干細(xì)胞樣特性的結(jié)腸直腸癌細(xì)胞)更高的量(即更高的數(shù)量)存在。體外結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞或其碎片可以是如上所述的。

在第四方面，提供了產(chǎn)生經(jīng)刺激的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的方法，其包括使結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞或其碎片與至少一種免疫系統(tǒng)細(xì)胞接觸，其中所述結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞通過使至少一種分化的結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)至其未分化的干細(xì)胞狀態(tài)獲得。

所述結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞可以是表達(dá)能夠?qū)⒎只Y(jié)腸直腸瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)或重編程為未分化癌干細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄因子的未分化癌干細(xì)胞。所述未分化結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞可通過用能夠?qū)⒎只Y(jié)腸直腸瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)成未分化結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞的重編程因子或轉(zhuǎn)錄因子重編程分化結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞獲得。

分化結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞向其未分化干細(xì)胞狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)可通過如上所述的用選自oct4和sox2的細(xì)胞重編程因子或轉(zhuǎn)錄因子重編程結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞可如上所述是自體同源細(xì)胞或同種異體細(xì)胞。所述免疫系統(tǒng)細(xì)胞可以是抗原呈遞細(xì)胞，例如樹突細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，所述樹突細(xì)胞是未成熟的樹突細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，所述未成熟樹突細(xì)胞在暴露于經(jīng)重編程的結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞之后并且任選地在暴露于如上所述的成熟誘導(dǎo)劑之后可變成cd83、cd40和cd86表達(dá)上調(diào)的成熟樹突細(xì)胞。

在所公開方法中使用的結(jié)腸直腸干細(xì)胞可以是如上所述的體外(或試管衍生的)結(jié)腸直腸干細(xì)胞。所述癌干細(xì)胞可以進(jìn)一步是經(jīng)熱激的癌干細(xì)胞或其碎片。所述碎片可以是經(jīng)熱激癌干細(xì)胞的裂解物。可施加的熱激條件如上文和實(shí)施例中所述。

本文中限定的方法可以是體內(nèi)、離體或體外方法。

可使用如上文和實(shí)施例中所述的載體將細(xì)胞重編程因子或轉(zhuǎn)錄因子遞送到腫瘤細(xì)胞中。所述載體可以是包含鋅指核酸酶編碼序列和含有細(xì)胞重編程因子的融合基因的桿狀病毒載體。

如上所述，所述方法中使用的結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞的未分化干細(xì)胞狀態(tài)可通過多種特征來鑒定，所述特征例如下列至少一項(xiàng)：

(a)上皮特征喪失且e-鈣粘蛋白表達(dá)降低；(b)獲得間充質(zhì)特性且波形蛋白(vim)、纖連蛋白(fn1)、玻連蛋白(vtn)、n-鈣粘蛋白(cdh2)、snail(snai1)、twist(twist1)、鋅指e盒結(jié)合同源框1(zeb1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(tgfb1)、slug(snai2)和sox4差異表達(dá)；以及(c)表達(dá)選自以下的癌干細(xì)胞標(biāo)志物：cd24、cs133、cd144、cd166、醛脫氫酶1(aldh1a1)、含有富亮氨酸重復(fù)序列的g蛋白偶聯(lián)受體5(lgr5)、二肽基肽酶4(dpp4)、連環(huán)蛋白β-1(ctnnb1)、atp結(jié)合盒亞家族g成員5(abcg5)和整聯(lián)蛋白β-1(itgb1)。

在第五方面，提供了一種疫苗，其包含用本文中限定的方法刺激的至少一種免疫細(xì)胞。所述免疫細(xì)胞可以是抗原呈遞細(xì)胞。所述抗原呈遞細(xì)胞可以是樹突細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，所述免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞是從接受疫苗的對象獲得的自體同源細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)例中，免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞是從接受疫苗的不同對象獲得的同種異體細(xì)胞。

所述疫苗可包含可藥用載體。所述疫苗還可包含佐劑，所述佐劑增加對象對疫苗的免疫應(yīng)答。合適的佐劑包括但不限于氫氧化鋁(明礬)、免疫刺激復(fù)合物(immunostimulatingcomplex，iscoms)、非離子嵌段聚合物或共聚物、細(xì)胞因子(如il-1、il-2、il-7、ifn-α、ifn-β、ifn-γ等)、皂苷、單磷酰脂質(zhì)a(monophosphoryllipida，mla)、胞壁酰二肽(muramyldipeptide，mdp)等。其他合適的佐劑包括例如硫酸鋁鉀、從大腸桿菌(escherichiacoli)分離的熱不穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性腸毒素、霍亂毒素或其b亞基、白喉毒素、破傷風(fēng)毒素、百日咳毒素、弗氏不完全佐劑或完全佐劑?；诙舅氐淖魟?，例如白喉毒素、破傷風(fēng)毒素和百日咳毒素可以在使用前例如通過用甲醛處理滅活。

在第六方面，提供了從如本文中限定的方法獲得的經(jīng)刺激免疫細(xì)胞。所述經(jīng)刺激的免疫細(xì)胞可以是抗原呈遞細(xì)胞，例如樹突細(xì)胞。

如上所述的組合物、疫苗或經(jīng)刺激免疫細(xì)胞可用于治療，例如用于治療癌癥，例如結(jié)腸直腸癌。

在第七方面，提供了在對象中治療結(jié)腸直腸癌的方法，其包括用如本文中限定的組合物或如本文中限定的疫苗或通過如本文中限定的方法刺激的免疫細(xì)胞免疫對象。

在第八方面，提供了如本文中限定的組合物或如本文中限定的疫苗或通過如本文中限定的方法刺激的免疫細(xì)胞在制備用于在對象中治療結(jié)腸直腸癌的藥物中的用途。

術(shù)語“對象”指人或其他哺乳動(dòng)物，并且包括期望使用本發(fā)明的方法、組合物、疫苗和/或經(jīng)刺激免疫細(xì)胞來檢查或治療的任何個(gè)體。然而，應(yīng)當(dāng)理解，“對象”并非暗示存在癥狀。在本發(fā)明范圍內(nèi)的合適對象包括但不限于靈長類動(dòng)物、家畜動(dòng)物(例如綿羊、牛、馬、驢、豬)、實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)動(dòng)物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠)、伴侶動(dòng)物(例如貓、狗)和捕獲的野生動(dòng)物(例如狐貍、鹿)。所述術(shù)語不指示特定的年齡。因此，期望涵蓋成年和新生個(gè)體。所述對象優(yōu)選地是人，但還可以是家畜、實(shí)驗(yàn)室對象或?qū)櫸飫?dòng)物。在一個(gè)實(shí)例中，所述對象是癌癥患者，例如結(jié)腸直腸癌患者。所述患者可以是處于癌癥的任何階段例如i期、ii期、iii期或iv期的患者。所述患者可以是遭受癌癥復(fù)發(fā)或再發(fā)的患者。

本文中使用的術(shù)語“治療”或其變化形式包括無論如何補(bǔ)救疾病狀態(tài)或癥狀、預(yù)防疾病建立或以其他方式預(yù)防、阻止、延遲或逆轉(zhuǎn)疾病或其他不期望癥狀以任何方式進(jìn)展的任何和所有用途。因此，“治療”包括預(yù)防性治療和治療性治療。

在第九方面，提供了產(chǎn)生用于對象的包含自體同源樹突細(xì)胞的抗結(jié)腸直腸癌疫苗的方法，其包括以下步驟：(a)提取并純化從來自對象的樣品獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞(單核細(xì)胞)；(b)在有效誘導(dǎo)單核細(xì)胞向樹突細(xì)胞分化的條件下培養(yǎng)單核細(xì)胞；(c)使(b)中的經(jīng)培養(yǎng)未成熟樹突細(xì)胞與癌干細(xì)胞或其碎片接觸，所述癌干細(xì)胞或其碎片通過將至少一種分化結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)至其未分化結(jié)腸直腸干細(xì)胞狀態(tài)獲得；和(d)用樹突細(xì)胞成熟誘導(dǎo)劑培養(yǎng)(c)中裝載有結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞的樹突細(xì)胞；以及(e)收獲裝載有結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞的成熟樹突細(xì)胞作為抗癌疫苗。

“外周血單個(gè)核細(xì)胞”可以是具有圓形核的任何血細(xì)胞。例如，外周血單個(gè)核細(xì)胞可以是淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞。外周血單個(gè)核細(xì)胞可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)例如通過ficoll-paque^tm技術(shù)和/或通過細(xì)胞分選技術(shù)例如磁激活細(xì)胞分選(magnetic-activatedcellsorting，macs)從取自對象的血樣中提取并純化。由這些技術(shù)獲得的單核細(xì)胞可在“有效誘導(dǎo)單核細(xì)胞向樹突細(xì)胞分化的條件”下培養(yǎng)。例如，可如下所述用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor，gm-csf)和白介素-4(interleukin-4，il4)培養(yǎng)hla-a2+人外周血單個(gè)核細(xì)胞以獲得未成熟樹突細(xì)胞。因此，在一個(gè)實(shí)例中，第九方面的方法中(b)的條件包括在包含gm-csf和il-4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)單核細(xì)胞。

如本文中限定的“樹突細(xì)胞成熟誘導(dǎo)劑”指能夠誘導(dǎo)或引起樹突細(xì)胞從未成熟狀態(tài)成熟的制劑。樹突細(xì)胞成熟誘導(dǎo)劑的實(shí)例包括但不限于如下所述的脂多糖(lps)和干擾素-γ。

在一個(gè)實(shí)例中，提供了包含通過與如上所述的至少一種結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞或其碎片接觸而致敏的至少一種分離的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的組合物，其中如上所述的結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞如上所述通過使至少一種分化結(jié)腸直腸瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)以具有未分化結(jié)腸直腸干細(xì)胞狀態(tài)獲得。在該實(shí)例中，分離的免疫系統(tǒng)細(xì)胞可以是例如t細(xì)胞，并且所述接觸可以是間接接觸，例如經(jīng)由已經(jīng)用上述結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞或其碎片脈沖的樹突細(xì)胞接觸。

本文中舉例說明性地描述的本發(fā)明可適當(dāng)?shù)卦诓淮嬖谌魏我?、限制下?shí)施，雖然在本文中未具體公開。因此，例如，術(shù)語“包括”、“包括”及其變化形式等將被廣泛地且無限制地理解。另外，本文中采用的術(shù)語和表達(dá)用作描述性而不是限制性術(shù)語，并且在使用這些術(shù)語和表達(dá)時(shí)并不意在排除所示和所描述的特征或其部分的任何等同物，而是認(rèn)識到在所要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)多種修改是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本發(fā)明已經(jīng)通過優(yōu)選實(shí)施方案和可選特征具體公開，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員仍可采用本文中體現(xiàn)的本發(fā)明的變化方案和改變方案，并且認(rèn)為這樣的變化方案和改變方案在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本文中已廣泛且一般性地描述了本發(fā)明。落入一般性公開內(nèi)容中的每個(gè)較窄種類和亞屬群組也形成本發(fā)明的一部分。這包括具有從屬中移除任何主題的附帶條件或否定限制的本發(fā)明的一般性描述，而不管所排除的材料是否在本文中具體描述。

