相關(guān)申請(qǐng)案

本申請(qǐng)案主張根據(jù)2014年10月10日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)案ussn62/062,257的35u.s.c.§119(e)的權(quán)益，其全部內(nèi)容以引用的方式并入本文中。

聯(lián)邦政府資助的研究

本發(fā)明根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院授予的2r01ca068490-19和2r01ca076120-13在政府支持下進(jìn)行。政府擁有本發(fā)明中的某些權(quán)利。

背景技術(shù)：

報(bào)道基因測(cè)定已經(jīng)在制藥和生物技術(shù)工業(yè)中常規(guī)地使用以識(shí)別影響蛋白功能的前導(dǎo)化合物。在近十年中，化學(xué)家在短時(shí)間內(nèi)通過如組合化學(xué)反應(yīng)的技術(shù)合成大量化學(xué)化合物能力已大大提高，并且常常需要篩選數(shù)千到數(shù)百萬的化合物以識(shí)別對(duì)所關(guān)注蛋白質(zhì)具有期望效應(yīng)的那些化合物。

通常，報(bào)道基因測(cè)定測(cè)量在樣品中一種報(bào)道基因蛋白的活性，但是可結(jié)合多種報(bào)道基因。用于共表達(dá)多種報(bào)道基因的一個(gè)策略涉及雙順反子構(gòu)建體的設(shè)計(jì)，其中通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)序列分隔開的兩種基因在常見上游啟動(dòng)子的控制下表達(dá)為單個(gè)轉(zhuǎn)錄盒(或雙順反子轉(zhuǎn)錄)(延(yen)等人，《科學(xué)(science.)》2008年11月7日；322(5903)：918-23)。插入ires序列充當(dāng)用于有效的帽獨(dú)立性內(nèi)部翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。此設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)具有ires引導(dǎo)的帽獨(dú)立性翻譯的兩種基因的轉(zhuǎn)錄。此系統(tǒng)允許在實(shí)驗(yàn)處理時(shí)不期望改變的對(duì)照?qǐng)?bào)道基因與在每個(gè)測(cè)試樣品中歸一化為所述對(duì)照的測(cè)試報(bào)道基因一起共表達(dá)。然而，相比于帽獨(dú)立性翻譯，在所述細(xì)胞中的許多擾動(dòng)可差異地影響蓋獨(dú)立性翻譯。此外，一些ires已經(jīng)示出顯示下游基因的可變表達(dá)(王(wong)等人《基因療法(genether.)》2002年3月；9(5)：337-44)。這導(dǎo)致高的假陽性和不可靠的報(bào)道基因測(cè)定。因此，存在用于分析蛋白穩(wěn)定性的有效的高通量方法的需要，其中報(bào)道基因活性的非特異性變異用于控制在細(xì)胞類蛋白穩(wěn)定性測(cè)定中的固有變化。這使得降低有效且高效地運(yùn)行hts測(cè)定所需要的數(shù)據(jù)中的錯(cuò)誤。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一些方面，本公開涉及可用于在特異性擾動(dòng)之后有效監(jiān)測(cè)數(shù)千蛋白的穩(wěn)定性的質(zhì)粒的開發(fā)。

根據(jù)一些方面，本公開提供一種識(shí)別使所關(guān)注蛋白穩(wěn)定或使其不穩(wěn)定的測(cè)試化合物的方法，所述方法包括：

(i)使包括dna質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸，其中所述質(zhì)粒包括以可操作連接的

(a)啟動(dòng)子，

(b)第一內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)；

(c)編碼第一報(bào)道基因蛋白的核苷酸序列；

(d)第二ires；以及

(e)編碼第二報(bào)道基因蛋白的核苷酸序列，

其中開放閱讀框(orf)融合到編碼第一報(bào)道基因蛋白的所述核苷酸序列或融合到編碼第二報(bào)道基因蛋白的所述核苷酸序列，并且其中所述開放閱讀框編碼所關(guān)注蛋白；

(ii)在所述測(cè)試化合物的存在和不存在所述測(cè)試化合物下確定融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)與未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)的比率；以及

(iii)當(dāng)所述在測(cè)試化合物存在下融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)與未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率與在不存在所述測(cè)試化合物的情況下融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)與未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率相比增加時(shí)，將所述測(cè)試化合物識(shí)別為穩(wěn)定劑，而當(dāng)在所述測(cè)試化合物存在下融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)與未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率與在不存在所述測(cè)試化合物的情況下融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)與未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率相比降低時(shí)，將所述測(cè)試化合物識(shí)別為去穩(wěn)定劑。

在一些實(shí)施例中，所述第一和第二報(bào)道基因蛋白具有可區(qū)分的可檢測(cè)報(bào)道基因信號(hào)。在一些實(shí)施例中，所述第一和第二報(bào)道基因蛋白為具有由其產(chǎn)物產(chǎn)生的可區(qū)分信號(hào)的酶蛋白。在一些實(shí)施例中，所述第一和第二報(bào)道基因蛋白為具有可區(qū)分的生物發(fā)光信號(hào)的生物發(fā)光蛋白。在一些實(shí)施例中，所述第一和第二報(bào)道基因蛋白為具有可區(qū)分的熒光信號(hào)的熒光蛋白。在一些實(shí)施例中，所述第一和第二報(bào)道基因蛋白選自由海腎熒光素酶(rluc)和螢火蟲熒光素酶(fluc)組成的群組。在一些實(shí)施例中，所述第一和第二報(bào)道基因蛋白選自由綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白組成的群組。在一些實(shí)施例中，所述啟動(dòng)子為真核啟動(dòng)子或合成啟動(dòng)子。在一些實(shí)施例中，所述啟動(dòng)子包括巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子。在一些實(shí)施例中，所述開放閱讀框來源于生物體的orfeome。在一些實(shí)施例中，所述開放閱讀框編碼癌蛋白。在一些實(shí)施例中，所述癌蛋白選自由以下組成的群組：myc、ikaros家族鋅指蛋白1(ikzf1)、ikaros家族鋅指蛋白3(ikzf3)、干擾素調(diào)節(jié)因子4(irf4)、突變體p53、n-ras、c-fos和c-jun。在一些實(shí)施例中，使包括所述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸包括在所述測(cè)試化合物存在下使所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞生長適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。

