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發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及aav載體和使用aav載體用于治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法。

發(fā)明概述

肌纖蛋白(myoc)突變導(dǎo)致約2％-4％的原發(fā)性開角型青光眼(poag；～90,000美國患者)。具體而言，青光眼myoc突變p370l或y437h導(dǎo)致10％-30％的幼年型poag(joag；～6,000美國患者)且與增加的眼內(nèi)壓(iop)、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡和視神經(jīng)頭(onh)損傷相關(guān)(shimizu等人(2000)am.j.ophthalmol.130:165-77；fanandwiggs(2010)j.clin.invest.120:3064-72)。

盡管myoc突變與青光眼相關(guān)，myoc突變體對眼部功能的影響仍不清楚。因此，需要進(jìn)一步理解myoc和突變體myoc的功能以揭示用于治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的新型治療性策略。

本發(fā)明提供用于在哺乳動物中治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法，包括對所述哺乳動物的眼部施用在所述哺乳動物的眼中增加wnt信號傳導(dǎo)的作用劑。在一些實施方案中，所述作用劑增加所述哺乳動物眼部的小梁網(wǎng)(tm)細(xì)胞中的wnt信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，所述作用劑增加所述哺乳動物眼中的r-脊椎蛋白1(rspo1)、r-脊椎蛋白2(rspo2)、r-脊椎蛋白3(rspo3)和/或r-脊椎蛋白4(rspo4)活性。在一些實施方案中，所述作用劑與在所述哺乳動物眼中增加一種或多種rspo活性的一種或多種其他作用劑組合使用。在一些實施方案中，所述作用劑增加所述哺乳動物眼部tm中的rspo1。在一些實施方案中，所述作用劑是rspo1或其功能性變體。在一些實施方案中，所述作用劑是重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，其含有編碼rspo1或其功能性變體的載體。在一些實施方案中，rspo1是截短的rspo1。在一些實施方案中，作用劑增加所述哺乳動物眼部tm中的rspo2。在一些實施方案中，所述作用劑是rspo2或其功能性變體。在一些實施方案中，所述作用劑是重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，其包含編碼rspo2或其功能性變體的載體。在一些實施方案中，rspo2是截短的rspo2。在一些實施方案中，所述作用劑增加所述哺乳動物眼部tm中的rspo3。在一些實施方案中，所述作用劑是rspo3或其功能性變體。在一些實施方案中，所述作用劑是重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，其包含編碼rspo3或其功能性變體的載體。在一些實施方案中，rspo3是截短的rspo3。在一些實施方案中，所述作用劑增加所述哺乳動物眼部tm中的rspo4。在一些實施方案中，所述作用劑是rspo4或其功能性變體。在一些實施方案中，所述作用劑是重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，其包含編碼rspo4或其功能性變體的載體。在一些實施方案中，rspo4是截短的rspo4。

一些方面，本發(fā)明提供在所述哺乳動物的眼中施用增加wnt信號傳導(dǎo)的第二作用劑。在一些實施方案中，所述第二作用劑增加所述哺乳動物眼部tm中的wnt信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，所述第二作用劑減少或抑制所述哺乳動物眼中肌纖蛋白(myoc)的表達(dá)。在一些實施方案中，所述第二作用劑減少或抑制所述哺乳動物眼部tm中myoc的表達(dá)。在一些實施方案中，所述第二作用劑是重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，其包含編碼靶向myoc的表達(dá)的抑制性核酸的載體。在一些實施方案中，抑制性核酸是靶向myoc的表達(dá)的myocrnai。在一些實施方案中，myocrnai是靶向myoc的表達(dá)的myocshrna。

一些方面，本發(fā)明的作用劑減少或抑制所述哺乳動物眼中肌纖蛋白(myoc)的表達(dá)。在一些實施方案中，所述作用劑減少或抑制所述哺乳動物眼部tm中myoc的表達(dá)。在一些實施方案中，所述作用劑是重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，其包含編碼靶向myoc的表達(dá)的抑制性核酸的載體。在一些實施方案中，抑制性核酸是靶向myoc的表達(dá)的myocrnai。在其他實施方案中，myocrnai是靶向myoc的表達(dá)的myocshrna。

在本發(fā)明的一些實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在所述哺乳動物的眼中施用增加wnt信號傳導(dǎo)的第二作用劑。在一些實施方案中，所述第二作用劑增加所述哺乳動物眼部tm中的wnt信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，所述第二作用劑增加所述哺乳動物眼中r-脊椎蛋白1(rspo1)、r-脊椎蛋白2(rspo2)、r-脊椎蛋白3(rspo3)或r-脊椎蛋白4(rspo4)的活性。在一些實施方案中，所述第二作用劑增加所述哺乳動物眼部tm中的rspo1。在一些實施方案中，所述第二作用劑是rspo1或其功能性變體。在一些實施方案中，所述第二作用劑是重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，其包含編碼rspo1或其功能性變體的載體。在一些實施方案中，rspo1是截短的rspo1。在一些實施方案中，所述第二作用劑增加所述哺乳動物眼部tm中的rspo2。在一些實施方案中，所述第二作用劑是rspo2或其功能性變體。在一些實施方案中，所述第二作用劑是重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，其包含編碼rspo2或其功能性變體的載體。在一些實施方案中，rspo2是截短的rspo2。在一些實施方案中，所述第二作用劑增加所述哺乳動物眼部tm中的rspo3。在一些實施方案中，所述第二作用劑是rspo3或其功能性變體。在一些實施方案中，所述第二作用劑是重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，其包含編碼rspo3或其功能性變體的載體。在一些實施方案中，rspo3是截短的rspo3。在一些實施方案中，所述第二作用劑增加所述哺乳動物眼部tm中的rspo4。在一些實施方案中，所述第二作用劑是rspo4或其功能性變體。在一些實施方案中，所述第二作用劑是重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，其包含編碼rspo4或其功能性變體的載體。在一些實施方案中，rspo4是截短的rspo4。

一些方面，本發(fā)明提供用于在哺乳動物中治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法，包括對所述哺乳動物的眼部施用重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，所述顆粒包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的載體。一些方面，本發(fā)明提供在哺乳動物中用于治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法，包括對所述哺乳動物眼部施用重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，所述顆粒包含編碼靶向所述哺乳動物中肌纖蛋白(myoc)的表達(dá)的myocrnai的載體。其他方面，本發(fā)明提供在哺乳動物中用于治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法，包括對所述哺乳動物的眼部施用增加所述哺乳動物眼中wnt信號傳導(dǎo)的作用劑和減少或抑制所述哺乳動物中肌纖蛋白的表達(dá)的作用劑。其他方面，本發(fā)明提供在哺乳動物中用于治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法，包括對所述哺乳動物的眼部施用包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的載體的重組腺伴隨病毒(raav)顆粒和包含編碼靶向所述哺乳動物中肌纖蛋白的表達(dá)的myocrnai的載體的raav顆粒。另一方面，本發(fā)明提供在哺乳動物中用于治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法，包括對所述哺乳動物的眼部施用重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，所述顆粒包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體和編碼靶向所述哺乳動物中肌纖蛋白的表達(dá)的myocshrna(myocshrna)的載體。在一些實施方案中，rnai是靶向myoc的shrna。在一些實施方案中，shrna減少或抑制myoc的表達(dá)。

一些方面，本發(fā)明提供用于在具有眼部病癥的哺乳動物的小梁網(wǎng)細(xì)胞中增強(qiáng)wnt信號傳導(dǎo)的方法，包括對所述哺乳動物的眼部施用重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，所述顆粒包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的載體。一些方面，本發(fā)明提供用于在具有眼部病癥的哺乳動物小梁網(wǎng)細(xì)胞中增強(qiáng)wnt信號傳導(dǎo)的方法，包括對所述哺乳動物的眼部施用重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，所述顆粒包含編碼靶向所述哺乳動物中肌纖蛋白(myoc)的表達(dá)的抑制性核酸的載體。其他方面，本發(fā)明提供用于在具有眼部病癥的哺乳動物的小梁網(wǎng)細(xì)胞中增強(qiáng)wnt信號傳導(dǎo)的方法，包括對所述哺乳動物的眼部施用重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，所述顆粒包含編碼靶向所述哺乳動物中肌纖蛋白(myoc)的表達(dá)的myocrnai的載體。其他方面，本發(fā)明提供用于在具有眼部病癥的哺乳動物的小梁網(wǎng)細(xì)胞中增強(qiáng)wnt信號傳導(dǎo)的方法，包括對所述哺乳動物的眼部施用包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的載體的重組腺伴隨病毒(raav)顆粒和包含編碼靶向所述哺乳動物中肌纖蛋白的表達(dá)的myocrnai的載體的raav顆粒。其他方面，本發(fā)明提供用于在具有眼部病癥的哺乳動物中增強(qiáng)小梁網(wǎng)細(xì)胞中的wnt信號傳導(dǎo)的方法，包括對所述哺乳動物的眼部施用重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，所述顆粒包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體和編碼靶向所述哺乳動物中肌纖蛋白的表達(dá)的myocrnai的載體。在一些實施方案中，所述眼部病癥是肌纖蛋白(myoc)青光眼。

在一些實施方案中，所述哺乳動物是人。在本發(fā)明的一些實施方案中，肌纖蛋白(myoc)青光眼與肌纖蛋白中的突變相關(guān)。在一些實施方案中，肌纖蛋白(myoc)青光眼與人肌纖蛋白中的突變相關(guān)。在一些實施方案中，肌纖蛋白突變包含選自以下的一個或多個氨基酸取代：e323k、k398r、q368x、g364v、p370l、d380a、k423e、y437h和i477s。在一些實施方案中，肌纖蛋白突變包含p370l氨基酸取代。在一些實施方案中，肌纖蛋白突變包含y437h氨基酸取代。在一些實施方案中，肌纖蛋白(myoc)青光眼是原發(fā)性開角型青光眼(poac)。在一些實施方案中，肌纖蛋白(myoc)青光眼是幼年型原發(fā)性開角型青光眼(joac)。在本發(fā)明的一些實施方案中，治療減少肌纖蛋白(myoc)青光眼的癥狀。在一些實施方案中，減少肌纖蛋白(myoc)青光眼的癥狀是減少眼內(nèi)壓、減少小梁網(wǎng)中myoc的積累、減少眼高壓或增加來自小梁網(wǎng)的房水外流。

在一些實施方案中，rspo1是人rspo1。在一些實施方案中，rspo1與人rspo1具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo1包含seqidno:8的氨基酸序列。在一些實施方案中，rspo1與seqidno:8具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo1包含seqidno:11的氨基酸序列。在一些實施方案中，rspo1與seqidno:11具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo1包含seqidno:12的氨基酸序列。在一些實施方案中，rspo1與seqidno:12具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo2是人rspo2。在一些實施方案中，rspo2與人rspo2具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo2包含seqidno:9的氨基酸序列。在一些實施方案中，rspo2與seqidno:9具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo2包含seqidno:13的氨基酸序列。在一些實施方案中，rspo2與seqidno:13具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo2包含seqidno:14的氨基酸序列。在一些實施方案中，rspo2與seqidno:14具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo3是人rspo3。在一些實施方案中，rspo3與人rspo3具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo3包含seqidno:1的氨基酸序列。在一些實施方案中，rspo3與seqidno:1具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo3包含seqidno:15的氨基酸序列。在一些實施方案中，rspo3與seqidno:15具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo3包含seqidno:16的氨基酸序列。在一些實施方案中，rspo3包含seqidno:17的氨基酸序列。在一些實施方案中，rspo3與seqidno:17具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo4是人rspo4。在一些實施方案中，rspo4與人rspo4具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo4包含seqidno:10的氨基酸序列。在一些實施方案中，rspo4與seqidno:10具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo4包含seqidno:18的氨基酸序列。在一些實施方案中，rspo4與seqidno:18具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo4包含seqidno:19的氨基酸序列。在一些實施方案中，rspo4與seqidno:12具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo1、rspo2、rspo3、rspo4和/或其功能性變體與啟動子可操作地連接。在一些實施方案中，啟動子能夠在所述哺乳動物的眼中表達(dá)rspo1、rspo2、rspo3、rspo4和/或其功能性變體。在一些實施方案中，啟動子能夠在小梁網(wǎng)的細(xì)胞中表達(dá)rspo1、rspo2、rspo3、rspo4和/或其功能性變體。在一些實施方案中，啟動子是雜交雞β-肌動蛋白(cba)啟動子。

在一些實施方案中，本發(fā)明靶向myoc的表達(dá)的myocrnai靶向人myoc。在一些實施方案中，rnai是小抑制性rna(sirna)、微小rna(mirna)或小發(fā)夾rna(shrna)。在一些實施方案中，myocrnai是myocshrna。在一些實施方案中，shrna靶向seqidno:6所示的myoc的氨基酸序列。在一些實施方案中，shrna包含seqidno:7的環(huán)序列。在一些實施方案中，myocrnai(例如shrna)與啟動子可操作連接。在一些實施方案中，啟動子能夠在所述哺乳動物的眼中表達(dá)myocrnai(例如shrna)。在另一實施方案中，啟動子能夠在小梁網(wǎng)的細(xì)胞中表達(dá)myocrnai(例如shrna)。在一些實施方案中，啟動子是雜交雞β-肌動蛋白(cba)啟動子。在一些實施方案中，啟動子是rna聚合酶iii啟動子。在一些實施方案中，myocrnai(例如shrna)的表達(dá)減少或抑制所述哺乳動物眼中myoc的表達(dá)。在一些實施方案中，myocrnai(例如shrna)的表達(dá)減少或抑制所述哺乳動物小梁網(wǎng)的細(xì)胞中myoc的表達(dá)。在一些實施方案中，myoc是野生型myoc。在一些實施方案中，myoc是突變體myoc。在一些實施方案中，myoc是野生型myoc和突變體myoc。在另一個實施方案中，突變體myoc包含對應(yīng)人myoc的p370l和/或y437h氨基酸取代的氨基酸取代。在一些實施方案中，肌纖蛋白突變包含選自以下的一個或多個氨基酸取代：e323k、k398r、q368x、g364v、p370l、d380a、k423e、y437h和i477s。

在上述方面和實施方案的一些實施方案中，aav病毒顆粒包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6(例如野生型aav6衣殼或變體aav6衣殼如shh10，如u.s.pgpub.2012/0164106中所述)、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9(例如野生型aav9衣殼或修飾的aav9衣殼，如u.s.pgpub.2013/0323226中所述)、aav10、aavrh10、aav11、aav12、酪氨酸衣殼突變體、發(fā)夾結(jié)合衣殼突變體、aav2r471a衣殼、aavaav2/2-7m8衣殼、aavdj衣殼(例如aav-dj/8衣殼、aav-dj/9衣殼或u.s.pgpub.2012/0066783中所述的任何其他衣殼)、aav2n587a衣殼、aav2e548a衣殼、aav2n708a衣殼、aavv708k衣殼、山羊aav衣殼、aav1/aav2嵌合衣殼、牛aav衣殼、小鼠aav衣殼、raav2/hbov1衣殼或美國專利號8,283,151或國際公開號wo/2003/042397中所述的aav衣殼。在一些實施方案中，aav病毒顆粒包含在r484、r487、k527、k532、r585或r588的一個或多個位置含有氨基酸取代的aav衣殼，其基于aav2的vp1編號。在其他實施方案中，aav顆粒包含來自進(jìn)化枝a-f的aav血清型的衣殼蛋白。在一些實施方案中，raav病毒顆粒包含aav血清型2衣殼。在其他實施方案中，aav血清型2衣殼包含含有r471a氨基酸取代的aav2衣殼蛋白，其相對aav2vp1編號。在一些實施方案中，載體包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aavdj、山羊aav、牛aav或小鼠aav血清型反向末端重復(fù)(itr)。在一些實施方案中，載體包括aav血清型2itr。在一些實施方案中，aav病毒顆粒包含源自相同aav血清型的一個或多個itr和衣殼。在其他實施方案中，aav病毒顆粒包含源自與raav病毒顆粒的衣殼不同aav血清型的一個或多個itr。在一些實施方案中，raav病毒顆粒包含aav2衣殼，且其中所述載體包含aav2itr。在其他實施方案中，aav2衣殼包含含有r471a氨基酸取代的aav2衣殼蛋白，其相對aav2vp1編號。

在一些實施方案中，將至少1×10⁹基因組拷貝的raav顆粒施用至哺乳動物。在一些實施方案中，將aav施用至所述哺乳動物眼部的角膜、視網(wǎng)膜和/或鞏膜。在一些實施方案中，aav顆粒通過玻璃體內(nèi)注射和/或房內(nèi)注射施用。在一些實施方案中，將raav施用至眼部多于一處的位置。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供在哺乳動物中治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法，其中所述哺乳動物是人。在一些實施方案中，肌纖蛋白(myoc)青光眼是原發(fā)性開角型青光眼(poac)。在一些實施方案中，肌纖蛋白(myoc)青光眼是幼年型原發(fā)性開角型青光眼(joac)。

在本發(fā)明的一些實施方案中，raav病毒顆粒在藥物組合物中。在其他實施方案中，所述藥物組合物進(jìn)一步包含藥物上可接受的載劑。

在上述方法的一些實施方案中，所述作用劑(例如aav顆粒)與增加r-脊椎蛋白(例如rspo1、rspo2、rspo3和/或rspo4)活性的一種或多種其他作用劑組合使用。

一些方面，本發(fā)明提供含有aav載體的重組aav顆粒，其中所述aav載體包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的核酸。其他方面，本發(fā)明提供raav顆粒，其含有編碼靶向哺乳動物中肌纖蛋白(myoc)表達(dá)的抑制性核酸的載體。其他方面，本發(fā)明提供raav顆粒，其包含編碼靶向哺乳動物中肌纖蛋白(myoc)表達(dá)的myocrnai的載體。其他方面，本發(fā)明提供raav顆粒，其包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體和編碼靶向所述哺乳動物中肌纖蛋白的表達(dá)的myocrnai的載體。

在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo1或其功能性變體的核酸，且所述rspo1或其功能性變體是人rspo1。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo1或其功能性變體的核酸，且所述rspo1或其功能性變體包含seqidno:8、11和/或12的氨基酸序列。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo1或其功能性變體的核酸，且所述rspo1或其功能性變體包含與seqidno:8、11和/或12的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo2或其功能性變體的核酸，且所述rspo2或其功能性變體是人rspo2。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo2或其功能性變體的核酸，且所述rspo2或其功能性變體包含seqidno:9、13和/或14的氨基酸序列。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo2或其功能性變體的核酸，且所述rspo2或其功能性變體包含與seqidno:9、13和/或14的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo3或其功能性變體的核酸，且所述rspo3或其功能性變體是人rspo3。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo3或其功能性變體的核酸，且所述rspo3或其功能性變體包含seqidno:1和/或15-17的氨基酸序列。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo3或其功能性變體的核酸，且所述rspo3或其功能性變體包含與seqidno:1和/或15-17的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo4的核酸，且所述rspo4是人rspo4。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo4或其功能性變體的核酸，且所述rspo4或其功能性變體包含seqidno:10、18和/或19的氨基酸序列。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo4或其功能性變體的核酸，且所述rspo4或其功能性變體包含與seqidno:10、18和/或19的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在其他實施方案中，rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體與啟動子可操作連接。在其他實施方案中，啟動子能夠在所述哺乳動物的眼中表達(dá)rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體。在一些實施方案中，所述啟動子能夠在小梁網(wǎng)的細(xì)胞中表達(dá)rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體。在一些實施方案中，啟動子是雜交雞β-肌動蛋白(cba)啟動子。

在一些實施方案中，靶向哺乳動物中的肌纖蛋白(myoc)表達(dá)的抑制性核酸是rnai。在一些實施方案中，本發(fā)明靶向myoc的表達(dá)的myocrnai(例如shrna)靶向人myoc。在一些實施方案中，rnai是小抑制性rna(sirna)、微小rna(mirna)或小發(fā)夾rna(shrna)。在一些實施方案中，myocrnai是shrna。在一些實施方案中，rnai(例如shrna)靶向seqidno:6中所示的myoc的氨基酸序列。在一些實施方案中，rnai(例如shrna)包含seqidno:7的環(huán)序列。在一些實施方案中，myocrnai(例如shrna)與啟動子可操作連接。在一些實施方案中，啟動子能夠在所述哺乳動物眼中表達(dá)myocrnai(例如shrna)。在其他實施方案中，啟動子能夠在小梁網(wǎng)的細(xì)胞中表達(dá)myocrnai(例如shrna)。在一些實施方案中，啟動子是雜交雞β-肌動蛋白(cba)啟動子。在一些實施方案中，啟動子是rna聚合酶iii啟動子。在一些實施方案中，myocrnai(例如shrna)的表達(dá)減少或抑制所述哺乳動物眼中myoc的表達(dá)。在一些實施方案中，myocrnai(例如shrna)的表達(dá)減少或抑制哺乳動物的小梁網(wǎng)的細(xì)胞中myoc的表達(dá)。在一些實施方案中，myoc是野生型myoc。在一些實施方案中，myoc是突變體myoc。在一些實施方案中，myoc是野生型myoc和突變體myoc。在其他實施方案中，突變體myoc包含對應(yīng)人myoc的e323k、k398r、q368x、g364v、p370l、d380a、k423e、y437h和i477s氨基酸取代的氨基酸取代。在一些實施方案中，突變體myoc包含對應(yīng)人myoc的p370l和/或y437h氨基酸取代的氨基酸取代。在一些實施方案中，肌纖蛋白突變與原發(fā)性開角型青光眼(poac)相關(guān)。在一些實施方案中，肌纖蛋白突變與幼年型原發(fā)性開角型青光眼(joac)相關(guān)。

在上述方面和實施方案的一些實施方案中，aav病毒顆粒包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6(例如野生型aav6衣殼或變體aav6衣殼如shh10，如u.s.pgpub.2012/0164106中所述)、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9(例如野生型aav9衣殼或修飾的aav9衣殼，如u.s.pgpub.2013/0323226中所述)、aav10、aavrh10、aav11、aav12、酪氨酸衣殼突變體、發(fā)夾結(jié)合衣殼突變體、aav2r471a衣殼、aavaav2/2-7m8衣殼、aavdj衣殼(例如aav-dj/8衣殼、aav-dj/9衣殼或u.s.pgpub.2012/0066783中所述的任何其他衣殼)、aav2n587a衣殼、aav2e548a衣殼、aav2n708a衣殼、aavv708k衣殼、山羊aav衣殼、aav1/aav2嵌合衣殼、牛aav衣殼、小鼠aav衣殼、raav2/hbov1衣殼或美國專利號8,283,151或國際公開號wo/2003/042397中所述的aav衣殼。在一些實施方案中，aav病毒顆粒包含在r484、r487、k527、k532、r585或r588的一個或多個位置含有氨基酸取代的aav衣殼，其基于aav2的vp1編號。在其他實施方案中，aav顆粒包含來自進(jìn)化枝a-f的aav血清型的衣殼蛋白。在一些實施方案中，raav病毒顆粒包含aav血清型2衣殼。在其他實施方案中，aav血清型2衣殼包含含有r471a氨基酸取代的aav2衣殼蛋白，其相對aav2vp1編號。在一些實施方案中，所述載體包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aavdj、山羊aav、牛aav或小鼠aav血清型反向末端重復(fù)(itr)。在一些實施方案中，載體包含aav血清型2itr。在一些實施方案中，aav病毒顆粒包含源自相同aav血清型的一個或多個itr和衣殼。在其他實施方案中，aav病毒顆粒包含源自與raav病毒顆粒的衣殼不同aav血清型的一個或多個itr。在一些實施方案中，raav病毒顆粒包含aav2衣殼，且其中所述載體包含aav2itr。在其他實施方案中，aav2衣殼包含含有r471a氨基酸取代的aav2衣殼蛋白，其相對aav2vp1編號。

