發(fā)明的技術領域
本發(fā)明涉及親和層析領域,更具體地說涉及可用于免疫球蛋白的親和層析法的a蛋白的突變的免疫球蛋白結合結構域。本發(fā)明還涉及突變的結構域的多聚體和含有突變的結構域或多聚體的基質的分離。
發(fā)明前景
免疫球蛋白代表了全球制造或開發(fā)中最流行的生物制藥制品。對這一特殊治療市場的高商業(yè)需求和由此產生的價值導致重點投向制藥公司以在控制相關成本的同時使其相應的mab生產過程的生產力最大化。
在大多數(shù)情況下采用親和層析法,作為在這些免疫球蛋白分子(例如單克隆或多克隆抗體)純化中的關鍵步驟之一。特別引人關注的親和試劑類別是能夠與免疫球蛋白分子的不可變部分特異性結合的蛋白質,這種相互作用獨立于抗體的抗原結合特異性。這類試劑廣泛用于親和層析法,從不同樣品(例如但不限于血清或血漿制備物或細胞培養(yǎng)來源的原料)中回收免疫球蛋白。這類蛋白質的一個實例是葡萄球菌a蛋白,其含有能夠與來自不同物種的igg免疫球蛋白的fc和fab部分結合的結構域。
基于葡萄球菌a蛋白(spa)的試劑由于其高親和力和選擇性而廣泛應用于生物技術,例如應用于親和層析法以用于俘獲和純化抗體以及用于檢測或定量。目前,基于spa的親和培養(yǎng)基可能是最廣泛使用的親和培養(yǎng)基用于從不同的樣品(包括工業(yè)細胞培養(yǎng)上清液)中分離單克隆抗體及其片段。因此,包含a蛋白-配體的不同基質可以是市購獲得的,例如為天然a蛋白的形式(例如proteinasepharose?,gehealthcare,uppsala,sweden),也包括重組a蛋白(例如rproteinasepharose?,gehealthcare)。更準確地說,在商用重組a蛋白產品中進行的遺傳操作的目的在于促進其與支持體的連接并提高配體的生產率。
像其它親和層析應用一樣,這些應用需要全面注意污染物的明確清除。這類污染物可以是例如層析程序中與固定相或基質吸附的未洗脫分子,例如不需要的生物分子或微生物,包括例如蛋白質、糖、脂質、細菌和病毒。為了在后續(xù)使用之前使基質再生,通常在第一次洗脫所需產物后進行從基質中清除這類污染物。這類清除通常包括稱為就地清洗(cleaning-in-place,cip)的程序,其中使用能夠將污染物從固定相中洗脫的劑。常用的一種這類作用劑是流經(jīng)所述固定相的堿性溶液。目前最廣泛使用的清潔消毒劑是naoh,其濃度范圍可為0.1直到例如1m,這取決于污染的程度和性質。該策略與將基質暴露于ph值高于13的溶液中有關。對于含有蛋白質性親和配體的許多親和層析基質,這類堿性環(huán)境是極嚴苛的條件,因此導致因配體對所涉及的高ph不穩(wěn)定性所致的能力降低。
因此大量研究集中在開發(fā)顯示承受堿性ph值的能力提高的工程改造的蛋白質配體。例如,gülich等(susannegülich,martinlinhult,per-?kenygren,mathiasuhlén,sophiahober,journalofbiotechnology80(2000),169-178)提出進行工程改造以提高鏈球菌白蛋白結合結構域(abd)在堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性質的蛋白質。gülich等人建立了abd的一個突變體,其中所有4個天冬酰胺殘基被亮氨酸(1個殘基)、天冬氨酸(2個殘基)和賴氨酸(1個殘基)置換。此外,gülich等人報告了其突變體顯示與天然蛋白質類似的靶蛋白質結合行為,且與使用親代未工程改造的配體制備的柱相比,含有工程改造的配體的親和柱顯示在重復暴露于堿性條件后較高的結合能力。因此,在該文中得出結論,所有4個天冬酰胺殘基都可被置換而對結構和功能沒有任何顯著作用。
最新研究表明,還可對a蛋白(spa)進行改變以實現(xiàn)類似的性質。美國專利申請公開us2005/0143566(其通過引用以其整體結合到本文中),公開了當至少一個天冬酰胺殘基突變成谷氨酰胺或天冬氨酸以外的氨基酸時,與親代spa,例如spa的b結構域或z蛋白(一種來源于spa的b結構域的合成構建體)相比,突變使在高達約13-14的ph值下化學穩(wěn)定性提高(us5,143,844,通過引用以其整體結合)。作者表明當這些突變的蛋白質用作親和配體時,分離介質如預期可更好地承受使用堿性劑的清洗程序。wo2008/039141、jp2006304633a、ep1992692a1、ep2202310a2、wo2010/110288、wo2012/086660、wo2012/083425、wo2012/087230和wo2014/146350中還公布了其目的在于提高堿穩(wěn)定性的a蛋白結構域的其它突變,其所有均通過引用以其整體結合到本文中。然而,目前可獲得的突變仍對堿性ph敏感,清洗期間的naoh濃度通常限于0.1m,這意味著難以實現(xiàn)徹底清洗。會改進清洗的較高naoh濃度,導致不可接受的能力喪失。
因此在該領域仍需要獲得含有針對堿性清洗程序穩(wěn)定性進一步提高的蛋白質配體的分離基質。
發(fā)明概述
本發(fā)明的一個方面提供堿穩(wěn)定性提高的多肽。這用權利要求1限定的多肽實現(xiàn)。
一個優(yōu)勢是堿穩(wěn)定性相對于親代多肽提高,同時保持對免疫球蛋白和其它含fc的蛋白質的高選擇性結合。
本發(fā)明的第二個方面提供堿穩(wěn)定性提高、包含多個多肽的多聚體。這用權利要求限定的多聚體實現(xiàn)。
本發(fā)明的第三個方面提供編碼堿穩(wěn)定性提高的多肽或多聚體的核酸或載體。這用權利要求限定的核酸或載體實現(xiàn)。
本發(fā)明的第四個方面提供能夠表達堿穩(wěn)定性提高的多肽或多聚體的表達系統(tǒng)。這用權利要求限定的表達系統(tǒng)實現(xiàn)。