本發(fā)明的所述實(shí)施例和方面中的每個(gè)可獨(dú)立或組合實(shí)踐。此外，本文所用的措詞和術(shù)語是出于描述的目的并且不應(yīng)被視為是限制性的。本文“包含”、“包括”或“具有”、“含有”、“涉及”以及其變體的使用意指涵蓋在其后所列舉的所述項(xiàng)目和其等效物以及額外項(xiàng)目。

參考具體實(shí)施方式，本發(fā)明的這些和其它方面以及各種優(yōu)點(diǎn)和效用將變得顯而易見。本發(fā)明的每個(gè)方面可涵蓋如將被理解的各種實(shí)施例。

在本申請(qǐng)案中識(shí)別的所有文獻(xiàn)以其全文引用的方式并入本文中。

附圖說明

附圖并不打算按比例繪制。在附圖中，不同的圖中所說明的每個(gè)相同或幾乎相同的組件由類似數(shù)字表示。為了清楚的目的，可能不在每一個(gè)附圖中標(biāo)記每一個(gè)組件。在附圖中：

圖1確認(rèn)在293ft和hela細(xì)胞中的pirigf構(gòu)建體表達(dá)(圖1a至1c)和在u-2os細(xì)胞中的pug-firp構(gòu)建體表達(dá)(圖1d)。測(cè)試若干不同形式的哺乳動(dòng)物和慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建體的產(chǎn)生表達(dá)標(biāo)記的靶蛋白(例如螢火蟲或nanoluc標(biāo)簽)和共表達(dá)報(bào)道基因熒光素酶(例如海腎或螢火蟲)的細(xì)胞(例如293ft、hela或u-2os細(xì)胞)的能力。

在圖2中，293ft和hela細(xì)胞用ikzf1-螢火蟲、ikzf3-螢火蟲和myc-螢火蟲融合蛋白轉(zhuǎn)染并且分別使用嘌呤霉素和遺傳霉素選擇。這些集合體非常不穩(wěn)定并且在10到30天中丟失信號(hào)并且通常對(duì)imid具有極小應(yīng)答(圖2a至2c)。因此，使用有限的克隆策略在96孔板中分離單個(gè)克隆。存活的細(xì)胞被分離為菌落，進(jìn)一步擴(kuò)增并且測(cè)試熒光素酶信號(hào)和對(duì)imid的應(yīng)答?？寺?b4被識(shí)別為對(duì)來那度胺的強(qiáng)應(yīng)答者。hela細(xì)胞表達(dá)非常低水平的熒光素酶，這使hela克隆的分離非常困難。通過對(duì)螢火蟲、ikzf1和myc的蛋白質(zhì)印跡的檢測(cè)確認(rèn)所述融合蛋白的表達(dá)和與螢火蟲熒光素酶信號(hào)相關(guān)的相對(duì)表達(dá)(圖2d)。

在圖3中表達(dá)指定螢火蟲融合蛋白的細(xì)胞系克隆(ikzf1-2b4、ikzf1-2b11、myc-1c3和myc-5f2)在dual-glo測(cè)定中評(píng)估再現(xiàn)性。imid的效能和螢火蟲熒光素酶信號(hào)的相對(duì)降低確認(rèn)期望的應(yīng)答并且產(chǎn)生具有足夠用于篩選的z'值的數(shù)據(jù)(圖3a至3d)。

圖4示出了對(duì)于ikzf12b4細(xì)胞-活性化合物(prestwick收集；圖4a)和nci收集；圖4b)的試驗(yàn)性篩選結(jié)果。

圖5示出了對(duì)于myc5f2細(xì)胞-活性化合物nci收集)的試驗(yàn)性篩選結(jié)果。

圖6確認(rèn)在ikzf12b4和myc5f2細(xì)胞系(圖6a至6c)上測(cè)試命中物。來自市售化合物和來自dtp化合物的概述重復(fù)測(cè)試數(shù)據(jù)在圖6d至6e中示出。

圖7示出了使用蛋白質(zhì)印跡的確認(rèn)數(shù)據(jù)。ikzf12b4細(xì)胞系實(shí)例(圖7a至7b)、myc5f2實(shí)例(圖7c)。

圖8示出了hsp90抑制劑的進(jìn)一步評(píng)估。圖8a表明在用myc-螢火蟲融合蛋白暫時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上的hsp90抑制劑cct018159和格爾德霉素的測(cè)試。圖8b示出了在穩(wěn)定表達(dá)myc-螢火蟲融合蛋白的293ft細(xì)胞上的hsp90抑制劑cct018159和格爾德霉素的測(cè)試。圖8c示出了在穩(wěn)定表達(dá)myc-螢火蟲融合蛋白的5種不同細(xì)胞系上的若干hsp-90抑制劑在各種劑量下的測(cè)試。圖8d比較在暫時(shí)表達(dá)ikzf1-螢火蟲融合蛋白的293ft細(xì)胞上的所述hsp90抑制劑biib021和泊馬度胺。

圖9示出了iccb篩選結(jié)果的概貌圖。具體地說，它示出了用于ikzf1iccb篩選的最佳挑選重復(fù)試驗(yàn)。

圖10示出了比較ikzf1對(duì)myc細(xì)胞系的活性。測(cè)試在ikzf1和myc細(xì)胞系中的133種最佳挑選。

圖11示出了在16小時(shí)對(duì)于hsp90抑制劑：biib021(圖11a)和pf-04929113(圖11b)的較好劑量應(yīng)答。

圖12示出了在包含環(huán)己酰胺未標(biāo)記的熒光素酶(圖12a)和環(huán)己酰胺標(biāo)記的熒光素酶(圖12b)的7種myc細(xì)胞系上的環(huán)己酰胺時(shí)程。