本發(fā)明提供含有任何本文所述的重組aav顆粒的藥物組合物。本發(fā)明還提供適用于任何本文所述的方法的藥物組合物。本發(fā)明提供本文所述的藥物組合物和重組aav顆粒在制造用于在哺乳動物中治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的藥物中的用途。在一些實施方案中，所述哺乳動物是人。在一些實施方案中，肌纖蛋白(myoc)青光眼是原發(fā)性開角型青光眼(poac)。在一些實施方案中，肌纖蛋白(myoc)青光眼是幼年型原發(fā)性開角型青光眼(joac)。

一些方面，本發(fā)明提供用于在哺乳動物中治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的試劑盒，其中所述試劑盒包含含有編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的載體的raav病毒顆粒；含有aav載體的raav病毒顆粒，其中所述aav載體包含編碼靶向哺乳動物中肌纖蛋白(myoc)表達(dá)的抑制性核酸(例如，包含myocrnai的shrna)的核酸；和/或包含aav載體的raav病毒顆粒，其中所述aav載體包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體和編碼靶向哺乳動物中myoc的表達(dá)的myocrnai(例如shrna)的核酸。在一些實施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含用于在治療肌纖蛋白(myoc)青光眼中使用的說明。在一些實施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含緩沖液和/或藥物上可接受的賦形劑。

在一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含編碼靶向哺乳動物中myoc表達(dá)的myocrnai(例如shrna)的核酸。在一些實施方案中，myocrnai靶向人myoc的表達(dá)。在一些實施方案中，myocrnai靶向seqidno:6所示的myoc的氨基酸序列。在一些實施方案中，rnai是小抑制性rna(sirna)、微小rna(mirna)或小發(fā)夾rna(shrna)。在一些實施方案中，rnai是shrna。在一些實施方案中，myocshrna包含seqidno:7的環(huán)序列。在一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含aav載體，其中所述aav載體包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的核酸。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo1或其功能性變體的核酸，且rspo1或其功能性變體是人rspo1。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo1或其功能性變體的核酸，且rspo1或其功能性變體包含seqidno:8、11和/或12的氨基酸序列。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo1或其功能性變體的核酸，且rspo1或其功能性變體包含與seqidno:8,11和/或12的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo2或其功能性變體的核酸，且rspo2或其功能性變體是人rspo2。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo2或其功能性變體的核酸，且rspo2或其功能性變體包含seqidno:9、13和/或14的氨基酸序列。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo2或其功能性變體的核酸，且rspo2或其功能性變體包含與seqidno:9、13和/或14的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo3或其功能性變體的核酸，且rspo3或其功能性變體是人rspo3。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo3或其功能性變體的核酸，且rspo3或其功能性變體包含seqidno:1和/或15-17的氨基酸序列。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo3或其功能性變體的核酸，且rspo3或其功能性變體包含與seqidno:1和/或15-17的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo4或其功能性變體的核酸，且rspo4或其功能性變體是人rspo4。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo4或其功能性變體的核酸，且rspo4或其功能性變體包含seqidno:10、18和/或19的氨基酸序列。在一些實施方案中，aav載體包含編碼rspo4或其功能性變體的核酸，且rspo4或其功能性變體包含與seqidno:10、18和/或19的氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體與啟動子可操作連接。在一些實施方案中，啟動子能夠在哺乳動物的眼中表達(dá)rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體。在一些實施方案中，啟動子能夠在小梁網(wǎng)的細(xì)胞中表達(dá)rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體。在一些實施方案中，啟動子是雜交雞β-肌動蛋白(cba)啟動子。在一些實施方案中，myocrnai與啟動子可操作連接。在一些實施方案中，啟動子能夠在哺乳動物的眼中表達(dá)myocrnai。在一些實施方案中，啟動子能夠在小梁網(wǎng)的細(xì)胞中表達(dá)myocrnai。在一些實施方案中，啟動子是雜交雞β-肌動蛋白(cba)啟動子。在一些實施方案中，啟動子是rna聚合酶iii啟動子。在一些實施方案中，myocrnai的表達(dá)減少或抑制哺乳動物眼中myoc的表達(dá)。在一些實施方案中，myocrnai的表達(dá)減少或抑制哺乳動物小梁網(wǎng)的細(xì)胞中myoc的表達(dá)。

在一些實施方案中，本文所述的aav顆粒可與增加r-脊椎蛋白(例如rspo1、rspo2、rspo3和/或rspo4)活性的一種或多種其他作用劑組合使用。

在一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含aav病毒顆粒，所述顆粒含有載體和aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6(例如野生型aav6衣殼或變體aav6衣殼如shh10，如u.s.pgpub.2012/0164106中所述)、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9(例如野生型aav9衣殼或修飾的aav9衣殼，如u.s.pgpub.2013/0323226中所述)、aav10、aavrh10、aav11、aav12、酪氨酸衣殼突變體、發(fā)夾結(jié)合衣殼突變體、aav2r471a衣殼、aavaav2/2-7m8衣殼、aavdj衣殼(例如aav-dj/8衣殼、aav-dj/9衣殼或u.s.pgpub.2012/0066783中所述的任何其他衣殼)、aav2n587a衣殼、aav2e548a衣殼、aav2n708a衣殼、aavv708k衣殼、山羊aav衣殼、aav1/aav2嵌合衣殼、牛aav衣殼、小鼠aav衣殼、raav2/hbov1衣殼或美國專利號8,283,151或國際公開號wo/2003/042397中所述的aav衣殼。在一些實施方案中，aav病毒顆粒包含aav衣殼，所述衣殼在位置r484、r487、k527、k532、r585或r588的一處或多處含有氨基酸取代，其基于aav2的vp1編號。在其他實施方案中，aav顆粒包含來自進(jìn)化枝a-f的aav血清型的衣殼蛋白。在一些實施方案中，raav病毒顆粒包含aav血清型2衣殼。在一些實施方案中，aav血清型2衣殼包含含有r471a氨基酸取代的aav2衣殼蛋白，其相對aav2vp1編號。在一些實施方案中，載體包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aavdj、山羊aav、牛aav或小鼠aav血清型反向末端重復(fù)(itr)。在一些實施方案中，載體包含aav血清型2itr。在一些實施方案中，aav病毒顆粒包含源自相同aav血清型的一個或多個itr和衣殼。在一些實施方案中，aav病毒顆粒包含源自與raav病毒顆粒的衣殼不同aav血清型的一個或多個itr。在一些實施方案中，raav病毒顆粒包含aav2衣殼，且載體包含aav2itr。在一些實施方案中，aav2衣殼包含含有r471a氨基酸取代的aav2衣殼蛋白，其相對aav2vp1編號。

在上述試劑盒的一些實施方案中，所述試劑盒的aav顆粒與增加r-脊椎蛋白(例如rspo1、rspo2、rspo3和/或rspo4)活性的一種或多種其他作用劑組合使用。在一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含如本文所述的aav顆粒和增加r-脊椎蛋白(例如rspo1、rspo2、rspo3和/或rspo4)的活性的一種或多種其他作用劑。

本發(fā)明提供適于在本文所述任何一種方法中使用的試劑盒。本發(fā)明提供包含本文所述的任何重組aav顆粒的試劑盒。一些方面，本文所述的試劑盒進(jìn)一步包括用于在治療肌纖蛋白(myoc)青光眼中使用的說明。一些方面，本文所述的試劑盒進(jìn)一步包含緩沖液和/或藥物上可接受的賦形劑。

一些方面，本發(fā)明提供向哺乳動物眼部小梁網(wǎng)遞送核酸(例如編碼治療性轉(zhuǎn)基因的核酸)的方法，包括向所述哺乳動物的眼部施用含有raav載體的aav血清型2(aav2)顆粒，其中所述raav載體包含核酸，且其中aav2顆粒包含含有r471a氨基酸取代的aav2衣殼蛋白，其基于aav2的vp1編號。一些方面，本發(fā)明提供治療哺乳動物中的眼部病癥的方法，其包括對所述哺乳動物的眼部施用包含raav載體的aav2顆粒，其中所述raav載體包含編碼治療性轉(zhuǎn)基因的核酸，且其中所述aav2顆粒包含含有r471a氨基酸取代的aav2衣殼蛋白，其基于aav2的vp1編號。在一些實施方案中，玻璃體內(nèi)和/或房內(nèi)施用raav顆粒。在一些實施方案中，raav顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)眼部的小梁網(wǎng)的細(xì)胞。在一些實施方案中，治療性轉(zhuǎn)基因在眼部的小梁網(wǎng)中表達(dá)。在一些實施方案中，治療性轉(zhuǎn)基因編碼治療性多肽或治療性核酸。在一些實施方案中，眼部病癥是與眼部的小梁網(wǎng)相關(guān)的病癥。在一些實施方案中，眼部病癥是肌纖蛋白(myoc)青光眼。在一些實施方案中，哺乳動物是人。

一些方面，本發(fā)明提供用于將核酸(例如編碼治療性轉(zhuǎn)基因的核酸)遞送至哺乳動物眼部小梁網(wǎng)的重組aav2顆粒，其中所述aav2顆粒包含raav載體，其中所述raav載體包含核酸，且其中aav2顆粒包含含有r471a氨基酸取代的aav2衣殼蛋白，其基于aav2的vp1編號。一些方面，本發(fā)明提供用于治療哺乳動物中眼部病癥的重組aav2顆粒，其中所述aav2顆粒包含raav載體，其中raav載體包含編碼治療性轉(zhuǎn)基因的核酸，且其中所述aav2顆粒包含含有r471a氨基酸取代的aav2衣殼蛋白，其基于aav2的vp1編號。在一些實施方案中，raav顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)眼部的小梁網(wǎng)的細(xì)胞。在一些實施方案中，治療性轉(zhuǎn)基因在眼部小梁網(wǎng)中表達(dá)。在一些實施方案中，治療性轉(zhuǎn)基因編碼治療性多肽或治療性核酸。在一些實施方案中，所述眼部病癥是與眼部的小梁網(wǎng)相關(guān)的病癥。在一些實施方案中，眼部病癥是肌纖蛋白(myoc)青光眼。在一些實施方案中，所述哺乳動物是人。

一些方面，本發(fā)明提供重組aav2顆粒用于將核酸(例如編碼治療性轉(zhuǎn)基因的核酸)遞送至哺乳動物眼部的小梁網(wǎng)的用途，其中所述aav2顆粒包含raav載體，其中所述raav載體包含所述核酸，且其中所述aav2顆粒包含含有r471a氨基酸取代的aav2衣殼蛋白，其基于aav2的vp1編號。一些方面，本發(fā)明提供重組aav2顆粒用于在哺乳動物中治療眼部病癥的用途，其中所述aav2顆粒包含raav載體，其中所述raav載體包含編碼治療性轉(zhuǎn)基因的核酸，且其中所述aav2顆粒包含含有r471a氨基酸取代的aav2衣殼蛋白，其基于aav2的vp1編號。在一些實施方案中，玻璃體內(nèi)和/或房內(nèi)施用raav顆粒。在一些實施方案中，raav顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)眼部的小梁網(wǎng)的細(xì)胞。在一些實施方案中，治療性轉(zhuǎn)基因在眼部小梁網(wǎng)中表達(dá)。在一些實施方案中，治療性轉(zhuǎn)基因編碼治療性多肽或治療性核酸。在一些實施方案中，所述眼部病癥是與眼部小梁網(wǎng)相關(guān)的病癥。在一些實施方案中，所述眼部病癥是肌纖蛋白(myoc)青光眼。在一些實施方案中，所述哺乳動物是人。

一些方面，本發(fā)明提供將核酸(例如編碼治療性轉(zhuǎn)基因的核酸)遞送至哺乳動物眼部小梁網(wǎng)的試劑盒，其包含含有raav載體的raav2顆粒，其中所述raav載體包含所述核酸，且其中所述aav2顆粒包含含有r471a氨基酸取代的aav2衣殼蛋白，其基于aav2的vp1編號。一些方面，本發(fā)明提供用于治療哺乳動物中眼部病癥的試劑盒，其包含含有raav載體的raav2顆粒，其中所述raav載體包含編碼治療性轉(zhuǎn)基因的核酸，且其中所述aav2顆粒包含含有r471a氨基酸取代的aav2衣殼蛋白，其基于aav2的vp1編號。在一些實施方案中，玻璃體內(nèi)和/或房內(nèi)施用raav顆粒。在一些實施方案中，raav顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)眼部的小梁網(wǎng)的細(xì)胞。在一些實施方案中，治療性轉(zhuǎn)基因在眼部小梁網(wǎng)中表達(dá)。在一些實施方案中，治療性轉(zhuǎn)基因編碼治療性多肽或治療性核酸。在一些實施方案中，所述眼部病癥是與眼部小梁網(wǎng)相關(guān)的病癥。在一些實施方案中，眼部病癥是肌纖蛋白(myoc)青光眼。在一些實施方案中，哺乳動物是人。

本文引用的全部參考文獻(xiàn)包括專利申請和出版物通過提述以其整體并入。

附圖簡述

圖1證明myoc突變體p370l和y437h是不分泌的且阻斷野生型myoc(“wtmyoc”)的分泌。來自使用表達(dá)wtmyoc和/或myoc突變體(如標(biāo)記)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解物通過蛋白免疫印跡使用抗人myoc抗體探測。

圖2顯示myoc突變體p370l是不分泌的且阻斷293t和sv40t-抗原轉(zhuǎn)化的人小梁網(wǎng)(“htm-t”)細(xì)胞兩者中野生型myoc(“wtmyoc”)的分泌。來自使用表達(dá)wtmyoc和/或p370lmyoc(如標(biāo)記)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的293t或htm-t細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解物通過蛋白免疫印跡使用抗人myoc抗體探測。

圖3描述了wtmyoc、p370lmyoc或y437h表達(dá)對wnt信號傳導(dǎo)的影響。對于每個實驗，“無mwnt3a”條形圖在左側(cè)，且“wmwnt3a-400ng/ml”條形圖在右側(cè)。

圖4顯示rspo3表達(dá)可在與p370l或y437hmyoc共表達(dá)時恢復(fù)wnt信號傳導(dǎo)。對于每個實驗，“無mwnt3a”條形圖在左側(cè)，且“wmwnt3a-400ng/ml”條形圖在右側(cè)。

圖5顯示rspo3表達(dá)可在與p370lmyoc共表達(dá)時恢復(fù)htm-t細(xì)胞中的wnt信號傳導(dǎo)。對于每個實驗，“無mwnt3a”條形圖在左側(cè)，且“400ng/mlhwnt3a”條形圖在右側(cè)。

圖6顯示myocshrna對293t細(xì)胞中myoc表達(dá)的影響。來自293t細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解物經(jīng)由蛋白免疫印跡使用抗人myoc抗體探測。細(xì)胞使用表達(dá)wtmyoc(條帶1)；wtmyoc和myocshrna#79(2)；wtmyoc和myocshrna#93(3)；wtmyoc和亂序shrna對照(4)；或egfp(5)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。55/57kd的條帶代表完整大小的myoc蛋白的糖基化(57kd)和非糖基化(55kd)形式。22kd的條帶代表鈣蛋白酶ii裂解產(chǎn)物的n-末端。

圖7顯示myocshrna對htm-t細(xì)胞中myoc表達(dá)的影響。來自htm-t細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解物經(jīng)由蛋白免疫印跡使用抗人myoc抗體探測。細(xì)胞使用表達(dá)wtmyoc(條帶1)；p370lmyoc(2)；wtmyoc和p370lmyoc(3)；wtmyoc和p370lmyoc和grp94shrna#1(4)；wtmyoc和p370lmyoc和grp94shrna#2(5)；wtmyoc和p370lmyoc和myocshrna#53(6)；wtmyoc和p370lmyoc和pgipzmyocshrna#79(7)；wtmyoc和p370lmyoc和pgipzmyocshrna#93(8)；wtmyoc和p370lmyoc和亂序shrna對照(9)；或egfp(10)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

圖8顯示rspo3表達(dá)和myoc沉默與p370lmyoc共表達(dá)時協(xié)同恢復(fù)wnt信號傳導(dǎo)。293t細(xì)胞用top-flash報告構(gòu)建體和wtmyoc(“myoc”)，加p370lmyoc、grp94shrna、pgipzmyocshrnas#79(第一)和#93(第二)和/或rspo3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，如標(biāo)記。添加重組小鼠wnt3a(400ng/ml)后擴(kuò)增wnt信號傳導(dǎo)并通過top-flash測定測量。轉(zhuǎn)染后測量螢光素酶活性(平均值±sd,n＝1-3重復(fù)孔)并標(biāo)準(zhǔn)化至組成型表達(dá)的海腎(renilla)螢光素酶的轉(zhuǎn)染對照的水平。對于每個實驗，“無wnt添加”條形圖在左側(cè)，且“添加400ng/mlwnt3a”條形圖在右側(cè)。

圖9顯示myoc沉默與p370l或y437hmyoc共表達(dá)時恢復(fù)wnt信號傳導(dǎo)。293t細(xì)胞使用top-flash報告構(gòu)建體和wtmyoc(“myoc”)，加p370lmyoc、y437hmyoc、myocshrna和/或亂序?qū)φ誷hrna(“pgipz-無效”)共轉(zhuǎn)染，如標(biāo)記。添加重組小鼠wnt3a(400ng/ml)后擴(kuò)增wnt信號傳導(dǎo)并通過top-flash測定測量。轉(zhuǎn)染后測量螢光素酶活性(平均值±sd,n＝1-3重復(fù)孔)并標(biāo)準(zhǔn)化至組成型表達(dá)的海腎螢光素酶的轉(zhuǎn)染對照的水平。對于每個實驗，“無wnt添加”條形圖在左側(cè)，且“添加400ng/mlwnt3a”條形圖在右側(cè)。

圖10顯示通過野生型aav2病毒顆粒(上圖)和包含衣殼蛋白的r471a氨基酸取代的aav2顆粒體外(左圖)和體內(nèi)(右圖)轉(zhuǎn)導(dǎo)小梁網(wǎng)的細(xì)胞。

圖11顯示人rspo家族蛋白的結(jié)構(gòu)域圖，其描述了弗林蛋白酶樣富含cys結(jié)構(gòu)域、凝血酶敏感素1型結(jié)構(gòu)域和c末端正電結(jié)構(gòu)域，如標(biāo)記(圖改編自kim,k.a.等人(2008)mol.biol.cell.19:2588-2596)。

圖12顯示人rspo家族基因的結(jié)構(gòu)域圖，其描述了圖11所列的蛋白結(jié)構(gòu)域。描繪了氨基酸序列編號，且針對每個家族成員測試的截短的突變體如標(biāo)記(圖改編自kim,k.a.等人(2006)cellcycle5:23-26)。

圖13a顯示具有標(biāo)記的信號序列、fu1、fu2和tsp1結(jié)構(gòu)域的全長人rspo3(seqidno:1)的序列。

圖13b顯示具有標(biāo)記的信號序列、fu1和fu2結(jié)構(gòu)域的活性人rspo3片段(seqidno:16)的序列。使用的缺乏信號肽的片段對應(yīng)seqidno:16的氨基酸22-146，且包括his標(biāo)簽為15kda。

圖13c描繪具有標(biāo)記的信號肽、fu1、fu2、tsp1和br結(jié)構(gòu)域的全長hrspo3的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。每個結(jié)構(gòu)域的推定功能列于下文。

圖13d顯示全長hrspo3和hrspo3片段的蛋白免疫印跡。

圖14描繪測試的hrspo3片段。下文還提供了具有標(biāo)記的信號肽、fu1、fu2、tsp1和br結(jié)構(gòu)域的全長hrspo3的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和為每個結(jié)構(gòu)域推定的功能。

圖15顯示全長rspo3和rspo3片段的表達(dá)與y437hmyoc共表達(dá)時可恢復(fù)wnt信號傳導(dǎo)。

圖16顯示rspo家族成員的表達(dá)當(dāng)與y437hmyoc共表達(dá)時即使不添加wnt3a也可誘導(dǎo)wnt信號傳導(dǎo)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供用于在哺乳動物中治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法，包括對所述哺乳動物的眼部施用重組腺伴隨病毒(raav)病毒顆粒。在一些實施方案中，哺乳動物眼中的wnt信號傳導(dǎo)增加；例如，通過表達(dá)r-脊椎蛋白1(rspo1)、r-脊椎蛋白2(rspo2)、r-脊椎蛋白3(rspo3)和/或r-脊椎蛋白4(rspo4)。在一些實施方案中，肌纖蛋白(myoc)(例如突變體肌纖蛋白)的表達(dá)受到抑制，例如通過使用rnai靶向myoc的表達(dá)。一些方面，aav顆粒包含其中編碼rspo1、rspo2、rspo3和/或rspo4和/或功能性變體的載體。其他方面，raav顆粒包含編碼靶向哺乳動物中肌纖蛋白(myoc)表達(dá)的myocrnai(例如shrna)的載體。其他方面，本發(fā)明提供用于治療哺乳動物中肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法，包括對所述哺乳動物的眼部施用包含其中編碼rspo1、rspo2、rspo3和/或rspo4和/或功能性變體的載體的raav顆粒和包含編碼靶向哺乳動物中肌纖蛋白的表達(dá)的myocrnai(例如shrna)的載體的raav顆粒的混合物。其他方面，本發(fā)明提供用于在哺乳動物中治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法，包括對所述哺乳動物的眼部施用raav顆粒，所述顆粒包含其中編碼rspo1、rspo2、rspo3和/或rspo4和/或功能性變體和編碼靶向哺乳動物中肌纖蛋白的表達(dá)的myocrnai(例如shrna)(myocshrna)的載體。本發(fā)明還提供使用其中編碼rspo1、rspo2、rspo3和/或rspo4和/或功能性變體和/或myocrnai(例如shrna)的raav載體用于治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的組合物和試劑盒。本發(fā)明還提供重組aav顆粒、組合物和試劑盒。

一些方面，本發(fā)明提供靶向aav2的方法以轉(zhuǎn)導(dǎo)小梁網(wǎng)的細(xì)胞。一些方面，本發(fā)明提供含有r471a突變的raav2顆粒，其基于aav2的vp1編號。在一些實施方案中，本發(fā)明提供使用含有突變的衣殼蛋白(例如r471a氨基酸取代)的aav2病毒顆粒用于治療與小梁網(wǎng)(例如肌纖蛋白(myoc)青光眼)相關(guān)的眼部疾病的方法和組合物。

i.一般性技術(shù)