其他實(shí)施方案在所附權(quán)利要求書和非限制性實(shí)例內(nèi)。此外，當(dāng)用馬庫什組描述在發(fā)明的特征或方面時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，因此還根據(jù)馬庫什組的任何單獨(dú)成員或亞組成員描述本發(fā)明。

除非上下文明確地另外指出，否則本申請中使用的沒有數(shù)量詞修飾的名詞包括復(fù)數(shù)參考。例如，術(shù)語“制劑”包括多種試劑，包括其混合物。

在本公開內(nèi)容通篇，本發(fā)明的各個(gè)方面可以以范圍形式示出。應(yīng)當(dāng)理解，范圍形式的描述僅僅是為了方便和簡潔，并且不應(yīng)被解釋為對本發(fā)明范圍的不靈活限制。因此，范圍的描述應(yīng)認(rèn)為已經(jīng)具體公開了所有可能的子范圍以及在該范圍內(nèi)的單獨(dú)數(shù)值。例如，例如1至6的范圍描述應(yīng)認(rèn)為已經(jīng)具體公開了例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3到6等的子范圍，以及在該范圍內(nèi)的單獨(dú)數(shù)值，例如1、2、3、4、5和6。不管范圍的寬度，這均適用。

本文中使用的關(guān)于數(shù)值平均值使用的術(shù)語“約”指例如數(shù)值的+50％或+30％，優(yōu)選+20％，更優(yōu)選+10％，仍更優(yōu)選+5％，并且最優(yōu)選+1％。在必要時(shí)，詞語“約”可以從本發(fā)明的定義中省略。

實(shí)施例

實(shí)施例1材料和方法

使用鋅指核酸酶技術(shù)來將稱為oskm因子(oct4、sox2、klf4和cmyc)的一組細(xì)胞重編程因子插入crc細(xì)胞基因組中用于這些癌細(xì)胞的誘導(dǎo)重編程。使用腫瘤球形成方法，從經(jīng)重編程的crc細(xì)胞富集csc樣細(xì)胞。這些csc樣細(xì)胞一致地顯示出cd24和許多其他結(jié)腸直腸csc相關(guān)抗原的上調(diào)表達(dá)。然后，將這些csc樣細(xì)胞用于樹突細(xì)胞(dc)疫苗接種，其已經(jīng)被測試作為crc的輔助治療。在用經(jīng)oskm表達(dá)crc的細(xì)胞裂解物脈沖的dc致敏自體同源初始t細(xì)胞之后，通過用裝載有csc抗原相關(guān)肽的t2細(xì)胞再刺激來在ifn-γelispot測定中檢測t細(xì)胞。顯著增加的ifn-γ陽性斑點(diǎn)證明，經(jīng)脈沖的dc能夠在自體同源t細(xì)胞中引發(fā)抗csc抗原應(yīng)答。因此，oskm表達(dá)crc細(xì)胞系可用作提供dc疫苗接種的csc相關(guān)抗原的容易獲得的來源，這是可提高患有crc的患者的治療效果的方法。

質(zhì)粒和重組bv載體

使用允許目的基因通過轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)移到桿狀病毒穿梭載體(桿粒)中的供體質(zhì)粒pfastbac1(invitrogen,carlsbad,ca)作為構(gòu)建用于產(chǎn)生桿狀病毒的重組質(zhì)粒的質(zhì)粒骨架。如前所述，將鋅指核酸酶(zfn)編碼序列亞克隆到pfastbac1供體質(zhì)粒中(phang等,2013；tay等,2013)。為了構(gòu)建pfb-zfn，使用基因合成服務(wù)(lifetechnologies,carlsbad,ca)基于先前報(bào)道的氨基酸序列(hockemeyer等,2009)來合成編碼右側(cè)和左側(cè)zfn的兩個(gè)dna片段，其各自為993bp。工程化的zfn包含屬于與foki內(nèi)切核酸酶的專性異二聚體形式融合的aavs1基因座的右和左同源臂(miller等,2007)。將合成的構(gòu)建體克隆到pma(ampr)(lifetechnologies)中。然后，通過pcr擴(kuò)增兩個(gè)片段，并分別使用noti/xbai(對于右側(cè)zfn)和kpni/hindiii(對于左側(cè)zfn)將其亞克隆到pfastbac1中。然后，從pfb-ef1α-egfp-hyg-lox(ramachandra等,2011)擴(kuò)增1.1kb人延伸因子1α(ef1α)啟動(dòng)子，并使用bamhi/noti克隆到上述構(gòu)建體中以驅(qū)動(dòng)zfn表達(dá)。最后，從pires(clontech,mountainviewca)擴(kuò)增0.6kb內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)，并使用xbai/kpni插入在右側(cè)和左側(cè)zfnorf之間。aavs1開始于ppp1r12c基因的外顯子1的5’端上游424bp，并且結(jié)束于在3’端下游3.35kb。使用pfbzfn來靶向ppp1r12c基因的內(nèi)含子1內(nèi)的區(qū)域。

攜帶aavs1同源臂的供體載體pfb-oskm和pfb-egfp-oskm的構(gòu)建先前已有報(bào)道(phang等,2013；zhu等,2013)。oskm表達(dá)盒含有ef1a啟動(dòng)子；由與自切割2a序列和ires連接的人oct4、klf4、sox2和c-myc基因組成的融合基因(oskm)；以及土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(wpre)。為了構(gòu)建具有重編程因子的供體質(zhì)粒pfb-oskm，從pzdonor-aavs1(sigma-aldrich,stlouis,mo)擴(kuò)增屬于aavs1基因座的810bp左同源臂和837bp右同源臂，并使用snabbi/sali(對于左同源臂)和notq/bstbq(對于右同源臂)插入其是先前構(gòu)建的pfastbac1載體pfb-pgk-neo-egfp-loxp(ramachandra等,2011)中，其包含異種特異性或野生型loxp位點(diǎn)。在去除egfp編碼序列后，使用ecori和sbfi將攜帶ecori-asci-sbfi限制性位點(diǎn)的63bp銜接子序列引入pfb-aavs1。然后，通過asci和sbfi限制性位點(diǎn)插入sv40聚(a)信號。

最后，從phage-ef1a-stemcca(millipore,bedford,ma)擴(kuò)增含有ef1a啟動(dòng)子、4個(gè)ipsc轉(zhuǎn)錄因子基因(與自切割2a序列和ires連接作為融合基因人oct4、klf4、sox2和c-myc基因)和土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件的多順反子盒并使用ecori/asci插入到經(jīng)修飾的pfb-aavs1質(zhì)粒中以構(gòu)建pfb-oskm。為了構(gòu)建pfb-egfp-oskm，通過單ecori限制性酶將完整的egfp編碼序列引入pfb-oksm并重新連接。添加小牛腸堿性磷酸酶(ciap)以防止消化的骨架載體自連接。用于載體構(gòu)建的引物列于下面的補(bǔ)充表1中。

分別使用pfbzfn、pfb-oskm和pfb-egfp-oskm＝產(chǎn)生重組bv，包括bv-zfn、bv-oskm和bv-egfp-oskm，并且根據(jù)invitrogen的bac-to-bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的方案在sf9昆蟲細(xì)胞中增殖。本研究中的重組dna研究遵循國家衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth)的指南。

人誘導(dǎo)多能癌細(xì)胞的產(chǎn)生和結(jié)腸直腸csc的衍生

人腸腺癌hct-8細(xì)胞和人結(jié)腸腺癌sw480細(xì)胞最初由新加坡國立大學(xué)(nationaluniversityofsingapore)的linqinsong博士提供，并且在具有10％胎牛血清(fbs；invitrogen,carlsbad,ca)的dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dmem)(高葡萄糖)中進(jìn)行培養(yǎng)。使用有限稀釋法進(jìn)行單細(xì)胞克隆。使用隨機(jī)選擇的hct-8和sw480亞克隆進(jìn)行遺傳修飾以將oskm基因引入aavs1基因座中。具體地，在桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的前一天，將1×10⁴個(gè)癌細(xì)胞接種在6孔板的一個(gè)孔中完全生長培養(yǎng)基中。用bv-zfn和bvegfp-oskm(或bv-oskm)載體以每個(gè)細(xì)胞100空斑形成單位(pfu)的感染復(fù)數(shù)(moi)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，各自持續(xù)6小時(shí)。第二天，在上述相同條件下再次轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第3天開始400μg/ml下的g418選擇，并且每天更換培養(yǎng)基持續(xù)7天。在第10天，將轉(zhuǎn)導(dǎo)的癌細(xì)胞解離并且將1×10³個(gè)細(xì)胞重新鋪板在接種有絲裂霉素c失活小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mef)的新鮮的孔板中一個(gè)孔中的人ipsc培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基由80％dmem/f12、20％knockout血清替代品(invitrogen)、2mml-谷氨酰胺、0.1mmβ-巰基乙醇(sigma-aldrich)、0.1mm非必需氨基酸(invitrogen)、10ng/mlbfgf(peprotech，rockyhill，nj)和青霉素/鏈霉素組成。每天更換培養(yǎng)基。在第20天至25天，機(jī)械地分離具有限定邊界的緊湊的ips細(xì)胞樣集落，并在人ips細(xì)胞培養(yǎng)基中的mef上擴(kuò)增成ipc細(xì)胞克隆。每7天人工地傳代這些hct-8和sw480衍生的ipc細(xì)胞集落。通過用移液管刮取分化細(xì)胞或通過機(jī)械地傳代未分化細(xì)胞的單個(gè)菌落來使細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)。

在將hct-8和sw480衍生的ipc細(xì)胞分化成結(jié)腸直腸csc之前，在無飼養(yǎng)條件下在matrigel包被的板(bdscience,franklinlakes,nj)上用mtesr培養(yǎng)基(stemcelltechnology,bc,canada)在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)條件(37℃，5％co2)在加濕培養(yǎng)箱中擴(kuò)增ipc細(xì)胞集落。使用accumax(millipore,bedford,ma)將擴(kuò)增的細(xì)胞解離為單細(xì)胞，并以每孔1×10⁴的密度接種在0.1％明膠包被的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板(nalgenuncinternational,rochester,ny)上。將細(xì)胞在由補(bǔ)充有以下的dmem/f12(1:1混合物)培養(yǎng)基構(gòu)成的csc培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)：1％fbs、2％b27(invitrogen)、2mml-谷氨酰胺、50單位/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素和20ng/ml人表皮生長因子(egf)(sigma-aldrich)。傳代1個(gè)月之后，獲得均質(zhì)細(xì)胞群用于csc表征。對于傳代，將細(xì)胞用1×dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(invitrogen)洗滌，用0.25％(w/v)胰蛋白酶-0.53mmedta處理，并在未經(jīng)包被的t25培養(yǎng)瓶上以1:10的分傳比(splitratio)進(jìn)行傳代培養(yǎng)?？蓪⑦@些細(xì)胞冷凍保存在含有10％dmso的csc完全生長培養(yǎng)基中，并且其在從液氮儲存中解凍后保持存活。