圖13示出了在包含mg-132標(biāo)記的熒光素酶(圖13a)和mg-132未標(biāo)記的熒光素酶(圖13b)的7種myc細(xì)胞系上的mg132時(shí)程。

圖14示出了在包含mln4924標(biāo)記的熒光素酶(圖14a)和mln4924未標(biāo)記的熒光素酶(圖14b)的7種myc細(xì)胞系上的mln4924時(shí)程。

圖15示出了在用針對(duì)mycmrna的sirna處理48小時(shí)的myc阻斷基因表現(xiàn)之后的a549-myc-螢火蟲和h1299-myc-螢火蟲蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)。如通過具有myc和螢火蟲導(dǎo)入抗體的蛋白質(zhì)印跡觀察，融合蛋白的降低(圖15a)與熒光素酶信號(hào)的降低(圖15b)比較。myc抗體還檢測(cè)內(nèi)源性myc的降低。

圖16示出了來自針對(duì)包含表達(dá)myc-螢火蟲的a549(圖16a)、h1299(圖16b)和hek293t(圖16c)細(xì)胞和表達(dá)myc-nanoluc的u2os(圖16d)細(xì)胞的dub酶家族的sirna的商業(yè)文庫的篩選結(jié)果。

具體實(shí)施方式

在一些方面，本公開基于可用于在特異性擾動(dòng)之后有效監(jiān)測(cè)數(shù)千蛋白的穩(wěn)定性的所述質(zhì)粒的開發(fā)。所述質(zhì)粒允許兩種報(bào)道基因蛋白的所述共表達(dá)，其中的每種處于ires的控制下。以此方式，兩種報(bào)道基因一起被轉(zhuǎn)錄(即由相同mrna編碼)并且兩者均使用ires翻譯。這將由差異地影響ires依賴性與ires獨(dú)立性翻譯的擾動(dòng)(例如化合物)引起的所述兩種報(bào)道基因的比率的偽改變的問題最小化，并且因此將假陽性最小化。

根據(jù)一些方面，本公開提供一種識(shí)別使所關(guān)注蛋白穩(wěn)定或使其不穩(wěn)定的測(cè)試化合物的方法。所述方法包括

(i)使包括dna質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸，其中所述質(zhì)粒包括以可操作連接的

(a)啟動(dòng)子，

(b)第一內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)；

(c)編碼第一報(bào)道基因蛋白的核苷酸序列；

(d)第二ires；以及

(e)編碼第二報(bào)道基因蛋白的核苷酸序列，

其中開放閱讀框(orf)融合到編碼第一報(bào)道基因蛋白的所述核苷酸序列或融合到編碼第二報(bào)道基因蛋白的所述核苷酸序列，并且其中所述開放閱讀框編碼所關(guān)注蛋白；

(ii)在所述測(cè)試化合物的存在和不存在所述測(cè)試化合物下確定融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)與未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)的比率；以及

(iii)當(dāng)在所述測(cè)試化合物存在下融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)與未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率與在不存在所述測(cè)試化合物的情況下融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)與未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率相比增加時(shí)，將所述測(cè)試化合物識(shí)別作為穩(wěn)定劑，而當(dāng)在所述測(cè)試化合物存在下融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)與未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率與在不存在所述測(cè)試化合物的情況下融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)與未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)的比率相比降低時(shí)，將所述測(cè)試化合物識(shí)別為去穩(wěn)定劑。

如本文所用，“可操作連接”是指在兩種核酸序列，如轉(zhuǎn)錄控制元件(例如啟動(dòng)子)和連接的經(jīng)轉(zhuǎn)錄序列之間的功能連接。因此，啟動(dòng)子如果可調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，那么它與基因處于可操作連接中。

如本文所使用，“啟動(dòng)子”通常含有提供用于rna聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)和用于發(fā)生轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子的特異性dna序列(響應(yīng)性元件)。在一些實(shí)施例中，啟動(dòng)子為真核啟動(dòng)子或合成啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的實(shí)例包含但不限于tata盒、來自猿猴病毒40的sv40晚期啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子、泛素c啟動(dòng)子(ubc啟動(dòng)子)和t7啟動(dòng)子。這些和其它啟動(dòng)子序列是在本領(lǐng)域中是眾所周知的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，啟動(dòng)子為cmv啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，啟動(dòng)子為ubc啟動(dòng)子。

如本文所用，“內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)”或“ires”為調(diào)節(jié)在rna分子上的核糖體的內(nèi)部進(jìn)入并且由此調(diào)節(jié)在真核系統(tǒng)中的翻譯的順式作用核酸元件。在本發(fā)明的所述方法和組合物中，第一與第二ires元件包含于所述質(zhì)粒中。所述第一和第二ires元件允許獨(dú)立翻譯編碼報(bào)道基因蛋白的核苷酸序列并且開放閱讀框融合到編碼來自單個(gè)信使rna的另一報(bào)道基因蛋白的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述第一和第二ires相同(即，它們具有相同序列)。在一些實(shí)施例中，所述第一和第二ires是不相同的(即，它們不具有相同序列)。