本文描述和引用的技術(shù)和方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員一般充分理解的且使使用常規(guī)方法學(xué)所通常采用的，如例如molecularcloning:alaboratorymanual(sambrook等，第4版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,2012)；currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel等編，2003)；methodsinenzymology叢書(academicpress,inc.)；pcr2:apracticalapproach(m.j.macpherson,b.d.hames和g.r.taylor編，1995)；antibodies,alaboratorymanual(harlow和lane,編，1988)；cultureofanimalcells:amanualofbasictechniqueandspecializedapplications(r.i.freshney,第6版,j.wileyandsons,2010)；oligonucleotidesynthesis(m.j.gait編,1984)；methodsinmolecularbiology,humanapress；cellbiology:alaboratorynotebook(j.e.cellis編,academicpress,1998)；introductiontocellandtissueculture(j.p.mather和p.e.roberts,plenumpress,1998)；cellandtissueculture:laboratoryprocedures(a.doyle,j.b.griffiths,和d.g.newell,編，j.wileyandsons,1993-8)；handbookofexperimentalimmunology(d.m.weir和c.c.blackwell,編，1996)；genetransfervectorsformammaliancells(j.m.miller和m.p.calos,編，1987)；pcr:thepolymerasechainreaction,(mullis等編,1994)；currentprotocolsinimmunology(j.e.coligan等編,1991)；shortprotocolsinmolecularbiology(ausubel等編,j.wileyandsons,2002)；immunobiology(c.a.janeway等，2004)；antibodies(p.finch,1997)；antibodies:apracticalapproach(d.catty.編,irlpress,1988-1989)；monoclonalantibodies:apracticalapproach(p.shepherd和c.dean,編，oxforduniversitypress,2000)；usingantibodies:alaboratorymanual(e.harlow和d.lane,coldspringharborlaboratorypress,1999)；theantibodies(m.zanetti和j.d.capra,編，harwoodacademicpublishers,1995)和cancer:principlesandpracticeofoncology(v.t.devita等編,j.b.lippincottcompany,2011)中所述的廣泛采用的方法學(xué)。

ii.定義

如本文使用的“載體”指包含待遞送入宿主細(xì)胞(體外或體內(nèi))的核酸的重組質(zhì)?；虿《?。

如本文使用的術(shù)語“多核苷酸”或“核酸”指任何長度的聚合形式的核苷酸，其為核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。因此，該術(shù)語包括但不限于單、雙或多鏈dna或rna、基因組dna、cdna、dna-rna雜交物或包含嘌呤和嘧啶堿基或其他天然、化學(xué)或生化修飾的、非天然或衍生的核苷酸堿基的聚合物。核酸的骨架可包含糖和磷酸基團(tuán)(如通常在rna或dna中所發(fā)現(xiàn))，或修飾或取代的糖或磷酸基團(tuán)?？商鎿Q地，核酸的骨架可包含合成的亞單元如氨基磷酸的聚合物且因此可以是寡脫氧核苷氨基磷酸(p-nh2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯低聚物。此外，雙鏈核酸可從化學(xué)合成(通過在適當(dāng)?shù)臈l件下合成互補(bǔ)鏈并退火該鏈，或使用dna聚合酶以適當(dāng)?shù)囊飶念^開始合成互補(bǔ)鏈)的單鏈多核苷酸產(chǎn)物獲得。

術(shù)語“多肽”和“蛋白”可互換使用以指代氨基酸殘基的聚合物，且不限于最小長度。這樣的氨基酸殘基聚合物可包含天然或非天然氨基酸殘基，且包括但不限于氨基酸殘基的肽、寡肽、二聚體、三聚體和多聚體。全長蛋白及其片段兩者都由定義所涵蓋。術(shù)語還包括多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、唾液酸化、乙?；?、磷酸化等。此外，就本發(fā)明而言，“多肽”指包含對天然序列的修飾如缺失、添加和取代(一般在性質(zhì)上是保守的)的蛋白，只要該蛋白保持預(yù)期活性。這些修飾可以是故意的，如通過定點(diǎn)誘變，或可以是偶然的，如通過產(chǎn)生蛋白的宿主的突變或由于pcr擴(kuò)增的錯誤。

“重組病毒載體”指包含一種或多種異源序列(即非病毒來源的核酸序列)的重組多核苷酸載體。在重組aav載體的情況中，重組核酸側(cè)翼為至少一個，優(yōu)選兩個反向末端重復(fù)序列(itr)。

“重組aav載體(raav載體)”指含有一個或多個異源序列(即非aav來源的核酸序列)的多核苷酸載體，其側(cè)翼為至少一個，優(yōu)選兩個aav反向末端重復(fù)序列(itr)。當(dāng)存在于已經(jīng)使用適當(dāng)?shù)妮o助病毒(或表達(dá)適當(dāng)?shù)妮o助功能)感染并表達(dá)aavrep和cap基因產(chǎn)物(即aavrep和cap蛋白)的宿主細(xì)胞中時，該raav載體可復(fù)制并包裝入感染的病毒顆粒。當(dāng)raav載體并入較大多核苷酸(例如，在染色體中或在用于克隆或轉(zhuǎn)染的另一載體如質(zhì)粒中)時，可將raav載體稱為“原載體(pro-vector)”，其在aav包裝功能和適當(dāng)?shù)妮o助功能存在下可通過復(fù)制和殼體化“援救”。raav載體可以是多種形式中的任一種，包括但不限于質(zhì)粒、線性人工染色體，其可與脂質(zhì)體復(fù)合、包封在脂質(zhì)體內(nèi)，且在實施方案中，包封在病毒顆粒特別是aav顆粒中?？蓪aav載體包裝入aav病毒衣殼以生成“重組腺伴隨病毒顆粒(raav顆粒)”。aav輔助功能(即允許aav由宿主細(xì)胞復(fù)制和包裝的功能)可以多種形式中的任一種提供，包括但不限于幫助aav復(fù)制和包裝的輔助病毒或輔助病毒基因。其他aav輔助功能為本領(lǐng)域已知。

“raav病毒”或“raav病毒顆?！敝赣芍辽僖环Naav衣殼蛋白和殼體化的raav載體基因組組成的病毒顆粒。

“異源”意為源自與其所比較的或其所導(dǎo)入或并入的實體的其余部分在基因型上不同的實體。例如，由基因工程技術(shù)引入不同細(xì)胞類型的核酸是異源核酸(且當(dāng)表達(dá)時，可編碼異源多肽)。相似地，并入病毒載體的細(xì)胞序列(例如基因或其部分)相對于載體是異源核苷酸序列。

術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”指引入細(xì)胞并能夠轉(zhuǎn)錄成為rna且任選地在適當(dāng)?shù)臈l件下翻譯和/或表達(dá)的核酸。一些方面中，其賦予其所引入的細(xì)胞預(yù)期的特性，或除此以外導(dǎo)致預(yù)期的治療或診斷結(jié)果。另一方面，其可轉(zhuǎn)錄成為介導(dǎo)rna干擾的分子，如sirna。

如指代病毒滴度中使用，術(shù)語“基因組顆粒(gp)”、“基因組等價物”或“基因組拷貝”指包含重組aavdna基因組的病毒粒數(shù)目，不論其感染性或功能性。在特定載體制備中基因組顆粒的數(shù)目可通過如本文實施例或例如clark等人(1999)hum.genether.,10:1031-1039；veldwijk等人(2002)mol.ther.,6:272-278中所述的方法測量。

如指代病毒滴度中使用，術(shù)語“感染單位(iu)”、“感染顆?！被颉皬?fù)制單位”指如通過感染中心測定所測量的具有感染和復(fù)制能力的重組aav載體顆粒的數(shù)目，也稱為復(fù)制中心測定，如例如mclaughlin等人(1988)j.virol.,62:1963-1973中所述。

如指代病毒滴度中使用，術(shù)語“轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(tu)”指導(dǎo)致功能性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物產(chǎn)生的感染性重組aav載體顆粒的數(shù)目，如在功能性測定中所測量，如本文實施例或例如xiao等人(1997)exp.neurobiol.,144:113-124中；或fisher等人(1996)j.virol.,70:520-532(lfu測定)中所述。

“反向末端重復(fù)”或“itr”序列是本領(lǐng)域熟知的術(shù)語且指代在病毒基因組的末端發(fā)現(xiàn)的相對短的序列，其處于相反方向。

“aav反向末端重復(fù)(itr)”序列是本領(lǐng)域熟知的術(shù)語，其為在天然單鏈aav基因組兩末端存在的約145個核苷酸的序列。itr的最外面125個核苷酸可以兩種可替換的方向中的任一種存在，導(dǎo)致不同aav基因組間和單aav基因組的兩末端間的異質(zhì)性。最外面125個核苷酸還包含自身互補(bǔ)的數(shù)個較短區(qū)(稱為a、a'、b、b'、c、c'和d區(qū))，允許在該itr部分內(nèi)發(fā)生鏈間堿基配對。

“末端解析序列”或“trs”是在病毒dna復(fù)制過程中通過aavrep蛋白切割的aavitr的d區(qū)中的序列。突變體末端解析序列難以通過aavrep蛋白切割。

對于aav的“輔助病毒”指允許aav(為有缺陷的細(xì)小病毒)通過宿主細(xì)胞復(fù)制并包裝的病毒。已識別多種這樣的輔助病毒，包括腺病毒、泡疹病毒和痘類病毒如牛痘。腺病毒涵蓋多個不同的亞類，盡管亞類c的腺病毒5型(ad5)是最常用的。已知人、非人哺乳動物和鳥類來源的多種腺病毒且可從保藏機(jī)構(gòu)如atcc獲得。也可從保藏機(jī)構(gòu)如atcc獲得的泡疹病毒家族包括例如單純泡疹病毒(herpessimplexviruses，hsv)、eb病毒(epstein-barrviruses，ebv)、巨細(xì)胞病毒(cytomegaloviruses，cmv)和偽狂犬病病毒(pseudorabiesviruses，prv)。

相對于參照多肽或核酸序列的“百分比(％)序列同一性”定義為對齊序列并引進(jìn)缺口后(若需要，以實現(xiàn)最大百分比序列同一性，且不將任何保守取代考慮為序列同一性的部分)，候選序列中與參照多肽或核酸序列中的氨基酸殘基或核苷酸相同的氨基酸殘基或核苷酸的百分比。出于確定百分比氨基酸或核酸序列同一性的目的的比對可以多種本領(lǐng)域內(nèi)的方式實現(xiàn)，例如使用公共可獲得的計算機(jī)軟件程序，例如currentprotocolsinmolecularbiology(ausubeletal.,eds.,1987),supp.30,section7.7.18,表7.7.1中所述的那些，且包括blast、blast-2、align或megalign(dnastar)軟件。優(yōu)選的比對軟件是alignplus(scientificandeducationalsoftware,pennsylvania)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定用于測量比對的適當(dāng)?shù)膮?shù)，包括任何在比較的序列全長上需要實現(xiàn)最大比對的算法。就本文而言，給定氨基酸序列a對、與或針對給定氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(其可替換地可稱為具有或包含對、與或針對給定氨基酸序列b具有一定％氨基酸序列同一性的氨基酸序列a)如下計算：100乘以分?jǐn)?shù)x/y，其中x是在a和b的程序比對中通過序列比對程序評分為相同匹配的氨基酸殘基的數(shù)目，且其中y是b中氨基酸殘基的總數(shù)?？梢岳斫獾氖瞧渲邪被嵝蛄衋的長度與氨基酸序列b的長度不等，a對b的％氨基酸序列同一性將不等于b對a的％氨基酸序列同一性。就本文而言，給定核酸序列c對、與或針對給定核酸序列d的％核酸序列同一性(其可替換地可稱為對、與或針對給定核酸序列d具有或包含一定％核酸序列同一性的給定核酸序列c)如下計算：100乘以分?jǐn)?shù)w/z，其中w是在c和d的程序比對中通過序列比對程序評分為相同匹配的核苷酸的數(shù)目，且其中z是d中核苷酸的總數(shù)?？梢岳斫獾氖瞧渲泻怂嵝蛄衏的長度不等于核酸序列d的長度，c對d的％核酸序列同一性將不等于d對c的％核酸序列同一性。

“分離的”分子(例如核酸或蛋白)或細(xì)胞意為其已經(jīng)鑒定和從其天然環(huán)境的組分分離和/或回收。

“有效量”是足以影響有益的或預(yù)期的結(jié)果，包括臨床結(jié)果(例如改善癥狀、實現(xiàn)臨床終點(diǎn)等)的量。有效量可以一次或多次施用。就疾病狀態(tài)而言，有效量是足以改善、穩(wěn)定或延遲疾病進(jìn)展的量。例如，有效量的raav顆粒表達(dá)預(yù)期量的異源核酸如治療性多肽或治療性核酸。

“個體”或“受試者”是哺乳動物。哺乳動物包括但不限于馴養(yǎng)動物(例如，牛、綿羊(sheep)、貓、狗和馬)、靈長類動物(例如，人和非人靈長類動物如猴)、兔和嚙齒類動物(例如小鼠和大鼠)。在一些實施方案中，個體或受試者是人。

如本文使用的“治療”是用于獲得有益或預(yù)期的臨床結(jié)果的方式。就本發(fā)明而言，有益或預(yù)期的臨床結(jié)果包括但不限于癥狀改善、疾病程度的減少、疾病的穩(wěn)定化(例如未惡化)狀態(tài)、疾病擴(kuò)散(例如轉(zhuǎn)移)的防止、疾病進(jìn)展的延遲或減緩、疾病狀態(tài)的改善或緩和以及緩解(無論部分或全部)，無論是可檢測的或不可檢測的?！爸委煛边€可意為與未接受治療的預(yù)期生存率相比延長生存率。

如本文使用的術(shù)語“小梁網(wǎng)”指位于角膜和虹膜附近的海綿樣組織，其發(fā)揮功能以將房水從眼部排入血液。位于角膜和虹膜附近的海綿樣組織發(fā)揮功能以將房水從眼部排入血液。小梁網(wǎng)包含內(nèi)皮內(nèi)襯空間(小梁間隙)，房水穿透其至鞏膜靜脈竇(schlemm'scanal)。其經(jīng)常分為兩部分：與角膜和鞏膜接觸并開放進(jìn)入鞏膜靜脈竇的角膜鞏膜網(wǎng)和面對前房的葡萄膜小梁。

如本文使用的術(shù)語“中央視網(wǎng)膜”指外黃斑和/或內(nèi)黃斑和/或中央凹。如本文使用的術(shù)語“中央視網(wǎng)膜細(xì)胞類型”指中央視網(wǎng)膜的細(xì)胞類型，如例如rpe和感光細(xì)胞。

術(shù)語“黃斑”指靈長類動物中中心視網(wǎng)膜的區(qū)域，其相比外周視網(wǎng)膜包含較高相對濃度的感光細(xì)胞，特別是視桿和視錐細(xì)胞。如本文使用的術(shù)語“外黃斑”還稱為“外周黃斑”。如本文使用的術(shù)語“內(nèi)黃斑”還稱為"中心黃斑"。

術(shù)語“中央凹”指靈長類動物中心視網(wǎng)膜中直徑約等于或小于0.5mm的小區(qū)域，其相比外周視網(wǎng)膜和黃斑包含與較高相對濃度的感光細(xì)胞，特別是視錐細(xì)胞。

如本文使用的術(shù)語“視網(wǎng)膜下間隙”指感光細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞間視網(wǎng)膜中的位置。視網(wǎng)膜下間隙可以是潛在的空間，如任何流體視網(wǎng)膜下注射前。視網(wǎng)膜下間隙還可包含注射入潛在空間的流體。在該情況中，流體“與視網(wǎng)膜下間隙接觸”?！芭c視網(wǎng)膜下間隙接觸”的細(xì)胞包括在視網(wǎng)膜下間隙邊界的細(xì)胞，如rpe和感光細(xì)胞。

如本文使用的術(shù)語“泡(bleb)”指眼部視網(wǎng)膜下間隙內(nèi)的流體空間。本發(fā)明的泡可通過將流體單次注射入單一間隙、通過將一種或多種流體多次注射入相同間隙或通過多次注射入多個間隙生成，其當(dāng)重新定位時生成在視網(wǎng)膜下間隙的預(yù)期部分上用于實現(xiàn)治療效果的總流體間隙。

“雞β-肌動蛋白(cba)啟動子”指源自雞β-肌動蛋基因的多核苷酸序列(例如，原雞(gallusgallus)β肌動蛋白，由genbankentrezgeneid396526表示)。如本文使用的“雞β-肌動蛋白啟動子”可指包含巨細(xì)胞病毒(cmv)早期增強(qiáng)子元件，雞β-肌動蛋白基因的啟動子和第一外顯子和內(nèi)含子，以及兔β-珠蛋白基因的剪接受體的啟動子，如miyazaki,j.,等人(1989)gene79(2):269-77中所述的序列。如本文使用的術(shù)語“cag啟動子”可互換使用。如本文使用的術(shù)語“cmv早期增強(qiáng)子/雞β肌動蛋白(cag)啟動子”可互換使用。

“肌纖蛋白(myoc)”指涉及細(xì)胞骨架功能、細(xì)胞粘附、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞遷移的蛋白(或編碼所述蛋白的基因)，也由于小梁網(wǎng)誘導(dǎo)型糖皮質(zhì)激素響應(yīng)、gpoa、tigr、glc1a、joag和joag1所知。肌纖蛋白在多種不同細(xì)胞類型中作為分泌蛋白表達(dá)。在眼中，認(rèn)為肌纖蛋白通過小梁網(wǎng)分泌進(jìn)入房水，該組織在眼內(nèi)壓(iop)調(diào)節(jié)中至關(guān)重要。如上文所述，認(rèn)為肌纖蛋白中的突變導(dǎo)致原發(fā)性開角型青光眼病例亞類，特別是幼年型病癥。

如本文使用的“肌纖蛋白”可指全長的前體以及任何經(jīng)加工的蛋白形式(例如，從細(xì)胞分泌的成熟蛋白)。肌纖蛋白的實例可包括但不限于人、小鼠、狗和貓肌纖蛋白，例如ncbi參考序列np_000252、np_034995、np_001041495和np_001265779。肌纖蛋白基因的實例可包括但不限于人、小鼠、狗和貓肌纖蛋白基因，例如genbankentrezgeneid4653(myoc，也稱為gpoa、joag、tigr、glc1a和joag1)、genbankentrezgeneid17926(myoc，也稱為tigr、glc1a和ai957332)、genbankentrezgeneid490344和genbankentrezgeneid101087632。

“r-脊椎蛋白1(rspo1)”指參與wnt信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)的r-脊椎蛋白家族成員。術(shù)語“rspo1”可指rspo1蛋白或編碼rspo1蛋白的基因。含有血小板反應(yīng)素1型重復(fù)(tsr-1)的蛋白r-脊椎蛋白的超家族成員包括信號肽、tsr-1結(jié)構(gòu)域和兩個弗林蛋白酶樣重復(fù)。盡管精確的機(jī)制尚不清楚，認(rèn)為r-脊椎蛋白家族多肽活化wnt信號傳導(dǎo)。對于r-脊椎蛋白和wnt信號傳導(dǎo)間關(guān)聯(lián)的進(jìn)一步描述，參見例如kim,k.a.等人(2006)cellcycle5:23-26；kim,k.a.等人(2008)mol.biol.cell.19:2588-2596；jin,y.r.andyoon,j.k.(2012)int.j.biochem.cellbiol.44:2278-2287；和delau,w.b.,等人(2012)genomebiol.13(3):242。

如本文使用，“rspo1”可指全長的前體以及任何經(jīng)加工形式的蛋白(例如從細(xì)胞分泌的成熟蛋白)。rspo1蛋白的實例可包括但不限于人、小鼠、狗和貓rspo1，例如ncbi參考序列np_001229837、np_619624、xp_00562890和xp_003989918。rspo1基因的實例可包括但不限于人、小鼠、狗和貓rspo1基因，例如genbankentrezgeneid284654(rspo1，也稱為rspo和cristin3)、genbankentrezgeneid192199(rspo1，也稱為r脊椎蛋白和r-脊椎蛋白)、genbankentrezgeneid608179和genbankentrezgeneid101091033。在一些實施方案中，rspo1是rspo1的功能性變體。在一些實施方案中，功能性rspo1變體可包含一個或多個氨基酸取代、插入和/或缺失(例如截短)但保留對應(yīng)全長rspo1的一種或多種活性的一些或全部活性(例如，wnt信號傳導(dǎo)活性，其測定在本文描述或例證)。在一些實施方案中，功能性rspo1變體是截短的rspo1。截短的rspo1多肽的實例包括但不限于seqidno:11和12，或缺失信號肽的加工形式的seqidno:11和12。

“r-脊椎蛋白2(rspo2)”指涉及wnt信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)的r-脊椎蛋白家族成員。術(shù)語“rspo2”可指rspo2蛋白或編碼rspo2蛋白的基因。含有血小板反應(yīng)素1型重復(fù)(tsr-1)的蛋白r-脊椎蛋白的超家族成員包括信號肽、tsr-1結(jié)構(gòu)域和兩個弗林蛋白酶樣重復(fù)。盡管精確的機(jī)制尚不清楚，認(rèn)為r-脊椎蛋白家族多肽活化wnt信號傳導(dǎo)。對于r-脊椎蛋白和wnt信號傳導(dǎo)間關(guān)聯(lián)的進(jìn)一步描述，參見例如kim,k.a.等人(2006)cellcycle5:23-26；kim,k.a.等人(2008)mol.biol.cell.19:2588-2596；jin,y.r.andyoon,j.k.(2012)int.j.biochem.cellbiol.44:2278-2287；和delau,w.b.,等人(2012)genomebiol.13(3):242。

如本文使用的“rspo2”可指全長的前體以及任何加工形式的蛋白(例如分泌自細(xì)胞的成熟蛋白)。rspo2蛋白的實例可包括但不限于人、小鼠、狗和貓rspo2，例如ncbi參考序列np_848660、np_766403、xp_005627927和xp_004000104。rspo2基因的實例可包括但不限于人、小鼠、狗和貓rspo2基因，例如genbankentrezgeneid340419(rspo2，也稱為cristin2)、genbankentrezgeneid239405(rspo2，也稱為ftls、aa673245、d430027k22和2610028f08rik)、genbankentrezgeneid482004和genbankentrezgeneid101087380。在一些實施方案中，rspo2是rspo2的功能性變體。在一些實施方案中，功能性rspo2變體可包含一個或多個氨基酸取代、插入和/或缺失(例如截短)但保留對應(yīng)全長rspo2的一種或多種活性的一些或全部活性(例如，wnt信號傳導(dǎo)活性，其測定在本文描述或例證)。在一些實施方案中，功能性rspo2變體是截短的rspo2。截短的rspo2多肽的實例包括但不限于seqidno:13和14，或缺失信號肽的加工形式的seqidno:13和14。

“r-脊椎蛋白3(rspo3)”指參與wnt信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)的r-脊椎蛋白家族成員。術(shù)語“rspo3”可指rspo3蛋白或編碼rspo3蛋白的基因。含有血小板反應(yīng)素1型重復(fù)(tsr-1)的蛋白r-脊椎蛋白的超家族成員包括信號肽、tsr-1結(jié)構(gòu)域和兩個弗林蛋白酶樣重復(fù)。盡管精確的機(jī)制尚不清楚，認(rèn)為rspo3活化wnt信號傳導(dǎo)，且小鼠和非洲爪蟾(xenopus)中rspo3功能的喪失導(dǎo)致wnt功能喪失表型(kazanskaya,o.,等人(2008)development135:3655-64)。對于r-脊椎蛋白和wnt信號傳導(dǎo)間關(guān)聯(lián)的進(jìn)一步描述，參見例如delau,w.b.,等人(2012)genomebiol.13(3):242。

如本文使用，“rspo3”可指全長的前體以及任何加工形式的蛋白(例如來自細(xì)胞的成熟蛋白)。rspo3蛋白的實例可包括但不限于人、小鼠、狗和貓rspo3，例如ncbi參考序列np_116173、np_082627、xp_005615677和xp_003986583。rspo3基因的實例可包括但不限于人、小鼠、狗和貓rspo3基因，例如genbankentrezgeneid84870(rspo3，也稱為pwtsr、thsd2和cristin1)、genbankentrezgeneid72780(rspo3，也稱為thsd2、cristin1、aw742308和2810459h04rik)、genbankentrezgeneid476287和genbankentrezgeneid101085635。在一些實施方案中，rspo3是rspo3的功能性變體。在一些實施方案中，功能性rspo3變體可包括一個或多個氨基酸取代、插入和/或缺失(例如截短)但但保留對應(yīng)全長rspo3的一種或多種活性的一些或全部活性(例如，wnt信號傳導(dǎo)活性，其測定在本文描述和/或例證)。在一些實施方案中，功能性rspo3變體是截短的rspo3。截短的rspo3多肽的實例包括但不限于seqidno:15-17或缺少信號肽的加工形式的seqidno:15-17。