本發(fā)明的第五個方面提供能夠選擇性結合免疫球蛋白和其它含fc的蛋白質并顯示堿穩(wěn)定性提高的分離基質。這用權利要求限定的分離基質實現(xiàn)。
本發(fā)明的第六個方面提供分離免疫球蛋白或其它含fc的蛋白質的經(jīng)濟有效的方法。這用權利要求限定的方法實現(xiàn)。
隨附權利要求書中描述了本發(fā)明的其它合適的實施方案。
定義
術語“抗體”和“免疫球蛋白”在本文可互換使用,要理解為還包括抗體的片段、包含抗體或抗體片段的融合蛋白和包含抗體或抗體片段的綴合物。
術語“fc結合多肽”和“fc結合蛋白”分別是指能夠與抗體的可結晶部分(fc)結合的多肽或蛋白質,包括例如a蛋白和g蛋白或其保持所述結合性質的任何片段或融合蛋白。
術語“接頭”在本文是指在多聚體中使兩個多肽單元單體或結構域彼此連接的元件。
術語“間隔基(spacer)”在本文是指將多肽或多肽多聚體與支持體連接的元件。
附圖簡述
圖1顯示由seqidno:1-7和26-27限定的fc結合結構域的比對。
實施方案的詳細描述
一方面,本發(fā)明公開了fc結合多肽,其包含由圖1所示的seqidno:1(e-結構域)、seqidno:2(d-結構域)、seqidno:3(a-結構域)、seqidno:4(b-結構域)、seqidno:5(c-結構域)、seqidno:6(z蛋白)、seqidno:7(zvar)或seqidno:8(變體a-結構域)、seqidno26(無接頭區(qū)氨基酸1-6的zvar)或seqidno27(無接頭區(qū)氨基酸1-6的c-結構域)限定的、或與之有至少90%、至少95%或至少98%同一性的葡萄球菌a蛋白(spa)的fc結合結構域的突變體或由其組成,其中至少對應于seqidno:4-7中*42位的位置處的丙氨酸殘基突變成另一個氨基酸殘基(例如精氨酸),和/或其中至少對應于seqidno:4-7中37位的位置處的天冬氨酸殘基突變成谷氨酸。z蛋白(seqidno:6)是us5143844中公開的突變的b-結構域,而seqidno7表示z蛋白進一步突變的變體,本文稱為zvar,其突變?yōu)閚3a,n6d,n23t。seqidno:8是來自金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)菌株n315的a蛋白的a-結構域的一種天然變體,使用圖1的位置術語,其具有a46s突變。與親代結構域/多肽相比,這些結構域中d37和/或a42的突變賦予提高的堿穩(wěn)定性,而又不損害免疫球蛋白結合性質。因此,多肽還可描述為fc結合多肽或免疫球蛋白結合多肽,或者作為fc結合多肽單元或免疫球蛋白結合多肽單元。
*在該描述中,使用圖1的氨基酸殘基位置編號慣例,且按對應于seqidno4-7中的那些標明位置編號。
在替代用語中,本發(fā)明公開了包含由seqidno28限定的或與之有至少90%、至少95%或至少98%同一性的序列的fc結合多肽。
seqidno28
kex1qx2afyeilx3lpnlteeqrx4x5fiqx6lkdx7psx8sx9x10x11laeakx12x13ndaqapk
其中其每個各獨立為
x1=a或q
x2=e、k或n
x3=h或k
x4=a或n
x5=a或g
x6=s或k
x7=e或d
x8=q或v
x9=k、r或a
x10=a、e或n
x11=i或l
x12=k或r
x13=l或y
d37e(x7)和/或a42r(x9)突變可為僅有的突變或多肽還可包含其它突變,例如對應于seqidno:4-8中的3、6、9、10、15、18、23、28、29、32、33、36、37、40、42、43、44、47、50、51、55和57位的位置的至少一個的取代。在這些位置的一個或多個中,原始氨基酸殘基例如可被不是天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸取代。原始氨基酸殘基例如可被丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、賴氨酸、谷氨酸或天冬氨酸取代。此外,例如來自第1-6位和/或第56-58位的一個或多個氨基酸殘基可缺失。
在一些實施方案中,在對應于seqidno:4-7(x1)的9位的位置處的氨基酸殘基是谷氨酰胺、天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸以外的氨基酸,例如丙氨酸。在具體的實施方案中,seqidno:7的9位的氨基酸殘基是丙氨酸,11位的氨基酸殘基是賴氨酸。9位的突變還論述于同時待審的申請pct/se2014/050872中,其通過引用以其整體結合到本文中。
在一些實施方案中,對應于seqidno:4-7中50位的位置處的氨基酸殘基(x12)是精氨酸或谷氨酸。
在某些實施方案中,對應于seqidno:4-7中的11位的位置處的氨基酸殘基(x2)是賴氨酸或谷氨酸。
在某些實施方案中,對應于seqidno:4-7中的3位的位置處的氨基酸殘基是丙氨酸和/或對應于seqidno:4-7中的6位的位置處的氨基酸殘基是天冬氨酸。3和6位的氨基酸殘基之一可以是天冬酰胺,而在備選的實施方案中,3和6位的兩個氨基酸殘基可以是天冬酰胺。
在一些實施方案中,對應于seqidno:4-7中的43位的位置處的氨基酸殘基(x10)是丙氨酸或谷氨酸,例如丙氨酸。在具體的實施方案中,seqidno:7中9位的氨基酸殘基是丙氨酸,11位的氨基酸殘基是賴氨酸或谷氨酸,而43位的氨基酸殘基是丙氨酸或谷氨酸。
在某些實施方案中,在對應于seqidno:4-7的28位的位置處的氨基酸殘基(x4)是丙氨酸或天冬酰胺,例如丙氨酸。
在一些實施方案中,對應于seqidno:4-7中的40位的位置處的氨基酸殘基(x8)選自天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酸和纈氨酸,或選自谷氨酸和纈氨酸。