許多ires元件已經(jīng)在病毒和真核基因組兩者中識(shí)別。此外，也已開發(fā)合成ires元件。例如，ires元件已經(jīng)發(fā)現(xiàn)于多種病毒中，包含以下病毒屬的成員：腸病毒屬(例如人類脊髓灰質(zhì)炎病毒1(石井(ishii)等人(1998)《病毒學(xué)雜志(jvirol.)》72：2398-405和白(shiroki)等人(1997)《病毒學(xué)雜志》77：1-8)、人類b型柯薩奇病毒)；鼻病毒(例如人類鼻病毒)；肝病毒(a型肝炎病毒)；心病毒屬(腦心肌炎病毒ecmv(基因庫寄存編號(hào)ab041927的核苷酸2137-2752和金(kim)等人(1992)《分子細(xì)胞生物學(xué)(molcellbiology)》72：3636-43)和泰勒腦脊髓炎病毒(etheirler'sencephalomyelitisvirus))；口蹄疫病毒屬(口蹄疫病毒(基因庫寄存編號(hào)af308157的核苷酸600-1058；貝爾斯罕(belsham)等人(1990)《歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)(embo)》77：1105-10；貝利(poyry)等人(2001)rna7：647-60；以及斯通利(stoneley)等人(2000)《核酸研究(nucleicacidresearch)》25：687-94)，a型馬鼻炎病毒、馬b型鼻炎)；瘟病毒屬(例如牛病毒腹瀉病毒(普爾(poole)等人(1995)《病毒學(xué)(virology)》206：150-154)和典型豬瘟病毒(萊茵布蘭(rijnbrand)等人(1997)《病毒學(xué)雜志》77：451-7)；丙型肝炎病毒屬(例如c型肝炎病毒(冢山-小原(tsukiyama-kohara)等人(1992)《病毒學(xué)雜志》66：1476-1483，萊蒙(lemon)等人(1997)《病毒學(xué)研討會(huì)(semin.virol.)》5：274-288，和基因庫登錄號(hào)aj242654的核苷酸1201-1812)和gb病毒b)。這些參考文獻(xiàn)中的每個(gè)均以引用方式并入本文中。

ires元件也已在來自逆轉(zhuǎn)錄病毒科的病毒中發(fā)現(xiàn)，其包含慢病毒科的成員(例如猿猴免疫缺乏病毒(奧爾曼(ohlmann)等人(2000)《生物化學(xué)雜志(journalofbiologicalchemistry)》275:11899-906)和人類免疫缺陷病毒1(巴克(buck)等人(2001)《病毒學(xué)雜志》75:181-91)；blv-htlv逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如人類t親淋巴病毒1型(阿塔爾(attal)等人(1996)《eees快報(bào)(eeesletters)》392：220-4)；以及哺乳動(dòng)物c型逆轉(zhuǎn)錄病毒家族(例如莫洛尼鼠白血病病毒(moloneymurineleukemiavirus)(瓦格納(vagner)等人(1995)《生物化學(xué)雜志(j.biol.chem)》270：20316-83)，弗云德鼠白血病病毒(friendmurineleukemiavirus)、哈維鼠肉瘤病毒(harveymurinesarcomavirus)，禽類網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒(洛佩茲-拉斯特拉(lopez-lastra)等人(1997)《人類基因療法》5:1855-65)，鼠白血病病毒(環(huán)境rna)(迪福德(deffaud)等人(2000)《病毒學(xué)雜志》74:846-50)，勞斯氏肉瘤病毒(roussarcomavirus)(迪福德等人(2000)《病毒學(xué)雜志》74:11581-8)。這些參考文獻(xiàn)中的每個(gè)均以引用方式并入本文中。

真核mrna還含有ires元件，其包含例如bip(馬切亞克(macejak)等人(1991)《自然(nature)》355：91)；果蠅的觸角控制基因(外顯子d和e)(奧(oh)等人(1992)《基因和發(fā)展(genesanddevelopment)》6：1643-1653；c-myc；以及細(xì)胞凋亡的x鏈抑制劑(xiap)基因(美國專利第6,171,821號(hào))。

已經(jīng)產(chǎn)生各種合成ires元件。參見例如格雷戈里(degregorio)等人(1999)《歐洲分子生物學(xué)雜志(emboj.)》75：4865-74；歐文斯(owens)等人(2001)《美國國家科學(xué)院院刊(pnas)》4：1471-6；以及文卡特桑(venkatesan)等人(2001)《分子和細(xì)胞生物學(xué)(molecularandcellularbiology)》21：2826-37。對(duì)于本領(lǐng)域中已知的另外的ires元件參見例如rangueil.inserm.fr/iresdatabase。

在具體實(shí)施例中，ires序列來源于腦心肌炎病毒(ecmv)。

如本文所用，報(bào)道基因蛋白為當(dāng)表達(dá)時(shí)可例如經(jīng)由其熒光或酶活性特異性地檢測(cè)(即，當(dāng)表達(dá)時(shí)具有可檢測(cè)信號(hào))的任何蛋白。所述質(zhì)粒包括編碼第一報(bào)道基因蛋白的核苷酸序列和編碼第二報(bào)道基因蛋白的核苷酸序列。開放閱讀框融合到編碼第一報(bào)道基因蛋白的所述核苷酸序列或融合到編碼第二報(bào)道基因蛋白的所述核苷酸序列任一者。在一些實(shí)施例中，所述開放閱讀框融合到編碼第一報(bào)道基因蛋白的所述核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，所述開放閱讀框融合到編碼第二報(bào)道基因蛋白的所述核苷酸序列。這允許人們研究響應(yīng)于不同刺激的所述連接開放閱讀框的所述表達(dá)。如本文所用，“融合”旨在意指由所述orf編碼的所述氨基酸和所述報(bào)道基因蛋白通過肽鍵接合以產(chǎn)生連續(xù)的蛋白序列。因此，融合到所述開放閱讀框的所述報(bào)道基因蛋白充當(dāng)所述融合的開放閱讀框的穩(wěn)定性的標(biāo)記。未融合到所述開放閱讀框的其它報(bào)道基因蛋白(并且因此不產(chǎn)生具有由所述orf編碼的所述氨基酸的連續(xù)蛋白序列)充當(dāng)歸一化細(xì)胞數(shù)量和表達(dá)變化的內(nèi)部對(duì)照。