“r-脊椎蛋白4(rspo4)”指參與wnt信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)的r-脊椎蛋白家族成員。術(shù)語“rspo4”可指rspo4蛋白或編碼rspo4蛋白的基因。含有血小板反應(yīng)素1型重復(fù)(tsr-1)的蛋白r-脊椎蛋白的超家族成員包括信號肽、tsr-1結(jié)構(gòu)域和兩個弗林蛋白酶樣重復(fù)。盡管精確的機(jī)制尚不清楚，認(rèn)為r-脊椎蛋白家族多肽活化wnt信號傳導(dǎo)。對于r-脊椎蛋白和wnt信號傳導(dǎo)間關(guān)聯(lián)的進(jìn)一步描述，參見例如kim,k.a.等人(2006)cellcycle5:23-26；kim,k.a.等人(2008)mol.biol.cell.19:2588-2596；jin,y.r.andyoon,j.k.(2012)int.j.biochem.cellbiol.44:2278-2287；和delau,w.b.,等人(2012)genomebiol.13(3):242。

如本文使用，“rspo4”可指全長的前體以及任何加工形式的蛋白(例如分泌自細(xì)胞的成熟蛋白)。rspo4蛋白的實例可包括但不限于人、小鼠、狗和貓rspo4，例如ncbi參考序列np_001025042、np_001035779、xp_542937和xp_011279253。rspo4基因的實例可包括但不限于人、小鼠、狗和貓rspo4基因，例如genbankentrezgeneid343637(rspo4，也稱為cristin4和c20orf182)、genbankentrezgeneid228770(rspo4，也稱為a730099f22和a930029k19rik)、genbankentrezgeneid485813和genbankentrezgeneid101091527。在一些實施方案中，rspo4是rspo4的功能性變體。在一些實施方案中，功能性rspo4變體可包含一個或多個氨基酸取代、插入和/或缺失(例如截短)但保留對應(yīng)全長rspo4的一種或多種活性的一些或全部活性(例如，wnt信號傳導(dǎo)活性，其測定在本文描述或例證)。在一些實施方案中，功能性rspo4變體是截短的rspo4。截短的rspo4多肽的實例包括但不限于seqidno:18和19，或缺少信號肽的加工形式的seqidno:18和19。

如本文使用，“rna干擾(rnai)”是其中rna分子抑制基因表達(dá)(通常通過引起特定mrna分子的破壞)的生物過程。rnai的實例包括小抑制性rna(sirna)、微小rna(mirna)、小發(fā)夾rna(shrna)。

如本文使用，“小發(fā)夾rna”或“短發(fā)夾rna”(shrna)是產(chǎn)生能夠用于沉默靶基因表達(dá)(例如通過rna干擾)的緊固發(fā)夾回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)(tighthairpinturn)的rna分子。

“wnt信號傳導(dǎo)”指通過wnt蛋白和卷曲(frizzled，fz)家族受體間的相互作用調(diào)節(jié)的相關(guān)細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的集合(綜述參考例如logan,c.y.,andnusse,r.(2004)annu.rev.celldev.biol.20:781-810)。這些通路參與各種各樣的發(fā)育和致病過程。如本文使用，除非另外表明，術(shù)語“wnt信號傳導(dǎo)”可指典型wnt通路的部分或全部，wnt/平面細(xì)胞極性(planarcellpolarity，pcp)通路和/或wnt/鈣通路。例如，在典型的wnt通路中，wnt與卷曲(frizzled)/lrp受體復(fù)合物的結(jié)合導(dǎo)致dishevelled(dsh)、axin、結(jié)腸腺瘤性息肉(adenomatouspolyposiscoli，apc)和糖原合酶激酶(gsk-3)活性的調(diào)節(jié)，最終抑制β-連環(huán)蛋白的降解。β-連環(huán)蛋白隨后能夠轉(zhuǎn)運(yùn)至核并調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，例如，結(jié)合淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子1/t細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(lef/tcf)轉(zhuǎn)錄因子。在一些實施方案中，可測定β-連環(huán)蛋白活性作為wnt信號傳導(dǎo)的讀出(例如通過top-flash測定，如molenaar,m.,等人(1996)cell86(3):391-9中所表征)。

本文提及“約”某個值或參數(shù)包括(和描述)針對值或參數(shù)本身的實施方案。例如，提及“約x”的描述包括“x”的描述。

如本文使用，除非另外表明，單數(shù)形式的冠詞“一種”、“一個”和“所述”包括復(fù)數(shù)指代物。

應(yīng)該理解的是，本文所述的本發(fā)明的方面和實施方案包括“包含”、“由…組成”和/或“基本上由…組成”的方面和實施方案。

iii.治療方法

本發(fā)明提供用于肌纖蛋白(myoc)青光眼的基因療法的方法，其中將包含治療載體的raav顆粒遞送至哺乳動物的眼部。在一些實施方案中，肌纖蛋白(myoc)青光眼是原發(fā)性開角型青光眼(poac)。在一些實施方案中，肌纖蛋白(myoc)青光眼是幼年型原發(fā)性開角型青光眼(joac)。在一些實施方案中，哺乳動物是人(例如具有poac的人或具有joac的人)。在一些實施方案中，具有肌纖蛋白(myoc)青光眼的哺乳動物具有突變的myoc。在一些實施方案中，突變的myoc包含對應(yīng)人myoc的e323k、k398r、q368x、g364v、p370l、d380a、k423e、y437h和i477s的一個或多個氨基酸取代。在一些實施方案中，突變的myoc基因包含對應(yīng)人myoc的p370l和/或y437h氨基酸取代的一個或多個氨基酸取代。在一些實施方案中，本發(fā)明提供在人中治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法，包括對所述人的眼部施用有效量的raav顆粒，所述顆粒含有編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體和/或myocrnai(例如shrna)的載體。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法用于減少哺乳動物中肌纖蛋白(myoc)青光眼的癥狀；例如，減少眼內(nèi)壓、減少小梁網(wǎng)中myoc的積累、減少眼高壓或增加來自小梁網(wǎng)的房水外流。

一些方面，本發(fā)明提供在具有眼部病癥的哺乳動物中增強(qiáng)小梁網(wǎng)細(xì)胞中wnt信號傳導(dǎo)的方法，包括對所述哺乳動物的眼部施用重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，所述顆粒包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的載體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供在具有眼部病癥的哺乳動物中增強(qiáng)小梁網(wǎng)細(xì)胞中wnt信號傳導(dǎo)的方法，包括對所述哺乳動物的眼部施用重組腺伴隨病毒(raav)顆粒，所述顆粒包含編碼靶向哺乳動物中肌纖蛋白(myoc)表達(dá)的myocrnai的載體。在一些實施方案中，wnt信號傳導(dǎo)使用表達(dá)rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體和/或myocrnai的一種或多種病毒顆粒增強(qiáng)；例如，rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體和myocrnai可從具有不同重組病毒基因組或從相同的raav病毒基因組表達(dá)。

治療性載體

本發(fā)明提供用于肌纖蛋白(myoc)青光眼的基因療法的方法，其中將包含治療性載體的raav顆粒遞送至哺乳動物的眼部；例如，治療性載體可編碼治療性核酸和/或治療性多肽。編碼治療性核酸和/或治療性多肽的治療性aav載體可使用本領(lǐng)域已知的方法、使用標(biāo)準(zhǔn)合成和重組方法生成。在一些實施方案中，治療性多肽是刺激wnt信號傳導(dǎo)的多肽。在一些實施方案中，突變體myoc存在下治療性多肽刺激wnt信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，人突變體myoc存在下治療性多肽刺激wnt信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，與青光眼相關(guān)的人突變體myoc存在下治療性多肽刺激wnt信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，突變體myoc包含p370l和/或y437h氨基酸取代。在一些實施方案中，突變的myoc包含對應(yīng)人myoc的e323k、k398r、q368x、g364v、p370l、d380a、k423e、y437h和i477s的一個或多個氨基酸取代。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的raav載體，其中所述raav載體編碼r-脊椎蛋白(rspo)多肽(例如rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體)。在一些實施方案中，rspo1多肽是人rspo1。在一些實施方案中，rspo1包含seqidno:8的氨基酸序列或其功能性變體。rspo1功能性變體的實例包括具有一個或多個氨基酸取代、添加和/或缺失的seqidno:8的氨基酸序列。在一些實施方案中，變體rspo1包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10個取代、添加和/或缺失的seqidno:8的氨基酸序列，同時維持刺激wnt信號傳導(dǎo)的能力(例如，突變體myoc存在下)。在一些實施方案中，變體rspo1與seqidno:8具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo1是截短的rspo1。在一些實施方案中，截短的rspo1可包含一個或多個弗林蛋白酶樣富含cys結(jié)構(gòu)域(例如fu1和/或fu2)但缺少下述中的一個或多個：信號肽、血小板反應(yīng)素1型結(jié)構(gòu)域(例如tsr-1或tsp1)和/或帶正電荷的c-末端結(jié)構(gòu)域(例如包含二分nls和/或br結(jié)構(gòu)域；例如參見圖11-13c)。在一些實施方案中，截短的rspo1可包含seqidno:11和/或12或缺少信號肽的加工形式的seqidno:11和/或12。在一些實施方案中，截短的rspo1與seqidno:11和/或12具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo2多肽是人rspo2。在一些實施方案中，rspo2包含seqidno:9的氨基酸序列或其功能性變體。rspo2功能性變體的實例包括具有一個或多個氨基酸取代、添加和/或缺失的seqidno:9的氨基酸序列的rspo2。在一些實施方案中，變體rspo2包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10個取代、添加和/或缺失的seqidno:9的氨基酸序列，同時維持刺激wnt信號傳導(dǎo)的能力(例如，突變體myoc存在下)。在一些實施方案中，變體rspo2與seqidno:9具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo2是截短的rspo2。在一些實施方案中，截短的rspo2可包含一個或多個弗林蛋白酶樣富含cys結(jié)構(gòu)域(例如fu1和/或fu2)但缺少下述中的一個或多個：信號肽、血小板反應(yīng)素1型結(jié)構(gòu)域(例如tsr-1或tsp1)和/或帶正電荷的c-末端結(jié)構(gòu)域(例如包含二分nls和/或br結(jié)構(gòu)域；以供參考參見圖11-13c)。在一些實施方案中，截短的rspo2可包含seqidno:13和/或14，或缺少信號肽的加工形式的seqidno:13和/或14。在一些實施方案中，截短的rspo2與seqidno:13和/或14具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo3多肽是人rspo3。在一些實施方案中，rspo3包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能性變體。rspo3功能性變體的實例包括具有一個或多個氨基酸取代、添加和/或缺失的seqidno:1的氨基酸序列的rspo3。在一些實施方案中，變體rspo3包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10個取代、添加和/或缺失的seqidno:1的氨基酸序列，同時維持刺激wnt信號傳導(dǎo)的能力(例如，突變體myoc存在下)。在一些實施方案中，變體rspo3與seqidno:1具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo3是截短的rspo3。在一些實施方案中，截短的rspo3可包含一個或多個弗林蛋白酶樣富含cys結(jié)構(gòu)域(例如fu1和/或fu2)但缺少下述中的一個或多個：信號肽、血小板反應(yīng)素1型結(jié)構(gòu)域(例如tsr-1或tsp1)和/或帶正電荷的c-末端結(jié)構(gòu)域(例如包含二分nls和/或br結(jié)構(gòu)域；例如參見圖11-13c)。在一些實施方案中，截短的rspo3可包含seqidno:15、16和/或17或缺少信號肽的加工形式的seqidno:15、16和/或17。在一些實施方案中，截短的rspo3與seqidno:15、16和/或17具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo4多肽是人rspo4。在一些實施方案中，rspo4包含seqidno:9的氨基酸序列或其功能性變體。rspo2功能性變體的實例包括具有一個或多個氨基酸取代、添加和/或缺失的seqidno:10的氨基酸序列的rspo2。在一些實施方案中，變體rspo4包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10個取代、添加和/或缺失的seqidno:10的氨基酸序列，同時維持刺激wnt信號傳導(dǎo)的能力(例如，突變體myoc存在下)。在一些實施方案中，變體rspo4與seqidno:10具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些實施方案中，rspo4是截短的rspo4。在一些實施方案中，截短的rspo4可包含一個或多個弗林蛋白酶樣富含cys結(jié)構(gòu)域(例如fu1和/或fu2)但缺少下述中的一個或多個：信號肽、血小板反應(yīng)素1型結(jié)構(gòu)域(例如tsr-1或tsp1)和/或帶正電荷的c-末端結(jié)構(gòu)域(例如包含二分nls和/或br結(jié)構(gòu)域；例如參見圖11-13c)。在一些實施方案中，截短的rspo4可包含seqidno:18和/或19或缺少信號肽的加工形式的seqidno:18和19。在一些實施方案中，截短的rspo4與seqidno:18和/或19具有大于約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在一些實施方案中，raav載體包含與啟動子可操作連接的編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的核酸。在一些實施方案中，啟動子能夠在哺乳動物眼中表達(dá)rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體。在一些實施方案中，啟動子能夠在小梁網(wǎng)的細(xì)胞中表達(dá)rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體。在一些實施方案中，啟動子是雜交雞β-肌動蛋白(cba)啟動子。

本發(fā)明提供用于肌纖蛋白(myoc)青光眼的基因療法的方法，其中將包含治療性載體的raav顆粒遞送至哺乳動物的眼部；例如治療性載體可編碼治療性核酸和/或治療性多肽。編碼治療性核酸和/或治療性多肽的治療性aav載體可使用本領(lǐng)域已知的方法、使用標(biāo)準(zhǔn)的合成和重組方法生成。在一些實施方案中，治療性核酸編碼靶向myoc的表達(dá)的rna。在一些實施方案中，異源核酸編碼減少或抑制myoc的表達(dá)的rna。在一些實施方案中，異源核酸編碼減少或抑制突變體myoc的表達(dá)的rna。在一些實施方案中，異源核酸編碼減少或抑制突變體人myoc的表達(dá)的rna。在一些實施方案中，突變體人myoc包含p370l氨基酸取代和/或y437氨基酸取代。治療性核酸的非限制性實例包括rnai、小抑制性rna(sirna)、微小rna(mirna)、小發(fā)夾rna(shrna)和/或核酶(如錘頭和發(fā)夾核酶)。在一些實施方案中，編碼減少或抑制myoc的表達(dá)的rna的異源核酸是減少或抑制myoc的表達(dá)的shrna(例如野生型和突變體myoc)。

一些方面，本發(fā)明提供用于肌纖蛋白(myoc)青光眼的基因療法的方法，其中將包含治療性載體的raav顆粒遞送至哺乳動物的眼部，其中所述載體包含編碼一種或多種治療性多肽的核酸。包含治療性載體的raav顆?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法、使用標(biāo)準(zhǔn)合成和重組方法生成。在一些實施方案中，載體編碼治療性多肽。在一些實施方案中，治療性多肽靶向wnt信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，治療性多肽刺激wnt信號傳導(dǎo)。

一些方面，本發(fā)明提供用于肌纖蛋白(myoc)青光眼的基因療法的方法，其中將包含治療性載體的raav顆粒遞送至哺乳動物的眼部，其中所述載體包含編碼一種或多種治療性多肽和一種或多種治療性核酸的核酸。包含治療性載體的raav顆粒可使用本領(lǐng)域已知的方法、使用標(biāo)準(zhǔn)合成和重組方法生成。在一些實施方案中，治療性多肽靶向wnt信號傳導(dǎo)且治療性核酸靶向myoc表達(dá)。在一些實施方案中，治療性多肽刺激wnt信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，異源核酸編碼減少或抑制myoc的表達(dá)的rna。在一些實施方案中，異源核酸編碼減少或抑制突變體myoc表達(dá)的rna。在一些實施方案中，異源核酸編碼減少或抑制突變體人myoc的表達(dá)的rna。在一些實施方案中，突變體人myoc包含p370l氨基酸取代和/或y437氨基酸取代。治療性核酸的非限制性實例包括rnai、sirna、mirna、shrna和/或核酶。

一些方面，本發(fā)明提供在哺乳動物中用于肌纖蛋白(myoc)青光眼的基因療法的方法，其中將包含編碼一種或多種治療性多肽的載體的raav顆粒施用至哺乳動物并將包含編碼一種或多種治療性核酸的載體的raav顆粒施用至哺乳動物。在一些實施方案中，治療性多肽靶向wnt信號傳導(dǎo)且治療性核酸靶向myoc表達(dá)。在一些實施方案中，治療性多肽刺激wnt信號傳導(dǎo)。在一些實施方案中，異源核酸編碼減少或抑制myoc的表達(dá)的rna。在一些實施方案中，異源核酸編碼減少或抑制突變體myoc的表達(dá)的rna。在一些實施方案中，異源核酸編碼減少或抑制突變體人myoc的表達(dá)的rna。在一些實施方案中，突變體人myoc包含p370l氨基酸取代和/或y437氨基酸取代。治療性核酸的非限制性實例包括rnai、sirna、mirna、shrna和/或核酶?？蓪幋a一種或多種治療性多肽的載體的raav顆粒和包含編碼一種或多種治療性核酸的載體的raav顆粒同時或順序施用至哺乳動物。在一些實施方案中，在施用包含編碼一種或多種治療性核酸的載體的raav顆粒前施用包含編碼一種或多種治療性多肽的載體的raav顆粒。在一些實施方案中，在施用包含編碼一種或多種治療性核酸的載體的raav顆粒后施用包含編碼一種或多種治療性多肽的載體的raav顆粒。

本發(fā)明的核酸可編碼為細(xì)胞內(nèi)蛋白、錨定在細(xì)胞膜中、保留在細(xì)胞內(nèi)或使用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的由細(xì)胞分泌的多肽。對于由接受載體的細(xì)胞分泌的多肽；優(yōu)選所述多肽是可溶的(即不附著至細(xì)胞)。例如，可溶多肽缺少跨膜區(qū)且由細(xì)胞分泌。鑒定和去除編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的核酸序列的技術(shù)為本領(lǐng)域已知。

根據(jù)本發(fā)明可施用的載體還包括含有編碼rna(例如shrna、rnai、核酶、mirna、sirna、反義rna)的核酸的載體，當(dāng)由載體的核酸轉(zhuǎn)錄時所述rna可通過干擾與本發(fā)明的疾病狀態(tài)相關(guān)的異?；蜻^量蛋白例如myoc的翻譯或轉(zhuǎn)錄治療肌纖蛋白(myoc)青光眼。在一些實例中，本發(fā)明的核酸可編碼rna，其通過高度特異性消除或減少編碼異常和/或過量蛋白的mrna治療疾病。治療性rna序列包括小發(fā)夾rna(shrna)、rnai、小抑制性rna(sirna)、微小rna(mirna)和/或核酶(如錘頭和發(fā)夾核酶)，其可通過高度特異性消除或減少編碼異常和/或過量蛋白的mrna治療疾病，所述蛋白如在多種形式的遺傳性視網(wǎng)膜變性中發(fā)生的那些?？捎糜诒景l(fā)明的治療性rna序列和編碼這些序列的核酸的實例包括描述于例如美國專利號6,225,291中的那些，其內(nèi)容在本文通過提述以其全文并入。

在本發(fā)明的一些實施方案中，治療性rna序列是靶向myoc的表達(dá)的rnai(例如shrna)序列。在一些實施方案中，靶向myoc的表達(dá)的rnai(例如shrna)序列是減少或抑制myoc的表達(dá)的rnai(例如shrna)序列。在一些實施方案中，rnai(例如shrna)減少或抑制人myoc的表達(dá)。在一些實施方案中，rnai(例如shrna)減少或抑制包含seqidno:3的氨基酸序列的myoc的表達(dá)。在一些實施方案中，myocrnai(例如shrna)靶向myoc的qamsvih(seqidno:6)氨基酸序列。在一些實施方案中，raav顆粒編碼包含多于一種靶向myoc的表達(dá)(例如減少或抑制)的rnai的載體。在一些實施方案中，myocrnai(例如shrna)的環(huán)序列包含核酸序列aatagtgaagccacagatgtatt(seqidno:7)。在一些實施方案中，raav顆粒編碼包含靶向myoc的表達(dá)(例如減少或抑制)的1、2、3、4、5或更多種rnai(例如，shrna)的載體。

在一些實施方案中，raav載體包含與啟動子可操作連接的編碼myocrnai(例如shrna)的核酸。在一些實施方案中，啟動子能夠在哺乳動物的眼中表達(dá)myocrnai(例如shrna)。在一些實施方案中，啟動子能夠在小梁網(wǎng)的細(xì)胞中表達(dá)myocrnai(例如shrna)。在一些實施方案中，啟動子是雜交雞β-肌動蛋白(cba)啟動子。在一些實施方案中，啟動子是rna聚合酶iii啟動子。

在一些實施方案中，raav載體包含編碼如本文所述的任何rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的核酸和編碼任何如本文所述的myocrnai(例如shrna)的核酸。在一些實施方案中，編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的核酸和編碼myocrnai(例如shrna)的核酸在不同的raav基因組上。在一些實施方案中，編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的核酸和編碼myocrnai(例如shrna)的核酸在相同的raav基因組上。在一些實施方案中，編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的核酸和編碼myocrnai(例如shrna)的核酸與相同的啟動子可操作連接。在一些實施方案中，編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的核酸和編碼myocrnai(例如shrna)的核酸與不同的啟動子可操作連接。在一些實施方案中，編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的核酸在編碼myocrnai(例如shrna)的核酸的5’。在一些實施方案中，編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的核酸在編碼myocrnai(例如shrna)的核酸的3’。在一些實施方案中，編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的核酸和編碼myocrnai(例如shrna)的核酸與相同的啟動子可操作連接，其中所述核酸在rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體和myocrnai(例如shrna)核酸間包含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)。

raav組合物

一些方面，本發(fā)明提供含有任何本文所述的raav顆粒的組合物。一般而言，用于在本發(fā)明的方法和系統(tǒng)中使用的組合物包含有效量的含有編碼多肽和/或rna的raav載體的raav顆粒，優(yōu)選在藥物上可接受的賦形劑中。如本領(lǐng)域熟知，藥物上可接受的賦形劑是相對惰性的物質(zhì)，其促進(jìn)藥理學(xué)上有效的物質(zhì)的施用，且可作為液體溶液或懸浮液、作為乳液或作為適于在使用前于液體中溶解或懸浮的固體形式提供。例如，賦形劑可給予形狀或稠度，或作為稀釋劑發(fā)揮作用。適當(dāng)?shù)馁x形劑包括但不限于穩(wěn)定劑、潤濕和乳化劑、用于改變滲透壓的鹽、封裝劑、ph緩沖物質(zhì)和緩沖劑。這樣的賦形劑包括任何適于直接遞送至眼部的藥劑，對其施用將不具有過度毒性。藥物上可接受的賦形劑包括但不限于山梨醇、多種吐溫化合物的任一種和液體如水、鹽水、甘油和乙醇。藥物上可接受的鹽可包括其中，例如，無機(jī)酸鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；和有機(jī)酸的鹽如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。藥物上可接受的賦形劑的深入討論可在remington’spharmaceuticalsciences(mackpub.co.,n.j.1991)中獲得。