在某些實施方案中,對應于seqidno:4-7中的42位的位置處的氨基酸殘基(x9)是丙氨酸、賴氨酸或精氨酸。
在一些實施方案中,對應于seqidno:4-7中的18位的位置處的氨基酸殘基(x3)是賴氨酸或組氨酸,例如賴氨酸。
在某些實施方案中,對應于seqidno:4-7中的33位的位置處的氨基酸殘基(x6)是賴氨酸或絲氨酸,例如賴氨酸。
在一些實施方案中,對應于seqidno:4-7中的37位的位置處的氨基酸殘基(x7)是谷氨酸或天冬氨酸,例如谷氨酸。
在某些實施方案中,對應于seqidno:4-7中的51位的位置處的氨基酸殘基(x13)是酪氨酸或亮氨酸,例如酪氨酸。
在一些實施方案中,對應于seqidno:4-7中的44位的位置處的氨基酸殘基(x11)是亮氨酸或異亮氨酸。在具體的實施方案中,seqidno:7中9和11位的氨基酸殘基分別是丙氨酸和賴氨酸,而44位的氨基酸殘基是異亮氨酸。任選43位的氨基酸殘基則可為丙氨酸或谷氨酸。
在一些實施方案中,對應于seqidno:4-7的1、2、3和4位或3、4、5和6位的位置處的氨基酸殘基缺失。在這些實施方案的具體變體中,親代多肽是a蛋白的c結構域(seqidno:5)。這些缺失對天然c結構域的作用描述于us9018305和us8329860,其通過引用以其整體結合到本文中。
在某些實施方案中,seqidno4-7(例如seqidno7中)的突變,選自:d37e;a42r;n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y;q9a,n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y;n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i;q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i;q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r;q9a,n11k,h18k,d37e,a42r;q9a,n11e,d37e,q40v,a42k,n43a,l44i和q9a,n11e,d37e,q40v,a42r,n43a,l44i。這些突變提供特別高的堿穩(wěn)定性。
在一些實施方案中,多肽包含選自seqidno:9-18和24-25;10-18和24-25或11-18和24-25的序列或基本上由其組成。多肽可由例如選自上組或選自該組的子集的序列限定,但是它還可包含在n端和/或c端的其它氨基酸殘基,例如n端的前導序列和/或c端的尾序列。
seqidno9zvar(d37e)
vdakfdkeqqnafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsqsanllaeakklndaqapk
seqidno10zvar(a42r)
vdakfdkeqqnafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsrnllaeakklndaqapk
seqidno:11zvar(s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)
vdakfdkeqqnafyeilhlpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapk
seqidno:12zvar(h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)
vdakfdkeqqnafyeilklpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapk
seqidno13zvar(n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)
vdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapk
seqidno14zvar(q9a,n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)
vdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqraafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapk
seqidno15zvar(n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i)
vdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrailaeakklndaqapk
seqidno16zvar(q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i)
vdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrailaeakklndaqapk
seqidno17zvar(q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r)
vdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrailaeakrlndaqapk
seqidno18zvar(q9a,n11k,h18k,d37e,a42r)
vdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrnllaeakklndaqapk
seqidno24zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42k,n43a,l44i)
vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvskailaeakklndaqapk
seqidno25zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42r,n43a,l44i)
vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvsrailaeakklndaqapk
在第二方面,本發(fā)明公開了包含由上文公開的任何實施方案限定的多個多肽單元的多聚體或基本上由其組成的多聚體。多聚體可以是例如二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體或九聚體。它可以是同多聚體(homomultimer),其中多聚體中的所有單元是相同的或它可以是異多聚體(heteromultimer),其中至少一個單元不同于其它單元。有利的是,多聚體中的所有單元例如通過包含上文公開的突變是堿穩(wěn)定性的。多肽可通過多肽的c端和n端之間的肽鍵彼此直接連接?;蛘?,多聚體中的兩個或更多個單位可通過包含寡聚物類或聚合物類的接頭,例如包含多達15或30個氨基酸,例如1-5、1-10或5-10個氨基酸的元件連接。這類接頭的性質應優(yōu)選不破壞蛋白質單元的空間構象的穩(wěn)定。例如這可通過避免接頭中脯氨酸的存在而實現(xiàn)。此外,所述接頭還應優(yōu)選在堿性環(huán)境中足夠穩(wěn)定,從而不損害突變的蛋白質單元的性質。為此目的,如果接頭不含天冬酰胺,則是有利的。如果接頭不含谷氨酰胺,則也是有利的。多聚體可在n端進一步包含多個氨基酸殘基,例如來源于克隆過程的殘基或從切下的信號序列構成殘基。其它氨基酸殘基的數(shù)目可為例如為15個或更少,例如10個或更少或5個或更少。作為一個具體實例,多聚體可在n端包含aq序列。
在某些實施方案中,多聚體可包含選自以下的序列或基本由其組成:seqidno20、seqidno21、seqidno22和seqidno23。下文列出了這些序列,并命名為親代(突變)n,其中n為多聚體中單體單位的數(shù)目。
seqidno20zvar(n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)4
aqgtvdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapkvdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapkvdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapkvdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapkc
seqidno21zvar(q9a,n11k,h18k,d37e,a42r)4
aqgtvdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrnllaeakklndaqapkvdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrnllaeakklndaqapkvdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrnllaeakklndaqapkvdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrnllaeakklndaqapkc
seqidno22zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42k,n43a,l44i)4
aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvskailaeakklndaqapkc
seqidno23zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42r,n43a,l44i)4
aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvsrailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvsrailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvsrailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvsrailaeakklndaqapkc
在一些實施方案中,上文公開的多肽和/或多聚體在c端或n端還包含選自一個或多個半胱氨酸殘基、多個賴氨酸殘基和多個組氨酸殘基的一個或多個偶聯(lián)元件。偶聯(lián)元件還可位于距c端或n端1-5個氨基酸殘基內,例如1-3或1-2個氨基酸殘基內。偶聯(lián)元件可以是例如c端的單一半胱氨酸。偶聯(lián)元件可與c端或n端直接連接,或它/它們可通過包含多達15個氨基酸例如1-5、1-10或5-10個氨基酸的序列段(stretch)(接頭)連接。特別在針對seqidno26和27的突變和對于seqidno28多肽就是這種情況,其中接頭的具體實例可為例如vdakfd或adnkfn,例如vdakfd。這個序列段優(yōu)選還應在堿性環(huán)境中足夠穩(wěn)定而不損害突變的蛋白質的性質。為此目的,如果序列段不含天冬酰胺,則是有利的。如果序列段不含谷氨酰胺,則也可以是有利的。具有c端半胱氨酸的優(yōu)勢是蛋白質的終點偶聯(lián)可通過半胱氨酸硫醇基與支持體上的親電子基團反應來實現(xiàn)。這提供了偶聯(lián)蛋白質的優(yōu)異遷移率,這對結合能力是重要的。