通常，所述第一和第二報(bào)道基因蛋白具有可區(qū)分的可檢測(cè)報(bào)道基因信號(hào)。例如，所述第一和第二報(bào)道基因蛋白為具有由其產(chǎn)物產(chǎn)生的可區(qū)分的信號(hào)的酶蛋白。在一些實(shí)施例中，所述第一和第二報(bào)道基因蛋白為發(fā)射不同波長的光和/或利用不同底物的生物發(fā)光蛋白。另選地，所述第一和第二報(bào)道基因蛋白為在不同波長下發(fā)熒光的熒光蛋白。

可使用本領(lǐng)域中已知的許多報(bào)道基因蛋白，其包含但不限于生物發(fā)光蛋白、熒光報(bào)道基因蛋白和酶蛋白，如產(chǎn)生特異性可檢測(cè)產(chǎn)物的β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶和堿性磷酸酶。所述熒光報(bào)道基因蛋白包含例如綠色熒光蛋白(gfp)、青色熒光蛋白(cfp)、紅色熒光蛋白(rfp)和黃色熒光蛋白(yfp)以及其改性的形式，例如增強(qiáng)的gfp(egfp)、增強(qiáng)的cfp(ecfp)、增強(qiáng)的rfp(erfp)、mcherry和增強(qiáng)的yep(eyep)。

生物發(fā)光蛋白如熒光素酶的實(shí)例，包含但不限于海腎熒光素酶(rluc)、螢火蟲熒光素酶(fluc)和nanoluc，在本領(lǐng)域中是已知的(參見例如范(fan),f.和伍德(wood),k.《測(cè)定和藥物發(fā)展技術(shù)(assayanddrugdevelopmenttechnologies)》v5#1(2007)；古普塔(gupta),r.等人《自然方法(naturemethods)》v8#10(2011)；nano-熒光素酶分析系統(tǒng)(普洛麥格(promega))和en.wikipedia.org/wiki/bioluminescence。

報(bào)導(dǎo)報(bào)道基因蛋白的其它非限制性實(shí)例在下文示出：

物質(zhì)特異性熒光素酶特異性、所需輔因子和物理特性。

在一些實(shí)施例中，所述第一和第二報(bào)道基因蛋白選自由海腎熒光素酶(rluc)、螢火蟲熒光素酶(fluc)和nanoluc組成的所述群組。在一些實(shí)施例中，所述第一和第二報(bào)道基因蛋白選自由綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白組成的所述群組。

開放閱讀框融合到編碼第一報(bào)道基因蛋白的所述核苷酸序列或融合到編碼第二報(bào)道基因蛋白的所述核苷酸序列任一者。所述開放閱讀框融合到所述核苷酸序列的5'或3'末端。如本文所用，開放閱讀框或orf是指編碼氨基酸的連續(xù)序列的核苷酸序列。翻譯的開放閱讀框可為編碼蛋白或所關(guān)注的多肽的基因的全部或一部分。

所述質(zhì)粒的所述orf編碼所關(guān)注蛋白。如本文所用，“所關(guān)注蛋白”可為可被關(guān)注的任何可想象的多肽或蛋白，以便研究或以其它方式表征。在一些實(shí)施例中，所述orf可來源于生物體的orfeome。完全orfeome含有編碼給定生物體的所有蛋白的核酸。完整的orfeome的代表性分?jǐn)?shù)為至少60％的由所述生物體表達(dá)的所有蛋白。在一些實(shí)施例中，所述生物體為哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物為人類。

在一些實(shí)施例中，所關(guān)注的所述蛋白為人類多肽或蛋白。在一些實(shí)施例中，所關(guān)注的所述蛋白為癌蛋白，如但不限于ras、myc、src、fos、jun、myb、abl、bcl2、hox11、hox11l2、tal1/scl、lmol、lm02、egfr、mycn、mdm2、cdk4、gli1、igf2、egfr、flt3-itd、tp53、pax3、pax7、bcr/abl、her2neu、flt3r、flt3-itd、tan1、b-raf、e2a-pbx1，和npm-alk，以及pax和fkhr基因家族的成員的融合、wnt、myc、erkegfr、fgfr3、cdh5、kit、ret、干擾素調(diào)節(jié)因子4(irf4)和trk。其它示范性致癌基因?yàn)楸绢I(lǐng)域中眾所周知的并且若干此些實(shí)例描述于例如《人類癌癥的基因基礎(chǔ)(thegeneticbasisofhumancancer)》(沃格斯坦(vogelstein),b.和凱澤(kinzler),k.w.編，麥格勞希爾集團(tuán)(mcgraw-hill)，紐約(newyork,n.y.)，1998)。

在一些實(shí)施例中，所關(guān)注的所述蛋白為轉(zhuǎn)錄因子。此些轉(zhuǎn)錄因子的一些實(shí)例包含但不限于所述stat家族(stat1、2、3、4、5a、5b和6)、fos/jun、nfκb、hiv-tat和所述e2f家族。在一些實(shí)施例中，所關(guān)注的所述蛋白為ikaros家族鋅指蛋白。在一些實(shí)施例中，所關(guān)注的所述蛋白為ikzf1、ikzf2、ikzf3、ikzf4或ikzf5。在一些實(shí)施例中，所關(guān)注的所述蛋白為ikzf1或ikzf3。

編碼報(bào)道基因蛋白的所述核苷酸序列和所述融合的orf“在框內(nèi)”，即，包括編碼所述報(bào)道基因蛋白的所述核苷酸序列的單個(gè)多核苷酸的連續(xù)三聯(lián)體密碼子，并且所述融合的開放閱讀框編碼單個(gè)連續(xù)的氨基酸序列。

