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本申請要求2014年10月14日提交的美國臨時申請序列號62/063,784的優(yōu)先權權益，該申請的全部內容通過引用并入本文。

本發(fā)明涉及白細胞介素-15突變蛋白和白細胞介素-15相關分子、前述物質的修飾及其相關用途，等等。

背景技術：

白細胞介素-15(il-15)是參與刺激nk細胞、cd8+記憶t細胞和幼稚cd8+細胞的細胞溶解活性、細胞因子分泌、增殖和存活的細胞因子(參見fehniger等人，jimmunol162:4511-20(1999))。作為多效細胞因子，其在先天性和適應性免疫中起重要作用(參見lodolce等人，cytokinegrowthfactorrev13(6):429-39(2002年12月))和alves等人，blood102:2541-46(2003))。

il-15由大量細胞類型(包括巨噬細胞、單核細胞、樹突細胞和成纖維細胞)組成性表達(grabstein等人，science264(5161):965-68(1994年5月))。il-15的表達可以通過例如細胞因子(例如，gm-csf)、雙鏈mrna、非甲基化cpg寡核苷酸、經(jīng)由toll樣受體的脂多糖，以及干擾素(例如ifn-γ)，或者在例如單核細胞被皰疹病毒、結核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)和白色念珠菌(candidaalbicans)的感染后刺激(bamford等人，jimmunol160(9):4418-26(1998年5月))。

il-15結合t細胞和nk細胞上的特定受體復合物。il-15和il-15rα在活化的樹突細胞和單核細胞上共表達，并且il-15在與il-15rα的復合物中發(fā)揮功能(bergamaschi等人，jbiolchem283:4189-99(2008))。il-15/il-15α作為異二聚體結合到t細胞和nk細胞上的兩條鏈-il-2rβ(也稱為il-15rβ；cd122)和γc(也稱為il-2rg；cd132；γ-c；普通γ鏈)分子。β和γc鏈在il-2和il-15之間共享，并且對于這些細胞因子的信號傳導是必需的(giri等人，emboj.13:2822-30(1994)和giri等人，emboj.14:3654-3663(1995))。

與il-2/il-15βγc受體復合物的共享一致，已經(jīng)顯示il-15在體外介導與il-2的功能相似的許多功能。它們共享許多生物活性，并且對t淋巴細胞的存活表現(xiàn)出相似的貢獻(參見waldmann等人，annurevimmunol17:19-49(1999))。據(jù)信，il-2和il-15之間的生物學差異可能是由于例如其不同的產(chǎn)生位點、其與膜受體蛋白(分別稱為il-2α和il-15rα)的結合強度，以及這些額外的受體分子的調節(jié)。il-2和il-15在調節(jié)cd8+記憶細胞數(shù)目方面發(fā)揮作用。

盡管事實上il-15涉及許多疾病、病癥和病況，包括例如某些病毒性疾病和癌性病況，但目前沒有il-15相關藥劑是可商購的。因此，安全有效的il-15藥劑將解決迄今未滿足的醫(yī)學需求。

技術實現(xiàn)要素：

本公開涉及il-15組合物及其用途。術語“il-15”、“il-15多肽”、“il-15劑”、“il-15分子”等旨在廣義地解釋，并且包括例如人和非人il-15相關多肽，包括同源物、變體(包括突變蛋白)及其片段，以及具有例如前導序列(例如信號肽)的il-15多肽。具體實施方案涉及前述各項的修飾。在具體實施方案中，與其肽的未修飾形式相比，修飾改善了肽的至少一種性質或其它特征(例如半衰期或功效)。在某些實施方案中，修飾導致生物活性的降低，條件是增強了另一種特征(例如，藥代動力學參數(shù)，如半衰期)，導致從治療角度至少有益，并且通常更為有益的經(jīng)修飾的il-15分子。

本公開的其它實施方案涉及用于鑒定可根據(jù)本文所述方法修飾的il-15的特定氨基酸殘基或結構域的方法和其它技術。使用(例如，治療或預防病癥或其癥狀)、鑒定和/或產(chǎn)生本文所述的肽的方法也是本公開的方面。其它方面包括例如包含肽的藥物組合物。

成熟人il-15是114個氨基酸的單體多肽。已經(jīng)報道了兩種轉錄物，一種具有48個氨基酸的信號肽(長信號肽；lsp)(圖1a；seqidno:1)，以及另一種具有21個氨基酸的信號肽(短信號肽；ssp)(圖1b；seqidno:2)，兩者都產(chǎn)生相同的成熟蛋白(圖1c；seqidno:3)。如本文闡述，成熟人il-15描述為包括通過三種截然不同的氨基酸區(qū)段(a/b環(huán)；b/c轉角；和c/d環(huán))連接的四個螺旋(a-d)。這些氨基酸區(qū)段也稱為一個或多個螺旋間接合。

在下文中討論了可以或不可以突變和/或修飾的il-15螺旋和螺旋間接合的氨基酸殘基和區(qū)域。舉例來說，被埋在il-15的三維核心內或參與受體結合的氨基酸殘基和區(qū)域通常不是修飾的候選物。

本公開考慮包含會有利于將peg或其它部分(例如血清白蛋白)對至少一個氨基酸殘基的連接的取代的肽。在下文中詳細描述了此類肽的實例。

本文描述了用于評估本文所述的il-15肽的免疫原性的方法。在另外的實施方案中，經(jīng)修飾的肽在至少一種性質(例如物理性質，包括溶解度、生物利用度、血清半衰期和循環(huán)時間)方面具有改善。在下文進一步描述了此類特性。在本公開的具體實施方案中，與相應的未修飾的il-15肽相比，突變體il-15或經(jīng)修飾的il-15肽的免疫原性更小(即，刺激更少的免疫應答)。在其它實施方案中，經(jīng)修飾的il-15肽與相應的未修飾的il-15肽相比是免疫原性-中性的(即不以治療相關方式改變免疫原性)。

本公開考慮包含圖1c的氨基酸序列(seqidno:3)的肽，其中肽包含至少一個氨基取代、缺失或添加，并且其中取代、缺失或添加不會例如不利地影響溶解度或免疫原性。本公開還考慮具有與seqidno:3的氨基酸序列的至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的肽，其中肽a)具有與seqidno:3的肽相比改善的至少一種性質(例如物理性質，包括溶解度、生物利用度、血清半衰期和循環(huán)時間)，和/或b)不比seqidno:3的肽具有更多的免疫原性，和/或c)具有至少等于seqidno:3的肽的生物活性的生物活性。

對于本領域技術人員將顯而易見的是，利用不同的方法(例如，量化il-15的確切濃度的不同方法和/或產(chǎn)生il-15的不同方法)可能由于計算蛋白質濃度或實際活性的差異而在表觀活性中有或多或少的活性的il-15劑。通過利用他們的技能和經(jīng)驗，熟練技術人員將能夠在確定il-15分子相對于hil-15的相對生物活性方面考慮到這些差異。在一些實施方案中，此類il-15分子具有至少60、至少70、至少80、至少90、至少95、至少100、至少101、至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少110、至少111、至少112或至少113個氨基酸殘基。

在一些實施方案中，上述肽的氨基酸殘基添加、缺失或取代不會破壞肽的分子內二硫鍵。然而，應當注意，此類添加、缺失或取代可能會破壞一個或多個分子間非共價鍵(例如，氫鍵)，但是此類破壞不應該對蛋白質功能具有治療相關作用。根據(jù)本公開的教導，在一些具體實施方案中，氨基酸取代可以是保守取代，并且在其它具體實施方案中，氨基酸取代可以是非保守取代。

在具體實施方案中，本公開考慮具有至少等于seqidno:3的生物活性的生物活性的肽。生物活性可以通過本領域已知的任何方法測定，包括趨化因子釋放測定法、tnfα產(chǎn)生測定法、ctll-2細胞增殖測定法、m07e細胞增殖測定法或t細胞ifnγ分泌測定法?？梢允褂胏d4+細胞、cd8+細胞或nk細胞進行t細胞篩選。本領域技術人員熟悉此類測定，并且本文描述了其中幾個的示例性方案。同樣，可以通過本領域技術人員已知的任何方法預測或測定肽的免疫原性，包括通過篩選t細胞表位或b細胞表位中的至少一種進行預測。在一個方面，通過計算機系統(tǒng)和/或離體測定系統(tǒng)預測免疫原性。

本公開還考慮包含seqidno:3的氨基酸序列的肽，其中所述肽包含表面暴露的氨基酸殘基的至少一個氨基酸取代，并且其中所述取代不會不利地影響生物活性、免疫原性和/或其它性質或特征。在某些實施方案中，這些肽也不包含參與受體結合的任何氨基酸殘基的取代。然而，應當理解，本公開考慮了可以容許的il-15受體結合區(qū)內或與其極其接近的一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失和/或添加。

如本文中別處詳細描述和圖3中描繪，成熟的hil-15包含a)螺旋a(氨基酸殘基1-17)；b)a/b螺旋間接合(a/b環(huán))(氨基酸殘基18-31)；c)螺旋b(氨基酸殘基32-53)；d)b/c螺旋間接合(b/c轉角)(氨基酸殘基54-57)；e)螺旋c(氨基酸殘基58-77)；f)c/d螺旋間接合(c/d環(huán))(氨基酸殘基78-96)；和g)螺旋d(氨基酸殘基97-114)。在一些實施方案中，本公開考慮肽，其包含a)螺旋a；b)a/b螺旋間接合；c)螺旋b；d)b/c螺旋間接合；e)螺旋c；f)c/d螺旋間接合；和g)螺旋d；其中此類肽還包含下列至少一項：i)除了氨基酸殘基2(w)、4-12(nvisdlkki；seqidno:37))或16(i)外的螺旋a的至少一個氨基酸殘基的取代；或ii)除了氨基酸殘基30(d)或31(v)外的a/b螺旋間接合的至少一個氨基酸殘基的取代；或iii)除了氨基酸殘基32(h)、35(c)、40(m)、42-44(cfl)、47(l)或50(i)外的螺旋b的至少一個氨基酸殘基的取代；或iv)b/c螺旋間接合的至少一個氨基酸殘基的取代；或v)除了氨基酸殘基59(i)、61-66(dtvenl；seqidno:38)或68-70(ila)外的螺旋c的至少一個氨基酸殘基的取代；或vi)除了氨基酸殘基85(c)或88(c)外的c/d螺旋間接合的至少一個氨基酸殘基的取代；或vii)除了氨基酸殘基99(f)、100(l)、103(f)或105-112(hivqmfin；seqidno:39)外的螺旋d的至少一個氨基酸殘基的取代。

參考前面段落中描述的肽，在具體實施方案中，本公開考慮肽，其中至少一個氨基酸取代在以下區(qū)域中的至少一個中：13-15、17-29、36-39、51-58、71-84或89-98。在其它實施方案中，至少一個氨基酸取代在以下區(qū)域中的至少一個中：17-28、36-38、51-57、71-84或89-98。在另外的實施方案中，至少一個氨基酸取代至少在以下位置之一：1、3、13-15、17-29、33、34、36-39、41、45、46、48、49、51-58、60、67、71-84、86、87、89-98、101、102、104、113或114。在某些實施方案中，至少一個氨基酸取代至少在以下位置之一：1、17-28、36-38、41、45、46、48、49、51-57、60、67、71-84、86、87、89-98、101、113或114。

使用系統(tǒng)方法，將上文鑒定的殘基取代，以便引入能夠為peg提供錨定和/或其它修飾的氨基酸。在本公開的具體實施方案中，用半胱氨酸、酪氨酸和n-糖基化位點(n-x-s和n-x-t基序)取代先前鑒定為此類取代的候選物的每個殘基。下文詳細描述并在圖6中概述的結果為熟練技術人員提供了關于產(chǎn)生有利的il-15突變蛋白的具體指導。

本公開的具體實施方案考慮本文所述的肽的修飾，其中修飾不改變肽的氨基酸序列(即，不將氨基酸取代、添加或缺失引入il-15一級氨基酸序列中)，并且與肽的未修飾形式相比，修飾改善或以其它方式增強肽的至少一種性質或其它特征(例如，藥代動力學參數(shù)或功效)。

本公開考慮引入可能有利的任何修飾。因此，在具體實施方案中，修飾改善了肽的至少一種物理性質(例如溶解度、生物利用度、血清半衰期和循環(huán)時間)。其它修飾包括引入用于阻斷受體切割和增加對il-15受體的親和力的手段(或修飾解離速率，使得il-15分子將與受體對接更長持續(xù)時間)。在另外的實施方案中，il-15肽的修飾不會對治療相關的水平的免疫原性造成有害影響，并且在另外的實施方案中，經(jīng)修飾的il-15比未修飾的il-15具有更小的免疫原性。

在一些實施方案中，修飾是聚乙二醇化，并且經(jīng)修飾的肽是peg-il-15。聚乙二醇化的肽可以包含共價連接到il-15的至少一個氨基酸殘基的至少一種peg分子(例如，n-末端或c-末端聚乙二醇化)?？梢越?jīng)由接頭將peg分子與il-15綴合；在下文中詳細描述接頭。在一些實施方案中，可以如下修飾(例如聚乙二醇化)il-15上的兩個或更多個不同位點：通過引入多于一個突變，然后修飾它們中的每個。在另外的實施方案中，可以與在il-15蛋白內的其它地方引入一種或多種突變，以及其修飾(例如，聚乙二醇化)組合修飾(例如聚乙二醇化)n-末端。在另外的實施方案中，可以與在il-15蛋白內的其它地方引入一種或多種突變，以及其修飾(例如，聚乙二醇化)組合修飾(例如聚乙二醇化)c-末端?？梢耘cn-末端的聚乙二醇化組合修飾(例如聚乙二醇化)il-15的酪氨酸26。在另外的實施方案中，il-15肽可以在n-末端和c-末端包含修飾(例如聚乙二醇化)。在本文中描述示例性聚乙二醇化條件。在另外的實施方案中，可以與在il-15蛋白內的其它地方引入一種或多種突變，以及其修飾(例如，聚乙二醇化)組合修飾(例如聚乙二醇化)n-末端。peg組分可以是肽容許的任何peg。由于il-15的相對較小的尺寸，peg的分子量大于用于許多其它蛋白質治療劑的peg的分子量。舉例來說，經(jīng)修飾的肽的peg組分在一些實施方案中具有5kda至20kd的分子量，在其它實施方案中分子量大于20kda，在某些實施方案中分子量大于25kda，在其它實施方案中分子量大于30kda，在其它實施方案中分子量大于35kda，或在其它實施方案中分子量至少為40kd。在具體實施方案中，peg具有20至40kda的分子量。本文描述了具有其它分子量值的peg。

本公開考慮對肽的任何修飾，其賦予期望的性質，包括改善(例如，掩蔽)未修飾的肽的性質。在一些實施方案中，經(jīng)修飾的肽包含fc融合分子；血清白蛋白(例如hsa或bsa)，其可以為hsa融合分子或白蛋白綴合物形式；或白蛋白結合結構域。經(jīng)修飾的肽可以是糖基化的或hes化的(hesylated)。在本公開內的別處描述前述各項的詳細描述。

在具體實施方案中，修飾是位點特異性的。在另外的實施方案中，修飾包括接頭。一些經(jīng)修飾的il-15分子可以包含多于一種類型的修飾。對本文所述的il-15肽的修飾類型和引入此類修飾的方法不是限制性的，并且熟練技術人員可以設想其它此類修飾和方法。

可以重組產(chǎn)生本文所述的肽。本公開考慮編碼肽的核酸分子，其中核酸分子可以可操作地連接到表達控制元件，所述表達控制元件賦予編碼肽的核酸分子在體外、在細胞中或在體內的表達。載體(例如，病毒載體)可以包含此類核酸分子。另外的實施方案需要表達本文所述的肽的轉化細胞或宿主細胞。

本公開還考慮結合本文的教導使用基因療法。對于基因療法用途和方法，可以用編碼如本文闡述的il-15相關多肽的核酸在體內轉化受試者中的細胞。或者，可以用轉基因或多核苷酸在體外轉化細胞，然后移植到受試者的組織中以實現(xiàn)治療。此外，可以用編碼il-15相關多肽的轉基因或多核苷酸轉化原代細胞分離物或建立的細胞系，然后任選地移植到受試者的組織中。

如本文中所述，本公開的肽可以包含通過引入至少一個突變產(chǎn)生的至少一個獨特的表位。在一些實施方案中，至少一個獨特的表位結合(特異性或非特異性)抗體(例如，激動性抗體)。在另外的實施方案中，抗體(例如，激動性抗體)的作用模擬通過il-15受體的il-15活化。

抗體可以是單克隆或多克隆的，并且可以是例如人或人源化的。實施方案包括包含存在于不同多肽或單個多肽中的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的抗體，或包含重鏈恒定區(qū)的抗體，所述重鏈恒定區(qū)例如是igg1、igg2、igg3或igg4同種型。例如，抗體可以是fv、scfv、fab、f(ab’)2或fab’抗體，或者它可以是單鏈fv(scfv)抗體(其可以是多聚化的)。

在另外的實施方案中，本公開的抗體以約10e7m-1至約10e12m-1的親和力結合肽?？贵w可以包含選自脂質部分、脂肪酸部分、多糖部分和碳水化合物部分的共價連接的部分。也考慮實施方案，其中抗體包含親和結構域，可以固定在固體支持物上，包含共價連接的非肽聚合物(例如，聚(乙二醇)聚合物)或者是可檢測標記的。

本公開包括藥物組合物，其包含本文所述的肽或抗體和藥學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。在一些實施方案中，賦形劑是等滲注射溶液。藥物組合物可適合于對受試者(例如人)施用，并且可包含一種或多種另外的預防劑或治療劑。在某些實施方案中，藥物組合物包含在無菌容器(例如，單次或多次使用的小瓶或注射器)中。試劑盒可以包含無菌容器，并且試劑盒還可以含有一種或多種另外的無菌容器，其包含至少一種另外的預防劑或治療劑或可用于藥理學療法的任何其它藥劑。本文中闡述了這些方面的實例。

本公開的另外的實施方案包括治療或預防受試者(例如人)中的疾病、病癥或病況的方法，包括施用治療有效量的本文所述的肽。其它實施方案包括治療或預防受試者中的疾病、病癥或病況的方法，包括施用治療有效量的本文所述的抗體。在本公開的各種實施方案中，疾病、病癥或病況是增殖性疾病，包括癌癥或癌癥相關疾病(例如，實體瘤或血液病癥)；免疫性或炎性疾病(例如炎性腸病、銀屑病、類風濕性關節(jié)炎、結節(jié)病、多發(fā)性硬化和阿爾茨海默氏病)；病毒性疾病(例如人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和巨細胞病毒)。

在治療或預防疾病、病癥或病況的方法中，施用治療有效量的本文所述的肽(或抗體)可以通過適合于肽(或抗體)的任何途徑，包括胃腸外注射(例如，皮下)。一種或多種另外的預防劑或治療劑可以與肽(或抗體)一起(例如，之前、同時或之后)施用，和/或它可以與肽(或抗體)分開或組合施用。

本公開的另外的實施方案包含seqidno:3的氨基酸序列，其中肽包含以下位置之一的至少一個氨基酸取代：1、3、13-15、17-29、33、34、36-39、41、45、48、49、51-58、60、67、71-84、86、87、89-98、101、102、104、113或114。在一些實施方案中，肽包含用酪氨酸取代以下位置的至少一個氨基酸殘基：1、3、13-15、17-25、27-29、33、34、36-39、41、45、48、49、51-58、60、67、71-84、86、87、89-98、101、102、104、113或114。在其它實施方案中，肽包含用半胱氨酸取代以下位置的至少一個氨基酸殘基：1、3、13-15、17-25、27-29、33、34、36-39、45、48、49、51-56、58、60、67、72-84、86、87、89-98、101、102、104、113或114。在另外的實施方案中，肽包括用n-x-s糖基化基序取代以下位置的至少一個氨基酸殘基：1、13-15、17-22、27-29、34、36、48、49、51-58、60、72-82、84、87、89-98、102或104，其中n-x-s糖基化基序的天冬酰胺代表氨基酸位置。在另外的實施方案中，肽包括用n-x-t糖基化基序取代以下位置的至少一個氨基酸殘基：1、13-15、17-22、29、34、36、48、49、51-58、60、71-78、80-82、84、87、89-98或102，其中n-x-t糖基化基序的天冬酰胺代表氨基酸位置。

本公開考慮前述段落中描述的肽與本文中公開的所有實施方案一起使用，用作本文中公開的所有實施方案的組分，等等。舉例來說，在具體實施方案中，本公開考慮藥物組合物、無菌容器和試劑盒，其包含前述段落中描述的肽。在其它實施方案中，可以對受試者施用治療有效量的前述段落中描述的肽以治療或預防如本文中所述的疾病、病癥或病況。

在審閱本文中闡述的教導后，本公開的其它方面對于熟練技術人員將是顯而易見的。

附圖說明

圖1a描繪了il-15長信號肽(lsp)蛋白(162個氨基酸殘基；seqidno:1)。信號肽(下劃線)包含殘基1-48。

圖1b描繪了il-15短信號肽(ssp)蛋白(135個氨基酸殘基；seqidno:2)。信號肽(下劃線)包括殘基1-21。

圖1c描繪了成熟人il-15蛋白(114個氨基酸殘基)(seqidno:3)。

圖2a描繪了長信號肽(lsp)cdna開放閱讀框(orf)(489個堿基對(seqidno:4)，編碼162個氨基酸殘基)。信號肽(下劃線)包含編碼前48個氨基酸的堿基對1-144。

圖2b描繪了短信號肽(ssp)cdna開放閱讀框(orf)(408個堿基對(seqidno:5)，編碼135個氨基酸殘基)。信號肽(下劃線)包含編碼前21個氨基酸的堿基對1-63。

圖2c描繪了編碼成熟人il-15蛋白的核酸序列(345個堿基對(seqidno:6)，編碼114個氨基酸殘基)。

圖3描繪了成熟人il-15氨基酸序列(seqidno:3)，指示對應于螺旋a-d的區(qū)域和螺旋間接合。

圖4a是il-15受體信號傳導復合物(pdb4gs7)的蛋白質晶體結構帶狀表示；頂視圖：il2/15rβ，il15rα，普通γ鏈和il-15(螺旋和螺旋內的特征是標記的)。

圖4b是il-15受體信號傳導復合物(pdb4gs7)的蛋白質晶體結構帶狀表示；側視圖：il2/15rβ，il15rα，普通γ鏈和il-15(螺旋和螺旋內的特征是標記的)。

圖5描繪了成熟人il-15氨基酸序列(seqidno:3)，指示哪些殘基代表聚乙二醇化的潛在位點?！?”指示殘基是潛在位點，“-”指示殘基不是潛在位點，“+/-”表示殘基可能是潛在位點。

圖6a-6b描繪了成熟人il-15氨基酸序列(seqidno:3)，指示哪些氨基酸殘基代表通過用酪氨酸或半胱氨酸取代，或通過產(chǎn)生n-糖基化基序(n-x-s或n-x-t)得到的用于聚乙二醇化的潛在位點。淺灰色小室表示圖5中鑒定為潛在的聚乙二醇化位點的殘基，并且“+”表示在該位置插入的突變體在活性測定法中是有活性的，而空的淺灰色小室表示在該位置插入的突變體沒有表現(xiàn)出活性或不能以可檢測的水平表達。

具體實施方案

在進一步描述本公開之前，應當理解，本公開不限于本文闡述的具體實施方案，并且還應當理解，本文使用的術語僅用于描述具體實施方案的目的，并且不意圖是限制性的。

在提供數(shù)值范圍的情況下，應當理解，除非背景另有明確規(guī)定，否則本發(fā)明內涵蓋所述范圍的上限和下限之間的每個居間數(shù)值(至下限單位的十分之一)，以及所述規(guī)定范圍中的任何其它規(guī)定或居間數(shù)值。這些較小范圍的上限和下限可以獨立地包括在較小范圍內，并且還包括在本發(fā)明內，在規(guī)定范圍內受到任何明確排除的限制。在規(guī)定范圍包括一個或兩個限制的情況下，排除那些包括的限制之一或兩者的范圍也包括在本發(fā)明中。除非另有定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。

必須指出，如本文和所附權利要求中所使用，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述/該”包括復數(shù)指示物，除非背景另有明確規(guī)定。還應注意，可以撰寫權利要求以排除任何可選要素。因此，本敘述旨在充當與敘述權利要求要素或使用“否定”限制結合使用如“僅僅”，“僅”等排他性術語的先行基礎。

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概述

本公開考慮突變體il-15分子(例如，突變蛋白)和其它il-15相關分子，以及其鑒定方法及其用途。如本文所述，可以修飾il-15分子以例如增強天然人il-15的性質，包括半衰期延長。修飾包括聚乙二醇化和與白蛋白(例如hsa)和fc的融合。特定的il-15分子具有與人il-15相當?shù)拿庖咴?，?或至少與人il-15相當?shù)纳锘钚裕?或至少一種性質的改善(例如，物理性質，包括溶解性、生物利用度、血清半衰期和循環(huán)時間)。熟練技術人員將認識到，由于例如非常長的半衰期，此類分子可能是可行的治療劑。本文所述的il-15分子及其組合物(例如，藥物組合物)可用于治療和/或預防各種疾病、病癥和病況，和/或其癥狀，包括例如炎性病癥和免疫相關病癥，以及癌癥和癌癥相關病癥。

應當注意，與本公開的多肽和核酸分子相關的對“人”的任何提及并不意味著對于獲得多肽或核酸的方式或來源而言是限制性的，而是僅參考序列，因為它可以對應于天然存在的人多肽或核酸分子的序列。除了人多肽和編碼它們的核酸分子之外，本公開還考慮來自其它物種的il-15相關多肽和相應的核酸分子。