一般而言，這些化合物經(jīng)配制用于通過眼部注射的施用(例如玻璃體內(nèi)、房內(nèi)、視網(wǎng)膜下)。因此，這些組合物優(yōu)選與藥物上可接受的媒劑如鹽水、林格平衡鹽溶液(ringer’sbalancedsaltsolution,ph7.4)等組合。盡管不需要，但組合物可任選以適于精確量施用的單位劑型提供。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的raav的藥物制劑。在一些實施方案中，所述制劑包含含有編碼rspo1、rspo2、rspo3和/或rspo4多肽或其功能性變體的raav載體的raav顆粒。在一些實施方案中，所述制劑包含含有編碼myocrnai(例如shrna)的raav載體的raav顆粒。在一些實施方案中，所述制劑包含含有編碼rspo1、rspo2、rspo3和/或rspo4多肽或其功能性變體和myocrnai(例如shrna)的raav載體的raav顆粒。在一些實施方案中，所述制劑包含含有編碼rspo1、rspo2、rspo3和/或rspo4多肽或其功能性變體的raav載體的raav顆粒和含有編碼myocrnai(例如shrna)的raav載體的raav顆粒。

raav眼部遞送的方法

一些方面，本發(fā)明提供在哺乳動物中治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法，其包括將raav顆粒施用至哺乳動物的眼部。在一些實施方案中，raav顆粒包含編碼rspo1、rspo2、rspo3和/或rspo4多肽或其功能性變體的raav載體和/或編碼myocrnai(例如shrna)的raav載體。在一些實施方案中，將raav顆粒通過玻璃體內(nèi)和/或房內(nèi)注射遞送至眼部。將raav顆粒施用至眼部的方法為本領(lǐng)域已知。

在一些實施方案中，將包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體和/或myocrnai(例如shrna)的raav載體的raav顆粒遞送至哺乳動物的眼部，其中rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體和/或myocrnai(例如shrna)在眼部小梁網(wǎng)中表達(dá)。在一些實施方案中，將包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體的raav載體的raav顆粒遞送至其中眼部的其他部分被轉(zhuǎn)導(dǎo)的哺乳動物的眼部(例如視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)。包含含有r471a氨基酸取代的aav2衣殼的raav顆粒的使用可促進(jìn)小梁網(wǎng)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

通過使用包含治療性多肽或核酸序列的載體安全和有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)眼部細(xì)胞(例如小梁網(wǎng)的細(xì)胞)，本發(fā)明的方法可用于治療具有肌纖蛋白(myoc)青光眼的個體例如人，其中轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞以足以治療肌纖蛋白(myoc)青光眼(例如poac或joac)的量產(chǎn)生治療性多肽或rna序列。在一些實施方案中，眼部細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)通過使用含有aav衣殼蛋白的r471a氨基酸取代(其基于aav2的vp1編號)的raav2顆粒改進(jìn)。在一些實施方案中，raav顆粒證實增加的小梁網(wǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)；例如大于約10％、25％、50％、75％、100％或其間任何數(shù)值的小梁網(wǎng)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

取決于治療目的，施用有效量的raav(在一些實施方案中以顆粒的形式)。例如，其中低轉(zhuǎn)導(dǎo)百分比可實現(xiàn)預(yù)期的治療效果，隨后治療目的一般滿足或超過該轉(zhuǎn)導(dǎo)水平。在一些情況中，該轉(zhuǎn)導(dǎo)水平可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)僅約1-5％的靶細(xì)胞(例如小梁網(wǎng)的細(xì)胞)實現(xiàn)，在一些實施方案中，至少約20％預(yù)期組織類型的細(xì)胞，在一些實施方案中，至少約50％，在一些實施方案中，至少約80％，在一些實施方案中至少約95％，在一些實施方案中至少約99％的預(yù)期組織類型的細(xì)胞。作為指導(dǎo)，每次注射施用的顆粒數(shù)目一般為約1×10⁶至約1×10¹⁴顆粒間、約1×10⁷至約1×10¹³顆粒間、約1×10⁹至約1×10¹²顆粒間或約1×10⁹顆粒、約1×10¹⁰顆?；蚣s1×10¹¹顆粒。raav組合物可通過一次或多次眼部注射施用，在相同的操作過程中或按天、周、月或年間隔開。在一些實施方案中，可使用多種載體以治療人。

鑒別由aav病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的眼部細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域已知；例如，免疫組化或標(biāo)記物如增強(qiáng)的綠色熒光蛋白的使用可用于檢測病毒顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)；例如包含具有一個或多個氨基酸取代的raav衣殼的病毒顆粒。

在本發(fā)明的一些實施方案中，所述方法包括玻璃體內(nèi)和/或房內(nèi)施用有效量的aav病毒顆粒至哺乳動物用于治療具有肌纖蛋白(myoc)青光眼的個體；例如具有poac或joac的人。在一些實施方案中，將組合物注射至眼中的一個或多個位置以允許異源核酸在眼部細(xì)胞(例如小梁網(wǎng)的細(xì)胞)中的表達(dá)。在一些實施方案中，將組合物注射入眼中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10處位置的任一種。

在一些實施方案中，將包含raav衣殼的raav病毒顆粒同時或順序施用至多于一處的位置。在一些實施方案中，raav病毒顆粒的多次注射間隔不超過1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、9小時、12小時或24小時。

視網(wǎng)膜下遞送方法

視網(wǎng)膜下遞送的方法為本領(lǐng)域已知。例如，參見wo2009/105690，其通過提述并入本文。簡言之，用于遞送raav顆粒(例如raav2顆粒)至黃斑和中央凹的視網(wǎng)膜下的一般方法可通過以下簡要概述說明。該實例僅意在說明該方法的一些特征，而并非意在限制。

一般而言，raav載體可以組合物的形式使用手術(shù)顯微鏡在直接觀察下通過眼內(nèi)注射(視網(wǎng)膜下)遞送。在一些實施方案中，載體封裝在raav顆粒中，其中所述raav顆粒包含含有raav衣殼蛋白的raav衣殼，所述raav衣殼蛋白在一個或多個與硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的位置包含一個或多個氨基酸取代(例如，減少或抑制或去除hspg結(jié)合)，且raav載體包含異源核酸和至少一個aav反向末端重復(fù)。該過程可涉及玻璃體切除術(shù)，隨后通過一個或多個小視網(wǎng)膜切開術(shù)使用精細(xì)套管注射raav載體懸浮液進(jìn)入視網(wǎng)膜下間隙。

簡言之，整個操作過程中輸液套管可縫合到位以通過輸液(例如鹽水)維持正常的球體積。玻璃體切除術(shù)使用適當(dāng)孔徑(例如20-27計)的套管實施，其中去除的玻璃體凝膠的體積由來自輸液套管的鹽水或其他等滲溶液的輸液替換。玻璃體切除術(shù)的實施具有的優(yōu)勢在于(1)其皮層(后玻璃體膜)的去除通過套管促進(jìn)視網(wǎng)膜滲透；(2)其去除和以流體(例如鹽水)替換生成空間以容納載體的眼內(nèi)注射，和(3)其受控的去除減少視網(wǎng)膜撕裂和意外的視網(wǎng)膜脫落的可能性。

在一些實施方案中，通過利用適當(dāng)孔徑(例如27-45計)的套管，raav組合物直接注射入中心視網(wǎng)膜外的視網(wǎng)膜下間隙，因此在視網(wǎng)膜下間隙中生成泡。在其他實施方案中，raav組合物的視網(wǎng)膜下注射通過將小體積(例如約0.1至約0.5ml)的適當(dāng)流體(如鹽水或林格氏溶液)視網(wǎng)膜下注射入中心視網(wǎng)膜外的視網(wǎng)膜下間隙進(jìn)行。向視網(wǎng)膜下間隙內(nèi)的該初始注射在視網(wǎng)膜下間隙內(nèi)建立了初始流體泡，導(dǎo)致在初始泡位置處的局部視網(wǎng)膜脫落。該初始流體泡可促進(jìn)raav組合物向視網(wǎng)膜下間隙的靶向遞送(通過在raav遞送前限定注射的平面)，并最小化進(jìn)入脈絡(luò)膜的可能的raav施用和raav注射或回流進(jìn)入玻璃體腔的可能性。在一些實施方案中，該初始流體泡可進(jìn)一步用包含一種或多種raav組合物和/或一種或多種其他治療劑的流體通過以相同或額外的細(xì)孔套管將這些流體直接施用至初始流體泡注射。

raav組合物和/或初始的小體積流體的眼內(nèi)施用可使用附接至注射器的細(xì)孔套管(例如27-45計)實施。在一些實施方案中，該注射器的柱塞可通過機(jī)械裝置驅(qū)動，如通過腳踏板的下壓。在每個受試者中根據(jù)待靶向的視網(wǎng)膜區(qū)(但在中心視網(wǎng)膜外)，細(xì)孔套管通過硬皮切開術(shù)推進(jìn)，通過玻璃體腔并在預(yù)先確定的位點(diǎn)進(jìn)入視網(wǎng)膜。在直接觀察下，載體懸浮液在神經(jīng)感覺視網(wǎng)膜下機(jī)械注射，導(dǎo)致使用自密封不擴(kuò)張視網(wǎng)膜切開術(shù)的局部視網(wǎng)膜脫離。如上所述，raav組合物可直接注射入視網(wǎng)膜下間隙，在中心視網(wǎng)膜外生成泡或載體可注射入中心視網(wǎng)膜外的初始泡，使其擴(kuò)張(并擴(kuò)張視網(wǎng)膜脫離區(qū))。在一些實施方案中，raav組合物注射后將另一流體注射入泡。

不希望受理論所限，視網(wǎng)膜下注射的速率和位置可導(dǎo)致可損傷黃斑、中央凹和/或潛在的rpe細(xì)胞的局部剪切力。視網(wǎng)膜下注射可以最小化或避免剪切力的速率實施。在一些實施方案中，raav組合物經(jīng)約15-17分鐘注射。在一些實施方案中，載體經(jīng)約17-20分鐘注射。在一些實施方案中，raav組合物經(jīng)約20-22分鐘注射。在一些實施方案中，raav組合物以約35至約65μl/min的速率注射。在一些實施方案中，raav組合物以約35μl/min的速率注射。在一些實施方案中，raav組合物以約40μl/min的速率注射。在一些實施方案中，raav組合物以約45μl/min的速率注射。在一些實施方案中，raav組合物以約50μl/min的速率注射。在一些實施方案中，raav組合物以約55μl/min的速率注射。在一些實施方案中，raav組合物以約60μl/min的速率注射。在一些實施方案中，raav組合物以約65μl/min的速率注射。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)可泡的注射速率和時間可由下述指導(dǎo)：例如raav組合物的體積或生產(chǎn)足夠的視網(wǎng)膜脫離以接近中心視網(wǎng)膜的細(xì)胞的泡的大小、用于遞送raav組合物的套管的大小和安全保持本發(fā)明的套管位置的能力。

在本發(fā)明的一些實施方案中，注射至視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜下間隙的組合物的體積大于約1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl或1ml的任一種或其間任何量。

可生成一個或多個(例如2、3或多個)泡。一般而言，由本發(fā)明的方法和系統(tǒng)生成的泡的總體積不能超過眼部的流體體積，例如在典型的人受試者中為約4ml。每個單獨(dú)的泡的總體積優(yōu)選為至少約0.3ml，且更優(yōu)選為至少約0.5ml進(jìn)而促進(jìn)足夠大小的視網(wǎng)膜脫落以暴露中心視網(wǎng)膜的細(xì)胞類型并生成具有用于優(yōu)化操作的足夠依賴性的泡。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解在根據(jù)本發(fā)明的方法和系統(tǒng)生成泡的過程中，必須維持適當(dāng)?shù)难蹆?nèi)壓進(jìn)而避免對眼部結(jié)構(gòu)的損傷。每個單獨(dú)的泡的大小可以為例如約0.5至約1.2ml、約0.8至約1.2ml、約0.9至約1.2ml、約0.9至約1.0ml、約1.0至約2.0ml、約1.0至約3.0ml。因此，在一個實例中，為注射共3ml的raav組合物懸浮液，可建立每個約1ml的3個泡。全部泡的組合的總體積可以是例如約0.5至約3.0ml、約0.8至約3.0ml、約0.9至約3.0ml、約1.0至約3.0ml、約0.5至約1.5ml、約0.5至約1.2ml、約0.9至約3.0ml、約0.9至約2.0ml、約0.9至約1.0ml。

為安全并有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)泡最初位置邊緣外的靶視網(wǎng)膜(例如中心視網(wǎng)膜)區(qū)域，可操縱泡以將泡重新定位至靶區(qū)域以供轉(zhuǎn)導(dǎo)。泡的操縱可通過由泡體積生成的泡的依賴性、包含泡的眼部的重新定位、具有包含一個或多個泡的一只眼或雙眼的人頭部的重新定位和/或通過流體-空氣交換的方式發(fā)生。這與中心視網(wǎng)膜是特別相關(guān)的，因為該區(qū)域通常通過視網(wǎng)膜下注射抵抗脫落。在一些實施方案中，利用流體-空氣交換以重新定位泡；來自輸液套管的流體由空氣臨時替換，例如來自將空氣吹至視網(wǎng)膜表面上。當(dāng)空氣的體積從視網(wǎng)膜的表面排出玻璃體腔流體時，玻璃體腔中的流體可以從套管中流出。來自玻璃體腔流體的壓力的臨時缺少使泡移動并受引力作用至眼部的從屬部分。通過適當(dāng)定位眼球，視網(wǎng)膜下的raav組合物的泡經(jīng)操縱以涉及鄰近區(qū)域(例如黃斑和/或中央凹)。在一些情況中，泡的重量足以引起其發(fā)生引力作用，即使不使用流體-空氣交換。泡向預(yù)期位置的移動可進(jìn)一步由改變受試者頭的位置促進(jìn)，進(jìn)而允許泡受引力作用至眼中的預(yù)期位置。一旦實現(xiàn)泡的預(yù)期構(gòu)造，流體返回至玻璃體腔。流體是適當(dāng)?shù)牧黧w，例如新鮮鹽水。一般而言，視網(wǎng)膜下raav組合物可留在原處而無視網(wǎng)膜粘結(jié)術(shù)至視網(wǎng)膜切開術(shù)且無眼內(nèi)填塞，且視網(wǎng)膜將在約48小時內(nèi)自發(fā)重新附著。

通過使用包含治療性多肽或rna序列的載體安全并有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)眼部細(xì)胞(例如小梁網(wǎng)的細(xì)胞)，本發(fā)明的方法可用于治療具有肌纖蛋白(myoc)青光眼的個體例如人，其中轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞以足以治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的量產(chǎn)生治療性多肽或rna序列。

取決于治療目的，施用有效量的raav(在一些實施方案中以顆粒的形式)。例如，當(dāng)?shù)桶俜直鹊霓D(zhuǎn)導(dǎo)可實現(xiàn)預(yù)期治療效果時，則治療目的一般滿足或超過該轉(zhuǎn)導(dǎo)水平。在一些情況中，該轉(zhuǎn)導(dǎo)水平可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)僅約1-5％的靶細(xì)胞實現(xiàn)，在一些實施方案中至少約20％的預(yù)期組織類型的細(xì)胞，在一些實施方案中至少約50％，在一些實施方案中至少約80％，在一些實施方案中至少約95％，在一些實施方案中至少約99％的預(yù)期組織類型的細(xì)胞。如上文討論，與hspg相互作用的raav衣殼的一個或多個氨基酸的取代改進(jìn)raav轉(zhuǎn)導(dǎo)。作為指導(dǎo)，每次注射施用的顆粒數(shù)目一般在約1×10⁶至約1×10¹⁴顆粒間，約1×10⁷至1×10¹³顆粒間，約1×10⁹至1×10¹²顆粒間或約1×10¹¹顆粒。raav組合物可通過一次或多次視網(wǎng)膜下注射施用，在相同操作過程中或按天、周、月或年間隔開。在一些實施方案中，可將多重載體用于治療人。

在一些實施方案中，將有效量的raav病毒顆粒施用至眼部導(dǎo)致大于約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或100％的任何或其間任何％的眼部細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一些實施方案中，約5％至約100％、約10％至約50％、約10％至約30％、約25％至約75％、約25％至約50％或約30％至約50％的眼部細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。鑒定由包含raav衣殼的aav病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的眼部細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域已知，例如免疫組化或標(biāo)記物的使用如增強(qiáng)的綠色熒光蛋白可用于檢測病毒顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

在一些實施方案中，有效量的raav病毒顆粒向小梁網(wǎng)的施用導(dǎo)致大于約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或100％的任何或其間任何％的小梁網(wǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一些實施方案中，約5％至約100％、約10％至約50％、約10％至約30％、約25％至約75％、約25％至約50％或約30％至約50％的小梁網(wǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。鑒定由包含raav衣殼的aav病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的小梁網(wǎng)細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域已知，例如免疫組化或標(biāo)記物的使用如增強(qiáng)的綠色熒光蛋白可用于檢測病毒顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

在本發(fā)明的一些實施方案中，所述方法包括對哺乳動物的眼部施用有效量的aav病毒顆粒用于治療具有肌纖蛋白(myoc)青光眼的個體，例如具有肌纖蛋白(myoc)青光眼的人。在一些實施方案中，將組合物注射至眼中的一個或多個位置以允許異源核酸在眼部細(xì)胞中的表達(dá)。在一些實施方案中，將組合物注射入眼中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10處位置的任一種。

在本發(fā)明的一些實施方案中，所述方法包括對哺乳動物的小梁網(wǎng)施用有效量的aav病毒顆粒用于治療具有肌纖蛋白(myoc)青光眼的個體，例如具有肌纖蛋白(myoc)青光眼的人。在一些實施方案中，將組合物注射至小梁網(wǎng)中的一處或多處位置以允許異源核酸在小梁網(wǎng)細(xì)胞中的表達(dá)。在一些實施方案中，將組合物注射入小梁網(wǎng)中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10處位置的任一種。

在一些實施方案中，將raav病毒顆粒同時或順序施用至多于一處的位置。在一些實施方案中，raav病毒顆粒的多重注射不超過1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、9小時、12小時或24小時間隔。

玻璃體內(nèi)注射的方法

用于玻璃體內(nèi)注射的一般方法可通過下列簡要概述說明。該實例僅意在說明所述方法的一些特征，且并非是以任何方式限制。用于玻璃體內(nèi)注射的操作為本領(lǐng)域已知(參見例如peyman,g.a.,等人(2009)retina29(7):875-912andfagan,x.j.andal-qureshi,s.(2013)clin.experiment.ophthalmol.41(5):500-7)。

簡言之，用于玻璃體內(nèi)注射的受試者可通過擴(kuò)張瞳孔、滅菌眼睛和施用麻醉劑制備用于操作。本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)散瞳劑可用于瞳孔擴(kuò)張。充分的瞳孔擴(kuò)張可在治療前確認(rèn)。滅菌可通過應(yīng)用眼部滅菌治療實現(xiàn)，例如包含碘化物的溶液如povidone-iodine相似的溶液也可用于清潔眼瞼、睫毛和任何其他鄰近的組織(例如皮膚)?？梢匀魏芜m當(dāng)?shù)臐舛仁褂萌魏芜m當(dāng)?shù)穆樽韯?，如利多卡因或普拉卡因。麻醉劑可通過任何本領(lǐng)域已知的方法施用，包括但不限于局部滴劑、凝膠或凍狀物，和麻醉劑的結(jié)膜下應(yīng)用。

注射前，滅菌的眼瞼窺器可用于從該區(qū)域清除睫毛。注射位點(diǎn)可以注射標(biāo)記。注射的位點(diǎn)可基于患者的晶狀體選擇。例如，注射位點(diǎn)可距離假性或無晶狀體患者中角膜緣的3-3.5mm，和晶狀體患者角膜緣的3.5-4mm?；颊呖煽聪蚺c注射位點(diǎn)相反的方向。

注射過程中，針可以垂直于鞏膜并指向眼部中心插入。可插入針進(jìn)而末端終止于玻璃體中，而非視網(wǎng)膜下間隙?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何適于注射的體積。注射后，可使用滅菌劑如抗生素治療眼部。還可潤洗眼部以去除過量的滅菌劑。

房內(nèi)注射方法

向眼部房內(nèi)注射的方法為本領(lǐng)域已知。房內(nèi)注射的非限制性實例由buie,etal.,(2010)iovs51(1):236-248提供。

通過玻璃體內(nèi)或房內(nèi)注射的raav遞送的有效性可通過本文所述的數(shù)種標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)測。例如，使用本發(fā)明的方法在受試者中治療后，可通過一項或多項臨床參數(shù)包括本文所述的那些評估受試者一種或多種疾病狀態(tài)的征兆或癥狀進(jìn)展的例如改進(jìn)和/或穩(wěn)定和/或延遲。這些測試的實例為本領(lǐng)域已知，且包括客觀和主觀(例如受試者報告的)測量。例如，測量治療對受試者視覺功能的有效性，可評估下述一項或多項：受試者主觀的視覺質(zhì)量或改善的中心視覺功能(例如，受試者流暢閱讀和識別人臉的能力的改善)、受試者視覺移動性(例如通過迷宮所需時間的減少)、視覺敏銳度(例如，受試者logmar評分的改進(jìn))、微量測定法(例如，受試者db評分的改進(jìn))、暗適應(yīng)的視野測量(例如，受試者db評分的改進(jìn))、精細(xì)矩陣映射(例如，受試者db評分的改進(jìn))、goldmann視野測量(例如，減少的暗點(diǎn)區(qū)域的大小(即失明區(qū)域)和解析較小目標(biāo)的能力的改善)、閃爍敏感性(例如赫茲的改善)、自發(fā)熒光和電生理測量(例如erg的改善)。在一些實施方案中，視覺功能通過受試者的視覺移動性測量。在一些實施方案中，視覺功能通過受試者的視覺敏銳度測量。在一些實施方案中，視覺功能通過微量測定法測量。在一些實施方案中，視覺功能通過暗適應(yīng)的視野測量進(jìn)行測量。在一些實施方案中，視覺功能通過erg測量。在一些實施方案中，視覺功能通過受試者主觀的視覺質(zhì)量測量。

對于本文所述任何方法或組合物，可將用于肌纖蛋白(myoc)青光眼的醫(yī)療測試用于評估本文所述的治療效力或診斷從本文所述的治療獲益的患者。用于診斷或監(jiān)測肌纖蛋白(myoc)青光眼的多種醫(yī)療測試為本領(lǐng)域已知。例如，可將檢眼鏡、激光偏光儀、眼部相干斷層掃描和/或掃描激光斷層掃描用于檢查可能由肌纖蛋白(myoc)青光眼損傷的視神經(jīng)。眼內(nèi)壓可通過眼壓測量進(jìn)行測量。厚度計可用于測量中心角膜厚度(例如，薄中央角膜厚度可預(yù)測肌纖蛋白(myoc)青光眼)。視野測試可用于評估視野。

如上文所述，肌纖蛋白突變已牽涉原發(fā)性開角型肌纖蛋白(myoc)青光眼(poag)。因此，用于診斷poag的醫(yī)療測試可用于評估本文所述的治療的效力或診斷可從本文所述的治療獲益的患者?？墒褂萌魏伪绢I(lǐng)域已知的用于診斷poag的醫(yī)療測試，例如將poag與另一形式的肌纖蛋白(myoc)青光眼(如閉角型青光眼)進(jìn)行區(qū)分。例如，前房角鏡可用于提供輔助poag診斷的評估。