基因組dna提取和基因分型

使用dneasy血液和組織試劑盒(qiagen,hilden,germany)分離細(xì)胞的基因組dna。使用pcr基因分型來驗(yàn)證oskm表達(dá)盒在由zfn介導(dǎo)的同源重組驅(qū)動(dòng)的aavs1位點(diǎn)的位點(diǎn)特異性整合。優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液由以下組成：21.5μltaqdna聚合酶高保真度主混合物(invitrogen)、0.5μl的10μm每種正向和反向引物、1.5μldmso和1μl200ng/μldna模板?；蚪Mdna的pcr擴(kuò)增使用以下參數(shù)進(jìn)行：初始變性步驟：94℃下5分鐘；隨后是35個(gè)循環(huán)：94℃下25秒，65℃下45秒和72℃下150秒；最后是延伸步驟：72℃下10分鐘。在1％瓊脂糖凝膠上分析擴(kuò)增產(chǎn)物。用于pcr擴(kuò)增的引物列于下面的補(bǔ)充表1中。

對于southern印跡分析，用ecori消化基因組dna(10μg)過夜。將消化的dna上樣到1％瓊脂糖凝膠上，并在25v下電泳10小時(shí)。然后，使用干印跡系統(tǒng)(invitrogen)將dna轉(zhuǎn)移至包含帶正電荷的尼龍膜的dna轉(zhuǎn)移堆(invitrogen)。在轉(zhuǎn)移后立即將膜在1.5mnacl/0.5mnaoh變性溶液中溫育10分鐘并風(fēng)干。在130mj/cm²下進(jìn)行uv交聯(lián)之后，將膜與digeasyhyb(roche,indianapolis,in)雜交過夜。使用pcrdig探針合成試劑盒(roche)合成靶向oksm表達(dá)盒的wpre區(qū)的dig標(biāo)記的探針。在雜交之后，將膜嚴(yán)格洗滌，封閉，然后與由即用型(roche)cdp-star檢測的抗地高辛-ap綴合物(digdna標(biāo)記和檢測試劑盒，roche)孵育。首先，將膜在40℃下用2xssc/0.1％sds洗滌兩次，然后在65℃下用0.1×ssc/0.1％sds洗滌兩次。使用dig洗滌和封閉緩沖液套裝(roche)進(jìn)行封閉和洗滌。使攜帶dna的膜暴露于化學(xué)發(fā)光成像分析儀(chemiluminescentimageanalyzer；imagequantlas4000mini,gehealthcarebiosciences,pittsburgh,pa)15分鐘。用于合成dig-標(biāo)記的探針的引物列于下面的補(bǔ)充表1中。

pcr定量實(shí)時(shí)pcr

提取總rna，并使用superscriptiiifirst-strandsynthesissystem(invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄。對于rt-pcr分析，使用以下參數(shù)進(jìn)行pcr擴(kuò)增：初始變性步驟：94℃下5分鐘；之后是25至30個(gè)循環(huán)：94℃下15秒，60℃下45秒和72℃下30秒；最后是延伸步驟：72℃下5分鐘。在2.5％瓊脂糖凝膠上分析擴(kuò)增產(chǎn)物。用于內(nèi)源、外源和總oskm(人oct4、sox2、klf4和c-myc基因)分析的pcr引物組列于下面的補(bǔ)充表1中。

對于定量實(shí)時(shí)pcr(qpcr)分析，使用rt實(shí)時(shí)sybrgreenpcr主混合物來擴(kuò)增合成的cdna。使用管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)來進(jìn)行內(nèi)部歸一化。使用2xquantitectsybrgreenpcr主混合物在兩步rt-pcr中擴(kuò)增cdna。目的基因的表達(dá)水平的歸一化通過將其相對表達(dá)水平除以gapdh的相對表達(dá)水平來進(jìn)行。每個(gè)基因的相對基因表達(dá)水平通過一式三份實(shí)驗(yàn)獲得。使用δδct方法來評價(jià)基因表達(dá)的相對量化。通過計(jì)算2^-δδct來確定相對基因表達(dá)的倍數(shù)變化。進(jìn)行qpcr分析以量化結(jié)腸直腸csc標(biāo)志物、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(emt)標(biāo)志物、常用結(jié)腸直腸癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物物和在全基因組關(guān)聯(lián)研究中鑒定的最顯著結(jié)腸直腸癌相關(guān)基因座(gwas)的表達(dá)。

熒光染色、western印跡分析和流式細(xì)胞術(shù)分析

將ipc細(xì)胞集落接種在matrigel包被的24孔室載玻片上，并在室溫下在4％多聚甲醛中固定30分鐘。為了誘導(dǎo)細(xì)胞的通透性，添加0.1％triton并孵育10分鐘。在用pbs洗滌之后，將細(xì)胞在封閉溶液(5％bsa)中孵育1小時(shí)。使用的一抗是針對nanog(1:100,r&dsystems,minneapolis,mn)、tra1-60(1:100,millipore)和ssea-4(1:200,santacruz)的那些。使用山羊抗兔igg-fitc或小鼠抗兔igg-羅丹明(santacruzbiotechnology)作為二抗。在抗體孵育之后，通過dapi(1:1000，chemicon)染色樣品以用于細(xì)胞核染色。然后，通過熒光顯微鏡拍攝圖像。

對于western印跡分析，用包含蛋白酶抑制劑混合物(nacalaitesque)的ripa緩沖液裂解細(xì)胞。使用xmark微板分光計(jì)(biorad)用蛋白質(zhì)測定染料試劑(biorad)來測量裂解物的蛋白質(zhì)濃度。上樣蛋白裂解物用于進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，sds-page)，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(biorad)。將膜在室溫下封閉1小時(shí)，然后在4℃下用小鼠抗-cd24(beckmancoulter)、兔抗sox2(abcam)和兔抗-oct4(abcam)抗體孵育過夜，之后用hrp綴合的二抗孵育。使用pierceeclwestern印跡底物(thermoscientific)使免疫反應(yīng)條帶可視化。使用β-肌動(dòng)蛋白抗體來確定相等上樣。

對于流式細(xì)胞術(shù)分析，使用以下單克隆抗體來鑒定和計(jì)數(shù)csc：藻紅蛋白(pe)-或別藻藍(lán)蛋白(apc)標(biāo)記的抗-cd133(克隆ac133/1；miltenyibiotec)、apc標(biāo)記的抗-cd24(克隆32d12；miltenyibiotec)、apc標(biāo)記的抗-cd44(克隆db105；miltenyibiotec)和pe標(biāo)記的抗-cd166(克隆3a6；bdpharmingen)。添加10μl每種抗體綴合物多至每100μlmacs緩沖液(pbs,ph7.2,0.5％bsa,and2mmedta)10⁷個(gè)有核細(xì)胞以用于標(biāo)記細(xì)胞并隨后通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。為了校正與熒光團(tuán)fitc和pe的光譜重疊，egfp陽性細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析需要顏色補(bǔ)償。

腫瘤球形成測定、集落形成測定、軟瓊脂集落形成測定、創(chuàng)傷愈合測定和細(xì)胞遷移/侵入測定

腫瘤球形成測定如前所述但稍作修改來進(jìn)行(lo等,2012)。將細(xì)胞在無血清的非粘附條件下在96孔超低附著板(corning,corning,ny)中的csc培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。將200個(gè)細(xì)胞接種到96孔板的每個(gè)孔中，并對每個(gè)克隆測試20個(gè)孔(總共4,000個(gè)細(xì)胞)。在培養(yǎng)1周之后，使用40x放大倍率透鏡在相差顯微鏡下計(jì)數(shù)腫瘤球的數(shù)目。腫瘤球應(yīng)具有實(shí)體的圓形結(jié)構(gòu)，尺寸為50微米至250微米不等。

對于集落形成測定，將rpmi-1640培養(yǎng)基加10％fbs中的細(xì)胞(400個(gè)細(xì)胞/2ml)分配到6孔培養(yǎng)板中并培養(yǎng)3周。用giemsa染色溶液(invitrogen)染色可視化形成的集落數(shù)，并在相差顯微鏡下計(jì)數(shù)。

對于軟瓊脂集落形成測定，將細(xì)胞以每孔1e4的密度一式三份地鋪板在具有0.6％基礎(chǔ)瓊脂和0.4％頂層瓊脂的6孔板中，并在37℃，5％co2中孵育一個(gè)月。將集落用mtt染色2小時(shí)，拍照，并用imagej量化。

對于創(chuàng)傷愈合測定，將細(xì)胞以一式三份接種在6孔板中，并在形成匯合單層之后使用200-μl尖端刮擦。在孵育后0小時(shí)和48小時(shí)，在相差顯微鏡下捕獲圖像，并分析刮擦的閉合。

對于細(xì)胞遷移和侵入測定，將細(xì)胞懸浮在無血清dmem中，并以5×10⁴/孔的密度接種到8-μm孔徑transwell室(bdbioscience)的頂室中。用geltrex(lifetechnologies)包被室用于侵入測定，同時(shí)使用未經(jīng)包被的室進(jìn)行遷移測定。用鈣黃綠素-am(5μg/ml)(lifetechnologies)通過在37℃下孵育30分鐘預(yù)標(biāo)記細(xì)胞，并將其接種到頂室。用15％fbs作為化學(xué)引誘物制備底室。在37℃下孵育24小時(shí)后，用固定/染色溶液(0.1％結(jié)晶紫、1％福爾馬林和20％乙醇)固定將遷移且通過膜侵入并固定至膜下表面的細(xì)胞以用于可視化并在顯微鏡下計(jì)數(shù)。通過用通過geltrex侵入的細(xì)胞數(shù)除以遷移通過未包被的插入膜的細(xì)胞數(shù)來計(jì)算細(xì)胞侵入率。

畸胎瘤形成測定

為了測試ipc細(xì)胞的畸胎瘤形成能力，使用accutase(millipore)解離1×10⁶個(gè)細(xì)胞，并與pbs中的0.5×10⁶經(jīng)絲裂霉素處理的hff混合至總體積為50μl。在移植之前，向制備的細(xì)胞中添加50μl未經(jīng)稀釋的冷matrigel(bectondickinson,franklinlakes,nj)。將細(xì)胞注射到5周齡nod/scidil2rg(裸)(nsg)小鼠的后腿中。在注射后兩個(gè)月，取出所得畸胎瘤并固定在4％多聚甲醛中，包埋在石蠟中，切成5μm切片，并用蘇木精和伊紅染色。動(dòng)物的所有處理和護(hù)理均根據(jù)由新加坡國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究委員會(nationaladvisorycommitteeforlaboratoryanimalresearch，singapore)發(fā)布的用于科學(xué)目的的動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。