定義

除非另有指示，以下術語旨在具有以下闡述的含義。在貫穿本說明書的其它地方定義了其它術語。

術語“患者”或“受試者”可互換使用，指人或非人動物(例如哺乳動物)。

術語“施用”等當它們應用于例如受試者、細胞、組織、器官或生物流體時指例如il-15或peg-il-15、核酸(例如，編碼天然人il-15的核酸)、包含前述物質的藥物組合物或診斷劑；與受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。在細胞的背景中，施用包括試劑與細胞接觸(例如體外或離體)，以及試劑與流體接觸，其中使流體與細胞接觸。

短語“治療”、“處理”等指在已經(jīng)診斷、觀察到疾病、病癥或病況或其癥狀之后啟動，從而暫時或永久地消除、減少、抑制、減輕或改善至少一種折磨受試者的疾病、病癥或病況的主要原因，或者與折磨受試者的疾病、病癥或病況有關的至少一種癥狀的作用過程(如施用il-15或包含il-15的藥物組合物)。因此，治療包括抑制(例如，阻止疾病、病癥或病況或與其有關的臨床癥狀的發(fā)展或進一步發(fā)展)活動性疾病。術語也可以用于其它情況，如il-15或peg-il-15在例如流體相或膠體相中接觸il-15受體的情況。

如本文中所用，術語“需要治療”是指由內科醫(yī)生或其他護理人員作出的受試者需要或將受益于治療的判斷。這種判斷是基于內科醫(yī)生或護理人員專業(yè)領域的各種因素。

術語“預防”等指以某種方式(例如，在疾病、病癥、病況或其癥狀發(fā)作前)啟動，以便暫時或永久地預防、阻抑、抑制或減少受試者發(fā)生疾病、病癥、病況等的風險(如通過例如臨床癥狀的缺乏確定)或延遲其發(fā)作(通常在傾向于具有特定疾病、病癥或病況的受試者的背景中)的作用過程(如施用il-15或包含il-15的藥物組合物)。在某些情況下，術語還指減緩疾病、病癥或病況的進展或抑制其進展成有害或其它不期望的狀態(tài)。

如本文中所用，術語“需要預防”是指內科醫(yī)生或其他護理人員作出的關于受試者需要或將受益于預防性護理的判斷。基于內科醫(yī)生或護理人員專業(yè)領域的各種因素做出這種判斷。

術語“治療有效量”是指單獨或作為藥物組合物的一部分且以單一劑量或作為一系列劑量的一部分，以在對受試者施用時能夠對疾病、病癥或病況的任何癥狀、方面或特征具有任何可檢測、積極影響的量對受試者施用藥劑?？梢酝ㄟ^測量相關的生理效應來確定治療有效量，并且它可以結合給藥方案和受試者的病況的診斷分析等來調整。舉例來說，在施用后產(chǎn)生的炎癥細胞因子的量的測量可以指示是否已經(jīng)使用治療有效量。

短語“以足以實現(xiàn)變化的量”是指在施用特定療法之前(例如，基線水平)和之后測量的指標水平之間存在可檢測的差異。指標包括任何客觀參數(shù)(例如，il-15的血清濃度)或主觀參數(shù)(例如受試者的幸福感)。

術語“小分子”是指具有小于約10kda、小于約2kda或小于約1kda的分子量的化學化合物。小分子包括但不限于無機分子、有機分子、含有無機組分的有機分子、包含放射性原子的分子和合成分子。在治療上，小分子可能比大分子更易透過細胞，不易降解，并且不太可能引發(fā)免疫應答。

術語“配體”是指例如可以起受體的激動劑或拮抗劑作用的肽、多肽、膜締和或膜結合的分子或其復合物?！芭潴w”涵蓋天然配體和合成配體，例如細胞因子、細胞因子變體、類似物、突變蛋白和源自抗體的結合組合物，以及例如細胞因子的肽模擬物和抗體的肽模擬物。術語還涵蓋既不是激動劑也不是拮抗劑，但是可以結合受體而不顯著影響其生物學特性(例如信號傳導或粘附)的藥劑。此外，術語包括已經(jīng)例如通過化學或重組方法改變?yōu)槟そY合配體的可溶形式的膜結合配體。配體或受體可以完全是細胞內的，也就是說，其可以駐留在胞質溶膠、細胞核或其它細胞內區(qū)室中。配體和受體的復合物稱為“配體-受體復合物”。

術語“抑制劑”和“拮抗劑”，或“活化因子”和“激動劑”分別指抑制性或活化性分子，例如用于活化例如配體、受體、輔因子、基因、細胞、組織。抑制劑是減少、阻斷、阻止、延遲激活、失活、脫敏或下調例如基因、蛋白質、配體、受體或細胞的分子?；罨蜃邮窃黾?、激活、促進、增強激活、敏化或上調例如基因、蛋白質、配體、受體或細胞的分子。抑制劑也可以定義為降低、阻斷或失活組成性活性的分子?！凹觿笔桥c靶標相互作用以引起或促進靶標激活的增加的分子?！稗卓箘笔桥c激動劑的作用相反的分子。拮抗劑預防、減少、抑制或中和激動劑的活性，并且拮抗劑也可以預防、抑制或降低靶標(例如靶受體)的組成性活性，即使在沒有鑒定的激動劑的情況下。

術語“調節(jié)”等是指分子(例如，活化因子或抑制劑)直接或間接地增加或降低il-15分子(或編碼它們的核酸分子)的功能或活性的能力；或增強分子產(chǎn)生與il-15分子相當?shù)男Ч哪芰ΑＰg語“調節(jié)劑”意圖廣泛地指可以影響上文所述活性的分子。舉例來說，例如基因、受體、配體或細胞的調節(jié)劑是改變基因、受體、配體或細胞的活性的分子，其中活性可以受激活、抑制或在其調節(jié)性質上改變。調節(jié)劑可以單獨起作用，或者它可以使用輔因子，例如蛋白質、金屬離子或小分子。術語“調節(jié)劑”包括經(jīng)由與il-15相同的作用機制起作用(即，與il-15以類似于其的方式調節(jié)相同的信號傳導途徑的藥劑)并且能夠引發(fā)相當于(或大于)il-15的生物應答的生物應答的藥劑。

調節(jié)劑的實例包括小分子化合物和其它生物有機分子。許多小分子化合物的文庫(例如，組合文庫)是可商購的，并且可以充當用于鑒定調節(jié)劑的起點。熟練技術人員能夠開發(fā)一種或多種測定法(例如，生物化學或基于細胞的測定法)，其中可以篩選此類化合物文庫以鑒定一種或多種具有期望性質的化合物；此后，熟練的藥物化學家能夠通過例如合成和評估其類似物和衍生物來優(yōu)化此類一種或多種化合物。合成和/或分子建模研究也可用于鑒定上文所述的分子。

分子的“活性”可以描述或指分子與配體或受體的結合；催化活性；刺激基因表達或細胞信號傳導、分化或成熟的能力；抗原性活性；其它分子的活性的調節(jié)等。術語還可以指在調節(jié)或維持細胞與細胞相互作用(例如粘附)中的活性，或在維持細胞(例如細胞膜)結構中的活性?！盎钚浴币部梢砸庵副然钚?，例如[催化活性]/[mg蛋白]或[免疫活性]/[mg蛋白]、生物區(qū)室中的濃度等。術語“增殖活性”涵蓋促進，例如正常細胞分裂以及癌癥、腫瘤、發(fā)育異常、細胞轉化、轉移和血管發(fā)生，對于例如正常細胞分裂以及癌癥、腫瘤、發(fā)育異常、細胞轉化、轉移和血管發(fā)生必需，或者與例如正常細胞分裂以及癌癥、腫瘤、發(fā)育異常、細胞轉化、轉移和血管發(fā)生明確相關的活性。

如本文中所用，“相當”、“相當?shù)幕钚浴?、“與…相當?shù)幕钚浴薄ⅰ跋喈數(shù)男Ч?、“與…相當?shù)男Ч钡仁强梢远亢?或定性觀察的相對術語。術語的含義往往取決于使用它們的背景。舉例來說，兩種都激活受體的藥劑可以從定性角度看作具有相當?shù)男Ч?，但是如果根?jù)公認的測定法(例如劑量-響應測定法)中或在公認的動物模型中測定，一種藥劑只能達到另一種藥劑的活性的20％，那么這兩種藥劑可以從定量角度看作缺乏相當?shù)男Ч?。當將一個結果與另一個結果(例如，一個結果與參考標準)進行比較時，“相當?shù)摹苯?jīng)常(盡管不總是)意味著一個結果與參考標準偏離小于35％、小于30％、少于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于7％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。在具體實施方案中，如果一個結果與參考標準偏離小于15％、小于10％或小于5％，則它與參考標準是相當?shù)?。舉例來說而非限制，活性或效果可以指功效、穩(wěn)定性、溶解度或免疫原性。如前指示，熟練技術人員認識到，使用不同的方法可能導致il-15由于計算蛋白質濃度或實際活性的差異而在表觀活性中比hil-15參考標準具有或多或少的活性。熟練技術人員將能夠在確定il-15分子相對于hil-15的相對生物活性方面考慮到這些差異。

例如，細胞、組織、器官或生物體的術語“應答”包括生物化學或生理行為的變化，例如生物區(qū)室內的濃度、密度、粘附或遷移，基因表達速率或分化狀態(tài)，其中變化與激活、刺激或治療相關，或與內部機制如遺傳編程相關。在某些情況下，術語“激活”，“刺激”等指如由內部機制以及外部或環(huán)境因素調節(jié)的細胞活化；而術語“抑制”，“下調”等指相反的效果。

在本文中可互換使用的術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”是指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的氨基酸、化學或生物化學修飾的或衍生化的氨基酸和具有經(jīng)修飾的多肽主鏈的多肽。術語包括融合蛋白，包括但不限于與異源氨基酸序列的融合蛋白、與具有或不具有n-末端甲硫氨酸殘基的異源和同源前導序列的融合蛋白；免疫標記的蛋白質等。

如本文中所用，術語“變體”和“同源物”可互換使用以分別指與參考氨基酸或核酸序列相似的氨基酸或dna序列。術語涵蓋天然存在的變體和非天然存在的變體。天然存在的變體包括同源物(從一種物種到另一種物種分別在氨基酸或核苷酸序列上不同的多肽和核酸)和等位變體(從一種物種內的一個個體到另一個分別在氨基酸或核苷酸序列上不同的多肽和核酸)。因此，變體和同源物涵蓋天然存在的dna序列和由其編碼的蛋白質及其同種型，以及蛋白質或基因的剪接變體。術語還涵蓋在一個或多個堿基中與天然存在的dna序列存在變化，但是由于遺傳密碼的簡并性仍然翻譯為對應于天然存在的蛋白質的氨基酸序列的核酸序列。非天然存在的變體和同源物包括分別包含氨基酸或核苷酸序列變化的多肽和核酸，其中人工引入序列的變化(例如，突變蛋白)；例如，在實驗室中通過人干預(“人為”)產(chǎn)生變化。因此，非天然存在的變體和同源物也可以指與天然存在的序列相差一個或多個保守取代和/或標簽和/或綴合物的那些。

如本文中所用，術語“突變蛋白”廣泛地指突變的重組蛋白。這些蛋白質通常攜帶單個或多個氨基酸取代，并且經(jīng)常源自已進行定點或隨機誘變的克隆基因或完全合成的基因。除非另有指示，使用如“il-15突變體”等術語是指il-15突變蛋白。

術語“dna”、“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”等在本文中可互換使用，指任何長度的核苷酸(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物)的聚合形式。多核苷酸的非限制性實例包括線性和環(huán)狀核酸、信使rna(mrna)、互補dna(cdna)、重組多核苷酸、載體、探針、引物等。

應當理解，貫穿本公開，根據(jù)單字母或三字母代碼提及氨基酸。為了方便讀者，下文提供了單字母和三字母氨基酸代碼：

如本文中關于天然人il-15或il-15突變蛋白所使用，術語“經(jīng)修飾的”，“修飾”等指增強人il-15或il-15突變蛋白的期望性質的一種或多種變化。這些期望的性質包括例如延長循環(huán)半衰期、增加穩(wěn)定性、減少清除、改變免疫原性或變應原性，以及使特定抗體(例如通過引入獨特表位)能夠用于檢測測定法。如下文中詳細討論，可以進行的對人il-15或il-15突變蛋白的修飾包括但不限于聚乙二醇化(共價連接一個或多個聚乙二醇(peg)分子或其衍生物)；糖基化(例如，n-糖基化)、聚唾液酸化和hes化；白蛋白融合；經(jīng)由例如綴合的脂肪酸鏈(酰化)的白蛋白結合；fc-融合；和與peg模擬物的融合。在一些實施方案中，在此類修飾中使用接頭并在下文中描述。

如本文中在多肽結構的背景中所使用，“n-末端”(或“氨基末端”)和“c-末端”(或“羧基末端”)是指多肽的極端氨基和羧基末端，而術語“n-末端”和“c-末端”分別指多肽的氨基酸序列相對于n-末端和c-末端的相對位置，并且可以包括n-末端和c-末端的殘基?！爸苯觧-末端”或“直接c-末端”是指第一氨基酸殘基相對于第二氨基酸殘基的位置，其中第一和第二氨基酸殘基共價結合以提供連續(xù)的氨基酸序列。

在氨基酸序列或多核苷酸序列(例如，源自“il-15多肽”的氨基酸序列)的背景中，“源自”意在指示多肽或核酸具有基于參考多肽或核酸(例如，天然存在的il-15多肽或編碼il-15的核酸)序列的序列，并不意味著就制備蛋白質或核酸的來源或方法而言是限制性的。舉例來說，術語“源自”包括參考氨基酸或dna序列的同源物或變體。

在多肽的背景中，術語“分離的”是指若天然存在的話在與其可以天然存在的環(huán)境不同的環(huán)境中所關注的多肽?！胺蛛x的”意在包括在基本上富集所關注的多肽和/或部分或基本上純化所關注的多肽的樣品內的多肽。當多肽不是天然存在時，“分離的”指示多肽已經(jīng)從通過合成或重組手段制備它的環(huán)境中分離出來。

“富集”意味著樣品被非天然操作(例如由科學家進行)，以便以下述濃度存在所關注的多肽：a)比起始樣品，如生物樣品(例如，多肽天然存在或它在施用后存在的樣品)中的多肽濃度大的濃度(例如，大至少3倍、大至少4倍、大至少8倍，大至少64倍或更多)或b)比制備多肽的環(huán)境(例如，與在細菌細胞中一樣)更大的濃度。

“基本上純的”指示組分(例如多肽)占組合物總含量的大于約50％，并且通常總多肽含量的大于約60％。更典型地，“基本上純的”是指其中總組合物中至少75％、至少85％、至少90％或更多是所關注組分的組合物。在一些情況下，多肽將占組合物總含量的大于約90％，或大于約95％。

當提到配體/受體、抗體/抗原或其它結合對時，術語“特異性結合”或“選擇性結合”指示結合反應，其決定蛋白質在異質蛋白質群體及其它生物制劑中的存在。因此，在指定條件下，規(guī)定的配體結合特定受體，并且不以顯著量結合樣品中存在的其它蛋白質?？紤]的方法的抗體或源自抗體的抗原結合位點的結合組合物以下述親和力結合其抗原或其變體或突變蛋白，所述親和力比任何其它抗體或自其衍生的結合組合物的親和力大至少2倍、大至少10倍、大至少20倍或大至少100倍。在一個具體的實施方案中，抗體將具有大于約10⁹升/摩爾的親和力，如通過例如scatchard分析(munsen等人，1980analyt.biochem.107:220-239)測定。

il-15

il-15，也稱為mgc9721，預測是由染色體4q31上的34kb區(qū)編碼的12.8kda單體糖蛋白。il-15屬于四α-螺旋束家族，其中的其它成員包括il-2、il-4、il-7、il-9、粒細胞集落刺激因子(g-csf)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)。人il-15的基因組結構包含9個外顯子(1-8和4a)和8個內含子。人和小鼠共享相似的內含子/外顯子結構。編碼成熟蛋白的il-15基因部分的整體內含子/外顯子結構類似于il-2基因和其它4種α-螺旋束細胞因子的結構。

本領域技術人員將理解il-15核酸和氨基酸序列在基因數(shù)據(jù)庫(例如，genbank)中是可公開獲得的。如圖1c(seqidno:3)中描繪，成熟人il-15蛋白包含114個氨基酸殘基(12.8kda)。在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組人il-15是單個非糖基化多肽鏈(115個氨基酸殘基，包括n-末端甲硫氨酸，具有12.9kd的分子量)。已經(jīng)報道了兩種轉錄物，據(jù)報道兩者都產(chǎn)生相同的成熟蛋白質。參考圖1a(seqidno:1)，il-15長信號肽(lsp)蛋白(登錄號bc018149.2)包含162個氨基酸殘基，包括48個殘基信號肽(下劃線)。參考圖1b(seqidno:2)，il-15短信號肽(ssp)蛋白(登錄號bc100962.1)包含135個氨基酸殘基，包括21個殘基的信號肽(下劃線)。已將lsp描述為分泌性蛋白質，并且已將ssp描述為剩余的細胞內的。

圖2a描繪了長信號肽(lsp)cdnaorf(489個堿基對(seqidno:4)，編碼162個氨基酸殘基)(登錄號bc018149.2)；信號肽(下劃線)包括堿基對1-144，編碼前48個氨基酸。圖2b描繪了短信號肽(ssp)cdnaorf(408個堿基對(seqidno5)，編碼135個氨基酸殘基)(登錄號bc100962.1)；信號肽(下劃線)包括堿基對1-63，編碼前21個氨基酸。圖2c描繪了編碼成熟人il-15蛋白的核酸序列(345個堿基對(seqidno:6)，編碼114個氨基酸殘基)。

非人示例性哺乳動物il-15核酸或氨基酸序列可來自例如靈長類、犬、貓、豬、馬、牛、綿羊、嚙齒動物、鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠。示例性非人哺乳動物il-15核酸序列的登錄號包括u19843(獼猴)；dq021912(獼猴)；ab000555(獼猴)；nm_214390(豬)；dq152967(綿羊)；nm_174090(牛)；nm_008357(鼠)；nm_013129(鼠屬)；dq083522(水牛)；xm_844053(犬)；dq157452(兔形目)；和nm_001009207(貓)。示例性非人哺乳動物il-15氨基酸序列的登錄號包括aab60398(牛)；aay45895(獼猴)；np_999555(豬)；np_776515(牛)；aay83832(水牛)；abb02300(綿羊)；xp_849146(犬)；np_001009207(貓)；np_037261(鼠屬)；和np_032383(鼠)。與人il-15(“hil-15”)相比成熟獼猴il-15(“cil-15”)的同一性是96％，而成熟小鼠il-15(“mil-15”)和成熟hil-15的同一性是75％。

人il-15在c42-c88和c35-c85位置含有兩個二硫鍵，前者與il-2內的c-c同源。在n79和n112處有兩個n-連接的糖基化位點(取決于所使用的分析方法，n71可視為第三個糖基化位點)。已經(jīng)預測成熟的il-15蛋白在氨基酸殘基1至15、18至57、65至78和97至114具有強螺旋矩，支持其4個α-螺旋束結構(fehniger等人，blood97(1)(2001年1月1日))。

如先前指示，il-15和il-2之間存在聯(lián)系?；趇l-15和il-15rα表達的復雜調節(jié)和差異模式，這種受體/配體對的關鍵體內功能可能與il-2和il-2rα的體內功能不同。il-15表現(xiàn)出幾個關鍵的非冗余作用，包括其在自然殺傷(nk)細胞、nk-t細胞和腸上皮內淋巴細胞發(fā)育和功能中的重要性。由于據(jù)報道il-15在自身免疫過程(例如類風濕性關節(jié)炎)和惡性腫瘤(例如t細胞白血病)中起作用，正常il-15功能的破壞已經(jīng)與受試者中的不利影響聯(lián)系起來。

雖然兩者都經(jīng)由受體亞基il-2rβ和普通γ鏈(γ(c))發(fā)出信號，但il-15和il-2不共享全部相同的生物學功能。在il-15-il-15rα-il-2rβ-γ(c)四級復合物的結構中，il-15結合異二聚體中的il-2rβ和γ(c)，所述異二聚體類似于il-2-il-2rα-il-2rβ-γ(c)復合物的異二聚體。已經(jīng)顯示了il-15rα實質性增加il-15對il-2rβ的親和力，這繼而是il-15反式信號傳導所必需的。il-15和il-2誘導相似的信號，并且已顯示il-2rα相對于il-15rα的特異性確定細胞響應性。(參見ring等人，nat.immunol.13(12):1187-95(2012年12月13日))。

il-15主要作為膜結合形式存在，盡管它也作為可溶性分子存在(jakobisiak等人，cytokinegrowthfactorref22(2)99-109(2011年4月))，并且它與兩種不同的信號傳導機制有關。主要機制是由膜結合復合物il-15/il-15rα介導的反式呈遞。在這種信號傳導機制中，il-15結合il-15rα受體，隨后呈遞給在其細胞表面上具有il-15rβγc復合物的周圍細胞。第二種機制是順式呈遞，其中il-15由il-15rα呈遞給同一細胞上的15rβγc信號傳導復合物。參考主要信號傳導機制，il-15與il-15rα受體結合后，隨后呈現(xiàn)給攜帶il-15rβγc復合物的周圍細胞，il-15β亞基激活janus激酶1(jak1)，并且γc亞基激活janus激酶2(jak2)，其導致信號傳導物和轉錄活化因子3(stat3)和stat5的磷酸化和激活。由于il-15和il-2共享受體亞基，它們具有相似的下游效應，包括b細胞淋巴瘤(bcl-2)的誘導；絲裂原活化蛋白激酶(map)途徑和淋巴細胞激活蛋白磷酸化酪氨酸激酶(lck)和脾酪氨酸激酶(syk)的磷酸化，其導致細胞增殖和成熟(schluns等人，intjbiochemcellbiol37(8):1567-71(2005年8月))。

相比之下，肥大細胞中的il-15r信號傳導途徑包括jak2和stat5代替jak1/3和stat3/5。磷酸化stat形成轉錄因子并激活適當基因的轉錄。il-15r的β鏈募集并且還激活src家族的蛋白酪氨酸激酶，包括lck、fyn和lyn激酶。β鏈也激活磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)和akt信號傳導途徑，并誘導各種轉錄因子的表達，包括c-fos、c-jun、c-myc和nf-κb(jakobisiak等人，cytokinegrowthfactorref22(2)99-109(2011年4月))。

如先前指示，本公開還考慮結合本文中的教導在體內、體外和離體使用基因療法?；虔煼ㄍㄟ^將通常包裝在載體中的遺傳物質遞送到受試者內的內源細胞來實現(xiàn)，以引入新基因、引入預先存在的基因的額外拷貝、損害現(xiàn)有基因的功能發(fā)揮或修復現(xiàn)有的但是不發(fā)揮功能的基因。一旦在細胞內，核酸由細胞機器表達，導致產(chǎn)生所關注的蛋白質。在本公開的背景中，基因療法用作治療劑以遞送編碼用于治療或預防本文中所述的疾病、病癥或病況的il-15劑的核酸。如本文中所用，基因療法還描述了從受試者中取出細胞，用編碼il-15的核酸分子轉染細胞，并將細胞返回到受試者。

如上文提到，對于基因療法用途和方法，可以用編碼如本文中闡述的il-15相關多肽的核酸在體內轉化受試者中的細胞?；蛘?，可以用轉基因或多核苷酸在體外轉化細胞，然后移植到受試者的組織中以實現(xiàn)治療。此外，可以用編碼il-15相關多肽的轉基因或多核苷酸轉化原代細胞分離物或建立的細胞系，然后任選地移植到受試者的組織中。

聚乙二醇化il-15

重組人il-15的用途通常受到其相對短的血清半衰期的限制，這可能是由于例如腎清除或蛋白水解降解。因此，已經(jīng)探索了各種方法來改善il-15的藥代動力學譜，而不會不利地破壞其結構并因此對活性具有不想要的影響。如在例如cn102145178中報道，il-15的聚乙二醇化導致某些藥代動力學參數(shù)(例如，血清半衰期)的改善。然而，cn102145178著重于n-末端的聚乙二醇化。還報道了包含il-15和fc的融合分子以改善半衰期(參見例如cn200410067182)。

如熟練技術人員將顯而易見的是，可以將多于一個聚乙二醇分子可以連接于多于一個氨基酸殘基。因此，如本文中所用，術語“聚乙二醇化的il-15”和“peg-il-15”是指具有共價連接到il-15蛋白的至少一個氨基酸殘基(通常通過接頭)，使得連接穩(wěn)定的一個或多個聚乙二醇分子的il-15分子。術語“單聚乙二醇化的il-15”和“單peg-il-15”可用于指示將一個聚乙二醇分子通常通過接頭共價連接到il-15的單個氨基酸殘基。術語“二聚乙二醇化的il-15”和“二-peg-il-15”可用于描述il-15蛋白，其中將一個聚乙二醇分子共價連接到一個氨基酸殘基，并且將另一個聚乙二醇分子共價連接到不同的氨基酸殘基。例如，一個聚乙二醇分子可以與成熟il-15的n-末端氨基酸殘基共價結合，并且另一個聚乙二醇分子可以與c-末端殘基共價連接。還可以產(chǎn)生蛋白質，其中聚乙烯分子共價連接到多于兩個氨基酸殘基；本領域普通技術人員熟悉產(chǎn)生此類分子的手段。