肌纖蛋白(myoc)青光眼的治療效力可在動物模型中測試。肌纖蛋白(myoc)青光眼的動物模型為本領(lǐng)域已知。例如，表達(dá)y437h人myoc或y423h小鼠myoc的小鼠已證明發(fā)展與poag相似的肌纖蛋白(myoc)青光眼癥狀(參見zode等人(2011)j.clin.invest.121(9):3542-53和senatorov,v.,等人(2006)j.neurosci.26(46):11903-14)。此外，缺少一氧化氮受體可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的α亞基的小鼠是poag的另一模型(buys,e.s.,等人(2013)plosone8(3):e60156)。還建立了大鼠模型；表達(dá)經(jīng)由腺病毒基因轉(zhuǎn)移遞送的人tgf-β的大鼠顯示增加的iop(shepard,a.r.,等人(2010)invest.ophthalmol.51(4):2067-76)。poag多個方面的其他動物模型包括靈長類動物、狗和斑馬魚模型的進(jìn)一步說明可在bouhenni,r.a.,等人(2012)j.biomed.biotechnol.2012:692609)中獲得。

在一些眼部病癥中，存在“滋養(yǎng)細(xì)胞(nursecell)”現(xiàn)象，其中改進(jìn)一種類型的細(xì)胞的功能可改進(jìn)另一種的功能。例如，通過本發(fā)明的raav對中心視網(wǎng)膜的rpe轉(zhuǎn)導(dǎo)可隨后改善視桿細(xì)胞的功能，且改善的視桿細(xì)胞的功能繼而導(dǎo)致改善的視錐細(xì)胞功能。因此，治療一種類型的細(xì)胞可導(dǎo)致另一種功能的改善。在肌纖蛋白(myoc)青光眼中，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)tm減少iop將減少神經(jīng)節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的退化。

特定raav載體和組合物的選擇取決于多種不同因素，包括但不限于個人的病史和病況特征和待治療的個體。這些特征的評估和適當(dāng)治療方案的設(shè)計最終是處方醫(yī)師的職責(zé)。

本發(fā)明的組合物(例如編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4或其功能性變體和/或myocrnai(例如shrna)的aav病毒顆粒)可單獨(dú)或與一種或多種用于治療眼部病癥的其他治療劑組合使用。順序施用的時間間隔可以按照至少(或可替換地少于)分鐘、小時或天。

在一些實施方案中，可將一種或多種其他治療劑施用至小梁網(wǎng)。其他治療劑的非限制性實例包括前列腺素如適利達(dá)(xalatan)、lumigan、travatanz和rescula；β-阻斷劑包括timopticxe、istalol和betoptics；α-腎上腺素能激動劑包括碘吡啶(iopidine)、阿爾法糖(alphagan)和阿爾法糖-p；碳酸酐酶抑制劑包括trusopt和azopt、diamox、neptazane和daranide；副交感神經(jīng)藥包括毛果蕓香堿、卡巴膽堿、二乙氧膦酰硫膽堿和癸二胺苯酯；腎上腺素包括丙炔；或組合治療包括可索達(dá)(cosopt)、combigan和duotrav。

iv.表達(dá)構(gòu)建體

本發(fā)明提供通過包含異源核酸的raav載體的視網(wǎng)膜下遞送將異源核酸遞送至眼部的方法，且其中所述raav載體封裝在包含一個或多個與hspg相互作用的氨基酸取代的raav衣殼中。在一些實施方案中，異源核酸(例如轉(zhuǎn)基因)與啟動子可操作連接。示例性的啟動子包括但不限于巨細(xì)胞病毒(cmv)即刻早期啟動子、rsvltr、momlvltr、磷酸甘油酸激酶-1(pgk)啟動子、猿猴病毒40(sv40)啟動子和ck6啟動子、轉(zhuǎn)甲狀腺素啟動子(ttr)、tk啟動子、四環(huán)素響應(yīng)啟動子(tre)、hbv啟動子、haat啟動子、lsp啟動子、嵌合肝特異性啟動子(lsp)、e2f啟動子、端粒酶(htert)啟動子、巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子/雞β-肌動蛋白/兔β-珠蛋白啟動子(cag啟動子；niwaetal.,gene,1991,108(2):193-9)和伸長因子1-α啟動子(efl-α)啟動子(kimetal.,gene,1990,91(2):217-23andguoetal.,genether.,1996,3(9):802-10)。在一些實施方案中，啟動子包含人β-葡糖苷酸酶啟動子或與雞β-肌動蛋白(cba)啟動子連接的巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子。啟動子可以是組成型、誘導(dǎo)型或阻遏型啟動子。在一些實施方案中，啟動子能夠在眼部細(xì)胞中表達(dá)異源核酸。在一些實施方案中，啟動子能夠在感光細(xì)胞或rpe中表達(dá)異源核酸。在實施方案中，啟動子是視紫紅質(zhì)激素(rk)啟動子；例如人rk啟動子。在一些實施方案中，啟動子是視蛋白啟動子；例如人視蛋白啟動子或小鼠視蛋白啟動子。在一些實施方案中，啟動子是rna聚合酶iii啟動子。在一些實施方案中，本發(fā)明提供通過將raav顆粒施用至哺乳動物眼部在哺乳動物中治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法，所述raav顆粒包含編碼在cba啟動子控制下的rspo1、rspo2、rspo3、rspo4多肽或其功能性變體的raav載體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供通過將raav顆粒施用至哺乳動物眼部在哺乳動物(例如人)中治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法，所述raav顆粒包含編碼在cba啟動子下的靶向(例如減少或抑制)myoc(例如人myoc)的rnai(例如shrna)的raav載體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供通過將包含編碼在cba啟動子控制下的rspo1、rspo2、rspo3、rspo4多肽或其功能性變體的raav載體的raav顆粒和包含編碼在cba啟動子控制下的靶向(例如減少或抑制)myoc(例如人myoc)的rnai(例如shrna)的raav載體的raav顆粒施用至哺乳動物眼部在哺乳動物(例如人)中治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明提供通過將raav顆粒施用至哺乳動物眼部在哺乳動物(例如人)中治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法，所述raav顆粒包含編碼在cba啟動子控制下的rspo1、rspo2、rspo3、rspo4多肽或其功能性變體的raav載體和在cba啟動子控制下的靶向(例如減少或抑制)myoc(例如人myoc)的rnai(例如shrna)。

本發(fā)明預(yù)期重組病毒基因組用于引進(jìn)一種或多種編碼治療性多肽的核酸序列和/或用于包裝入raav病毒顆粒的核酸的重組病毒基因組的用途。重組病毒基因組可包括任何元件以建立治療性多肽和/或核酸的表達(dá)，例如啟動子、itr、核糖體結(jié)合元件、終止子、增強(qiáng)子、選擇性標(biāo)記、內(nèi)含子、多聚a信號和/或復(fù)制起點(diǎn)。

一些方面，本發(fā)明提供包含重組自身互補(bǔ)基因組的病毒顆粒。具有自身互補(bǔ)基因組的aav病毒顆粒和使用自身互補(bǔ)aav基因組的方法描述于美國專利號6,596,535；7,125,717；7,765,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054和8,361,457；和wangz.,etal.,(2003)genether10:2105-2111，其每一篇在本文以其全文通過提述并入。包含自身互補(bǔ)基因組的raav將憑借其部分互補(bǔ)序列迅速形成雙鏈dna分子(例如，轉(zhuǎn)基因的互補(bǔ)編碼和非編碼鏈)。在一些實施方案中，第一異源核酸序列和第二異源核酸序列通過突變的itr(例如正確的itr)連接。在一些實施方案中，itr包含多核苷酸序列5’-cactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccacgcccgggctttgcccgggcg–3’(seqidno:20)。突變的itr包含含有末端解析序列的d區(qū)的缺失。結(jié)果是，在復(fù)制aav病毒基因組時，rep蛋白將不會在突變的itr切割病毒基因組，且由此以5'-3'順序包含下述的重組病毒基因組將包裝入病毒衣殼：aavitr、包含調(diào)節(jié)序列的第一異源多核苷酸序列、突變的aavitr、與第一異源多核苷酸反向的第二異源多核苷酸和第三aavitr。

vi.病毒顆粒和產(chǎn)生病毒顆粒的方法

raav病毒顆粒

本發(fā)明提供使用raav顆粒治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的方法并提供包含raav顆粒的組合物。在一些實施方案中，病毒顆粒是包含核酸的重組aav顆粒，所述核酸含有編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4多肽或其功能性變體和/或本文所述的myocrnai(例如shrna)的序列，所述序列側(cè)翼為一個或兩個itr。核酸封裝在aav顆粒中。aav顆粒還包含衣殼蛋白。在一些實施方案中，核酸包含轉(zhuǎn)錄方向的感興趣的編碼序列可操作連接組分(例如編碼rspo1,rspo2,rspo3,rspo4多肽或其功能性變體的核酸，和/或myocrnai(例如shrna))、控制序列包括轉(zhuǎn)錄初始和終止序列，由此形成表達(dá)盒。表達(dá)盒在5'和3'末端側(cè)翼為至少一個功能性aavitr序列?！肮δ苄詀avitr序列”意為itr序列用于aav病毒粒子的救援、復(fù)制和包裝目的發(fā)揮功能。參見davidsonetal.,pnas,2000,97(7)3428-32；passinietal.,j.virol.,2003,77(12):7034-40；和pechanetal.,genether.,2009,16:10-16，其在本文全部通過提述并入。為實踐本發(fā)明的一些方面，重組載體至少包含對于通過raav感染的殼體化和物理結(jié)構(gòu)至關(guān)重要的全部aav序列。用于本發(fā)明的載體中使用的aavitr不需要具有野生型核苷酸序列(例如，如kotin,hum.genether.,1994,5:793-801中所述)，且可通過核苷酸的插入、缺失或取代改變或aavitr可源自數(shù)種aav血清型的任何。目前已知多于40種的aav血清型，且新的血清型和現(xiàn)有血清型的變體持續(xù)被鑒別。參見gaoetal.,pnas,2002,99(18):11854-6；gaoetal.,pnas,2003,100(10):6081-6；和bossisetal.,j.virol.,2003,77(12):6799-810。任何aav血清型的使用都考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，raav載體是源自aav血清型的載體，包括但不限于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aavdj、山羊aav、牛aav或小鼠aav等。在一些實施方案中，aav中的核酸包含aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aavdj、山羊aav、牛aav的itr或小鼠aav血清型反向末端重復(fù)(itrs)等的itr。在一些實施方案中，aav中的核酸進(jìn)一步編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4多肽或其功能性變體；myocrnai(例如shrna)；或rspo1、rspo2、rspo3、rspo4多肽或其功能性變體和如本文所述的myoc。例如，aav中的核酸可包含本文設(shè)想的任何aav血清型的至少一種itr且可進(jìn)一步編碼對靶向seqidno:6的myocrnai(例如shrna)進(jìn)行編碼并包含seqidno:7的環(huán)序列的核酸和/或下述一種或多種：包含seqidno:8、11和/或12的rspo1；包含seqidno:9、13和/或14的rspo2；包含seqidno:1、15、16和/或17的rspo3和包含seqidno:10、18和/或19的rspo4。在一些實施方案中，所述核酸編碼與seqidno:8、11或12至少約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rspo1；與seqidno:9、13或14至少約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rspo2；與seqidno:1或15-17至少約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rspo3；或與seqidno:10、18或19至少約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的rspo4。

在其他實施方案中，raav顆粒包含下述的衣殼蛋白：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6(例如野生型aav6衣殼或變體aav6衣殼如shh10，如u.s.pgpub.2012/0164106中所述)、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9(例如野生型aav9衣殼，或如u.s.pgpub.2013/0323226中所述的修飾的aav9衣殼)、aav10、aavrh10、aav11、aav12、酪氨酸衣殼突變體、發(fā)夾結(jié)和衣殼突變體、aav2r471a衣殼、aavaav2/2-7m8衣殼、aavdj衣殼(例如aav-dj/8衣殼、aav-dj/9衣殼或任何u.s.pgpub.2012/0066783中所述的其他衣殼)、aav2n587a衣殼、aav2e548a衣殼、aav2n708a衣殼、aavv708k衣殼、山羊aav衣殼、aav1/aav2嵌合衣殼、牛aav衣殼、小鼠aav衣殼、raav2/hbov1衣殼或u.s.pat.no.8,283,151或國際公開號wo/2003/042397中所述的aav衣殼。在一些實施方案中，aav病毒顆粒包含在位置r484,r487,k527,k532,r585或r588的一處或多處含有氨基酸取代的aav衣殼，其基于aav2的vp1編號。在其他實施方案中，raav顆粒包含來自進(jìn)化枝a-f的aav血清型的衣殼蛋白。在一些實施方案中，突變體衣殼蛋白保持形成aav衣殼的能力。在一些實施方案中，raav顆粒包含允許小梁網(wǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的衣殼蛋白。在一些實施方案中，raav顆粒包含允許小梁網(wǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的突變體衣殼蛋白。在一些實施方案中，raav顆粒包含aav2的衣殼蛋白，其中所述衣殼蛋白包含r471a氨基酸取代，其基于aav2的vp1編號(lochrieetal.,jvirol(2006)80(2):821-834)。在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4多肽或其功能性變體的載體的raav顆粒；包含r471a氨基酸取代的aav2衣殼，其基于aav2的vp1編號和/或編碼myocrnai(例如shrna)的載體。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供在哺乳動物中治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的組合物和方法，其中將包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4多肽或其功能性變體的raav載體的raav2病毒顆粒遞送至哺乳動物的眼部(其中可轉(zhuǎn)導(dǎo)眼部的不同部分(例如視網(wǎng)膜))并將包含編碼myocrnai的raav載體的raav2r471a病毒顆粒遞送至哺乳動物的眼部(其中轉(zhuǎn)導(dǎo)了小梁網(wǎng)的細(xì)胞)。在一些實施方案中，本發(fā)明提供在哺乳動物中治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的組合物和方法，其中將包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4多肽或其功能性變體的raav載體的raav2r471a病毒顆粒和包含編碼myocrnai的raav載體的raav2r471a病毒顆粒遞送至哺乳動物的眼部(其中轉(zhuǎn)導(dǎo)了小梁網(wǎng)的細(xì)胞)。在一些實施方案中，本發(fā)明提供在哺乳動物中治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的組合物和方法，其中將包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4多肽或其功能性變體和編碼myocrnai的raav載體的raav2r471a病毒顆粒遞送至哺乳動物的眼部(其中轉(zhuǎn)導(dǎo)了小梁網(wǎng)的細(xì)胞)。

一些方面，本發(fā)明提供遞送轉(zhuǎn)基因的組合物和方法(例如，至眼部小梁網(wǎng)的治療性轉(zhuǎn)基因)。在一些實施方案中，所述組合物和方法使用包含突變體衣殼的raav2顆粒，其中所述衣殼包含r471a氨基酸取代，其相對于aav2的vp1編號。這樣的組合物和方法可在治療眼部疾病中使用；例如與小梁網(wǎng)相關(guān)的眼部疾病如肌纖蛋白(myoc)青光眼。

將不同的aav血清型用于優(yōu)化特定靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)或靶向特定靶組織(例如患病組織)內(nèi)的特定細(xì)胞類型。raav顆粒可包含相同血清型或混合血清型的病毒蛋白和病毒核酸。

自身互補(bǔ)的aav病毒基因組

一些方面，本發(fā)明提供包含重組自身互補(bǔ)基因組的病毒顆粒。具有自身互補(bǔ)基因組的aav病毒顆粒和使用自身互補(bǔ)aav基因組的方法描述于美國專利號6,596,535；7,125,717；7,765,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054和8,361,457；和wangz.,etal.,(2003)genether10:2105-2111，其每一篇在本文通過提述以其全文并入。包含自身互補(bǔ)基因組的raav將憑借其部分互補(bǔ)的序列迅速形成雙鏈dna分子(例如，轉(zhuǎn)基因的互補(bǔ)編碼和非編碼鏈)。在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含aav基因組的aav病毒顆粒，其中raav基因組包含第一異源多核苷酸序列(例如mir-708和/或視紫紅質(zhì)編碼鏈)和第二異源多核苷酸序列(例如mir-708的反義鏈和/或視紫紅質(zhì)非編碼鏈或反義鏈)，其中所述第一異源多核苷酸序列可與第二多核苷酸序列沿其長度的大部分或全部形成鏈內(nèi)堿基對。在一些實施方案中，第一異源多核苷酸序列和第二異源多核苷酸序列通過促進(jìn)鏈內(nèi)堿基配對的序列例如發(fā)夾dna結(jié)構(gòu)連接。發(fā)夾結(jié)構(gòu)為本領(lǐng)域已知，例如在sirna分子中。在一些實施方案中，第一異源多核苷酸序列和第二異源多核苷酸序列通過突變的itr(例如右側(cè)itr)連接。在一些實施方案中，itr包含多核苷酸序列5'-cactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccacgcccgggctttgcccgggcg-3'(seqidno:20)。突變的itr包含含有末端解析序列的d區(qū)的缺失。結(jié)果是，當(dāng)復(fù)制aav病毒基因組時，rep蛋白將不會在突變的itr切割病毒基因組且由此，以5'至3'順序包含下述的重組的病毒基因組將包裝入病毒衣殼：aavitr、包含調(diào)節(jié)序列的第一異源多核苷酸序列、突變的aavitr、與第一異源多核苷酸反向的第二異源多核苷酸和第三aavitr。在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含重組病毒基因組的aav病毒顆粒，所述基因組含有功能性aav2itr、編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4多肽或其功能性變體和/或myocrnai(例如shrna)的第一多核苷酸序列、包含d區(qū)缺失并缺少功能性末端解析序列的突變的aav2itr、包含與編碼第一多核苷酸序列的rspo1、rspo2、rspo3、rspo4多肽或其功能性變體和/或myocrnai(例如shrna)的序列互補(bǔ)的序列的第二多核苷酸序列和功能性aav2itr。

aav顆粒的產(chǎn)生

raav顆?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生。參見例如美國專利號6,566,118；6,989,264和6,995,006。在實踐本發(fā)明中，用于產(chǎn)生raav顆粒的宿主細(xì)胞包括哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、微生物和酵母。宿主細(xì)胞還可以是包裝細(xì)胞，其中aavrep和cap基因穩(wěn)定保持在其中aav載體基因組穩(wěn)定保持的宿主細(xì)胞或生產(chǎn)細(xì)胞中。示例性的包裝和生產(chǎn)細(xì)胞源自293、a549或hela細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化和配制aav載體。

一些方面，提供用于產(chǎn)生任何如本文公開的raav顆粒的方法，其包括(a)在產(chǎn)生raav顆粒的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含(i)一種或多種aav包裝基因，其中每種所述aav包裝基因編碼aav復(fù)制和/或殼體化蛋白；(ii)包含編碼治療性多核苷酸和/或如本文所述的側(cè)翼為至少一個aavitr的核酸的raav原載體，和(iii)aav輔助功能；和(b)回收由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的raav顆粒。

在其他實施方案中，純化raav顆粒。如本文所述的術(shù)語“純化”包括缺少至少一些其他組分的raav顆粒的制備物，所述組分在天然存在或初始制備所來自的raav顆粒中存在。因此，例如，分離的raav顆粒可使用純化技術(shù)制備以從來源混合物如培養(yǎng)裂解物或生產(chǎn)培養(yǎng)基上清將其富集。富集可以多種方式測量，如例如通過溶液中存在的抗dna酶顆粒(drp)或基因組拷貝(gc)的比例或通過感染，或其可相對來源混合物中存在的第二潛在干擾物質(zhì)測量，如污染物，包括生產(chǎn)培養(yǎng)污染物或生產(chǎn)中的污染物，包括輔助病毒、培養(yǎng)基組分等。

本文還提供包含raav顆粒和藥物上可接受的載劑的藥物組合物，所述raav顆粒含有編碼治療性多肽和/或治療性核酸的異源核酸，其中所述raav顆粒包含含有與hspg相互作用的一個或多個取代或氨基酸的raav衣殼。所述藥物組合物可適于任何本文所述的施用模式；例如通過視網(wǎng)膜下施用。

在一些實施方案中，包含本文所述的raav和藥物上可接受的載劑的藥物組合物適于施用至人。這樣的載劑為本領(lǐng)域已知(參見例如remington'spharmaceuticalsciences,15thedition,pp.1035-1038and1570-1580)。在一些實施方案中，包含本文所述的raav和藥物上可接受的載劑的藥物組合物適于眼部注射。這樣的藥物上可接受的載劑可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，如花生油、大豆油、礦物油等。鹽水溶液和葡萄糖水溶液、聚乙二醇(peg)和甘油溶液還可作為液體載劑采用，特別是用于可注射的溶液。藥物組合物可進(jìn)一步包含其他成分，例如防腐劑、緩沖液、張力劑、抗氧化劑和穩(wěn)定劑、非離子潤濕劑或澄清劑、增粘劑等。本文所述的藥物組合物可包裝入單個單位劑量或多劑量形式中。組合物一般作為無菌和基本上等滲的溶液配制。

vii.系統(tǒng)和試劑盒

如本文所述的raav組合物可包含在經(jīng)設(shè)計用于本文所述的本發(fā)明的方法之一中的系統(tǒng)內(nèi)。在一些實施方案中，本發(fā)明提供用于將載體遞送至個體眼部的系統(tǒng)，其包含a)包含有效量的raav顆粒的組合物，其中所述載體包含編碼治療性多肽和/或治療性rna和至少一個aav末端重復(fù)的異源核酸；和b)用于raav眼部遞送的裝置。在一些實施方案中，所述raav顆粒包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4多肽或其功能性變體的raav載體。在一些實施方案中，raav顆粒包含編碼靶向(例如減少或抑制)myoc表達(dá)的一種或多種myocrnai(例如shrna)的raav載體。在一些實施方案中，raav顆粒包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4多肽或其功能性變體和靶向(例如減少或抑制)myoc表達(dá)的一種或多種myocrnai(例如shrna)的raav載體。在一些實施方案中，所述試劑盒或系統(tǒng)包含含有編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4多肽或其功能性變體的raav載體的raav顆粒和包含編碼靶向(例如減少或抑制)myoc表達(dá)的一種或多種myocrnai(例如shrna)的raav載體的raav顆粒。

一般而言，所述系統(tǒng)包含細(xì)孔套管，其中所述套管是27-45計，一個或多個注射器(例如1、2、3、4或更多個)和一種或多種(例如1、2、3、4或更多種)適于在本發(fā)明的方法中使用的流體。

細(xì)孔套管適于載體懸浮液和/或其他待注射入視網(wǎng)膜下間隙的流體的視網(wǎng)膜下注射。在一些實施方案中，套管是27-45計。在一些實施方案中，細(xì)孔套管是35-41計。在一些實施方案中，細(xì)孔套管是40或41計。在一些實施方案中，細(xì)孔套管是41計。套管可以是任何適當(dāng)類型的套管，例如套管或套管。

注射器可以是任何適當(dāng)?shù)淖⑸淦?，只要其能夠與用于遞送流體的套管連接。在一些實施方案中，注射器是系統(tǒng)注射器。在一些實施方案中，系統(tǒng)具有一個注射器。在一些實施方案中，系統(tǒng)具有兩個注射器。在一些實施方案中，系統(tǒng)具有三個注射器。在一些實施方案中，系統(tǒng)具有四個或更多個注射器。

所述系統(tǒng)可進(jìn)一步包含自動注射泵，其可通過例如腳踏板激活。

適于在本發(fā)明的方法中使用的流體包括本文所述的那些，例如，各包含有效量的一種或多種本文所述的載體的一種或多種載體、用于生成初始泡的一種或多種流體(例如鹽水或其他適當(dāng)?shù)牧黧w)和一種或多種包含一種或多種治療劑的流體。