實(shí)施例2

通過穩(wěn)定表達(dá)oskm基因產(chǎn)生結(jié)腸直腸癌ipc細(xì)胞

最近開發(fā)了用于oskm因子基因的位點(diǎn)特異性整合的基于桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的工程化鋅指核酸酶(zfn)技術(shù)(phang等,2013)。該技術(shù)涉及使用兩種非整合型桿狀病毒載體：一種表達(dá)zfn(bv-zfn)，另一種作為供體載體編碼oskm轉(zhuǎn)錄因子基因(bv-oskm)。bv-oskm攜帶含有與自切割2a序列和ires連接作為融合基因并由ef1a啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人oct4、klf4、sox2和c-myc基因的表達(dá)盒。所述表達(dá)盒在兩側(cè)以與aavs1基因座同源的序列為側(cè)翼。在用bv-zfn和bv-oskm共轉(zhuǎn)導(dǎo)之后(圖1a)，可將表達(dá)盒有效地引入人染色體19中的aavs1基因座中，這是具有側(cè)翼為保護(hù)所整合轉(zhuǎn)基因免于基因沉默從而促進(jìn)經(jīng)修飾細(xì)胞中的穩(wěn)健和持續(xù)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的絕緣子元件的開放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)。用該技術(shù)來測試人crchct-8和sw480細(xì)胞的單細(xì)胞衍生亞克隆中的癌細(xì)胞重編程。

在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第15天將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到絲裂霉素c失活小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mef)的飼養(yǎng)層并將其在人ips細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)之后，在第20天左右觀察到早期集落的形成。集落呈現(xiàn)出邊界尖銳的緊湊細(xì)胞形態(tài)(圖1b)，并且對ap染色呈陽性。pcr基因分型證明在6個(gè)受檢樣品中5個(gè)中oskm盒的aavs1位點(diǎn)整合(圖1c)，其通過southern印跡分析得到進(jìn)一步證實(shí)。產(chǎn)生的集落表達(dá)典型的胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物，如通過免疫染色(圖1d)、rt-pcr分析和流式細(xì)胞術(shù)分析所證明的。為了檢測其分化潛力，將從集落收集的細(xì)胞注射到nsg小鼠的后腿中以形成畸胎瘤。通過組織學(xué)檢查評估形成的畸胎瘤的分化譜，并證明在畸胎瘤中來自所有三個(gè)胚胎胚層的細(xì)胞的存在(圖1e)。這些發(fā)現(xiàn)證明，crc細(xì)胞可重編程為ipc細(xì)胞，并且一些重編程細(xì)胞顯示出多能性。

實(shí)施例3

oskm的異位表達(dá)賦予人crc細(xì)胞以csc樣特性

將hct8和sw480衍生的ipc細(xì)胞在由補(bǔ)充有1％fbs和20ng/ml人表皮生長因子(egf)的dmem/f12的1:1混合物組成的csc培養(yǎng)基中擴(kuò)增。使用rtqpcr方法，確定所選擇的克隆中oskm基因的相對表達(dá)水平(圖2a)。與野生型(wt)細(xì)胞相比，在所有受檢hct8和sw480克隆中觀察到8倍至400倍的sox2過表達(dá)。在5個(gè)受檢克隆中的4個(gè)中觀察到oct4的上調(diào)2倍至100倍。western印跡分析證實(shí)了這些克隆中oct4和sox2蛋白的表達(dá)上調(diào)。c-myc和klf4的上調(diào)不是那么明顯，可能是因?yàn)閔ct8和sw480crc亞克隆中的內(nèi)源基因的高水平表達(dá)。

試圖闡明oskm基因的異位表達(dá)在csc的表型特征中的作用。形成腫瘤球的能力是csc的一個(gè)特征。當(dāng)將hct3.11和sw1.9克隆解離成單細(xì)胞懸浮液并在超低附著板中培養(yǎng)時(shí)，與wthct8和sw480亞克隆相比，檢測到在第14天形成顯著更高數(shù)量的腫瘤球數(shù)(圖2b)。通過流式細(xì)胞術(shù)在數(shù)個(gè)oskm表達(dá)的hct8和sw480克隆中分析常用于crc的四種充分研究的csc表面標(biāo)志物的表達(dá)：prominin1(cd133)、cd44抗原(cd44)、小細(xì)胞肺癌簇4抗原(cd24)和活化白細(xì)胞細(xì)胞粘附分子(cd166)。在所有受檢克隆中一致地觀察到cd24上調(diào)，甚至在僅顯示sox2上調(diào)的克隆(hct1.8)中也如此(圖2c)。確定csc表型的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)是通過將系列稀釋物注射到免疫缺陷小鼠中來檢查受試細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤發(fā)生性。通過在nodscid小鼠中皮下注射10,000個(gè)腫瘤細(xì)胞來進(jìn)行體內(nèi)腫瘤發(fā)生性測試，并檢測到在hct3.11接種后10只小鼠中有6只中形成腫瘤，而在接種hct/wt細(xì)胞后在10只小鼠中根本沒有腫瘤形成。用hct3.11和sw1.9克隆進(jìn)行的體外測定還證明集落形成、細(xì)胞侵入和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性提高。因此，oct4和sox2的過表達(dá)足以在crc細(xì)胞中誘導(dǎo)csc特性。

為了進(jìn)一步表征所衍生的oskm表達(dá)細(xì)胞，用實(shí)時(shí)rt-pcr分析對以下三種hct克隆進(jìn)行標(biāo)志物基因表達(dá)的深度評估：無oskm修飾的單細(xì)胞克隆(hct/wt)、其中oct4和sox2二者均上調(diào)的hct3.11，以及僅sox2上調(diào)的hct1.8。除cd24、cd133、cd44和cd166之外，其他的受試結(jié)腸直腸csc標(biāo)志物包括醛脫氫酶1(aldh1a1)、含富亮氨酸重復(fù)序列的g蛋白偶聯(lián)受體5(lgr5)、二肽基肽酶4(dpp4)、連環(huán)蛋白β-1(ctnnb1)、atp結(jié)合盒亞家族g成員5(abcg5)和整聯(lián)蛋白β-1(itgb1)。值得注意的是，檢測到hct3.11中的aldh1a1基因表達(dá)上調(diào)10倍(圖3a)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在白血病和數(shù)種類型的實(shí)體瘤中表達(dá)高水平aldh1a1的腫瘤細(xì)胞顯示出歸因于csc的特性。由于csc樣細(xì)胞可通過異常激活上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(emt)而產(chǎn)生，因此進(jìn)行定量rt-pcr分析以確定emt標(biāo)志物的表達(dá)。上皮特征的喪失可通過e-鈣粘蛋白表達(dá)來檢測，而間充質(zhì)特性的獲得可通過以下的表達(dá)來確定：波形蛋白(vim)、纖連蛋白(fn1)、玻連蛋白(vtn)、n-鈣粘蛋白(cdh2)、snail(snai1)、twist(twist1)、鋅指e盒結(jié)合同源框1(zeb1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(tgfb1)、slug(snai2)和sox4。發(fā)現(xiàn)在hct1.8中波形蛋白、zeb1和slug上調(diào)，在hct3.11中纖連蛋白和slug重新調(diào)節(jié)(圖3b)。還進(jìn)行實(shí)時(shí)rt-pcr分析以檢測通常用于診斷和預(yù)后的臨床設(shè)置的crc標(biāo)志物的基因表達(dá)水平，所述標(biāo)志物包括癌胚抗原(cea)、ca19-9(b3galt5和st6galnac6)、胸苷酸合酶(ts)、胸苷磷酸化酶(tp)、二氫嘧啶脫氫酶(dpd)、gtp酶kras(kras)和腫瘤抑制子p53(tp53)。在hct3.11中dpd顯著上調(diào)，高達(dá)30倍(圖3c)。已知腫瘤組織中dpd的過表達(dá)與對化學(xué)治療的不敏感性相關(guān)。進(jìn)一步量化與在gwas中鑒定的最顯著crc相關(guān)基因座相關(guān)的14個(gè)基因的表達(dá)。檢測到在hct3.11中多梳復(fù)合蛋白(polycombcomplexprotein，bmi-1)基因、mothersagainstdecapentaplegichomolog7(smad7)基因和神經(jīng)內(nèi)分泌7b2(scg5)基因上調(diào)和在hct1.8中bmi1和formin-1(fmn1)基因的上調(diào)(圖3d)。oskm表達(dá)對多種與crc相關(guān)的病理標(biāo)志物的影響表明這些轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤發(fā)生和crc發(fā)育中的重要作用。

實(shí)施例4

裝載有oskm表達(dá)crc的裂解物的人樹突細(xì)胞在體外致敏自體同源t細(xì)胞之后引發(fā)結(jié)腸直腸csc抗原特異性t細(xì)胞應(yīng)答

鑒于oskm表達(dá)crc細(xì)胞中的csc樣特性增加，對用這些細(xì)胞脈沖的dc進(jìn)行評估以確定其是否可用于致敏對oct4抗原具有反應(yīng)性的人t細(xì)胞(圖4a)。用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)和白介素-4(il-4)由hla-a2+人外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)產(chǎn)生未成熟dc(圖4b)。這些dc對dc標(biāo)志物例如cd11c、cd86和dc-sign呈陽性，但顯示t細(xì)胞共刺激分子cd40的表達(dá)水平低并且cd83幾乎不表達(dá)，cd83是對刺激t細(xì)胞重要的分子(圖4c)。為了引發(fā)免疫應(yīng)答，dc應(yīng)從抗原加工細(xì)胞成熟為抗原呈遞細(xì)胞(apc)。在用脂多糖(lps)和干擾素-γ(inf-γ)成熟之后，pbmc衍生的dc上調(diào)cd83和cd40以及cd86的表達(dá)：對于cd83和cd40而言，分別從未成熟dc中的0.96％和48.97％上調(diào)至成熟dc中的98.76％和99.30％(圖4b、圖4c)。還使用macs從pbmc中選擇初始t細(xì)胞，其使cd8+細(xì)胞從28％增加至98％，并顯著減少cd45ro+和cd57+記憶t細(xì)胞(圖4d)。然后，用hct3.11腫瘤細(xì)胞裂解物脈沖的dc致敏這些初始t細(xì)胞以產(chǎn)生ctl。免疫后識別個(gè)別抗原的特異性t細(xì)胞的頻率通常非常低。檢測個(gè)體細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的方法elispot技術(shù)在測量t細(xì)胞免疫中高度靈敏，可能在1:10,000至1:1,000,000的頻率范圍內(nèi)檢測抗原特異性t細(xì)胞。因此,進(jìn)行ifn-γelispot測定以分析針對oct4的抗原特異性t細(xì)胞應(yīng)答。用裝載有oct4和gfp(陽性對照)肽的t2細(xì)胞再刺激后t細(xì)胞反應(yīng)性顯著提高(圖4e)證明，裝載有oskm表達(dá)crc的裂解物的人dc能夠在自體同源t細(xì)胞中引發(fā)抗csc抗原應(yīng)答。