在具體實施方案中，本公開中使用的peg-il-15是單peg-il-15，其中經(jīng)由接頭將1至9個peg分子共價連接到n-末端的氨基酸殘基的α氨基基團或賴氨酸殘基側鏈上的ε氨基基團。下文進一步描述了接頭。為了在成熟il-15內通?？赡懿贿m于聚乙二醇化的位點實現(xiàn)聚乙二醇化，可以通過引入多于一個突變，然后修飾(即，聚乙二醇化)它們中的每個修飾il-15上的一個或多個不同位點。在本文中其它地方描述了示例性的聚乙二醇化條件。

在具體實施方案中，peg部分的平均分子量為約5kda至約50kda。例如，peg部分可以具有大于約5kda、大于約10kda、大于約15kda、大于約20kda、大于約25kda、大于約30kda、大于約35kda,大于約40kda、大于約45kda或大于約50kda的分子量。在一些實施方案中，分子量是約5kda至約10kda、約5kda至約15kda、約5kda至約20kda、約10kda至約15kda、約10kda至約20kda、約10kda至約25kda或約10kda至約30kda。在其它實施方案中，分子量是約15kda至約20kda、約15kda至約25kda、約15kda至約30kda、約15kda至約35kda、約15kda至約40kda或約15kda至約45kda。

由于il-15的大小，在特定實施方案中考慮了大于20kda的peg(例如，在20-40kda范圍內)。在一些實施方案中，分子量為約20kda至約25kda、約20kda至約30kda、約20kda至約35kda、約20kda至約40kda、約20kda至約45kda或約20kda至約50kda。在一些另外的實施方案中，分子量是約25kda至約30kda、約25kda至約35kda、約25kda至約40kda、約25kda至約45kda或約25kda至約50kda。在其它實施方案中，分子量是約30kda至約35kda、約30kda至約40kda、約30kda至約45kda或約30kda至約50kda。在其它實施方案中，分子量是約35kda至約40kda、約35kda至約45kda、約35kda至約50kda、約40kda至約45kda、約40kda至約50kda或約45kda至約50kda。本公開考慮了以5kda增量具有大于50kda的分子量(例如，55kda、60kda、65kda等)的peg。

雖然本公開不需要使用將peg連接到il-15的特定方法或位點，但聚乙二醇化改善、不改變或僅僅名義上降低il-15分子的活性通常是有利的。在某些實施方案中，任何半衰期增加的影響都大于生物活性的任何降低的影響。經(jīng)常通過評估用細菌抗原(脂多糖(lps))攻擊并用peg-il-15處理的受試者的血清中的炎性細胞因子(例如ifn-γ)的水平測量peg-il-15的生物活性。在本文其它地方描述了用于測量生物活性的其它手段。

il-15變體

il-15變體可以考慮到各種目標制備，包括在治療用途期間增加血清半衰期、減少針對il-15的免疫應答、促進純化或制備、降低降解、改善治療功效和減輕副作用的嚴重性或發(fā)生。氨基酸序列變體通常是自然界中未發(fā)現(xiàn)的預定變體，盡管有些可能是翻譯后變體，例如糖基化變體。可以使用il-15的任何變體，只要它保持適當水平的il-15活性。在本文中其它地方描述了il-15活性(例如，t細胞和天然殺傷(nk)細胞活化和增殖的調節(jié))。

短語“保守氨基酸取代”是指通過用具有相似酸度、堿性、電荷、極性或側鏈尺寸的側鏈的氨基酸替換蛋白質中的氨基酸來保持蛋白質的活性的取代。保守氨基酸取代通常需要在以下組內氨基酸殘基的取代：1)l、i、m、v、f；2)r、k；3)f、y、h、w、r；4)g、a、t、s；5)q、n；和6)d、e。關于取代、插入或缺失的指導可以基于不同變體蛋白或來自不同物種的蛋白質的氨基酸序列的比對。因此，除了任何天然存在的il-15多肽之外，本公開考慮具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個，通常不超過20、10或5個氨基酸取代，其中取代通常是保守的氨基酸取代。應該注意到，可以將一種或多種非天然氨基酸引入il-15中作為促進位點特異性綴合的手段。

本公開還考慮含有源自成熟il-15的連續(xù)氨基酸殘基的成熟il-15的活性片段(例如亞序列)。肽或多肽亞序列的連續(xù)氨基酸殘基的長度隨衍生亞序列的特定天然存在的氨基酸序列而變化。通常，肽和多肽可以是約20個氨基酸至約40個氨基酸、約41個氨基酸至約50個氨基酸、約51個氨基酸至約60個氨基酸、約61個氨基酸至約70個氨基酸酸、約71個氨基酸至約80個氨基酸、約81個氨基酸至約90個氨基酸、約91個氨基酸至約100個氨基酸、約101個氨基酸至約105個氨基酸、約106個氨基酸酸至約110個氨基酸或約111、112或113個氨基酸，直到全長肽或多肽。

另外，il-15多肽可以在定義長度的連續(xù)氨基酸(例如“比較窗口”)上與參考序列相比具有定義的序列同一性。用于比較的序列的比對方法是本領域中公知的。用于比較的序列的最佳比對可以例如通過smith&waterman、adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源性算法、通過needleman&wunsch、j.mol.biol.48:443(1970)的同源性比對算法、通過pearson&lipman、proc.nat'l.acad.sci.usa85:2444(1988)的搜索相似性法、通過這些算法的計算機化執(zhí)行(wisconsingeneticssoftwarepackage、madison、wis.中的gap、bestfit、fasta和tfasta)或通過手動比對和目視檢查(參見例如currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel等人編，1995增補))進行。

舉例來說，合適的il-15多肽可以包含氨基酸序列，其具有與約20個氨基酸至約40個氨基酸、約41個氨基酸至約50個氨基酸、約51個氨基酸至約60個氨基酸、約61個氨基酸至約70個氨基酸、約71個氨基酸至約80個氨基酸、約81個氨基酸至約90個氨基酸、約91個氨基酸至約100個氨基酸、約101個氨基酸至約105個氨基酸、約106個氨基酸至約110個氨基酸或約111、112或113個氨基酸的連續(xù)區(qū)段，直至全長肽或多肽的至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或至少約99％氨基酸序列同一性。

如下文進一步討論，il-15多肽可以從天然來源(例如，除了其天然存在的環(huán)境以外的環(huán)境)中分離，并且也可以重組制備(例如，在經(jīng)遺傳修飾的宿主細胞，如細菌、酵母、畢赤酵母屬、昆蟲細胞等中)，其中用包含編碼多肽的核苷酸序列的核酸修飾經(jīng)遺傳修飾的宿主細胞。也可以合成制備il-15多肽(例如通過無細胞化學合成)。

本公開考慮編碼il-15分子的核酸分子，包括其天然存在和非天然存在的同種型、等位變體和剪接變體。本公開還涵蓋在一個或多個堿基中與天然存在的dna序列存在變化但由于遺傳密碼的簡并性而仍然翻譯為對應于il-15多肽的氨基酸序列的核酸序列。

il-15突變體(例如突變蛋白)和經(jīng)修飾的il-15分子

本公開部分涉及經(jīng)由對il-15的誘變和其它修飾來操作蛋白質功能。在一些實施方案中，本公開考慮經(jīng)修飾的il-15分子，其中一種或多種有利特征已經(jīng)被添加到il-15(在未修飾的il-15中不存在特征的情況下)和/或得到增強(在未修飾的il-15中存在特征的情況下，盡管為小于最佳的量)。如下文進一步討論，可以經(jīng)由包括例如在人il-15中產(chǎn)生一系列點突變的合理藥物設計方法來鑒定和合成此類分子?？梢栽u估該系列的點突變以確定該系列中成員的特性(例如，功效)的性質和程度。

在一些實施方案中，使用點突變促進例如經(jīng)修飾的il-15肽的合成，其中肽包含共價或非共價修飾(例如聚乙二醇化、fc融合和hsa融合)。繼而，可以進行經(jīng)修飾的肽的系統(tǒng)評估，以限定il-15一級氨基酸序列的位置，其中可以實現(xiàn)修飾，同時a)保留蛋白質生物活性；b)增強某些蛋白質功能；c)降低某些il-15功能的重要性，同時維持其它功能；或d)a)-c)的某些組合。

本文中考慮的合理藥物設計方法的一個目標是鑒定可以在不會對生物活性產(chǎn)生有害影響，同時允許添加或增強其它屬性的情況下修飾的il-15的那些氨基酸殘基和區(qū)域。這些合理的藥物設計方法的另一個目標是定義il-15的氨基酸殘基和區(qū)域，其中可以使用修飾來選擇性地降低某些il-15功能的功能性，同時保持或增強其它功能。因此，在某些實施方案中，il-15分子(例如，突變蛋白)或經(jīng)修飾的il-15分子突出了il-15的一種或多種作用，同時降低一種或多種不同的作用的重要性；強調了il-15的一種或多種作用，同時不影響其它功能(例如維持正常水平的il-15活性)；或降低il-15的一種或多種作用的重要性，而不影響其它作用。在某些實施方案中，修飾物可以導致生物活性的降低，條件是另一個特征(例如藥代動力學參數(shù)如半衰期)得到增強，導致修飾的il-15分子，其從治療角度看是至少有益的且通常更加有益的。

在具體實施方案中，與其肽的未修飾形式相比，本文中所述的修飾改善了肽的至少一種性質或其它特征(例如溶解度)。本公開的其它實施方案涉及用于鑒定可根據(jù)本文所述方法修飾的il-15的特定氨基酸殘基或結構域的方法和其它技術。使用(例如，在治療或預防病癥或其癥狀中)并鑒定和/或產(chǎn)生本文所述的肽的方法也是本公開的方面。在本文中其它地方討論此類方面。其它方面包括例如包含肽的藥物組合物。

盡管已經(jīng)描述了某些il-15功能結構域的鑒定和特定類型的il-15綴合物的產(chǎn)生，但是文獻缺乏本文所述的il-15分子的類型以及用于鑒定和/或產(chǎn)生它們的方法和使用它們的方法的任何公開。

在具體實施方案中，本公開考慮產(chǎn)生人il-15中的一系列點突變和在例如哺乳動物或細菌系統(tǒng)中表達那些突變的il-15蛋白(例如，突變蛋白)。本公開考慮使用與本文所述的突變體il-15分子相容的任何表達系統(tǒng)。在具體實施方案中考慮哺乳動物蛋白質表達系統(tǒng)，而在其它實施方案中，候選蛋白質表達系統(tǒng)包括源自細菌(例如大腸桿菌(e.coli)、棒狀桿菌屬(corynebacterium)、熒光假單胞菌(p.fluorescens)和枯草芽孢桿菌(b.subtilis))、酵母(例如釀酒酵母)和桿狀病毒感染的昆蟲細胞的蛋白質表達系統(tǒng)。可以使用基于細胞或無細胞的表達系統(tǒng)。在細菌包含體中產(chǎn)生大多數(shù)重組細胞因子，然后純化并重折疊。

經(jīng)常采用細菌細胞表達細胞因子，一種通常涉及蛋白質重折疊的方法。然而，最初使用哺乳動物表達系統(tǒng)以確定突變的蛋白質是否將得到表達是有利的。如果哺乳動物細胞可以表達突變的蛋白質，則蛋白質折疊可能不會被突變破壞。哺乳動物細胞系折疊和分泌突變體分子的能力和作為用于進一步評價的候選物的所述分子的活力之間經(jīng)常存在密切的關聯(lián)。相反，如果在細菌中進行初始表達，并且突變的蛋白質不能被正確重折疊，那么不會清楚的是突變是否是破壞性的或蛋白質重折疊方案是否為次最佳的。

在表達系統(tǒng)(例如基于哺乳動物細胞系的表達系統(tǒng))中不顯著破壞蛋白質折疊和分泌的突變體il-15分子可能是用于進一步評價的候選物。例如，可以充分純化此類突變體il-15分子，以在一種或多種體內或體外/離體測定法中實現(xiàn)生物活性分析，包括本文所述的ctll-2細胞增殖測定法。作為進一步的實例，可以在提供il-15/il-15結合配偶體親合力測量的體外測定法中評價此類突變體il-15分子。此外，已經(jīng)描述了體內模型并且可以用于本文所述的il-15分子的評估。

在具體實施方案中，通過例如聚乙二醇化修飾突變體il-15多肽分子(例如，突變蛋白)。然后，可以評估這些經(jīng)修飾的il-15分子以確定它們對蛋白質功能的影響。表現(xiàn)出有利特征(例如，對蛋白質功能的名義影響或沒有影響)的經(jīng)修飾的il-15分子可以是進一步修飾(例如更大或分支的peg)和評價(例如溶解度)的候選物。在本文其它地方詳細描述了聚乙二醇化和其它類型的修飾。

此外，本公開考慮使用一種或多種用于測定免疫原性的測定法來評估突變體il-15肽和經(jīng)修飾的il-15肽，如本文所述的體外、離體或計算機免疫原性測定法。表現(xiàn)出特定的有利特征(例如，增強的功效而沒有免疫原性的增加，如在計算機中測定)的經(jīng)修飾的il-15分子可以是進一步評價的候選物，包括體內免疫原性分析和/或在體內背景中的額外分析。在具體實施方案中，這些經(jīng)修飾的il-15分子不比相應的未修飾的il-15分子更具免疫原性。

本文中涵蓋其它il-15分子，包括il-15片段；包含與異源蛋白質復合的il-15多肽的分子；以及il-15融合蛋白，其包含在核酸水平上融合到一種或多種治療劑(例如，抗炎生物制劑)的il-15。可以使用本文所述的方法或熟練技術人員已知的任何其它方法修飾此類分子。

本公開的合理藥物設計方法可以利用來自多個來源的晶體學數(shù)據(jù)和類似數(shù)據(jù)。舉例來說，描述了與il-15rα的壽司結構域復合的il-15的晶體結構。olsen等人，j.biol.chem.282(51):37191-204(2007年12月21日)。此外，pettit等人，j.biol.chem.272:2312-18(1997)描述了使用位點特異性誘變、聚乙二醇綴合和同源性建模的il-15的結構-功能研究。此類來源中描述的信息和數(shù)據(jù)雖然本身不足且不完整，但也可以代表可用于鑒定可修飾的il-15氨基酸殘基和結構域的組分。作為利用此類信息和數(shù)據(jù)的結果，鑒定出突變體il-15分子(例如，突變蛋白)和經(jīng)修飾的突變體il-15分子(以及在一些實施方案中，經(jīng)修飾的天然hil-15)為具有本文所述的有利和/或期望的特征。

如本文中描述和圖3中描繪，成熟的hil-15包含a)螺旋a(氨基酸殘基1-17)；b)a/b螺旋間接合(a/b環(huán))(氨基酸殘基18-31)；c)螺旋b(氨基酸殘基32-53)；d)b/c螺旋間接合(b/c轉角)(氨基酸殘基54-57)；e)螺旋c(氨基酸殘基58-77)；f)c/d螺旋間接合(c/d環(huán))(氨基酸殘基78-96)；和g)螺旋d(氨基酸殘基97-114)。在一些實施方案中，本公開考慮肽，其包含a)螺旋a；b)a/b螺旋間接合；c)螺旋b；d)b/c螺旋間接合；e)螺旋c；f)c/d螺旋間接合；和g)螺旋d；其中此類肽還包含下列至少一項：i)除了氨基酸殘基2(w)、4-12(nvisdlkki；seqidno:37))或16(i)外的螺旋a的至少一個氨基酸殘基的取代；或ii)除了氨基酸殘基30(d)或31(v)外的a/b螺旋間接合的至少一個氨基酸殘基的取代；或iii)除了氨基酸殘基32(h)、35(c)、40(m)、42-44(cfl)、47(l)或50(i)外的螺旋b的至少一個氨基酸殘基的取代；或iv)b/c螺旋間接合的至少一個氨基酸殘基的取代；或v)除了氨基酸殘基59(i)、61-66(dtvenl；seqidno:38)或68-70(ila)外的螺旋c的至少一個氨基酸殘基的取代；或vi)除了氨基酸殘基85(c)或88(c)外的c/d螺旋間接合的至少一個氨基酸殘基的取代；或vii)除了氨基酸殘基99(f)、100(l)、103(f)或105-112(hivqmfin；seqidno:39)外的螺旋d的至少一個氨基酸殘基的取代。圖3中闡述了這些區(qū)域的邊界。

盡管圖3中闡述的螺旋和螺旋間接合的邊界在本領域中公認為定義那些特定區(qū)域，但普通技術人員將認識到，在定義此類區(qū)域的特定氨基酸殘基中可能存在某些偏差。熟練技術人員在實施本公開時能夠考慮到這些偏差。

雖然il-15受體結合和信號傳導的機制尚未得到充分的闡明，但已經(jīng)顯示了il-15在與il-15rα的復合物中發(fā)揮功能。此復合物與il-2/il-15rβ和γc協(xié)同起作用以實現(xiàn)il-15信號傳導。圖4a是人il-15的蛋白質晶體結構帶狀表示(俯視圖)，其中某些螺旋和螺旋間接合是標記的。還描繪了某些il-15結合配偶體(例如il-15rα)。圖4b是人il-15的蛋白質晶體結構帶狀表示(側視圖)，其中某些螺旋和螺旋間接合是標記的。還描繪了某些il-15結合配偶體(例如il-15rα)。

對于修飾(例如聚乙二醇化)可能是較差的候選物的氨基酸殘基包括：疏水核心區(qū)域中的殘基，其可能不能接近修飾；與結合界面接觸或極其接近的殘基(例如，參與il-15β/γ受體結合的殘基)；和參與二硫鍵的半胱氨酸殘基，其通常與基于半胱氨酸的聚乙二醇化學物質不反應(盡管二硫鍵的半胱氨酸聚乙二醇化已經(jīng)使用定義的聚乙二醇化條件完成)。相比之下，可能是潛在修飾(例如聚乙二醇化)的良好候選物的氨基酸殘基包括不參與蛋白質-蛋白質相互作用的表面暴露的殘基或形成螺旋間接合的殘基。值得注意的是，當不受il-15rα結合時，已經(jīng)觀察到il-15是構象“塑性”的(ring等人，nat.immunol.13(12):1187-95(2012年12月13日))。

目前存在化學物質用于例如多肽的n-末端、賴氨酸殘基、半胱氨酸殘基、組氨酸殘基、精氨酸殘基、天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基、絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基、酪氨酸殘基和c-末端的聚乙二醇化。如上文指示，本公開考慮引入非天然氨基酸殘基，其繼而可以被聚乙二醇化。然而，以位點特異性的方式僅使這些氨基酸殘基中的一些常規(guī)地聚乙二醇化。其它氨基酸的聚乙二醇化只能在復雜條件下以位點特異性方式實現(xiàn)，而其它氨基酸(如谷氨酸和絲氨酸殘基)的聚乙二醇化)通常導致太多的位置異構體以致于無用。

可能適合于聚乙二醇化的成熟il-15內可能的殘基(例如，組氨酸和蘇氨酸)的評估如下：發(fā)現(xiàn)n-末端是可用于聚乙二醇化的位點；發(fā)現(xiàn)c-末端是可能的可用于聚乙二醇化的位點；賴氨酸(k)-7個殘基存在于成熟il-15中，但發(fā)現(xiàn)無一是可用于聚乙二醇化的位點；半胱氨酸(c)-4個殘基存在于成熟il-15中，但發(fā)現(xiàn)無一是可用于聚乙二醇化的位點；組氨酸(h)-4個殘基存在于成熟il-15中，但發(fā)現(xiàn)無一是可用于聚乙二醇化的位點；天冬氨酸(d)-6個殘基存在于成熟il-15中，但發(fā)現(xiàn)無一是可用于聚乙二醇化的位點；谷氨酸(e)-12個殘基存在于成熟il-15中，但發(fā)現(xiàn)無一是可用于聚乙二醇化的位點；絲氨酸(s)-13個殘基存在于成熟il-15中，但發(fā)現(xiàn)無一是可用于聚乙二醇化的位點；和蘇氨酸(t)–6個殘基存在于成熟il-15中，但發(fā)現(xiàn)無一是可用于聚乙二醇化的位點。在一個實施方案中，成熟il-15中唯一的酪氨酸(y)殘基代表用于聚乙二醇化的可能位點。

盡管每個上述殘基在合適的條件下可以適合于聚乙二醇化，但從商業(yè)角度來看用于聚乙二醇化的實際候選物的殘基數(shù)目是上文闡述的那些殘基的一部分。舉例來說，目前基于賴氨酸的聚乙二醇化策略不允許特定賴氨酸(來自野生型il-15分子內的7個賴氨酸殘基之間)的聚乙二醇化而不產(chǎn)生位置異構體。此類位置異構體在治療劑中通常是不能容忍的。此外，它們經(jīng)常在制造過程中引入額外的復雜性。最后，如果那些殘基與“靶標”殘基具有相似的鍵或環(huán)結構，則某些聚乙二醇化策略將導致“非靶標”殘基的聚乙二醇化。

根據(jù)本文所闡述的教導，在成熟il-15的114氨基酸殘基中，預測經(jīng)由誘變和位點特異性化學的組合修飾氨基殘基對44個殘基是無用(參見圖5)。在44個殘基中，4個可能參與二硫鍵。剩余的40個殘基可能與受體信號傳導復合體接觸，被埋在三級il-15結構的疏水核心區(qū)域內，或兩者。為了實施本公開，不需要了解il-15/il-2受體信號傳導復合體的各種組分如何相互作用以及如何實現(xiàn)信號傳導。然而，在三個il-15r亞基(α、β和γc)中，認為信號傳導包含il-15與β和γc亞基的結合。因此，在一些實施方案中，本公開考慮了結合il-15rα的il-15的一個或多個氨基酸殘基的聚乙二醇化，因為此類聚乙二醇化應當僅對il-15信號傳導具有名義的影響(如果有的話)。相反，基于本文闡述的教導，預測經(jīng)由誘變和位點特異性化學的組合修飾氨基酸殘基對59個殘基是可行的，所述殘基可能是表面暴露的并且不整體參與il-15受體復合物或二硫鍵鍵合。認為11個殘基具有作為潛在的聚乙二醇化位點的潛力(例如，側翼有參與受體結和不參與受體結合的另一個表面暴露的殘基的殘基)，如圖5中的“+/-”指示。應當理解，根據(jù)所使用的方法和其它參數(shù)，熟練技術人員可以得出結論，認為不是潛在的聚乙二醇化位點的一個或多個殘基，認為是潛在的聚乙二醇化位點的一個或多個殘基和/或認為可能是潛在的聚乙二醇化位點的一個或多個殘基可能落入不同的類別(例如，可以推斷可能是潛在的聚乙二醇化位點的殘基是潛在的聚乙二醇化位點)。

如上文闡述，59個氨基酸殘基代表潛在容許通過取代將充當peg錨定的氨基酸的突變的位點。在這59個可能的位點中，由于各種原因，在特定位置消除某些突變體：殘基26(y)不能突變?yōu)槔野彼?，因為人il-15在該位置已經(jīng)含有酪氨酸；殘基71(n)已經(jīng)含有n-x-sn-糖基化基序，因此只能引入n-x-t基序；殘基79(n)已經(jīng)含有n-x-tn-糖基化基序，因此只能引入n-x-s基序；并且殘基112(n)已經(jīng)含有n-x-sn-糖基化基序，因此只能引入n-x-t基序。殘基113(t)和114(s)分別是倒數(shù)第二個殘基和最后一個殘基，因此不能添加3個氨基酸的n-糖基化基序。由于跨越三個氨基酸的用于n-糖基化位點的基序(n-x-s或n-x-t，其中x≠p)，有時必需使n-糖基化突變側翼的殘基突變；然而，此類突變設計為使得n-糖基化將發(fā)生在所關注的特定殘基。使用本文所述的方法產(chǎn)生突變體，并在ctll-2增殖測定法中進行評價以測定生物活性。

圖6闡述了特定取代的ctll-2增殖數(shù)據(jù)。對數(shù)據(jù)的回顧得出幾個一般觀察。首先，螺旋之間的環(huán)通常是突變的良好位置。然而，a/b環(huán)內的一些殘基是對于修飾較差的候選物。第二，盡管半胱氨酸突變體通常是非常破壞性的，但僅殘基6(i)和70(a)的突變是無活性的。下文闡述了可以為了引入將充當用于聚乙二醇化的位點的氨基酸而做出的精確取代的詳細討論。然而，在保留一些生物活性的情況下，最適合于取代的幾個殘基總結如下：a)氨基酸殘基1(n)的全部四種取代(即酪氨酸(y)、半胱氨酸(c)、n-x-s和n-x-t)產(chǎn)生活性蛋白，并且可以容易地采用標準n-末端的聚乙二醇化策略；b)氨基酸殘基13(e)至15(l)的取代產(chǎn)生有利的結果；c)氨基酸殘基17(q)至23(a)的取代產(chǎn)生有利的結果；d)氨基酸殘基48(q)、49(v)、51(s)至58(s)和60(h)的取代產(chǎn)生活性蛋白；e)氨基酸殘基71(n)至84(g)產(chǎn)生有利的結果，除了在該13個殘基跨度間的兩個突變外；f)氨基酸殘基89(e)至98(e)的取代產(chǎn)生有利的結果；以及g)在c-末端的氨基酸殘基113(t)和114(s)產(chǎn)生有利的結果，并且可以容易地采用標準的c-末端的聚乙二醇化策略。

本公開的一些實施方案考慮在至少一個以下區(qū)域中包含至少一個氨基酸取代的肽：17-28、36-38、51-57、71-84或89-98。在其它實施方案中，肽包含至少在以下位置之一的至少一個氨基酸取代：1、17-28、36-38、41、45、46、48、49、51-57、60、67、71-84、86、87、89-98、101、113或114。在另外的實施方案中，肽包含至少在以下位置之一的至少一個氨基酸取代：1、3、13-15、17-29、33、34、36-39、41、45、46、48、49、51-58、60、67、71-84、86、87、89-98、101、102、104、113或114。