適于在本發(fā)明的方法中使用的流體包括本文所述的那些，例如各包含有效量的一種或多種如本文所述的載體的一種或多種流體、用于生成初始泡的一種或多種流體(例如鹽水或其他適當(dāng)?shù)牧黧w)和一種或多種包含一種或多種治療劑的流體。

在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積大于約0.8ml。在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積為至少約0.9ml。在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積為至少約1.0ml。在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積為至少約1.5ml。在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積為至少約2.0ml。在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積為大于約0.8ml至約3.0ml。在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積為大于約0.8ml至約2.5ml。在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積為大于約0.8ml至約2.0ml。在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積為大于約0.8ml至約1.5ml。在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積為大于約0.8ml至約1.0ml。在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積為約0.9ml至約3.0ml。在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積為約0.9ml至約2.5ml。在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積為約0.9ml至約2.0ml。在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積為約0.9ml至約1.5ml。在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積為約0.9ml至約1.0ml。在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積為約1.0ml至約3.0ml。在一些實施方案中，包含有效量的載體的流體的體積為約1.0ml至約2.0ml。

用于生成初始泡的流體可以是例如約0.1至約0.5ml。在一些實施方案中，系統(tǒng)中全部流體的總體積為約0.5至約3.0ml。

在一些實施方案中，系統(tǒng)包含單一流體(例如包含有效量的載體的流體)。在一些實施方案中，系統(tǒng)包含2種流體。在一些實施方案中，系統(tǒng)包含3種流體。在一些實施方案中，系統(tǒng)包含4種或更多種流體。

本發(fā)明的系統(tǒng)可進(jìn)一步包裝入試劑盒，其中所述試劑盒可進(jìn)一步包括使用說明。在一些實施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括用于raav顆粒組合物的視網(wǎng)膜下遞送的裝置。在一些實施方案中，使用說明包括根據(jù)本文所述方法之一的說明。在一些實施方案中，使用說明包括用于raav顆粒的玻璃體內(nèi)和/或房內(nèi)遞送的說明，所述raav顆粒包含編碼rspo1、rspo2、rspo3、rspo4多肽或其功能性變體和/或myocrnai(例如shrna)的載體。

實施例

可通過參照下述實施例更完整地理解本發(fā)明。然而，其不應(yīng)理解為是對本發(fā)明范圍的限制?？梢岳斫獾氖潜疚乃龅膶嵤├蛯嵤┓桨竷H出于闡述目的且基于其的多種修飾和改變將建議給本領(lǐng)域的技術(shù)人員且將包括在本申請的精髓和范圍和附加的權(quán)利要求范圍內(nèi)。

實施例1:青光眼myoc突變(例如p370l和y437h)阻斷myoc的分泌

為理解myoc突變體如何影響眼部功能，特別是可有助于iop的細(xì)胞如小梁網(wǎng)細(xì)胞，將提供對肌纖蛋白(myoc)青光眼發(fā)病機(jī)理的了解。理解myoc功能還可以幫助揭示肌纖蛋白(myoc)青光眼潛在的治療策略。本文所述的結(jié)果證明myoc突變體減少野生型myoc表達(dá)并阻斷wnt信號傳導(dǎo)。此外，這些結(jié)果表明r-脊椎蛋白3(rspo3)的表達(dá)和/或myoc的沉默可恢復(fù)通過突變體myoc的表達(dá)阻斷的wnt信號傳導(dǎo)。

方法

質(zhì)粒載體

對于myoc和rspo3質(zhì)粒，myoccdna由clonedb-sanofioncology提供。rspo3cdna由clonedb-sanofioncology提供。

為構(gòu)建pcba2-in-myocp370l，依照制造商的推薦將ii試劑盒(agilent,santaclara)和引物5’-accacggacagttcctgtattcttggggtgg-3’(seqidno:21)和5’-ccaccccaagaatacaggaactgtccgtggt-3’(seqidno:22)用于引進(jìn)預(yù)期的單堿基取代。

為構(gòu)建pcba2-in-myocy437h，依照制造商的推薦將lightningkit(agilent,santaclara)和引物5'-tctgtggcaccttgcacaccgtcagcagc-3'(seqidno:23)和5'-gctgctgacggtgtgcaaggtgccacaga-3'(seqidno:24)用于引進(jìn)預(yù)期的單堿基取代。

grp94shrna質(zhì)粒獲得自origenetechnologies,inc.(cat.no.tr312309)。pgipz-myoc質(zhì)粒(dharmacongelifesciences)由clonedb-sanofioncology提供。gipz微小rna-適合的shrna集合(gipzmicrorna-adaptedshrnacollection，stegmeier,等人(2005)proc.natl.acad.sci.usa.102:13212-7)。gipzshrna設(shè)計以天然的mir-30初始轉(zhuǎn)錄物為基礎(chǔ)以通過內(nèi)源rnai通路使加工成為可能并以最小的細(xì)胞毒性導(dǎo)致特定的基因沉默。pgipz-null質(zhì)粒，表達(dá)非靶向、無效shrnamir的組成型shrnamir載體由clonedb-sanofioncology提供。

細(xì)胞培養(yǎng)和重組蛋白

在dmem、10％fcs和5％co2中培養(yǎng)hek293細(xì)胞(microbixbiosystemsinc.)。從atcc獲得hek293t(293t)細(xì)胞系并在dmem、10％fcs和5％co2中培養(yǎng)。

原代人小梁網(wǎng)(htm)細(xì)胞的永生化

經(jīng)由使用aav2-sv40t-抗原載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)將sv40大t抗原(sv40larget-antigen，sv40tag)用于永生化。將保持在完全成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基(sciencell)中的第7代htm細(xì)胞(sciencellresearchlaboratories,carlsbad,ca)接種于10cm細(xì)胞培養(yǎng)平板上并使用1×10⁵drp的aav2-sv40-tag(標(biāo)記為“htm-t”)或aav2-egfp(陰性對照，標(biāo)記為“htm-ent”)轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時。一旦細(xì)胞達(dá)到融合，將其傳代至2×15cm平板上(p8)。約每3-4天重復(fù)傳代細(xì)胞。在第10代，取一部分以確定細(xì)胞計數(shù)。來自htm-t細(xì)胞的總細(xì)胞數(shù)為5.2×10⁶，相比之下來自htm-ent細(xì)胞為2.5×10⁵總細(xì)胞。

實施蛋白免疫印跡以確定sv40t-抗原的存在。簡言之，離心500ul的細(xì)胞懸浮液，并將獲得的細(xì)胞沉淀裂解入包含蛋白酶抑制劑雞尾酒混合物的100μlripa緩沖液。通過sds-page分析5μl的細(xì)胞裂解物，隨后使用iblot快速轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(lifetechnologies)進(jìn)行免疫印跡。印跡使用無tbs蛋白的阻斷劑(thermofisherscientific,waltham,ma)阻斷并與單克隆抗sv40t-抗原抗體(genetex,irvine,ca)溫育。印跡隨后與抗小鼠hrp標(biāo)記的抗體(r&dsystems,minneapolis,mn)溫育。使用supersignalwestfemtochemiluminescentsubstrate(thermofisher)可視化免疫反應(yīng)性條帶。從htm-t而非htm-ent細(xì)胞檢測到對應(yīng)sv40t-抗原的突出的80kda條帶，表明sv40t-抗原的存在和表達(dá)。來自293t細(xì)胞的裂解物作為陽性對照發(fā)揮作用，其也包含80kdasv40t-抗原條帶。擴(kuò)大htm-t細(xì)胞并在第12代(以1×10⁶細(xì)胞10瓶)和稍后在第18代(以10⁶細(xì)胞46瓶)將細(xì)胞庫冷凍在細(xì)胞冷凍介質(zhì)(lifetechnologies,grandisland,ny)中。

htm-t表征

htm-t和原代htm細(xì)胞的比較顯示了細(xì)胞形態(tài)學(xué)、群體倍增時間和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的顯著差異。原代htm細(xì)胞看起來較大且呈成纖維細(xì)胞樣，具有長的紡錘形細(xì)胞體，而永生化的htm-t細(xì)胞較小，為立方形且大小相對均勻。htm-t細(xì)胞系表明增加的生長速率，具有比原代細(xì)胞發(fā)生快約3-4倍的群體倍增。此外，htm-t細(xì)胞超過20代細(xì)胞持續(xù)增殖，而原代htm細(xì)胞到第10代顯示減少的生長速率且到第12代顯示最終的生長停滯。使用egfp質(zhì)粒確定轉(zhuǎn)染效率并以相似的細(xì)胞密度脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(lipofectamine)至兩種類型的細(xì)胞。簡言之，根據(jù)制造商的方案使用lipofectamine2000(lifetechnologies)以egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染亞匯合的htm-t或htm細(xì)胞。盡管htm-t細(xì)胞具有更大的細(xì)胞數(shù)每mm²細(xì)胞培養(yǎng)表面，但相比原代htm細(xì)胞(～5％)顯然存在更大的egfp+htm-t細(xì)胞(～50％)百分比。

蛋白免疫印跡

使用lipofectamine2000(lifetechnologies)以表達(dá)wtmyoc、myoc突變體p370l和y437h、rspo3和/或shrna的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293t或htm-t細(xì)胞。簡言之，將細(xì)胞裂解入包含蛋白酶抑制劑雞尾酒混合物的50-100μlripa緩沖液中。通過sds-page分析10-13μl的細(xì)胞裂解物，隨后使用iblot快速轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(lifetechnologies)進(jìn)行免疫印跡。使用tris緩沖鹽水、0.05％吐溫20(tbst)、0.2％i-block(基于酪蛋白的阻斷試劑；lifetechnologies)阻斷印跡并使用小鼠抗人myoc抗體溫育。隨后使用抗小鼠hrp標(biāo)記的抗體(r&dsystems,minneapolis,mn)溫育印跡。使用ecl化學(xué)發(fā)光底物(eclchemiluminescentsubstrate，thermofisher)可視化免疫反應(yīng)條帶并在使用kodakx-omat2000處理器顯影的biomaxxar膜(carestreamhealth)上可視化。

螢光素酶報告測定

將293t或htm-t細(xì)胞以2×10⁴細(xì)胞/孔接種入costar96孔白色或黑色壁的平板。根據(jù)制造商的方案使用fugenehd轉(zhuǎn)染試劑(promega,madison,wi)在細(xì)胞接種后1-2天實施轉(zhuǎn)染。

簡言之，包含40:1比率的tcf/lef調(diào)節(jié)的螢火蟲螢光素酶報告基因和巨細(xì)胞病毒(cmv)驅(qū)動的海腎螢光素酶基因的topflash報告質(zhì)粒(millipore,billerica,ma)與靶質(zhì)粒1:1混合。添加8μl的fugenehd試劑，并立即渦旋樣品，隨后在室溫溫育15分鐘。將質(zhì)粒dna復(fù)合物添加至細(xì)胞并在37℃溫育24小時。樣品未經(jīng)刺激或以400ng/ml的重組人或小鼠wnt3a蛋白(r&dsystems)刺激并額外溫育20-24小時。根據(jù)制造商的方案使用雙螢光素酶測定系統(tǒng)(promega)測量wnt信號傳導(dǎo)。在centroxs³960微板光度計(bertholdtechnologies,oakridge,tn)上測量吸收值并報告為相對光單位(rlu)。為控制轉(zhuǎn)染效率，針對海腎螢光素酶rlu標(biāo)準(zhǔn)化螢火蟲螢光素酶rlu。以三份孔實施全部樣品。

結(jié)果

野生型myoc(wtmyoc)分泌自經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞，但很少至無myoc分泌自表達(dá)五種不同突變體形式的myoc的細(xì)胞，且已報導(dǎo)用正常和突變體myoc對培養(yǎng)細(xì)胞的共轉(zhuǎn)染抑制wtmyoc分泌(jacobson等人(2001)hum.mol.genet.10(2):117-25)。為檢查突變體myoc表達(dá)對myoc分泌的影響，使用表達(dá)野生型myoc、p370l突變體myoc或y437h突變體myoc的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。

如圖1所示，表達(dá)野生型myoc的293細(xì)胞在兩種細(xì)胞裂解物(參見底部印跡標(biāo)記的“細(xì)胞”)中都顯示可檢測的myoc蛋白表達(dá)并分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基(參見頂部印跡標(biāo)記的“介質(zhì)”)。然而，使用表達(dá)p370l或y437hmyoc的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示細(xì)胞內(nèi)表達(dá)但未分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基。此外，用表達(dá)野生型myoc和p370l或y437hmyoc的質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致myoc分泌入細(xì)胞培養(yǎng)基的缺少。這些結(jié)果表明p370l和y437h突變體不能從293細(xì)胞分泌且也能夠阻斷野生型myoc的分泌。

進(jìn)行了進(jìn)一步的實驗以確定是否在人眼部細(xì)胞中觀察到這些結(jié)果。如上文所述，通過aav-介導(dǎo)的sv40大t-抗原(htm-t細(xì)胞)的表達(dá)永生化人小梁網(wǎng)細(xì)胞系。使用表達(dá)野生型myoc的質(zhì)粒、表達(dá)p370lmyoc的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293t和htm-t細(xì)胞，或使用兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。圖2顯示蛋白免疫印跡，其在這些細(xì)胞中探查細(xì)胞內(nèi)或分泌的myoc蛋白的存在。盡管野生型myoc由293t和htm-t細(xì)胞表達(dá)和分泌，但293t和htm-t細(xì)胞都表達(dá)p370lmyoc但未分泌p370lmyoc。p370lmyoc在293t和htm-t兩種細(xì)胞中還都阻斷野生型myoc的分泌。

這些結(jié)果表明青光眼myoc突變體(例如p370l和y437h)都能夠阻斷野生型myoc在人細(xì)胞中的分泌。此外，突變體myoc也能夠阻斷myoc在htm細(xì)胞中的分泌。

實施例2:青光眼myoc突變(例如p370l和y437h)阻斷wnt信號傳導(dǎo)

認(rèn)為myoc與wnt信號傳導(dǎo)通路的組分如卷曲蛋白(fzd)家族的wnt受體、分泌的卷曲蛋白相關(guān)蛋白(sfrp)家族的wnt拮抗劑和wnt抑制因子1(wif-1)相互作用，其調(diào)節(jié)刺激壓力纖維形成的肌動蛋白細(xì)胞骨架的組織(kwon等人(2009)mol.cell.biol.29:2139-54)。壓力纖維的形成對于小梁網(wǎng)(tm)的收縮性和iop調(diào)節(jié)至關(guān)重要。然而，準(zhǔn)確來說myoc如何與wnt信號傳導(dǎo)連接和該連接如何影響iop尚不知曉。基于細(xì)胞生物學(xué)實驗，肌纖蛋白作為基質(zhì)細(xì)胞蛋白的功能已被提出(reschandfautsch,2009；kochetal,2014)。其他小組已證實肌纖蛋白是少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)因子且參與小鼠中視神經(jīng)的髓鞘化(kwonetal.,2014)。

已表明myoc可作為wnt信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用且wnt蛋白可通過執(zhí)行器功能補(bǔ)償肌纖蛋白的缺少(kwon等人(2009)mol.cell.biol.29:2139-54)。數(shù)個小組報導(dǎo)了通過b-連環(huán)蛋白非依賴性機(jī)制作用的肌纖蛋白和wnt蛋白作用間的相似性(kwonandtomarev(2011)j.cell.physiol.226(12):3392-402)。已報導(dǎo)青光眼tm(gtm)細(xì)胞中減少的wnt信號傳導(dǎo)是由于較高的sfrp1內(nèi)源水平(wang等人(2008)j.clin.invest.118:1056-64；linandhankenson(2011)j.cell.biochem.112:3491-501)。另一小組顯示wnt信號傳導(dǎo)途徑保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞系rgc-5免于升高的壓力(fragoso等人(2011)cell.mol.neurobiol.31(1):163-73)。

從文獻(xiàn)不清楚青光眼myoc突變(例如p370l或y437h)是否對tm中的wnt信號傳導(dǎo)具有任何影響。一項報導(dǎo)聲稱青光眼myoc突變(其抑制myoc從tm的分泌)對tm中wnt信號傳導(dǎo)的影響尚不知曉，如通過top-flashwnt信號傳導(dǎo)測定所測量(mao等人(2012)invest.ophthalmol.vis.sci.53(11):7043-51)。另一小組已報導(dǎo)p370l對caco-2細(xì)胞中的wnt信號傳導(dǎo)具有刺激影響，通過top-flashwnt信號傳導(dǎo)測定顯示(shen等人(2012)plosone7(9):e44902)。

相比之下，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了myoc突變(例如p370l和y437h)對293和tm細(xì)胞中的wnt信號傳導(dǎo)具有抑制影響，如通過top-flashwnt信號傳導(dǎo)測定所顯示，其報告β-連環(huán)蛋白活性。

為評估m(xù)yocp370l和y437h突變體對wnt信號傳導(dǎo)的影響，使用top-flash報告構(gòu)建體和wtmyoc(“myoc”)、p370lmyoc或y437hmyoc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞。添加重組小鼠wnt3a(400ng/ml)后擴(kuò)增wnt信號傳導(dǎo)并通過top-flash測定測量。轉(zhuǎn)染后測量螢光素酶活性(平均值±sd,n＝4)并標(biāo)準(zhǔn)化至連續(xù)表達(dá)的海腎螢光素酶水平的轉(zhuǎn)染對照。

如圖3所示，使用重組小鼠wnt3刺激293t細(xì)胞引起top-flash報道子的增加。野生型myoc的表達(dá)未干擾wnt信號傳導(dǎo)，如通過top-flash所測定。然而，野生型myoc與p370lmyoc或y437hmyoc的共表達(dá)阻斷了293t細(xì)胞中top-flash的活化。這些結(jié)果表明青光眼myoc突變體(例如p370l和y437h)的表達(dá)能夠抑制人細(xì)胞中的wnt信號傳導(dǎo)。

實施例3:由青光眼myoc突變(例如p370l和y437h)阻斷wnt信號傳導(dǎo)的恢復(fù)

之前的實施例證實青光眼myoc突變體p370l和y437h發(fā)揮作用以阻斷人細(xì)胞中的wnt信號傳導(dǎo)。進(jìn)行了其他實驗以檢查wnt信號傳導(dǎo)可通過其在表達(dá)這些myoc突變體的細(xì)胞中恢復(fù)的潛在機(jī)制。

r-脊椎蛋白3(rspo3)是由rspo3基因編碼的蛋白，其活化wnt信號傳導(dǎo)，且檢查了rspo3的表達(dá)是否能夠恢復(fù)當(dāng)wnt信號傳導(dǎo)由突變體myoc表達(dá)抑制時的wnt信號傳導(dǎo)。對于這些實驗，與上述圖3相似的是，293t細(xì)胞用top-flash報道子構(gòu)建體和wtmyoc(“myoc”)、p370lmyoc、y437hmyoc和/或rspo3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，如標(biāo)記。添加重組小鼠wnt3a(400ng/ml)后擴(kuò)增了wnt信號傳導(dǎo)并通過top-flash測定進(jìn)行了測量。轉(zhuǎn)染后測量了螢光素酶活性(平均值±sd,n＝3)并標(biāo)準(zhǔn)化至連續(xù)表達(dá)的海腎螢光素酶水平的轉(zhuǎn)染對照。

如圖4中所示，rspo3表達(dá)引起了wnt信號傳導(dǎo)的增加，如通過top-flash所測量。重要的是，相比僅表達(dá)p370lmyoc或y437hmyoc時所觀察的wnt信號傳導(dǎo)的抑制，rspo3與p370lmyoc或y437hmyoc的共表達(dá)能夠恢復(fù)wnt信號傳導(dǎo)。使用top-flash報道分子構(gòu)建體和wtmyoc(“myoc”)、p370lmyoc、y437hmyoc和/或rspo3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，如標(biāo)記。添加重組小鼠wnt3a(400ng/ml)后擴(kuò)增了wnt信號傳導(dǎo)并通過top-flash測定進(jìn)行了測量。轉(zhuǎn)染后測量了螢光素酶活性并標(biāo)準(zhǔn)化至連續(xù)表達(dá)的海腎螢光素酶水平的轉(zhuǎn)染對照。

為測試在htm細(xì)胞中是否觀察到相似的效果，使用top-flash報道子構(gòu)建體和wtmyoc(“myocw.t.”)、p370lmyoc和/或rspo3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染htm-t細(xì)胞。如上文所述通過top-flash測定測量了wnt活性(螢光素酶活性顯示為平均值±sd,n＝3)。圖5顯示p370lmyoc的表達(dá)引起了wnt信號傳導(dǎo)的減少且能夠減少共表達(dá)野生型myoc的htm-t細(xì)胞中的wnt信號傳導(dǎo)。rspo3的表達(dá)能夠增加僅表達(dá)p370lmyoc或p370lmyoc與野生型myoc的組合的htm-t細(xì)胞中的wnt信號傳導(dǎo)。圖4和5闡述的結(jié)果表明rspo3的表達(dá)恢復(fù)了表達(dá)青光眼myoc突變體的細(xì)胞中的wnt信號傳導(dǎo)，如293t和htm-t細(xì)胞。

令人驚訝的是，已發(fā)現(xiàn)通過表達(dá)青光眼myoc突變體抑制wnt可由沉默myoc(例如通過rnai)逆轉(zhuǎn)。在293t細(xì)胞中測試了myocshrna對myoc表達(dá)的影響。如圖6中所示，相比亂序shrna對照，myocshrna減少了表達(dá)野生型myoc的細(xì)胞中myoc蛋白的表達(dá)。對于細(xì)胞內(nèi)和分泌的myoc都觀察到該減少。

圖7顯示htm-t細(xì)胞中myocshrna的影響。myocshrna減少了共表達(dá)野生型和p370l突變體myoc的htm-t細(xì)胞中myoc蛋白的表達(dá)。對于細(xì)胞內(nèi)和分泌的myoc都觀察到該減少。與之相比，靶向grp94的shrna對myoc表達(dá)無影響。grp94是參與分泌蛋白的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)的分子伴侶，且近期提出其可作為治療劑用于患有一些情況的myoc青光眼的患者，這是由于認(rèn)為grp94可促進(jìn)myoc突變體的清除(suntharalingametal.,(2012)j.biol.chem.287(48):40661-9)。亂序shrna對照相似地對myoc表達(dá)不具有影響。

由于myocshrna影響myoc表達(dá)，接下來研究了其對wnt信號傳導(dǎo)的影響。如圖8中所示，p370lmyoc的表達(dá)減少了293t細(xì)胞中的wnt信號傳導(dǎo)。grp94shrna和亂序shrna對照不能恢復(fù)由p370lmyoc抑制的wnt信號傳導(dǎo)。與之相反，myocshrna增加了表達(dá)p370lmyoc的細(xì)胞中的wnt信號傳導(dǎo)至約野生型水平(即在不表達(dá)p370lmyoc的對照細(xì)胞中觀察到的wnt信號傳導(dǎo)水平，如通過top-flash所測量)。還發(fā)現(xiàn)rspo3的表達(dá)增加表達(dá)p370lmyoc的細(xì)胞中的wnt信號傳導(dǎo)，且rspo3與myocrnai(例如shrna)的組合表達(dá)導(dǎo)致表達(dá)p370lmyoc的細(xì)胞中wnt信號傳導(dǎo)的協(xié)同增加。