由于垂死腫瘤細(xì)胞提供腫瘤抗原源和能夠觸發(fā)抗原呈遞細(xì)胞活化的內(nèi)源危險(xiǎn)信號二者，已經(jīng)使用熱應(yīng)激來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，之后使用其裂解物用于dc脈沖。熱應(yīng)激強(qiáng)烈地提高熱激蛋白(heatshockprotein，hsp)的水平，熱激蛋白是在低水平組成型表達(dá)并在細(xì)胞應(yīng)激條件下顯著誘導(dǎo)的獨(dú)特蛋白的超家族。在免疫系統(tǒng)中，這些蛋白質(zhì)可誘導(dǎo)dc的成熟并提供用于特異性觸發(fā)獲得性免疫應(yīng)答的伴侶多肽。為了測試是否受應(yīng)激的垂死腫瘤細(xì)胞能夠用作dc脈沖的優(yōu)越抗原源，將oskm表達(dá)的hct3.11細(xì)胞在42℃熱處理60分鐘。在37℃下培養(yǎng)2小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞回收之后，將經(jīng)熱處理的細(xì)胞冷凍并解凍6個(gè)循環(huán)，收集細(xì)胞上清液用于dc脈沖。在經(jīng)熱處理的細(xì)胞中觀察到hsp70蛋白的上調(diào)且不影響oct4表達(dá)(圖5a)。在使用從熱激細(xì)胞收集的上清液脈沖dc之后，檢測dc表面標(biāo)志物表達(dá)，并且在腫瘤上清液脈沖的dc和在未脈沖而成熟的dc之間沒有觀察到差異(圖5b)。然后，將這些dc用于t細(xì)胞致敏。在與dc共培養(yǎng)連續(xù)兩周之后，cd8+t細(xì)胞擴(kuò)增9倍，而對于使用未經(jīng)脈沖dc致敏的t細(xì)胞，觀察到6倍擴(kuò)增。在用dc致敏細(xì)胞之后，進(jìn)一步檢測t細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)。用從熱激細(xì)胞收集的上清液脈沖的dc致敏的t細(xì)胞已變成效應(yīng)t細(xì)胞，并且其中一些檢測為記憶t細(xì)胞(圖5c)。使用ifn-γelispot測定，與用未經(jīng)熱激的hct3.11的全裂解物致敏的t細(xì)胞相比，在用從熱激細(xì)胞收集的上清液脈沖的dc致敏t細(xì)胞之后，檢測到針對oct4、sox2以及數(shù)種其他csc-和crc-相關(guān)抗原的抗原特異性t細(xì)胞應(yīng)答提高(圖5d)。這些研究表明，攝取熱激腫瘤細(xì)胞的凋亡小體可產(chǎn)生更擅長引發(fā)csc抗原特異性ctl的成熟dc。

實(shí)施例5

很多臨床試驗(yàn)已證明基于自體同源樹突細(xì)胞(dc)的細(xì)胞免疫治療的安全性和功效。鑒于oct4、sox2、cd24以及很多其他csc標(biāo)志物的上調(diào)與多種人癌癥類型中的不良預(yù)后相關(guān)的臨床觀察，在此已開發(fā)了針對csc的dc疫苗接種的新策略(圖6)，其中已證明oskm表達(dá)的crc細(xì)胞的細(xì)胞裂解物可用作與未分化csc相關(guān)的抗原的可及來源，未分化csc用于dc脈沖以誘導(dǎo)針對結(jié)腸直腸csc的特異性免疫應(yīng)答。如圖6中所示，首先對結(jié)腸直腸癌細(xì)胞(crc)進(jìn)行“oskm重編程”(即使用包含oct4、sox2、klf4和c-myc基因的oskm表達(dá)盒重編程)變?yōu)檎T導(dǎo)多能癌(ipc)細(xì)胞。如本文所述將ipc細(xì)胞在癌干細(xì)胞(csc)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)以獲得結(jié)腸直腸csc樣細(xì)胞。然后，對csc樣細(xì)胞進(jìn)行熱激處理并裂解以產(chǎn)生包含期望腫瘤抗原的裂解物。使用經(jīng)熱激的裂解物脈沖由已使用本文中所述的方法從患者獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞制備的未成熟dc(pbmc)。然后，將經(jīng)脈沖的dc注射回患者內(nèi)以誘導(dǎo)體內(nèi)t細(xì)胞致敏和擴(kuò)增。這產(chǎn)生對結(jié)腸直腸csc具有特異性的cd8+ctls。

oct4和sox2基因在癌干細(xì)胞中的表達(dá)

干細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)顯著發(fā)展是通過用oskm轉(zhuǎn)錄因子重編程分化的體細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干(ips)細(xì)胞。oct4和sox2以及nanog是編碼負(fù)責(zé)維持胚胎干(es)細(xì)胞多能性的調(diào)控線路中核心元件的三個(gè)基因。klf4在癌發(fā)生和正常發(fā)育二者中均起重要作用，尤其是在對es細(xì)胞和ips細(xì)胞的自我更新和多能性重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起重要作用。myc是得到充分研究的典型癌基因，并且是很多不同人癌癥中最高度擴(kuò)增的癌基因之一。

已注意到通過重編程的ips細(xì)胞衍生和致癌性轉(zhuǎn)化之間具有高相似性：二者均可通過一系列遺傳修飾和表觀遺傳修飾來誘導(dǎo)并且利用類似的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。在由分化體細(xì)胞變?yōu)閕ps細(xì)胞的過程期間，細(xì)胞獲得無限的增殖特性和自我更新活性，這兩個(gè)特征對癌細(xì)胞最重要。事實(shí)上，研究已經(jīng)表明，ips基因在多種類型的腫瘤中均表達(dá)并且參與其發(fā)育，支持細(xì)胞重編程和腫瘤轉(zhuǎn)化利用共同機(jī)制的觀念。oct4的異位表達(dá)可劑量依賴性地提高胚胎干細(xì)胞的惡性潛能，并且足以在小鼠中誘導(dǎo)腫瘤。sox2已被鑒定為肺和食管鱗狀細(xì)胞癌中擴(kuò)增的譜系存活癌基因。在低分化實(shí)體瘤中可頻繁地檢測到多能性相關(guān)因子的表達(dá)提高，表明這些惡性細(xì)胞已獲得未分化的干細(xì)胞特性。在臨床上，癌癥亞型中oct4和sox2的表達(dá)提高與侵襲性疾病進(jìn)程例如未分化組織學(xué)、對治療的抗性、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和較短的患者存活率相關(guān)。由于所述相關(guān)性，已提出這兩種蛋白質(zhì)為癌癥患者中遠(yuǎn)端復(fù)發(fā)和預(yù)后不良的新預(yù)示物。

最近，已出現(xiàn)將oct4和sox2基因與csc聯(lián)系起來的直接證據(jù)。發(fā)現(xiàn)，與具有相同衍生的相對分化的癌細(xì)胞相比，這兩種蛋白在數(shù)種癌癥的csc中富集。在肺癌衍生的cd133陽性細(xì)胞中，需要oct-4表達(dá)以維持細(xì)胞的癌干細(xì)胞樣特性。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，sox2的敲減導(dǎo)致膠質(zhì)瘤csc的增殖受到抑制并且腫瘤發(fā)生性喪失。在骨肉瘤中，已鑒定到這樣的腫瘤細(xì)胞亞群，其能夠激活外源性oct4報(bào)道子并且與用oct4陽性細(xì)胞和oct4陰性細(xì)胞重建異源性腫瘤的對應(yīng)物相比更具腫瘤發(fā)生性。在乳腺癌中，oct4在正常乳腺細(xì)胞中的異位表達(dá)導(dǎo)致在裸鼠中產(chǎn)生具有腫瘤引發(fā)和移生能力的細(xì)胞并且發(fā)生高級的低分化的乳腺癌。在上皮卵巢癌中，從卵巢原發(fā)性腫瘤分離的csc具有增強(qiáng)的oct4表達(dá)。在crc中，ips基因的異位表達(dá)促進(jìn)人crc細(xì)胞的球體形成、增殖、集落形成和遷移，并且crc中ips基因表達(dá)的標(biāo)志可用于預(yù)測癌癥患者的存活。

這些發(fā)現(xiàn)表明，ips基因可能是csc誘導(dǎo)的主要調(diào)控基因和維持csc身份的關(guān)鍵因子。作為在csc上過表達(dá)或在這些腫瘤發(fā)生性細(xì)胞中具有高活性但在正常組織中表達(dá)受限的蛋白質(zhì)，oct4和sox2產(chǎn)物是免疫干預(yù)的潛在靶標(biāo)。

作為腫瘤抗原源oskm表達(dá)csc樣細(xì)胞

本研究的主要目的是研究用經(jīng)oskm表達(dá)crc細(xì)胞脈沖的人dc是否可誘導(dǎo)sox2/oct4特異性ctl和結(jié)腸直腸csc抗原特異性ctl。這些crc細(xì)胞具有在細(xì)胞表面上以高密度表達(dá)的oskm基因產(chǎn)物作為過表達(dá)的“腫瘤相關(guān)”抗原。多能性相關(guān)抗原作為癌癥免疫治療靶標(biāo)是有吸引力的，因?yàn)檫@類抗原可能對可限制體內(nèi)存在的反應(yīng)性t細(xì)胞，尤其是是高親合力t細(xì)胞的庫的免疫耐受機(jī)制較不易感。在臨床上，靶向csc上多能性相關(guān)基因的疫苗可用于針對具有低分化特征的多種癌癥，而不是靶向限定的癌癥亞群。因此，這些疫苗可用作通用的癌癥免疫治療平臺，特別是在維持治療以預(yù)防或延遲癌癥復(fù)發(fā)的情況下。已經(jīng)研究了人免疫系統(tǒng)介導(dǎo)針對多能性相關(guān)基因的t細(xì)胞應(yīng)答的能力。

當(dāng)測試人白細(xì)胞抗原(hla)-a*0201-限制性sox2衍生肽對膠質(zhì)瘤反應(yīng)性cd8+ctl的活化時(shí)，可產(chǎn)生針對該肽的特異性ctl并且其能夠裂解膠質(zhì)瘤細(xì)胞，證明sox2為ctl的靶抗原。雖然可在健康人的外周血中容易地檢測到oct4特異性記憶cd4+t細(xì)胞，但是僅在患有新診斷的生殖細(xì)胞腫瘤的患者的35％中檢測到針對oct4的免疫。