多肽或多聚體的堿穩(wěn)定性可如下評價:通過使用例如nhs-或馬來酰亞胺偶聯(lián)化學,按實施例中所述使之與spr芯片(例如tobiacorecm5傳感器芯片)偶聯(lián),并且在堿性溶液中在規(guī)定的溫度(例如22+/-2℃)下溫育之前和之后,通常使用多克隆人igg,測量芯片的免疫球蛋白結合能力。溫育可在例如0.5mnaoh中進行多個10分鐘循環(huán),例如100、200或300個循環(huán)。在0.5mnaoh中在22+/-2℃下100個10分鐘溫育循環(huán)后,基質的igg容量可為溫育前igg容量的至少55%,例如至少60%、至少80%或至少90%?;蛘?,可將所述在100個循環(huán)后針對如上測量特定突變體的剩余igg容量與親代多肽/多聚體的剩余igg容量進行比較。在這種情況下,突變體的剩余igg容量可為親代多肽/多聚體的至少105%,例如至少110%、至少125%、至少150%或至少200%。
在第三方面,本發(fā)明公開了編碼上文公開的任何實施方案的多肽或多聚體的核酸。因此,本發(fā)明包括本發(fā)明核酸序列的所有形式,例如編碼多肽或多聚體的rna和dna。本發(fā)明包括載體,例如質粒,其除編碼序列以外,還包含所需的用于表達本發(fā)明的多肽或多聚體的信號序列。在一個實施方案中,載體包含編碼本發(fā)明的多聚體的核酸,其中編碼各單元的各個核酸可具有同源或異源的dna序列。
在第四方面,本發(fā)明公開了表達系統(tǒng),其包含上文公開的核酸或載體。表達系統(tǒng)可以是例如革蘭氏陽性或革蘭氏陰性原核宿主細胞系統(tǒng),例如經(jīng)修飾表達本發(fā)明多肽或多聚體的大腸桿菌(e.coli)或芽孢桿菌(bacillussp.)。在一個備選的實施方案中,表達系統(tǒng)是真核宿主細胞系統(tǒng),例如酵母,例如巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)或釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)或哺乳動物細胞,例如cho細胞。
在第五方面,本發(fā)明公開了分離基質,其中多個上文公開的任何實施方案的多肽或多聚體與固相支持體偶聯(lián)。這類基質可用于分離免疫球蛋白或其它含fc的蛋白質,且由于多肽/多聚體的堿穩(wěn)定性提高,因此基質在清洗期間會承受高度堿性的條件,這對在生物過程分離背景下的長期重復使用是必需的??稍趬A性溶液中在規(guī)定的溫度(例如22+/-2℃)下溫育之前和之后,通常使用多克隆人igg,測量免疫球蛋白結合能力,對基質的堿穩(wěn)定性進行評價。溫育可在例如0.5m或1.0mnaoh中進行多個15分鐘循環(huán),例如100、200或300個循環(huán),相當于25、50或75小時的總溫育時間。在0.5mnaoh中在22+/-2℃下在96-100個15分鐘溫育循環(huán)或24或25小時的總溫育時間之后,基質的igg容量可為溫育前igg容量的至少80%、例如至少85%、至少90%或至少95%。在1.0mnaoh中在22+/-2℃下在24小時的總溫育時間后,基質的容量可為溫育前igg容量的至少70%、例如至少80%或至少90%。
本領域技術人員應了解,表達的多肽或多聚體應在固定在支持體之前純化到適當程度。這類純化方法是本領域眾所周知的,容易采用標準方法進行基于蛋白質的配體在支持體上的固定。下面將更詳細地論述合適的方法和支持體。
本發(fā)明的基質的固相支持體可以是任何合適的眾所周知的類型。常規(guī)的親和分離基質常常是有機性質的和以這樣的聚合物為基礎,其將親水表面暴露于所用的水性介質,即將羥基(-oh)、羧基(-cooh)、甲酰氨基(-conh2,可能呈n取代的形式)、氨基(-nh2,可能呈取代形式)、寡乙烯氧基或聚乙烯氧基暴露在其外面,也暴露在其內表面(如存在話)。固體支持體可適宜為多孔的。多孔性可表示為kav或kd值(特定大小的探針分子可達到的孔體積的分數(shù)),該值例如按照描述于gelfiltrationprinciplesandmethods,pharmacialkbbiotechnology1991,第6-13頁的方法,通過反向大小排阻層析法測量。按照定義,kd和kav值兩者總是位于0-1的范圍內。kav值可有利地為0.6-0.95,例如0.7-0.90或0.6-0.8,如用mw110kda的葡聚糖作為探針分子測量的。這個的優(yōu)勢是支持體具有大分數(shù)的孔隙,能夠容納本發(fā)明的多肽/多聚體和與多肽/多聚體結合的免疫球蛋白兩者,并提供免疫球蛋白自結合部位往返的質量運輸。
可利用例如存在于配體中的硫醇基、氨基和/或羧基,通過常規(guī)偶聯(lián)技術使多肽或多聚體與支持體連接。bisepoxides、環(huán)氧氯丙烷、cnbr、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)等是眾所周知的偶聯(lián)試劑。可在支持體和多肽/多聚體之間,引入稱為間隔基的分子,這改進多肽/多聚體的可用性和促進多肽/多聚體與支持體的化學偶聯(lián)。根據(jù)多肽/多聚體的性質和偶聯(lián)條件,偶聯(lián)可以是多點偶聯(lián)(例如通過多個賴氨酸)或單點偶聯(lián)(例如通過單一半胱氨酸)?;蛘撸嚯?多聚體可通過非共價鍵合(例如物理吸附或生物特異性吸附)與支持體連接。