盡管已提出抑制grp94作為減少myoc突變體影響的機(jī)制，本文所述的這些結(jié)果表明rspo3和/或myocshrna的表達(dá)在myoc突變體表達(dá)存在下的wnt信號傳導(dǎo)的去阻遏中更加有效。

還檢查了myocshrna對表達(dá)y437hmyoc的細(xì)胞中wnt信號傳導(dǎo)的影響。如圖9中所示，p370l或y437hmyoc的表達(dá)減少了293t細(xì)胞中的wnt信號傳導(dǎo)。然而，myocshrna能夠恢復(fù)表達(dá)p370l或y437hmyoc的細(xì)胞中的wnt信號傳導(dǎo)。當(dāng)表達(dá)亂序shrna對照時未觀察到該效果。

總之，這些結(jié)果證實了由myoc突變體(例如p370l和y437h)阻斷的wnt信號傳導(dǎo)可通過表達(dá)r-脊椎蛋白3(rspo3)和/或抑制myoc(例如通過rnai)恢復(fù)。

實施例4:aav2r471a轉(zhuǎn)導(dǎo)小梁網(wǎng)的細(xì)胞

為確定aav顆粒是否能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)小梁網(wǎng)的細(xì)胞，將編碼egfp的aav2載體包裝入包含r471a氨基酸取代的aav2顆粒的野生型aav2顆粒(基于vp1編號)。通過使用aav2egfp和aav2r471aegfp處理htm細(xì)胞(如上文所述)體外評估了病毒顆粒。如圖10(左圖)中所示，相比野生型aav2，aav2r471aegfp顯示了更高的tm細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。為在體內(nèi)評估tm細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，將aav2egfp和aav2r471aegfp注射入小鼠眼部。隨后處死小鼠并分析了egfp表達(dá)。如圖10(右圖)中所示，aav2r471aegfp相比野生型aav2在體內(nèi)顯示了更高的tm細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。

實施例5:肌纖蛋白(myoc)青光眼動物模型中的rspo3表達(dá)或myocshrna

上述實施例證實了青光眼myoc突變(例如p370l和y437h)阻斷wnt信號傳導(dǎo)，且該wnt信號傳導(dǎo)的抑制可通過r-脊椎蛋白3(rspo3)的表達(dá)或myocshrna逆轉(zhuǎn)。不希望受任何具體理論所限，認(rèn)為myoc突變(例如p370l和/或y437h)可影響tm中的wnt信號傳導(dǎo)，由此調(diào)節(jié)iop并有助于poag。下述實驗測試了經(jīng)由aav2載體遞送的r-脊椎蛋白3(rspo3)表達(dá)或myocshrna是否能夠改善疾病小鼠模型中的青光眼癥狀。

將poag的小鼠模型用于檢查在治療肌纖蛋白(myoc)青光眼中aav介導(dǎo)的r-脊椎蛋白3(rspo3)表達(dá)和/或myocshrna遞送至眼部的效力。例如，可使用表達(dá)y437hmyoc的小鼠模型(參見zode等人(2011)j.clin.invest.121(9):3542-53)。在該模型中，人y437hmyoc在轉(zhuǎn)基因小鼠中cmv啟動子的控制下表達(dá)。使用該系統(tǒng)，y437hmyoc在與肌纖蛋白(myoc)青光眼相關(guān)的組織如小梁網(wǎng)和鞏膜中表達(dá)。這些小鼠呈現(xiàn)大致正常的眼睛形態(tài)但在三個月齡后開始顯示肌纖蛋白(myoc)青光眼樣癥狀，如增加的iop和視神經(jīng)的進(jìn)行性、軸索變性。

將表達(dá)gfp、小鼠rspo3、靶向小鼠myoc(來自質(zhì)粒pgipz#93的myocshrna靶標(biāo)和環(huán)序列；dharmacon,gehealthcare)的shrna或亂序shrna的轉(zhuǎn)基因克隆入在來自質(zhì)粒pcba(2)-int-bgh的雜交雞β-肌動蛋白(cba)啟動子控制下的aav2基因組，其還包含牛生長激素多聚腺苷酸化信號序列(xu,r.,等人(2001)genether.8:1323-32)。隨后將表達(dá)盒克隆入包含aav2反向末端重復(fù)(itr)的前病毒質(zhì)粒載體paavsp70(ziegler,r.j.,等人(2004)mol.ther.9:231-40)。包含側(cè)翼為itr的區(qū)的質(zhì)粒sp70.br/sflt01中獲得的aav基因組的總大小為4.6kb。

將aav2基因組包裝入具有r471a突變的aav2衣殼以允許小梁網(wǎng)的感染或包裝入野生型aav2衣殼以允許視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的感染。使用“無病毒基因(gutless)”載體的方式使用三重轉(zhuǎn)染方法將aav2基因組包裝入aav2野生型或r471a衣殼(參見例如xiao等人(1998)j.virol.,3:2224-32)。簡言之，使用治療性基因和其調(diào)節(jié)元件替換rep和cap基因，兩者都夾在5’和3’反向末端重復(fù)(itr)間。在單獨(dú)的質(zhì)粒上以順式提供rep和cap基因，且第三質(zhì)粒有助于所需的腺病毒輔助基因?？商鎿Q地，通過復(fù)制缺陷的腺病毒提供所需的輔助基因和/或腺病毒輔助基因穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞基因組。不希望受任何具體理論所限，假設(shè)病毒衣殼完整裝配，且側(cè)翼具有itr的載體基因組隨后經(jīng)由衣殼孔插入衣殼(myers&carter(1980)virology,102:71-82)。包含基因組的衣殼隨后經(jīng)配制用于注射。

使表達(dá)人y437hmyoc的轉(zhuǎn)基因小鼠生長至約3個月齡且隨后隨機(jī)分配入治療組。麻醉小鼠并使用編碼gfp、小鼠rspo3、靶向小鼠myoc的shrna或亂序shrna的aav載體經(jīng)由玻璃體內(nèi)或房內(nèi)注射進(jìn)行注射。在一個治療組中，為測試視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的效果，小鼠接受具有表達(dá)小鼠rspo3的野生型aav2衣殼的aav2載體的注射和在對側(cè)眼睛中的具有表達(dá)gfp的野生型aav2衣殼的aav2載體的注射。在一個治療組中，為測試小梁網(wǎng)中的效果，小鼠接受具有表達(dá)靶向小鼠myoc的shrna的r471aaav2衣殼的aav2載體的注射和在對側(cè)眼睛中的具有表達(dá)亂序shrna的r471aaav2衣殼的aav2載體的注射。在一個治療組中，小鼠在一只眼中接受表達(dá)小鼠rspo3的aav載體和表達(dá)靶向小鼠myoc的shrna的aav載體的混合物的注射且在對側(cè)眼睛中接受表達(dá)gfp的aav載體和/或表達(dá)亂序shrna的aav載體的注射。在一個治療組中，小鼠在一只眼中接受表達(dá)小鼠rspo3的aav載體并表達(dá)靶向小鼠myoc的shrna的注射且在對側(cè)眼睛中接受表達(dá)gfp和表達(dá)亂序shrna的aav載體的注射。

注射后以常規(guī)的時間間隔檢查小鼠肌纖蛋白(myoc)青光眼的癥狀，將接受實驗治療的眼和接受對照治療的眼進(jìn)行比較。通過眼壓計測量iop(kim,c.y.,等人(2007)eye(lond.)21(9):1202-9)。通過超聲測厚儀測量角膜厚度(lively,g.d.,等人(2010)physiol.genomics42(2):281-6)。通過前房角鏡檢查評估虹膜角膜的角度。使用模式視網(wǎng)膜電圖(perg)通過分析對視覺刺激的模式視網(wǎng)膜電圖響應(yīng)測量了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的功能(zode等人(2011)j.clin.invest.121(9):3542-53)。可處死小鼠并解剖眼部用于其他表型表征。例如，通過免疫熒光顯微鏡和/或透射電子顯微鏡評估了視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)和/或形態(tài)學(xué)。

實施例6:rspo家族蛋白恢復(fù)由青光眼myoc突變阻斷的wnt信號傳導(dǎo)的用途

如實施例3中所證實，由myoc突變體(例如p370l和y437h)阻斷的wnt信號傳導(dǎo)可通過r-脊椎蛋白3(rspo3)的表達(dá)恢復(fù)。為進(jìn)一步理解該wnt信號傳導(dǎo)恢復(fù)的潛在機(jī)制，檢查了不同rspo家族成員和變體恢復(fù)wnt信號傳導(dǎo)的能力。

人rspo家族蛋白hrspo1、2、3和4分享相似的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，其包括弗林蛋白酶樣富含cys結(jié)構(gòu)域、血小板反應(yīng)素1型結(jié)構(gòu)域和c-末端帶正電荷的結(jié)構(gòu)域，如圖11和12說明。為檢查恢復(fù)wnt信號傳導(dǎo)所需的功能結(jié)構(gòu)域，生成了人rspo3的數(shù)個截短的變體。變體、每個變體中包括和排除的特定結(jié)構(gòu)域示于圖11、12、13a和14中。為測試rspo3變體對wnt信號傳導(dǎo)的影響，使用top-flash報道子構(gòu)建體和wtmyoc(“myoc”)或y437hmyoc共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，且還使用全長或部分rspo3質(zhì)粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)染，如圖15中所標(biāo)記。添加重組人wnt3a(400ng/ml)后擴(kuò)增了wnt信號傳導(dǎo)并通過top-flash測定進(jìn)行了測量。轉(zhuǎn)染后測量了螢光素酶活性(平均值±sd,n＝3)并標(biāo)準(zhǔn)化至組成型表達(dá)的海腎螢光素酶水平的轉(zhuǎn)染對照。

如實施例3中所述，突變體myocy437h抑制293t細(xì)胞中的wnt信號傳導(dǎo)，如通過top-flash測定所測量。圖15顯示在該測定中不同hrspo3截短的變體對wnt信號傳導(dǎo)的影響。如圖15中所示，測試的全部hrspo3形式，部分和全長都具有wnt恢復(fù)活性，其中全長的rspo3相比很多截短形式呈現(xiàn)更強(qiáng)效的活性。

為測試不同rspo家族成員對wnt信號傳導(dǎo)的影響，使用top-flash報道子構(gòu)建體和wtmyoc(“myoc”)或y437hmyoc共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，且還使用全長或部分rspo1、rspo2或rspo4質(zhì)粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)染，如圖16中所標(biāo)記(參見用于闡述rspo1、2、3和4截短形式的圖12)。添加重組小鼠wnt3a(400ng/ml)后擴(kuò)增了wnt信號傳導(dǎo)并通過top-flash測定進(jìn)行了測量。轉(zhuǎn)染后測量了螢光素酶活性(平均值±sd,n＝3)并標(biāo)準(zhǔn)化至組成型表達(dá)的海腎螢光素酶水平的轉(zhuǎn)染對照。

這些研究的結(jié)果示于圖16。這些結(jié)果表明全長和截短的rspo1、2和4也具有wnt恢復(fù)活性，其中全長的rspo呈現(xiàn)比截短形式更強(qiáng)效的活性。全部rspo家族成員和形式與wnt3a能夠作用。

序列

rspo3多肽序列(信號序列加下劃線)

mhlrliswlfiilnfmeyigsqnasrgrrqrrmhpnvsqgcqggcatcsdyngclsckprlffalerigmkqigvclsscpsgyygtrypdinkctkckadcdtcfnknfctkcksgfylhlgkcldncpegleannhtmecvsivhcevsewnpwspctkkgktcgfkrgtetrvreiiqhpsakgnlcpptnetrkctvqrkkcqkgergkkgrerkrkkpnkgeskeaipdskslesskeipeqrenkqqqkkrkvqdkqksvsvstvh(seqidno:1)

rspo3多核苷酸序列

atgcacttgcgactgatttcttggctttttatcattttgaactttatgga

atacatcggcagccaaaacgcctcccggggaaggcgccagcgaagaatgc

atcctaacgttagtcaaggctgccaaggaggctgtgcaacatgctcagat

tacaatggatgtttgtcatgtaagcccagactattttttgctctggaaag

aattggcatgaagcagattggagtatgtctctcttcatgtccaagtggat

attatggaactcgatatccagatataaataagtgtacaaaatgcaaagct

gactgtgatacctgtttcaacaaaaatttctgcacaaaatgtaaaagtgg

attttacttacaccttggaaagtgccttgacaattgcccagaagggttgg

aagccaacaaccatactatggagtgtgtcagtattgtgcactgtgaggtc

agtgaatggaatccttggagtccatgcacgaagaagggaaaaacatgtgg

cttcaaaagagggactgaaacacgggtccgagaaataatacagcatcctt

cagcaaagggtaacctgtgtcccccaacaaatgagacaagaaagtgtaca

gtgcaaaggaagaagtgtcagaagggagaacgaggaaaaaaaggaaggga

gaggaaaagaaaaaaacctaataaaggagaaagtaaagaagcaatacctg

acagcaaaagtctggaatccagcaaagaaatcccagagcaacgagaaaac

aaacagcagcagaagaagcgaaaagtccaagataaacagaaatcggtatc

agtcagcactgtacactag(seqidno:2)

myoc多肽序列

mrffcarccsfgpempavqllllaclvwdvgartaqlrkandqsgrcqytfsvaspnesscpeqsqamsvihnlqrdsstqrldleatkarlsslesllhqltldqaarpqetqeglqrelgtlrrerdqletqtreletaysnllrdksvleeekkrlrqenenlarrlesssqevarlrrgqcpqtrdtaravppgsrevstwnldtlafqelkseltevpasrilkespsgylrsgegdtgcgelvwvgepltlrtaetitgkygvwmrdpkptypytqettwridtvgtdvrqvfeydlisqfmqgypskvhilprplestgavvysgslyfqgaesrtviryelntetvkaekeipgagyhgqfpyswggytdidlavdeaglwviystdeakgaivlsklnpenleleqtwetnirkqsvanafiicgtlytvssytsadatvnfaydtgtgisktltipfknrykyssmidynplekklfawdnlnmvtydiklskm(seqidno:3)

myoccdna序列

atgaggttcttctgtgcacgttgctgcagctttgggcctgagatgccagctgtccagctgctgcttctggcctgcctggtgtgggatgtgggggccaggacagctcagctcaggaaggccaatgaccagagtggccgatgccagtataccttcagtgtggccagtcccaatgaatccagctgcccagagcagagccaggccatgtcagtcatccataacttacagagagacagcagcacccaacgcttagacctggaggccaccaaagctcgactcagctccctggagagcctcctccaccaattgaccttggaccaggctgccaggccccaggagacccaggaggggctgcagagggagctgggcaccctgaggcgggagcgggaccagctggaaacccaaaccagagagttggagactgcctacagcaacctcctccgagacaagtcagttctggaggaagagaagaagcgactaaggcaagaaaatgagaatctggccaggaggttggaaagcagcagccaggaggtagcaaggctgagaaggggccagtgtccccagacccgagacactgctcgggctgtgccaccaggctccagagaagtttctacgtggaatttggacactttggccttccaggaactgaagtccgagctaactgaagttcctgcttcccgaattttgaaggagagcccatctggctatctcaggagtggagagggagacaccggatgtggagaactagtttgggtaggagagcctctcacgctgagaacagcagaaacaattactggcaagtatggtgtgtggatgcgagaccccaagcccacctacccctacacccaggagaccacgtggagaatcgacacagttggcacggatgtccgccaggtttttgagtatgacctcatcagccagtttatgcagggctacccttctaaggttcacatactgcctaggccactggaaagcacgggtgctgtggtgtactcggggagcctctatttccagggcgctgagtccagaactgtcataagatatgagctgaataccgagacagtgaaggctgagaaggaaatccctggagctggctaccacggacagttcccgtattcttggggtggctacacggacattgacttggctgtggatgaagcaggcctctgggtcatttacagcaccgatgaggccaaaggtgccattgtcctctccaaactgaacccagagaatctggaactcgaacaaacctgggagacaaacatccgtaagcagtcagtcgccaatgccttcatcatctgtggcaccttgtacaccgtcagcagctacacctcagcagatgctaccgtcaactttgcttatgacacaggcacaggtatcagcaagaccctgaccatcccattcaagaaccgctataagtacagcagcatgattgactacaaccccctggagaagaagctctttgcctgggacaacttgaacatggtcacttatgacatcaagctctccaagatgtag(seqidno:4)

myocshrna靶序列

ggccatgtcagtcatccat(seqidno:5)

qamsvih(seqidno:6)

shrna環(huán)序列序列

aatagtgaagccacagatgtatt(seqidno:7)

rspo1多肽序列(信號序列加下劃線)

mrlglcvvalvlswthltissrgikgkrqrrisaegsqacakgcelcsevngclkcspklfillerndirqvgvclpscppgyfdarnpdmnkcikckiehceacfshnfctkckeglylhkgrcypacpegssaangtmecsspaqcemsewspwgpcskkqqlcgfrrgseertrrvlhapvgdhaacsdtketrrctvrrvpcpegqkrrkggqgrrenanrnlarkeskeagagsrrrkgqqqqqqqgtvgpltsagpa(seqidno:8)

rspo2多肽序列(信號序列加下劃線)

mqfrlfsfaliilncmdyshcqgnrwrrskrasyvsnpickgclscskdngcsrcqqklffflrregmrqygeclhscpsgyyghrapdmnrcarcriencdscfskdfctkckvgfylhrgrcfdecpdgfapleetmecvegcevghwsewgtcsrnnrtcgfkwgletrtrqivkkpvkdtilcptiaesrrckmtmrhcpggkrtpkakekrnkkkkrklieraqeqhsvflatdranq(seqidno:9)

rspo4多肽序列(信號序列加下劃線)

mraplcllllvahavdmlalnrrkkqvgtglggnctgciicseengcstcqqrlflfirregirqygkclhdcppgyfgirgqevnrckkcgatcescfsqdfcirckrqfylykgkclptcppgtlahqntrecqgecelgpwggwspcthngktcgsawglesrvreagragheeaatcqvlsesrkcpiqrpcpgerspgqkkgrkdrrprkdrkldrrldvrprqpglqp(seqidno:10)

rspo1截短1-135多肽序列(信號序列加下劃線)

mrlglcvvalvlswthltissrgikgkrqrrisaegsqacakgcelcsevngclkcspklfillerndirqvgvclpscppgyfdarnpdmnkcikckiehceacfshnfctkckeglylhkgrcypacpegssa(seqidno:11)

rspo1截短1-206多肽序列(信號序列加下劃線)

_

mrlglcvvalvlswthltissrgikgkrqrrisaegsqacakgcelcsevngclkcspklfillerndirqvgvclpscppgyfdarnpdmnkcikckiehceacfshnfctkckeglylhkgrcypacpegssaangtmecsspaqcemsewspwgpcskkqqlcgfrrgseertrrvlhapvgdhaacsdtketrrctvrrvpc(seqidno:12)

rspo2截短1-134多肽序列(信號序列加下劃線)

mqfrlfsfaliilncmdyshcqgnrwrrskrasyvsnpickgclscskdngcsrcqqklffflrregmrqygeclhscpsgyyghrapdmnrcarcriencdscfskdfctkckvgfylhrgrcfdecpdgfap(seqidno:13)

rspo2截短1-203多肽序列(信號序列加下劃線)

mqfrlfsfaliilncmdyshcqgnrwrrskrasyvsnpickgclscskdngcsrcqqklffflrregmrqygeclhscpsgyyghrapdmnrcarcriencdscfskdfctkckvgfylhrgrcfdecpdgfapleetmecvegcevghwsewgtcsrnnrtcgfkwgletrtrqivkkpvkdtilcptiaesrrckmtmrhc(seqidno:14)

rspo3截短1-135多肽序列(信號序列加下劃線)

mhlrliswlfiilnfmeyigsqnasrgrrqrrmhpnvsqgcqggcatcsdyngclsckprlffalerigmkqigvclsscpsgyygtrypdinkctkckadcdtcfnknfctkcksgfylhlgkcldncpeglea(seqidno:15)

rspo3截短1-146多肽序列(信號序列加下劃線)

mhlrliswlfiilnfmeyigsqnasrgrrqrrmhpnvsqgcqggcatcsdyngclsckprlffalerigmkqigvclsscpsgyygtrypdinkctkckadcdtcfnknfctkcksgfylhlgkcldncpegleannhtmecvsiv(seqidno:16)

rspo3截短1-206多肽序列(信號序列加下劃線)

mhlrliswlfiilnfmeyigsqnasrgrrqrrmhpnvsqgcqggcatcsdyngclsckprlffalerigmkqigvclsscpsgyygtrypdinkctkckadcdtcfnknfctkcksgfylhlgkcldncpegleannhtmecvsivhcevsewnpwspctkkgktcgfkrgtetrvreiiqhpsakgnlcpptnetrkctvqrkkc(seqidno:17)

rspo4截短1-128多肽序列(信號序列加下劃線)

mraplcllllvahavdmlalnrrkkqvgtglggnctgciicseengcstcqqrlflfirregirqygkclhdcppgyfgirgqevnrckkcgatcescfsqdfcirckrqfylykgkclptcppgtla(seqidno:18)

rspo4截短1-195多肽序列(信號序列加下劃線)

mraplcllllvahavdmlalnrrkkqvgtglggnctgciicseengcstcqqrlflfirregirqygkclhdcppgyfgirgqevnrckkcgatcescfsqdfcirckrqfylykgkclptcppgtlahqntrecqgecelgpwggwspcthngktcgsawglesrvreagragheeaatcqvlsesrkcpiqrp(seqidno:19)

突變的itr多核苷酸序列

cactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccacgcccgggctttgcccgggcg(seqidno:20)

myoc370l正向誘變引物(取代加下劃線)

accacggacagttcctgtattcttggggtgg(seqidno:21)

myoc370l反向誘變引物(取代加下劃線)

ccaccccaagaatacaggaactgtccgtggt(seqidno:22)

myocy437h正向誘變引物(取代加下劃線)

tctgtggcaccttgcacaccgtcagcagc(seqidno:23)

myocy437h反向誘變引物(取代加下劃線)

gctgctgacggtgtgcaaggtgccacaga(seqidno:24)

序列表

<110>pechan,peter

scaria,abraham

ardinger,jeffery

<120>用于治療肌纖蛋白(myoc)青光眼的腺相關(guān)病毒載體

<130>159792012540

<140>尚未指定

<141>與此同時

<150>62/051,229

<151>2014-09-16

<160>24

<170>用于windows的fastseq4.0版

<210>1

<211>272

<212>prt

<213>人

<400>1

methisleuargleuilesertrpleupheileileleuasnphemet

151015

glutyrileglyserglnasnalaserargglyargargglnargarg

202530

methisproasnvalserglnglycysglnglyglycysalathrcys

354045

serasptyrasnglycysleusercyslysproargleuphepheala

505560

leugluargileglymetlysglnileglyvalcysleusersercys

65707580

proserglytyrtyrglythrargtyrproaspileasnlyscysthr

859095

lyscyslysalaaspcysaspthrcyspheasnlysasnphecysthr

100105110

lyscyslysserglyphetyrleuhisleuglylyscysleuaspasn

115120125

cysprogluglyleuglualaasnasnhisthrmetglucysvalser

130135140

ilevalhiscysgluvalserglutrpasnprotrpserprocysthr

145150155160

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<223>合成的構(gòu)建體

<400>21

accacggacagttcctgtattcttggggtgg31

<210>22

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的構(gòu)建體

<400>22

ccaccccaagaatacaggaactgtccgtggt31

<210>23

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的構(gòu)建體

<400>23

tctgtggcaccttgcacaccgtcagcagc29

<210>24

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的構(gòu)建體

<400>24

gctgctgacggtgtgcaaggtgccacaga29