然而，生殖細(xì)胞腫瘤的化學(xué)治療導(dǎo)致在這些患者中體內(nèi)誘導(dǎo)抗oct4免疫，表明人中缺乏對oct4的免疫耐受。除多能性相關(guān)基因之外，oskm工程化crc細(xì)胞還表達(dá)很多csc相關(guān)的腫瘤發(fā)生性抗原，并且因此用作由于oskm基因介導(dǎo)的重編程產(chǎn)生的csc抗原的豐富來源。由于其還攜帶原始體細(xì)胞突變、內(nèi)部缺失、親代癌細(xì)胞中的染色體易位和與變化相關(guān)的很多未鑒定到的新抗原，因此這些oskm表達(dá)crc細(xì)胞將提供廣譜的腫瘤抗原。

穩(wěn)定癌細(xì)胞系的使用為疫苗制備和應(yīng)用提供了很多優(yōu)點(diǎn)。首先，使用已建立的細(xì)胞系的使用有助于規(guī)避耗時(shí)和成本高的患者個(gè)體化gmp生產(chǎn)，并且消除對連續(xù)生產(chǎn)定制的單獨(dú)疫苗的需求。其次，使用已建立的細(xì)胞系簡化物流、降低疫苗生產(chǎn)和遞送過程的勞力并且提高其成本效用。第三，使用已建立的細(xì)胞系允許高度標(biāo)準(zhǔn)化地大規(guī)模生產(chǎn)適于具有特定腫瘤類型的所有患者的同種異體疫苗，所謂的“現(xiàn)成”產(chǎn)品。最后，與hla單倍型無關(guān)，對所有疫苗使用單一批次的同種異體疫苗消除疫苗在質(zhì)量和組成方面的變化，有利于臨床結(jié)果的可靠比較分析。

結(jié)論

在切除原發(fā)性腫瘤之后，在未接受化學(xué)治療的患有iv期crc的患者中生存中值為8個(gè)月，在接受化學(xué)治療的患者中為21個(gè)月。已引入例如伊立替康(cpt-11)和奧沙利鉑(ohp)的活性化學(xué)治療性藥物來治療患有轉(zhuǎn)移性crc的患者。然而，受副作用和累積毒性的限制，連續(xù)化學(xué)治療的時(shí)長很少超過6個(gè)月。作為典型方式，以預(yù)定數(shù)量的周期(3至6個(gè)月)進(jìn)行化學(xué)治療，隨后完全中斷或用毒性較低的藥物維持。當(dāng)前的研究有可能導(dǎo)致開發(fā)基于自體同源免疫細(xì)胞的治療方案，即靶向csc的基于dc的免疫治療，希望該方案可用作crc維持治療的選擇方案。雖然數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)針對crc對dc癌癥免疫治療進(jìn)行了測試，但是使用dc方案來靶向csc的努力仍然是之前尚未探索的開創(chuàng)性工作。當(dāng)前的研究是有吸引力的，因?yàn)槠淅没蚬こ谭椒▉碓鰪?qiáng)crc細(xì)胞的csc性質(zhì)，之后將其用于dc脈沖。本文中關(guān)于通過oskm因子來轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)csc基因表達(dá)而公開的發(fā)現(xiàn)不僅揭示了對csc中的分子調(diào)控機(jī)制的基本了解，并且還為開發(fā)新的crc治療提供了重要線索。

補(bǔ)充表1

用于靶向oksm轉(zhuǎn)基因整合和過表達(dá)的引物

補(bǔ)充表1(繼續(xù))

用于dna甲基化分析的引物

補(bǔ)充表1(繼續(xù))

用于人結(jié)腸直腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物的引物

補(bǔ)充表1(繼續(xù))

用于上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(emt)標(biāo)志物的引物

補(bǔ)充表1(繼續(xù))

用于結(jié)腸直腸癌預(yù)后生物標(biāo)志物的引物

補(bǔ)充表1(繼續(xù))

用于在gwas中鑒定的結(jié)腸直腸癌高風(fēng)險(xiǎn)基因座的引物

補(bǔ)充表1(繼續(xù))

用cd24核心啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄調(diào)控的引物

補(bǔ)充表1(繼續(xù))

用于emsa測定的經(jīng)生物素標(biāo)記的寡核苷酸

補(bǔ)充表1(繼續(xù))

用于敲除cd243’-utr上的mir-205結(jié)合位點(diǎn)的引物

補(bǔ)充表1(繼續(xù))

用于敲除cd24orf的引物

參考文獻(xiàn)

1.hockemeyer,d.,soldner,f.,beard,c.,gao,q.,mitalipova,m.,dekelver,r.c.,katibah,g.e.,amora,r.,boydston,e.a.,zeitler,b.etal.(2009)efficienttargetingofexpressedandsilentgenesinhumanescsandipscsusingzinc-fingernucleases.naturebiotechnology,27,851-857.

2.miller,j.c.,holmes,m.c.,wang,j.,guschin,d.y.,lee,y.l.,rupniewski,i.,beausejour,c.m.,waite,a.j.,wang,n.s.,kim,k.a.etal.(2007)animprovedzinc-fingernucleasearchitectureforhighlyspecificgenomeediting.naturebiotechnology,25,778-785.

3.phangrz,tayfc,gohsl,lauch,zhuh,tanwk,liangq,chenc,dus,liz,tayjc,wuc,zengj,fanw,tohhc,wangs.zincfingernuclease-expressingbaculoviralvectorsmediatetargetedgenomeintegrationofreprogrammingfactorgenestofacilitatethegenerationofhumaninducedpluripotentstemcells.stemcellstranslmed.2013dec；2(12):935-45.

4.ramachandra,c.j.,shahbazi,m.,kwang,t.w.,choudhury,y.,bak,x.y.,yang,j.andwang,s.(2011)efficientrecombinase-mediatedcassetteexchangeattheaavs1locusinhumanembryonicstemcellsusingbaculoviralvectors.nucleicacidsresearch,39,e107.

5.tayfc,tanwk,gohsl,ramachandracj,lauch,zhuh,chenc,dus,phangrz,shahbazim,fanw,wangs.targetedtransgeneinsertionintotheaavs1locusdrivenbybaculoviralvectormediatedzincfingernucleaseexpressioninhuman-inducedpluripotentstemcells.jgenemed.2013oct；15(10):384-95.

6.zhu,h.,lau,c.h.,goh,s.l.,liang,q.,chen,c.,du,s.,phang,r.z.,tay,f.c.,tan,w.k.,li,z.etal.(2013)baculoviraltransductionfacilitatestalen-mediatedtargetedtransgeneintegrationandcre/loxpcassetteexchangeinhuman-inducedpluripotentstemcells.nucleicacidsresearch,41,e180.

序列列表

<110>新加坡科技研究局

<120>上調(diào)癌干細(xì)胞標(biāo)志物以產(chǎn)生抗原特異性細(xì)胞毒性效應(yīng)t細(xì)胞的方法

<130>9869sg3314

<160>205

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化總oct4表達(dá)(正向引物)

<400>1

tattcagccaaacgaccatc20

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化總oct4表達(dá)(反向引物)

<400>2

gcctctcactcggttctc18

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化總sox2表達(dá)(正向引物)

<400>3

acgacgtgagcgccctgcagtacaa25

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化總sox2表達(dá)(反向引物)

<400>4

gctggagctggcctcggacttgacc25

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化總klf4表達(dá)(正向引物)

<400>5

cctacacaaagagttcccatc21

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化總klf4表達(dá)反向引物)

<400>6

agtgcctggtcagttcatc19

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化總c-myc表達(dá)(正向引物)

<400>7

aggaacaagaagatgaggaag21

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化總c-myc表達(dá)(反向引物)

<400>8

tgcgtagttgtgctgatg18

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化外源oct4表達(dá)(正向引物)

<400>9

gtactcctcggtccctttcc20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化外源oct4表達(dá)(反向引物)

<400>10

cacctgcaagtttcagcaaa20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化外源sox2表達(dá)(正向引物)

<400>11

catgtcccagcactaccaga20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化外源sox2表達(dá)(反向引物)

<400>12

acatcccctgcttgtttcaa20

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化外源klf4表達(dá)(正向引物)

<400>13

gaccacctcgccttacacat20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化外源klf4表達(dá)(反向引物)

<400>14

ccaaaagacggcaatatggt20

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化外源c-myc表達(dá)(正向引物)

<400>15

aagaggacttgttgcggaaa20

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化外源c-myc表達(dá)(反向引物)

<400>16

ggcattaaagcagcgtatcc20

<210>17

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化內(nèi)源oct4表達(dá)(正向引物)

<400>17

aaggaattgggaacacaaagg21

<210>18

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化內(nèi)源oct4表達(dá)(反向引物)

<400>18

caagagcatcattgaacttcac22

<210>19

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化內(nèi)源sox2表達(dá)(正向引物)

<400>19

gggaaatgggaggggtgcaaaagagg26

<210>20

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化內(nèi)源sox2表達(dá)(反向引物)

<400>20

ttgcgtgagtgtggatgggattggtg26

<210>21

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化內(nèi)源klf4表達(dá)(正向引物)

<400>21

tggtgcttggtgagtcttg19

<210>22

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化內(nèi)源klf4表達(dá)(反向引物)

<400>22

aggtcataaatgttgatcggaag23

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化內(nèi)源c-myc表達(dá)(正向引物)

<400>23

ccttgccgcatccacgaaac20

<210>24

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化內(nèi)源c-myc表達(dá)(反向引物)

<400>24

ccttgctcgggtgttgtaagttc23

<210>25

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶ecori-asci-sbfi限制性位點(diǎn)的銜接子序列

<400>25

acagaattcctgcgcgccaagttacggcgcgccc34

<210>26

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶ecori-asci-sbfi限制性位點(diǎn)的銜接子序列

<400>26

ttagcatacattatacctgcaggcac26

<210>27

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>檢測oksm-egfp供體在aavs1基因座處的位點(diǎn)特異性整合(正向引物)

<400>27

gctacgtcccttcggccctcaatc24

<210>28

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>oksm-egfp供體在aavs1基因座處的位點(diǎn)特異性整合(反向引物)

<400>28

gcctccctaagacccagaagtccag25

<210>29

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>檢測oksm-egfp盒在基因組中的多重整合的southern印跡的探針設(shè)計(jì)(正向引物)

<400>29

gactggtattcttaactatgttgctcc27

<210>30

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>檢測oksm-egfp盒在基因組中的多重整合的southern印跡的探針設(shè)計(jì)(反向引物)

<400>30

caaagggagatccgactcgtctga24

<210>31

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增經(jīng)二硫化物處理的oct3/4啟動(dòng)子(正向引物)

<400>31

gaggttggagtagaaggattgttttggttt30

<210>32

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增經(jīng)二硫化物處理的oct3/4啟動(dòng)子(反向引物)

<400>32

cccccctaacccatcacctccaccacctaa30

<210>33

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增未經(jīng)二硫化物處理的oct3/4啟動(dòng)子(正向引物)

<400>33

gaggctggagcagaaggattgctttggccc30

<210>34

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增未經(jīng)二硫化物處理的oct3/4啟動(dòng)子(反向引物)

<400>34

cccccctggcccatcacctccaccacctgg30

<210>35

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增經(jīng)二硫化物處理的nanog啟動(dòng)子(正向引物)