本文所描述的方法允許人們篩選化合物的文庫和識(shí)別使所關(guān)注蛋白穩(wěn)定或使其不穩(wěn)定的測(cè)試化合物?；衔镂膸鞛橥ǔＳ糜诟咄亢Y選的存儲(chǔ)化合物的收集。所述文庫化合物可包含(例如)合成的有機(jī)分子、天然存在的有機(jī)分子、肽、多肽、核酸分子和其組分?；衔镂膸斓膶?shí)例包含但不限于screen-化合物文庫(enzo生命科學(xué)(enzolifesciences))，express-pick收集和core文庫(化學(xué)橋(chembridge))，《國家癌癥研究所文庫(nationalcancerinstitutelibrary)》，prestwickchemical和tocriscreen化合物文庫匯集(tocriscreencompoundlibrarycollections)。

本文所述的質(zhì)?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何可用的技術(shù)引入到所述宿主細(xì)胞。例如，所述質(zhì)?？赏ㄟ^脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、deae聚葡萄糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、聲致穿孔、感染和光學(xué)轉(zhuǎn)染引入到所述宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞包含但不限于細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌、枯草桿菌和鼠傷寒沙門氏菌)、酵母細(xì)胞(例如釀酒酵母和粟酒裂殖酵母)、植物細(xì)胞(例如煙草和陸地棉)，和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如cho細(xì)胞，和3t3成纖維細(xì)胞、hek293細(xì)胞、u-2os細(xì)胞)。

在一些實(shí)施例中，使用本文所述的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸包括在存在所述測(cè)試化合物的情況下使所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下生長適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。合適的培養(yǎng)條件(包含所述培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間)將根據(jù)所培養(yǎng)的所述細(xì)胞變化。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地通過以下標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議確定所述培養(yǎng)條件，如《微生物學(xué)(microbiology)》學(xué)術(shù)出版社公司(academicpressinc.)中的系列方法所描述。通常，所述細(xì)胞培養(yǎng)基可含有以適當(dāng)量和組合的以下營養(yǎng)物中的任一種：(一或多種)鹽、(一或多種)緩沖液、氨基酸、葡萄糖或其它(一或多種)糖、抗生素、血清或血清替代物，和其它組分如但不限于肽生長因子、輔因子和微量元素。在一些實(shí)施例中，所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞在所述化合物存在下生長15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、10小時(shí)、12小時(shí)、14小時(shí)、16小時(shí)、18小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)、30小時(shí)、48小時(shí)或72小時(shí)。

在一些實(shí)施例中，單個(gè)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞基于對(duì)對(duì)照測(cè)試化合物的優(yōu)化的應(yīng)答首先分離、克隆并且擴(kuò)增并且經(jīng)確認(rèn)以提供hts活動(dòng)所需要的足夠低的誤差。通過確定所關(guān)注的所述融合的報(bào)道基因蛋白相對(duì)于具有用于高通量篩選所需要的必需應(yīng)答穩(wěn)定性和再現(xiàn)性的所述未融合報(bào)道基因的所述應(yīng)答來幫助選擇適當(dāng)?shù)目寺　Ｍㄟ^另外將所述融合的報(bào)道基因信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化為所述對(duì)照未融合的報(bào)道基因來幫助識(shí)別有用的克隆，這可顯著地降低相對(duì)于測(cè)量單獨(dú)來自所述融合的報(bào)道基因的所述應(yīng)答的所述固有誤差。這種誤差降低對(duì)于對(duì)測(cè)試化合物(所述測(cè)試化合物具有相對(duì)于從治療和未經(jīng)治療樣品觀察的相應(yīng)的信號(hào)獲得的所述應(yīng)答誤差的足夠大的應(yīng)答)對(duì)應(yīng)的有用克隆細(xì)胞系的識(shí)別很重要，以便提供足夠用于高通量篩選的z因子。(en.wikipedia.org/wiki/z-factor)。

“融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)”是指由融合到所述orf的所述核苷酸序列編碼的所述報(bào)道基因蛋白的所述可檢測(cè)信號(hào)。如本文所用，“未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)”是指由未融合到所述orf的所述核苷酸序列編碼的所述報(bào)道基因蛋白的所述可檢測(cè)信號(hào)。在所述測(cè)試化合物的存在和不存在所述測(cè)試化合物下使用本領(lǐng)域中已知的方法確定所述融合的和未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)?？墒褂玫臋z測(cè)器如(但不限于)光度計(jì)、分光光度計(jì)和熒光計(jì)，或可檢測(cè)報(bào)道基因蛋白活性的改變的任何其它裝置。可使用本領(lǐng)域中已知的使得來自單個(gè)樣品中的兩種報(bào)道基因的穩(wěn)定報(bào)道基因信號(hào)的定量的測(cè)定系統(tǒng)。實(shí)例包含但不限于依次測(cè)量來自單個(gè)樣品的螢火蟲和海腎熒光素酶的活性的dual-熒光素酶分析系統(tǒng)(普洛麥格)。

在檢測(cè)由所述報(bào)道基因蛋白產(chǎn)生的信號(hào)之后，在所述測(cè)試化合物存在下所述融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)與未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率與在不存在所述測(cè)試化合物的情況下所述融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)與未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率相比。與在不存在所述測(cè)試化合物的情況下融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)與未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率相比，當(dāng)在所述測(cè)試化合物存在下融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)與未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率增加時(shí)，將所述測(cè)試化合物識(shí)別為所關(guān)注的所述蛋白的穩(wěn)定劑。相比之下，與在不存在所述測(cè)試化合物的情況下融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)與未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率相比，當(dāng)在所述測(cè)試化合物存在下融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)與未融合的報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率降低時(shí)，將測(cè)試化合物識(shí)別為所關(guān)注的所述蛋白的去穩(wěn)定劑。