在一些實施方案中,基質包含5-25,例如5-20mg/ml、5-15mg/ml、5-11mg/ml或6-11mg/ml的與支持體偶聯(lián)的多肽或多聚體??赏ㄟ^偶聯(lián)過程中所用的多肽/多聚體的濃度、所用的激活和偶聯(lián)條件和/或所用的支持體的孔結構來控制偶聯(lián)的多肽/多聚體的量。作為普通規(guī)則,基質的絕對結合能力隨著偶聯(lián)的多肽/多聚體的量提高,至少達到其中孔變得顯著受限于偶聯(lián)的多肽/多聚體的點。每mg偶聯(lián)的多肽/多聚體的相對結合能力在高偶聯(lián)水平下會降低,導致上文規(guī)定范圍內的最適成本效益。
在某些實施方案中,多肽或多聚體通過硫醚鍵與支持體偶聯(lián)。進行這類偶聯(lián)的方法是本領域眾所周知的,且本領域技術人員采用標準技術和儀器容易進行。硫醚鍵是柔性和穩(wěn)定的,并且常常適用于親和層析法。特別當硫醚鍵是通過多肽或多聚體上的末端或近末端半胱氨酸殘基時,偶聯(lián)的多肽/多聚體的遷移率提高,這提供提高的結合能力和結合動力學。在一些實施方案中,如上文所述多肽/多聚體通過蛋白質上提供的c端半胱氨酸偶聯(lián)。這允許半胱氨酸硫醇基與支持體上的親電子基團(例如環(huán)氧基、鹵代醇基等)的有效偶聯(lián),導致了硫醚橋偶聯(lián)。
在某些實施方案中,支持體包含多羥基多聚體,例如多糖。多糖的實例包括例如葡聚糖、淀粉、纖維素、普魯蘭多糖(pullulan)、瓊脂、瓊脂糖等。多糖是固有親水的,其非特異性相互作用的程度低,它們提供大量的反應性(可激活的)羥基,并且它們對用于生物加工的堿性清洗溶液通常是穩(wěn)定的。
在一些實施方案中,支持體包含瓊脂或瓊脂糖。用于本發(fā)明的支持體可容易地按照標準方法制備,例如反相懸浮凝膠法(shjertén:biochimbiophysacta79(2),393-398(1964)?;蛘撸A基質是可市購獲得的產品,例如以sepharose?ff(gehealthcare)的名稱銷售的交聯(lián)瓊脂糖珠。在一個實施方案中,這對大規(guī)模分離是特別有利的,采用描述于us6602990或us7396467(其通過引用以其整體結合到本文中)的方法,使支持體改變以增加其剛性,因此使基質更適于高的流速。
在某些實施方案中,支持體,例如多糖或瓊脂糖支持體與例如羥基烷基醚交聯(lián)劑交聯(lián)。產生這類交聯(lián)的交聯(lián)試劑可以是例如表鹵代醇如環(huán)氧氯丙烷、雙環(huán)氧化合物如丁二醇二環(huán)氧甘油醚、烯丙基化試劑如烯丙基鹵或烯丙基縮水甘油醚。交聯(lián)對支持體的剛性是有益的,并提高化學穩(wěn)定性。羥基烷基醚交聯(lián)是堿穩(wěn)定性的,并且不引起顯著的非特異性吸附。
或者,固體支持體基于合成多聚體,例如聚乙烯醇、多羥基烷基丙烯酸酯、多羥基烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等。在疏水多聚體的情況下,例如基于二乙烯和單乙烯基取代的苯的基質,基質的表面常常是親水化的以將上文定義的親水基顯露在環(huán)境水性液體中。這類聚合物容易按照標準方法產生,參見例如“styrenebasedpolymersupportsdevelopedbysuspensionpolymerization(通過懸浮多聚化開發(fā)的基于苯乙烯的多聚體支持體)”(rarshady:chimicael'industria70(9),70-75(1988))?;蛘?,使用市購可獲得的產品,例如source?(gehealthcare)。在另一個備選方法中,本發(fā)明的固體支持體包含無機性質的支持體,例如二氧化硅、氧化鋯等。
在又一個實施方案中,固體支持體呈另一種形式,例如表面、芯片、毛細管或濾器(例如膜或深層濾器(depthfilter)基質)。
至于本發(fā)明的基質的形狀,在一個實施方案中,基質呈多孔整料的形式。在一個備選的實施方案中,基質是可為多孔或無孔的珠狀形式或顆粒形式。呈珠狀形式或顆粒形式的基質可用作填充床或以懸浮形式使用。懸浮形式包括稱為膨脹床和純懸液的那些,其中顆?;蛑榱J亲杂梢苿拥摹T谡?、填充床和膨脹床的情況下,分離程序通常遵循具有濃度梯度的常規(guī)層析法。在純懸浮的情況下,將使用分批形式。
在第六方面,本發(fā)明公開了分離免疫球蛋白的方法,其中使用上文公開的分離基質。
在某些實施方案中,所述方法包括以下步驟:
a)使包含免疫球蛋白的液體樣品與上文公開的分離基質接觸,
b)將所述分離基質用洗液(washingliquid)洗滌,
c)將免疫球蛋白用洗脫液從分離基質中洗脫,和
d)將分離基質用清洗液(cleaningliquid)(其可備選稱為就地清洗(cip)液)清洗例如至少10分鐘的接觸(溫育)時間。
所述方法還可包括以下步驟:在步驟a)前提供上述實施方案任一個的親和分離基質并提供包含免疫球蛋白和至少一種其它物質的溶液作為液體樣品,和在步驟c)后回收洗脫液和任選通過例如陰離子或陽離子交換層析法、多元層析法和/或疏水相互作用層析法對洗脫液進行進一步分離步驟。液體樣品、洗液和洗脫液的合適組成以及進行分離的通用條件是親和層析領域和特別是a蛋白層析領域中眾所周知的。包含含fc的蛋白質和至少一種其它物質的液體樣品可包含宿主細胞蛋白質(hcp),例如cho細胞、大腸桿菌或酵母蛋白質??赏ㄟ^針對這些蛋白質的免疫測定,例如來自cygnustechnologies的chohcp或大腸桿菌hcpelisa試劑盒,方便地測定cho細胞和大腸桿菌蛋白質的含量??稍诓襟Eb)期間使宿主細胞蛋白質或cho細胞/大腸桿菌蛋白質解吸附。