鑒定表明生物活性的突變體

使用本文所述的方法，進行評估以確定成熟人il-15蛋白的114個氨基酸殘基中的哪個將容許用有助于形成peg部分的錨定位點的殘基的取代。進一步分析使用此評估鑒定的殘基，以確定取代是否會導致展現(xiàn)出生物活性的突變體(突變蛋白)。熟練技術人員將認識到，并非所有在體外測定法中有活性的突變體都將在體內環(huán)境中具有活性，反之亦然。

如上文和在圖5中指示，114個殘基的成熟人il-15多肽的44個氨基酸殘基(由“-”表示)不是用于聚乙二醇化的候選物。這44個殘基中的4個是形成二硫鍵的半胱氨酸(殘基35→85和殘基42→88)，因此不可用于突變。剩余的40個殘基可能與受體信號傳導復合體接觸，被埋在三級il-15結構的疏水核心區(qū)域內，或兩者。因此，70個殘基(在圖5中，其中59個與“+”相關，并且其中11個與“+/-”相關)代表可以容許突變的位點，所述突變通過將充當peg的錨定的氨基酸的取代進行。然后，使用如本文所述的ctll-2細胞增殖測定法評估這些潛在位點的突變。

評估結果總結在圖6a-6b中。圖6a-6b的第一行定義了il-15的每個區(qū)域的邊界：a)螺旋a；b)a/b環(huán)(即a/b螺旋間接合)；c)螺旋b；d)b/c轉角(即b/c螺旋間接合)；e)螺旋c；f)cd環(huán)(即c/d螺旋間接合)；和g)螺旋d。第二行闡述了114個殘基的成熟il-15多肽的每個氨基酸殘基。圖6的下四行涉及在每個殘基處引入的突變類型：半胱氨酸、酪氨酸和n-x-s和n-x-tn-糖基化基序。

參考圖6a-6b中的陰影法，除了下面描述的具有“x”的深灰色框之外，深灰色框中的殘基既不突變也不是分析的一部分，因為認為它們不是用于引入可充當peg錨定的氨基酸的良好候選物；如上文指示，此類殘基可能與受體信號傳導復合物接觸，被埋在三級il-15結構的疏水核心區(qū)域內，或兩者。然而，應當注意，這些殘基中的一些在引入n-糖基化位點的情況下是突變的。淺灰色框中剩余的70個殘基表示更可能在同二聚體上表面暴露，并且不太可能干擾受體結合的殘基。應當理解，熟練技術人員可以得出結論，可以不同地分類一個或多個殘基(即，可以將在深灰色框中的殘基置于淺灰色框中)。

使用本文所述的方法產(chǎn)生突變體(例如半胱氨酸或酪氨酸)，并且在實驗部分中描述并且與soman等人(jimmunolmethods348(1-2):83-94(2009年8月31日))描述的測定法基本相似的ctll-2細胞增殖測定法中評估它們的生物活性。如果突變體得到表達并表現(xiàn)出生物活性，則將“+”置于適用的盒中(例如，提到氨基酸殘基41，酪氨酸突變體表現(xiàn)出活性，而半胱氨酸突變體不然)。為評估目的，測量任何生物活性導致“+”符號的分配。在沒有“+”的淺灰色框(即，空白灰色框)中的突變體指示突變體不表達或在ctll-2測定法中無活性。

在圖6a-6b中與特定氨基酸殘基相關的一些淺灰色列中，一些框(淺灰色)可以是空白的或含有“+”，而其它框是深灰色并含有“x”。在這些情況下，由于各種原因，不能突變深灰色的“x”盒。不能將殘基26(y)突變?yōu)槔野彼幔驗槿薸l-15在該位置已經(jīng)含有酪氨酸。對于殘基71(n)，不能引入n-x-sn-糖基化基序，因為蛋白已經(jīng)含有n-x-sn-糖基化基序。對于殘基79(n)，不能引入n-x-tn-糖基化基序，因為蛋白質已經(jīng)含有n-x-tn-糖基化基序。對于殘基113(t)，由于n-糖基化基序長三個氨基酸(n-x-s或n-x-t)，不能在蛋白質的倒數(shù)第二個殘基引入n-糖基化位點。對于殘基114(s)，由于n-糖基化基序長三個氨基酸，不能在蛋白質的最后一個殘基處引入n-糖基化位點。

鑒于圖6a-6b中描繪并在本文中別處描述的教導，熟練技術人員將認識到以下內容：1)存在有70個潛在殘基，其中為了錨定peg部分的目的，可以引入突變(即，存在有70個淺灰色列)。2)在70個潛在殘基中，進一步的評估指示69個殘基擁有使其成為錨定peg部分的可行候選物的性質，因為殘基46(e)不產(chǎn)生具有任何測試突變的活性蛋白質。3)除了已經(jīng)是酪氨酸的殘基26外，可以用酪氨酸取代69個殘基中的每個，并產(chǎn)生生物活性蛋白。4)除了殘基26(y)、41(k)、57(a)和71(n)之外，可以用半胱氨酸取代69個殘基中的每個，并產(chǎn)生生物活性蛋白。5)除了3(v)、23(a)至26(y)、33(p)、37(v)至39(a)、41(k)、45(l)、67(i)、83(s)、86(k)和101(q)外，可以在69個殘基中的每個產(chǎn)生n-x-s糖基化基序，并產(chǎn)生生物活性蛋白。殘基113(t)和114(s)不能容納糖基化位點，因為如上文指示，它們代表天然人il-15的最后兩個殘基。殘基71(n)已經(jīng)表示n-x-s糖基化基序的天冬酰胺。6)除殘基3(v)、23(a)至28(e)、33(p)、37(v)至39(a)、41(k)、45(l)、67(i)、83(s)、86(k)、101(q)和104(v)以外，可以在69個殘基中的每個產(chǎn)生n-x-t糖基化基序。殘基113(t)和114(s)不能容納糖基化位點，因為如上文指示，它們代表天然人il-15的最后兩個殘基。殘基79(n)已經(jīng)表示n-x-t糖基化基序的天冬酰胺。

il-15的經(jīng)修飾的形式的免疫原性考慮

免疫原性(抗原在受試者中引發(fā)體液(b細胞)和/或細胞介導的(t細胞)免疫應答的能力)可被歸類為“期望的”或“不期望的”。期望的免疫原性通常是指通過疫苗注射引起的受試者針對病原體(例如病毒或細菌)引發(fā)的免疫應答。在這種情況下，免疫應答是有利的。相反地，不期望的免疫原性通常是指受試者針對如治療性蛋白質(例如il-15)等抗原而引發(fā)的免疫應答；免疫應答可以例如導致不利影響治療性蛋白質的有效性或其藥代動力學參數(shù)的抗藥物抗體(ada)，和/或有助于其它不良反應。在這種情況下，免疫反應是不利的。

存在有影響受試者對蛋白質治療劑的免疫反應的許多受試者特異性和產(chǎn)品特異性因素。受試者特異性因素包括受試者的免疫狀態(tài)和能力；在先致敏/變態(tài)反應史；施用途徑；施用的劑量和頻率；受試者的遺傳狀況；受試者對內源蛋白的免疫耐受性狀態(tài)。影響免疫原性的產(chǎn)品特異性因素包括產(chǎn)品起源(外源或內源)；產(chǎn)品的主要分子結構/翻譯后修飾、三級和四級結構等；產(chǎn)物聚集體的存在；綴合/修飾(例如糖基化和聚乙二醇化)；具有佐劑活性的雜質；產(chǎn)品的免疫調節(jié)特性；以及配制劑。

已證明自體或人樣的多肽治療劑令人驚訝地在某些應用中是免疫原性的，并且在其它應用中令人驚訝地是非免疫原性的。特定的il-15突變蛋白和il-15的其它修飾形式(例如，聚乙二醇化的il-15和il和il-15結構域)可能引起大量的體液和細胞介導的免疫應答。如本文進一步討論，t細胞表位和/或b細胞表位的除去或修飾可以降低免疫原性。實際上，在某些情況下，一個或多個氨基酸殘基與“掩蔽劑”(例如，peg)的綴合和/或對氨基酸殘基本身的變化(例如通過取代)可以顯著降低否則高度免疫原性蛋白質的免疫原性。

t細胞表位。如下面進一步討論，與經(jīng)常依賴于二級和三級蛋白質結構的復雜三維b細胞表位相反，cd4+t細胞表位是長度通常范圍從約11至約20個氨基酸殘基的線性肽序列。存在臨床免疫原性數(shù)據(jù)的一系列蛋白質的比較分析顯示t細胞表位的存在和效力與相應蛋白質的免疫原性之間的強關系。

計算機篩選工具經(jīng)常用作綜合t細胞表位評估的初始步驟。對肽的輔助cd4+t細胞應答的誘導需要肽結合mhcii類?？梢栽谥委熜缘鞍踪|的開發(fā)過程中利用這種肽結合數(shù)據(jù)的分析。舉例而言，antitopeltd(cambridge,uk)具有專有的計算機分子建模技術(itope^tm)，其可以對肽與34種mhcii類等位基因的結合建模?？梢詾槊糠N等位基因確定單個氨基酸殘基對肽結合的貢獻，然后在“去免疫”序列變體的設計中使用這些數(shù)據(jù)，其中突變t細胞表位以破壞結合。

此外，用于鑒定t細胞表位的“免疫信息學”算法和其它技術可用于將蛋白質治療劑分類為較高風險和較低風險的類別。為了闡明，可以將蛋白質序列解析為重疊的9聚體肽框，然后評估對“覆蓋”大多數(shù)人的遺傳背景的8種常見ii類hla等位基因中的每個的結合潛力。通過計算蛋白質內高得分框的密度，可以估計蛋白質的總體“免疫原性評分”。此外，可以鑒定密集堆積、高評分框的亞區(qū)域或潛在免疫原性的“簇”，并且可以計算和編譯簇得分。然后，可以使用蛋白質的“免疫原性得分”以及免疫原性的其它決定因素測定蛋白質將會引發(fā)免疫應答的可能性。

可以采用降低治療性蛋白質免疫原性的其它方法。技術(例如antitope的專有episcreen^tm人離體t細胞測定系統(tǒng))可用于測定輔助cd4+t細胞對蛋白質、肽、配制劑等的應答。從使用這些技術產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可用于在起始蛋白的序列內定位輔助cd4+t細胞表位，然后通過以下一項或多項從蛋白質中除去t細胞表位：設計突變以減少/消除與人mhcii類的結合；靶向t細胞受體接觸殘基以破壞肽/mhcii類復合物的識別；進行結構和同源性分析以指導關鍵氨基酸殘基的靶向和取代，以便保持期望的蛋白質活性；以及基于效力優(yōu)先化t細胞表位以除去。

b細胞表位。可以將b細胞表位置于兩種類別之一。在第一類中，表位由蛋白質的特定區(qū)域的一級氨基酸序列定義，并且表位的組分依次位于蛋白質上。這些線性b細胞表位的長度通常為約5至約20個氨基酸殘基。在第二類中，表位由蛋白質的構象結構定義，并且表位的組分位于蛋白質的不同部分中，所述部分在天然蛋白質的折疊的二級或三級結構中彼此接近。因為大多數(shù)b細胞表位是基于蛋白質的構象結構，所以b細胞表位比t細胞表位(其由它們的一級氨基酸序列確定)更難以鑒定。

先前使用的基于序列的b細胞表位預測器的實例包括由sahas和raghavagp(“abcpred技術”)(proteins(2006)65:40-48)；chen等人(aminoacids(2007)33:423-28)；el-manzalawyy等人(“bcpred”技術)(jmolrecognit(2008)21:243-55)；sweredoskimj和baldip(“cobepro”技術)(proteinengdessel(2009)22:113-20)；weelj等人(“bayesb”技術)(bmcgenomics(2010)11:s21)；以及ansarihr和raghavagp(“cbtope”技術)(immunomeres(2010)6:6)描述的技術。

使用支持向量機工具(“best”)的b細胞表位預測是一種有希望的新型b細胞表位技術(gaoj等人(2012)plosone7(6):e40104.doi:10.1371/journal.pone.0040104)。與僅從短序列片段預測的許多先前的方法相反，best方法從抗原序列預測表位，通過支持向量機(svm)使用基于從滑動20聚體產(chǎn)生的平均選定得分進行。svm預測器利用通過組合源自鏈的信息、序列保守、與已知(訓練)表位的相似性和預測的二級結構和相對溶劑可及性產(chǎn)生的綜合和定制設計的一組輸入。此外，幾個商業(yè)實體利用專有技術來評估b細胞表位(例如proimmune的b細胞elispot技術；proimmuneltd.；oxford，uk)。

為了評估免疫原性，著重于潛在的t細胞表位是有用的，所述t細胞表位通常雖然不總是驅動抗原特異性b細胞應答。

il-15的生產(chǎn)方法

可以通過任何合適的方法產(chǎn)生本公開的多肽，所述方法包括非重組(例如，化學合成)和重組方法。

化學合成

在化學合成多肽的情況下，可以經(jīng)由液相或固相進行合成。固相肽合成(spps)允許引入非天然氨基酸和/或肽/蛋白質主鏈修飾。各種形式的spps，如9-芴基甲氧基羰基(fmoc)和叔丁氧基羰基(boc)可用于合成本公開的多肽?；瘜W合成的詳情是本領域中已知的(例如，ganesana.(2006)minirev.med.chem.6:3-10；和camareroj.a.等人(2005)proteinpeptlett.12:723-8)。

如下文描述，可以進行固相肽合成。α功能(nα)和任何反應性側鏈均受酸不穩(wěn)定或堿不穩(wěn)定基團的保護。保護基在連接酰胺鍵的條件下是穩(wěn)定的，但是可以容易地切割而不損害已經(jīng)形成的肽鏈。適用于α-氨基功能的保護基包括但不限于下列各項：boc、芐氧基羰基(z)、o-氯芐氧羰基、雙苯基異丙氧基羰基、叔戊氧基羰基(amoc)、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基-芐基氧基羰基、鄰-硝基亞磺?；?-氰基-叔丁氧-羰基、fmoc、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己-1-基)乙基(dde)，等等。

合適的側鏈保護基包括但不限于：乙酰基、烯丙基(all)、烯丙基氧基羰基(alloc)、芐基(bzl)、芐基氧基羰基(z)、叔丁基氧基羰基(boc)、芐基氧基甲基(bom)、鄰-溴芐基氧基羰基、叔丁基(tbu)、叔丁基二甲基甲硅烷基、2-氯芐基、2-氯芐基氧基羰基、2,6-二氯芐基、環(huán)己基、環(huán)戊基、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)亞己-1-基)乙基(dde)、異丙基、4-甲氧基-2,3,6-三甲基芐基磺?；?mtr)、2,3,5,7,8-五甲基色滿-6-磺?；?pmc)、新戊?；?、四氫吡喃-2-基，甲苯磺?；?tos)、2,4,6-三甲氧基芐基、三甲基甲硅烷基和三苯甲基(trt)。在固相合成中，將c-末端氨基酸與合適的支持物材料綴合。合適的支持物材料是對用于合成過程的逐步縮合和切割反應的試劑和反應條件是惰性的并且不溶于所用反應介質的那些材料?？缮藤彽闹С治锊牧系膶嵗ㄒ呀?jīng)用反應性基團和/或聚乙二醇改性的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；氯甲基化苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；羥甲基化或氨甲基化苯乙烯/二乙烯基苯共聚物等。

當期望制備肽酸時，可以使用用4-芐基氧基芐基醇(wang-錨定)或2-氯三苯甲基氯化物衍生化的聚苯乙烯(1％)-二乙烯基苯或在肽酰胺的情況下，可以使用用5-(4’-氨基甲基)-3’,5’-二甲氧基苯氧基)戊酸(pal-錨定)或對-(2,4-二甲氧基苯基-氨基甲基)-苯氧基基團(rink酰胺錨定)衍生化的聚苯乙烯(1％)二乙烯基苯或

通過在室溫或升高的溫度(例如，40℃至60℃)在乙醇、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二氯甲烷、四氫呋喃、n-甲基吡咯烷酮或類似溶劑中加入活化劑使c-末端fmoc-保護的氨基酸與支持物材料起反應并且例如以2至72小時反應時間實現(xiàn)與聚合支持物的連接。

nα-保護的氨基酸(例如，fmoc氨基酸)與pal、wang或rink錨定的綴合可以例如在1-羥基苯并三唑或1-羥基-7-氮雜苯并三唑存在或不存在下借助綴合試劑，如n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)、n,n’-二異丙基碳二亞胺(dic)或其它碳二亞胺、2-(1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸鹽(tbtu)或其它脲鹽、o-酰基脲、苯并三唑-1-基-三-吡咯烷基-六氟磷酸鏻(pybop)或其它鏻鹽、n-羥基琥珀酰亞胺、其它n-羥基酰亞胺或肟，例如借助于tbtu通過加入hobt，在添加或不添加堿，如例如二異丙基乙胺(diea)、三乙胺或n-甲基嗎啉，例如二異丙基乙胺的情況下，以反應時間2至72小時(例如3小時，在1.5至3倍過量的氨基酸和綴合試劑中，例如以2倍過量和約10℃至50℃之間的溫度，例如在溶劑如二甲基甲酰胺、n-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷，例如二甲基甲酰胺中25℃)進行。

也可以在上文描述的條件下使用活性酯(例如五氟苯基、對硝基苯基等)，nα-fmoc-氨基酸的對稱酸酐、其酰基氯或?；婢Y合試劑。

nα-保護的氨基酸(例如，fmoc氨基酸)可通過加入diea與二氯甲烷中的2-氯三苯甲基樹脂綴合，反應時間為10至120分鐘，例如20分鐘，但不限于使用此溶劑和此堿。

受保護的氨基酸的連續(xù)綴合可以根據(jù)肽合成中的常規(guī)方法進行，通常在自動肽合成儀中進行。在通過用例如二甲基甲酰胺中的哌啶(10％至50％)處理5至20分鐘，例如，用dmf中的50％哌啶的2x2分鐘和用dmf中的20％哌啶的1x15分鐘切割固相上的綴合氨基酸的nα-fmoc保護基后，將3至10倍過量，例如10倍過量的接著的受保護的氨基酸與惰性非水性極性溶劑，如二氯甲烷、dmf或兩種的混合物中的先前的氨基酸并且在約10℃至50℃的溫度，例如在25℃綴合。先前提及的用于將第一nα-fmoc氨基酸綴合到pal，wang或rink錨定的試劑適合作為綴合試劑。也可以使用受保護的氨基酸的活性酯，或其氯化物或氟化物或其對稱酸酐作為備選。

在固相合成結束時，從支持物材料中切割肽，同時切斷側鏈保護基?？梢杂萌宜峄蚱渌鼜娝嵝越橘|進行切割，加入5％-20％v/v的清除劑如二甲基硫醚、乙基甲基硫醚、苯甲硫醚、硫代甲酚、間甲酚、苯甲醚乙二硫醇、酚或水，例如15％v/v二甲基硫醚/乙二硫醇/間甲酚1:1:1，在0.5至3小時內，例如2小時。通過用冰醋酸/三氟乙醇/二氯甲烷2:2:6切割2-氯三苯甲基錨定得到具有完全保護的側鏈的肽?？梢酝ㄟ^硅膠上的層析純化受保護的肽。如果通過wang錨將肽連接到固相，并且如果意圖獲得具有c-末端烷基酰胺化的肽，則可以用烷基胺或氟代烷基胺進行氨解來進行切割。氨解在約-10℃至50℃(例如約25℃)之間的溫度下進行，并且反應時間在約12至24小時(例如約18小時)。此外，可以通過例如用甲醇再酯化從支持物切割肽。

可以將獲得的酸性溶液與3至20倍量的冷乙醚或正己烷(例如10倍過量的乙醚)混合，以便使肽沉淀，因此分離仍然在乙醚中的清除劑和切割的保護基團。可以通過從冰醋酸將肽再沉淀數(shù)次進行進一步純化?？梢詫@得的沉淀物溶于水或叔丁醇或兩種溶劑的混合物，例如叔丁醇/水的1:1混合物中，并冷凍干燥。

可以通過各種層析法純化獲得的肽，包括以乙酸形式在弱堿性樹脂上的離子交換；非衍生化的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物(例如，xad)上的疏水吸附層析；硅膠上的吸附層析；離子交換層析，例如在羧甲基纖維素上；分配層析，例如，在g-25上；反流分配層析；或高壓液相層析(hplc)，例如在辛基或十八烷基甲硅烷基二氧化硅(ods)相上的反相hplc。

重組生產(chǎn)

可以使用本領域中已知的標準技術，如本文所述的那些技術，以多種方式合成il-15(例如鼠和人il-15)。il-15可為病毒來源，moore等人，(1990)science248:1230中公開了來自埃巴病毒的病毒il-15(bcrf1蛋白)的克隆和表達。此外，重組il-15可以從許多來源商購(例如lifetechnologies,grandisland,ny和biolegend,sandiego,ca)。

可以使用位點特異性誘變(也稱為定點誘變和寡核苷酸定向誘變)來產(chǎn)生dna中的特定突變以產(chǎn)生具有改善或期望的性質的本公開的合理設計的蛋白質(例如，特定的il-15突變蛋白和其它修飾形式的il-15，包括其結構域)。用于位點特異性誘變的技術是本領域中公知的。早期的位點特異性誘變方法(例如kunkel方法；盒式誘變；pcr定點誘變；和全質粒誘變，包括sprinp)已被更精確且有效的方法替換，如各種體內方法，包括delittoperfetto(參見storicif.andresnickma,(2006)methodsinenzymology409:329-45)；置換型“突進突出”(“pop-inpop-out”)；用pcr和一個可循環(huán)標志物的直接基因缺失和位點特異性誘變；使用長同源區(qū)域用pcr和一個可循環(huán)標志物的直接基因缺失和位點特異性誘變；以及用合成寡核苷酸進行體內定點誘變(參見例如于vitromutagenesisprotocols(methodsinmolecularbiology),第2版isbn978-0896039100)。此外，用于實現(xiàn)位點特異性誘變的工具是可商購的(例如stratagenecorp.,lajolla,ca)。

在使用重組技術產(chǎn)生多肽的情況下，可以使用任何合適的構建體和任何合適的宿主細胞作為細胞內蛋白或分泌性蛋白產(chǎn)生多肽，所述宿主細胞可以分別是原核或真核細胞，如細菌(例如，大腸桿菌)或酵母宿主細胞?？捎米魉拗骷毎恼婧思毎钠渌鼘嵗ɡハx細胞、哺乳動物細胞和/或植物細胞。在使用哺乳動物宿主細胞的情況下，它們可以包括人細胞(例如hela、293、h9和jurkat細胞)；小鼠細胞(例如，nih3t3、l細胞和c127細胞)；靈長類細胞(例如cos1、cos7和cv1)；和倉鼠細胞(例如，中國倉鼠卵巢(cho)細胞)。

可以根據(jù)本領域中已知的標準方法使用適合于多肽表達的多種宿主載體系統(tǒng)。參見例如sambrook等人，1989currentprotocolsinmolecularbiologycoldspringharborpress,newyork；及ausubel等人1995currentprotocolsinmolecularbiology,wiley和sons編。用于將遺傳物質導入宿主細胞中的方法包括例如轉化、電穿孔、接合、磷酸鈣方法等。可以選擇用于轉移的方法，以提供導入的多肽編碼核酸的穩(wěn)定表達。編碼多肽的核酸可以作為可遺傳的附加體元件(例如，質粒)提供，或可以是基因組整合的。用于生產(chǎn)所關注多肽的多種合適的載體是可商購的。

載體可以在宿主細胞中提供染色體外維持，或可以提供對宿主細胞基因組的整合。表達載體提供轉錄和翻譯調控序列，并且可以提供誘導型或組成性表達，其中編碼區(qū)在轉錄啟動區(qū)，以及轉錄和翻譯終止區(qū)的轉錄控制下可操作地連接。通常，轉錄和翻譯調節(jié)序列可以包括但不限于啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列，以及增強子或活化因子序列。啟動子可以是組成性或誘導型，并且可以是強的組成性啟動子(例如t7)。

表達構建體通常具有位于啟動子序列附近的方便的限制性位點，以提供編碼所關注蛋白質的核酸序列的插入。可以存在在表達宿主中操作的選擇標志物，以便于選擇含有載體的細胞。此外，表達構建體可以包括額外的元素。例如，表達載體可以具有一個或兩個復制系統(tǒng)，因此允許其保持在生物體中，例如在哺乳動物或昆蟲細胞中用于表達和在原核宿主中用于克隆和擴增。此外，表達構建體可以含有選擇標志物基因以允許選擇經(jīng)轉化的宿主細胞?？蛇x擇的基因是本領域中公知的，并且將隨所用的宿主細胞而變化。

可以根據(jù)本領域已知的方法實現(xiàn)蛋白質的分離和純化。例如，可以從遺傳修飾為組成性和/或在誘導時表達蛋白質的細胞的裂解物中，或從合成反應混合物中通過免疫親和純化分離出蛋白質，所述免疫親和純化通常包括使樣品與抗蛋白質抗體接觸，清洗以除去非特異性結合的材料，并且洗脫特異性結合的蛋白質?？梢酝ㄟ^透析和通常用于蛋白質純化的其它方法進一步純化分離的蛋白質。在一個實施方案中，可以使用金屬螯合層析法分離蛋白質。蛋白質可含有修飾以促進分離。

可以以基本上純的或分離的形式(例如，不含其它多肽)制備多肽。多肽可以存在于相對于可能存在的其它成分(例如其它多肽或其它宿主細胞成分)富集多肽的組合物中。例如，可以提供純化的多肽，使得多肽存在于基本上不含其它表達蛋白質的組合物中，例如小于約90％、小于約60％、小于約50％、小于約40％、小于約30％、小于約20％、小于約10％、小于約5％或小于約1％。