在一些實(shí)施例中，所述開放閱讀框融合到編碼第一報(bào)道基因蛋白的所述核苷酸序列。在此類實(shí)施例中，在存在和不存在所述化合物下確定第一報(bào)道基因蛋白信號(hào)與第二報(bào)道基因蛋白信號(hào)的比率。與在不存在所述測(cè)試化合物的情況下第一報(bào)道基因蛋白信號(hào)與第二報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率相比，當(dāng)在所述測(cè)試化合物存在下所述第一報(bào)道基因蛋白信號(hào)與第二報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率增加時(shí)，將所述測(cè)試化合物識(shí)別為穩(wěn)定劑。與在不存在所述測(cè)試化合物的情況下第一報(bào)道基因蛋白信號(hào)與第二報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率相比，當(dāng)在所述測(cè)試化合物存在下第一報(bào)道基因蛋白信號(hào)與第二報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率降低時(shí)，將所述測(cè)試化合物識(shí)別為去穩(wěn)定劑。

在一些實(shí)施例中，所述開放閱讀框融合到編碼第二報(bào)道基因蛋白的所述核苷酸序列。在此些實(shí)施例中，在存在和不存在所述化合物下確定第二報(bào)道基因蛋白信號(hào)與第一報(bào)道基因蛋白信號(hào)的比率。與在不存在所述測(cè)試化合物的情況下第二報(bào)道基因蛋白信號(hào)與第一報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率相比，當(dāng)在存在所述測(cè)試化合物下所述第二報(bào)道基因蛋白信號(hào)與第一報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率增加時(shí)，將所述測(cè)試化合物識(shí)別為穩(wěn)定劑。與在不存在所述測(cè)試化合物的情況下第二報(bào)道基因蛋白信號(hào)與第一報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率相比，當(dāng)在所述測(cè)試化合物存在下第二報(bào)道基因蛋白信號(hào)與第一報(bào)道基因蛋白信號(hào)的所述比率降低時(shí)，將所述測(cè)試化合物識(shí)別為去穩(wěn)定劑。

通過以下實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明，所述實(shí)例決不應(yīng)理解為進(jìn)一步限制。在整個(gè)本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)(包含文獻(xiàn)參考、授予的專利、公開的專利申請(qǐng)以及共同待決專利申請(qǐng))的全部內(nèi)容特此以引用的方式明確地并入。

實(shí)例

實(shí)例1

pirigf構(gòu)建體在293ft和hela細(xì)胞中表達(dá)(圖1a至1c)并且pug-firp構(gòu)建體在u-2os細(xì)胞中表達(dá)(圖1d)。測(cè)試若干不同形式的哺乳動(dòng)物和慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建體的產(chǎn)生表達(dá)標(biāo)記的靶蛋白(例如螢火蟲或nanoluc標(biāo)簽)和共表達(dá)報(bào)道基因熒光素酶(例如海腎或螢火蟲)的細(xì)胞(例如293ft、hela或u-2os細(xì)胞)的能力。

293ft和hela細(xì)胞用ikzf1-螢火蟲、ikzf3-螢火蟲和myc-螢火蟲融合蛋白轉(zhuǎn)染并且分別使用嘌呤霉素和遺傳霉素選擇。這些集合體非常不穩(wěn)定并且在10到30天中丟失信號(hào)并且通常對(duì)imid具有極小應(yīng)答(圖2a至2c)。因此，使用有限的克隆策略在96孔板中分離單個(gè)克隆。存活的細(xì)胞被分離為菌落，進(jìn)一步擴(kuò)增并且測(cè)試熒光素酶信號(hào)和對(duì)imid的應(yīng)答?？寺?b4被識(shí)別為對(duì)來那度胺的強(qiáng)應(yīng)答者。hela細(xì)胞表達(dá)非常低水平的熒光素酶，這使hela克隆的分離非常困難。通過對(duì)螢火蟲、ikzf1和myc的蛋白質(zhì)印跡的檢測(cè)確認(rèn)所述融合蛋白的表達(dá)和與螢火蟲熒光素酶信號(hào)相關(guān)的相對(duì)表達(dá)(圖2d)。

表達(dá)所述指定螢火蟲融合蛋白的細(xì)胞系克隆(ikzf1-2b4、ikzf1-2b11、myc-1c3和myc-5f2)在用于再現(xiàn)性的所述dual-glo測(cè)定中評(píng)估。imid的效能和螢火蟲熒光素酶信號(hào)的相對(duì)降低確認(rèn)期望的應(yīng)答并且產(chǎn)生具有足夠用于篩選的z'值的數(shù)據(jù)(圖3a至3d)。

在圖4a和4b中示出了對(duì)于ikzf12b4細(xì)胞-活性化合物(prestwick收集和nci收集)的試驗(yàn)性篩選結(jié)果。

在圖5中示出了對(duì)于myc5f2細(xì)胞-活性化合物nci收集的試驗(yàn)性篩選結(jié)果。

證實(shí)在ikzf12b4和myc5f2細(xì)胞系上測(cè)試的命中物(圖6a至6c)。來自市售化合物和來自dtp化合物的概述復(fù)驗(yàn)數(shù)據(jù)在圖6d至6e中示出。

圖7示出了使用蛋白質(zhì)印跡的確認(rèn)數(shù)據(jù)。ikzf12b4細(xì)胞系實(shí)例(圖7a至7b)、myc5f2實(shí)例(圖7c)。

圖8示出了hsp90抑制劑的進(jìn)一步評(píng)估。圖8a表明在用所述myc-螢火蟲融合蛋白暫時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上的hsp90抑制劑cct018159和格爾德霉素的測(cè)試。圖8b示出了在穩(wěn)定表達(dá)myc-螢火蟲融合蛋白的293ft細(xì)胞上的hsp90抑制劑cct018159和格爾德霉素的測(cè)試。圖8c示出了在穩(wěn)定表達(dá)所述myc-螢火蟲融合蛋白的5種不同細(xì)胞系上的若干hsp-90抑制劑在各種劑量下的測(cè)試。圖8d比較在暫時(shí)表達(dá)ikzf1-螢火蟲融合蛋白的293ft細(xì)胞上的所述hsp90抑制劑biib021和泊馬度胺。