<400>35

tggttaggttggttttaaatttttg25

<210>36

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增經(jīng)二硫化物處理的nanog啟動(dòng)子(反向引物)

<400>36

aacccacccttataaattctcaatta26

<210>37

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增未經(jīng)二硫化物處理的nanog啟動(dòng)子(正向引物)

<400>37

tggccaggctggtttcaaactcctg25

<210>38

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增未經(jīng)二硫化物處理的nanog啟動(dòng)子(反向引物)

<400>38

gacccacccttgtgaattctcagtta26

<210>39

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增經(jīng)二硫化物處理的rex1啟動(dòng)子(正向引物)

<400>39

ggtttaaaagggtaaatgtgattatattta30

<210>40

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增經(jīng)二硫化物處理的rex1啟動(dòng)子(反向引物)

<400>40

caaactacaaccacccatcaac22

<210>41

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增未經(jīng)二硫化物處理的rex1啟動(dòng)子(正向引物)

<400>41

ggcctaaaagggtaaatgtgattacaccca30

<210>42

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增未經(jīng)二硫化物處理的rex1啟動(dòng)子(反向引物)

<400>42

caggctacagccacccatcagc22

<210>43

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnacd133(正向引物)

<400>43

cttcatccacagatgctcctaag23

<210>44

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnacd133(反向引物)

<400>44

tggattcatatgccttctgtaaga24

<210>45

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnacd44(正向引物)

<400>45

agggatcctccagctcctttcg22

<210>46

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnacd44(反向引物)

<400>46

cgtccgagagatgctgtagcga22

<210>47

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnacd166(正向引物)

<400>47

gtgtgtctgggagaagacgctg22

<210>48

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnacd166(反向引物)

<400>48

ggtacgtcaagtcggcaaggtatg24

<210>49

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnaabcb5(正向引物)

<400>49

atccacaagccagactagaaggc23

<210>50

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnaabcb5(反向引物)

<400>50

agatccaactgcttcctttctcag24

<210>51

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnaaldh1a1(正向引物)

<400>51

tgagccagtcacctgtgttcca22

<210>52

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnaaldh1a1(反向引物)

<400>52

tggcagagctcctcctcagttg22

<210>53

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnacd29(正向引物)

<400>53

atcagacgcgcagaggaggc20

<210>54

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnacd29(反向引物)

<400>54

gagcaaacacacagcaaactgaactg26

<210>55

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnactnnb1(正向引物)

<400>55

acggaggaaggtctgaggagca22

<210>56

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnactnnb1(反向引物)

<400>56

tgagtagccattgtccacgctgg23

<210>57

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnalgr5(正向引物)

<400>57

acagtgcggcagacgtaaggat22

<210>58

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnalgr5(反向引物)

<400>58

ggagcagctgactgatgttgttcatac27

<210>59

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnacd26(正向引物)

<400>59

gtggaaggttcttctgggact21

<210>60

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnacd26(反向引物)

<400>60

actgcccatcaggagatattgaat24

<210>61

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnae-鈣粘蛋白(正向引物)

<400>61

gggtgactacaaaatcaatc20

<210>62

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnae-鈣粘蛋白(反向引物)

<400>62

gggggcagtaagggctcttt20

<210>63

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrna波形蛋白(正向引物)

<400>63

tgaaggaggaaatggctcgtc21

<210>64

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrna波形蛋白(反向引物)

<400>64

gtttggaagaggcagagaaatcc23

<210>65

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrna纖連蛋白(正向引物)

<400>65

ggagtttcctgagggttt18

<210>66

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrna纖連蛋白(反向引物)

<400>66

gcagaagtgtttgggtga18

<210>67

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnan-鈣粘蛋白(正向引物)

<400>67

cgaatggatgaaagacccatcc22

<210>68

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnan-鈣粘蛋白(反向引物)

<400>68

ggagccactgccttcatagtcaa23

<210>69

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnasnail(正向引物)

<400>69

atcggaagcctaactacagcgagc24

<210>70

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnasnail(反向引物)

<400>70

cagagtcccagatgagcattgg22

<210>71

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnatwist(正向引物)

<400>71

ggagtccgcagtcttacgag20

<210>72

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnatwist(反向引物)

<400>72

tctggaggacctggtagagg20

<210>73

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnazeb1(正向引物)

<400>73

acccttgaaagtgatccagc20

<210>74

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnazeb1(反向引物)

<400>74

cattccattttctgtcttccgc22

<210>75

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnaslug(正向引物)

<400>75

agatgcatattcggacccac20

<210>76

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnaslug(反向引物)

<400>76

cctcatgtttgtgcaggaga20

<210>77

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnatgfb1(正向引物)

<400>77

attcctggcgatacctcagc20

<210>78

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnatgfb1(反向引物)

<400>78

acccgttgatgtccacttgc20

<210>79

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnasox4(正向引物)

<400>79

ggcctcgagctgggaatcgc20

<210>80

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnasox4(反向引物)

<400>80

gcccactcggggtcttgcac20

<210>81

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnacea(正向引物)

<400>81

aacttctcctggtctctcagct22

<210>82

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnacea(反向引物)

<400>82

gcaaatgctttaaggaagaag21

<210>83

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnab3galt5(ca19-9)(正向引物)

<400>83

caaaccaagcccagaacctg20

<210>84

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnab3galt5(ca19-9)(反向引物)

<400>84

tcaatctcatcttcgggaaagc22

<210>85

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnast6galnac6(ca19-9)(正向引物)

<400>85

gccggagatgaggaaactga20

<210>86

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnast6galnac6(ca19-9)(反向引物)

<400>86

gatcacgaacactgctgacc20

<210>87

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnats(正向引物)

<400>87

acctgaatcacatcgagcca20

<210>88

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnats(反向引物)

<400>88

ttggatgcggattgtaccct20

<210>89

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnatp(正向引物)

<400>89

cgcctggtgacttctcc17

<210>90

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnatp(反向引物)

<400>90

tgggtcagcaccgaggt17

<210>91

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnadpd(正向引物)

<400>91

gttgtggctatgattgatga20

<210>92

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnadpd(反向引物)

<400>92

attcacagataagggtacgc20

<210>93

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnadcc(正向引物)

<400>93

ttccgccatggtttttaaatca22

<210>94

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnadcc(反向引物)

<400>94

agcctcattttcagccacaca21

<210>95

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnakras(正向引物)

<400>95

actggggagggctttctttg20

<210>96

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnakras(反向引物)

<400>96

ggcatcatcaacaccctgtct21

<210>97

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnatp53(正向引物)

<400>97

ggtggtgccctatgagccg19

<210>98

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnatp53(反向引物)

<400>98

tcctctgtgcgccggtctc19

<210>99

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnagpa33(正向引物)

<400>99

ccaatcaaaggagggctcacc21

<210>100

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnagpa33(反向引物)

<400>100

ttctcttagctgctctggtggc22

<210>101

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnabmi-1(正向引物)

<400>101

tggctcgcattcattttctg20

<210>102

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnabmi-1(反向引物)

<400>102

agtagtggtctggtcttgtg20

<210>103

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnaapc(正向引物)

<400>103

ggaagcagagaaagtactgga21

<210>104

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnaapc(反向引物)

<400>104

ctgaagttgagcgtaataccag22

<210>105

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnasmad4(正向引物)

<400>105

ctgctgctggaattggtgttga22

<210>106

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnasmad4(反向引物)

<400>106

ctggagggcccggtgtaagt20

<210>107

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnaaxin2(正向引物)

<400>107

ctggctccagaagatcacaaag22

<210>108

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnaaxin2(反向引物)

<400>108

atctcctcaaacaccgctcca21

<210>109

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnapold1(正向引物)

<400>109

gactacacgggagccactgtca22

<210>110

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnapold1(反向引物)

<400>110

gtaacacaggttgtgggccatc22

<210>111

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnastk11(正向引物)

<400>111

gaagtcggaacacaaggaag20

<210>112

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnastk11(反向引物)

<400>112

ccgtaacctcctcagtagtt20

<210>113

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnabmpr1a(正向引物)

<400>113

gtcagaaaatggagtaacctta22

<210>114

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnabmpr1a(反向引物)

<400>114

tagttcgctgaaccaataaagg22

<210>115

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnamutyh(正向引物)

<400>115

ggcctctgtctccccatatcat22

<210>116

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnamutyh(反向引物)

<400>116

ctgctgtagggtctctgctgta22

<210>117

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnasmad7(正向引物)

<400>117

ctgcaacccccatcacctta20

<210>118

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnasmad7(反向引物)

<400>118

ccctgtttcagcggaggaa19

<210>119

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnabmp2(正向引物)

<400>119

ggtggaatgactggattg18

<210>120

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnabmp2(反向引物)

<400>120

gcatcgagatagcactg17

<210>121

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnabmp4(正向引物)

<400>121

ctggtccaccacaatgtgac20

<210>122

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnabmp4(反向引物)

<400>122

cgatcggctaatcctgacat20

<210>123

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnarhpn2(正向引物)

<400>123

gagaacgacggctactttcgga22

<210>124

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnarhpn2(反向引物)

<400>124

agctcttccttgagcatctgca22

<210>125

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnascg5(正向引物)

<400>125

atatccagctcaccaggccatgaa24

<210>126

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnascg5(反向引物)

<400>126

tgttgtctccagtcaactctgcca24

<210>127

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnagrem1(正向引物)

<400>127

gtcacactcaactgccctga20

<210>128

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnagrem1(反向引物)

<400>128

ggtgaggtgggtttctggta20

<210>129

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnafmn1(正向引物)

<400>129

cagcatctctgttcctccatca22

<210>130

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnafmn1(反向引物)

<400>130

agtgccttccattatgcctacc22

<210>131

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建pgk-luc-內(nèi)含子以檢測cd24的內(nèi)含子2（2.4kb）轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性(正向引物)

<400>131

gcgctctagactgcagggattagcgcctggag32

<210>132

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建pgk-luc-內(nèi)含子以檢測cd24的內(nèi)含子2（2.4kb）轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性(反向引物)

<400>132

atatggccggccccacatcacagctacctccatgtac37

<210>133

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建cd24-衍生的螢光素酶報(bào)道子以檢測cd24的核心啟動(dòng)子活性(正向引物)

<400>133

gatgatatcgataccagccgggtaccagcag31

<210>134

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建cd24-衍生的螢光素酶報(bào)道子以檢測cd24的核心啟動(dòng)子活性(反向引物)

<400>134

gataagctttcaggatgctgggtgcttggag31

<210>135

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建cd24-衍生的螢光素酶報(bào)道子以檢測cd24的核心啟動(dòng)子活性(正向引物)

<400>135

gatgatatcgcagtctgagtggcaatgcacttg33

<210>136

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建cd24-衍生的螢光素酶報(bào)道子以檢測cd24的核心啟動(dòng)子活性(反向引物)

<400>136

gataagctttcaggatgctgggtgcttggag31

<210>137

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建cd24-衍生的螢光素酶報(bào)道子以檢測cd24的核心啟動(dòng)子活性(正向引物)