可以使用重組技術產(chǎn)生il-15多肽來操作本領域已知的不同的il-15相關核酸以提供能夠編碼il-15多肽的構建體。應當理解，當提供特定的氨基酸序列時，普通熟練技術人員鑒于她在例如分子生物學方面的背景和經(jīng)驗將認識到編碼此類氨基酸序列的多種不同核酸分子。

酰胺鍵取代

在一些情況下，il-15包含除肽鍵之外的一種或多種鍵，例如至少兩個相鄰的氨基酸通過除酰胺鍵之外的鍵連接。例如，為了減少或消除不期望的蛋白水解或其它降解手段，和/或提高血清穩(wěn)定性，和/或限制或增加構象柔性，可以取代il-15骨架內的一個或多個酰胺鍵。

在另一個實例中，il-15中的一個或多個酰胺鍵(-co-nh-)可以用作為酰胺鍵的電子等排體的鍵替換，如-ch2nh-、-ch2s-、-ch2ch2-、-ch＝ch-(順式和反式)、-coch2-、-ch(oh)ch2-或-ch2so-。il-15中的一個或多個酰胺鍵也可以用例如還原的電子等排體假肽鍵替換。參見couder等人(1993)int.j.peptideproteinres.41:181-184。此類替換以及如何實現(xiàn)它們是本領域普通技術人員已知的。

氨基酸取代

可以在il-15多肽中進行一個或多個氨基酸取代。以下是非限制性實例：

a)取代烷基取代的疏水性氨基酸，包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、正亮氨酸，(s)-2-氨基丁酸、(s)-環(huán)己基丙氨酸或由c1-c10碳的脂肪族側鏈取代的其它簡單的α-氨基酸，包括支鏈、環(huán)狀和直鏈烷基、烯基或炔基取代；

b)取代芳香族取代的疏水性氨基酸，包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、磺基酪氨酸、聯(lián)苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-苯并噻吩丙氨酸、3-苯并噻吩丙氨酸、組氨酸，包括氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氮雜、鹵代(氟、氯、溴或碘)或烷氧基(c1-c4)-取代形式的上文列出的芳香族氨基酸，其示例性實例是：2-、3-或4-氨基苯丙氨酸、2-、3-或4-氯苯丙氨酸、、2-、3-或4-甲基苯丙氨酸、2-、3-或4-甲氧基苯丙氨酸、5-氨基-、5-氯-、5-甲基-或5-甲氧基色氨酸、2’-、3’-或4’-氨基-、2’-、3’-或4’-氯-、2、3或4-聯(lián)苯基丙氨酸、2’-、3’-或4’-甲基-、2-、3-或4-聯(lián)苯基丙氨酸，以及2-或3-吡啶基丙氨酸；

c)取代含有堿性側鏈的氨基酸，包括精氨酸、賴氨酸、組氨酸、鳥氨酸、2,3-二氨基丙酸、高精氨酸，包括先前氨基酸的烷基、烯基或芳基取代的(c1-c10支鏈、直鏈或環(huán)狀)衍生物，無論取代基是在雜原子(如α氮，或一個或多個遠端氮)上，或在α碳上，例如在前-r位上。充當闡述性實例的化合物包括：n-ε-異丙基賴氨酸、3-(4-四氫吡啶基)-甘氨酸、3-(4-四氫吡啶基)-丙氨酸、n,n-γ,γ’-二乙基-高精氨酸。還包括化合物，如α-甲基-精氨酸、α-甲基-2,3-二氨基丙酸、α-甲基-組氨酸、α-甲基-鳥氨酸，其中烷基占據(jù)α-碳的前r位。還包括由烷基、芳香族、雜芳香族(其中雜芳香族基團單獨或組合具有一個或多個氮、氧或硫原子)、羧酸或許多公知的活化衍生物如酰基氯、活性酯、活性雜環(huán)酰胺(azolides)和相關衍生物以及賴氨酸、鳥氨酸或2,3-二氨基丙酸中的任一種形成的酰胺；

d)取代酸性氨基酸，包括天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸、酪氨酸、2,4-二氨基丙酸的烷基、芳基、芳烷基和雜芳基磺酰胺、鳥氨酸或賴氨酸和四唑取代的烷基氨基酸；

e)取代側鏈酰胺殘基，包括天冬酰胺、谷氨酰胺和天冬酰胺或谷氨酰胺的烷基或芳香族取代的衍生物；和

f)取代含羥基的氨基酸，包括絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸、2,3-二氨基丙酸和絲氨酸或蘇氨酸的烷基或芳香族取代的衍生物。

在某些實施方案中，il-15包含一種或多種天然存在的非遺傳編碼的l-氨基酸、合成的l-氨基酸或氨基酸的d-對映異構體。在一些實施方案中，il-15僅包含d-氨基酸。例如，il-15多肽可以包含一個或多個以下殘基：羥脯氨酸、β-丙氨酸、鄰氨基苯甲酸、間氨基苯甲酸、對氨基苯甲酸、間氨基甲基苯甲酸、2,3-二氨基丙酸、α-氨基異丁酸、n-甲基甘氨酸(肌氨酸)、鳥氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、n-甲基異亮氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、正亮氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸3-苯并噻吩丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、青霉胺、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩丙氨酸、甲硫氨酸亞砜、高精氨酸、n-乙酰賴氨酸、2,4-二氨基丁酸、ρ-氨基苯丙氨酸、n-甲基纈氨酸、高半胱氨酸、高絲氨酸、ε-氨基己酸、ω-氨基己酸、ω-氨基庚酸、ω-氨基辛酸、ω-氨基十二烷酸、ω-氨基十四烷酸、環(huán)己基丙氨酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、δ-氨基戊酸和2,3-二氨基丁酸。

另外的修飾

可以將半胱氨酸殘基或半胱氨酸類似物引入il-15多肽中提供經(jīng)由二硫鍵與另一個肽的連接或提供il-15多肽的環(huán)化。引入半胱氨酸或半胱氨酸類似物的方法是本領域已知的(參見例如美國專利號8,067,532)。其它的環(huán)化手段包括引入肟接頭或羊毛硫氨酸接頭；參見例如美國專利號8,044,175。可以使用和/或引入可以形成環(huán)化鍵的氨基酸(或非氨基酸部分)的任意組合?？梢杂冒被?或氨基酸和-(ch2)n-co-或-(ch2)n-c6h4-co-)與允許引入橋的官能團的任意組合產(chǎn)生環(huán)化鍵。一些實例是二硫化物、二硫化物模擬物，如-(ch2)n-碳橋、硫縮醛、硫醚橋(胱硫醚或羊毛硫氨酸)和含有酯和醚的橋。在這些實例中，n可以是任何整數(shù)，但是通常小于10。

其它修飾包括例如n-烷基(或芳基)取代(ψ[conr])或主鏈交聯(lián)以構建內酰胺和其它環(huán)狀結構。其它衍生物包括c-末端羥甲基衍生物，o-修飾的衍生物(例如c-末端羥甲基芐基醚)、n-末端修飾的衍生物，包括取代的酰胺，如烷基酰胺和酰肼。

在一些情況下，用一種或多種d-氨基酸取代il-15多肽中的一種或多種l-氨基酸。

在一些情況下，il-15多肽是反倒位(retroinverso)類似物(參見例如sela和zisman(1997)fasebj.11:449)。反倒位肽類似物是線性多肽的異構體，其中氨基酸序列的方向為反向(反)，并且其中一個或多個氨基酸的手性d-或l-是倒置的(倒位)，例如使用d-氨基酸而不是l-氨基酸。[參見例如jameson等人(1994)nature368:744；及brady等人(1994)nature368:692]。

il-15多肽可以包括“蛋白轉導結構域”(ptd)，其指促進穿過脂質雙層、膠束、細胞膜、細胞器膜或囊泡膜的多肽、多核苷酸、碳水化合物或有機或無機分子。連接到另一個分子的ptd有助于分子穿過膜，例如從細胞外空間到細胞內空間或胞質溶膠到細胞器內。在一些實施方案中，ptd與il-15多肽的氨基末端共價連接，而在其它實施方案中，ptd與il-15多肽的羧基末端共價連接。示例性的蛋白質轉導結構域包括但不限于最小的十一肽蛋白轉導結構域(對應于包含ygrkkrrqrrr的hiv-1tat的殘基47-57；seqidno:11)；包含足以直接進入細胞中的精氨酸殘基數(shù)目(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或10-50個精氨酸)的聚精氨酸序列；vp22結構域(zender等人(2002)cancergenether.9(6):489-96)；果蠅antennapedia蛋白轉導結構域(noguchi等人(2003)diabetes52(7):1732-1737)；截短的人降鈣素肽(trehin等人(2004)pharm.research21:1248-1256)；多賴氨酸(wender等人(2000)proc.natl.acad.sci.usa97:13003-13008)；rrqrrtsklmkr(seqidno:7)；轉運蛋白gwtlnsagyllgkinlkalaalakkil(seqidno:8)；kalaweaklakalakalakhlakalakalkcea(seqidno:9)；和rqikiwfqnrrmkwkk(seqidno:10)。示例性ptd包括但不限于ygrkkrrqrrr(seqidno:11)、rkkrrqrrr(seqidno:12)；3個精氨酸殘基至50個精氨酸殘基的精氨酸均聚物；示例性的ptd結構域氨基酸序列包括但不限于以下任何一種：ygrkkrrqrrr(seqidno:13)；rkkrrqrr(seqidno:14)；yaraaarqara(seqidno:15)；thrlprrrrrr(seqidno:16)；和ggrrarrrrrr(seqidno:17)。

il-15多肽的c-末端末端的氨基酸的羧基cor3以游離形式(r3＝oh)或以生理學容許的堿性或堿土金屬鹽(例如，鈉、鉀或鈣鹽)的形式存在。羧基也可以用伯、仲或叔醇，如例如甲醇、支鏈或非支鏈的c1-c6烷基醇，例如乙醇或叔丁醇進行酯化。羧基也可以用伯胺或仲胺，如氨、支鏈或非支鏈c1-c6烷基胺或c1-c6二烷基胺，如甲胺或二甲胺進行酰胺化。

il-15多肽的n-末端的氨基酸nr1r2的氨基以游離形式存在(r1＝h和r2＝h)或以生理學容許的鹽(如例如氯化物或乙酸鹽)的形式存在。氨基也可以用酸乙?；?，使得r1＝h和r2＝乙?；?、三氟乙?；蚪饎偼榛?。氨基可以以通過通常用于肽化學中的氨基保護基，如上文提供的那些(例如fmoc、芐氧基-羰基(z)、boc和alloc)保護的形式存在。氨基可以是n-烷基化的，其中r1和/或r2＝c1-c6烷基或c2-c8烯基或c7-c9芳烷基。烷基殘基可以是直鏈、支鏈或環(huán)狀的(例如分別是乙基、異丙基和環(huán)己基)。

增強和/或模擬il-15功能的特定修飾

改善本文公開的治療方式(例如il-15突變蛋白)的一種或多種物理性質和/或施用它們的方式通常是有益的，有時是必要的。物理性質的改善包括例如調節(jié)免疫原性；增加水溶性、生物利用度、血清半衰期和/或治療半衰期；和/或調節(jié)生物活性的方法。某些修飾也可用于例如產(chǎn)生用于檢測測定法(例如，表位標簽)的抗體并提供蛋白質純化的容易性。通常必須賦予此類改善，而不會不利影響(或名義上影響)治療方式的生物活性和/或增加其免疫原性。

il-15的聚乙二醇化是本公開考慮的一個具體修飾，而其它修飾包括但不限于糖基化(n和o連接)；聚唾液酸化；包含血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(hsa)、獼猴血清白蛋白或牛血清白蛋白(bsa))的白蛋白融合分子；通過例如綴合的脂肪酸鏈的白蛋白結合(?；?；和fc-融合蛋白。此外，peg模擬物代表本文考慮的其它藥物。

聚乙二醇化：蛋白質治療劑的臨床有效性通常受到短血漿半衰期和對蛋白酶降解的易感性的限制。各種治療性蛋白質的研究已經(jīng)顯示了，可以通過各種修飾來克服此類困難，所述修飾包括將多肽序列與多種非蛋白性聚合物中的任一種，例如聚乙二醇(peg)、聚丙二醇或聚氧化烯綴合或連接。這通常通過與蛋白質和非蛋白質聚合物(例如peg)共價結合的連接部分來實現(xiàn)。已經(jīng)顯示了此類peg綴合的生物分子擁有臨床上有用的性質，包括更好的物理和熱穩(wěn)定性、針對對酶降解的易感性的保護、增加的溶解性、更長的體內循環(huán)半衰期和降低的清除、降低的免疫原性和抗原性以及降低的毒性。

適合于與多肽序列綴合的peg通常在室溫下可溶于水，并且具有通式r(o-ch2-ch2)no-r，其中r是氫或保護基，如烷基或烷醇基(alkanol)，并且其中n是1至1000的整數(shù)。當r是保護基時，它通常具有1至8個碳。與多肽序列綴合的peg可以是直鏈或支鏈的。本公開考慮支鏈peg衍生物、“星形peg”和多臂peg。本公開中使用的peg的分子量(分子質量)不限于任何特定的范圍。某些實施方案具有5kda至20kda的分子量，而其它實施方案具有4kda至10kda的分子量。在本文其它地方描述了描述具有額外分子量的peg的其它實施方案。

本公開還考慮了綴合物的組合物，其中peg具有不同的n值，因此各種不同的peg以特定比率存在。例如，一些組合物包含綴合物的混合物，其中n＝1、2、3和4。在一些組合物中，n＝1的綴合物的百分比是18-25％，n＝2的綴合物的百分比是50-66％，n＝3的綴合物的百分比是12-16％，n＝4的綴合物的百分比高達5％。可以通過本領域已知的反應條件和純化方法產(chǎn)生此類組合物。在整個說明書中描述了示例性反應條件。可以使用陽離子交換層析分離綴合物，然后鑒定含有綴合物的級份，所述綴合物具有例如期望數(shù)目的連接的peg，經(jīng)純化而不含未修飾的蛋白質序列和具有其它數(shù)目的連接的peg的綴合物。

聚乙二醇化最常發(fā)生在多肽的n-末端的α氨基、賴氨酸殘基的側鏈上的ε氨基和組氨酸殘基的側鏈上的咪唑基。由于大多數(shù)重組多肽擁有單個α和多個ε氨基和咪唑基團，根據(jù)接頭化學，可以產(chǎn)生許多位置異構體?？梢栽诒疚闹袘帽绢I域已知的通用聚乙二醇化策略?？梢越?jīng)由介導一種或多種多肽序列的游離氨基或羧基和聚乙二醇之間的鍵的末端反應性基團(“間隔物”)將peg與本公開的多肽結合。具有可以與游離氨基結合的間隔物的peg包括n-羥基琥珀酰亞胺聚乙二醇，其可以通過用n-羥基琥珀酰亞胺活化聚乙二醇的琥珀酸酯來制備。可以與游離氨基結合的另一種活化的聚乙二醇是2,4-雙(o-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪，其可以通過聚乙二醇單甲醚與氰尿酰氯反應來制備。與游離羧基結合的活化聚乙二醇包括聚氧乙烯二胺。

可以通過各種常規(guī)方法進行本公開的一種或多種多肽序列與具有間隔物的peg的綴合。例如，利用試劑與蛋白質的摩爾比4:1到30:1，可以在5至10的ph，在4℃至室溫的溫度在溶液中進行綴合反應30分鐘至20小時?？梢赃x擇反應條件以指導反應向主要產(chǎn)生期望的取代度。一般來說，低溫、低ph(例如ph＝5)和短反應時間趨于減少連接的peg數(shù)目，而高溫、中性至高ph(例如ph≥7)、較長的反應時間趨于增加連接的peg的數(shù)目?？梢允褂帽绢I域已知的各種手段終止反應。在一些實施方案中，通過酸化反應混合物并在例如-20℃冷凍來終止反應。在例如美國專利號5,252,714；5,643,575；5,919,455；5,932,462和5,985,263中討論了各種分子的聚乙二醇化。

如上文指示，聚乙二醇化最常發(fā)生在n-末端、賴氨酸殘基的側鏈和組氨酸殘基的側鏈上的咪唑基團。通過例如優(yōu)化反應條件和改善純化方法的改進增強了此類聚乙二醇化的有用性。最近的殘留特異性化學已經(jīng)實現(xiàn)精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸以及羧基末端的聚乙二醇化?？梢蕴禺愋跃垡叶蓟@些氨基酸殘基中的一些，而其它氨基酸殘基更混雜，或者僅在某些條件下導致位點特異性聚乙二醇化。

目前允許額外的氨基酸殘基的聚乙二醇化的方法包括橋聯(lián)聚乙二醇化(二硫橋)、酶促聚乙二醇化(谷氨酰胺和c-末端)和糖基化(o-和n-糖基化位點或糖蛋白的聚糖)和異雙功能聚乙二醇化。進一步的方法涉及含有非天然氨基酸的蛋白質的聚乙二醇化、c-末端聚乙二醇化的內含蛋白融合蛋白、轉谷氨酰胺酶介導的聚乙二醇化、分選酶(sortase)a-介導的聚乙二醇化，以及可釋放的且非共價的聚乙二醇化。此外，特異性聚乙二醇化方法與基因工程技術的組合使得聚乙烯聚糖聚合物能夠在蛋白質表面上的任何位置處實質性綴合，這是由于例如用攜帶正交反應性基團的天然或非天然氨基酸取代多肽中的特定氨基酸殘基。一般來說，參見例如pasut,g.和veronese,f.m.,(2012)j.controlledrelease161:461-72；roberts,m.j.等人,(2012)advanceddrugdeliveryrev.64:116-27；jevsevar,s.等人,(2010)biotechnol.j.5:113-28；及yoshioka,y.(2011)chem.centralj.5:25。

聚乙二醇化分子的治療價值得到完全驗證。以前和/或目前的藥物產(chǎn)品包括：omontys(affymax/takeda)；pegloticase(savient)；cimzia(nektar/ucbpharma)；macugen(pfizer)；neulasta(amgen)；somavert(pfizer)；pegasys(roche)；doxil(orthobiotech)和pegintron(schering-plough)。

本公開還考慮使用peg模擬物。已經(jīng)開發(fā)出重組peg模擬物，其保留了peg的屬性(例如，增強的血清半衰期)，同時賦予幾個另外的有利性質。舉例來說，可以形成已經(jīng)與所關注的肽或蛋白質藥物重組融合的能夠形成與peg相似的擴展構象的簡單多肽鏈(包括例如ala、glu、gly、pro、ser和thr)(例如，amunix’xten技術；mountainview,ca)。這消除了在制造過程中對額外的綴合步驟的需要。此外，已建立的分子生物學技術能夠控制多肽鏈的側鏈組成，從而優(yōu)化免疫原性和制造性質。

糖基化：為了本公開的目的，“糖基化”意在廣泛地指將聚糖連接于蛋白質、脂質或其它有機分子的酶促方法。

術語“糖基化”與本公開結合使用通常意圖指添加或缺失一個或多個碳水化合物部分(通過除去下面的糖基化位點或通過用化學和/或酶促手段除去糖基化)，和/或添加天然序列中可能存在或不存在的一個或多個糖基化位點。此外，短語包括天然蛋白的糖基化的定性變化，其涉及存在的各種碳水化合物部分的性質和比例的變化。

糖基化可以顯著影響多肽如il-15的物理性質(例如溶解性)，并且在蛋白質穩(wěn)定性、分泌和亞細胞定位中也是重要的。糖基化多肽還可以表現(xiàn)出增強的穩(wěn)定性或可以改善一種或多種藥代動力學性質，如半衰期。此外，溶解度改善可以例如能夠產(chǎn)生與包含非糖基化多肽的制劑相比更適合于藥物施用的制劑。

適當?shù)奶腔瘜ι锘钚钥梢允侵陵P重要的。實際上，當在缺乏糖基化蛋白質的細胞過程的細菌(例如大腸桿菌)中表達時，來自真核生物體的某些基因產(chǎn)生蛋白質，所述蛋白質由于它們缺乏糖基化而在少許活性或沒有活性的情況下回收。

可以通過改變氨基酸序列實現(xiàn)糖基化位點的添加?？梢岳缤ㄟ^一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基(用于o-連接的糖基化位點)或天冬酰胺殘基(用于n-連接的糖基化位點)的添加或取代進行對多肽的改變。n-連接和o-連接的寡糖和每種類型中發(fā)現(xiàn)的糖殘基的結構可能是不同的。通常在二者中發(fā)現(xiàn)的一類糖是n-乙酰神經(jīng)氨酸(以下稱為唾液酸)。唾液酸通常是n-連接和o-連接的寡糖兩者的末端殘基，并且由于其負電荷可能對糖蛋白賦予酸性特性。本公開的一個具體實施方案包括n-糖基化變體的產(chǎn)生和使用。

任選地，本公開的多肽序列可以通過經(jīng)由核酸水平變化來改變，特別是通過在預選堿基上突變編碼多肽的核酸，使得產(chǎn)生將翻譯成期望的氨基酸的密碼子。增加多肽上碳水化合物部分數(shù)目的另一種手段是通過糖苷與多肽的化學或酶促綴合。碳水化合物的除去可以化學或酶促完成，或者通過取代編碼糖基化的氨基酸殘基的密碼子實現(xiàn)?；瘜W脫糖基化技術是已知的，并且多肽上的碳水化合物部分的酶促切割可以通過使用多種內切和外切糖苷酶實現(xiàn)。

二氫葉酸還原酶(dhfr)缺陷型中國倉鼠卵巢(cho)細胞是用于生產(chǎn)重組糖蛋白的常用的宿主細胞。這些細胞不表達酶β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶，因此不將α-2,6連接中的唾液酸添加到在這些細胞中產(chǎn)生的糖蛋白的n-連接寡糖。

聚唾液酸化：本公開還考慮使用聚唾液酸化、多肽與天然存在的可生物降解的α-(2→8)連接的聚唾液酸(“psa”)的綴合，以便改善多肽的穩(wěn)定性和體內藥代動力學。psa是一種可生物降解、無毒的天然聚合物，其是高親水性的，對其給予在血液中的高表觀分子量，從而延長其血清半衰期。此外，一系列肽和蛋白質治療劑的聚唾液酸化導致了顯著降低的蛋白水解、體內活性的保留和免疫原性和抗原性的降低(參見例如g.gregoriadis等人，int.j.pharmaceutics(2005)300(1-2):125-30)。與用其它綴合物(例如peg)的修飾一樣，用于位點特異性聚唾液酸化的各種技術是可用的(參見例如t.lindhout等人,(2011)pnas108(18)7397-7402)。

白蛋白融合：用于綴合的另外的合適的組分和分子包括白蛋白，如人血清白蛋白(hsa)、獼猴血清白蛋白和牛血清白蛋白(bsa)。

成熟has，一種具有約20天的血清半衰期的585個氨基酸的多肽(約67kda)，主要負責維持膠體滲透血壓、血液ph值，以及許多內源和外源配體的轉運和分布。蛋白質具有三種結構上同源的結構域(i、ii和iii結構域)，幾乎全部處于α-螺旋構象，并且由17個二硫橋高度穩(wěn)定化。白蛋白的三種主要藥物結合區(qū)域位于亞結構域ib、iia和iiia內的三種結構域中的每種上。

白蛋白合成發(fā)生在肝臟中，所述肝臟產(chǎn)生短壽的初級產(chǎn)物前原白蛋白。因此，全長hsa具有18個氨基酸的信號肽(mkwvtfisllflfssays；seqidno:40)，隨后是6個氨基酸的前結構域(rgvfrr；seqidno:41)；該24個氨基酸殘基肽可以稱為前原結構域。hsa可以使用其內源性信號肽作為前原結構域表達和分泌?；蛘撸梢允褂门c成熟構建體融合的igk信號肽來表達和分泌hsa。前原白蛋白在其氨基末端的內質網(wǎng)管腔中快速共翻譯切割，以產(chǎn)生穩(wěn)定的609個氨基酸的前體多肽白蛋白原。然后，白蛋白原傳遞至高爾基體，在那里通過弗林蛋白酶依賴性氨基末端切割將其轉化為585個氨基酸的成熟白蛋白。

白蛋白的主要氨基酸序列、結構和功能在物種間是高度保守的，白蛋白合成和分泌的過程也是如此。例如，食蟹猴、牛、狗、兔和大鼠中發(fā)現(xiàn)與hsa相當?shù)陌椎鞍籽椎鞍住Ｔ诜侨宋锓N中，牛血清白蛋白(bsa)在結構上與hsa最相似(參見例如kosa等人,nov2007jpharmsci.96(11):3117-24)。本公開考慮了使用來自非人物種的白蛋白，包括但不限于上文列出的那些，例如在藥物開發(fā)過程中。

根據(jù)本公開，白蛋白可以在羧基末端、氨基末端、羧基和氨基末端以及內部與藥物分子(例如，本文所述的多肽)綴合(參見例如usp5,876,969和usp7,056,701)。

在本公開考慮的hsa-藥物分子綴合物中，可以使用各種形式的白蛋白，如白蛋白分泌前序列及其變體、其片段和變體，以及hsa變體。這種形式通常擁有一種或多種期望的白蛋白活性。在另外的實施方案中，本公開涉及包含直接或間接與白蛋白、白蛋白片段和白蛋白變體等融合的多肽藥物分子的融合蛋白，其中融合蛋白具有比未融合藥物分子更高的血漿穩(wěn)定性和/或融合蛋白保留未融合藥物分子的治療活性。在一些實施方案中，間接融合通過接頭如肽接頭或其修飾形式實現(xiàn)。