實(shí)例2：比較ikzf1對(duì)myc細(xì)胞系的活性

在hms篩選設(shè)施iccb處的篩選活動(dòng)

在iccb處篩選ikzf1的最佳挑選重復(fù)試驗(yàn)(圖9)。44,460種化合物中，篩選的0.6％的化合物具有基于相比于板平均值的大于35％的fluc/rluc降低的命中率。最佳挑選0.3％的化合物重復(fù)81％(108/133)的命中物，相比于dmso對(duì)照具有大于25％的fluc/rluc降低。在兩種細(xì)胞系中大約90％(97/108)被命中。對(duì)于ikzf1對(duì)myc，存在11>25％的活性差異。所有上述結(jié)果為中等或弱命中。

所述iccb最佳挑選ikzf1對(duì)myc選擇性比較的所述結(jié)果示出，在所述ikzf1細(xì)胞系篩選中的大部分命中物在表明非特異性機(jī)制的反向篩選測(cè)定中也有效(圖10)。五種化合物在所述反向篩選中是惰性的，但是仍使ikzf1熒光素酶信號(hào)降低大于35％，這顯示出一些選擇性。

對(duì)于hsp90抑制劑的劑量反應(yīng)

相比于所述反向篩選表達(dá)myc-螢火蟲的293ft細(xì)胞系：表達(dá)myc-螢火蟲的海腎和u2os細(xì)胞系：表明用于ikzf1機(jī)制非選擇性的海腎，兩種hsp90抑制劑，biib021(圖11a)和pf-04929113(圖11b)，在所述293ftikzf1細(xì)胞系中示出類似活性。蛋白水平的阻斷基因表現(xiàn)通過蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)，這表明所述熒光素酶報(bào)道基因系統(tǒng)精確地反映融合蛋白降低。

用于7myc-熒光素酶融合細(xì)胞系的穩(wěn)定性時(shí)程

在用環(huán)己酰胺阻擋所有蛋白合成之后，七種細(xì)胞系用于測(cè)量所述熒光素酶的半衰期。觀察的融合的熒光素酶(myc-螢火蟲和myc-nanoluc；圖12b)兩者的衰減與觀察的所述未融合的熒光素酶(海腎和螢火蟲；圖12a)的所述衰減相比，其使用所述myc-螢火蟲：海腎和myc-nanoluc：螢火蟲細(xì)胞系293t，u2os和所述myc-螢火蟲：海腎細(xì)胞系a549，h1299和ls174t兩者。正如期望，因?yàn)槲礃?biāo)記的海腎含有pest域，所述未標(biāo)記的螢火蟲的所述半衰期(大約4小時(shí))短于所述未標(biāo)記的海腎(大約12小時(shí))的所述半衰期。大約2小時(shí)的mycnanoluc半衰期長于少于1小時(shí)的myc-螢火蟲半衰期并且更接近未標(biāo)記的螢火蟲的所述半衰期。myc-nanoluc和未標(biāo)記螢火蟲的平衡的半衰期應(yīng)降低加工品命中的數(shù)量。

在阻擋用mg132的蛋白酶體后，七種myc-熒光素酶報(bào)道基因細(xì)胞系用于測(cè)量myc熒光素酶表達(dá)的改變。所述未融合的海腎和螢火蟲的所述表達(dá)不變維持約6小時(shí)，但是在18小時(shí)之后降低到在細(xì)胞系中的可變程度(圖13b)。所有細(xì)胞系示出myc熒光素酶融合蛋白增加至少50％，但是具有不同的時(shí)程。所述myc-nanoluc展示熒光素酶信號(hào)增加約4倍，這表明所述這些融合蛋白的較大部分通過蛋白酶體降解(圖13a)。

在用類泛素化修飾抑制劑mln-4924抑制泛素依賴性蛋白分解之后，七種myc熒光素酶報(bào)道基因細(xì)胞系用于量測(cè)myc熒光素酶表達(dá)的改變(圖14a至14b)。除293tmyc-螢火蟲：海腎細(xì)胞系以外，最低限度地影響所述未融合的海腎和螢火蟲的所述表達(dá)。所有細(xì)胞系示出myc熒光素酶融合蛋白增加至少50％，通常在治療6小時(shí)之后達(dá)到峰值。這些結(jié)果確認(rèn)，在所有7種細(xì)胞系中泛素依賴性蛋白分解至少部分造成所述myc融合蛋白的所述穩(wěn)定性。

在simyc阻斷基因表現(xiàn)之后表達(dá)myc螢火蟲的a549和h1299細(xì)胞系

使用針對(duì)于mrcmrna的sirna治療48小時(shí)，sirna用于阻斷基因表現(xiàn)在所述a549和h1299細(xì)胞系中的所述myc螢火蟲熒光素酶融合蛋白。如通過具有myc和螢火蟲導(dǎo)入抗體的蛋白質(zhì)印跡所觀察，融合蛋白質(zhì)的所述降低(圖15a)與熒光素酶信號(hào)的所述降低(圖15b)比較。myc抗體還檢測(cè)內(nèi)源性myc的所述降低。在所述a549細(xì)胞中觀察到顯著的myc-nick帶。

sigenomesirna文庫

圖16a至16d示出了來自針對(duì)具有表達(dá)myc螢火蟲的a549、h1299和hek293t細(xì)胞和表達(dá)myc-nanoluc的u2os細(xì)胞的dub酶家族的市售sirna的文庫的篩選結(jié)果。

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