可通過使用用于從a蛋白介質中洗脫的任何合適的溶液進行洗脫。這可以是例如ph5或更低、例如ph2.5-5或3-5的溶液或緩沖液。在一些情況下也可為ph11或更高、例如ph11-14或ph11-13的溶液或緩沖液。在一些實施方案中,洗脫緩沖液或洗脫緩沖液梯度包含至少一個單官能、二官能或三官能羧酸或這類羧酸的鹽。在某些實施方案中,洗脫緩沖液或洗脫緩沖液梯度包含選自以下的至少一種陰離子物類:乙酸鹽、檸檬酸鹽、甘氨酸、琥珀酸鹽、磷酸鹽和甲酸鹽。
在一些實施方案中,清洗液是堿性的,例如ph為13-14。這類溶液提供基質、特別是間隔(interval)上層的有效清洗。
在某些實施方案中,清洗液包含0.1-2.0mnaoh或koh,例如0.5-2.0或0.5-1.0mnaoh或koh。這些是有效的清洗溶液,當naoh或koh濃度超過0.1m或至少0.5m時特別如此。本發(fā)明的多肽的高穩(wěn)定性使得能夠使用這類強堿性溶液。
所述方法還可包括將基質用消毒液消毒的步驟,所述消毒液可包含例如過氧化物,例如過氧化氫和/或過酸,例如過乙酸或過甲酸。
在一些實施方案中,重復步驟a)-d)至少10次,例如至少50次、50-200、50-300或50-500次。這對于工藝經(jīng)濟性是重要的,因為基質可重復使用多次。
還可重復步驟a)-c)至少10次,例如至少50次、50-200、50-300或50-500次,其中步驟d)在步驟c)的多次后進行,使得進行步驟d)至少10次,例如至少50次。步驟d)可在例如步驟c)的每第二至第二十次時進行。
實施例
蛋白質的誘變
使用編碼突變的寡核苷酸,通過兩步pcr進行位點定向誘變。使用含有z、b或c的單一結構域的質粒作為模板。將pcr片段連接入大腸桿菌表達載體。采用dna測序以證實插入片段的正確序列。
為了形成突變體的多聚體,使用位于b、c或z結構域的起始密碼子(gtagac)的acci位點(相當于氨基酸vd)。單體結構域的載體用acci消化和磷酸酶處理。設計對各變體有特異性的acci黏性末端引物,從每個模板產生2個重疊的pcr產物。將pcr產物純化,通過比較2%瓊脂糖凝膠上的pcr產物來估算濃度。將等量的成對pcr產物在連接緩沖液中雜交(90℃->25℃,45分鐘)。所得產物構成可能連接至acci位點的片段的約?(正確的pcr片段和/或消化的載體)。在連接和轉化后,集落經(jīng)pcr篩選以鑒定含有所需突變體的構建體。陽性克隆通過dna測序證實。
構建體表達和純化
在標準培養(yǎng)基中通過大腸桿菌k12發(fā)酵,使構建體在細菌周質中表達。在發(fā)酵后,對細胞進行熱處理以將周質內容物釋放到培養(yǎng)基中。通過用具有0.2μm孔徑的膜微過濾,回收釋放到培養(yǎng)基中的構建體。
將此時在來自過濾步驟的滲透物中的各個構建體通過親和力純化。將滲透物加載到含有固定化igg(iggsepharose6ff,gehealthcare)的層析介質中。通過降低ph,對加載的產物用磷酸緩沖鹽水進行洗滌和洗脫。
將洗脫合并物調節(jié)至中性ph(ph8)并通過加入二硫蘇糖醇還原。然后將樣品加載至陽離子交換器中。在洗滌步驟后,將構建體在nacl梯度中洗脫以將其與任何污染物分開。通過超濾使洗脫合并物濃縮至40-50mg/ml。應注意到,固定化igg介質中構建體成功的親和純化表明,所論述的構建體對igg具有高親和力。
用rpclc-ms分析純化的配體以測定純度并確定與預期(根據(jù)氨基酸序列)相當?shù)姆肿恿俊?/p>
實施例1
使用gehealthcare的胺偶聯(lián)試劑盒(用于芯片中羧基甲基上的胺的碳二亞胺偶聯(lián)),以在biacore表面等離子體共振(spr)儀器(gehealthcare,sweden)上足以給于約200-1500ru的信號強度的量,將列于表1中還在n端含aqgt前導序列和在c端含半胱氨酸的純化的單體配體固定在biacorecm5傳感器芯片(gehealthcare,sweden)上。為了跟蹤固定化表面的igg結合能力,使1mg/ml人多克隆igg(gammanorm)從芯片上流過,記錄信號強度(與結合的量成比例)。然后就地清洗(cip)表面,即在室溫(22+/-2℃)下用500mmnaoh沖洗10分鐘。對此重復96-100個循環(huán),跟蹤固定化配體堿穩(wěn)定性作為在每個循環(huán)后剩余的igg結合能力(信號強度)。結果見表1,并且表明與用作參比的親代結構zvar1相比,至少配體zvar(d37e)1、zvar(a42r)1、zvar(s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)1、zvar(h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)1、zvar(n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)1、zvar(q9a,n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)1、zvar(n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i)1、zvar(q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i)1和zvar(q9a,n11k,h18k,d37e,42r,n43a,l44i,k50r)1具有改進的堿穩(wěn)定性。
表1.通過biacore評價的單體配體(0.5mnaoh)。
實施例2