細胞內切割可以通過例如弗林蛋白酶或胱天蛋白酶酶促進行。細胞表達低水平的這些內源性酶，其能夠在細胞內切割融合分子的一部分。因此，在不與hsa綴合的情況下從細胞分泌一些多肽，而其它多肽以包含hsa的融合分子的形式分泌。本公開的實施方案考慮了各種弗林蛋白酶融合構建體的使用。例如，可以設計包含序列rgrr(seqidno:18)、rkrkkr(seqidno:19)、rkkr(seqidno:20)或rrrkkr(seqidno:21)的構建體。

本公開還考慮細胞外切割(離體切割)，由此從細胞分泌融合分子，進行純化，然后切割。應當理解，切除可以與成熟的il-15分離整個hsa-接頭復合物，或者小于整個hsa-接頭復合物。

如上文提到，可以例如通過遺傳操作實現(xiàn)白蛋白與本公開的一種或多種多肽的融合，使得編碼hsa或其片段的核酸連接到編碼一種或多種多肽序列的核酸。此后，可以用融合的核苷酸序列以例如合適的質粒的形式轉化或轉染合適的宿主，以便表達融合多肽?？梢栽隗w外從例如原核或真核細胞或體內從例如轉基因生物體實現(xiàn)表達。在本公開的一些實施方案中，在哺乳動物細胞系，例如cho細胞系中進行融合蛋白的表達。轉化在本文中廣義地使用，是指源自直接攝取通過細胞膜、外源遺傳物質(外源核酸)的摻入和表達的細胞的遺傳改變。在一些細菌中自然發(fā)生轉化，但它也可以通過人工手段在其它細胞中實現(xiàn)。

此外，可以修飾白蛋白本身以延長其循環(huán)半衰期?？梢酝ㄟ^上文描述的遺傳操作技術或通過化學綴合獲得經(jīng)修飾的白蛋白與il-15的融合；所得的融合分子的半衰期超過與非修飾白蛋白的融合的半衰期(參見wo2011/051489)。

備選白蛋白結合策略：已經(jīng)開發(fā)了幾種白蛋白結合策略作為直接融合的備選，包括通過綴合脂肪酸鏈(酰化)的白蛋白結合。由于血清白蛋白是脂肪酸的轉運蛋白，具有白蛋白結合活性的這些天然配體已被用于小蛋白治療劑的半衰期延長。例如，地特胰島素(levemir)(用于糖尿病的批準產(chǎn)品)包含與經(jīng)遺傳修飾的胰島素綴合的肉豆蔻基鏈，產(chǎn)生長效胰島素類似物。

本公開考慮包含白蛋白結合結構域(abd)多肽序列和本文所述的一種或多種多肽的序列的融合蛋白。文獻中描述的任何abd多肽序列可以是融合蛋白的組分。融合蛋白的組分可以任選地通過接頭，如本文所述的接頭共價鍵合。在本公開的一些實施方案中，融合蛋白包含abd多肽序列作為n-末端部分和本文所述的多肽作為c-末端部分。

本公開還考慮包含白蛋白結合多肽的片段的融合蛋白，該片段基本上保留白蛋白結合；或者包含至少兩個白蛋白結合多肽或其片段作為單體單元的白蛋白結合多肽或其片段的多聚體。關于abd和相關技術的一般討論，參見wo2012/050923、wo2012/050930、wo2012/004384和wo2009/016043。

與其它分子的綴合：用于綴合的其它合適的組分和分子包括例如甲狀腺球蛋白；破傷風類毒素；白喉類毒素；聚氨基酸，如聚(d-賴氨酸:d-谷氨酸)；輪狀病毒的vp6多肽；流感病毒血凝素，流感病毒核蛋白；匙孔血藍蛋白(klh)；和乙型肝炎病毒核心蛋白和表面抗原；或上述的任何組合。

因此，本公開考慮多肽序列的n-和/或c-末端的一種或多種另外的組分或分子，如另一種多肽(例如，具有與主題多肽異源的氨基酸序列的多肽)或載體分子的綴合。因此，示例性多肽序列可以作為與另一種成分或分子的綴合物提供。

綴合物修飾可以導致多肽序列，其保留具有源自第二分子的另外或互補的功能或活性的活性。例如，多肽序列可以與分子綴合，例如以促進溶解性、儲存、體內或貨架半衰期或穩(wěn)定性、免疫原性的降低、體內延遲或受控釋放等。其它功能或活性包括相對于未綴合的多肽序列降低毒性的綴合物、比未綴合的多肽序列更有效地靶向細胞或器官類型的綴合物，或者進一步反擊如本文中闡述的疾病、病癥或病況(例如癌癥)相關的原因或效應的藥物。

il-15多肽還可以與大的、緩慢代謝的大分子如蛋白質；多糖，如sepharose、瓊脂糖、纖維素或纖維素珠；聚合氨基酸，如聚谷氨酸或聚賴氨酸；氨基酸共聚物；滅活的病毒顆粒；滅活的細菌毒素，如來自白喉、破傷風、霍亂或白細胞毒素分子的類毒素；滅活的細菌；和樹突細胞綴合。若想要的話，此類綴合形式可用于產(chǎn)生針對本公開的多肽的抗體。

用于綴合的其它候選組分和分子包括適合于分離或純化的那些。具體的非限制性實例包括結合分子，如生物素(生物素-抗生物素蛋白特異性結合對)、抗體、受體、配體、凝集素或包含固體支持物的分子，包括例如塑料或聚苯乙烯珠、板、磁珠、測試條和膜。

可以使用如陽離子交換層析的純化方法通過電荷差分離綴合物，所述電荷差有效地將綴合物分離成它們的各種分子量。例如，可以加載陽離子交換柱，然后用約20mm乙酸鈉(ph約4)清洗，然后用約3至5.5的ph(例如ph約4.5)緩沖的線性(0m至0.5m)nacl梯度洗脫。通過陽離子交換層析獲得的級分的含量可以使用常規(guī)方法，例如質譜法、sds-page或用于通過分子量分離分子實體的其它已知方法通過分子量鑒定。

fc融合分子：在某些實施方案中，本公開的多肽序列的氨基末端或羧基末端可與免疫球蛋白fc區(qū)(例如人fc)融合以形成融合綴合物(或融合分子)。已經(jīng)顯示fc融合綴合物增加生物藥物的系統(tǒng)半衰期，因此生物制藥產(chǎn)品可能需要不太頻繁的施用。

fc結合作為血管襯里的內皮細胞中的新生兒fc受體(fcrn)，并且在結合時，fc融合分子受到保護而免于降解并再釋放到循環(huán)中，使循環(huán)中的分子保持更長。認為這種fc結合是內源性igg保留其長血漿半衰期的機制。最近的fc融合技術將生物藥物的單拷貝與抗體的fc區(qū)連接，以優(yōu)化與傳統(tǒng)fc-融合綴合物相比生物藥物的藥代動力學和藥效學性質。

其它修飾：本公開考慮使用il-15目前已知或未來開發(fā)的其它修飾以改善一種或多種性質。一種此類方法涉及通過hes化修飾多肽序列，所述hes化利用與其它分子連接的羥乙基淀粉衍生物以便改變多肽序列的特征。hes化的各個方面描述于例如美國專利申請?zhí)?007/0134197和2006/0258607。

本公開還考慮包含小泛素樣修飾劑(sumo)作為融合標簽(lifesensors,inc.；malvern,pa)的融合分子。本文所述的多肽與sumo的融合可以傳達幾種有益效果，包括表達的增強、溶解性的改善和/或輔助開發(fā)純化方法。sumo蛋白酶識別sumo的三級結構并在sumo的c-末端切割融合蛋白，從而釋放本文所述的具有期望的n-末端氨基酸的多肽。

本公開還考慮使用pasylation^tm(xl-proteingmbh(freising,germany))。該技術擴展了所關注的蛋白質的表觀分子大小，而不會對蛋白質的治療生物活性具有負面影響，超出了腎小球的孔徑，從而降低了蛋白質的腎清除。

接頭：上文已經(jīng)描述了接頭及其用途。用于修飾本公開的多肽序列的任何前述組分和分子可以任選地通過接頭綴合。合適的接頭包括通常具有足夠長度以允許修飾的多肽序列與連接的組分和分子之間的一些移動的“柔性接頭”。接頭分子通常為約6-50個原子長。接頭分子也可以是例如芳基乙炔、含有2-10個單體單元的乙二醇低聚物，二胺、二酸、氨基酸或其組合。合適的接頭可以容易地選擇并且可以是任何合適的長度，如1個氨基酸(例如gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50或多于50個氨基酸。

示例性的柔性接頭包括甘氨酸聚合物(g)n、甘氨酸-絲氨酸聚合物(例如，(gs)n、gsggsn(seqidno:22)、gggsn(seqidno:23)、(gmso)n、(gmsogm)n、(gmsogmsogm)n(seqidno:24)、(gsggsm)n(seqidno:25)、(gsgsmg)n(seqidno:26)和(gggsm)n(seqidno:27)和其組合，其中m、n和o各自獨立地選自至少1的整數(shù))、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-絲氨酸聚合物和其它柔性接頭。甘氨酸和甘氨酸-絲氨酸聚合物是相對非結構化的，因此可以充當組分之間的中性系鏈。示例性的柔性接頭包括但不限于ggsg(seqidno:28)、ggsgg(seqidno:29)、gsgsg(seqidno:30)、gsggg(seqidno:31)、gggsg(seqidno:32)和gsssg(seqidno:33)。

在本公開的某些實施方案中，通過共價連接至一個或多個peg分子的活化接頭將peg與il-15綴合。如果接頭是化學反應性的并且準備共價連接到肽上的反應性基團，則接頭是“活化的”。本公開考慮使用任何活化的接頭，條件是它可以在合適的反應條件下容納一個或多個peg分子并與氨基酸殘基形成共價鍵。在具體的方面中，活化的接頭相對于其它連接位點(例如賴氨酸的ε氨基或組氨酸的亞氨基)以高選擇性方式連接到α氨基。

在一些實施方案中，活化的peg可由下式表示：(peg)b-l’，其中peg共價連接到接頭的碳原子以形成醚鍵，b是1至9(即，1至9個peg分子可以連接到接頭)，并且l’含有可以與例如氨基酸殘基上的氨基或亞氨基反應以提供peg與il-15的共價連接的反應性基團(活化部分)。在其它實施方案中，活化的接頭(l’)含有式rcho的醛，其中r是直鏈或支鏈c1-11烷基；在將活化的接頭共價連接到il-15后，接頭含有2至12個碳原子。本公開考慮實施方案，其中丙醛是示例性的活化接頭。peg-丙醛(ch2ch2cho)描述于美國專利5,252,714中，并且是可商購的(例如shearwaterpolymers(huntsville,al))。其它活化的peg-接頭可以可商購自例如shearwaterpolymers和enzon,inc.(piscataway,n.j.)。

在一些實施方案中，期望將多于一個peg分子共價連接到il-15，并且可以使用合適的活化的分支(即“多臂”)接頭?？梢允褂脤蓚€或更多個peg分子共價連接到il-15的氨基酸殘基上的氨基(例如，在n-末端的α氨基)的任何合適的支鏈peg接頭。在具體實施方案中，本公開考慮的分支接頭含有兩個或三個peg分子。舉例來說，分支peg接頭可以是水解穩(wěn)定的直鏈或支鏈脂肪族基團，并含有與氨基酸殘基的氨基反應的活化部分(如醛基)，如上所述；分支接頭的脂肪族基團可以含有2至12個碳。在一些實施方案中，脂肪族基團可以是叔丁基，其可以含有例如三個碳原子的每個上的三個peg分子(即總共9個peg分子)和叔丁基的第四個碳上的反應性醛部分。

在美國專利號5,643,575、5,919,455、7,052,868和5,932,462中描述了其它示例性的分支peg接頭。熟練技術人員可以通過例如添加反應性醛部分來制備對分支peg接頭的修飾。用于制備使用的接頭的方法在本領域中也是公知的，并且在例如上面列出的美國專利中進行了描述。

治療和預防用途

本公開考慮本文所述的il-15多肽(例如peg-il-15)在治療或預防大量疾病、病癥和/或病況和/或其癥狀中的用途。雖然在下文中詳細描述了具體的用途，但是應當理解，本公開不限于此。此外，雖然以下闡述了具體疾病、病癥和病況的一般類別，但是一些疾病、病癥和病況可以是多于一類的成員，而其它可能不是任何公開類別的成員。

如下面更詳細地討論，已經(jīng)顯示il-15在與免疫和炎癥功能相關的疾病、病癥和病況中發(fā)揮作用(例如，自身免疫相關性病癥(例如類風濕性關節(jié)炎)、結節(jié)病、炎性腸病和移植排斥)；癌癥(例如白血病、淋巴組織增殖性病癥和實體瘤)；和傳染病(例如hiv)。[參見例如fehniger等人，blood97(1)(2001年1月1日)]。

免疫和炎性病況。在一些實施方案中，本公開考慮免疫系統(tǒng)的抑制和免疫相關疾病、病癥和病況的治療。如本文中所用，如“免疫疾病”、“免疫病況”、“免疫病癥”、“炎性疾病”、“炎性病況”、“炎性病癥”等術語意圖廣泛地涵蓋任何免疫或炎癥相關病況(例如病理性炎癥和自身免疫性疾病)。此類病況常常與其它疾病、病癥和病況密不可分。舉例來說，“免疫病況”可以指增殖性病況，如癌癥、腫瘤和血管生成；包括抵抗免疫系統(tǒng)消除的感染(急性和慢性)、腫瘤和癌癥。

本文所述的il-15肽可以用于通過施用有效抑制一種或多種細胞事件的量抑制免疫功能，所述細胞事件由于野生型il-15與il-15受體復合物之間的相互作用而天然發(fā)生。或者，可以施用編碼本文所述的il-15肽的核酸分子或表達本文所述的il-15肽的重組細胞。在具體實施方案中，il-15肽以與野生型il-15類似的親和力結合il-15受體復合物，但不能激活細胞信號轉導。有利的是，il-15肽與野生型il-15有效競爭并抑制通常響應il-15信號傳導而關聯(lián)的事件。

可以例如由炎性細胞因子引起的免疫和炎性相關疾病、病癥和病況的非限制性列表包括關節(jié)炎(例如類風濕性關節(jié)炎)、結節(jié)病、腎衰竭、狼瘡、哮喘、銀屑病、結腸炎、胰腺炎、變態(tài)反應、手術并發(fā)癥(例如其中炎性細胞因子阻止愈合)、貧血和纖維肌痛?？赡芘c慢性炎癥有關的其它疾病和病癥包括阿爾茨海默氏病、充血性心力衰竭、中風、主動脈瓣狹窄、動脈硬化、骨質疏松癥、帕金森病、感染、炎性腸病(例如克羅恩病和潰瘍性結腸炎)、過敏性接觸性皮炎和其它濕疹、系統(tǒng)性硬化、移植和多發(fā)性硬化。在下文中更詳細地描述了il-15分子可能特別有效的一些上述疾病、病癥和病況(由于例如目前療法的限制)。

本公開的il-15多肽可以特別有效地治療和預防炎性腸病(ibd)。ibd包括克羅恩病(cd)和潰瘍性結腸炎(uc)，這兩者都是可以影響胃腸道的任何部分的特發(fā)性慢性疾病，并且與許多不利影響相關，并且長期uc患者有增加的發(fā)展結腸癌的風險。目前的ibd治療旨在控制炎性癥狀，而某些藥劑(例如，皮質類固醇、氨基水楊酸和標準免疫抑制劑(如環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤和甲氨蝶呤))已經(jīng)以有限的成功滿足，長期治療可能會引起肝損傷(例如纖維化或肝硬化)和骨髓抑制，并且患者通常對此類治療變得難治。

銀屑病，一系列免疫介導性慢性皮膚病，在美國影響超過450萬人，其中認為150萬人患有中度至重度形式的疾病。此外，超過10％的銀屑病患者會發(fā)展銀屑病關節(jié)炎，從而破壞關節(jié)周圍的骨骼和結締組織。對銀屑病的潛在生理學的理解改善已經(jīng)導致引入例如靶向導致該疾病炎癥性質的t淋巴細胞和細胞因子的活性的藥劑。這些藥劑包括tnf-α抑制劑(也用于治療類風濕性關節(jié)炎(ra))，包括enbrel(依那西普(etanercept))、remicade(英利昔單抗)和humira(阿達木單抗)(adalimumab))和t細胞抑制劑如amevive(阿來法塞(alefacept))和raptiva(依法珠單抗)。雖然這些藥物中的幾種在某些患者群體中在一定程度上有效，但無一可以顯示有效地治療所有患者。

類風濕性關節(jié)炎(ra)影響約1％的美國人口(約210萬人)，所述類風濕性關節(jié)炎通常以關節(jié)的膜襯里(滑膜)的慢性炎癥為特征。細胞因子(包括tnf-α和il-1)在炎癥過程中的作用的進一步了解使得能夠開發(fā)和引入一類新的緩解疾病的抗風濕藥物(dmard)。藥劑(其中一些與其它適應癥的治療方式重疊)包括enbrel(依那西普)、remicade(英利昔單抗)、humira(阿達木單抗)和kineret(阿那白滯素)。雖然這些藥劑中的一些緩解癥狀，抑制結構性損傷的進展，并改善特定患者群體中的身體功能，但仍然需要具有改善的功效、互補作用機制和較少/較不嚴重的不良反應的備選藥物。

在某些情況下，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了器官和組織的移植排斥涉及il-15相關的成分。排斥是由細胞免疫和體液免疫二者介導的適應性免疫應答，以及先天免疫應答的組分。不同類型的移植器官和組織通常具有不同的排斥機制平衡。腎臟、心臟、骨髓、皮膚和血液是最常參與移植排斥的器官和組織。移植排斥的治療通常由排斥的醫(yī)學類別(例如超急性，急性或慢性)決定。免疫抑制療法構成治療移植排斥的主要手段。治療通常起始于皮質類固醇(例如潑尼松)。聯(lián)合療法通常需要添加鈣調神素抑制劑(例如環(huán)孢菌素和他克莫司)和抗增殖劑(例如硫唑嘌呤)。可以將特定免疫組分特異性的抗體加入免疫抑制療法；抗體治療劑包括單克隆抗il-2rα受體抗體(例如，達克珠單抗(daclizumad))和單克隆抗cd20抗體(例如利妥昔單抗)。盡管在許多情況下有幫助，但需要備選治療方式，如il-15相關藥劑。

患有多發(fā)性硬化癥(ms)(一種嚴重虛弱的自身免疫性疾病，包括腦和脊髓中髓磷脂的炎癥和瘢痕形成的多個區(qū)域)的受試者可以特別由本文所述的il-15多肽幫助，因為目前的治療僅緩解癥狀或延遲殘疾的進展。

已經(jīng)在丙型肝炎誘導的肝疾病期間以及在肝硬化和慢性肝炎中觀察到il-15血清水平升高?；加懈渭毎┑氖茉囌咧械膇l-15水平特別升高。

類似地，il-15多肽可以特別有利于患有神經(jīng)變性性病癥的受試者，如阿爾茨海默氏病(ad)(一種嚴重損害患者思想、記憶和語言過程的腦部病癥)；帕金森病(pd)(一種以例如異常運動、僵硬和震顫為特征的進行性cns病癥)；以及糖尿病。這些疾病是進行性和虛弱的，并且沒有治愈性藥物可用。

癌癥和相關病況。根據(jù)本公開，本文所述的il-15分子(例如肽)可用于治療具有不希望的表達il-15受體的細胞增殖的受試者?；蛘?，可以施用編碼本文所述的il-15肽的核酸分子或表達本文所述的il-15肽的重組細胞。雖然不需要il-15施加抗增殖作用的根本作用機制的理解來實施本公開，但細胞增殖可被補體定向的細胞溶解或抗體依賴性細胞毒性抑制。

本文所述的il-15肽可用于治療或預防增殖性病況或病癥，包括癌癥，例如子宮癌、宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、睪丸癌、胃腸癌(例如食管癌、口咽癌、胃癌、小腸癌或大腸癌、結腸癌或直腸癌)、腎癌、腎細胞癌、膀胱癌、骨癌、骨髓癌、皮膚癌、頭或頸癌、肝癌、膽囊癌、心臟癌、肺癌、胰腺癌、唾液腺癌、腎上腺癌、甲狀腺癌、腦癌(例如膠質瘤)、神經(jīng)節(jié)癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)癌和周圍神經(jīng)系統(tǒng)(pns)癌以及造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)(例如脾或胸腺)的癌癥。本公開還提供了治療或預防其它癌癥相關疾病、病癥或病況的方法，包括例如免疫原性腫瘤、非免疫原性腫瘤、休眠性腫瘤、病毒誘導的癌癥(例如，上皮細胞癌、內皮細胞癌、鱗狀細胞癌和乳頭瘤病毒)、腺癌、淋巴瘤(例如皮膚t細胞淋巴瘤(ctcl)、癌、黑素瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、畸胎癌、化學誘導的癌癥、轉移和血管生成。

在具體實施方案中，腫瘤或癌癥是結腸癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、肺癌、成膠質細胞瘤或白血病(例如htlv-1介導的成年t細胞白血病)。術語癌癥相關疾病、病癥和病況的使用意在廣義地指直接或間接與癌癥相關的病況，并且包括例如血管發(fā)生和癌前病況如發(fā)育異常。

在一些實施方案中，本公開提供了用il-15分子和至少一種另外的治療劑或診斷劑治療增殖性病況、癌癥、腫瘤或癌前病況的方法，其實例在本文其它地方闡述。

病毒和細菌性病況。il-15在病毒和細菌性疾病、病癥和病況中的作用越來越受到關注。假定il-15依賴于其受體結合活性和其它因素而產(chǎn)生刺激和抑制作用。

關于人免疫缺陷病毒(hiv)，il-15通過其模擬il-2作用的能力而具有兩個相互沖突的效應。一種效應是免疫功能的潛在有益的增強，而另一個效應是hiv復制的潛在有害的激活。這些相反的作用也存在于其它病毒相關病癥中。在il-15水平和病毒載量波動之間觀察到緊密的時間相關性。本公開考慮il-15多肽在治療和/或預防用il-15治療可以有益的任何病毒性疾病、病癥或病況中的用途?？紤]的病毒性疾病、病癥和病況的實例包括埃巴病毒、乙型肝炎、丙型肝炎、hiv、單純皰疹病毒和巨細胞病毒(cmv)。

il-15最近與某些細菌和其它侵入性感染有關。舉例來說，報告指出，在由例如沙門氏菌和惡性瘧原蟲引起的感染前施用重組il-15改善了針對生物素的宿主防御和生物體的清除。

藥物組合物

本公開的il-15多肽可以是適合于對受試者施用的組合物的形式。通常，此類組合物是包含il-15和一種或多種藥學上可接受或生理上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑的“藥物組合物”。在某些實施方案中，il-15多肽以治療上可接受的量存在。藥物組合物可用于本公開的方法中；因此，例如，藥物組合物可以離體或體內施用于受試者，以便實施本文所述的治療和預防方法和用途。

本公開的藥物組合物可以配制為與意圖的施用方法或途徑相容；本文闡述了示例性施用途徑。此外，藥物組合物可以與本文所述的其它治療活性劑或化合物組合使用，以治療或預防如本公開考慮的疾病、病癥和病況。

藥物組合物通常包含治療有效量的由本公開考慮的il-15多肽和一種或多種藥學上和生理上可接受的配制劑。合適的藥學上可接受或生理上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑包括但不限于抗氧化劑(例如抗壞血酸和硫酸氫鈉)、防腐劑(例如芐醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯或正丙酯)、乳化劑、懸浮劑、分散劑、溶劑、填充劑、增量劑、洗滌劑、緩沖劑、媒介物、稀釋劑和/或佐劑。例如，合適的媒介物可以是生理鹽水溶液或檸檬酸鹽緩沖鹽水，可能補充有用于胃腸外施用的藥物組合物中常見的其它材料。中性緩沖鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是進一步的示例性媒介物。本領域技術人員將容易地認識到可用于藥物組合物和本文考慮的劑型的各種緩沖液。典型的緩沖劑包括但不限于藥學上可接受的弱酸、弱堿或其混合物。例如，緩沖成分可以是水溶性物質，如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸、乙酸、抗壞血酸、天冬氨酸、谷氨酸及其鹽?？山邮艿木彌_劑包括例如tris緩沖劑、n-(2-羥乙基)哌嗪-n’-(2-乙磺酸)(hepes)、2-(n-嗎啉代)乙磺酸(mes)、2-(n-嗎啉代)乙磺酸鈉鹽(mes)、3-(n-嗎啉代)丙磺酸(mops)和n-三[羥甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(taps)。

在已經(jīng)配制藥物組合物后，可以將它作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或脫水或凍干粉末儲存在無菌小瓶中。此類制劑可以以即用形式、需要在使用前重建的凍干形式、在使用前需要稀釋的液體形式或其它可接受的形式存儲。在一些實施方案中，在一次性容器(例如，一次性小瓶、安瓿、注射器或自動注射器(類似于例如))中提供藥物組合物，而在其它實施方案中提供多次使用容器(例如，多次使用小瓶)。任何藥物遞送裝置可用于遞送il-15，包括植入物(例如可植入泵)和導管系統(tǒng)、緩慢注射泵和裝置，所有這些都是熟練技術人員公知的。也可以利用通常皮下或肌肉內施用的積存注射在限定的時間段內釋放本文公開的多肽。積存注射通常是基于固體的或基于油的，并且通常包含本文闡述的至少一種制劑組分。本領域普通技術人員熟悉積存注射的可能配方和用途。