<400>137

gatgatatccctgtagtttgcagcgtcaggca32

<210>138

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建cd24-衍生的螢光素酶報(bào)道子以檢測cd24的核心啟動(dòng)子活性(反向引物)

<400>138

gataagctttcaggatgctgggtgcttggag31

<210>139

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建cd24-衍生的螢光素酶報(bào)道子以檢測cd24的核心啟動(dòng)子活性(正向引物)

<400>139

gatgatatcccacgcccggccaaagtatttc31

<210>140

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建cd24-衍生的螢光素酶報(bào)道子以檢測cd24的核心啟動(dòng)子活性(反向引物)

<400>140

gataagctttcaggatgctgggtgcttggag31

<210>141

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sox2結(jié)合位點(diǎn)的cd24啟動(dòng)子區(qū)(正向引物)

<400>141

tggcaggtcccgggaaacaaaggaaacttgggcccggc38

<210>142

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶sox2結(jié)合位點(diǎn)的cd24啟動(dòng)子區(qū)(反向引物)

<400>142

gccgggcccaagtttcctttgtttcccgggacctgcca38

<210>143

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶兩個(gè)sox2結(jié)合位點(diǎn)的cd24啟動(dòng)子區(qū)正向引物)

<400>143

ccgggaaacaaaggaaactccgggaaacaaaggaaact38

<210>144

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶兩個(gè)sox2結(jié)合位點(diǎn)的cd24啟動(dòng)子區(qū)（陽性對照）(反向引物)

<400>144

agtttcctttgtttcccggagtttcctttgtttcccgg38

<210>145

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>不攜帶sox2結(jié)合位點(diǎn)的cd24啟動(dòng)子區(qū)（非相關(guān)序列1）(正向引物)

<400>145

ccagccgggtaccagcagccggcggcgcccgcccacct38

<210>146

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>不攜帶sox2結(jié)合位點(diǎn)的cd24啟動(dòng)子區(qū)（非相關(guān)序列1）(反向引物)

<400>146

aggtgggcgggcgccgccggctgctggtacccggctgg38

<210>147

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>不攜帶sox2結(jié)合位點(diǎn)的cd24啟動(dòng)子區(qū)（非相關(guān)序列2）(正向引物)

<400>147

gctttcctggtatataaggtctcgccggctcgccgcgc38

<210>148

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>不攜帶sox2結(jié)合位點(diǎn)的cd24啟動(dòng)子區(qū)（非相關(guān)序列2）(反向引物)

<400>148

gcgcggcgagccggcgagaccttatataccaggaaagc38

<210>149

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶突變的sox2結(jié)合位點(diǎn)的cd24啟動(dòng)子區(qū)(正向引物)

<400>149

tggcaggtcccgggaaaaggaggaaacttgggcccggc38

<210>150

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶突變的sox2結(jié)合位點(diǎn)的cd24啟動(dòng)子區(qū)(反向引物)

<400>150

gccgggcccaagtttcctccttttcccgggacctgcca38

<210>151

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶共有sox2結(jié)合位點(diǎn)的cd24啟動(dòng)子區(qū)（陽性對照）(正向引物)

<400>151

tggcaggtccatttgcataacaaagagttgggcccggc38

<210>152

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>攜帶共有sox2結(jié)合位點(diǎn)的cd24啟動(dòng)子區(qū)（陽性對照）(反向引物)

<400>152

gccgggcccaactctttgttatgcaaatggacctgcca38

<210>153

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建crispr以敲減cd243’-utr上的mir205結(jié)合位點(diǎn)

(正向引物)

<400>153

aaacgagtttcatgtacaagatgagt26

<210>154

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建crispr以敲減cd243’-utr上的mir205結(jié)合位點(diǎn)(反向引物)

<400>154

taaaactcatcttgtacatgaaactc26

<210>155

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>t7e1測定以量化對所靶向cd24位點(diǎn)的crispr介導(dǎo)的切割效率(正向引物)

<400>155

cagtcaacagccagtctcttcgtg24

<210>156

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>t7e1測定以量化對所靶向cd24位點(diǎn)的crispr介導(dǎo)的切割效率(反向引物)

<400>156

catcattgccctggcacatgtca23

<210>157

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建攜帶cd24序列的左同源臂(正向引物)

<400>157

gcgctacgtaccaggatagacagtgacccaatga34

<210>158

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建攜帶cd24序列的左同源臂(反向引物)

<400>158

atatgtcgaccttgtacatgaaactccagcagat34

<210>159

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建攜帶cd24序列的右同源臂(正向

引物)

<400>159

atatgcggccgcgaaggagaggcaacatccaaaatag37

<210>160

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建攜帶cd24序列的右同源臂(反向

引物)

<400>160

gcgcttcgaatcaagcctgtaatcccagcactttg35

<210>161

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>檢測mcherry轉(zhuǎn)基因在cd24上的位點(diǎn)特異性整合(正向引物)

<400>161

gacatcacctcccacaacgaggact25

<210>162

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>檢測mcherry轉(zhuǎn)基因在cd24上的位點(diǎn)特異性整合(反向引物)

<400>162

agcatcagtgtgtgaccatgcgaac25

<210>163

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增6號染色體上的mrnacd24(正向引物)

<400>163

gagcaatggtggccaggctc20

<210>164

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增6號染色體上的mrnacd24(反向引物)

<400>164

ggattgggtttagaagatggggaaa25

<210>165

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增y染色體上的mrnacd24(正向引物)

<400>165

gagcaatggtggccaggctt20

<210>166

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增y染色體上的mrnacd24(反向引物)

<400>166

ggattgggtttagaagatggggaag25

<210>167

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增15號染色體上的mrnacd24(正向引物)

<400>167

atccagccagacacgctgca20

<210>168

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增15號染色體上的mrnacd24(反向引物)

<400>168

cagtagctggatttggggcagtc23

<210>169

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增由6號染色體表達(dá)的截短mrnacd24(正向

引物)

<400>169

tctggaagtccaatgtggcaag22

<210>170

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增由6號染色體表達(dá)的截短mrnacd24(反向

引物)

<400>170

cactggaagttcccttctcatgtac25

<210>171

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化前體莖環(huán)hsa-mir-205表達(dá)(正向引物)

<400>171

agatcctcagacaatccatgtgct24

<210>172

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化前體莖環(huán)hsa-mir-205表達(dá)(反向引物)

<400>172

agctccatgcctcctgaact20

<210>173

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>成熟mir205-5p的cdna合成(銜接子)

<400>173

tccgtcgttctaatgcgaacagactccg28

<210>174

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化成熟mir205-5p表達(dá)(正向引物)

<400>174

cctccatccttcattccaccg21

<210>175

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化成熟mir205-5p表達(dá)(反向引物)

<400>175

gtttccgtcgttctaatgcgaa22

<210>176

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化mir205hg表達(dá)(正向引物)

<400>176

ctcaagtacccatcttggaggg22

<210>177

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>量化mir205hg表達(dá)(反向引物)

<400>177

cacgcacactccagatgtctc21

<210>178

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建cmv-mir205(正向引物)

<400>178

gcgcgaattcaaagatcctcagacaatccatgtgct36

<210>179

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建cmv-mir205(反向引物)

<400>179

atatactagttgtcagctccatgcctcctgaac33

<210>180

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建cmv-mir205hg(共表達(dá)mir205)(正向引物)

<400>180

gcgcgaattcgaaatgggctgagtccctcttg32

<210>181

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建cmv-mir205hg(共表達(dá)mir205)(反向引物)

<400>181

atatactagttttttcagtagacaagcaacttttag36

<210>182

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建pgk-luc-utr以檢測cd24的3’-utr（211bp）轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性正向引物)

<400>182

gcgctctagacttaagagactcaggccaagaaacg35

<210>183

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建pgk-luc-utr以檢測cd24的3’-utr（211bp）轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性(反向引物)

<400>183

atatggccggccggcatccatcatctagtcaaacctc37

<210>184

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建pgk-luc-utr以檢測cd24的3’-utr（211bp）轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性(正向引物)

<400>184

gcgctctagacttaagagactcaggccaagaaacg35

<210>185

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建pgk-luc-utr以檢測cd24的3’-utr（211bp）轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性(反向引物)

<400>185

atatggccggcccaagccacattcaaggaaatcatgtct39

<210>186

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建crispr以敲除cd24orf(正向引物)

<400>186

aaacggacatgggcagagcaatgggt26

<210>187

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建crispr以敲除cd24orf(反向引物)

<400>187

taaaacccattgctctgcccatgtcc26

<210>188

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>t7e1測定以量化對所靶向cd24位點(diǎn)的crispr介導(dǎo)的切割效率(正向引物)

<400>188

cacgtcacggctattgtggctttc24

<210>189

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>t7e1測定以量化對所靶向cd24位點(diǎn)的crispr介導(dǎo)的切割效率(反向引物)

<400>189

gcctctgggtgaaagtgggaagtag25

<210>190

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建攜帶cd24序列的左同源臂(正向引物)

<400>190

gcgctacgtagctcacagaacaaagcaagggcttc35

<210>191

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建攜帶cd24序列的左同源臂(反向引物)

<400>191

atatgtcgacttgctctgcccatgtcccct30

<210>192

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建攜帶cd24序列的右同源臂(正向引物)

<400>192

atatgcggccgctggtggccaggctcgggct31

<210>193

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>構(gòu)建攜帶cd24序列的右同源臂(反向引物)

<400>193

gcgcttcgaaaggatctagggagaccgcgctggtag36

<210>194

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>檢測mcherry轉(zhuǎn)基因在cd24上的位點(diǎn)特異性整合

(正向引物)

<400>194

gacatcacctcccacaacgaggact25

<210>195

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>檢測mcherry轉(zhuǎn)基因在cd24上的位點(diǎn)特異性整合

(反向引物)

<400>195

atcctccaaacccgaactgaccca24

<210>196

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnacd24(fowrad引物)

<400>196

gagcaatggtggccaggctc20

<210>197

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnacd24(反向引物)

<400>197

ggattgggtttagaagatggggaaa25

<210>198

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnadpp4(正向引物)

<400>198

cattcacttttgaaaagttctccctagaaag31

<210>199

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnadpp4(反向引物)

<400>199

cgtttttgtgcagttttaaaatgtgtgc28

<210>200

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnaitgb1(正向引物)

<400>200

ggttctcatatgaacctaactggtcaaa28

<210>201

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnaitgb1(反向引物)

<400>201

atcatgtttataaaagcaatagaaggtacggt32

<210>202

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnakit(正向引物)

<400>202

aaggtgatctatttttccctttctcc26

<210>203

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnakit(反向引物)

<400>203

tttcatactgaccaaaactcagcct25

<210>204

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnamet(正向引物)

<400>204

gactcctacaacccgaatactgc23

<210>205

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>擴(kuò)增mrnamet(反向引物)

<400>205

catagtgctccccaatgaaagtagag26