使用gehealthcare的胺偶聯(lián)試劑盒(用于芯片中羧基甲基上胺的碳二亞胺偶聯(lián)),以在biacore儀器(gehealthcare,sweden)上足以給予約200-1500ru的信號強度的量,將表2中所列的純化的四聚體配體固定在biacorecm5傳感器芯片(gehealthcare,sweden)上。為了跟蹤固定化表面的igg結合能力,使1mg/ml人多克隆igg(gammanorm)從芯片上流過,記錄信號強度(與結合的量成比例)。然后使表面就地清洗(cip),即在室溫(22+/-2℃)下用500mmnaoh沖洗10分鐘。對此重復300個循環(huán),并跟蹤固定化配體堿穩(wěn)定性作為在每個循環(huán)后剩余的igg結合能力(信號強度)。結果見表2和圖2,且表明與用作參比的親代結構zvar4相比,至少配體zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42k,n43a,l44i)4和zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42r,n43a,l44i)4具有改進的堿穩(wěn)定性。
表2.通過biacore評價的四聚體和六聚體配體(0.5mnaoh)。
實施例3
采用下文描述的方法,使表3的純化的四聚體配體(全部具有額外的n端半胱氨酸)固定在瓊脂糖珠粒上,并針對容量和穩(wěn)定性進行評價。結果見表2。
表3.在柱中評價的含四聚體配體的基質(0.5mnaoh)。
激活
所用的基礎基質是按照us6602990的方法制備的85微米(容積加權的,d50v)介質直徑的剛性交聯(lián)的瓊脂糖珠粒,且按照描述于gelfiltrationprinciplesandmethods,pharmacialkbbiotechnology1991,第6-13頁的方法,其孔徑相當于針對mw110kda葡聚糖的0.70的反向凝膠過濾層析法kav值。
在25℃下機械攪拌10分鐘的同時,將25ml(g)瀝干的基礎基質、10.0ml蒸餾水和2.02gnaoh在100ml燒瓶中混合。加入4.0ml環(huán)氧氯丙烷,反應進行2小時?;罨哪z用10凝膠沉積體積(gv)的水洗滌。
偶聯(lián)
向50mlfalcon管中的20ml配體溶液(50mg/ml)中加入169mgnahco3、21mgna2co3、175mgnacl和7mgedta。將falcon管置于搖床上5-10分鐘,然后加入77mgdte。還原進行>45分鐘。然后使配體溶液在裝滿sephadexg-25的pd10柱中脫鹽。通過測量276nmuv吸收,測定脫鹽溶液中的配體含量。
激活的凝膠用3-5gv{0.1m磷酸鹽/1mmedtaph8.6}洗滌,配體然后按照描述于us6399750的方法偶聯(lián)。實驗中所用的所有緩沖液通過氮氣脫氣至少5-10分鐘??赏ㄟ^改變配體溶液的量和濃度,控制凝膠的配體含量。
在固定后,凝膠用蒸餾水洗滌3xgv。將凝膠+1gv{0.1m磷酸鹽/1mmedta/10%硫代甘油ph8.6}混合,將管置于搖床上在室溫下過夜。然后將交替地用3xgv{0.1mtris/0.15mnaclph8.6}和0.5mhac洗滌凝膠,接著8-10xgv和蒸餾水。將凝膠樣品送往外面的實驗室進行氨基酸分析,從總氨基酸含量計算配體含量(mg/ml凝膠)。
蛋白質
gammanorm165mg/ml(octapharma),在平衡緩沖液中稀釋至2mg/ml。
平衡緩沖液
pbs磷酸鹽緩沖液10mm+0.14mnacl+0.0027mkcl,ph7.4(medicago)
吸附緩沖液
pbs磷酸鹽緩沖液10mm+0.14mnacl+0.0027mkcl,ph7.4(medicago)
洗脫緩沖液
100mm乙酸鹽ph2.9
動態(tài)結合能力
將2ml樹脂裝入tricorn?5100柱中。用?ktaexplorer10系統(tǒng)以6分鐘的停留時間測定漏過容量(breakthroughcapacity)。使平衡緩沖液流過旁通柱(bypasscolumn),直到獲得穩(wěn)定的基線。這在自動零位調整之前進行。將樣品施加到柱中,直到獲得100%uv信號。然后,再次施加平衡緩沖液,直到獲得穩(wěn)定的基線。
將樣品加載到柱中,直到達到最大吸光度85%的uv信號。然后將柱用5柱體積(cv)平衡緩沖液以0.5ml/分鐘的流速洗滌。蛋白質用5cv洗脫緩沖液以0.5ml/分鐘的流速洗脫。然后柱用0.5mnaoh以0.2ml/分鐘的流速清洗,并用平衡緩沖液再平衡。
為了計算10%下的漏過容量,應用以下方程式。這是加載到柱中直到柱流出物中igg的濃度是進料中igg濃度的10%的igg的量。
a100%=100%uv信號;
asub=來自非結合igg亞類的吸光度貢獻;
a(v)=指定施加體積下的吸光度;
vc=柱體積;
vapp=施加直到10%漏過的體積;
vsys=系統(tǒng)死體積;
c0=進料濃度。
計算10%漏過下的動態(tài)結合能力(dbc)。針對10%和80%漏過,計算動態(tài)結合能力(dbc)。
cip-0.5mnaoh
在重復暴露于堿性清洗溶液之前和之后均測定10%漏過dbc(qb10)。各循環(huán)包括用0.5mnaoh以0.5/分鐘的速率泵送過柱20分鐘的cip步驟,之后將柱靜置4小時。暴露發(fā)生在室溫(22+/-2℃)下。在該溫育后,柱用平衡緩沖液以0.5ml/分鐘的流速洗滌20分鐘。表4顯示6個4小時循環(huán)(即0.5mnaoh的24小時累積暴露時間)后的剩余容積,呈絕對數(shù)和相對于起始容積兩者。
該書面描述利用實施例以公開本發(fā)明,包括最佳方式,并且使本領域任何技術人員能夠實施本發(fā)明,包括制備和使用任何裝置或系統(tǒng)和進行任何結合的方法。本發(fā)明的專利范圍由權利要求書限定,可包括本領域技術人員想到的其它實施例。如果這類其它實施例具有無不同于權利要求書的字面語言的結構要素,或如果它們包括與權利要求書的字面語言無實質性差異的等同結構要素,則它們旨在權利要求書的范圍內。正文中提及的所有專利和專利申請均通過引用以其整體結合到本文中,就像它們被分別結合一樣。