藥物組合物可以是無菌注射水性或油性懸浮液的形式。該懸浮液可根據(jù)已知技術使用本文提及的合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑配制。無菌可注射制劑也可以是無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如作為1,3-丁二醇中的溶液?？梢允褂玫目山邮艿南♂寗?、溶劑和分散介質包括水、林格氏溶液、等滲氯化鈉溶液、cremophorel^tm(basf，parsippany，nj)或磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)及其合適的混合物。另外，無菌不揮發(fā)油常規(guī)用作溶劑或懸浮介質。為此目的，可以使用任何溫和的不揮發(fā)油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸可用于制備注射劑。可以通過包括延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)來實現(xiàn)特定可注射制劑的延長吸收。

含有活性成分的藥物組合物可以是適于口服使用的形式，如片劑、膠囊、糖錠劑、錠劑、水性或油性懸浮液、可分散的粉末或顆粒、乳劑、硬膠囊或軟膠囊或糖漿、溶液、微珠或酏劑。意圖用于口服使用的藥物組合物可以根據(jù)本領域已知的用于制造藥物組合物的任何方法制備，并且這種組合物可以含有一種或多種藥劑，如例如甜味劑、調味劑、著色劑藥劑和防腐劑，以提供藥學上優(yōu)雅且可口的制劑。片劑、膠囊等含有與適合于制造片劑的無毒性藥學上可接受的賦形劑混合的活性成分。這些賦形劑可以是例如稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；造粒劑和崩解劑，例如玉米淀粉或藻酸；粘合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；和潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。

適合于口服施用的片劑、膠囊等可以是未涂覆的或通過已知技術包被以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，從而提供持續(xù)的作用。例如，可以使用延時材料，如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它們也可以通過本領域已知的技術進行包被以形成用于受控釋放的滲透性治療性片劑。其它藥劑包括可生物降解的或生物相容性的顆?；蚓酆衔镔|，如聚酯、聚胺酸、水凝膠、聚乙烯吡咯烷酮、聚酐、聚乙醇酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素、硫酸魚精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚丙交酯/乙交酯共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物以控制施用的組合物的遞送。例如，口服藥劑可以通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠囊中，分別通過使用羥甲基纖維素或明膠微膠囊或聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，或在膠體藥物遞送系統(tǒng)中俘獲。膠體分散系統(tǒng)包括大分子復合物、納米膠囊、微球、微珠和基于脂質的系統(tǒng)，包括水包油乳液、膠束、混合膠束和脂質體。用于制備上文提及的制劑的方法對于本領域技術人員是顯而易見的。

口服使用的制劑也可以以硬明膠膠囊形式呈現(xiàn)，其中活性成分與惰性固體稀釋劑，例如碳酸鈣、磷酸鈣、高嶺土或微晶纖維素混合，或作為軟明膠膠囊呈現(xiàn)，其中活性成分與水或油介質，例如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。

水性懸浮液含有活性物質與適合于其制造的賦形劑的混合物。此類賦形劑可以是懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠和阿拉伯樹膠；分散劑或潤濕劑，例如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)或環(huán)氧烷與脂肪酸的縮合產(chǎn)物(例如，硬脂酸聚氧乙烯酯)或環(huán)氧乙烷與長鏈脂肪族醇(例如十七碳亞乙基氧基鯨蠟醇)的縮合產(chǎn)物或環(huán)氧乙烷與源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物(例如，聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯)或環(huán)氧乙烷與源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物(例如，聚乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)。水性懸浮液還可含有一種或多種防腐劑。

油性懸浮液可以通過將活性成分懸浮在植物油，例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油中，或礦物油如液體石蠟中來配制。油性懸浮液可以含有增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇?？梢约尤胩鹞秳?如上文闡述)和調味劑以提供可口的口服制劑。

適合于通過加入水制備水性懸浮液的分散粉末和顆粒提供與分散劑或潤濕劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑混合的活性成分。在本文中示例合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑。

本公開的藥物組合物也可以是水包油乳劑的形式。油相可以是植物油，例如橄欖油或花生油，或礦物油，例如液體石蠟，或這些的混合物。合適的乳化劑可以是天然存在的樹膠，例如阿拉伯樹膠或黃蓍膠；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂、源自脂肪酸的酯或偏酯；己糖醇酐，例如脫水山梨糖醇單油酸酯；和偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯。

制劑還可以包括保護組合物免受身體快速降解或消除的載體，如受控釋放制劑，包括植入物、脂質體、水凝膠、前藥和微囊化遞送系統(tǒng)。例如，可以采用單獨或與蠟組合的延時材料，如單硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。

本公開考慮以直腸施用的栓劑形式施用il-15多肽。栓劑可以通過將藥物與合適的非刺激性賦形劑混合來制備，所述賦形劑在常溫下為固體但在直腸溫度下為液體，因此將在直腸中融化以釋放藥物。此類材料包括但不限于可可脂和聚乙二醇。

本公開考慮的il-15多肽可以是現(xiàn)在已知或將來開發(fā)的任何其它合適的藥物組合物(例如，用于鼻腔或吸入用途的噴霧劑)的形式。

制劑中多肽或其片段的濃度可以廣泛變化(例如，按重量計小于約0.1％，通常為或至少約2％至多至20％至50％或更高)，并且通常將根據(jù)例如所選擇的特定施用模式，主要基于流體體積、粘度和基于受試者的因素選擇。

施用途徑

本公開考慮以任何適當?shù)姆绞绞┯胕l-15分子及其組合物。合適的施用途徑包括胃腸外(例如肌肉內、靜脈內、皮下(例如注射或植入物)、腹膜內、腦池內、關節(jié)內、腹膜內、腦內(實質內)和腦室內)、口服、鼻、陰道、舌下、眼內、直腸、局部(例如透皮)、舌下和吸入。通常皮下或肌肉內施用的積存注射也可用于在限定的時間段內釋放本文公開的il-15分子。

本公開的具體實施方案考慮胃腸外施用，并且在進一步的具體實施方案中，胃腸外施用是皮下。

聯(lián)合療法

本公開考慮使用il-15分子與一種或多種活性治療劑(例如細胞因子)或其它預防或治療方式(例如輻射)組合。在此類聯(lián)合療法中，各種活性劑經(jīng)常具有不同的互補作用機制。通過允許一種或多種藥劑的劑量減少，從而減少或消除與一種或多種藥劑相關的副作用，此類聯(lián)合療法可能是特別有利的。此外，此類聯(lián)合療法可對潛在的疾病、病癥或病況具有協(xié)同的治療或預防作用。

如本文中所用，“組合/聯(lián)合”意在包括可以分開施用，例如分開配制用于分開施用(例如，如可以在試劑盒中提供)的治療劑，以及可以在單一制劑中一起施用(即“共施用”)的療法。

在某些實施方案中，il-15多肽和一種或多種活性治療劑或其它預防或治療方式依次施用或施加，例如其中一種藥劑在一種或多種其它藥劑之前施用。在其它實施方案中，il-15多肽和一種或多種活性治療劑或其它預防或治療方式同時施用，例如兩種或更多種藥物同時或大約同時施用；兩種或更多種藥物可以在兩種或更多種分開的制劑中存在或組合成單一制劑(即共制劑)。不管兩種或更多種藥劑是依次還是同時施用，為了本公開的目的，認為它們是聯(lián)合施用的。

本公開的il-15多肽可以在任何情況下以任何合適的方式與至少一種其它(活性)劑聯(lián)合使用。在一個實施方案中，在一段時間內維持本公開的至少一種活性劑和至少一種il-15多肽的治療。在另一個實施方案中，減少或中斷用至少一種活性劑的治療(例如當受試者穩(wěn)定時)，而將用本公開的il-15多肽的治療維持于恒定的給藥方案。在另一個實施方案中，減少或中斷用至少一種活性劑的治療(例如當受試者穩(wěn)定時)，而減少用本公開的il-15多肽的治療(例如，更低劑量、更不頻繁的施用或更短的治療方案)。在另一個實施方案中，減少或中斷用至少一種活性劑的治療(例如當受試者穩(wěn)定時)，并且增加用本公開的il-15多肽的治療(例如，更高劑量、更頻繁的施用或更長的治療方案)。在另一個實施方案中，維持用至少一種活性劑的治療，并且減少或中斷用本公開的il-15多肽的治療(例如，更低劑量、更不頻繁的施用或更短的治療方案)。在另一個實施方案中，減少或中斷用至少一種活性劑的治療和用本公開的il-15多肽的治療(例如，更低劑量、更不頻繁的施用或更短的治療方案)。

免疫和炎性病況。本公開提供了用il-15分子和至少一種另外的治療劑或診斷劑治療和/或預防免疫和/或炎性相關疾病、病癥和病況以及與其相關的病癥的方法。

可用于聯(lián)合療法的治療劑的實例包括但不限于以下：非類固醇抗炎藥(nsaid)，如阿司匹林、布洛芬和其它丙酸衍生物(阿利洛芬，苯惡洛芬、布氯酸、卡洛芬、芬布芬、非諾洛芬、氟洛芬、氟比洛芬、吲哚洛芬、酮洛芬、咪洛芬、萘普生、奧沙普秦、吡洛芬、普拉洛芬、舒洛芬、噻洛芬酸和硫惡洛芬)、乙酸衍生物(吲哚美辛，阿西美辛，阿氯芬酸，環(huán)氯茚酸，雙氯芬酸，芬氯酸，芬克洛酸，芬替酸、呋羅芬酸(fuirofenac)、異丁芬酸、伊索克酸、奧西平酸(oxpinac)、舒林酸、硫平酸、托美丁、齊多美辛和佐美酸)、滅酸衍生物(氟芬那酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、尼氟酸和托芬那酸)、聯(lián)苯羧酸衍生物(二氟尼柳和氟苯柳)、昔康類(伊索昔康、吡羅昔康、舒多昔康和替諾昔康)、水楊酸鹽(乙酰水楊酸、柳氮磺吡啶)和吡唑啉酮(阿扎丙宗、芐哌立隆(bezpiperylon)、非普拉宗、莫非布宗、羥布宗、保泰松)。其它組合包括環(huán)氧合酶-2(cox-2)抑制劑。

用于組合的其它活性劑包括類固醇，如潑尼松龍、潑尼松、甲潑尼龍、倍他米松、地塞米松或氫化可的松。此類組合可能是特別有利的，因為可以通過逐漸減少需要的類固醇劑量減少或甚至消除類固醇的一種或多種副作用。

可以聯(lián)合用于治療例如類風濕性關節(jié)炎的活性劑的其它實例包括細胞因子抑制性抗炎藥(csaid)；其它人細胞因子或生長因子(例如，tnf、lt、il-1β、il-2、il-6、il-7、il-8、il-10、il-16、il-18、emap-ii、gm-csf、fgf或pdgf)的抗體或拮抗劑。

活性劑的具體組合可能會干擾自身免疫和隨后的炎性級聯(lián)中的不同點，并且包括tnf拮抗劑，如嵌合、人源化或人tnf抗體、remicade、抗tnf抗體片段(例如cdp870)和可溶性p55或p75tnf受體、其衍生物、p75tnfrigg(enbrel.)或p55tnfr1gg(lenercept)、可溶性il-13受體(sil-13)，以及還有tnfα轉化酶(tace)抑制劑；類似地，il-1抑制劑(例如白細胞介素-1-轉化酶抑制劑)可能是有效的。其它組合包括白細胞介素11、抗p7s和p-選擇蛋白糖蛋白配體(psgl)?？膳c本文所述的il-15多肽組合使用的藥劑的其它實例包括干擾素-β1a(avonex)；干擾素-β1b(betaseron)；克帕松；高壓氧；靜脈內免疫球蛋白；克拉屈濱(clabribine)；以及其它人細胞因子或生長因子的抗體或拮抗劑(例如，cd40配體和cd80的抗體)。

本公開包括上述任一項的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。

癌癥和相關病況。本公開提供了用于用il-15分子和至少一種另外的治療劑或診斷劑治療和/或預防增殖性病況；癌癥、腫瘤或癌前疾病、病癥或病況的方法。

化學治療劑的實例包括但不限于烷化劑，如塞替派和環(huán)磷酰胺；烷基磺酸鹽，如白消安，英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶如苯并多巴、卡波醌(carboquone)、麥曲多巴(meturedopa)和尤利多巴(uredopa)；乙撐亞胺和甲基密胺，包括六甲蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亞乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亞乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羥甲基密胺(trimethylolomelamime)；氮芥(nitrogenmustards)，如苯丁酸氮芥(chiorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氧化氮芥鹽酸鹽(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法侖、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；硝基脲(nitrosureas)，如卡莫司汀、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，如阿克萊諾霉素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、奧瑟霉素(authramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博萊霉素(bleomycins)、放線菌素c(cactinomycin)、加利車霉素(calicheamicin)、卡洛比星(carabicin)、洋紅霞素(caminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放線菌素d(dactinomycin)、道諾霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、博替羅霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑霉素(streptonigrin)、鏈佐星、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；葉酸類似物，如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙；嘌呤類似物，如氟達拉賓(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，如安西他濱、阿扎胞苷、6-硫唑嘧啶、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氮尿苷、5-fu；雄激素，如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、環(huán)硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酪(testolactone)；抗雄激素，如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，如葉酸；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid)；安吖啶(amsacrine)；貝曲布辛(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；伊達曲仙(edatraxate)；德弗法明(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；伊弗尼辛(elformithine)；依利醋銨(elliptiniumacetate)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香蔬多糖(lentinan)；氯尼達明；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌達醇(mopidamol)；硝氨丙吖啶(nitracrine)；噴司他??；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；雷佐生(razoxane)；西左非蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonicacid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露糖醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；瓜西托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(ara-c)；環(huán)磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇(paclitaxel)和多西他賽(doxetaxel)；苯丁酸氮芥；吉西他賓(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨喋呤；鉑和鉑配位絡合物，如順鉑和卡鉑；長春堿；依托泊苷(vp-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；絲裂霉素c；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿(vincristine)；長春瑞濱；諾維本(navelbine)；諾肖林(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道諾霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；cpt-11；拓撲異構酶抑制劑；二氟甲基鳥氨酸(dmfo)；視黃酸；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他濱；以及上述任何一種的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。化學治療劑還包括作用為調節(jié)或抑制對腫瘤的激素作用的抗激素劑，如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、可莫昔芬、奧那司酮和托瑞米芬；和抗雄激素如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任何一種的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。在某些實施方案中，聯(lián)合療法包括施用激素或相關激素劑。

可以與il-15多肽聯(lián)合使用的其它治療方式包括細胞因子或細胞因子拮抗劑，如il-12、infα或抗表皮生長因子受體、放療、針對另一腫瘤抗原的單克隆抗體、單克隆抗體和毒素的復合物、t細胞佐劑、骨髓移植物或抗原呈遞細胞(例如樹突細胞療法)。本文中還提供了疫苗(例如，作為可溶性蛋白質或編碼蛋白質的核酸)。

本公開包括上述任一項的藥學上可接受的鹽，酸或衍生物。

病毒和細菌性病況。本公開提供用于用il-15分子和至少一種另外的治療劑或診斷劑(例如一種或多種其它抗病毒劑和/或一種或多種與病毒療法無關的藥劑)治療和/或預防病毒性疾病、病癥和病況以及與其相關的病癥的方法。

此類聯(lián)合療法包括靶向各種病毒生命周期階段并具有不同作用機制的抗病毒劑，包括但不限于以下：病毒脫殼抑制劑(例如金剛烷胺和金剛乙胺(rimantidine))；逆轉錄酶抑制劑(例如，阿昔洛韋，齊多夫定和拉米夫定)；靶向整合酶的藥劑；阻斷轉錄因子連接到病毒dna的藥劑；影響翻譯的藥劑(例如反義分子)(例如福米韋生)；調節(jié)翻譯/核酶功能的藥劑；蛋白酶抑制劑；病毒裝配調節(jié)劑(例如利福平)；以及阻止病毒顆粒釋放的藥劑(例如，扎那米韋和奧塞米韋)。某些病毒感染(如hiv)的治療和/或預防通常需要抗病毒劑組(“雞尾酒”)?？紤]與il-15多肽聯(lián)合使用的其它抗病毒藥物包括但不限于：阿巴卡韋、阿德福韋、金剛烷胺、安普那韋(amprenavir)、安普利近(ampligen)、arbidol、阿扎那韋(atazanavir)、依發(fā)韋侖(atripla)、boceprevirertet、西多福韋(cidofovir)、雙汰芝(combivir)、地瑞那韋(darunavir)、地拉韋啶(delavirdine)、去羥肌苷(didanosine)、二十二醇(docosanol)、依度尿苷(edoxudine)、依法韋倫(efavirenz)、恩曲他濱(emtricitabine)、恩夫韋地(enfuvirtide)、恩替卡韋(entecavir)、泛昔洛韋(famciclovir)、呋山那韋(fosamprenavir)、膦甲酸(foscarnet)、膦乙酸(fosfonet)、更昔洛韋(ganciclovir)、伊巴他濱(ibacitabine)、imunovir、碘苷、咪喹莫特(imiquimod)、茚地那韋(indinavir)、肌苷、各種干擾素(例如聚乙烯乙二醇alfa-2a)、洛匹那韋(lopinavir)、洛韋胺(loviride)、馬拉維諾(maraviroc)、嗎啉胍(moroxydine,美替沙腙(methisazone)、奈非那韋(nelfinavir)、奈韋拉平(nevirapine)、nexavir、噴昔洛韋(penciclovir)、帕拉米韋(peramivir)、普來可那立(pleconaril)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、雷特格韋(raltegravir)、利巴韋林(ribavirin)、利托那韋(ritonavir)、嘧啶(pyramidine)、沙奎那韋(saquinavir)、司他夫定(stavudine)、特拉匹韋(telaprevir)、去羥肌苷加(tenofovir)、替拉那韋(tipranavir)、曲氟尿苷(trifluridine)、三協(xié)唯(trizivir)、曲金剛胺(tromantadine)、特魯瓦達(truvada)、伐昔洛韋(valaciclovir)、纈更昔洛韋(valganciclovir)、vicriviroc、阿糖腺苷(vidarabine)、韋拉密仃(viramidine)和扎西他濱(zalcitabine)。

認為棒狀革蘭陰性菌的沙門氏菌屬(salmenella)的il-15處理與目前正在開發(fā)的疫苗結合最有效的。關于用于治療惡性瘧原蟲寄生物的聯(lián)合療法，抗瘧藥(例如，氯喹)和青蒿素在與il-15肽的聯(lián)合療法中可以是有效的。

本公開包括上述任一項的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。

劑量

本公開的il-15多肽可以以一定量對受試者施用，所述量取決于例如施用目標(例如，期望的消退程度)；接受制劑施用的受試者的年齡、重量、性別、健康和身體狀況；施用途徑；以及疾病、病癥、病況或其癥狀的性質。給藥方案可以考慮與所施用的藥劑相關的任何不良反應的存在、性質和程度。有效的劑量和劑量方案可以容易地從例如安全性和劑量遞增試驗、體內研究(例如，動物模型)以及本領域技術人員已知的其它方法來確定。

通常，給藥參數(shù)決定了劑量的量小于對受試者可以不可逆地有毒性的量(最大耐受劑量(mtd))，并且不小于對受試者產(chǎn)生可測量的影響所需的量。這些量通過例如與adme相關的藥代動力學和藥效學參數(shù)來確定，考慮到施用途徑和其它因素。

有效劑量(ed)是在一定分數(shù)的服用藥劑的受試者中產(chǎn)生治療響應或期望效果的藥劑的劑量或量。藥劑的“中值有效劑量”或ed50是在接受其施用的群體的50％中產(chǎn)生治療響應或期望效果的藥劑的劑量或量。雖然ed50通常用作對藥劑效果合理預期的量度，但并不一定是考慮到所有相關因素，臨床醫(yī)生認為合適的劑量。因此，在一些情況下，有效量超過計算的ed50，在其它情況下有效量小于計算的ed50，而在其它情況下，有效量與計算的ed50相同。

此外，本公開的il-15分子的有效劑量可以是當對受試者以一個或多個劑量施用時相對于健康受試者產(chǎn)生期望結果的量。例如，對于經(jīng)歷特定病癥的受試者，有效劑量可以是將所述病癥的診斷參數(shù)、測量、標志物等改善至少約5％、至少約10％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％或超過90％的劑量，其中100％定義為正常受試者展現(xiàn)的診斷參數(shù)、測量、標志物等。治療本文所述的疾病、病癥或病況必需的il-15分子的量基于綴合蛋白的il-15活性，其可以通過本領域已知的il-15活性測定法確定。

il-15分子的治療有效量的范圍可以為約0.01至約100μg蛋白/kg體重/天、約0.1至20μg蛋白/kg體重/天、約0.5至10μg蛋白質/kg體重/天或約1至4μg蛋白/kg體重/天。在一些實施方案中，il-15分子的治療有效量的范圍可以為約1至16μg蛋白/kg體重/天。本公開考慮通過連續(xù)輸注施用il-15分子以遞送例如約50至800μg蛋白/kg體重/天。輸注速率可以隨著對例如不利影響和血細胞計數(shù)的評估而變化。

對于口服藥劑的施用，組合物可以以片劑、膠囊等形式提供，其含有1.0-1000毫克的活性成分，特別是1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0或1000.0毫克的活性成分。

在某些實施方案中，以“單位劑型”含有所公開的il-15多肽的劑量。短語“單位劑型”是指物理上離散的單位，每個單位含有單獨或與一種或多種額外的藥劑組合的預定量的本公開的il-15多肽，足以產(chǎn)生期望的效果。應當理解，單位劑型的參數(shù)將取決于具體藥劑和待實現(xiàn)的效果。

試劑盒

本公開還考慮包含il-15及其藥物組合物的試劑盒。試劑盒通常為容納各種組分的物理結構的形式，如下文所述，并且可以用于例如實施本文所述的方法。

試劑盒可以包括本文所公開的一種或多種il-15多肽(在例如無菌容器中提供)，其可以是適合于對受試者施用的藥物組合物的形式。il-15多肽可以以準備使用的形式提供，或者以施用前需要例如重建或稀釋的形式提供。當il-15多肽是需要由使用者重建的形式時，試劑盒還可以包含與il-15多肽包裝或分開的緩沖液、藥學上可接受的賦形劑等。當考慮聯(lián)合療法時，試劑盒可以單獨含有幾種藥劑，或者它們可以已經(jīng)被含在試劑盒中。試劑盒的每種組分可以封閉在單獨的容器內，并且所有的各種容器可以在單個包裝內。本公開的試劑盒可以設計用于適當維持容納在其中的組分所必需的條件(例如冷藏或冷凍)。

試劑盒可以包含標簽或包裝插頁，包括其中組分的鑒定信息及其使用說明(例如，給藥參數(shù)、活性成分的臨床藥理學，包括作用機理、藥代動力學和藥效學、不良反應、禁忌癥等)。標簽或插頁可以包括制造商信息，如批號和失效期。標簽或包裝插頁可以例如集成到容納組分的物理結構中、單獨含在物理結構內，或者固定到試劑盒的組件(例如，安瓿、管或小瓶)。

標簽或插頁可另外包括或并入計算機可讀介質，如盤(例如，硬盤、卡、存儲盤)，光盤，如cd或dvd-rom/ram、dvd、mp3、磁帶或電存儲介質如ram和rom或這些雜合物，如磁/光存儲介質/flash介質或存儲器型卡。在一些實施方案中，實際指令不存在于試劑盒中，而是提供用于從遠程源獲得指令(例如通過因特網(wǎng))的手段。

實施例

提出以下實施例，以便為本領域普通技術人員提供如何產(chǎn)生和使用本發(fā)明的完整公開和描述，而不意圖限制發(fā)明人視為其發(fā)明的范圍，它們也不意圖表示以下實驗是實施的，并且是可以實施的所有實驗。應當理解，以現(xiàn)在進行時書寫的示例性描述不一定是實施的，而是可以實施描述以產(chǎn)生其中描述的數(shù)據(jù)等。已經(jīng)努力確保使用的數(shù)字(例如量，溫度等)的準確性，但是應該考慮一些實驗誤差和偏差。

除非另有指示，份為重量份，分子量為重均分子量，溫度為攝氏度(℃)，并且壓力為或接近大氣壓。

使用標準縮寫，包括以下：bp＝堿基對；kb＝千堿基；pl＝皮升；s或sec＝秒；min＝分鐘；h或hr＝小時；aa＝氨基酸；kb＝千堿基；nt＝核苷酸；ng＝納克；μg＝微克；mg＝毫克；g＝克；kg＝千克；dl或dl＝分升；μl或μl＝微升；ml或ml＝毫升；l或l＝升；nm＝納摩爾；μm＝微摩爾；mm＝毫摩爾；m＝摩爾；kda＝千道爾頓；i.m.＝肌內；i.p.＝腹膜內；s.c.＝皮下；qd＝每日；bid＝每日兩次；qw＝每周；qm＝每月；hplc＝高效液相層析；bw＝體重；u＝單位；ns＝統(tǒng)計學不顯著；pbs＝磷酸鹽緩沖鹽水；pcr＝聚合酶鏈式反應；nhs＝n-羥基琥珀酰亞胺；dmem＝伊格爾培養(yǎng)基的dulbeco改良；gc＝基因組拷貝；elisa＝酶聯(lián)免疫吸附測定法；edta＝乙二胺四乙酸；pma＝佛波酮肉豆蔻酸乙酸酯；rhil-15＝重組人il-15；lps＝脂多糖。

材料和方法

可以在下述實施例中使用以下通用材料和方法：

描述了分子生物學中的標準方法(參見例如sambrook和russell(2001)molecularcloning,第3版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.；和ausubel等人(2001)currentprotocolsinmolecularbiology,第1-4卷,johnwileyandsons,inc.newyork,n.y.，其描述了在細菌細胞中的克隆和dna誘變(第1卷)、在哺乳動物細胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖綴合物和蛋白質表達(第3卷)和生物信息學(第4卷))。

科學文獻描述了蛋白質純化的方法，包括免疫沉淀、層析、電泳、離心和結晶，以及化學分析、化學修飾、翻譯后修飾、融合蛋白的產(chǎn)生和蛋白質的糖基化(參見例如coligan等人(2000)currentprotocolsinproteinscience,第1-2卷,johnwileyandsons,inc.,ny)。

描述了多克隆和單克隆抗體的生產(chǎn)、純化和片段化(例如，harlow和lane(1999)usingantibodies,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny)；用于表征配體/受體相互作用的標準技術是可用的(參見例如coligan等人(2001)currentprotocolsinimmunology,第4卷,johnwiley,inc.,ny)；用于流式細胞術(包括熒光激活細胞分選(facs))的方法是可用的(參見例如，shapiro(2003)practicalflowcytometry,johnwileyandsons,hoboken,nj)；適用于修飾核酸，包括核酸引物和探針、多肽和抗體的熒光試劑(例如用作診斷試劑)是可用的(molecularprobes(2003)catalogue,molecularprobes,inc.,eugene,or.；sigma-aldrich(2003)catalogue,st.louis,mo.)。

描述了免疫系統(tǒng)的組織學的標準方法(參見例如louis等人(2002)basichistology:textandatlas,mcgraw-hill,newyork,ny)。

免疫細胞(cd4⁺和cd8⁺t-細胞)的消減可以通過抗體介導的消除來實現(xiàn)。例如，可以每周注射250μg的cd4-或cd8-特異性抗體，并使用facs和ihc分析來驗證細胞消減。

用于確定例如抗原片段、前導序列、蛋白質折疊、功能結構域、糖基化位點和序列比對的軟件包和數(shù)據(jù)庫是可用的(參見例如gcgwisconsin包(accelrys,inc.,sandiego,ca)；以及decypher^tm(timelogiccorp.,crystalbay,nv)。

免疫感受態(tài)balb/c或b細胞缺陷型balb/c小鼠可以從thejacksonlab.,barharbor,me獲得，并且可以按照標準程序(參見例如martin等人(2001)infect.immun.,69(11):7067-73和compton等人(2004)comp.med.54(6):681-89)使用。適用于本公開考慮的實驗工作的其它小鼠品系是熟練技術人員已知的，并且通常可從thejacksonlab獲得。熟練技術人員熟悉也可以用于本公開的實施中的模型和細胞系(例如，炎癥模型)。

血清il-15濃度水平和暴露水平可以通過本領域中使用的標準方法測定。例如，可以如下進行血清暴露水平測定法：通過將來自小鼠尾巴剪斷的全血(約50μl/小鼠)收集到普通毛細血管，通過離心分離血清和血細胞，并通過標準elisa試劑盒(例如r&dsystems)和技術測定il-15暴露水平。可替代地或另外地，以下描述的elisa方案(或類似方案)可以適合于測量人il-15的血清水平，作為確定突變蛋白或經(jīng)修飾的突變蛋白的體內半衰期的手段。

突變蛋白的產(chǎn)生與評估

人il-15表達載體psectag2hygro-huil15的裝配。可以通過使用platinumpfxdna聚合酶(lifetechnologies#11708-039，按照制造商的方案)，使用pcmv6-ac-人-il15(origene#sc324164，genbank登錄#nm_000585.4)作為dna模板和引物5’-tataggcccagccggccgccgccaccatgagaatttcgaaaccacatttgag-3’(seqidno:34)和5’-tatagggccctcaagaagtgttgatgaacatttgg-3’(seqidno:35)經(jīng)由pcr擴增完整的人il-15開放閱讀框裝配人il-15哺乳動物表達載體，并且可以使用qiaquickpcr純化試劑盒(qiagen#28106)擴增所得pcr反應?？梢杂胹fii和apai(newenglandbiolabs,ipswich,ma)在37℃將純化的人il-15pcr片段和哺乳動物表達載體psectag2hygro(b)(lifetechnologies#v910-20)消化1小時，其中對psectag2hygro(b)消化添加牛腸磷酸酶(newenglandbiolabs,ipswich,ma)?？梢栽?00v下在1％瓊脂糖凝膠(lonza#54803)上將消化的dna片段運行1小時，然后使用qiaquick凝膠提取試劑盒(qiagen#28706)進行切割和純化?？梢允褂每焖賒na連接試劑盒(roche#11635379001)將人il-15pcr片段連接到psectag2hygro(b)載體中，轉化到oneshottop10化學感受態(tài)大腸桿菌(lifetechnologies#c404006)中，鋪板到含有100μg/ml氨芐西林的瓊脂平板，并在37℃下培養(yǎng)過夜。次日，可以單獨挑取細菌菌落，并置于含有l(wèi)b+100μg/ml氨芐西林的3ml培養(yǎng)物中，并在37℃下，在搖動培養(yǎng)箱中以200rpm培養(yǎng)8-20小時。然后，將兩(2)ml的每種培養(yǎng)物等分到2ml管中，將細胞以6000rpm在臺式離心機中沉淀10分鐘，吸出培養(yǎng)基，并使用qiaprepspinminiprep試劑盒(qiagen#27106)從細菌中純化出dna?？梢酝ㄟ^dna測序(mclab,southsanfrancisco,ca)鑒定正確的表達載體。

產(chǎn)生突變蛋白表達載體。使用quikchangeii位點定向誘變試劑盒(agilenttechnologies#200524)，按照具有以下澄清的制造商的方案將前述的人il-15哺乳動物表達載體psectag2hygro-huil-15突變來裝配人il-15突變蛋白表達載體：引物不總是滿足推薦的tm；將pcr反應循環(huán)16-18輪，延長時間為6-7分鐘；將4μldpni處理的反應轉化為oneshottop10化學感受態(tài)細胞(lifetechnologies#c404006)，如先前描述。如先前描述，將三(3)ml微量制備培養(yǎng)物培養(yǎng)、純化、并且序列驗證。對于一些突變蛋白，培養(yǎng)400ml培養(yǎng)物并純化。簡言之，將1個細菌菌落挑取到400mllb+100μg/ml氨芐西林中，并在搖動培養(yǎng)箱中以200rpm在2l擋板錐形瓶中在37℃下培養(yǎng)12-20小時。然后，將培養(yǎng)物在離心機(在ja-10轉子中在beckmanavantij-25t中6000rpm，持續(xù)20分鐘)中沉淀，吸出培養(yǎng)基，并且使用endofreeplasmidmega試劑盒(qiagen,#12381)，按照制造商的方案(具有非常小的變化，具有熟練技術人員熟悉的類型，對dna沉淀方法做出以提高最終dna濃度)提取dna。

通過一次插入一個突變裝配需要多個氨基酸變化的突變蛋白。引入n-糖基化基序n-x-s和n-x-t有時需要引入三個突變，因為x≠p(脯氨酸)。用于突變蛋白的編號約定將起始密碼子分配為第一個位置，因此前48個殘基(mriskphlrsisiqcylclllnshflteagihvfilgcfsaglpktea(seqidno:36))包含信號肽，并且成熟蛋白的第一個殘基將是天冬酰胺堿49。

蛋白質轉染方案。可以在hek293ft細胞(lifetechnologies#r700-07)中瞬時表達所有人il-15表達載體(野生型和突變蛋白)?？梢栽?7℃下在5％co2在t175燒瓶(greinerone/cellstar#660175)中在50mldmem(lifetechnologies#11995-073)+10％表征的胎牛血清(hyclon/thermoscientific#sh30071.03)+1x青霉素/鏈霉素(lifetechnologies#15140-122)中維持細胞。達到匯合后，可以用10mlpbs+5mmedta分離細胞，再用10ml生長培養(yǎng)基收集細胞，在離心機(beckmanallegra6r)中以1000rpm沉淀，吸出培養(yǎng)基，將細胞重懸浮于新鮮培養(yǎng)基中，然后在三個各含有45ml生長培養(yǎng)基的t175燒瓶之間分開。

可以將所有表達載體轉染到6孔板或t175燒瓶中。對于6孔板轉染，可以從匯合的t175燒瓶中收獲hek293ft細胞，如先前所述收集細胞，然后重懸于20ml新鮮生長培養(yǎng)基中?？梢栽诤?ml新鮮培養(yǎng)基的6孔板(falcon#353046)的每個孔中添加七百(700)μl細胞懸浮液，并且如上所述培養(yǎng)過夜。次日，可以使用以下方案使用lipofectamine2000(lifetechnologies#1388795)轉染細胞：可以將250μloptimemi還原血清培養(yǎng)基(lifetechnologies#31985-088)等分到兩個eppendorf管，然后可以將10μllipofectamine2000轉染試劑(lifetechnologies#1388795)加入到一個等分試樣，并將4μgdna加入另一個?？梢栽谑覝叵聦煞N溶液分開溫育5分鐘，然后可以通過將兩種溶液組合并在室溫下將它們再溫育30分鐘來形成轉染復合物。然后，可以將完整的500μl混合物逐滴加入6孔板的1個孔，并且返回培養(yǎng)箱4小時。然后，可以將轉染培養(yǎng)基吸出并用dmem+青霉素/鏈霉素替換，并且培養(yǎng)約36小時。然后，可以收獲條件化培養(yǎng)基，并在4℃下儲存。然后，可以如上所述轉染t175燒瓶，區(qū)別在于：轉染前可將具有42-45ml生長培養(yǎng)基的t175燒瓶培養(yǎng)至95％匯合，并且可以通過將175μllipofectamine2000加入到4.4mloptimemi并且將75-100μldna加入到第二份4.4mloptimemi形成轉染復合物。抽吸轉染復合物后，可向每個燒瓶加入50ml培養(yǎng)基。

模擬轉染可以含有空的psectag2hygro(b)表達載體或沒有dna，并且可以如前所述制備。

人il-15檢測elisa。可以在4℃下用100μl/孔pbs+1μg/ml抗人il-15抗體(例如atcchb-12062，克隆m111,manassas,va)將96孔板(nuncmaxisorp#442404)包被過夜，在dpbs-tween20(teknova#p0297)中清洗6x200μl，并且在室溫下在搖擺平臺上在200μl/孔pbs+5％bsa(calbiochem#2960)中封閉2小時，并且如先前描述的那樣清洗?？梢栽趐bs中連續(xù)稀釋樣品，并將100μl/孔加入到測定板中?？梢砸皇絻煞莼蛞皇饺葸\行樣品。作為陽性對照，可以摻入純化的人il-15，而緩沖液或來自模擬轉染的條件化培養(yǎng)基可以用作陰性對照，并且兩者都連續(xù)稀釋?？梢栽?℃下在搖擺平臺上溫育樣品過夜，然后如前所述清洗?？梢韵蛎總€孔加入100μl/孔的pbs+抗人il-15抗體(例如，ab7213；abcam)，在搖擺平臺上室溫溫育1小時，如前所述清洗，然后可以加入100μl/孔驢抗兔igg(h+l)-hrp(jacksonimmunoresearch#711-035-152，以1:10,000稀釋)，并在室溫下在搖擺平臺上再溫育1小時?？梢匀缢銮逑窗?，并且用100μl/孔的1-stepultratmb-elisa(pierce/thermo#34029)顯現(xiàn)1-5分鐘，然后用100μl/孔停止溶液(lifetechnologies#ss04)停止反應。可以在450nm在moleculardevicesm2讀板器上讀板。

另一種elisa形式可以包括預制試劑盒(例如，按照在人il-15quantikineelisa試劑盒(r&dsystems#d1500，minneapolis，mn)中制造商推薦的方案)。

野生型和突變蛋白人il-15的純化?？梢詫⒖谷薸l-15抗體(例如atcchb-12062，克隆m111，manassas，va)綴合到cnbr活化的sepharose4fastflow(gehealthcare#71-5000-15af，按照制造商的方案)，并且在pbs中平衡。可以在玻璃econo柱(bio-rad，hercules，ca)中含有的每100ml條件化培養(yǎng)基中珠?；?00μl-1ml的m111-sepaharose，并在室溫下在搖擺平臺上溫育1-2小時?？梢酝ㄟ^重力流將培養(yǎng)基運行通過柱，用1xpbs(ph7.4)清洗1次，用0.1m甘氨酸(ph2.9)洗脫，并用10％體積的1mtris緩沖液(ph8.0)中和?？梢允褂胊micon超離心過濾裝置(millipore,billerica,ma；5,000kd分子量截留)將蛋白質濃縮并緩沖液交換到pbs(ph7.4)中。可以通過分光光度計在280nm處測定蛋白質濃度。

sec分析蛋白。使用1100系列hplc(agilenttechnologies，santaclara，ca)，可將20-50μg蛋白質注射到用pbs(ph7.4)平衡的tsk3000sw柱(tosohbiosciences,tokyo,jp)上，并以流速1ml/min運行。

il-15的聚乙二醇化

可以在ph4-8的50mm磷酸鹽及100mmnacl中將peg(nofcorporation，japan)稀釋至10-100mg/ml的濃度，并且可以在pbs,ph7.4中將人il-15稀釋至2-10mg/ml的濃度。最終反應混合物可以包括10:1至2:1比率范圍(ppapeg:人il-15)的peg和人il-15，和終濃度5-50mm的氰基硼氫化鈉。反應可以在4℃-25℃下溫育2至48小時。為了選擇期望的蛋白質種類和/或緩沖液交換，可以通過sec(如前所述)分級聚乙二醇化蛋白質，或者為了消除聚乙二醇化反應混合物和/或緩沖液交換中的大多數(shù)非蛋白質種類，peg-il-15反應混合物可進行超濾步驟(例如，milliporelabscaletff系統(tǒng)可與具有5kda分子量截留的再生纖維素(plcgc)膜一起使用)。

測定il-15的修飾形式的生物活性的測定法

本公開考慮使用本領域已知的任何測定法和方法來測定本文所述的il-15分子的生物活性。下文描述的測定法是代表性的，而不是排他性的。

ctll-2細胞增殖測定法。soman等人(jimmunolmethods348(1-2):83-94(2009年8月31日))描述了使用可溶性celltiter96aqueousonereagent(promega；madison，wi)的ctll-2細胞的優(yōu)化的基于四唑染料的比色細胞增殖測定法定量評估il-15生物活性。ctll-2是依賴il-2的鼠細胞系。

本文中使用與soman等人描述的測定法基本上相似的ctll-2細胞增殖測定法測定il-15生物活性。簡言之，將ctll-2細胞(atcctib-214,manassas,va)在補充有10％fbs和10％t-stim(corning#354115,tewsbury,ma)的rpmi1640(lifetechnologies,11875-093,grandisland,ny)中培養(yǎng)。在37℃在補充5％co2的情況下以10,000個細胞/ml-100,000個細胞/ml的密度維持細胞，并且當它們以對數(shù)期生長(通常在解凍后2-3周；細胞活力≥95％)時收獲，并用20ml無t-stim的生長培養(yǎng)基清洗4次(通過以1000rpm離心5分鐘)。然后，將100μl無t-stim的生長培養(yǎng)基中的25,000個細胞/孔等分到透明的96孔組織培養(yǎng)板中，并且在稀釋蛋白質的情況下返回到培養(yǎng)箱。將il-15樣品在測定培養(yǎng)基中稀釋至初始濃度8ng/ml，然后連續(xù)兩倍稀釋，然后將100μl加入到96孔組織培養(yǎng)板的孔并返回到37℃，5％co2培養(yǎng)箱達48小時。在48小時溫育期后，加入aqueousonesolution(20μl/孔)，并將懸浮液在37℃和5％co2下再溫育1-4小時。在490nm讀板，并從樣品孔讀數(shù)中減去具有培養(yǎng)基的孔中的背景讀數(shù)。

m07e細胞增殖測定法。kanakura等人(blood76(4):706-15(1990年8月15日))；caliceti等人(plosone7(7):e41246.doi:10.1371/journal.pone.0041246(2012))；和zauner等人(biotechniques20:905-13(1996年5月))描述了使用m07e(人巨核細胞白血病細胞系，其增殖是il-3或gm-csf依賴性的)細胞增殖測定法。m07e細胞可以從dsmz(dsmz編號acc104；braunschweig,germany)購買。

可以在補充有10％fbs、rhgm-csf(10ng/ml)或rhil-3(10ng/ml)的rpmi1640培養(yǎng)基(gibco,grandisland,ny)中培養(yǎng)m07e細胞系；或者，可以在補充有5％fcs和10ng/mlil3的imdm中培養(yǎng)細胞?？梢允褂胢tt[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(sigma)摻入定量因子誘導的m07e細胞增殖。簡言之，可以在37℃下在平底微量滴定板(100μl/孔)中培養(yǎng)m07e細胞的一式三份等分試樣72小時。對于培養(yǎng)的最后4小時，可以加入mtt(10μl在pbs中的5mg/mlmtt溶液)。在72小時時，可以將100μl酸性異丙醇(異丙醇中的0.04nhcl)加入到所有孔，混合，并在微elisa讀數(shù)器上在540nm測量光密度。

cd8+/cd4+t細胞測定法。當用peg-il-15處理時，活化的原代人cd8+和cd4+t細胞分泌ifnγ、粒酶b、穿孔蛋白和tnfα。以下方案提供了用于篩選這些細胞因子的產(chǎn)生的示例性測定法?？梢愿鶕?jù)任何標準方案(參見例如fuss等人(2009)currentprotocolsinimmunology,unit7.1,johnwiley,inc.,ny)分離人原代外周血單核細胞(pbmc)?？梢杂煤衦pmi(lifetechnologies；carlsbad,ca)、10mmhepes(lifetechnologies；carlsbad,ca)、10％胎牛血清(hyclonethermofisherscientific；waltham,ma)和青霉素/鏈霉素混合物(lifetechnologies；carlsbad,ca)的完全rpmi，或在aim-v無血清培養(yǎng)基(lifetechnologies#12055-083)中，在任何標準培養(yǎng)處理的6孔板(bd；franklinlakes,nj)中在具有5％co2的濕潤37℃培養(yǎng)箱中每孔培養(yǎng)2.5mlpbmc(以1000萬個細胞/ml的細胞密度)?？梢允褂胢iltenyibiotec的macs細胞分離技術根據(jù)制造商的方案(miltenyibiotech；auburn,ca)分離cd8+和cd4+t細胞?？梢酝ㄟ^用抗cd3和抗cd-28抗體(affymetrixebioscience；sandiego,ca)包被24孔組織培養(yǎng)板(costar#3526,corning,ny)并且通過加入1mlaim-v培養(yǎng)基中的3e6個細胞/孔來激活t細胞?？梢匀缢雠囵B(yǎng)細胞3天，然后收集并以2e6個細胞/ml的密度重懸浮于新鮮的aim-v中，并將250μl/孔等分到96孔組織培養(yǎng)板(falcon#353072,corning,ny)?？梢赃B續(xù)稀釋人peg-il-15并以1μg/ml至0.01ng/ml的終濃度加入到孔；可以在具有5％co2的濕潤的37℃培養(yǎng)箱中溫育細胞3天。然后，可以收集培養(yǎng)基，并且使用商業(yè)elisa試劑盒并按照制造商的方案(例如，affymetrixbioscience；sandiego,ca或r&dsystems,minneapolis,mn))測定ifnγ、粒酶b、穿孔蛋白和/或tnfα。

nk細胞測定法。人nk細胞可以從pbmc細胞(先前描述的方案；在完全rpmi中培養(yǎng))中分離，并且根據(jù)制造商的方案(miltenyibiotech；auburn，ca)使用miltenyibiotec的macs細胞分離技術類似地分離?？梢陨L和培養(yǎng)細胞(如對t細胞所述，使用完整的rpmi)，在250μl完全rpmi中以5e5個細胞/孔在96孔組織培養(yǎng)板(falcon#353072，corning，ny)中接種。在生長1-3天后，可以如對t細胞所述測定培養(yǎng)基。

腫瘤模型和腫瘤分析

可以使用任何公認的腫瘤模型、測定法等評價本文所述的il-15分子對各種腫瘤的影響。下文描述的腫瘤模型和腫瘤分析是可以利用的腫瘤模型和腫瘤分析的代表。

每個腫瘤接種，以10⁴、10⁵或10⁶個細胞皮下或皮內注射同基因小鼠腫瘤細胞?？梢允褂胑p2乳腺癌、ct26結腸癌、pdv6鱗狀皮膚癌和4t1乳腺癌模型(參見例如langowski等人(2006)nature442:461-465)。可以使用免疫感受態(tài)balb/c或b細胞缺陷型balb/c小鼠?？梢詫eg-mil-15施用于免疫感受態(tài)小鼠，而peg-hil-15處理可以在b細胞缺陷型小鼠中。在治療開始之前，允許腫瘤達到100-250mm³的大小。il-15、peg-mil-15、peg-hil-15或緩沖液對照在遠離腫瘤植入的部位皮下施用。通常使用電子測徑器每周兩次監(jiān)測腫瘤生長。

在各種終點收獲腫瘤組織和淋巴器官以測量許多炎癥標志物的mrna表達，并對幾種炎性細胞標志物進行免疫組織化學。將組織在液氮中快速冷凍并儲存在-80℃。通常使用電子測徑器每周兩次監(jiān)測原發(fā)性腫瘤生長?？梢允褂霉?寬度²x長度/2)計算腫瘤體積，其中長度是較長的尺度。在開始處理前，允許腫瘤達到90-250mm³的大小。

本文描述了本發(fā)明的具體實施方案，包括發(fā)明人已知的用于實施本發(fā)明的最佳模式。在閱讀前述內容后，所公開的實施方案的描述、變化對于本領域技術人員來說可變得顯而易見，并且預期熟練技術人員可以適當采用此類變化。因此，意圖以與本文具體描述的方式不同的方式實施本發(fā)明，并且本發(fā)明包括根據(jù)適用法律允許的所附權利要求中所述的主題的所有修改和等同方案。此外，除非本文另有說明或根據(jù)背景明顯矛盾，否則本發(fā)明涵蓋了其所有可能變化的上述要素的任何組合。

本說明書中引用的所有出版物、專利申請、登錄號和其它參考文獻通過引用并入本文，如同每個單獨的出版物或專利申請具體和單獨地指明通過引用并入本文一樣。

序列表

<110>s·麥考利

<120>白介素-15組合物及其用途

<130>acir-001wo

<150>us62/063,784

<151>2014-10-14

<160>41

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>162

<212>prt

<213>智人

<400>1

metargileserlysprohisleuargserileserileglncystyr

151015

leucysleuleuleuasnserhispheleuthrglualaglyilehis

202530

valpheileleuglycyspheseralaglyleuprolysthrgluala

354045

asntrpvalasnvalileseraspleulyslysilegluaspleuile

505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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145150155160

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<210>2

<211>135

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<213>智人

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<210>4

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<212>dna

<213>智人

<400>4

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cccagttgcaaagtaacagcaatgaagtgctttctcttggagttacaagttatttcactt300

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<210>5

<211>408

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<213>智人

<400>5

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<210>6

<211>345

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<213>智人

<400>6

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<210>7

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>7

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1510

<210>8

<211>27

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<213>人工序列

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<223>合成多肽

<400>8

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151015

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2025

<210>9

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<213>人工序列

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<223>合成多肽

<400>9

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151015

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202530

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<210>10

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>10

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151015

<210>11

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>11

tyrglyarglyslysargargglnargargarg

1510

<210>12

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>12

arglyslysargargglnargargarg

15

<210>13

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>13

tyrglyarglyslysargargglnargargarg

1510

<210>14

<211>8

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<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>14

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15

<210>15

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>15

tyralaargalaalaalaargglnalaargala

1510

<210>16

<211>11

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<213>人工序列

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<223>合成多肽

<400>16

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1510

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<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>17

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1510

<210>18

<211>4

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<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>18

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1

<210>19

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>19

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15

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<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>20

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1

<210>21

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<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>21

argargarglyslysarg

15

<210>22

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>ser可以重復n次，其中n是至少1的整數(shù)。

<400>22

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15

<210>23

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>ser可以重復n次，其中n是至少1的整數(shù)。

<400>23

glyglyglyser

1

<210>24

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

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<220>

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<222>(1)..(5)

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<220>

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<222>(2)..(2)

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<220>

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<222>(3)..(3)

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<220>

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<222>(4)..(4)

<223>ser可以重復o次，其中o是至少1的整數(shù)。

<220>

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<222>(5)..(5)

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<400>24

glyserglysergly

15

<210>25

<211>5

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<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<220>

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<222>(1)..(5)

<223>1-5位可以重復n次，其中n是至少1的整數(shù)。

<220>

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<222>(5)..(5)

<223>ser可以重復m次，其中m是至少1的整數(shù)。

<400>25

glyserglyglyser

15

<210>26

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(5)

<223>1-5位可以重復n次，其中n是至少1的整數(shù)。

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>ser可以重復m次，其中m是至少1的整數(shù)。

<400>26

glyserglysergly

15

<210>27

<211>4

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<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

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<221>misc_feature

<222>(1)..(4)

<223>1-4位可以重復n次，其中n是至少1的整數(shù)。

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>ser可以重復m次，其中m是至少1的整數(shù)。

<400>27

glyglyglyser

1

<210>28

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<213>人工序列

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1

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<213>人工序列

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15

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<220>

<223>合成多肽

<400>30

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15

<210>31

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<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>31

glyserglyglygly

15

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<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>32

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15

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<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>33

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15

<210>34

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>34

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<210>35

<211>35

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<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>35

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<210>36

<211>48

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<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

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151015

leucysleuleuleuasnserhispheleuthrglualaglyilehis

202530

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<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>37

asnvalileseraspleulyslysile

15

<210>38

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>38

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15

<210>39

<211>8

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<213>人工序列

<220>

<223>合成多肽

<400>39

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15

<210>40

<211>18

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<213>人工序列

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<223>合成多肽

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151015

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<210>41

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<213>人工序列

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<223>合成多肽

<400>41

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15